KR20240019034A - 변형된 융합 단백질 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 개시는 혈관내피성장인자 및 태반성장인자와 결합하는 변형된 융합 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 개시의 일 실시태양에 따른 변형된 융합 단백질은 우수한 생산성 및 안정성을 나타낼 수 있다. 본 개시의 일 실시태양에 따른 변형된 융합 단백질은 우수한 혈중 안정성을 나타낼 수 있다. 본 개시의 일 실시태양에 따른 변형된 융합 단백질은 기존에 개발된 물질과 비교하여 산성(acidic) 성질을 가지며 pI 분포에서 산성 및 중성영역의 전하변이체 비율이 증가하는 성질을 나타낼 수 있다.
Description
본 개시는 혈관내피성장인자 및 태반성장인자와 결합하는 변형된 융합 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다.
혈관내피성장인자(Vascular endothelial growth factor, VEGF)는 신호전달 단백질로써 순환계 형성(vasculogenesis) 및 혈관신생(angiogenesis)에 중요한 역할을 한다. 일반적인 기능으로는 배아 발달, 부상 또는 운동 후의 근육, 경색된 혈관을 우회하는 신생 혈관의 형성에 관여하나 VEGF의 비정상적 증가는 종양의 발생 및 전이와 밀접한 관련이 있다(Carmeliet, P. y Jain, RK. 2000. Nature 407: 249- 257).
VEGF는 VEGF-A, -B, -C, -D 및 PLGF(placenta growth factor)의 5종으로 분류되며, 이들은 혈관신생에 기여하는 것으로 알려져 있다(Carmeliet, P. y Jain, RK. 2000. Nature 407: 249-257; Kuwano M, et al.2001. Intern Med 40: 565-572). 반면 VEGF 수용체는 VEGF R1, R2, R3의 3종이 있으며, 수용체의 종류에 따라 이에 결합하는 리간드의 종류 및 결합친화도에 차이가 있고, 이중 VEGFR-1/-2는 혈관신생에 관여하는 것으로 알려져 있다(Veikkola, et. al., 2000. Cancer research 60: 203-212).
종양 형성 과정에 주요한 요소로 알려진 혈관내피성장인자의 제거를 통하여 혈관신생 억제를 표적하는 약물들의 개발이 과거로부터 현재까지 이어져오고 있다. 대표적으로 항-VEGF-A를 표적하는 단클론 항체 형태의 약물인 베바시주맙(Stacker, et. al., 2013. Chinese Journal of Cancer Research. 32(6):297-302.; Kazazi-Hyseni, et. al., 2010. Oncologist. 15(8):819-825; DrugBank Accession Number: DB00112)이 있다. 단클론 항체 의약품의 경우 단일한 혈관내피성장인자와 결합하는 작용기작을 갖고 있으며, 암화(canceration)에는 다중의 성장인자들이 관여하므로 단클론 항체에 의한 괄목할 만한 효능을 나타내기에는 효과적이지 않은 약물이었다. 베바시주맙은 오히려 세포내 보상기전에 의해 표적되지 않은 다른 형태의 성장인자의 발현율을 증가시켜 내성이 생기는 부작용을 초래하였다(Bagley, et. al., 2011. Clinical cancer research 17(5): 976-988; Lieu, et. al., 2013. Plos One 8: e77117; Cutsem, et. al., 2020 Clinical cancer research 26(3): 717-725). 이러한 이유로 암화와 관련된 혈관성장인자들을 다중 표적하는 약물에 대한 개발 필요성이 점진적으로 확대되었다. 특히 후기 암화 과정에서 보상적 경로에 의해 발현율이 높아지는 PLGF에 대한 중요성이 부각되고 있지만, 현재 개발된 혹은 개발중인 대다수의 약물은 VEGF를 표적하고 있어서, PLGF 표적 약물의 개발에 대한 필요성은 더 커지고 있다.
단클론 항체 약물의 단점을 해결하기 위하여, 혈관내피성장인자들을 다중 표적하는 약물들이 개발되고 있는데, 대표적인 단백질 약물은 VEGF-Trap(Ciombor, et. al., 2013.Clinical cancer research. 19 (8): 1920-1925. DrugBank Accession Number: DB08885) 및 VEGF-Grab (Lee. et al., 2015. Mol. Cancer. Ther. 14(2):470-9.)이다. 이들은 모두 디코이 수용체의 일부를 모사하였으며 VEGF-Trap은 VGFR1 D2-VGFR2 D3의 이종 단백질 형태로, VEGF-Grab은 VEGFR1 D2-D3의 동종 단백질 형태로 면역글로불린의 Fc와 융합되어 있는 재조합 융합 단백질이다. 이러한 혈관내피성장인자들을 다중표적하는 융합 단백질의 물성을 개선하고자 하는 노력이 지속되어 왔다. 특히 표적물질에 대한 높은 결합력과 증가된 체내 지속기간을 보유하면서도, 상업적 규모의 생산 측면에서, 단백질 치료제 수준의 높은 생산성을 충족할 수 있는 물리적 안정성 및 화학적 안정성을 갖는 융합 단백질의 개발에 대한 필요성이 있어 왔다.
단백질의 물성 증가는 발현 및 정제 시 단백질의 물리적 안정성 및 화학적 안정성을 증대시켜 생산 효율을 극대화하고, 단백질의 체내 도입 시 비특이적 결합 및 분해를 감소시켜 높은 체내 지속력에 도달하게 한다.
본 개시의 발명자들은 VEGFR1의 세포외 도메인을 포함하는 융합 단백질의 물성 및 안정성을 효율적으로 증대시키기 위한 노력을 지속적으로 하였다.
그 결과, 본 개시의 발명자들은 VEGFR1 도메인 D2 및 도메인 D3을 포함하는 융합 단백질에서, 도메인 D3의 특정 영역에서의 아미노산 변이, 링커의 길이 조절 및 변이, 또는 융합 단백질 내에 이황화결합을 도입하여 변형된 융합 단백질을 개발하였고, 이러한 변형된 융합 단백질이 우수한 생산성 및 안정성을 나타낸다는 점을 확인함으로써 본 개시를 완성하였다.
1. 본 개시의 일 실시태양은, VEGFR1 세포외 도메인, 링커 및 다량체화 도메인을 포함하고, 상기 VEGFR1 세포외 도메인은 VEGFR1의 면역글로불린(Ig) 유사 도메인 D2 및 Ig 유사 도메인 D3을 포함하며, 링커가 Ig 유사 도메인 D3와 다량체화 도메인 사이에 존재하고, 아래 특성 (a) 내지 특성 (c) 중 하나 이상을 가지는 것인, 변형된 융합 단백질에 관한 것일 수 있다: (a) 도메인 D3의 β1-β2 루프 상의 하나 이상의 아미노산 잔기, 도메인 D3의 β2-β3 루프 상의 하나 이상의 아미노산 잔기, 및/또는 도메인 D3의 β5-β6 루프 상의 하나 이상의 아미노산 잔기가 단백질의 순 pI(net pI)를 감소시키는 아미노산, 측쇄가 음전하를 띄는 아미노산, 또는 측쇄가 정전기적음전하를 갖게 되는 아미노산으로 치환된 것이고, 여기서 도메인 D3의 β1-β2 루프는 서열번호 1의 아미노산 서열의 T236 내지 T247 아미노산 잔기를 포함하고, β2-β3 루프는 서열번호 1의 아미노산 서열의 T256 내지 V262 아미노산 잔기를 포함하고, β5-β6 루프는 서열번호 1의 아미노산 서열의 D299 내지 L308 아미노산 잔기를 포함함; (b) 링커가 약 13개 내지 약 35개의 아미노산 길이를 가지는 것임; 및 (c) 융합 단백질 내에 이황화결합이 존재하고, 도메인 D3의 β1-β2 루프 상의 아미노산 잔기 중 하나 또는 β5-β6 루프 상의 아미노산 잔기 중 하나와, 도메인 D3의 Y329를 기준으로 -2, -1, 0, +1, +2, 및 +3 위치에 존재하는 아미노산 잔기 중 하나가 시스테인으로 치환되는 것임.
2. 일 실시태양에 있어서, 특성 (a)에서 아미노산 치환은, VEGFR2 상동 서열의 아미노산 잔기, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 아스파라긴, 글루타민, 아스파르트산, 또는 글루탐산인 아미노산 잔기, 또는 알라닌 또는 글리신인 측쇄가 짧은 아미노산 잔기로 치환된 것일 수 있다.
3. 일 실시태양에 있어서, 특성 (a)는 도메인 D3의 β1-β2 루프 상의 하나 이상의 아미노산 잔기, 및 도메인 D3의 β5-β6 루프 상의 하나 이상의 아미노산 잔기가 단백질의 순 pI(net pI)를 감소시키는 아미노산, 측쇄가 음전하를 띄는 아미노산, 또는 측쇄가 정전기적음전하를 갖게 되는 아미노산으로 치환된 것일 수 있다.
4. 일 실시태양에 있어서, 특성 (a)는 도메인 D3의 β2-β3 루프 상의 하나 이상의 아미노산 잔기가, 기존의 아미노산 잔기의 측쇄보다 작은 크기를 갖는 아미노산 잔기 또는 유사한 크기의 극성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 치환된 것일 수 있다.
5. 일 실시태양에 있어서, 특성 (a)는, 도메인 D3의 β1-β2 루프 상의 K241, L243, R244, 및 H246 아미노산 잔기 중 한 개 이상, 도메인 D3의 β2-β3 루프 상의 L258 아미노산 잔기, 및/또는 도메인 D3의 β5-β6 루프 상의 K300, Q302, K304, 및 K306 아미노산잔기 중 한 개 이상이 치환된 것일 수 있다.
6. 일 실시태양에 있어서, 특성 (a)는, 도메인 D3의 β1-β2 루프 상에서 K241T, K241E, L243S, R244V, 및 H246E 중 하나 이상의 아미노산 치환, 도메인 D3의 β2-β3 루프 상에서 L258A, L258S, 또는 L258D의 아미노산 치환, 및/또는 도메인 D3의 β5-β6 루프 상에서 K300G, Q302T, K304S, 및 K306Q 중 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 것일 수 있다.
7. 일 실시태양에 있어서, 특성 (a)는, 도메인 D3의 β1-β2 루프 상에서 (i) L243S 및 R244V 아미노산 치환, 또는 (ii) K241E, L243S, R244V, 및 H246E 아미노산 치환, 도메인 D3의 β2-β3 루프 상에서 L258A, L258S, 또는 L258D 아미노산 치환, 및/또는 도메인 D3의 β5-β6 루프 상에서 (i) K300G 아미노산 치환, (ii) K300G, Q302T, 및 K304S 아미노산 치환, 또는 (iii) K300G, Q302T, K304S, 및 K306Q 아미노산 치환을 포함하는 것일 수 있다.
8. 일 실시태양에 있어서, 특성 (a)는, 도메인 D3의 β1-β2 루프 상에서 K241E, L243S, R244V, 및 H246E 아미노산 치환; 도메인 D3의 β2-β3 루프 상에서 L258A, L258S, 또는 L258D 아미노산 치환; 및 도메인 D3의 β5-β6 루프 상에서 K300G, Q302T, 및 K304S 아미노산 치환을 포함하는 것일 수 있다.
9. 일 실시태양에 있어서, 변형된 융합 단백질은 도메인 D3에서 R238S 및 R275N 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
10. 일 실시태양에 있어서, 변형된 융합 단백질은 링커와 연결되는 도메인 D3의 C 말단의 아미노산 서열이 K331 아미노산 잔기를 기준으로 KALE이며, 단 이 경우 아미노산 K, A, L 및 E 중 하나 이상이 결실될 수 있는 것일 수 있다.
11. 일 실시태양에 있어서, 변형된 융합 단백질은 도메인 D2의 N 말단이 아미노산 서열 SDT 또는 아미노산 서열 EF으로 시작하는 것일 수 있다.
12. 일 실시태양에 있어서, 특성 (b)에서 링커가 약 14개 이상의 아미노산 길이를 가지는 것일 수 있다.
13. 일 실시태양에 있어서, 특성 (b)에서 링커가 GS 반복 서열을 포함하고, 상기 GS 반복 서열은 G 및 S로만 이루어진 2 내지 60개 길이의 아미노산 서열이며, 링커의 N 말단의 아미노산이 글루탐산일 수 있는 것일 수 있다.
14. 일 실시태양에 있어서, GS 반복 서열이 (GS)n, (GSSG)n, (GGGGS)n 또는 (GS)m(GGGGS)n 이고, 여기서 n은 1 내지 10의 정수이며, m은 0 내지 10의 정수일 수 있다.
15. 일 실시태양에 있어서, GS 반복 서열이 GS, GSSG, (GSSG)2, GGGGS, (GGGGS)4, GS(GGGGS) 및 GS(GGGGS)3 로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
16. 일 실시태양에 있어서, 특성 (b)에서 링커가 면역글로불린으로부터 유래한 힌지 영역의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 힌지 영역의 아미노산 서열은 변형될 수 있는 것일 수 있다.
17. 일 실시태양에 있어서, 면역글로불린으로부터 유래한 힌지 영역은 CH1 영역으로부터 유래한 서열, 어퍼 힌지(upper hinge) 및/또는 코어 힌지(core hinge)를 포함하는 것일 수 있다.
18. 일 실시태양에 있어서, 상기 면역글로불린으로부터 유래한 힌지 영역은 인간 IgA, IgD, IgM, IgE, 또는 IgG 로부터 유래한 것일 수 있다.
19. 일 실시태양에 있어서, 특성 (b)에서 면역글로불린으로부터 유래한 힌지 영역에 존재하는 파파인 인식 부위 또는 글리코실화 부위에서 아미노산 변이를 가지는 것일 수 있다.
20. 일 실시태양에 있어서, 특성 (b)에서 파파인 인식 부위에서의 아미노산 변이는, 파파인 인식 부위에 존재하는 아미노산 잔기 중 하나 이상을 알라닌, 세린, 티로신, 프롤린, 또는 트레오닌으로 치환하거나 또는 파파인 인식 부위에 방향족 탄소 또는 사이클릭 탄소를 측쇄에 갖는 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 1개 내지 10개의 아미노산 서열을 삽입하는 것일 수 있고, 글리코실화 부위에서의 아미노산 변이는, 면역글로불린으로부터 유래한 힌지 영역에 존재하는 세린 또는 트레오닌을, (i) 결실시키거나 또는 (ii) 세린, 아스파라긴 또는 트레오닌 외의 다른 아미노산으로 치환하는 것일 수 있다.
21. 일 실시태양에 있어서, 세린, 아스파라긴 또는 트레오닌 외의 다른 아미노산이 글리신 또는 알라닌일 수 있다.
22. 일 실시태양에 있어서, 코어 힌지에 존재하는 시스테인이 세린 또는 글리신으로 치환된 것일 수 있다.
23. 일 실시태양에 있어서, 특성 (b)에서 링커가 N 말단부터 (i) GS, GSSG, (GSSG)2, GGGGS, (GGGGS)4, GS(GGGGS) 및 GS(GGGGS)3 로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 및 (ii) 인간 IgG1, IgG4 또는 IgD/G1으로 이루어진 군으로부터 선택된 면역글로불린으로부터 유래한 힌지 영역을 순서대로 포함할 수 있고, 상기 힌지 영역의 아미노산 서열은 변형될 수 있다.
24. 일 실시태양에 있어서, 특성 (b)에서 상기 링커가 GSSGDKTHTSPPSP, GSSGEPKSSDKTYTSPPSP, GSKVDKKVEPKSSDKTHTCPPCP, GSKVDKKVEPKSSDKTYTCPPCP, GSKVDKKVEPKSSDTPPTCPPCP, GSGGGGSGGGGSGGGGSAESKYGPPCPPCP, GSNTGSGGEEKKKEKEKEEQEERSSDKTYTCPPCP, GSNTGSGGEEKKKEKEKEEQEERSSDTPPTCPPCP, EGSSGGSSGEPKSDATPTCPPCP, EGSSGGSSGEPKSDSTYTCPPCP, GCKVDKKVEPKSSDKTYTCPPCP, CSKVDKKVEPKSSDKTYTCPPCP, GGGGSAEPKAGDKAPPGPPGP, GGGGSAEPKSSDKTYTCPPCP, GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEPKSSDKTYTCPPCP, CSSGDATPTSPPSP, CSKVDKKVEPKSSDTPPTCPPCP, CSGGGGSAEPKAGDATPPTCPPCP, CSGGGGSGGGGSGGGGSAESKYGPPCPPCP, CSNTGSGGEEKKKEKEKEEQEERSSDTPPTCPPCP, CGSSGGSSGEPKSDATPTCPPCP, 및 CSGGGGSAEPKAGDATPPTCPPCPPCP 로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열인 것일 수 있다.
25. 일 실시태양에 있어서, 특성 (c)에서 β1-β2 루프 상의 아미노산 잔기 중 하나가 V240 내지 T247의 아미노산 서열 상의 아미노산 잔기 중 하나인 것일 수 있다.
26. 일 실시태양에 있어서, 특성 (c)에서 도메인 D3의 β1-β2 루프 상의 T241, L243, 및 R244 아미노산 잔기 또는 β5-β6 루프 상의 N303 아미노산 잔기 중 하나가 시스테인으로 치환될 수 있고, 도메인 D3의 Y329를 기준으로 0, +2, 및 +3 위치에 존재하는 아미노산 잔기 중 하나가 시스테인으로 치환될 수 있다.
27. 일 실시태양에 있어서, 특성 (c)에서 변형된 융합 단백질은 T241 및 도메인 D3의 Y329를 기준으로 +3 위치에 존재하는 아미노산 잔기가 시스테인으로 치환되거나; L243C 및 Y329C 아미노산 변이를 가지거나; L243 및 도메인 D3의 Y329를 기준으로 +2 위치에 존재하는 아미노산 잔기가 시스테인으로 치환되거나; R244C 및 Y329C 아미노산 변이를 가지거나; 또는 N303C 및 Y329C 아미노산 변이를 가지는 것일 수 있다.
28. 일 실시태양에 있어서, 변형된 융합 단백질은 (a) 도메인 D3의 β1-β2 루프 상에서 K241T, K241E, L243S, R244V, 및 H246E 중 하나 이상의 아미노산 치환, 도메인 D3의 β2-β3 루프 상에서 L258A, L258S, 또는 L258D의 아미노산 치환, 및/또는 도메인 D3의 β5-β6 루프 상에서 K300G, Q302T, K304S, 및 K306Q 중 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고; (b) 링커가 GSSGDKTHTSPPSP, GSSGEPKSSDKTYTSPPSP, GSKVDKKVEPKSSDKTHTCPPCP, GSKVDKKVEPKSSDKTYTCPPCP, GSKVDKKVEPKSSDTPPTCPPCP, GSGGGGSGGGGSGGGGSAESKYGPPCPPCP, GSNTGSGGEEKKKEKEKEEQEERSSDKTYTCPPCP, GSNTGSGGEEKKKEKEKEEQEERSSDTPPTCPPCP, EGSSGGSSGEPKSDATPTCPPCP, EGSSGGSSGEPKSDSTYTCPPCP, GCKVDKKVEPKSSDKTYTCPPCP, CSKVDKKVEPKSSDKTYTCPPCP, GGGGSAEPKAGDKAPPGPPGP, GGGGSAEPKSSDKTYTCPPCP, GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEPKSSDKTYTCPPCP, CSSGDATPTSPPSP, CSKVDKKVEPKSSDTPPTCPPCP, CSGGGGSAEPKAGDATPPTCPPCP, CSGGGGSGGGGSGGGGSAESKYGPPCPPCP, CSNTGSGGEEKKKEKEKEEQEERSSDTPPTCPPCP, CGSSGGSSGEPKSDATPTCPPCP, 및 CSGGGGSAEPKAGDATPPTCPPCPPCP 로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열이고, (c) 도메인 D3의 β1-β2 루프 상의 T241, L243, 및 R244 아미노산 잔기 또는 β5-β6 루프 상의 N303 아미노산 잔기 중 하나가 시스테인으로 치환되고, 도메인 D3의 Y329를 기준으로 0, +2, 및 +3 위치에 존재하는 아미노산 잔기 중 하나가 시스테인으로 치환된 것이고, 상기 특성 (a) 내지 (c)를 모두 가지는 것일 수 있다.
29. 일 실시태양에 있어서, 변형된 융합 단백질은 (a) 도메인 D3의 β1-β2 루프 상에서 (i) L243S 및 R244V 아미노산 치환, 또는 (ii) K241E, L243S, R244V, 및 H246E 아미노산 치환, 도메인 D3의 β2-β3 루프 상에서 L258A, L258S, 또는 L258D 아미노산 치환, 및/또는 도메인 D3의 β5-β6 루프 상에서 (i) K300G 아미노산 치환, (ii) K300G, Q302T, 및 K304S 아미노산 치환, 또는 (iii) K300G, Q302T, K304S, 및 K306Q 아미노산 치환을 포함하고; (b) 링커가 CSSGDATPTSPPSP, CSKVDKKVEPKSSDTPPTCPPCP, CSGGGGSAEPKAGDATPPTCPPCP, CSGGGGSGGGGSGGGGSAESKYGPPCPPCP, CSNTGSGGEEKKKEKEKEEQEERSSDTPPTCPPCP, CGSSGGSSGEPKSDATPTCPPCP, CSKVDKKVEPKSSDKTYTCPPCP, 및 CSGGGGSAEPKAGDATPPTCPPCPPCP 로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열이고; (c) L243 및 도메인 D3의 Y329를 기준으로 +2 위치에 존재하는 아미노산 잔기가 시스테인으로 치환된 것이고, 상기 특성 (a) 내지 (c)를 모두 가지는 것일 수 있다.
30. 일 실시태양에 있어서, 변형된 융합 단백질은 (a) 도메인 D3의 β1-β2 루프 상에서 K241E, L243S, R244V, 및 H246E 아미노산 치환, 도메인 D3의 β2-β3 루프 상에서 L258A, L258S, 또는 L258D 아미노산 치환, 및 도메인 D3의 β5-β6 루프 상에서 K300G, Q302T, 및 K304S 아미노산 치환을 포함하고; (b) 링커가 CSSGDATPTSPPSP, CSKVDKKVEPKSSDTPPTCPPCP, CSGGGGSAEPKAGDATPPTCPPCP, CSGGGGSGGGGSGGGGSAESKYGPPCPPCP, CSNTGSGGEEKKKEKEKEEQEERSSDTPPTCPPCP, CGSSGGSSGEPKSDATPTCPPCP, CSKVDKKVEPKSSDKTYTCPPCP, 및 CSGGGGSAEPKAGDATPPTCPPCPPCP 로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열이고; (c) L243 및 도메인 D3의 Y329를 기준으로 +2 위치에 존재하는 아미노산 잔기가 시스테인으로 치환된 것이고, 상기 특성 (a) 내지 (c)를 모두 가지는 것일 수 있다.
31. 일 실시태양에 있어서, 변형된 융합 단백질은 서열번호 10 내지 서열번호 70, 서열번호 77 내지 서열번호 93 및 서열번호 98로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
32. 일 실시태양에 있어서, 다량체화 도메인이, (a) 면역글로불린의 Fc 부위; (b) IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4의 CH3 부위; (c) IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4의 CH2 및 CH3 부위; (d) 서열번호 99와 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린의 Fc 부위; 또는 (e) 서열번호 99의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린의 Fc 부위일 수 있다.
33. 일 실시태양에 있어서, 다량체화 도메인이 면역글로불린의 Fc 부위이며, Fc 부위의 로어 힌지(lower hinge) 영역부터 시작하는 것일 수 있다.
34. 일 실시태양에 있어서, 다량체화 도메인이 서열번호 99로 이루어진 IgG1의 Fc 부위일 수 있다.
35. 일 실시태양에 있어서, 다량체화 도메인은 서열번호 99에 대해 D126E 아미노산 치환, L128M 아미노산 치환 및/또는 K217 아미노산 결실을 가지는 것일 수 있다.
36. 일 실시태양에 있어서, 변형된 융합 단백질은 이량체 또는 다량체 형태일 수 있다.
37. 본 개시의 일 실시태양은, 본 개시의 일 실시태양에 따른 변형된 융합 단백질을 유효성분으로서 포함하는, 자가면역 질환, 염증성 질환, 신생물 형성 질환, 암, 혈관신생 관련 질환 또는 안질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물에 관한 것일 수 있다.
38. 본 개시의 일 실시태양은, 본 개시의 일 실시태양에 따른 변형된 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자에 관한 것일 수 있다.
39. 본 개시의 일 실시태양은, 본 개시의 일 실시태양에 따른 변형된 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 숙주 세포에 관한 것일 수 있다.
40. 본 개시의 일 실시태양은, 본 개시의 일 실시태양에 따른 변형된 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터에 관한 것일 수 있다.
41. 일 실시태양에 있어서, 벡터는 재조합 바이러스 벡터 일 수 있다.
42. 본 개시의 일 실시태양은, 본 개시의 일 실시태양에 따른 재조합 바이러스 벡터를 포함하는, 바이러스 벡터를 대상체에 전달하기 위한 약학적 조성물이며, 여기서 상기 재조합 바이러스 벡터에 의해 암호화된 융합 단백질이 대상체 내에서 발현되며, 자가면역 질환, 염증성 질환, 신생물 형성 질환, 암, 혈관신생 관련 질환 또는 안질환의 예방 또는 치료를 위한 것인, 약학적 조성물에 관한 것일 수 있다.
43. 일 실시태양에 있어서, 재조합 바이러스 벡터는 재조합 아데노 관련 바이러스 벡터일 수 있다.
본 개시의 일 실시태양에 따른 변형된 융합 단백질은 우수한 생산성, 물리적 안정성 및 화학적 안정성을 나타낼 수 있다.
본 개시의 일 실시태양에 따른 변형된 융합 단백질은 우수한 혈중 안정성을 나타낼 수 있다.
본 개시의 일 실시태양에 따른 변형된 융합 단백질은 기존에 개발된 물질과 비교하여 산성(acidic) 성질을 가지며 pI 분포에서 산성 및 중성영역의 전하변이체 비율이 증가하는 성질을 나타낼 수 있다. 이에 따라 변형된 융합 단백질은 체내에서 매트릭스 및 세포 표면과의 비특이적 상호작용이 개선되는 효과를 나타낼 수 있다.
도 1a는 VEGFR1 및 VEGFR2의 D2-D3 도메인의 표면전하 분포도를 3D 구조로 나타낸 그림이다. 리간드인 VEGF의 결합표면(초록색 원으로 표시) 및 변이가 도입될 수 있는 D3 도메인의 루프가 위치한 부위(붉은색 원으로 표시)를 나타낸 그림이다.
도 1b는 VEGFR1의 도메인 D3에서 변이가 일어날 수 있는 예시적인 아미노산 잔기의 위치를 3D 구조 상 나타낸 그림이다.
도 1c는 VEGFR1의 도메인 D3에서 변이가 일어날 수 있는 예시적인 아미노산 잔기와 그 구조를 나타낸 그림이다. 도 1c의 (A)는 변이 부위의 아미노산 잔기 및 측쇄의 위치를 스틱으로 나타낸 그림이고 (B)는 (A)를 45도 회전시킨 그림이다.
도 2는 VEGFR1 세포외 부위를 3D 구조로 나타낸 그림이다. 도 2a는 VEGFR1이 VEGF 리간드와 결합할 때의 구조를 나타낸 그림이고, 도 2b 및 도 2c는 VEGFR1의 도메인 D2 및 도메인 D3와 Fc 영역이 결합된 융합 단백질(예: VEGF-Grab3)이, 리간드와 결합하기 전 열린 구조(도 2b)를 가지는 경우와 결합 후 닫힌 구조(도 2c)를 가지는 경우를 3D 모델링을 통하여 나타낸 그림이다. 도 2d는 자연 상태의 VEGFR1에서 이량체를 형성할 때 D3 말단으로부터 도메인 D4의 이량체 형성부위까지의 거리를 나타낸 그림이다.
도 3은 본 개시에서 도입한 링커를 디자인하기 위한 예시적인 모식도를 나타낸 그림이다.
도 4a 및 도 4b는 단백질의 혈청내 안정성 및 VEGF-A 결합능을 측정한 그래프이다.
도 5a 내지 도 5c는 단백질의 혈청내 안정성을 측정한 그래프이다.
도 6a 내지 도 6f는 단백질의 등전점을 측정한 그래프이다.
도 7a 내지 도 7d는 단백질의 pI 분포도를 분석한 그래프이다.
도 8a 내지 도 8d는 단백질의 열안정성은 분석한 그래프이다.
도 9a 내지 도 9c는 단백질의 VEGF-A 결합능을 측정한 그래프이다.
도 1b는 VEGFR1의 도메인 D3에서 변이가 일어날 수 있는 예시적인 아미노산 잔기의 위치를 3D 구조 상 나타낸 그림이다.
도 1c는 VEGFR1의 도메인 D3에서 변이가 일어날 수 있는 예시적인 아미노산 잔기와 그 구조를 나타낸 그림이다. 도 1c의 (A)는 변이 부위의 아미노산 잔기 및 측쇄의 위치를 스틱으로 나타낸 그림이고 (B)는 (A)를 45도 회전시킨 그림이다.
도 2는 VEGFR1 세포외 부위를 3D 구조로 나타낸 그림이다. 도 2a는 VEGFR1이 VEGF 리간드와 결합할 때의 구조를 나타낸 그림이고, 도 2b 및 도 2c는 VEGFR1의 도메인 D2 및 도메인 D3와 Fc 영역이 결합된 융합 단백질(예: VEGF-Grab3)이, 리간드와 결합하기 전 열린 구조(도 2b)를 가지는 경우와 결합 후 닫힌 구조(도 2c)를 가지는 경우를 3D 모델링을 통하여 나타낸 그림이다. 도 2d는 자연 상태의 VEGFR1에서 이량체를 형성할 때 D3 말단으로부터 도메인 D4의 이량체 형성부위까지의 거리를 나타낸 그림이다.
도 3은 본 개시에서 도입한 링커를 디자인하기 위한 예시적인 모식도를 나타낸 그림이다.
도 4a 및 도 4b는 단백질의 혈청내 안정성 및 VEGF-A 결합능을 측정한 그래프이다.
도 5a 내지 도 5c는 단백질의 혈청내 안정성을 측정한 그래프이다.
도 6a 내지 도 6f는 단백질의 등전점을 측정한 그래프이다.
도 7a 내지 도 7d는 단백질의 pI 분포도를 분석한 그래프이다.
도 8a 내지 도 8d는 단백질의 열안정성은 분석한 그래프이다.
도 9a 내지 도 9c는 단백질의 VEGF-A 결합능을 측정한 그래프이다.
본 문서에 기재된 다양한 실시태양 또는 실시예들은, 본 개시의 기술적 사상을 명확히 설명하기 위한 목적으로 예시된 것이며, 이를 특정한 실시 형태로 한정하려는 것이 아니다. 본 개시의 기술적 사상은, 본 문서에 기재된 각 실시태양 또는 실시예의 다양한 변경(modifications), 균등물(equivalents), 대체물(alternatives) 및 각 실시태양 또는 실시예의 전부 또는 일부로부터 선택적으로 조합된 실시태양 또는 실시예를 포함한다.
본 개시에 사용되는 모든 기술적 용어들 및 과학적 용어들은, 달리 정의되지 않는 한, 본 개시가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다.
본 문서에서 사용되는 단수형의 표현은, 문맥상 다르게 뜻하지 않는 한 복수형의 의미를 포함할 수 있으며, 이는 청구범위에 기재된 단수형의 표현에도 마찬가지로 적용된다.
I. 정의
본 개시에서, 용어 "약"은 기술 분야의 숙련된 기술자에게 널리 공지된 바와 같이, 각각의 값에 대한 통상적인 오차 범위를 나타낼 수 있다. 이는 본 개시에 기재된 수치 값 또는 범위의 맥락에서, 일 실시태양에서 언급되거나 또는 청구된 수치 값 또는 범위의 ±20%, ±15%, ±10%, ±9%, ±8%, ±7%, ±6%, ±5%, ±4%, ±3%, ±2%, 또는 ±1%임을 의미할 수 있다. 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 길이에 있어서, "약"은 핵산 또는 단백질이 기재된 뉴클레오티드 또는 아미노산의 수로 제한되지 않음을 나타낼 수 있으며, 양 말단에 첨가 또는 제거된 몇몇의 뉴클레오티드 또는 아미노산이 기능적 활성을 저해하지 않는 범위 내에서 포함될 수 있다.
본 개시에서 사용되는 "포함하는", "구비하는", "갖는" 등과 같은 표현은, 해당 표현이 포함되는 어구 또는 문장에서 달리 언급되지 않는 한, "포함하는"과 유사한 방식으로 다른 실시예를 포함할 가능성을 내포하는 개방형 용어(open-ended terms)로 이해되어야 한다.
본 개시에서 사용된 용어 "및/또는"은 해당 용어와 연관된 항목에 있어서, 항목들 중 임의의 하나 이상, 항목들의 임의의 조합 또는 항목들 전부를 의미할 수 있다.
본 개시에서 사용된 용어 "아미노산"은 자연에 존재하는(naturally occurring) 모든 L-α-아미노산을 의미할 수 있다. 이 정의는 노르류신(norleucine), 오르니틴 및 호모시스테인을 포함할 수 있다.
본 개시에서 사용된 용어 "변이" 또는 "아미노산 변이"는 참조(예: 천연 서열) 폴리펩티드 또는 단백질과 비교하여, 아미노산 서열의 치환, 삽입, 결실 또는 이들의 조합을 의미할 수 있으며, 용어 "변이체"는 이러한 변이로 인해 참조 폴리펩티드 또는 단백질과 비교하여 아미노산 서열에 일부 차이를 갖는 분자를 의미할 수 있다.
또한, 본 개시의 변이체의 범위에는 동일하거나 유사한 생물학적 활성을 보인 단백질 또는 단편 또는 이들의 유도체 및 번역 동안 또는 번역 후에 예를 들어, 당화, 단백질 가수분해에 의한 절단, 항체 분자 또는 다른 세포 리간드로의 연결 등에 의하여 별도로 변형된 유도체가 포함될 수 있다.
본 개시에서 사용된 용어 "담체(carriers)"는 적용된 투여량과 농도에서 세포 또는 포유동물에 비독성인 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제를 포함할 수 있다. 종종 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 수용성 pH 버퍼 용액이다. 약학적으로 허용 가능한 담체의 예는 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산과 같은 버퍼; 아스코르브산을 포함하는 항산화제; 저분자량(약 10개의 잔기 미만) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 폴리머; 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 알지닌 또는 라이신과 같은 아미노산; 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이팅제; 만니톨 또는 솔비톨과 같은 당알코올; 나트륨과 같은 염-형성 반대이온; 및/또는 TWEEN®, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 및 PLURONICS®와 같은 비이온성 계면활성제를 포함할 수 있으며, 이에 의하여 제한되는 것은 아니다.
본 개시에서 사용된 용어 "유효량"은 유익하거나 소망하는 임상 또는 생화학적 결과를 가져오는데 충분한 양을 의미할 수 있다. 유효량은 1회 이상으로 투여될 수 있다. 유효량은 질병 상태의 진행을 완화시키거나, 개선하거나, 안정화시키거나, 느리게 하거나 또는 지연시키는데 충분한 양을 의미할 수 있다.
본 개시에서 사용된 용어 "리간드"는 변형된 융합 단백질에 높은 친화도로 결합되는 분자(예: VEGF-A, -B, -C, -D, 및 PLGF)를 의미할 수 있다. 다른 맥락에서 "리간드"는 폴리펩티드 또는 단백질과 같은 분자에 공유적으로 또는 일시적으로 특이적 결합하는 모든 분자 또는 제제, 또는 화합물을 의미할 수 있다.
본 개시에서 사용된 용어 "개체" 또는 "대상체"는 포유동물을 의미할 수 있다. 포유동물에는 가축(예컨대, 소, 양, 고양이, 개 그리고 말), 영장류(예컨대, 인간 및 원숭이와 같은 비 인간 영장류), 토끼, 그리고 설치류(예컨대, 마우스와 랫트)가 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 일 실시태양에서, 개체 또는 대상체는 인간일 수 있다.
본 개시에서 사용된 용어, "약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 희석제"는 모든 용매, 분산매, 코팅제, 항균제와 항진균제, 등장용 제제와 흡착지연제 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 개시에 기술된 본 개시의 일 실시태양은, 일 실시태양을 "포함하는", 이로 "이루어지는" 및/또는 이로 "필수적으로 이루어지는" 것을 포함하는 것으로 이해된다.
II. 변형된 융합 단백질 및 변형된 융합 단백질 구성 성분
1. 혈관내피성장인자 수용체(vascular endothelial growth factor receptor; VEGFR)
일 실시태양에서, 본 개시의 변형된 융합 단백질은 VEGFR1 세포외 도메인을 구성성분으로 포함할 수 있다. VEGFR1은 fms 관련 티로신 키나아제(FLT-1)라고도 알려져 있으며, FLT1 유전자에 의해 암호화된다. VEGFR1의 아미노산 서열은 서열번호 1의 아미노산 서열로 제시되며, UniProtKB. #P17948로 찾을 수 있다. 일 실시태양에서, VEGFR1은 인간과 같은 포유동물로부터 유래한다. VEGFR1에는 세포 외 영역의 N 말단부터 시작하여 C 말단까지 1, 2, 3, 4, 5, 6 및 7의 번호가 매겨진 일곱 개의 면역글로불린(Ig) 유사 도메인이 존재하며, 이는 VEGFR2 및 VEGFR3의 경우에도 동일하다.
일 실시태양에서, VEGFR1 세포외 도메인은 Ig 유사 도메인 D2 및 Ig 유사 도메인 D3를 포함할 수 있다. 본 개시에서 사용된 용어 VEGFR1의 "Ig 유사 도메인 D2"은 VEGFR1의 세포 외 영역의 N 말단에서 발견되는 두 번째 Ig 유사 도메인을 지칭하고, VEGFR의 "Ig 유사 도메인 D3"는 VEGFR1의 세포 외 영역의 N 말단에서 발견되는 세 번째 Ig 유사 도메인을 지칭하되, 이들 도메인의 기능성(예: VEGF 리간드에 대한 결합 및/또는 VEGFR 경로의 활성화 저해)이 유지되는 범위 내에서의 변이체를 포함하는 개념이다. VEGFR1의 Ig 유사 도메인 D2 및 D3는 종에 따라 활성을 나타내는 단백질의 아미노산 서열에 차이가 존재하는 경우가 있으므로, 그 유래나 서열에 한정되지 않으며, 이의 야생형 또는 활성을 가지는 변이체를 포함할 수 있다.
일 실시태양에서, VEGFR1의 Ig 유사 도메인 D2는 서열번호 1의 G132 내지 H214의 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 또는 이러한 아미노산 서열로부터 나타나는 VEGF 리간드에 대한 결합 친화도를 유사 또는 동등하게 가지는 아미노산 서열 변이체를 포함할 수 있다. 구체적으로 일 실시태양에서, VEGFR1의 Ig 유사 도메인 D2는 서열번호 1의 G132 내지 H214의 아미노산 서열에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일 실시태양에서, VEGFR1의 Ig 유사 도메인 D3는 서열번호 1의 L215 내지 A332의 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 또는 이러한 아미노산 서열로부터 나타나는 VEGF 리간드에 대한 결합 친화도를 유사 또는 동등하게 가지는 아미노산 서열 변이체를 포함할 수 있다. 구체적으로 일 실시태양에서, VEGFR1의 Ig 유사 도메인 D3는 L215 내지 A332의 아미노산 서열에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일 실시태양에서, 본 개시의 변형된 융합 단백질은 VEGFR1의 Ig 유사 도메인 D2 및 Ig 유사 도메인 D3외에 다른 VEGFR 세포외 도메인을 추가로 포함할 수 있다.
이론에 얽매이지 않고, 본 개시에서는 VEGFR의 세포외 도메인이 VEGF 리간드와의 결합에 의해 VEGF 경로의 활성화를 저해하여, VEGF 리간드와 VEGFR과의 상호 작용을 차단하는 것으로 생각된다. 또한, 이론에 얽매이지 않고, 본 개시에서는 VEGFR의 세포외 도메인이 VEGF 신호 전달 경로의 우성 음성 저해를 위해 VEGFR과 결합할 수 있다고 생각된다. 일 실시태양에서, VEGFR의 세포외 도메인은 VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D 및 PLGF로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 VEGF 리간드와 결합할 수 있다. 일 실시태양에서, VEGFR의 세포외 도메인은 VEGFR(예컨대, VEGFR1, VEGFR2 및/또는 VEGFR3)과 결합할 수 있다.
일 실시태양에서, VEGFR 세포외 도메인은 숙주 세포로부터 VEGFR 세포외 도메인 또는 이를 포함하는 변형된 융합 단백질의 분비를 위한 신호 서열로 작용하는 신호 펩티드를 포함할 수 있거나, 포함하지 않을 수 있다. 이러한 신호 펩티드는 관심 있는 단백질을 암호화하는 핵산(예컨대, VEGFR1의 세포외 도메인)에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
2. 링커
변형된 융합 단백질의 구성성분들(예: VEGFR1의 세포외 도메인 또는 다량체화 도메인)은 펩티드 링커와 같은 연결 모이어티에 의해 연결될 수 있다. 이러한 링커는 융합 단백질 구성성분들의 유연성을 증가시키며, 융합 단백질 내의 각 기능성 구성성분의 구조를 유의하게 방해하지 않는다.
일 실시태양에서, 링커는 VEGFR1 세포외 도메인의 C 말단 끝(예: Ig 유사 도메인 D3의 C 말단)을 다량체화 도메인(예: IgG1 Fc 부위)의 N 말단 끝에 연결하는 데에 이용될 수 있다.
일 실시태양에서, 링커는 면역글로불린으로부터 유래한 힌지 영역의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 면역글로불린으로부터 유래한 힌지 영역은 면역글로불린의 Fc 부위의 N 말단 영역에 존재하는 힌지 영역을 포함할 수 있다. 일 실시태양에서, 면역글로불린으로부터 유래한 힌지 영역은 인간 IgA, IgD, IgM, IgE, 또는 IgG으로부터 유래한 것일 수 있다. 일 실시태양에서, 면역글로불린으로부터 유래한 힌지 영역은 면역글로불린의 Fc 부위의 코어 힌지(core hinge) 영역까지의 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 이러한 서열은 Fc 부위의 로어 힌지(lower hinge) 영역을 포함하지 않는다. 예를 들어, 힌지 영역이 IgG1으로부터 유래한 경우, 로어 힌지 영역은 APELLGGP에 상응하는 아미노산 서열일 수 있다. 일 실시태양에서, 링커는 아미노산 서열 EDKTHTCPPCP 또는 LEDKTHTCPPCP 일 수 있다.
3. 다량체화 도메인
본 개시는 임의의 변형된 융합 단백질의 구성성분이 될 수 있는 다량체화 도메인(예: 면역글로불린의 Fc 부위)을 제공한다. 다량체화 도메인은 서브유닛의 회합을 촉진하여 예를 들어, 이량체, 삼량체, 사량체 등을 형성하는 다량체 단백질의 부분이다. 본 개시에서 사용된 용어 "다량체화 도메인"은 이량체화 도메인, 삼량체화 도메인, 사량체화 도메인 등을 지칭하는 데 이용될 수 있다. 다량체화 도메인을 포함하는 융합 단백질은 다량체화 도메인을 포함하는 다른 융합 단백질과 상호 작용하여 융합 단백질 다량체(예컨대, 융합 단백질 이량체)를 생성할 수 있다. 예를 들어, IgG Fc 부위는 본 개시에 기술된 VEGFR1의 세포외 도메인과 융합될 수 있는 이량체화 도메인이다. VEGFR1의 세포외 도메인 및 IgG Fc 부위를 포함하는 융합 단백질은 IgG Fc 부위를 포함하는 또 다른 융합 단백질과 이량체화하여, VEGF 리간드와 PLGF 리간드에 동시에 결합할 수 있는 융합 단백질 이량체를 생성할 수 있다.
일 실시태양에서, 다량체화 도메인은 면역글로불린의 Fc 부위일 수 있다. 추가적인 실시태양에서, 면역글로불린의 Fc 부위는 IgG Fc 부위, IgA Fc 부위, IgM Fc 부위, IgD Fc 부위 및 IgE Fc 부위로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 또 다른 추가적인 실시태양에서, 면역글로불린의 Fc 부위는 IgG1 Fc 부위, IgG2 Fc 부위, IgG3 Fc 부위 및 IgG4 Fc 부위로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 일 실시태양에서, Fc 부위는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4의 CH3 부위를 포함할 수 있다. 일 실시태양에서, Fc 부위는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4의 CH2 및 CH3 부위를 포함할 수 있다. Fc 부위를 포함하는 면역글로불린을 암호화하는 아미노산 서열들은 당해 분야에 잘 알려져 있다. 일 실시태양에서 다량체화 도메인은 서열번호 99의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린의 Fc 부위일 수 있다. 일 실시태양에서 다량체화 도메인은 서열번호 99의 아미노산 서열로 이루어진 IgG1의 Fc 부위일 수 있다.
일 실시태양에서, Fc 부위는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4의 CH3 부위 또는 CH2 및 CH3 부위의 아미노산 서열에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일 실시태양에서, 다량체화 도메인은 서열번호 99의 아미노산 서열에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일 실시태양에서, 다량체화 도메인은 면역글로불린 Fc 부위의 로어 힌지(lower hinge) 영역부터 시작하는 것일 수 있다. Fc 부위의 로어 힌지 영역은 Ala244부터 시작할 수 있으며 Ala244 내지 Pro251의 아미노산 서열에 상응하는 것일 수 있다. 여기서 아미노산 잔기의 위치는 카밧 넘버링에 따른다(Kabat et. al., in of Proteins of Immunological Interest 5th Ed.,US Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242,1991). 예를 들어, 인간 IgG1 Fc 영역의 로어 힌지 영역은 서열번호 99의 아미노산 서열을 기준으로 1 내지 8번째 아미노산 잔기에 상응하거나, APELLGGP의 아미노산 서열에 상응하는 것일 수 있다. 로어 힌지 영역부터 시작하는 인간 IgG1 Fc 부위는 서열번호 99의 아미노산 서열로 제시된다.
일 실시태양에서, Fc 부위는 단백질 일부가 당화되어 있거나 혹은 전체가 당화되지 않은 형태일 수 있다.
일 실시태양에서, Fc 부위는 서열번호 99를 기준으로 D126E 아미노산 치환, L128M 아미노산 치환 및/또는 K217 아미노산 결실을 가질 수 있다. 이러한 아미노산 변이는 FcRn과의 상호작용을 통하여 융합 단백질의 반감기를 증가시킬 수 있다. 상기 아미노산 변이는 서열번호 99의 아미노산 서열에 상응하는 서열을 가지는 다른 면역글로불린 Fc 부위에서 동일하게 나타날 수 있으며, 본 개시의 변형된 융합 단백질은 상기 아미노산 변이를 가지는 다른 면역글로불린 Fc 부위를 다량체화 도메인 구성성분으로 포함할 수 있다.
이하에서는 본 개시의 변형된 융합 단백질이 가지는 특성에 대해 서술한다. 이러한 특성을 위한 아미노산 변이에 있어서, 아미노산 잔기의 위치는 서열번호 1의 VEGFR1의 전체 아미노산 서열에 따른 아미노산 잔기 위치에 상응하도록 기재되었다.
4. 표면 전하 전이 변이 특성
일 실시태양에서, 본 개시의 변형된 융합 단백질은 표면 전하 전이 변이 특성을 가질 수 있다. 본 개시에서, 표면 전하 전이 변이 특성을 가지는 변형된 융합 단백질은 "표면 전하 전이 변이체" 또는 "표면 전하 변이체"로 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
일 실시태양에 따른 표면 전하 전이 변이 특성에서, 변형된 융합 단백질은 Ig 유사 도메인 D3의 β1-β2 루프 상의 하나 이상의 아미노산 잔기, 도메인 D3의 β2-β3 루프 상의 하나 이상의 아미노산 잔기, 및/또는 도메인 D3의 β5-β6 루프 상의 하나 이상의 아미노산 잔기가 단백질의 순 pI(net pI)를 감소시키는 아미노산, 측쇄가 음전하를 띄는(negatively charged) 아미노산, 또는 측쇄가 정전기적음전하(electro-negative)를 갖게 되는 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 일 실시태양에서, 측쇄가 정전기적음전하를 갖게 되는 아미노산은 치환 후 인접한 아미노산 잔기 혹은 분자의 특성에 따라 정전기적음전하를 갖게 되는 것을 의미할 수 있으며, 분자 내 전자 분포에 따라 생기는 상대적인 개념을 의미할 수 있다. 예를 들어, 하이드록시(-OH)를 포함하는 아미노산 잔기는 산소 원자에 존재하는 비공유전자쌍으로 인해 정전기적음전하 상태가 될 수 있고, 이러한 현상으로 단백질의 순 pI가 감소할 수 있다.
일 실시태양에서, Ig 유사 도메인 D3의 β1-β2 루프는 서열번호 1의 아미노산 서열의 T236 내지 T247 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 일 실시태양에서, Ig 유사 도메인 D3의 β2-β3 루프는 서열번호 1의 아미노산 서열의 T256 내지 V262 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 일 실시태양에서, Ig 유사 도메인 D3의 β5-β6 루프는 서열번호 1의 아미노산 서열의 D299 내지 L308 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 본 개시에서, β1-β2 루프는 "Site 1," β2-β3 루프는 "Site 2," 및 β5-β6 루프는 "Site 3"으로 지칭될 수 있다. 본 개시의 발명자는 상기 루프에 존재하는 아미노산 잔기가 도메인 D3의 표면으로 노출된다는 점을 확인하고, 루프에 존재하는 아미노산 잔기의 변이를 통해 변형된 융합 단백질의 표면 전하 안정화 및 구조 안정화를 달성하였다.
일 실시태양에서, Site 1 및 Site 3에 존재하는 아미노산 잔기는 그 구조적 위치로 인해 아미노산 잔기 간의 상호 작용을 통해 서로 영향을 주게 되고, 이에 따라 각 Site에서 2중, 3중 또는 4중 아미노산 변이(예: 아미노산 치환)가 도입될 수 있다.
일 실시태양에서, Site 2의 아미노산 잔기들은 도메인 D3가 VEGF 리간드 또는 PLGF 리간드와 결합하는 측면의 도메인 표면에 노출되며, 리간드에 대한 결합력 또는 표면 잔기 노출로 인한 용해도(solubility)에 영향을 미칠 수 있다. 일 실시태양에서, Site 2 상에 존재하는 아미노산 잔기의 경우, 단백질 구조 또는 리간드와의 결합력과 용해도에 영향을 크게 미치지 않는 범위 내에서 기존의 아미노산 잔기의 측쇄보다 작은 크기를 갖는 아미노산 잔기(예: Ala) 또는 유사한 크기의 극성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기(예: Ser 또는 Asp)로 치환될 수 있다.
일 실시태양에서, 상기 3개 루프는 그 기능을 유지하는 범위 내의 아미노산 서열 변이체를 포괄하는 개념으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 일 실시태양에서, β1-β2 루프, β2-β3 루프 및 β5-β6 루프는 각각 아미노산 서열 TPRPVKLLRGHT, TPLNTRV 및 DKMQNKDKGL에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일 실시태양에 따른 표면 전하 전이 변이 특성에서, 아미노산 치환은 (i) VEGFR2 상동 서열의 아미노산 잔기, (ii) 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 아스파라긴, 글루타민, 아스파르트산, 또는 글루탐산인 아미노산 잔기, 또는 (iii) 알라닌 또는 글리신인 측쇄가 짧은 아미노산 잔기로 치환되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
일 실시태양에 따른 링커 변이 특성에서, 변형된 융합 단백질은 Ig 유사 도메인 D3의 β1-β2 루프 상의 하나 이상의 아미노산 잔기, 및 도메인 D3의 β5-β6 루프 상의 하나 이상의 아미노산 잔기가 단백질의 순 pI(net pI)를 감소시키는 아미노산, 측쇄가 음전하를 띄는 아미노산, 또는 측쇄가 정전기적음전하를 갖게 되는 아미노산으로 치환된 것일 수 있다.
일 실시태양에 따른 표면 전하 전이 변이 특성에서, 변형된 융합 단백질은 (i) Ig 유사 도메인 D3의 β1-β2 루프 상의 K241, L243, R244, 및 H246 아미노산 잔기 중 한 개 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 일 실시태양에서, 상기 β1-β2 루프 상의 상기 아미노산 잔기는 트레오닌, 글루탐산, 세린, 및 발린 중 어느 하나로 치환될 수 있다.
일 실시태양에 따른 표면 전하 전이 변이 특성에서, 변형된 융합 단백질은 (ii) Ig 유사 도메인 D3의 β2-β3 루프 상의 L258 아미노산 잔기의 아미노산 치환을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 일 실시태양에서, 상기 β2-β3 루프 상의 아미노산 잔기는 알라닌, 세린 및 아스파르트산 중 어느 하나로 치환될 수 있다.
일 실시태양에 따른 표면 전하 전이 변이 특성에서, 변형된 융합 단백질은 (iii) 도메인 D3의 β5-β6 루프 상의 K300, Q302, K304, 및 K306 아미노산 잔기 중 한 개 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 일 실시태양에서, 상기 β5-β6 루프 상의 상기 아미노산 잔기는 글리신, 트레오닌, 세린 및 글루타민 중 어느 하나로 치환될 수 있다.
일 실시태양에 따른 표면 전하 전이 변이 특성에서, 변형된 융합 단백질은 (i) 도메인 D3의 β1-β2 루프 상에서 K241T, K241E, L243S, R244V, 및 H246E 중 하나 이상의 아미노산 치환, (ii) 도메인 D3의 β2-β3 루프 상에서 L258A, L258S, 또는 L258D의 아미노산 치환, 및/또는 (iii) 도메인 D3의 β5-β6 루프 상에서 K300G, Q302T, K304S, 및 K306Q 중 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 것일 수 있다.
일 실시태양에 따른 표면 전하 전이 변이 특성에서, 변형된 융합 단백질은 도메인 D3의 β1-β2 루프 상에서 (i) L243S 및 R244V 아미노산 치환, 또는 (ii) K241E, L243S, R244V, 및 H246E 아미노산 치환; 도메인 D3의 β2-β3 루프 상에서 L258A, L258S, 또는 L258D 아미노산 치환; 및/또는 도메인 D3의 β5-β6 루프 상에서 (i) K300G 아미노산 치환, (ii) K300G, Q302T, 및 K304S 아미노산 치환, 또는 (iii) K300G, Q302T, K304S, 및 K306Q 아미노산 치환을 포함하는 것일 수 있다.
일 실시태양에 따른 표면 전하 전이 변이 특성에서, 변형된 융합 단백질은 도메인 D3의 β1-β2 루프 상에서 K241E, L243S, R244V, 및 H246E 아미노산 치환; 도메인 D3의 β2-β3 루프 상에서 L258A, L258S, 또는 L258D 아미노산 치환; 및 도메인 D3의 β5-β6 루프 상에서 K300G, Q302T, 및 K304S 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
일 실시태양에서, 변형된 융합 단백질은 Ig 유사 도메인 D3에서 R238S 및/또는 R275N 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
일 실시태양에서, 변형된 융합 단백질은 링커와 연결되는 Ig 유사 도메인 D3의 C 말단의 아미노산 서열이 K331 아미노산 잔기를 기준으로 KALE이며, 단 이 경우 아미노산 K, A, L 및 E 중 하나 이상이 결실될 수 있는 것일 수 있다. 일 실시태양에서, 변형된 융합 단백질의 Ig 유사 도메인 D3의 C 말단은 K 및 A가 결실되거나; K, A 및 L이 결실되거나; A, L 및 E가 결실되거나; K, A, L 및 E가 결실된 것일 수 있다. 일 실시태양에서, 본 개시의 변형된 융합 단백질의 Ig 유사 도메인 D3의 C 말단 아미노산은 D330일 수 있다.
일 실시태양에서, 변형된 융합 단백질의 Ig 유사 도메인 D2의 N 말단은 추가로 변형될 수 있다. 본 개시의 변형된 융합 단백질은 이를 암호화하는 핵산 서열 또는 핵산 분자가 다양한 유래의 벡터에 삽입되어 생산될 수 있다. 이 경우 상기 핵산 서열 또는 핵산 분자가 삽입되는 벡터의 종류 또는 유래에 따라서 Ig 유사 도메인 D2의 N 말단은 G132로 시작하는 것이 아니라, 벡터로부터 유래된 아미노산 서열(예: 아미노산 서열 EF)부터 N 말단이 시작되어 도메인 D2의 N 말단의 아미노산 서열에 변이가 나타날 수 있다. 또한 일 실시태양에서, 본 개시의 변형된 융합 단백질은 Ig 유사 도메인 D2의 N 말단에서 VEGFR1의 Ig 유사 도메인 D1의 C 말단 서열을 추가로 포함할 수 있다. 일 실시태양에서, 변형된 융합 단백질의 Ig 유사 도메인 D2의 N 말단은 아미노산 서열 SDT 또는 아미노산 서열 EF로 시작할 수 있다. 다만 이러한 벡터 유래 아미노산 서열에 의한 N 말단 서열의 변이는 본 개시의 변형된 융합 단백질의 생산성 또는 물성에는 영향을 미치지 않을 수 있다.
5. 링커 변이 특성
일 실시태양에서, 본 개시의 변형된 융합 단백질은 링커 변이 특성을 가질 수 있다. 본 개시에서, 링커 변이 특성을 가지는 변형된 융합 단백질은 "링커 변이체"로 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 본 개시의 변형된 융합 단백질은 링커 변이 특성에 의해, (i) 자연 상태의 VEGFR1 세포외 도메인 중 도메인 D2 및 도메인 D3가 리간드와 결합하는 구조를 유사하게 모사할 수 있으며, (ii) 자연 상태의 VEGFR1 세포외 도메인 중 도메인 D3가 원활한 리간드 결합을 위해 확보해야 할 구조적 특성으로 도메인 D4의 이량체 형성 부위까지의 길이를 가질 수 있고, (iii) 링커 자체가 우수한 구조적 안정성을 가질 수 있다.
일 실시태양에 따른 링커 변이 특성에서, 링커가 약 14개 이상의 아미노산 길이를 가지는 것일 수 있다. 일 실시태양에서, 링커가 약 14개 내지 약 70개, 약 14개 내지 약 65개, 약 14개 내지 약 60개, 약 14개 내지 약 55개, 약 14개 내지 약 50개, 약 14개 내지 약 45개, 약 14개 내지 약 40개, 약 14개 내지 약 38개, 또는 약 14개 내지 약 36개의 아미노산 길이를 가지는 것일 수 있다. 일 실시태양에서, 링커가 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 45개, 50개, 55개, 56개, 57개, 58개, 59개, 60개, 61개, 62개, 63개, 64개, 65개, 또는 70개(포함적, 이들 숫자 사이의 임의의 값을 포함함)의 아미노산을 포함하거나 이러한 아미노산으로 이루어진 것일 수 있다.
일 실시태양에 따른 링커 변이 특성에서, 링커가 GS 반복 서열을 포함할 수 있다. 일 실시태양에서, GS 반복 서열은 G 및 S로만 이루어진 2 내지 60개 길이의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 여기서 GS 반복 서열은 N 말단의 아미노산이 글루탐산일 수 있다. 일 실시태양에서, GS 반복 서열은 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 또는 60개(포함적, 이들 숫자 사이의 임의의 값을 포함함)의 아미노산을 포함하거나 이러한 아미노산으로 이루어진 것일 수 있다. 일 실시태양에서, GS 반복 서열은 2 내지 20개의 아미노산을 포함하거나 이러한 아미노산으로 이루어진 것일 수 있다.
일 실시태양에 따른 링커 변이 특성에서, GS 반복 서열은 (GS)n, (GSSG)n, (GGGGS)n 또는 (GS)m(GGGGS)n 일 수 있으며, 여기서 n은 1 내지 10의 정수이며, m은 0 내지 10의 정수일 수 있다.
일 실시태양에 따른 링커 변이 특성에서, GS 반복 서열이 GS, GSSG, (GSSG)2, GGGGS, (GGGGS)4, GS(GGGGS) 및 GS(GGGGS)3 로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
일 실시태양에 따른 링커 변이 특성에서, 링커가 면역글로불린으로부터 유래한 힌지 영역의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일 실시태양에서, 상기 힌지 영역의 아미노산 서열은 변형될 수 있다.
본 개시에서, 링커는 VEGFR1 도메인 D3의 C-말단과 파파인 분해에 의해 생성되는 인간 면역글로불린의 Fc영역 사이에 위치한 부위로 Fc가 함유하고 있는 CH2 영역(A244-K360)의 N-말단 부위에 위치한 P243으로부터 도메인 D3의 C-말단 사이에 위치한 전영역을 지칭할 수 있다. 여기서 Fc 영역 및 Fc에 함유되어 있는 CH2 영역의 아미노산 위치는 카밧 넘버링에 따른다(Kabat et. al., in of Proteins of Immunological Interest 5th Ed.,US Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242,1991). 일 실시태양에서, 링커는 인간 면역글로불린으로부터 유래한 일부 영역을 포함할 수 있으며 해당 영역은 CH1(K218~V223) 혹은 힌지 영역(E226~P243)의 아미노산 서열 또는 이러한 아미노산 서열의 일부일 수 있다.
본 개시에서, 링커가 면역글로불린으로부터 유래한 힌지 영역의 아미노산 서열을 포함할 경우, 포함된 힌지 영역의 특성을 그대로 포함하게 된다. 예를 들어, Fc 부위의 힌지 영역은 다양한 단백질 분해 효소(protease)에 대한 절단 위치(cleavage site)를 가지며, 힌지 영역이 융합 단백질에 도입 후 Ser/Thr 아미노산에서 발생하는 O-글리코실화에 의한 올리고머화를 유발할 수 있다(Song et. al., 2020. Comput Struct Biotechnol J. 18:3925-3935.). 이러한 힌지 영역에서의 글리코실화는 단백질의 발현 또는 정제 시 물성에 영향을 미칠 수 있으며, 정제 과정 중 가역적으로 일어나는 힌지 영역의 이황화결합의 페어링에 구조적 간섭을 일으켜 정상적인 이황화결합 형성을 방해할 수 있다. 본 개시의 링커 변이 특성을 가지는 변형된 융합 단백질의 경우, 면역글로불린으로부터 유래한 힌지 영역의 아미노산 서열을 변형하여, 링커 자체의 우수한 구조적 안정성을 달성하고 물성이 개선되도록 변형되었다.
일 실시태양에 따른 링커 변이 특성에서, 면역글로불린으로부터 유래한 힌지 영역은 CH1 영역으로부터 유래한 서열, 어퍼 힌지(upper hinge) 및/또는 코어 힌지(core hinge)를 포함할 수 있다. 일 실시태양에서 면역글로불린의 CH1 영역으로부터 유래한 일부 아미노산 서열은 베타-스트랜드(β-strand) 또는 베타-시트(β-sheet)를 형성할 수 있다. 일 실시태양에서, 면역글로불린으로부터 유래한 힌지 영역은 인간 IgA, IgD, IgM, IgE, IgG, 또는 이들의 조합으로부터 유래한 것일 수 있다.
일 실시태양에 따른 링커 변이 특성에서, 변형된 융합 단백질은 링커에 포함된 면역글로불린으로부터 유래한 힌지 영역에 존재하는 파파인 인식 부위 또는 글리코실화 부위에서 아미노산 변이를 가지는 것일 수 있다.
일 실시태양에 따른 링커 변이 특성에서, 파파인 인식 부위에서의 아미노산 변이는, 파파인 인식 부위에 존재하는 아미노산 잔기 중 하나 이상을 알라닌, 세린, 티로신, 프롤린, 또는 트레오닌으로 치환하거나 또는 파파인 인식 부위에 방향족 탄소 또는 사이클릭 탄소를 측쇄에 갖는 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 1개 내지 10개의 아미노산 서열을 삽입하는 것일 수 있다.
일 실시태양에서, 링커에 포함된 힌지 영역은 IgG1으로부터 유래된 것일 수 있다. 이 경우 파파인 인식 부위 중에서 절단 아미노산 근처의 아미노산 서열은 KTHT일 수 있다. 일 실시태양에서, 상기 힌지 영역이 IgG1으로부터 유래된 경우, 파파인 인식 부위에서 절단 아미노산에 해당하는 히스티딘은 프롤린, 프롤린-프롤린 또는 티로신으로 치환될 수 있다.
일 실시태양에서, 상기 힌지 영역이 IgG1으로부터 유래된 경우, 방향족 탄소 또는 사이클릭 탄소를 측쇄에 갖는 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 1개 내지 10개의 아미노산 서열은 절단 아미노산에 해당하는 히스티딘 앞에 삽입될 수 있다. 일 실시태양에서, 상기 방향족 탄소 또는 사이클릭 탄소를 측쇄에 갖는 아미노산은 프롤린 또는 티로신일 수 있다. 일 실시태양에서, 상기 절단 아미노산 앞에 삽입되는 서열은 시스테인을 포함할 수 있다. 파파인 인식 부위에 삽입되는 서열이 시스테인을 포함할 경우, 이량체 형성 시 마주하는 상대 단량체 동일부위에 위치하는 시스테인과 이황화결합을 형성하여 링커에 강직성(rigidity)를 부여할 수 있고 이에 따라 링커의 루프 구조를 안정화시킬 수 있다. 일 실시태양에서, 상기 절단 아미노산 앞에 삽입되는 서열은 아미노산 서열 PPTC일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 파파인 인식 부위에 삽입되는 서열은, 방향족 탄소 또는 사이클릭 탄소를 측쇄에 갖는 아미노산으로 인하여 방향족 탄소 또는 사이클릭 탄소간의 소수성 상호작용이 형성될 수 있고, 상호작용에 의해 링커의 루프 구조를 안정화시킬 수 있다.
일 실시태양에서, 상기 힌지 영역이 IgG1으로부터 유래된 경우, 변이를 가지는 파파인 인식 부위의 아미노산 서열 KTHT는 KTYT, TPP, ATPT, STYT, KAPP, 및 ATPPTCP으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 변형된 것일 수 있다.
일 실시태양에 따른 링커 변이 특성에서, 글리코실화 부위에서의 아미노산 변이는, 면역글로불린으로부터 유래한 힌지 영역에 존재하는 세린 또는 트레오닌을, 결실시키거나 또는 세린 또는 트레오닌 외의 다른 아미노산으로 치환하는 것일 수 있다. 일 실시태양에서, 세린 또는 트레오닌 외의 다른 아미노산이 글리신 또는 알라닌일 수 있다. 세린 또는 트레오닌 아미노산의 치환을 통해 힌지 영역에 발생할 수 있는 O-글리코실화를 방지할 수 있다.
일 실시태양에 따른 링커 변이 특성에서, 코어 힌지에 존재하는 시스테인이 세린 또는 글리신으로 치환될 수 있다. 이 경우 코어 힌지에 존재하는 이황화결합이 제거되어 링커의 가요성을 증가시킬 수 있고 링커의 길이를 더 증가시키는 것과 같은 효과를 기대할 수 있다.
일 실시태양에 따른 링커 변이 특성에서, 링커가 N 말단부터 (i) GS, GSSG, (GSSG)2, GGGGS, (GGGGS)4, GS(GGGGS) 및 GS(GGGGS)3 로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 및 (ii) 인간 IgG1, IgG4 또는 IgD/G1으로 이루어진 군으로부터 선택된 면역글로불린으로부터 유래한 힌지 영역을 순서대로 포함할 수 있고, 상기 힌지 영역의 아미노산 서열은 변형될 수 있다.
본 개시에서 IgD/G1으로부터 유래한 힌지 영역은 IgD 및 IgG1의 힌지 서열의 조합을 의미할 수 있으며, 구체적으로 IgD/G1으로부터 유래한 힌지 영역은 NTGSGGEEKKKEKEKEEQEERSSDKTHTCPPCP일 수 있다. 일 실시태양에서, IgD의 힌지 서열은 NTGSGGEEKKKEKEKEEQEERSS, NTGRGGEEKKKEKEKEEQEER, 또는 이들의 변이체일 수 있다. 일 실시태양에서, IgG1의 힌지 서열은 DKTHTCPPCP 또는 이들의 변이체일 수 있다.
일 실시태양에 따른 링커 변이 특성에서, 링커가 GSSGDKTHTSPPSP, GSSGEPKSSDKTYTSPPSP, GSKVDKKVEPKSSDKTHTCPPCP, GSKVDKKVEPKSSDKTYTCPPCP, GSKVDKKVEPKSSDTPPTCPPCP, GSGGGGSGGGGSGGGGSAESKYGPPCPPCP, GSNTGSGGEEKKKEKEKEEQEERSSDKTYTCPPCP, GSNTGSGGEEKKKEKEKEEQEERSSDTPPTCPPCP, EGSSGGSSGEPKSDATPTCPPCP, EGSSGGSSGEPKSDSTYTCPPCP, GCKVDKKVEPKSSDKTYTCPPCP, CSKVDKKVEPKSSDKTYTCPPCP, GGGGSAEPKAGDKAPPGPPGP, GGGGSAEPKSSDKTYTCPPCP, GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEPKSSDKTYTCPPCP, CSSGDATPTSPPSP, CSKVDKKVEPKSSDTPPTCPPCP, CSGGGGSAEPKAGDATPPTCPPCP, CSGGGGSGGGGSGGGGSAESKYGPPCPPCP, CSNTGSGGEEKKKEKEKEEQEERSSDTPPTCPPCP, CGSSGGSSGEPKSDATPTCPPCP, 및 CSGGGGSAEPKAGDATPPTCPPCPPCP 로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열일 수 있다.
6. 이황화결합 변이 특성
일 실시태양에서, 본 개시의 변형된 융합 단백질은 이황화결합 변이 특성을 가질 수 있다. 본 개시에서 이러한 이황화결합 변이 특성을 가지는 변형된 융합 단백질은 "이황화결합 변이체"로 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 본 개시의 변형된 융합 단백질은 이종 단백질의 융합체이므로, 서로 다른 종류의 단백질이 결합되는 부위에서 안정성이 저하될 것으로 예상된다. 이에 변형된 융합 단백질의 물리적 절단을 방지하고 안정성을 개선하기 위해 이황화결합 변이 특성을 도입하였다.
이황화결합 변이 특성을 도입하기 위해, 융합 단백질에서 이종 단백질의 연결이 시작되고 2차 구조가 결여될 수 있는 Ig 유사 도메인 D3의 C-말단 부위를 중심으로 다음과 같은 기준에 따라 이황화결합 변이가 도입될 수 있는 아미노산 잔기 위치를 탐색하였다: (1) 후보 아미노산 잔기가 융합 단백질의 표면에 노출되어 이황화결합을 형성할 수 있을 것, (2) 이종 단백질이 연결되는 가요성 루프-링커 상에 존재할 것, (3) 서로 다른 두 부위에 존재하는 아미노산 잔기가 이황화결합을 형성할 수 있는 거리 내에 있을 것. 이러한 기준에 따라 3차 구조 에너지 예측 프로그램(foldx in YASARA, Schymkowitz et al.2005 Nucleic Acids Research. 33:W382-388)을 이용하여 후보 아미노산 잔기를 선정하고, 이러한 아미노산 잔기를 시스테인으로 치환하여 이황화결합에 따른 변형된 융합 단백질의 특성(예: 생산성, 물성, 리간드에 대한 결합력)이 개선됨을 확인하였다(실시예 2.3. 참조). 일 실시태양에서, 이황화결합 변이 특성은 VEGFR1 도메인 내 한 자리 및 링커의 한 자리에서 시스테인 잔기로의 치환을 통해 도입될 수 있으며, 이에 따라 안정적인 결합 형태 중 하나인 공유결합을 통해 변형된 융합 단백질의 우수한 안정성을 달성할 수 있다.
일 실시태양에서, 이황화결합 변이 특성을 위해 (i) Ig 유사 도메인 D3의 β1-β2 루프 상의 아미노산 잔기 중 하나 또는 β5-β6 루프 상의 아미노산 잔기 중 하나와, (ii) Ig 유사 도메인 D3의 Y329를 기준으로 -2, -1, 0, +1, +2, 및 +3 위치에 존재하는 아미노산 잔기 중 하나가 시스테인으로 치환될 수 있다. 이러한 치환에 의해 본 개시의 변형된 융합 단백질은 단백질 내에 이황화결합을 가질 수 있다. 일 실시태양에서, 이황화결합 변이 특성의 도입을 위하여 상기 (i) 및 (ii)에 기재된 위치에 존재하는 아미노산 잔기의 선정은 상기 기준 (1) 내지 (3)에 따라 결정될 수 있다.
일 실시태양에서, 상기 (i)에서 β1-β2 루프 상의 아미노산 잔기 중 하나가 V240 내지 T247의 아미노산 서열 상의 아미노산 잔기 중 하나인 것일 수 있다.
일 실시태양에서, 이황화결합 변이 특성을 위해 Ig 유사 도메인 D3의 β1-β2 루프 상의 T241, L243, 및 R244 아미노산 잔기 또는 β5-β6 루프 상의 N303 아미노산 잔기 중 하나가 시스테인으로 치환되고, Ig 유사 도메인 D3의 Y329를 기준으로 0, +2, 및 +3 위치에 존재하는 아미노산 잔기 중 하나가 시스테인으로 치환된 것일 수 있다.
일 실시태양에서, 이황화결합 변이 특성을 위해 본 개시의 변형된 융합 단백질은 T241 및 도메인 D3의 Y329를 기준으로 +3 위치에 존재하는 아미노산 잔기가 시스테인으로 치환되거나; L243C 및 Y329C 아미노산 변이를 가지거나; L243 및 도메인 D3의 Y329를 기준으로 +2 위치에 존재하는 아미노산 잔기가 시스테인으로 치환되거나; R244C 및 Y329C 아미노산 변이를 가지거나; 또는 N303C 및 Y329C 아미노산 변이를 가지는 것일 수 있다.
7. 융합 단백질
본 개시의 일 실시태양에서, VEGF 리간드 및 PLGF 리간드에 동시에 결합할 수 있는 변형된 융합 단백질이 제공될 수 있다. 일 실시태양에서, 변형된 융합 단백질은 VEGF 리간드에 대한 제1 결합 특이성 및 PLGF 리간드에 대한 제2 결합 특이성을 포함할 수 있다. 여기서 VEGF 리간드는 VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, 및 VEGF-D 중 하나 이상 일 수 있으며, 구체적으로 VEGF-A일 수 있다.
일 실시태양에서, 변형된 융합 단백질은 VEGFR1 세포외 도메인, 링커 및 다량체화 도메인을 포함할 수 있다. 일 실시태양에서, 변형된 융합 단백질은 N 말단부터 C 말단까지 VEGFR1 세포외 도메인, 링커 및 다량체화 도메인의 순서로 정렬된 구성성분을 포함할 수 있다. 일 실시태양에서, VEGFR1 세포외 도메인은 VEGFR1의 Ig 유사 도메인 D2 및 Ig 유사 도메인 D3를 포함할 수 있다.
일 실시태양에서, 변형된 융합 단백질은 (a) 표면 전하 전이 특성, (b) 링커 변이 특성, 및 (c) 이황화결합 변이 특성 중 하나 이상을 가지는 것일 수 있다.
일 실시태양에서, 변형된 융합 단백질은 아래 특성 (a), 특성 (b) 및 특성 (c)를 모두 가지는 것일 수 있다:
(a) 도메인 D3의 β1-β2 루프 상에서 K241T, K241E, L243S, R244V, 및 H246E 중 하나 이상의 아미노산 치환, 도메인 D3의 β2-β3 루프 상에서 L258A, L258S, 또는 L258D의 아미노산 치환, 및/또는 도메인 D3의 β5-β6 루프 상에서 K300G, Q302T, K304S, 및 K306Q 중 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고;
(b) 링커가 GSSGDKTHTSPPSP, GSSGEPKSSDKTYTSPPSP, GSKVDKKVEPKSSDKTHTCPPCP, GSKVDKKVEPKSSDKTYTCPPCP, GSKVDKKVEPKSSDTPPTCPPCP, GSGGGGSGGGGSGGGGSAESKYGPPCPPCP, GSNTGSGGEEKKKEKEKEEQEERSSDKTYTCPPCP, GSNTGSGGEEKKKEKEKEEQEERSSDTPPTCPPCP, EGSSGGSSGEPKSDATPTCPPCP, EGSSGGSSGEPKSDSTYTCPPCP, GCKVDKKVEPKSSDKTYTCPPCP, CSKVDKKVEPKSSDKTYTCPPCP, GGGGSAEPKAGDKAPPGPPGP, GGGGSAEPKSSDKTYTCPPCP, GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEPKSSDKTYTCPPCP, CSSGDATPTSPPSP, CSKVDKKVEPKSSDTPPTCPPCP, CSGGGGSAEPKAGDATPPTCPPCP, CSGGGGSGGGGSGGGGSAESKYGPPCPPCP, CSNTGSGGEEKKKEKEKEEQEERSSDTPPTCPPCP, CGSSGGSSGEPKSDATPTCPPCP, 및 CSGGGGSAEPKAGDATPPTCPPCPPCP 로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열이고,
(c) 도메인 D3의 β1-β2 루프 상의 T241, L243, 및 R244 아미노산 잔기 또는 β5-β6 루프 상의 N303 아미노산 잔기 중 하나가 시스테인으로 치환되고, 도메인 D3의 Y329를 기준으로 0, +2, 및 +3 위치에 존재하는 아미노산 잔기 중 하나가 시스테인으로 치환된 것임.
일 실시태양에서, 변형된 융합 단백질은 아래 특성 (a), 특성 (b) 및 특성 (c)를 모두 가지는 것일 수 있다:
(a) 도메인 D3의 β1-β2 루프 상에서 (i) L243S 및 R244V 아미노산 치환, 또는 (ii) K241E, L243S, R244V, 및 H246E 아미노산 치환, 도메인 D3의 β2-β3 루프 상에서 L258A, L258S, 또는 L258D 아미노산 치환, 및/또는 도메인 D3의 β5-β6 루프 상에서 (i) K300G 아미노산 치환, (ii) K300G, Q302T, 및 K304S 아미노산 치환, 또는 (iii) K300G, Q302T, K304S, 및 K306Q 아미노산 치환을 포함하고;
(b) 링커가 CSSGDATPTSPPSP, CSKVDKKVEPKSSDTPPTCPPCP, CSGGGGSAEPKAGDATPPTCPPCP, CSGGGGSGGGGSGGGGSAESKYGPPCPPCP, CSNTGSGGEEKKKEKEKEEQEERSSDTPPTCPPCP, CGSSGGSSGEPKSDATPTCPPCP, CSKVDKKVEPKSSDKTYTCPPCP, 및 CSGGGGSAEPKAGDATPPTCPPCPPCP 로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열이고;
(c) L243 및 도메인 D3의 Y329를 기준으로 +2 위치에 존재하는 아미노산 잔기가 시스테인으로 치환된 것임.
일 실시태양에서, 변형된 융합 단백질은 아래 특성 (a), 특성 (b) 및 특성 (c)를 모두 가지는 것일 수 있다:
(a) 도메인 D3의 β1-β2 루프 상에서 K241E, L243S, R244V, 및 H246E 아미노산 치환, 도메인 D3의 β2-β3 루프 상에서 L258A, L258S, 또는 L258D 아미노산 치환, 및 도메인 D3의 β5-β6 루프 상에서 K300G, Q302T, 및 K304S 아미노산 치환을 포함하고;
(b) 링커가 CSSGDATPTSPPSP, CSKVDKKVEPKSSDTPPTCPPCP, CSGGGGSAEPKAGDATPPTCPPCP, CSGGGGSGGGGSGGGGSAESKYGPPCPPCP, CSNTGSGGEEKKKEKEKEEQEERSSDTPPTCPPCP, CGSSGGSSGEPKSDATPTCPPCP, CSKVDKKVEPKSSDKTYTCPPCP, 및 CSGGGGSAEPKAGDATPPTCPPCPPCP 로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열이고;
(c) L243 및 도메인 D3의 Y329를 기준으로 +2 위치에 존재하는 아미노산 잔기가 시스테인으로 치환된 것임.
일 실시태양에서, 변형된 융합 단백질은 서열번호 10 내지 서열번호 70, 서열번호 77 내지 서열번호 93 및 서열번호 98로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일 실시태양에서, 변형된 융합 단백질은 서열번호 10 내지 서열번호 70, 서열번호 77 내지 서열번호 93 및 서열번호 98로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
일 실시태양에서, 변형된 융합 단백질은 서열번호 10 내지 서열번호 70, 서열번호 77 내지 서열번호 93 및 서열번호 98로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 포함할 수 있다. 이러한 변이체의 경우, 본 개시의 변형된 융합 단백질이 가지는 특성에서 나타나는 아미노산 변이를 그대로 포함 또는 유지하면서, 그 외의 아미노산 서열에서 나타나는 아미노산 변이(예: 보존적 아미노산 치환)를 포함할 수 있다.
일 실시태양에서, 본 개시의 변형된 융합 단백질의 구성성분(VEGFR1 세포외 도메인, 링커 및 다량체화 도메인)들은 예를 들어, 글리코실화, 시알릴화, 아세틸화 및 포스포릴화를 포함하는 번역 후 변형을 보유할 수 있다.
일 실시태양에서, 본 개시의 변형된 융합 단백질은 본 개시에 기술된 특성에서 나타나는 아미노산 변이 위치 외의 다른 위치에서 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 이러한 보존적 아미노산 치환은 본 개시의 변형된 융합 단백질의 각 구성성분들(예: VEGFR1의 세포외 도메인, 링커 및 다량체화 도메인) 중 임의의 것 안으로 도입될 수 있다.
일 실시태양에서, 본 개시의 변형된 융합 단백질은 세포로부터의 단백질 분비를 위한 신호 펩티드 또는 신호 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 개시의 변형된 융합 단백질은 이종 기원의 펩티드, 구체적으로 신호 서열 또는 성숙한 융합 단백질의 N 말단에 특이적인 절단 자리를 가지고 있는 기타 펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 일 실시태양에서, 상기 이종 기원의 신호 서열은 진핵 숙주 세포에 의해 인식되고 가공되는(즉, 신호 펩티드 가수분해효소에 의해 절단되는) 것일 수 있다. 신호 펩티드에 관한 내용은 해당 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 한국 등록특허 제10-2228921호에 제시되어 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 실시태양에서, 신호 펩티드는 인간 인터루킨 신호 서열일 수 있다. 일 실시태양에서, 신호 펩티드는 MVSYWDTGVLLCALLSCLLLTGSSSG(tPA), MEFGLSWVFLVALFRGVQC(H7), MKWVTFISLLFLFSSAYS(인간 혈청 알부민), MGWSCIILFLVATATGVHS(마우스 Ig 중쇄), MDWTWRVFCLLAVAPGAHS(인간 Ig 중쇄), 또는 MYRMQLLSCIALSLALVTNS(인간 인터루킨-2)인 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 통상의 기술자가 융합 단백질의 제조를 위해 사용할 수 있는 신호 펩티드라면 제안되지 않고 사용될 수 있다.
본 개시의 일 실시태양에서, 본 개시의 변형된 융합 단백질을 두 개 이상 포함하는 다량체 융합 단백질이 제공될 수 있다. 다량체(예컨대, 이량체, 삼량체, 사량체 등)는 동일한 융합 단백질로부터 형성(예컨대, 동형 다량체)될 수 있거나, 이종 기원의 융합 단백질(예컨대, 이형 다량체)을 형성할 수 있다. 일 실시태양에서, 상기 다량체 융합 단백질은 서열번호 10 내지 서열번호 70, 서열번호 77 내지 서열번호 93 및 서열번호 98로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 10 내지 서열번호 70, 서열번호 77 내지 서열번호 93 및 서열번호 98로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 변형된 융합 단백질을 포함할 수 있다. 일 실시태양에서, 이러한 융합 단백질은 본 개시의 변형된 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포로부터 단백질 융합 다량체로서 회수된다. 일 실시태양에서, 이러한 다량체 융합 단백질은 글리코실화될 수 있다. 예를 들어, 이러한 다량체 융합 단백질은 VEGFR의 세포외 도메인 및/또는 다량체화 도메인에서 숙주 세포로부터 방출 후에 글리코실화될 수 있다.
일 실시태양에서, 본 개시의 변형된 융합 단백질은 리간드 활성의 저해(예: VEGF 활성 또는 PLGF 활성의 저해)에 대해 약 1 mg/ml, 500 ng/ml, 300 ng/ml, 100 ng/ml, 70 ng/ml, 50 ng/ml, 45 ng/ml, 40 ng/ml, 35 ng/ml, 30 ng/ml, 25 ng/ml, 20 ng/ml, 10 ng/ml, 5 ng/ml, 또는 1 ng/ml(포함적, 이들 숫자 사이의 임의의 값을 포함함) 이하의 IC50을 가질 수 있다.
일 실시태양에서, 본 개시의 변형된 융합 단백질은 결합 파트너(예컨대, VEGF 및/또는 PLGF)에 대해 1.0 mM, 500 μM, 100 μM, 50 μM, 25 μM, 10 μM, 5 μM, 1 μM, 900 nM, 800 nM, 700 nM, 600 nM, 500 nM, 400 nM, 350 nM, 300 nM, 250 nM, 200 nM, 150 nM, 100 nM, 95 nM, 90 nM, 85 nM, 80 nM, 75 nM, 70 nM, 65 nM, 60 nM, 55 nM, 50 nM, 45 nM, 40 nM, 35 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 5 nM, 1 nM, 900 pM, 800 pM, 700 pM, 600 pM, 500 pM, 400 pM, 300 pM, 200 pM, 100 pM, 50 pM, 25 pM, 12.5 pM, 6.25 pM, 5 pM, 4 pM, 3 pM, 1 pM, 0.5 pM, 0.1 pM, 0.05 pM 또는 0.01 pM(포함적, 이들 숫자 사이의 임의의 값을 포함함) 중 임의의 것보다 작은 Kd를 가질 수 있다.
III. 핵산, 벡터 및 숙주 세포
핵산
본 개시의 일 실시태양에서, VEGFR1 세포외 도메인 및/또는 다량체화 도메인과 같은, 본 개시의 임의의 변형된 융합 단백질 구성성분을 암호화하는 단리된 핵산이 제공될 수 있다. 포유동물 VEGFR을 암호화하는 핵산이 모든 수용체 유형에 대하여 기술되어 있다. 예시적인 핵산 서열은, 이에 제한되지는 않으나, 미국 특허 번호 7,928,072 및 WO2006/113277에서 찾을 수 있다. 인간 VEGFR1 및 VEGFR2를 암호화하는 mRNA는, 각각, 진뱅크 수탁 번호 NM_002019.4 및 NM_002253.2에서 찾을 수 있다. 일 실시태양에서, 단리된 핵산은 서열번호 100으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 VEGFR1의 Ig 유사 도메인 D2 및 D3를 암호화할 수 있다. 일 실시태양에서, 단리된 핵산은 서열번호 100으로 이루어진 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 VEGFR1의 Ig 유사 도메인 D2 및 D3를 암호화할 수 있다.
다량체화 도메인(예컨대, Fc 부위)을 암호화하는 단리된 핵산이 본 개시에 제공될 수 있다. 일 실시태양에서, 단리된 핵산은 서열번호 99의 아미노산 서열을 포함하는 다량체화 도메인을 암호화할 수 있다. 일부 구현예에서, 단리된 핵산은 서열번호 99로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 다량체화 도메인을 암호화할 수 있다.
본 개시의 변형된 융합 단백질을 암호화하는 단리된 핵산이 제공될 수 있다. 일 실시태양에서, 단리된 핵산은 서열번호 10 내지 서열번호 70, 서열번호 77 내지 서열번호 93 및 서열번호 98로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 변형된 융합 단백질을 암호화할 수 있다. 일 실시태양에서, 단리된 핵산은 서열번호 10 내지 서열번호 70, 서열번호 77 내지 서열번호 93 및 서열번호 98로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 변형된 융합 단백질을 암호화할 수 있다.
본 개시의 변형된 융합 단백질 또는 융합 단백질의 구성성분(예: VEGFR1의 세포외 도메인 또는 다량체화 도메인)를 암호화하는 단리된 핵산 서열은 링커를 암호화하는 핵산 서열을 더 포함할 수 있다.
일 실시태양에서, 단리된 핵산은 숙주세포로부터 변형된 융합 단백질을 분비하는 신호 서열의 역할을 하는 신호 펩티드를 암호화하는 서열을 더 포함할 수 있다. 일 실시태양에서, 단리된 핵산은 신호 펩티드를 암호화하는 서열을 포함하지 않을 수 있다.
본 개시의 변형된 융합 단백질 또는 융합 단백질의 구성성분(예: VEGFR1 세포외 도메인, 링커 또는 다량체화 도메인)를 암호화하는 단리된 핵산 분자는 RNA의 형태, 예를 들어 mRNA, hnRNA, tRNA 또는 임의의 다른 형태, 또는 이에 제한되지는 않으나, 클로닝으로 얻거나 합성으로 생성된 cDNA 및 게놈 DNA를 포함하는 DNA의 형태 또는 이의 임의의 조합일 수 있다. 이러한 단리된 핵산 분자는 해당 분야에 알려진 다양한 방법으로 제조될 수 있다(문헌: Molecular Cloning: A Laboratory Manual(Sambrook et al., 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2012) and Current Protocols in Molecular Biology(F.M. Ausubel, et al. eds., 2003 참조).
벡터
본 개시는 일 실시태양에서, 변형된 융합 단백질 또는 융합 단백질 구성성분을 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열을 상기 단백질을 발현하기 위한 세포 내로 도입하기 위한 핵산 전달 비히클 또는 이의 용도에 관한 것일 수 있다. 핵산 서열은 상기 단리된 핵산의 서열일 수 있다.
일 실시태양에서, 핵산 전달 비히클의 예는, 리포좀, 생체적합 폴리머(천연 폴리머 및 합성 폴리머를 포함함); 지단백질; 폴리펩티드; 다당류; 지질다당류; 인공 바이러스 외피(envelope); 금속 입자; 및 박테리아, 바이러스, 예를 들어 배쿨로바이러스(baculovirus), 아데노바이러스(adenovirus) 및 레트로바이러스(retrovirus), 박테리오파지, 코스미드, 플라스미드, 진균류 벡터 및 다양한 진핵 및 원핵 숙주에서의 발현에 대해 기술된, 당해 분야에 통상적으로 사용되는 다른 재조합 비히클일 수 있다. 일 실시태양에서, 핵산 전달 비히클은 발현 벡터, 예를 들어 플라스미드일 수 있다. 일 실시태양에서, 발현 벡터에 포함된 상기 핵산 서열은 발현 조절 서열에 작동적으로 연결될 수 있다.
일 실시태양에서, 벡터는 발현 벡터의 통상적인 기능을 수립하기 위한 임의의 요소, 예를 들어, 프로모터, 리보좀 결합 요소, 종결자, 인핸서, 선택 마커, 및 복제 원점을 포함할 수 있다. 프로모터는 구조적, 유도성 또는 억제성 프로모터일 수 있다. 예시적인 프로모터는 한국 등록특허 제10-0659477호에 제시되어 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
핵산을 세포에 전달할 수 있는 다수의 발현 벡터(예컨대, 박테리아 세포, 효모 세포, 식물 세포, 또는 포유동물 세포 유래)가 당해 분야에 알려져 있고, 세포 내에서 변형된 융합 단백질 또는 융합 단백질 구성성분을 생성하기 위해 본 개시에서 사용될 수 있다. 예를 들어, E. 콜라이(E. coli)가 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하도록 조작된 플라스미드, 예를 들어, pBR322(Mandel et al., J. Mol. Biol., 1970, 53:154)로 형질전환되면 변형된 융합 단백질을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 발현된 변형된 융합 단백질 또는 융합 단백질 구성성분은 세포로부터 수확되고, 당해 분야에 공지되고 본 개시에 기술된 바와 같은 통상적인 기술에 따라 정제될 수 있다.
일 실시태양에 있어서, 상술한 변형된 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하고, 박테리아 또는 진핵 숙수에서 복제될 수 있는 발현 벡터는 숙주를 감염(transfect)시키는데 사용될 수 있고, 이에 의하여 생물학적으로 활성인 형태로 회수될 수 있는 변형된 융합 단백질의 생산을 위한 상기 핵산이 직접적으로 발현될 수 있다. 본 개시에서, 생물학적으로 활성인 형태는 VEGF 리간드 또는 PLGF 리간드에 결합할 수 있는 형태를 포함한다.
일 실시태양에 있어서, 변형된 융합 단백질 또는 융합 단백질 구성성분을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 발편 벡터는 적어도 세 가지 일반적인 방법인 (a) DNA-DNA 혼성화, (b) "마커" 유전자 기능의 존재 또는 부재, 및 (c) 삽입된 서열의 발현으로 확인될 수 있으나, 이에 의하여 제한되는 것은 아니다. 상기 세 가지 방법의 구체적인 내용은 한국 등록특허 제10-0659477호 또는 제10-2228921호에 제시되어 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
숙주 세포
본 개시의 일 실시태양에서, 본 개시의 변형된 융합 단백질을 암호화하는 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공될 수 있다. 이러한 숙주 세포는 본 개시의 변형된 융합 단백질의 발현에 적합한 것이며, 변형된 융합 단백질을 생산하기 위한 숙주-벡터계에 해당할 수 있다. 일 실시태양에서, 숙주 세포는 바이러스성 입자(예: 재조합 바이러스 벡터)를 생성하기 위해 사용될 수 있다.
본 개시에서 사용된 용어 "숙주 세포"는 본 개시의 벡터(들) 및 이의 자손(progeny)에 대한 수여자가 되거나 될 수 있는 세포를 포함할 수 있다. 자연적, 우연한, 또는 정교한 돌연변이로 인해, 자손은 반드시(형태학 또는 전체 DNA 상보체의 게놈에서) 원래의 모세포와 완전하게 동일하지 않을 수 있다. 일 실시태양에서, 숙주세포는 E. coli와 같은 박테리아 세포, Pichia pastoris와 같은 효모 세포, Spodoptera frugiperda와 같은 곤충 세포, 또는 COS, HEK 또는 CHO 세포와 같은 포유동물 세포일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
일 실시태양에서, 본 개시의 변형된 융합 단백질은 숙주세포에서 일시적으로, 계속적으로(constitutively) 또는 영구적으로 발현될 수 있다.
본 개시의 일 실시태양에서, 변형된 융합 단백질의 생산이 가능한 조건 하에서 상기 숙주 세포 또는 숙주-벡터계의 세포를 배양한 후, 생산된 융합 단백질을 회수하여 본 개시의 변형된 융합 단백질을 생산하는 방법을 제공할 수 있다. 본 개시의 실시에 유용한 변형된 융합 단백질은 원핵 또는 진핵 발현 시스템에서 발현시켜 생산될 수 있다. 숙주 세포를 배양하는 방법 또는 숙주 세포로부터 융합 단백질을 제조하는 방법은 해당 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 한국 등록특허 제10-2228921호에 제시되어 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 실시태양에 있어서, 상기 숙주 세포로부터 생산된 본 개시의 변형된 융합 단백질은 다양한 방법을 통해 정제되고 확인될 수 있다. 숙주 세포로부터 생산된 융합 단백질을 정제 및 확인하는 방법은 해당 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 한국 등록특허 제10-2228921호에 제시되어 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 숙주 세포로부터 생산된 융합 단백질은 8 M의 구아니디늄 염산염과 투석에 의하여 정량적으로 추출되는 가용성 단백질(soluble proteins) 또는 봉입체(inclusion bodies)로서 세포로부터 회수될 수 있다. 상기 융합 단백질의 추가적인 정제를 위하여, 종래의 이온 교환 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피, 당 차이 크로마토그래피(different sugar chromatography), 소수성 상호작용 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피 또는 겔 여과를 포함하는 많은 정제 방법이 사용될 수 있으며, 이에 의하여 제한되는 것은 아니다.
IV. 바이러스성 입자(viral particles) 및 바이러스성 입자를 생성하는 방법
본 개시의 일 실시태양에서, 본 개시의 변형된 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 바이러스성 입자(또는 비리온)가 제공될 수 있다.
바이러스 벡터는, 특정 표적 조직(예컨대, 질환을 가지는 조직) 내 표적 세포에서 단백질의 발현을 위해 융합 단백질 또는 융합 단백질 구성성분을 암호화하는 핵산을 전달하기 위해 사용될 수 있다. 많은 종류의 바이러스가 알려져 있고, 다수가 핵산을 표적 세포에 전달하기 위한 목적으로 연구되고 있다. 외인성 핵산은, 세포로의 전달을 위해, 벡터, 예를 들어 아데노바이러스, 부분적으로 결실된 아데노바이러스, 완전히 결실된 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스(AAV), 레트로바이러스, 렌티바이러스, 등 내로 삽입될 수 있다.
일 실시태양에서, 세포는 개체 내에 존재하고, 바이러스가 정맥 내, 근육 내, 내문 또는 기타 투여 경로를 통해 전달될 수 있다. 일 실시태양에서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(AAV) 및 레트로바이러스(렌티바이러스, 예를 들어, 인간 면역결핍 바이러스(HIV)를 포함함)로부터 유래된 것들을 포함할 수 있다. 예시적인 바이러스 벡터에 대해서는, 그 전체가 참조로서 본원에 포함된, 미국 특허 번호 7,928,072 및 WO2006/113277를 참조하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 바이러스 입자 및 이를 생성하는 방법은 해당 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 한국 등록특허 제10-2228921호에 제시되어 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
IV. 융합 단백질 및 바이러스 입자를 이용한 처리법
본 개시의 일 실시태양은, 본 개시의 변형된 융합 단백질을 유효성분으로서 포함하는, VEGF 리간드 또는 VEGF 수용체와 관련된 질환 또는 이러한 질환의 증상 중 적어도 하나의 예방, 개선 또는 치료에 사용하기 위한 약학적 조성물에 관한 것일 수 있다.
본 개시의 일 실시태양은, 본 개시의 변형된 융합 단백질을 투여하는 단계를 포함하는, VEGF 리간드 또는 VEGF 수용체와 관련된 질환 또는 이러한 질환의 증상 중 적어도 하나를 예방, 개선 또는 치료하는 방법에 관한 것일 수 있다.
본 개시의 일 실시태양은, 본 개시의 변형된 융합 단백질의 VEGF 리간드 또는 VEGF 수용체와 관련된 질환 또는 이러한 질환의 증상 중 적어도 하나를 예방, 개선 또는 치료하기 위한 용도에 관한 것일 수 있다.
본 개시의 일 실시태양은, VEGF 리간드 또는 VEGF 수용체와 관련된 질환 또는 이러한 질환의 증상 중 적어도 하나를 예방, 개선 또는 치료하기 위한 방법에 사용하기 위한 본 개시의 변형된 융합 단백질 또는 이를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것일 수 있다.
일 실시태양에서, 본 개시의 변형된 융합 단백질은 이를 암호화 하는 핵산의 형태로 핵산 전달 비히클 또는 바이러스성 입자(예: 재조합 바이러스 벡터)로 VEGF 리간드 또는 VEGF 수용체와 관련된 질환 또는 이러한 질환의 증상 중 적어도 하나의 예방, 개선 또는 치료에 사용될 수 있다. 일 실시태양에서, 상기 핵산 전달 비히클 또는 바이러스성 입자는 VEGF 리간드 또는 VEGF 수용체와 관련된 관련된 질환 또는 이러한 질환의 증상 중 적어도 하나의 예방, 개선 또는 치료에 사용하기 위한 유전자 치료에 적용될 수 있다일 실시태양에서, 상기 핵산은 치료효과를 매개하는 암호화된 단백질, 즉 본 개시의 변형된 융합 단백질을 생산할 수 있다. 해당 분야에서 이용 가능한 모든 유전자 치료방법이 본 개시에 따라 사용될 수 있다. 일 실시태양에서, 상기 핵산은 최종적인 재조합 세포의 생체 내 투여에 앞서 세포로 도입된다. 유전자 치료 목적을 위하여 핵산이 도입되는 세포는 모든 이용 가능한 세포 유형을 포함하며, 예를 들어, 상피 세포, 내피 세포, 케라티노사이트, 섬유아세포, 근육 세포, 간세포, 혈액 세포(예: T-림프구, B-림프구, 단핵구, 대식세포, 중성구, 호산구, 거핵구, 또는 과립구), 다양한 줄기세포 또는 선조세포(progenitor cell), 예를 들어 골수, 제대혈, 말초혈액, 태아 간에서 얻은 조혈 줄기 또는 선조세포 등이 포함될 수 있으며, 이에 의하여 제한되는 것은 아니다. 일 실시태양에서, 유전자 치료를 위하여 사용되는 세포는 환자의 자가 유래 세포일 수 있다.
일 실시태양에서, 변형된 융합 단백질은 VEGF 단백질 및/또는 PLGF 단백질에 결합할 수 있다. 일 실시태양에서, 변형된 융합 단백질은 다음의 특성 중 하나 이상을 가질 수 있다: (a) VEGF 패밀리, 예를 들어 VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, 또는 PLGF 중 하나 이상의 단백질에 결합; (b) VEGF 패밀리 단백질의 VEGF 수용체에 대한 결합의 차단; (c) VEGF 신호 경로의 활성화 저해; (d) 안질환, 자가면역 질환, 염증성 질환, 신생물(neoplasm) 형성 질환, 또는 암과 같은 질환의 예방, 개선 및/또는 치료; (e) 신생물 또는 암 성장의 약화, 방지 또는 예방; (f) 신생물 또는 암 전이 억제. 변형된 융합 단백질의 활성은 생체 내 및/또는 시험관 내에서 측정될 수 있다.
일 실시태양에서, 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제를 포함할 수 있다. 일 실시태양에서, 약학적으로 허용 가능한 담체는 땅콩유, 대두유, 광유 등과 같은, 석유, 동물, 식물, 또는 합성 유래의 것들을 포함하는, 물과 오일 같은, 멸균 액체일 수 있다. 식염수 및 수용성 덱스트로스, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 글리세롤 용액 또한 액체 담체로서, 특히 주사 가능한 용액을 위하여, 이용될 수 있다. 이러한 약학적 조성물은 추가적인 성분들, 예를 들어, 보존제, 완충액, 등장제, 항산화제 및 안정화제, 비이온성 습윤 또는 정화제, 점증제 등을 더 포함할 수 있다. 본 개시의 약학적 조성물은 단일 단위 투여량으로 또는 다회 투여량 형태로 포장될 수 있다. 이러한 조성물은 일반적으로 멸균성 및 실질적으로 등장성의 용액으로 제형화된다. 또한, 조성물은 눈 및 안과 조직의 수양액에 적합한 삼투값을 보유하도록 제형화될 수 있다. 이러한 삼투값은 일반적으로 물 킬로그램당 약 200 내지 400 밀리오스몰("mOsm/kg") 범위 또는 약 300 mOsm/kg일 수 있다. 망막은 약 283 mOsm/kg의 삼투값을 보유하는 것으로 여겨진다.
일 실시태양에서, 약학적 조성물은 비경구용 조성물일 수 있다. 비경구용 조성물은 투여량의 균일성과 투여의 용이성을 위한 단위 제형(dosage unit form) 형태로 제형화 하는 것이 유리할 수 있다.
질환 또는 질병
일 실시태양에서, VEGF 리간드 또는 VEGF 수용체와 관련된 질환은 자가면역 질환(예: 류머티스성 관절염, 다발성 경화증 또는 전신 홍반성 루푸스), 염증성 질환(염증성 관절염, 골 관절염, 또는 건선), 신생물 형성 질환, 암(예: 유방암, 폐암, 위암, 췌장암 또는 백혈병), 혈관신생 관련 질환(예: 아테롬성 동맥 경화증) 또는 안질환(예: 노인성 황반 변성, 맥락막신혈관형성, 또는 포도막염)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
일 실시태양에서, 암은 전립선암, 요도암, 음경암, 유방암, 폐암, 식도암, 소장암, 대장암, 직장암, 결장암, 간암, 요로암(예: 방광암), 신장암, 폐암(예: 비소세포 폐암), 난소암, 자궁경부암, 자궁내막암, 질암종, 음문암종, 췌장암, 위암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 피부암(예: 흑색종), 호지킨병(Hodgkin's disease), 골암, 림프 또는 골수의 조혈모세포암, 만성 또는 급성 백혈병, 두경부암, 비인두암종(nasopharyngeal carcinoma; NPC), 교아종, 기형암종, 신경아세포종, 선암종, 간엽 기원의 암(예: 섬유육종 또는 횡문근육종), 연조직 육종 및 암종, 융모암종, 간아세포종, 중추신경계(CNS; central nervous system) 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종인, 카포시육종(Karposi's sarcoma) 또는 빌름(Wilm's) 종양을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 본 개시의 변형된 융합 단백질은 항-혈관신생 제제 또는 항-VEGF 제제로 작용하여 암 또는 암의 증상을 개선, 예방 및/또는 치료할 수 있다.
투여 방법 및 투여 용량
본 개시의 일 실시태양에서, 유효량의 변형된 융합 단백질을 대상체에 전달하는 방법이 제공될 수 있다. 변형된 융합 단백질은 조성물 내에서 대상체에 전달될 수 있다. 변형된 융합 단백질은 또한 변형된 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 핵산 전달 비히클 또는 바이러스성 입자(예: 재조합 바이러스 벡터)에 의해 대상체에 전달될 수 있다. 본 개시의 일 실시태양에서, 변형된 융합 단백질 또는 변형된 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 핵산 전달 비히클 또는 바이러스성 입자(예: 재조합 바이러스 벡터)를 포함하는 조성물이 제공될 수 있다.
일 실시태양에서, 본 개시의 조성물은, 개체에게, 이에 제한되지는 않으나, 다음을 포함하는 임의의 경로를 통하여 투여될 수 있다: (예컨대, 주입 펌프에 의해) 정맥 내, 복강 내, 안 내, 동맥 내, 폐 내, 경구, 흡입, 방광 내, 근육 내, 기관 내, 피하, 안 내, 척추강 내, 경피, 경흉막, 동맥 내, 국소, 흡입적(예컨대, 스프레이의 미스트), 점막(예를 들어 비강 점막을 통해), 피하, 경피, 위장관, 관절 내, 낭 내, 심실 내, 두개 내, 요도 내, 간 내 및 종양 내. 일 실시태양에서, 본 개시의 조성물은, 예를 들어, 인퓨전 주사 또는 볼루스 주사, 상피 또는 점막피부 내벽(mucocutaneous linings)(예를 들어, 구강 점막, 직장 점막과 장 점막 등)을 통한 흡수와 같은 모든 일반적인 경로로 투여될 수 있고, 다른 생물학적 유효성분과 함께 투여될 수도 있다. 투여는 전신적 또는 국소적일 수 있다. 일 실시태양에서, 본 개시의 조성물은 뇌실 내 주사와 척수 내 주사를 포함하는 모든 적합한 경로로 중추신경계로 도입될 수 있으며, 뇌실 내 주사는 뇌실 내 카테터, 예를 들어 Ommaya 저장고(reservoir)와 같은 저장고에 붙어 있는 카테터에 의하여 이루어질 수 있다.
일 실시태양에서, 변형된 융합 단백질, 이를 암호화하는 핵산 전달 비히클 또는 이들을 포함하는 조성물의 최적 유효량은 실험적으로 결정할 수 있고, 질환의 유형 및 중증도, 투여의 경로, 질환 진행 및 건강, 개체의 체중 및 체면적에 따라 달라질 수 있다. 이러한 결정은 통상의 기술자의 기술 내에 포함된다.
일 실시태양에서, 변형된 융합 단백질은, 예를 들어, 하루에 체중 kg 당 약 0.05 ng 내지 약 20 mg이 투여될 수 있다. 일 실시태양에서, 변형된 융합 단백질의 투여량은 약 0.1 mg/kg 이상, 약 0.5 mg/kg 이상, 약 1.0 mg/kg 이상, 약 1.5 mg/kg 이상, 약 2.0 mg/kg 이상, 약 2.5 mg/kg 이상, 약 3.0 mg/kg 이상, 약 3.5 mg/kg 이상, 약 4.0 mg/kg 이상, 약 4.5 mg/kg 이상, 약 5.0 mg/kg 이상, 약 6.0 mg/kg 이상, 약 8.0 mg/kg 이상, 약 10.0 mg/kg 이상, 약 15.0 mg/kg 이상이거나, 약 20.0 mg/kg 이하, 약 17.0 mg/kg 이하, 약 14.0 mg/kg 이하, 약 11.0 mg/kg 이하, 약 9.0 mg/kg 이하, 약 7.0 mg/kg 이하, 약 5.5 mg/kg 이하, 약 5.0 mg/kg 이하, 약 4.5 mg/kg 이하, 약 4.0 mg/kg 이하, 약 3.5 mg/kg 이하, 약 3.0 mg/kg 이하, 약 2.5 mg/kg 이하, 약 2.0 mg/kg 이하, 약 1.5 mg/kg 이하, 또는 약 1.0 mg/kg 이하일 수 있다. 일 실시태양에서, 변형된 융합 단백질의 투여량은 약 1.0 mg/kg 내지 약 10.0 mg/kg 또는 약 1.0 mg/kg 내지 약 5.0 mg/kg일 수 있다.
일 실시태양에서, 본 개시의 변형된 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 핵산 전달 비히클(예: 재조합 바이러스 벡터)의 양은 용량 당 약 104 내지 약 1014 drp의 DNAse 입자 저항성(drp) 역가로 개체에 투여될 수 있다. 일 실시태양에서, 변형된 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 핵산 전달 비히클의 양은 용량 당 약 105 내지 약 1013, 약 106 내지 약 1012, 약 107 내지 약 1011, 약 108 내지 약 1010, 약 109 내지 약 1010, 약 1010 내지 약 1011, 또는 약 1011 내지 약 1012 drp로 개체에게 투여될 수 있다.
일 실시태양에서, 본 개시의 변형된 융합 단백질 또는 이를 암호화하는 핵산전달 비히클을 포함하는 조성물은 단회 일일 용량으로 투여되거나, 총 일일 용량이 일일 2, 3, 또는 4회의 나누어진 투여량으로 투여될 수 있다. 일 실시태양에서, 본 개시의 변형된 융합 단백질을 포함하는 조성물은, 주 6회, 주 5회, 주 4회, 주 3회, 주 2회, 주 1회, 격주마다 l회, 3주마다 1회, 매월 1회, 2개월마다 1회, 3개월마다 1회, 6개월마다 1회, 9개월마다 1회 또는 매년 1회 투여될 수 있다. 일 실시태양에서, 본 개시의 변형된 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 핵산 전달 비히클을 포함하는 조성물은 덜 잦은 빈도로, 예를 들어, 3개월마다 1회, 4개월마다 1회, 5개월마다 1회, 6개월마다 1회, 7개월마다 1회, 8개월마다 1회, 9개월마다 1회, 10개월마다 1회, 11개월마다 1회, 또는 매년 1회 투여될 수 있다.
진단 또는 검출
본 개시의 변형된 융합 단백질은 리간드-수용체 결합 상호작용을 확인하기 위하여 방사성 동위원소, 형광 표지, 독소 표지, 효소 표지, 화학발광 표지 또는 핵자기 공명 조영제와 같은 검출 가능한 표지로 표지될 수 있다. 키메라 분자에 적용되는 어세이 시스템 또한 고려될 수 있다. 이러한 검출 가능한 표지는 해당 분야에 널리 알려져 있다.
V. 제조 물품 및 키트
본 개시는 일 실시태양에 있어서, 본 개시의 변형된 융합 단백질, 이를 발현하는 재조합 바이러스 벡터 또는 이를 포함하는 조성물을 적합한 포장 내에 포함하는 제조 물품 또는 키트에 관한 것일 수 있다. 일 실시태양에서, 상기 적합한 포장은 해당 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 바이알(예를 들어, 밀봉된 바이알), 용기, 앰플, 병, 항아리, 유연한 포장(예컨대, 밀봉된 마일라 또는 플라스틱 백) 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 제조 물품은 추가적으로 멸균 및/또는 밀봉될 수 있다.
일 실시태양에서, 키트는 상기 조성물을 본 개시에 기술된 용도로 사용하는 방법에 대한 설명서를 더 포함할 수 있다. 일 실시태양에서, 키트는 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 구성품을 더 포함할 수 있으며, 예를 들어, 기타 완충액, 희석제, 필터, 니들, 시린지, 및 본 개시에 기술된 임의의 방법을 수행하기 위한 설명서를 포함하는 패키지 인서트(package inserts; PI)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일 실시태양에서, 키트는 (i) 본 개시에 기술된 융합 단백질 및/또는 본 개시에 기술된 융합 단백질을 암호화하는 재조합 바이러스 벡터, (ii) 약학적으로 허용가능한 담체, 및 (iii) 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 완충액, 희석제, 필터, 니들, 시린지, 및 투여를 수행하기 위한 설명서를 포함하는 패키지 인서트.
이하, 실시예를 들어 본 개시의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 개시에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 개시의 범주 및 범위가 하기 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
[실시예 1] 단백질의 생산, 물성 평가 및 결합력 평가
실시예 1.1 - 발현 벡터의 제조
아래 실시예에서 디자인된 변형된 융합 단백질의 코딩서열 영역(CDS, coding sequence)을 CHO 생산 세포에 적합한 형태로 핵산의 코돈 최적화(codon optimization)를 진행한 뒤, 유전자 합성을 통하여 최종 pcDNA3.1(+) 벡터(Invitrogen)에서 변형된 융합 단백질을 제조하였다(Geneuniversal). 기존의 융합 단백질인 VEGF-Grab1 및 VEGF-Grab3도 동일한 방법으로 제조하였다.
실시예 1.2 - 변형된 융합 단백질의 생산 및 물성 평가
단백질 생산에 사용된 ExpiCHOTM 세포(Gibco)는 계대 수(passage number) 10 이상 20이하에서 일시발현에 사용되었다. VEGF-Grab1 또는 VEGF-Grab3를 매단계 동일조건하에서 배양 및 정제하여 각 변형된 융합 단백질의 물성개선효과를 측정하는 대조군으로 사용하였다. VEGF-Grab1, VEGF-Grab3 및 변형된 융합 단백질의 일시발현은 제조사(Gibco)에서 제공하는 ExpifectamineTM(Gibco)을 이용한 Max Titer protocol 배양 방법을 이용하였다. 트랜스펙션 하루 전날 ExpiCHOTM 세포를 3.0 x 106 세포/ml의 밀도로 계대배양하고, 다음날 세포의 밀도와 생존율을 다시 측정하여 세포 밀도를 6.0 x 106 세포/ml 되도록 ExpiCHOTM 발현 배지를 첨가하여 희석하였다. 25 ml의 세포배양액을 125 ml 에를렌마이어(Erlenmeyer) 플라스크에 분주한 후 트랜스펙션 혼합물 제조 전까지 37 ℃ 인큐베이터에서 세포를 보관한다. 25 μg에 해당하는 플라스미드 유전자를 1 ml의 OptiProTM SFM 배지와 잘 섞어주었다. 80 ul의 ExpifectamineTM CHO 세포를 920 ul의 OptiProTM SFM 배지와 잘 섞어준 후 2분간 상온에 방치하였다. Expifectamine-OptiProTM SFM 혼합물을 미리 섞어둔 플라스미드-OptiProTM SFM에 첨가하여 잘 섞어준 후 상온에서 2분간 방치하였다. 2분 후 혼합액을 미리 분주해 둔 세포배양액에 천천히 첨가 후 37 ℃, 8% CO2, 130 rpm의 조건으로 설정된 인큐베이터에서 배양하였다. 트랜스펙션 후 18-22시간이 될 때, ExpifectamineTM CHO 인핸서 150 ul와 ExpiCHOTM 피드 4 ml을 섞어준 후 배양중인 플라스크에 첨가한 후, 32 ℃, 8% CO2, 130 rpm의 조건으로 설정된 인큐베이터에서 세포 배양을 지속하였다. 트랜스펙션 후 5일차 ExpiCHOTM 피드 4 ml을 추가적으로 첨가하였다. 트랜스팩션 6일차 이후부터 세포 밀도(cell density)와 생존율(viability)을 트리판 블루 염색법을 통한 CountessⅡ(Invitrogen)기기를 이용하여 측정하였다. 세포의 생존율이 70% 내지 80% 미만에 도달하는 시점이 될 때 Cedex(Roche) 장비를 이용하여 최종 역가(titer)를 측정한 후 3000 xg로 30분간 원심분리하여 단백질이 포함된 세포 배양액을 회수하였다. 회수된 상층액을 0.22 μm 시린지 필터(syringe filter)를 통하여 여과한 후 해당 배양액을 -80 ℃에 보관하였다.
배양액으로부터의 단백질들의 정제는 HiTrap Fibro PrismA 컬럼이 장착된 AKTA avant25 기기를 이용하여 친화 크로마토그래피로 수행되었다. 0.22 μm 시린지 필터로 여과한 배양액을 분당 16 ml의 속도로 흘려주고 50 mM Na-Pi, 50 mM NaCl, pH 7.0의 버퍼를 15배 컬럼부피만큼 흘려주어 씻어내었다. 비특이적 결합을 제거하기위해 일차적으로 50 mM Na-Pi, 1 M NaCl, pH 5.5 조건의 버퍼로, 이차적으로 50 mM Na-OAc, pH 4.6 조건의 버퍼로 각각 15배 컬럼부피만큼 컬럼을 씻어주었다. 100 mM 글리신, pH 3.0 조건의 용출 버퍼를 15배 컬럼부피만큼 흘려주어, 결합되어 있는 단백질들을 용출하여 딥-웰 블록(deep-well block) 또는 15 ml 튜브에 수집하였다. 수집된 단백질들에 1 M Trizma® 염기 (pH 11.0) 용액을, 수집된 단백질 부피의 1%만큼 첨가하여 단백질 용액을 중화시켜준 후 0.22 μm 시린지 필터를 이용하여 침전물을 제거해 주었다. 중화 전 및 중화 후의 시료를 각각 UV 측정법을 통하여 정량하고, SE-HPLC를 통하여 분석한 후 순도를 측정하였다. 결합능 측정을 위해 순도가 90%에 도달하지 못한 시료에 대해서 추가적으로 Superdex200 increase 10/300 컬럼을 이용한 크기배제 크로마토그래피를 수행하여 정제를 진행하였다. 250 mM K-Pi, 200 mM KCl, pH 6.2 또는 250 mM K-Pi, 200 mM KCl, pH 5.5로 완충되어 있는 컬럼에 Centricon® 30MWCO 농축기를 이용하여 500 μl 이하의 부피로 농축된 단백질을 주입하였다. 용출되는 단백질을 튜브에 수집하여 SE-HPLC를 통하여 순도를 확인한 후 농축을 수행하였다. 최종 농축된 단백질을 UV 정량법을 통해 분석하고, SEC-HPLC 및 SDS-PAGE 분석법을 통하여 순도를 확인하였다.
위 과정을 통해 각 단백질의 물성으로 역가, 용출량, 수율(step yield), 고분자량 종(high molecular weight species; HMWS)의 함량, 저분자량 종(low molecular weight species; LMWS)의 함량, 및 기능성 단량체 함량 중 하나 이상을 측정하였다. 여기서 역가는 세포 배양액 회수 시 측정된 배양액 중 존재하는 Fc-융합단백질의 농도를 의미하여, 용출량은 일차 정제 단계인 친화 크로마토그래피 수행 후 회수된 단백질의 총량을 의미하며, 수율은 일차 정제 후 회수된 총 단백질의 양을 배양액 중 측정된 단백질 총량으로 나눈 값으로 일차 정제 시 컬럼에 의해 회수된 단백질의 회수율을 의미한다. 고분자량 종(HMWS)은 예측된 단백질의 기능 유닛보다 큰 질량을 갖는 단백질종이며, 저분자량 종(LMWS)은 예측된 단백질의 기능 유닛보다 작은 질량을 갖는 단백질종으로 두 경우 모두 비정상적인 단백질 접힘(protein folding)을 갖는 분획을 의미한다. 기능성 단량체는 정상적인 단백질의 구조 및 기능을 갖는 분획을 의미한다.
실시예 1.3 - VEGF-A 및 PLGF에 대한 결합력 평가
VEGF-A 및 PLGF 리간드에 대한 각 단백질의 결합 친화도를 이전에 문헌(Kamat et al, 2017)에 따라 Octet®RED96e (ForteBIO) 기기를 이용하여 측정하였다.
먼저 결합력 측정 전 AHC 센서를 1x KB 버퍼(ForteBIO)에 담가 안정화시켰다. 분석하고자 하는 물질인 VEGF-Grab1 또는 VEGF-Grab-3 및 변형된 융합 단백질을 20 nM 농도로 흘려주어 센서에 결합시킨 후, 1X KB 버퍼로 세척하여 결합 후 남아있는 단백질을 제거하였다. 이후 VEGF-A 및 PLGF를 각각 3 농도 구간(VEGF-A: 40, 20, 10nM; PLGF: 5, 2.5, 1.25 nM)으로 흘려주어 결합력을 측정하였다. 결합력 측정 결과 중 신뢰성 확보를 위한 지표, Full X^2(3 이하)와 Full R^2(0.95 이상)가 범위에 들어오는 두 농도에서 측정된 결합력의 평균값을 산출하여 상대비교 하였다.
[실시예 2] 변형된 융합 단백질의 디자인
실시예 2.1 - 표면 전하 전이(surface charge transition) 변이체의 제조 및 특성 평가
물성이 증가된 VEGFR 수용체 구성을 포함하는 융합 단백질을 확보하기 위해, 본 개시의 발명자들은 VEGFR1의 세포외 도메인(Extracellular domain) 전체가 포함된 구조(PDB entry. 5t89)를 주형으로 하여 단백질의 표면 전하 분포도(surface charge distribution)를 분석하고 양전하가 밀집된 부분 및 소수성 표면전하를 갖는위치를 도출하였다(도 1a).
이를 통해 VEGFR1 도메인 D3에서 T236 내지 T247 아미노산 잔기에 해당하는 β1-β2 루프(Site 1으로 명명함), T256 내지 V262 아미노산 잔기에 해당하는 β2-β3 루프(Site 2로 명명함) 및 D299 내지 L308 아미노산 잔기에 해당하는 β5-β6 루프(Site 3로 명명함)에 존재하는 아미노산 잔기의 측쇄(side chain)가 융합 단백질의 표면으로 노출된다는 점을 확인하였다. 표면에 노출된 아미노산 잔기를 중심으로 단백질의 표면 전하 분포도에서 도출된 위치를 대입하여 변이를 도입할 수 있는 아미노산 잔기 위치를 선정 및 추론하였다(도 1b 및 도 1c). 표면에 노출되어 있는 상기 가변 루프(flexible loop)에 위치하는 아미노산 잔기의 변이를 통하여 융합 단백질의 표면 전하 및 구조 안정화를 달성하고자 하였다. 예를 들어, 표면에 노출된 아미노산 잔기를 VEGFR2의 상동위치에 존재하는 아미노산 잔기로 치환하는 것을 시도하였다. 더불어 Site 2의 아미노산 잔기들은 리간드(VEGF 또는 PLGF)와 결합하는 측면의 단백질 표면에 노출되어 있으며, 해당 위치에서의 변이는 리간드와의 결합력 또는 표면 잔기 노출로 인한 용해도(solubility)에 영향을 미친다. 따라서 Site 2의 아미노산 잔기의 경우, 예를 들어, 단백질 구조 또는 리간드와의 결합력에 영향을 크게 미치지 않는 범위 내에서 기존의 아미노산 잔기의 측쇄보다 작은 크기를 갖거나 또는 유사한 크기의 극성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 치환하는 것을 시도하였다.
서로 다른 위치에서 변이가 도입된 변형된 융합 단백질을 표 32 및 표 33과 같이 제조하였으며, 각 변이체가 가지는 변이 위치는 표 1과 같다. 변이체를 실시예 1에 따라 제조하고 그 물성 및 결합력을 평가하였다. VEGFR-야생형 단백질(C88)을 기초로 제조한 변이체의 물성 평가 결과를 표 2에 나타내고, 결합력 평가 결과를 표 3 내지 표 4에 나타내었다. VEGF-Grab3를 기초로 제조한 변이체의 물성 평가 결과는 표 5에 나타내고, 결합력 평가 결과는 표 6에 나타내었으며, 결합력 평가 결과는 이는 VEGF-Grab3(삼성바이오로직스 제조)에 대한 상대적인 결합력 평가 결과를 나타낸다.
이하의 실시예 또는 표에 기재된 표면 전하 변이 위치 또는 이황화결합 위치는, C10 내지 C87 변이체(서열번호 10 내지 서열번호 70)의 경우 서열번호 3의 아미노산 서열을 기준으로 변이된 위치 및 아미노산 잔기를 기재한 것이며, C97 내지 C114 및 C119 변이체(서열번호 77 내지 서열번호 93 및 서열번호 98)의 경우 서열번호 71의 아미노산 서열을 기준으로 변이된 위치 및 아미노산 잔기를 기재한 것이다.
| 단백질 코드 | 표면 전하 변이 위치 | 링커 서열 | 링커 서열 유래 | ||
| Site 1 | Site 2 | Site 3 | |||
| C10 | - | - | K300G | DKTHTCPPCP | IgG1 |
| C11 | L243S/R244V | - | - | DKTHTCPPCP | IgG1 |
| C12 | L243S/R244V | - | K300G | DKTHTCPPCP | IgG1 |
| C13 | K241E/L243S/R244V/H246E | - | - | DKTHTCPPCP | IgG1 |
| C14 | K241E/L243S/R244V/H246E | - | K300G | DKTHTCPPCP | IgG1 |
| C15 | - | - | K300G/Q302T/K304S | DKTHTCPPCP | IgG1 |
| C16 | - | - | K300G/Q302T/K304S/K306Q | DKTHTCPPCP | IgG1 |
| C17 | K241E/L243S/R244V/H246E | - | K300G/Q302T/K304S/K306Q | DKTHTCPPCP | IgG1 |
| C19 | - | L258S | - | DKTHTCPPCP | IgG1 |
| C20 | - | L258A | - | DKTHTCPPCP | IgG1 |
| C25 | K241E/L243S/R244V/H246E | L258A | K300G/Q302T/K304S/K306Q | DKTHTCPPCP | IgG1 |
| C26 | K241E/L243S/R244V/H246E | L258A | K300G | DKTHTCPPCP | IgG1 |
| C27 | K241E/L243S/R244V/H246E | L258A | K300G/Q302T/K304S | DKTHTCPPCP | IgG1 |
| C28 | - | L258A | K300G/Q302T/K304S | DKTHTCPPCP | IgG1 |
| C29 | - | L258A | K300G/Q302T/K304S/K306Q | DKTHTCPPCP | IgG1 |
| C30 | K241E/L243S/R244V/H246E | K300G/Q302T/K304S | DKTHTCPPCP | IgG1 | |
| C97 | L243S/R244V | - | - | LEDKTHTCPPCP | IgG1 |
| C98 | K241E/L243S/R244V/H246E | - | - | LEDKTHTCPPCP | IgG1 |
| C99 | L258A | LEDKTHTCPPCP | IgG1 | ||
| C119 | L258D | LEDKTHTCPPCP | IgG1 | ||
| C100 | - | - | K300G/Q302T/K304S/K306Q | LEDKTHTCPPCP | IgG1 |
| C101 | L243S/R244V | L258A | LEDKTHTCPPCP | IgG1 | |
| C102 | - | L258A | K300G/Q302T/K304S | LEDKTHTCPPCP | IgG1 |
| C103 | - | L258A | K300G/Q302T/K304S/K306Q | LEDKTHTCPPCP | IgG1 |
| C104 | K241E/L243S/R244V/H246E | - | K300G/Q302T/K304S/K306Q | LEDKTHTCPPCP | IgG1 |
| C105 | K241E/L243S/R244V/H246E | L258A | K300G/Q302T/K304S/K306Q | LEDKTHTCPPCP | IgG1 |
| C106 | K241E/L243S/R244V/H246E | L258A | K300G | LEDKTHTCPPCP | IgG1 |
| C107 | K241E/L243S/R244V/H246E | L258A | K300G/Q302T/K304S | LEDKTHTCPPCP | IgG1 |
| 단백질 코드 | HMWS(%) | 기능성 단량체 함량(%) | LMWS(%) |
| C88 | 70.1 | 22.5 | 7.4 |
| VEGF-Grab3(파노로스바이오사이언스 제조) | 60.5 | 34.5 | 5.0 |
| C97 | 70.4 | 24.2 | 5.5 |
| C98 | 55.4 | 34.3 | 10.2 |
| C99 | 56.8 | 34.6 | 8.6 |
| C119 | 57.9 | 36.8 | 5.3 |
| C100 | 54.0 | 36.1 | 9.9 |
| C101 | 69.8 | 24.8 | 5.4 |
| C102 | 52.9 | 44.0 | 3.1 |
| C103 | 54.6 | 36.0 | 9.4 |
| C104 | 56.2 | 35.5 | 8.3 |
| C105 | 56.5 | 36.3 | 7.2 |
| C106 | 64.3 | 29.9 | 5.8 |
| C107 | 57.7 | 36.0 | 6.3 |
| 단백질 코드 | VEGF-A에 대한 결합력 | C88 대비 VEGF-A에 대한 결합력 (증가배수) | ||||
| KD(M) | kon(1/Ms) | kdis(1/s) | fold(KD) | fold(kon) | fold(kdis) | |
| C88 | 6.08E-11 | 5.78E+05 | 3.51E-05 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| VEGF-Grab3(파노로스바이오사이언스 제조) | 3.58E-11 | 3.72E+05 | 1.33E-05 | 1.70 | 0.64 | 2.64 |
| C97 | 6.00E-12 | 2.81E+05 | 1.68E-06 | 10.15 | 0.49 | 20.89 |
| C98 | 3.56E-13 | 2.81E+05 | <1.0E-07 | > 60.86 | 0.49 | > 100 |
| C99 | 3.83E-13 | 2.61E+05 | <1.0E-07 | > 60.86 | 0.45 | > 100 |
| C119 | 4.84E-11 | 5.31E+05 | 2.57E-05 | 1.26 | 0.92 | 1.37 |
| C100 | 3.39E-13 | 2.95E+05 | <1.0E-07 | > 60.86 | 0.51 | > 100 |
| C101 | 1.17E-10 | 4.51E+05 | 5.27E-05 | 0.52 | 0.78 | 0.67 |
| C102 | 8.14E-11 | 3.85E+05 | 3.13E-05 | 0.75 | 0.67 | 1.12 |
| C103 | 2.49E-10 | 2.88E+05 | 7.15E-05 | 0.24 | 0.50 | 0.49 |
| C104 | 3.81E-13 | 2.63E+05 | <1.0E-07 | > 60.86 | 0.46 | > 100 |
| C105 | 3.75E-13 | 2.67E+05 | <1.0E-07 | > 60.86 | 0.46 | > 100 |
| C106 | 3.90E-13 | 2.57E+05 | <1.0E-07 | > 60.86 | 0.44 | > 100 |
| C107 | 4.83E-13 | 2.07E+05 | <1.0E-07 | > 60.86 | 0.36 | > 100 |
| 단백질 코드 | PLGF에 대한 결합력 | C88 대비 PLGF에 대한 결합력 (증가배수) | ||||
| KD(M) | kon(1/Ms) | kdis(1/s) | fold(KD) | fold(kon) | fold(kdis) | |
| C88 | 2.05E-10 | 1.21E+06 | 2.48E-04 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| VEGF-Grab3(파노로스바이오사이언스 제조) | 1.51E-10 | 1.33E+06 | 2.02E-04 | 1.36 | 1.10 | 1.23 |
| C97 | 1.52E-10 | 1.28E+06 | 1.95E-04 | 1.35 | 1.06 | 1.28 |
| C98 | 3.75E-10 | 5.49E+05 | 2.06E-04 | 0.55 | 0.45 | 1.21 |
| C99 | 3.76E-10 | 1.36E+06 | 5.11E-04 | 0.54 | 1.12 | 0.49 |
| C119 | 5.34E-10 | 1.83E+06 | 9.75E-04 | 0.38 | 1.50 | 0.25 |
| C100 | 4.53E-10 | 1.56E+06 | 7.05E-04 | 0.45 | 1.29 | 0.35 |
| C101 | 6.84E-11 | 5.60E+06 | 3.83E-04 | 2.99 | 4.61 | 0.65 |
| C102 | 2.21E-10 | 2.36E+06 | 5.23E-04 | 0.93 | 1.95 | 0.47 |
| C103 | 1.61E-10 | 2.21E+06 | 3.55E-04 | 1.27 | 1.82 | 0.70 |
| C104 | 2.23E-10 | 1.21E+06 | 2.69E-04 | 0.92 | 1.00 | 0.92 |
| C105 | 2.70E-10 | 1.76E+06 | 4.75E-04 | 0.76 | 1.45 | 0.52 |
| C106 | 2.45E-10 | 2.31E+06 | 5.64E-04 | 0.84 | 1.90 | 0.44 |
| C107 | 2.35E-10 | 1.58E+06 | 3.71E-04 | 0.87 | 1.30 | 0.67 |
| 단백질 코드 | 역가 (g/L) | 용출량(mg) | 수율(%) | HMWS(%) | 기능성 단량체 함량(%) | LMWS(%) |
| VEGF-Grab1(파노로스바이오사이언스 제조) | 0.527 | 8.6 | 46.7 | 33.1 | 43.0 | 23.8 |
| VEGF-Grab3(파노로스바이오사이언스 제조) | 0.359 | 5.4 | 50.5 | 53.9 | 44.3 | 1.7 |
| C10 | 0.647 | 11.1 | 49.0 | 47.9 | 40.0 | 12.1 |
| C11 | 0.602 | 11.1 | 52.7 | 52.2 | 45.1 | 2.7 |
| C12 | 0.673 | 12.0 | 50.9 | 65.5 | 30.1 | 4.4 |
| C13 | 0.752 | 12.9 | 48.9 | 56.3 | 40.2 | 2.9 |
| C14 | 0.762 | 14.9 | 55.8 | 58.0 | 38.2 | 3.8 |
| C15 | 0.647 | 12.2 | 54.1 | 44.5 | 54.2 | 2.3 |
| C16 | 0.764 | 10.6 | 39.5 | 23.9 | 60.4 | 15.7 |
| C17 | 0.632 | 12.7 | 57.5 | 51.6 | 46.5 | 1.9 |
| C19 | 0.652 | 11.4 | 49.9 | 45.4 | 48.4 | 6.2 |
| C20 | 0.455 | 8.1 | 51.0 | 39.0 | 54.8 | 6.2 |
| C25 | 0.565 | 8.0 | 40.4 | 39.8 | 60.1 | 0.1 |
| C26 | 0.434 | 7.1 | 46.5 | 42.1 | 57.1 | 0.8 |
| C27 | 0.632 | 7.0 | 31.8 | 42.2 | 57.1 | 0.7 |
| C28 | 0.536 | 7.5 | 39.9 | 38.1 | 61.1 | 0.7 |
| C29 | 0.591 | 8.2 | 39.7 | 34.7 | 62.4 | 2.9 |
| C30 | 0.483 | 8.3 | 49.1 | 57.7 | 41.3 | 1.0 |
| 단백질 코드 | VEGF-A에 대한 결합력(증가배수) | PLGF에 대한 결합력(증가배수) | ||||
| fold(KD) | fold(kon) | fold(kdis) | fold(KD) | fold(kon) | fold(kdis) | |
| C25 | 0.18 | 1.34 | 0.14 | 0.56 | 1.28 | 0.44 |
| C26 | 0.03 | 1.36 | 0.02 | 0.53 | 1.34 | 0.39 |
| C27 | 0.05 | 1.43 | 0.03 | 0.70 | 2.13 | 0.33 |
| C28 | 0.88 | 0.88 | 1.00 | 0.52 | 1.02 | 0.51 |
| C29 | 0.85 | 0.85 | 1.00 | 0.57 | 1.09 | 0.52 |
| C30 | < 0.01 | 1.67 | < 0.01 | 0.51 | 2.22 | 0.23 |
표 2 내지 표 6의 결과에 따르면, 본 개시의 일 실시태양에 따른 변형된 융합 단백질은 역가 및 단백질 용출량 결과로부터 우수한 생산성을 나타내는 것을 확인할 수 있으며, 기능성 단량체 결과로부터 우수한 물성을 나타내는 것을 확인할 수 있다. 또한 예를 들어, kon 등에 대한 결과로부터, 리간드에 대한 결합력에서도 우수한 특성을 나타냄을 확인할 수 있다.
실시예 2.2 - 링커 변이체의 제조 및 특성 평가
인간 VEGF 수용체의 경우 면역글로불린 유사 도메인 D2 및 D3와의 상호작용에 의해 리간드인 VEGF 또는 PLGF와 결합하게 된다(도 2a 참조). 이러한 도메인 D2 및 도메인 D3를 이용한 융합 단백질(예: VEGF-Grab3)의 경우, 리간드와 결합하기 전에는 도메인 D2 및 도메인 D3가 열린 구조를 가지다가 리간드와 결합하면서 닫힌 구조를 형성하게 된다(도 2b 및 도 2c 참조). 도메인 D3와 다량체화 도메인의 결합 길이에 따라서 도메인 D2 및 도메인 D3의 구조체가 리간드와 결합하기에 충분한 공간을 확보하지 못하거나 또는 구조체간에 간섭이 발생할 경우 리간드에 대한 융합 단백질의 결합력이 저하되는 현상이 발생할 수 있다. 그러므로 융합 단백질에서 도메인 D3와 다량체화 도메인의 결합 길이와 결합 방식은 리간드와 결합하는 융합 단백질의 구조와 리간드에 대한 결합력에 영향을 미칠 수 있다.
반면 자연 상태에서 인간 VEGF 수용체의 경우 도메인 D3와 도메인 D4의 결합 구조에서, 도메인 D3의 말단부터 도메인 D4의 이량체 형성 부위(dimerization site)까지의 길이는 대략 37 Å에 해당하고(도 2d 참조), 인간 VEGF 수용체의 경우 도메인 D4 이하에서는 동일한 도메인끼리 서로 결합된 상태로 존재한다. 도메인 D4 이하는 융합 단백질에서 다량체화 도메인과 유사한 구조로 볼 수 있다. 따라서 본 발명자는 자연 상태의 인간 VEGF 수용체의 구조적 특성을 모사하고 확보하기 위하여, 본 개시의 변형된 융합 단백질에서 링커의 길이 및 종류를 변경하였다. 구체적으로 Gly-Ser 반복서열의 폴리펩타이드와 IgG1, IgG4, IgD에서 유래한 힌지 영역의 아미노산 서열 및 이들 힌지의 변이 서열로 이루어진 링커를 도입하였다. 이를 통해 리간드 결합시 도메인 D3와 다량체화 도메인(Fc 영역) 사이에 형성되는 루프(링커)에 형성되는 긴장도(tension)를 감소시켜 물리적 안정성을 증가시키고자 하였다.
더불어 면역글로불린의 힌지 영역으로부터 유래한 아미노산 서열의 경우, 그 자체의 특성으로 인하여 다양한 단백질 분해 효소(protease)에 대한 절단 위치(cleavage site)를 가지고 있으며(Vlasak and Ionescu. 2011. Mabs 3: 253-263) 융합 단백질에 도입 후 글리코실화(aglycosylation), 예를 들어 O-글리코실화가 발생하여 올리고머화(oligomerization)가 발생할 수 있다(Song et. al. 2020. Computational and Structural Biotechnology Journal 18: 3925- 3935). 본 발명자는 본 개시의 변형된 융합 단백질의 체내 안정성을 개선하기 위하여 단백질 분해 효소에 의한 절단 위치, 예를 들어 파파인에 대한 절단 위치에서 아미노산 서열을 추가로 변형시키고, 글리코실화가 발생하는 Ser 또는 Thr 아미노산 잔기를 변형시키는 시도를 수행하였다. 또한 링커의 구조적 유연성을 증가시키기 위하여 Fc 힌지 영역의 코어 힌지로부터 유래한 서열(예: CPPCP)에 존재하는 시스테인을 치환하는 시도를 수행하였다. 본 개시에서 도입한 링커를 디자인하기 위한 예시적인 모식도를 도 3에 나타내었다.
링커가 도입된 변형된 융합 단백질을 표 32 및 표 33과 같이 제조하였으며, 각 변이체가 가지는 링커 특성은 표 7과 같다. 표 7에서 볼드 및 밑줄 표시된 아미노산은 변이를 발생시킨 위치의 아미노산 잔기를 의미한다.
변이체를 실시예 1에 따라 제조하고 그 물성 및 결합력을 평가하였다. VEGFR-야생형 단백질을 기초로 제조한 변이체의 물성 평가 결과를 표 8에 나타내고, 결합력 평가 결과를 표 9 내지 표 10에 나타내었다. VEGF-Grab3를 기초로 제조한 변이체의 물성 평가 결과는 표 11에 나타내고, 결합력 평가 결과는 표 12 및 표 13에 나타내었으며, 표 12는 VEGF-Grab3(파노로스바이오사이언스 제조)에 대한 상대적인 결합력 평가 결과를 나타내고 표 13은 VEGF-Grab3(삼성바이오로직스 제조)에 대한 상대적인 결합력 평가 결과를 나타낸다. C88 또는 VEGF-Grab3(파노로스바이오사이언스 제조)에 대한 상대적인 결합력 평가의 경우, 변이체와 동일한 조건 및 배치에서 생산한 것과 비교한 것이다.
| 단백질 코드 | GS 반복 서열 | 파파인/글리코실화 변이 | 코어 힌지 변이 | 링커 서열 중 Fc 힌지 유래 | 최종 링커 서열 |
| C32 | GSSG | - | S PP S P | IgG1 | GSSGDKTHTSPPSP |
| C34 | GSSG | - | S PP S P | IgG1 | GSSGEPKSSDKTYTSPPSP |
| C36 | GS | - | - | IgG1 | GSKVDKKVEPKSSDKTHTCPPCP |
| C37 | GS | SSDKT Y T | - | IgG1 | GSKVDKKVEPKSSDKTYTCPPCP |
| C39 | GS | SSDT PP T | - | IgG1 | GSKVDKKVEPKSSDTPPTCPPCP |
| C41 | GSGGGGSGGGGSGGGGS | - | - | IgG4 | GSGGGGSGGGGSGGGGSAESKYGPPCPPCP |
| C43 | GS | SSDKT Y T | - | IgD/G1 | GSNTGSGGEEKKKEKEKEEQEERSSDKTYTCPPCP |
| C44 | GS | SSDT PP T | - | IgD/G1 | GSNTGSGGEEKKKEKEKEEQEERSSDTPPTCPPCP |
| C45 | (E)GSSGGSSG | SD A T P T | - | IgG1 | EGSSGGSSGEPKSDATPTCPPCP |
| C46 | (E)GSSGGSSG | SD S T Y T | - | IgG1 | EGSSGGSSGEPKSDSTYTCPPCP |
| C52 | GGGGS | AG DK APP | G PP G P | IgG1 | GGGGSAEPKAGDKAPPGPPGP |
| C55 | GGGGS | SSDKT Y T | - | IgG1 | GGGGSAEPKSSDKTYTCPPCP |
| C56 | GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS | SSDKT Y T | - | IgG1 | GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEPKSSDKTYTCPPCP |
| C108 | GSSG | - | S PP S P | IgG1 | GSSGDKTHTSPPSP |
| C109 | GS | - | - | IgG1 | GSKVDKKVEPKSSDKTHTCPPCP |
| C111 | (E)GSSGGSSG | SD A T P T | - | IgG1 | EGSSGGSSGEPKSDATPTCPPCP |
| C115 | - | - | - (본 개시에서 정의하는 링커 존재하지 않음) | ||
| C116 | GSSGGSSGGSSGGSSGGSSGGSSGGSSGGSSGGSSGGSSG | - | - | IgG1 | GSSGGSSGGSSGGSSGGSSGGSSGGSSGGSSGGSSGGSSGDKTHTCPPCP |
| C117 | GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS | - | - | IgG1 | GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCP |
| C118 | GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS | - | - | IgG1 | GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCP |
| 단백질 코드 | HMWS(%) | 기능성 단량체 함량(%) | LMWS(%) |
| C88 | 70.1 | 22.5 | 7.4 |
| C108 | 61.9 | 25.1 | 13.1 |
| C109 | 65.2 | 26.9 | 7.9 |
| C111 | 65.9 | 27.7 | 6.5 |
| C115 | 65.4 | 18.5 | 16.1 |
| C116 | 70.1 | 24.0 | 5.9 |
| C117 | 78.0 | 15.2 | 6.7 |
| C118 | 68.7 | 25.0 | 6.3 |
| 단백질 코드 | VEGF-A에 대한 결합력 | C88 대비 VEGF-A에 대한 결합력(증가배수) | ||||
| KD(M) | kon(1/Ms) | kdis(1/s) | fold(KD) | fold(kon) | fold(kdis) | |
| C88 | 6.08E-11 | 5.78E+05 | 3.51E-05 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| C108 | 3.14E-10 | 4.83E+05 | 1.52E-04 | 0.19 | 0.84 | 0.23 |
| C109 | 2.67E-10 | 5.21E+05 | 1.39E-04 | 0.23 | 0.90 | 0.25 |
| C111 | 3.75E-11 | 6.99E+05 | 2.63E-05 | 1.62 | 1.21 | 1.34 |
| 단백질 코드 | PLGF에 대한 결합력 | C88 대비 PLGF에 대한 결합력(증가배수) | ||||
| KD(M) | kon(1/Ms) | kdis(1/s) | fold(KD) | fold(kon) | fold(kdis) | |
| C88 | 2.05E-10 | 1.21E+06 | 2.48E-04 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| C108 | 2.36E-10 | 3.16E+06 | 7.46E-04 | 0.87 | 2.61 | 0.33 |
| C109 | 2.47E-10 | 1.63E+06 | 4.02E-04 | 0.83 | 1.34 | 0.62 |
| C111 | 1.74E-10 | 2.27E+06 | 3.93E-04 | 1.18 | 1.87 | 0.63 |
| 단백질 코드 | 역가 (g/L) | 용출량(mg) | 수율(%) | HMWS(%) | 기능성 단량체 함량(%) | LMWS(%) |
| VEGF-Grab1(파노로스바이오사이언스 제조) | 0.527 | 8.6 | 46.7 | 33.1 | 43.0 | 23.8 |
| VEGF-Grab3(파노로스바이오사이언스 제조) | 0.359 | 5.4 | 50.5 | 53.9 | 44.3 | 1.7 |
| C32 | 0.236 | 7.4 | 89.1 | 27.0 | 63.4 | 9.6 |
| C34 | 0.207 | 7.2 | 99.8 | 29.8 | 60.0 | 10.2 |
| C36 | 0.124 | 4.6 | 106.2 | 35.5 | 50.9 | 13.6 |
| C37 | 0.157 | 5.2 | 95.5 | 38.7 | 48.4 | 12.9 |
| C39 | 0.276 | 8.0 | 82.8 | 38.1 | 51.8 | 10.2 |
| C41 | 0.281 | 7.4 | 75.5 | 33.3 | 55.2 | 11.5 |
| C43 | 0.308 | 8.7 | 80.7 | 35.3 | 57.3 | 7.4 |
| C44 | 0.219 | 5.6 | 73.5 | 30.9 | 58.7 | 10.4 |
| C45 | 0.206 | 5.3 | 73.6 | 32.9 | 67.1 | 0.0 |
| C46 | 0.241 | 5.4 | 64.5 | 36.6 | 63.4 | 0.0 |
| C52 | 0.221 | 9.1 | 120.6 | 25.2 | 70.0 | 4.8 |
| C55 | 0.283 | 9.1 | 97.7 | 25.5 | 70.5 | 4.0 |
| C56 | 0.095 | 4.0 | 132.2 | 33.3 | 60.6 | 6.1 |
| 단백질 코드 | VEGF-A에 대한 결합력(증가배수) | PLGF에 대한 결합력(증가배수) | ||||
| fold(KD) | fold(kon) | fold(kdis) | fold(KD) | fold(kon) | fold(kdis) | |
| C32 | 2.13 | 1.34 | 1.59 | 3.08 | 0.98 | 3.14 |
| C34 | 1.22 | 1.40 | 0.87 | 2.28 | 0.61 | 3.76 |
| C36 | 0.73 | 1.19 | 0.61 | 1.54 | 1.47 | 1.05 |
| C37 | 0.83 | 1.19 | 0.70 | 0.94 | 0.86 | 1.09 |
| C39 | 0.77 | 1.30 | 0.59 | 4.64 | 2.14 | 2.17 |
| C41 | 0.40 | 1.36 | 0.30 | 3.63 | 2.09 | 1.73 |
| C43 | 0.43 | 1.42 | 0.30 | 1.86 | 0.76 | 2.44 |
| C44 | 0.35 | 1.50 | 0.23 | 1.73 | 1.49 | 1.16 |
| C45 | 0.56 | 1.08 | 0.52 | 1.81 | 1.47 | 1.23 |
| C52 | 0.24 | 1.19 | 0.20 | 1.67 | 1.42 | 1.17 |
| C55 | 0.30 | 1.06 | 0.29 | 1.47 | 1.09 | 1.36 |
| C56 | 0.26 | 1.16 | 0.22 | 2.16 | 1.44 | 1.70 |
| 단백질 코드 | VEGF-A에 대한 결합력(증가배수) | PLGF에 대한 결합력(증가배수) | ||||
| fold(KD) | fold(kon) | fold(kdis) | fold(KD) | fold(kon) | fold(kdis) | |
| C32 | 0.57 | 1.53 | 0.37 | 4.40 | 1.14 | 3.85 |
| C34 | 0.33 | 1.60 | 0.20 | 3.26 | 0.71 | 4.60 |
| C36 | 0.20 | 1.36 | 0.14 | 2.21 | 1.72 | 1.29 |
| C37 | 0.22 | 1.36 | 0.16 | 1.35 | 1.01 | 1.33 |
| C39 | 0.21 | 1.49 | 0.14 | 6.64 | 2.50 | 2.65 |
| C41 | 0.11 | 1.56 | 0.07 | 5.19 | 2.45 | 2.12 |
| C43 | 0.12 | 1.63 | 0.07 | 2.67 | 0.89 | 2.99 |
| C44 | 0.09 | 1.71 | 0.05 | 2.48 | 1.74 | 1.42 |
| C45 | 0.15 | 1.23 | 0.12 | 2.59 | 1.72 | 1.50 |
| C52 | 0.64 | 1.64 | 0.39 | 1.20 | 1.53 | 0.78 |
| C55 | 0.82 | 1.45 | 0.56 | 1.06 | 1.17 | 0.91 |
| C56 | 0.69 | 1.59 | 0.44 | 1.56 | 1.56 | 1.14 |
표 8 내지 표 13의 결과에 따르면, 본 개시의 일 실시태양에 따른 변형된 융합 단백질은 역가 및 단백질 용출량 결과로부터 우수한 생산성을 나타내는 것을 확인할 수 있으며, 기능성 단량체 결과로부터 우수한 물성을 나타내는 것을 확인할 수 있다. 또한 예를 들어, kon 등에 대한 결과로부터, 리간드에 대한 결합력에서도 우수한 특성을 나타냄을 확인할 수 있다.
반면 본 개시의 일 실시태양에 따른 링커 변이체의 링커 길이를 벗어나는 링커 서열을 가지는 변이체(C115 내지 C118)의 경우, 본 개시의 변형된 융합 단백질(예: C108 변이체)과 비교하여 역가 또는 기능성 단량체 비율이 현저히 감소하는 것을 확인하였다.
실시예 2.3 - 이황화결합 변이체의 제조 및 특성 평가
융합 단백질은 이종 단백질의 결합체이므로 결합 부위에서 비특이적 절단에 의한 안정성 저하가 예상된다. 도메인 D3의 말단은 루프를 형성하고 있는 부분으로 2차 구조가 결여되어 있을 수 있고, 이종 단백질인 다량체화 도메인과의 연결이 시작되는 부위이므로 안정성이 약할 것으로 예상된다. 공유 결합인 이황화결합(disulfide bond)을 도입하여, 이종 단백질의 결합이 일어나는 부위 근처에서 도메인 간의 접합을 유도하여 단백질의 물리적 절단을 방지하고 안정성을 개선하고자 하였다.
융합 단백질 상에서 이황화결합이 도입될 수 있는 위치를 3차 구조 기반 분석을 통하여 도출하였다. 도메인 D3 말단 영역에 인접한 가변화 루프에 위치한 잔기 중 측쇄의 방향이 링커를 향하고 있으며 측쇄 말단의 원자와 Y329 Cα 원자의 거리가 6 Å 이내인 잔기를 이황화결합을 위한 변이잔기로 선정하였다. 구조 모델링 프로그램(Phyre2, Swiss model)을 통하여 융합 단백질의 3차원 구조를 확보한 후 도입부위의 인실리코(in-silico) 변이를 통하여 이황화결합이 도입된 구조 모델을 확보하였다. 이후 3차 구조 에너지 예측 프로그램(foldx in YASARA, Schymkowitz et al.2005 Nucleic Acids Research. 33:W382-388)을 통하여 이황화결합 도입에 의한 융합 단백질의 에너지 준위 변화를 예측하였다.
융합 단백질에서 도메인 D3 말단과 물리적으로 근접하고 이황화결합을 형성할 수 있는 위치로, 도메인 D3의 β1-β2 루프 상의 아미노산 잔기 또는 β5-β6 루프 상의 아미노산 잔기를 선정하였으며, 도메인 D3 말단의 경우 Y329를 기준으로 -2, -1, 0, +1, +2, 및 +3 위치에 존재하는 아미노산 잔기를 선정하였다.
이황화결합이 도입된 변형된 융합 단백질을 표 32 및 표 33과 같이 제조하였으며, 각 변이체가 가지는 이황화결합 특성은 표 14와 같다. 3차 구조 에너지 예측 프로그램을 통하여 계산된 변이체들의 에너지 값을 표 15에 나타내었다. 변이체를 실시예 1에 따라 제조하고 그 물성 및 결합력을 평가하였다. VEGFR-야생형 단백질을 기초로 제조한 변이체의 물성 평가 결과를 표 16에 나타내고, 결합력 평가 결과를 표 17 내지 표 18에 나타내었다. VEGF-Grab3를 기초로 제조한 변이체의 물성 평가 결과는 표 19에 나타내고, 결합력 평가 결과는 표 20 및 표 21에 나타내었으며, 표 20은 VEGF-Grab3(파노로스바이오사이언스 제조)에 대한 상대적인 결합력 평가 결과를 나타내고 표 21은 VEGF-Grab3(삼성바이오로직스 제조)에 대한 상대적인 결합력 평가 결과를 나타낸다. VEGF-Grab3(파노로스바이오사이언스 제조)에 대한 상대적인 결합력 평가의 경우, 변이체와 동일한 조건 및 배치에서 생산한 것과 비교한 것이다.
| 단백질 코드 | 이황화결합을 위한 아미노산 변이 | 링커 서열 | 링커 서열 중 Fc 힌지 유래 |
| C37 | 대조군 | GSKVDKKVEPKSSDKTYTCPPCP | IgG1 |
| C47 | K241C/332C | GCKVDKKVEPKSSDKTYTCPPCP | IgG1 |
| C48 | L243C/Y329C | GSKVDKKVEPKSSDKTYTCPPCP | IgG1 |
| C49 | L243C/331C | CSKVDKKVEPKSSDKTYTCPPCP | IgG1 |
| C50 | R244C/Y329C | GSKVDKKVEPKSSDKTYTCPPCP | IgG1 |
| C51 | N303C/Y329C | GSKVDKKVEPKSSDKTYTCPPCP | IgG1 |
| C88 | 대조군 | LEDKTHTCPPCP | IgG1 |
| C109 | 대조군 | GSKVDKKVEPKSSDKTHTCPPCP | IgG1 |
| C112 | L243C/331C | CSKVDKKVEPKSSDKTYTCPPCP | IgG1 |
| 단백질 코드 | 단백질 구조 에너지 값 (kcal/mol) |
| C37 | 322.64 |
| C47 | 320.01 |
| C48 | 323.96 |
| C49 | 326.73 |
| C50 | 315.08 |
| C51 | 320.02 |
| 단백질 코드 | 역가 (g/L) | 용출량(mg) | 수율(%) | HMWS(%) | 기능성 단량체 함량(%) | LMWS(%) |
| C88 | 0.223 | 4.9 | 74.1 | 70.1 | 22.5 | 7.4 |
| C109 | 0.133 | 3.2 | 77.8 | 65.2 | 26.9 | 7.9 |
| C112 | 0.202 | 6.2 | 98.6 | 32.2 | 53.6 | 14.2 |
| 단백질 코드 | VEGF-A에 대한 결합력 | C88 대비 VEGF-A에 대한 결합력 (증가배수) | ||||
| KD(M) | kon(1/Ms) | kdis(1/s) | fold(KD) | fold(kon) | fold(kdis) | |
| C88 | 6.08E-11 | 5.78E+05 | 3.51E-05 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| C109 | 2.67E-10 | 5.21E+05 | 1.39E-04 | 0.23 | 0.90 | 0.25 |
| C112 | 2.07E-10 | 6.78E+05 | 1.40E-04 | 0.29 | 1.17 | 0.25 |
| 단백질 코드 | PLGF에 대한 결합력 | C88 대비 PLGF에 대한 결합력 (증가배수) | ||||
| KD(M) | kon(1/Ms) | kdis(1/s) | fold(KD) | fold(kon) | fold(kdis) | |
| C88 | 2.05E-10 | 1.21E+06 | 2.48E-04 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| C109 | 2.47E-10 | 1.63E+06 | 4.02E-04 | 0.83 | 1.34 | 0.62 |
| C112 | 4.38E-11 | 1.03E+06 | 4.49E-05 | 4.68 | 0.85 | 5.53 |
| 단백질 코드 | 역가 (g/L) | 용출량(mg) | 수율(%) | HMWS(%) | 기능성 단량체 함량(%) | LMWS(%) |
| VEGF-Grab1(파노로스바이오사이언스 제조) | 0.527 | 8.6 | 46.7 | 33.1 | 43.0 | 23.8 |
| VEGF-Grab3(파노로스바이오사이언스 제조) | 0.359 | 5.4 | 50.5 | 53.9 | 44.3 | 1.7 |
| C47 | 0.230 | 7.1 | 88.2 | 35.8 | 53.3 | 10.9 |
| C48 | 0.316 | 9.3 | 83.9 | 46.6 | 53.4 | 0.0 |
| C49 | 0.243 | 5.1 | 60.2 | 11.1 | 88.9 | 0.0 |
| C50 | 0.214 | 5.1 | 68.4 | 45.1 | 54.9 | 0.0 |
| C51 | 0.156 | 6.7 | 123.1 | 53.8 | 46.2 | 0.0 |
| 단백질 코드 | VEGF-A에 대한 결합력(증가배수) | PLGF에 대한 결합력(증가배수) | ||||
| fold(KD) | fold(kon) | fold(kdis) | fold(KD) | fold(kon) | fold(kdis) | |
| C47 | 0.70 | 0.91 | 0.77 | 1.55 | 0.74 | 2.11 |
| C48 | 0.95 | 1.15 | 0.83 | 2.26 | 1.31 | 1.72 |
| C49 | 1.43 | 0.99 | 1.44 | 1.40 | 0.88 | 1.60 |
| C50 | 0.30 | 1.89 | 0.16 | 2.98 | 2.08 | 1.43 |
| C51 | 0.39 | 1.62 | 0.24 | 2.39 | 1.05 | 2.26 |
| 단백질 코드 | VEGF-A에 대한 결합력(증가배수) | PLGF에 대한 결합력(증가배수) | ||||
| fold(KD) | fold(kon) | fold(kdis) | fold(KD) | fold(kon) | fold(kdis) | |
| C47 | 0.19 | 1.04 | 0.18 | 2.22 | 0.86 | 2.58 |
| C48 | 0.26 | 1.31 | 0.19 | 3.23 | 1.54 | 2.10 |
| C49 | 0.38 | 1.14 | 0.34 | 2.01 | 1.03 | 1.96 |
| C50 | 0.08 | 2.16 | 0.04 | 4.26 | 2.43 | 1.75 |
| C51 | 0.10 | 1.85 | 0.06 | 3.41 | 1.23 | 2.77 |
표 16 내지 표 21의 결과에 따르면, 본 개시의 일 실시태양에 따른 변형된 융합 단백질은 역가 및 단백질 용출량 결과로부터 우수한 생산성을 나타내는 것을 확인할 수 있으며, 기능성 단량체 결과로부터 우수한 물성을 나타내는 것을 확인할 수 있다. 이러한 결과는 구조모델의 에너지 준위의 계산 결과에서도 확인할 수 있다. 표 15에 따르면 이황화결합이 도입된 융합 단백질 구조의 에너지 값은 이황화결합이 도입되지 않은 구조의 에너지 값과 동등하거나 낮은 수준으로 나타났으며, 이는 이황화결합의 도입을 통하여 구조적 안정화를 확보할 수 있음을 나타낸다. 또한 예를 들어, kon 등에 대한 결과로부터, 리간드에 대한 결합력에서도 우수한 특성을 나타냄을 확인할 수 있다.
실시예 2.4 - 조합 변이체의 제조 및 특성 평가
상기 실시예 2.1 내지 2.3의 결과로부터 얻은 변이체들 중 상대적으로 보다 우수한 특성을 나타내는 변이체의 특성을 조합하여 갖는 조합 변이체를 제조하였다. 각 변이체가 가지는 특성은 표 22에 나타내었다. 변이체를 실시예 1에 따라 제조하고 그 물성 및 결합력을 평가하였다. VEGFR-야생형 단백질을 기초로 제조한 변이체의 물성 평가 결과를 표 23에 나타내고, 결합력 평가 결과를 표 24 내지 표 25에 나타내었다(여기서 비교를 위해 VEGFR-야생형 단백질(C88), C65 및 C73 변이체를 함께 평가하였다). VEGF-Grab3를 기초로 제조한 변이체의 물성 평가 결과는 표 26에 나타내고, 결합력 평가 결과는 표 27 및 표 28에 나타내었으며, 표 27은 VEGF-Grab3(파노로스바이오사이언스 제조)에 대한 상대적인 결합력 평가 결과를 나타내고 표 28은 VEGF-Grab3(삼성바이오로직스 제조)에 대한 상대적인 결합력 평가 결과를 나타낸다. VEGF-Grab3(파노로스바이오사이언스 제조)에 대한 상대적인 결합력 평가의 경우, 변이체와 동일한 조건 및 배치에서 생산한 것과 비교한 것이다.
| 단백질 코드 | 표면 전하 변이 위치 | 링커 서열 | 링커 서열 중 Fc 힌지 유래 | 이황화결합을 위한 아미노산 변이 |
| C61 | K241E/R244V/H246E/L258A/K300G/Q302T/K304S | CSSGDATPTSPPSP | IgG1 | L243C/331C |
| C62 | K241E/R244V/H246E/L258A/K300G/Q302T/K304S | CSKVDKKVEPKSSDTPPTCPPCP | IgG1 | L243C/331C |
| C63 | K241E/R244V/H246E/L258A/K300G/Q302T/K304S | CSGGGGSAEPKAGDATPPTCPPCP | IgG1 | L243C/331C |
| C64 | K241E/R244V/H246E/L258A/K300G/Q302T/K304S | CSGGGGSGGGGSGGGGSAESKYGPPCPPCP | IgG4 | L243C/331C |
| C65 | K241E/R244V/H246E/L258A/K300G/Q302T/K304S | CSNTGSGGEEKKKEKEKEEQEERSSDTPPTCPPCP | IgD/G1 | L243C/331C |
| C66 | K241E/R244V/H246E/L258A/K300G/Q302T/K304S | CGSSGGSSGEPKSDATPTCPPCP | IgG1 | L243C/331C |
| C67 | K241E/R244V/H246E/L258A/K300G/Q302T/K304S | CSKVDKKVEPKSSDKTYTCPPCP | IgG1 | L243C/331C |
| C68 | K241E/R244V/H246E/L258S/K300G/Q302T/K304S | CSKVDKKVEPKSSDTPPTCPPCP | IgG1 | L243C/331C |
| C69 | K241E/R244V/H246E/L258D/K300G/Q302T/K304S | CSKVDKKVEPKSSDTPPTCPPCP | IgG1 | L243C/331C |
| C70 | K241E/R244V/H246E/L258S/K300G/Q302T/K304S | CSGGGGSGGGGSGGGGSAESKYGPPCPPCP | IgG4 | L243C/331C |
| C71 | K241E/R244V/H246E/L258D/K300G/Q302T/K304S | CSGGGGSGGGGSGGGGSAESKYGPPCPPCP | IgG4 | L243C/331C |
| C72 | K241E/R244V/H246E/L258S/K300G/Q302T/K304S | CGSSGGSSGEPKSDATPTCPPCP | IgG1 | L243C/331C |
| C73 | K241E/R244V/H246E/L258D/K300G/Q302T/K304S | CGSSGGSSGEPKSDATPTCPPCP | IgG1 | L243C/331C |
| C74 | K241E/R244V/H246E/L258D/K300G/Q302T/K304S | CSSGDATPTSPPSP | IgG1 | L243C/331C |
| C75 | K241E/R244V/H246E/L258D/K300G/Q302T/K304S | CSNTGSGGEEKKKEKEKEEQEERSSDTPPTCPPCP | IgD/G1 | L243C/331C |
| C76 | L258A/K300G/Q302T/K304S/K306Q | CSSGDATPTSPPSP | IgG1 | L243C /331C |
| C77 | K241T/L258A/K300G/Q302T/K304S/K306Q | CSKVDKKVEPKSSDTPPTCPPCP | IgG1 | L243C /331C |
| C78 | L258A/K300G/Q302T/K304S/K306Q | CSGGGGSAEPKAGDATPPTCPPCPPCP | IgG1 | L243C /331C |
| C79 | L258A/K300G/Q302T/K304S/K306Q | CSGGGGSGGGGSGGGGSAESKYGPPCPPCP | IgG4 | L243C /331C |
| C80 | L258A/K300G/Q302T/K304S/K306Q | CSNTGSGGEEKKKEKEKEEQEERSSDTPPTCPPCP | IgD/G1 | L243C /331C |
| C81 | L258A/K300G/Q302T/K304S/K306Q | CGSSGGSSGEPKSDATPTCPPCP | IgG1 | L243C /331C |
| C82 | L258D/K300G/Q302T/K304S/K306Q | CSSGDATPTSPPSP | IgG1 | L243C /331C |
| C83 | L258D/K300G/Q302T/K304S/K306Q | CSKVDKKVEPKSSDTPPTCPPCP | IgG1 | L243C /331C |
| C84 | L258D/K300G/Q302T/K304S/K306Q | CSGGGGSAEPKAGDATPPTCPPCPPCP | IgG1 | L243C /331C |
| C85 | L258D/K300G/Q302T/K304S/K306Q | CSGGGGSGGGGSGGGGSAESKYGPPCPPCP | IgG4 | L243C /331C |
| C86 | L258D/K300G/Q302T/K304S/K306Q | CSNTGSGGEEKKKEKEKEEQEERSSDTPPTCPPCP | IgD/G1 | L243C /331C |
| C87 | L258D/K300G/Q302T/K304S/K306Q | CGSSGGSSGEPKSDATPTCPPCP | IgG1 | L243C /331C |
| C113 | K241E/R244V/H246E/L258A/K300G/Q302T/K304S | CSNTGSGGEEKKKEKEKEEQEERSSDTPPTCPPCP | IgD/G1 | L243C/331C |
| C114 | K241E/R244V/H246E/L258D/K300G/Q302T/K304S | CGSSGGSSGEPKSDATPTCPPCP | IgG1 | L243C/331C |
| 단백질 코드 | 역가 (g/L) | 용출량(mg) | 수율(%) | HMWS(%) | 기능성 단량체 함량(%) | LMWS(%) |
| C88 | 0.223 | 4.9 | 74.1 | 70.1 | 22.5 | 7.4 |
| C113 | 0.276 | 7.3 | 87.0 | 41.4 | 55.5 | 3.2 |
| C114 | 0.475 | 10.8 | 78.7 | 55.8 | 37.7 | 6.5 |
| C65 | 0.185 | 6.9 | 123.1 | 36.1 | 62.9 | 1.1 |
| C73 | 0.143 | 5.0 | 116.4 | 20.2 | 79.8 | 0.0 |
| 단백질 코드 | VEGF-A에 대한 결합력 | C88 대비 VEGF-A에 대한 결합력 (증가배수) | ||||
| KD(M) | kon(1/Ms) | kdis(1/s) | fold(KD) | fold(kon) | fold(kdis) | |
| C88 | 6.08E-11 | 5.78E+05 | 3.51E-05 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| C113 | 2.20E-10 | 5.56E+05 | 1.23E-04 | 0.28 | 0.96 | 0.29 |
| C114 | 1.83E-13 | 5.47E+05 | <1.0E-07 | > 60.86 | 0.95 | > 100 |
| C65 | 8.46E-11 | 5.16E+05 | 4.37E-05 | 0.72 | 0.89 | 0.80 |
| C73 | 1.53E-13 | 6.52E+05 | <1.0E-07 | > 60.86 | 1.13 | > 100 |
| 단백질 코드 | PLGF에 대한 결합력 | C88 대비 PLGF에 대한 결합력 (증가배수) | ||||
| KD(M) | kon(1/Ms) | kdis(1/s) | fold(KD) | fold(kon) | fold(kdis) | |
| C88 | 2.05E-10 | 1.21E+06 | 2.48E-04 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| C113 | 1.14E-10 | 1.47E+06 | 1.68E-04 | 1.80 | 1.22 | 1.48 |
| C114 | 1.60E-10 | 1.86E+06 | 2.98E-04 | 1.28 | 1.53 | 0.83 |
| C65 | 1.37E-10 | 2.41E+06 | 3.31E-04 | 1.49 | 1.99 | 0.75 |
| C73 | 1.68E-10 | 2.22E+06 | 3.72E-04 | 1.22 | 1.83 | 0.67 |
| 단백질 코드 | 역가 (g/L) | 용출량(mg) | 수율(%) | HMWS(%) | 기능성 단량체 함량(%) | LMWS(%) |
| VEGF-Grab1 | 0.527 | 8.6 | 46.7 | 33.1 | 43.0 | 23.8 |
| VEGF-Grab3 | 0.359 | 5.4 | 50.5 | 53.9 | 44.3 | 1.7 |
| C61 | 0.537 | 10 | 62.2 | 10.2 | 89.8 | 0.0 |
| C62 | 0.231 | 5.9 | 85.7 | 11.2 | 88.8 | 0.0 |
| C63 | 0.505 | 9.6 | 63.4 | 9.5 | 90.5 | 0.0 |
| C64 | 0.171 | 6.2 | 121.6 | 13.7 | 86.3 | 0.0 |
| C65 | 0.66 | 8.5 | 42.7 | 9.7 | 90.3 | 0.0 |
| C66 | 0.212 | 6.2 | 98.1 | 20.7 | 79.4 | 0.0 |
| C67 | 0.437 | 5.8 | 43.9 | 5 | 95.1 | 0.0 |
| C68 | 0.153 | 6.3 | 137.3 | 45 | 55.0 | 0.0 |
| C69 | 0.378 | 5 | 44.4 | 2.6 | 97.4 | 0.0 |
| C70 | 0.61 | 8 | 43.9 | 13.2 | 86.9 | 0.0 |
| C71 | 0.698 | 7.1 | 33.8 | 4.6 | 95.4 | 0.0 |
| C72 | 0.451 | 7.3 | 54.1 | 9.5 | 90.5 | 0.0 |
| C73 | 0.408 | 7.1 | 58.3 | 3.1 | 96.9 | 0.0 |
| C74 | 0.535 | 5.8 | 35.9 | 6.7 | 93.3 | 0.0 |
| C75 | 0.295 | 8.2 | 92.2 | 0.4 | 99.6 | 0.0 |
| C76 | 0.767 | 11.3 | 49.0 | 22.2 | 77.8 | 0.0 |
| C77 | 0.530 | 9.7 | 61.1 | 26.8 | 73.2 | 0.0 |
| C78 | 0.920 | 5.9 | 21.3 | 28.5 | 71.5 | 0.0 |
| C79 | 0.542 | 7.3 | 44.6 | 32.6 | 67.4 | 0.0 |
| C80 | 0.409 | 6.8 | 55.7 | 30.2 | 69.8 | 0.0 |
| C81 | 0.249 | 4.3 | 57.0 | 40.8 | 59.2 | 0.0 |
| C82 | 0.974 | 4.5 | 15.4 | 24.5 | 75.2 | 0.0 |
| C83 | 0.771 | 6.5 | 28.0 | 32.9 | 67.1 | 0.0 |
| C84 | 0.504 | 10.7 | 70.6 | 33.0 | 67.0 | 0.0 |
| C85 | 0.401 | 6.1 | 50.4 | 13.4 | 86.6 | 0.0 |
| C86 | 0.669 | 6.7 | 33.2 | 30.1 | 69.9 | 0.0 |
| C87 | 0.715 | 8.0 | 37.5 | 21.9 | 78.1 | 0.0 |
| 단백질 코드 | VEGF-A에 대한 결합력(증가배수) | PLGF에 대한 결합력(증가배수) | ||||
| fold(KD) | fold(kon) | fold(kdis) | fold(KD) | fold(kon) | fold(kdis) | |
| C61 | 1.35 | 0.74 | 1.83 | 1.24 | 0.76 | 1.62 |
| C62 | > 100 | 1.27 | > 100 | 1.93 | 1.70 | 1.13 |
| C63 | 1.54 | 0.70 | 2.21 | 1.38 | 0.89 | 1.56 |
| C64 | 2.54 | 1.39 | 1.83 | 1.82 | 1.70 | 1.07 |
| C65 | 2.12 | 0.72 | 2.93 | 1.83 | 0.91 | 2.00 |
| C66 | 1.46 | 1.24 | 1.18 | 3.77 | 1.25 | 3.01 |
| C67 | 1.95 | 0.94 | 2.06 | 1.03 | 0.96 | 1.07 |
| C68 | > 100 | 1.83 | > 100 | 1.21 | 2.43 | 0.50 |
| C69 | > 100 | 1.37 | > 100 | 0.83 | 1.24 | 0.67 |
| C70 | 3.01 | 1.20 | 2.52 | 1.38 | 1.30 | 1.06 |
| C71 | 3.06 | 0.99 | 3.10 | 1.43 | 0.82 | 1.75 |
| C72 | 0.95 | 0.82 | 1.15 | 1.48 | 0.70 | 2.11 |
| C73 | > 100 | 1.29 | > 100 | 2.10 | 0.66 | 3.18 |
| C74 | > 100 | 2.09 | > 100 | 1.07 | 2.06 | 0.52 |
| C75 | 0.27 | 1.38 | 0.20 | 0.88 | 2.07 | 0.42 |
| C76 | > 100 | 1.25 | > 100 | 0.82 | 1.75 | 0.47 |
| C77 | > 100 | 1.17 | > 100 | 0.87 | 1.62 | 0.54 |
| C78 | > 100 | 1.37 | > 100 | 0.91 | 1.67 | 0.55 |
| C79 | > 100 | 1.38 | > 100 | 0.82 | 1.39 | 0.59 |
| C80 | > 100 | 1.50 | > 100 | 0.87 | 1.71 | 0.51 |
| C81 | 1.12 | 1.44 | 0.77 | 8.77 | 1.03 | 8.51 |
| C82 | 1.53 | 1.40 | 1.09 | 0.91 | 1.23 | 0.74 |
| C83 | 1.48 | 1.38 | 1.07 | 0.81 | 1.37 | 0.59 |
| C84 | > 100 | 1.38 | > 100 | 0.76 | 1.29 | 0.59 |
| C85 | > 100 | 1.28 | > 100 | 0.84 | 0.97 | 0.86 |
| C86 | > 100 | 1.08 | > 100 | 1.41 | 0.59 | 2.39 |
| C87 | > 100 | 0.93 | > 100 | 0.64 | 1.42 | 0.45 |
| 단백질 코드 | VEGF-A에 대한 결합력(증가배수) | PLGF에 대한 결합력(증가배수) | ||||
| fold(KD) | fold(kon) | fold(kdis) | fold(KD) | fold(kon) | fold(kdis) | |
| C61 | < 0.01 | 0.94 | < 0.01 | 1.53 | 1.14 | 1.35 |
| C62 | 1.83 | 0.55 | 1.00 | 2.39 | 2.54 | 0.94 |
| C63 | < 0.01 | 0.99 | < 0.01 | 1.71 | 1.32 | 1.30 |
| C64 | 0.01 | 0.50 | < 0.01 | 2.26 | 2.54 | 0.89 |
| C65 | < 0.01 | 0.96 | < 0.01 | 2.26 | 1.36 | 1.66 |
| C66 | < 0.01 | 0.56 | < 0.01 | 4.67 | 1.87 | 2.50 |
| C67 | < 0.01 | 0.73 | < 0.01 | 1.27 | 1.43 | 0.89 |
| C68 | 2.65 | 0.38 | 1.00 | 1.49 | 3.63 | 0.41 |
| C69 | 0.42 | 0.51 | 0.21 | 1.03 | 1.86 | 0.56 |
| C70 | 0.01 | 0.58 | < 0.01 | 1.70 | 1.93 | 0.88 |
| C71 | 0.01 | 0.70 | < 0.01 | 1.77 | 1.22 | 1.45 |
| C72 | < 0.01 | 0.84 | < 0.01 | 1.84 | 1.05 | 1.75 |
| C73 | 1.87 | 0.54 | 1.00 | 2.60 | 0.99 | 2.64 |
| C74 | 1.17 | 1.17 | 1.00 | 1.47 | 2.54 | 0.58 |
| C75 | < 0.01 | 0.77 | < 0.01 | 1.20 | 2.56 | 0.47 |
| C76 | 0.69 | 0.69 | 1.00 | 1.13 | 2.16 | 0.52 |
| C77 | 0.65 | 0.65 | 1.00 | 1.19 | 2.00 | 0.60 |
| C78 | 0.76 | 0.76 | 1.00 | 1.25 | 2.06 | 0.61 |
| C79 | 0.77 | 0.77 | 1.00 | 1.13 | 1.72 | 0.66 |
| C80 | 0.84 | 0.84 | 1.00 | 1.20 | 2.11 | 0.57 |
| C81 | < 0.01 | 0.80 | 0.01 | 12.01 | 1.27 | 9.41 |
| C82 | 0.01 | 0.78 | 0.01 | 1.25 | 1.52 | 0.82 |
| C83 | 0.01 | 0.77 | 0.01 | 1.11 | 1.69 | 0.65 |
| C84 | 0.77 | 0.77 | 1.00 | 1.04 | 1.60 | 0.65 |
| C85 | 0.71 | 0.71 | 1.00 | 1.15 | 1.20 | 0.95 |
| C86 | 0.60 | 0.60 | 1.00 | 1.93 | 0.73 | 2.65 |
| C87 | 0.52 | 0.52 | 1.00 | 0.88 | 1.76 | 0.50 |
표 23 내지 표 28의 결과에 따르면, 본 개시의 일 실시태양에 따른 변형된 융합 단백질은 역가 및 단백질 용출량 결과로부터 우수한 생산성을 나타내는 것을 확인할 수 있으며, 기능성 단량체 결과로부터 우수한 물성을 나타내는 것을 확인할 수 있다. 또한 예를 들어, kon 등에 대한 결과로부터, 리간드에 대한 결합력에서도 우수한 특성을 나타냄을 확인할 수 있다. 이러한 결과로부터 실시예 2.1 내지 2.3에서 변형된 융합 단백질의 구조 디자인 시 도입한 특성들이 유효하게 나타나고 이러한 특성들이 조합되어 시너지 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.
실시예 2.5 - 기타 변이체의 제조 및 특성 평가
융합 단백질에서, D3 말단에 위치한 DKA 아미노산 서열은 구조적으로 다량체화 도메인과 연결이 시작되는 부위이며, 링커와 연결되어 루프 형태를 구성하므로 물리적으로 약한 부위에 해당하고 단백질의 발현 및 정제 시 절단이 일어날 가능성이 높다. 단백질의 발현 및 정제 시 물리적으로 약한 부위의 존재로 인해 단편이 생성될 수 있다. 이에 따라 위 실시예 2.1 내지 2.3에서는 대부분의 서열에서 도메인 D3 말단에서 KA를 결실시킨 변형된 융합 단백질을 제조하였다. 도메인 D3 말단에서의 아미노산 서열 결실이, 본 개시의 변형된 융합 단백질의 물성 향상에는 영향을 미치지 않는다는 점을 확인하기 위하여, 도메인 D3의 C 말단과 링커가 연결되는 부위로서, 아미노산 서열 KALE에 관한 결실 변이체를 제조하고 그 물성을 확인하였다. 구체적으로 VEGFR-야생형 단백질(C88)을 기초로 KA 아미노산을 결실시킨 변이체(C89)와 VEGF-Grab3를 기초로 KA 및 KAL을 결실시킨 변이체(C90 및 C91)를 제조하였다.
VEGFR1 세포외 도메인을 포함하는 융합 단백질을 제조할 경우, 발현 벡터의 종류 또는 특성에 따라서 도메인 D2의 N 말단 서열에 변이가 나타날 수 있다. 이러한 변이가 융합 단백질의 물성 등에는 영향을 미치지 않는다는 점을 확인하기 위하여 도메인 D2의 N 말단에 아미노산 변이를 가지는 변이체를 제조하였다. 구체적으로 실시예 2.1 내지 2.3의 변이체들은 모두 벡터로부터 유래한 EF 아미노산 서열을 도메인 D2의 N 말단에 포함하므로, EF 아미노산 서열을 포함하는 변이체(C4 및 C5), EF 아미노산 서열이 결실된 변이체(C8 및 C9)와 N 말단이 본래의 VEGFR1의 서열을 포함하는 SDT로 시작하는 변이체(C6 및 C7)를 제조하였다.
융합 단백질의 제조에 사용되는 다량체화 도메인에서, 서열번호 99을 기준으로 D126E 아미노산 치환, L128M 아미노산 치환 및/또는 K217 아미노산 결실이, 융합 단백질의 물성 또는 효능에는 영향을 미치지 않는 점을 확인하기 위하여 변이체를 제조하였다. 구체적으로 VEGF-Grab3를 기준으로 D126E 아미노산 치환 및 L128M 아미노산 치환을 가지는 변이체(C95) 및 K217 아미노산 결실을 가지는 변이체(C96)를 제조하였다.
위와 같은 추가 변이가 도입된 변형된 융합 단백질을 표 33과 같이 제조하였다. 변이체를 실시예 1에 따라 제조하고 그 물성, 혈청 안정성 또는 VEGF-A 억제능을 평가하였다. 물성은 실시예 1.2에 기재된 방법에 따라 평가하였으며, 혈청 안정성은 실시예 3에 기재된 방법에 따라 평가하였으며, VEGF-A 억제능은 실시예 6에 기재된 방법에 따라 평가하였다. 이러한 평가 결과는 표 29 내지 표 31 및 도 4에 나타내었다.
| 단백질 코드 | 물성 평가 결과 | 혈청 안정성(%) | VEGF-A 억제능 (IC50, μg/ml) | ||
| HMWS(%) | 기능성 단량체 함량(%) | LMWS(%) | |||
| C88 | 73.1 | 22.5 | 4.5 | 6.6 | 0.05284 |
| C89 | 73.9 | 21.4 | 4.7 | 8.8 | 0.17220 |
| VEGF-Grab3 | 60.5 | 34.5 | 5.0 | 12.2 | 0.03341 |
| VEGF-Grab1 | 61.7 | 26.3 | 12.1 | 34.4 | 0.03984 |
| C90 | 59.0 | 35.2 | 5.8 | - | - |
| C91 | 59.2 | 34.4 | 6.4 | - | 0.03890 |
| 단백질 코드 | 역가 (g/L) | 용출량(mg) | 수율(%) | HMWS(%) | 기능성 단량체 함량(%) | LMWS(%) |
| VEGF-Grab1 | 0.527 | 8.6 | 46.7 | 33.1 | 43.0 | 23.8 |
| VEGF-Grab3 | 0.359 | 5.4 | 50.5 | 53.9 | 44.3 | 1.7 |
| C4 | 0.312 | 6.2 | 56.5 | 43.4 | 35.7 | 20.9 |
| C5 | 0.545 | 8.0 | 41.8 | 51.1 | 41.9 | 7.0 |
| C6 | 0.468 | 7.3 | 44.9 | 50.1 | 45.9 | 4.1 |
| C7 | 0.340 | 7.6 | 63.9 | 52.4 | 42.2 | 5.4 |
| C8 | 0.305 | 7.7 | 71.7 | 35.4 | 32.8 | 13.8 |
| C9 | 0.429 | 7.7 | 51.5 | 45.9 | 34.0 | 20.1 |
| 단백질 코드 | 물성 평가 결과 | 혈청 안정성(%) | VEGF-A 억제능 (IC50, μg/ml) | ||
| HMWS(%) | 기능성 단량체 함량(%) | LMWS(%) | |||
| VEGF-Grab3 | 60.5 | 34.5 | 5.0 | 12.2 | 0.03341 |
| C95 | 62.0 | 34.4 | 3.6 | 13.6 | 0.04262 |
| C96 | 65.9 | 30.7 | 3.4 | 15.2 | 0.04143 |
표 29 내지 표 31의 결과에 따르면, 도메인 D3 말단에서의 변이, 도메인 D2의 N 말단에서의 변이 및 다량체화 도메인에서의 변이는 변형된 융합 단백질의 물성 향상, 혈청 안정성 또는 VEGF-A 억제능에 영향이 없음을 확인할 수 있다.
위 실시예 2.1 내지 2.4의 변이체들의 특성을 하기 표 32에 정리하였다.
| 단백질 코드 | 표면 전하 변이 위치 | 링커 서열 | 링커 서열 중 Fc 힌지 유래 | 이황화결합 위치 |
| C10 | K300G | DKTHTCPPCP | IgG1 | - |
| C11 | L243S/R244V | DKTHTCPPCP | IgG1 | - |
| C12 | L243S/R244V/K300G | DKTHTCPPCP | IgG1 | - |
| C13 | K241E/L243S/R244V/H246E | DKTHTCPPCP | IgG1 | - |
| C14 | K241E/L243S/R244V/H246E/K300G | DKTHTCPPCP | IgG1 | - |
| C15 | K300G/Q302T/K304S | DKTHTCPPCP | IgG1 | - |
| C16 | K300G/Q302T/K304S/K306Q | DKTHTCPPCP | IgG1 | - |
| C17 | K241E/L243S/R244V/H246E/K300G/Q302T/K304S/K306Q | DKTHTCPPCP | IgG1 | - |
| C19 | L258S | DKTHTCPPCP | IgG1 | - |
| C20 | L258A | DKTHTCPPCP | IgG1 | - |
| C25 | K241E/L243S/R244V/H246E/L258A/K300G/Q302T/K304S/K306Q | DKTHTCPPCP | IgG1 | - |
| C26 | K241E/L243S/R244V/H246E/L258A/K300G | DKTHTCPPCP | IgG1 | - |
| C27 | K241E/L243S/R244V/H246E/L258A/K300G/Q302T/K304S | DKTHTCPPCP | IgG1 | - |
| C28 | L258A/K300G/Q302T/K304S | DKTHTCPPCP | IgG1 | - |
| C29 | L258A/K300G/Q302T/K304S/K306Q | DKTHTCPPCP | IgG1 | - |
| C30 | K241E/L243S/R244V/H246E/K300G/Q302T/K304S | DKTHTCPPCP | IgG1 | - |
| C32 | - | GSSGDKTHTSPPSP | IgG1 | - |
| C34 | - | GSSGEPKSSDKTYTSPPSP | IgG1 | - |
| C36 | - | GSKVDKKVEPKSSDKTHTCPPCP | IgG1 | - |
| C37 | - | GSKVDKKVEPKSSDKTYTCPPCP | IgG1 | - |
| C39 | - | GSKVDKKVEPKSSDTPPTCPPCP | IgG1 | - |
| C41 | - | GSGGGGSGGGGSGGGGSAESKYGPPCPPCP | IgG4 | - |
| C43 | - | GSNTGSGGEEKKKEKEKEEQEERSSDKTYTCPPCP | IgD/G1 | - |
| C44 | - | GSNTGSGGEEKKKEKEKEEQEERSSDTPPTCPPCP | IgD/G1 | - |
| C45 | - | EGSSGGSSGEPKSDATPTCPPCP | IgG1 | - |
| C46 | - | EGSSGGSSGEPKSDSTYTCPPCP | IgG1 | - |
| C47 | - | GCKVDKKVEPKSSDKTYTCPPCP | IgG1 | K241C/332C |
| C48 | - | GSKVDKKVEPKSSDKTYTCPPCP | IgG1 | L243C/Y329C |
| C49 | - | CSKVDKKVEPKSSDKTYTCPPCP | IgG1 | L243C/331C |
| C50 | - | GSKVDKKVEPKSSDKTYTCPPCP | IgG1 | R244C/Y329C |
| C51 | - | GSKVDKKVEPKSSDKTYTCPPCP | IgG1 | N303C/Y329C |
| C52 | - | GGGGSAEPKAGDKAPPGPPGP | IgG1 | |
| C55 | - | GGGGSAEPKSSDKTYTCPPCP | IgG1 | |
| C56 | - | GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEPKSSDKTYTCPPCP | IgG1 | |
| C61 | K241E/R244V/H246E/L258A/K300G/Q302T/K304S | CSSGDATPTSPPSP | IgG1 | L243C/331C |
| C62 | K241E/R244V/H246E/L258A/K300G/Q302T/K304S | CSKVDKKVEPKSSDTPPTCPPCP | IgG1 | L243C/331C |
| C63 | K241E/R244V/H246E/L258A/K300G/Q302T/K304S | CSGGGGSAEPKAGDATPPTCPPCP | IgG1 | L243C/331C |
| C64 | K241E/R244V/H246E/L258A/K300G/Q302T/K304S | CSGGGGSGGGGSGGGGSAESKYGPPCPPCP | IgG4 | L243C/331C |
| C65 | K241E/R244V/H246E/L258A/K300G/Q302T/K304S | CSNTGSGGEEKKKEKEKEEQEERSSDTPPTCPPCP | IgD/G1 | L243C/331C |
| C66 | K241E/R244V/H246E/L258A/K300G/Q302T/K304S | CGSSGGSSGEPKSDATPTCPPCP | IgG1 | L243C/331C |
| C67 | K241E/R244V/H246E/L258A/K300G/Q302T/K304S | CSKVDKKVEPKSSDKTYTCPPCP | IgG1 | L243C/331C |
| C68 | K241E/R244V/H246E/L258S/K300G/Q302T/K304S | CSKVDKKVEPKSSDTPPTCPPCP | IgG1 | L243C/331C |
| C69 | K241E/R244V/H246E/L258D/K300G/Q302T/K304S | CSKVDKKVEPKSSDTPPTCPPCP | IgG1 | L243C/331C |
| C70 | K241E/R244V/H246E/L258S/K300G/Q302T/K304S | CSGGGGSGGGGSGGGGSAESKYGPPCPPCP | IgG4 | L243C/331C |
| C71 | K241E/R244V/H246E/L258D/K300G/Q302T/K304S | CSGGGGSGGGGSGGGGSAESKYGPPCPPCP | IgG4 | L243C/331C |
| C72 | K241E/R244V/H246E/L258S/K300G/Q302T/K304S | CGSSGGSSGEPKSDATPTCPPCP | IgG1 | L243C/331C |
| C73 | K241E/R244V/H246E/L258D/K300G/Q302T/K304S | CGSSGGSSGEPKSDATPTCPPCP | IgG1 | L243C/331C |
| C74 | K241E/R244V/H246E/L258D/K300G/Q302T/K304S | CSSGDATPTSPPSP | IgG1 | L243C/331C |
| C75 | K241E/R244V/H246E/L258D/K300G/Q302T/K304S | CSNTGSGGEEKKKEKEKEEQEERSSDTPPTCPPCP | IgD/G1 | L243C/331C |
| C76 | L258A/K300G/Q302T/K304S/K306Q | CSSGDATPTSPPSP | IgG1 | L243C/331C |
| C77 | L258A/K300G/Q302T/K304S/K306Q | CSKVDKKVEPKSSDTPPTCPPCP | IgG1 | L243C/331C |
| C78 | L258A/K300G/Q302T/K304S/K306Q | CSGGGGSAEPKAGDATPPTCPPCPPCP | IgG1 | L243C/331C |
| C79 | L258A/K300G/Q302T/K304S/K306Q | CSGGGGSGGGGSGGGGSAESKYGPPCPPCP | IgG4 | L243C/331C |
| C80 | L258A/K300G/Q302T/K304S/K306Q | CSNTGSGGEEKKKEKEKEEQEERSSDTPPTCPPCP | IgD/G1 | L243C/331C |
| C81 | L258A/K300G/Q302T/K304S/K306Q | CGSSGGSSGEPKSDATPTCPPCP | IgG1 | L243C/331C |
| C82 | L258D/K300G/Q302T/K304S/K306Q | CSSGDATPTSPPSP | IgG1 | L243C/331C |
| C83 | L258D/K300G/Q302T/K304S/K306Q | CSKVDKKVEPKSSDTPPTCPPCP | IgG1 | L243C/331C |
| C84 | L258D/K300G/Q302T/K304S/K306Q | CSGGGGSAEPKAGDATPPTCPPCPPCP | IgG1 | L243C/331C |
| C85 | L258D/K300G/Q302T/K304S/K306Q | CSGGGGSGGGGSGGGGSAESKYGPPCPPCP | IgG4 | L243C/331C |
| C86 | L258D/K300G/Q302T/K304S/K306Q | CSNTGSGGEEKKKEKEKEEQEERSSDTPPTCPPCP | IgD/G1 | L243C/331C |
| C87 | L258D/K300G/Q302T/K304S/K306Q | CGSSGGSSGEPKSDATPTCPPCP | IgG1 | L243C/331C |
| C97 | L243S/R244V | LEDKTHTCPPCP | IgG1 | - |
| C98 | K241E/L243S/R244V/H246E | LEDKTHTCPPCP | IgG1 | - |
| C99 | L258A | LEDKTHTCPPCP | IgG1 | - |
| C119 | L258D | LEDKTHTCPPCP | IgG1 | - |
| C100 | K300G/Q302T/K304S/K306Q | LEDKTHTCPPCP | IgG1 | - |
| C101 | L243S/R244V/L258A | LEDKTHTCPPCP | IgG1 | - |
| C102 | L258A/K300G/Q302T/K304S | LEDKTHTCPPCP | IgG1 | - |
| C103 | L258A/K300G/Q302T/K304S/K306Q | LEDKTHTCPPCP | IgG1 | - |
| C104 | K241E/L243S/R244V/H246E/K300G/Q302T/K304S/K306Q | LEDKTHTCPPCP | IgG1 | - |
| C105 | K241E/L243S/R244V/H246E/L258A/K300G/Q302T/K304S/K306Q | LEDKTHTCPPCP | IgG1 | - |
| C106 | K241E/L243S/R244V/H246E/L258A/K300G | LEDKTHTCPPCP | IgG1 | - |
| C107 | K241E/L243S/R244V/H246E/L258A/K300G/Q302T/K304S | LEDKTHTCPPCP | IgG1 | - |
| C108 | - | GSSGDKTHTSPPSP | IgG1 | - |
| C109 | - | GSKVDKKVEPKSSDKTHTCPPCP | IgG1 | - |
| C111 | - | EGSSGGSSGEPKSDATPTCPPCP | IgG1 | - |
| C112 | - | CSKVDKKVEPKSSDKTYTCPPCP | IgG1 | L243C/331C |
| C113 | K241E/R244V/H246E/L258A/K300G/Q302T/K304S | CSNTGSGGEEKKKEKEKEEQEERSSDTPPTCPPCP | IgD/G1 | L243C/331C |
| C114 | K241E/R244V/H246E/L258D/K300G/Q302T/K304S | CGSSGGSSGEPKSDATPTCPPCP | IgG1 | L243C/331C |
| C115 | - | - (본 개시에서 정의하는 링커 존재하지 않음) | - | - |
| C116 | - | GSSGGSSGGSSGGSSGGSSGGSSGGSSGGSSGGSSGGSSGDKTHTCPPCP | IgG1 | - |
| C117 | - | GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCP | IgG1 | - |
| C118 | - | GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCP | IgG1 | - |
표 33에 본 개시에 기술된 단백질들의 식별코드와 아미노산 서열 및 서열번호를 기재하였다.
| 단백질 코드 | 아미노산 서열 | 서열번호 |
| VEGFR1 (FLT1) |
MVSYWDTGVLLCALLSCLLLTGSSSGSKLKDPELSLKGTQHIMQAGQTLHLQCRGEAAHKWSLPEMVSKESERLSITKSACGRNGKQFCSTLTLNTAQANHTGFYSCKYLAVPTSKKKETESAIYIFISDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVQISTPRPVKLLRGHTLVLNCTATTPLNTRVQMTWSYPDEKNKRASVRRRIDQSNSHANIFYSVLTIDKMQNKDKGLYTCRVRSGPSFKSVNTSVHIYDKAFITVKHRKQQVLETVAGKRSYRLSMKVKAFPSPEVVWLKDGLPATEKSARYLTRGYSLIIKDVTEEDAGNYTILLSIKQSNVFKNLTATLIVNVKPQIYEKAVSSFPDPALYPLGSRQILTCTAYGIPQPTIKWFWHPCNHNHSEARCDFCSNNEESFILDADSNMGNRIESITQRMAIIEGKNKMASTLVVADSRISGIYICIASNKVGTVGRNISFYITDVPNGFHVNLEKMPTEGEDLKLSCTVNKFLYRDVTWILLRTVNNRTMHYSISKQKMAITKEHSITLNLTIMNVSLQDSGTYACRARNVYTGEEILQKKEITIRDQEAPYLLRNLSDHTVAISSSTTLDCHANGVPEPQITWFKNNHKIQQEPGIILGPGSSTLFIERVTEEDEGVYHCKATNQKGSVESSAYLTVQGTSDKSNLELITLTCTCVAATLFWLLLTLFIRKMKRSSSEIKTDYLSIIMDPDEVPLDEQCERLPYDASKWEFARERLKLGKSLGRGAFGKVVQASAFGIKKSPTCRTVAVKMLKEGATASEYKALMTELKILTHIGHHLNVVNLLGACTKQGGPLMVIVEYCKYGNLSNYLKSKRDLFFLNKDAALHMEPKKEKMEPGLEQGKKPRLDSVTSSESFASSGFQEDKSLSDVEEEEDSDGFYKEPITMEDLISYSFQVARGMEFLSSRKCIHRDLAARNILLSENNVVKICDFGLARDIYKNPDYVRKGDTRLPLKWMAPESIFDKIYSTKSDVWSYGVLLWEIFSLGGSPYPGVQMDEDFCSRLREGMRMRAPEYSTPEIYQIMLDCWHRDPKERPRFAELVEKLGDLLQANVQQDGKDYIPINAILTGNSGFTYSTPAFSEDFFKESISAPKFNSGSSDDVRYVNAFKFMSLERIKTFEELLPNATSMFDDYQGDSSTLLASPMLKRFTWTDSKPKASLKIDLRVTSKSKESGLSDVSRPSFCHSSCGHVSEGKRRFTYDHAELERKIACCSPPPDYNSVVLYSTPPI | 서열번호 1 |
| VEGF-Grab1 | EFGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVQISTPSPVTLLRGHTLVLNCTATTPLNTRVQMTWSYPDEKNKRASVRRRIDQSNSHANIFYSVLTIDKMQNKDKGLYTCRVRSGPSFKSVNTSVHIYDKALEDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK | 서열번호 2 |
| VEGF-Grab3 | EFGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVQISTPSPVTLLRGHTLVLNCTATTPLNTRVQMTWSYPDEKNKNASVRRRIDQSNSHANIFYSVLTIDKMQNKDKGLYTCRVRSGPSFKSVNTSVHIYDKALEDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK | 서열번호 3 |
| C4 | EFGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVQISTPSPVTLLRGHTLVLNCTATTPLNTRVQMTWSYPDEKNKNASVRRRIDQSNSHANIFYSVLTIDKMQNKDKGLYTCRVRSGPSFKSVNTSVHIYDKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG | 서열번호 4 |
| C5 | EFGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVQISTPSPVTLLRGHTLVLNCTATTPLNTRVQMTWSYPDEKNKNASVRRRIDQSNSHANIFYSVLTIDKMQNKDKGLYTCRVRSGPSFKSVNTSVHIYDKETKTPECPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG | 서열번호 5 |
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| VEGFR1의 Ig 유사 도메인 D2 및 D3 | GRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVQISTPRPVKLLRGHTLVLNCTATTPLNTRVQMTWSYPDEKNKRASVRRRIDQSNSHANIFYSVLTIDKMQNKDKGLYTCRVRSGPSFKSVNTSVHIYDKA | 서열번호 100 |
| 잘트랩 | SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKLEDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG | 서열번호 101 |
[실시예 3] 혈중 모사 환경에서 안정성 평가
본 개시의 변형된 융합 단백질의 생체내 안정성을 간접적으로 분석하기 위해, 래트에서 채취한 공혈청과의 반응을 통하여 특정시간 이후 잔존하는 단백질 변이체의 농도를 ELISA 방법을 통해 측정하였다. 시험 수행 시간 기준 168시간, 96시간, 48시간, 24시간, 4시간, 2시간, 1시간, 0시간 전에 각각 VEGF-Grab3, 변형된 융합 단백질 및 잘트랩(SANOFI; 서열번호 101)을 래트 공혈청과 혼합하여 최종농도 10 μg/ml이 되도록 제조한 후, 37 ℃인큐베이터에 넣어 보관하였다. 시험 수행 전날 4 ℃에서의 오버나잇 배양(Overnight incubation)을 통해 플레이트에 인간 VEGF-A(R&D systems)를 코팅시키고, 이를 0.1% PBS-T 세척 버퍼로 세척하여 충분히 결합되지 않은 인간 VEGF-A를 제거한 후, 5% 탈지유(Skim milk)가 포함된 0.1% PBS-T를 처리하여 실온에서 1 시간의 블로킹(blocking) 과정을 수행하였다. 농도 비교를 위해 사용되는 표준물질은 VEGF-Grab3 및 잘트랩을 각각 50 내지 0.39 μg/ml의 농도로 연속 희석법을 이용하여 제조하였다. 표준물질 연속 희석액과 시간대별로 준비했던 단백질-혈청 혼합물을 블로킹 버퍼에 200배로 희석한 뒤, 플레이트의 웰(well)에 100 μl씩 넣어 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 이후 웰에 담긴 반응액을 모두 제거하고 세척 버퍼를 이용하여 플레이트를 세척하였다. 검출 항체(detection antibody) 인 HRP 고트 항-인간 IgG Fc 교차-흡수 2차 항체(HRP Goat anti-human IgG Fc Cross-Absorbed Secondary antibody)(Invitrogen)를 실온에서 1 시간 반응시킨 후, 세척을 거쳐 반응하지 않은 검출 항체를 제거한 후, 3, 3', 5,5' 테트라메틸벤지딘(TMB) 용액(Sigma)을 100 μl씩 첨가하여 실온에서 10 분간 반응시킨 뒤 정지 용액(Sigma)을 가하여 반응을 멈추었다. 플레이트 리더(Plate reader)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 표준물질(VEGF-Grab3 및 잘트랩)의 흡광도를 기준으로 표준 곡선을 도시(plotting) 한 후 변형된 융합 단백질의 잔존량을 산출하여 상대적으로 비교하였다. 산출된 결과 중, 0시간 농도 대비 168시간(7일 후) 농도를 계산하여 상대 흡광도%를 표 34, 표 35, 및 도 5에 나타내었다.
| 단백질 코드 | 변이체의 상대 흡광도%(7일 후) |
| C88 | 6.6 |
| VEGF-Grab3(파노로스바이오사이언스 제조) | 12.2 |
| VEGF-Grab3(삼성바이오로직스 제조) | 35.5 |
| VEGF-Grab1(파노로스바이오사이언스 제조) | 34.4 |
| C98 | 62.7 |
| C119 | 16.1 |
| C100 | 49.9 |
| C101 | 5.5 |
| C102 | 13.4 |
| C104 | 83.3 |
| C105 | 74.0 |
| C107 | 61.6 |
| C108 | 8.5 |
| C109 | 6.7 |
| C111 | 8.6 |
| C112 | 84.0 |
| C113 | 97.7 |
| C114 | 99.2 |
| C115 | 8.8 |
| C116 | 5.8 |
| C118 | 6.9 |
| C65 | 103.1 |
| C73 | 105.1 |
| 단백질 코드 | 변이체의 상대 흡광도%(7일 후) |
| VEGF-Grab3(파노로스바이오사이언스 제조) | 20.26 |
| VEGF-Grab3(삼성바이오로직스 제조) | 45.52 |
| C61 | 98.35 |
| C62 | 98.69 |
| C63 | 99.34 |
| C64 | 97.43 |
| C65 | 97.42 |
| C66 | 98.04 |
| C67 | 99.99 |
| C68 | 97.17 |
| C69 | 97.19 |
| C70 | 97.83 |
| C71 | 101.48 |
| C72 | 101.28 |
| C73 | 101.4 |
| 잘트랩 | 99.1 |
표 34 및 도 5에 따르면, 본 개시의 변형된 융합 단백질은 혈청내 안정성이 VEGFR-야생형 단백질에 비하여 우수하게 나타났다. 이황화결합을 도입한 C112 변이체의 경우, 동일한 링커 서열을 가지되 이황화결합이 도입되지 않은 C109 변이체의 혈청내 안정성(6.7%)보다 현저히 우수한 혈청내 안정성을 나타내었다. 본 개시의 일 실시태양에 따른 링커 변이체의 링커 길이를 벗어나는 링커 서열을 가지는 변이체 C115, C116, 및 C118의 경우 VEGFR-야생형 단백질에 비해 우수한 혈청내 안정성을 나타내지는 않았다.
표 35에 따르면, 본 개시의 변형된 융합 단백질은 혈청내에서 약 97%를 상회하는 안정성을 나타냈고, 시판 의약품인 잘트랩®과 동등하거나 그보다 우수한 혈청내 안정성을 나타냄을 확인할 수 있었다. 이들은 모두 실험기간 내(7일)에 단백질의 분해 패턴이 관찰되지 않았다. 이러한 결과로부터, 본 개시의 변형된 변형된 융합 단백질은 우수한 체내 안정성을 가지며, 잘트랩®과 비교하였을 때 의약품에 준하는 안정성을 가지고 있음을 확인할 수 있다. 본 개시의 변형된 융합 단백질의 체내 도입 시 물질의 지속기간을 향상시켜 효능에 영향을 미칠 수 있음을 간접적으로 예측할 수 있다.
[실시예 4] 등전점 분석
iclEF(image capillary isoelectric focusing, 이미지 모세관 등전점 시스템) 분석법을 통하여 VEGF-Grab3 및 본 개시의 변형된 융합 단백질의 등전점을 분석하였다. 2 mg/ml의 농도로 희석된 변형된 융합 단백질 40 μl와 미리 준비된 160 ul의 마스터 혼합 용액(Master mix solution)(SERVALYTTM + 저 pI 마커(5.85)(ProteinSimple) + 고 pI 마커(9.99)(ProteinSimple) + 1 % 메틸 셀룰로오스(ProteinSimple) + DW + 500 mM 아르기닌(Sigma) + 200 mM 이미노디아세트산(Sigma) + 10 M 요소(Sigma))을 섞은 뒤 원심분리를 통하여 침전물 및 기포를 제거한 후 기기(Maurice, ProteinSimple) 내 각 웰에 삽입하였다. 양극 용액(Catholyte solution) 및 음극 용액(Anolyte solution)을 각각 2 ml씩 카트리지의 OH- 및 H+ 위치에 담고 카트리지를 기기에 장착하였다. 이후 기기 사용 설명에 따라 등전점을 측정하였다. 측정된 pI가 단일 피크가 아닌, 특정 범위의 다중 피크로 나타나기 때문에 산성(pI 6~7), 중성(pI 7~8), 염기성(pI 8 <)의 세 구간으로 나누어 단백질의 pI 분포도를 정의하였으며, 가장 높은 비율의 분포도를 갖는 구간을 비교하였다. 그 결과를 다음 표 36, 도 6 및 도 7에 나타내었다.
| 총 % | 산성 | 중성 | 염기성 | 합계 |
| VEGF-Grab3(파노로스바이오사이언스 제조) | 18.6 | 81.3 | 99.9 | |
| VEGF-Grab3(삼성바이오로직스 제조) | 48.6 | 51.3 | 99.9 | |
| C61 | 74.5 | 25.5 | 100 | |
| C62 | 51 | 29.8 | 19.3 | 100.1 |
| C64 | 48.8 | 29.2 | 21.8 | 99.8 |
| C65 | 96.8 | 3.4 | 100.2 | |
| C69 | 66.5 | 28.1 | 5.5 | 100.1 |
| C71 | 57.6 | 42.5 | 100.1 | |
| C72 | 51.3 | 48.7 | 100 | |
| C73 | 71.1 | 28.8 | 99.9 | |
| 잘트랩 | 61.8 | 38.2 | 100 |
표 36, 도 6 및 도 7에서 나타내는 바와 같이, 기존물질 VEGF-Grab3는 잘트랩에 비해 광범위하고 높은 pI를 갖는 것으로 측정되었다. 가장 높은 비율의 전하변이체가 존재하는 구간은 염기성 구간(pI 8.0 <)으로 산성 구간(pI 6.0~7.0)에서 가장 높은 분포도를 갖는 잘트랩과는 대조적이다. 본 개시의 변형된 융합 단백질의 경우 염기성 구간의 분포율이 감소하거나(C62), 없어지는(C61, C65, C71, C72, C73) 결과를 나타내었으며 최대 분포를 가지는 구간이 산성 구간으로 이동하였다. 이에 따라 본 개시의 변형된 융합 단백질은 매트릭스 및 세포 표면과의 비특이적 상호작용이 감소될 것으로 기대된다. 또한 이러한 비특이적 상호작용의 감소로 인해 본 개시의 변형된 융합 단백질의 세포내 순환 (recycling)이 개선되고, 본 개시의 변형된 융합 단백질의 체내 반감기 및 효능이 개선될 수 있다.
[실시예 5] 열안정성 분석
VEGF-Grab3 및 본 개시의 변형된 융합 단백질(C62, C72, C73)을 1x PBS 버퍼를 이용하여 최종 2 mg/ml의 농도로 희석하여 준비하였다. 12.5 μl의 단백질에 2.5 μl의 8X 프로틴 써멀 시프트TM 다이(Protein Thermal ShiftTM dye)(Life Technologies)와 5.0 μl 프로틴 써멀 시프트TM 버퍼(Life Technologies)를 첨가하여 최종 반응액을 제조하였다. 준비된 20 μl의 반응액을 PCR 튜브에 담고 퀀트스튜디오TM 리얼-타임 PCR(QuantStudioTM Real-time PCR) 장비의 트레이에 정렬한 뒤 Tm 값을 측정하였다. 모든 분석은 4회 반복실험으로 수행되었다. 각 단백질에 대한 용융 곡선 플롯(melting curve plot) 및 Tm1, Tm2, Tm3 값 결과를 도 8 및 표 37에 나타내었다.
| 단백질 코드 | Tm1 | Tm2 | Tm3 |
| VEGF-Grab3 | 41.83 | 48.50 | 67.55 |
| C62 | 61.51 | - | - |
| C72 | 55.12 | - | - |
| C73 | 52.90 | - | - |
도 8 및 표 37에서 나타내는 바와 같이, 기존 물질인 VEGF-Grab3의 경우 Tm1= 41.83℃, Tm2= 48.50℃, Tm3= 67.55℃의 세 구간에서 녹는점을 갖는 것이 관찰되었다. 본 개시의 변형된 융합 단백질(C62, C72 및 C73)의 경우 단일의 Tm point가 관찰되었으며, VEGF-Grab3의 첫번째 Tm보다 최소 11 ℃에서 최대 20 ℃만큼 Tm이 증가하였다. 이로부터 본 개시의 변형된 융합 단백질이 우수한 열안정성을 보유한다는 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 6] VEGF-A 억제능 분석
VEGF-A에 대한 억제능을 정량적으로 분석하기 위해, VEGFR-2(KDR)의 발현 및 VEGF-A/VEGFR-2 상호작용에 따른 루시퍼라제 리포터 시스템이 도입된 유전자 조작 세포주(KDR/NFAT-RE HEK293, Promega)를 사용하였다. 1.6 x106 세포/ml 밀도의 세포 25 μl를 96 웰 플레이트에 분주한 후, 25 μl의 VEGF-A 용액(33.3 ng/ml 농도) 및 각기 다른 농도로 희석해 둔 25 μl의 VEGF-Grab3 또는 본 개시의 변형된 융합 단백질을 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 6 시간 동안 반응시켰다. 이후 플레이트를 실온에 15분 동안 식힌 다음, 75 μl의 Bio-Glo 시약(Promega, 루시퍼라제 검정 버퍼 + 기질 혼합물)를 첨가하였다. 10분 동안 빛이 차단된 상태에서 반응시킨 후 플레이트 리더기를 이용하여 발광을 측정하였다. GraphPad Prism을 통해 분석하여 각 물질에 대한 IC50 값을 산출하였으며 그 결과를 다음 표 38 내지 표 41 및 도 9에 나타내었다. 도 9c에서 VEGFA stimulation 및 VEGF stimulation 그래프는 아무런 변이체를 처리하지 않고 VEGFA 또는 VEGF만을 처리한 경우의 결과를 의미한다.
표 38 내지 표 41의 데이터는 각각 동일한 조건 및 배치에서 생산된 단백질의 값을 기재한 것이며, 이에 따라 대조군으로 사용된 VEGF-Grab3(파노로스바이오사이언스 제조)의 값을 각각 기재하였다.
| 단백질 코드 | IC50 (μg/ml) |
| C88 | 0.05284 |
| VEGF-Grab3(파노로스바이오사이언스 제조) | 0.03341 |
| VEGF-Grab3(삼성바이오로직스 제조) | 0.02420 |
| VEGF-Grab1(파노로스바이오사이언스 제조) | 0.03984 |
| C98 | 0.03115 |
| C119 | 0.04029 |
| C100 | 0.03051 |
| C101 | 0.04404 |
| C102 | 0.03250 |
| C104 | 0.02661 |
| C107 | 0.02775 |
| C108 | 0.05194 |
| C109 | 0.05478 |
| C111 | 0.04882 |
| C112 | 0.03397 |
| C113 | 0.02993 |
| C114 | 0.03100 |
| C115 | 0.04901 |
| C116 | 0.05728 |
| C65 | 0.02867 |
| C73 | 0.02796 |
| 단백질 코드 | IC50 (μg/ml) |
| VEGF-Grab3(파노로스바이오사이언스 제조) | 0.04353 |
| C61 | 0.03218 |
| C62 | 0.02953 |
| C63 | 0.03275 |
| C64 | 0.03324 |
| C65 | 0.04045 |
| C66 | 0.03915 |
| C67 | 0.02917 |
| C68 | 0.03036 |
| C69 | ND |
| C70 | 0.0349 |
| C71 | 0.03073 |
| C72 | 0.03669 |
| C73 | 0.02925 |
| 단백질 코드 | IC50 (μg/ml) |
| VEGF-Grab3(파노로스바이오사이언스 제조) | 0.01314 |
| C74 | 0.007035 |
| C75 | 0.01365 |
| C76 | 0.007567 |
| C77 | 0.00624 |
| C78 | 0.01083 |
| C79 | 0.00881 |
| C80 | 0.01014 |
| C82 | 0.02168 |
| C83 | 0.01982 |
| C85 | 0.02103 |
| C86 | 0.01932 |
| C87 | 0.01808 |
| 단백질 코드 | IC50 (μg/ml) |
| VEGF-Grab3(파노로스바이오사이언스 제조) | 0.003805 |
| C81 | 0.00268 |
| C84 | 0.006157 |
도 9 및 표 38 내지 표 41에 따르면, VEGF-Grab3와 본 개시의 변형된 융합 단백질은 모두 낮은 수준의 IC50을 나타내어 우수한 VEGF-A 억제능을 가진다는 점을 확인할 수 있다. 본 개시의 일 실시태양에 따른 링커 변이체의 링커 길이를 벗어나는 링커 서열을 가지는 변이체 C115 및 C116의 경우 VEGFR-야생형 단백질에 비해 우수한 VEGF-A 억제능을 나타내지는 않았다.
이상의 설명으로부터, 본 개시가 속하는 기술분야의 통상의 기술자는 본 개시의 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 개시의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 개시의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (43)
- VEGFR1 세포외 도메인, 링커 및 다량체화 도메인을 포함하고,
상기 VEGFR1 세포외 도메인은 VEGFR1의 면역글로불린(Ig) 유사 도메인 D2 및 Ig 유사 도메인 D3을 포함하며, 링커가 Ig 유사 도메인 D3와 다량체화 도메인 사이에 존재하고,
아래 특성 (a) 내지 특성 (c) 중 하나 이상을 가지는 것인, 변형된 융합 단백질.
(a) 도메인 D3의 β1-β2 루프 상의 하나 이상의 아미노산 잔기, 도메인 D3의 β2-β3 루프 상의 하나 이상의 아미노산 잔기, 및/또는 도메인 D3의 β5-β6 루프 상의 하나 이상의 아미노산 잔기가 단백질의 순 pI(net pI)를 감소시키는 아미노산, 측쇄가 음전하를 띄는 아미노산, 또는 측쇄가 정전기적음전하를 갖게 되는 아미노산으로 치환된 것이고,
여기서 도메인 D3의 β1-β2 루프는 서열번호 1의 아미노산 서열의 T236 내지 T247 아미노산 잔기를 포함하고, β2-β3 루프는 서열번호 1의 아미노산 서열의 T256 내지 V262 아미노산 잔기를 포함하고, β5-β6 루프는 서열번호 1의 아미노산 서열의 D299 내지 L308 아미노산 잔기를 포함함;
(b) 링커가 약 13개 내지 약 35개의 아미노산 길이를 가지는 것임; 및
(c) 융합 단백질 내에 이황화결합이 존재하고, 도메인 D3의 β1-β2 루프 상의 아미노산 잔기 중 하나 또는 β5-β6 루프 상의 아미노산 잔기 중 하나와, 도메인 D3의 Y329를 기준으로 -2, -1, 0, +1, +2, 및 +3 위치에 존재하는 아미노산 잔기 중 하나가 시스테인으로 치환되는 것임 - 제1항에 있어서, 특성 (a)에서 아미노산 치환은,
VEGFR2 상동 서열의 아미노산 잔기,
세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 아스파라긴, 글루타민, 아스파르트산, 또는 글루탐산인 아미노산 잔기, 또는
알라닌 또는 글리신인 측쇄가 짧은 아미노산 잔기로 치환된 것인,
변형된 융합 단백질. - 제1항에 있어서, 특성 (a)는 도메인 D3의 β1-β2 루프 상의 하나 이상의 아미노산 잔기, 및 도메인 D3의 β5-β6 루프 상의 하나 이상의 아미노산 잔기가 단백질의 순 pI(net pI)를 감소시키는 아미노산, 측쇄가 음전하를 띄는 아미노산, 또는 측쇄가 정전기적음전하를 갖게 되는 아미노산으로 치환된 것인,
변형된 융합 단백질. - 제3항에 있어서, 특성 (a)는 도메인 D3의 β2-β3 루프 상의 하나 이상의 아미노산 잔기가, 기존의 아미노산 잔기의 측쇄보다 작은 크기를 갖는 아미노산 잔기 또는 유사한 크기의 극성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 치환된 것인,
변형된 융합 단백질. - 제1항에 있어서, 특성 (a)는,
도메인 D3의 β1-β2 루프 상의 K241, L243, R244, 및 H246 아미노산 잔기 중 한 개 이상,
도메인 D3의 β2-β3 루프 상의 L258 아미노산 잔기,
및/또는 도메인 D3의 β5-β6 루프 상의 K300, Q302, K304, 및 K306 아미노산잔기 중 한 개 이상이 치환된 것인,
변형된 융합 단백질. - 제5항에 있어서, 특성 (a)는,
도메인 D3의 β1-β2 루프 상에서 K241T, K241E, L243S, R244V, 및 H246E 중 하나 이상의 아미노산 치환,
도메인 D3의 β2-β3 루프 상에서 L258A, L258S, 또는 L258D의 아미노산 치환, 및/또는
도메인 D3의 β5-β6 루프 상에서 K300G, Q302T, K304S, 및 K306Q 중 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 것인,
변형된 융합 단백질. - 제6항에 있어서, 특성 (a)는,
도메인 D3의 β1-β2 루프 상에서 (i) L243S 및 R244V 아미노산 치환, 또는 (ii) K241E, L243S, R244V, 및 H246E 아미노산 치환,
도메인 D3의 β2-β3 루프 상에서 L258A, L258S, 또는 L258D 아미노산 치환, 및/또는
도메인 D3의 β5-β6 루프 상에서 (i) K300G 아미노산 치환, (ii) K300G, Q302T, 및 K304S 아미노산 치환, 또는 (iii) K300G, Q302T, K304S, 및 K306Q 아미노산 치환을 포함하는 것인,
변형된 융합 단백질. - 제7항에 있어서, 특성 (a)는,
도메인 D3의 β1-β2 루프 상에서 K241E, L243S, R244V, 및 H246E 아미노산 치환;
도메인 D3의 β2-β3 루프 상에서 L258A, L258S, 또는 L258D 아미노산 치환; 및
도메인 D3의 β5-β6 루프 상에서 K300G, Q302T, 및 K304S 아미노산 치환을 포함하는 것인,
변형된 융합 단백질. - 제1항에 있어서,
도메인 D3에서 R238S 및 R275N 아미노산 치환을 포함하는 것인,
변형된 융합 단백질. - 제1항에 있어서,
링커와 연결되는 도메인 D3의 C 말단의 아미노산 서열이 K331 아미노산 잔기를 기준으로 KALE이며, 단 이 경우 아미노산 K, A, L 및 E 중 하나 이상이 결실될 수 있는 것인,
변형된 융합 단백질. - 제1항에 있어서,
도메인 D2의 N 말단이 아미노산 서열 SDT 또는 아미노산 서열 EF으로 시작하는 것인,
변형된 융합 단백질. - 제1항에 있어서, 특성 (b)에서
링커가 약 14개 이상의 아미노산 길이를 가지는 것인,
변형된 융합 단백질. - 제1항에 있어서, 특성 (b)에서
링커가 GS 반복 서열을 포함하고,
상기 GS 반복 서열은 G 및 S로만 이루어진 2 내지 60개 길이의 아미노산 서열이며, 링커의 N 말단의 아미노산이 글루탐산일 수 있는 것인,
변형된 융합 단백질. - 제13항에 있어서,
상기 GS 반복 서열이 (GS)n, (GSSG)n, (GGGGS)n 또는 (GS)m(GGGGS)n 이고,
여기서 n은 1 내지 10의 정수이며, m은 0 내지 10의 정수인,
변형된 융합 단백질. - 제14항에 있어서,
상기 GS 반복 서열이 GS, GSSG, (GSSG)2, GGGGS, (GGGGS)4, GS(GGGGS) 및 GS(GGGGS)3 로 이루어진 군으로부터 선택된 것인,
변형된 융합 단백질. - 제1항에 있어서,
특성 (b)에서 링커가 면역글로불린으로부터 유래한 힌지 영역의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 힌지 영역의 아미노산 서열은 변형될 수 있는 것인,
변형된 융합 단백질. - 제16항에 있어서,
면역글로불린으로부터 유래한 힌지 영역은 CH1 영역으로부터 유래한 서열, 어퍼 힌지(upper hinge) 및/또는 코어 힌지(core hinge)를 포함하는 것인,
변형된 융합 단백질. - 제17항에 있어서,
상기 면역글로불린으로부터 유래한 힌지 영역은 인간 IgA, IgD, IgM, IgE, 또는 IgG 로부터 유래한 것인,
변형된 융합 단백질. - 제16항에 있어서, 특성 (b)에서
면역글로불린으로부터 유래한 힌지 영역에 존재하는 파파인 인식 부위 또는 글리코실화 부위에서 아미노산 변이를 가지는 것인,
변형된 융합 단백질. - 제19항에 있어서, 특성 (b)에서
파파인 인식 부위에서의 아미노산 변이는, 파파인 인식 부위에 존재하는 아미노산 잔기 중 하나 이상을 알라닌, 세린, 티로신, 프롤린, 또는 트레오닌으로 치환하거나 또는 파파인 인식 부위에 방향족 탄소 또는 사이클릭 탄소를 측쇄에 갖는 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 1개 내지 10개의 아미노산 서열을 삽입하는 것이고,
글리코실화 부위에서의 아미노산 변이는, 면역글로불린으로부터 유래한 힌지 영역에 존재하는 세린 또는 트레오닌을, (i) 결실시키거나 또는 (ii) 세린, 아스파라긴 또는 트레오닌 외의 다른 아미노산으로 치환하는 것인,
변형된 융합 단백질. - 제20항에 있어서, 세린, 아스파라긴 또는 트레오닌 외의 다른 아미노산이 글리신 또는 알라닌인,
변형된 융합 단백질. - 제17항에 있어서,
코어 힌지에 존재하는 시스테인이 세린 또는 글리신으로 치환된 것인,
변형된 융합 단백질. - 제1항에 있어서, 특성 (b)에서
링커가 N 말단부터
(i) GS, GSSG, (GSSG)2, GGGGS, (GGGGS)4, GS(GGGGS) 및 GS(GGGGS)3 로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 및
(ii) 인간 IgG1, IgG4 또는 IgD/G1으로 이루어진 군으로부터 선택된 면역글로불린으로부터 유래한 힌지 영역을 순서대로 포함하고,
상기 힌지 영역의 아미노산 서열은 변형될 수 있는 것인,
변형된 융합 단백질. - 제1항에 있어서, 특성 (b)에서
상기 링커가 GSSGDKTHTSPPSP, GSSGEPKSSDKTYTSPPSP, GSKVDKKVEPKSSDKTHTCPPCP, GSKVDKKVEPKSSDKTYTCPPCP, GSKVDKKVEPKSSDTPPTCPPCP, GSGGGGSGGGGSGGGGSAESKYGPPCPPCP, GSNTGSGGEEKKKEKEKEEQEERSSDKTYTCPPCP, GSNTGSGGEEKKKEKEKEEQEERSSDTPPTCPPCP, EGSSGGSSGEPKSDATPTCPPCP, EGSSGGSSGEPKSDSTYTCPPCP, GCKVDKKVEPKSSDKTYTCPPCP, CSKVDKKVEPKSSDKTYTCPPCP, GGGGSAEPKAGDKAPPGPPGP, GGGGSAEPKSSDKTYTCPPCP, GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEPKSSDKTYTCPPCP, CSSGDATPTSPPSP, CSKVDKKVEPKSSDTPPTCPPCP, CSGGGGSAEPKAGDATPPTCPPCP, CSGGGGSGGGGSGGGGSAESKYGPPCPPCP, CSNTGSGGEEKKKEKEKEEQEERSSDTPPTCPPCP, CGSSGGSSGEPKSDATPTCPPCP, 및 CSGGGGSAEPKAGDATPPTCPPCPPCP 로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열인 것인,
변형된 융합 단백질. - 제1항에 있어서, 특성 (c)에서
β1-β2 루프 상의 아미노산 잔기 중 하나가 V240 내지 T247의 아미노산 서열 상의 아미노산 잔기 중 하나인 것인,
변형된 융합 단백질. - 제1항에 있어서, 특성 (c)에서
도메인 D3의 β1-β2 루프 상의 T241, L243, 및 R244 아미노산 잔기 또는 β5-β6 루프 상의 N303 아미노산 잔기 중 하나가 시스테인으로 치환되고,
도메인 D3의 Y329를 기준으로 0, +2, 및 +3 위치에 존재하는 아미노산 잔기 중 하나가 시스테인으로 치환된 것인,
변형된 융합 단백질. - 제26항에 있어서, 특성 (c)에서
T241 및 도메인 D3의 Y329를 기준으로 +3 위치에 존재하는 아미노산 잔기가 시스테인으로 치환되거나;
L243C 및 Y329C 아미노산 변이를 가지거나;
L243 및 도메인 D3의 Y329를 기준으로 +2 위치에 존재하는 아미노산 잔기가 시스테인으로 치환되거나;
R244C 및 Y329C 아미노산 변이를 가지거나; 또는
N303C 및 Y329C 아미노산 변이를 가지는 것인,
변형된 융합 단백질. - 제1항에 있어서,
(a) 도메인 D3의 β1-β2 루프 상에서 K241T, K241E, L243S, R244V, 및 H246E 중 하나 이상의 아미노산 치환,
도메인 D3의 β2-β3 루프 상에서 L258A, L258S, 또는 L258D의 아미노산 치환, 및/또는
도메인 D3의 β5-β6 루프 상에서 K300G, Q302T, K304S, 및 K306Q 중 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고;
(b) 링커가 GSSGDKTHTSPPSP, GSSGEPKSSDKTYTSPPSP, GSKVDKKVEPKSSDKTHTCPPCP, GSKVDKKVEPKSSDKTYTCPPCP, GSKVDKKVEPKSSDTPPTCPPCP, GSGGGGSGGGGSGGGGSAESKYGPPCPPCP, GSNTGSGGEEKKKEKEKEEQEERSSDKTYTCPPCP, GSNTGSGGEEKKKEKEKEEQEERSSDTPPTCPPCP, EGSSGGSSGEPKSDATPTCPPCP, EGSSGGSSGEPKSDSTYTCPPCP, GCKVDKKVEPKSSDKTYTCPPCP, CSKVDKKVEPKSSDKTYTCPPCP, GGGGSAEPKAGDKAPPGPPGP, GGGGSAEPKSSDKTYTCPPCP, GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEPKSSDKTYTCPPCP, CSSGDATPTSPPSP, CSKVDKKVEPKSSDTPPTCPPCP, CSGGGGSAEPKAGDATPPTCPPCP, CSGGGGSGGGGSGGGGSAESKYGPPCPPCP, CSNTGSGGEEKKKEKEKEEQEERSSDTPPTCPPCP, CGSSGGSSGEPKSDATPTCPPCP, 및 CSGGGGSAEPKAGDATPPTCPPCPPCP 로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열이고,
(c) 도메인 D3의 β1-β2 루프 상의 T241, L243, 및 R244 아미노산 잔기 또는 β5-β6 루프 상의 N303 아미노산 잔기 중 하나가 시스테인으로 치환되고,
도메인 D3의 Y329를 기준으로 0, +2, 및 +3 위치에 존재하는 아미노산 잔기 중 하나가 시스테인으로 치환된 것이고,
상기 특성 (a) 내지 (c)를 모두 가지는,
변형된 융합 단백질. - 제1항에 있어서,
(a) 도메인 D3의 β1-β2 루프 상에서 (i) L243S 및 R244V 아미노산 치환, 또는 (ii) K241E, L243S, R244V, 및 H246E 아미노산 치환,
도메인 D3의 β2-β3 루프 상에서 L258A, L258S, 또는 L258D 아미노산 치환, 및/또는
도메인 D3의 β5-β6 루프 상에서 (i) K300G 아미노산 치환, (ii) K300G, Q302T, 및 K304S 아미노산 치환, 또는 (iii) K300G, Q302T, K304S, 및 K306Q 아미노산 치환을 포함하고;
(b) 링커가 CSSGDATPTSPPSP, CSKVDKKVEPKSSDTPPTCPPCP, CSGGGGSAEPKAGDATPPTCPPCP, CSGGGGSGGGGSGGGGSAESKYGPPCPPCP, CSNTGSGGEEKKKEKEKEEQEERSSDTPPTCPPCP, CGSSGGSSGEPKSDATPTCPPCP, CSKVDKKVEPKSSDKTYTCPPCP, 및 CSGGGGSAEPKAGDATPPTCPPCPPCP 로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열이고;
(c) L243 및 도메인 D3의 Y329를 기준으로 +2 위치에 존재하는 아미노산 잔기가 시스테인으로 치환된 것이고,
상기 특성 (a) 내지 (c)를 모두 가지는,
변형된 융합 단백질. - 제1항에 있어서,
(a) 도메인 D3의 β1-β2 루프 상에서 K241E, L243S, R244V, 및 H246E 아미노산 치환,
도메인 D3의 β2-β3 루프 상에서 L258A, L258S, 또는 L258D 아미노산 치환, 및
도메인 D3의 β5-β6 루프 상에서 K300G, Q302T, 및 K304S 아미노산 치환을 포함하고;
(b) 링커가 CSSGDATPTSPPSP, CSKVDKKVEPKSSDTPPTCPPCP, CSGGGGSAEPKAGDATPPTCPPCP, CSGGGGSGGGGSGGGGSAESKYGPPCPPCP, CSNTGSGGEEKKKEKEKEEQEERSSDTPPTCPPCP, CGSSGGSSGEPKSDATPTCPPCP, CSKVDKKVEPKSSDKTYTCPPCP, 및 CSGGGGSAEPKAGDATPPTCPPCPPCP 로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열이고;
(c) L243 및 도메인 D3의 Y329를 기준으로 +2 위치에 존재하는 아미노산 잔기가 시스테인으로 치환된 것이고,
상기 특성 (a) 내지 (c)를 모두 가지는,
변형된 융합 단백질. - 제1항에 있어서, 서열번호 10 내지 서열번호 70, 서열번호 77 내지 서열번호 93 및 서열번호 98로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진, 변형된 융합 단백질.
- 제1항에 있어서, 상기 다량체화 도메인이,
(a) 면역글로불린의 Fc 부위;
(b) IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4의 CH3 부위;
(c) IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4의 CH2 및 CH3 부위;
(d) 서열번호 99와 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린의 Fc 부위; 또는
(e) 서열번호 99의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린의 Fc 부위
인, 변형된 융합 단백질. - 제1항에 있어서, 상기 다량체화 도메인이 면역글로불린의 Fc 부위이며, Fc 부위의 로어 힌지(lower hinge) 영역부터 시작하는 것인,
변형된 융합 단백질. - 제1항에 있어서, 상기 다량체화 도메인이 서열번호 99로 이루어진 IgG1의 Fc 부위인,
변형된 융합 단백질. - 제34항에 있어서, 상기 다량체화 도메인은 서열번호 99에 대해 D126E 아미노산 치환, L128M 아미노산 치환 및/또는 K217 아미노산 결실을 가지는 것인,
변형된 융합 단백질. - 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 이량체 또는 다량체 형태인,
변형된 융합 단백질. - 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항의 변형된 융합 단백질을 유효성분으로서 포함하는, 자가면역 질환, 염증성 질환, 신생물 형성 질환, 암, 혈관신생 관련 질환 또는 안질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물.
- 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항의 변형된 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자.
- 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항의 변형된 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 숙주 세포.
- 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항의 변형된 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터.
- 제40항에 있어서, 재조합 바이러스 벡터인, 벡터.
- 제41항의 재조합 바이러스 벡터를 포함하는, 바이러스 벡터를 대상체에 전달하기 위한 약학적 조성물이며, 여기서 상기 재조합 바이러스 벡터에 의해 암호화된 융합 단백질이 대상체 내에서 발현되며, 자가면역 질환, 염증성 질환, 신생물 형성 질환, 암, 혈관신생 관련 질환 또는 안질환의 예방 또는 치료를 위한 것인, 약학적 조성물.
- 제42항에 있어서, 상기 재조합 바이러스 벡터는 재조합 아데노 관련 바이러스 벡터인, 약학적 조성물.
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