JP2023520922A

JP2023520922A - 活性化可能サイトカイン構築物および関連組成物ならびに方法

Info

Publication number: JP2023520922A
Application number: JP2022561460A
Authority: JP
Inventors: ミトラ，サヤンタン; ジー．ラピュヤード，ニコル; ハイザーアッシ，ヒクマット; エム．ペイドゥンガット，マダン; エル．ダニエル，ディラン; スコラン，エルワンリー; エー．ボグダノフ，ウォルター; カイ，ナー; ワン，シン
Original assignee: シートムエックスセラピューティクス，インコーポレイテッド
Priority date: 2020-04-10
Filing date: 2021-04-09
Publication date: 2023-05-22
Also published as: CA3174786A1; KR20220167295A; IL297225A; WO2021207669A1; CN115667523A; US20220402990A1; EP4133085A1; US11365233B2; US20210317177A1; BR112022020440A2; AU2021254283A1; MX2022012592A

Abstract

本開示で提供されるのは、（ａ）第１の成熟サイトカインタンパク質（ＣＰ１）、第１の切断可能部分（ＣＭ１）、および第１のダイマー化ドメイン（ＤＤ１）を含む第１のモノマー構築物であって、ＣＭ１が、ＣＰ１とＤＤ１の間に配置される、第１のモノマー構築物；および（ｂ）第２の成熟サイトカインタンパク質（ＣＰ２）、第２の切断可能部分（ＣＭ２）、および第２のダイマー化ドメイン（ＤＤ２）を含む第２のモノマー構築物であって、ＣＭ２が、ＣＰ２とＤＤ２の間に配置される、第２のモノマー構築物を含む活性化可能サイトカイン構築物（ＡＣＣ）であり、ＣＭ１およびＣＭ２は、プロテアーゼの基質として機能し、ＤＤ１およびＤＤ２は、相互に結合し、ＡＣＣは、ＣＰ１および／またはＣＰ２の少なくとも１つの活性の対照レベルに比べて、ＣＰ１および／またはＣＰ２の少なくとも１つの活性の低下を特徴とする。【選択図】図５

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年４月１０日に出願の米国特許仮出願第６３／００８，５４２号、２０２１年３月１６日に出願の米国特許仮出願第６３／１６１，８８９号、および２０２１年３月２３日に出願の米国特許仮出願第６３／１６４，８４９号の優先権の利益を主張する。これらの仮出願の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

本出願は、電子データで提出された配列リストを含む。配列表は、「ＣＹＴＸ－０７１－ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」の名称で２０２１年４月７日に作成され、３７９，０００バイトのサイズである。配列表の電子データ中の情報は、本出願の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

発明の分野
本開示は、バイオテクノロジーの分野に関し、より具体的には、活性化可能サイトカイン構築物に関する。

サイトカインは、ウイルス感染および／または他の抗原性刺激に応答してほとんどの有核細胞により産生および分泌される天然起源の小さいタンパク質および糖タンパク質のファミリーである。インターフェロンは、サイトカインのサブクラスである。インターフェロンは、現在３つの主要なクラス：インターフェロンＩ型、インターフェロンＩＩ型、およびインターフェロンＩＩＩ型に分類される。インターフェロンは、細胞表面上の特定の膜受容体に結合することにより、それらの細胞活性を発揮する。

インターフェロン療法は、多くの臨床的有用性を有する。例えば、インターフェロンは、免疫系を上方制御すること、および抗ウイルスおよび抗増殖特性を有することも知られている。これらの生物学的特性は、ウイルス感染症および悪性腫瘍の治療のための治療薬としてのインターフェロンの臨床使用をもたらした。さらに、インターフェロンは、癌細胞を特定および攻撃するために患者の自然免疫系を動員するために有用である。従って、インターフェロン療法は、肝炎、カポジ肉腫、毛様細胞性白血病、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、濾胞性リンパ腫、腎細胞癌（ＲＣＣ）、メラノーマ、および他の病状の治療のためを含む、癌および抗ウイルス療法において広範に使用されてきた。しかし、インターフェロンの全身投与には、特に、強いインフルエンザ様症状、神経学的症状、肝毒性、骨髄抑制、および不整脈を含む用量依存性毒性が付随する。メラノーマ患者の試験では、ペムブロリズマブとペグ化ＩＦＮαの組み合わせは、６０．５％のＯＲＲをもたらした。この併用療法はまた、ペグ化ＩＦＮαの投与量低減を必要とした４９％のＧ３／Ｇ４有害事象にも関連した（Ｄａｖａｒｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，２０１８）。これらの望ましくない副作用は、インターフェロン治療薬の投与量を制限し、ときには、インターフェロン治療の中断または遅延をもたらす。

インターロイキンは、サイトカインの別のサブクラスである。インターロイキンは、細胞増殖、分化、および運動性を調節する。それらは、炎症などの免疫応答の刺激に特に重要である。インターロイキンは、癌、自己免疫疾患、および他の障害の治療に使用されてきた。例えば、インターロイキン－２（ＩＬ－２）は、メラノーマ、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、神経芽腫、腎細胞癌（ＲＣＣ）の治療に適応され、急性冠症候群、急性骨髄症候群、アトピー性皮膚炎、自己免疫性肝疾患、基底細胞癌、膀胱癌、乳癌、カンジダ症、結腸直腸癌、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、子宮内膜腫、ＨＩＶ感染症、虚血性心疾患、関節リウマチ、鼻咽頭腺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、卵巣癌、膵臓癌、全身性エリテマトーデス、結核、および他の障害を含む状態にも有用であると考えられている。特に、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、およびＩＬ－２１などの他のインターロイキンは、癌および他の障害のための可能性のある治療法である。インターロイキン療法には、特に、インフルエンザ様症状、悪心、嘔吐、下痢、低血圧、および不整脈を含む、望ましくない副作用が付随する場合が多い。

従って、所望標的に対する改善された特異性および選択性のサイトカイン療法の必要性および願望は、極めて大きな関心である。疾患部位へのサイトカイン治療薬の増強された標的化は、全身性機序に基づく毒性を減らし、より広範な治療的有用性をもたらすであろう。

本開示は、（ａ）第１の成熟サイトカインタンパク質（ＣＰ１）、第１の切断可能部分（ＣＭ１）、および第１のダイマー化ドメイン（ＤＤ１）を含む第１のモノマーであって、ＣＭ１が、ＣＰ１とＤＤ１の間に配置される、第１のモノマー；および（ｂ）第２の成熟サイトカインタンパク質（ＣＰ２）、第２の切断可能部分（ＣＭ２）、および第２のダイマー化ドメイン（ＤＤ２）を含む第２のモノマーであって、ＣＭ２が、ＣＰ２とＤＤ２の間に配置される、第２のモノマー、を含む活性化可能サイトカイン構築物（ＡＣＣ）を提供し、ＣＭ１およびＣＭ２は、プロテアーゼの基質として機能し、ＤＤ１およびＤＤ２は相互に結合し、ＡＣＣは、ＣＰ１および／またはＣＰ２の少なくとも１つの活性の対照レベルに比べて、ＣＰ１および／またはＣＰ２の少なくとも１つの活性における低下を特徴とする。ＣＭ１およびＣＭ２を切断するプロテアーゼは、健康な組織に比べて、患部組織（例えば、腫瘍組織）で過剰発現され得る。ＡＣＣは、ＣＭ１および／またはＣＭ２の切断時に活性化され、それにより、サイトカインは患部組織中（例えば、腫瘍微小環境中）でその活性を発揮し得るが、一方でサイトカイン活性は健康な組織の状況においては弱められる。従って、本明細書で提供されるＡＣＣは、従来のサイトカイン治療薬に比べて減少した毒性をもたらし、サイトカインのより高い有効投与量を可能にし、および／またはサイトカインの治療濃度域を増大させ得る。

本明細書で提供されるのは、第１のモノマー構築物および第２のモノマー構築物を含む、活性化可能サイトカイン構築物（ＡＣＣ）であり、（ａ）第１のモノマー構築物は、第１の成熟サイトカインタンパク質（ＣＰ１）、第１の切断可能部分（ＣＭ１）、および第１のダイマー化ドメイン（ＤＤ１）を含み、ＣＭ１は、ＣＰ１とＤＤ１の間に配置され；および（ｂ）第２のモノマー構築物は、第２の成熟サイトカインタンパク質（ＣＰ２）、第２の切断可能部分（ＣＭ２）、および第２のダイマー化ドメイン（ＤＤ２）を含み、ＣＭ２は、ＣＰ２とＤＤ２の間に配置され、ＤＤ１およびＤＤ２は相互に結合し、それにより第１のモノマー構築物と第２のモノマー構築物のダイマーを形成し、ＡＣＣは、ＣＰ１および／またはＣＰ２活性の少なくとも１つの対照レベルに比べて、ＣＰ１および／またはＣＰ２活性の少なくとも１つの低下したレベルを有することを特徴とする。

本開示は、（ａ）第１の成熟サイトカインタンパク質（ＣＰ１）、第１のダイマー化ドメイン（ＤＤ１）を含む第１のモノマー；および（ｂ）第２の成熟サイトカインタンパク質（ＣＰ２）、切断可能部分（ＣＭ）、および第２のダイマー化ドメイン（ＤＤ２）を含む第２のモノマーを含む、活性化可能サイトカイン構築物（ＡＣＣ）を提供し、ＣＭは、ＣＰ２とＤＤ２の間に配置され、ＣＭは、プロテアーゼの基質として機能し、ＤＤ１およびＤＤ２は、相互に結合し、ＡＣＣは、ＣＰ１および／またはＣＰ２の少なくとも１つの活性の対照レベルに比べて、ＣＰ１および／またはＣＰ２の少なくとも１つの活性における低下を特徴とする。

本開示は、（ａ）第１の成熟サイトカインタンパク質（ＣＰ１）、切断可能部分（ＣＭ）、および第１のダイマー化ドメイン（ＤＤ１）を含む第１のモノマーであって、ＣＭがＣＰ１とＤＤ１の間に配置される、第１のモノマー；および（ｂ）第２の成熟サイトカインタンパク質（ＣＰ２）、および第２のダイマー化ドメイン（ＤＤ２）を含む第２のモノマー、を含む活性化可能サイトカイン構築物（ＡＣＣ）を提供し、ＣＭは、プロテアーゼの基質として機能し、ＤＤ１およびＤＤ２は、相互に結合し、ＡＣＣは、ＣＰ１および／またはＣＰ２の少なくとも１つの活性の対照レベルに比べて、ＣＰ１および／またはＣＰ２の少なくとも１つの活性における低下を特徴とする。

本開示は、（ａ）第１の成熟サイトカインタンパク質（ＣＰ１）、および第１のダイマー化ドメイン（ＤＤ１）を含む第１のモノマー、および（ｂ）第２の成熟サイトカインタンパク質（ＣＰ２）、および第２のダイマー化ドメイン（ＤＤ２）を含む第２のモノマーを含む、活性化可能サイトカイン構築物（ＡＣＣ）を提供し、ＣＰ１、ＣＰ２、またはＣＰ１およびＣＰ２の両方は、プロテアーゼの基質として機能するアミノ酸配列を含み；ＤＤ１およびＤＤ２は、相互に結合し、ＡＣＣは、ＣＰ１および／またはＣＰ２の少なくとも１つの活性の対照レベルに比べて、ＣＰ１および／またはＣＰ２の少なくとも１つの活性における低下を特徴とする。

本開示のＡＣＣは、ＣＰ１およびＣＰ２がペプチドマスク、例えば、親和性マスキング部分に接続されていないことを特徴とする。

いくつかの実施形態では、第１のモノマー構築物は、ＣＰ１、ＣＭ１、およびＤＤ１を含む第１のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、第２のモノマー構築物は、ＣＰ２、ＣＭ２、およびＤＤ２を含む第２のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＤＤ１およびＤＤ２は、１対のＦｃドメイン；ヒトＩＬ－１５受容体のアルファ鎖（ＩＬ１５Ｒα）由来のスシドメインと可溶性ＩＬ－１５；バルナーゼとバルンスター；プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）とＡ－キナーゼアンカータンパク質（ＡＫＡＰ）；変異ＲＮアーゼＩフラグメントをベースにしたアダプター／ドッキングタグモジュール；エピトープと単一ドメイン抗体単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）；エピトープと単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）；およびタンパク質シンタキシン、シナプトタグミン、シナプトブレビン、およびＳＮＡＰ２５の相互作用に基づく可溶性Ｎ－エチルマレイミド感受性因子付着タンパク質受容体（ＳＮＡＲＥ）モジュール、抗原結合ドメインとエピトープからなる群より選択される対である。

いくつかの実施形態では、ＤＤ１およびＤＤ２は、１対のＦｃドメインである。いくつかの実施形態では、１対のＦｃドメインは、１対のヒトＦｃドメインである。いくつかの実施形態では、ヒトＦｃドメインは、ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメイン、ヒトＩｇＧ２Ｆｃドメイン、ヒトＩｇＧ３Ｆｃドメイン、またはヒトＩｇＧ４Ｆｃドメインである。いくつかの実施形態では、ヒトＦｃドメインは、ヒトＩｇＧ４Ｆｃドメインである。いくつかの実施形態では、ヒトＦｃドメインは、配列番号３と少なくとも８０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＦｃドメインは、配列番号３と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＦｃドメインはそれぞれ、配列番号３を含む。いくつかの実施形態では、ＤＤ１およびＤＤ２は、同じである。いくつかの実施形態では、ＤＤ１およびＤＤ２は、１対の同一のヒトＩｇＧ４Ｆｃドメインである。いくつかの実施形態では、ダイマー化ドメインは、それぞれ配列番号３１５および３１６のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ヒトＦｃドメインは、グリコシル化を排除するためにおよび／またはＦｃ－ガンマ受容体結合を低減するために変異を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＦｃドメインは、変異Ｎ２９７Ｑ、Ｎ２９７Ａ、またはＮ２９７Ｇを含む；いくつかの実施形態では、ヒトＦｃドメインは、位置２３４および／または２３５に変異、例えば、Ｌ２３５Ｅ、またはＬ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ（ＩｇＧ１中で）、またはＦ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ（ＩｇＧ４中で）を含む；いくつかの実施形態では、ヒトＦｃドメインは、変異Ｖ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ｑ／Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、もしくはＰ３３１Ｓ、またはまたはこれらの組み合わせを含む、ＩｇＧ２Ｆｃドメインである（全て、ＥＵナンバリングによる）。

改変ヒトＦｃドメインの追加の例は、当業者に既知である。少なくとも１つのアミノ酸の変異がＦｃ機能の低下をもたらすＩｇ重鎖定常領域アミノ酸の例は、限定されないが、重鎖定常領域のアミノ酸２２８、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３９、２５２、２５４、２５６、２６５、２７０、２９７、３１８、３２０、３２２、３２７、３２９、３３０、および３３１（ＥＵナンバリングによる）での変異を含む。変異アミノ酸の組み合わせの例も、当該技術分野において既知であり、例えば、限定されないが、アミノ酸２３４、２３５、および３３１での変異の組み合わせ、例えば、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、およびＰ３３１Ｓまたは３１８、３２０、および３２２でのアミノ酸変異の組み合わせ、例えば、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２０Ａ、およびＫ３２２Ａを含む。

改変Ｆｃドメインのさらなる例としては、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６ＩｇＧ１；Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２ＥＩｇＧ１；Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０ＬＩｇＧ１；Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ；１つの重鎖で、Ｌ２３４Ｙ／Ｌ２３５Ｑ／Ｇ２３６Ｗ／Ｓ２３９Ｍ／Ｈ２６８Ｄ／Ｄ２７０Ｅ／Ｓ２９８ＡＩｇＧ１、および相対する重鎖で、Ｄ２７０Ｅ／Ｋ３２６Ｄ、Ａ３３０Ｍ／Ｋ３３４ＥＩｇＧ；Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２ＥＩｇＧ１；Ｋ３２６Ｗ／Ｅ３３３ＳＩｇＧ１；Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４ＴＩｇＧ１；Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０ＹＩｇＧ１；Ｎ２９７ＡまたはＮ２９７ＱまたはＮ２９７ＧＩｇＧ１；Ｌ２３５ＥＩｇＧ１；Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５ＡＩｇＧ１；Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５ＡＩｇＧ４；Ｈ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１ＳＩｇＧ２；Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１ＳＩｇＧ２；Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６ＥＩｇＧ１；Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４ＳＩｇＧ１；Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８ＦＩｇＧ１；Ｎ３２５Ｓ／Ｌ３２８ＦＩｇＧ１、などが挙げられる。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃドメインは、Ｎ２９７ＡＩｇＧ１、Ｎ２９７ＱＩｇＧ１、およびＳ２２８ＰＩｇＧ４、からなる群より選択される１つまたは複数の置換を含む。

いくつかの実施形態では、ＤＤ１は、抗原結合ドメインを含み、ＤＤ２は、対応するエピトープを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、抗Ｈｉｓタグ抗原結合ドメインであり、ＤＤ２はＨｉｓタグを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）である。いくつかの実施形態では、ＤＤ１およびＤＤ２の少なくとも１つは、非ポリペプチドポリマーおよび小分子からなる群より選択されるダイマー化ドメイン置換基を含む。いくつかの実施形態では、ＤＤ１およびＤＤ２は、相互に共有結合した非ポリペプチドポリマーを含む。いくつかの実施形態では、非ポリペプチドポリマーは、硫黄含有ポリエチレングリコールであり、ＤＤ１およびＤＤ２は、１つまたは複数のジスルフィド結合を介して相互に共有結合している。いくつかの実施形態では、ＤＤ１およびＤＤ２の少なくとも１つは、小分子を含む。いくつかの実施形態では、小分子は、ビオチンである。いくつかの実施形態では、ＤＤ１は、ビオチンを含み、ＤＤ２は、アビジンを含む。

いくつかの実施形態では、ＣＰ１およびＣＰ２は、成熟サイトカインである。いくつかの実施形態では、ＣＰ１およびＣＰ２のそれぞれは、成熟サイトカイン配列を含み、シグナルペプチド（本明細書においては、「シグナル配列」とも呼ばれる）をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＰ１および／またはＣＰ２は、インターフェロン、インターロイキン、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＣＤ１５４、ＬＴ－β、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β、４－１ＢＢＬ、ＡＰＲＩＬ、ＣＤ７０、ＣＤ１５３、ＣＤ１７８、ＧＩＴＲＬ、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＡＬＬ－１、ＴＲＡＩＬ、ＴＷＥＡＫ、ＴＲＡＮＣＥ、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β３、Ｅｐｏ、Ｔｐｏ、Ｆｌｔ－３Ｌ、ＳＣＦ、Ｍ－ＣＳＦ、およびＭＳＰからなる群よりそれぞれ個別に選択される。ＣＰ１および／またはＣＰ２は、野性型ヒトまたは非ヒト動物配列、変異体配列、短縮配列、ハイブリッド配列、または挿入を含む配列であり得る。いくつかの実施形態では、ＣＰ１およびＣＰ２は、同じである。いくつかの実施形態では、ＣＰ１およびＣＰ２は、異なり、本開示は、本明細書に記載されたサイトカインタンパク質のいずれか２つの選択および組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＣＰ１および／またはＣＰ２は、インターフェロンである。いくつかの実施形態では、ＣＰ１およびＣＰ２は両方、インターフェロンである。いくつかの実施形態では、ＣＰ１およびＣＰ２は、異なるインターフェロンである。いくつかの実施形態では、ＣＰ１およびＣＰ２は、同じインターフェロンである。いくつかの実施形態では、ＣＰ１またはＣＰ２は、インターフェロンである。いくつかの実施形態では、ＣＰ１またはＣＰ２の１つは、インターフェロンであり、ＣＰ１またはＣＰ２の残りは、インターフェロン以外のサイトカインである。いくつかの態様では、サイトカインの片方または両方は、モノマーサイトカインである。いくつかの態様では、インターフェロンの片方または両方は、モノマーインターフェロンである。いくつかの態様では、ＣＰ１またはＣＰ２は、モノマーインターフェロンであり、ＣＰ１またはＣＰ２の残りは、異なるサイトカインである。いくつかの態様では、ＣＰ１および／またはＣＰ２は、変異体サイトカイン配列を含む。いくつかの態様では、ＣＰ１および／またはＣＰ２は、ユニバーサルサイトカイン配列を含む。いくつかの態様では、ＣＰ１および／またはＣＰ２は、サイトカイン活性を保持する短縮配列を含む。

いくつかの実施形態では、インターフェロンは、ヒト野生型成熟インターフェロンである。いくつかの実施形態では、インターフェロンは、Ｉ型およびＩＩ型インターフェロンであってよく、例えば、限定されないが、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンω、インターフェロンγ、およびインターフェロンτを含む。いくつかの実施形態では、インターフェロンは、インターフェロンαである。いくつかの実施形態では、インターフェロンは、インターフェロンα２ａ、インターフェロンα２ｂ、およびインターフェロンα－ｎ３からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、インターフェロンは、インターフェロンα２ｂである。いくつかの実施形態では、インターフェロンは、変異体インターフェロンである。いくつかの実施形態では、インターフェロンは、変異体インターフェロンであり、内因性プロテアーゼ切断部位は、１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失、または挿入により機能不全にされている。いくつかの実施形態では、インターフェロンは、例えば、異なるサイトカインサブタイプのハイブリッド配列またはキメラサイトカイン配列またはヒト化サイトカイン配列を有するユニバーサルサイトカイン分子である。いくつかの実施形態では、インターフェロンは、ユニバーサルインターフェロン分子である。いくつかの実施形態では、インターフェロンは、ユニバーサルインターフェロンα、例えば、インターフェロンα１とインターフェロンα２ｂのハイブリッドである。いくつかの実施形態では、ＣＰ１および／またはＣＰ２は、配列番号１と少なくとも８０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＰ１および／またはＣＰ２は、配列番号１と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＰ１および／またはＣＰ２は、配列番号１の配列を含む。いくつかの実施形態では、インターフェロンは、インターフェロンβである。いくつかの実施形態では、インターフェロンβは、インターフェロンβ－１ａ、およびインターフェロンβ－１ｂからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、ＣＰ１および／またはＣＰ２は、ＩＦａｂドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＰ１および／またはＣＰ２は、インターロイキンを含む。いくつかの実施形態では、インターロイキンは、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－１ＲＡ、ＩＬ－１８、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－３、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１０、ＩＬ－２０、ＩＬ－１４、ＩＬ－１６、およびＩＬ－１７からなる群より選択される。

いくつかの実施形態では、ＣＭ１および／またはＣＭ２は、合計約３アミノ酸～約１５アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭ１およびＣＭ２は、異なるプロテアーゼのための基質を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭ１およびＣＭ２は、同じ長さであり、同じアミノ酸配列を含む。。いくつかの実施形態では、ＣＭ１およびＣＭ２は、同じプロテアーゼのための基質を含む。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、次記からなる群より選択される：ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭ１５、ＡＤＡＭ１７／ＴＡＣＥ、ＡＤＡＭＤＥＣ１、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＤＡＭＴＳ５、ＢＡＣＥ、レニン、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、カスパーゼ１４、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＫ、カテプシンＬ、カテプシンＳ、カテプシンＶ／Ｌ２、カテプシンＸ／Ｚ／Ｐ、クルジパイン、レグマイン、オツバイン－２、ＫＬＫ４、ＫＬＫ５、ＫＬＫ６、ＫＬＫ７、ＫＬＫ８、ＫＬＫ１０、ＫＬＫ１１、ＫＬＫ１３、ＫＬＫ１４、メプリン、ネプリライシン、ＰＳＭＡ、ＢＭＰ－１、マトリックスメタロプロテアーゼ（例えば、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－３、ＭＭＰ－７、ＭＭＰ－９、ＭＭＰ－１０、ＭＭＰ－１１、ＭＭＰ－１２、ＭＭＰ－１３、ＭＭＰ－１４、ＭＭＰ－１５、ＭＭＰ－１６、ＭＭＰ－１７、ＭＭＰ－１９、ＭＭＰ－２０、ＭＭＰ－２３、ＭＭＰ－２４、ＭＭＰ－２６、ＭＭＰ－２７）、活性化タンパク質Ｃ、カテプシンＡ、カテプシンＧ、キマーゼ、ＦＶＩＩａ、ＦＩＸａ、ＦＸａ、ＦＸＩａ、ＦＸＩＩａ、エラスターゼ、グランザイムＢ、グアニジノベンゾアターゼ、ＨｔｒＡ１、ヒト好中球リアーゼ、ラクトフェリン、マラプシン、ＮＳ３／４Ａ、ＰＡＣＥ４、プラスミン、ＰＳＡ、ｔＰＡ、トロンビン、トリプターゼ、ｕＰＡ、ＤＥＳＣ１、ＤＰＰ－４、ＦＡＰ、ヘプシン、マトリプターゼ－２、ＭＴ－ＳＰ１／マトリプターゼ、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＭＰＲＳＳ３、およびＴＭＰＲＳＳ４。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、ｕＰＡ、レグマイン、ＭＴ－ＳＰ１、ＡＤＡＭ１７、ＢＭＰ－１、ＴＭＰＲＳＳ３、ＴＭＰＲＳＳ４、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－９、ＭＭＰ－１２、ＭＭＰ－１３、およびＭＭＰ－１４からなる群より選択される。

好適な切断可能部分は、国際公開第２０１０／０８１１７３号、国際公開第２０１５／０４８３２９号、国際公開第２０１５／１１６９３３号、国際公開第２０１６／１１８６２９号、および国際公開第２０２０／１１８１０９号で開示されている。これらの特許の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、ＣＭ１および／またはＣＭ２は、次記からなる群より選択される配列を含む：ＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号５）、ＴＧＲＧＰＳＷＶ（配列番号６）、ＰＬＴＧＲＳＧＧ（配列番号７）、ＴＡＲＧＰＳＦＫ（配列番号８）、ＮＴＬＳＧＲＳＥＮＨＳＧ（配列番号９）、ＮＴＬＳＧＲＳＧＮＨＧＳ（配列番号１０）、ＴＳＴＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号１１）、ＴＳＧＲＳＡＮＰ（配列番号１２）、ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ（配列番号１３）、ＡＶＧＬＬＡＰＰ（配列番号１４）、ＡＱＮＬＬＧＭＶ（配列番号１５）、ＱＮＱＡＬＲＭＡ（配列番号１６）、ＬＡＡＰＬＧＬＬ（配列番号１７）、ＳＴＦＰＦＧＭＦ（配列番号１８）、ＩＳＳＧＬＬＳＳ（配列番号１９）、ＰＡＧＬＷＬＤＰ（配列番号２０）、ＶＡＧＲＳＭＲＰ（配列番号２１）、ＶＶＰＥＧＲＲＳ（配列番号２２）、ＩＬＰＲＳＰＡＦ（配列番号２３）、ＭＶＬＧＲＳＬＬ（配列番号２４）、ＱＧＲＡＩＴＦＩ（配列番号２５）、ＳＰＲＳＩＭＬＡ（配列番号２６）、ＳＭＬＲＳＭＰＬ（配列番号２７）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号２８）、ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号２９）、ＩＳＳＧＬＬＳＳＧＧＳＧＧＳＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号３０）、ＬＳＧＲＳＧＮＨ（配列番号３１）、ＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号３２）、ＬＳＧＲＳＤＤＨ（配列番号３３）、ＬＳＧＲＳＤＩＨ（配列番号３４）、ＬＳＧＲＳＤＱＨ（配列番号３５）、ＬＳＧＲＳＤＴＨ（配列番号３６）、ＬＳＧＲＳＤＹＨ（配列番号３７）、ＬＳＧＲＳＤＮＰ（配列番号３８）、ＬＳＧＲＳＡＮＰ（配列番号３９）、ＬＳＧＲＳＡＮＩ（配列番号４０）、ＬＳＧＲＳＤＮＩ（配列番号４１）、ＭＩＡＰＶＡＹＲ（配列番号４２）、ＲＰＳＰＭＷＡＹ（配列番号４３）、ＷＡＴＰＲＰＭＲ（配列番号４４）、ＦＲＬＬＤＷＱＷ（配列番号４５）、ＩＳＳＧＬ（配列番号４６）、ＩＳＳＧＬＬＳ（配列番号４７）、ＩＳＳＧＬＬ（配列番号４８）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号４９）、ＡＶＧＬＬＡＰＰＴＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号５０）、ＡＶＧＬＬＡＰＰＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号５１）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＤＨ（配列番号５２）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＩＨ（配列番号５３）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＱＨ（配列番号５４）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＴＨ（配列番号５５）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＹＨ（配列番号５６）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＮＰ（配列番号５７）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＡＮＰ（配列番号５８）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＡＮＩ（配列番号５９）、ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＤＨ（配列番号６０）、ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＩＨ（配列番号６１）、ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＱＨ（配列番号６２）、ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＴＨ（配列番号６３）、ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＹＨ（配列番号６４）、ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＮＰ（配列番号６５）、ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＡＮＰ（配列番号６６）、ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＡＮＩ（配列番号６７）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＮＩ（配列番号６８）、ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＮＩ（配列番号６９）、ＧＬＳＧＲＳＤＮＨＧＧＡＶＧＬＬＡＰＰ（配列番号７０）、ＧＬＳＧＲＳＤＮＨＧＧＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ（配列番号７１）、ＬＳＧＲＳＤＮＨＧＧＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ（配列番号７２）、ＩＳＳＧＬＳＳ（配列番号７３）、ＰＶＧＹＴＳＳＬ（配列番号７４）、ＤＷＬＹＷＰＧＩ（配列番号７５）、ＬＫＡＡＰＲＷＡ（配列番号７６）、ＧＰＳＨＬＶＬＴ（配列番号７７）、ＬＰＧＧＬＳＰＷ（配列番号７８）、ＭＧＬＦＳＥＡＧ（配列番号７９）、ＳＰＬＰＬＲＶＰ（配列番号８０）、ＲＭＨＬＲＳＬＧ（配列番号８１）、ＬＬＡＰＳＨＲＡ（配列番号８２）、ＧＰＲＳＦＧＬ（配列番号８３）、ＧＰＲＳＦＧ（配列番号８４）、ＳＡＲＧＰＳＲＷ（配列番号８５）、ＧＧＷＨＴＧＲＮ（配列番号８６）、ＨＴＧＲＳＧＡＬ（配列番号８７）、ＡＡＲＧＰＡＩＨ（配列番号８８）、ＲＧＰＡＦＮＰＭ（配列番号８９）、ＳＳＲＧＰＡＹＬ（配列番号９０）、ＲＧＰＡＴＰＩＭ（配列番号９１）、ＲＧＰＡ（配列番号９２）、ＧＧＱＰＳＧＭＷＧＷ（配列番号９３）、ＦＰＲＰＬＧＩＴＧＬ（配列番号９４）、ＳＰＬＴＧＲＳＧ（配列番号９５）、ＳＡＧＦＳＬＰＡ（配列番号９６）、ＬＡＰＬＧＬＱＲＲ（配列番号９７）、ＳＧＧＰＬＧＶＲ（配列番号９８）、ＰＬＧＬ（配列番号９９）、およびＳＧＲＳＤＮＩ（配列番号１００）。いくつかの実施形態では、ＣＭは、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号２８）、ＬＳＧＲＳＤＤＨ（配列番号３３）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＱＨ（配列番号５４）、ＳＧＲＳＤＮＩ（配列番号１００）、およびＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＮＩ（配列番号６８）からなる群より選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、対象の腫瘍により産生され、例えば、プロテアーゼは、対象の健康な組織中より、腫瘍中でより多い量で産生される。いくつかの実施形態では、対象は、癌を有すると診断または特定されている。

いくつかの実施形態では、ＣＰ１およびＣＭ１は、第１のモノマー構築物中で相互に直接に隣接している。いくつかの実施形態では、ＣＭ１およびＤＤ１は、第１のモノマー構築物中で相互に直接に隣接している。いくつかの実施形態では、ＣＰ２およびＣＭ２は、第２のモノマー構築物中で相互に直接に隣接している。いくつかの実施形態では、ＣＭ２およびＤＤ２は、第２のモノマー構築物中で相互に直接に隣接している。いくつかの実施形態では、第１のモノマー構築物は、ＣＭ１に直接隣接するＣＰ１、およびＤＤ１に直接隣接するＣＭ１を含み、ＣＭ１は、配列番号５～１００からなる群より選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のモノマー構築物は、ＣＭ２に直接隣接するＣＰ２、およびＤＤ２に直接隣接するＣＭ２を含み、ＣＭ２は、配列番号５～１００からなる群より選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のモノマー構築物は、ＣＭ１に直接隣接するＣＰ１、およびＤＤ１に直接隣接するＣＭ１を含み、ＣＭ１は、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５または４アミノ酸長以下である配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のモノマー構築物は、ＣＭ２に直接隣接するＣＰ２、およびＤＤ２に直接隣接するＣＭ２を含み、ＣＭ２は、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５または４アミノ酸長以下である配列を含む。いくつかの実施形態では、第１および第２のモノマー構築物は、サイトカイン（それぞれＣＭ１およびＣＭ２）が１０、９、８、７、６、５、または４アミノ酸長以下である切断可能部分（それぞれＣＭ１およびＣＭ２）に直接に隣接し、切断可能部分がヒトＩｇＧのＦｃ領域であるダイマー化ドメイン（それぞれＤＤ１およびＤＤ２）に直接に隣接するように構成され、Ｆｃ領域のＮ末端は、ＮからＣ方向に読み取られるヒンジ領域中の第１のシステイン残基（例えば、ＥＵナンバリングを用いて、ヒトＩｇＧ１のシステイン２２６）である。いくつかの態様では、ダイマー化ドメインは、ＩｇＧＦｃ領域であり、上部ヒンジ残基は、除去されている。例えば、Ｆｃは、バリアントであり、Ｎ末端配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴ（配列番号５１６）、ＥＲＫ、ＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴ（配列番号５１７）、またはＥＳＫＹＧＰＰ（配列番号５１８）は除去されている。

いくつかの実施形態では、第１のモノマー構築物は、少なくとも１つのリンカーを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのリンカーは、ＣＰ１とＣＭ１の間に配置されるリンカーＬ１および／またはＣＭ１とＤＤ１の間に配置されるリンカーＬ２である。いくつかの実施形態では、第２のモノマー構築物は、少なくとも１つのリンカーを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのリンカーは、ＣＰ２とＣＭ２の間に配置されるリンカーＬ３および／またはＣＭ２とＤＤ２の間に配置されるリンカーＬ４である。いくつかの実施形態では、第１のモノマー構築物は、リンカーＬ１を含み、第２のモノマー構築物は、リンカーＬ３を含む。いくつかの実施形態では、Ｌ１およびＬ３は、同じである。いくつかの実施形態では、第１のモノマー構築物は、リンカーＬ２を含み、第２のモノマー構築物は、リンカーＬ４を含む。いくつかの実施形態では、Ｌ２およびＬ４は、同じである。いくつかの実施形態では、各リンカーは、１アミノ酸～約１５アミノ酸の全長を有する。いくつかの実施形態では、各リンカーは、少なくとも５アミノ酸の全長を有する。本明細書で使用される場合、「リンカー」という用語は、アミノ酸配列がプロテアーゼの基質ではないペプチドを指す。

いくつかの実施形態では、第１のモノマー構築物は、少なくとも１つのリンカーを含み、各リンカーは、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧ（配列番号２１０）；ＧＧＧＳ（配列番号２）；ＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号２１１）；ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号２１２）；ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２１３）；ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２１４）；ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２１５）；ＧＧＧＧＳ（配列番号２１６）；ＧＳ；ＧＧＧＧＳＧＳ（配列番号２１７）；ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＳ（配列番号２１８）；ＧＧＳＬＤＰＫＧＧＧＧＳ（配列番号２１９）；ＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧ（配列番号２２０）；ＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧ（配列番号２２１）；ＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳ（配列番号２２２）；ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＫＧ（配列番号２２３）；ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＳＧＳＴＫＧ（配列番号２２４）；ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号２２５）；ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＳＥＧＳＴ（配列番号２２６）；（ＧＳ）ｎ、（ＧＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号２２７）、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２２８）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２１６）、式中、ｎは少なくとも１の整数である；ＧＧＳＧ（配列番号２２９）；ＧＧＳＧＧ（配列番号２３０）；ＧＳＧＳＧ（配列番号２３１；ＧＳＧＧＧ（配列番号２３２）；ＧＧＧＳＧ（配列番号２３３）；ＧＳＳＳＧ（配列番号２３４）；ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２１３）；ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２１４）；およびＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＳＥＧＳＴ（配列番号２２６）からなる群から独立に選択される。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＳ（配列番号２）の配列を含む。

本明細書で使用される場合、「スペーサー」という用語は、本明細書では、成熟ＡＣＣの遊離末端、例えば、シグナルペプチドと成熟ＡＣＣのＮ末端の間、に組み込まれたアミノ酸残基またはペプチドを指す。いくつかの態様では、スペーサー（または「ヘッダー」は、グルタミン（Ｑ）残基を含んでよい。いくつかの態様では、スペーサー中の残基は、アミノペプチダーゼおよび／またはエキソペプチダーゼ作用を最小化して、Ｎ末端アミノ酸の切断を防止する。例示的な非限定的スペーサーアミノ酸配列は、次の例示的アミノ酸配列のいずれかを含む、またはいずれかからなる：ＱＧＱＳＧＳ（配列番号５０４）；ＧＱＳＧＳ（配列番号５０５）；ＱＳＧＳ（配列番号５０６）；ＳＧＳ；ＧＳ；Ｓ；ＱＧＱＳＧＱＧ（配列番号５０７）；ＧＱＳＧＱＧ（配列番号５０８）；ＱＳＧＱＧ（配列番号５０９）；ＳＧＱＧ（配列番号５１０）；ＧＱＧ；ＱＧ；Ｇ；ＱＧＱＳＧＱ（配列番号５１１）；ＧＱＳＧＱ（配列番号５１２）；ＱＳＧＱ（配列番号５１３）；ＱＧＱＳＧ（配列番号５１４）；ＱＧＱＳ（配列番号５１５）；ＳＧＱ；ＧＱ；およびＱ。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、取り除かれ得る。

いくつかの実施形態では、第１のモノマー構築物は、ＮからＣ末端方向に、ＣＰ１、ＣＭ１、およびＣＭ１のＣ末端に直接または間接的に連結される、ＤＤ１を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、ＣからＮ末端方向に、ＣＰ１、ＣＭ１、およびＣＭ１のＮ末端に直接または間接的に連結される、ＤＤ１を含む。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチドは、ＮからＣ末端方向に、ＣＰ２、ＣＭ２、およびＣＭ２のＣ末端に直接または間接的に連結される、ＤＤ２を含む。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチドは、ＣからＮ末端方向に、ＣＰ２、ＣＭ２、およびＣＭ２に直接または間接的に連結される、ＤＤ２を含む。

いくつかの実施形態では、第１のモノマー構築物は、ＮからＣ末端方向に、ＣＰ１、オプションのリンカー、ＣＭ１、オプションのリンカー、およびＤＤ１を含み、ＤＤ１は、ＩｇＧのＦｃ領域であり、Ｆｃ領域のＮ末端は、ＮからＣ方向に読み取られるヒンジ領域中の第１のシステイン残基（例えば、ＥＵナンバリングによる、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４のシステイン２２６）であり、ＣＰ１とＤＤ１のＮ末端システインの間に配置されるＣＭ１および任意のリンカーは、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、または４アミノ酸以下、好ましくは１０アミノ酸以下、特に好ましくは７アミノ酸以下の合わせた全長を有する。いくつかの実施形態では、第２のモノマー構築物は、ＮからＣ末端方向に、ＣＰ２、オプションのリンカー、ＣＭ２、オプションのリンカー、およびＤＤ２を含み、ＤＤ２は、ＩｇＧのＦｃ領域であり、Ｆｃ領域のＮ末端は、ＮからＣ方向に読み取られるヒンジ領域中の第１のシステイン残基（例えば、ＥＵナンバリングによる、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４のシステイン２２６）であり、ＣＰ２とＤＤ２のＮ末端システインの間に配置されるＣＭ２および任意のリンカーは、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、または４アミノ酸以下、好ましくは１０アミノ酸以下、特に好ましくは７アミノ酸以下の合わせた全長を有する。

いくつかの実施形態では、ＡＣＣは、第１のモノマー構築物と第２のモノマー構築物が同一であるホモダイマーであり、配列番号３１３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のモノマー構築物および第２のモノマー構築物はそれぞれ、配列番号３１３と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のモノマー構築物および第２のモノマー構築物はそれぞれ、ＮからＣ末端方向に、配列番号１；配列番号４１、配列番号６８、および配列番号１００からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＭ；およびダイマー化ドメインを含む。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＣＰ１および／またはＣＰ２活性は、表面プラズモン共鳴法を用いて測定されるＣＰ１および／またはＣＰ２のその同族受容体に対する結合親和性（Ｋ_Ｄ）である。例えば、ＣＰ１またはＣＰ２がインターフェロンである場合、同族受容体は、インターフェロンα／β受容体（ＩＦＮＡＲ）であり得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＣＰ１および／またはＣＰ２活性は、リンパ腫細胞の増殖のレベルである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＣＰ１および／またはＣＰ２活性は、リンパ腫細胞中のＪＡＫ／ＳＴＡＴ／ＩＳＧＦ３経路活性化のレベルである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの活性は、リンパ腫細胞中の分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）産生のレベルである。いくつかの実施形態では、ＡＣＣ（プロテアーゼへの曝露の前）は、対照レベルに比べて、少なくとも１つのＣＰ１および／またはＣＰ２活性の少なくとも２倍の低減を特徴とする。いくつかの実施形態では、ＡＣＣは、対照レベルに比べて、少なくとも１つのＣＰ１および／またはＣＰ２活性の少なくとも５倍の低減を特徴とする。いくつかの実施形態では、ＡＣＣは、対照レベルに比べて、少なくとも１つのＣＰ１および／またはＣＰ２活性の少なくとも１０倍の低減を特徴とする。いくつかの実施形態では、ＡＣＣは、対照レベルに比べて、少なくとも１つのＣＰ１および／またはＣＰ２活性の少なくとも２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍、１１００倍、１２００倍、１３００倍、１４００倍、１５００倍、１６００倍、１７００倍、１８００倍、１９００倍、２０００倍の低減を特徴とする。いくつかの実施形態では、ＣＰ１および／またはＣＰ２の少なくとも１つの活性の対照レベルは、ＡＣＣのプロテアーゼへの曝露後のＡＣＣ中のＣＰ１および／またはＣＰ２の活性である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＣＰ１および／またはＣＰ２の活性の対照レベルは、対応する野生型成熟サイトカインの対応するＣＰ１および／またはＣＰ２活性である。

いくつかの実施形態では、ＡＣＣは、プロテアーゼへの曝露後の切断産物の生成を特徴とし、切断産物は、ＣＰ１および／またはＣＰ２の少なくとも１つの活性を含む。いくつかの実施形態では、ＣＰ１および／またはＣＰ２の少なくとも１つの活性は、抗増殖活性である。いくつかの実施形態では、対照レベルは、野生型成熟サイトカインのＥＣ５０値であり、ＥＣ５０（切断産物）のＥＣ５０（野生型対照レベル）に対する比率は、約１０未満、または約９未満、または約８未満、または約７未満、または約６未満、または約５未満、または約４未満、または約３未満、または約２未満、または約１．５未満であるか、または約１に等しい。いくつかの実施形態では、切断産物のＥＣ５０は、野生型成熟サイトカインのＥＣ５０とほぼ同じであり、切断後に、ＣＰ１および／またはＣＰ２の活性が完全に回復される、またはほぼ完全に回復されることを示している。

本明細書で提供されるのは、本明細書で記載のＡＣＣのいずれか１つを含む組成物である。いくつかの実施形態では、組成物は、医薬組成物である。また、本明細書で提供されるのは、本明細書で記載のいずれか１つの組成物の少なくとも１種の投与量を含むキットである。

本明細書で提供されるのは、治療有効量の本明細書で記載のＡＣＣのいずれか１つまたは本明細書で記載の組成物のいずれか１つを対象に投与することを含む、それを必要としている対象を治療する方法である。いくつかの実施形態では、対象は、癌を有すると特定または診断されている。いくつかの非限定的実施形態では、癌は、カポジ肉腫、毛様細胞性白血病、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、濾胞性リンパ腫、腎細胞癌（ＲＣＣ）、メラノーマ、神経芽腫、基底細胞癌、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、鼻咽頭腺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、卵巣癌、膵臓癌である。いくつかの非限定的実施形態では、癌は、リンパ腫である。いくつかの非限定的実施形態では、リンパ腫は、バーキットリンパ腫である。

本明細書で提供されるのは、本明細書で記載のＡＣＣのいずれか１つのＣＰ１およびＣＭ１を含むポリペプチドをコードする核酸である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、本明細書で記載のＤＤ１のいずれか１つをさらに含む。また、本明細書で提供されるのは、本明細書で記載のＡＣＣのいずれか１つのＣＰ２およびＣＭ２を含むポリペプチドをコードする核酸である。モノマーが同一である場合、本開示は、二量体化してＡＣＣを形成するモノマーをコードする単一核酸を提供する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、本明細書で記載のＤＤ２のいずれか１つをさらに含む。また、本明細書で提供されるのは、本明細書で記載の核酸のいずれか１つを含むベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、発現ベクターである。また、本明細書で提供されるのは、本明細書で記載の核酸のいずれか１つ、または本明細書で記載のベクターのいずれか１つを含む細胞である。

本明細書で提供されるのは、本明細書で記載のＡＣＣのいずれか１つの、第１のモノマー構築物のＣＰ１およびＣＭ１を含むポリペプチドおよび第２のモノマー構築物のＣＰ２およびＣＭ２を含むポリペプチドを一緒にコードする核酸対である。また、本明細書で提供されるのは、本明細書で記載の核酸対のいずれか１つを一緒に含むベクター対である。いくつかの実施形態では、ベクター対は、１対の発現ベクターである。また、本明細書で提供されるのは、本明細書で記載の核酸対のいずれか１つ、または本明細書で記載のベクター対のいずれか１つを含む細胞である。他の実施形態では、本発明は、ベクター対を含むベクターを提供する。

本明細書で提供されるのは、ＡＣＣを産生するのに十分な条件下で液体培地中にて本明細書で記載の細胞のいずれか１種を培養すること；および細胞または液体培地からＡＣＣを回収すること、を含むＡＣＣを製造する方法である。いくつかの実施形態では、方法は、細胞または液体培地から回収されたＡＣＣを単離することをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、単離されたＡＣＣを医薬組成物に処方することをさらに含む。

本明細書で提供されるのは、本明細書で記載の方法のいずれか１つにより産生されたＡＣＣである。また、本明細書で提供されるのは、本明細書で記載のＡＣＣのいずれか１つを含む組成物である。また、本明細書で提供されるのは、本明細書で記載の組成物のいずれか１つの組成物であり、組成物は、医薬組成物である。また、本明細書で提供されるのは、本明細書で記載のいずれか１つの組成物の少なくとも１種の投与量を含むキットである。

別に定めのない限り、全ての技術および化学的用語は、本発明が属する当業者に通常理解されているものと同じ意味を有する。本発明で使用するための方法および材料が本明細書で記載されるが、当該技術分野において既知の他の好適な方法および材料も同様に使用可能である。材料、方法、および実施例は、例示のみの目的のために示され、限定する意図はない。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、配列、データベース項目、および他の参考文献は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。矛盾がある場合には、定義を含み、本明細書が支配する。

本発明の別の特徴および利点は、下記の詳細な説明および図、ならびに特許請求の範囲から明らかになろう。

用語の「ａ」および「ａｎ」は、１つまたは複数の（すなわち、少なくとも１つの）、その冠詞の文法的目的語を指す。例えば、「ａｃｅｌｌ」は、１つまたは複数の細胞を包含する。

本明細書で使用される「約（ａｂｏｕｔ）」および「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という用語は、数値または範囲で指定された量を修飾するために使用される場合、数値と共に当業者に既知の値からの合理的な偏差を示す。例えば、±２０％、±１０％、または±５％は、適切な場合には、記述された値の意図される意味の範囲内である。

濃度、量、およびその他の数値データは、本明細書では範囲の形式で表現または提示し得る。このような範囲形式は、単に、便宜上および簡潔さを目的として使用され、範囲の限界値として明示的に記載された数値のみを含むのではなく、あたかも各数値および部分範囲が明示的に記載されているかのように全ての個別の数値またはその範囲内に包含される部分範囲を含むように柔軟に解釈されるべきであることを理解されたい。一例として、「約０．０１～約２．０」という数値範囲は、明示的に記述された約０．０１～約２．０の値のみならず、示された範囲内の個々の値および部分範囲も含むと解釈されるべきである。従って、この数値範囲には、０．５、０．７、および１．５などの個別値と、０．５～１．７、０．７～１．５、および１．０～１．５などの部分範囲とが含まれる。さらに、このような解釈は、記述される範囲の広さや特性に関係なく適用されるべきである。さらに、特に指示がない限り、すべてのパーセンテージは重量基準であることに留意されたい。

本開示の範囲の理解において、用語の「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」およびそれらの派生語は、本明細書で使用される場合、示された特徴、要素、成分、基、整数、および／またはステップの存在を指定するが、示されない特徴、要素、成分、基、整数、および／またはステップの存在を排除しない、開放型用語であると意図される。前述はまた、用語の、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」およびそれらの派生語などの類似の意味を有する単語にも当てはまる。「から構成される」という用語および本明細書で使用されるその派生語は示した特徴、要素、成分、基、整数、および／またはステップの存在を指定するが、他の指定されない特徴、要素、成分、基、整数および／またはステップの存在を排除する閉鎖型用語であると意図される。「から本質的に構成される」という用語は、本明細書で使用される場合、述べられた特徴、要素、成分、基、整数、および／またはステップならびに特徴、要素、成分、基、整数、および／またはステップの基本的および新規特性に実質的に影響しないものの存在を特定すると意図される。これらの移行用語（すなわち、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ」、または「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ」）のいずれか１つへの言及は、特定的に使用されない他の移行用語のいずれかへの置き換えを直接支援すると理解される。例えば、用語を「含む」から「から本質的になる」または「からなる」に修正することは、この開示を通じて開示される任意の要素に対するこの定義による直接的な裏付けを見つけ得る。この定義に基づいて、本明細書で開示される、または参照により組み込まれる任意の要素は、請求発明に含まれるか、または除外され得る。

本明細書で使用される場合、複数の化合物、要素、またはステップは、便宜上共通のリスト中で提示され得る。しかし、これらのリストは、リストの各メンバーが別々のユニークなメンバーとして個別に識別されるかのように解釈されるべきである。従って、そのようなリストの個々のメンバーは、反対の指摘なしに、共通のグループでの表現のみに基づいて、同じリストの他のメンバーと事実上同等であると解釈されるべきではない。

さらに、特定の分子、構築物、組成物、要素、部分、賦形剤、障害、状態、特性、ステップなどが、１つの特定の実施形態または態様の文脈で、または本開示の別の段落またはセクションで考察され得る。これは単に便宜および簡潔さのためであり、いずれかのこのような開示は、本開示および請求項中のどこででも見られるいずれか他の実施形態または態様にも同様に適用でき、それらと組み合わされると意図され、それらはすべて出願日において出願および請求発明を形成することが理解される。例えば、構築物、組成物、または方法に関して、構築物、分子、方法のステップ、キット、または組成物のリストは、これらの方法ステップ、活性剤、キット、または組成物がその実施形態または態様の文脈またはセクションに再度記載されない場合でも、本開示の他の任意の部分に記載される構築物、組成物、製剤、および方法に関する実施形態に対する直接的支援が意図され、実際にそれを見出す。

別段の指定がない限り、「タンパク質をコードする核酸配列」は、相互の縮重バージョンであり従って同じアミノ酸配列をコードする、全てのヌクレオチド配列を含む。

ポリペプチド一次アミノ酸配列における第２のドメインまたは配列に対する第１のドメインまたは配列の位置に言及する場合の「Ｎ末端に位置する」という用語は、第１のドメインまたは配列が、第第２のドメインまたは配列より、ポリペプチド一次アミノ酸配列のＮ末端の近くに位置することを意味する。いくつかの実施形態では、第１のドメインまたは配列と、第２ドメインまたは配列との間に、追加の配列および／またはドメインが存在し得る。

ポリペプチド一次アミノ酸配列における第２のドメインまたは配列に対する第１のドメインまたは配列の位置に言及する場味の「Ｃ末端に位置する」という用語は、第１のドメインまたは配列が、第２のドメインまたは配列より、ポリペプチド一次アミノ酸配列のＣ末端の近くに位置することを意味する。いくつかの実施形態では、第１のドメインまたは配列と、第２ドメインまたは配列との間に、追加の配列および／またはドメインが存在し得る。

用語「外来性」は、それが導入されている同じ細胞、組織、または生物により産生されない、またはそれらに由来しない、細胞、組織、または生物の外部から導入された、あるいは外部に由来する任意の物質を指す。

用語「形質導入された（ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ）」、「遺伝子導入された（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）」、または「形質転換された（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）」は、それにより外来性核酸が細胞中に導入または移入される過程を指す。「形質導入された」、「遺伝子導入された」、または「形質転換された」細胞（例えば、哺乳動物細胞）は、本明細書で記載のいずれかの活性化可能サイトカイン構築物をコードする外来性の核酸を含む外来性核酸（例えば、ベクター）を形質導入された、遺伝子導入された、または形質転換された細胞である。

「核酸」という用語は、単鎖または二本鎖型の、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）またはこれらの組み合わせを指す。特に限定されない限り、この用語は、参照核酸と類似の結合特性を有する天然ヌクレオチドの既知の類似体を含む核酸を包含する。特に指示がない限り、特定の核酸配列はまた、相補的配列、ならびに明示的に示された配列を暗黙に包含する。本明細書で記載のいずれかの核酸のいくつかの実施形態では、核酸は、ＤＮＡである。本明細書で記載のいずれかの核酸のいくつかの実施形態では、核酸は、ＲＮＡである。

改変は、部位特異的変異誘発およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）媒介変異誘発などの、当該技術分野において既知の技術によりヌクレオチド配列中に導入できる。保存アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基と置き換えられる置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定義されている。これらのファミリーは、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸）を有するアミノ酸、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、およびヒスチジン）を有するアミノ酸、非極性アミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、およびトリプトファン）、非荷電極性アミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニンおよびチロシン）、親水性アミノ酸（例えば、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、セリン、およびトレオニン）、疎水性アミノ酸（例えば、アラニン、システイン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン、およびバリン）を含む。アミノ酸の他のファミリーは、次記を含む：脂肪族－ヒドロキシアミノ酸（例えば、セリンおよびトレオニン）、アミドファミリー（例えば、アスパラギンおよびグルタミン）脂肪族ファミリー（例えば、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン）、芳香族ファミリー（例えば、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン）。

本明細書で使用される場合、表現「特異的に結合する」または「免疫反応する」は、活性化可能抗原結合タンパク質複合体が、所望の標的抗原の１つまたは複数の抗原決定基と反応し、他のポリペプチドと反応しないか、または例えば、約１０^－６Ｍまたはそれを超える、はるかに低い親和性で結合することを意味する。

用語「治療」は、障害の少なくとも１つの症状を改善することを指す。いくつかの実施形態では、治療される障害は、癌であり、癌の少なくとも１つの症状が改善される。

それぞれ第１および第２のダイマー化ドメインＤＤ１１４０およびＤＤ２１９０を介して、共有結合または非共有結合で相互に結合する第１および第２のモノマー構築物を含む例示的活性化可能サイトカイン構築物の概略図である。第１のモノマー構築物は、Ｎ末端からＣ末端へ、第１の成熟サイトカインタンパク質ＣＰ１１００、第１のオプションのリンカー１１０、第１の切断可能部分ＣＭ１１２０、第２のオプションのリンカー１３０、および第１のダイマー化ドメインＤＤ１１４０を含む。第２のモノマー構築物は、Ｎ末端からＣ末端へ、第２の成熟サイトカインタンパク質ＣＰ２１５０、第３のオプションのリンカー１６０、第２の切断可能部分ＣＭ２１７０、第４のオプションのリンカー１８０、および第２のダイマー化ドメインＤＤ２１９０を含む。それぞれ第１および第２のダイマー化ドメインＤＤ１２００およびＤＤ２２５０を介して、共有結合でまたは非共有結合で相互に結合する第１および第２のモノマー構築物を含む例示的活性化可能サイトカイン構築物の概略図である。第１のモノマー構築物は、Ｎ末端からＣ末端へ、第１のダイマー化ドメインＤＤ１２００、第２のオプションのリンカー２１０、第１の切断可能部分ＣＭ１２２０、第１のオプションのリンカー２３０、および第１の成熟サイトカインタンパク質ＣＰ１２４０を含む。第２のモノマー構築物は、Ｎ末端からＣ末端へ、第２のダイマー化ドメインＤＤ２２５０、第４のオプションのリンカー２６０、第２の切断可能部分ＣＭ２２７０、第３のオプションのリンカー２８０、および第２の成熟サイトカインタンパク質ＣＰ２２９０を含む。それぞれ第１および第２のダイマー化ドメインＤＤ１３４０およびＤＤ２３９０を介して、共有結合または非共有結合で相互に結合する第１および第２のモノマー構築物を含む例示的活性化可能サイトカイン構築物の概略図である。第１のモノマー構築物は、Ｎ末端からＣ末端へ、第１の成熟サイトカインタンパク質ＣＰ１３００、第１のオプションのリンカー３１０、第１の切断可能部分ＣＭ１３２０、第２のオプションのリンカー３３０、および第１のダイマー化ドメインＤＤ１３４０を含む。第２のモノマー構築物は、Ｎ末端からＣ末端へ、第２の成熟サイトカインタンパク質ＣＰ２３５０、第３のオプションのリンカー３６０、第２の切断可能部分ＣＭ２３７０、第４のオプションのリンカー３８０、および第２のダイマー化ドメインＤＤ２３９０を含む。それぞれ第１および第２のダイマー化ドメインＤＤ１４００およびＤＤ２４５０を介して、非共有結合手段で相互に結合する第１および第２のモノマー構築物を含む例示的活性化可能サイトカイン構築物の概略図である。第１のモノマー構築物は、Ｎ末端からＣ末端へ、第１のダイマー化ドメインＤＤ１４００、第２のオプションのリンカー４１０、第１の切断可能部分ＣＭ１４２０、第１のオプションのリンカー４３０、および第１の成熟サイトカインタンパク質ＣＰ１４４０を含む。第２のモノマー構築物は、Ｎ末端からＣ末端へ、第２のダイマー化ドメインＤＤ２４５０、第４のオプションのリンカー４６０、第２の切断可能部分ＣＭ２４７０、第３のオプションのリンカー４８０、および第２の成熟サイトカインタンパク質ＣＰ２４９０を含む。例示的活性化可能サイトカイン構築物ＩＦＮα２ｂ－１２０４ｄＬ－ｈＩｇＧ４（配列番号３０９）のアミノ酸配列を提供し、第１および第２のモノマー構築物は、同一のアミノ酸配列を有する。Ｎ末端からＣ末端へ、第１および第２のモノマー構築物のアミノ酸配列は：マウスシグナルペプチド（太字ではないイタリック文字）；成熟ヒトインターフェロンα２ｂ（下線付き文字）；切断可能部分１２０４ｄＬ（太字文字）；リンカー（イタリックで太字文字）；およびヒトＩｇＧ４Ｆｃドメイン（イタリックでも、太字でも、または下線付きでもない文字）をコードする。例示的活性化可能サイトカイン構築物ＩＦＮα２ｂ－１４９０ＤＮＩ－ｈＩｇＧ４（配列番号３１１）のアミノ酸配列を提供し、第１および第２のモノマー構築物は、同一のアミノ酸配列を有する。Ｎ末端からＣ末端へ、アミノ酸配列は：マウスシグナルペプチド（太字ではないイタリック文字）；成熟ヒトインターフェロンα２ｂ（下線付き文字）；切断可能部分１４９０ＤＮＩ（イタリックでない太字文字）；リンカー（イタリックで太字文字）；およびヒトＩｇＧ４Ｆｃドメイン（イタリックでも、太字でも、または下線付きでもない文字）をコードする。活性化可能サイトカイン構築物ＩＦＮα２ｂ－ｈＩｇＧ４Ｆｃ（切断可能部分１２０４ｄＬまたは１４９０を有する）およびプロテアーゼ（ｕＰＡまたはＭＴ－ＳＰ１）の切断反応を示し、これは、モノマー成熟ＩＦＮα２ｂを生成する。（１）切断可能部分１２０４を有するＡＣＣ（１２０４）；（２）プロテアーゼ膜型セリンプロテアーゼ１（ＭＴ－ＳＰ１）および切断可能部分１２０４を有するＡＣＣＩＦＮα２ｂ－ｈＩｇＧ４Ｆｃの産物（１２０４ＭＴ－ＳＰ１）；（３）切断可能部分１２０４を有するＡＣＣＩＦＮα２ｂ－ｈＩｇＧ４ＦｃおよびプロテアーゼｕＰＡの産物（１２０４ｕＰＡ）；（４）５アミノ酸リンカーに融合された切断可能部分１２０４を有するＡＣＣＩＦＮα２ｂ－ｈＩｇＧ４Ｆｃ（１２０４＋１）；（５）ＩＦＮα２ｂ－ｈＩｇＧ４Ｆｃ１２０４＋１およびＭＴ－ＳＰ１の産物（１２０４＋１ＭＴ－ＳＰ１）；（６）切断可能部分１４９０を有するＡＣＣＩＦＮα２ｂ－ｈＩｇＧ４Ｆｃ；（７）ＭＴ－ＳＰ１および、切断可能部分１４９０を有するＡＣＣＩＦＮα２ｂ－ｈＩｇＧ４Ｆｃの産物；ｕＰＡおよび切断可能部分１４９０を有するＡＣＣＩＦＮα２ｂ－ｈＩｇＧ４Ｆｃ（１４９０ｕＰＡ）の産物をロードしたゲル像である。シラトロン（登録商標）（ペグインターフェロンα２ｂ）および種々のインターフェロンα２ｂ（ＩＦＮα２ｂ）融合体：ＩＦＮα２ｂにＮ末端で融合されたヒトＩｇＧ４（ＩＦＮα２ｂＮｈＧ４）；５アミノ酸リンカーを介してＩＦＮα２ｂにＮ末端で融合されたヒトＩｇＧ４（ＩＦＮα２ｂ５ＡＡＮｈＧ４）；活性化可能サイトカイン構築物ＩＦＮα２ｂ－１２０４ｄＬ－ｈＩｇＧ４（ＩＦＮα２ｂ１２０４ＤＮＩｄＬＮｈＧ４）；ＩＦＮα２ｂ－１２０４ｄＬ－ｈＩｇＧ４と同じ成分を含むが、成熟サイトカインタンパク質成分と切断可能部分の間に配置される５アミノ酸リンカーも有する活性化可能サイトカイン構築物（ＩＦＮα２ｂ５ＡＡ１２０４ＤＮＩｄＬＮｈＧ４）；および活性化可能サイトカイン構築物ＩＦＮα２－１４９０ＤＮＩ－ｈＩｇＧ４（ＩＦＮα２ｂ１４９０ＤＮＩＮｈＧ４）のインターフェロンα２ｂ活性を評価するためのＨＥＫ２９３細胞ベースレポーターアッセイからの結果を提供する。ＨＥＫ２９３細胞ベースレポーターアッセイにより測定した、ＥＣ５０に対するインターフェロンα２ｂ－Ｆｃ融合体中のフレキシブルリンカーの長さの影響を示す。ＨＥＫ２９３細胞ベースレポーターアッセイにより測定した、インターフェロンα２ｂ－Ｆｃ融合体中のリンキング領域（ＬＲ）の長さのＥＣ５０に与える影響を示す。シラトロン（登録商標）（ペグインターフェロンα２ｂ）および種々のＩＦＮα２ｂ融合体：ＩＦＮα２ｂにＮ末端で融されたヒトＩｇＧ４（ＩＦＮα２ｂＮｈＧ４）；５アミノ酸リンカーを介してＩＦＮα２ｂにＮ末端で融合されたヒトＩｇＧ４（ＩＦＮα２ｂ５ＡＡＮｈＧ４）；活性化可能サイトカイン構築物ＩＦＮα２ｂ－１２０４ｄＬ－ｈＩｇＧ４（ＩＦＮα２ｂ１２０４ＤＮＩｄＬＮｈＧ４）；ＩＦＮα２ｂ－１２０４ｄＬ－ｈＩｇＧ４と同じ成分を含むが、成熟サイトカインタンパク質成分と切断可能部分の間に配置される５アミノ酸リンカーも有する活性化可能サイトカイン構築物（ＩＦＮα２ｂ５ＡＡ１２０４ＤＮＩｄＬＮｈＧ４）；および活性化可能サイトカイン構築物ＩＦＮα２－１４９０ＤＮＩ－ｈＩｇＧ４（ＩＦＮα２ｂ１４９０ＤＮＩＮｈＧ４）の抗増殖活性を測定するためのＤａｕｄｉアポトーシスアッセイからの結果を提供する。Ｄａｕｄｉアポトーシスアッセイから測定されるＥＣ５０に対するインターフェロンα２ｂ－Ｆｃ融合体中のリンカーの長さの影響を示す。Ｄａｕｄｉアポトーシスアッセイから測定されるＥＣ５０に対するインターフェロンα２ｂ－Ｆｃ融合体中のリンキング領域（ＬＲ）の長さの影響を示す。ＡＣＣ（ＩＦＮα２ｂ１２０４ＤＮＩｄＬＮｈＧ４）；プロテアーゼ処理ＡＣＣ（ＩＦＮα２ｂ１２０４ＤＮＩｄＬＮｈＧ４＋ｕＰＡ）；および組換え親サイトカイン（ＩＦＮα２ｂ）の抗増殖活性を測定するための、Ｄａｕｄｉリンパ腫細胞ベースアッセイの結果を提供する。結果は、ＡＣＣのプロテアーゼによる処理後に、ＡＣＣ中のサイトカインの活性は、組換え親サイトカインと同等のレベルに回復され得たことを示した。ＡＣＣ（ＩＦＮα２ｂ１２０４ＤＮＩｄＬＮｈＧ４）；プロテアーゼ処理（活性化）ＡＣＣ（ＩＦＮα２ｂ１２０４ＤＮＩｄＬＮｈＧ４＋ｕＰＡ）；シラトロン（登録商標）；および組換え親サイトカイン（ＩＦＮα２ｂ）の活性を評価するための、ＨＥＫ２９３細胞ベースレポーターアッセイの結果を示す。結果は、ＡＣＣのプロテアーゼによる処理後に、ＡＣＣ中のサイトカインの活性は、組換え親サイトカインと同等のレベルに回復され得たことを示した。ＡＣＣ（ＰｒｏＣ４４０）、プロテアーゼ処理ＡＣＣ（ＰｒｏＣ４４０＋ｕＰＡ）、およびｓｔｅｍｃｅｌｌＩＦＮα２ｂの抗増殖活性を測定するためのＤａｕｄｉリンパ腫細胞ベースアッセイの結果（上段）、およびＨＥＫ２９３細胞ベースレポーターアッセイの結果（下段）を示す。結果は、活性が、本開示のＡＣＣ構造を作製することにより１０００Ｘ低減され、プロテアーゼによるＡＣＣの処理後に、ＡＣＣ中のサイトカインの活性が、組換え親サイトカインと同等のレベルに回復されたことを示した。ＰｒｏＣ４４０の構造を示し、ＣＭ中の予測部位でのｕＰＡによる切断が、質量分析により確認されたことを示す。ｕＰＡ活性化に対する感受性に加えて、ＰｒｏＣ４４０は、ＭＭＰ４により切断される。質量分析による解析が、切断可能部分近傍のＩＦＮαのＣ末端の先端部のＭＭＰ１４切断部位（Ｌ１６１の）を特定したことを示す。ＭＭＰ１４によるプロテアーゼ活性化は、組換えサイトカインと同等であるレベルに活性を回復した。ＰｒｏＣ４４０およびＰｒｏＣ６５７（ＮＩＦＮα２ｂ０ＡＡ１２０４ＤＮＩｄＬ０ＡＡＩｇＧ４ＫｉＨＳＳ）の構造を示す。ＡＣＣＰｒｏＣ４４０およびＰｒｏＣ６５７、プロテアーゼ処理ＡＣＣ（ＰｒｏＣ４４０＋ｕＰＡ）、およびｓｔｅｍｃｅｌｌＩＦＮα２ｂの活性を、ＩＦＮ応答性ＨＥＫ２９３細胞を用いて試験した。結果は、ＰｒｏＣ６５７の活性は、ＳｔｅｍＣｅｌｌＩＦＮα２ｂまたはｕＰＡ活性化ＰｒｏＣ４４０に比べて低下したが、ＰｒｏＣ４４０に比べて、増大したことを示した。（上段）Ｄａｕｄｉ異種移植腫瘍モデルを用いて、インビボでのＡＣＣＰｒｏＣ４４０の抗増殖効果を示す。ＡＣＣＰｒｏＣ４４０は、０．１ｍｇ／ｋｇの低い投与量で完全な腫瘍退縮を誘導し、０．０２ｍｇ／ｋｇの投与量で腫瘍増殖の速度を低下させた。（下段）Ｄａｕｄｉ異種移植腫瘍モデルを用いて、インビボでのシラトロン（登録商標）の抗増殖効果を示す。ＰｒｏＣ２８６の構造、およびＤａｕｄｉアポトーシスアッセイでのシラトロン（登録商標）の活性と比較したＰｒｏＣ２８６の活性を示す。ＰｒｏＣ２８６およびシラトロン（登録商標）は、類似のレベルの活性を示し、ＰｒｏＣ２８６が、ハムスター試験におけるＩＦＮα２ｂの耐容性を評価するためのシラトロン（登録商標）対照の代用物として使用可能であることを示す。ＰｒｏＣ２９１の構造、およびＤａｕｄｉアポトーシスアッセイでのシラトロン（登録商標）の活性と比較したＰｒｏＣ２９１の活性を示す。ＰｒｏＣ２９１は、シラトロン（登録商標）およびＰｒｏＣ２８６に比べて、有意に低減された活性を示した。ＩＦＮα－ｃｏｎ（組換えインターフェロンα、非天然起源Ｉ型インターフェロン）、ＰｒｏＣ４４０＋ｕＰＡ、ＰＥＧ－ＩＦＮα２ｂ（シラトロン（登録商標））、およびＰｒｏＣ４４０の活性、ならびに、例えば、０．０８、０．４、２、１０、１５ｍｇ／ｋｇ（「ｍｐｋ」）の漸増用量での、インビボ用量漸増試験における予測される中毒量を示す。ＡＣＣＰｒｏＣ８５９ユニバーサルインターフェロンの構造（上段）、Ｂ１６マウスメラノーマ細胞アッセイでのＡＣＣＰｒｏＣ８５９の抗増殖効果およびＩＦＮ応答性ＨＥＫ２９３アッセイにおけるＡＣＣＰｒｏＣ８５９の活性を示す。それぞれ第１および第２のダイマー化ドメインＤＤ１５４０およびＤＤ２５９０を介して、非共有結合手段で相互に結合する第１および第２のモノマー構築物を含む例示的活性化可能サイトカイン構築物の概略図である。第１のモノマー構築物は、Ｎ末端からＣ末端へ、第１の成熟サイトカインタンパク質ＣＰ１５００、第１のオプションのリンカー５１０、第１の切断可能部分ＣＭ１５２０、第２のオプションのリンカー５３０、および第１のダイマー化ドメインＤＤ１５４０を含む。第２のモノマー構築物は、Ｎ末端からＣ末端へ、第２の成熟サイトカインタンパク質ＣＰ２５５０、第３のオプションのリンカー５６０、および第２のダイマー化ドメインＤＤ２５９０を含む。それぞれ第１および第２のダイマー化ドメインＤＤ１６００およびＤＤ２６５０を介して、非共有結合手段で相互に結合する第１および第２のモノマー構築物を含む例示的活性化可能サイトカイン構築物の概略図である。第１のモノマー構築物は、Ｎ末端からＣ末端へ、第１のダイマー化ドメインＤＤ１６００、第１のオプションのリンカー６３０、および第１の成熟サイトカインタンパク質ＣＰ１６４０を含む。第２のモノマー構築物は、Ｎ末端からＣ末端へ、第２のダイマー化ドメインＤＤ２６５０、第２のオプションのリンカー６６０、切断可能部分ＣＭ６７０、第３のオプションのリンカー６８０、および第２の成熟サイトカインタンパク質ＣＰ２６９０を含む。それぞれ第１および第２のダイマー化ドメインＤＤ１７４０およびＤＤ２７９０を介して、非共有結合手段で相互に結合する第１および第２のモノマー構築物を含む例示的活性化可能サイトカイン構築物の概略図である。第１のモノマー構築物は、Ｎ末端からＣ末端へ、第１の成熟サイトカインタンパク質ＣＰ７００、第１のオプションのリンカー７１０、第１の切断可能部分ＣＭ１７２０、第２のオプションのリンカー７３０、および第１のダイマー化ドメインＤＤ１７４０を含む。第２のモノマー構築物は、Ｎ末端からＣ末端へ、サイトカイン活性を欠くポリペプチドまたはタンパク質７８０、および第２のダイマー化ドメインＤＤ２７９０を含む。サイトカイン活性を欠くポリペプチドまたはタンパク質７８０は、例えば、サイトカイン活性を欠く短縮サイトカインタンパク質、サイトカイン活性を欠く変異サイトカインタンパク質、スタブ配列、またはＣＰ７００に高親和性で結合し第２の部分の対照レベルに比べて第２の部分のサイトカイン活性を低減するポリペプチド配列であり得る。ＤＤ１７４０およびＤＤ２７９０は、同じであるまたは異なっていてよい。それぞれ第１および第２のダイマー化ドメインＤＤ１８００およびＤＤ２８５０を介して、非共有結合手段で相互に結合する第１および第２のモノマー構築物を含む例示的活性化可能サイトカイン構築物の概略図である。第１のモノマー構築物は、Ｎ末端からＣ末端へ、第１のダイマー化ドメインＤＤ１８００およびサイトカイン活性を欠くポリペプチドまたはタンパク質８３０を含む。第２のモノマー構築物は、Ｎ末端からＣ末端へ、第２のダイマー化ドメインＤＤ２８５０、第１のオプションのリンカー８６０、切断可能部分ＣＭ８７０、第２のオプションのリンカー８８０、および成熟サイトカインタンパク質ＣＰ８９０を含む。サイトカイン活性を欠くポリペプチドまたはタンパク質８３０は、例えば、サイトカイン活性を欠く短縮サイトカインタンパク質、サイトカイン活性を欠く変異サイトカインタンパク質、スタブ配列、またはＣＰ７００に高親和性で結合し第２の部分の対照レベルに比べて第２の部分のサイトカイン活性を低減するポリペプチド配列であり得る。ＤＤ１８００およびＤＤ２８５０は、同じであるまたは異なっていてよい。ＳｙｒｉａｎＧｏｌｄＨａｍｓｔｅｒにおいて治療期間にわたり、２ｍｐｋ、１０ｍｐｋ、および１５ｍｐｋの対照ｈＩｇＧ４、ＰｒｏＣ２８６、またはＰｒｏＣ４４０を投与した場合の、動物の体重減少を示す。２ｍｐｋ、１０ｍｐｋ、および１５ｍｐｋの対照ｈＩｇＧ４、ＰｒｏＣ２８６、またはＰｒｏＣ４４０を投与したＳｙｒｉａｎＧｏｌｄＨａｍｓｔｅｒでの臨床化学結果（アルカリホスファターゼ、アラニントランスアミナーゼ、およびアスパラギン酸アミノ基転移酵素）を示す。２ｍｐｋ、１０ｍｐｋ、および１５ｍｐｋの対照ｈＩｇＧ４、ＰｒｏＣ２８６、またはＰｒｏＣ４４０を投与したＳｙｒｉａｎＧｏｌｄＨａｍｓｔｅｒでの血液学分析結果（網状赤血球、好中球、および白血球（ＷＢＣ）数）を示す。そのリンキング領域（ＬＲ）を示すＡＣＣの実施形態を概略的に示す。

本明細書で提供されるのは、対応するサイトカインの少なくとも１つの活性の低減されたレベルを示す活性化可能サイトカイン構築物（ＡＣＣ）であるが、これは、活性化条件への曝露後に、実質的に回復された活性を有するサイトカイン産物をもたらす。本発明の活性化可能サイトカイン構築物は、患部組織への曝露時に選択的に活性化され、正常組織中では活性化されないように設計され得る。従って、これらの化合物は、サイトカインベース療法のメリットを与える可能性を有し、特定のサイトカインベース治療薬に関連する潜在的に少ない毒性を有する。

さらに本明細書で提供されるのは、関連中間体、組成物、キット、核酸、および組換え細胞、ならびに本明細書で記載のいずれかの活性化可能サイトカイン構築物の使用方法および製造方法を含む、関連する方法である。

発明者らは意外にも、本明細書で記載の特定の要素および構造的配向を有するＡＣＣが、特に癌を治療するための療法でのサイトカインの安全性および治療指数の改善においておそらく効果的であるように見えることを見出した。サイトカインは、自然および適応免疫系の制御因子であり、かつ前臨床モデルで広範な抗腫瘍活性を有する一方で、それらの臨床的成果は、全身毒性および標的組織への芳しくない全身曝露により制限されてきた。発明者らは意外にも、本明細書で記載の特定の要素および構造的配向を有するＡＣＣが、サイトカイン治療薬に付随する全身毒性を減らし、標的化および標的組織への曝露を改善するように見えることを見出した。従って、本開示は、本明細書で記載の特定の要素および構造的配向を有するＡＣＣを対象に投与することにより、サイトカイン治療薬の標的介在性薬物動態（ＴＭＤＤ）を低減する方法を提供する。従って、本発明は、投与されたサイトカイン投与量のかなりの割合が正常組織により隔離される問題を解決する。この問題は、従来のサイトカイン治療薬において、標的組織、例えば、癌組織に到達するために体循環で利用できる投与量の割合を制限する。本サイトカイン構築物は、標的結合を腫瘍組織に局在化させ、それにより効力を維持し、副作用を低減し、新規標的化機会を可能にし、検証された標的に対する治療濃度域を改善し、創薬可能でない標的についての治療濃度域を作成し、および複数の結合モダリティを提供する。本開示は、安全で効果的な全身送達を可能にし、それにより従来の全身性サイトカイン治療薬の用量依存性毒性を回避し、かつ腫瘍内注入の必要性も回避する。本開示は、局在化抗ウイルス活性、免疫調節活性、抗増殖活性およびアポトーシス促進性活性を与える手段を提供する。発明者らは意外にも、第１および第２のモノマー構築物のダイマー化が、サイトカイン活性の高い低減を達成し、特に、単一サイトカインがダイマー化ドメインに付着される場合よりも、特により高い低減を達成することを見出した。図１５を参照されたい。

さらに、発明者らは、サイトカイン活性の低減の程度が、フレキシブルリンカー長またはリンキング領域長を変えることにより調節できることを発見した。発明者らは意外にも、サイトカイン活性の１，０００倍以上のオーダーの低減は、立体的に束縛されているダイマー化ドメイン（例えば、ヒンジ領域の第１のシステイン、例えば、ＥＵナンバリングによるＣｙｓ２２６で短縮化されているヒトＩｇＧのＦｃドメイン）に短いプロテアーゼ切断可能配列を介してサイトカインを付着することにより達成できることを見出した。意外にも、プロテアーゼ切断は、立体的障害に関わらず起こり、完全なサイトカイン活性は、ダイマー化ドメインからのサイトカイン切断時に復帰される。

特定の活性化可能サイトカイン構築物を開示する、出願者の２０２０年４月１０日出願の米国特許仮出願第６３／００８，５４２号は、その全体が本明細書に参照として組み込まれる。

活性化可能サイトカイン構築物
本発明の活性化可能サイトカイン構築物は、第１のモノマー構築物および第２のモノマー構築物を含むダイマー複合体である。モノマー成分のダイマー化は、１対のダイマー化ドメインにより促進される。一態様では、各モノマー構築物は、サイトカインタンパク質、切断可能部分、およびダイマー化ドメイン（ＤＤ）を含む。一態様では、１つのモノマー構築物は、サイトカインタンパク質、切断可能部分、およびＤＤを含み、一方でもう１つのモノマー構築物は、サイトカインタンパク質およびＤＤを含むが、切断可能部分を含まない。一態様では、１つのモノマー構築物は、サイトカインタンパク質、切断可能部分、およびＤＤを含み、一方で他のモノマー構築物は、サイトカイン活性を欠くタンパク質またはペプチド、およびＤＤを含むが、切断可能部分を含まない。特定の実施形態では、本発明は、第１のモノマー構築物および第２のモノマー構築物を含む活性化可能サイトカイン構築物（ＡＣＣ）を提供し、
（ａ）第１のモノマー構築物は、第１の成熟サイトカインタンパク質（ＣＰ１）、第１の切断可能部分（ＣＭ１）、および第１のダイマー化ドメイン（ＤＤ１）を含み、
ＣＭ１は、ＣＰ１とＤＤ１の間に配置され；および
（ｂ）第２のモノマー構築物は、第２の成熟サイトカインタンパク質（ＣＰ２）、第２の切断可能部分（ＣＭ２）、および第２のダイマー化ドメイン（ＤＤ２）を含み、
ＣＭ２は、ＣＰ２とＤＤ２の間に配置され；
ＤＤ１およびＤＤ２は、相互に結合し、それにより第１のモノマー構築物および第２のモノマー構築物のダイマーを形成し、および
ＡＣＣは、少なくとも１つのＣＰ１および／またはＣＰ２活性の対照レベルに比べて、少なくとも１つのＣＰ１および／またはＣＰ２活性の低減されたレベルを有することを特徴とする。

サイトカイン構築物に関連して使用される場合、用語「活性化可能な」は、第１のレベルの１つまたは複数の活性を示し、一方または両方の切断可能な部分の切断を起こす状態への曝露が第２のレベルの１つまたは複数の活性を示すサイトカイン構築物の生成をもたらし、第２のレベルの活性が第１のレベルの活性より大きい、サイトカイン構築物を指す。活性の非限定的例は、本明細書で記載されるまたは当該技術分野において既知のサイトカインの例示的活性のいずれかを含む。

用語「成熟サイトカインタンパク質」は本明細書では、シグナル配列を欠くサイトカインタンパク質を指す。サイトカインタンパク質（ＣＰ）は、成熟サイトカインタンパク質またはシグナルペプチドを有するサイトカインタンパク質であってよい。従って、本開示のＡＣＣは、いくつかの態様では、成熟サイトカインタンパク質配列を含み得る。いくつかの態様では、本開示のＡＣＣは、成熟サイトカインタンパク質配列、および追加で、シグナル配列を含み得る。いくつかの態様では、本開示のＡＣＣは、本明細書で記述のシグナル配列を含む、または欠く、本明細書で開示の配列を含み得る。

用語「切断可能部分」および「ＣＭ」は、本明細書では同じ意味で用いられ、配列特異的プロテアーゼのための基質を含む配列のペプチドを指す。ＣＭ１および／またはＣＭ２としての使用に好適な切断可能部分は、当技術分野で既知のいずれかのプロテアーゼ基質を含む。例示的切断可能部分は、下記でさらに詳細に記載される。

用語「ダイマー化ドメイン」および「ＤＤ」は、本明細書では同じ意味で用いられ、１対のダイマー化ドメインの１つのメンバーを指し、対の各メンバーは、１つまたは複数の共有結合のまたは非共有結合相互作用を介して残りのメンバーに結合できる。第１のＤＤおよび第２のＤＤは、同じであるまたは異なっていてよい。ＤＤ１および／またはＤＤ２としての使用に好適な例示的ＤＤは、本明細書中下記でより詳細に記載される。

本明細書で使用される場合、サイトカインまたはＦｃドメインなどのポリペプチドは、野性型ポリペプチド（例えば、天然に存在するポリペプチド）または野性型ポリペプチドのバリアントであってよい。バリアントは、野性型ポリペプチドの１つまたは複数のアミノ酸の置換、挿入、欠失および／または付加により改変されたポリペプチドであり得るが、ただし、バリアントが野性型ポリペプチドの基本的機能または活性を保持するという場合である。いくつかの実施例では、バリアントは、野性型ポリペプチドに比較して、改変された（例えば、高められたまたは低減された）機能または活性を有し得る。いくつかの態様では、バリアントは、野性型ポリペプチドの機能性フラグメントであり得る。用語「機能性フラグメント」は、ポリペプチド（例えば、サイトカイン）の配列が、完全長ポリペプチド配列より少ないアミノ酸を含み得るが、活性（例えば、サイトカイン活性）を付与するのに十分なポリペプチド鎖長であることを意味する。

第１および第２のモノマー構築物は、例えば、１つまたは複数のリンカーなどの追加の要素をさらに含み得る。追加の要素は、以下でより詳細に記載される。第１および第２のモノマー構築物のそれぞれにおけるＣＰ、ＣＭ、およびＤＤ成分の構成は、各モノマー構築物中で同じ順で配置され得る。ＣＰ１、ＣＭ１、およびＤＤ１成分は、対応するＣＰ２、ＣＭ２、およびＤＤ２に比べて、例えば、ＣＰおよびＣＭ成分（およびＤＤ成分がポリペプチドであるいくつかの実施形態では、ＤＤ成分）の分子量、サイズ、アミノ酸配列などの観点から、同じであるまたは異なってよい。従って、得られるダイマーは、対称のまたは非対称のモノマー構築物成分を有し得る。

いくつかの実施形態では、第１のモノマー構築物は、ＣＰおよびＣＭ成分のＮからＣ末端方向に、ＣＰ１、ＣＭ１、およびＣＭ１のＣ末端に直接または間接に（リンカーを介して）連結されたＤＤ１を含む。他の実施形態では、第１のモノマー構築物は、ＣＰおよびＣＭ成分のＮからＣ末端方向に、ＣＰ１、ＣＭ１、およびＣＭ１のＮ末端に直接または間接に（リンカーを介して）連結されたＤＤ１を含む。いくつかの実施形態では、第２のモノマー構築物は、ＣＰおよびＣＭ成分のＮからＣ末端方向に、ＣＰ２、ＣＭ２、およびＣＭ２のＣ末端に直接または間接に（リンカーを介して）連結されたＤＤ２を含む。他の実施形態では、第２のモノマー構築物は、ＣＰおよびＣＭ成分のＮからＣ末端方向に、ＣＰ２、ＣＭ２、およびＣＭ２のＮ末端に直接または間接に（リンカーを介して）連結されたＤＤ２を含む。

特定の実施形態では、第１および第２のモノマー構築物は、ダイマーの各メンバー中の成分が、ＣＰおよびＣＭ成分のＮ末端からＣ末端に同じ順に構成されるように配向される。例示的ＡＣＣの概略図を、図１Ａで提供する。図１Ａを参照して、ＡＣＣは、ＣＰおよびＣＭ成分のＮ末端からＣ末端へ下記を含む：（１）ＣＰ１１００；ＣＰ１１００に対してＣ末端に位置するＣＭ１１２０；存在する場合、ＣＰ１１００のＣ末端とＣＭ１１２０のＮ末端の間に配置されるオプションのリンカー１１０；ＤＤ１１４０；および存在する場合、ＣＭ１１２０のＣ末端とＤＤ１１４０の間に配置されるオプションのリンカー１３０；を有する第１のモノマー構築物；（２）ＣＰ２１５０；ＣＰ２１５０に対してＣ末端に位置するＣＭ２１７０；存在する場合、ＣＰ２１５０のＣ末端とＣＭ２１７０のＮ末端の間に配置されるオプションのリンカー１６０；ＤＤ２１９０；および存在する場合、ＣＭ２１７０のＣ末端とＤＤ２１９０の間に配置されるオプションのリンカー１８０；を有する第２のモノマー構築物；および（３）１つまたは複数の共有結合または非共有結合（←→）。

ＡＣＣの逆配向で構成された成分を有する、さらなる例示的ＡＣＣの概略図を、図１Ｂで提供する。図１Ｂを参照して、ＡＣＣは、ＣＰおよびＣＭ成分のＮ末端からＣ末端へ下記を含む：（１）ＤＤ１２００；ＣＭ１２２０；存在する場合、ＤＤ１２００とＣＭ１２２０のＮ末端の間に配置されるオプションのリンカー２１０；ＣＭ１２２０に対してＣ末端に位置するＣＰ１２４０；および存在する場合、ＣＭ１２２０のＣ末端とＣＰ１２４０のＮ末端の間に配置されるオプションのリンカー２３０；を有する第１のモノマー構築物；（２）ＤＤ２２５０；ＣＭ２２７０；存在する場合、ＤＤ２２５０とＣＭ２２７０のＮ末端の間に配置されるオプションのリンカー２６０；ＣＭ２２７０に対してＣ末端に位置するＣＰ２２９０；および存在する場合、ＣＭ２２９０のＣ末端とＣＰ２２９０のＮ末端の間に配置されるオプションのリンカー２８０；を有する第２のモノマー構築物；および（３）１つまたは複数の共有結合または非共有結合（←→）。

図２Ａは、それぞれ第１および第２のダイマー化ドメインＤＤ１３４０およびＤＤ２３９０を介して、非共有結合手段で相互に結合する第１および第２のモノマー構築物を含む例示的活性化可能サイトカイン構築物の概略図である。第１のモノマー構築物は、ＣＰおよびＣＭ成分のＮ末端からＣ末端へ、第１の成熟サイトカインタンパク質ＣＰ１３００、第１のオプションのリンカー３１０、第１の切断可能部分ＣＭ１３２０、第２のオプションのリンカー３３０、および第１のダイマー化ドメインＤＤ１３４０を含む。第２のモノマー構築物は、Ｎ末端からＣ末端へ、第２の成熟サイトカインタンパク質ＣＰ２３５０、第３のオプションのリンカー３６０、第２の切断可能部分ＣＭ２３７０、第４のオプションのリンカー３８０、および第２のダイマー化ドメインＤＤ２３９０を含む。

図２Ｂは、それぞれ第１および第２のダイマー化ドメインＤＤ１４００およびＤＤ２４５０を介して、非共有結合手段で相互に結合する第１および第２のモノマー構築物を含む例示的活性化可能サイトカイン構築物の概略図である。第１のモノマー構築物は、ＣＰおよびＣＭ成分のＮ末端からＣ末端へ、第１のダイマー化ドメインＤＤ１４００、第２のオプションのリンカー４１０、第１の切断可能部分ＣＭ１４２０、第１のオプションのリンカー４３０、および第１の成熟サイトカインタンパク質ＣＰ１４４０を含む。第２のモノマー構築物は、ＣＰおよびＣＭ成分のＮ末端からＣ末端へ、第２のダイマー化ドメインＤＤ２４５０、第４のオプションのリンカー４６０、第２の切断可能部分ＣＭ２４７０、第３のオプションのリンカー４８０、および第２の成熟サイトカインタンパク質ＣＰ２４９０を含む。別の態様では、ＣＰ１４４０およびＣＰ２４９０として示される２つの部分の１つは、サイトカイン活性を欠く短縮サイトカインタンパク質である。例えば、ＣＰ１またはＣＰ２は、野性型インターフェロンα２ｂの最初の１５１個のアミノ酸を有する短縮インターフェロンα２ｂであり得る。別の態様では、ＣＰ１４４０およびＣＰ２４９０として示される２つの部分の１つは、サイトカイン活性を欠く変異サイトカインタンパク質である。例えば、ＣＰ１またはＣＰ２は、Ｌ１３０Ｐ変異を有する短縮インターフェロンα２ｂであり得る。別の態様では、ＣＰ１４４０およびＣＰ２４９０として示される２つの部分の１つは、サイトカイン活性を欠くポリペプチド配列、シグナル部分および／またはスタブ配列である。別の態様では、ＣＰ１４４０およびＣＰ２４９０として示される２つの部分の第１の部分は、ＣＰ１４４０およびＣＰ２４９０として示される２つの部分の第２の部分に高親和性で結合し、第２の部分の対照レベルに比べて、第２の部分のサイトカイン活性を低減するポリペプチド配列である。

ＡＣＣ構造は、活性化後にサイトカイン活性の機能が実質的に損なわれない様式で成熟サイトカインタンパク質成分の活性を低減するのに極めて効果的であることが発見された。本明細書で記載のＡＣＣのための活性化条件は、ＡＣＣ中の少なくとも１つの切断可能部分を切断できるプロテアーゼへの曝露である。実施例で示すように、ＡＣＣの活性化は、サイトカイン活性の実質的回復を生じる。この結果は、サイトカイン成分の立体配座がＡＣＣの枠組みの中で非可逆的に変更されなかったことを示唆する。重要なことに、ＡＣＣは、マスキング効果を達成するために、サイトカインタンパク質成分に対する結合親和性を有するペプチドマスクを特定し利用する必要性に依存しない。従って、ＡＣＣは、サイトカインタンパク質成分に対する結合親和性を有するペプチドマスクを含まない。本発明者らは意外にも、ＡＣＣ構造が、サイトカインタンパク質成分に対する結合親和性を有する何らかのマスキング部分を使用することなく、サイトカインのオフターゲットおよび望ましくない活性および／または有害副作用を回避するのに十分であることを見出した。従って、本明細書で記載のＡＣＣは、親和性マスキング部分またはペプチドマスク部分を欠くことを特徴とする。

ＡＣＣは、それぞれ、ＣＰ１、ＣＰ２、ＣＭ１、ＣＭ２、ＤＤ１、およびＤＤ２として種々の成熟サイトカインタンパク質、切断可能部分、およびＤＤのいずれかを採用し得る。例えば、当技術分野において既知の成熟サイトカインタンパク質またはその配列および／または短縮バリアントのいずれかは、ＡＣＣのＣＰ１およびＣＰ２成分の片方または両方としての使用のために好適であり得る。成熟サイトカインタンパク質、ＣＰ１およびＣＰ２は、同じであるまたは異なっていてよい。ある特定の実施形態では、ＣＰ１およびＣＰ２は、同じである。他の実施形態では、ＣＰ１およびＣＰ２は、異なる。ＡＣＣは、ＣＰ１および／またはＣＰ２のＮおよび／またはＣ末端の片方または両方で追加のアミノ酸残基を含み得る。

いくつかの実施形態では、ＣＰ１および／またはＣＰ２は、インターフェロン（例えば、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターフェロンτ、およびインターフェロンωなど）、インターロイキン（例えば、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－１ＲＡ、ＩＬ－１８、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－３、ＩＬ－５、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－６、ＩＬ－１１、ＩＬ－２１など）、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＩＬ－１０、ＩＬ－２０、ＩＬ－１４、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＣＤ１５４、ＬＴ－β、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β、４－１ＢＢＬ、ＡＰＲＩＬ、ＣＤ７０、ＣＤ１５３、ＣＤ１７８、ＧＩＴＲＬ、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＡＬＬ－１、ＴＲＡＩＬ、ＴＷＥＡＫ、ＴＲＡＮＣＥ、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β３、ＥＰＯｏ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ－３Ｌ、ＳＣＦ、Ｍ－ＣＳＦ、およびＭＳＰ、など、ならびにそれらの配列および短縮バリアントからなる群から選択される成熟サイトカインタンパク質をそれぞれ独立に含み得る。例えば、このようなタンパク質の配列は、本明細書で例示されるものを含み、追加の配列は、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎから取得できる。本発明のＡＣＣでの使用に好適である短縮バリアントは、サイトカイン活性を保持する任意のＮまたはＣ末端短縮サイトカインを含む。本発明で採用される例示的短縮バリアントは、当技術分野において既知のいずれかの短縮サイトカインポリペプチド（例えば、Ｓｌｕｔｚｋｉｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６０：１０１９－１０３０，２００６，および米国特許出願公開第２００９／００２５１０６号を参照）、ならびにＮおよび／またはＣ末端で、１～約４０アミノ酸、１～約３５アミノ酸、１～約３０アミノ酸、１～約２５アミノ酸、１～約２０アミノ酸、１～約１５アミノ酸、１～約１０アミノ酸、１～約８アミノ酸、１～約６アミノ酸、１～約４アミノ酸だけ短縮され、サイトカイン活性を保持するサイトカインポリペプチドを含む。前述の実施形態のいくつかでは、短縮ＣＰは、Ｎ末端で短縮されたＣＰである。他の実施形態では、短縮ＣＰは、Ｃ末端で短縮されたＣＰである。特定の実施形態では、短縮ＣＰは、ＣおよびＮ末端で短縮されたＣＰである。

いくつかの実施形態では、ＣＰ１および／またはＣＰ２はそれぞれ、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８７、配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９０、配列番号１９１、配列番号１９２、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８、配列番号１９９、配列番号２００、配列番号２０１、配列番号２０２、配列番号２０３、配列番号２０４、配列番号２０５、配列番号２０６、配列番号２０７、配列番号２０８、および配列番号２０９からなる群から選択されるサイトカイン参照配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を独立に含む。配列同一性のパーセンテージは、配列アラインメントプログラム、例えば、インターネットのＮＣＢＩウェブサイトで公的に入手可能な１連のＢＬＡＳＴプログラムを使って整列される場合２つ以上のペプチド配列の間のアミノ酸配列同一性のレベルを指す。Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０，１９９０、も参照されたい。いくつかの態様では、ＡＣＣは、ＣＰ１またはＣＰ２として、インターフェロンα２ｂ変異体、例えば、位置Ｌ１３０に変異、例えば、Ｌ１３０Ｐ変異を有するインターフェロンα２ｂ分子を含む。いくつかの態様では、ＡＣＣは、位置Ｉ２４、Ｆ６４、Ｉ６０、Ｉ６３、Ｆ６４、Ｗ７６、Ｉ１１６、Ｌ１１７、Ｆ１２３、もしくはＬ１２８、またはこれらの組み合わせに変異を有するインターフェロンα２ｂ変異体を含む。例えば、インターフェロンα２ｂ変異体は、Ｉ１１６のＴ、Ｎ、もしくはＲ；Ｌ１２８のＮ、Ｈ、もしくはＲ；Ｉ２４のＰもしくはＱへの変異；変異Ｌ１１７Ｈ；またはＬ１２８Ｔ、またはこれらの組み合わせを含み得る。いくつかの態様では、インターフェロンα２ｂ変異体は、変異Ｉ２４Ｑ、Ｉ６０Ｔ、Ｆ６４Ａ、Ｗ７６Ｈ、Ｉ１１６Ｒ、およびＬ１２８Ｎ、またはこれらのサブセットを含み得る。いくつかの態様では、ＡＣＣは、ＣＰ１およびＣＰ２の１つとして、サイトカイン活性を欠く短縮インターフェロンα２ｂ分子を含む。例えば、短縮インターフェロンα２ｂは、１５１以下のアミノ酸のインターフェロンα２ｂ、例えば、野性型インターフェロンα２ｂ配列中のＮからＣ末端へのアミノ酸のいずれか：１～１５１、１～１５０、１～１４９、１～１４８、．．．１～１０、１～９、１～８、１～７、１～６、または２～１５１、３～１５１、４～１５１、５～１５０、６～１４９、７～１４８、８～１４７、またはこれらのアミノ酸の任意の介在配列もしくは変異体からなり得る。

ある特定の実施形態では、ＣＰ１および／またはＣＰ２は、インターフェロンを含む。ＣＰ１および／またはＣＰ２として、本発明の構築物での使用に好適であるインターフェロンは、例えば、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンω、およびインターフェロンτを含む。いくつかの実施形態では、インターフェロンがインターフェロンαである場合、それは、インターフェロンα２ａ、インターフェロンα２ｂ、またはインターフェロンα－ｎ３であり得る。インターフェロンαのさらなる例としては、インターフェロンα－１、インターフェロンα－４、インターフェロンα－５、インターフェロンα－６、インターフェロンα－７、インターフェロンα－８、インターフェロンα－１０、インターフェロンα－１３、インターフェロンα－１４、インターフェロンα－１６、インターフェロンα－１７、およびインターフェロンα－２１が挙げられる。いくつかの実施形態では、インターフェロンは、組換えまたは精製インターフェロンαである。特定の実施形態では、インターフェロンがインターフェロンβである場合、それは、インターフェロンβ－１ａ、およびインターフェロンβ－１ｂからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、ＣＰ１および／またはＣＰ２は、インターフェロンαまたはインターフェロンβのＩＦａｂドメインを含む。ＩＦａｂは、インターフェロンのサイトカイン放出および抗ウィルス機能に関与する。例示的ＩＦａｂ配列は、配列番号３２５～３３４で提供される。

いくつかの実施形態では、ＣＰ１および／またはＣＰ２は、インターフェロン活性を示し、配列番号１、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４および配列番号１０５からなる群より選択されるインターフェロンα参照配列と、少なくとも８０％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、インターフェロンα参照配列は、配列番号１（ヒトインターフェロンα２ｂ）である。いくつかの実施形態では、ＣＰ１および／またはＣＰ２は、配列番号１、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、および配列番号１０５からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する成熟αインターフェロンを含む。特定の実施形態では、ＣＰ１および／またはＣＰ２は、配列番号１のアミノ酸配列を有する成熟ヒトαインターフェロンを含む。上述の実施形態のいくつかでは、ＣＰ１およびＣＰ２は同じアミノ酸配列を含む。

他の実施形態では、ＣＰ１および／またはＣＰ２は、インターフェロン活性を示し、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、および配列番号１０９からなる群より選択されるインターフェロンβ参照配列と、少なくとも８０％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、インターフェロンβ参照配列は、配列番号１０６および配列番号１０７からなる群から選択されるヒトインターフェロンβ参照配列である。いくつかの実施形態では、ＣＰ１および／またはＣＰ２は、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、および配列番号１０９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する成熟βインターフェロンを含む。上述の実施形態のいくつかでは、ＣＰ１およびＣＰ２は同じアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＣＰ１および／またはＣＰ２は、インターフェロン活性を示し、配列番号１１０（ヒトインターフェロンω）に対応するインターフェロンω参照配列と、少なくとも８０％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＣＰ１および／またはＣＰ２は、配列番号１１０のアミノ酸配列を有する成熟ヒトωインターフェロンを含む。上述の実施形態のいくつかでは、ＣＰ１およびＣＰ２は同じアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＣＰ１および／またはＣＰ２は、インターロイキン活性を示し、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、および配列番号１６０からなる群から選択されるインターロイキン参照配列と少なくとも８０％同一、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＰ１および／またはＣＰ２は、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、および配列番号１６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する成熟インターロイキンを含む。上述の実施形態のいくつかでは、ＣＰ１およびＣＰ２は同じアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＣＰ１および／またはＣＰ２は、インターロイキン活性を示し、配列番号１１１（ヒトＩＬ－１α）、配列番号１１３（ヒトＩＬ－１β）、配列番号１１５（ヒトＩＬ－１ＲＡ）、配列番号１１７（ヒトＩＬ－１８）、配列番号１１９（ヒトＩＬ－２）、配列番号１２１（ヒトＩＬ－４）、配列番号１２３（ヒトＩＬ－７）、配列番号１２５（ヒトＩＬ－９）、配列番号１２７（ヒトＩＬ－１３）、配列番号１２９（ヒトＩＬ－１５）、配列番号１３１（ヒトＩＬ－３）、配列番号１３３（ヒトＩＬ－５）、配列番号１３７（ヒトＩＬ－６）、配列番号１３９（ヒトＩＬ－１１）、配列番号１４３（ヒトＩＬ－１２α）、配列番号１４４（ヒトＩＬ－１２β）、配列番号１５１（ヒトＩＬ－１０）、配列番号１５３（ヒトＩＬ－２０）；配列番号１５５（ヒトＩＬ－１４）、配列番号１５７（ヒトＩＬ－１６）、および配列番号１５９（ヒトＩＬ－１７）からなる群から選択されるインターロイキン参照配列と少なくとも８０％同一、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。特定のこれらの実施形態では、ＣＰ１および／またはＣＰ２は、配列番号１１１（ヒトＩＬ－１α）、配列番号１１３（ヒトＩＬ－１β）、配列番号１１５（ヒトＩＬ－１ＲＡ）、配列番号１１７（ヒトＩＬ－１８）、配列番号１１９（ヒトＩＬ－２）、配列番号１２１、配列番号１２３（ヒトＩＬ－７）、配列番号１２５（ヒトＩＬ－９）、配列番号１２７（ヒトＩＬ－１３）、配列番号１２９（ヒトＩＬ－１５）、配列番号１３１（ヒトＩＬ－３）、配列番号１３３（ヒトＩＬ－５）、配列番号１３７（ヒトＩＬ－６）、配列番号１３９（ヒトＩＬ－１１）、配列番号１４３（ヒトＩＬ－１２α）、配列番号１４４（ヒトＩＬ－１２β）、配列番号１５１（ヒトＩＬ－１０）、配列番号１５３（ヒトＩＬ－２０）；配列番号１５５（ヒトＩＬ－１４）、配列番号１５７（ヒトＩＬ－１６）、および配列番号１５９（ヒトＩＬ－１７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。上述の実施形態のいくつかでは、ＣＰ１およびＣＰ２は同じアミノ酸配列を含む。

用いられるサイトカインタンパク質の配列のアミノ酸の数は、用いられる特定のサイトカインタンパク質に応じて変わり得る。いくつかの実施形態では、ＣＰ１および／またはＣＰ２は、合計約１０アミノ酸～約７００アミノ酸、約１０アミノ酸～約６５０アミノ酸、約１０アミノ酸～約６００アミノ酸、約１０アミノ酸～約５５０アミノ酸、約１０アミノ酸～約５００アミノ酸、約１０アミノ酸～約４５０アミノ酸、約１０アミノ酸～約４００アミノ酸、約１０アミノ酸～約３５０アミノ酸、約１０アミノ酸～約３００アミノ酸、約１０アミノ酸～約２５０アミノ酸、約１０アミノ酸～約２００アミノ酸、約１０アミノ酸～約１５０アミノ酸、約１０アミノ酸～約１００アミノ酸、約１０アミノ酸～約８０アミノ酸、約１０アミノ酸～約６０アミノ酸、約１０アミノ酸～約４０アミノ酸、約１０アミノ酸～約２０アミノ酸、約２０アミノ酸～約７００アミノ酸、約２０アミノ酸～約６５０アミノ酸、約２０アミノ酸～約６００アミノ酸、約２０アミノ酸～約５５０アミノ酸、約２０アミノ酸～約５００アミノ酸、約２０アミノ酸～約４５０アミノ酸、約２０アミノ酸～約４００アミノ酸、約２０アミノ酸～約３５０アミノ酸、約２０アミノ酸～約３００アミノ酸、約２０アミノ酸～約２５０アミノ酸、約２０アミノ酸～約２００アミノ酸、約２０アミノ酸～約１５０アミノ酸、約２０アミノ酸～約１００アミノ酸、約２０アミノ酸～約８０アミノ酸、約２０アミノ酸～約６０アミノ酸、約２０アミノ酸～約４０アミノ酸、約４０アミノ酸～約７００アミノ酸、約４０アミノ酸～約６５０アミノ酸、約４０アミノ酸～約６００アミノ酸、約４０アミノ酸～約５５０アミノ酸、約４０アミノ酸～約５００アミノ酸、約４０アミノ酸～約４５０アミノ酸、約４０アミノ酸～約４００アミノ酸、約４０アミノ酸～約３５０アミノ酸、約４０アミノ酸～約３００アミノ酸、約４０アミノ酸～約２５０アミノ酸、約４０アミノ酸～約２００アミノ酸、約４０アミノ酸～約１５０アミノ酸、約４０アミノ酸～約１００アミノ酸、約４０アミノ酸～約８０アミノ酸、約４０アミノ酸～約６０アミノ酸、約６０アミノ酸～約７００アミノ酸、約６０アミノ酸～約６５０アミノ酸、約６０アミノ酸～約６００アミノ酸、約６０アミノ酸～約５５０アミノ酸、約６０アミノ酸～約５００アミノ酸、約６０アミノ酸～約４５０アミノ酸、約６０アミノ酸～約４００アミノ酸、約６０アミノ酸～約３５０アミノ酸、約６０アミノ酸～約３００アミノ酸、約６０アミノ酸～約２５０アミノ酸、約６０アミノ酸～約２００アミノ酸、約６０アミノ酸～約１５０アミノ酸、約６０アミノ酸～約１００アミノ酸、約６０アミノ酸～約８０アミノ酸、約８０アミノ酸～約７００アミノ酸、約８０アミノ酸～約６５０アミノ酸、約８０アミノ酸～約６００アミノ酸、約８０アミノ酸～約５５０アミノ酸、約８０アミノ酸～約５００アミノ酸、約８０アミノ酸～約４５０アミノ酸、約８０アミノ酸～約４００アミノ酸、約８０アミノ酸～約３５０アミノ酸、約８０アミノ酸～約３００アミノ酸、約８０アミノ酸～約２５０アミノ酸、約８０アミノ酸～約２００アミノ酸、約８０アミノ酸～約１５０アミノ酸、約８０アミノ酸～約１００アミノ酸、約１００アミノ酸～約７００アミノ酸、約１００アミノ酸～約６５０アミノ酸、約１００アミノ酸～約６００アミノ酸、約１００アミノ酸～約５５０アミノ酸、約１００アミノ酸～約５００アミノ酸、約１００アミノ酸～約４５０アミノ酸、約１００アミノ酸～約４００アミノ酸、約１００アミノ酸～約３５０アミノ酸、約１００アミノ酸～約３００アミノ酸、約１００アミノ酸～約２５０アミノ酸、約１００アミノ酸～約２００アミノ酸、約１００アミノ酸～約１５０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約７００アミノ酸、約１５０アミノ酸～約６５０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約６００アミノ酸、約１５０アミノ酸～約５５０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約５００アミノ酸、約１５０アミノ酸～約４５０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約４００アミノ酸、約１５０アミノ酸～約３５０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約３００アミノ酸、約１５０アミノ酸～約２５０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約２００アミノ酸、約２００アミノ酸～約７００アミノ酸、約２００アミノ酸～約６５０アミノ酸、約２００アミノ酸～約６００アミノ酸、約２００アミノ酸～約５５０アミノ酸、約２００アミノ酸～約５００アミノ酸、約２００アミノ酸～約４５０アミノ酸、約２００アミノ酸～約４００アミノ酸、約２００アミノ酸～約３５０アミノ酸、約２００アミノ酸～約３００アミノ酸、約２００アミノ酸～約２５０アミノ酸、約２５０アミノ酸～約７００アミノ酸、約２５０アミノ酸～約６５０アミノ酸、約２５０アミノ酸～約６００アミノ酸、約２５０アミノ酸～約５５０アミノ酸、約２５０アミノ酸～約５００アミノ酸、約２５０アミノ酸～約４５０アミノ酸、約２５０アミノ酸～約４００アミノ酸、約２５０アミノ酸～約３５０アミノ酸、約２５０アミノ酸～約３００アミノ酸、約３００アミノ酸～約７００アミノ酸、約３００アミノ酸～約６５０アミノ酸、約３００アミノ酸～約６００アミノ酸、約３００アミノ酸～約５５０アミノ酸、約３００アミノ酸～約５００アミノ酸、約３００アミノ酸～約４５０アミノ酸、約３００アミノ酸～約４００アミノ酸、約３００アミノ酸～約３５０アミノ酸、約３５０アミノ酸～約７００アミノ酸、約３５０アミノ酸～約６５０アミノ酸、約３５０アミノ酸～約６００アミノ酸、約３５０アミノ酸～約５５０アミノ酸、約３５０アミノ酸～約５００アミノ酸、約３５０アミノ酸～約４５０アミノ酸、約３５０アミノ酸～約４００アミノ酸、約４００アミノ酸～約７００アミノ酸、約４００アミノ酸～約６５０アミノ酸、約４００アミノ酸～約６００アミノ酸、約４００アミノ酸～約５５０アミノ酸、約４００アミノ酸～約５００アミノ酸、約４００アミノ酸～約４５０アミノ酸、約４５０アミノ酸～約７００アミノ酸、約４５０アミノ酸～約６５０アミノ酸、約４５０アミノ酸～約６００アミノ酸、約４５０アミノ酸～約５５０アミノ酸、約４５０アミノ酸～約５００アミノ酸、約５００アミノ酸～約７００アミノ酸、約５００アミノ酸～約６５０アミノ酸、約５００アミノ酸～約６００アミノ酸、約５００アミノ酸～約５５０アミノ酸、約５５０アミノ酸～約７００アミノ酸、約５５０アミノ酸～約６５０アミノ酸、約５５０アミノ酸～約６００アミノ酸、約６００アミノ酸～約７００アミノ酸、約６００アミノ酸～約６５０アミノ酸、または約６５０アミノ酸～約７００アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ＣＰ１および／またはＣＰ２は、成熟野生型ヒトサイトカインタンパク質である。

ＡＣＣの各モノマー構築物は、種々のダイマー化ドメインのいずれかを用い得る。好適なＤＤは、ポリマー（例えば、合成ポリマー、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、など）および小分子（約１キロダルトン未満、場合により約８００ダルトン未満の分子量を有する非ポリマー部分）の両方の部分を含む。ＤＤ対は、相互に結合することが当技術分野において既知である任意の部分の対であってよい。

例えば、いくつかの実施形態では、ＤＤ１およびＤＤ２は、ヒトＩＬ－１５受容体のアルファ鎖（ＩＬ１５Ｒα）由来のスシドメインと可溶性ＩＬ－１５；バルナーゼとバルンスター；ＰＫＡとＡＫＡＰ；変異ＲＮアーゼＩフラグメントをベースにしたアダプター／ドッキングタグモジュール；１対の抗原結合ドメイン（例えば、１対の単一ドメイン抗体）；タンパク質シンタキシン、シナプトタグミン、シナプトブレビン、およびＳＮＡＰ２５の相互作用に基づく可溶性Ｎ－エチルマレイミド感受性因子付着タンパク質受容体（ＳＮＡＲＥ）モジュール；単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）および対応するエピトープ；抗原結合ドメイン（例えば、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体などの単鎖抗体）および対応するエピトープ；コイルドコイルポリペプチド構造（例えば、Ｆｏｓ－Ｊｕｎコイルドコイル構造、酸／塩基コイルドコイルヘリックス、Ｇｌｕ－Ｌｙｓコイルドコイルヘリックス、ロイシンジッパー構造）、ビオチンとアビジンまたはストレプトアビジンなどの小分子結合対、アミン／アルデヒド、レクチン／炭水化物；例えば、１対の硫黄またはチオール含有ポリマー（例えば、１対のＦｃドメイン、１対のチオール化ヒト血清アルブミンポリペプチド、など）などの相互に結合できる１対のポリマー；などの群より選択される対のメンバーである。

いくつかの実施形態では、ＤＤ１およびＤＤ２は、非ポリペプチドポリマーである。非ポリペプチドポリマーは、相互に共有結合し得る。いくつかの実施例では、非ポリペプチドポリマーは、硫黄含有ポリマー、例えば、硫黄含有ポリエチレングリコールであり得る。このような場合、ＤＤ１およびＤＤ２は、１つまたは複数のジスルフィド結合を介して相互に共有結合し得る。

ＤＤ１およびＤＤ２の対が１対のエピトープおよび抗原結合ドメインのメンバーである場合、エピトープは、天然のまたは非天然起源のエピトープであり得る。例示的非天然起源エピトープは、例えば、ポリ－Ｈｉｓペプチド（例えば、Ｈｉｓタグ、など）などの非天然起源のペプチドを含む。

ある特定の実施形態では、ＤＤ１およびＤＤ２は、１対のＦｃドメインである。本明細書で使用される場合、「Ｆｃドメイン」は、免疫グロブリンの単一重鎖の連続アミノ酸配列を指す。１対のＦｃドメインは、一緒に結合して、免疫グロブリンのＦｃ領域を形成する。

いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン対は、１対のヒトＦｃドメイン（例えば、１対の野生型ヒトＦｃドメイン）である。いくつかの実施形態では、ヒトＦｃドメインは、ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメイン（例えば、野生型ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメイン）、ヒトＩｇＧ２Ｆｃドメイン（例えば、野生型ヒトＩｇＧ２Ｆｃドメイン）、ヒトＩｇＧ３Ｆｃドメイン（例えば、野生型ヒトＩｇＧ３Ｆｃドメイン）、またはヒトＩｇＧ４Ｆｃドメイン（例えば、野生型ヒトＩｇＧ４Ｆｃドメイン）である。いくつかの実施形態では、ヒトＦｃドメインは、配列番号３と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）である配列を含む。

いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン対は、Ｆｃドメインのノブ変異体およびホール変異体を含む。ノブおよびホール変異体は、相互に作用して、ダイマー化を促進し得る。いくつかの実施形態では、ノブおよびホール変異体は、２つのＦｃドメイン（例えば、ＣＨ３ドメイン中の）の間の境界内に１つまたは複数のアミノ酸改変を含み得る。一例では、改変は、抗体重鎖の１つに、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｗおよび任意選択で、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ、ならびに抗体重鎖の別の１つに、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖおよび任意選択で、Ｙ３４９Ｃを含む（ＫａｂａｔナンバリングシステムのＥＵインデックスによるナンバリング）。ノブおよびホール変異体の例は、配列番号３１５および３１６のＦｃ変異体、ならびに米国特許第５，７３１，１６８号；同第７，６９５，９３６号；および同第１０，６８３，３６８号に記載されたものを含み、これらの特許は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ダイマー化ドメインは、それぞれ、配列番号３１５または３１６と、少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）である配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＤＤ１および／またはＤＤ２は、血清半減期延長部分（例えば、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）などの血清タンパク質を結合するポリペプチド）または血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ））をさらに含んでよい。半減期延長部分の例としては、Ｈｅｘａ－ｈａｔＧＳＴ（グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ）グルタチオン親和性、カルモデュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ、セルロース結合ドメイン、マルトース結合タンパク質、Ｓ－ペプチドタグ、キチン結合タグ、免疫反応性エピトープ、エピトープタグ，Ｅ２Ｔａｇ、ＨＡエピトープタグ、Ｍｙｃエピトープ、ＦＬＡＧエピトープ、ＡＵ１およびＡＵ５エピトープ、Ｇｌｕ－Ｇｌｕエピトープ、ＫＴ３エピトープ、ＩＲＳエピトープ、Ｂｔａｇエピトープ、プロテインキナーゼＣエピトープおよびＶＳＶエピトープ、が挙げられる。

いくつかの実施形態では、ＤＤ１および／またはＤＤ２はそれぞれ、合計約５アミノ酸～約２５０アミノ酸、約５アミノ酸～約２００アミノ酸、約５アミノ酸～約１８０アミノ酸、約５アミノ酸～約１６０アミノ酸、約５アミノ酸～約１４０アミノ酸、約５アミノ酸～約１２０アミノ酸、約５アミノ酸～約１００アミノ酸、約５アミノ酸～約８０アミノ酸、約５アミノ酸～約６０アミノ酸、約５アミノ酸～約４０アミノ酸、約５アミノ酸～約２０アミノ酸、約５アミノ酸～約１０アミノ酸、約１０アミノ酸～約２５０アミノ酸、約１０アミノ酸～約２００アミノ酸、約１０アミノ酸～約１８０アミノ酸、約１０アミノ酸～約１６０アミノ酸、約１０アミノ酸～約１４０アミノ酸、約１０アミノ酸～約１２０アミノ酸、約１０アミノ酸～約１００アミノ酸、約１０アミノ酸～約８０アミノ酸、約１０アミノ酸～約６０アミノ酸、約１０アミノ酸～約４０アミノ酸、約１０アミノ酸～約２０アミノ酸、約２０アミノ酸～約２５０アミノ酸、約２０アミノ酸～約２００アミノ酸、約２０アミノ酸～約１８０アミノ酸、約２０アミノ酸～約１６０アミノ酸、約２０アミノ酸～約１４０アミノ酸、約２０アミノ酸～約１２０アミノ酸、約２０アミノ酸～約１００アミノ酸、約２０アミノ酸～約８０アミノ酸、約２０アミノ酸～約６０アミノ酸、約２０アミノ酸～約４０アミノ酸、約４０アミノ酸～約２５０アミノ酸、約４０アミノ酸～約２００アミノ酸、約４０アミノ酸～約１８０アミノ酸、約４０アミノ酸～約１６０アミノ酸、約４０アミノ酸～約１４０アミノ酸、約４０アミノ酸～約１２０アミノ酸、約４０アミノ酸～約１００アミノ酸、約４０アミノ酸～約８０アミノ酸、約４０アミノ酸～約６０アミノ酸、約６０アミノ酸～約２５０アミノ酸、約６０アミノ酸～約２００アミノ酸、約６０アミノ酸～約１８０アミノ酸、約６０アミノ酸～約１６０アミノ酸、約６０アミノ酸～約１４０アミノ酸、約６０アミノ酸～約１２０アミノ酸、約６０アミノ酸～約１００アミノ酸、約６０アミノ酸～約８０アミノ酸、約８０アミノ酸～約２５０アミノ酸、約８０アミノ酸～約２００アミノ酸、約８０アミノ酸～約１８０アミノ酸、約８０アミノ酸～約１６０アミノ酸、約８０アミノ酸～約１４０アミノ酸、約８０アミノ酸～約１２０アミノ酸、約８０アミノ酸～約１００アミノ酸、約１００アミノ酸～約２５０アミノ酸、約１００アミノ酸～約２００アミノ酸、約１００アミノ酸～約１８０アミノ酸、約１００アミノ酸～約１６０アミノ酸、約１００アミノ酸～約１４０アミノ酸、約１００アミノ酸～約１２０アミノ酸、約１２０アミノ酸～約２５０アミノ酸、約１２０アミノ酸～約２００アミノ酸、約１２０アミノ酸～約１８０アミノ酸、約１２０アミノ酸～約１６０アミノ酸、約１２０アミノ酸～約１４０アミノ酸、約１４０アミノ酸～約２５０アミノ酸、約１４０アミノ酸～約２００アミノ酸、約１４０アミノ酸～約１８０アミノ酸、約１４０アミノ酸～約１６０アミノ酸、約１６０アミノ酸～約２５０アミノ酸、約１６０アミノ酸～約２００アミノ酸、約１６０アミノ酸～約１８０アミノ酸、約１８０アミノ酸～約２５０アミノ酸、約１８０アミノ酸～約２００アミノ酸、または約２００アミノ酸～約２５０アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ＤＤ１およびＤＤ２はそれぞれ、２つのシステイン残基、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含むヒンジ領域の一部を含むＦｃドメインである。いくつかの実施形態では、ＤＤ１およびＤＤ２はそれぞれ、そのＮ末端がＮからＣ方向に読み取られるヒンジ領域中の第１のシステイン残基（例えば、ＥＵナンバリングを用いて、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４のシステイン２２６）である、Ｆｃドメインである。

いくつかの態様では、直接にまたは間接的に（例えば、リンカーを介して）ＣＰとＤＤ成分の間に配置されるのは、プロテアーゼの基質を含む切断可能部分である。いくつかの実施形態では、ＣＭ１およびＣＭ２は、ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭ１５、ＡＤＡＭ１７／ＴＡＣＥ、ＡＤＥＭＤＥＣ１、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＤＡＭＴＳ５、ＢＡＣＥ、レニン、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、カスパーゼ１４、カテプシンＡ、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＧ、カテプシンＫ、カテプシンＬ、カテプシンＳ、カテプシンＶ／Ｌ２、カテプシンＸ／Ｚ／Ｐ、キマーゼ、クルジパイン、ＤＥＳＣ１、ＤＰＰ－４、ＦＡＰ、レグマイン、オツバイン－２、エラスターゼ、ＦＶＩＩａ、ＦｉＸＡ、ＦＸａ、ＦＸＩａ、ＦＸＩＩａ、グランザイムＢ、グアニジノベンゾアターゼ、ヘプシン、ＨｔｒＡ１、ヒト好中球エラスターゼ、ＫＬＫ４、ＫＬＫ５、ＫＬＫ６、ＫＬＫ７、ＫＬＫ８、ＫＬＫ１０、ＫＬＫ１１、ＫＬＫ１３、ＫＬＫ１４、ラクトフェリン、マラプシン、マトリプターゼ－２、メプリン、ＭＴ－ＳＰ１／マトリプターゼ、ネプリライシン、ＮＳ３／４Ａ、ＰＡＣＥ４、プラスミン、ＰＳＭＡ、ＰＳＡ、ＢＭＰ－１、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ７、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１２、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１５、ＭＭＰ１６、ＭＭＰ１７、ＭＭＰ１９、ＭＭＰ２０、ＭＭＰ２３、ＭＭＰ２４、ＭＭＰ２６、ＭＭＰ２７、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＭＰＲＳＳ３、ＴＭＰＲＳＳ４、ｔＰａ、トロンビン、トリプターゼ、およびｕＰＡ、からなる群より選択されるプロテアーゼの基質をそれぞれ独立に含み得る。

本明細書で記載のいずれかのＡＣＣのいくつかの実施形態では、本明細書で記載のＣＭのいずれかを切断するプロテアーゼは、ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭ１５、ＡＤＡＭ１７／ＴＡＣＥ、ＡＤＡＭＤＥＣ１、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＤＡＭＴＳ５、ＢＡＣＥ、レニン、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、カスパーゼ１４、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＫ、カテプシンＬ、カテプシンＳ、カテプシンＶ／Ｌ２、カテプシンＸ／Ｚ／Ｐ、クルジパイン、レグマイン、オツバイン－２、ＫＬＫ４、ＫＬＫ５、ＫＬＫ６、ＫＬＫ７、ＫＬＫ８、ＫＬＫ１０、ＫＬＫ１１、ＫＬＫ１３、ＫＬＫ１４、メプリン、ネプリライシン、ＰＳＭＡ、ＢＭＰ－１、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－３、ＭＭＰ－７、ＭＭＰ－９、ＭＭＰ－１０、ＭＭＰ－１１、ＭＭＰ－１２、ＭＭＰ－１３、ＭＭＰ－１４、ＭＭＰ－１５、ＭＭＰ－１６、ＭＭＰ－１７、ＭＭＰ－１９、ＭＭＰ－２０、ＭＭＰ－２３、ＭＭＰ－２４、ＭＭＰ－２６、ＭＭＰ－２７、活性化タンパク質Ｃ、カテプシンＡ、カテプシンＧ、キマーゼ、ＦＶＩＩａ、ＦＩＸａ、ＦＸａ、ＦＸＩａ、ＦＸＩＩａ、エラスターゼ、グランザイムＢ、グアニジノベンゾアターゼ、ＨｔｒＡ１、ヒト好中球リアーゼ、ラクトフェリン、マラプシン、ＮＳ３／４Ａ、ＰＡＣＥ４、プラスミン、ＰＳＡ、ｔＰＡ、トロンビン、トリプターゼ、ｕＰＡ、ＤＥＳＣ１、ＤＰＰ－４、ＦＡＰ、ヘプシン、マトリプターゼ－２、ＭＴ－ＳＰ１／マトリプターゼ、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＭＰＲＳＳ３、およびＴＭＰＲＳＳ４であり得る。

本明細書で記載のいずれかのＡＣＣのいくつかの実施形態では、プロテアーゼは、ｕＰＡ、レグマイン、ＭＴ－ＳＰ１、ＡＤＡＭ１７、ＢＭＰ－１、ＴＭＰＲＳＳ３、ＴＭＰＲＳＳ４、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－９、ＭＭＰ－１２、ＭＭＰ－１３、およびＭＭＰ－１４からなる群から選択される。

既知の基質を有するプロテアーゼの増大されたレベルは、いくつかの癌で報告されている。例えば、ＬａＲｏｃａｅｔａｌ．，ＢｒｉｔｉｓｈＪ．Ｃａｎｃｅｒ９０（７）：１４１４－１４２１，２００４を参照されたい。本明細書で用いられるＣＭ１および／またはＣＭ２成分での使用に好適な基質は、癌細胞および組織中により広く認められるものを含む。従って、特定の実施形態では、ＣＭ１および／またはＣＭ２はそれぞれ独立に、癌に関連する患部組織中により広く認められるプロテアーゼに対する基質を含む。いくつかの実施形態では、癌は、胃癌、乳癌、骨肉腫、および食道癌からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、癌は、乳癌である。いくつかの実施形態では、癌は、ＨＥＲ２陽性癌である。いくつかの実施形態では、癌は、カポジ肉腫、毛様細胞性白血病、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、濾胞性リンパ腫、腎細胞癌（ＲＣＣ）、メラノーマ、神経芽腫、基底細胞癌、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、鼻咽頭腺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、ＢＣＧ抵抗性筋層非浸潤性膀胱癌（ＮＭＩＢＣ）、子宮内膜癌、膵臓癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、結腸直腸癌、食道癌、胆嚢癌、神経膠腫、頭頸部癌、子宮癌、子宮頸癌、または精巣癌、などである。上述の実施形態のいくつかでは、ＣＭ成分は、腫瘍組織中により広く存在するプロテアーゼのための基質を含む。

いくつかの実施形態では、ＣＭ１および／またはＣＭ２はそれぞれ独立に、配列番号５～配列番号１００からなる群より選択される配列、ならびにそのＣ末端およびＮ末端短縮バリアントを含む。

いくつかの実施形態では、ＣＭは、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号２８）、ＬＳＧＲＳＤＤＨ（配列番号３３）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＱＨ（配列番号５４）、およびＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＮＩ（配列番号６８）の群より選択される配列を含む。

特定の実施形態では、ＣＭ１および／またはＣＭ２は、ＡＰＲＳＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号２６３）、ＡＱＮＬＬＧＭＹ（配列番号２６４）、ＬＳＧＲＳＤＮＨＧＧＡＶＧＬＬＡＰＰ（配列番号２６５）、ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＧＧＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号２６６）、ＬＳＧＲＳＤＮＨＧＧＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ（配列番号２６７）、ＬＳＧＲＳＤＮＨＧＧＳＧＧＳＩＳＳＧＬＬＳＳ（配列番号２６８）、ＩＳＳＧＬＬＳＳＧＧＳＧＧＳＬＳＧＲＳＧＮＨ（配列番号２６９）、ＬＳＧＲＳＤＮＨＧＧＳＧＧＳＱＮＱＡＬＲＭＡ（配列番号２７０）、ＱＮＱＡＬＲＭＡＧＧＳＧＧＳＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号２７１）、ＬＳＧＲＳＧＮＨＧＧＳＧＧＳＱＮＱＡＬＲＭＡ（配列番号２７２）、ＱＮＱＡＬＲＭＡＧＧＳＧＧＳＬＳＧＲＳＧＮＨ（配列番号２７３）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＧＮＨ（配列番号２７４）、ならびにこれらのＣ末端およびＮ末端短縮バリアント、からなる群から選択される配列を含む。ＣＭの例は、米国特許出願公開第２０１６／０２８９３２４号、同２０１９／０２８４２８３号、国際公開第２０１０／０８１１７３号、同２０１５／０４８３２９号、同２０１５／１１６９３３号、同２０１６／１１８６２９号、および同２０２０／１１８１０９号で記載のものも含む。これらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

ＣＭ１および／またはＣＭ２での使用に好適である上述のアミノ酸配列の短縮バリアントは、対応するプロテアーゼのために認識部位を保持するいずれかのバリアントである。これらは、上述したアミノ酸配列の少なくとも３連続アミノ酸、またはまたはプロテアーゼの認識部位を保持する前述のアミノ酸配列の少なくとも４、または少なくとも５、または少なくとも６、少なくとも７アミノ酸を含む、Ｃ末端および／またはＮ末端短縮バリアントを含む。特定の実施形態では、上述したアミノ酸配列の短縮バリアントは、上記のいずれかに対応するアミノ酸配列であるが、１～約１０アミノ酸、１～約９アミノ酸、１～約８アミノ酸、１～約７アミノ酸、１～約６アミノ酸、１～約５アミノ酸、１～約４アミノ酸、１～約３アミノ酸だけ短縮されたＣおよび／またはＮ末端であり、（１）少なくとも３つのアミノ酸残基を有し、（２）プロテアーゼの認識部位を保持するものである。前述の実施形態のいくつかでは、短縮ＣＭは、Ｎ末端で短縮されたＣＭである。いくつかの実施形態では、短縮ＣＭは、Ｃ末端で短縮されたＣＭである。いくつかの実施形態では、短縮ＣＭは、ＣおよびＮ末端で短縮されたＣＭである。

本明細書で記載のいずれかの活性化可能サイトカイン構築物のいくつかの実施形態では、ＣＭ１および／またはＣＭ２は、合計約３アミノ酸～約２５アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭ１および／またはＣＭ２は、合計約３アミノ酸～約２５アミノ酸、約３アミノ酸～約２０アミノ酸、約３アミノ酸～約１５アミノ酸、約３アミノ酸～約１０アミノ酸、約３アミノ酸～約５アミノ酸、約５アミノ酸～約２５アミノ酸、約５アミノ酸～約２０アミノ酸、約５アミノ酸～約１５アミノ酸、約５アミノ酸～約１０アミノ酸、約１０アミノ酸～約２５アミノ酸、約１０アミノ酸～約２０アミノ酸、約１０アミノ酸～約１５アミノ酸、約１５アミノ酸～約２５アミノ酸、約１５アミノ酸～約２０アミノ酸、または約２０アミノ酸～約２５アミノ酸を含む。

いくつかの実施形態では、ＡＣＣは、異なるプロテアーゼのための基質を含む複数のＣＭを含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＭ１およびＣＭ２は、異なるプロテアーゼのための基質を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭ１およびＣＭ２は、同じプロテアーゼのためのための基質を含む。

第１および第２のモノマー構築物は、１つまたは複数のリンカーなどを含む１つまたは複数の追加の成分を含み得る。いくつかの実施形態では、第１のモノマーは、ＣＰ１とＣＭ１の間に配置されるリンカーを含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＰ１およびＣＭ１は、第１のモノマー中で相互に直接に隣接している。いくつかの実施形態では、第１のモノマーは、ＣＭ１とＤＤ１の間に配置されるリンカーを含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、１アミノ酸～約１５アミノ酸の全長を有する。いくつかの実施形態では、ＣＭ１およびＤＤ１は、第１のモノマー中で相互に直接に隣接している。いくつかの実施形態では、ＣＭおよびＣＰ１とＤＤ１の間に配置される任意のリンカーは、３～１５アミノ酸、または３～１０アミノ酸、または３～７アミノ酸の合わせた全長を有する。

いくつかの実施形態では、第２のモノマーは、ＣＰ２とＣＭ２の間に配置されるリンカーを含む。いくつかの実施形態では、ＣＰ２およびＣＭ２は、第２のモノマー構築物中で相互に直接に隣接している。いくつかの実施形態では、第２のモノマーは、ＣＭ２とＤＤ２の間に配置されるリンカーを含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、１アミノ酸～約１５アミノ酸の全長を有する。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＳ（配列番号２）の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭ２（例えば、本明細書で記載の切断可能部分のいずれか）およびＤＤ２（例えば、本明細書で記載のＤＤのいずれか）は、第２のモノマー中で相互に直接に隣接している。いくつかの実施形態では、ＣＭおよびＣＰ２とＤＤ２の間に配置される任意のリンカーは、３～１５アミノ酸、または３～１０アミノ酸、または３～７アミノ酸の合わせた全長を有する。

いくつかの実施形態では、第１のモノマーおよび／または第２のモノマーは、合計約５０アミノ酸～約８００アミノ酸、約５０アミノ酸～約７５０アミノ酸、約５０アミノ酸～約７００アミノ酸、約５０アミノ酸～約６５０アミノ酸、約５０アミノ酸～約６００アミノ酸、約５０アミノ酸～約５５０アミノ酸、約５０アミノ酸～約５００アミノ酸、約５０アミノ酸～約４５０アミノ酸、約５０アミノ酸～約４００アミノ酸、約５０アミノ酸～約３５０アミノ酸、約５０アミノ酸～約３００アミノ酸、約５０アミノ酸～約２５０アミノ酸、約５０アミノ酸～約２００アミノ酸、約５０アミノ酸～約１５０アミノ酸、約５０アミノ酸～約１００アミノ酸、約１００アミノ酸～約８００アミノ酸、約１００アミノ酸～約７５０アミノ酸、約１００アミノ酸～約７００アミノ酸、約１００アミノ酸～約６５０アミノ酸、約１００アミノ酸～約６００アミノ酸、約１００アミノ酸～約５５０アミノ酸、約１００アミノ酸～約５００アミノ酸、約１００アミノ酸～約４５０アミノ酸、約１００アミノ酸～約４００アミノ酸、約１００アミノ酸～約３５０アミノ酸、約１００アミノ酸～約３００アミノ酸、約１００アミノ酸～約２５０アミノ酸、約１００アミノ酸～約２００アミノ酸、約１００アミノ酸～約１５０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約８００アミノ酸、約１５０アミノ酸～約７５０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約７００アミノ酸、約１５０アミノ酸～約６５０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約６００アミノ酸、約１５０アミノ酸～約５５０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約５００アミノ酸、約１５０アミノ酸～約４５０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約４００アミノ酸、約１５０アミノ酸～約３５０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約３００アミノ酸、約１５０アミノ酸～約２５０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約２００アミノ酸、約２００アミノ酸～約８００アミノ酸、約２００アミノ酸～約７５０アミノ酸、約２００アミノ酸～約７００アミノ酸、約２００アミノ酸～約６５０アミノ酸、約２００アミノ酸～約６００アミノ酸、約２００アミノ酸～約５５０アミノ酸、約２００アミノ酸～約５００アミノ酸、約２００アミノ酸～約４５０アミノ酸、約２００アミノ酸～約４００アミノ酸、約２００アミノ酸～約３５０アミノ酸、約２００アミノ酸～約３００アミノ酸、約２００アミノ酸～約２５０アミノ酸、約２５０アミノ酸～約８００アミノ酸、約２５０アミノ酸～約７５０アミノ酸、約２５０アミノ酸～約７００アミノ酸、約２５０アミノ酸～約６５０アミノ酸、約２５０アミノ酸～約６００アミノ酸、約２５０アミノ酸～約５５０アミノ酸、約２５０アミノ酸～約５００アミノ酸、約２５０アミノ酸～約４５０アミノ酸、約２５０アミノ酸～約４００アミノ酸、約２５０アミノ酸～約３５０アミノ酸、約２５０アミノ酸～約３００アミノ酸、約３００アミノ酸～約８００アミノ酸、約３００アミノ酸～約７５０アミノ酸、約３００アミノ酸～約７００アミノ酸、約３００アミノ酸～約６５０アミノ酸、約３００アミノ酸～約６００アミノ酸、約３００アミノ酸～約５５０アミノ酸、約３００アミノ酸～約５００アミノ酸、約３００アミノ酸～約４５０アミノ酸、約３００アミノ酸～約４００アミノ酸、約３００アミノ酸～約３５０アミノ酸、約３５０アミノ酸～約８００アミノ酸、約３５０アミノ酸～約７５０アミノ酸、約３５０アミノ酸～約７００アミノ酸、約３５０アミノ酸～約６５０アミノ酸、約３５０アミノ酸～約６００アミノ酸、約３５０アミノ酸～約５５０アミノ酸、約３５０アミノ酸～約５００アミノ酸、約３５０アミノ酸～約４５０アミノ酸、約３５０アミノ酸～約４００アミノ酸、約４００アミノ酸～約８００アミノ酸、約４００アミノ酸～約７５０アミノ酸、約４００アミノ酸～約７００アミノ酸、約４００アミノ酸～約６５０アミノ酸、約４００アミノ酸～約６００アミノ酸、約４００アミノ酸～約５５０アミノ酸、約４００アミノ酸～約５００アミノ酸、約４００アミノ酸～約４５０アミノ酸、約４５０アミノ酸～約８００アミノ酸、約４５０アミノ酸～約７５０アミノ酸、約４５０アミノ酸～約７００アミノ酸、約４５０アミノ酸～約６５０アミノ酸、約４５０アミノ酸～約６００アミノ酸、約４５０アミノ酸～約５５０アミノ酸、約４５０アミノ酸～約５００アミノ酸、約５００アミノ酸～約８００アミノ酸、約５００アミノ酸～約７５０アミノ酸、約５００アミノ酸～約７００アミノ酸、約５００アミノ酸～約６５０アミノ酸、約５００アミノ酸～約６００アミノ酸、約５００アミノ酸～約５５０アミノ酸、約５５０アミノ酸～約８００アミノ酸、約５５０アミノ酸～約７５０アミノ酸、約５５０アミノ酸～約７００アミノ酸、約５５０アミノ酸～約６５０アミノ酸、約５５０アミノ酸～約６００アミノ酸、約６００アミノ酸～約８００アミノ酸、約６００アミノ酸～約７５０アミノ酸、約６００アミノ酸～約７００アミノ酸、約６００アミノ酸～約６５０アミノ酸、約６５０アミノ酸～約８００アミノ酸、約６５０アミノ酸～約７５０アミノ酸、約６５０アミノ酸～約７００アミノ酸、約７００アミノ酸～約８００アミノ酸、約７００アミノ酸～約７５０アミノ酸、または約７５０アミノ酸～約８００アミノ酸を含み得る。

本明細書で記載のいずれかのＡＣＣのいくつかの実施形態では、１つまたは複数のリンカー（例えば、フレキシブルリンカー）が、活性化可能サイトカイン構築物中に導入されて、ドメイン間の、部分間の、部分とドメインの間の、１つまたは複数の連結部に、またはリンカーが有益であると思われる任意の他の連結部に、柔軟性を与えることができる。ＡＣＣがコンホメーション上の制約のある構築物として提供されるいくつかの実施形態では、フレキシブルリンカーを挿入して、切断されていない活性化可能サイトカイン構築物中の構造の形成および維持を容易にできる。本明細書で記載のいずれかのリンカーは、所望の柔軟性を与えて、標的（例えば、サイトカインの受容体）の結合の阻害を促進できる、またはプロテアーゼによるＣＭの切断を促進できる。いくつかの実施形態では、全体的にまたは部分的に柔軟性であるリンカーがＡＣＣ中に組み込まれ、これにより、リンカーは、所望のＡＣＣを得るために、フレキシブルリンカーならびに１つまたは複数のより柔軟性の少ない構造を与える部分を含むことができる。いくつかのリンカーは、システイン残基を含み、これは、ジスルフィド結合を形成し、構築物の柔軟性を低減し得る。いくつかの実施形態では、リンカーまたはリンキング領域の長さを短縮することが、ＡＣＣ中の成熟サイトカインタンパク質の活性を低減する（例えば、図８Ａ、８Ｂおよび１０Ａ、１０Ｂを参照）。大抵の場合、リンカー長は、ＮからＣ方向へ、前の成分のＣ末端アミノ酸に隣接するリンカーのＮ末端から、後の成分のＮ末端アミノ酸に隣接するリンカーのＣ末端までのアミノ酸の数を計数することにより決定される（すなわち、この場合、リンカー長は、前の成分のＣ末端アミノ酸または後の成分のＮ末端アミノ酸を含まない）。Ｆｃドメインを含むＤＤのＮ末端でリンカーが用いられるいくつかの実施形態では、リンカー長は、前の成分のＣ末端アミノ酸に隣接するリンカーのＮ末端から、Ｆｃヒンジ領域の第１のシステインに隣接するリンカーのＣ末端までのアミノ酸の数を計数することにより決定される（すなわち、この場合、リンカー長は、前の成分のＣ末端アミノ酸またはＦｃヒンジ領域の第１のシステインを含まない）。

本開示および図２５から明らかなように、本開示のＡＣＣは、ＣＰと、ダイマー化ドメイン間の相互作用の近接点との間に一続きのアミノ酸を含む。この一続きのアミノ酸は、リンキング領域（ＬＲ）と呼ばれることもある。本明細書で使用される場合、「リンキング領域」または「ＬＲ」という用語は、サイトカインのＣ末端と、ダイマー化ドメイン間の相互作用の近接点に隣接するＮ末端であるアミノ酸残基との間の一続きのアミノ酸残基を指す（すなわち、リンキング領域は、サイトカインのＣ末端アミノ酸または対応する第２のモノマーのＤＤに対する相互作用の近接点を形成するＤＤのＮ末端アミノ酸を含まない）。例えば、ＤＤが１対のＦｃドメインである場合、リンキング領域は、サイトカインのＣ末端と、Ｆｃのジスルフィド結合に寄与する第１のＮ末端システイン残基（例えば、ＥＵナンバリングによる、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４Ｆｃドメインのシステイン２２６）との間の一続きのアミノ酸残基である。ダイマー化ドメインがペプチドではない場合、リンキング領域は、サイトカインのＣ末端から最後のアミノ酸までの一続きのアミノ酸残基である。例えば、ＤＤがビオチン－ストレプトアビジン対である場合、ビオチン含有モノマーのリンキング領域は、サイトカインのＣ末端と、ビオチン分子との間の一続きのアミノ酸残基であり、また、ストレプトアビジン含有モノマーのリンキング領域は、サイトカインのＣ末端と、ストレプトアビジン分子との間の一続きのアミノ酸残基である。いくつかの態様では、リンキング領域は、２４、１８、１４、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、または４アミノ酸以下、例えば、５～１４、７～１２、または８～１１アミノ酸を含み得る。

いくつかの実施形態では、追加のアミノ酸配列は、ＡＣＣのいずれかのドメインのいずれかに対しＮ末端またはＣ末端に配置され得る。例としては、限定されないが、ターゲティング部分（例えば、標的組織中に存在する細胞の受容体のためのリガンド）および血清半減期延長部分（例えば、免疫グロブリン血清タンパク質に結合するポリペプチド）または血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ））が挙げられる。

本明細書で記載のいずれかのサイトカイン構築物のいくつかの実施形態では、リンカーは、合計約１アミノ酸～約２５アミノ酸（例えば、約１アミノ酸～約２４アミノ酸、約１アミノ酸～約２２アミノ酸、約１アミノ酸～約２０アミノ酸、約１アミノ酸～約１８アミノ酸、約１アミノ酸～約１６アミノ酸、約１アミノ酸～約１５アミノ酸、約１アミノ酸～約１４アミノ酸、約１アミノ酸～約１２アミノ酸、約１アミノ酸～約１０アミノ酸、約１アミノ酸～約８アミノ酸、約１アミノ酸～約６アミノ酸、約１アミノ酸～約５アミノ酸、約１アミノ酸～約４アミノ酸、約１アミノ酸～約３アミノ酸、約１アミノ酸～約２アミノ酸、約２アミノ酸～約２５アミノ酸、約２アミノ酸～約２４アミノ酸、約２アミノ酸～約２２アミノ酸、約２アミノ酸～約２０アミノ酸、約２アミノ酸～約１８アミノ酸、約２アミノ酸～約１６アミノ酸、約２アミノ酸～約１５アミノ酸、約２アミノ酸～約１４アミノ酸、約２アミノ酸～約１２アミノ酸、約２アミノ酸～約１０アミノ酸、約２アミノ酸～約８アミノ酸、約２アミノ酸～約６アミノ酸、約２アミノ酸～約５アミノ酸、約２アミノ酸～約４アミノ酸、約２アミノ酸～約３アミノ酸、約４アミノ酸～約２５アミノ酸、約４アミノ酸～約２４アミノ酸、約４アミノ酸～約２２アミノ酸、約４アミノ酸～約２０アミノ酸、約４アミノ酸～約１８アミノ酸、約４アミノ酸～約１６アミノ酸、約４アミノ酸～約１５アミノ酸、約４アミノ酸～約１４アミノ酸、約４アミノ酸～約１２アミノ酸、約４アミノ酸～約１０アミノ酸、約４アミノ酸～約８アミノ酸、約４アミノ酸～約６アミノ酸、約４アミノ酸～約５アミノ酸、約５アミノ酸～約２５アミノ酸、約５アミノ酸～約２４アミノ酸、約５アミノ酸～約２２アミノ酸、約５アミノ酸～約２０アミノ酸、約５アミノ酸～約１８アミノ酸、約５アミノ酸～約１６アミノ酸、約５アミノ酸～約１５アミノ酸、約５アミノ酸～約１４アミノ酸、約５アミノ酸～約１２アミノ酸、約５アミノ酸～約１０アミノ酸、約５アミノ酸～約８アミノ酸、約５アミノ酸～約６アミノ酸、約６アミノ酸～約２５アミノ酸、約６アミノ酸～約２４アミノ酸、約６アミノ酸～約２２アミノ酸、約６アミノ酸～約２０アミノ酸、約６アミノ酸～約１８アミノ酸、約６アミノ酸～約１６アミノ酸、約６アミノ酸～約１５アミノ酸、約６アミノ酸～約１４アミノ酸、約６アミノ酸～約１２アミノ酸、約６アミノ酸～約１０アミノ酸、約６アミノ酸～約８アミノ酸、約８アミノ酸～約２５アミノ酸、約８アミノ酸～約２４アミノ酸、約８アミノ酸～約２２アミノ酸、約８アミノ酸～約２０アミノ酸、約８アミノ酸～約１８アミノ酸、約８アミノ酸～約１６アミノ酸、約８アミノ酸～約１５アミノ酸、約８アミノ酸～約１４アミノ酸、約８アミノ酸～約１２アミノ酸、約８アミノ酸～約１０アミノ酸、約１０アミノ酸～約２５アミノ酸、約１０アミノ酸～約２４アミノ酸、約１０アミノ酸～約２２アミノ酸、約１０アミノ酸～約２０アミノ酸、約１０アミノ酸～約１８アミノ酸、約１０アミノ酸～約１６アミノ酸、約１０アミノ酸～約１５アミノ酸、約１０アミノ酸～約１４アミノ酸、約１０アミノ酸～約１２アミノ酸、約１２アミノ酸～約２５アミノ酸、約１２アミノ酸～約２４アミノ酸、約１２アミノ酸～約２２アミノ酸、約１２アミノ酸～約２０アミノ酸、約１２アミノ酸～約１８アミノ酸、約１２アミノ酸～約１６アミノ酸、約１２アミノ酸～約１５アミノ酸、約１２アミノ酸～約１４アミノ酸、約１４アミノ酸～約２５アミノ酸、約１４アミノ酸～約２４アミノ酸、約１４アミノ酸～約２２アミノ酸、約１４アミノ酸～約２０アミノ酸、約１４アミノ酸～約１８アミノ酸、約１４アミノ酸～約１６アミノ酸、約１４アミノ酸～約１５アミノ酸、約１５アミノ酸～約２５アミノ酸、約１５アミノ酸～約２４アミノ酸、約１５アミノ酸～約２２アミノ酸、約１５アミノ酸～約２０アミノ酸、約１５アミノ酸～約１８アミノ酸、約１５アミノ酸～約１６アミノ酸、約１６アミノ酸～約２５アミノ酸、約１６アミノ酸～約２４アミノ酸、約１６アミノ酸～約２２アミノ酸、約１６アミノ酸～約２０アミノ酸、約１６アミノ酸～約１８アミノ酸、約１８アミノ酸～約２５アミノ酸、約１８アミノ酸～約２４アミノ酸、約１８アミノ酸～約２２アミノ酸、約１８アミノ酸～約２０アミノ酸、約２０アミノ酸～約２５アミノ酸、約２０アミノ酸～約２４アミノ酸、約２０アミノ酸～約２２アミノ酸、約２２アミノ酸～約２５アミノ酸、約２２アミノ酸～約２４アミノ酸、または約２４アミノ酸～約２５アミノ酸）を含み得る。

本明細書で記載のいずれかのＡＣＣのいくつかの実施形態では、リンカーは、合計約１アミノ酸、約２アミノ酸、約３アミノ酸、約４アミノ酸、約５アミノ酸、約６アミノ酸、約７アミノ酸、約８アミノ酸、約９アミノ酸、約１０アミノ酸、約１１アミノ酸、約１２アミノ酸、約１３アミノ酸、約１４アミノ酸、約１５アミノ酸、約１６アミノ酸、約１７アミノ酸、約１８アミノ酸、約１９アミノ酸、約２０アミノ酸、約２１アミノ酸、約２２アミノ酸、約２３アミノ酸、約２４アミノ酸、または約２５アミノ酸を含む。

意外にも、発明者らは、ＣＰとＤＤの間に何らかのリンカーを含まないＡＣＣが、野生型成熟サイトカインに比べて、サイトカイン活性の最も顕著な低減を示すことを発見した。図８Ａおよび１０Ａを参照されたい。さらに、ＣＰとＤＤの間にリンカーが存在しない配置は依然として、ＣＰとＤＤの間に配置されるＣＭの効果的な切断を可能にする。図１２～１４を参照されたい。従って、いくつかの実施形態では、ＡＣＣは、ＣＰとＤＤの間にいかなるリンカーも含まず、ＣＰとＤＤの間のＣＭは、１０、９、８、７、６、５、４、または３以下のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、リンキング領域中のアミノ酸の総数は、２５アミノ酸以下、例えば、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、または３アミノ酸以下、または３～１０アミノ酸または５～１５アミノ酸、または７～１２アミノ酸、または３～２５アミノ酸により包含される範囲から選択される任意の範囲または特定の数のアミノ酸を含む。

本明細書で記載のいずれかのＡＣＣのいくつかの実施形態では、リンカーは、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）残基が豊富であり得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、セリン（ＳｅｒまたはＳ）残基が豊富であり得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、グリシンおよびセリン残基が豊富であり得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、１つまたは複数のグリシン－残基対（ＧＳ）（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０以上のＧＳ対）を有する。いくつかの実施形態では、リンカーは、１つまたは複数のＧｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（ＧＧＧＳ）配列（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０以上のＧＧＧＳ配列）を有する。いくつかの実施形態では、リンカーは、１つまたは複数のＧｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（ＧＧＧＧＳ）配列（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０以上のＧＧＧＧＳ配列）を有する。いくつかの実施形態では、リンカーは、１つまたは複数のＧｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ（ＧＧＳＧ）配列（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０以上のＧＧＳＧ配列）を有する。

本明細書で記載のいずれかのＡＣＣのいくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧ（配列番号２１０）、ＧＧＧＳ（配列番号２）、ＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号２１１）、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号２１２）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２１３）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２１４）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２１５）、ＧＧＧＧＳ（配列番号２１６）、ＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＳ（配列番号２１７）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＳ（配列番号２１８）、ＧＧＳＬＤＰＫＧＧＧＧＳ（配列番号２１９）、ＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧ（配列番号２２０）、ＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧ（配列番号２２１）、ＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳ（配列番号２２２）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＫＧ（配列番号２２３）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＳＧＳＴＫＧ（配列番号２２４）、およびＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号２２５）のいずれか１つまたは１つまたは複数の組み合わせを含む。

リンカーの非限定的例は、ＧＧＧＳ（配列番号２）、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧ（配列番号２１０）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２１３）、ＧＧＧＧＳＧＳ（配列番号２１７）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＳ（配列番号２１８）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２１４）、ＧＧＳＬＤＰＫＧＧＧＧＳ（配列番号２１５）、およびＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＳＥＧＳＴ（配列番号２２６）と少なくとも７０％同一（例えば、少なくとも７２％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７８％、少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）である配列を含み得る。

いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＧＳＬＤＰＫＧＧＧＧＳ（配列番号２１９）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＳ（配列番号２１８）、ＧＧＧＧＳＧＳ（配列番号２１７）、ＧＳ、（ＧＳ）ｎ、（ＧＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号２２７）および（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２２８）、ＧＧＳＧ（配列番号２２９）、ＧＧＳＧＧ（配列番号２３０）、ＧＳＧＳＧ（配列番号２３１）、ＧＳＧＧＧ（配列番号２３２）、ＧＧＧＳＧ（配列番号２３３）、ＧＳＳＳＧ（配列番号２３４）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２１３）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２１４）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＳＥＧＳＴ（配列番号２２６）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２１６）からなる群より選択される配列を含む。式中、ｎは、少なくとも１の整数である。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＧＳＬＤＰＫＧＧＧＧＳ（配列番号２１９）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＳ（配列番号２１８）、ＧＧＧＧＳＧＳ（配列番号２１７）、およびＧＳからなる群より選択される配列を含む。本明細書で記載のいずれかのＡＣＣのいくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２１３）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２１４）、およびＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＳＥＧＳＴ（配列番号２２６）からなる群から選択される配列を含む。本明細書で記載のいずれかの活性化可能サイトカイン構築物のいくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２１３）またはＧＧＧＧＳ（配列番号２１６）からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＳ（配列番号２）の配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＡＣＣは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０リンカー配列（例えば、本明細書で記載のまたは当該技術分野において既知の例示的リンカー配列のいずれかのリンカー配列と同じまたは異なるリンカー配列）を含み得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、スルホ－ＳＩＡＢ、ＳＭＰＢ、およびスルホ－ＳＭＰＢを含み、リンカーは、一級アミンスルフヒドリルと反応する。

本明細書で記載のいずれかのＡＣＣのいくつかの実施形態では、ＡＣＣは、ＣＰ１および／またはＣＰ２の少なくとも１つの活性の対照レベルに比べて、ＣＰ１および／またはＣＰ２の少なくとも１つの活性における低減を特徴とする。いくつかの実施形態では、対照レベルは、組換えＣＰ１および／またはＣＰ２（例えば、商業的に入手できる組換えＣＰ１および／またはＣＰ２、組換え野生型ＣＰ１および／またはＣＰ２、など）の活性レベルであり得る。いくつかの実施形態では、対照レベルは、ＡＣＣの切断（活性化）型の活性のレベルであり得る。特定の実施形態では、対照レベルは、ペグ化ＣＰ１および／またはＣＰ２の活性化のレベルであり得る。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの活性は、表面プラズモン共鳴法を用いて測定される（例えば、リン酸緩衝食塩水中、２５℃で実施される）その同族受容体に対するＣＰ１および／またはＣＰ２の結合親和性（Ｋ_Ｄ）である。特定の実施形態では、少なくとも１つの活性は、リンパ腫細胞の増殖のレベルである。他の実施形態では、少なくとも１つの活性は、リンパ腫細胞のＪＡＫ／ＳＴＡＴ／ＩＳＧＦ３経路活性化のレベルである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの活性は、リンパ腫細胞中のＳＥＡＰ産生のレベルである。さらなる実施形態では、ＣＰ１および／またはＣＰ２の少なくとも１つの活性は、例えば、ＲＮＡｓｅｑ法（例えば、Ｚｉｍｍｅｒｅｒｅｔａｌ．，Ｃｌｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．１４（１８）：５９００－５９０６，２００８；Ｈｉｌｋｅｎｓｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１：５２５５－５２６３，２００３）を用いるサイトカイン刺激遺伝子誘導のレベルである。

いくつかの実施形態では、ＡＣＣは、少なくとも１つのＣＰ１および／またはＣＰ２活性の対照レベルに比べて、少なくとも１つのＣＰ１および／またはＣＰ２活性における少なくとも２倍の低減を特徴とする。いくつかの実施形態では、ＡＣＣは、ＣＰ１および／またはＣＰ２の少なくとも１つの活性の対照レベルに比べて、ＣＰ１および／またはＣＰ２の少なくとも１つの活性における少なくとも５倍の低減を特徴とする。いくつかの実施形態では、ＡＣＣは、ＣＰ１および／またはＣＰ２の少なくとも１つの活性の対照レベルに比べて、ＣＰ１および／またはＣＰ２の少なくとも１つの活性における少なくとも１０倍の低減を特徴とする。いくつかの実施形態では、ＡＣＣは、ＣＰ１および／またはＣＰ２の少なくとも１つの活性の対照レベルに比べて、ＣＰ１および／またはＣＰ２の少なくとも１つの活性における少なくとも２０倍の低減を特徴とする。いくつかの実施形態では、ＡＣＣは、ＣＰ１および／またはＣＰ２の少なくとも１つの活性の対照レベルに比べて、ＣＰ１および／またはＣＰ２の少なくとも１つの活性における少なくとも３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍の低減を特徴とする。いくつかの実施形態では、ＡＣＣは、ＣＰ１および／またはＣＰ２の少なくとも１つの活性の対照レベルに比べて、ＣＰ１および／またはＣＰ２の少なくとも１つの活性における１～２０倍の低減、２００～５００倍の低減、３００～５００倍の低減、４００～５００倍の低減、５００～６００倍の低減、６００～７００倍の低減、１５０～１０００倍の低減、１００～１５００倍の低減、２００～１５００倍の低減、３００～１５００倍の低減、４００～１５００倍の低減、５００～１５００倍の低減、１０００～１５００倍の低減、１００～１０００倍の低減、２００～１０００倍の低減、３００～１０００倍の低減、４００～１０００倍の低減、５００～１０００倍の低減、１００～５００倍の低減、２０～５０倍の低減、３０～５０倍の低減、４０～５０倍の低減、１００～４００倍の低減、２００～４００倍の低減、または３００～４００倍の低減、１００～３００倍の低減、２００～３００倍の低減、または１００～２００倍の低減を特徴とする。

いくつかの実施形態では、ＣＰ１および／またはＣＰ２の少なくとも１つの活性の対照レベルは、プロテアーゼによるＣＭ１およびＣＭ２の切断後にＡＣＣから放出されるＣＰ１および／またはＣＰ２（「切断産物」）の活性である。いくつかの実施形態では、ＣＰ１および／またはＣＰ２の少なくとも１つの活性の対照レベルは、対応する野生型成熟サイトカイン（例えば、組換え野生型成熟サイトカイン）の活性である。

いくつかの実施形態では、ＡＣＣのプロテアーゼとのインキュベーションは、活性化サイトカイン産物をもたらし、活性化サイトカイン産物のＣＰ１および／またはＣＰ２の１つまたは複数の活性は、無処理のＡＣＣのＣＰ１および／またはＣＰ２の１つまたは複数の活性より大きい。いくつかの実施形態では、活性化サイトカイン産物のＣＰ１および／またはＣＰ２の１つまたは複数の活性は、ＡＣＣのＣＰ１および／またはＣＰ２の１つまたは複数の活性より１倍大きい。いくつかの実施形態では、活性化サイトカイン産物のＣＰ１および／またはＣＰ２の１つまたは複数の活性は、ＡＣＣのＣＰ１および／またはＣＰ２の１つまたは複数の活性より２倍大きい。いくつかの実施形態では、活性化サイトカイン産物のＣＰ１および／またはＣＰ２の１つまたは複数の活性は、ＡＣＣのＣＰ１および／またはＣＰ２の１つまたは複数の活性より５倍大きい。いくつかの実施形態では、活性化サイトカイン産物のＣＰ１および／またはＣＰ２の１つまたは複数の活性は、ＡＣＣのＣＰ１および／またはＣＰ２の１つまたは複数の活性より１０倍大きい。いくつかの実施形態では、活性化サイトカイン産物のＣＰ１および／またはＣＰ２の１つまたは複数の活性は、ＡＣＣのＣＰ１および／またはＣＰ２の１つまたは複数の活性より２０倍大きい。いくつかの実施形態では、活性化サイトカイン産物のＣＰ１および／またはＣＰ２の１つまたは複数の活性は、ＡＣＣのＣＰ１および／またはＣＰ２の１つまたは複数の活性よりも、少なくとも１～２０倍大きい、２～２０倍大きい、３～２０倍大きい、４～２０倍大きい、５～２０倍大きい、１０～２０倍大きい、１５～２０倍大きい、１～１５倍大きい、２～１５倍大きい、３～１５倍大きい、４～１５倍大きい、５～１５倍大きい、１０～１５倍大きい、１～１０倍大きい、２～１０倍大きい、３～１０倍大きい、４～１０倍大きい、５～１０倍大きい、１～５倍大きい、２～５倍大きい、３～５倍大きい、４～５倍大きい、１～４倍大きい、２～４倍大きい、３～４倍大きい、１～３倍大きい、２～３倍大きい、または１～２倍大きい。

いくつかの実施形態では、ＡＣＣは、配列番号３０９または３１１と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一である配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＡＣＣは、配列番号３１０または３１２と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一である配列を含む核酸によりコードされ得る。いくつかの態様では、ＡＣＣは、このような配列を含むが、いずれも、これらの配列のシグナル配列を含まない。シグナル配列は、特に限定されない。いくつかのシグナル配列の非限定的例は、例えば、配列番号３０９の残基１～２０ならびに他の配列中の、または別の種または細胞株由来のシグナル配列で置換された、対応する残基およびヌクレオチドを含む。シグナル配列の他の例は、ＭＲＡＷＩＦＦＬＬＣＬＡＧＲＡＬＡ（配列番号３４３）およびＭＡＬＴＦＡＬＬＶＡＬＬＶＬＳＣＫＳＳＣＳＶＧ（配列番号３４４）を含む。

これらの活性化可能サイトカイン構築物の種々の例示的態様は、以下に記載され、本明細書で提供される方法で任意の組み合わせで制限なく使用できる。活性化可能サイトカイン構築物および活性化可能サイトカイン構築物の製造方法は、以下で記載される。

いくつかの実施形態では、ＣＭは、特定のプロテアーゼとの使用のために選択される。プロテアーゼは、腫瘍細胞で産生されるものであってよい（例えば、腫瘍細胞は、健康な組織よりもより大量のプロテアーゼを発現し得る）。いくつかの実施形態では、ＣＭは、ＡＤＡＭ１７、ＢＭＰ－１、カテプシンなどのシステインプロテアーゼ、ＨｔｒＡ１、レグマイン、マトリプターゼ（ＭＴ－ＳＰ１）、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、好中球エラスターゼ、ＴＭＰＲＳＳ３またはＴＭＰＲＳＳ４などのＴＭＰＲＳＳ、トロンビン、およびｕ－型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ、ウロキナーゼとも呼ばれる）からなる群より選択される少なくとも１種のプロテアーゼの基質である。

いくつかの実施形態では、ＣＭは、少なくとも１種のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）のための基質である。ＭＭＰの例としては、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ７、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１２、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１５、ＭＭＰ１６、ＭＭＰ１７、ＭＭＰ１９、ＭＭＰ２０、ＭＭＰ２３、ＭＭＰ２４、ＭＭＰ２６、およびＭＭＰ２７が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＣＭは、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１、ＭＭＰ３、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１７、ＭＭＰ１１、およびＭＭＰ１９のための基質である。いくつかの実施形態では、ＣＭは、ＭＭＰ７のための基質である。いくつかの実施形態では、ＣＭは、ＭＭＰ９のための基質である。いくつかの実施形態では、ＣＭは、ＭＭＰ１４のための基質である。いくつかの実施形態では、ＣＭは、２種以上のＭＭＰのための基質である。いくつかの実施形態では、ＣＭは、少なくともＭＭＰ９およびＭＭＰ１４のための基質である。いくつかの実施形態では、ＣＭは、同じＭＭＰのために２種以上の基質を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、少なくとも２種以上のＭＭＰ９基質を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、少なくとも２種以上のＭＭＰ１４基質を含む。

いくつかの実施形態では、ＣＭは、ＭＭＰのための基質であり、配列ＩＳＳＧＬＬＳＳ（配列番号１９）；ＱＮＱＡＬＲＭＡ（配列番号１６）；ＡＱＮＬＬＧＭＶ（配列番号１５）；ＳＴＦＰＦＧＭＦ（配列番号１８）；ＰＶＧＹＴＳＳＬ（配列番号７４）；ＤＷＬＹＷＰＧＩ（配列番号７５）；ＭＩＡＰＶＡＹＲ（配列番号４２）；ＲＰＳＰＭＷＡＹ（配列番号４３）；ＷＡＴＰＲＰＭＲ（配列番号４４）；ＦＲＬＬＤＷＱＷ（配列番号４５）；ＬＫＡＡＰＲＷＡ（配列番号７６）；ＧＰＳＨＬＶＬＴ（配列番号７７）；ＬＰＧＧＬＳＰＷ（配列番号７８）；ＭＧＬＦＳＥＡＧ（配列番号７９）；ＳＰＬＰＬＲＶＰ（配列番号８０）；ＲＭＨＬＲＳＬＧ（配列番号８１）；ＬＡＡＰＬＧＬＬ（配列番号１７）；ＡＶＧＬＬＡＰＰ（配列番号１４）；ＬＬＡＰＳＨＲＡ（配列番号８２）；ＰＡＧＬＷＬＤＰ（配列番号２０）；および／またはＩＳＳＧＬＳＳ（配列番号７３）を含む。

いくつかの実施形態では、ＣＭは、トロンビンのための基質である。いくつかの実施形態では、ＣＭは、トロンビンのための基質であり、配列ＧＰＲＳＦＧＬ（配列番号８３）またはＧＰＲＳＦＧ（配列番号８４）を含む。

いくつかの実施形態では、ＣＭは、ＮＴＬＳＧＲＳＥＮＨＳＧ（配列番号９）；ＮＴＬＳＧＲＳＧＮＨＧＳ（配列番号１０）；ＴＳＴＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号１１）；ＴＳＧＲＳＡＮＰ（配列番号１２）；ＶＡＧＲＳＭＲＰ（配列番号２１）；ＶＶＰＥＧＲＲＳ（配列番号２２）；ＩＬＰＲＳＰＡＦ（配列番号２３）；ＭＶＬＧＲＳＬＬ（配列番号２４）；ＱＧＲＡＩＴＦＩ（配列番号２５）；ＳＰＲＳＩＭＬＡ（配列番号２６）；およびＳＭＬＲＳＭＰＬ（配列番号２７）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＣＭは、好中球エラスターゼのための基質である。いくつかの実施形態では、ＣＭは、セリンプロテアーゼのための基質である。いくつかの実施形態では、ＣＭは、ｕＰＡのための基質である。いくつかの実施形態では、ＣＭは、レグマインのための基質である。いくつかの実施形態では、ＣＭは、マトリプターゼのための基質である。いくつかの実施形態では、ＣＭは、セリンプロテアーゼのための基質である。いくつかの実施形態では、ＣＭは、カテプシンなどのシステインプロテアーゼのための基質である。

いくつかの実施形態では、ＣＭは、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号２８）；ＩＳＳＧＬＬＳＳＧＧＳＧＧＳＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号３０）；ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＴＳＴＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号２７５）；ＴＳＴＳＧＲＳＡＮＰＲＧＧＧＡＶＧＬＬＡＰＰ（配列番号２７６）；ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＧＧＴＳＴＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号２７７）；ＴＳＴＳＧＲＳＡＮＰＲＧＧＧＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ（配列番号２７８）；ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号２９）；ＬＳＧＲＳＤＮＨＧＧＡＶＧＬＬＡＰＰ（配列番号７０）；ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＧＧＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号２６６）；ＬＳＧＲＳＤＮＨＧＧＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ（配列番号２６７）；ＬＳＧＲＳＤＮＨＧＧＳＧＧＳＩＳＳＧＬＬＳＳ（配列番号２６８）；ＬＳＧＲＳＧＮＨＧＧＳＧＧＳＩＳＳＧＬＬＳＳ（配列番号２７９）；ＩＳＳＧＬＬＳＳＧＧＳＧＧＳＬＳＧＲＳＧＮＨ（配列番号２６９）；ＬＳＧＲＳＤＮＨＧＧＳＧＧＳＱＮＱＡＬＲＭＡ（配列番号２７０）；ＱＮＱＡＬＲＭＡＧＧＳＧＧＳＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号２７１）；ＬＳＧＲＳＧＮＨＧＧＳＧＧＳＱＮＱＡＬＲＭＡ（配列番号２７２）；ＱＮＱＡＬＲＭＡＧＧＳＧＧＳＬＳＧＲＳＧＮＨ（配列番号２７３）、および／またはＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＧＮＨ（配列番号２７４）の配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＣＭ１および／またはＣＭ２は、配列番号５～配列番号１００からなる群より選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号２８）、ＬＳＧＲＳＤＤＨ（配列番号３３）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＱＨ（配列番号５４）、ＳＧＲＳＤＮＩ（配列番号１００）、およびＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＮＩ（配列番号６８）からなる群より選択される配列を含む。

いくつかの態様では、ＡＣＣは、配列番号１および１０１～２０９から選択されるＣＰ１、配列番号５～１００および２６３～３０８から選択されるＣＭ１、および配列番号１および１０１～２０９から選択されるＣＰ２と二量体化したＤＤ１、配列番号５～１００および２６３～３０８から選択されるＣＭ２、ならびにＤＤ２を含む。いくつかの態様では、ＡＣＣは、ＣＰ１とＣＭ１の間、および／またはＣＭ１とＤＤ１の間に、配列番号２および２１０～２３４、２４５、または２５０から選択されるリンカー、およびＣＰ２とＣＭ２の間および／またはＣＭ２とＤＤ２の間に、配列番号２および２１０～２３４、２４５、または２５０から選択されるリンカーを含み得る。いくつかの実施形態では、ＡＣＣは、配列番号３または配列番号４と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を有するＤＤ１および／またはＤＤ２を含む。いくつかの実施形態では、ＡＣＣは、配列番号３１５または配列番号３１６と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を有するＤＤ１を含む。いくつかの実施形態では、ＡＣＣは、配列番号３１５または配列番号３１６と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を有するＤＤ２を含む。

薬剤へのコンジュゲーション
本開示はまた、本明細書で記載のいずれかのＡＣＣ中に、例えば、目的の細胞または組織への送達を容易にするターゲティング部分、薬剤（例えば、治療薬、抗腫瘍薬）、毒素、またはこれらのフラグメントを含む、追加の要素を組み込むための方法および材料を提供する。

本明細書で記載のいずれかのＡＣＣのいくつかの実施形態では、ＡＣＣを、限定されないが、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素、またはそのフラグメント）、または放射性同位体を含む細胞傷害薬にコンジュゲートできる。本明細書で記載のいずれかのＡＣＣのいくつかの実施形態では、活性化可能サイトカイン構築物を、限定されないが、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素、またはそのフラグメント）、または放射性同位体を含む細胞傷害薬にコンジュゲートできる。

本明細書で記載のいずれかのＡＣＣにコンジュゲートできる細胞傷害薬の非限定例としては、ドラスタチンおよびその誘導体（例えば、オーリスタチンＥ、ＡＦＰ、モノメチルオーリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）、モノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、デスメチルオーリスタチンＥ（ＤＭＡＥ）、オーリスタチンＦ、デスメチルオーリスタチンＦ（ＤＭＡＦ）、ドラスタチン１６（ＤｍＪ）、ドラスタチン１６（Ｄｐｖ）、オーリスタチン誘導体（例えば、オーリスタチンチラミン、オーリスタチンキノロン））、マイタンシノイド（例えば、ＤＭ－１、ＤＭ－４）、マイタンシノイド誘導体、デュオカルマイシン、αアマニチン、ツルボスタチン、フェンスタチン、ヒドロキシフェンスタチン、スポンギスタチン５、スポンギスタチン７、ハリスタチン１、ハリスタチン２、ハリスタチン３、ハロコムスタチン（ｈａｌｏｃｏｍｓｔａｔｉｎ）、ピロロベンゾイミダゾール（ＰＢＩ）、シブロスタチン６、ドキサリホルム（ｄｏｘａｌｉｆｏｒｍ）、セマドチン類似体（ＣｅｍＣＨ２－ＳＨ）、シュードモナス毒素Ａ（ＰＥＳ８）バリアント、シュードモナス毒素Ａ（ＺＺ－ＰＥ３８）バリアント、ＺＪ－１０１、アントラサイクリン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ブリオスタチン、カンプトテシン、７－置換カンプトテシン、１０，１１－ジフルオロメチレンジオキシカンプトテシン、コンブレタスタチン、デブロモアプリシアトキシン、ＫａｈａＭｉｄｅ－Ｆ、ディスコデルモリドおよびエクテイナシジンが挙げられる。

本明細書で記載のいずれかのＡＣＣにコンジュゲートできる酵素的活性毒素の非限定例としては、ジフテリア毒素、緑膿菌由来外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファサルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓｆｏｒｄｉｉ）、ｄｉａｎｆｈｉｎタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（例えば、ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ－８）、ニガウリ阻害剤、クルシン、ｃｒｏｔｉｒｓ、サボンソウ阻害剤、ｇｅｉｏｎｉｎ、ｍｉｔｏｇｅｌｉｉｎ、レストリクトシン、フェノマイシン、ネオマイシン、およびトリコテシンが挙げられる。

本明細書で記載のいずれかのＡＣＣにコンジュゲートできる抗悪性腫瘍薬の非限定例としては、アドリアマイシン、セルビジン、ブレオマイシン、アルケラン、ベルバン、オンコビン、フルオロウラシル、メトトレキサート、チオテパ、ビサントレン、ノバントロン、チオグアニン、プロカルバジン、およびシタラビンが挙げられる。

本明細書で記載のいずれかのＡＣＣにコンジュゲートできる抗ウイルス薬の非限定例としては、アシクロビル、ビラＡ、およびシンメトレルが挙げられる。

本明細書で記載のいずれかのＡＣＣにコンジュゲートできる抗真菌薬の非限定例としては、ナイスタチンが挙げられる。

本明細書で記載のいずれかのＡＣＣにコンジュゲートできるコンジュゲート可能検出薬の非限定例としては、フルオレセインおよびその誘導体およびその誘導体、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）が挙げられる。

本明細書で記載のいずれかの活性化可能サイトカイン構築物にコンジュゲートできる抗菌薬の非限定例としては、アミノグリコシド、ストレプトマイシン、ネオマイシン、カナマイシン、アミカシン、ゲンタマイシン、およびトブラマイシンが挙げられる。

本明細書で記載のいずれかの活性化可能サイトカイン構築物にコンジュゲートできる３β，１６β，１７α－トリヒドロキシコレスタ－５－エン－２２－オン１６－Ｏ－（２－Ｏ－４－メトキシベンゾイル－β－Ｄ－キシロピラノシル）－（１－－＞３）－（２－Ｏ－アセチル－α－Ｌ－アラビノピラノシド）（ＯＳＷ－１）の非限定例としては、Ｏ６－ベンジルグアニンのｓ－ニトロベンジルオキシカルボニル誘導体、トポイソメラーゼ阻害剤ヘミアステリン、セファロタキシン、ホモハリントニン、ピロールオベンゾジアゼピンダイマー（ＰＢＤ）、官能化ピロロベンゾジアゼピン、カリチアマイシン、ポドフィロトキシン、タキサン、およびビンカアルカロイドが挙げられる。

本明細書で記載のいずれかの活性化可能サイトカイン構築物にコンジュゲートできる放射性医薬品の非限定例としては、^１２３Ｉ、^８９Ｚｒ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^９９ｍＴｃ、^２０１Ｔ１、^６２Ｃｕ、^１８Ｆ、^６８Ｇａ、^１３Ｎ、^１５Ｏ、^３８Ｋ、^８２Ｒｂ、^１１１Ｉｎ、^１３３Ｘｅ、^１１Ｃ、および^９９ｍＴｃ（テクネチウム）が挙げられる。

本明細書で記載のいずれかのＡＣＣにコンジュゲートできる重金属の非限定例としては、バリウム、金色、および白金が挙げられる。

本明細書で記載のいずれかのＡＣＣにコンジュゲートできる抗マイコプラズマ薬の非限定例としては、タイロシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシンＢ、アンピシリン、スルファニルアミド、ポリミキシン、およびクロラムフェニコールが挙げられる。

当業者は、多岐にわたる可能な部分を、本明細書で記載のいずれかの活性化可能サイトカイン構築物にコンジュゲートできることを理解するであろう。コンジュゲーションは、ＡＣＣおよび他の部分がそれらのそれぞれの活性を保持する限り、２つの分子を結合する任意の化学反応を含み得る。コンジュゲーションは、多くの化学的機序、例えば、共有結合、親和性結合、インターカレーション、配位結合、および複合体化を含んでよい。いくつかの実施形態では、好ましい結合は、共有結合である。共有結合は、既存の側鎖の直接縮合、または外部架橋分子の取り込みのいずれかによって達成できる。多くの二価または多価の連結剤は、本開示のいずれかの活性化可能サイトカイン構築物をコンジュゲートすることにおいて有用である。例えば、コンジュゲーションは、チオエステル、カルボジイミド、スクシンイミドエステル、グルタルアルデヒド、ジアゾベンゼン、およびヘキサメチレンジアミンなどの有機化合物を含んでよい。いくつかの実施形態では、活性化可能サイトカイン構築物は、コンジュゲーションのための適切な部位を提供するために、１つまたは複数の天然アミノ酸残基を含んでよい、あるいは、導入できる。

本明細書で記載のいずれかのＡＣＣのいくつかの実施形態では、薬剤および／またはコンジュゲートは、ジスルフィド結合（例えば、システイン分子上のジスルフィド結合）により抗原結合ドメインに付着される。多くの癌は天然で高レベルの還元剤のグルタチオンを放出するため、癌組織微小環境中に存在するグルタチオンは、ジスルフィド結合を還元し、その後、送達部位で薬剤および／またはコンジュゲートを放出できる。

本明細書で記載のいずれかのＡＣＣのいくつかの実施形態では、コンジュゲートが標的部位（例えば、患部組織（例えば、癌組織））内で補体の存在下でその標的に結合すると、リンカーにコンジュゲートおよび／または薬剤を付着するアミドまたは結合が切断され、その活性化型でのコンジュゲートおよび／または薬剤の放出がもたらされる。対象に投与されるとこれらのコンジュゲートおよび／または薬剤は、標的部位（例えば、患部組織（例えば、癌組織））でコンジュゲートおよび／または薬剤の送達および放出を達成する。これらのコンジュゲートおよび／または薬剤は、本明細書で記載のいずれかのコンジュゲートおよび／または薬剤のインビボ送達に特に効果的である。

いくつかの実施形態では、リンカーは、補体系の酵素により切断可能でない。例えば、コンジュゲートおよび／または薬剤は、補体活性化が最終的に標的細胞を溶解するので、補体活性化なしに放出される。このような実施形態では、コンジュゲートおよび／または薬剤は、標的細胞（例えば、ホルモン、酵素、副腎皮質ステロイド、神経伝達物質、または遺伝子）に送達される。さらに、リンカーは、血清プロテアーゼによる切断に対し感受性がやや低く、コンジュゲートおよび／または薬剤は、標的部位でゆっくりと放出される。

本明細書で記載のいずれかのＡＣＣのいくつかの実施形態では、コンジュゲートおよび／または薬剤は、コンジュゲートおよび／または薬剤が標的部位（例えば、疾患組織（例えば、癌組織））に送達されるが、コンジュゲートおよび／または薬剤が放出されないように、設計される。

本明細書で記載のいずれかのＡＣＣのいくつかの実施形態では、コンジュゲートおよび／または薬剤は、直接に、または非切断性リンカーを介して、抗原結合ドメインに付着される。例示的非切断性リンカーとしては、アミノ酸（例えば、Ｄ－アミノ酸）、ペプチド、または本明細書に記載の方法により、後で抗原結合ドメインへの結合に利用できる官能基を含むように改変可能な他の有機化合物が挙げられる。

本明細書で記載のいずれかのＡＣＣのいくつかの実施形態では、ＡＣＣは、ある薬剤に対する少なくとも１つのコンジュゲーション位置を含む。いくつかの実施形態では、可能な全てのコンジュゲーション位置が、ある薬剤へのコンジュゲーションに利用可能である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のコンジュゲーション位置は、限定されないが、ジスルフィド結合に関与する硫黄原子、鎖間ジスルフィド結合に関与する硫黄原子、鎖間スルフィド結合に関与するが硫黄原子であるが鎖内ジスルフィド結合に関与しない硫黄原子、および／またはシステインのイオウ原子または硫黄原子を含む他のアミノ酸残基を含む。このような場合には、残基は、タンパク質構築物構造体中に天然で存在し得るか、または限定されないが、部位特異的変異誘発、化学変換、もしくは非天然アミノ酸の誤取り込みを含む方法を用いて、タンパク質構築物中に組み込まれ得る。

本開示はまた、コンジュゲーションのためのＡＣＣを調製するための方法および材料を提供する。本明細書で記載のいずれかのＡＣＣのいくつかの実施形態では、ＡＣＣは、１種または複数の鎖間ジスルフィド結合を含むように改変される。例えば、ＡＣＣ中のジスルフィド結合は、限定されないが、ＴＣＥＰ、ＤＴＴ、またはβメルカプトエタノールなどの還元剤への曝露後に還元を受け得る。場合によっては、ジスルフィド結合の還元は、ほんの部分的である。本明細書で使用される場合、用語の部分的還元は、ＡＣＣが還元剤と接触しかつ全ての可能なコンジュゲーション部位の一部が還元を受ける（例えば、全てのジスルフィド結合が還元されるとは限らない）状況を指す。いくつかの実施形態では、活性化可能サイトカイン構築物は、全ての可能なコンジュゲーション部位の９９％未満（例えば、９８％未満、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％または５％未満）が還元される場合、還元剤との接触後に部分的に還元される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の鎖間のジスルフィド結合において還元を有するＡＣＣは、遊離チオールと反応性がある薬物にコンジュゲートされる。

本開示はまた、ＡＣＣ上の特定の部位に治療薬をコンジュゲートするための方法および材料を提供する。本明細書で記載のいずれかのＡＣＣのいくつかの実施形態では、ＡＣＣは、治療薬がＡＣＣの特定の部位でＡＣＣにコンジュゲートできるように、改変される。例えば、ＡＣＣは、ＡＣＣへのコンジュゲーションを促進する様式で部分的に還元され得る。このような場合、ＡＣＣの部分的な還元は、ＡＣＣ中のコンジュゲーション部位が還元されない様式で起こる。いくつかの実施形態では、ＡＣＣ上のコンジュゲーション部位は、タンパク質構築物上の特定の部位で薬剤のコンジュゲーションを促進するように選択される。種々の要因が、還元剤による処理時にＡＣＣの「還元レベル」に影響を与え得る。例えば、限定されないが、ＡＣＣに対する還元剤の比率、インキュベーションの長さ、インキュベーション温度、および／または還元反応溶液のｐＨは、本明細書で記載の方法および物質でＡＣＣの部分的還元を達成するために最適化を必要とし得る。因子（例えば、ＡＣＣに対する還元剤の比率、還元剤を用いたインキュベーションの長さと温度、および／または還元剤のｐＨ）の任意の適切な組み合わせを使用して、ＡＣＣの部分的還元（例えば、可能なコンジュゲーション部位の全体的還元または特定のコンジュゲーション部位での還元）を達成できる。

ＡＣＣに対する還元剤の有効比率は、薬剤へのコンジュゲーションを可能にする様式でＡＣＣを少なくとも部分的に還元する任意の比率であり得る（例えば、可能なコンジュゲーション部位の全体的還元または特定のコンジュゲーション部位での還元）。いくつかの実施形態では、ＡＣＣに対する還元剤の比率は、約２０：１～１：１、約１０：１～１：１、約９：１～１：１、約８：１～１：１、約７：１～１：１、約６：１～１：１、約５：１～１：１、約４：１～１：１、約３：１～１：１、約２：１～１：１、約２０：１～１：１．５、約１０：１～１：１．５、約９：１～１：１．５、約８：１～１：１．５、約７：１～１：１．５、約６：１～１：１．５、約５：１～１：１．５、約４：１～１：１．５、約３：１～１：１．５、約２：１～１：１．５、約１．５：１～１：１．５、または約１：１～１：１．５の範囲である。いくつかの実施形態では、比は、約５：１～１：１の範囲である。いくつかの実施形態では、比は、約５：１～１．５：１の範囲である。いくつかの実施形態では、比は、約４：１～１：１の範囲である。いくつかの実施形態では、比は、約４：１～１．５：１の範囲である。いくつかの実施形態では、比は、約８：１～１：１の範囲である。いくつかの実施形態では、比は、約２．５：１～１：１の範囲である。

ＡＣＣを還元剤で処理するための効果的なインキュベーション時間および温度は、ＡＣＣへの薬剤のコンジュゲーションを可能にする様式でＡＣＣを少なくとも部分的に還元する（例えば、可能なコンジュゲーション部位の全体的還元または特定のコンジュゲーション部位での還元）任意の時間および温度であり得る。いくつかの実施形態では、ＡＣＣを処理するためのインキュベーション時間および温度は、３７℃で約１時間～３７℃で約１２時間の範囲（またはその任意の部分範囲）である。

ＡＣＣを還元剤で処理するための還元反応のための効果的なｐＨは、ＡＣＣの薬剤へのコンジュゲーションを可能にする様式でＡＣＣを少なくとも部分的に還元する（例えば、可能なコンジュゲーション部位の全体的還元または特定のコンジュゲーション部位での還元）任意のｐＨであり得る。

部分的還元されたＡＣＣがチオールを含む薬剤と接触されると、薬剤は、ＡＣＣ中の鎖間のチオールにコンジュゲートできる。薬剤は、チオール含有試薬（例えば、システインまたはＮ－アセチルシステイン）を用いてチオールを含有するように改変できる。例えば、ＡＣＣは、ＡＣＣに対する還元剤の所望の比率で約３７℃で約１時間にわたり還元剤（例えば、ＴＥＰＣ）とのインキュベーション後に部分的に還元できる。ＡＣＣに対する還元剤の効果的な比率は、チオール含有薬剤のコンジュゲーションを可能にする様式でＡＣＣ中に位置する少なくとも２つの鎖間のジスルフィド結合で部分的に還元する（例えば、可能なコンジュゲーション部位の全体的還元または特定のコンジュゲーション部位での還元）任意の比率であり得る。

本明細書で記載のいずれかのＡＣＣのいくつかの実施形態では、ＡＣＣは、いかなる鎖内ジスルフィド結合の還元も避ける様式で還元剤により還元される。本明細書で記載のいずれかのＡＣＣのいくつかの実施形態では、ＡＣＣは、いかなる鎖内ジスルフィド結合の還元も回避しかつ少なくとも１つの鎖間のジスルフィド結合を還元する様式で還元剤により還元される。

本明細書で記載のいずれかのＡＣＣのいくつかの実施形態では、ＡＣＣはまた、ＡＣＣにコンジュゲートされる薬剤を含み得る。いくつかの実施形態では、コンジュゲートされる薬剤は、治療薬である。

いくつかの実施形態では、薬剤（例えば、活性化可能サイトカイン構築物にコンジュゲートされる薬剤）は、例えば、標識または他のマーカーなどの検出可能部分である。例えば、薬剤は、放射標識アミノ酸、マークされたアビジンによって検出可能な１つまたは複数のビオチニル部分（例えば、蛍光マーカーまたは光学的方法もしくは熱量測定法によって検出可能な酵素活性を含むストレプトアビジン）、１種または複数の放射性同位体もしくは放射性核種、１種または複数の蛍光標識、１種または複数の酵素標識、および／または１種または複数の化学発光剤であるか、またはこれらを含む。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、スペーサー分子によって付着される。

いくつかの実施形態では、薬剤（例えば、活性化可能サイトカイン構築物にコンジュゲートされる細胞傷害薬）は、炭水化物部分、スルフヒドリル基、アミノ基、またはカルボキシレート基を用いてＡＣＣに連結される。

本明細書で記載の薬剤にコンジュゲートされるいずれかのＡＣＣのいくつかの実施形態では、薬剤（例えば、活性化可能サイトカイン構築物にコンジュゲートされる細胞傷害薬）は、リンカーおよび／またはＣＭ（切断可能配列とも呼ばれる）を介してＡＣＣにコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、薬剤（例えば、活性化可能サイトカイン構築物にコンジュゲートされる細胞傷害薬）は、ＡＣＣ中のシステインまたはリジンにコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、薬剤（例えば、活性化可能サイトカイン構築物にコンジュゲートされる細胞傷害薬）は、本明細書で開示の残基などのＡＣＣの別の残基にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、リンカーは、チオール含有リンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは、非切断性リンカーである。切断可能部分およびリンカーのいくつかの非限定的例が、表１に提供される。

当業者は、多種多様の可能な部分を、本開示のＡＣＣにカップルできることを理解するであろう。（例えば、“ＣｏｎｊｕｇａｔｅＶａｃｃｉｎｅｓ”，ＣｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓｔｏＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｍ．ＣｒｕｓｅａｎｄＲ．Ｅ．Ｌｅｗｉｓ，Ｊｒ（ｅｄｓ），ＣａｒｇｅｒＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，（１９８９）を参照されたい。この文献は、参照により全体が本明細書に組み込まれる）。一般に、ＡＣＣへの薬剤（例えば、細胞傷害薬）の効果的なコンジュゲーションは、薬剤をＡＣＣに結合し同時に薬剤およびＡＣＣが機能を保持することを可能にする化学反応により達成できる。

薬剤にコンジュゲートされるいずれかのＡＣＣのいくつかの実施形態では、限定されないが、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミデートＨＣＬ）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス－アジド化合物（例えば、ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス－ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トリエン２，６－ジイソシアネート）、およびビス－活性フッ素化合物（例えば、１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン）を含む種々の二官能性タンパク質カップリング剤を用いてＡＣＣに薬剤をコンジュゲートできる。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３８：１０９８（１９８７年）に記載のように調製できる。いくつかの実施形態では、炭素－１４－標識１－イソチオシアナトベンジル－３－メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）キレート化剤を用いて、ＡＣＣに放射性ヌクレオチドをコンジュゲートできる。（例えば、国際公開第９４／１１０２６号を参照されたい）。

好適なリンカーおよびＣＭは、文献に記載されている。（例えば、Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｓ．ｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．４４：２０１－２０８（１９８４）ｄｅｓｃｒｉｂｉｎｇｕｓｅｏｆＭＢＳ（Ｍ－ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｅｎｚｏｙｌ－Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅｅｓｔｅｒを参照）。また、オリゴペプチドリンカーを介してＡＣＣにカップリングされたハロゲン化アセチルヒドラジド誘導体の使用について記載する米国特許第５，０３０，７１９号も参照されたい。いくつかの実施形態では、好適なリンカーとしては、（ｉ）ＥＤＣ（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩；（ｉｉ）ＳＭＰＴ（４－スクシンイミジルオキシカルボニル－α－メチル－α－（２－ピリジルジチオ）トルエン）（ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｃａｔ．（２１５５８Ｇ）；（ｉｉｉ）ＳＰＤＰ（スクシンイミジル－６［３－（２－ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍ．Ｃｏ．，カタログ番号２１６５１Ｇ）；（ｉｖ）スルホ－ＬＣ－ＳＰＤＰ（スルホスクシンイミジル６［３－（２－ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍ．Ｃｏ．カタログ番号２１６５－Ｇ）；および（ｖ）ＥＤＣにコンジュゲートしているスルホ－ＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミド：ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍ．Ｃｏ．，カタログ番号２４５１０）が挙げられる。追加のリンカーは、ＳＭＣＣ、スルホ－ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢまたはスルホ－ＳＰＤＢを包含するが、これらに限定されない。

上記のＣＭおよびリンカーは、様々な属性を有する成分を含み、従って、異なる物理化学的特性を有するコンジュゲートをもたらす。例えば、アルキルカルボキシレートのスルホ－ＮＨＳエステルは、芳香族カルボキシレートのスルホ－ＮＨＳエステルよりも安定である。ＮＨＳエステル含有リンカーは、スルホＮＨＳエステルよりも溶解性が低い。さらに、リンカーＳＭＰＴは、立体障害のあるジスルフィド結合を含み、向上した安定性を有するコンジュゲートを形成できる。ジスルフィド結合は一般に、ジスルフィド結合がインビトロで切断されるため、他の結合ほど安定でなく、より少ない利用可能なコンジュゲートをもたらす。スルホ－ＮＨＳは、特に、カルボジイミドカップリングの安定性を強化できる。カルボジイミドカップリング（ＥＤＣなど）は、スルホ－ＮＨＳと共に使用されると、カルボジイミドカップリング反応単独よりも加水分解に対して耐性であるエステルを形成する。

いずれかのＡＣＣのいくつかの実施形態では、薬剤は、ＡＣＣのアミノ酸配列中に含まれる改変アミノ酸配列を用いて、ＡＣＣにコンジュゲートできる。コンジュゲーション可能なアミノ酸をＡＣＣのアミノ酸配列内の特定の位置に挿入することにより、タンパク質構築物は、コンジュゲート薬剤の制御された配置および／または投与量のために設計され得る。例えば、ＡＣＣは、反応性チオール基を提供しタンパク質フォールディングおよび／または構築に悪影響を与えず、および結合特性を変えない、第１のモノマー、第２のモノマー、第３のモノマー、および／または第４のモノマー上の位置でシステインアミノ酸残基を含むように改変できる。いくつかの実施形態では、ＡＣＣは、コンジュゲーションのための好適な部位を提供するために、ＡＣＣのアミノ酸配列内に１つまたは複数の非天然アミノ酸残基を含むように改変できる。いくつかの実施形態では、ＡＣＣは、ＡＣＣのアミノ酸配列内に酵素的に活性化可能なペプチド配列を含むように改変できる。

核酸
本明細書で提供されるのは、本明細書で記載のいずれかのＡＣＣの第１のモノマー構築物（または第１のモノマー構築物のタンパク質部分）（例えば、本明細書で記載のいずれかの第１のモノマー構築物）および第２のモノマー構築物（または第２のモノマー構築物のタンパク質部分）（例えば、本明細書で記載のいずれかの第２のモノマー構築物）をコードする配列を含む核酸である。いくつかの実施形態では、１対の核酸は、第１のモノマー構築物（または第１のモノマー構築物のタンパク質部分）および第２のモノマー構築物（または第２モノマー構築物のタンパク質部分）を一緒にコードする。いくつかの実施形態では、第１のモノマー構築物（または第１のモノマー構築物のタンパク質部分）をコードする核酸配列は、第２のモノマー構築物（または第２のモノマー構築物のタンパク質部分）をコードする核酸配列と、少なくとも７０％同一（例えば、少なくとも７２％同一、少なくとも７４％同一、少なくとも７６％同一、少なくとも７８％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一）である。

いくつかの実施形態では、第１のモノマー構築物のタンパク質部分をコードする核酸は、ＣＰ１およびＣＭ１部分を含むポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、第２のモノマー構築物のタンパク質部分をコードする核酸は、ＣＰ２およびＣＭ２部分を含むポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、１対の核酸は、第１のモノマー構築物のタンパク質部分および第２のモノマー構築物のタンパク質部分を一緒にコードし、タンパク質部分はその後、それぞれ、ＤＤ１およびＤＤ２部分にコンジュゲートされる（その後のコンジュゲーションステップにおいて）。

いくつかの実施形態では、第１のモノマー構築物をコードする核酸は、ＤＤ１部分を含むポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、第２のモノマー構築物をコードする核酸は、ＤＤ２部分を含むポリペプチドをコードする。

ベクター
本明細書で提供されるのは、本明細書で記載のいずれかの核酸を含むベクターおよびベクターセットである。当業者は、本明細書で記載のいずれかのＡＣＣを製造し、本明細書で記載のいずれかのＡＣＣを発現させるためのベクターまたはベクターセットを用いるために、好適なベクターまたはベクターセット（例えば、発現ベクター）を選択できるであろう。例えば、ベクターまたはベクターセットの選択では、細胞を考慮しなければならない。理由は、ベクターは、細胞の染色体中に統合でき、かつ／またはその中で複製できる必要があるためである。ＡＣＣを産生するために使用できる例示的ベクターはまた、以下で記載される。

本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、細胞（例えば、本明細書で記載のいずれかの細胞）中で組換えタンパク質（例えば、第１のまたは第２のモノマー）の発現を誘導できるポリヌクレオチドを指す。「ベクター」は、核酸およびそのフラグメントを宿主細胞中に送達でき、調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリ（Ａ）シグナル）を含む。外来性ポリヌクレオチドが、発現されるために、発現ベクター中に挿入されてよい。用語「ベクター」はまた、人工染色体、プラスミド、レトロウイルス、およびバキュロウイルスベクターを含む。

本明細書で記載のいずれかの核酸を含み、細胞（例えば、哺乳動物細胞）の形質転換に好適であるベクターを構築する方法は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，Ｅｄｓ．“ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，” ２^ｎｄＥｄ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，１９８９ａｎｄＡｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，Ｅｄｓ．“ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，” ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ，１９９３、を参照されたい。

ベクターの非限定的例としては、プラスミド、トランスポゾン、コスミド、およびウイルスベクター（例えば、任意のアデノウイルス（例えば、ｐＳＶまたはｐＣＭＶベクター）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、およびレトロウイルス）、および任意のゲートウェイ（登録商標）ベクターが挙げられる。ベクターは、例えば、発現のための十分なシス作用性エレメントを含んでよく；発現のための他のエレメントは、ホスト哺乳動物細胞により、またはインビトロ発現系で供給できる。熟練開業医は、本明細書で記載のいずれかのＡＣＣの製造のために、好適なベクターおよび哺乳動物細胞を選択できるであろう。

本明細書で記載のいずれかのＡＣＣのいくつかの実施形態では、ＡＣＣは、組換えＤＮＡ技術および真核生物または原核生物種中での発現を用いて生合成により作製され得る。

いくつかの実施形態では、ベクターは、本明細書で記載のいずれかのＡＣＣの第１のモノマーおよび第２のモノマーをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、発現ベクターである。

いくつかの実施形態では、１対のベクターは、本明細書で記載のいずれかのＡＣＣの第１のモノマーおよび第２のモノマーを一緒にコードする１対の核酸を含む。いくつかの実施形態では、ベクター対は、１対の発現ベクターである。

細胞
また、本明細書で提供されるのは、本明細書で記載のいずれかの核酸を含む本明細書で記載のいずれかのベクターまたはベクターセットを含む宿主細胞である。

本明細書で記載のいずれかのＡＣＣは、任意の細胞（例えば、哺乳動物細胞）により産生できる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）、げっ歯類細胞（例えば、マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、またはモルモット細胞）、または非ヒト霊長類細胞である。

核酸およびベクター（例えば、本明細書で記載のいずれかのベクターまたはいずれかのベクターセット）を細胞中に導入する方法は、当技術分野において既知である。核酸を細胞中に導入するための使用できる方法の非限定的例としては、リポフェクション、トランスフェクション、リン酸カルシウム法、陽イオンポリマートランスフェクション、ウィルス形質導入（例えば、アデノウイルス形質導入、レンチウイルス形質導入）ナノ粒子トランスフェクション、および電気穿孔が挙げられる。

いくつかの実施形態では、導入ステップは、本明細書で記載のいずれかのＡＣＣを構成するモノマーをコードする核酸を含むベクター（例えば、本明細書で記載のいずれかのベクターまたはベクターセット）の細胞中への導入を含む。

本明細書で記載のいずれかの方法のいくつかの実施形態では、細胞は、真核細胞であり得る。本明細書で使用される場合、「真核細胞」という用語は、別個の膜結合核を有する細胞を指す。このような細胞は、例えば、哺乳動物（例えば、げっ歯類、非ヒト霊長類、またはヒト）、昆虫、真菌、または植物細胞を含み得る。いくつかの実施形態では、真核細胞は、サッカロミセス・セレビシエ（出芽酵母）細胞などの、酵母細胞である。いくつかの実施形態では、真核細胞は、哺乳動物、トリ、植物、または昆虫細胞などの、高等真核生物細胞である。哺乳動物細胞の非限定的例としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞およびヒト胎児腎臓細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）が挙げられる。

いくつかの実施形態では、細胞は、本明細書で記載のいずれかのＡＣＣの第１のモノマーおよび第２のモノマーをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、本明細書で記載のいずれかのＡＣＣの第１のモノマーおよび第２のモノマーを一緒にコードする核酸対を含む。

活性化可能サイトカイン構築物を製造する方法
本明細書で提供されるのは、（ａ）ＡＣＣを製造するのに十分な条件下で、液体培地中にて本明細書で記載のいずれかの組換え宿主細胞を培養すること；および（ｂ）宿主細胞および／または液体培地からＡＣＣを回収すること、を含む本明細書で記載のいずれかのＡＣＣを製造する方法である。

細胞を培養する方法は、当該技術分野において周知である、細胞は、細胞増殖、細胞分化および細胞成長に好都合な条件下にて、インビトロで、維持できる。例えば、細胞は、細胞（例えば、本明細書で記載のいずれかの細胞）を、細胞生存および成長を支援するのに十分な必要成長因子およびサプリメントを含む細胞培地と接触させることにより培養できる。

本明細書で記載のいずれかの方法のいくつかの実施形態では、方法は、回収したＡＣＣを単離することをさらに含む。単離方法の非限定的例としては、硫酸アンモニウム沈殿法、ポリエチレングリコール沈殿法、サイズ排除クロマトグラフィー、リガンド親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、アニオンまたはカチオン）、および疎水性相互作用クロマトグラフィーが挙げられる。

いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＰ１およびＣＭ１を含む第１のモノマー構築物のタンパク質部分およびＣＰ２およびＣＭ２を含む第２のモノマー構築物のタンパク質部分を産生でき、その後、タンパク質部分は、それぞれ、ＤＤ１およびＤＤ２部分にコンジュゲートされる。

組成物および本明細書で記載の方法は、ＡＣＣのダイマー化を形成および維持するためにダイマー化ドメインの間にジスルフィド結合を形成させる非還元条件または部分的還元条件の使用を含み得る。

本明細書で記載のいずれかの方法のいくつかの実施形態では、方法は、単離ＡＣＣを医薬組成物に処方することをさらに含む。種々の処方は、当技術分野において既知であり、本明細書で記載される。本明細書で記載のいずれかの単離ＡＣＣは、任意の投与経路（例えば、静脈内、腫瘍内、皮下、皮内、経口（例えば、吸入）、経皮（例えば、局所）、経粘膜、または筋肉内）のために処方できる。

また、本明細書で提供されるのは、本明細書記載のいずれかの方法により製造されるＡＣＣである。また、本明細書で提供されるのは、本明細書記載のいずれかの方法により製造されるいずれかのＡＣＣを含む組成物（例えば、医薬組成物）である。また、本明細書で提供されるのは、本明細書で記載のいずれかの組成物（例えば、医薬組成物）の少なくとも１種の投与量を含むキットである。

治療の方法
本明細書で提供されるのは、対象に本明細書で記載のＡＣＣのいずれかの治療的有効量を投与することを含む対象の疾患（例えば、癌（例えば、本明細書で記載のいずれかの癌））を治療する方法である。

本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、任意の哺乳動物を指す。いくつかの実施形態では、対象は、ネコ（例えば、ネコ（ｃａｔ））、イヌ（例えば、イヌ（ｄｏｇ））、ウマ（例えば、ウマ（ｈｏｒｓｅ））、ウサギ、ブタ、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスターまたはモルモット）、非ヒト霊長類（例えば、サル（例えば、サル（ｍｏｎｋｅｙ）（例えば、ヒヒ、キヌザル））、または類人猿（例えば、チンパンジー、ゴリラ、オランウータン、またはテナガザル））、またはヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。

いくつかの実施形態では、対象は以前に、疾患（例えば、癌（例えば、本明細書で記載のいずれかの癌））を有すると特定または診断されている。

本明細書で使用される場合、「治療する」という用語は、対象（例えば、本明細書で記載のいずれかの対象）の重症度、頻度または１種または複数（例えば、１、２、３、４、５つ）の疾患（例えば、癌（例えば、本明細書で記載のいずれかの癌））の症状または徴候を低減することを含む。疾患が癌であるいくつかの実施形態では、治療することは、癌の対象における癌の成長の低減、癌進行の抑制、癌転移の抑制、または癌再発のリスクを低減することをもたらす。

本明細書で記載のいずれかの方法のいくつかの実施形態では、疾患は、癌である。本明細書で提供されるのは、本明細書で記載のいずれかのＡＣＣまたは本明細書で記載のいずれかの組成物（例えば、医薬組成物）の治療的有効量を対象に投与することを含む、それを必要としている対象（例えば、本明細書で記載されるまたは当該技術分野において既知のいずれかの例示的対象）を治療する方法である。

これらの方法のいくつかの実施形態では、対象は、癌を有すると特定または診断されている。癌の非限定的例としては、固形腫瘍、血液学的腫瘍、肉腫、骨肉腫、神経膠芽腫、神経芽腫、メラノーマ、横紋筋肉腫、ユーイング肉腫、骨肉腫、Ｂ細胞新生物、多発性骨髄腫、リンパ腫（例えば、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫）、白血病（例えば、毛様細胞性白血病、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、カポジ肉腫、網膜芽細胞腫、胃癌、尿路上皮癌、肺癌、腎細胞癌、胃および食道癌、膵臓癌、前立腺癌、脳癌、結腸癌、骨癌、肺癌、乳癌、結腸直腸癌、卵巣癌、鼻咽頭腺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、扁平上皮頭頸部癌、子宮内膜癌、膀胱癌、子宮頸癌、肝臓癌、および肝細胞癌が挙げられる。いくつかの実施形態では、癌は、リンパ腫である。いくつかの非限定的実施形態では、リンパ腫は、バーキットリンパ腫である。いくつかの態様では、対象は、リー・フラウメニ症候群、家族性乳癌・卵巣癌（ＢＲＣＡ１またはＢＲＣＡ２変異）、などの家族性癌症候群を有すると特定または診断されている。開示される方法はまた、非固形癌の治療にも有用である。例示的固形腫瘍としては、肺、乳房、リンパ性、胃腸（例えば、結腸）、および泌尿生殖（例えば、腎臓、尿路上皮、または精巣腫瘍）器、咽頭、前立腺、および卵巣のものなどの種々の臓器系の悪性腫瘍（例えば、肉腫、腺癌、および癌腫）が挙げられる。例示的腺癌としては、結腸直腸癌、腎細胞癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、および小腸癌が挙げられる。

米国国立癌研究所により記載される例示的癌としては、急性リンパ性白血病、成人、急性リンパ性白血病、小児、急性骨髄性白血病、成人、副腎皮質がん、副腎皮質がん、小児、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、ＡＩＤＳ関連悪性腫瘍、肛門癌、星状細胞腫、小児小脳、星状細胞腫、小児脳、胆管癌、肝外、膀胱癌、膀胱癌、小児、骨癌、骨肉腫／悪性線維性組織球腫、脳幹神経膠腫、小児、脳腫瘍、成人、脳腫瘍、脳幹神経膠腫、小児、脳腫瘍、小脳星状細胞腫、小児、脳腫瘍、脳星状細胞腫／悪性神経膠腫、小児、脳腫瘍、上衣腫、小児、脳腫瘍、髄芽腫、小児、脳腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、小児、脳腫瘍、視覚路および視床下部神経膠腫、小児、脳腫瘍、小児（その他）、乳癌、乳癌および妊娠、乳癌、小児、乳癌、男性、気管支腺腫／カルチノイド、小児、カルチノイド腫瘍、小児、カルチノイド腫瘍、胃腸、癌腫、副腎皮質、癌腫、島細胞、原発不明の癌腫、中枢神経系リンパ腫、原発、小脳星状細胞腫、小児、脳星状細胞腫／悪性神経膠腫、小児、子宮頸癌、小児癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、腱鞘の明細胞肉腫、結腸癌、結腸直腸癌、小児、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、子宮内膜癌、上衣腫、小児、上皮癌、卵巣、食道癌、食道癌、小児、腫瘍のユーイングファミリー、頭蓋外胚細胞腫瘍、小児、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼癌、眼球内黒色腫、眼癌、網膜芽細胞腫、胆嚢癌、胃部（胃）癌、胃部（胃）癌、小児、消化管カルチノイド腫瘍、胚細胞腫瘍、頭蓋外、小児、胚細胞腫瘍、性腺外、胚細胞腫瘍、卵巣、妊娠性絨毛腫瘍、神経膠腫、小児脳幹、神経膠腫、小児視覚路および視床下部、ヘアリー細胞白血病、頭頸部癌、肝細胞（肝臓）癌、成人（原発）、肝細胞（肝臓）癌、小児（原発）、ホジキンリンパ腫、成人、ホジキンリンパ腫、小児、妊娠中のホジキンリンパ腫、下咽頭癌、視床下部および視覚路神経膠腫、小児、眼球内黒色腫、島細胞がん（膵島）、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、喉頭癌、小児、白血病、急性リンパ芽球性、成人、白血病、急性リンパ芽球性、小児、白血病、急性骨髄性、成人、白血病、急性骨髄性、小児、白血病、慢性リンパ球性、白血病、慢性骨髄性、白血病、ヘアリー細胞、口唇および口腔癌、肝臓癌、成人（原発）、肝臓癌、小児（原発）、肺癌、非小細胞、肺癌、小細胞、リンパ芽球性白血病、成人急性、リンパ芽球性白血病、小児急性、リンパ性白血病、慢性、リンパ腫、ＡＩＤＳ関連、リンパ腫、中枢神経系（原発）、リンパ腫、皮膚Ｔ細胞、リンパ腫、ホジキン、成人、リンパ腫、ホジキン、小児、リンパ腫、妊娠中ホジキン、リンパ腫、非ホジキン、成人、リンパ腫、非ホジキン、小児、リンパ腫、妊娠中非ホジキン、リンパ腫、原発中枢神経系、マクログロブリン血症、ワルデンストレーム、男性乳癌、悪性中皮腫、成人、悪性中皮腫、小児、悪性胸腺腫、髄芽腫、小児、メラノーマ、メラノーマ、眼内、メルケル細胞癌、中皮腫、悪性、原発不明転移性扁平上皮性頸部癌、多発性内分泌腫瘍症候群、小児、多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍、菌状息肉症、骨髄異形成症候群、骨髄性白血病、慢性、骨髄性白血病、小児急性、骨髄腫、多発性、骨髄増殖性疾患、慢性、鼻腔および副鼻腔癌、上咽頭癌、上咽頭癌、小児、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、成人、非ホジキンリンパ腫、小児、妊娠中の非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、口腔癌、小児、口腔および口唇癌、中咽頭癌、骨肉腫／骨の悪性線維性組織球腫、卵巣癌、小児、卵巣上皮癌、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵臓癌、膵臓癌、小児、膵臓癌、島細胞、副鼻腔および鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、褐色細胞腫、松果体およびテント上原始神経外胚葉性腫瘍、小児、下垂体腫瘍、形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、妊娠および乳癌、妊娠およびホジキンリンパ腫、妊娠および非ホジキンリンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発肝臓癌、成人、原発肝臓癌、小児、前立腺癌、直腸癌、腎細胞（腎臓）癌、腎細胞癌、小児、腎盂および尿管、移行上皮癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、小児、唾液腺癌、唾液腺癌、小児、肉腫、腫瘍のユーイングファミリー、肉腫、カポジ、肉腫（骨肉腫）／骨の悪性線維性組織球腫、肉腫、横紋筋肉腫、小児、肉腫、軟部組織、成人、肉腫、軟部組織、小児、セザリー症候群、皮膚癌、皮膚癌、小児、皮膚癌（メラノーマ）、皮膚がん、メルケル細胞、小細胞肺癌、小腸癌、軟部組織肉腫、成人、軟部組織肉腫、小児、原発不明扁平上皮性頸部癌、転移性、胃部（胃）癌、胃部（胃）癌、小児、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、小児、Ｔ－細胞リンパ腫、皮膚、精巣癌、胸腺腫、小児、胸腺腫、悪性、甲状腺癌、甲状腺癌、小児、腎盂および尿管の移行上皮癌、絨毛性腫瘍、妊娠性、小児の原発不明部位癌、小児の珍しい癌、尿管および腎盂、移行上皮癌、尿道癌、子宮肉腫、腟癌、視覚路および視床下部神経膠腫、小児、外陰癌、ワルデンストレームマクログロブリン血症、ならびにウィルムス腫瘍、が挙げられる。

さらなる例示的癌としては、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）およびマントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）が挙げられる。

上述の癌の転移はまた、本明細書で記載される方法により治療および予防できる。

いくつかの実施形態では、これらの方法は、対象の癌の１つまたは複数の症状の数、重症度、または発生頻度の減少をもたらし得る（例えば、治療前の対象の癌１つまたは複数の症状の数、重症度、または発生頻度に比べて）。

本明細書で記載のいずれかの方法のいくつかの実施形態では、方法は、追加の治療薬（例えば、表２に挙げた１種または複数の治療薬）を対象に投与することをさらに含む。

組成物／キット
また、本明細書で提供されるのは、本明細書で記載のいずれかのＡＣＣおよび１種または複数（例えば、１、２、３、４、または５種）の薬学的に許容可能な担体（例えば、本明細書で記載のいずれかの薬学的に許容可能な担体）、希釈剤または賦形剤を含む組成物（例えば、医薬組成物）である。

いくつかの実施形態では、本明細書記載のいずれかのＡＣＣを含む組成物（例えば、医薬組成物）は、無菌バイアルまたは予め充填されるシリンジ中に配置されてよい。

いくつかの実施形態では、本明細書記載のいずれかのＡＣＣを含む組成物（例えば、医薬組成物）は、異なる投与経路（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、または腫瘍内投与）用に処方されてよい。

いくつかの実施形態では、本明細書で記載のいずれかの医薬組成物は、１種または複数の緩衝液（例えば、中性緩衝食塩水、リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））、アミノ酸（例えば、グリシン）、１種または複数の炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、スクロース、デキストラン、またはマンニトール）１種または複数の抗酸化剤、１種または複数のキレート化剤（例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン）、１種または複数の防腐剤、および／または薬学的に許容可能な担体（例えば、静菌性水、ＰＢＳ、または生理食塩水）を含んでよい。

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能な担体」という用語は、薬学的投与に適合する任意のすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤、抗微生物剤、等張剤および吸収遅延剤などを指す。好適な担体としては、限定されないが、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、および約５％ヒト血清アルブミンが挙げられる。

本明細書で記載のいずれかの医薬組成物のいくつかの実施形態では、本明細書で記載のいずれかのＡＣＣは、例えば、インプラントおよびマイクロカプセル化送達系を含む持続および制御放出製剤として体内からの迅速除去を防ぐ担体と共に調製される。生分解性で、生体適合性のポリマー、例えば、エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸を使用できる。このような医薬組成物および製剤の調製のための方法は、当業者には自明である。

また、本明細書で提供されるのは、本明細書で記載のいずれかのＡＣＣ、本明細書で記載のいずれかのＡＣＣを含むいずれかの組成物、または本明細書で記載のいずれかのＡＣＣを含むいずれかの医薬組成物を含むキットである。また、本明細書で記載のＡＣＣに加えて、表２から選択される１種または複数の第２の治療薬を含むキットも提供される。第２の治療薬は、ＡＣＣとは別の投与剤形として提供され得る。あるいは、第２の治療薬は、ＡＣＣと一緒に処方され得る。

本明細書で記載のいずれかのキットは、本明細書で記載のいずれかの組成物（例えば、医薬組成物）および／またはいずれかのＡＣＣを使用するための説明書を含み得る。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書で記載のいずれかの方法を実施するための説明書を含み得る。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書で記載のいずれかの組成物（例えば、医薬組成物）の少なくとも１つの投与量を含み得る。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書で記載のいずれかの医薬組成物を投与するためのシリンジを提供し得る。

実施例
本発明は、特許請求の範囲に記述された本発明の範囲を限定しない、以下の実施例によりさらに説明される。
実施例１：活性化可能サイトカイン構築物の製造
活性化可能サイトカイン構築物ＩＦＮα２ｂ－１２０４ＤＮＩｄｌ－ｈＩｇＧ４を、組換え法により調製した。このＡＣＣの第１および第２のモノマー構築物は、同一であり、それぞれは図３に示すアミノ酸配列（配列番号３０９）を有するポリペプチドである。第１および第２のモノマー構築物のそれぞれは、Ｎ末端からＣ末端へ、マウスＩｇＧカッパシグナル配列由来のシグナル配列（配列番号３０９の残基１～２０）、ヒトインターフェロンα２ｂに対応する成熟サイトカインタンパク質（配列番号１）、配列番号９９のアミノ酸配列を有する切断可能部分、アミノ酸配列：ＧＧＧＳを有するリンカー（配列番号２）、およびヒトＩｇＧＦｃに対応するＤＤ（配列番号４）を含む。ポリペプチドを、宿主細胞を配列番号３１０の配列を有するポリヌクレオチドで宿主細胞を形質転換することにより調製し、続いて、得られた組換え宿主細胞を培養した。得られた発現されたポリペプチドのダイマー化は、活性化可能サイトカイン構築物、ＩＦＮα２ｂ１２０４ＤＮＩｄｌ－ｈＩｇＧ４を生じた。

活性化可能サイトカイン構築物ＩＦＮα２ｂ１４９０ＤＮＩ－ｈＩｇＧ４もまた、組換え法により調製した。このＡＣＣの第１および第２のモノマー構築物もまた、同一であり、それぞれは図４に示すアミノ酸配列（配列番号３１１）を有するポリペプチドである。このＡＣＣの第１および第２のモノマー構築物のそれぞれは、Ｎ末端からＣ末端へ、マウスＩｇＧカッパシグナル配列由来のシグナル配列（配列番号３０９の残基１～２０）、ヒトインターフェロンα２ｂに対応する成熟サイトカインタンパク質（配列番号１）、配列番号６８のアミノ酸配列を有する切断可能部分、アミノ酸配列：ＧＧＧＳを有するリンカー（配列番号２）、およびヒトＩｇＧＦｃに対応するＤＤ（配列番号４）を含む。ポリペプチドを、配列番号３１２の配列を有するポリヌクレオチドで宿主細胞を形質転換することにより調製し、続いて、得られた組換え宿主細胞を培養した。得られた発現されたポリペプチドのダイマー化は、活性化可能サイトカイン構築物、ＩＦＮα２ｂ１２０４ｄｌ－ｈＩｇＧ４を生じた。

リンカー中に追加の５アミノ酸残基を含んだ追加の活性化可能サイトカイン構築物を調製した。

電気泳動法を、活性化可能サイトカイン構築物およびプロテアーゼ処理活性化可能サイトカイン構築物に対し実施した。図６は、ゲルを示し、これは、左から右へ、（１）ＡＣＣＩＦＮα２ｂ－１２０４ＤＮＩｄｌ－ｈＩｇＧ４（「１２０４」）；（２）ＭＴ－ＳＰ１処理ＩＦＮα２ｂ－１２０４ＤＮＩｄｌーｈＩｇＧ４（「１２０４ＭＴ－ＳＰ１」）；（３）ｕＰＡ処理ＩＦＮα２ｂ－１２０４ＤＮＩｄｌ－ｈＩｇＧ４（「１２０４ｕＰＡ」）；（４）リンカーに追加された５アミノ酸残基を有するＩＦＮα２ｂ－１２０４ＤＮＩｄｌ－ｈＩｇＧ４（１２０４＋１）；（５）ＭＴ－ＳＰ１－処理ＩＦＮα２ｂ－１２０４ＤＮＩｄｌ－ｈＩｇＧ４（「１２０４＋１ＭＴ－ＳＰ１」）；（６）ｕＰＡ処理ＩＦＮα２ｂ－１２０４ＤＮＩｄｌ－ｈＩｇＧ４（「１２０４＋１ｕＰＡ」）；（７）ＩＦＮα２ｂ１４９０ＤＮＩ－ｈＩｇＧ４（「１４９０」）；（８）ＭＴ－ＳＰ１処理ＩＦＮα２ｂ１４９０ＤＮＩ－ｈＩｇＧ４（「１４９０ＭＴ－ＳＰ１」）；および（９）ｕＰＡ処理ＩＦＮα２ｂ１４９０ＤＮＩ－ｈＩｇＧ４（「１４９０ｕＰＡ」）の結果を示す。結果は、プロテアーゼが、活性化可能サイトカイン構築物の切断可能部分の切断に効果的であったことを示唆する。

実施例２．活性化可能サイトカイン構築物のＩＦＮα２ｂ活性
ヒトＩ型インターフェロンに対する細胞ベースレポーターアッセイを用いて、実施例１で記載のＡＣＣの活性を試験した。
ＩＦＮ応答性ＨＥＫ２９３細胞を、ヒトＳＴＡＴ２およびＩＲＦ９遺伝子を安定に遺伝子導入することにより生成して完全に活性なＩ型ＩＦＮシグナル伝達経路を得た。細胞はまた、ＩＦＮα／β誘導性ＩＳＧ５４プロモーターの制御下にある誘導性ＳＥＡＰ（分泌型胚性アルカリホスファターゼ）レポーター遺伝子も備える。導入遺伝子発現を維持するために、細胞を、１０％ＦＢＳ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、３０μｇ／ｍＬのブラストサイジン、１００μｇ／ｍＬのゼオシンおよび１００μｇ／ｍＬのノルモシンを補充したＤＭＥＭＧｌｕｔａＭａｘ培地中で培養した。これらの細胞へのＩ型ＩＦＮの添加は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ／ＩＳＧＦ３経路を活性化し、ＳＥＡＰの産生を続いて誘導し、これは、Ｑｕａｎｔｉ－Ｂｌｕｅ溶液による、アルカリホスファターゼ活性の比色分析検出を用いて上清中で容易に評価できる。このレポーターアッセイを用いて、ＩＦＮα２ｂ含有ＡＣＣの活性を、シラトロン（登録商標）（ペグインターフェロンα２ｂ）の活性と比較した。図７のデータは、ＡＣＣのＩＦＮα２ｂ活性が、シラトロン（登録商標）（ペグインターフェロンα２ｂ）のＩＦＮα２ｂ活性と比較して、有意に低減されたことを示す。

さらに、図８Ａおよび８Ｂのデータは、（非切断の）ＡＣＣの活性が、リンカーまたはリンキング領域の長さを変えることにより調節され得たことを示す。図８Ａおよび８Ｂのデータは、ＨＥＫ２９３レポーターアッセイで試験した、ＩＦＮα２ｂとｈＩｇＧ４Ｆｃの間に可変リンカー長を有するまたはリンカーのないＩＦＮα２ｂ－ｈＩｇＧ４Ｆｃ融合構築物の結果のを示す。この実験で試験した融合タンパク質は、ＮからＣ末端方向に、成熟ＩＦＮα２ｂサイトカイン配列、オプションのリンカーおよび／または切断可能部分、および配列番号４のヒトＩｇＧ４のＦｃドメイン（Ｆｃ配列のＮ末端がアミノ酸配列ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣ・・・で始まるように完全ヒンジ領域を含む）を含む。第１の構築物（リンキング領域＝７）は、リンカーまたは切断可能部分を有しない；その配列は、ＮからＣ末端方向に、配列番号４に融合された配列番号１からなる。第２の構築物（リンキング領域＝１２）は、５アミノ酸リンカーＳＧＧＧＧ（配列番号３３５）を有する；その配列は、ＮからＣ末端方向に、配列番号４に融合した配列番号３３５に融合された配列番号１からなる。第３の構築物（リンキング領域＝１８）は、７アミノ酸ＣＭ（ＳＧＲＳＤＮＩ）および４アミノ酸リンカーＧＧＧＳを含む；その配列は、ＮからＣ末端方向に、配列番号４に融合された配列番号２に融合された配列番号１００に融合された配列番号１からなる。第４の構築物（リンキング領域＝２３）は、５アミノ酸リンカー、７アミノ酸ＣＭ、および４アミノ酸リンカーを含む；その配列は、ＮからＣ末端方向に、配列番号４に融合された配列番号２に融合された配列番号１００に融合された配列番号３３５に融合された配列番号１からなる。第５の構築物（リンキング領域＝２４）は、１３アミノ酸ＣＭ（ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＮＩ）および４アミノ酸リンカーを含む；その配列は、ＮからＣ末端方向に、配列番号４に融合された配列番号２に融合された配列番号６８に融合された配列番号１からなる。

実施例３：癌細胞に対するＡＣＣのインビトロ抗増殖効果
ＩＦＮα２ｂおよびＩＦＮα２ｂ含有ＡＣＣの抗増殖効果を、ヒトＢ細胞リンパ芽球性起源の細胞株のＤａｕｄｉ細胞を用いて試験した。Ｄａｕｄｉ細胞を、１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ－１６４０培地中で２ｘ１０^５細胞／ｍＬの濃度で調製し、５０μＬの分取量を、白色平底９６ウェルプレートのウェルにピペットで入れた（１０Ｋ／ウェル）。試験されるＡＣＣまたは対照を、１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ－１６４０培地中で希釈した。二重の５倍系列希釈を生成し、これから５０μＬを各ウェルに添加した。３７℃で３日間のインキュベーション後、生存率キットを使用して、細胞内ＡＴＰのレベルを、残っている生存細胞の数の推定値として測定した。１００μＬのｃｅｌｌ－ｔｉｔｅｒｇｏを、プレートに直接加え、これを次に、オービタルシェーカーに１０分間置いた。このインキュベーション後に、発光シグナルを、Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーを用いて直接測定した。用量反応曲線を、生成し、ＥＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍソフトウェアを用いて非線形回帰のシグモイドフィットにより得た。特異的活性を、組換えＩＦＮα２ｂまたは医薬品グレードシラトロン（登録商標）（ペグインターフェロンα２ｂ）とのＥＣ５０値の比較により決定した。

Ｄａｕｄｉリンパ腫細胞中のＩＦＮα２ｂ含有ＡＣＣの抗増殖活性は、非切断ＡＣＣのＩＦＮα２ｂ活性が、シラトロン（登録商標）（ペグインターフェロンα２ｂ）に比べて、低下されたことを示した（図９）。

図１０Ａおよび１０Ｂのデータはまた、（非切断）ＡＣＣの活性が、リンカーの長さを変えることにより調節し得たことも示した。種ＩＦＮα２ｂとｈＩｇＧ４Ｆｃの間に種々のリンカー長さを有する、またはリンカーのないＩＦＮα２ｂ－ｈＩｇＧ４Ｆｃ融合タンパク質構築物を、Ｄａｕｄｉ細胞を使ってインビトロで試験した。データは、サイトカインとＦｃドメインの間のフレキシブルリンカーの長さおよびリンキング領域（ＬＲ）の長さが、（非切断）ＡＣＣの活性に影響を与えたことを示す。ゼロリンカー、または短いリンカー、およびそれに対応した短いＬＲを有する構築物は、低減したサイトカイン活性を示し、一方、より長いリンカーおよび従って、より長いＬＲを有する構築物は、より高いレベルのサイトカイン活性を有する。結果を、図１０Ａおよび１０Ｂに示す。融合タンパク質構築物は、図８Ａおよび８Ｂに関して上記実施例２に記載されるものと同じである。

実施例４：プロテアーゼ処理ＡＣＣの活性
プロテアーゼ処理ＩＦＮα２ｂ含有ＡＣＣを、Ｄａｕｄｉリンパ腫細胞ベースアッセイおよび細胞ベースレポーターアッセイで抗増殖性応答について試験して、活性が回復され得るかどうかを決定した。
二量体化ドメインを切断するために、ＩＦＮα２ｂ含有ＡＣＣを、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、またはマトリプターゼ（ＭＴ－ＳＰ１）などの組換えヒトプロテアーゼで、３７℃で一晩処理した。プロテアーゼ阻害剤のカクテルを加えて、実施例２および３に記載のように活性について試験する前にプロテアーゼを中和した。これらのアッセイからの結果は、プロテアーゼによるＩＦＮα２ｂ含有ＡＣＣの処理は、組換えサイトカインと同等のレベルまで活性を回復し得ることを示す。ＡＣＣＩＦＮα２ｂ－１２０４ＤＮＩｄｌ－ｈＩｇＧ４、ＡＣＣＩＦＮα２ｂ－１２０４ＤＮＩｄｌ－ｈＩｇＧ４＋ｕＰＡ、ＳｔｅｍＣｅｌｌＩＦＮα２ｂ（ヒト組換えＩＦＮα２ｂ、ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｔａｌｏｇ＃７８０７７．１で入手可能）のＥＣ５０を、Ｄａｕｄｉアポトーシスアッセイ結果から計算し、下表３に示す。

ＡＣＣＩＦＮα２ｂ－１２０４ＤＮＩｄｌ－ｈＩｇＧ４、ＡＣＣＩＦＮα２ｂ－１２０４ＤＮＩｄｌ－ｈＩｇＧ４＋ｕＰＡ、およびＳｔｅｍＣｅｌｌＩＦＮα２ｂのＥＣ５０を、ＩＦＮα／βアッセイ結果から計算し、下表４に示す。

これらの結果は、活性化プロテアーゼの非存在下では、ＩＦＮα２ｂ－１２０４ＤＮＩｄｌ－ｈＩｇＧ４の活性は、ＩＦＮα２ｂ対照に比べて、有意に低下されることを示す。

実施例５：ユニバーサルＰｒｏＩＦＮ
ヒトおよびマウス細胞の両方に対する活性を有するユニバーサルインターフェロン配列（ＰｒｏＣ８５９）（ＩＦＮαＡＤ０ＡＡ１２０４ＤＮＩｄＬ０ＡＡＩｇＧ４）を有する本開示によるＡＣＣを、組換え法により調製した。このＡＣＣの第１および第２のモノマー構築物は、同一であり、それぞれはアミノ酸配列（配列番号３２３およびそのＮ末端にシグナル配列）を有するポリペプチドである。第１および第２のモノマー構築物のそれぞれは、Ｎ末端からＣ末端へ、シグナル配列、ＩＦＮα１とＩＦＮα２ａのハイブリッドであるユニバーサルインターフェロン分子に対応する成熟サイトカインタンパク質（配列番号３２４）、配列番号１００のアミノ酸配列を有する切断可能部分、およびヒトＩｇＧＦｃに対応するダイマー化ドメイン（配列番号３）を含む。ユニバーサルＰｒｏＩＦＮの活性を、ＩＦＮ応答性ＨＥＫ２９３細胞およびＢ１６マウスメラノーマ細胞を用いてインビトロで試験した。

ＰｒｏＣ８５９の活性は、マウスＩＦＮα４に比べて、少なくとも１５０Ｘ低下された。ｕＰａによるプロテアーゼ活性化は、図１９に示すように、マウスＩＦＮα４と同等のレベルに活性を回復した。ＡＣＣＰｒｏＣ８５９、ＡＣＣＰｒｏＣ８５９＋ｕＰＡ、およびマウスＩＦＮα４のＥＣ５０値を、アッセイ結果から計算し、図１９に示す。

実施例６：リード化合物ＡＣＣＰｒｏＣ４４０のインビトロキャラクタリゼーション：
活性化可能サイトカイン構築物ＰｒｏＣ４４０（ＮＩＦＮα２ｂ０１２０４ＤＮＩｄＬ０ＡＡＦｃ）もまた、組換え法により調製した。このＡＣＣの第１および第２のモノマー構築物は、同一であり、それぞれは配列番号３１３のアミノ酸配列およびそのＮ末端にシグナル配列を有するポリペプチドである。第１および第２のモノマー構築物のそれぞれは、Ｎ末端からＣ末端へ、シグナル配列、ヒトインターフェロンα２ｂに対応する成熟サイトカインタンパク質（配列番号１）、配列番号１００のアミノ酸配列を有する切断可能部分、およびヒトＩｇＧＦｃに対応するダイマー化ドメイン（配列番号３）を含む。

ＰｒｏＣ４４０の活性を、ＩＦＮ応答性ＨＥＫ２９３細胞およびＤａｕｄｉ細胞を用いて、前述のようにインビトロで試験した。両アッセイにおいて、ＰｒｏＣ４４０の活性は、ＳｔｅｍＣｅｌｌＩＦＮα２ｂに比べて、少なくとも１，０００Ｘ低下された（図１３）。ｕＰａによるプロテアーゼ活性化は、組換えサイトカイン（図１３に示すＩＦＮα２ｂ）と同等のレベルに活性を回復した。ＡＣＣＰｒｏＣ４４０、ＡＣＣＰｒｏＣ４４０＋ｕＰＡ、およびＳｔｅｍＣｅｌｌＩＦＮα２ｂのＥＣ５０を、ＩＦＮα／βアッセイ結果から計算し、下表５に示す。

ＡＣＣＰｒｏＣ４４０、ＡＣＣＰｒｏＣ４４０＋ｕＰＡ、およびＳｔｅｍＣｅｌｌＩＦＮα２ｂのＥＣ５０を、Ｄａｕｄｉアポトーシスアッセイ結果から計算し、下表６に示す。

ＣＭ中の予測部位でのｕＰＡによる切断が、質量分析により確認された（図１４Ａおよび１４Ｂ）。ｕＰＡ活性化に対する感受性に加えて、ＰｒｏＣ４４０は、ＭＭＰ４により切断される（図１４Ａおよび１４Ｂ）。質量分析による分析は、切断可能部分近傍の、ＩＦＮαのＣ末端の先端部でＭＭＰ１４切断部位を特定した（図１４Ｂ）。ＭＭＰ１４によるプロテアーゼ活性化は、組換えサイトカインと同等のレベルに活性を回復した。ひとまとめにして、これは、ＡＣＣＰｒｏＣ４４０が、少なくともｕＰＡおよびＭＭＰ１４により固有で改変された切断可能部分の切断後に完全に活性を回復できることを示す。

ＡＣＣＰｒｏＣ６５７（ＮＩＦＮα２ｂ０ＡＡ１２０４ＤＮＩｄＬ０ＡＡＩｇＧ４ＫｉＨＳＳ）もまた、組換え法により調製された。このＡＣＣの第１のモノマー構築物は、配列番号３１４のアミノ酸配列およびそのＮ末端にシグナル配列を有するポリペプチドである。このＡＣＣの第１のモノマー構築物は、Ｎ末端からＣ末端へ、シグナル配列、ヒトインターフェロンα２ｂに対応する成熟サイトカインタンパク質（配列番号１）、配列番号６８のアミノ酸配列を有する切断可能部分、およびノブ変異を有するヒトＩｇＧＦｃに対応するダイマー化ドメイン（配列番号３１５）を含む。このＡＣＣの第２のモノマー構築物は、配列番号３２２のアミノ酸配列およびそのＮ末端にシグナル配列を有するポリペプチドである。第２のモノマー構築物は、Ｎ末端からＣ末端へ、シグナル配列、スタブ部分（配列番号３１７）、およびホール変異を有するヒトＩｇＧＦｃに対応するダイマー化ドメイン（配列番号３１６）を含む。

ＰｒｏＣ６５７の活性を、前述のようにＩＦＮ応答性ＨＥＫ２９３細胞を用いてインビトロで試験した。ＰｒｏＣ６５７の活性は、ＳｔｅｍＣｅｌｌＩＦＮα２ｂまたはｕＰＡ活性化ＰｒｏＣ４４０に比べて低下されたが、ＰｒｏＣ４４０に比べて、増大された（図１５）。従って、本開示は、ＡＣＣの活性の低下のレベルを調節可能にするＡＣＣの種々の構造を提供する。

実施例７：ＡＣＣのインビボ抗増殖剤活性：
ＩＦＮα２ｂＡＣＣＰｒｏＣ４４０のインビボでの抗増殖効果を、Ｄａｕｄｉ異種移植腫瘍モデルを用いて試験した。Ｂｅｉｇｅ／マウスに、無血清培地（１：１マトリゲル）中の１０ｘ１０^６Ｄａｕｄｉ細胞を皮下移植した。平均腫瘍体積が約６０～１２０ｍｍ^３に達すると、マウスを、ランダム化し、ＰｒｏＣ４４０を週１回、５週間にわたり投与した。体重および腫瘍測定を、試験期間の間週２回記録した。図１６のデータは、ＩＦＮα２ｂ含有ＡＣＣＰｒｏＣ４４０が、０．１ｍｇ／ｋｇの低い投与量で完全な腫瘍退縮を誘導し、０．０２ｍｇ／ｋｇの投与量で腫瘍増殖の速度を低下させた（上段）こと、およびシラトロン（登録商標）の抗増殖効果が、比較のために示される（下段）ことを示す。

実施例８：ＡＣＣのインビボ耐容活性
ヒトＩＦＮα２ｂは、ハムスターＩＦＮα受容体と交差反応し、かつハムスター中で活性であることが以前に示されている（Ａｌｔｒｏｃｋｅｔａｌ，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎＲｅｓｅａｒｃｈ，１９８６）。ＩＦＮα２ｂ含有ＡＣＣＰｒｏＣ４４０の耐容性を評価するために、ＳｙｒｉａｎＧｏｌｄＨａｍｓｔｅｒに０．４ｍｇ／ｋｇの開始投与量を投与した。動物は、１つの投与量の試験品の投与を受け、非許容毒性（ＤＬＴは、用量制限毒性を意味する）が確認されない限り、投与後７日間まで試験を続けた。開始投与量（０．４ｍｇ／ｋｇ（「ｍｐｋ」））は、ハムスター（１２５ｇｒ）において体重減少、低下した食物摂取量および骨髄抑制を誘導することが予測される、ＩＮＦα－ｃｏｎ（Ｉｎｆｅｒｇｅｎ（登録商標）の名称でＡｍｇｅｎにより製造された、組換えインターフェロンα、非天然起源Ｉ型インターフェロン）の同等量を表す。（（カニクイザル（ｃｙｎｏ）では、ＩＮＦα－ｃｏｎの０．１ｍｇ／ｋｇ／日は、体重減少、低下した食物摂取量および骨髄抑制に関連付けられている（１２５ｇのハムスターの１．２５～２．５ｘ１０^７Ｕに相当））。開始投与量が許容されたら、動物は、２ｍｇ／ｋｇの「中間投与量」まで進められ、非許容でない限り、３回の試験品の投与を受けた。許容されたら、動物は、１０ｍｇ／ｋｇの「高投与量」まで進められ、非許容でない限り、３回の試験品の投与を受けた。許容されたら、動物を１５ｍｇ／ｋｇの「より高い投与量」まで進めた。各段階で、試験投与量が許容されなかった場合、動物を次のより低い投与量に後退させた。開始投与量が許容されなかった場合、動物を０．０８ｍｇ／ｋｇの「より低い投与量」に後退させた。動物に、ＤＤ－ＣＭ－ＣＰダイマーのＮからＣ末端構造を有するＡＣＣ（ＰｒｏＣ２８６）を投与した。陰性対照として、動物にヒトＩｇＧ４を投与した。陰性対照は、予測通り、動物において何の毒性も示さなかった。

ＰｒｏＣ２８６（ＣｈＩｇＧ４５ＡＡ１２０４ＤＮＩｄＬＩＦＮα２ｂ）もまた、組換え法により調製した。第１および第２のモノマー構築物は、同一であり、それぞれは配列番号３２０のアミノ酸配列およびそのＮ末端にシグナル配列を有するポリペプチドである。第１および第２のモノマー構築物のそれぞれは、Ｎ末端からＣ末端へ、シグナル配列、ヒトＩｇＧＦｃに対応するダイマー化ドメイン（配列番号３）、リンカー（配列番号３２１）、配列番号１００のアミノ酸配列を有する切断可能部分、リンカー（配列番号２）、およびヒトインターフェロンα２ｂに対応する成熟サイトカインタンパク質（配列番号１）を含む。

ＰｒｏＣ２９１（ＮｈＩｇＧ４５ＡＡ１２０４ＤＮＩｄＬＩＦＮα２ｂ）もまた、組換え法により調製した。第１および第２のモノマー構築物は、同一である。第１および第２のモノマー構築物のそれぞれは、Ｎ末端からＣ末端へ、ヒトインターフェロンα２ｂに対応する成熟サイトカインタンパク質（配列番号１）、リンカー（配列番号３２１）、ＣＭ（配列番号１００）、リンカー（ＧＧＧＳ）、および完全ヒンジ配列を含むヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域（配列番号４）を含む。

ＰｒｏＣ２８６およびＰｒｏＣ２９１の活性を、Ｄａｕｄｉアポトーシスアッセイにおいてシラトロン（登録商標）（ＰＥＧ－ＩＦＮα２ｂ）の活性と比較した（図１７Ａ、１７Ｂ）。このアッセイでは、ＰｒｏＣ２８６およびシラトロン（登録商標）は、図１７Ａに示すように、類似のレベルの活性を示した。これは、ＰｒｏＣ２８６が、ペグ化ＩＦＮα２ｂと類似の活性を有し、ハムスター試験におけるＩＦＮα２ｂの耐容性を評価するためのシラトロン（登録商標）対照の代用物として使用し得ることを示す。ＰｒｏＣ２９１は、ＰｒｏＣ２８６およびシラトロン（登録商標）に比べて、低減された活性を示し、ＩＦＮＮ末端のＦｃへの構造的配置が活性の低減に重要であることを示す。すなわち、ＤＤが１対のＦｃドメインである場合、サイトカインをＤＤに対しＮ末端に配置すること（ＰｒｏＣ２９１でのように）は、サイトカインがＤＤに対してＣ末端に配置される（ＰｒｏＣ２８６でのように）場合より、サイトカイン活性のより大きな低下をもたらし得る。

動物は、０．４ｍｇ／ｋｇの開始投与量を、１日目に投与された。動物は、非許容毒性（ＤＬＴ）に達しない限り、１週間にわたり試験を継続された。臨床観察、体重および温度測定を、各動物について、投与前、投与後６時間、２４時間、７２時間、および７日目に実施した。血液学および化学分析用の血液試料を、各動物について投与の７２時間、７日後に収集した。血液学および化学分析を、サンプリングの直後に実施した。血液学分析のために、血液塗抹標本、血球数の差異、ヘマトクリット値、ヘモグロビン、平均赤血球血色素量、平均血球体積、血小板数、赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）数、赤血球分布幅、網状赤血球数および白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）数を、評価した。臨床化学パネルは、アラニンアミノトランスフェラーゼ、アルブミン、アルブミン／グロブリン比率、アルカリホスファターゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、カルシウム、塩化物、コレステロール、クレアチンキナーゼ、クレアチン、γ－グルタミルトランスフェラーゼ、グロブリン、グルコース、無機リン、カリウム、ナトリウム、総ビリルビン量、総タンパク質、トリグリセリド、尿素、窒素、およびＣ反応性タンパク質の測定を含んだ。耐容性試験における毒性の証拠を、図２２～２４にまとめる。

全体として、マスクされていないＰｒｏＣ２８６構築物を投与された動物は、２ｍｐｋで投与された場合平均５％の体重減少を示し、１０ｍｐｋおよび１５ｍｐｋで投与された場合、１５％の体重減少を示した（図２２）。１５ｍｐｋでＰｒｏＣ２８６を投与された１匹の動物は、投与の７日後に（試験の終わりに）２０％の体重減少を示した。これは、非許容投与量と考えられる。対照的に、２ｍｐｋおよび１０ｍｐｋでＰｒｏＣ４４０を投与された動物は、体重減少を示さなかった。

１５ｍｐｋでＰｒｏＣ４４０を投与された動物は、平均５％の体重減少を示した（図２２）。これは、Ｎ末端で始まる二量体化構造、ＣＰ－ＣＭ－ＤＤを有する本開示のＡＣＣが意外にも、ＩＦＮα２ｂ媒介体重減少を抑制することを示す。理論に束縛されることを意図するものではないが、インターフェロンをＤＤのＮ末端に配置することおよび比較的短いＬＲを使用することは、ＰｒｏＣ４４０の場合サイトカイン活性を抑制し、ペグ化ＩＦＮα２ｂ（シラトロン（登録商標））またはＰｒｏＣ２８６に比べて、インターフェロンの毒性を低減すると考えられる。

臨床化学の観点から、ＰｒｏＣ２８６を投与された動物は、投与の７日後（試験の終わり）に、全ての投与量（０．４ｍｐｋ、２ｍｐｋ、１０ｍｐｋおよび１５ｍｐｋ）でアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の有意な上昇を示した（図２３）。有意なＡＬＰの増大は、動物が１０ｍｐｋまたは１５ｍｐｋのＰｒｏＣ４４０を投与された場合測定されなかった（図２３）。ＡＬＴの上昇は、肝臓毒性のマーカーである。ＩＦＮα２ｂは、肝臓毒性を誘導することが示されている。これは、Ｎ末端で始まる二量体化構造、ＣＰ－ＣＭ－ＤＤを有する本開示のＡＣＣが意外にも、ＩＦＮα２ｂ媒介肝臓毒性を抑制することを示す。

血液学の観点から、投与の３日後、および７日後（試験の終わり）に、２ｍｐｋ、１０ｍｐｋおよび１５ｍｐｋでＰｒｏＣ２８６を投与された動物は、網状赤血球数、好中球数および白血球（ＷＢＣ）数のレベルの有意な低下を示した（図２４）。これらの低下は、ＩＦＮα２ｂ媒介骨髄毒性を想起させる。投与の３日後に、ＰｒｏＣ４４０を投与された動物は、網状赤血球数、好中球数および白血球（ＷＢＣ）数のレベルの低下を示した（図２４）。全体として、ＰｒｏＣ４４０を投与された動物で観察された造血細胞の低下レベルは、ＰｒｏＣ２８６を投与された動物で観察された低下レベルほど顕著ではない。投与の７日後（試験の終わり）に、ＰｒｏＣ４４０を投与された動物では、網状赤血球数、好中球数および白血球（ＷＢＣ）数の全体レベルは、正常レベルに戻るか、または陰性対照ＩｇＧ４を投与された動物で観察されるものと類似のレベルに戻る（図２４）。ＰｒｏＣ２８６を投与された動物では、網状赤血球数、好中球数および白血球（ＷＢＣ）数は、低いままである。これは、Ｎ末端で始まる二量体化構造、ＣＰ－ＣＭ－ＤＤを有する本開示のＡＣＣが意外にも、ＩＦＮα２ｂ媒介骨髄毒性を抑制することを示す。

実施例４．追加のサイトカイン構築物のインビトロキャラクタリゼーション
追加の活性化可能サイトカイン構築物もまた、組換え法により調製した。これらのＡＣＣの第１および第２のモノマー構築物は、同一であった。第１および第２のモノマー構築物のそれぞれは、Ｎ末端からＣ末端へ、マウスＩｇＧカッパシグナル配列由来のシグナル配列（配列番号３０９の残基１～２０）、ヒトインターフェロンα２ｂに対応する成熟サイトカインタンパク質（配列番号１）、配列番号１００のアミノ酸配列を有する切断可能部分（ＣＭ）、およびヒトＩｇＧ４Ｓ２２８ＰＦｃに対応するダイマー化ドメイン（配列番号３を含む）を含む。加えて、これらのＡＣＣは、ＣＰとＣＭの間に、アミノ酸配列ＳＧＧＧＧを有するリンカーを含む、または含まない。これらのＡＣＣは、ＣＭとＤＤの間に、アミノ酸配列ＧＧＧＳを有するリンカーを含む、または含まない。これらのＡＣＣはまた、Ｎ末端からシステイン２２６のＤＤのヒンジの一部を含む、または含まない。これらの追加の活性化可能サイトカイン構築物は、表６に記載される（配列番号３３６～３４２および配列番号３１３を参照）。

フレキシブルリンカーを有さずＣｙｓ２２６に切り詰めたＦｃ領域を有するＡＣＣである、ＰｒｏＣ４４０の活性、および種々のリンカーおよびＦｃ領域配列を含む追加のＡＣＣの活性を、前述のようにＩＦＮ応答性ＨＥＫ２９３細胞およびＤａｕｄｉ細胞を用いてインビトロで試験した。両アッセイで、ＰｒｏＣ４４０の活性（例えば、抗増殖効果）は、サイトカインと、対応する第２のモノマーにＤＤを結合する第１のアミノ酸（すなわち、Ｃｙｓ２２６）との間に種々の追加の配列を含む全ての他のＡＣＣに比べて、低減された。ＡＣＣのＥＣ５０値を、ＩＦＮα／β分析結果から計算し、下表７に示す。

ＡＣＣのＥＣ５０値を、Ｄａｕｄｉアポトーシスアッセイ結果から計算し、下表８に示す。

表７および表８のデータはまた、（非切断）ＡＣＣの活性が、サイトカインとＤＤのＣｙｓ２２６との間のアミノ酸配列の長さを変えることにより調節され得たことも示した。

理論に束縛されることを意図するものではないが、本明細書で示される結果に基づき、発明者らは、サイトカインをＤＤのＮ末端に配置することおよび比較的短いＬＲを使用することが、前述の特定の実施例で例示されるインターフェロンαサイトカインに加えて、種々のサイトカインについてサイトカイン活性を抑制すると予測する。上述のように、本明細書で記載の本発明は、本明細書で考察した種々のサイトカインタンパク質を含む活性化可能サイトカイン構築物を包含する。非限定的例として、本発明のＡＣＣで使用されるＣＰは、配列番号１０１～２０９で列挙されたいずれかのもの、およびそれらのバリアントであり得る。特に、モノマーサイトカインは、本明細書で記載のＡＣＣでの使用に向いている。本明細書で提供される結果に基づき、本発明のＡＣＣは、対応する野生型サイトカインに比べて、低減されたサイトカイン活性を示し、および関連プロテアーゼによるＡＣＣの切断時に、切断産物は、対応する野生型サイトカインに類似のサイトカイン活性を回復すると考えられる。

他の実施形態
本発明をその詳細な説明と共に記載してきたが、前出の説明は、添付の特許請求の範囲によって定められる本発明の範囲を例示することを意図しており、限定することを意図するものではないことは理解されよう。他の態様、利点、および修正は、下記の特許請求項の範囲内に入る。

Claims

第１のモノマー構築物および第２のモノマー構築物を含む活性化可能サイトカイン構築物（ＡＣＣ）であって、
（ａ）前記第１のモノマー構築物は、第１の成熟サイトカインタンパク質（ＣＰ１）、第１の切断可能部分（ＣＭ１）、および第１のダイマー化ドメイン（ＤＤ１）を含み、
前記ＣＭ１は、前記ＣＰ１と前記ＤＤ１の間に配置され；および
（ｂ）前記第２のモノマー構築物は、第２の成熟サイトカインタンパク質（ＣＰ２）、第２の切断可能部分（ＣＭ２）、および第２のダイマー化ドメイン（ＤＤ２）を含み、
前記ＣＭ２は、前記ＣＰ２と前記ＤＤ２の間に配置され；または
（ａ）前記第１のモノマー構築物は、第１の成熟サイトカインタンパク質（ＣＰ１）、第１のダイマー化ドメイン（ＤＤ１）を含み、および
（ｂ）前記第２のモノマー構築物は、第２の成熟サイトカインタンパク質（ＣＰ２）、切断可能部分（ＣＭ）、および第２のダイマー化ドメイン（ＤＤ２）を含み、前記ＣＭは、前記ＣＰ２と前記ＤＤ２の間に配置され、前記ＣＭは、プロテアーゼの基質として機能し、または
（ａ）前記第１のモノマー構築物は、第１の成熟サイトカインタンパク質（ＣＰ１）、切断可能部分（ＣＭ）、および第１のダイマー化ドメイン（ＤＤ１）を含み、前記ＣＭは、前記ＣＰ１と前記ＤＤ１の間に配置され、および
（ｂ）前記第２のモノマー構築物は、第２の成熟サイトカインタンパク質（ＣＰ２）、および第２のダイマー化ドメイン（ＤＤ２）を含み、
前記ＣＭは、プロテアーゼの基質として機能し、または
（ａ）前記第１のモノマー構築物は、第１の成熟サイトカインタンパク質（ＣＰ１）、および第１のダイマー化ドメイン（ＤＤ１）を含み、および
（ｂ）前記第２のモノマー構築物は、第２の成熟サイトカインタンパク質（ＣＰ２）、および第２のダイマー化ドメイン（ＤＤ２）を含み、前記ＣＰ１、前記ＣＰ２、またはＣＰ１およびＣＰ２の両方は、プロテアーゼの基質として機能するアミノ酸配列を含み、
さらに（ｃ）前記ＤＤ１および前記ＤＤ２は、相互に結合しそれにより前記第１のモノマー構築物および前記第２のモノマー構築物のダイマーを形成し、および
さらに（ｄ）前記少なくとも１つのＣＰ１および／またはＣＰ２活性の対照レベルに比べて少なくとも１つのＣＰ１および／またはＣＰ２活性の低減されたレベルを有することを特徴とする、
活性化可能サイトカイン構築物（ＡＣＣ）。
前記第１のモノマー構築物が、前記ＣＰ１、前記ＣＭ１、および前記ＤＤ１を含む第１のポリペプチドを含む、請求項１に記載のＡＣＣ。
前記第２のモノマー構築物が、前記ＣＰ２、前記ＣＭ２、および前記ＤＤ２を含む第２のポリペプチドを含む、請求項１または２のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載のＡＣＣ。
前記ＤＤ１および前記ＤＤ２が、１対のＦｃドメイン；ヒトＩＬ－１５受容体のアルファ鎖（ＩＬ１５Ｒα）由来のスシドメインと可溶性ＩＬ－１５；バルナーゼとバルンスター；ＰＫＡとＡＫＡＰ；変異ＲＮアーゼＩフラグメントをベースにしたアダプター／ドッキングタグモジュール；エピトープとｓｄＡｂ；エピトープとｓｃＦｖ；およびタンパク質シンタキシン、シナプトタグミン、シナプトブレビン、およびＳＮＡＰ２５の相互作用に基づくＳＮＡＲＥモジュール、抗原結合ドメインとエピトープからなる群より選択される対である、請求項１～３のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載のＡＣＣ。
前記ＤＤ１および前記ＤＤ２が、１対のＦｃドメインである、請求項４に記載のＡＣＣ。
前記Ｆｃドメイン対が、１対のヒトＦｃドメインである、請求項５に記載のＡＣＣ。
前記ヒトＦｃドメインが、ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメイン、ヒトＩｇＧ２Ｆｃドメイン、ヒトＩｇＧ３Ｆｃドメイン、またはヒトＩｇＧ４Ｆｃドメインである、請求項６に記載のＡＣＣ。
前記ヒトＦｃドメインが、ヒトＩｇＧ４Ｆｃドメインである、請求項７に記載のＡＣＣ。
前記ヒトＦｃドメインが、配列番号３、配列番号３１５、または配列番号３１６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む、請求項８に記載のＡＣＣ。
前記ヒトＦｃドメインが、配列番号３、配列番号３１５、または配列番号３１６と少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項９に記載のＡＣＣ。
前記ヒトＦｃドメインが、配列番号３、配列番号３１５、または配列番号３１６を含む、請求項１０に記載のＡＣＣ。
前記ＤＤ１および前記ＤＤ２が、同じである、請求項１～３および５～１１のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載のＡＣＣ。
ＤＤ１が、抗原結合ドメインを含みかつＤＤ２が、対応するエピトープを含む、請求項４に記載のＡＣＣ。
前記抗原結合ドメインが、抗Ｈｉｓタグ抗原結合ドメインでありかつ前記ＤＤ２が、Ｈｉｓタグを含む、請求項１３に記載のＡＣＣ。
前記抗原結合ドメインが、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である、請求項１３に記載のＡＣＣ。
前記抗原結合ドメインが、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）である、請求項１３に記載のＡＣＣ。
ＤＤ１およびＤＤ２の少なくとも１つが、非ポリペプチドポリマーおよび小分子からなる群より選択されるダイマー化ドメイン置換基を含む、請求項１に記載のＡＣＣ。
ＤＤ１およびＤＤ２が、相互に共有結合した非ポリペプチドポリマーを含む、請求項１７に記載のＡＣＣ。
前記非ポリペプチドポリマーが、硫黄含有ポリエチレングリコールであり、かつＤＤ１およびＤＤ２が、１つまたは複数のジスルフィド結合を介して相互に共有結合される、請求項１８に記載のＡＣＣ。
ＤＤ１およびＤＤ２の少なくとも１つが、小分子を含む、請求項１７に記載のＡＣＣ。
前記小分子が、ビオチンである、請求項２０に記載のＡＣＣ。
ＤＤ１が、ビオチンを含みかつＤＤ２が、アビジンを含む、請求項２０に記載のＡＣＣ。
前記ＣＰ１および／または前記ＣＰ２が、インターフェロン、インターロイキン、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＣＤ１５４、ＬＴ－β、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β、４－１ＢＢＬ、ＡＰＲＩＬ、ＣＤ７０、ＣＤ１５３、ＣＤ１７８、ＧＩＴＲＬ、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＡＬＬ－１、ＴＲＡＩＬ、ＴＷＥＡＫ、ＴＲＡＮＣＥ、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β３、Ｅｐｏ、Ｔｐｏ、Ｆｌｔ－３Ｌ、ＳＣＦ、Ｍ－ＣＳＦ、およびＭＳＰからなる群よりそれぞれ個別に選択される、請求項１～２２のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載のＡＣＣ。
前記ＣＰ１および前記ＣＰ２が、同じである、請求項１～２３のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載のＡＣＣ。
前記ＣＰ１および前記ＣＰ２が、異なる、請求項１～２３のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載のＡＣＣ。
前記ＣＰ１および／または前記ＣＰ２が、インターフェロンである、請求項１～２３のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載のＡＣＣ。
前記ＣＰ１および前記ＣＰ２が、インターフェロンである、請求項２６に記載のＡＣＣ。
前記ＣＰ１および前記ＣＰ２が、異なるインターフェロンである、請求項２６に記載のＡＣＣ。
前記ＣＰ１および前記ＣＰ２が、同じインターフェロンである、請求項２６に記載のＡＣＣ。
前記ＣＰ１または前記ＣＰ２が、インターフェロンである、請求項２６に記載のＡＣＣ。
前記インターフェロンが、ヒト野生型成熟インターフェロンである、請求項２６～３０のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載のＡＣＣ。
前記インターフェロンが、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンω、およびインターフェロンτからなる群より選択される、請求項２６～３１のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載のＡＣＣ。
前記インターフェロンが、インターフェロンαである、請求項３２に記載のＡＣＣ。
前記インターフェロンが、インターフェロンα２ａ、インターフェロンα２ｂ、およびインターフェロンα－ｎ３からなる群より選択される、請求項３３に記載のＡＣＣ。
前記インターフェロンが、インターフェロンα２ｂである、請求項３４に記載のＡＣＣ。
前記ＣＰ１および／またはＣＰ２が、配列番号１と少なくとも８０％同一である配列を含む、請求項３５に記載のＡＣＣ。
前記ＣＰ１および／またはＣＰ２が、配列番号１と少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項３６に記載のＡＣＣ。
前記ＣＰ１および／またはＣＰ２が、配列番号１の配列を含む、請求項３７に記載のＡＣＣ。
前記インターフェロンが、インターフェロンβである、請求項３２に記載のＡＣＣ。
前記インターフェロンβが、インターフェロンβ－１ａ、およびインターフェロンβ－１ｂからなる群より選択される、請求項３９に記載のＡＣＣ。
前記ＣＰ１および／または前記ＣＰ２が、ＩＦａｂドメインを含む、請求項１～４０のいずれか１項に記載のＡＣＣ。
前記ＣＰ１および／または前記ＣＰ２が、インターロイキンを含む、請求項４１に記載のＡＣＣ。
前記インターロイキンが、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－１ＲＡ、ＩＬ－１８、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－３、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１０、ＩＬ－２０、ＩＬ－１４、ＩＬ－１６、およびＩＬ－１７からなる群より選択される、請求項４２に記載のＡＣＣ。
前記ＣＭ１および／または前記ＣＭ２が、合計約３アミノ酸～約１５アミノ酸を含む、請求項１～４３のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載のＡＣＣ。
前記ＣＭ１および前記ＣＭ２が、異なるプロテアーゼの基質を含む、請求項１～４４のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載のＡＣＣ。
前記ＣＭ１および前記ＣＭ２が、同じプロテアーゼの基質を含む、請求項１～４４のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載のＡＣＣ。
前記プロテアーゼが、ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭ１５、ＡＤＡＭ１７／ＴＡＣＥ、ＡＤＡＭＤＥＣ１、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＤＡＭＴＳ５、ＢＡＣＥ、レニン、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、カスパーゼ１４、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＫ、カテプシンＬ、カテプシンＳ、カテプシンＶ／Ｌ２、カテプシンＸ／Ｚ／Ｐ、クルジパイン、レグマイン、オツバイン－２、ＫＬＫ４、ＫＬＫ５、ＫＬＫ６、ＫＬＫ７、ＫＬＫ８、ＫＬＫ１０、ＫＬＫ１１、ＫＬＫ１３、ＫＬＫ１４、メプリン、ネプリライシン、ＰＳＭＡ、ＢＭＰ－１、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－３、ＭＭＰ－７、ＭＭＰ－９、ＭＭＰ－１０、ＭＭＰ－１１、ＭＭＰ－１２、ＭＭＰ－１３、ＭＭＰ－１４、ＭＭＰ－１５、ＭＭＰ－１６、ＭＭＰ－１７、ＭＭＰ－１９、ＭＭＰ－２０、ＭＭＰ－２３、ＭＭＰ－２４、ＭＭＰ－２６、ＭＭＰ－２７、活性化タンパク質Ｃ、カテプシンＡ、カテプシンＧ、キマーゼ、ＦＶＩＩａ、ＦＩＸａ、ＦＸａ、ＦＸＩａ、ＦＸＩＩａ、エラスターゼ、グランザイムＢ、グアニジノベンゾアターゼ、ＨｔｒＡ１、ヒト好中球リアーゼ、ラクトフェリン、マラプシン、ＮＳ３／４Ａ、ＰＡＣＥ４、プラスミン、ＰＳＡ、ｔＰＡ、トロンビン、トリプターゼ、ｕＰＡ、ＤＥＳＣ１、ＤＰＰ－４、ＦＡＰ、ヘプシン、マトリプターゼ－２、ＭＴ－ＳＰ１／マトリプターゼ、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＭＰＲＳＳ３、およびＴＭＰＲＳＳ４、からなる群より選択される、請求項１～４６のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載のＡＣＣ。
前記プロテアーゼが、ｕＰＡ、レグマイン、ＭＴ－ＳＰ１、ＡＤＡＭ１７、ＢＭＰ－１、ＴＭＰＲＳＳ３、ＴＭＰＲＳＳ４、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－９、ＭＭＰ－１２、ＭＭＰ－１３、およびＭＭＰ－１４からなる群より選択される、請求項４７に記載のＡＣＣ。
前記ＣＭ１および／または前記ＣＭ２が、ＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号５）、ＴＧＲＧＰＳＷＶ（配列番号６）、ＰＬＴＧＲＳＧＧ（配列番号７）、ＴＡＲＧＰＳＦＫ（配列番号８）、ＮＴＬＳＧＲＳＥＮＨＳＧ（配列番号９）、ＮＴＬＳＧＲＳＧＮＨＧＳ（配列番号１０）、ＴＳＴＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号１１）、ＴＳＧＲＳＡＮＰ（配列番号１２）、ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ（配列番号１３）、ＡＶＧＬＬＡＰＰ（配列番号１４）、ＡＱＮＬＬＧＭＶ（配列番号１５）、ＱＮＱＡＬＲＭＡ（配列番号１６）、ＬＡＡＰＬＧＬＬ（配列番号１７）、ＳＴＦＰＦＧＭＦ（配列番号１８）、ＩＳＳＧＬＬＳＳ（配列番号１９）、ＰＡＧＬＷＬＤＰ（配列番号２０）、ＶＡＧＲＳＭＲＰ（配列番号２１）、ＶＶＰＥＧＲＲＳ（配列番号２２）、ＩＬＰＲＳＰＡＦ（配列番号２３）、ＭＶＬＧＲＳＬＬ（配列番号２４）、ＱＧＲＡＩＴＦＩ（配列番号２５）、ＳＰＲＳＩＭＬＡ（配列番号２６）、ＳＭＬＲＳＭＰＬ（配列番号２７）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号２８）、ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号２９）、ＩＳＳＧＬＬＳＳＧＧＳＧＧＳＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号３０）、ＬＳＧＲＳＧＮＨ（配列番号３１）、ＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号３２）、ＬＳＧＲＳＤＤＨ（配列番号３３）、ＬＳＧＲＳＤＩＨ（配列番号３４）、ＬＳＧＲＳＤＱＨ（配列番号３５）、ＬＳＧＲＳＤＴＨ（配列番号３６）、ＬＳＧＲＳＤＹＨ（配列番号３７）、ＬＳＧＲＳＤＮＰ（配列番号３８）、ＬＳＧＲＳＡＮＰ（配列番号３９）、ＬＳＧＲＳＡＮＩ（配列番号４０）、ＬＳＧＲＳＤＮＩ（配列番号４１）、ＭＩＡＰＶＡＹＲ（配列番号４２）、ＲＰＳＰＭＷＡＹ（配列番号４３）、ＷＡＴＰＲＰＭＲ（配列番号４４）、ＦＲＬＬＤＷＱＷ（配列番号４５）、ＩＳＳＧＬ（配列番号４６）、ＩＳＳＧＬＬＳ（配列番号４７）、ＩＳＳＧＬＬ（配列番号４８）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号４９）、ＡＶＧＬＬＡＰＰＴＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号５０）、ＡＶＧＬＬＡＰＰＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号５１）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＤＨ（配列番号５２）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＩＨ（配列番号５３）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＱＨ（配列番号５４）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＴＨ（配列番号５５）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＹＨ（配列番号５６）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＮＰ（配列番号５７）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＡＮＰ（配列番号５８）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＡＮＩ（配列番号５９）、ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＤＨ（配列番号６０）、ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＩＨ（配列番号６１）、ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＱＨ（配列番号６２）、ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＴＨ（配列番号６３）、ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＹＨ（配列番号６４）、ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＮＰ（配列番号６５）、ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＡＮＰ（配列番号６６）、ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＡＮＩ（配列番号６７）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＮＩ（配列番号６８）、ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＮＩ（配列番号６９）、ＧＬＳＧＲＳＤＮＨＧＧＡＶＧＬＬＡＰＰ（配列番号７０）、ＧＬＳＧＲＳＤＮＨＧＧＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ（配列番号７１）、ＬＳＧＲＳＤＮＨＧＧＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ（配列番号７２）、ＩＳＳＧＬＳＳ（配列番号７３）、ＰＶＧＹＴＳＳＬ（配列番号７４）、ＤＷＬＹＷＰＧＩ（配列番号７５）、ＬＫＡＡＰＲＷＡ（配列番号７６）、ＧＰＳＨＬＶＬＴ（配列番号７７）、ＬＰＧＧＬＳＰＷ（配列番号７８）、ＭＧＬＦＳＥＡＧ（配列番号７９）、ＳＰＬＰＬＲＶＰ（配列番号８０）、ＲＭＨＬＲＳＬＧ（配列番号８１）、ＬＬＡＰＳＨＲＡ（配列番号８２）、ＧＰＲＳＦＧＬ（配列番号８３）、ＧＰＲＳＦＧ（配列番号８４）、ＳＡＲＧＰＳＲＷ（配列番号８５）、ＧＧＷＨＴＧＲＮ（配列番号８６）、ＨＴＧＲＳＧＡＬ（配列番号８７）、ＡＡＲＧＰＡＩＨ（配列番号８８）、ＲＧＰＡＦＮＰＭ（配列番号８９）、ＳＳＲＧＰＡＹＬ（配列番号９０）、ＲＧＰＡＴＰＩＭ（配列番号９１）、ＲＧＰＡ（配列番号９２）、ＧＧＱＰＳＧＭＷＧＷ（配列番号９３）、ＦＰＲＰＬＧＩＴＧＬ（配列番号９４）、ＳＰＬＴＧＲＳＧ（配列番号９５）、ＳＡＧＦＳＬＰＡ（配列番号９６）、ＬＡＰＬＧＬＱＲＲ（配列番号９７）、ＳＧＧＰＬＧＶＲ（配列番号９８）、ＰＬＧＬ（配列番号９９）、およびＳＧＲＳＤＮＩ（配列番号１００）、からなる群より選択される配列を含む、請求項４７に記載のＡＣＣ。
前記ＣＭ１および／またはＣＭ２が、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号２８）、ＬＳＧＲＳＤＤＨ（配列番号３３）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＱＨ（配列番号５４）、ＳＧＲＳＤＮＩ（配列番号１００）、およびＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＮＩ（配列番号６８）からなる群より選択される配列を含む、請求項４７に記載のＡＣＣ。
前記ＣＭ１および／または前記ＣＭ２が、配列番号５～１００および２６３～３０８から選択される配列を含む、請求項１～５０のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載のＡＣＣ。
前記プロテアーゼが、対象中の腫瘍により産生される、請求項１～５１のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載のＡＣＣ。
前記対象が、癌を有すると診断または特定されている、請求項５２に記載のＡＣＣ。
前記ＣＰ１および前記ＣＭ１が、前記第１のモノマー構築物中で相互に直接に隣接する、請求項１～５３のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載のＡＣＣ。
前記ＣＭ１および前記ＤＤ１が、前記第１のモノマー構築物中で相互に直接に隣接する、請求項１～５４のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載のＡＣＣ。
前記ＣＰ２および前記ＣＭ２が、前記第２のモノマー構築物中で相互に直接に隣接する、請求項１～５５のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載のＡＣＣ。
前記ＣＭ２および前記ＤＤ２が、前記第２のモノマー構築物中で相互に直接に隣接する、請求項１～５６のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載のＡＣＣ。
前記第１のモノマー構築物が、少なくとも１つのリンカーを含む、請求項１～５７のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載のＡＣＣ。
前記少なくとも１つのリンカーが、前記ＣＰ１と前記ＣＭ１の間に配置されるリンカーＬ１および／または前記ＣＭ１と前記ＤＤ１の間に配置されるリンカーＬ２である、請求項５８に記載のＡＣＣ。
前記第２のモノマー構築物が、少なくとも１つのリンカーを含む、請求項５９に記載のＡＣＣ。
前記少なくとも１つのリンカーが、前記ＣＰ２と前記ＣＭ２の間に配置されるリンカーＬ３および／または前記ＣＭ２と前記ＤＤ２の間に配置されるリンカーＬ４である、請求項６０に記載のＡＣＣ。
前記第１のモノマー構築物が、リンカーＬ１を含みかつ前記第２のモノマー構築物が、リンカーＬ３を含む、請求項６１に記載のＡＣＣ。
Ｌ１およびＬ３が、同じである、請求項６２に記載のＡＣＣ。
前記第２のモノマー構築物が、リンカーＬ２を含みかつ前記第２のモノマー構築物が、リンカーＬ４を含む、請求項６３に記載のＡＣＣ。
Ｌ２およびＬ４が、同じである、請求項６４に記載のＡＣＣ。
各リンカーが、１アミノ酸～約１５アミノ酸の全長を有する、請求項６５に記載のＡＣＣ。
各リンカーが、少なくとも５アミノ酸の全長を有する、請求項６６に記載のＡＣＣ。
前記第１のモノマー構築物が、少なくとも１つのリンカーを含み、各リンカーが、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧ（配列番号２１０）；ＧＧＧＳ（配列番号２）；ＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号２１１）；ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号２１２）；ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２１３）；ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２１４）；ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２１５）；ＧＧＧＧＳ（配列番号２１６）；ＧＳ；ＧＧＧＧＳＧＳ（配列番号２１７）；ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＳ（配列番号２１８）；ＧＧＳＬＤＰＫＧＧＧＧＳ（配列番号２１９）；ＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧ（配列番号２２０）；ＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧ（配列番号２２１）；ＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳ（配列番号２２２）；ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＫＧ（配列番号２２３）；ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＳＧＳＴＫＧ（配列番号２２４）；ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号２２５）；ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＳＥＧＳＴ（配列番号２２６）；（ＧＳ）ｎ、（ＧＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号２２７）、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２２８）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２１６）、式中、ｎは少なくとも１の整数である；ＧＧＳＧ（配列番号２２９）；ＧＧＳＧＧ（配列番号２３０）；ＧＳＧＳＧ（配列番号２３１；ＧＳＧＧＧ（配列番号２３２）；ＧＧＧＳＧ（配列番号２３３）；ＧＳＳＳＧ（配列番号２３４）；ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２１３）；ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２１４）；およびＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＳＥＧＳＴ（配列番号２２６）からなる群からから独立に選択される、請求項１～６７のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載のＡＣＣ。
前記リンカーが、ＧＧＧＳ（配列番号２）の配列を含む、請求項６８に記載のＡＣＣ。
前記第１のモノマー構築物が、前記ＣＰ１、前記ＣＭ１、および、前記ＣＭ１のＣ末端に直接または間接的に連結される、前記ＤＤ１を、ＮからＣ末端方向で含む、請求項１～６９のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載のＡＣＣ。
前記第１のポリペプチドが、前記ＣＰ１、前記ＣＭ１、および、前記ＣＭ１のＮ末端に直接または間接的に連結される、前記ＤＤ１を、ＣからＮ末端方向で含む、請求項１～７０のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載のＡＣＣ。
前記第２のポリペプチドが、前記ＣＰ２、前記ＣＭ２、および、前記ＣＭ２のＣ末端に直接または間接的に連結される、前記ＤＤ２を、ＮからＣ末端方向で含む、請求項１～７１のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載のＡＣＣ。
前記第２のポリペプチドが、前記ＣＰ２、前記ＣＭ２、および、前記ＣＭ２に直接または間接的に連結される、前記ＤＤ２を、ＣからＮ末端方向で含む、請求項１～７２のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載のＡＣＣ。
前記第１のモノマー構築物が、ＮからＣ末端方向に、前記ＣＰ１、前記ＣＭ１、および前記ＤＤ１を含み、前記ＣＰ１および前記ＣＭ１が、相互に直接に隣接し、前記ＣＭ１および前記ＤＤ１が、相互に直接に隣接し、前記ＣＭ１が、１０アミノ酸以下のペプチドであり、前記第２モノマー構築物が、前記第１のモノマー構築物と同じであり、かつ前記第１および第２のモノマー構築物が、少なくとも２つのジスルフィド結合を介して相互に共有結合される、請求項７０に記載のＡＣＣ。
ＣＰ１が、インターフェロンである、請求項７４に記載のＡＣＣ。
ＣＰ１が、インターフェロンαである、請求項７５に記載のＡＣＣ。
前記少なくとも１つのＣＰ１および／またはＣＰ２活性が、表面プラズモン共鳴法を用いて測定されるその同族受容体に対する前記ＣＰ１および／または前記ＣＰ２の結合親和性（Ｋ_Ｄ）である、請求項１～７６のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載のＡＣＣ。
前記少なくとも１つのＣＰ１および／またはＣＰ２活性が、リンパ腫細胞の増殖のレベルである、請求項１～７６のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載のＡＣＣ。
前記少なくとも１つのＣＰ１および／またはＣＰ２活性が、リンパ腫細胞中のＪＡＫ／ＳＴＡＴ／ＩＳＧＦ３経路活性化のレベルである、請求項１～６のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載のＡＣＣ。
前記少なくとも１つの活性が、リンパ腫細胞中のＳＥＡＰ産生のレベルである、請求項１～７６のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載のＡＣＣ。
前記対照レベルに比べて少なくとも１つのＣＰ１および／またはＣＰ２活性における少なくとも２０倍の低減を特徴とする、請求項１～８０のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載のＡＣＣ。
前記対照レベルに比べて少なくとも１つのＣＰ１および／またはＣＰ２活性における少なくとも５０倍の低減を特徴とする、請求項８１に記載のＡＣＣ。
前記対照レベルに比べて少なくとも１つのＣＰ１および／またはＣＰ２活性における少なくとも１００倍の低減を特徴とする、請求項８２に記載のＡＣＣ。
前記対照レベルに比べて少なくとも１つのＣＰ１および／またはＣＰ２活性における少なくとも５００倍の低減を特徴とする、請求項８３に記載のＡＣＣ。
前記ＣＰ１および／またはＣＰ２の少なくとも１つの活性の対照レベルが、プロテアーゼへの前記ＡＣＣの曝露後の前記ＡＣＣ中の前記ＣＰ１および／またはＣＰ２の活性である、請求項１～８４のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載のＡＣＣ。
前記少なくとも１つのＣＰ１および／またはＣＰ２の前記対照レベルが、対応する野生型成熟サイトカインの前記対応するＣＰ１および／またはＣＰ２活性である、請求項１～８４のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載のＡＣＣ。
前記プロテアーゼへの曝露後に切断産物を生成することを特徴とし、前記切断産物が、前記ＣＰ１および／またはＣＰ２の少なくとも１つの活性を含む、請求項１～８６のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載のＡＣＣ。
前記ＣＰ１および／またはＣＰ２の少なくとも１つの活性が、抗増殖活性である、請求項８７に記載のＡＣＣ。
前記対照レベルが、ＥＣ５０値であり、かつＥＣ５０（対照レベル）に対するＥＣ５０（切断産物）の比率が、約１０未満、または約９未満、または約８未満、または約７未満、または約６未満、または約５未満、または約４未満、または約３未満、または約２未満、または約１．５未満である、請求項８８に記載のＡＣＣ。
請求項１～８９のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載のＡＣＣを含む組成物。
医薬組成物である、請求項９０に記載の組成物。
少なくとも１投与量の請求項９０または９１に記載の組成物を含む容器、バイアル、シリンジ、注入ペン、またはキット。
請求項１～８９のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載のＡＣＣまたは請求項９０または９１に記載の組成物の治療有効量を対象に投与することを含むそれを必要としている前記対象を治療する方法。
前記対象が、癌を有すると特定されているまたは診断されている、請求項９３に記載の方法。
前記癌が、リンパ腫、固形腫瘍、血液学的腫瘍、肉腫、骨肉腫、神経膠芽腫、神経芽腫、メラノーマ、横紋筋肉腫、ユーイング肉腫、骨肉腫、Ｂ細胞新生物、多発性骨髄腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、網膜芽細胞腫、膀胱癌、胃癌、尿路上皮癌、肺癌、結腸癌、腎細胞癌、胃および食道癌、膵臓癌、前立腺癌、乳癌、結腸直腸癌、卵巣癌、非小細胞肺癌、扁平上皮頭頸部癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、肝臓癌、または肝細胞癌である、請求項９４に記載の方法。
前記リンパ腫が、バーキットリンパ腫である、請求項９５に記載の方法。
請求項１～８９のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載のＡＣＣのＣＰ１およびＣＭ１を含むポリペプチドをコードする核酸。
前記ポリペプチドが、請求項１～１６または請求項２３～８８のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載のＤＤ１をさらに含む、請求項９７に記載の核酸。
請求項１～８９のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載のＡＣＣのＣＰ２およびＣＭ２を含むポリペプチドをコードする核酸。
前記ポリペプチドが、請求項１～１６または請求項２３～８８のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載のＤＤ２をさらに含む、請求項９９に記載の核酸。
請求項９７～１００のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載の核酸を含むベクター。
発現ベクターである、請求項１０１に記載のベクター。
請求項９６～９９のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載の核酸または請求項１０１または１０２に記載のベクターを含む細胞。
請求項１～８９のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載の第１のモノマー構築物のＣＰ１およびＣＭ１を含むポリペプチドおよび第２のモノマー構築物のＣＰ２およびＣＭ２を含むポリペプチドを一緒にコードする１対の核酸。
請求項１０４に記載の核酸対を一緒に含む１対のベクター。
１対の発現ベクターである、請求項１０５に記載のベクター対。
請求項１０２に記載の核酸対または請求項１０５または１０６に記載のベクター対を含む細胞。
ＡＣＣを製造するのに十分な条件下にて液体培地中で請求項１０３または１０７に記載の細胞を培養すること；および
前記細胞または前記液体培地から前記ＡＣＣを回収すること、
を含むＡＣＣを製造する方法。
前記細胞または前記液体培地から回収された前記ＡＣＣを単離すること
をさらに含む、請求項１０８に記載の方法。
医薬組成物へと単離されたＡＣＣを処方すること
をさらに含む、請求項１０９に記載の方法。
請求項１０８に記載の方法により製造されたＡＣＣ。
請求項１１１に記載のＡＣＣを含む組成物。
医薬組成物である、請求項１１２に記載の組成物。
少なくとも１投与量の請求項１１２または１１３に記載の組成物を含む容器、バイアル、シリンジ、注入ペン、またはキット。
第１のモノマー構築物および第２のモノマー構築物を含む活性化可能サイトカイン構築物（ＡＣＣ）であって、
（ａ）前記第１のモノマー構築物が、第１の成熟サイトカインタンパク質（ＣＰ１）、第１の切断可能部分（ＣＭ１）、および第１のダイマー化ドメイン（ＤＤ１）を含み、
（ｂ）前記第２のモノマー構築物が、第２の成熟サイトカインタンパク質（ＣＰ２）、第２の切断可能部分（ＣＭ２）、および第２のダイマー化ドメイン（ＤＤ２）を含み、
（ｃ）前記第１のモノマー構築物が、ＮからＣ末端方向に、前記ＣＰ１、前記ＣＭ１、および前記ＤＤ１を含むポリペプチドであり、さらに、
（ｉ）前記第１のモノマー構築物および前記第２のモノマー構築物のそれぞれが、１８アミノ酸以下を含むリンキング領域を含み、かつ
（ｉｉ）前記ＣＰ１が、成熟インターフェロンであり、
（ｄ）さらに、
（ｉ）前記第２のモノマー構築物が、前記第１のモノマー構築物と同じであり、
（ｉｉ）前記第１のおよび第２のモノマー構築物が、少なくとも１つのジスルフィド結合を介して相互に共有結合され、および
（ｉｉｉ）前記ＤＤ１および前記ＤＤ２が、１対のヒトＩｇＧＦｃドメインであり、
（ｅ）前記ＤＤ１および前記ＤＤ２が、相互に結合しそれにより前記第１のモノマー構築物および前記第２のモノマー構築物のダイマーを形成し、および
（ｆ）対応する対照インターフェロンレベルに比べて低減されたレベルのインターフェロン活性を有することを特徴とする、
活性化可能サイトカイン構築物（ＡＣＣ）。
前記ＣＰ１が、成熟ヒトインターフェロンαである、請求項１１５に記載のＡＣＣ。
前記成熟インターフェロンが、成熟インターフェロンα２ｂである、請求項１１５および１１６のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載のＡＣＣ。
前記成熟インターフェロンが、野生型成熟インターフェロンα２ｂの切り詰め型である、請求項１１５～１１７のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載のＡＣＣ。
前記成熟インターフェロンが、配列番号１と少なくとも９５％同一である配列を含む、請求項１１５～１１７のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載のＡＣＣ。
前記成熟インターフェロンαが、配列番号１の配列を含む、請求項１１５～１１７のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載のＡＣＣ。
前記ＣＰ１および前記ＣＭ１が、相互に直接に隣接し、前記ＣＭ１および前記ＤＤ１が、相互に直接に隣接し、かつ前記ＣＭ１および前記ＣＭ２がそれぞれ、１０アミノ酸以下、任意に７アミノ酸以下を含む、請求項１１５～１２０のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載のＡＣＣ。
前記ＣＭ１および前記ＣＭ２がそれぞれ独立に、ウロキナーゼ（ｕＰＡ）および／またはマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）の基質として機能する、請求項１１５～１２１のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載のＡＣＣ。
前記ＣＭ１および前記ＣＭ２がそれぞれ独立に、ウロキナーゼ（ｕＰＡ）および／ＭＭＰ－１４の基質として機能する、請求項１１５～１２２のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載のＡＣＣ。
前記ＣＭ１および前記ＣＭ２がそれぞれ、配列番号１００と少なくとも８５％同一である配列を含む、請求項１１５～１２３のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載のＡＣＣ。
前記ＣＭ１および前記ＣＭ２がそれぞれ、配列番号４１、配列番号６８、および配列番号１００からなる群より選択される配列を含む、請求項１１５～１２４のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載のＡＣＣ。
前記ＤＤ１および前記ＤＤ２が、１対のヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインまたは１対のヒトＩｇＧ４Ｆｃドメインである、請求項１１５～１２５のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載のＡＣＣ。
前記ＤＤ１および前記ＤＤ２が、ＥＵナンバリングにより番号付けられるシステイン２２６にＮ末端で短縮された１対のヒトＩｇＧ１ＦｃドメインまたはＥＵナンバリングにより番号付けられるシステイン２２６にＮ末端で短縮された１対のヒトＩｇＧ４Ｆｃドメインである、請求項１２６に記載のＡＣＣ。
前記ＤＤ１および前記ＤＤ２が、ＥＵナンバリングにより番号付けられるＳ２２８Ｐ変異を含む１対のヒトＩｇＧ４Ｆｃドメインである、請求項１２６または１２７に記載のＡＣＣ。
前記ＤＤ１および前記ＤＤ２がそれぞれ、配列番号３と少なくとも９５％同一である配列を含む、請求項１１５～１２８のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載のＡＣＣ。
前記ＤＤ１および前記ＤＤ２がそれぞれ、配列番号３の配列を含む、請求項１１５～１２９のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載のＡＣＣ。
前記第１のおよび第２のモノマー構築物が、少なくとも２つのジスルフィド結合を介して相互に共有結合される、請求項１１５～１３０のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載のＡＣＣ。
前記第１のおよび第２のモノマー構築物が、少なくとも３つのジスルフィド結合を介して相互に共有結合される、請求項１１５～１３１のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載のＡＣＣ。
前記第１のおよび第２のモノマー構築物が、少なくとも４つのジスルフィド結合を介して相互に共有結合される、請求項１１５～１３２のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載のＡＣＣ。
前記第１のモノマー構築物が、前記ＣＭ１のＮ末端に直接隣接するシグナル配列をさらに含む、請求項１１５～１３３のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載のＡＣＣ。
前記シグナル配列が、配列番号３４５と少なくとも９５％同一である配列を含む、請求項１３４に記載のＡＣＣ。
前記シグナル配列が、配列番号３４５の配列を含む、請求項１３４に記載のＡＣＣ。
前記第１のモノマー構築物および第２のモノマー構築物のそれぞれが、１２アミノ酸以下を含むリンキング領域を含む、請求項１１５～１３６のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載のＡＣＣ。
前記リンキング領域が、７～１２アミノ酸を有する、請求項１３７に記載のＡＣＣ。
前記リンキング領域が、７アミノ酸を含む、請求項１３７に記載のＡＣＣ。
対応する対照インターフェロンに比べてインターフェロン活性における少なくとも５００倍の低減を特徴とする、請求項１１５～１３９のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載のＡＣＣ。
前記ＣＰ１が、インターフェロンαでありかつ前記対照インターフェロンが、組換えインターフェロンαである、請求項１１５～１４０のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載のＡＣＣ。
前記ＣＰ１が、インターフェロンα２ｂでありかつ前記対照インターフェロンが、ペグ化インターフェロンα２ｂである、請求項１１５～１４０のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載のＡＣＣ。
前記インターフェロン活性が、リンパ腫細胞中の抗増殖活性である、請求項１１５～１４２のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載のＡＣＣ。
前記インターフェロン活性が、インターフェロン応答性ＨＥＫ２９３細胞中の分泌型胚性アルカリホスファターゼ産生の誘導である、請求項１１５～１４２のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載のＡＣＣ。
ＣＭ１が基質として機能する前記プロテアーゼへの曝露後の切断産物の生成を特徴とし、前記切断産物に対する前記対照インターフェロンのインターフェロン活性の比率が、約２未満であり、かつ前記対照インターフェロンが、対応する組換え野生型インターフェロンまたは対応するペグ化インターフェロンである、請求項１１５～１４４のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載のＡＣＣ。
前記切断産物のＥＣ５０が、対応する組換え野生型インターフェロンのＥＣ５０とほぼ同じである、請求項１４５に記載のＡＣＣ。
前記第１および第２のモノマー構築物がそれぞれ、配列番号３１３と少なくとも９５％同一である配列を含む、請求項１１５に記載のＡＣＣ。
野生型インターフェロンα２ｂに比べてインターフェロン活性における少なくとも５００倍低減を特徴とし、かつｕＰＡへの曝露後に切断産物を生成することをさらに特徴とし、前記切断産物が、野生型インターフェロンα２ｂとほぼ同じインターフェロン活性を有し、インターフェロン活性が、リンパ腫細胞における抗増殖アッセイでまたはインターフェロン応答性ＨＥＫ２９３細胞における分泌型胚性アルカリホスファターゼ産生の誘導のアッセイで測定される、請求項１４７に記載のＡＣＣ。
野生型インターフェロンα２ｂまたはペグ化インターフェロンα２ｂのいずれかに比べてインビボでより低い毒性を示す、請求項１４７に記載のＡＣＣ。
第１のモノマー構築物および第２のモノマー構築物を含む活性化可能サイトカイン構築物（ＡＣＣ）であって、
（ａ）前記第１のモノマー構築物が、第１の成熟サイトカインタンパク質（ＣＰ１）、第１の切断可能部分（ＣＭ１）、および第１のダイマー化ドメイン（ＤＤ１）を含み、
（ｂ）前記第２のモノマー構築物が、第２の成熟サイトカインタンパク質（ＣＰ２）、第２の切断可能部分（ＣＭ２）、および第２のダイマー化ドメイン（ＤＤ２）を含み、
（ｃ）前記第１のモノマー構築物が、ＮからＣ末端方向に、前記ＣＰ１、前記ＣＭ１、および前記ＤＤ１を含むポリペプチドであり、さらに、
（ｉ）前記ＣＰ１および前記ＣＭ１が、相互に直接に隣接し、
（ｉｉ）前記ＣＭ１および前記ＤＤ１が、相互に直接に隣接し、
（ｉｉｉ）前記ＣＰ１が、配列番号１と少なくとも８５％同一である配列を含み、
（ｉｖ）前記ＣＭ１が、配列番号１００と少なくとも８５％同一である配列を含み、
（ｄ）さらに、
（ｉ）前記第２のモノマー構築物が、前記第１のモノマー構築物と同じであり、
（ｉｉ）前記第１のおよび第２のモノマー構築物が、少なくとも１つのジスルフィド結合を介して相互に共有結合され、および
（ｉｉｉ）前記ＤＤ１およびＤＤ２が、１対のヒトＩｇＧ４Ｆｃドメインであり、
（ｅ）前記ＤＤ１および前記ＤＤ２が、相互に結合しそれにより前記第１のモノマー構築物および前記第２のモノマー構築物のダイマーを形成し、および
（ｆ）ペグ化インターフェロンα２ｂのインターフェロンα活性に比べて低減されたレベルのインターフェロン活性を有することを特徴とする、
活性化可能サイトカイン構築物（ＡＣＣ）。
請求項１１５～１５０のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載のＡＣＣを含む組成物。
医薬組成物である、請求項１５１に記載の組成物。
少なくとも１投与量の請求項１５１または１５２に記載の組成物を含む容器、バイアル、シリンジ、注入ペン、またはキット。
請求項１１５～１５０のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載のＡＣＣまたは請求項１５１または１５２に記載の組成物の治療有効量を対象に投与することを含むそれを必要としている前記対象を治療する方法。
前記対象が、癌を有すると特定されているまたは診断されている、請求項１５４に記載の方法。
請求項１１５～１５０のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載のＡＣＣの第１のモノマーを含むポリペプチドをコードする核酸。
請求項１５６に記載の核酸を含むベクター。
発現ベクターである、請求項１５７に記載のベクター。
請求項１５６に記載の核酸または請求項１５７または１５８に記載のベクターを含む哺乳動物細胞。
ＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ細胞である、請求項１５９に記載の哺乳動物細胞。
ＡＣＣを製造する方法であって、
ａ．請求項１５９または１６０に記載の哺乳動物細胞中で前記ＡＣＣを発現させること、および
ｂ．前記発現されたＡＣＣを精製すること、
を含む、方法。
前記ＣＭ１が、腫瘍組織中で過剰発現されるプロテアーゼの基質として機能する、請求項１１５～１５０のいずれか１項またはこれらの組み合わせに記載のＡＣＣ。