KR20120022699A - Vegf-a 및 tnf-알파에 결합할 수 있는 융합 단백질 - Google Patents

Abstract

본 출원은, (b) 다량체화 성분을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 (a) TNFR2 성분 및 VEGFR1 성분을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, VEGF 폴리펩티드 및 TNF 폴리펩티드에 동시에 결합할 수 있는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 분자로서, 상기 TNFR2 성분은 TNFR2의 세포외 도메인의 시스테인 풍부 도메인 1, 시스테인 풍부 도메인 2, 시스테인 풍부 도메인 3, 또는 시스테인 풍부 도메인 4의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 필수적으로 구성되고, 상기 VEGFR1 성분은 VEGFR1의 세포외 도메인의 Ig 유사 도메인 2의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 필수적으로 구성되는 것인 단리된 핵산 분자에 관해 기재한다.

Description

VEGF-A 및 TNF-알파에 결합할 수 있는 융합 단백질{FUSION PROTEIN CAPABLE OF BINDING VEGF-A AND TNF-ALPHA}

본 발명은 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 및 종양 괴사 인자 알파(TNF-α)에 동시에 결합할 수 있는 융합 단백질에 관한 것이며, 본 발명에서 이것은 "VEGF-A 및 TNF-알파 둘다 표적화하는 "이중 항염증 혈관형성 단백질, 또는 'Valpha'"로서 지칭된다. Valpha는 류마티스성 관절염, 골관절염, 건선, 당뇨병성 및 노인성 황반 변성 망막병, 암, 경화증, 염증성 장 질환, 다낭 신장, 강직 척추염, 크론병, 궤양 대장염, 및 죽상 동맥 경화증, 및 다른 급성 및 만성 염증과 같은 VEGF-A 및 TNF-α 관련 증상 및 질병을 치료하는데 어떤 것들이 치료학적으로 유용한지를 드러내게 한다.

혈관 내피 성장 인자-A(VEGF-A)는 혈액 내피 세포의 성장, 이동, 및 생존에 중요한 역할을 하며, 이들 과정은 주로 VEGFR1 및 VEGFR2의 활성화를 통해 혈관 형성 및 맥관 형성을 위한 필수적인 과정들이다(Ferrara N. et al., Nature Medicine 9:669-676, 2003; Shibuya M and Claesson- Welsh L, Exp. Cell Res. 312:549-560, 2005). VEGF는 종양 혈관 형성 및 전이, 류마티스성 관절염, 골관절염, 건선, 당뇨병성 및 노인성 황반 변성 망막병증에서 비정상 및 염증성 혈관형성에 대한 주요 분자이다(Ferrara N. et al., Nature Medicine 9:669-676, 2003; DeBandt M. et al., J Immunol. 171 :4853-4859, 2003; Aiello LP. N. Engl. J. Med. 353: 839-841, 2005).

종양 괴사 인자-알파(TNF-α)는 염증 부위에 백혈구를 동원함으로써 면역 반응을 매개한다(Hickey MJ. et al., J Immunol 158: 3391-3400, 1997). TNF-α는 포식 세포, 내피 세포 및 가지 세포를 비롯한 염증 세포에서 NF-κB의 활성화를 통해 염증을 개시하는데 주요 분자이다(Rojanasakul Y. et al., MoI. Cell. Biochem. 200: 119-125, 1999).

고수준의 VEGF-A 및 TNF-α는 염증 혈관 형성에 관련된 질병, 예컨대 류마티스성 관절염, 골관절염, 건선, 당뇨병성 및 노인성 황반 변성 망막병증, 암, 경화증, 염증성 장 질환, 다낭 신장, 강직 척추염, 크론병, 궤양 대장염, 및 죽상 동맥 경화증, 및 다른 급성 및 만성 염증에서 주요 결정인자이다. 따라서, VEFG 및TNF-α의 동시 억제는 이들 질병을 치료하는데 VEGF 또는 TNF-α의 단일 억제보다 더 효과적일 수 있다.

[발명의 내용]

본 발명은 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 및 종양 괴사 인자 알파(TNF-α)를 동시에 결합할 수 있는 융합 단백질, 즉 "VEGF-A 및 TNF-알파 둘다 표적화하는 이중 항염증 혈관형성 단백질, 또는 'Valpha'"를 제공한다. Valpha는 류마티스성 관절염, 골관절염, 건선, 당뇨병성 및 노인성 황반 변성 망막병증, 암, 경화증, 염증성 장 질환, 다낭 신장, 강직 척추염, 크론병, 궤양 대장염, 및 죽상 동맥 경화증, 및 다른 급성 및 만성 염증과 같은 VEGF-A 및 TNF-α 관련 증상 및 질병을 치료하는데 어떤 것들이 치료학적으로 유용한지를 드러내게 한다.

일예에서, 본 발명은 VEGF-A 및 TNF-α 폴리펩티드를 결합할 수 있는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이며, 이 분자는 VEGFR1 성분과 TNFR2 성분을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다량체화(multimerizing) 성분을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 VEGRF1 성분과 TNFR2 성분을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 연결될 수 있다. 그리고 다량체화 성분은 면역글로블린 도메인(domain)일 수 있다. 일예에서, 면역글로블린 도메인은 IgG의 Fc 도메인, IgG의 중쇄, 또는 IgG의 경쇄일 수 있다.

다른 일예에서, 핵산 분자에서, VEGFR1 성분과 TNFR2 성분은 VEGFR1과 TNFR2의 세포외 도메인의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.

다른 일예에서, 본 발명은 다음과 같은 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 핵산 또는 폴리펩티드 분자에 관한 것이다:

(a) Valpha FV＃1로서 지칭한 표 1에 제시된 뉴클레오티드 및 아미노산 서열로서, 원형 hTNFR2 컨스트럭트(construct)의 1 내지 22로부터 아미노산(1 내지 66으로부터 뉴클레오티드)으로부터 취한, 1 내지 22로부터 hTNFR2 신호 서열 아미노산(1 내지 66으로부터 뉴클레오티드), 원형 hTNFR2 컨스트럭트의 23 내지 257로부터 아미노산(67 내지 771로부터 뉴클레오티드)으로부터 취한, 23 내지 257로부터 hTNFR2 아미노산(67 내지 771로부터 뉴클레오티드), 원형 hVEGFR1 컨스트럭트의 132 내지 225로부터 아미노산(394 내지 675로부터 뉴클레오티드)으로부터 취한, 258 내지 351로부터 hVEGFR1 아미노산(뉴클레오티드 772 내지 1053), 및 352 내지 581로부터 인간 IgG 아미노산의 Fc 도메인(뉴클레오티드 1054 내지 1743)을 포함;

(b) Valpha VF＃1로서 지칭한 표 2에 제시한 뉴클레오티드 아미노산 서열로서, 원형 hVEGFR1 컨스트럭트의 132 내지 225로부터 아미노산(394 내지 675로부터 뉴클레오티드)으로부터 취한, 1 내지 26으로부터 hVEGFR1 신호 서열 아미노산(1 내지 78로부터 뉴클레오티드), 원형 hVEGFR1 컨스트럭트의 132 내지 225로부터 아미노산(394 내지 675로부터 뉴클레오티드)으로부터 취한, 27 내지 120으로부터 hVEGFR1 아미노산(79 내지 360으로부터 뉴클레오티드), 원형 hTNFR2 컨스트럭트의 23 내지 257로부터 아미노산(67 내지 771로부터 뉴클레오티드)으로부터 취한, 121 내지 355로부터 hTNFR2 아미노산(뉴클레오티드 361 내지 1065), 356 내지 585로부터 인간 IgG 아미노산의 Fc 도메인(뉴클레오티드 1066 내지 1755)을 포함; 또는

(c) 유전 부호의 축퇴(degeneracy) 결과로서 (a) 또는 (b)의 뉴클레오티드 서열과 다르지만 이로부터 발현된 동일 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열.

본 발명은 또한 상기에 기재한 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 벡터는 발현 벡터일 수 있다.

본 발명은 또한 적합한 숙주 세포 중에서 상기에 기재한 발현 벡터를 포함하는 융합 폴리펩티드의 제조를 위한 숙주 벡터 시스템에 관한 것이다. 이러한 적합한 숙주 세포는 박테리아 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 또는 포유동물 세포를 들 수 있다.

본 발명은 또한 Valpha FV＃1 및 Valpha VF＃1에 대한 아미노산 서열을 포함하나, 이들에 한정되지 않는, 상기에 기재한 단리된 임의의 핵산 분자에 의해 코딩된 융합 폴리펩티드에 관한 것이다.

본 발명은 또한 VEGF-A 및 TNF-α 분자를 동시에 결합하여 비기능적 복합체를 형성할 수 있는 조성물에 관한 것이다. 분자는 VEGFR1 및 TNFR2 성분을 사용하는 융합 컨스트럭트를 포함하나, 이에 한정되지 않는 상기에 기재한 융합 폴리펩티드의 다량체를 포함할 수 있다. 특히, 다량체는 이량체일 수 있다.

다른 일예에서, 본 발명은 융합 폴리펩티드의 생성을 가능하게 하고 이와 같이 생성된 융합 폴리펩티드를 회수하는 조건하에, 상기에 기재한 숙주 벡터 시스템의 세포를 성장시키는 것을 포함하는 융합 폴리펩티드를 제조하는 방법에 관한 것이다. 이러한 융합 폴리펩티드는 아세틸화 또는 PEG화(pegylation)에 의해 변형될 수 있다. 아세틸화는 약 10배 몰 과량 이상 내지 약 100배 몰 과량의 범위에서 몰 과량의 아세틸화제에 의해 완성될 수 있다. PEG화는 10K 또는 20K PEG에 의해 수행될 수 있다.

또 다른 일예에서, 본 발명은 포유동물에서 혈장 누출을 감소시키거나 억제하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 본 발명에서 기재한 유효량의 융합 폴리펩티드를 혈장 누출 감소 또는 억제가 필요한 포유동물에게 투여하는 것을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 누출은 망막 내일 수 있다.

또 다른 일예에서, 본 발명은 포유동물의 혈관 성장을 차단하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 본 발명에서 기재한 유효량의 융합 폴리펩티드를 혈관 성장 차단이 필요한 포유동물에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 일예에서, 혈관 성장 차단 활성은 특히 암, 연령 관련 황반 변성, 당뇨병성 망막병증, 류마티스성 관절염, 건선, 급성 및 만성 염증, 죽상 동맥 경화증 및 림프 증식 질환을 치료하는데 유용할 수 있다.

또 다른 일예에서, 본 발명은 포유동물의 종양 성장을 약화시키거나 방지하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 본 발명에서 기재한 유효량의 융합 폴리펩티드를 종양 성장의 약화 또는 방지가 필요한 포유동물에게 투여하는 것을 포함한다.

또 다른 일예에서, 본 발명은 포유동물의 부종을 약화시키거나 방지하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 본 발명에서 기재한 유효량의 융합 폴리펩티드를 부종의 약화 또는 방지가 필요한 포유동물에게 투여하는 것을 포함한다. 부종은 망막 부종 또는 뇌 부종일 수 있다.

또 다른 일예에서, 본 발명은 포유동물의 복수 형성을 약화시키거나 방지하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 본 발명에서 기재한 유효량의 융합 폴리펩티드를 복수 형성의 약화 또는 방지가 필요한 포유동물에게 투여하는 것을 포함한다. 복수는 난소암과 관련될 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명에서 기재한 유효량의 융합 폴리펩티드를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는 포유동물의 VEGF 수용체 리간드 및 TNF 수용체 리간드 활성을 억제하는 방법에 관한 것이다.

또 다른 일예에서, 본 발명은 포유동물의 염증 혈관 형성을 약화시키거나 방지하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 본 발명에서 기재한 유효량의 융합 폴리펩티드를 염증 혈관 형성의 약화 또는 방지가 필요한 포유동물에게 투여하는 것을 포함한다. 염증 혈관 형성에 의해 원인이 된 질병의 일예는 류마티스성 관절염이다. 염증 혈관 형성에 의해 원인이 된 질병의 다른 일예는 제한 없이, 척추 관절병증, 건선, 당뇨병성 망막병증, 죽상 동맥 경화증, 및 패혈증을 포함한다.

본 발명은 본원에서 하기 제시된 상세한 설명, 및 단지 예시의 방식으로만 제시되어 있어서, 본 발명을 제한하지 않는 첨부 도면으로부터 보다 충분히 이해할 수 있을 것이고, 상기 도면을 간단히 설명하면 다음과 같다.
도 1은 인간 VEGFR1 및 이의 3가지 주요 영역: 7가지 면역글로불린(Ig) 유사 도메인으로 구성되는 세포외 도메인, 트랜스멤브레인 및 세포내 도메인의 개략적 디아그램을 도시한 것이다. 도 1은 또한 인간 TNF 수용체 1(TNFR1) 또는 2(TNFR2) 및 이들의 3가지 주요 영역: 4가지 시스테인 농후 도메인으로 구성되는 세포외 도메인, 트랜스멤브레인 도메인 및 세포내 도메인의 개략적 디아그램도 도시한 것이다.
도 2는 VEGFR1(Mbd-VEGFR1)의 최소 리간드 결합 도메인, TNFR2(Mbd-TNFR2)의 최소 리간드 결합 도메인 및 인간 IgG의 Fc 부분을 조합하여 Valpha를 제조하는 개략적 디아그램을 도시한 것이다. 상기 TNFR2의 4가지 시스테인 농후 도메인은 TNF-α 결합에 필수적이고, 반면에 VEGFR1의 Ig 유사 도메인 2(Ig2)는 VEGF-A 결합에 필수적이다. 기본적으로, Mbd-TNFR2는 아미노-말단 부분에 위치하고, VEGFR1의 Ig2는 중간 부분에 위치하며, 인간 IgG의 Fc 부분은 Valpha의 카르복시-말단 부분에 위치하고, 그것은 VEGF 및 TNF-α의 이중 블록커이고, 항염증성 및 항혈관형성성 단백질로서 작용을 한다. Valpha의 추정 분자량은 ?65kD이고, Valpha의 이론적 pI 값은 7.14이다.
도 3은 포유동물 세포 배양 시스템을 사용하여 Valpha 단백질 발현을 위한, 유전자 작제물(gene construct), pCMV-dhfr, pCMV-dhfr-Fc, pCMV-dhfr-Valpha의 개략적 디아그램을 도시한 것이다. 서브도메인을 위한 인간 IgG의 유전자 인코딩 Fc를 pCMV-dhfr 내로 삽입한 후, 그 유전자 인코딩 Valpha가 pCMV-dhfr-Fc 내로 삽입된다. pCMV-dhfr-Valpha 유전자 작제물을 발생시키는데 표준 분자 방법이 이용된다. EcoRI 및 XhoI는 주요 제한 효소 부위이다.
도 4는 HEK293 세포에서 일시적으로 발현된 바와 같이 생성된 TNFR2-Fc, VEGFR3-Fc, Tie2-Fc 및 Valpha 단백질에 대한 웨스턴 블롯 분석을 도시한 것이다. TNFR2-Fc(1-257) 및 Valpha에 대한 발현 및 분비 수준은 VEGFR3-Fc(1-329) 및 Tie2-Fc(1-348)의 것보다 더 높다.
도 5a 내지 5c는 환원 조건 및 비환원 조건 하에서 정제된 Valpha 단백질(A), 및 환원 조건 하에서 BSA(소 혈청 알부민), Valpha 및 ENBREL(등록상표: Etancercept)(B)의 SDS-PAGE 겔의 쿠마지에 염색(Coomassie staining), 및 Valpha(C)의 등전점 포커싱(isoelectric focusing)을 도시한 것이다.
도 6은 확립된 ELISA 방법을 기초로 한 VEGF-A에 대한 Valpha의 결합 분석의 개략적 디아그램이다.
도 7은 확립된 ELISA 방법을 기초로 한 TNF-α에 대한 Valpha의 결합 분석의 개략적 디아그램이다.
도 8은 표준 ELISA 방법을 이용하여 Fc 융합 단백질을 검출하기 위한 결합 분석의 개략적 디아그램이다.
도 9는 VEGF-A 및 TNF-α에 대한 Valpha의 시험관내 결합 분석을 도시한 것이다. VEGF-A 또는 TNF-α 코팅된 평판은 VEGF-A 결합의 경우 Valpha, VEGF-Trap 및 TNFR2-Fc 0.01?10 nM 또는 TNF-2 결합의 경우 0.03?30 nM으로 항온 처리한다. VEGF-Trap 및 Valpha는 VEGF-A 결합을 나타내고, 반면에 TNFR2-Fc 및 Valpha는 TNF-α 결합을 나타낸다. VEGF-A에 대한 Valpha의 결합 친화성은 VEGF-Trap의 것보다 약간 약하고, TNF-α에 대한 Valpha의 결합 친화성은 TNFR2-Fc의 것과 유사하다.
도 10은 VEGF-A 및 TNF-α에 대한 Valpha의 동위상 결합(synchronous binding)의 유효성에 대한 개선된 샌드위치형 ELISA 결합 분석(advanced sandwitch ELISA binding assay)의 디아그램을 도시한 것이다.
도 11은 개선된 샌드위치형 ELISA 분석의 결과를 도시한 것이고, 그것은 VEGF 및 TNF-α에 대한 Valpha의 동위상 결합을 도시한 것이다.
도 12는 VEGF 및 TNF-α에 대한 VEGF-Trap, ENBREL(등록상표), 및 Valpha의 결합 모델에 대한 개략적 디아그램을 도시한 것이다.
도 13a 및 13b는 VEGF-A(A) 또는 TNF-α(B) 사이에서 Valpha의 결합 친화성을 검출하기 위한 표면 플라즈몬 공명 분석을 도시한 것이다. VEGF-A 결합의 경우, Valpha는 6.54 × 10^-12 M의 K_D 값을 갖고, 반면에 VEGF-Trap은 1.35 × 10^-12 M의 K_D 값을 갖는다. TNF-α 결합의 경우, Valpha는 6.41 × 10^-10 M의 K_D 값을 갖고, 반면에 ENBREL(등록상표)은 2.29 × 10^-10 M의 K_D 값을 갖는다.
도 14a 내지 도 14b는 배양된 HUVEC에서 VEGF-A-유도된 세포 이동에서 Valpha를 검사하기 위한 시험관내 스크래치 분석법을 도시한 것이다. VEGF-A 처리에 의해 유도된 세포 이동 활성은 Valpha 또는 VEGF-Trap(B)에 의해 억제되지만, TNFR2-Fc 단백질(B)에 의해서는 억제되지 않는다는 점을 유의해야 한다.
도 15a 내지 도 15f는 L929 뮤린 섬유육종에 대한 TNF-α 유도된 세포독성의 대표적 포토그래프를 도시한 것이다. (A)는 대조, 미처리 세포이다. 죽은 부유 세포는 세포(B)의 TNF-α 처리된 시료에서 적절히 관찰되고, 반면에 이러한 TNF-α 유도된 세포독성은 악티노마이신-D(AMD)(C)의 존재 하에 강화된다. TNFR2-Fc(E) 또는 Valpha에 의한 TNF-α 및 AMD의 동시 처리는 TNF-α-유도 세포독성(F)을 약화시키고, 반면에 Fc 단백질(D)에 의한 동시 처리는 TNF-α 유도된 세포독성을 변경시키지 않는다.
도 16a 및 도 16b는 L929 뮤린 섬유육종 세포에서 TNF-α 유도된 세포독성에서 Valpha의 효과에 관련한 MTT 분석을 도시한 것이다. 도 16a는 연속적으로 희석된 TNF-α(10 ng/ml 내지 0.0005 ng/ml)의 투여에 의해 유도된 세포 세포독성의 정도를 도시한 것이다. 도 16b는 TNF-α(5 ng/ml)- 유도된 세포 독성에서 Valpha, ENBREL(등록상표), 인플리시맵(REMICADE(등록상표), 및 VEGF-Trap의 차등적 억제를 도시한 것이다.
도 17은 대조군(BSA), LPS, TNF-α 또는 TNF-α + Valpha에 의해 처리된 인간 림프성 내피 세포에서 NF-κB 전좌에 대한 대표적 사진을 도시한 것이다. LPS 및 TNF-α 는 p65의 핵 전좌(백색 화살표)를 활발하게 감소시키고, 반면에 Valpha는 p65의 TNF-α 유도된 핵 전좌(TNF-α 유도된 NF-κB 전좌 활성화)를 강력하게 억제한다는 점을 유의해야 한다.
도 18은 미숙아 망막병증(ROP) 및 산소 유발 망막병증(OIR)로서 공지되어 있는 망막병증의 마우스 모델의 발생을 위한 개략적 디아그램을 도시한 것이다. 정상대기(정상산소: normoxia)에서 성장된 출생후 7일령(P7) 마우스는 고산소 조건(75％ O₂)에 옮겨서 5일 동안 살게 하고(P12), 다시 정상산소 조건으로 옮겨서 후속적인 5일 동안 살게 한다(P17). P17에서, 현저한 혈관 터프트(tuft) 형성이 망막 혈관의 중간 부분 및 원위 부분에서 검출되고, 반면에 망막의 근위 부분에서는 혈관이 검출되지 않는다(혈관-제거(vaso-obliteration)).
도 19a 및 19b는 마우스 ROP 모델에서 망막 혈관 누출(A) 및 망막내 혈관 터프트 형성(B)에 미치는 대조군, VEGF-Trap, ENBREL(등록상표) 또는 Valpha의 효과를 도시한 것이다. 망막의 후방 표면에서 출혈성 혈관 누출(백색 화살표)의 광학 현미경 분석(도 19a) 및 망막 전방 혈관 터프트 형성(백색 화살표 헤드부)의 면역조직학적 분석(도 19b)이 도시되어 있다.
도 20a 및 도 20b는 마우스를 사용한 망막병증 모델에 미치는 Valpha의 효과의 개선을 나타내는 포토그래프(A), 및 대조군, Valpha 및 VEGF-Trap에 대한 혈관신생(neovascularization)을 나타내는 바 그래프(B)를 도시한 것이다.
도 21a 내지 도 21c는 마우스를 사용한 콜라겐-유도된 관절염에 미치는 Valpha의 효과의 개선을 나타내는 포토그래프를 도시한 것이다. 대조군, VEGF-Trap, ENBREL(등록상표) 또는 Valpha 투여된 마우스의 포토그래프(A)가 도시되어 있고; 평균 관절염 점수 그래프가 대조군, VEGF-Trap, ENBREL(등록상표) 또는 Valpha의 투여에 대하여 도시되어 있으며(B); 뒷발(hind paw) 두께 측정 그래프가 대조군, VEGF-Trap, ENBREL(등록상표) 또는 Valpha의 투여에 대하여 도시되어 있다(C).
도 22a 및 도 22b는 콜라겐 유도된 관절염(CIA) 마우스 모델에 미치는 대조군, VEGF-Trap, ENBREL(등록상표) 또는 Valpha 의 효과에 관한 방사선그래프 분석(A) 및 대조군, VEGF-Trap, ENBREL(등록상표) 또는 Valpha의 투여에 대하여 전체 평균 방사선그래프 점수(B)를 도시한 것이다.

본 출원에서, 단수형은 대상의 단수형 및 복수형을 모두 의미하는 것으로 사용된다.

본 명세서에서 사용될 때, "약" 또는 "실질적으로"는 일반적으로 정확한 숫자로의 한정으로부터 자유 재량을 제공한다. 예컨대, 폴리펩티드 서열의 길이 상황에서 사용될 때, "약" 또는 "실질적으로"는 폴리펩티드가 언급된 수의 아미노산에 한정되는 것이 아님을 나타낸다. 그 결합 활성과 같은 기능적 활성이 존재하는 한 N-말단 또는 C-말단으로부터 추가되거나 공제되는 몇 개의 아미노산이 포함될 수 있다.

본 명세서에서 사용될 때, 하나 이상의 추가의 치료제"와 함께" 투여는 동시(병합) 투여 및 임의의 순서의 연속 투여를 포함한다.

본 명세서에서 사용될 때, "아미노산" 및 "아미노산들"은 모든 자연 발생적 L-α-아미노산을 의미한다. 이러한 정의는 노르류신, 오르니틴 및 호모시스테인을 포함하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용될 때, 일반적으로, 용어 "아미노산 서열 변종"은 기준(예컨대, 본래 서열) 폴리펩티드에 비하여 아미노산 서열이 일부 상이한 분자를 의미한다. 아미노산 변경은 본래 아미노산 서열에서 치환, 삽입, 결실 또는 이러한 변화의 임의의 소정 조합일 수 있다.

치환형 변종은 본래의 서열에서 1 이상의 아미노산 잔기가 제거되고 동일한 위치에 그 대신 상이한 아미노산이 삽입된 것들이다. 치환은 분자내 하나의 아미노산만이 치환된 일치환 또는 동일한 분자에서 2 이상의 아미노산이 치환된 다치환일 수 있다.

서열 내 아미노산에 대한 치환은 그 아미노산이 속하는 부류의 다른 멤버로부터 선택될 수 있다. 예컨대, 비극성(소수성) 아미노산은 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 포함한다. 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함한다. 양으로 하전된 (염기성) 아미노산은 아르기닌, 리신 및 히스티딘을 포함한다. 음으로 하전된 (산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. 또한, 동일하거나 유사한 생물학적 활성을 나타내는 단백질 또는 이의 단편 또는 유도체 및 예컨대 글리코실화, 단백질 분해 절단, 항체 분자 또는 다른 세포 리간드에의 결합 등에 의하여 번역 동안 또는 번역 후에 달리 변형된 유도체가 본 발명 범위 내에 포함된다.

삽입형 변종은 본래 아미노산 서열의 특정 위치에서 한 아미노산에 직접 인접하여 하나 이상의 아미노산이 삽입된 것들이다. 아미노산에 직접 인접한다는 것은 아미노산의 α-카르복시 또는 α-아미노 작용기에 결합됨을 의미한다.

결실형 변종은 본래 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 제거된 것들이다. 보통, 결실형 변종은 분자의 특정 영역에서 하나 또는 두 아미노산이 제거된다.

본 명세서에서 사용될 때, "길항제"는 생물학적 반응을 유도하지 않고 세포 수용체에 결합하는 리간드와 같이 다른 리간드의 작용을 무력화하는 리간드를 의미한다.

본 발명 리간드의 바람직한 생물학적 활성은 혈관 침투성을 억제하는 능력 및 염증을 약화시키는 능력을 포함한다. 혈관 침투성을 억제하는 능력은 당뇨병성 신증, 부종 및 복수와 같은 의학적 병태 및 질병의 치료에 유용하다. 본 발명 리간드의 바람직한 생물학적 활성은 (아폽토시스 예방을 비롯한) 내피 세포 온전성을 유지하는 능력을 포함한다. 염증을 약화시키는 능력은 류머티스성 관절염, 골관절염, 건선, 염증성 장 질환, 강직성 척추염, 크론병 및 궤양성 대장염과 같은 의학적 병태 및 질병의 치료에 유용하다.

리간드-수용체 결합 상호작용을 측정하기 위하여 방사성 동위 원소, 형광 태그, 효소 태그 또는 화학발광성 태그와 같은 검출 가능한 라벨로 융합 단백질을 표지하는 것도 고려된다. 키메라 분자를 이용하는 분석 시스템도 고려된다

본 명세서에서 사용될 때, "담체"는 사용되는 투약량 및 농도에서 이에 노출되는 세포 또는 포유동물에 대하여 비독성인 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정제를 포함한다. 종종 약학적으로 허용되는 담체는 pH 완충 수용액이다. 약학적으로 허용되는 담체의 예는 비제한적으로 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산을 포함하는 항산화제; 저분자량 (약 10 잔기 미만) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글루불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 단당류, 다당류 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 만니톨 또는 소르비톨과 같은 당 알콜; 나트륨과 같은 염형성 카운터이온; 및/또는 TWEEN？, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 및 PLURONICS？와 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다.

본 명세서에서 사용될 때, 핵산 서열의 상황에서 사용될 때 "실질적으로 이루어지는"은 핵산에 의하여 코딩된 아미노산의 의도된 기능을 수행하는 데 필수적인 서열을 의미한다.

본 명세서에서 사용될 때, "유효량"은 유리하거나 바람직한 임상적 또는 생화학적 결과를 얻기에 충분한 양이다. 유효량은 1회 이상 투여될 수 있다. 본 발명의 목적에서, 억제제 화합물의 유효량은 질병 상태를 완화, 경감, 안정화, 역전, 지연시키거나 질병 상태의 진행을 지연시키는 데 충분한 양이다.

본 명세서에서 사용될 때, "단편" 또는 "기능적 유도체"는 본 발명의 천연 리간드 또는 수용체의 생물학적 활성 아미노산 서열 변종 및 단편, 및 유기 유도체화 제제와의 반응에 의하여 수득되는 유도체, 번역후 변형, 비단백질성 중합체를 갖는 유도체 및 면역아데신을 비롯한 공유 변형을 의미한다.

본 명세서에서 사용될 때, "숙주 세포"는 본 발명의 벡터 수용체일 수 있거나 수용체였던 개별 세포 또는 세포 배양액을 포함한다. 숙주 세포는 단일 숙주 세의 자손을 포함하고 자손은 자연적인, 우연한 또는 고의의 돌연변이 및/또는 변화로 인하여 원래의 모세포와 (형태 또는 전체 DNA 상보성에서) 반드시 완전히 동일한 것이 아닐 수 있다.

본 명세서에서 사용될 때, "리간드"는 폴리펩티드와 같은 분자에 일시적으로 또는 공유적으로 특이 결합하는 임의의 분자 또는 제제 또는 화합물을 의미한다. 특정 상황에서 사용될 때, 리간드는 항체를 포함할 수 있다. 다른 상황에서, "리간드"는 리간드 트랩에서와 같이 높은 친화성을 갖고 다른 분자에 의하여 결합되는 분자를 의미할 수 있다.

본 명세서에서 사용될 때, 치료 목적을 위한 "포유류"는 인간, 가축 및 농장동물, 및 개, 고양이, 소, 말, 양, 돼지 등과 같은 동물원, 스포츠 또는 애완 동물을 비롯하여 포유류로서 분류되는 임의의 동물을 의미한다. 바람직하게는, 포유류는 인간이다.

본 명세서에서 사용될 때, "약학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제"는 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약학적 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 제제의 사용은 업계에 잘 알려져 있다. 임의의 종래의 매질 또는 제제가 활성 성분과 비상용성이 아닌 한, 치료 조성물에서 이의 사용이 고려된다. 보충 활성 성분도 조성물에 포함될 수 있다.

투약량의 균일성 및 투여의 용이성을 위해 비경구 조성물을 단위 제형으로 조제하는 것이 특히 유리하다. 본 명세서에서 사용될 때 단위 제형은 치료될 포유류 피험체에 대하여 단일 투약량으로서 적합한 물리적으로 구분된 단위들을 의미하며, 각 단위는 필요한 약학 담체와 회합되어 소정 치료 효과 생성하도록 계산된 소정량의 활성 물질을 함유한다. 본 발명의 단위 제형에 대한 내역은 (a) 활성 물질의 독특한 특성 및 달성하고자 하는 특정 치료 효과, 및 (b) 신체 건강 상태가 손상된 질병 상태를 갖는 살아있는 피험체에서 질병의 치료를 위한 이러한 활성 물질을 합성하는 기술에서의 고유 한계에 지배되거나 이에 직접적으로 의존한다.

기본적인 활성 성분은 단위 제형으로 적당한 약학적으로 허용되는 담체와 함께 유효량으로 편리하고 효과적인 투여를 위해 합성된다. 단위 제형은 예컨대 0.5 μg 내지 약 2000 mg 범위의 양으로 기본적인 활성 물질을 함유할 수 있다. 비율로 표현하여, 활성 물질은 일반적으로 담체 1 ml당 약 0.5 μg부터 존재한다. 보충적 활성 성분을 함유하는 조성물의 경우, 투약량은 상기 성분의 투여 방식 및 통상적인 용량을 참조하여 결정된다.

본 명세서에서 사용된 바의 "샘플" 또는 "생물학적 샘플"은 이의 가장 넓은 의미를 지칭하며, 수행하고자 하는 분석의 유형에 따라 개인, 체액, 세포주, 조직 배양물 또는 임의의 TNF-α 또는 VEGF-A 결합 펩티드를 함유할 수 있는 다른 공급원으로부터 얻은 임의의 생물학적 샘플을 포함한다. 기재한 바와 같이, 생물학적 샘플은 정액, 림프, 혈청, 형질, 소변, 윤활액, 척수액 등과 같은 체액을 포함한다. 포유 동물로부터 조직 생검 및 체액을 얻는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.

본 명세서에서 사용된 바의 "피험체"는 척추 동물, 바람직하게는 포유 동물, 더욱 바람직하게는 인간이다.

본 명세서에서 사용된 바의 "동시" 또는 "동시적" 결합은 단백질이 결합에 이용 가능할 경우 동시에 2 이상의 지정된 단백질에 단백질이 결합하는 것을 지칭한다.

본 명세서에서 사용된 바의 "치료"는 이로운 또는 소정의 임상학적 결과를 얻기 위한 접근법이다. 본 발명의 목적을 위해, 이로운 또는 소정의 임상학적 결과는 검출 가능 또는 검출 불가능과 관계 없이 증상의 경감, 질병 정도의 감소, 질병의 안정화된(즉 악화되지 않는) 상태, 질병 진행의 지연 또는 느려짐, 질병 상태의 개량 또는 완화, 및 진정(부분적인지 전체적인지 관계 없음)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. "치료"는 또한 치료를 받지 않을 경우 예상한 생존에 비해 생존이 연장됨을 의미할 수 있다. "치료"는 요법적 치료 및 예방적 또는 방지적 수단 모두를 지칭한다. 치료가 필요한 것들은 질환을 이미 앓고 있는 것들 뿐 아니라, 질환이 예방되어야 하는 것들을 포함한다. 질병의 "완화"는 치료가 없는 상황에 비해 질병 상태의 정도 및/또는 바람직하지 않은 임상학적 소견이 감소되거나 및/또는 진행의 과정이 느려지거나 길어지는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 바의 "벡터", "폴리뉴클레오티트 벡터", "구성체" 및 "폴리뉴클레오티드 구성체"는 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 벡터는 RNA, DNA, 레트로바이러스 코트에 캡슐화된 RNA, 아데노바이러스 코트에 캡슐화된 DNA, 다른 바이러스 또는 바이러스 유사 형태(예컨대, 단순 포진 및 아데노 구조체, 예컨대 폴리아미드)에 포장된 DNA를 포함하나 이에 한정되지 않은 여러 형태 중 임의의 것일 수 있다.

서열 목록 프리 텍스트

a, g, c, t 외의 뉴클레오티드 기호의 사용에 관해, 이들은 WIPO Standard ST.25, 부록 2, 표 1에 기재된 협정에 따르며, 여기서 k는 t 또는 g를 나타내고; n은 a, c, t 또는 g를 나타내며; m은 a 또는 c를 나타내고; r은 a 또는 g를 나타내고; s는 c 또는 g를 나타내며; w는 a 또는 t를 나타내고; y는 c 또는 t를 나타낸다.

표 1은 Mbd-TNFR2, VEGFR1의 Ig2 및 인간 IgG Fc 부분의 순서로 구성된 Valpha FV＃1의 하위 도메인 어셈블리에 대한 서열 번호 1 핵산 서열 및 이의 상당하는 아미노산 서열(서열 번호 2)을 나타낸다.

표 1에 기재된 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 원래의 hTNFR2 구성체의 1 내지 22의 아미노산(뉴클레오티드 1 내지 66)으로부터 취한 1 내지 22의 hTNFR2 신호 서열 아미노산(뉴클레오티드 1 내지 66), 원래의 hTNFR2 구성체의 23 내지 257의 아미노산(뉴클레오티드 67 내지 771)으로부터 취한 23 내지 257의 hTNFR2 아미노산(뉴클레오티드 67 내지 771), 원래의 hVEGFR1 구성체의 132 내지 225의 아미노산(뉴클레오티드 394 내지 675)으로부터 취한 258 내지 351의 hVEGFR1 아미노산(뉴클레오티드 772 내지 1053), 및 352 내지 581의 인간 IgG 아미노산의 Fc 도메인(뉴클레오티드 1054 내지 1743)을 포함하는 Valpha FV＃1로서 지칭된다.

표 2는 VEGFR1의 Ig2, Mbd-TNFR2 및 인간 IgC Fc 부분의 순서로 구성된 Valpha VF＃1의 하위 도메인 어셈블리에 대한 서열 번호 3 핵산 서열 및 이의 상당하는 아미노산 서열(서열 번호 4)을 나타낸다.

표 2에 기재된 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 원래의 hVEGFR1 구성체의 132 내지 225의 아미노산(뉴클레오티드 394 내지 675)으로부터 취한 1 내지 26의 hVEGFR1 신호 서열 아미노산(뉴클레오티드 1 내지 78), 원래의 hVEGFR1 구성체의 132 내지 225의 아미노산(뉴클레오티드 394 내지 675)으로부터 취한 27 내지 120의 hVEGFR1 아미노산(뉴클레오티드 79 내지 360), 원래의 hTNFR2 구성체의 23 내지 257의 아미노산(뉴클레오티드 67 내지 771)으로부터 취한 121 내지 355의 hTNFR2 아미노산(뉴클레오티드 361 내지 1065), 및 356 내지 585의 인간 IgG 아미노산의 Fc 도메인(뉴클레오티드 1066 내지 1755)을 포함하는 Valpha VF＃1로서 지칭된다.

표 1 및 2는 TNFR-Cys 도메인 1, 2, 3 및 4, 및 hVEGFR1 Ig 도메인 2를 나타낸다. 이들 도메인 각각은 본 발명에 따라 따로 사용할 수 있거나 또는 혼합 및 매칭할 수 있다. 예컨대, 도메인 모두를 함께 사용할 필요는 없다. 소정의 동시 결합 효과를 제공하기 위해, TNFR-Cys 도메인 1, 2, 3 또는 4는 개별적으로 사용하거나 또는 hVEGFR1의 도메인과 조합하거나 이와 함께 사용할 수 있다.

인간 VEGFR1 및 인간 TNFR2

인간 VEGFR1은 3개의 주요 영역, 즉 7개의 면역 글로불린(Ig) 유사 도메인을 갖는 세포외 도메인, 막 도메인 및 세포내 티로신 키나아제 도메인에 의해 분리된 1338개 아미노산으로 구성된다(UniProtKB/Swiss-Prot entry P 17948)(도 1). VEGFR1은 잘 알려진 단백질이므로, 이의 서열은 논의하지 않기로 한다.

VEGFR1 내 7개의 Ig 유사 도메인 중에서 Ig 유사 도메인 2는 VEGF-A 결합에 필수적이다(도 2). 그러나, VEGFR1의 Ig 유사 도메인 2는 다수의 염기성 아미노산을 함유하며, 이의 이론적 등전점(pi)은 9.19이다(Compute pI/Mw tool for Swiss-Prot/TrEMBL entries, http://kr.expasy.org/tools/pi_tool.html).

일반적으로, 양 하전된(즉, pi의 값이 높은) 단백질이 음 하전된 세포외 매트릭스에 비특이적으로 결합한다. 따라서, VEGFR1의 Ig 유사 도메인 2는 본래 치료적 단백질로서는 유용하지 않을 수 있는데, 왜냐하면 이것은 약한 약동학 특성을 가질 수 있기 때문이다.

두 가지의 공지된 TBN 수용체, TNFR1(분자량, 55 kD; TNF-R55) 및 TNFR2(분자량, 75 kD; TNF-R75)가 존재한다(도 1). 이들 두 가지 수용체는 TNF-α 및 TNF-β에 대해 유사한 친화도를 갖는다(Schall et al, Cell 1990, 61:361-370). TNFR2에 대한 TNF-α의 친화도는 TNFR1에 대한 친화도보다 몇 배 더 높다(Dri P. et al., J Immunol 162:460-466, 1999; Tartaglia LA. et al., J. Biol. Chem. 268: 18542-18548, 1993). TNFR1 및 TNFR2는 잘 알려진 단백질이므로, 이의 서열은 논의하지 않기로 한다.

인간 TNFR2는 3개의 주요 영역, 즉 4개의 시스테인 풍부 도메인으로 구성된 세포외 도메인, 막 도메인 및 세포내 도메인에 의해 분리된 461개 아미노산을 포함한다(UniProtKB/Swiss-Prot entry P20333)(도 1).

TNFR2의 세포외 하위 도메인의 4개의 시스테인 풍부 도메인은 TNF 결합에 필수적이다(도 2). 이 하위 도메인은 다수의 염기성 아미노산을 함유하지만, 이의 이론적 등전점(pi)은 6.5인데(Compute pI/Mw tool for Swiss-Prot/TrEMBL entries, http://kr.expasy.org/tools/pi_tool.html), 왜냐하면 이것은 다량의 시스테인 및 다른 산성 아미노산을 보유하기 때문이다.

VEGF 슈퍼패밀리는 VEGF-A, -B, -C, -D 및 PlGF를 포함하는 반면, TNF 슈퍼패밀리는 TNF-α(카테킨) 및 TNF-β(림포톡신)으로 구성된다. 이들 중에서, VEGF-A 및 TNF-α는 병리적 염증 및 혈관 형성에 중요한 분자이다. 본 발명은 바람직하게는 VEGF-A 및/또는 TNF 관련 질병을 치료하기 위한 RNA 간섭체, 인트라디아바디(intradiabody, 이중 항체) 또는 디코이 수용체를 이용한 VEGF-A 및 TNF-α의 동시 차단을 제공한다.

핵산 구성체

본 명세서에 기재된 바의 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터도 제공되는데, 여기서 핵산 분자는 발현 대조 서열에 작동 가능하게 연결된다. 융합 폴리펩티드의 발현에 적절한 숙주 세포에 도입된 본 발명의 발현 벡터를 포함하는 융합 폴리펩티드의 생성을 위한 숙주 벡터 시스템도 제공된다. 적절한 숙주 세포는 대장균, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)와 같은 효모 세포, 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)와 같은 곤충 세포, 또는 COS 또는 CHO 세포와 같은 포유 동물 세포일 수 있다.

본 발명은 또한 융합 폴리펩티드의 생성을 가능하게 하는 조건 하에서 본 명세서에 기재된 숙주-벡터 시스템의 세포를 성장시키고 이렇게 생성된 융합 폴리펩티드를 회수하는 것에 의한 본 발명의 융합 폴리펩티드의 생성 방법을 제공한다. 본 발명의 실시에 유용한 융합 폴리펩티드는 원핵 또는 진핵 발현 시스템 내에서의 발현에 의해 제조할 수 있다.

재조합 유전자를 발현시킬 수 있으며, 임의의 수의 방법을 이용하여 폴리펩티드를 정제할 수 있다. 유전자는 예컨대 pZErO(한정하는 것이 아님)와 같은 박테리아 발현 벡터로 하위 클로닝할 수 있다.

융합 폴리펩티드는 안정하고 생물적으로 활성인 단백질의 후속 형성을 가능하게 하는 임의의 기술에 의해 정제할 수 있다. 예컨대(한정하는 것은 아님) 인자를 가용성 단백질로서 또는 8M 구아디늄 염산염 및 투석에 의해 정량적으로 추출할 수 있는 봉입체로서 세포로부터 회수할 수 있다. 인자를 추가로 정제하기 위해, 종래의 이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 이당(different sugar) 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피 또는 겔 여과를 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 수의 정제 방법을 이용할 수 있다.

본 명세서에서 사용될 경우, 융합 폴리펩티드는 아미노산 잔기가 서열 내 잔류로 대체되어 조용한 또는 보존적인 변화를 초래하는 기능적으로 등가인 분자를 포함한다. 예컨대, 서열 내 1 이상의 아미노산 잔기는 기능적 등가물로서 작용하여 조용한 또는 보존적인 변화를 초래하는 상이한 극성의 다른 아미노산으로 대체할 수 있다. 서열 내 아미노산에 대한 대체물은 아미노산이 속하는 부류의 다른 멤버로부터 선택할 수 있다. 예컨대, 비극성(소수성) 아미노산은 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 포함한다. 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함한다. 양 하전된(염기성) 아미노산은 아르기닌, 리신 및 히스티딘을 포함한다. 음 하전된(산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. 동일하거나 유사한 생물학적 활성을 나타내는 단백질 또는 단편 또는 이의 유도체, 및 예컨대 글리코실화, 단백질 분해 분열, 항체 분자 또는 다른 세포 리간드에 대한 결합에 의해 번역 동안 또는 그 후 차별 개질되는 유도체도 본 발명의 범위에 포함된다.

본 발명의 융합 폴리펩티드를 발현시키는 세포는 유전적으로 조작되어, 예를 들어 형질감염, 형질도입, 전기천공 또는 미세주입 기법에 의해 융합 폴리펩티드를 생성한다.

또한, 본 발명은 태그된 형태(tagged form)로 본 발명에서 기술된 융합 폴리펩티드를 사용하는 것을 고려한다.

DNA 단편을 벡터에 주입시키기 위한 당업자에게 공지된 임의의 방법을 이용함으로써, 적절한 전사/번역 조절 신호 및 단백질 코딩 서열을 이용하여 본 발명의 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 발현 벡터를 구성할 수 있다. 이러한 방법은 시험관 내 재조합 DNA 및 합성 기법 및 생체 내 재조합(유전 재조합)을 포함할 수 있다. 본 발명의 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열의 발현은 제2 핵산 서열에 의해 조절함으로써, 상기 융합 폴리펩티드가 상기 재조합 DNA 분자에 의해 변형된 숙주에서 발현되도록 할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서 기술된 융합 폴리펩티드의 발현은 당업계에 공지된 임의의 촉진제/증대제 성분에 의해 제어될 수 있다. 상기 융합 폴리펩티드의 발현을 제어하는 데 이용될 수 있는 촉진제는 비한정적으로 문헌[Squinto et al., (1991, Cell 65:1-20)]에 기술된 긴 말단 반복; SV40 조기 촉진제 영역(Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310), CMV 촉진제, M-MuLV 5' 말단 반복, 라우스 육종 바이러스의 3' 긴 말단 반복에 함유된 촉진제(Yamamoto, et al., 1980, Cell 22:787-797), 헤르페스 티미딘 키나제 촉진제(Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:144-1445), 메탈로티오네인 유전자의 조절 서열(Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42); β-락타마제 촉진제와 같은 원핵 세포 발현 벡터(Villa-Kamaroff, et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731), 또는 tac 촉진제(DeBoer, et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 80:21-25)(또한, 문헌["Useful proteins from recombinant bacteria" in Scientific American, 1980, 242:74-94] 참조); 효모 또는 다른 균류로부터의 촉진제 성분, 예컨대 Gal 4 촉진제, ADH(알콜 데히드로게나제) 촉진제, PGK(포스포글리세롤 키나제) 촉진제, 알칼리성 포스파타제 촉진제 및 하기 동물 전사 조절 영역(이는 조직 특이성을 나타내고 형질전환 동물에 사용됨): 췌장 선포 세포에서 활성인 엘라스타제 I 유전자 조절 영역(Swift et al., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); 췌장 베타 세포에서 활성인 인슐린 유전자 조절 영역(Hanahan, 1985, Nature 315:115-122), 림프계 세포에서 활성인 면역글로불린 유전자 조절 영역(Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-658; Adames et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444), 고환, 유방, 림프 및 비만 세포에서 활성인 마우스 유방 종양 바이러스 조절 영역(Leder et al., 1986, Cell 45:485-495), 간에서 활성인 알부민 유전자 조절 영역(Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1:268-276), 간에서 활성인 알파-페토프로틴 유전자 조절 영역(Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 235:53-58); 간에서 활성인 알파 1-안티트립신 유전자 조절 영역(Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1:161-171), 골수 세포에서 활성인 베타-글로빈 유전자 조절 영역(Mogram et al., 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94); 뇌의 희돌기교 세포(oligodendrocyte cell)에서 활성인 수초 염기성 단백질 유전자 조절 영역(Readhead et al., 1987, Cell 48:703-712); 골격근에서 활성인 미오신 경쇄-2 유전자 조절 영역(Shani, 1985, Nature 314:283-286), 및 시상하부에서 활성인 성선자극성 방출 호르몬 유전자 조절 영역(Mason et al., 1986, Science 234:1372-1378)을 포함한다.

따라서, 본 발명에 따라서, 본 발명에서 기술된 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 박테리아 또는 진핵생물 숙주에서 자가복제, 및 특히 변성될 수 있는 발현 벡터를 이용하여 상기 숙주를 형질감염시키고, 이로써 직접 상기 핵산을 발현시켜 융합 폴리펩티드를 생성하며, 이어서 이는 생물학적 활성 형태로 회수될 수 있다. 본 원에서 사용되는 바와 같이, 생물학적 활성 형태는 관련 수용체에 결합하고, 분화 기능을 유도할 수 있고, 및/또는 상기 수용체를 발현시키는 세포의 표현형에 영향을 미칠 수 있는 형태를 포함한다. 이러한 생물학적으로 활성인 형태는, 예를 들어 VEGFR1, VEGFR2 및 TNFR2 수용체의 인산화, 또는 세포 DNA의 합성 억제를 차단할 수 있다.

핵산 삽입체를 함유하는 발현 벡터는 비한정적으로 3 이상의 일반적으로 접근법에 의해 확인할 수 있다: (a) DNA 교잡, (b) '마커(marker)' 유전자 기능의 존재 유무, 및 (c) 삽입된 서열의 발현. 상기 제1 접근법에서, 발현 벨터에 삽입된 외부 핵산의 존재는 삽입된 핵산 서열에 상응하는 서열을 포함하는 프로브를 이용하여 DNA-DNA 교잡에 의해 탐지할 수 있다. 상기 제2 접근법에서, 상기 재조합 벡터/숙주 시스템은 상기 벡터 중 외부 핵산 서열의 삽입에 의한 특정 '마커' 유전자 기능(예를 들어, 티미딘 키나제 활성, 항생제에 대한 내성, 형질감염 표현형, 바큘로바이러스 중 포매체 형성 등)의 존재 유무에 따라 확인 및 선택할 수 있다. 예를 들어, efl 핵산 서열이 상기 벡터의 마커 유전자 서열 내에 삽입되는 경우, 상기 삽입체를 함유하는 재조합은 상기 마커 유전자 기능의 부재에 의해 확인할 수 있다. 상기 제2 접근법에서, 재조합 발현 벡터는 그 재조합 구조에 의해 발현되는 외부 핵산 생성물을 분석하여 확인할 수 있다. 상기 분석은, 예를 들어 리간드를, 태그될 수 있는 수용체 또는 이의 일부, 예를 들어 탐지가능한 항체 또는 이의 일부에 결합시키거나, 또는 해당 단백질 또는 이의 일부에 대향하여 생성되는 항체에 결합시킴으로써, 예를 들어 해당 핵산 생성물의 물리적 또는 기능 특성을 기준으로 할 수 있다.

본 발명의 특히 변성된 융합 폴리펩티드는 상기 숙주에서 일시적으로, 본질적으로 또는 영구적으로 발현될 수 있다.

본 발명은 또한 VEGFR-I, VEGFR-2 및 TNFR-2 수용체를 발현하는 세포, 조직 또는 기관과 관련된 장애를 앓는 환자의 치료를 위한 치료제로서의 융합 폴리펩티드의 개발을 제공한다. 이러한 분자는 인간 또는 동물의 몸체의 치료 방법 또는 진단 방법에 사용될 수 있다.

상기 또는 기타 질환 또는 장애를 치료하는 데 유용한 유효 투약량은 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 결정할 수 있다(예를 들어 문헌[Fingl, et al., The Pharmacological Basis of Therapeutics, Goodman and Gilman, eds. Macmillan Publishing Co, New York, pp. 1-46 (1975)] 참조). 본 발명에 따라 사용하기 위한 약학 조성물은 생체 내 투여 전에, 표적 분자(예를 들어, 항체, 호르몬, 성장 인자 등)에 결합되고, 및/또는 리포솜, 마이크로캡슐 및 서방형 제제에 포함된, 약리학적으로 허용가능한 액체, 고체 또는 반고체 캐리어로 상기 기술된 융합 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들어, 상기 약리학적 조성물은 융합 폴리펩티드를 수용액, 예컨대 살균수, 염수, 인산 완충제 또는 덱스트로스 용액으로 포함할 수 있다. 대안적으로, 상기 활성제는 상기 치료를 필요로 하는 환자에 이식될 수 있는 고체(예를 들어, 왁스) 또는 반고체(예를 들어, 젤라틴) 제제에 포함될 수 있다. 상기 투여 경로는 당업자에게 공지된 임의의 투여 방식, 예컨대 비한정적으로 정맥내, 척추강내, 피하, 자궁내, 관련 조직 내 주사, 동맥내, 비강내, 경구 또는 이식 장치의 방식일 수 있다.

투여로써 몸 전체에 걸쳐 또는 국부 영역에 본 발명의 활성제를 전달할 수 있다. 예를 들어, 신경계의 먼 영역을 포함하는 일부 병태에서, 정맥내 또는 척추강내 제제 투여가 바람직할 수 있다. 일부 경우에서, 활성제를 포함하는 이식은 병변 영역 또는 그 근처에 설치할 수 있다. 적합한 이식으로는, 비한정적으로 젤폼(gelfoam), 왁스, 스프레이 또는 마이크로입자 기초의 이식을 들 수 있다.

본 발명은 또한 약리학적으로 허용가능한 비히클에 본 원에서 기술된 융합 폴리펩티드를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 전신 또는 국부로 투여할 수 있다. 당업계에 공지된 임의의 적합한 투여 방식, 예컨대 비한정적으로 정맥내, 척추강내, 동맥내, 비강내, 구강, 피하, 복강내, 또는 국부 주사 또는 수술 이식이 적용될 수 있다. 서방형 제제가 또한 제공된다.

유전자 치료

특정 실시양태에서, 유전자 치료에 의해 혈관 누출을 방지하고 치료적 혈관 발달을 위해, 키메라 TNF-α 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산을 투여한다. 유전자 치료는 발현되거나 발현가능한 핵산을 피험체에 투여하여 실시하는 치료법을 의미한다. 본 발명의 이러한 실시양태에서, 상기 핵산은 치료적 효과를 조정하는 이의 인코딩된 단백질을 생성한다.

당업계에서 가능한 유전자 치료를 위한 임의의 방법은 본 발명에 따라 적용될 수 있다. 예시적 방법이 하기 기술된다.

유전자 치료 방법의 일반적인 검토를 위해, 문헌[Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 12:488-505 (1993); Wu and Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993); 및 Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217 (1993); May, TIBTECH 11(5): 155-215 (1993)]을 참조할 수 있다. 이용될 수 있는, 재조합 DNA 기술 업계에 일반적으로 공지된 방법이 문헌[Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons, NY (1993); 및 Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)]에 기술되어 있다.

바람직한 측면에서, 핵산 서열은 키메라-TNF-α 또는 TNFR2 폴리펩티드를 코팅할 수 있고, 상기 핵산 서열은 적당한 호스트에서 폴리펩티드를 발현하는 발현 벡터의 일부이다. 구체적으로, 이러한 핵산 서열은 폴리펩티드 코딩 영역에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 갖고, 상기 프로모터는 유도적이거나 구성적이고, 경우에 따라 조직 특이적이다. 또다른 특정 구체예에서, 핵산 분자는, 폴리펩티드 코팅 서열 및 임의의 다른 원하는 서열이 게놈 내 원하는 부위에서 상동성 재조합을 촉진하는 영역에 의해 측접되어 항체 코딩 핵산의 염색체내 발현을 제공하는 것으로 사용된다(Koller and Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935 (1989); Zijlstra et al., Nature 342:435-438 (1989)).

환자에게 핵산이 전달되는 것은 환자가 핵산 또는 핵산-보유 벡터에 직접 노출되는 직접적인 경우, 또는 세포가 우선 시험관 내에서 핵산에 의해 형질변환된 후, 환자에게 이식되는 간접적인 경우일 수 있다. 이러한 2가지 접근법은 각각 생체내 또는 생체외 유전자 요법으로서 공지된다.

특정 구체예에서, 핵산 서열은 생체 내에 직접 투여되고, 발현되어 코딩된 생성물을 생성한다. 이는 당업계에 공지된 수많은 방법 중 임의의 방법, 예를 들어 적절한 핵산 발현 벡터의 일부로서 이를 구성하여 투여하면, 예컨대 결함 또는 약독화된 레트로바이러스성 또는 기타 바이러스성 벡터를 사용하여 감염에 의해 또는 네이키드(naked) DNA의 직접 주입, 또는 지질 또는 세포 표면 수용체 또는 형질감염제에 의한 코팅, 리포솜, 마이크로입자에서 캡슐화, 또는 마이크로캡슐에 의해 이들은 세포 내에 존재시키는 방법에 의해, 또는 이를 연결하여 핵을 진입하는 것으로 공지된 펩티드로 투여하는 방법에 의해, 이를 연결하여 수용체 매개 엔도시토시스되기 쉬운 리간드로 투여하는 방법(예, 문헌[Wu and Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)] 참조)(수용체를 특이적으로 발현하는 표적 세포 유형에 사용될 수 있음) 등에 의해 실현될 수 있다. 또다른 구체예에서, 핵산-리간드 복합체는 리간드가 융해성 바이러스 펩티드를 포함하여 엔도좀을 파괴함으로써 핵산이 리소좀 분해를 막도록 형성될 수 있다. 또다른 구체예에서, 핵산은 특정 수용체를 표적화함으로써 세포 특이적 흡수 및 발현에 대해 생체 내에서 표적화될 수 있다. 대안적으로, 핵산은 세포 내에 도입될 수 있고 상동성 재조합에 의해 발현을 위한 호스트 세포 DNA 내에 혼입될 수 있다(Koller and Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935 (1989); Zijlstra et al, Nature 342:435-438 (1989)).

특정 구체예에서, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 함유하는 바이러스성 벡터가 사용된다. 유전자 요법에 사용되는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 환자로의 유전자 전달이 용이한 하나 이상의 벡터로 클로닝된다. 레트로바이러스성 벡터, 아데노바이러스성 벡터 및 아데노-관련 바이러스는 사용될 수 있는 바이러스성 벡터의 예이다. 레트로바이러스성 벡터는 바이러스 게놈의 올바른 패키징 및 호스트 세포 DNA로의 통합에 필요한 성분을 함유한다.

아데노바이러스는 가벼운 질병 유발하는 경우 호흡기 상피를 자연적으로 감염시키기 때문에 호흡기 상피로 유전자를 전달하는 데 특히 매력적인 비히클이다. 아데노바이러스를 기초로 한 전달계와 다른 표적은 간, 중추신경계, 내피 세포 및 근육이다. 아데노바이러스는 비증식 세포(non-dividing cell)를 감염시킬 수 있다는 장점을 갖는다. 또한, 아데노-관련 바이러스(AAV)는 또한 유전자 요법에 사용하도록 제안된 바 있다.

유전자 요법에 대한 또다른 접근법은 전기천공법, 지질감염(lipofection), 인산칼슘 매개 형질감염, 또는 바이러스성 감염과 같은 방법에 의해 조직 배양에서 유전자를 세포로 전달하는 것과 관련된다. 통상, 전이 방법은 선별가능한 마커의 세포로의 전달을 포함한다. 세포는 이후 선별 하에 놓여서 전달된 유전자를 흡수하고 발현하는 세포를 단리시킨다. 이러한 세포는 이후 환자에게 전달된다.

이 구체예에서, 핵산은 생성된 재조합 세포의 생체내 투여 전에 세포로 도입된다. 이러한 도입은 당업계에 공지된 임의의 방법, 비제한적 예로서 형질감염, 전기천공법, 마이크로주입, 핵산 서열을 함유한 바이러스 또는 박테리오파지 벡터에 의한 주입, 세포 융합, 염색체 매개 유전자 전달, 마이크로세포 매개 유전자 전달, 스페로플라스트 융합 등을 포함한 방법에 의해 수행될 수 있다. 외래 유전자의 세포로의 도입을 위한 수많은 기법들이 당업계에 공지되어 있으며 본 발명에 따라 사용될 수 있고, 단 수용자 세포의 필요한 발달 및 생리 기능은 파괴되지 않는다. 기법은 핵산의 세포로의 안정한 전달을 제공하여야 하므로, 핵산은 세포에 의해 발현 가능하고 바람직하게는 세포 자손에 의해 유전가능하여 발현가능한 것이다.

유전자 요법을 위해 핵산이 도입될 수 있는 세포는 임의의 바람직한 이용가능한 세포 유형을 포함하고, 비제한적인 예로서 상피 세포, 내피 세포, 케라틴세포, 섬유아세포, 근육 세포, 간세포; 혈액 세포, 예컨대 T-림프구, B-림프구, 단핵세포, 대식세포, 호중구, 호산구, 거핵구, 과립구; 각종 줄기 또는 전구 세포, 구체적으로는 조혈모 또는 전구 세포, 예컨대 골수, 제대혈, 말초 혈액, 태아 간 등으로부터 얻을 수 있는 것들을 포함한다.

바람직한 구체예에서, 유전자 요법에 사용되는 세포는 환자의 자가성(autologous)이다.

재조합 세포가 유전자 요법에 사용되는 구체예에서, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 세포 또는 이의 자손에 의해 발현가능하도록 세포로 도입되며, 재조합 세포는 이후 치료 효과를 위해 생체 내에 투여된다. 특정 구체예에서, 줄기 또는 전구 세포가 사용된다. 시험관 내에서 단리되고 유지될 수 있는 임의의 줄기 및/또는 전구 세포는 본 발명의 이러한 구체예에 따라 잠재적으로 사용될 수 있다.

특정 구체예에서, 유전자 요법을 위해 도입시키고자 하는 핵산은 코딩 영역에 작동 가능하게 연결된 유도성 프로모터를 포함하므로, 핵산의 발현은 적절한 전사의 유도인자의 존재 또는 부재를 제어함으로써 조절가능하다.

치료 조성물

일 구체예에서, 본 발명은 혈관 누출 또는 혈관 형성 결핍을 특징으로 하는 각종 질병에 대한 치료에 관한 것이다. 이러한 방식으로, 본 발명의 치료 화합물은 TNFR-2, VEGFR-2 및 VEGFR-1을 활성화하는 화합물을 제공함으로써 상기 질병을 앓고 있거나 앓기 쉬운 인간 환자에게 투여될 수 있다.

치료 화합물의 제형은 당업계에 일반적으로 공지되어 있으며 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., USA]에서 편리하게 참조할 수 있다. 예를 들면, 1일 체중 1 kg 당 약 0.05 ng?약 20 mg이 투여될 수 있다. 투여 계획은 최적의 치료 반응을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들면, 1일에 여러 분할 용량을 투여할 수 있거나 그 용량은 치료 상황의 요구(exigency)에 의해 제시되는 바와 같이 비례적으로 감소시킬 수 있다. 활성 화합물은 편리한 방식으로, 예컨대 경구, 정맥내(수용성), 근육내, 피하, 비내, 피내 또는 좌제 경로 또는 이식(예, 복강내 경로에 의해 서방형 분자를 사용하거나 또는 시험관 내에서 감작되고 수용자로 양자 전달되는 세포, 예컨대 단핵세포 또는 수지상 세포를 사용함)으로 투여될 수 있다. 투여 경로에 따라, 펩티드는 물질로 코팅되도록 요구되어 효소, 산 및 상기 성분을 불활성시킬 수 있는 기타 천연 조건의 작용으로부터 보호될 수 있다.

예를 들면, 펩티드의 낮은 친지질성은 펩티드 결합을 분해할 수 있는 효소에 의해 위장관에서 그리고 산 가수분해에 의해 위에서 파괴되도록 한다. 비경구 투여 이외의 투여에 의해 펩티드를 투여하기 위해, 불활성화를 막는 물질에 의해 코팅되거나 이 물질과 함께 투여된다. 예를 들면, 펩티드는 효소 억제제에 의해 또는 리포솜에서 보조 투여되는 보조제로 투여될 수 있다. 본원에서 고려되는 보조제는 레조르시놀, 비이온성 계면활성제, 예컨대 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르 및 n-헥사데실 폴리에틸렌 에테르를 포함한다. 효소 억제제는 췌장 트립신 억제제, 디이소프로필플루오로포스페이트(DEP) 및 트라실롤을 포함한다. 리포솜은 수중유중수 CGF 에멀션 뿐만 아니라 통상의 리포솜을 포함한다.

활성 화합물은 또한 경구적으로 또는 복강내로 투여될 수 있다. 분산액은 또한 글리세롤 액체 폴리에틸렌 글리콜, 및 이의 혼합물에서 그리고 오일에서 제조될 수도 있다. 저장 및 용도의 일반적인 조건 하에서, 이러한 제제는 보존제를 함유하여 미생물의 성장을 방지한다.

주입가능한 용도를 위해 적당한 약학 형태는 멸균 수용액(수용성) 또는 분산액, 및 멸균 주입가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제제용 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우에, 형태는 멸균성이어야 하고 용이한 주사능(syringability)이 존재하는 정도로 액체이어야 한다. 이는 제조 및 저장의 조건 하에 안정하여야 하며 미생물, 예컨대 박테리아 및 진균의 오염 작용으로부터 보호되어야 한다. 담체는, 예컨대 물, 에탄올, 폴리올(예, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이의 적당한 혼합물, 및 식물유를 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우 필요한 입도의 유지에 의해 그리고 계면활성제의 사용에 의해 적절한 유동성이 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 각종 항균제 및 진균제, 예컨대 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 유도될 수 있다. 많은 경우에, 등장제, 에컨대 당류 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직하다. 주입가능한 조성물의 장기간의 흡수는 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수를 지연하는 제제 조성물의 사용에 의해 유도될 수 있다.

원하는 양의 활성 화합물을 적절한 용매 중에 필요한 상기 열거된 다양한 다른 성분과 혼입한 후 무균 여과시켜 무균 주사액을 제조한다. 일반적으로, 다양한 무균 활성 성분을 상기 열거된 것으로부터 필요한 다른 성분 및 염기성 분산 매질을 포함하는 무균 비히클로 혼입하여 분산액을 제조한다. 무균 주사액의 제조를 위한 무균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 활성 성분 + 임의의 추가의 원하는 성분의 분말을 이의 상기 무균 여과된 용액으로부터 생성시키는 진공 건조 및 동결 건조 기술이다.

상기 기재된 바대로 펩티드를 적절하게 보호할 때, 활성 화합물을, 예를 들면, 불활성 희석제 또는 동화 가능한 식용 담체와 함께 경구로 투여할 수 있거나, 이것을 경질 또는 연질 쉘 젤라틴 캡슐 중에 동봉할 수 있거나, 이것을 정제로 압출할 수 있거나, 이것을 식이 음식과 직접 혼입할 수 있다. 경구 치료학적 투여의 경우, 활성 화합물을 부형제와 혼입할 수 있고 섭취 가능한 정제, 협측 정제, 트로키제, 캡슐, 엘릭시르제, 현탁액, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용한다. 이러한 조성물 및 제제는 활성 화합물을 1 중량％ 이상 포함해야 한다. 조성물 및 제제의 백분율은 물론 변할 수 있고, 단위의 약 5 내지 약 80％인 것이 편리할 수 있다. 이러한 치료학적으로 유용한 조성물의 활성 화합물의 양은 적합한 용량이 얻어지는 양이다. 경구 용량 단위 형태가 활성 화합물의 약 0.1 ㎍ 내지 2000 mg을 포함하도록 본 발명에 따른 바람직한 조성물 또는 제제를 제조한다.

정제, 환제, 캡슐 등은 또한 다음을 포함할 수 있다: 결합제, 예컨대 검 트라가칸스, 아카시아, 옥수수 전분 또는 젤라틴; 부형제, 예컨대 인산칼슘; 붕괴제, 예컨대 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산 등; 활택제, 예컨대 스테아르산 마그네슘; 및 감미제, 예컨대 수크로스, 락토스 또는 사카린을 첨가할 수 있거나, 향료, 예컨대 페퍼민트, 윈터그린 오일, 또는 체리 향료. 용량 단위 형태가 캡슐인 경우, 이것은, 상기 유형의 물질 이외에, 액체 담체를 포함할 수 있다. 다양한 다른 물질이 코팅제로서, 또는 달리 용량 단위의 물리적 형태를 변경하기 위해 존재할 수 있다. 예를 들면, 정제, 환제 또는 캡슐을 쉘락, 당 또는 둘 다로 코팅할 수 있다. 시럽 또는 엘릭시르제는 활성 화합물, 감미제로서의 수크로스, 보존제로서의 메틸 및 프로필파라벤, 염료 및 항료, 에컨대 체리 또는 오렌지 향료를 포함할 수 있다. 물론, 임의의 용량 단위 형태를 제조하는 데 있어서 사용되는 임의의 물질은 약제학적으로 순수해야 하고 실질적으로 이용되는 양에서 비독성을 나타내야 한다. 또한, 활성 화합물을 서방 제제 및 제형에 혼입할 수 있다.

전달 시스템

리포솜, 마이크로입자, 마이크로캡슐에서의 캡슐화, 화합물을 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체 매개 엔도시토시스, 레트로바이러스 또는 다른 벡터의 일부로서 핵산의 구축 등과 같은 다양한 전달 시스템이 공지되어 있고 본 발명의 화합물을 투여하기 위해 사용할 수 있다. 도입 방법은 진피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 경피, 비강, 경막외 및 경구 투여를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 화합물 또는 조성물을 임의의 편리한 경로에 의해, 예를 들면 점적 또는 볼루스 주사에 의해, 상피 또는 점액피부 내벽(예를 들면, 경구 점막, 직장 및 소장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여할 수 있고 다른 생물학적 활성 물질과 함께 투여할 수 있다. 투여는 전신 또는 국소일 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 화합물 또는 조성물을 심실내 및 척추강내 주사를 비롯한 임의의 적합한 경로에 의해 중추 신경계로 도입하는 것이 바람직할 수 있고; 심실내 주사는 예를 들면, 옴마야 리저버(Ommaya reservoir)와 같은 리저버에 부착된 심실내 카테터에 의해 수월하게 할 수 있다. 예를 들면, 흡입기 또는 분무기, 및 에어로졸화제와의 제제의 사용에 의해 폐 투여를 또한 이용할 수 있다.

특정한 실시양태에서, 본 발명의 약학 화합물 또는 조성물을 치료를 필요로 하는 구역에 국소로 투여하는 것이 바람직할 수 있고; 이것은 주사에 의해, 카테터에 의해, 좌제에 의해, 또는 임플란트에 의해, 예를 들면 수술 후의 상처 드레싱과 조합하여, 수술 동안의 국소 점적, 국소 용도에 의해 성취될 수 있지만, 어떠한 방식으로든 제한되지 않고, 상기 임플란트는 막, 예컨대 시알라스틱 막(sialastic membrane), 또는 섬유를 비롯한 다공성, 비다공성 또는 교질 물질이다. 바람직하게는, 본 발명의 항체 또는 펩티드를 비롯한 단백질을 투여할 때, 단백질이 흡수하지 않는 물질을 사용하도록 주의를 기울여야 한다. 다른 실시양태에서, 화합물 또는 조성물을 소포, 특히 리포솜 중에 전달해야 한다. 또 다른 실시양태에서, 화합물 또는 조성물을 제어 방출 시스템으로 전달할 수 있다. 일 실시양태에서, 펌프를 사용할 수 있다. 다른 실시양태에서, 중합체 물질을 사용할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 제어 방출 시스템을 치료 표적 근처에 배치할 수 있고, 따라서 전신 용량의 오직 적은 비율만을 요한다.

라벨

적합한 효소 라벨은, 예를 들면, 물질과 반응하여 과산화수소의 생성을 촉매하는 옥시다제 군으로부터 얻은 라벨을 들 수 있다. 글루코스 옥시다제는 우수한 안정성을 갖고 이의 기질(글루코스)이 용이하게 구입 가능하므로 특히 바람직하다. 효소 라벨링된 항체/기질 반응에 의해 형성된 과산화수소의 농도를 측정하므로써 옥사다제 라벨의 활성을 평가할 수 있다. 효소 이외에, 다른 적합한 라벨로는 방사선 동위원소, 예컨대 요오드(¹²⁵I, ¹²¹I), 탄소(¹⁴C), 황(³⁵S), 삼중수소(³H), 인듐(¹¹²In), 및 테크네튬(^99mTC), 및 형광 라벨, 예컨대 플루오레세인 및 로다민 및 비오틴을 들 수 있다.

본 발명의 키메라-TNF-α, TNFR-2 또는 키메라 TNF-α/TNFR-2 복합체 특이적 항체에 대한 추가의 적합한 라벨이 하기 제공된다. 적합한 효소 라벨의 예로는 말레이트 디하이드로게나제, δ-5-스테로이드 아이소머라제, 효모-알콜 디하이드로게나제, α-글리세롤 포스페이트 디하이드로게나제, 트리오스 포스페이트 아이소머라제, 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제, 아스파라기나제, 글르코스 옥시다제, β-갈락토시다제, 리보뉴클라제, 우레아제, 카탈라제, 글루코스-6-포스페이트 디하이드로게나제, 글루코아밀라제 및 아세틸콜린 에스테라제를 들 수 있다.

적합한 방사선 동위원소 라벨의 예로는 ³H, ¹¹¹In, ¹²⁵I, ¹³¹I, ³²P, ³⁵S, ¹⁴C, ⁵¹Cr, ⁵⁷To, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁷⁵Se, ¹⁵²Eu, ⁹⁰Y, ⁶⁷Cu, ²¹⁷Ci, ²¹¹At, ²¹²Pb, ⁴⁷Sc, ¹⁰⁹Pd 등을 들 수 있다. ¹¹¹In은 간에 의한 ¹²⁵I 또는 ¹³¹I 라벨링된 폴리펩티드의 탈할로겐화의 문제점을 회피하므로 생체내 영상화에 사용되는 바람직한 동위원소이다. 또한, 이 방사성 핵종은 영상화에 더 바람직한 감마 방출 에너지를 갖는다. 예를 들면, 1-(P-이소티오시아네이토벤질)-DPTA와 단일클론 항체에 커플링된 ¹¹¹In은 비종양 조직, 특히 간에서 적은 흡수를 나타내고, 따라서 종양 국소화의 특수함을 개선한다.

적합한 비방사선 활성 동위원소 라벨의 예로는 ¹⁵⁷Gd, ⁵⁵Mn, ¹⁶²Dy, ⁵²Tr 및 ⁵⁶Fe를 들 수 있다.

적합한 형광 라벨의 예로는 ¹⁵²Eu 라벨, 플루오레세인 라벨, 이소티오시아네이트 라벨, 로다민 라벨, 피로에리트린 라벨, 피코시아닌 라벨, 알로피코시아닌 라벨, o-프탈알데하이드 라벨 및 플루오레스카민 라벨을 들 수 있다.

적합한 독소 라벨의 예로는 슈도마나스 독소, 디프테리아 독소, 리신 및 콜레라 독소를 들 수 있다.

화학발광 라벨의 예로는 루미날 라벨, 이소루미날 라벨, 방향족 아크리디늄 에스테르 라벨, 이미다졸 라벨, 아크리디늄염 라벨, 옥살레이트 에스테르 라벨, 루시페린 라벨, 루시퍼라제 라벨 및 에쿼린 라벨을 들 수 있다.

핵 자기 공명 조영제의 예로는 중금속 핵, 예컨대 Gd, Mn 및 철을 들 수 있다. 중수소를 또한 사용할 수 있다. EPR, PET 또는 당업자에게 공지된 다른 영상화 메커니즘에 대해 다른 조영제가 또한 존재한다.

상기 기재된 라벨을 폴리펩티드에 결합시키기 위한 통상적인 기술은 Kennedy 등(Clin. Chim. Acta 70:1-31 1976) 및 Schurs 등(Clin. Chim. Acta 81: 1-40, 1977)에 의해 제공된다. 커플링 기술로는 글루타르알데하이드 방법, 페리오데이드 방법, 디말레이미드 방법을 들 수 있다. m-말레이미도벤질-N-하이드록시-숙신이미드 에스테르 방법을 들 수 있고, 이들 방법 모두 본원에 참조문헌으로 포함된다.

바이오칩 및 바이오센서 기술을 이용하는 키메라-TNF-α, TNFR-2 또는 키메라 TNF-α/TNFR-2 복합체를 검출하기 위해 본 발명의 폴리펩티드 및 항체, 및 이의 단편을 사용할 수 있다. 본 발명의 바이오칩 및 바이오센서는 키메라 TNF-α/TNFR-2 복합체를 특이적으로 인식하는 항체를 검출하는 본 발명의 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 본 발명의 바이오칩 및 바이오센서는 또한 키메라 TNF-α/TNFR-2 복합체를 검출하기 위해 본 발명의 폴리펩티드를 특이적으로 인식하는 항체를 포함할 수 있다.

본 발명은 본원에 기재된 구체적인 실시양태에 의해 이의 범위가 제한되지 않는다. 실제로, 본원에 기재된 것 이외의 본 발명의 다양한 변형이 상기 설명 및 동반된 도면으로부터 당업자에게 명확할 것이다. 이러한 변형은 특허청구범위 내에 해당하도록 포함되도록 의도된다. 다음의 실시예는 본 발명의 제한의 방식이 아니라 본 발명의 예시의 방식에 의해 제공된다.

실시예

실시예 1 - 재조합 V알파 단백질의 유전자 제작 및 발현

인간 TNFR2의 시스테인 풍부 도메인, 인간 VEGFR1의 Ig-유사 도메인 및 인간 IgG의 Fc 도메인을 포함하는 융합 단백질 'V알파'를 코딩하는 유전자 구성체(도 3)를 pCMV-dhfr 벡터(Hwang SJ, et al., Protein Express Purif. 2005;39: 175-183)에 클로닝하였다.

재조합 단백질, V알파, TNFR2-Fc, VEGFR3-Fc 및 Tie2-Fc의 단백질 농도는 웨스턴 블랏 분석을 통해 비교하였다(도 4). 제조사의 설명서에 따라 Effectene liposomal transfection(Qiagen, Inc.)을 이용하여 인간 배아 신장 293(HEK293) 세포(American Type Culture Collection)를 V알파, TNFR2-Fc, VEGFR3-Fc, 또는 Tie2-Fc를 코딩하는 CMV 프로모터 구동성 구성체로 형질감염시켰다. 형질감염 후 48시간에 형질감염된 세포로부터의 상등액을 회수하였다. 재조합 단백질을 20 ㎕의 단백질-A 세파로스 비드를 부가하여 1 mL 상등액에서 면역침전시킨 후 1 mL PBS로 2회 세척하였다. 각각의 샘플을 샘플 완충액과 혼합하고, 10분간 가열 변성시키고, 10％ SDS-PAGE 겔 상에서 러닝시킨 후, 니트로셀룰로스막 상에 전기블랏팅하였다. 이 막을 0.05％ Triton X-100을 함유하는 Tris-완충 용액(50 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7.5) 중 5％ 탈지유로 블로킹하고 홀스래디쉬-퍼옥시다제(HRP)-접합된 염소 항인간 Fc 항체(1:10,000 희석; Sigma-Aldrich A0170)로 웨스턴 블랏하여 Fc-융합된 단백질을 검출하였다. 신호는 화학발광 스캐너(LAS-1000, Fuji Film, Tokyo)를 이용하여 제조사의 프로토콜(Amersham Pharmacia Biotech)에 따라 화학발광 검출을 통해 가시화하였다(도 4).

실시예 2 - CHO 세포를 이용한 V알파 단백질의 대량 생산 및 V알파 단백질의 등전점전기영동

V알파를 발현하는 재조합 중국 햄스터 난소(rCHO) 세포를 이전에 기술된 방법에 따라 확립하였다(Hwang SJ. et al., Protein Express Purif. 39:175-183; 2005). 간략하게, CHO-Val 세포는 디히드로폴레이트 리덕타제(dhfr) 및 V알파 유전자를 포함하는 벡터를 dhfr-결핍 CHO 세포(CRL-9096, American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, USA)에 형질감염시켜 제작하였다. 이후 dhfr/메토트렉세이트(MTX)-매개 유전자 증폭을 후속하였다. V알파를 분비하는 3종의 안정한 rCHO 세포는 일련의 증폭 농도의 MTX(20-320 nM, Sigma-Aldrich)를 이용하여 선별하였다. 그중에서, 최고량의 V알파를 발현하는 세포주 한종을 선택하고 "CHO-Val"이라 명명하였다. CHO-Val 세포를 5％ 투석된 태아 소혈청(Invitrogen, Carlsbad, California, USA) 및 20 nM MTX(Sigma- Aldrich)가 보충된 Iscove의 변형 둘베코 배지에서 성장 및 유지시켰다. 재조합 V알파 단백질의 생성을 위해, CHO-Val 세포를 37℃에 가습된 5％ CO₂ 항온배양기 중에 110 rpm의 오비탈 진탕기(Vision, Bucheon, Korea) 상에서 100 mL의 배지를 함유하는 250 mL 엘렌메이어 플라스크에 2 x 10⁵ 세포/mL로 접종하였다. 지정된 날 이후, V알파 재조합 단백질은 단백질-A 세파로스 친화성 크로마토그래피, 산 용리 및 후속 중성화를 통해 정제하였다. 정제 후, 단백질은 브래드포드 분석법을 이용해 정량하였고, SDS-PAGE 겔의 쿠마시블루 염색을 통해 검증하였다(도 5A 및 도 5B). 이 분석 결과는 대략 20 mg/L의 V알파가 "CHO-Val"로부터 회수되었음을 보여주었다. 재조합 V알파 단백질은 환원 조건 하에서 ?65 kD으로 이동하였고, 비환원 조건 하에서는 ?130 kD으로 이동하였다(도 5A).

20 ㎍의 V알파 단백질을 IsoGel 아가로스 IEF 플레이트 pH 3-10 스트립(Cambrex)에 적재하고 애노드에 1 M 인산 및 캐쏘드에 1 M 수산화나트륨을 이용하여 3시간 동안 50 mA의 일정 전류에서 러닝하였다(도 5C). 겔을 쿠마시 블루로 염색하였다(도 5C).

실시예 3 - V알파 단백질의 시험관내 결합능

VEGF-A 또는 TNF-α에 대한 V알파 재조합 단백질의 결합능은 효소-연결된 면 역흡착 분석법(ELISA)을 통해 측정하였다(도 6 및 도 7). 100 ㎕ 중 인산 완충 염수(PBS) 중 200 나노그램의 VEGF-A₁₆₅(CHO 세포로부터 생성)(이하 VEGF-A라 함), TNF-α(R＆D Cat＃210-TA/CF), 또는 항-hlgG Fc 특이적 항체(Abeam Cat＃ AB 1927)를 96웰 평판에 분취하고 밤새 4℃에서 항온반응시켰다. 모든 Fc 융합 단백질은 VEGF-A 또는 TNF-α 결합 ELISA 이전에 Fc 검출 ELISA 방법(도 8)을 이용하여 정규화하였다. 평판을 3회 각각 400 ㎕의 PBS로 세척한 후, 2시간 동안 37℃에서 블로킹 용액(100 ㎕ PBS 중 1％ BSA)을 이용해 블로킹을 실시하였다. 100 ㎕ 블로킹 용액 중 각각의 Fc 융합 단백질 예컨대 V알파, TNFR2-Fc(에타르네르셉트라고도 알려짐, 미국 특허 5447851), VEGF-트랩(Holash J. et al, Proc. Natl. Acad. ScL U. S. A 99: 11393- 11398, 2002; Jeon BH. et al., Cancer Research 68: 1100-1109, 2008)을 평판에 부가한 후, 37℃에서 2시간 동안 항온반응시켰다. 평판을 3회 각각 400 ㎕의 PBS로 세척한 후, 50 ㎕의 홀스래디쉬-퍼옥시다제(HRP)-접합된 염소 항인간 Fc 항체(1:10,000 희석; Sigma-Aldrich AO 170)를 평판에 부가하고 37℃에서 2시간 동안 항온반응시켰다. 3회 각각 400 ㎕의 PBS로 세척한 후, 50 ㎕의 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB) 용액(Sigma-Aldrich T0440)을 평판에 부가하고, 실온에서 10분간 항온반응시켰다. 반응은 50 ㎕의 1 M HCl을 부가하여 중지시키고 반응성 색상을 ELISA 판독기(BioRad M680)를 이용하여 광학 밀도 415 nm에서 분석하였다.

ELISA 분석결과는 V알파 및 VEGF-트랩이 VEGF-A에 결합할 수 있는 한편, V알파 및 TNFR2-Fc는 TNF-α에 결합할 수 있음을 보여주었다(도 9). 예를 들어, V알파는 VEGF-A 및 TNF-α에 동시에 결합할 수 있다(도 10 및 도 11).

실시예 4 - V알파의 VEGF-A 및 TNF-α에 대한 시험관 내 동시 결합

V알파 재조합 단백질이 VEGF 및 TNF-α에 동시에 결합할 수 있는지 여부를 조사하기 위해, 새로운 ELISA 방법을 고안하였다(도 10). 100 ㎕의 PBS 중 200 나노그램의 TNF-α(R＆D Cat＃210-TA/CF) 또는 BSA(음성 대조군)를 96웰 평판에 분취하고 밤새 4℃에서 항온반응하였다. 평판을 3회 각각 400 ㎕의 PBS로 세척한 후, 블로킹 용액(100 ㎕ PBS 중 1％ BSA)을 이용해 37℃에서 2시간 동안 블로킹을 실시하였다. 100 ㎕의 블로킹 용액 중 각각의 Fc 융합 단백질 예컨대 V알파, TNFR2-Fc, VEGF-트랩을 평판에 부가하고 37℃에서 2시간 동안 항온반응하였다. 평판을 3회 각각 400 ㎕의 PBS로 세척한 후, 블로킹 용액 중 1 ng/mL의 VEGF-A를 부가하였는데, 이는 그 아미노 말단에 FLAG 태그를 갖는다. 평판을 3회 각각 400 ㎕의 PBS로 세척한 후, 50 ㎕의 홀스래디쉬-퍼옥시다제(HRP)-접합된 항-Flag M2 항체(1:10,000 희석; Sigma-Aldrich A8592)를 평판에 부가하고, 37℃에서 2 시간 동안 항온반응시켰다. 평판을 3회 각각 400 ㎕의 PBS로 세척한 후, 50 ㎕의 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB) 용액(Sigma-Aldrich T0440)을 평판에 부가하고, 실온에서 10분간 항온반응시켰다. 반응은 50 ㎕의 1 M HCl을 부가하여 중지시켰고, 반응성 색상은 광학 밀도 415 nm에서 ELISA 판독기(BioRad M680)를 통해 분석하였다(도 10).

광학 신호는 V알파를 TNF-α와 항온반응시켰을때만 용량 의존적 방식으로 증가하였고, 반면 TNF-α 코팅과 항온반응시킨 VEGF-트랩 또는 BAS 코팅과 항온반응시킨 V알파는 어떠한 광학 신호도 변화시키지 않았다(도 11). 이들 결과는 평판에 고정된 TNF-α 단백질에 의해 포획된 V알파 재조합 단백질이 가용성 FLAG-태깅된 VEGF-A에 결합할 수 있음을 의미한다.

이러한 결과는 V알파 재조합 단백질이 VEGF-A 및 TNF-α에 동시에 결합할 수 있는 반면, VEGF-트랩은 VEGF-A에만 결합할 수 있고 ENBREL？(TNFR2-Fc)은 TNF-α에만 결합할 수 있음을 의미한다(도 12).

실시예 5 - V알파와 VEGF-A 또는 TNF-α 간의 상호작용 분석

V알파와 VEGF-A 또는 TNF-α의 결합을 BIAcore 3000(BIAcore AB)을 이용해 분석하였다. 1 마이크로그램의 VEGF-A 또는 TNF-α를 센서칩 CM5(BIAcore) 상에 N-히드록시숙신이미드(NHS) 및 1-에틸-3(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드(EDC)아민 커플링 시약을 이용하여 대략 2,000 공명 단위(RU)로 고정시켰다. 대조군으로서, BSA 단백질을 동일 칩의 다른 부분 상에 고정시켰다. 이어서 재조합 V알파, VEGF-트랩, 또는 ENBREL？ 단백질을 고정된 VEGF-A 또는 TNF-α 표면 상에 가하고, 포획된 양을 RU로서 센서그램에 기록하였다(도 13). 벌크 효과를 최소화하기 위해 모든 샘플은 러닝 완충액에 존재시켰다. 결합 상호작용의 동역학 매개변수는 BIAEVALUATION 소프트웨어(BIAcore)를 이용하여 비선형 곡선 적합화를 통해 센서그램으로부터 산출하였다(도 13).

실시예 6 - 시험관내 스크래치 분석법을 이용한 VEGF-유도된 내피 세포 이동성에 대한 V알파의 효과

VEGF에 대한 V알파의 억제 활성을 조사하기 위해, "인간 제대혈 내피세포(HUVEC)의 시험관내 스크래치 분석법"을 테스트하였다(도 14). HUVEC을 포화상태까지 배양하고 멸균된 블루 팁(1,000 ㎕)을 이용해 스크래치하였다. 떨어진 세포를 제거하고 디쉬를 지정한 단백질로 24시간 동안 처리하였다. VEGF-A의 최종 농도는 50 ng/mL이었고, 한편 TNFR2-Fc, V알파, 및 VEGF-트랩의 최종 농도는 2 ㎍/mL이었다. VEGF-A 및 각각의 억제 단백질을 처리한 후 0시 및 24시에 사진 영상을 찍었다(도 14).

24시간 후, PBS 처리된 HUVEC은 경계선으로부터 출발한 어떠한 유의한 이동성도 보이지 않았지만, VEGF(50 ng/mL)로 처리된 HUVEC은 유의한 세포 이동성을 보였다(도 14). VEGF-A 처리에 의해 유도된 세포 이동 활성은 V알파 또는 VEGF-트랩에 의해 억제되었지만, TNFR2-Fc 단백질에 의해서는 억제되지 않았고(도 14), 이러한 결과는 V알파 및 VEGF-트랩이 VEGF-유도된 세포 이동에 대해 억제 효과를 갖는다는 것을 의미한다.

실시예 7 - TNF-α-유도된 세포독성에 대한 V알파의 효과

TNF-α-유도된 생물학적 작용에 있어서의 V알파의 억제 효과를 시험하기 위해서, L929 뮤린 섬유육종 세포에 대한 TNF-α-유도된 세포독성을 시험하였다(도 15). L929 세포를 컨플루언스로 배양하고 24 시간 동안 제시된 단백질로 처리하였다. TNF-α의 최종 농도는 1.0 ng/ml인 반면, TNFR2-Fc, V알파, 및 VEGF-트랩의 최종 농도는 1 μg/ml이었다. 액티노마이신-D(AMD)의 최종 농도는 2 μg/ml이다. TNF-α 및 각 억제 단백질로 처리한지 24 시간 후에 위상차 현미경을 이용한 사진을 촬영하였다(도 15).

24 시간 후에, 대조군 L929 세포는 건강한 반면에, TNF-α-처리된 세포는 부분적으로 손상되고 부유되었다(도 15). 비교하여, TNF-α+ AMD-처리된 세포 및 TNF-α+AMD+Fc-처리된 세포는 거의 완전히 손상된 반면에, TNF-α + AMD + TNFR2-Fc-처리된 세포 및 TNF-α+ AMD + V알파-처리된 세포는 전혀 손상되지 않았는데(도 15), 이는 V알파가 L929 뮤린 섬유육종 세포에서의 TNF-α-유도된 세포독성에 대한 강한 억제 효과를 발휘함을 나타내는 것이다.

TNF-α 유도된 세포독성 L929 뮤린 섬유육종 세포에 대한 V알파의 억제 효과의 정량적 분석을 위해서, MTT 분석을 실시하였다(도 16). L929 세포를 5％ 혈청을 함유하는 DMEM 중에서 96웰 플레이트에서 5 x 10⁵ 세포/웰로 접종하였다. 한 레인은 세포 없이 남겨두었으며, 이 레인을 최소 흡광도에 대한 대조군으로서 이용하였다. 37℃, 5％ CO₂ 하의 가습 항온기에서 플레이트를 밤새 항온처리하였다. 과잉 세포 성장을 억제하기 위해 액티노마이신 D 2 μg/ml와 2％ 혈청을 함유하는 DMEM으로 배지를 교체하였다. 이 플레이트를 2개의 군으로 나누었는데, 하나는 TNF-α 처리된 군이고, 다른 하나는 TNF-α(5 ng/ml)-이고 지정된 재조합 단백질의 지정량-처리된 군이다. 연속 희석된 TNF-α(10 ng/ml에서부터 0.0005 ng/ml)를 세포와 함께 항온처리하였다(도 16A).

MTT 분석을 위해, 배양 배지를 버리고 플레이트를 PBS로 세척한 다음 각 웰에 MTT 시약 10 ㎕를 첨가하고, 4 시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. 세척 후에, 0.2％ HCl 70 ㎕를 이소프로판올 용액에 첨가하여 포르마잔 결정을 용해시켰다. ELISA 판독기(BioRad M680)로 광학 밀도 550 nm에서 반응성 색상을 분석하고, "생존율 = (샘플의 평균 흡광도)/(대조군의 평균 흡광도) x 100"을 이용하여 생존율을 계산하였다(도 16).

MTT 분석 결과, 농도 의존적 방식으로 세포가 TNF-α에 의해 손상되며, TNF-α의 LD50은 ?0.01 ng/ml임이 밝혀졌다(도 16A). 재조합 단백질, V알파, ENBREL^？, REMICADE^？, 및 VEGF-트랩의 연속 희석된(5-300 ng/ml) 농도는 TNF-α(5 ng/ml)-유도된 세포 독성을 차등 억제하였다. V알파의 IC50(평균 ± SE, n=4)은 51 ± 2.7, ENBREL^？의 IC50은 35 ± 2.3, REMICADE^？의 IC50은 101 ± 4.6, VEGF-트랩의 IC50은 범위 밖이었다(도 16B).

실시예 8 - NF-κB 활성에 대한 V알파의 영향

TNF-α는 NF-κB의 한 서브유닛인 p65의 인산화를 유도하며, 또한 이 인산화된 p65는 TNF-α 반응성 세포에서 세포질로부터 핵으로 전좌된다. 인간 림프 내피 세포(hLEC)의 TNF-α-유도된 NF-κB 활성화에 대한 V알파의 억제 효과를 조사하기 위해서, hLEC를 24웰 플레이트 내의 젤라틴 코팅된 무균 글래스 커버슬립에 접종하고 컨플루언스로 배양하였다. 그 다음, 대조군, 리포다당류(LPS, 500 ng/ml), TNF-α(1 ng/ml), 또는 TNF-α(1 ng/ml) + V알파(1 μg/ml)를 30분 동안 배양된 hLEC에 처리하여, 세포에서의 NF-κB의 핵 전좌를 면역형광 염색으로 조사하였다(도 17).

p65의 면역형광 염색을 위해서, 4℃에서 30분 동안 4％ 파라포름알데히드로 세포를 고정한 다음, 세포를 PBS로 세척하고 30분 동안 4℃에서 0.05％의 트리톤 X-100(PBS-T)을 함유하는 PBS로 투과시키고, 이어서 PBS로 세척하였다. 차단을 위해서, 5％ 당나귀 혈청 200 ㎕를 실온에서 1 시간 동안 각 웰에 첨가하였다. 그 다음 토끼 항-인간 NF-κB p65 항체(1:100 희석; Santa Cruz, Cat＃ SC-109)를 실온에서 밤새 세포와 함께 항온처리하였다. 1차 항체의 항온처리 후에, 세포를 PBS로 세척한 다음 당나귀 항-토끼 FITC 항체(1:200 희석; Jackson ImmunoResearch)와 함께 실온에서 2 시간 동안 항온처리하였다. 핵 염색을 위해서, 세포를 DAPI(1:1000; Invitrogen)와 함께 실온에서 10분 동안 항온처리하였다(도 17).

p65 분석의 면역형광 염색 결과 V알파는 hLEC에서 TNF-α-유도된 NF-κB 활성화를 강하게 억제하는 것으로 밝혀졌다(도 17).

실시예 9 - 망막병증에 대한 V알파의 영향

망막에서의 혈관 누수 및 부종을 수반하는 비정상적인 안구 혈관형성이 당뇨병성 망막병증 및 노인성 황반 변성의 주요 원인이다. 비정상적인 안구 혈관형성을 갖는 마우스 모델은, 과산소 대기 중에 신생 마우스를 노출시켜 형성할 수 있는, 즉 "미숙아 망막병증(ROP)" 또는 "산소-유도된 망막병증(OIR)" 모델이다(도 18). ROP를 C57/BL6 야생형 마우스에 도입하였다. 신생 마우스 및 이의 수유중인 어미를 출생후 7일(P7)과 P12 사이에 75％ 산소(사용된 PRO-OX 110 챔버 산소 조절기)에 노출시켰다. 이 절차는 망막 중심의 모세혈관상에서의 혈관 발생의 중단 및 혈관제거를 유발한다. P12에 동물을 산소 정상상태 실내 공기 조건으로 복귀시키면 망막 중심이 허혈 및 저산소 상태가 되고, 이러한 절차는 망막앞 신생혈관을 초래한다. P12에, 마우스에게 각 단백질(대조군, VEGF-트랩, V알파; 각각 5 μg)을 안구내 주사하고, P17일에 희생시켰다.

혈관에 대한 면역조직화학 염색 및 망막의 전층 검사를 다음과 같이 실시하였다. 안구를 즉시 마우스로부터 떼어내고 4℃에서 밤새 1％ 파라포름알데히드(PFA)에 고정하였다. 망막을 PBS에서 분리하고, 5％ 당나귀 혈청(Jackson Immuno Research)을 함유하는 TBS(TBS-T) 중의 0.3％ Triton X-100을 이용하여 25℃에서 1시간 동안 차단하고, 4℃에서 밤새 비오틴-접합된 이소렉틴 B4(Molecular Probes), 토끼 항-NG2 항체(Millipore), 래트 항-F4/80 항체(eBioscience), 및 햄스터 항-CD31 항체(Millipore)로 염색하였다. TBS-T에서 6회 세척한 후에, 샘플을 Cy3-접합된 스트렙타비딘(BD Pharmingen), FITC-접합된 항-토끼 IgG 항체(Jackson Laboratory), Cy5-접합된 항-래트 IgG 항체(Jackson Laboratory), 및 Cy3-접합된 항-햄스터 IgG 항체(Jackson Laboratory)와 함께 25℃에서 4 시간 동안 항온처리하였다. TBS-T에서 6회 더 세척한 후에, 광수용기 측이 아래를 향하도록 하고 VECTASHIELD(Vector) 시약에 포매시킨 Superfrost/Plus 현미경 슬라이드(12-550-15, Fisher)에서 망막을 전층검사하였다.

망막병증의 전형적인 특징인 망막 혈관의 망막앞 혈관타래의 수가 대조군에서는 매우 증가하였지만, VEGF-트랩- 및 V알파-처리된 군에서는 현저히 감소하였다(도 19). 또한 혈관 사행성(tortuosity)은 대조군에서 매우 증가하였지만, VEGF-트랩- 및 V알파-처리된 군에서는 현저히 감소하였다(도 20). 정량 분석 결과, 망막 혈관에서의 신생혈관에 의해 유발된 ROP-유도된 망막앞 혈관타래 형성(백색 화살표 선단)은 VEGF-트랩 또는 V알파를 이용한 처리에 의해 유효하게 억제되었다(도 20B). 그러나, F4/80+ 대식세포의 수는 대조군과 비교하여 VEGF-트랩-처리된 군에서 유사한 반면, V알파-처리된 군에서는 그 수가 현저히 감소하였다. 대조군 및 VEGF-트랩-처리된 군에서의 남은 대식세포는 망막의 병리학적 염증 과정을 추가로 유도할 수 있다. ROP 망막으로의 ROP-유도된 F4/80+ 대식세포의 침윤 감소에 있어서 V알파의 효능이 VEGF-트랩보다 더 높았다. 이들 데이타는 V알파가 마우스에서 ROP를 치료하기 위해 VEGF-트랩보다 더욱 효과적이라는 것을 나타낸다. 이들 데이타는 V알파가 AMD 및 당뇨병성 망막병증 환자의 치료를 위해 더욱 효과적인 분자임을 시사하는 것이다.

실시예 10 - 콜라겐-유도된 관절염에 대한 V알파의 효과

염증성 혈관형성은 류마티스성 관절염(RA) 진행의 특징적이고 중요한 기여인자이다(Lainer-Carr and Brahn, 2007, Nature Clinical Practice Rhuematology 3:434-442). 따라서, 염증성 혈관형성의 억제는 RA의 진행 및 관절 파괴를 줄이는 효과적인 방법일 수 있다. RA의 실험 마우스 모델을 형성하기 위한 콜라겐-유도된 관절염(CIA)의 유도를 위해서, 수컷 DBA/1J 마우스를, 동량의 완전 프로인트 보강제 중에 유화시킨 우형 II 콜라겐을 꼬리 기부에서 피내 주사하여 면역화하였다. 3주 후에, 동일한 방식으로 마우스에게 면역학적으로 추가접종하였다. 제1 면역화한지 3주 후부터 18일 동안 주 2회 대조군, VEGF-트랩(25 mg/kg), ENBREL^？(25 mg/kg), 또는 V알파(25 mg/kg)를 피하 주사하여 CIA 마우스를 처리하였다. 하기의 체계를 이용하여 각 발에 대해 질병 경중을 임상적으로 점수화하였다: 등급 0, 종창 없음; 등급 1, 약간의 종창 및 홍반; 등급 2, 현저한 부종; 등급 3, 관절 경직(도 21). 변형 방사선촬영 영상을 이용하여 방사선촬영 분석을 실시하고, 무릎, 발목 및 족근중족 관절에서 점수를 측정하였다(도 22). VEGF-트랩, ENBREL^？, 및 V알파는 임상 점수와 방사선학 및 조직학적 비정상을 완화시켰지만, 대조군 완충액은 CIA의 질병 경중 및 관절 파괴에 있어서 어떠한 경감 효과도 나타내지 않았다. 따라서, V알파는 RA 환자를 치료하기 위한 유효 치료제이다.

본 발명은 본원에 개시된 특정 실시 양태들에 의해 그 범위가 제한되지 않는다. 실제로, 본원에 개시된 실시 양태들 외에 본 발명의 각종 변형예가 상기 설명 및 하기 도면으로부터 당업자에게는 자명할 것이다. 그러한 변형은 특허청구범위 내에 속하는 것이다. 다음 실시예들은 본 발명을 예시하기 위해 제공된 것이며, 제한하려는 것이 아니다.

Claims (20)

1. (b) 다량체화 성분에 작동 가능하게 연결된 (a) TNFR2 성분 및 VEGFR1 성분을 포함하는 VEGF 폴리펩티드 및 TNF 폴리펩티드에 동시에 결합할 수 있는 융합 폴리펩티드로서, 상기 TNFR2 성분은 TNFR2의 세포외 도메인의 시스테인 풍부 도메인 1, 시스테인 풍부 도메인 2, 시스테인 풍부 도메인 3, 또는 시스테인 풍부 도메인 4의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VEGFR1 성분은 VEGFR1의 세포외 도메인의 Ig 유사 도메인 2의 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 폴리펩티드.
2. 제1항에 있어서, TNFR2의 세포외 도메인의 시스테인 풍부 도메인 1, 시스테인 풍부 도메인 2, 시스테인 풍부 도메인 3, 또는 시스테인 풍부 도메인 4의 아미노산 서열은 VEGFR1의 세포외 도메인의 Ig 유사 도메인 2의 N 말단에 위치하는 것인 융합 폴리펩티드.
3. 제1항에 있어서, TNFR2의 세포외 도메인의 시스테인 풍부 도메인 1, 시스테인 풍부 도메인 2, 시스테인 풍부 도메인 3, 또는 시스테인 풍부 도메인 4의 아미노산 서열은 VEGFR1의 세포외 도메인의 Ig 유사 도메인 2의 C 말단에 위치하는 것인 융합 폴리펩티드.
4. 제1항에 있어서, 상기 다량체화 성분이 면역글로불린 도메인을 포함하는 것인 융합 폴리펩티드.
5. 제1항에 있어서, 면역글로불린 도메인이 IgG의 Fc 도메인, IgG의 중쇄 및 IgG의 경쇄로 구성된 군에서 선택되는 것인 융합 폴리펩티드.
6. 제1항에 있어서, 서열 번호 2 또는 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드.
7. 제1항에 있어서, 아세틸화 또는 PEG화에 의해 변형된 것인 융합 폴리펩티드.
8. 제1항의 융합 폴리펩티드 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
9. (b) 다량체화 성분을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 (a) TNFR2 성분 및 VEGFR1 성분을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, VEGF 폴리펩티드 및 TNF 폴리펩티드에 동시에 결합할 수 있는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 분자로서, 상기 TNFR2 성분은 TNFR2의 세포외 도메인의 시스테인 풍부 도메인 1, 시스테인 풍부 도메인 2, 시스테인 풍부 도메인 3, 또는 시스테인 풍부 도메인 4의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 VEGFR1 성분은 VEGFR1의 세포외 도메인의 Ig 유사 도메인 2의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 단리된 핵산 분자.
10. 제9항에 있어서, TNFR2의 세포외 도메인의 시스테인 풍부 도메인 1, 시스테인 풍부 도메인 2, 시스테인 풍부 도메인 3 및 시스테인 풍부 도메인 4를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 VEGFR1의 세포외 도메인의 Ig 유사 도메인 2를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 상류에 위치하는 것인 단리된 핵산 분자.
11. 제9항에 있어서, TNFR2의 세포외 도메인의 시스테인 풍부 도메인 1, 시스테인 풍부 도메인 2, 시스테인 풍부 도메인 3 및 시스테인 풍부 도메인 4를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 VEGFR1의 세포외 도메인의 Ig 유사 도메인 2을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 하류에 위치하는 것인 단리된 핵산 분자.
12. (a) 서열 번호 1 또는 (b) 서열 번호 3의 뉴클레오티드 서열, 또는 유전자 코드의 축퇴성으로 인해 (a) 또는 (b)의 뉴클레오티드 서열과 다르지만 그로부터 발현되는 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
13. 제9항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
14. 적절한 숙주 세포에서 융합 폴리펩티드를 제조하기 위한, 제13항의 발현 벡터를 포함하는 숙주-벡터 시스템.
15. 제14항의 숙주-벡터 시스템의 세포를, 융합 폴리펩티드가 제조될 수 있는 조건 하에 배양하는 단계 및 이렇게 제조된 융합 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는, 융합 폴리펩티드의 제조 방법.
16. 유효량의 제1항의 융합 폴리펩티드를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 VEGF 수용체 리간드 및 TNF 수용체 리간드 활성을 억제하는 방법.
17. 유효량의 제1항의 융합 폴리펩티드를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 혈장 누출을 감소시키거나 억제하는 방법.
18. 제16항에 있어서, VEGF 수용체 리간드 및 TNF 수용체 리간드 활성이 당뇨병성 및 노인성 황반 변성 망막병증, 류마티스성 관절염, 골관절염, 건선, 암, 경화증, 염증성 장 질환, 다낭 신장, 강직성 척추염, 크론병, 궤양성 대장염, 죽상동맥 경화증, 및 다른 급성 및 만성 염증을 유발하는 것인 방법.
19. 망막병증을 앓고 있는 피험체의 망막병증을 치료하는 방법으로서, 제1항의 융합 폴리펩티드를 상기 피험체에게 투여하는 것을 포함하는 치료 방법.
20. 류마티스성 관절염을 앓고 있는 피험체의 류마티스성 관절염을 치료하는 방법으로서, 제1항의 융합 폴리펩티드를 상기 피험체에게 투여하는 것을 포함하는 치료 방법.

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