KR101819135B1 - 당화 vegf 디코이 수용체 융합 단백질 - Google Patents

Abstract

본 출원은 VEGFR1 구성요소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, VEGF 폴리펩티드와 태반 성장인자(PlGF) 폴리펩티드에 동시에 결합할 수 있는 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 핵산분자에 관한 것이다.

Description

당화 VEGF 디코이 수용체 융합 단백질{Glycosylated VEGF Decoy Receptor Fusion Protein}

본 발명은 암 치료 또는 안질환 치료의 수단으로서 혈관 형성 억제에 사용되는 키메라 분자의 제작에 관한 것이다.

혈관내피성장인자-A(Vascular endothelial growth factor-A, VEGF-A)는 주로 이의 주된 수용체(primary receptor)인 VEGF 수용체 2(VEGFR2)의 활성화를 통하여 종양의 혈관신생을 조절하는 중요한 조절자이다(1,2). VEGF-A는 종양 진행의 매 단계(stage) 내내 대부분의 종양 세포와 이에 상응하는 간질 세포(stromal cells)에서 발현되는 반면, VEGFR2는 성장하는 종양 혈관에서 과발현되는데, 이는 구조적 및 기능적으로 기형인 종양 혈관의 형성을 초래한다(1,3). VEGF-A는 VEGFR2의 세포 외 영역의 두 번째 면역글로불린(Ig) 호모로지 도메인(D2)에 특이적으로 결합하여, 혈관신생을 유도하는 신호전달의 활성화를 초래한다(4). 지난 수십년간 암 환자에서 단일클론항체, 수용성 디코이 수용체 융합 단백질 및 소분자 억제제를 사용하여 이 VEGF-A/VEGFR2 신호전달경로를 타겟팅 하려는 시도가 많이 이루어졌다(5-8). 현재의 VEGF-A/VEGFR2 신호전달의 치료적 차단이 임상적 이점을 제공하였지만, 항암 효과는 그리 대단하지 않았고 일시적이었으며, 결국에는 대체적(alternative) 혈관신생을 유도하는 신호전달경로의 활성화 및 종양 관련 대식세포(tumor-associated macrophages, TAM)와 같은 혈관신생 유도성 세포의 추가 유입(recruitment)을 통한 내성 획득을 초래하였다(9-11). 이러한 한계점은 항-혈관신생 암 치료전략에서의 현재의 충족되지 않은 니즈에 집중시켜 주며, 이러한 니즈는 성공적인 치료제 개발을 위하여 반드시 해결되어야 한다.

많은 안질환 또한 비정상적인 혈관신생과 상향 조절된 VEGF와 관련되어 있다. 특히, 나이관련황반변성(age-related macular degeneration, AMD)은 선진국에서 가장 중요한 노인 실명 원인이고, 나이관련황반변성의 분류 중 삼출성 나이관련황반변성은 나이관련황반변성 실명 원인의 대부분을 차지한다. 삼출성 나이관련황반변성에서, 부르크막(Bruch's membrane)을 뚫고 맥락막 모세혈관에서 맥락막신생혈관(choroidal neovascularization, CNV)이 자라나며 맥락막신생혈관에서 기인한 출혈과 삼출물로 인하여 황반부의 시세포가 급격하게 손상되고 중심시력이 저하된다(12,13). 또한, 맥락막신생혈관은 병적 근시(pathologic myopia)와 안히스토플라스마종(ocular histoplasmosis)을 포함한 다양한 망막의 퇴행성 및 염증성 질환을 갖는 환자의 시력을 위협하는 주요 문제이다. 혈관신생은 일반적인 경우는 관상동맥 측부 형성(coronary collateral formation)과 상처 치료 과정과 같은 병적 상황에서 작동하는 신체의 보호 메커니즘이다(14). 그리고 이러한 메커니즘은 또한 저산소증(hypoxia)로 알려진 산소 불충분 상태에 의하여 촉발된다. 저산소 상태는 VEGF를 포함한 HIF(hypoxic inducible factors)를 자극하고, 이는 혈관신생에서 중요한 역할을 하게 된다. 또한, 고농도의 VEGF를 갖는 눈은 망막 혈관의 누출을 겪고, 뒤 이어 황반 부종이 발생한다. 그러므로, VEGF는 삼출성 나이관련황반변성, 당뇨망막병증, 맥락막신생혈관, 미숙아망막병증, 신생혈관녹내장, 망막혈관폐쇄, 및 당뇨망막병증 또는 망막정맥폐색에 합병한 황반부종과 같은 비정상적인 혈관신생 및 혈관 누출과 관련된 안질환의 치료적 표적이 된다(15,16).

VEGF-A는 VEGFR1과 VEGFR2 모두에 결합한다. VEGF-A에 대한 VEGFR1의 결합 친화도(< 10~20 pM)는 VEGFR2(< 100~125 pM)의 결합 친화도 보다 훨씬 우수하다(17). 또한, VEGFR1은 다른 혈관신생 유도성 리간드이자 최근에 항-혈관신생 치료의 대안적 표적으로 강조되고 있는 VEGF-B와 태반 성장인자(placental growth factor, PlGF)의 수용체이다(18-21). 다양한 혈관신생 유도성 리간드에 결합하는 VEGFR1의 능력 때문에, VEGFR1은 치료 목적을 위한 신규 디코이 수용체 융합 단백질 개발의 유망한 백본으로 여겨지고 있다. 그러나, IgG1의 Fc 영역과 융합된 VEGFR1의 첫 3개의 Ig 도메인(VEGFR1-Fc)으로 구성된 디코이 수용체 융합 단백질의 효능은 Ig 도메인 3(VEGFR1 D3)의 양전하를 띤 많은 잔기 및 이의 높은 등전점(pI)값에 의한 세포외 기질(ECM)에 대한 비특이적 결합 때문에 만족스럽지 못하였다(6). 그렇긴 하지만, 이 결과는 IgG1 Fc에 융합된 VEGFR1 D2와 VEGFR2 D3로 구성된 VEGF-Trap(Regeneron의 Aflibercept)의 발명에 영감을 주었다. VEGFR1 D3를 VEGFR2 D3로 변경하여, VEGF-Trap의 순 pI(net pI)는 감소되었고, 이는 VEGFR1-Fc에 비하여 더 적은 ECM 결합과 향상된 약물동태학적(PK) 프로파일을 초래하였다(6). 그러나, VEGFR2 D3를 VEGFR1 D3 대신 사용하였기 때문에, VEGF-A와 PlGF의 고친화성 결합은 저해되었다(22). 따라서, 지금 해결되어야할 중요한 이슈는 비특이적 ECM 결합을 최소화하면서, VEGFR1 D3를 디코이 수용체로 활용하는 방법이다.

당화는 특정 아스파라긴(N-연결 당화) 또는 세린/트레오닌(O-연결 당화) 잔기로의 당 사슬(carbohydrate chains)의 첨가를 초래하는 번역 후 변형이다. 분비된 막단백질들의 당화는 이들의 생화학적 및 생물학적 특성에 영향을 미친다. 이는 일반적으로 음전하를 제공하고, 용해성을 증가시키므로, ECM에 대한 비특이적 결합을 줄인다. 더욱이, 당화는 단백질 가수분해에 대한 저항성을 부여하고, 혈청 반감기를 늘림으로써 단백질의 PK 특성을 향상시킨다(23). Amgen의 Aranesp(erythropoietin) 및 Genentech의 Gazyva(obinutuzumab)와 같은 당 조작된(Glyco-engineered) 치료 단백질은 이러한 이점을 이용한 좋은 예이다.

여기서, 본 발명자들은 새로운 VEGF 디코이 수용체 융합 단백질인 VEGF-Grab을 개발하였다. 모(Parental) 물질인 VEGFR1-Fc(Fc에 융합된 VEGFR1 D2-D3)를 백본으로 사용하였고, 위치지정 돌연변이를 통하여 VEGFR1 D3의 양전하를 띠는 부분으로 새로운 잠재적 당화 부위(glycosylation sites)를 도입하였다. 이 조작된(engineered) VEGF-Grab은 현저히 향상된 타겟 단백질 결합 효능과 매우 감소된 순 pI를 보였고, 이에 따라 비특이적 ECM 결합이 감소하였고, PK 프로파일은 향상되었다. 따라서, VEGF-Grab은 3개의 VEGFR1 리간드인 VEGF-A, VEGF-B 및 PlGF의 효과적 포획(capturing)을 통하여 종양의 혈관신생, 진행 및 전이를 강력히 억제하였다. 나아가, 우리는 현재 나이관련황반변성과 당뇨망막병증 등 안질환 치료에 승인된 항-VEGF 치료법의 치료 가치를 예측하는 방법인 레이저 유도 맥락막신생혈관(laser-induced choroidal neovascularization) 및 산소 유도 망막병증(oxygen-induced retinopathy, OIR) 쥐 모델을 활용하여 VEGF-Grab3가 혈관신생을 억제하는 유리체강 내 치료 효능을 관찰하였다.

혈관내피성장인자 A(VEGF-A)를 타겟으로 하는 항-혈관신생 치료법은 암과 나이관련황반변성(AMD) 치료를 위한 임상에 흔히 사용되고 있다. 그러나, 이의 임상적 효능은 보상적 경로의 활성화인 VEGF-B와 태반 성장인자(PlGF)의 증가에 기인한 및 내성의 획득을 포함한 문제점을 갖고 있어 제한적이다. 이러한 난점을 회피하기 위하여, 본 발명자들은 VEGF-A, VEGF-B 및 PlGF를 동시에 중화시킬 수 있는 새로운 당화된 용해성 디코이 수용체 융합 단백질인 VEGF-Grab을 개발하였다. VEGF-Grab은 돌연변이 유발을 통하여 면역글로불린(Ig) 유사 도메인 3에 도입된 3개의 잠재적 당화 부위와 함께, IgG1 Fc에 융합된 VEGF 수용체 1(VEGFR1)의 Ig 유사 도메인 2와 3을 갖는다. VEGF-Trap과 비교하여, VEGF-Grab은 VEGFR1 백본에서 주로 기인한, VEGF와 PlGF에 대한 보다 강력한 결합력을 보였다. 가장 중요한 것은, VEGFR1의 Ig 유사 도메인 3에 첨가된 음전하를 띤 O-글리칸은 원래 가진 VEGFR1의 양전하의 단점을 보완해줌으로써, 세포외 기질에 대한 VEGF-Grab의 비특이적 결합을 최소화하고, 매우 향상된 약물동력학적 프로파일을 초래하였다. 이러한 진전은 독성 프로파일은 VEGF-Trap과 비슷하지만, VEGF-Trap에 비하여 더 강력하고, 오래 지속되는 항-혈관신생 효과와 항종양 효과를 초래하였다. 종합적으로, 우리의 결과는 VEGF-Grab이 추가적인 임상 의약품 개발을 위한 유망한 치료제 후보물질임을 보여준다.

하나의 양태에서, 본 발명은 VEGFR1 구성요소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, VEGF 폴리펩티드와 태반 성장인자(PlGF) 폴리펩티드에 동시에(synchronously) 결합할 수 있는 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 핵산분자에 관한 것이다. 상기 VEGFR1 구성요소는 면역글로불린 유사(Ig-like) 도메인 2와 3을 포함할 수 있다. 상기 VEGFR1의 적어도 하나의 도메인 내 존재하는 암호화된 양전하를 띤 아미노산 잔기 한 개 이상이 음전하를 띤 잔기로 돌연변이될 수 있다. 상기 도메인은 도메인 3일 수 있다. 그리고 상기 아미노산 잔기는 서열목록 제2서열의 133-144번째 아미노산 잔기에 상응하고 서열목록 제1서열의 397-432번째 핵산 위치에 해당하는 β1-β2 루프, 또는 서열목록 제2서열의 164-174번째 아미노산 잔기에 상응하고 서열목록 제1서열의 490-522번째 핵산 위치에 해당하는 β3-β4 루프 상에 위치할 수 있다. 또한, 상기 VEGFR1의 적어도 하나의 도메인 내 존재하는 암호화된 양전하를 띤 아미노산 잔기 한 개 이상이 당화 부위를 생성시키기 위하여 돌연변이 될 수 있다. 상기 VEGFR1의 적어도 하나의 도메인 내 존재하는 암호화된 양전하를 띤 아미노산 잔기 한 개 이상이 상기 암호화된 폴리펩티드의 순 pI(net pI)를 감소시키기 위하여 돌연변이 될 수 있다. 상기 돌연변이 되는 잔기는 도메인 3의 β1-β2 루프 상의 R135 잔기, β1-β2 루프 상의 K138 잔기 또는 β3-β4 루프 상의 R172 잔기일 수 있다. 상기 VEGF는 VEGF-A 또는 VEGF-B일 수 있다. 선택적으로, 상기 VEGFR1 구성요소는 멀티머화(multimerizing) 구성요소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다.

다른 양태에서, 본 발명은 (a) VEGF-Grab1; (b) VEGF-Grab2; 또는 (c) VEGF-Grab3를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산분자에 관한 것이다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 상술한 핵산분자를 포함하는 핵산 벡터에 관한 것이다. 상기 벡터는 바이러스 벡터일 수 있다. 또는, 상기 벡터는 발현조절 서열에 작동가능하게 연결된 상술한 핵산분자를 포함하는 발현 벡터일 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 상술한 핵산 벡터를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 VEGFR1 구성요소를 포함하며, VEGF 폴리펩티드와 태반 성장인자(PlGF) 폴리펩티드에 동시에 결합할 수 있는 폴리펩티드를 생성시키는 방법에 관한 것이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 상술한 발현 벡터를 포함하는, 적합한 숙주세포에서 폴리펩티드를 생산하기 위한 숙주-벡터계(host-vector system)에 관한 것이다. 상기 숙주세포는 박테리아 세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 포유동물 세포일 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 상술한 세포를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 VEGFR1 구성요소를 포함하며, VEGF 폴리펩티드와 태반 성장인자(PlGF) 폴리펩티드에 동시에 결합할 수 있는 폴리펩티드를 생성시키는 방법에 관한 것이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 상술한 숙주-벡터계의 세포를 폴리펩티드의 생산이 가능한 조건 하에서 성장시키는(growing) 단계; 및 생산된 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 폴리펩티드의 생산방법에 관한 것이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 상술한 분리된 핵산분자에 의하여 암호화된 폴리펩티드에 관한 것이다. 상기 폴리펩티드는 VEGFR1 구성요소가 면역글로불린(Ig) 유사 도메인 2와 3을 포함할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 VEGFR1의 적어도 하나의 도메인 내 존재하는 양전하를 띤 아미노산 잔기 한 개 이상이 음전하를 띤 잔기로 돌연변이 될 수 있다. 상기 도메인은 도메인 3일 수 있다. 상기 아미노산 잔기는 서열목록 제2서열의 133-144번째 아미노산 잔기를 포함하는 β1-β2 루프, 또는 서열목록 제2서열의 164-174번째 아미노산 잔기를 포함하는 β3-β4 루프 상에 위치할 수 있다. 상기 VEGFR1의 적어도 하나의 도메인 내 존재하는 한 개 이상의 양전하를 띤 아미노산 잔기가 당화 부위를 생성시키기 위하여 돌연변이 될 수 있다. 상기 폴리펩티드는 당화될 수 있다. 또한, 상기 폴리펩티드는 시알산화(sialylated)될 수 있다. 상술한 폴리펩티드에서, VEGFR1의 적어도 하나의 도메인 내 존재하는 양전하를 띤 아미노산 잔기 한 개 이상이 상기 폴리펩티드의 순 pI를 감소시키기 위하여 돌연변이 될 수 있다. 상기 돌연변이 되는 잔기는 도메인 3의 β1-β2 루프 상의 R135 잔기, β1-β2 루프 상의 K138 잔기 또는 β3-β4 루프 상의 R172 잔기일 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 상술한 폴리펩티드의 유효량을 이를 필요로 하는 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는 포유동물에서 혈관 성장을 차단시키는 방법에 관한 것이다. 상기 포유동물은 인간일 수 있다.

상기 혈관 성장은 시력에 영향을 주는 질병을 야기하는 눈에서 일어날 수 있다. 상기 질병은 나이관련황반변성, 삼출성 나이관련황반변성, 맥락막신생혈관 형성, 병적 근시, 당뇨망막병증, 당뇨황반부종, 망막혈관폐쇄, 미숙아망막병증 또는 신생혈관녹내장일 수 있다. 상기 맥락막신생혈관 형성은 근시성 맥락막신생혈관 형성(myopic choroidal neovascularization), 외상성 맥락막신생혈관 형성(traumatic choroidal neovascularization), 포도막염에 의한 맥락막신생혈관 형성(uveitic choroidal neovascularization), 안히스토플라스마증(ocular histoplasmosis), 또는 특발성 맥락막신생혈관 형성(idiopathic choroidal neovascularization)일 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 상술한 폴리펩티드의 유효량을 이를 필요로 하는 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는 포유동물에서 VEGF 및/또는 PlGF 활성을 억제시키는 방법에 관한 것이다. 상기 포유동물은 인간일 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 상술한 폴리펩티드의 치료학적 유효량을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 포유동물에서 종양 성장을 약화시키거나 방지하는 방법에 관한 것이다. 상기 포유동물은 인간일 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 상술한 폴리펩티드의 치료학적 유효량을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 포유동물에서 전이를 억제하는 방법에 관한 것이다. 상기 포유동물은 인간일 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 상술한 폴리펩티드의 치료학적 유효량과 세포독성 치료제를 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 포유동물에서 종양 성장을 약화시키거나 또는 방지하는 방법에 관한 것이다. 상기 포유동물은 인간일 수 있다. 또한, 상기 세포독성 치료제는 시스플라틴일 수 있고, 이에 의하여 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 하기에 기술된 상세한 설명을 통해 충분히 이해될 것이며, 예시로 주어진 첨부 도면은 이해를 위한 수단으로 제공되며, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
도 1A-1G는 VEGF-Grab의 제조와 특징을 보여준다. A, VEGF-Grab (VEGF-Grab1, VEGF-Grab2 및 VEGF-Grab3; 이하에서 G1, G2 및 G3로 표기) 및 VEGF-Trap(VT)의 모식도. VEGF-Grab의 돌연변이 된 잔기를 하단 패널에 갈색으로 표시하였다. B, VEGFR1(왼쪽) 및 VEGFR2(오른쪽)의 D2-D3 도메인의 정전기 전위. 양전하를 띠는 잔기와 음전하를 띠는 잔기를 각각 파란색 및 빨간색으로 표시하였다. C, VEGF-A/VEGFR1 D2-D3 복합체의 모델 구조. VEGF-A 다이머를 노란색과 녹색으로 표시하였다. VEGFR1 D2 및 D3를 황갈색과 겨자색으로 표시하였다. 파랑 막대로 표시된 잔기들은 돌연변이 유발의 표적 부위이다. D, G1 및 G3의 환원된 조건(R)과 비환원된 조건(NR)에서의 SDS-PAGE 분석. E-G, G1, G3 및 VT의 VEGF-A(E), PlGF(F) 또는 VEGF-B(G)에 대한 결합 친화력. *p < 0.05 G1 vs VT; #p < 0.05 G3 vs VT. 각 그룹에서 n = 3. 값은 평균 ± SD로 나타내었다.
도 2는 원래의 VEGFR1-Ig3의 이차구조를 보여준다. β 가닥을 화살표와 원기둥(녹색)으로 표시하였다. VEGFR1-D3의 β1-β2 및 β3-β4 루프 상의 잔기들을 볼드채로 나타내었다.
도 3A-3K는 VEGF-Grab3가 낮은 ECM 결합과 연장된 약물동력학적 프로파일을 나타내었음을 보여준다. A, G1, G3 및 VT의 등전점 분석. 각 라인의 빨간줄은을 순 pI를 분석하기 위하여 사용하였다. B, 각 단백질의 pI 비교. 각 단백질의 순 pI는 각 아이소폼의 평균 pI으로 선으로 표시하였다. C, N-연결 글리칸을 제거하기 위한 PNGase F 절단. D, G3의 세린135에서 O-연결 당화의 분석. E, 질량 분석으로 분석된 당화 위치에 대한 모식도. 채워진 N-당화 위치(빨강); 채워진 O-당화 위치(파랑); 비어 있는 N- 또는 O-당화 위치(녹색). F 및 G, VT(F) 및 G3(G)의 다양한 투여량에 대한 PK 프로파일 분석. H, VT와 G3의 AUC(area under the curve) 비교. I 및 J, 피하 주사(4 mg/kg) 48시간 후 G3와 VT의 조직 분포. I, 종양에서 축적된 VT와 G3. J, 종양과 비교하여, 간과 신장에서의 VT와 G3의 상대적 축적량. K, 마트리겔 코팅 플레이트를 사용한 인 비트로 ECM 결합 친화력 분석. *p < 0.05 G1 vs VT; #p < 0.05 G3 vs VT. 각 그룹은 n = 3. 값은 평균 ± SD로 나타내었다.
도 4A-4H는 VEGF-grab이 VEGF 신호전달경로의 억제를 통하여 EC 생존, 이동 및 관 형성을 억제하였음을 보여준다. A-C, HUVEC에서 G1, G3 및 VT 처리 후 VEGF-A 로부터 유도된 VEGFR2와 ERK의 인산화 억제. 면역블랏(A) 및 정량(B 및 C). D, VEGF-A(0.2 nM) 존재 하에서의 G1, G3 및 VT 처리(0.35, 0.7, 3.5, 7, 35, 70 nM) 후의 HUVEC를 사용한 세포 생존율 측정. E 및 F, VEGF-A와 표기된 단백질의 존재 하에서 HUVEC를 사용한 세포 이동 측정. 이동 면적의 이미지(E) 및 정량(F). 상처치료 부위를 빨간색으로 표시하였다. G 및 H, VEGF-A와 표기된 단백질의 존재 하에서 HUVEC를 사용한 관 형성 어세에에 대한 이미지(G) 및 정량(H). *p < 0.05 vs 대조군; #p < 0.05 G3 vs VT. 각 그룹은 n = 3. 값을 평균 ± SD로 나타내었다.
도 5A-5U는 VEGF-Grab3가 LLC 종양에서 종양 성장, 혈관신생 및 전이를 효과적으로 저해하였음을 보여준다. A-N, 마우스에 표기된 날(화살표)에 단백질을 투여하였다. A 및 C, 종양 성장(A) 및 종양 무게(C)의 비교. B 및 D, H&E로 염색된 종양 내 괴사 부위의 이미지(B) 및 정량(D). 점선은 종양 내 괴사의 경계를 표시한다. E 및 F, 주변 부위와 종양 내 부위의 CD31⁺ 혈관의 이미지(E) 및 정량(F). G, 서혜부 림프절 내 cytokeratin⁺ 종양 세포 전이(빨강)를 보여주는 이미지. 각각의 표기된 부위(사각형)를 하단 패널에 확대하여 나타내었다. H 및 I, 림프 혈관밀도(lymphatic vascular densities, LVD)(H) 및 cytokeratin⁺ 종양 세포 전이(I)의 정량. J 및 K, 종양 내 Hypoxyprobe⁺ 저산소 부위(녹색)의 이미지(J) 및 정량(K). L 및 M, 종양 내 CD11b⁺ 골수성 세포의 이미지(L) 및 정량(M). N, G3와 VT 처리 후의 종양 내 조직의 다양한 유전자들의 mRNA 발현수준. 값을 대조군 종양에 대한 배수 변화(fold changes)로 표현하였다. O-R, 종양 성장과 전이에 대한 VT와 G3의 비교 투여량 반응. LLC 종양을 갖는 마우스에 표기된 날(화살표)에 VT 또는 G3를 투여하였다. O 및 P, VT(O) 또는 G3(P) 처리 후의 종양 성장 비교. Q 및 R, 서혜부 림프절 내 cytokeratin⁺ 종양 세포 전이의 이미지(Q) 및 정량(R). 스케일 바, 100 ㎛. *p < 0.05 vs 대조군; #p < 0.05 G3 vs VT. S-U, 표기된 날(검정색 화살표)에 VT 또는 G3와 시스플라틴의 병용 치료(녹색 화살표, 종양 이식 후 9일째). S, LLC 종양 성장의 비교. 종양 내의 Caspase3⁺ 사멸세포(빨강)의 이미지(T) 및 비교(U). 각 그룹은 n=5. 값을 평균 ± SD로 나타내었다. 스케일 바, 100 ㎛. *p < 0.05 vs 시스플라틴; #p<0.05 cis+G3 vs cis+VT.
도 6A-6I는 VEGF-Grab3가 자연적 유방암 모델에서 종양 성장을 지연시키고, 신규혈관의 형성과 전이를 억제하였음을 보여준다. A-I, 암컷 MMTV-PyMT 마우스(12주령)에 3주 동안 주당 두 번 VT 또는 G3(25 mg/kg)를 복강 내 주사하였다. A, H&E 염색된 종양 절편. 침윤성 종양 세포(Inv), 초기 암 병변(Ea) 및 주변 지방조직(Adi)을 점선으로 표시하였다. B, 종양 결절의 부피 비교. 선은 평균값을 나타낸다. C 및 D, 주변과 종양 내 영역의 CD31⁺ 혈관의 이미지(C) 및 비교(D). E 및 F, 종양 내의 Caspase3⁺ 사멸세포(빨강)의 이미지(E) 및 비교(F). G, 겨드랑이 림프절 내 cytokeratin⁺ 종양 세포 전이(빨강)를 보여주는 이미지. H 및 I, 겨드랑이 림프절 내 LVD(H) 및 cytokeratin⁺ 종양 세포 전이(I)의 정량. 달리 표현되지 않는 한, 각 그룹은 n=4이다. 값은 평균 ± SD로 나타내었다. 스케일 바, 100 ㎛. *p < 0.05 vs 대조군. #p < 0.05 G3 vs VT.
도 7A-D는 VEGF-Grab3가 종양 혈관신생을 보다 지속적으로 억제하는 것을 보여준다. A-D, VT 또는 G3 처리 후의 종양 혈관의 재성장. A, 실험 모식도. 마우스에 표기된 날에 단백질을 투여하였다(녹색 화살표). 투여를 중단하고, D17 및 D19(파랑 화살표)에 분석하였다. B-D, VT 또는 G3 처리 후의 혈관 수(vascularity)의 변화. 흰색 화살표 머리는 대표적인 새로운 혈관의 싹을 나타낸다. CD31+ 혈관의 이미지(B)와 정량(C) 및 싹의 수(D). *p < 0.05 VT D17 vs VT D19.
도 8A-8B는 50 ㎍의 VEGF-Grab3의 단일 유리체 내 주사가 부르크막의 파열 부위에서 맥락막신생혈관 형성을 억제하였음을 보여준다. A, 레이저 유도 맥락막신생혈관 형성 후 PBS(왼쪽), VEGF-Grab3(중간) 및 Aflibercept(오른쪽)을 투여한 마우스에서의 평면 마운트에서 항-PECAM-1/CD31 항체에 염색된 맥락막신생혈관 병변의 대표적인 공초점 현미경 이미지. 맥락막신생혈관이 PBS 처리와 비교하여 VEGF-Grab3 또는 Aflibercept 처리했을 때 현저히 억제되었다. 스케일 바 = 100 ㎛. B, 레이저 유도 대조군 PBS 주사된 눈, Aflibercept 주사된 눈 및 VEGF-Grab3 주사된 눈에서 발생한 맥락막신생혈관의 크기를 보여주는 막대그래프. 데이터를 평균 ± 평균의 표준오차(SEM)로 표현하였다. 이미지 분석에 의한 맥락막신생혈관 면적의 측정은 PBS(60곳의 파열 부위) 처리와 비교하여, VEGF-Grab3(60곳의 파열 부위) 또는 Aflibercept(60곳의 파열 부위) 처리된 눈에서 현저히 적은 신생혈관 형성이 일어났음을 확인시켜 주었다. 평균 사이의 통계적 차이는 one-way 분산 후 본페로니 테스트 분석으로 결정하였다.
도 9A-9B는 VEGF-Grab3의 유리체 내 주사가 산소유도망막병증 모델 마우스의 혈관밀도를 감소시켰음을 보여준다. A, 산소유도망막병증 모델 마우스의 대표적인 공초점 현미경 확대 이미지. 맥관 구조의 밀도가 PBS 처리와 비교하여 VEGF-Grab3 처리에 의하여 현저히 감소하였다. B, 산소유도망막병증 모델 마우스에서 VEGF-Grab3가 P17째에 무혈관 망막을 증가시켰음을 보여주는 막대그래프. 데이터를 평균 ± 평균의 표준오차(SEM)로 표현하였다. VEGF-Grab3 주사된 마우스의 혈관 강도가 PBS 주사된 대조군 안구와 비교하여 현저히 감소하였다(P<0.01).
도 10은 VEGF-Grab1, VEGF-Grab3 및 VEGF-Trap의 서열 정렬을 보여준다. G1, G3 및 VT의 아미노산 서열을 CLUSTALW를 사용하여 정렬하였다. 신호 서열, D2, D3 및 Fc 도메인을 서열 정렬의 위쪽에 나타내었다. 모든 단백질에서 질량분석으로 검출된 N-연결 당화 위치를 빨강 박스로 표시하였다. O-연결 당화에 의하여 채워진 돌연변이 된 위치를 파랑 박스로 표시하였다. 글리칸에 의하여 채워지지 않은 당화에 대한 돌연변이 된 위치를 녹색 박스로 표시하였다. 트립신 절단 후 MS 분광분석으로 분석한 펩티드 절편들을 서열 아래에 갈색선으로 나타내었다(추가적인 설명은 도 11A 참조).
도 11A-11B는 VEGF-Grab 및 VEGF-Trap의 N-연결 당화 분석을 보여준다. A, N-당화의 잠재적 위치를 포함하는 VEGF-Grab 및 VT의 PNGaseF/트립신 절단으로 확인된 펩티드 리스트. PNGase 절단 후 Asp로 변경될 잔기인 Asn 잔기를 특정 위치에서 N-당화시키면, 0.984 Da의 질량 증가를 초래한다. 반면, N-글리칸이 채워지지 않은 Asn 잔기는 탈당화에 영향을 받지 않는다. 따라서, LC/MS를 통하여 탈당화된 트립신에 의한 펩티드의 질량분석 추적을 통하여, N-당화 위치의 채워진 또는 비워진 상태를 알아낼 수 있다. 검출된 펩티드를 √로 표시하였다. 검출되지 않은 펩티드를 x로 표시하였다. N/A는 해당 없음을 의미한다. B, VT, G1 및 G3의 각 N-글리칸 클래스의 상대적 존재비: C/H-Fuc&Sia(fucosylated/sialylated complex/hybrid); C/H-Sia(sialylated complex/hybrid); C/H-Fuc(fucosylated complex/hybrid); C/H(undecorated complex/hybrid ); HM(high mannose).
도 12는 VEGF-Grab1 내의 O-연결 당화 분석을 보여준다. G1 당펩티드의 Tandem MS 스펙트럼. 세린135에서 O-연결 당화가 검출되었다. 완전한 펩티드 및 글리칸 파쇄는 위치- 및 구조-특이적 발굴을 가능하게 하였다. 사각형 = N-아세틸헥소사민, 원 = 헥소오스 및 다이아몬드 = 시알산.
도 13은 VEGF-Grab3가 종양 ECM에 적게 결합하였음을 보여준다. 어떠한 단백질 치료제도 처리되지 않은 종양조직에 100 nM의 VR1-Fc, VT 또는 G3를 처리하고, Fc-cy3 항체를 사용하여 염색되었다. 이는 이들 분자의 종양 ECM에 대한 비특이적 결합(빨강)을 검출하기 위한 방법으로 사용되었다. 콜라겐 타입 IV(녹색)는 ECM의 기저판에서 주로 발견되는 콜라겐이다. 스케일 바, 100 ㎛.
도 14는 VEGF-Grab1과 VEGF-Grab3의 약물동력학적 프로파일을 보여준다. 4 mg/kg의 피하 주사 후 G1의 혈청 수준. 혈액을 0, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48 및 96 시간에 채취하고, ELISA로 분석하였다.
도 15A-15B는 VEGF-Trap과 VEGF-Grab3의 조직 축적을 보여준다. A 및 B, LLC 종양을 갖는 C57BL/6J 마우스에 VT(4 mg/kg) 및 G3(4 mg/kg)를 투여한 후의 조직 내 VT와 G3의 수준. 조직을 48시간 후에 모으고, 용해 버퍼(Lysis buffer 6, R&D)로 용해한 다음, 브래드포드 어세이로 정량한 후 간(A) 및 신장(B)에 대하여 ELISA로 분석하였다. *p < 0.05 G3 vs VT. 값은 평균 ± SD이다.
도 16A-16G는 VEGF-Grab 또는 VEGF-Trap이 VEGFA의 부재 하에서는 VEGFR2 신호전달, EC 생존, 이동 및 관 형성에 영향을 미치지 않음을 보여준다. A-C, VEGFA(50 ng/㎖, 1 nM)의 존재 또는 부재 하에서 G1, G3 및 VT(2 ㎍/㎖, 14 nM, 각각)를 처리한 후 HUVEC에서의 VEGFR2와 ERK 인산화. 면역블랏(A) 및 정량(B). und는 미검출을 의미한다. D 및 E, VEGF(50 ng/㎖, 1 nM)와 표기된 단백질(2 ㎍/㎖, 14 nM)의 존재 또는 부재 하에서의 HUVEC를 이용한 세포 이동 측정. 상처 치료 양을 12시간 후에 모니터링 하였다. 상처치료 영역을 빨간색으로 나타내었다. 이동 부위의 이미지(D) 및 정량(E). F 및 G, VEGF(50 ng/㎖, 1 nM)와 표기된 단백질(2 ㎍/㎖, 14 nM)의 존재 또는 부재 하에서의 HUVEC를 이용한 관 형성 측정. 관 형성의 이미지(F) 및 정량(G). 스케일 바, 100 ㎛.
도 17A-17B는 항-VEGF 치료에 의한 VEGFR2 신호전달의 용량 의존적 억제를 보여준다. A-B, HUVEC를 배양하고, 하룻밤 동안 혈청이 없는 상태로 키운 다음, 각 단백질(0.125 ㎍/㎖(0.875 nM), 0.25 ㎍/㎖(1.75 nM), 0.5 ㎍/㎖(3.5 nM) 및 1 ㎍/㎖(7 nM))을 15분간 전처리 하고, VEGFA(50 ng/㎖, 1nM)를 10분간 처리하였다. 세포를 용해하고, 표기된 단백질을 면역블랏하여 VEGFR2 및 ERK1/2 신호전달의 활성화를 확인하였다. A, VEGF-Grab 또는 VT 처리 후의 VEGFR2와 ERK1/2 인산화의 용량 의존적 억제를 보여주는 면역블랏. B, VEGF-Grab 또는 VT 처리 후의 VEGFR2와 ERK1/2 인산화의 비교.
도 18은 항-VEGF 치료 후의 중요 장기의 조직학적 분석을 보여준다. 대조군, VT 또는 VEGF-Grab(25 mg/kg)을 LLC 종양을 갖는 마우스에 투여한 2주 후, 표기된 장기를 채취하고 조직학적 분석을 위하여 절편화 하였다. 이미지는 H&E 염색된 표기된 장기의 조직 절편을 보여준다. 스케일 바, 100 ㎛.
도 19는 VEGF-Grab이 덩어리가 큰 거대 종양의 성장을 효과적으로 억제하였음을 보여준다. 종양 부피가 500 mm³를 초과한 후, 대조군, VT 또는 G3를 지시된 날(화살표)에 LLC 종양을 갖는 마우스에 투여하였다. LLC 종양 성장의 비교.
도 20A-20B는 용량 의존적 항-VEGF 치료 후 신장 및 간의 조직학적 분석을 보여준다. LLC 종양을 갖는 마우스에 대조군, VT(5, 10, 25 및 50 mg/kg) 또는 G3(5, 10, 25 및 50 mg/kg)를 투여한 후, 신장과 간을 채취하고 조직학적 분석을 위하여 절편화 하였다. 이미지는 H&E 염색된 신장(A) 및 간(B)의 조직 절편을 보여준다. 스케일 바, 100 ㎛.
도 21은 VEGF-Grab3와 시스플라틴의 병용 치료가 종양 내 세포 사멸을 증가시켰음을 보여준다. 종양 이식 9일 후 LLC 종양을 갖는 마우스에 대조군, VT 또는 G3(25 mg/kg)와 함께 매 2일마다 시스플라틴(10 mg/kg)을 주사하였다. 병용 치료 후, Caspase 3⁺ 세포(빨강)는 대부분 LLC 종양 유래의 상피세포인 Pan-cytokeratin+ 세포(+)와 중첩되었으나, CD31⁺ 세포(녹색)와는 그러하지 않았으며, 이는 사멸세포가 종양 세포일 가능성이 더 높음을 보여준다.

본 출원에서, 단수형은 대상의 단수와 복수 모두를 나타내기 위하여 사용된다.

본 명세서에 기재된, "약" 또는 "실질적으로"는 일반적으로 정확한 수로 제한하는 것에 재량을 제공한다. 예를 들어, 폴리펩티드 서열의 길이에 대한 내용에 있어서, "약" 또는 "실질적으로"는 폴리펩티드가 기재된 아미노산의 수로 제한되지 않음을 나타낸다. N-말단 또는 C-말단에 첨가되거나 제거된 몇몇의 아미노산이 결합 활성과 같은 기능적 활성이 존재하는 한 포함될 수 있다.

본 명세서에 기재된, 하나 이상의 추가적인 치료제와 "병용하여" 투여는 동시 투여하는 것 및 어떠한 순서대로 연속적으로 투여하는 것을 포함한다.

본 명세서에 기재된, "아미노산" 및 "아미노산들"은 자연에 존재하는(naturally occurring) 모든 L-α-아미노산을 의미한다. 이 정의는 노르류신(norleucine), 오르니틴 및 호모시스테인을 포함하는 것으로 여겨진다.

본 명세서에서 사용된 용어, "아미노산 서열 변이체"는 보통 참조(예를 들어, 천연 서열) 폴리펩티드와 비교하여, 아미노산 서열에 일부 차이를 갖는 분자를 의미한다. 상기 아미노산 변경은 천연 아미노산 서열의 치환, 삽입, 결실 또는 상기 변경의 조합일 수 있다.

치환 변이체는 천연 서열이 제거되고 다른 아미노산이 동일한 위치에 삽입된 적어도 하나의 아미노산 잔기를 갖는 변이체이다. 상기 치환은 오직 하나의 아미노산이 치환된 단일, 또는 둘 이상의 아미노산이 같은 분자 내에서 치환된 복수일 수 있다.

서열 내 아미노산의 치환은 상기 아미노산이 속한 클래스의 다른 구성 아미노산으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 비극성(소수성) 아미노산은 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 포함한다. 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함한다. 양전하를 띤(염기성) 아미노산은 알지닌, 라이신 및 히스티딘을 포함한다. 음전하를 띤(산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. 또한, 본 발명의 범위에는 동일하거나 유사한 생물학적 활성을 보인 단백질 또는 단편 또는 이들의 유도체 및 번역 동안 또는 후에 예를 들어, 당화, 단백질 가수분해에 의한 절단, 항체분자 또는 다른 세포 리간드로의 연결 등에 의하여 별도로 변형된 유도체가 포함된다.

삽입 변이체는 원래(native)의 아미노산 서열의 특정 위치에서 바로 인접한 아미노산에 삽입된 하나 이상의 아미노산을 갖는 변이체이다. 아미노산에 바로 인접한은 아미노산의 α-카르복시 또는 α-아미노 작용기에 연결되는 것을 의미한다.

결실 변이체는 원래의 아미노산 서열 내의 하나 이상의 아미노산이 제거된 것이다. 보통, 결실 변이체는 분자의 특정 부위에서 결실된 하나 또는 두 개의 아미노산을 가질 것이다.

본 명세서에서 사용된 용어, "길항제"는 생물학적 반응을 이끌어내는 것 없이 세포 수용체에 결합하는 리간드로서, 다른 리간드의 작용(action)을 무효화하는 경향이 있는 리간드를 의미한다.

또한, 융합 단백질은 리간드-수용체 결합 상호작용을 확인하기 위하여 방사성 동위원소, 형광 표지, 효소 표지 또는 화학발광 표지와 같은 검출 가능한 표지로 표지되는 것으로 이해된다. 키메라 분자에 적용되는 어세이 시스템 또한 고려된다.

본 명세서에서 사용된 용어, "담체(carriers)"는 적용된 투여량과 농도에서 세포 또는 포유동물에 비독성인 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제를 포함한다. 종종 상기 약제학적으로 허용 가능한 담체는 수용성 pH 버퍼 용액이다. 약제학적으로 허용 가능한 담체의 예는 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산과 같은 버퍼; 아스코르브산을 포함하는 항산화제; 저분자량(약 10개의 잔기 미만) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 폴리머; 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 알지닌 또는 라이신과 같은 아미노산; 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이팅제; 만니톨 또는 솔비톨과 같은 당알코올; 나트륨과 같은 염-형성 반대이온; 및/또는 TWEEN^ⓡ, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 및 PLURONICS^ⓡ와 같은 비이온성 계면활성제를 포함하며, 이에 의하여 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서, 핵산 서열에 대한 내용 중에 사용된 "필수적으로 이루어진(consisting essentially of)"은 핵산에 의해 암호화된 아미노산의 의도된 기능을 수행하는데 필수적인 서열을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어, "유효량"은 유익하거나 소망하는 임상 또는 생화학적 결과를 가져오는데 충분한 양이다. 유효량은 1회 이상으로 투여될 수 있다. 본 발명의 목적상, 억제제 물질의 유효량은 질병 상태의 진행을 완화시키거나, 개선하거나, 안정화시키거나, 느리게 하거나 또는 지연시키는데 충분한 양이다.

본 명세서에서 사용된 용어, "단편" 또는 "기능적 유도체"는 유기 유도체화제와 반응하여 얻어진 유도체, 번역 후 변형, 비단백질성 폴리머를 갖는 유도체 및 면역접합체를 포함하는 공유 변이(covalent modifications) 뿐만 아니라, 생물학적으로 활성인 아미노산 서열 변이체 및 본원발명의 원래의 리간드 또는 수용체의 단편을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어, "숙주세포"는 본 발명의 벡터의 수용체(recipient)가 될 수 있거나 또는 수용체가 된 각 세포 또는 세포 배양물을 포함한다. 숙주세포는 단일 숙주세포의 자손을 포함하고, 상기 자손은 자연적, 우연적 또는 의도적인 돌연변이 및/또는 변화로 인하여, 원래의 모세포와 완전히 동일(형태 또는 총 DNA 컴플리먼트에서)할 필요는 없다.

본 명세서에서 사용된 용어, "리간드"는 폴리펩티드와 같은 분자에 공유적으로 또는 일시적으로 특이적 결합하는 모든 분자 또는 제제, 또는 화합물을 의미한다. 특정 맥락에서 사용될 때는, 리간드는 항체를 포함할 수 있다. 다른 맥락에서, "리간드"는 다른 분자에 의하여 높은 친화도로 결합되는 분자일 수 있다.

본 명세서에서, 치료 목적에서 사용된 용어, "포유동물"은 인간, 개, 고양이, 소, 말, 양, 돼지 등과 같은 가축과 동물원 동물, 스포츠 동물 또는 애완동물로 분류되는 모든 동물을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어, "약제학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 희석제"는 모든 용매, 분산매, 코팅제, 항균제와 항진균제, 등장용 제제와 흡착지연제 등을 포함한다. 이러한 약제학적 활성 물질용 매질과 제제의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다. 종래의 매질 또는 제제가 유효성분과 호환성이 없다는 사정이 없는 한, 치료용 조성물에서 이들의 사용은 고려된다. 보충의 유효성분 또한 상기 조성물에 포함될 수 있다.

비경구용 조성물은 투여량의 균일성과 투여의 용이성을 위한 단위 제형(dosage unit form) 형태로 제형화 하는 것이 특히 유리하다. 상기 용어 단위 제형은 투여 받을 포유동물 개체로의 일원화된 투여량에 적합한 물리적으로 구별되는 별개의 유닛을 의미하며, 각 유닛에는 요구되는 약제학적 담체와 관련하여 소망하는 치료효과를 발생시키는 것으로 계산된 유효성분의 미리 정해진 양이 포함되어 있다. 본 발명의 단위 제형에 대한 설명은 (a) 유효성분의 독특한 특징과 달성될 특정 치료효과, 및 (b) 신체의 건강이 손상된 질병을 갖는 개체의 질병 치료를 위한 유효성분의 조제술에 내재하는 제한사항에 의하여 좌우되고 직접적으로 의존한다.

주요한 유효성분은 유효량의 편리하고 효과적인 투여를 위하여 적합한 약제학적으로 허용 가능한 담체와 단위 제형 형태로 혼합된다. 단위 제형 형태는 예를 들어, 주된 유효성분을 0.5 ㎍ 내지 약 2000 mg의 양만큼 포함한다. 비율에 대하여 설명하면, 유효성분은 일반적으로 약 0.5 ㎍/㎖ 이상의 담체에 존재한다. 보충용 유효성분이 함유된 조성물의 경우에는, 상기 투여량은 상술한 성분의 일반적인 투여량과 투여방법을 참조하여 결정된다.

본 명세서에서 사용된 용어, "시료" 또는 "생물학적 시료"는 가장 넓은 의미로 이해되고, 개인, 체액, 세포주, 조직 배양물 또는 다른 소스로부터 얻은 모든 생물학적 시료를 포함하며, 이는 실시될 어세이의 종류에 따라 PlGF 또는 VEGF-A 결합 펩티드도 포함할 수 있다. 기술된 바와 같이, 생물학적 시료는 정액, 림프, 혈청, 혈장, 뇨, 활액, 척수액 등과 같은 체액을 포함한다. 포유동물로부터 생체 조직과 체액을 얻는 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "개체"는 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간이다.

본 명세서에서 사용된 용어, "동시에 일어나는(synchronous)" 또는 "동시적으로(synchronously)" 결합은 단백질이 결합이 가능한 경우, 이 단백질이 둘 이상의 지정된 단백질에 동시에(simultaneously) 결합하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어, "치료"는 유익하거나 소망하는 임상 결과를 얻기 위한 수단(approach)이다. 본 발명의 목적상, 유익하거나 소망하는 임상 결과는, 감지할 수 있거나 감지할 수 없는, 증상의 경감, 질병 정도의 감소, 질병 상태의 안정화(즉, 악화시키지 않음), 질병 진행의 지연 및 늦춤, 질병 상태의 개선 또는 완화, 및 병의 차도(부분적이거나 전체적이거나)를 포함하며, 이에 의하여 제한되는 것은 아니다. "치료"는 또한 치료를 받지 않은 경우에 기대되는 수명에 비하여 생존율을 연장시키는 것을 의미할 수도 있다. "치료"는 치료를 위한 치료와 예방 또는 방지를 위한 조치를 모두 의미한다. 치료를 필요로 하는 대상은 질환이 예방될 개체뿐만 아니라, 이미 질환이 발병한 개체를 포함한다. 질병의 "증상의 완화(Palliating)"는 치료가 없는 상황과 비교하여, 질병 상태의 정도 및/또는 원치 않는 임상 증상이 줄어드는 것, 및/또는 병의 진행의 경과(time course)가 느려지거나 길어지는 것을 의미한다.

본 명세서에서, "벡터", "폴리뉴클레오티드 벡터", "컨스트럭트" 및 "폴리뉴클레오티드 컨스트럭트"는 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 벡터는 RAN, DNA, 레트로바이러스 외피(coat)에 봉입된 RNA, 아데노바이러스 외피에 봉입된 DNA, 다른 바이러스 또는 바이러스 유사 형태(예를 들어, 헤르페스 바이러스 및 폴리아미드와 같은 아데노-구조체)에 패키징된 DNA를 포함하는 몇 가지 형태일 수 있고, 이에 의하여 제한되는 것은 아니다.

VEGF-Grab

본 연구에서, 우리는 연장된 PK 프로파일 및 VEGF와 PlGF 모두를 격리(sequester)시키는, VEGF-Grab이라 명명된, VEGFR1 D2-D3 및 Fc를 포함하는 신규 당화된 용해성 디코이 수용체 융합 단백질을 개발하였다. 비록 VEGFR1이 VEGFR2보다 높은 친화도로 VEGF-A 및 PlGF에 결합하지만, VEGFR1 백본을 갖는 디코이 치료제 단백질의 개발은 지금까지 어려운 것으로 여겨져 왔다. 이의 주요한 이유는 VEGFR1 D3 영역, 특히 β1-β2 루프 및/또는 β3-β4 루프의 양전하를 띤 잔기로 인한 VEGFR1의 높은 pI 값이다. 이는 비특이적 ECM 결합과 좋은 못한 PK 프로파일을 야기하여, 반감기의 감소, 이에 의한 효능의 감소 및 심지어 독성 부작용을 초래한다(6,42). 이와 같은 VEGFR1 D3의 본질적인 문제점을 해결하기 위하여, 우리는 리간드 결합과 관련 없는 것으로 예상된, VEGFR1 D3 루프 내의 3개의 양전하를 띤 잔기들을 돌연변이 시켰다. 이러한 양전하를 띤 잔기들은 잠재적 당화 부위(Ser, Thr 또는 Asn)가 되도록 변경되었다.

이러한 당화 전략을 이용한 새로운 디코이 수용체 융합 단백질의 창출은 몇 가지 이점을 발생시켰다. 첫째, VEGFR1 D3 영역으로의 당화 부위의 도입에 의하여 VEGF-Grab의 ECM 결합이 현저히 감소하였다. 이들 당화 부위는 양전하를 띤 잔기와 음전하를 띤 잔기, 또는 새롭게 부착된 음전하를 띤 글리칸의 균형을 잡아준다. 또한, 질량분석을 이용한 글리칸 분석에서 보여지는 바와 같이, G3는 G1 또는 VT와 비교하여 증가된 시알산화(sialylation)를 포함하였다. 간 내의 아시알로 당단백질(asialo-glycoprotein) 수용체가 비시알화 당단백질에 결합하여, 엔도시토시스를 통하여 혈청에서 이들 당단백질을 제거하기 때문에, 말단 시알산은 단백질의 인 비보 반감기에 있어 대단히 중요하다(43). 이 감소된 ECM 결합 및 G3의 증가된 시알화는 향상된 PK 프로파일을 가능하게 한 것으로 여겨진다. 구체적으로, VT와 비교하여, G3의 AUC는 1.7~1.9배 증가하였으며, 이러한 결과는 G3의 생체이용률(bioavailability)이 VT보다 월등함을 보여준다. 둘째, VEGFR1 D2-D3를 포함하는 G3는 VT와 비교하여 VEGF-A 및 PlGF에 대하여 보다 강력한 디코이 활성을 보여주었다: G3는 VT와 비교하여 1.5배 및 6.7배 높은 수준으로 VEGF-A 및 PlGF에 결합하였다. 이는 G3 처리 후의 EC 증식, 이동 및 관 형성의 강력한 억제를 입증한 우리의 인 비트로 실험에 의하여 증명되었다. 일치하는 결과가 인 비보 실험에서도 확인되었으며, 이 인 비보 실험에서 G3는 VT에 비하여 이식된 종양 모델과 자연적 종양 모델 모두에서 보다 강력한 항-혈관신생, 항종양 및 항전이 효과를 보여주었다. TAM 유입(recruitment)에 있어 대단히 중요한 PlGF에 대한 G3의 결합 친화도는 항-PlGF 항체와 비슷하였고(18), VT 처리 종양과 비교하여 G3 처리 종양에서 감소된 대식세포 침윤이 나타났다. LLC 종양 모델이 항 VEGF 치료에 대하여 비교적 내성을 갖는 것으로 알려져 있음을 고려하면(30,36), 이러한 결과들은 VEGF-Grab을 이용한 PlGF의 동시 차단을 통한 항 VEGF 치료에 대한 내성 극복의 가능성을 보여준다. 셋째, G3는 모 물질인 VEGFR1-Fc와 비교하여 독성 프로파일에서 개선을 보였다. ECM과의 비특이적 상호작용으로 인한 VEGFR1-Fc의 사용 시의 복수(Ascites) 형성과 사망률이 보고되었다(6,42). 우리의 동물실험 동안, G3는 2~3주 지속되는 오랜 기간 투여되는 동안 복수 형성의 징후 또는 사망률이 확인되지 않았다(데이터 미제시). 나아가, 중요 장기의 조직학적 분석은 VT와 비교하여 어떠한 유의성 있는 차이를 보여주지 못하였는데(도 18), 이는 모물질인 VEGFR1-Fc의 독성이 추가적인 당화의 도입으로 인하여 해소되었음을 보여준다. 그러나, 지연된 상처 치료와 출혈을 포함하는 전신 항-VEGF 치료의 부작용이 보고된바 있다(44). 최근, 국소적으로 혈관신생을 억제하는 Sticky-trap이 개발되어 전신적인 부작용을 나타내지 않는 것으로 확인되었다(45). 임상에서의 G3의 잠재적인 부작용이 다양한 투여량, 투여 시점 및 장기간 치료 후 측면에서 면밀히 연구되어야 하지만, G3는 Sticky-trap 컨셉을 채용하여 더욱 더 개선될 수 있다.

현재, 항-VEGF 제제는 다양한 종양에 대한 화학 요법과 병용 사용하는 임상 용도로 승인받았다(5). 여기서, 우리는 또한 추가적(additive)이고 상승적(synergistic) 효과를 갖는 화학 요법의 병용치료제로서의 VEGF-Grab의 유망한 응용을 증명하였다. 우리의 연구에서, VEGF-Grab의 단일 투여는 인 비보 쥐 맥락막신생혈관 및 산소유도망막병증 모델에서 aflibercept와 동등한 결과를 보였다. VEGF-Trap(aflibercept) 역시 VEGF-A를 억제하는 단일 치료보다 높은 효능을 보이는 나이관련황반변성(AMD) 치료제로서 FDA 승인을 받았기 때문에, VEGF-Grab 또한 AMD를 포함한 혈관신생성 안질환에 적용될 수 있다. 임상에서, 항-VEGF 제제의 매달 또는 두 달에 한 번씩의 반복적인 주사는 AMD 환자에서 시력을 유지해야만 한다. 그러나, 우리의 향상된 PK 프로파일은 보다 낮은 빈도의 투여량 요법으로도 aflibercept와 비슷한 결과를 발생시킬 가능성을 보여주며, 이는 높은 결합 친화도가 증가된 지속성을 초래할 수 있다는 상기 이유와 일치한다(6,47).

결론적으로, 우리의 증거는 VEGF-Grab3가 VEGF 및 PlGF 모두에 대하여 강력하고 효과적인 재조합 디코이임을 보여준다. 향상된 PK 프로파일을 통하여, VEGF-Grab3는 종양의 혈관신생, 성장 및 전이의 지속적인 억제를 보여주었다. 이 신규한 융합 단백질의 임상 적용 가능성은 추가적인 전임상과 임상시험을 통하여 조사되어야 한다.

안질환의 치료

많은 안질환 또한 비정상적인 혈관신생, 혈관 누수(vascular leakage) 및 상향 조절된 VEGF와 관련되어 있다. 일 양태에서, 상기 독창적인 당화된 VEGF 디코이 수용체 융합 단백질은 비정상적인 혈관신생 또는 혈관 누수와 관련된 눈 상태를 갖는 환자에게 투여될 수 있다. 상기 환자는 원치 않는 눈 또는 황반에서의 신생혈관 형성(neovascularization) 또는 부종을 겪는 환자일 수 있다.

삼출성 나이관련황반변성(AMD)

나이관련황반변성(age-related macular degeneration, AMD)은 선진국에서 가장 중요한 노인 실명 원인이다. 나이관련황반변성의 분류 중 삼출성 나이관련황반변성은 나이관련황반변성 실명 원인의 대부분을 차지한다. 삼출성 나이관련황반변성에서, 부르크막을 뚫고 맥락막 모세혈관에서 맥락막신생혈관(choroidal neovascularization, CNV)이 자라나며 맥락막신생혈관에서 기인한 출혈과 삼출물로 인하여 황반부의 시세포가 급격하게 손상되고 중심시력이 저하된다. 맥락막신생혈관는 또한 병적 근시를 포함한 다양한 망막의 퇴행성 및 염증성 질환을 갖는 환자의 시력을 위협하는 주요 문제이다. 추가적인 맥락막신생혈관 상태는 근시성 맥락막신생혈관 형성, 외상성 맥락막신생혈관, 안히스토플라스마증과 같은 포도막염에 의한 맥락막신생혈관 형성 및 특발성 맥락막신생혈관 형성을 포함하며, 이에 의하여 제한되는 것은 아니다.

근시성 맥락막신생혈관

근시성 맥락막신생혈관은 심각한 근시를 갖는 사람(전형적으로 -6 diopters 이상)에서 새로운 비정상적인 혈관이 망막 밑에서 자라는 망막 질환이다. 상기 질환은 퇴행성이고 점진적인 변화를 초래하는 공막, 맥락막 및 망막의 물리적 늘어남(physical stretching)을 동반한 비정상적으로 길쭉한 눈으로 특징되어 진다. 이러한 퇴행성 변화는 부르크막의 파열 및 맥락막신생혈관의 발생을 야기할 수 있다. 유사한 메커니즘이 외상성 맥락막신생혈관에 적용된다.

포도막염에 의한 맥락막신생혈관 형성

포도막염은 포도막을 포함한 안구의 염증이다. 포도막염에 의하여 부르크막이 손상될 경우 근시성 맥락막신생혈관과 유사한 기전으로 맥락막신생혈관이 발생하게 되며, 이는 중심시력저하를 초래한다.

안히스토플라스마증

안히스토플라스마증과 MCP(multifocal choroiditis and panuveitis) 증후군은 때때로 맥락막신생혈관이 발생하는 포도막염의 예이다. 맥락막신생혈관은 이러한 눈 염증성 질환에서의 시력 악화의 주요한 원인이다.

곰팡이류는 삶의 초기에 흡입되어 폐와 맥락막(망막을 싸고 있는 혈관층)을 포함하는 신체에 보통 무증상 및 자체 한정적인(self-limited) 감염을 야기한다. 알지 못하는 이유 때문에, 초기 감염 수십년 후, 맥락막의 상처는 유체와 혈액을 새게 하는 비정상적인 혈관(맥락막신생혈관)을 발생시킬 수 있다. 왜곡된 중심 시각과 시력(reading vision)의 손실은 상기 누출이 황반과 관련 있을 때 일어난다. 치료의 목표는 맥락막신생혈관(CNV)이 황반 중심으로 퍼지는 것을 막거나, 맥락막신생혈관이 황반 중심에 도달하면 맥락막신생혈관의 크기와 혈관 누수를 제한하는 것이다.

특발성 맥락막신생혈관

맥락막에서 기원한 새로운 혈관이 알려진 원인 없이 자발적으로 발생한 것으로 보일 때, 이 상태를 특발성 맥락막신생혈관이라고 한다. 근원적인 원인과 성장 위치와 상관없이, 신혈관 형성은 시력 손실을 초래한다.

당뇨망막병증 및 당뇨황반부종

당뇨망막병증은 당뇨 환자에서 발생하며, 근로 연령계층에서의 가장 흔한 실명의 원인이다. 병이 진행됨에 따라, 망막 혈관 훼손과 저상소 상태는 VEGF 상향조절을 유도하여, 증식성 당뇨망막병증의 특징인 망막의 신생혈관 형성을 야기한다. 망막의 신생혈관 형성은 일반적으로 유리체 출혈(vitreous hemorrhage)과 망막 박리를 야기하고, 이는 시력을 심각하게 손상시킨다. VEGF의 억제는 증식성 당뇨망막병증에서 망막의 신생혈관 형성을 퇴행시킬 수 있다. 또한, 높은 안내 VEGF 농도는 혈관 누수와 황반 부종을 유도할 수 있다. 황반 부종은 당뇨망막병증 환자의 중심시력을 손상시킬 수 있고, bevacizumab, ranibizumab 및 aflibercept와 같은 항-VEGF 제제는 황반 부종의 치료에 효과적인 것으로 알려져 있다.

망막혈관폐쇄

두 종류의 망막혈관폐쇄가 있다: 분지성 망막혈관폐쇄(branch retinal vein occlusion) 및 중심성 망막혈관폐쇄(central retinal vein occlusion). 망막혈관폐쇄는 당뇨망막병증과 유사한 발병 메커니즘에 영향을 받는다: 망막의 모세혈관 폐색, 저산소증 및 VEGF 상향조절. 따라서, 망막 신생혈관 형성 및 황반 부종은 종종 망막혈관폐쇄를 발생시킨다. 다른 항-VEGF 제제는 망막혈관폐쇄에 의한 황반 부종에 효과가 있는 것으로도 알려져 있다.

미숙아망막병증

미숙아망막병증은 아이에서 가장 흔한 실명의 원인이다. 미숙아망막병증은 비정상적인 신생혈관 형성으로 특징되어 지고, 이는 망막의 견인성 분리(tractional detachment)를 야기한다. 전통적인 치료법은 허혈성 망막에 대한 레이저 광응고법을 실시하여 VEGF와 비정상적인 신생혈관 형성을 억제하는 것이다. 최근, bevacizumab을 사용한 VEGF의 하향 조절이 신생혈관 형성을 퇴행시키고 실명을 예방하는데 효과가 있는 것으로 확인되었다.

신생혈관녹내장

신생혈관녹내장은 당뇨망막병증, 망막 정맥 폐색 및 안허혈증후군과 같은 허혈성 망막증의 실명을 유발하는 합병증이다. 만성적인 안허혈에서, 새로운 혈관이 홍채의 모서리에서 발행하여 섬유주대(trabecular meshwork)와 안구의 고압 발생을 차단한다. 높은 안압은 시신경 유두(optic nerve head)를 압박하고, 영구적인 실명이 발생할 수 있다. 이러한 일련의 병원성 사건은 신생혈관녹내장을 초래한다. 항-VEGF 제제는 신생혈관녹내장의 예방 및 치료에 효과적인 것으로 알려져 있다.

서열목록

a, g, c, t 외의 뉴클레오티드 기호의 사용에 대하여, WIPO Standard ST.25, 부록 2, 표 1에 기재된 규칙에 따라, k는 t 또는 g를 나타내며, n은 a, c, t 또는 g를 나타내고, m은 a 또는 c를 나타내며, r은 a 또는 g를 나타내고, s는 c 또는 g를 나타내며, w는 a 또는 t를 나타내고, y는 c 또는 t를 나타낸다.

표 1은 hVEGFR1 신호 서열, VEGFR1 도메인 2, VEGFR1 도메인 3 및 hFC 도메인 부분이 순서대로 이루어진 VEGF-Grab 백본 서열의 하위(subdomain) 구성(assemblies)에 대한 서열목록 제1서열의 핵산 서열 및 이에 상응하는 아미노산 서열(서열목록 제2서열)을 보여준다.

표 2는 VEGFR1 도메인 3 내의 403-405번째 핵산 위치(아미노산 위치 135Ser) 및 412-414번째 핵산 위치(아미노산 위치 138Thr)에 돌연변이를 갖는, hVEGFR1 신호 서열, VEGFR1 도메인 2, VEGFR1 도메인 3 및 hFC 도메인 부분이 순서대로 이루어진 VEGF-Grab1의 하위 구성에 대한 서열목록 제3서열의 핵산 서열 및 이에 상응하는 아미노산 서열(서열목록 제4서열)을 보여준다.

표 3은 VEGFR1 도메인 3 내의 514-516번째 핵산 위치(아미노산 위치 172Asn)에 돌연변이를 갖는, hVEGFR1 신호 서열, VEGFR1 도메인 2, VEGFR1 도메인 3 및 hFC 도메인 부분이 순서대로 이루어진 VEGF-Grab2의 하위 구성에 대한 서열목록 제5서열의 핵산 서열 및 이에 상응하는 아미노산 서열(서열목록 제6서열)을 보여준다.

표 4는 VEGFR1 도메인 3 내의 403-405번째 핵산 위치(아미노산 위치 135Ser), 412-414번째 핵산 위치(아미노산 위치 138Thr) 및 514-516번째 핵산 위치(아미노산 위치 172Asn)에 돌연변이를 갖는, hVEGFR1 신호 서열, VEGFR1 도메인 2, VEGFR1 도메인 3 및 hFC 도메인 부분이 순서대로 이루어진 VEGF-Grab3의 하위 구성에 대한 서열목록 제7서열의 핵산 서열 및 이에 상응하는 아미노산 서열(서열목록 제8서열)을 보여준다.

핵산 컨스트럭트

또한, 본 발명은 상술한 본 발명의 핵산분자를 포함하는 발현 벡터를 제공하며, 상기 핵산분자는 발현조절 서열에 작동적으로 연결되어 있다. 또한, 본 발명은 융합 폴리펩티드의 발현에 적합한 숙주세포로 도입된 본 발명의 발현 벡터를 포함하는, 융합 폴리펩티드의 생산용 숙주-벡터계를 제공한다. 상기 적합한 숙주세포는 E. coli와 같은 박테리아 세포, Pichia pastoris와 같은 효모 세포, Spodoptera frugiperda와 같은 곤충 세포, 또는 COS, HEK 또는 CHO 세포와 같은 포유동물 세포일 수 있다.

본 발명은 또한 융합 폴리펩티드의 생산이 가능한 조건 하에서 상술한 숙주-벡터계의 세포를 자라게 한 후, 생산된 융합 폴리펩티드를 회수하여 본 발명의 융합 폴리펩티드를 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명의 실시에 유용한 융합 폴리펩티드는 원핵 또는 진핵 발현 시스템에서 발현시켜 생산될 수 있다.

상기 재조합 유전자는 발현될 수 있고, 상기 폴리펩티드는 다양한 방법을 사용하여 정제된다. 상기 유전자는 예를 들어 pZErO와 같은 박테리아 발현 시스템으로 서브클로닝 될 수 있고, 이에 의하여 제한되는 것은 아니다.

상기 융합 폴리펩티드는 안정적이며, 생물학적으로 안정적인 단백질의 차후의 형성을 가능하게 하는 모든 기법에 의하여 정제될 수 있다. 예를 들어, 상기 물질은 8M의 구아니디늄 염산염과 투석에 의하여 정량적으로 추출되는 가용성 단백질(soluble proteins) 또는 봉입체(inclusion bodies)로서 세포로부터 회수될 수 있다. 상기 물질의 추가적인 정제를 위하여, 종래의 이온 교환 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피, 당 차이 크로마토그래피(different sugar chromatography), 소수성 상호작용 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피 또는 겔 여과를 포함하는 많은 정제방법이 사용될 수 있으며, 이에 의하여 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서, 융합 폴리펩티드는 침묵(silent) 또는 보존적 변화를 초래하는 서열 내의 아미노산 잔기가 치환된 기능적으로 동등한 분자를 포함한다. 예를 들어, 상기 서열 내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 침묵 또는 보존적 변화를 초래하며 기능적 등가물로 작용하는 유사한 극성의 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 상기 서열 내의 아미노산 치환은 아미노산이 속한 클래스의 다른 구성으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 비극성(소수성) 아미노산은 알리닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 포함한다. 극성 중성 아미노산은 글라이신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함한다. 양전하를 띤(염기성) 아미노산은 알지닌, 라이신 및 히스티딘을 포함한다. 음전하를 띤(산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. 잠재적 당화 아미노산은 세린, 트레오닌 및 아스파라긴을 포함한다. 또한, 본 발명의 범위에는 동일하거나 유사한 생물학적 활성을 나타내는 단백질, 단편 또는 이들의 유도체, 및 예를 들어 당화, 단백질분해효소에 의한 절단, 항체 분자 또는 다른 세포 리간드로의 연결 등과 같은 변형 또는 후의 별도의 변형이 이루어진 유도체를 포함된다.

본 발명의 융합 폴리펩티드를 발현하는 세포는 융합 폴리펩티드를 생산하도록, 예를 들어, 트랜스펙션, 트랜스덕션, 전기천공 또는 마이크로인젝션 기법으로 유전적으로 조작된다.

또한, 본 발명은 상술한 융합 폴리펩티드의 표지된 형태의 사용도 포함한다.

당해 기술분야의 통상의 기술자에게 알려진 DNA 단편을 벡터로 삽입하는 모든 방법을, 적절한 전사/번역 조절신호와 단백질 코딩 서열을 이용하여 본 발명의 융합 폴리펩티드를 암호화하는 발현 벡터를 구축하는데 이용할 수 있다. 이들 방법은 인 비트로 재조합 DNA와 합성 기법 및 인 비보 재조합(recombination)(유전자 재조합)을 포함할 수 있다. 본 발명의 융합 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열의 발현은 2차 핵산 서열에 의하여 조절되어 상기 융합 폴리펩티드가 재조합 DNA 분자로 형질전환된 숙주에서 발현될 수 있다. 예를 들어, 상술한 융합 폴리펩티드의 발현은 당해 기술분야에 알려진 모든 프로모터/인핸서 인자에 의하여 조절될 수 있다. 상기 융합 폴리펩티드의 발현을 조절하기 위하여 사용될 수 있는 프로모터는 Squinto et al.,(1991, Cell 65:1-20)에 기재된 긴 말단 반복(long terminal repeat); SV40 초기 프로모터 부위(Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310), CMV 프로모터, M-MuLV 5'말단 반복(M-MuLV 5' terminal repeat), Rous sarcoma 바이러스의 3'긴 말단 반복(3'long terminal repeat)에 포함된 프로모터(Yamamoto, et al., 1980, Cell 22:787-797), 헤르페스 티미딘 키나아제 프로모터(Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:144-1445), 메탈로티오네인 유전자의 조절서열(Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42); β-락타마아제 프로모터(Villa-Kamaroff, et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731) 또는 tac 프로모터(DeBoer, et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25; Useful proteins from recombinant bacteria" in Scientific American, 1980, 242:74-94)와 같은 원핵 발현 벡터; Gal 4 프로모터, ADH(alcohol dehydrogenase) 프로모터, PGK(phosphoglycerol kinase) 프로모터, 알칼라인 포스파타아제 프로모터와 같은 효모 또는 다른 곰팡이류 유래의 프로모터 인자, 및 다음의 조직 특이성을 나타내고 트랜스제닉 동물에서 사용되는 동물의 전사 조절부위를 포함하며, 이에 의하여 제한되는 것은 아니다: 췌장 소엽 세포(pancreatic acinar cells)에서 활성인 elastase I 유전자 조절부위(Swift et al., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515), 췌장 베타 세포에서 활성인 인슐린 유전자 조절부위(Hanahan, 1985, Nature 315:115-122), 림프 세포에서 활성인 면역글로불린 유전자 조절부위(Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-658; Adames et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444), 고환, 유방, 림프 및 비만 세포에서 활성인 마우스 유방암 바이러스 조절부위(Leder et al., 1986, Cell 45:485-495), 간에서 활성인 알부민 유전자 조절부위(Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1:268-276), 간에서 활성인 알파-페토프로테인 유저나 조절부위(Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 235:53-58); 간에서 활성인 알파 1-안티트립신 유전자 조절부위(Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1:161-171), 골수성 세포에서 활성인 베타-글로빈 유전자 조절부위(Mogram et al., 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94); 뇌의 희돌기교세포에서 활성인 수초 염기성 단백질(Readhead et al., 1987, Cell 48:703-712); 골격근에서 활성인 미오신 경쇄-2 유전자 조절부위(Shani, 1985, Nature 314:283-286), 및 시상하부에서 활성인 성선자극호르몬 방출 호르몬 유전자 조절부위(Mason et al., 1986, Science 234:1372-1378).

따라서, 본 발명에 따르면, 상술한 융합 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 박테리아 또는 진핵 숙수에서 복재될 수 있는 발현 벡터는 숙주를 감염(transfect)시키는데 사용될 수 있고, 이에 의하여 생물학적으로 활성인 형태로 회수될 수 있는 융합 폴리펩티드의 생산을 위한 상기 핵산이 직접적으로 발현된다. 본 명세서에서, 생물학적으로 활성인 형태는 관련된 수용체에 결합하여 분화 기능(differentiated function)을 야기할 수 있는 형태 및/또는 상기 수용체를 발현하는 세포의 표현형에 영향을 줄 수 있는 형태를 포함한다.

핵산 삽입물을 포함하는 발현 벡터는 적어도 세 가지의 방법인 (a) DNA-DNA 혼성화, (b) "마커" 유전자 기능의 존재 또는 부재, 및 (c) 삽입된 서열의 발현으로 확인될 수 있으며, 이에 의하여 제한되는 것은 아니다. 첫 번째 방법에서, 발현 벡터에 삽입된 외래 핵산의 존재는 삽입된 핵산 서열에 상응하는 서열을 포함하는 프로브를 사용하여 DNA-DNA 혼성화로 검출할 수 있다. 두 번째 방법에서, 재조합 벡터/숙주 시스템은 벡터 내의 외래 핵산 서열의 삽입에 의하여 야기된 특정 "마커" 유전자 기능(예를 들어, 티미딘 키나아제 활성, 항생제에 대한 내성, 형질전환 표현형, 베큘로바이러스 내의 오쿨루션 바디 형성 등)의 존재 또는 부재에 기초하여 확인되고 선택될 수 있다. 예를 들어, efl 핵산 서열이 벡터의 마커유전자 서열 안에 삽입된 경우, 상기 삽입물을 포함하는 재조합체는 마커 유전자 기능의 부재에 의하여 확인될 수 있다. 세 번째 방법에서, 재조합체 발현 벡터는 재조합체 컨스트럭트에 의하여 발현된 외래 핵산 산물을 어세이하여 확인될 수 있다. 이러한 어세이는, 예를 들어, 리간드의 예를 들어 검출 가능한 항체 또는 이의 단편으로 표지된 수용체 또는 이의 부분에 대한 결합, 또는 관심 있는 단백질 또는 이의 부분에 대하여 생성된 항체에 대한 결합에 의하여, 예를 들어 관심 있는 핵산 산물의 물리적 또는 기능적 특성에 기초할 수 있다.

본 발명의 특정 변형예에서, 상기 융합 폴리펩티드는 숙주세포에서 일시적으로, 계속적으로(constitutively) 또는 영구적으로 발현될 수 있다.

본 발명은 추가적으로 VEGF-A, VEGF-B 및/또는 PlGF를 발현하는 세포, 조직 또는 장기와 관련된 질병을 갖는 환자의 치료를 위한 치료제로서의 융합 폴리펩티드의 개발에 관한 것이다. 이러한 분자는 인간 또는 동물의 신체의 치료방법, 또는 진단방법에서 사용될 수 있다.

이들 질병, 또는 다른 질병 또는 질환의 치료에 유용한 유효 복용량은 통상의 기술자에게 알려진 방법(예를 들어, Fingl, et al., The Pharmacological Basis of Therapeutics, Goodman and Gilman, eds. Macmillan Publishing Co, New York, pp. 1-46 (1975))을 사용하여 결정될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 약제학적 조성물은 담체 또는 표적화 분자(예를 들어, 항체, 호르몬, 성장인자 등)에 연결되거나 및/또는 리포좀, 마이크로캡슐 및 방출 조절제형에 포함된, 약제학적으로 허용 가능한 액체, 고체 또는 반고체 담체 내의 상술한 융합 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들어, 상기 약제학적 조성물은 멸균수, 식염수, 인산염 버퍼 또는 덱스트로스 용액과 같은 수용액 내에 융합 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 그렇지 않으면, 유효성분은 치료가 필요한 환자에게 주입될 수 있는 고체(예를 들어, 왁스) 또는 반고체(예를 들어, 젤리 같은) 제형에 포함될 수 있다. 투여 경로는 정맥 내, 척수 내, 피하, 자궁 내, 관련 있는 조직으로의 주사, 동맥 내, 비강 내, 경구 또는 이식 장치를 통한 방법을 포함하는 당해 기술분야에 알려진 모든 투여경로일 수 있다.

투여는 본 발명의 유효성분의 몸 전체 또는 국소 부위의 분포를 초래한다. 예를 들어, 신경계의 먼 부위와 관련된 일부 상황에서, 제제의 정맥 또는 척수 내 투여가 바람직하다. 특정 상황에서, 유효성분을 포함하는 이식재가 병변 내 또는 병변 주위에 놓여 질 수 있다. 적합한 이식재는 젤폼, 왁스, 스프레이 또는 미세입자 기반 이식재를 포함하며, 이에 의하여 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 또한 약제학적으로 허용 가능한 비히클 내에 상술한 융합 폴리펩티드를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 전신 또는 국부로 투여될 수 있다. 정맥 내 투여, 척수 내 투여, 동맥 내 투여, 비강 내 투여, 경구 투여, 피하 투여, 복강 내 투여, 또는 국부 주사 또는 외과수술용 이식재에 의한 투여를 포함하는 당해 기술분야에 알려진 모든 적절한 투여 방식이 사용될 수 있다. 본 발명은 지연된 방출 제형으로 제공될 수도 있다.

유전자 치료

일 구현예에서, 상기 독창적인 키메라 분자를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산은 혈관신생을 억제하기 위한 유전자 치료에 적용될 수 있다. 유전자 치료는 발현된 또는 발현될 수 있는 핵산을 개체에게 투여하여 실시되는 치료법을 의미한다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 핵산은 치료효과를 매개하는 암호화된 단백질을 생산한다.

당해 기술분야에서 이용 가능한 모든 유전자 치료방법이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 예시적인 방법을 하기에 기술하였다.

유전자 치료의 일반적인 리뷰를 위하여, Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 12:488-505 (1993); Wu and Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993); and Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993); May, TIBTECH 11(5):155-215 (1993)를 참조할 수 있다. 사용될 수 있는 재조합 DNA 기술 분야에서 잘 알려진 방법은 Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); and Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)에 기술되어 있다.

우선적으로, 핵산 서열은 적합한 숙주에서 폴리펩티드를 발현하는 발현 벡터의 부분서열로서, VEGF-Grab을 암호화할 수 있다. 특히, 이러한 핵산 서열은 폴리펩티드 코딩 영역에 작동적으로 연결되어 있는 프로모터를 가지며, 상기 프로모터는 유도성(inducible) 또는 항시성(constitutive), 및 선택적으로 조직-특이적이다. 다른 구현예에서, 핵산 분자는 원하는 게놈 위치에서의 상동 재조합을 촉진하는 부위가 양 옆에 있는 폴리펩티드 코딩 서열과 모든 다른 소망하는 서열에서 사용되어, 항체를 암호화하는 핵산의 염색체 내 발현을 가능하게 한다(Koller and Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935 (1989); Zijlstra et al., Nature 342:435-438 (1989).

핵산의 환자로의 전달은 환자가 핵산 또는 핵산 운반 벡터에 직접적으로 노출되는 직접적 방식이거나, 세포가 먼저 핵산으로 인 비트로 형질전환 된 다음 환자에게 이식되는 비직접적 방식일 수 있다. 이들 두 방식은 각각 인 비보 또는 엑스 비보 유전자 치료법으로 알려져 있다.

특정 구현예에서, 핵산 서열은 코딩 산물을 생산하기 위하여 발현되는 장소에 직접적으로 인 비보 투여된다. 이는 예를 들어, 결함이 있거나 약화된 레트로바이러스 또는 다른 바이러스 벡터를 사용하여 감염시켜, 핵산을 적합한 핵산 발현 벡터의 부분으로 구축한 후 투여하여 핵산이 세포 내 성분이 되게 하거나, 또는 네이키드 DNA를 직접 주입하거나, 또는 지질 또는 세포 표면 수용체 또는 형질감염 시약으로 코팅하거나, 리포좀, 마이크로입자 또는 마이크로캡슐로 봉입하거나, 또는 핵으로 들어가는 것으로 알려진 펩티드와 핵산을 연결한 후 투여하거나, 수용체 매개 엔도시토시스에 적용되는 리간드에 핵산을 연결한 후 투여하거나(예를 들어, Wu and Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987) 참조)(이는 수용체를 특이적으로 발현하는 세포 유형을 타겟팅하는데 사용될 수 있다)와 같은 당해 기술분야에 알려진 모든 방법에 의하여 달성될 수 있다. 다른 구현예에서, 핵산은 엔도솜을 방해하는 푸코제닉(fusogenic) 바이러스 펩티드를 포함하는 리간드와 핵산-리간드 복합체를 형성할 수 있고, 이는 핵산이 리소좀 분해를 피하게 해준다. 또 다른 구현예에서, 상기 핵산은 특이적 수용체를 표적하여 세포 특이적 이입(uptake)과 발현에 대하여 인 비보 표적이 될 수 있다. 그렇지 않으면, 상기 핵산은 상동 재조합에 의하여, 발현을 위하여 숙주세포 DNA 내로 통합되거나 세포 내로 도입될 수 있다(Koller and Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935 (1989); Zijlstra et al., Nature 342:435-438 (1989)).

특정 구현예에서, 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열이 포함된 바이러스 벡터가 사용된다. 유전자 치료에서 사용될 상기 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 하나 이상의 벡터에 클로닝되고, 이는 유전자의 환자로의 전달을 용이하게 한다. 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스가 사용될 수 있는 바이러스 벡터의 예이다. 레트로바이러스 벡터는 바이러스 게놈의 올바른 패키징과 숙주세포 DNA로의 통합에 필요한 구성요소를 포함한다.

아데노바이러스는 아데노바이러스가 가벼운 병을 야기하는 호흡상피에 자연적으로 감염하기 때문에, 호흡상피로 유전자를 전달하는데 특히 매력적인 전달체이다. 아데노바이러스 기반 전달 시스템의 다른 표적은 간, 중추신경계, 상피세포 및 근육이다. 아데노바이러스는 비분열 세포(non-dividing cells)를 감염시킬 수 있는 이점을 갖는다. 또한, 아데노-연관 바이러스(AAV)는 유전자 치료에서의 사용이 제안된바 있다.

유전자 치료의 다른 방식은 전기천공, 리포펙타민, 칼슘 포스페이트 매개 트랜스펙션 또는 바이러스 감염과 같은 방법에 의하여 조직 배양물 내의 세포로 유전자를 이동시키는 것과 관련된다. 일반적으로, 이동 방법은 선별 마커를 세포로 이동시키는 것을 포함한다. 상기 세포는 이후 이동한 유전자를 받아 발현하는 세포를 분리하기 위한 선별 과정을 겪는다. 이들 세포는 이후 환자에게 전달된다.

본 구현예에서, 핵산은 최종적인 재조합 세포의 인 비보 투여에 앞서 세포로 도입된다. 이러한 도입은 트랜스펙션, 전기천공, 마이크로 주입, 핵산 서열을 포함하는 바이러스 또는 박테리오파지 벡터로 감염, 세포 융합, 염색체 매개 유전자 이동, 마이크로세포 매개 유전자 이동, 스페로플라스트 융합 등을 포함하는 당해 기술분야에 알려진 모든 방법에 의하여 실시될 수 있다. 외래 유전자를 세포로 도입하기 위한 많은 방법이 당해 기술분야에 알려져 있고, 이 방법은 수용 세포의 발달적 또는 생리적 기능이 손상되지 않는다면 본 발명에 부합되게 사용될 수 있다. 상기 기법은 핵산이 세포에 의하여 발현 가능하고 유전되어, 세포 자손에 의하여 발현 가능하도록, 핵산의 세포로의 안정적 전달을 가능하게 하여야 한다.

유전자 치료 목적을 위하여 핵산이 도입되는 세포는 모든 이용 가능한 세포 유형을 포함하며, 여기에는 상피 세포, 내피 세포, 케라티노사이트, 섬유아세포, 근육 세포, 간세포; T-림프구, B-림프구, 단핵구, 대식세포, 중성구, 호산구, 거핵구, 과립구와 같은 혈액 세포; 다양한 줄기세포 또는 선조세포(progenitor cell), 특히, 예를 들어 골수, 제대혈, 말초혈액, 태아 간에서 얻은 조혈 줄기 또는 선조세포 등이 포함되며, 이에 의하여 제한되는 것은 아니다.

바람직한 일 구현예에서, 유전자 치료를 위하여 사용되는 세포는 환자의 자가 유래이다.

재조합 세포가 유전자 치료에 사용되는 구현예에서, 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 세포로 도입되어, 세포 또는 이의 자손에 의하여 발현될 수 있고, 상기 재조합 세포는 이후 치료효과를 위하여 인 비보 투여된다. 특정예에서, 줄기세포 또는 선조세포가 사용된다. 인 비트로에서 분리되고 유지될 수 있는 모든 줄기세포 및/또는 선조세포는 본 발명의 상기 특정예에 부합되게 사용될 수 있다.

특정예에서, 유전자 치료를 위하여 도입되는 핵산은 코딩 부위에 작동적으로 연결된 유도성 프로모터를 포함하며, 그 결과 전사의 적절한 유도 인자의 존재 또는 부재를 조절함으로써 핵산의 발현이 조절된다.

치료용 조성물

일 구현예에서, 본 발명은 원치 않는 혈관 형성으로 특징지어지는 다양한 질병의 치료에 관한 것이다. 상기 독창적인 치료용 복합물은 상기 질병이 발병하거나, 또는 발병할 우려가 있는 인간 환자에게 투여되어, VEGF-A, VEGF-B 및/또는 PIGF에 결합하는 분자를 제공할 수 있다.

치료용 물질의 제형은 일반적으로 당해 기술분야에 잘 알려져 있고, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., USA를 참조할 수 있다. 예를 들어, 하루에 체중 kg 당 약 0.05 ng 내지 약 20 mg이 투여될 수 있다. 복용법은 최적의 치료반응을 제공하기 위하여 조절될 수 있다. 예를 들어, 몇 차례로 나눈 복용량이 매일 투여될 수 있고, 또는 복용량은 치료 상황의 긴급에 따라 비례적으로 줄여질 수 있다. 유효성분은 경구, 정맥 내(수용성 장소), 근육 내, 피하, 비강 내, 안 내, 피부 내, 좌약 또는 이식(예를 들어, 복강 내 경로를 통한 지연 방출성 분자를 이용하여, 또는 예를 들어 인 비트로에서 감작되고 수용체로 전달된 단핵구 또는 수지상세포와 같은 세포를 사용하여)과 같은 편리한 방법으로 투여될 수 있다. 투여 경로에 의존적으로, 상기 펩티드는 효소의 작용, 산 및 성분을 불활성화 시킬 수 있는 기타 자연적 상황으로부터 펩티드를 보호하기 위한 물질로의 코팅이 필요할 수 있다.

예를 들어, 상기 펩티드의 낮은 친유성은 위장관에서 펩티드 결합을 절단할 수 있는 효소에 의하여, 또는 위에서 산 가수분해에 의하여 펩티드가 분해되도록 만들 수 있다. 비경구 이외의 방법으로 펩티드를 투여하기 위하여, 펩티드는 불활성화를 방지하기 위한 물질로 코팅되거나 이러한 물질과 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, 펩티드는 어쥬번트 형태로 투여되거나, 효소 억제제와 함께 투여되거나, 또는 리포좀 형태로 투여될 수 있다. 본 명세서에서, 어쥬번트는 레조르시놀(resorcinol), n-헥사데실 폴리에틸렌 에테르와 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르와 같은 비이온성 계면활성제를 포함하는 것으로 이해된다. 효소 억제제는 췌장 트립신 억제제, DEP(diisopropylfluorophosphate) 및 트라시롤(trasylol)을 포함한다. 리포좀은 일반적인 리포좀 뿐만 아니라, water-in-oil-in-water CGF 에멀전을 포함한다.

유효성분은 비경구적으로 또는 복강 내로 투여될 수 있다. 분산은 글리세롤 액상 폴리에틸렌글리콜과 이들의 혼합물, 및 오일에서 이루어질 수 있다. 저장과 사용의 일반적인 조건 하에서, 이러한 제제는 미생물의 성장을 방지하기 위한 방부제를 포함한다.

주사 용도에 적합한 약제학적 제형은 멸균 수용액(수용성) 또는 현탁액 및 멸균 주사액 또는 현탁액의 처방전에 따른 조제를 위한 멸균 파우더를 포함한다. 모든 경우에 있어, 상기 제형은 멸균되어야 하고, 주사를 쉽게 하기 위하여 유체여야 한다. 상기 제형은 제조와 저장 조건 하에서 안정해야 하고, 박테리아와 곰팡이와 같은 미생물의 오염을 방지해야 한다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예컨대, 글리세롤, 프로필렌글리콜 및 액상 폴리에틸렌글리콜 등), 이들의 적절한 혼합물 및 식물성 오일이 포함된 용매 또는 분산매일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅제를 사용하여, 현탁액의 경우에 요구된 입자 크기를 유지하여, 및 계면활성제를 사용하여 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 예를 들어 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티오머살(theomersal) 등과 같은 다양한 항균제와 항진균제를 사용하여 이루어질 수 있다. 많은 경우에, 예를 들어 당 또는 염화나트륨과 같은 등장화제를 포함하는 것이 바람직하다. 주사용 조성물의 연장된 흡수는 예컨대 알루미늄 모노스테아레이드와 젤라틴과 같은 흡수를 지연시키는 제제를 사용하여 이루어질 수 있다.

멸균 주사용액은 요구된 양의 유효성분을 위에서 열거한 다양한 성분들(필요한 경우)과 함께 적절한 용매에 포함시킨 후 여과 살균하여 제조할 수 있다. 일반적으로, 현탁액은 다양한 멸균된 유효성분을 기본 분산매와 위에 열거한 성분들에서 선택된 필요한 성분이 포함된 멸균 비히클에 포함시켜 제조한다. 멸균 자수용액의 제조를 위한 멸균 파우더의 경우에는, 미리 멸균 여과 처리된 용액 유래의 추가적인 요구성분과 유효성분이 포함된 파우더를 만드는 진공 건조와 동결 건조 기술을 사용하는 것이 바람직하다.

상기 펩티드가 상술한 바와 같이 적절하게 보호된 경우, 유효성분은 예를 들어, 불활성 희석액 또는 동화할 수 있는 식용 담체와 함께, 또는 단단하거나 부드러운 젤라틴 캡슐에 동봉되어, 또는 정제로 제제되어, 또는 식품에 직접 포함되어 경구적으로 투여될 수 있다. 경구 투여를 위하여, 상기 유효성분은 부형제에 포함되어, 삼킬 수 있는 정제, 버컬정(buccal tablet), 트로키제(troches), 캡슐, 엘릭시르제(elixir), 현탁제, 시럽, 오블라토(wafer) 등의 형태로 사용될 수 있다. 이러한 조성물과 제제는 적어도 1중량%의 유효성분을 포함해야 한다. 물론, 상기 조성물과 제제의 비율은 달라질 수 있고, 유닛(unit)이 약 5중량% 내지 약 80중량%일 수 있다. 이러한 치료적으로 유용한 조성물 내의 유효성분의 양은 적절한 복용량을 얻을 수 있는 양이다. 본 발명의 바람직한 조성물 또는 제제는 유효성분을 약 0.1 ㎍ 내지 2000 mg으로 포함하는 경구용 단위 제형으로 제조된다.

정제, 알약, 캡슐 등은 또한 다음을 포함할 수 있다: 크라가탄트 검, 아카시아, 옥수수 전분 또는 젤라틴과 같은 결합제; 인산이칼슘과 같은 부형제; 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산 등과 같은 붕해제; 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제; 및 수크로오스, 락토오스와 같은 감미제, 사카린이 첨가될 수도 있고, 또는 페퍼민트, 노루발린 오일 또는 체리 조미료와 같은 향료. 단위 제형이 캡슐인 경우, 위에서 언급한 물질에 더하여 액상 담체를 더 포함할 수 있다. 다양한 다른 물질들이 코팅제로 포함될 수 있고, 그렇지 않으면 다양한 다른 물질들이 제향의 물리적 형태를 변경하기 위하여 포함될 수 있다. 예를 들어, 정제, 알약 또는 캡슐은 쉘락, 당 또는 둘 모두로 코팅될 수 있다. 시럼 또는 엘릭시르제는 유효성분, 감미제로서 수크로오스, 방부제로서 메틸과 프로필파라벤, 염료 및 체리 또는 오렌지 조미료와 같은 향료를 포함할 수 있다. 물론, 단위 제형의 제조에 이용되는 모든 물질은 약제학적으로 순수해야 하고, 적용된 양에서 실질적으로 비독성이어야 한다. 또한, 유효성분은 서방형 제제 또는 제형에 포함될 수 있다.

전달 시스템

다양한 전달 시스템이 알려져 있고, 예를 들어, 리포좀 내 봉입, 마이크로입자, 마이크로캡슐, 본 발명의 물질을 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체 매개 엔도시토시스, 레트로바이러스 또는 다른 벡터의 부분으로 핵산을 구축하는 것 등과 같은 방법을 본 발명의 물질을 투여하는데 사용할 수 있다. 도입 방법은 피부 내, 근육 내, 복강 내, 정맥 내, 피하, 비강 내, 안 내, 경막 외 및 경구 루트를 포함하며, 이에 의하여 제한되는 것은 아니다. 상기 물질 또는 조성물은, 예를 들어, 인퓨전 주사 또는 볼루스 주사, 상피 또는 점막피부 내벽(mucocutaneous linings)(예를 들어, 구강 점막, 직장 점막과 장 점막 등)을 통한 흡수와 같은 모든 일반적인 경로로 투여될 수 있고, 다른 생물학적 유효성분과 함께 투여될 수도 있다. 투여는 전신적 또는 국부적일 수 있다. 또한, 본 발명의 약제학적 물질 또는 조성물은 심실 내 주사와 척수 내 주사를 포함하는 모든 적합한 경로로 중추신경계로 도입되는 것이 바람직하고, 심실 내 주사는 심실 내 카테터, 예를 들어 Ommaya 저장고(reservoir)와 같은 저장고에 붙어 있는 카테터에 의하여 용이하게 이루어질 수 있다. 예를 들어, 흡입기 또는 분무기의 사용, 및 에어로졸화제로 제제화 함으로써 폐 투여 또한 적용될 수 있다.

특정 구현예에서, 본 발명의 물질 또는 조성물은 치료가 필요한 부위로 국소 투여되는 것이 바람직하고, 이는 예를 들어, 수술 중 국소 주입, 예컨대, 수술 후 상처 드레싱과 함께 국소 도포, 주사, 카테터, 좌약, 또는 실라스틱 막과 같은 막 또는 섬유를 포함하는 다공성, 비다공성 또는 젤라틴 재료와 같은 이식재에 의하여 달성될 수 있으며, 이에 의하여 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는, 항체 또는 본 발명의 펩티드를 포함하는 단백질을 투여하는 경우, 상기 단백질이 흡수하지 않는 물질의 사용에 주의를 기울어야한다. 다른 구현예에서, 상기 물질 또는 조성물은 비히클, 특히 리포좀 형태로 전달될 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 물질 또는 조성물은 방출 조절 시스템으로 전달될 수 있다. 일 구현예에서, 펌프가 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 폴리머 물질이 사용될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 방출 조절 시스템이 치료 표적에 인접하여 위치할 수 있고, 이에 따라 전신 복용량(systemic dose)의 오직 일부만을 사용할 수 있다.

표지(Labels)

적절한 효소 표지는 예를 들어, 물질과 반응하여 과산화수소의 생성을 촉매하는 산화 효소 유래의 표지를 포함한다. 글루코오스 산화 효소는 우수한 안정성과 이의 기질(글루코오스)을 쉽게 구할 수 있기 때문에 특히 선호된다. 산화 효소 표지의 활성은 효소 표지된 항체/기질 반응에 의하여 형성된 과산화수소의 양을 측정하여 분석될 수 있다. 효소 외에 다른 적합한 표지는 요오드(¹²⁵I, ¹²¹I), 탄소(¹⁴C), 황(³⁵S), 삼중수소(³H), 인듐(¹¹²In) 및 테크네튬(^99mTc)과 같은 방사성 동위원소, 플루오레세인과 로다민과 같은 형광 표지, 및 비오틴을 포함한다.

적절한 효소 표지의 예는 말레이트 탈수소효소, δ-5-스테로이드 이성질화 효소, 이스트-알코올 탈수소효소, α-글리세롤 포스페이트 탈수소효소, 트리오즈 인산염 이성질화 효소, 과산화효소, 알칼라인 포스파타아제, 아스파라기나아제, 글루코오스 산화효소, β-갈락토시다아제, 리보뉴클레아제, 요소가수분해효소, 카탈라아제, 글루코오스-6-포스페이트 탈수소효소, 글루코아밀라아제 및 아세틸콜린 에스테라아제를 포함한다.

적합한 방사성 동위원소 표지의 예는 ³H, ¹¹¹In, ¹²⁵I, ¹³¹I, ³²P, ³⁵S, ¹⁴C, ⁵¹Cr, ⁵⁷To, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁷⁵Se, ¹⁵²Eu, ⁹⁰Y, ⁶⁷Cu, ²¹⁷Ci, ²¹¹At, ²¹²Pb, ⁴⁷Sc, ¹⁰⁹Pd 등을 포함한다. 간에 의한 ¹²⁵I 또는 ¹³¹I 표지된 폴리펩티드의 할로겐 이탈 문제를 막을 수 있기 때문에, 인 비보 이미징에 사용되는 경우에는 ¹¹¹In이 바람직한 동위원소이다. 또한, 이 방사성 뉴클레오티드(radionucleotide)는 이미징에 보다 바람직한 감마선 방출 에너지를 가지고 있다. 예를 들어, 1-(P-isothiocyanatobenzyl)-DPTA를 갖는 단일클론항체에 커플링 된 ¹¹¹In은 비종양 조직, 특히 간에서 거의 흡수되지 않았고, 이에 따라 종양 위치확인(tumor localization)의 특이성이 증가되었다.

비-방사성 동위원소 표지의 예는 ¹⁵⁷Gd, ⁵⁵Mn, ¹⁶²Dy, ⁵²Tr 및 ⁵⁶Fe을 포함한다.

적합한 형광 표지의 예는 ¹⁵²Eu 표지, 플루오레세인 표지, 이소티오시안염(isothiocyanate) 표지, 로다민 표지, 피코에리트린 표지, 피코시아닌 표지, 알로피코시아닌 표지, o-프탈알데하이드 표지 및 플루오레사민 표지를 포함한다.

적합한 독소 표지의 예는 슈도모나스 독소, 디프테리아 독소, 리신 및 콜레라 독소를 포함한다.

화학발광 표지의 예는 루미날 표지, 이소루미날 표지, 방향족 아크리디늄 에스테르 표지, 이미다졸 표지, 아크리디늄 염 표지, 옥살레이트 에스테르 표지, 루시페린 표지, 루시퍼라아제 표지 및 에쿼린 표지를 포함한다.

핵자기 공명 조영제의 예는 Gd, Mn 및 철과 같은 중금속 핵종(heavy metal nuclei)을 포함한다. 듀테륨이 사용될 수도 있다. EPR, PET 또는 통상의 기술자에게 알려진 다른 이미징 메커니즘을 위한 다른 조영제도 있다.

상술한 표지를 폴리펩티드에 결합시키는 전형적인 기술은 Kennedy et al.(Clin. Chim. Acta 70:1-31 1976 and Schurs et al. Clin. Chim. Acta 81:1-40, 1977)에 제시되어 있다. 커플링 기술은 글루타알데하이드법, 과옥소산염(periodate)법, 디말레이미드법, m-말리이미도벤질-M-하이드록시-숙신이미드 에스테르법을 포함하며, 이들 방법 모두는 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

단편을 포함한 본 발명의 폴리펩티드와 항체는 바이오칩 및 바이오센서 기술을 사용하여 VEGF-Grab/리간드 복합체를 검출하는데 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 바이오칩과 바이오센서는 VEGF-Grab/리간드 복합체를 검출하기 위하여, 본원발명의 폴리펩티드를 특이적으로 인식하는 항체를 포함할 수 있다.

본원발명은 상술한 특정 구현예의 범위에 의하여 제한되지 않는다. 명세서에 기재된 것과 더불어 발명의 다양한 변형은 앞서 설명한 내용과 수반된 도면으로부터 통상의 기술자에게 명백하게 될 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구항의 범위에 속하는 것으로 의도된다. 다음의 실시예는 본원발명의 설명의 수단으로 제공되며, 본원발명을 제한하지 않는다.

실시예

실시예 1 - 실험재료 및 실험방법

실시예 1.1 - 세포주

본 실험의 모든 세포주(HUVEC (CC-2519, Lonza), dhfr-결실 CHO 세포(CRL-9096, ATCC) 및 LLC 세포(CRL-1642, ATCC))는 6개월 이상 배양하지 않았다.

실시예 1.2 - 재조합 단백질의 생산

인간 IgG1의 Fc 도메인(Fc로 칭함)에 융합된 인간 VEGFR1(아미노산 잔기 132-331)을 pCMV-dhfr 벡터(26,27)에 클로닝 하였다. 일련의 VEGF-Grab들을 위치 특이적 돌연변이(site directed mutagenesis)를 통하여 제조하였다. VEGF-Grab 컨스트럭트로 dhfr-결실 CHO 세포를 트랜스펙션 하였다. 트랜스펙션 된 세포를 G418로 선별하고, 메토트렉세이트(methotrexate)를 점진적으로 늘려 처리하여(0.001-0.5 μM) 유전자를 증폭시켰다. 이후, 세포를 0.5 μM의 메토트렉세이트가 포함된 HyQSFM4CHO(ThermoScientific) 배지에서 자라게 하였다. VEGF-Grab과 VEGF-Trap(6)을 단백질 A-세파로스 친화 크로마토그래피를 통하여 정제하였다. 정제된 단백질을 브래드포드 분석으로 정량하고, SDS-PAGE 후 쿠마시 블루 염색을 하여 확인하였다.

실시예 1.3 - 등전점 전기영동(Isoelectric Focusing) 분석

VEGF Grab(G1 및 G3) 및 VEGF Trap(VT)의 등전점을 분석하기 위하여, 단백질 5 ㎍과 IEF 마커(Novex)를 pH 3-10 범위의 IEF 겔(Novex)에 로딩하고, 100 V에서 1시간, 200 V에서 1시간, 500 V에서 30분간 전기영동 하였다. 전기영동 후, 겔을 silver staining 키트(Elpis)를 사용하여 염색하였다.

실시예 1.4 - 인 비트로 ECM 결합 어세이

단계 희석된 G1, G3 또는 VT(5-80 nM)를 ECM 코팅 플레이트(Becton Dickinson)에 처리하였다. 세척 후, HRP 컨쥬게이트 된 염소 항-인간 Fc 항체를 첨가하고, TMB 용액을 첨가하였다. 흡광도를 ELISA 리더기를 사용하여 450 nm에서 측정하였다.

실시예 1.5 - 인 비보 ECM 결합 어세이

100 nM의 VR1-Fc, VT 또는 G3를 어떠한 단백질 치료제도 처리되지 않은 종양 부위(section)에 처리하고, 비특이적으로 결합된 VR1-Fc, VT 또는 G3를 항-인간 Fc-cy3 항체를 사용하여 검출하였다. ECM 마커로서, ECM의 기저판(basal lamina)에서 주로 발견되는 콜라겐 타입 IV를 FITC로 대비염색 하였다.

실시예 1.6 - 고상(Solid phase) 결합 어세이

리간드에 대한 VEGF-Grab의 결합 친화도를 이전에 문헌(28)에 따라 ELISA로 측정하였다. 요약하면, MaxiSorp 플레이트(Nunc)를 hVEGF-A₁₆₅(150 ng/㎖), PlGF(62.5 ng/㎖) 또는 hVEGF-B(125 ng/㎖)로 코팅하고, VEGF-Grab 또는 VEGF-Trap을 단계적으로 증가된 양(0.1 nM-10 μM)으로 첨가하였다. 세척 후, 플레이트를 HRP 컨쥬게이트 된 염소 항-인간 Fc 항체와 함께 인큐베이션 하였다. 이후, 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine(TMB) 용액(Sigma-Aldrich)을 첨가하고, 흡광도를 ELISA 리더기(BioRad)로 450 nm에서 측정하였다.

실시예 1.7 - 탈당화 형태의 N-당화 펩티드(de-N-glycosylated peptides)의 제조

당단백질을 열로 변성시키고, 디티오트레이톨(dithiothreitol) 및 요오드아세트아미드(iodoacetamide)를 각각 사용하여 환원 및 알킬화 하였다. 트립신(Promega, Madison, WI)을 1:50(w/w)의 효소 대 단백질 비율로 첨가하고, 혼합물을 37℃의 온도에서 16시간 동안 인큐베이션 하였다. 펩티드/당펩티드(glycopeptide)를 C18 peptide trap(Michrom, Auburn, CA)을 사용하여 농축한 다음, speedvac으로 건조시켰다. N-당펩티드를 2 ㎕의 펩티드 N-글리코시다아제 F(New England Biolabs, Ipswich, MA)와 함께 37℃에서 16시간 동안 인큐베이션 하여 탈당화 시켰다. 펩티드를 C18 peptide trap(Michrom, Auburn, CA)을 사용하여 농축하고, speedvac으로 건조시켰다.

실시예 1.8 - N-글리칸의 효소에 의한 방출

N-글리칸 방출(release) 및 관련된 처리 과정을 이전의 문헌(29)에 따라 실시하였다. 요약하면, 당단백질을 열로 변성시키고, 37℃에서 16시간 동안 펩티드-N-글리코시다아제 F로 분해(digestion)하기 전에 탄산수소암모늄과 디티오트레이톨 수용액에서 환원시켰다.

실시예 1.9 - 흑연화 탄소 SPE를 이용한 글리칸과 짧은 당펩티드의 농축

방출된 글리칸 및 당펩티드를 이전의 문헌(29)에 따라 흑연화 탄소 고상 추출법(graphitized carbon solid-phase extraction)을 사용하여 정제하였다. 요약하면, 흑연화 탄소 카트리지(Grace Davison, Deerfield, IL)를 수용액 상태의 조건으로 만들고, 수용성 N-글리칸 용액을 로딩한 다음 물로 세척하였다. N-글리칸을 물에 용해된 20% 아세토니트릴, 40% 아세토니트릴 및 0.05%(v/v) 트리플루오로아세트산으로 단계적으로 희석하였다. 샘플들을 speedvac으로 건조시켰다.

실시예 1.10 - VEGFR2 활성화 검출을 위한 면역블랏

EGM-2(Lonza)에서 자란 HUVEC 세포주가 컨플루언시에 도달하게 되면, 세포를 OPTI-MEM(Invitrogen)에서 하룻밤 동안 혈청이 없는 상태로 키웠다. 이후, VEGF-Grab 또는 VEGF-Trap(2 ㎍/㎖, 14 nM)을 15분간 처리한 다음 VEGF-A(50 ng/㎖, 1 nM)를 10분간 처리하였다. 처리 후, 세포를 1 X PBS로 세척하고, 용해 버퍼로 용해시켰다. 이후, 50 ㎍의 총 단백질을 10% SDS-PAGE에 로딩하고, 니트로셀룰로오스 막에 옮긴 다음 항-인산-VEGFR2 및 항-인산-ERK1/2 항체(Cell signaling)로 면역블랏 하였다. 스트리핑(stripping) 후, VEGFR2 및 ERK1/2 역시 면역블랏 하였다.

실시예 1.11 - 세포 이동 어세이(Migration Assay)

HUVEC를 μ-dish(Ibidi)의 culture-insert에 분주하였다. 세포가 컨플루언시에 도달한 후, culture-insert를 제거하였다. 이후, 상처 안에서 이동한 세포를 EBM-2(Lonza)에서 VEGF-A(50 ng/㎖, 1 nM) 및 단백질(2 ㎍/㎖, 14 nM)을 처리하고, 12시간 동안 관찰하였다.

실시예 1.12 - 관 형성 어세이(Tube Formation Assay)

환원형(reduced) 성장인자가 포함된 마트리겔(BD Biosciences)로 24웰 플레이트를 코팅하였다. HUVEC를 분주하고(5 X 10⁴ 세포/웰), VEGF-Grab 또는 VEGF-Trap(2 ㎍/㎖, 14 nM)을 처리하였다. 15분 후, VEGF-A(50 ng/㎖, 1 nM)를 첨가하고, 12시간 동안 인큐베이션 하였다. 현미경 상의 이미지를 얻었다.

실시예 1.13 - 세포 생존 어세이(Cell Survival Assay)

분주된 HUVEC가 컨플루언시에 도달한 후, VEGFA (0.2 nM)의 존재 또는 부재 하에서, 세포를 VEGF-Grab 또는 VEGF-Trap(0.35, 0.7, 3.5, 7, 35 및 70 nM)의 처리와 함께 OPTI-MEM(Invitrogen)에서 혈청이 없는 상태에서 키웠다. 36시간 후, WST-1(water-soluble tetrazolium salt, DOGEN)을 첨가하고, 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

실시예 1.14 - 세포 이동 어세이(Migration Assay)

70 ㎕의 HUVEC를 5 X 10⁵ 세포/㎖의 밀도로 μ-dish(Ibidi)의 culture-insert에 분주하였다. 세포가 컨플루언시에 도달한 후, culture-insert를 제거하였다. 이후, 상처 안에서 이동한 세포를 EBM-2(Lonza)에서 VEGF-A(50 ng/㎖) 및 기재된 단백질(2 ㎍/㎖)을 처리하고, 12시간 동안 관찰하였다. 현미경 상의 이미지를 얻었다.

실시예 1.15 - 마우스

SPF(Specific pathogen-free) 수컷 C57BL/6J 및 암컷 MMTV-PyMT 트랜스제닉 마우스(FVB/N)를 Jackson Laboratory에서 구입하였다. 모든 마우스를 죽이기 전에 80 mg/kg의 케타민과 12 mg/kg의 자일라진(xylazine)으로 마취하였다. 눈 실험을 위하여, 총 15마리의 C57BL/6J 마우스(6주령, 18-20 g)를 사용하였다. 모든 마우스는 눈 및 시력 연구의 동물 이용에 관한 ARVO(Association for Research in Vision and Ophthalmology) 선서에 따라 처리되었다. 모든 동물의 관리와 실험절차는 KAIST의 동물 관리 위원회(Animal Care Committee)로부터의 승인(KA2013-42) 하에 실시되었다.

실시예 1.16 - PK 분석

C57BL/6J 마우스(~25 g)에 4, 10 또는 25 mg/kg의 VEGF-Grab 및 VEGF-Trap을 피하 주사하였다. 주사 후 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 96 및 144시간째에 꼬리로부터 혈액 샘플을 채취하였다. 혈청 내 단백질 수준을 ELISA로 측정하였다.

실시예 1.17 - 종양 모델 및 치료요법

쥐 루이스 폐암종(Murine Lewis lung carcinoma, LLC) 세포(100 ㎕ 내 1 X 10⁶ 세포)를 마우스(8-10주령)의 등쪽 부위에 피하 주사하였다. 종양 크기를 0.5 X 길이 X 넓이²에 따라 계산하였다. 각 시점에 VEGF-Grab3 또는 VEGF-trap(지시된 투여량으로)을 복강 내 투여하였다. G3와 화학 요법의 병용 치료를 위하여, 시스플라틴(10 mg/kg, Sigma-Aldrich)을 9일째에 VT 또는 G3가 투여된 LLC 종양을 갖는 마우스에 복강 내 투여하였다. 자연 유방암 모델(spontaneous breast cancer model)에서의 항암 효과를 평가하기 위하여, 암컷 MMTV-PyMT 마우스(12주령)에 VT 또는 G3(25 mg/kg)을 3주간 주당 두 번 IP 투여하였다. 마우스를 마취하고, 원발성 종양(primary tumor, LNs) 및 장기를 조직학적 분석을 위하여 채취하였다. 동물의 관리와 실험절차는 KAIST의 동물 관리 위원회로부터의 승인(KA2013-42) 하에 실시되었다.

실시예 1.18 - 실시간 정량 PCR

RNeasy plus mini 키트(Qiagen)를 사용하여 종양 샘플에서 전체 RNA를 추출하고, SuperScriptII 역전사효소(Invitrogen)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 실시간 정량 PCR을 프라이머 세트(표 5에 기재)를 이용하여, TOPreal^TM qPCR SYBR premix(Enzynomics)와 CFX96 실시간 PCR 검출 시스템(Bio-Rad)을 사용하여 실시하였다. 실시간 PCR 결과는 CFX manager 소프트웨어(Bio-Rad)를 사용하여 분석하였다.

실시예 1.19 - 조직학적 분석

이전의 문헌(30)에 따라 종양을 처리하고 염색하였다. 동결 샘플을 절단하고, 항체(표 6에 기재)로 염색하였다. 종양의 저산소 부위를 관찰하기 위하여, Hypoxyprobe-1^TM(60 mg/kg, solid pimonidazole hydrochloride, Hypoxyprobe)를 희생 90분 전에 정맥 주사하였다. 종양을 모은 후, 절단하고, FITC 결합 항-Hypoxyprobe 항체로 염색하였다. CD11b⁺, cytokeratin⁺ 및 caspase3⁺ 면적을 총 섹션 면적에 대한 백분율로 계산하였다.

실시예 1.20 - 눈 치료 절차

일반적인 마취 후에 C57BL/6J 마우스에 다이오드 532 nm 레이저(Lumenis Inc., Santa Clara, CA) 처리를 하였다. 동공(pupils)을 확장시키기 위하여, 각 마우스의 각 눈에 0.5% 트로픽아미드(tropicamide) 및 0.5% 페닐레프린(phenylephrine; Mydrin-P^ⓡ; Santen Pharmaceutical, Osaka, Japan)을 한 방울씩 떨어뜨린 후, RPE와 밑에 있는 부르크막을 파열시켜 맥락막신생혈관을 유도하였다. 부르크막의 파괴는 시신경 원판(optic disc)을 제외한 디스크 직경의 2배에 100 mW의 파워, 75 ㎛의 스팟 크기 및 100 ms의 지속기간을 가하여 유도하였다. 맥락막신생혈관 억제 분석을 위하여, 마우스를 임의적으로 세 개의 그룹으로 분류하였다: 시판 중인 약물인 Eylea(Aflibercept)(농도, 25 mg/㎖; 투여량, 2 ㎕)를 유리체강 내 투여한 VEGF-Trap 처리 그룹, Aflibercept는 등장액(10 mM sodium phosphate, 40 mM sodium chloride, 0.03% polysorbate 20 및 5% sucrose[pH 6.2])에 용해됨; VEGF-Grab3(농도, 25 mg/㎖; 투여량, 2 ㎕)를 유리체강 내 투여한 VEGF-Grab3 처리 그룹; 및 PBS(phosphate-buffered saline)(2 ㎕)를 투여한 대조군. 이전의 문헌(31)과 같이 산소 유도를 통하여 마우스를 이용하여 산소유도망막병증 모델을 만들었다. 요약하면, 7일령[출생 후 7일 (P7)] C57BL/6J 마우스 신생아 새끼(litters) 및 이들의 어미를 닫힌 고산소 챔버에 5일간 놓았다. 75%의 산소농도를 유지하고, 마우스에 표준 마우스 식이와 물을 제한 없이 공급하였다. 이후, P12째에 새끼와 어미를 실내 공기(산소 정상 상태) 상태로 다시 옮겼다. 이후, 산소유도망막병증 퇴행 분석(OIR regression analysis)을 위하여, 마우스를 세 개의 그룹으로 임의적으로 분류하였다: 시판 중인 약물인 Eylea(Aflibercept)(농도, 25 mg/㎖; 투여량, 1 ㎕)를 유리체강 내 투여한 VEGF-Trap 처리 그룹; VEGF-Grab3(농도, 25 mg/㎖; 투여량, 1 ㎕)를 유리체강 내 투여한 VEGF-Grab3 처리 그룹; 및 PBS(phosphate-buffered saline)(1 ㎕)를 투여한 대조군. P17째에, 분석을 위하여 마우스를 안락사 시켰다.

실시예 1.21 - 안구 샘플 절제 및 처리

맥락막신생혈관 모델에 대한 레이저 광응고법 시행 2주 후 및 산소유도망막병증 새끼가 태어난지 17일 후, 모든 마우스를 마취시키고 25 mg/㎖의 FITC(fluorescein isothiocyanate)-표지된 덱스트란(2 X 10⁶ 평균 분자량, Sigma, St. Louis, MO)이 포함된 1 ㎖의 PBS로 왼쪽 심실을 통하여 관류하였다(perfuse). 자궁 탈구를 통하여 마우스를 희생시킨 후, 안구를 적출하고 PBS에 용해된 2% 파라포름알데하이드(PFA)로 상온에서 5분간 고정하였다. 해부용 현미경 하에서 각막, 수정체 및 유리체를 제거하였다. 열린 안배(eyecup)를 1% PFA에 20분간 삽입하였다. 남아있는 망막/맥락막/공막 복합체를 글라스 슬라이드 위에 놓았다. 평평한 마운트(mount)를 제조하기 위하여 망막/맥락막/공막 안배를 4개의 방사상으로 절개하였다. 기저(underlying) RPE/맥락막/공막으로부터 망막을 조심스럽게 분리하고, 별도로 평평하게 놓았다. 맥락막과 망막의 맥관 구조(vasculature)를 조사하기 위하여, 햄스터 항-PECAM-1/CD31(hamster anti-mouse, clone 2H8, MAB1398Z, Millipore, 1:200)과 함께 인큐베이션 하였다. 간략히, 0.4% Triton X-100(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 5% 정상 염소 혈청(DAKO, Hamburg, Germany) 및 20% 디메틸 설폭사이드(DMSO; Sigma, St. Louis, MO)가 함유된 PBS로 블로킹한 후, RPE/맥락막/공막 평면 마운트(flat-mounts)를 블로킹 버퍼에 용해된 햄스터 항-PECAM-1/CD31 1차 항체와 함께 4℃에서 2일간 인큐베이션 하였다. 항-PECAM-1/CD31 항체는 내피세포의 표면에 결합하고, 선택적으로 쥐 맥관 구조를 표지한다. PBS로 세척한 후, 평면 마운트를 2차 항체로서 블로킹 버퍼에 용해된 TRITC(tetramethylrhodamine isothiocyanate)-결합된 염소 항-아메리칸 햄스터 IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., 1:200)와 함께 4℃에서 2일간 인큐베이션 하였다. PBS로 세척한 후, 세포 핵을 10 ㎍/㎖의 4'6-diamidino-2-phenylindole(DAPI, Sigma)로 염색하였다.

실시예 1.22 - 항체

실험에 사용한 항체를 표 6에 나타내었다.

실시예 1.23 - 이미징 및 정량

평면 마운트를 맥락막신생혈관에 대하여 조사하였다. 이후, 스캐닝 레이저 공초점 현미경(Zeiss - LSM780, Zeiss, Jena, Germany)을 사용하여 Z-stack 이미지를 캡처하였다. 녹색으로 염색된 FITC-표지 덱스트란으로 채워진 맥관 구조 및 맥락막신생혈관 복합체를 레드 채널(TRITC가 결합된 항-PECAM-1/CD31 항체)을 사용하여 확인하였다. 맥락막의 평면 마운트의 맥락막신생혈관 이미지를 이미지 캡처 프로그램(LSM Image Browser, Zeiss)을 사용하여 디지털화 하였다. 빨간색 영역으로 염색된 TRITC가 결합된 항-PECAM-1/CD31 항체는 맥락막신생혈관의 존재를 확인시켜 준다. 녹색 병변으로 염색된 FITC-표지 덱스트란의 전체 면적(㎛²)을 계산하고, 이미지 분석 프로그램(Image-J software, NIH, USA)을 사용하여 비교하였다. 산소유도망막병증 새끼들의 망막 평면 마운트의 전체 망막 타일-스캔 이미지(tile-scan images)를 스캐닝 레이저 공초점 현미경을 사용하여 얻었다. 이후, 이미지 분석 소프트웨어(Image-J software, NIH, USA)를 사용하여 망막의 혈관 강도를 계산하였다.

실시예 1.24 - 통계 분석

값들을 평균 ± SD로 표현하였다. 평균 사이의 통계적 차이를 independent sample t-test 또는 one-way 분산 후(analysis of variance with one-way) Student-Newman-Keuls 또는 Bonferroni test 분석으로 결정하였다. p < 0.05를 통계적 유의성으로 간주하였다.

실시예 2 - 결과

실시예 2.1 - VEGF-Grab의 디자인 및 이의 VEGF-A 및 PlGF에 대한 증가된 결합 친화도

VEGFR1 및 VEGFR2는 모두 세포 외 도메인 내에 7개의 면역글로불린(Ig) 유사 도메인을 가지고 있다(도 1A). 이들 중, VEGFR1 D2는 VEGF-A와 PlGF 결합에 대한 주 기여자이다. 또한, VEGFR1 D3 내 잔기 역시 VEGF-A와 PlGF의 고 친화 결합에 참여한다(22). 따라서, VEGFR1 D2-D3는 높은 친화력으로 VEGF-A와 PlGF에 모두 결합하기 위한 최소 필요한 도메인이다. 신규한 VEGF 디코이 수용체 융합 단백질을 디자인하기 위하여, 우리는 먼저 주형 구조(PDB ID : 1FLT 및 2X1X)를 사용하여, MODELLER(32)에 의하여 생성된 VEGFR1 D2-D3/VEGF-A 복합체의 모델 구조를 분석하였다(도 1B 및 1C). 정전기 전위 분석은 VEGFR1 D3가 VEGFR2 D3와 비교하여, VEGFR1 D3의 높은 pI에 기여하는 양전하로 하전된 다량의 아미노산(파란색으로 표시)을 가지고 있음을 알려주었다(도 1B). VEGFR1을 사용하여, 우리는 VEGF-Grab으로 명명된 VEGF 디코이 수용체 융합 단백질을 디자인하였다. VEGF-Grab은 hVEGFR1 신호서열(1-26번째 아미노산, 원래의 hVEGFR1의 1-26번째 아미노산(1-78번째 뉴클레오티드)에 해당하는 1-78번째 뉴클레오티드), hVEGFR1 D2-D3 도메인(27-229번째의 아미노산, 원래의 hVEGFR1의 132-332번째 아미노산(394-996번째 뉴클레오티드)에 해당하는 79-687번째 뉴클레오티드) 및 인간 IgG의 Fc 도메인(230-459번째 아미노산, 688-1377번째 뉴클레오티드)을 포함한다. VEGFR1 D3의 순 pI(net pI)를 감소시키고, VEGF 디코이 수용체 융합 단백질의 인 비보 반감기를 증가시키기 위한 시도로, VEGF-A/VEGFR1 D2-D3 복합체의 모델 구조가 hVEGFR1 D3 도메인의 β1-β2 루프(서열목록 제2서열의 133-144번째 아미노산, 원래의 hVEGFR1의 236-247번째 아미노산(706-741번째 뉴클레이티드)에 해당하는 서열목록 제1서열의 397-432번째 뉴클레오티드) 및 hVEGFR1 D3 도메인의 β3-β4 루프(서열목록 제2서열의 164-174번째 아미노산, 원래의 hVEGFR1의 267-277번째 아미노산(799-831번째 뉴클레이티드)에 해당하는 서열목록 제1서열의 490-522번째 뉴클레오티드)는 리간드 결합에 관여하지 않으나, 많은 양전하를 띠는 잔기를 포함할뿐만 아니라 유연한 루프 내에 위치함을 보여줬기 때문에, 우리는 VEGFR1-D3의 β1-β2 및 β3-β4 루프 상에 위치하는 잔기를 돌연변이 유발의 타겟으로 삼았다. 따라서, VEGF-Grab의 이들 루프 상의 전하 변경 돌연변이(charge conversion mutations)가 이들의 VEGF-A/PlGF에 대한 높은 친화도를 유지시키고, VEGFR1 D3 도메인의 순 pI를 감소시키며, 구조적 분열(structural disruption)을 방지해줄 것으로 예상되었다(도 1C). 전하 변경 돌연변이에 더하여, 이들 루프 상의 돌연변이 유발에 대한 다른 근거는 단백질의 반감기를 증가시킬 수 있는 잠재적인 O- 또는 N- 당화 위치가 되도록 하는 세린, 트레오닌 또는 아스파라긴에 대한 돌연변이이다.

이러한 아이디어를 테스트하기 위하여, 우리는 세 개의 VEGFR1 변이체인 VEGF-Grab1, VEGF-Grab2 및 VEGF-Grab3를 제조하였다(도 1A). VEGFR1 D3 루프 영역 안의 세 개의 양전하를 띄는 잔기인 R135, K138 및 R172를 글리칸이 붙을 수 있는 음전하를 띠는 잔기(R135S, K138T 및 R172N)로 돌연변이 시켰다(도 1A 및 도 10). 모든 VEGF-Grab 컨스트럭트들은 Fc에 융합된 VEGFR1 D2-D3 변이체로 이루어져 있다(도 1A). 유감스럽게도, 모(parental) VEGFR1-Fc 및 VEGF-Grab2의 CHO 세포에서의 발현은 매우 낮아서, VEGF-Grab1과 VEGF-Grab3에 대해서만 추가 실험을 진행하였다. VEGF-Grab1, VEGF-Grab3 및 VEGF-Trap(이하, 각각 G1, G3 및 VT로 약칭함)을 CHO 세포에서 생산하고, 단백질 A 친화 크로마토그래피로 정제하였다. 정제된 G1 및 G3는 환원 SDS-PAGE 조건에서 분산된 밴드 패턴을 보였는데(도 1D), 이는 당화된 단백질의 전형적인 특징이다(24). 비환원 조건에서, VEGF-Grab은 Fc의 이황화 결합으로 인하여 다이머 형태를 보여주었다(도 1D). 혈관신생을 유발하는 리간드(pro-angiogenic ligands)인 VEGF-A, PlGF 및 VEGF-B에 대한 VEGF-Grab과 VT의 인 비트로 결합 친화도는 G1(K_D = 7.9 X 10^-10 M) 및 G3(K_D = 5.6 X 10^-10 M)가 VT(K_D = 8.4 X 10^-10 M) 보다 VEGF-A에 대하여 1.1 및 1.5배 높은 친화도를 보여주었다(도 1E). 그러나, 결합에 VEGFR1-D2만 요구하는 VEGF-B에 대한 G1과 G3의 결합 친화도는 VT와 유사하였다(도 1G). 흥미롭게도, PlGF에 대한 G1(K_D = 2.8 X 10^-9 M) 및 G3(K_D = 6.9 X 10^-9 M)의 결합 친화도는 VT(KD = 4.6 X 10^-8 M) 보다 각각 18.5배 및 6.7배 강력하였는데(도 1F), 이러한 결과는 VEGF-A와 PlGF 모두에 현저히 높은 친화도를 갖는 새로운 당화 VEGF 디코이 수용체 융합 단백질인 G1과 G3가 성공적으로 제조되었음을 보여준다.

실시예 2.2 - VEGF-Grab에 새로이 첨가된 O-글리칸의 확인

당화가 단백질의 pI를 변경시킬 수 있기 때문에(33), VEGF-Grab의 pI를 측정하였다. 붙은 글리칸의 다양한 구성 때문에, VT, G1 및 G3는 등전점 전기영동 겔 상에 다양한 아이소폼과 함께 미세이질성(micro-heterogeneity)을 나타내었다(도 3A). 흥미롭게도, 모(parental) VEGFR1-Fc(pI: 9.4)(6)와 비교하여, G1과 G3의 pI는 각각 8.0 및 7.4까지 현저히 감소하였다(도 3B). 이러한 pI값은 VT(pI: 7.8)와 견줄만하였다. PNGaseF에 의한 분해 후, VEGF-Grab과 VT의 분자량은 감소하였으며(도 2C), 이는 VT, G1 및 G3 내의 N-연결(N-linked) 당화의 존재를 나타낸다. VT와 대조적으로, PNGaseF에 의한 분해 후에도 G1과 G3는 O-연결 당화를 암시하는 분산된 밴드 패턴을 보여주었다.

VEGF-Grab의 돌연변이 부위의 N- 또는 O-글리칸의 존재를 한 번 더 확인하기 위하여, 당화 매핑(glycosylation mapping)을 위한 질량분석을 실시하였다. N-당화의 잠재적 위치를 포함하는 탈당화(deglycosylation) 및 비당화(unglycosylated) 트립신 분해 펩티드의 계산된 질량(Calculated masses)을 도 11A에 나타내었다. LC/MS 데이터로부터 G3의 돌연변이 된 Asn172는 당화되지 않은 반면, 세 개의 원래의 N-당화 위치인 Asn61, Asn93 및 Asn308(VT의 경우 Asn328)은 모두 채워져 있음을 알아냈다(도 3E 및 도 10). 다음으로, Glyco-Analytical Multispecific Proteolysis(glyco-AMP)를 사용하여, VEGF-Grab의 Ser135와 Thr138이 O-당화되었는지 여부를 조사하였다(34). MS/MS 스펙트럼으로부터, O-당펩티드(STPSPV+HexNAc1Hex1NeuAc1)가 G1과 G3 모두에서 관찰되었다(도 3D 및 도 12). HexNAc, NeuAc-H2O, NeuAc, Hex1NeuAc1, 및 HexNAc1Hex1NeuAc1에 대한 전형적인 글리칸 절편들은 VEGF-Grab의 Ser135가 O-당화되었음을 확인시켜 주었다. 그러나, Thr138의 O-당화에 대한 증거는 확인하지 못하였다.

이후, G1, G3 및 VT의 전체적인 N-글리칸 구성을 분석하였다. N-글리칸 프로파일을 nano-LC/MS 및 MALDI-MS로 정량하였다. 이 데이터는 VT와 비교하여, G1과 G3가 high mannose(HM) 당화의 증가, 푸코실화(fucosylation)의 감소, 및 complex-undecorated glycans(C/H-Fuc)를 나타내었음을 보여주었다(도 11B). 특히, G3는 G1과 비교하여 더 낮은 pI를 초래하는 G1에 비하여 증가된 시알화(sialylation)를 보여주었다(도 3A). 이 질량분석 결과는 G1과 G3 모두는 VEGFR1 D2의 61N과 93N 및 Fc의 308N(VT의 경우 328N)의 세 개의 N-당화 위치뿐만 아니라, 돌연변이 된 잔기 중에서 오직 하나의 추가적인 O-당화 위치(Ser135)를 가지고 있음을 보여주었다(도 3E 및 도 10-12). 또한, G3는 VT 또는 G1 보다 더 시알화된 것으로 확인되었다.

실시예 2.3 - VEGF-Grab3는 감소된 ECM 결합과 향상된 PK 프로파일을 나타낸다.

높은 pI값을 갖는 단백질은 ECM에 비특이적으로 결합하여 좋지 않은 PK와 생체이용률(bioavailability)을 초래한다(33). 우리는 VEGF-Grab의 감소된 pI값이 실제로 VT와 비교할만한 감소된 인 비트로 ECM 결합을 초래하였음을 확인하였다(도 3K). G3의 감소된 인 비트로 ECM 결합을 증명하기 위하여, 100 nM의 모 VEGFR1-Fc, VT 또는 G3로 대조군 종양 절편을 염색하였다. VEGFR1-Fc는 종양 절편에 비특이적으로 결합한 반면, VT 또는 G3는 종양 절편에서 검출되지 않았다(도 13). 이러한 데이터는 G3와 VT의 낮은 인 비보 ECM 결합을 확인시켜 주고, 이는 세 군데의 돌연변이 부위에서의 전하 변경 및 G3의 Ser135에 추가적으로 첨가된 글리칸이 VEGFR1-Fc의 본질적인 문제점인 ECM에 대한 비특이적 결합을 효과적으로 극복할 수 있도록 해줌을 나타낸다. G1 및 G3가 향상된 인 비보 반감기를 나타내는지 여부를 테스트하기 위하여, 4일 동안 4 mg/kg 투여량에서 PK 프로파일을 분석하였다. 흥미롭게도, G3는 G1과 비교하여 향상된 PK 프로파일(area under the curve (AUC): 59.44 ㎍ x 일/㎖)을 나타내었다(도 14). 이에 따라, 우리는 후속의 인 비보 항암 연구에 G3를 사용하였다. 이후, VT 및 G3의 PK 프로파일을 6일간 다양한 투여량(4, 10, 25 mg/kg)에서 평가하였다(도 3 F 및 G). 4, 10, 및 25 mg/kg 주사 후 각각, VT는 37.57, 34.07, 및 65.02 ㎍ X days/㎖의 AUC를 나타낸 반면, G3는 64.36, 65.68, 및 117.5 ㎍ x 일/㎖의 AUC를 나타내었다(도 3H). 이는 VT에 비하여 각각 1.7배, 1.9배, 1.8배 증가된 것이다. 이러한 향상된 G3의 PK 프로파일은 또한 G3의 낮은 인 비보 ECM 결합을 뒷받침한다. 더욱이, PK 프로파일은, VT는 투여 후 6일째에 대부분 제거되나, 6일째 G3 수준은 VT 보다 2.5배 높게 유지되고 있음을 증명해주며(도 3 F 및 G), 이는 G3가 혈청에서 연장된 반감기를 가지고 있음을 보여준다. 또한, 피하 주사(4 mg/kg) 48시간 후 LLC 종양을 갖는 마우스의 간, 신장, 종양 및 소변 내 VT 및 G3의 축적된 양을 조사하였다. VT 보다 더 높은 G3 수준이 간, 신장 및 특히 종양(18.9배 증가)에서 검출되었다(도 2I 및 도 15). 간 및 신장에서 축적된 G3의 종양과 비교한 상대적 양은 VT에서 보다 현저히 낮았으며(도 3J), 이는 대부분의 G3가 VEGF-A와 PlGF가 대부분(predominantly) 생산되는 장소인 종양 부위에 축적되었음을 보여준다. 우리의 실험조건 하에서 소변에서 G3 또는 VT가 검출되지 않았다. 종합적으로, 위와 같은 결과들은 VEGF-Grab3가 보다 낮은 ECM 결합 특성 및 연장된 반감기를 가지고 있음을 나타내준다.

실시예 2.4 - VEGF-Grab은 VEGF 신호전달경로를 억제하여 EC 생존, 이동 및 관 형성을 억제한다.

VEGF-A는 VEGFR2 활성화를 통하여 세포증식, 세포이동 및 내피세포의 생존을 촉진한다(4). 따라서, 우리는 HUVEC에서의 VEGFR2 신호전달(signaling)을 조사하였다. VEGF-Grab 및 VT는 모두 VEGFR2와 이의 다운스트림 ERK의 VEGF-A 유도된 인산화를 약화시켰다(도 4A-C 및 도 16A-C, 투여량 의존적 억제에 대한 도 17 참조). 또한, VEGF-Grab은 1.7 nM 및 2.4 nM의 IC₅₀(half maximal inhibitory concentration)으로 HUVEC의 VEGF-A 유도된 증식을 억제하였으며, 이 수치는 VT(IC₅₀ = 4.8) 보다 각각 2.8배 및 2배 더 효율적인 것이다(도 4D). 또한, VEGF-Grab 및 VT는 HUVEC의 VEGF-A 유도된 세포이동(도 4E와 F 및 도 16D와 E) 및 관 형성(도 4G와 H 및 도 16F와 G)을 현저히 억제하였다. 이상과 같은 결과는 VEGF-Grab 및 VT가 VEGF-A 격리(sequestration)를 통하여 VEGF-A 유도된 내피세포 활성화를 비슷한 수준으로 억제하였음을 보여준다.

실시예 2.5 - VEGF-Grab은 향상된 항종양 활성을 나타낸다.

G3의 항종양 활성을 평가하기 위하여, LLC 종양 모델(36)에 25 mg/kg의 VT 또는 G3를 투여하였다. G3 투여는 종양 부피와 무게를 각각 61%와 71% 감소시켰으나, VT 투여는 각각 37%와 29%만 감소시켰다(도 5A 및 C). 또한, 종양 내 괴사(intratumoral necrosis)는 VT 처리 종양(21%)에서 보다 G3 처리 종양(35%)에서 현저히 높았다(고 5B 및 D). 나아가, 비록 림프의 혈관 밀도에서는 유의적 차이를 보이지 않았으나, G3 처리 종양은 VT 처리 종양과 비교하여, 종양 주변(peri-)과 종양 내 부위에서 모두 우수한 항-혈관신생 효과와 항전이 효과를 나타내었다(도 5E-I).

항-VEGF 치료는 결국 종양 내 저산소 지역으로의 TAM의 이동(recruitment)을 촉진하는 전산소 상태를 유도한다. TAM은 일반적으로 종양의 재혈관형성(re-vascularize)을 위한 혈관신생을 유도하는 인자와 혈관신생 조절인자를 과하게 발현시킨다(37). 흥미롭게도, VT 처리 종양과 G3 처리 종양 모두에서의 현저히 증가된 저산소 상태에도 불구하고(도 5J 및 K), G3 처리 그룹에서의 대식세포 침윤(infiltration) 수준은 비처리 대조군 종양과 거의 유사한 수준으로 유지되었고(도 5L 및 M), 이것이 VT와 비교하여 G3의 PlGF에 대한 증가된 친화도에 기여하는 것으로 생각된다(18). 다음으로, 종양의 다양한 유전자 발현 프로파일을 분석하였다. G3 처리는 VEGF-A, PlGF, VEGF-C, VEGFR1 및 VEGFR2를 포함하는 혈관신생 유도 유전자를 하향 조절하였다. G3는 또한 VT에 비하여 Bv8과 CCL2 발현을 감소시켰다. 이들 두 유전자는 항-혈관신생 치료에 대한 무반응(refractoriness)을 야기할 수 있는 종양으로의 골수성 세포 이동(myeloid cell recruitment)에 중요하다(도 5N)(38,39). 또한, VT 처리 마우스 또는 G3 처리 마우스의 심장, 폐, 간 및 신장을 포함한 중요 장기(vital organs)의 H&E 염색 절편에서는 뚜렷한 차이를 나타내지 않았다(도 18). 크기가 큰 종양(>500 mm³)에 대한 G3의 항종양 효과 역시 평가하였다. 이러한 결과는 VT 및 G3 처리 후 종양 성장이 각각 27% 및 46% 지연되었음을 보여주며(도 19), 이는 G3가 부피가 큰 육안으로 보이는 종양에서도 유망한 치료제임을 암시한다.

투여량-반응성을 확인하기 위하여, 종양 마우스에 매 2일마다 VT 또는 G3를 다양한 투여량(5, 10, 25 및 50 mg/kg)으로 주사하였다. G3 투여 그룹의 종양 성장은 50 mg/kg에서의 최대 효과와 함께 투여량 의존적으로 점진적으로 감소되었다. 그러나, VT 투여 그룹에서는 25 mg/kg과 50 mg/kg 사이에 종양 성장의 분명한 차이가 없었고, 이 VT 투여 그룹의 효능은 G3 10 mg/kg 투여 시와 비슷하였다(도 5O 및 P). 종양 전이 측면에서, VT와 G3는 모두 50 mg/kg에서 최대 항전이 효과를 나타내었다(도 5Q 및 R). VT 또는 G3의 모든 투여량에서, H&E로 염색된 신장 또는 간에서는 유의성 있는 차이를 확인하지 못했다(도 20). 종합적으로, 이상과 같은 결과들은 G3의 VEGF-A와 PlGF에 대한 보다 높은 친화성 및 연장된 반감기가 VT 보다 더 우수한 G3의 암 치료효과에 기여함을 보여준다.

항-VEGF 치료 단독은 부피가 큰 종양의 완전한 제거(regression)를 유도하는데 충분하지 않기 때문에, 화학요법과 항-VEGF 치료와의 병용은 유망한 치료전략이다(40). G3와 시스플라틴의 병용치료는 시스플라틴 단독치료(종양 부피의 33% 감소) 또는 VT와 시스플라틴의 병용치료(종양 부피의 57% 감소)와 비교하여, 가장 강력한 항종양 효과(종양 부피의 78% 감소)를 나타내었다(도 5S). 또한, 종양 세포의 종양 내 세포사멸은 시스플라틴 단독치료와 비교하여 시스플라틴+G3 병용 그룹에서 >2배 증가하였다(도 5T 및 U, 도 21). 이러한 결과들은 G3가 병용 화학요법에 대한 유망한 치료 옵션임을 보여준다.

실시예 2.6 - VEGF-Grab3는 또한 자연적 유방암 모델에서 종양 성장, 혈관신생 및 전이를 억제한다.

G3가 다른 종양 모델에서 종양 진행을 지속적으로 억제하는지 여부를 알아보기 위하여, 자연적 유방암 모델(spontaneous breast cancer model)인 MMTV-PyMT 마우스(41)를 이용하여 우리의 실험결과들을 확인해보았다. VT와 G3 처리는 대조군과 비교하여 종양 결절의 평균 크기를 각각 34% 및 61% 감소시켰다(도 6B). H&E 염색된 종양 절편은 대조군 MMTV-PyMT 종양은 남아있는 유선(mammary gland) 구조 없이 침윤성 종양 세포(invasive tumor cells, Inv)의 고상의 시트(solid sheets)를 보여주었다. 반면, G3 처리 종양 결절에서는, 초기 암과 주변의 지방조직(Adi) 사이의 경계(점선)가 잘 보존되어 있는 보다 초기의 암 병변(Ea)이 관찰되었다(도 6A). G3는 대조군에 비해 종양 주변 부위와 종양 내 부위에서 종양 혈관밀도를 각각 45%와 53% 감소시켰고, VT 처리 종양에서는 27%와 28% 감소되었다(도 6C 및 D). 종양 세포 세포사멸은 대조군 또는 VT 처리 종양과 비교하여, G3 처리 종양에서 현저히 증가하였다(도 6E 및 F). 전이성 종양 세포는 대조군과 비교하여 G3와 VT 처리 마우스의 겨드랑이(axillary) LNs에서 각각 64%와 52% 더 적었으나, 림프 혈관밀도에서는 유의성 있는 차이를 관찰하지 못하였다(도 6G-I). 이러한 결과들은 G3의 향상된 항-혈관신생 활성이 유방암 모델에서도 종양 성장과 전이를 효율적으로 억제할 수 있음을 증명해준다.

실시예 2.7 - VEGF-Grab은 종양 혈관신생에 대한 지속적 억제를 제공한다.

새로운 혈관 싹(vascular sprouts)은 항-혈관신생 치료의 중단 후 바로, 남아있는 종양 맥관 구조로부터 재생(regrowth)하기 시작하는 것으로 보고된바 있다(11). G3의 지속성(durability)을 조사하기 위하여, 정해진 시점에 VT 또는 G3를 여러 차례 종양을 갖는 마우스에 투여하였다(도 7A, 녹색 화살표). 이후, 투여를 중단하고, D17 및 D19째에 종양 매관 구조의 리모델링을 분석하였다(도 7A, 파란색 화살표). 대조군 종양의 혈관은 D17(투여중단 후 2일)과 D19(투여중단 후 4일) 사이에 혈관 싹의 24% 증가와 종양 혈관밀도의 17%증가를 보였으나, VT 중단(withdrawn) 종양 혈관은 D17에서의 결과와 비교하여 D19째에 혈관 싹의 91% 증가와 혈관밀도의 51% 증가를 보였으며, 이러한 결과는 통상적인 항-VEGF 치료의 중단에 따른 종양 혈관의 활발한 재생을 나타낸다. VT와 대조적으로, G3 중단 종양 혈관은 D17에서의 결과와 비교하여 D19째에 혈관 싹과 혈관밀도가 단지 22%와 20% 증가하였으며, 이는 대조군에서의 수치와 유사한 것이다(도 7B-D). 이러한 결과들은 VT와 비교하여 종양의 혈관신생에 대한 G3의 지속적인 억제 효과를 증명한다.

실시예 2.8 - VEGF-Grab3의 유리체 내 투여는 맥락막 신혈관 형성 및 산소유도망막병증 비관류 영역 퇴행(non-perfusion area regression)을 억제한다.

G3가 맥락막신생혈관의 크기를 감소시키는지 여부를 알아보기 위하여, 맥락막신생혈관 면적을 맥락막신생혈관 유도 14일 후 면역형광 공초점 이미징을 통하여 측정하였다. G3 처리 마우스는 PBS 처리 대조군 마우스와 비교하여 맥락막신생혈관의 현저한 퇴행을 보여주었다. 처리 14일 후 PBS 처리 대조군 마우스의 맥락막신생혈관 크기는 10803.34 ㎛³(범위가 3017.24 ㎛³에서부터 38898.73 ㎛³까지, n=60)였다. 그러나, G3 처리 마우스의 맥락막신생혈관 크기는 5193.76 ㎛³(범위가 270.52 ㎛³에서부터 11563.26 ㎛³까지, n=60)까지 감소하였다(P < 0.01)(도 8A). 맥락막신생혈관의 대표 이미지에 나타난 바와 같이(도 8B), 맥락막신생혈관 크기는 PBS 처리에 비하여 G3 처리 시 현저히 억제되었다. Aflibercept 처리 마우스 역시 현저한 맥락막신생혈관 퇴행을 보여주었다. Aflibercept 처리 후의 맥락막신생혈관 크기는 5221.77 ㎛³(범위가 439.68 ㎛³에서부터 15984.70 ㎛³까지, n=60)였다(P <　0.01). G3 처리 마우스와 비교하여, Aflibercept 처리 마우스 맥락막신생혈관 크기에 유의성 있는 차이는 없었다. 세 그룹의 맥락막신생혈관 면적의 크기 및 이들의 통계적 유의성을 도 8B에 나타내었다. 산소유도망막병증 마우스에서, VEGF-Grab 처리는 PBS 투여 대조군 눈과 비교하여 P17째에 무혈관 망막의 면적을 증가시켰다. G3 처리 눈과 비교하여, P17째에 PBS 투여된 눈의 혈관 밀도는 거의 2배 증가되었다(P < 0.01)(도 9B). 망막 맥락구조의 대표 확장 이미지에 나타난 바와 같이(도 9A), 혈관밀도는 PBS 처리와 비교하여 G3 처리 시 현저히 억제되었다. 이러한 결과들은 G3의 1회 투여가 레이저 유도 맥락막신생혈관 및 산소유도망막병증 비관류 영역 퇴행(OIR Non-perfusion Area Regression)을 효과적으로 억제할 수 있음을 증명하며, 이는 G3가 AMD와 DME에 대한 유망한 치료 옵션임을 보여준다.

본원발명은 명세서에 기술된 특정 실시예의 범위에 의하여 제한되지 않는다. 명세서에 기재된 것과 더불어 발명의 다양한 변형은 앞서 설명한 내용과 수반된 도면으로부터 통상의 기술자에게 명백하게 될 것이다. 이러한 변형은 청구범위 내에 속하는 것으로 의도된다. 다음의 실시예는 본원발명의 설명으로 제공되며, 이에 의하여 제한되는 것은 아니다.

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Ala Leu Glu Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 225 230 235 240 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 245 250 255 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 260 265 270 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 275 280 285 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 290 295 300 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 305 310 315 320 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 325 330 335 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 340 345 350 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 355 360 365 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 370 375 380 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 385 390 395 400 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 405 410 415 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 420 425 430 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 435 440 445 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer - R135S/K138T for VEGF-Grab1 and VEGF-Grab3 <400> 9 agcacaccaa gcccagtcac attacttaga 30 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer - R135S/K138T for VEGF-Grab1 and VEGF-Grab3 <400> 10 tctaagtaat gtgactgggc ttggtgtgct 30 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer - R172N for VEGF-Grab2 and VEGF-Grab3 <400> 11 aataagaacg cttccgtaag gcgacgaatt 30 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer - R172N for VEGF-Grab2 and VEGF-Grab3 <400> 12 aattcgtcgc cttacggaag cgttcttatt 30 <210> 13 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer - mGAPDH <400> 13 gtcgtggagt ctactggtgt cttcac 26 <210> 14 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer - mGAPDH <400> 14 gttgtcatat ttctcgtggt tcacaccc 28 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer - mVEGFA <400> 15 gtcagagagc aacatcacca tgcag 25 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer - mVEGFA <400> 16 ctttggtctg cattcacatc tgctg 25 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer - mPlGF <400> 17 gatgctggtc atgaagctgt tc 22 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer- mPlGF <400> 18 tcgtctccag aataggtctg ca 22 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer - mVEGF-C <400> 19 cgttctctgc cagcaacatt accac 25 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer- mVEGF-C <400> 20 cttgttgggt ccacagacat catgg 25 <210> 21 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer - mPDGF-B <400> 21 cacagagact ccgtagatga agatggg 27 <210> 22 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer - mPDGF-B <400> 22 cactcggcga ttacagcagg ctctg 25 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer - mVEGFR1 <400> 23 ggctctacga ccttagactg tca 23 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mVEGFR1 <400> 24 tgctgtttcc tggtcctaaa ata 23 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer - mVEGFR2 <400> 25 accagaagta aaagtgatcc caga 24 <210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer - mVEGFR2 <400> 26 tccaccaaaa gatggagata attt 24 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer - mPDGFRalpha <400> 27 cgactccaga tgggagttcc c 21 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer - mPDGFRalpha <400> 28 tgccatccac ttcacaggca 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer - mPDGFRbeta <400> 29 agctacatgg ccccttatga 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer - mPDGFRbeta <400> 30 ggatcccaaa agaccagaca 20 <210> 31 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer - mBv8 <400> 31 gcatgacagg agtcatcatt tt 22 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer - mBv8 <400> 32 aaatggcagg atatcaggaa a 21 <210> 33 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer - mCCL2 <400> 33 gagcatccac gtgttggct 19 <210> 34 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer - mCCL2 <400> 34 tggtgaatga gtagcagcag gt 22 <210> 35 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VR1-Ig3 <400> 35 Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Gln Ile Ser Thr 1 5 10 15 Pro Arg Pro Val Lys Leu Leu Arg Gly His Thr Leu Val Leu Asn Cys 20 25 30 Thr Ala Thr Thr Pro Leu Asn Thr Arg Val Gln Met Thr Trp Ser Tyr 35 40 45 Pro Asp Glu Lys Asn Lys Arg Ala Ser Val Arg Arg 50 55 60

Claims (41)

1. 서열번호 4, 서열번호 6 또는 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 VEGFR1 구성요소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 이루어지고,
   상기 VEGFR1 구성요소는 면역글로불린 유사(Ig-like) 도메인 2 및 3을 포함하며,
   상기 VEGFR1의 적어도 하나의 도메인 내 존재하는 암호화된 양전하를 띤 아미노산 잔기 한 개 이상이 당화 부위(glycosylation site)를 생성시키기 위하여 돌연변이된 것이며,
   상기 도메인 3의 β1-β2 루프 상의 R135 잔기, β1-β2 루프 상의 K138 잔기 또는 β3-β4 루프 상의 R172 잔기 중 한 개 이상이 음전하를 띤(negative charged) 잔기로 돌연변이된 것인, VEGF 폴리펩티드와 태반 성장인자(PlGF) 폴리펩티드에 동시에(synchronously) 결합할 수 있는 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 핵산분자.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 아미노산 잔기가 서열목록 제2서열의 133-144번째 아미노산 잔기에 상응하고 서열목록 제1서열의 397-432번째 핵산 위치에 해당하는 β1-β2 루프, 또는 서열목록 제2서열의 164-174번째 아미노산 잔기에 상응하고 서열목록 제1서열의 490-522번째 핵산 위치에 해당하는 β3-β4 루프 상에 위치하는 것인 핵산분자.
   
3. 삭제
4. 제 1 항에 있어서, 상기 VEGFR1의 적어도 하나의 도메인 내 존재하는 암호화된 양전하를 띤 아미노산 잔기 한 개 이상이 상기 암호화된 폴리펩티드의 순 pI(net pI)를 감소시키기 위하여 돌연변이된 것인 핵산분자.
   
5. 제 1 항에 있어서, 상기 VEGF가 VEGF-A 또는 VEGF-B인 것인 핵산분자.
   
6. 제 1 항에 있어서, 상기 VEGFR1 구성요소가 멀티머화(multimerizing) 구성요소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게(operatively) 연결된 것인 핵산분자.
   
7. 제 1 항의 핵산분자를 포함하는 핵산 벡터.
   
8. 제 7 항에 있어서, 상기 벡터가 바이러스 벡터(viral vector)인 것인 핵산 벡터.
   
9. 발현조절 서열에 작동가능하게 연결된 제 1 항의 핵산분자를 포함하는 발현 벡터.
   
10. 제 9 항의 발현 벡터를 포함하는, 적합한 숙주세포에서 폴리펩티드를 생산하기 위한 숙주-벡터계(host-vector system).
    
11. 제 10 항에 있어서, 상기 적합한 숙주세포가 박테리아 세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 포유동물 세포인 것인 숙주-벡터계.
    
12. 제 10 항의 숙주-벡터계의 세포를 폴리펩티드의 생산이 가능한 조건 하에서 성장시키는(growing) 단계; 및 생산된 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 폴리펩티드의 생산방법.
    
13. 서열번호 4, 서열번호 6 또는 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 VEGFR1 구성요소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 이루어지고,
    상기 VEGFR1 구성요소는 면역글로불린 유사(Ig-like) 도메인 2 및 3을 포함하며,
    상기 VEGFR1의 적어도 하나의 도메인 내 존재하는 한 개 이상의 양전하를 띤 아미노산 잔기가 당화 부위를 생성시키기 위하여 돌연변이된 것이며,
    상기 도메인 3의 β1-β2 루프 상의 R135 잔기, β1-β2 루프 상의 K138 잔기 또는 β3-β4 루프 상의 R172 잔기 중 한 개 이상이 음전하를 띤(negative charged) 잔기로 돌연변이된 것인, VEGF 폴리펩티드와 태반 성장인자(PlGF) 폴리펩티드에 동시에(synchronously) 결합할 수 있는 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 핵산분자에 의하여 암호화된 폴리펩티드.
14. 제 13 항에 있어서, 상기 아미노산 잔기가 서열목록 제2서열의 133-144번째 아미노산 잔기를 포함하는 β1-β2 루프, 또는 서열목록 제2서열의 164-174번째 아미노산 잔기를 포함하는 β3-β4 루프 상에 위치하는 것인 폴리펩티드.
    
15. 삭제
16. 제 13 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 당화된(glycosylated) 것인 폴리펩티드.
17. 제 13 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 시알산화된(sialylated) 것인 폴리펩티드.
18. 제 13 항에 있어서, 상기 VEGFR1의 적어도 하나의 도메인 내 존재하는 양전하를 띤 아미노산 잔기 한 개 이상이 상기 폴리펩티드의 순 pI를 감소시키기 위하여 돌연변이된 것인 폴리펩티드.
    
19. 제 13 항의 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 포유동물의 혈관 성장 억제용 약학적 조성물.
    
20. 제19항에 있어서, 상기 포유동물은 인간인 것인, 약학적 조성물.
    
21. 제 13 항의 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 포유동물의 암전이 억제용 약학적 조성물.
    
22. 제21항에 있어서, 상기 포유동물은 인간인 것인, 약학적 조성물.
    
23. 제 13 항의 폴리펩티드 및 세포독성 치료제를 포함하는 포유동물의 종양 성장 감소 또는 억제용 약학적 조성물.
    
24. 제 23 항에 있어서, 상기 세포독성 치료제가 시스플라틴인 것인, 약학적 조성물.
25. 삭제
26. 삭제
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