JP7477885B2 - サイトカインをベースとした生理活性化薬剤およびその使用方法 - Google Patents

サイトカインをベースとした生理活性化薬剤およびその使用方法 Download PDF

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Description

関連特許出願
本出願は２０１８年６月２２日に出願された米国仮出願第６２／６８９，０５３号の利益を主張するものであり、当該仮特許出願の全内容は参照により本明細書に援用される。
疾患治療用の候補治療薬として、多くのサイトカインの評価が行われてきた。しかし、サイトカインによる身体免疫系への全身的な過剰刺激または過剰抑制が、その開発と臨床的有用性の著しい障害となっている。
インターロイキン－２（ＩＬ－２）およびインターロイキン－１５（ＩＬ－１５）は、共通の受容体成分（γｃおよびＩＬ－２Ｒβ）とシグナル経路を共有しており、いくつかの類似した機能を有する。両サイトカインが、Ｔ細胞の増殖を刺激し；細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の産生を刺激し；Ｂ細胞の増殖と、Ｂ細胞による免疫グロブリンの合成を促進し；ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の産生および残存を誘導する。非常に多くの前臨床試験、さらには複数の臨床的評価から、両サイトカインは、がん、自己免疫障害、炎症性障害、移植、および種々の他の障害において、潜在的価値のある治療薬と見なされている。転移性腎細胞癌患者および悪性黒色腫患者において、組換えＩＬ－２の使用が承認されている。ＩＬ－１５については、いくつかの腫瘍学臨床試験が進行中であるが、使用が承認されたものは未だない。さらに、ＩＬ－２およびＩＬ－１５は共に、第３の、ユニークな、非シグナル伝達性の受容体αサブユニットとして、それぞれＩＬ－２Ｒα（別名ＣＤ２５）またはＩＬ－１５Ｒαを有しているが、これらが、ＩＬ－２およびＩＬ－１５の別個の受容体特異性および生物学的機能に寄与しているのかもしれない。
組換えヒトＩＬ－２は転移性黒色腫および腎がんに使用されている効果の高い免疫療法であり、およそ１０％の患者で持続的な反応が見られる。しかし、半減期が短く、毒性が強いことで、ＩＬ－２の最適用量は制限を受けている。さらに、ＩＬ－２は、そのヘテロ三量体型受容体のＩＬ－２Ｒαβγに対して、より大きな親和性で結合するため、高レベルのＩＬ－２Ｒαを恒常的に発現している免疫抑制的な制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の優先的な増殖が起こる。Ｔｒｅｇの増殖はがん免疫療法にとってのＩＬ－２の望ましくない効果となり得る。しかし、低用量でもＴｒｅｇ細胞を刺激できるＩＬ－２の能力は、自己免疫性の慢性炎症性障害の治療で利用できる可能性があった。さらに最近になって、細胞傷害性のエフェクターＴ細胞またはＴｒｅｇ細胞のどちらかを選択的に刺激するよう、ＩＬ－２を改変できることが分かった。様々なアプローチから、改善された選択的な免疫調節活性を有するＩＬ－２バリアントが生成されるに至った。
ＩＬ－２とＩＬ－１５は共に免疫エフェクター細胞の強力なアゴニストであるため、細胞傷害性の免疫細胞が患部またはその近傍でのみ完全に活性化されること、例えば、がん部位またはその近傍でのみ完全に活性化されて、腫瘍細胞がごく特異的に破壊されること；あるいは、炎症性の問題を有する部位（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｉｓｓｕｅ ｓｉｔｅ）またはその近傍でのみ完全に活性化されて、抗自己免疫性慢性炎症性障害としてのみ働くこと、が重要となる。全てのサイトカイン、ケモカイン、および増殖因子について、標的に対する特異性および選択性を改善し、健常な細胞および組織をそのままの未損傷な状態に残すことは、大きな関心事である。
一つの態様において、本発明は、全身性機構（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）に基づいた毒性を低減し、がん、自己免疫障害、炎症性障害、および種々の他の障害の治療における、ＩＬ－１５およびＩＬ－２などのサイトカイン、ケモカイン、ホルモン、および増殖因子の、治療的有用性を広げることを目的とした、サイトカインをベースとした生理活性化薬剤（「ＶｉｔｏＫｉｎｅ」）のプラットフォームを提供する。このＶｉｔｏＫｉｎｅプラットフォームは、図１に示された構築体と、図２に示された、提唱された活性化法とにより規定される。図１を参照すると、本発明の新規ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体は以下の３つのドメインを含んでいる：１）組織標的ドメイン；半減期延長ドメイン；または二重機能性部分ドメインからなる群から選択されるＤ１ドメイン（「Ｄ１」）、２）「活性部分ドメイン」であるＤ２ドメイン（「Ｄ２」）、および３）「遮蔽部分ドメイン」であるＤ３ドメイン（「Ｄ３」）。重要なこととして、ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体のＤ２ドメインは患部組織で発現上昇しているプロテアーゼによって、または患部での加水分解によって、局所的な活性化を受けるまで、ほぼ不活性または最低限の活性を維持するため、当該活性部分が周辺の、または患部以外の細胞もしくは正常な組織の細胞表面上の受容体に結合することが制限されることで、その経路の過剰な活性化が抑制され、好ましくない「オンターゲット」であるが「標的組織外に対する」毒性や望ましくない標的シンクが低減される。
種々の実施形態において、本発明のＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、または組織特異抗原、細胞表面分子もしくは細胞外マトリックスタンパク質、またはプロテアーゼ、または任意の翻訳後修飾残基、に結合する抗体または抗体断片などの、ターゲティング部分であるＤ１を含む。種々の実施形態において、本発明のＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体は、患部細胞または患部組織に対して結合親和性を示すタンパク質またはペプチドなどの、ターゲティング部分であるＤ１を含む。種々の実施形態において、本発明のＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体は、患部細胞または患部組織上で発現されているＣ型レクチン受容体などの特定の受容体に対して結合親和性を示す、グリカン修飾タンパク質またはグリカン修飾ペプチドなどの、修飾を受けたタンパク質またはペプチドであるＤ１を含む。種々の実施形態において、本発明のＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体は、免疫チェックポイント修飾因子に対する抗体であるＤ１ドメインを含む。種々の実施形態において、本発明のＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体は、組織部位にサイトカインを滞留させる機能を有するＤ１を含む。種々の実施形態において、本発明のＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体は、組織ターゲティングおよび組織滞留など、二機能性であるＤ１を含む。種々の実施形態において、本発明のＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体は、ポリマーであるＤ１ドメインを含む。種々の実施形態において、本発明のＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体は、半減期延長部分であるＤ１ドメインを含む。種々の実施形態において、本発明のＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体は、Ｆｃドメイン（またはその機能性断片）であるＤ１ドメインを含む。
「Ｆｃドメイン」とは、ヒンジ領域の全体または一部を通常含む、２つのＦｃドメイン単量体からなる二量体を指す。種々の実施形態において、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメイン、ヒトＩｇＧ２のＦｃドメイン、ヒトＩｇＧ３のＦｃドメイン、ヒトＩｇＧ４のＦｃドメイン、ＩｇＡのＦｃドメイン、ＩｇＤのＦｃドメイン、ＩｇＥのＦｃドメイン、ＩｇＧのＦｃドメイン、およびＩｇＭのＦｃドメインからなる群から選択されるか、またはこれらの任意の組み合わせである。種々の実施形態において、Ｆｃドメインは、補体結合特性またはＦｃ受容体結合特性が変化したＦｃドメインをもたらすアミノ酸変化を含む。補体結合特性またはＦｃ受容体結合特性が変化したＦｃドメインをもたらすことが知られているアミノ酸変化は、当該技術分野において公知である。種々の実施形態において、ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体の製造に使用されるＦｃドメイン配列は、配列番号１３に記載のヒトＩｇＧ１－Ｆｃドメイン配列である。種々の実施形態において、ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体の製造に使用されるＦｃドメイン配列は、ＦｃγＲの結合やＣ１ｑの結合を断つアミノ酸置換を含む、配列番号１４に記載の配列である。種々の実施形態において、Ｆｃドメインは、生体内半減期のさらなる延長をもたらすアミノ酸変化を含む。半減期がさらに延長されたＦｃドメインをもたらすことが知られているアミノ酸変化は、当該技術分野において公知である。種々の実施形態において、ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体の製造に使用されるＦｃドメイン配列は、ＦｃγＲの結合やＣ１ｑの結合を断ち、生体内半減期を延長させるアミノ酸置換を含む、配列番号１５６または配列番号１６６に記載の配列である。種々の実施形態において、ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体の製造に使用されるＦｃドメイン配列は、配列番号１５に記載のＫｎｏｂ－Ｆｃドメイン配列由来である。種々の実施形態において、ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体の製造に使用されるＦｃドメイン配列は、配列番号１６に記載のＨｏｌｅ－Ｆｃドメイン配列由来である。種々の実施形態において、ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体の製造に使用されるＦｃドメイン配列は、配列番号１６７に記載の、生体内半減期が延長されたＫｎｏｂ－Ｆｃドメイン配列由来である。種々の実施形態において、ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体の製造に使用されるＦｃドメイン配列は、配列番号１６８に記載の、生体内半減期（ｉｎ ｖｉｖｏ ｈａｌｆ）が延長されたＨｏｌｅ－Ｆｃドメイン配列由来である。
種々の実施形態において、本発明のＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体は、タンパク質であるＤ２ドメインを含む。種々の実施形態において、本発明のＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体は、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２３、およびトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）スーパーファミリーのリガンド、例えばＴＧＦβ（配列番号２４）、を含むがこれらに限定はされない群から選択される、サイトカインであるＤ２ドメインを含む。種々の実施形態において、本発明のＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体は、ＩＬ－１５であるＤ２ドメインを含む。種々の実施形態において、本発明のＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体は、ＩＬ－１５ポリペプチドに１または複数のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、またはアミノ酸挿入を含むＩＬ－１５バリアント（または変異体）である、Ｄ２ドメインを含む。種々の実施形態において、本発明のＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体は、ＩＬ－２であるＤ２ドメインを含む。種々の実施形態において、本発明のＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体は、ＩＬ－２ポリペプチドに１または複数のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、またはアミノ酸挿入を含むＩＬ－２バリアント（または変異体）である、Ｄ２ドメインを含む。
種々の実施形態において、ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体のＤ２ドメインは、配列番号２に記載の成熟ヒトＩＬ－１５ポリペプチド（以下、ｈｕＩＬ－１５またはＩＬ－１５野生型（ｗｔ）とも称する）の配列を含む、ＩＬ－１５ドメインである。種々の実施形態において、ＩＬ－１５ドメインは、配列番号２に記載の成熟ヒトＩＬ－１５ポリペプチドの配列に由来する配列を含むＩＬ－１５バリアント（または変異体）となるであろう。種々の実施形態において、ＩＬ－１５ドメインは、配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列相同性を有する配列を含むＩＬ－１５バリアント（または変異体）となるであろう。ＩＬ－１５のバリアント（または変異体）は、元のアミノ酸、成熟配列内での上記元のアミノ酸の位置、およびバリアント型のアミノ酸、を用いて呼称される。例えば、ｈｕＩＬ－１５「Ｓ５８Ｄ」は、配列番号２の５８位にＳからＤへの置換を含むヒトＩＬ－１５を表す。種々の実施形態において、ＩＬ－１５バリアントは、ネイティブＩＬ－１５ポリペプチドと比較した場合のＩＬ－１５Ｒβγｃ受容体に対する結合活性の増加などから示されるような、ＩＬ－１５アゴニストとしての機能を有する。種々の実施形態において、ＩＬ－１５バリアントは、ネイティブＩＬ－１５ポリペプチドと比較した場合に、ＩＬ－１５Ｒβγｃ受容体に対する結合活性が減少していること、またはＩＬ－１５Ｒβγｃ受容体に対する結合活性は類似もしくは増加しているがシグナル伝達活性は減少もしくは消失していることなどから示されるような、ＩＬ－１５アンタゴニストとしての機能を有する。種々の実施形態において、ＩＬ－１５バリアントは、ネイティブＩＬ－１５ポリペプチドと比較して、ＩＬ－１５Ｒβγｃ受容体に対し、結合親和性が増加しているか、または結合活性が減少している。種々の実施形態において、ＩＬ－１５バリアントの配列は、ネイティブＩＬ－１５配列と比較して、少なくとも１つ（すなわち、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれ以上）のアミノ酸変化を有する。アミノ酸変化としては、ＩＬ－１５Ｒβおよび／またはＩＬ－１５Ｒβγｃと相互作用するＩＬ－１５のドメインなどの、ＩＬ－１５ポリペプチドに、アミノ酸置換、アミノ酸欠失、およびアミノ酸挿入のうちの１または複数を含ませることができる。種々の実施形態において、アミノ酸変化は、配列番号２の３０位、３１位、３２位、５８位、６２位、６３位、６７位、６８位、または１０８位における、１または複数のアミノ酸置換またはアミノ酸欠失である。種々の実施形態において、アミノ酸変化は、成熟ヒトＩＬ－１５配列の、３０位のＤからＴへの置換、３１位のＶからＹへの置換、３２位のＨからＥへの置換、５８位のＳからＤへの置換、６１位のＴからＤへの置換、６３位のＶからＦへの置換、６７位のＩからＶへの置換、６８位のＩからＦもしくはＨもしくはＤもしくはＫへの置換、１０８位のＱからＡもしくはＭもしくはＳへの置換、またはこれらの置換の任意の組み合わせである。種々の実施形態において、アミノ酸変化は成熟ヒトＩＬ－１５配列の５８位におけるＳからＤへの置換である。種々の実施形態において、ＩＬ－１５ポリペプチドは、配列番号３のＩＬ－１５バリアントを含む。種々の実施形態において、ＩＬ－１５ドメインは、アミノ酸置換、アミノ酸欠失、およびアミノ酸挿入の任意の組み合わせを有する。
種々の実施形態において、本発明のＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体のＤ２ドメインは、ＩＬ－２ポリペプチドを含む。種々の実施形態において、本発明のＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体は、１または複数のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、またはアミノ酸挿入を含むＩＬ－２バリアント（または変異体）である、Ｄ２ドメインを含む。種々の実施形態において、ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体は、ＩＬ－２ドメインが配列番号８に記載の成熟ヒトＩＬ－２ポリペプチド（以下、ｈｕＩＬ－２またはＩＬ－２野生型（ｗｔ）とも称する の配列を含む、Ｄ２ドメインを含む。種々の実施形態において、ＩＬ－２ドメインは、配列番号８に記載の成熟ヒトＩＬ－２ポリペプチドの配列に由来する配列を含むＩＬ－２バリアント（または変異体）となるであろう。種々の実施形態において、ＩＬ－２ドメインは、配列番号８と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列相同性を有する配列を含むＩＬ－２バリアント（または変異体）となるであろう。種々の実施形態において、ＩＬ－２バリアントはＩＬ－２アゴニストとしての機能を有する。種々の実施形態において、ＩＬ－２バリアントはＩＬ－２アンタゴニストとしての機能を有する。種々の実施形態において、アミノ酸変化は、配列番号８の１９位、２０位、３８位、４１位、４２位、４４位、８８位、１０７位、１２５位、または１２６位における、１または複数のアミノ酸置換である。種々の実施形態において、アミノ酸変化は、成熟ヒトＩＬ－２配列の、１９位のＬからＤもしくはＨもしくはＮもしくはＰもしくはＱもしくはＲもしくはＳもしくはＹへの置換、２０位のＤからＥもしくはＩもしくはＮもしくはＱもしくはＳもしくはＴもしくはＹへの置換、３８位のＲからＥもしくはＡへの置換、４１位のＴからＡもしくはＧもしくはＶへの置換、４２位のＦからＡへの置換、４４位のＦからＧもしくはＶへの置換、８８位のＮからＤ、ＥもしくはＧもしくはＩもしくはＭもしくはＱもしくはＴもしくはＲへの置換、１０７位のＹからＧもしくはＨもしくはＬもしくはＶへの置換、１２５位のＳからＥ、Ｈ、Ｋ、Ｉ、もしくはＷへの置換、１２６位のＱからＤもしくはＥもしくはＫもしくはＬもしくはＭもしくはＮへの置換、またはこれらの置換の任意の組み合わせである。
種々の実施形態において、本発明のＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体は、Ｄ２のタンパク質またはサイトカインに対するコグネイト受容体／結合パートナー、または同定されている任意の結合パートナーである、「遮蔽部分ドメイン」（Ｄ３）を含む。種々の実施形態において、Ｄ３ドメインは、Ｄ２ドメインに対するコグネイト受容体／結合パートナーのバリアントである。種々の実施形態において、Ｄ３ドメインは、野生型コグネイト受容体／結合パートナーと比較して、Ｄ２ドメインに対する結合性が増強されている。種々の実施形態において、Ｄ３ドメインは、野生型コグネイト受容体／結合パートナーと比較して、Ｄ２ドメインに対する結合性が減少または消失している。種々の実施形態において、Ｄ３ドメインは、Ｄ２の活性を遮蔽することができる、タンパク質、またはペプチド、または抗体、または抗体断片である。種々の実施形態において、Ｄ３ドメインは、ＤＮＡ、ＲＮＡ断片、またはＰＥＧなどのポリマーである。種々の実施形態において、本発明のＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体は、ＩＬ－１５Ｒα細胞外ドメインまたはその機能性断片であるＤ３ドメインを含む。種々の実施形態において、本発明のＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体は、ＩＬ－１５ＲαＳｕｓｈｉドメインであるＤ３ドメインを含む。種々の実施形態において、本発明のＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体は、ＩＬ－２Ｒα細胞外ドメインまたはその機能性断片であるＤ３ドメインを含む。種々の実施形態において、本発明のＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体は、ＩＬ－２ＲαＳｕｓｈｉドメインであるＤ３ドメインを含む。種々の実施形態において、Ｄ３ドメインは、目的の治療部位で活性化を受けるまで、Ｄ２の機能活性を遮蔽することが可能である。
種々の実施形態において、ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体のＤ１、Ｄ２、およびＤ３ドメインは、プロテアーゼ切断可能なポリペプチドリンカー配列で連結されている。種々の実施形態において、ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体のＤ１、Ｄ２、およびＤ３ドメインは、切断が不可なポリペプチドリンカー配列で連結されている。種々の実施形態において、本発明のＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体のＬ１およびＬ２は共に、プロテアーゼ切断可能なペプチドリンカーである。種々の実施形態において、本発明のＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体のＬ１は、プロテアーゼ切断可能なペプチドリンカーであり、Ｌ２は切断不可なペプチドリンカーである。種々の実施形態において、本発明のＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体のＬ１は、切断不可なペプチドリンカーであり、Ｌ２はプロテアーゼ切断可能なペプチドリンカーである。種々の実施形態において、本発明のＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体のＬ１およびＬ２は共に、切断不可なリンカーである。種々の実施形態において、リンカーは、Ｇ／Ｓ含量が豊富である（例えば、リンカー内の少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、またはそれ以上のアミノ酸がＧまたはＳである。各々のペプチドリンカー配列は独立して選択できる。種々の実施形態において、プロテアーゼ切断可能なリンカーは、配列番号７１～９６および配列番号１５７～１６１に記載の配列の群から選択される。種々の実施形態において、プロテアーゼ切断可能なリンカーには、切断可能なリンカーのＮ末端、または切断可能なリンカーのＣ末端、または切断可能なリンカーの両末端に、長さ可変の追加のペプチドスペーサーを持たせることができる。種々の実施形態において、切断不可なリンカーは、配列番号１０７～１２７に記載の配列の群から選択される。種々の実施形態において、リンカーは、柔軟または剛直であり、種々の長さを有する。
種々の実施形態において、ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体のＤ２ドメインおよびＤ３ドメインは、図１に示されるように、Ｄ１ドメインのＮ末端に配置される。種々の実施形態において、ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体のＤ２ドメインおよびＤ３ドメインは、図１に示されるように、Ｄ１ドメインのＣ末端に配置される。
種々の実施形態において、ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体のＤ１ドメイン、Ｄ２ドメイン、およびＤ３ドメインは、単量体であってもよく、二量体であってもよく、あるいは、Ｄ１が二量体であり、Ｄ２およびＤ３が単量体であるなどの、二量体および単量体の組み合わせであってもよい。
別の態様において、本開示は、対象におけるがんまたはがん転移を治療するための方法において、それを必要とする対象に治療有効量の本発明の医薬組成物を投与することを含む、上記方法を提供する。１つの実施形態において、対象はヒト対象である。種々の実施形態において、がんは、膵がん、胃がん、肝臓がん、乳がん、卵巣がん、大腸がん、黒色腫、白血病、骨髄異形成症候群、肺がん、前立腺がん、脳がん、膀胱がん、頭頸部がん、横紋筋肉腫、または任意のがんから選択される。
別の態様において、本開示は、対象におけるがんまたはがん転移を治療するための方法において、治療有効量の本発明の医薬組成物を、以下からなる群から選択される第２の治療方法と組み合わせて投与することを含む、上記方法を提供する：細胞障害性化学療法、免疫療法、小分子キナーゼ阻害剤標的療法、外科手術、放射線療法、幹細胞移植、ＣＡＲ－Ｔ、ＣＡＲ－ＮＫ、ｉＰＳ誘導ＣＡＲ－ＴまたはｉＰＳ誘導ＣＡＲ－ＮＫを含む細胞療法、およびカルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）などのワクチン。種々の実施形態において、併用療法は、治療有効量の免疫療法を対象に投与することを含み得るが、免疫療法としては、特定の腫瘍抗原に対する枯渇抗体（ｄｅｐｌｅｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を用いた治療；抗体薬物複合体を用いた治療；ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ４０、ＯＸ－４０、ＣＤ１３７、ＧＩＴＲ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ－３、Ｓｉｇｌｅｃ７、Ｓｉｇｌｅｃ８、Ｓｉｇｌｅｃ９、Ｓｉｇｌｅｃ１５、およびＶＩＳＴＡなどの共刺激分子または共抑制分子（免疫チェックポイント）に対するアゴニスト抗体、アンタゴニスト抗体、または阻止抗体を用いた治療；ブリナツモマブなどの二重特異性Ｔ細胞誘導抗体（ＢｉＴＥ（登録商標））を用いた治療：ＩＬ－１２、ＩＬ－２１、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、およびＩＦＮ－γなどの生物学的応答調節物質の投与を含む治療；シプロイセルＴなどの治療用ワクチンを用いた治療；樹状細胞ワクチンまたは腫瘍抗原ペプチドワクチンを用いた治療；キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）－Ｔ細胞を用いた治療；ＣＡＲ－ＮＫ細胞を用いた治療；腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を用いた治療；養子移植抗腫瘍Ｔ細胞（生体外で増殖された且つ／またはＴＣＲトランスジェニックのＴ細胞）を用いた治療；ＴＡＬＬ－１０４細胞を用いた治療；Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストのＣｐＧおよびイミキモドなどの免疫刺激剤を用いた治療；並びに、ＢＣＧなどのワクチンを用いた治療が挙げられるが、これらに限定はされず；上記の併用療法はエフェクター細胞による腫瘍細胞の殺傷を増大させ、すなわち、同時に投与された場合、ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体と免疫療法との間には相乗作用が存在する。
別の態様において、本開示は、対象におけるウイルス感染症を治療するための方法において、それを必要とする対象に治療有効量の本発明の医薬組成物を投与することを含む、上記方法を提供する。１つの実施形態において、上記対象はヒト対象である。種々の実施形態において、上記ウイルスはＨＩＶである。
別の態様において、本開示は、対象におけるウイルス感染症を治療するための方法において、アシクロビル、エプクルーサ、マヴィレット、ジドブジン、およびエンフビルチドを含むがこれらに限定はされない第二の治療方法と組み合わせて、治療有効量の本発明の医薬組成物を投与することを含む、上記方法を提供する。
別の態様において、本開示は、対象における自己免疫疾患を治療するための方法において、それを必要とする対象に治療有効量の本発明の医薬組成物を投与することを含む、上記方法を提供する。１つの実施形態において、上記対象はヒト対象である。種々の実施形態において、自己免疫疾患は全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、尋常性天疱瘡、重症筋無力症、溶血性貧血、血小板減少性紫斑病、グレーブス病、シェーグレン病、皮膚筋炎、橋本病、多発性筋炎、炎症性腸疾患、多発性硬化症（ＭＳ）、真性糖尿病、関節リウマチ、および強皮症からなる群から選択される。
別の態様において、本開示は、対象における炎症性疾患を治療するための方法において、それを必要とする対象に治療有効量の本発明の医薬組成物を投与することを含む、上記方法を提供する。１つの実施形態において、上記対象はヒト対象である。種々の実施形態において、炎症性疾患は、クローン病、潰瘍性大腸炎、コラーゲン大腸炎、リンパ球性大腸炎、虚血性大腸炎、空置大腸炎、ベーチェット症候群、および分類不能大腸炎からなる群から選択される。
種々の実施形態において、炎症性疾患は、アカラシア、成人スティル病、無ガンマグロブリン血症、アミロイドーシス、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性血管浮腫、自己免疫性自律神経障害、自己免疫性脳脊髄炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性睾丸炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性蕁麻疹、軸索およびニューロンの神経障害、バロー病、ベーチェット病、良性粘膜類天疱瘡、キャッスルマン病、シャーガス病、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、慢性再発性多発性骨髄炎、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、コーガン症候群、コクサッキー心筋炎、クレスト症候群、疱疹状皮膚炎、デビック病／視神経脊髄炎、円板状ループス、ドレスラー症候群、好酸球性食道炎、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維化肺胞炎、巨細胞性動脈炎、巨細胞性心筋炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、妊娠性疱疹または妊娠性類天疱瘡、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４関連硬化性疾患、免疫に関連した有害事象、封入体筋炎、間質性膀胱炎、若年性関節炎、若年性（Ｊｕｖｅｎｉｅ）筋炎、ランバート・イートン症候群、白血球破壊性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬（Ｌｉｃｈｅｎ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、木質結膜炎、線状ＩｇＡ病、慢性ライム病（Ｌｙｍｅ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｈｒｏｎｉｃ）、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎（Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ Ｐｏｌｙａｎｇｉｔｉｓ）、混合結合組織病、モーレン潰瘍、ムッハ・ハーベルマン病、多巣性運動ニューロパチー、視神経炎、回帰性リウマチ、ＰＡＮＤＡＳ、傍腫瘍性小脳変性症、パリー・ロンベルク症候群、毛様体扁平部炎、パーソネージ・ターナー症候群、静脈周囲性脳脊髄炎、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎、多腺性症候群（ｐｏｌｙｇｌａｎｄｕｌａｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、リウマチ性多発筋痛、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、原発性硬化性胆管炎（Ｐｒｉｍａｒｙ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ Ｃｈｏｌａｎｇｉｔｉｓ）、プロゲステロン皮膚炎（Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ Ｄｅｍａｔｉｔｉｓ）、乾癬性関節炎、赤芽球癆、壊疽性膿皮症、レイノー現象（Ｒｅｙｎａｕｄ’ｓ Ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ）、反射性交感神経性ジストロフィー、再発性多発性軟骨炎、後腹膜線維症、強膜炎、精子・精巣自己免疫、全身硬直症候群、亜急性細菌性心内膜炎、スザック症候群、交感性眼炎、高安動脈炎、血小板減少性紫斑病、トローザ・ハント症候群、横断性脊髄炎（Ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ Ｍｙｅｌｔｉｔｉｓ）、未分化結合組織病、フォークト・小柳・原田病などの他の自己免疫性炎症性疾患からなる群から選択される。
別の態様において、本開示は、がん治療用の医薬を調製するためのＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体の使用を提供する。
別の態様において、本開示は、ウイルス感染症治療用の医薬を調製するためのＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体の使用を提供する。
別の態様において、本開示は、自己免疫疾患治療用の医薬を調製するためのＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体の使用を提供する。
別の態様において、本開示は、炎症治療用の医薬を調製するためのＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体の使用を提供する。
別の態様において、本開示は、がん、ウイルス感染症、自己免疫疾患、または炎症を治療することが可能な第二の治療薬または細胞治療と組み合わせた、本発明のＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体の使用を提供する。
別の態様において、本開示は、本開示のＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体をコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。別の態様において、本開示は、本明細書に記載の核酸を含むベクターを提供する。種々の実施形態において、上記のベクターは発現ベクターである。別の態様において、本開示は、本開示の核酸を含む単離された細胞を提供する。種々の実施形態において、上記の細胞は、本開示の発現ベクターを含む宿主細胞である。別の態様において、上記のタンパク質またはポリペプチドの発現を促進する条件下で上記の宿主細胞を培養することによる、ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体の作製方法が提供される。
別の態様において、本開示は、単離されたＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体を、薬剤的に許容できる担体と混合して含む、医薬組成物を提供する。
図１は、本発明のＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体の代表的な型を示している。 図２は、提唱されたＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体活性化メカニズムを示している。例示的なＶｉｔｏＫｉｎｅは、２種のプロテアーゼ切断可能なリンカーを含み；Ｌ１リンカーの切断により起こるプロテアーゼ１の活性化は活性型１をもたらし；Ｌ２リンカーの切断により起こるプロテアーゼ２の活性化は第２活性型をもたらし；Ｌ１リンカーおよびＬ２リンカーの切断により起こる両方のプロテアーゼによる活性化は活性型３をもたらす。 図３は、プロテインＡ精製後の例示的なＩＬ－１５ ＶｉｔｏＫｉｎｅ Ｐ－０３１５の、Ａ）還元剤の非存在下および存在下のＳＤＳ－ＰＡＧＥ、Ｂ）サイズ排除クロマトグラム、のタンパク質プロファイルを示している。 図４は、高活性ＩＬ－１５融合タンパク質Ｐ－０１９８と比較した、ＩＬ－１５ ＶｉｔｏＫｉｎｅ Ｐ－０１７２の結合性および機能活性を示している。（Ａ）ＥＬＩＳＡアッセイで測定されたＩＬ－２Ｒβに対する結合活性；（Ｂ～Ｃ）ＦＡＣＳ分析による新鮮ヒトＰＢＭＣのヒトＣＤ８＋Ｔ細胞上（Ｂ）およびＮＫ細胞上（Ｃ）のＣＤ６９発現の誘導。 図５は、高活性ＩＬ－１５融合タンパク質Ｐ－０１６６と比較した、単量体Ｆｃ ＩＬ－１５ ＶｉｔｏＫｉｎｅ Ｐ－０１７０の機能活性を示している。新鮮ヒトＰＢＭＣのヒトＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ６９発現の誘導はＦＡＣＳで測定と解析を行った。 図６は、高活性ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質Ｐ－０１６５と比較した、リンカー長が異なる例示的なＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体（Ｐ－０２０４、Ｐ－０２０５、およびＰ－０２０６）による、ヒトＰＢＭＣのＡ）ＣＤ８＋Ｔ細胞上、およびＢ）ＮＫ（ＣＤ５６＋）細胞上のＣＤ６９発現の誘導を示している。 図７は、完全活性（ｆｕｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ）ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質のＰ－０２０７およびＰ－０２１７と比較した、異なるＬ１リンカーおよびＬ２リンカーを有する例示的なＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体（Ｐ－０２０２、Ｐ－０２０３、およびＰ－０２０４）による、ヒトＰＢＭＣにおけるＮＫ（ＣＤ５６＋）細胞の増殖を示している。 図８は、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質Ｐ－０１５６と比較して、ＦＡＣＳで測定された、Ｌ２リンカー配列組成が異なる例示的なＦｃ ＩＬ－１５ ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体（Ｐ－０３５１、Ｐ－０４８８、およびＰ－０４８９）による、ヒトＰＢＭＣにおけるＡ）ＮＫ（ＣＤ５６＋）細胞、およびＢ）ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を示している。 図９は、様々な量のＭＭＰ－２を用いたＦｃ ＩＬ－１５ ＶｉｔｏＫｉｎｅ Ｐ－０３１５のタンパク質分解の、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示している。 図１０は、完全な切断に適した反応条件を求めるための、異なる条件下でｕＰＡを用いたＦｃ ＩＬ－１５ ＶｉｔｏＫｉｎｅ Ｐ－０２０３のタンパク質分解の、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示している。 図１１は、Ａ）ｕＰＡによるタンパク質分解前後のＦｃ ＩＬ－１５ ＶｉｔｏＫｉｎｅ Ｐ－０２０３のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示している。Ｂ）ｕＰＡ消化とプロテインＡ精製による切断型Ｆｃ断片除去後の、活性型ＶｉｔｏＫｉｎｅ Ｐ－０２０３のタンパク質プロファイル。 図１２は、Ａ）ＭＭＰ－２によるタンパク質分解前後のＦｃ ＩＬ－１５ ＶｉｔｏＫｉｎｅ Ｐ－０３１５のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示している。ゲルは、ＭＭＰ－２消化とプロテインＡ精製を受けたＰ－０３１５のプロファイル；Ｂ）ＭＭＰ－２消化後のプロテインＡ精製から得られたＶｉｔｏＫｉｎｅ Ｐ－０３１５の第２活性型のタンパク質プロファイル；Ｃ）ＭＭＰ－２およびｕＰＡの両方による二重タンパク質分解後のフロースルーモードでのプロテインＡ精製から得られた、ＶｉｔｏＫｉｎｅ Ｐ－０３１５の第３活性型のタンパク質プロファイルも示している。 図１３は、Ａ）ＣＤ５６＋ＮＫ細胞上およびＢ）ＣＤ８＋Ｔ細胞上の活性化マーカーＣＤ６９の誘導を分析することによる、プロテアーゼ（ｕＰＡ）によって活性化されたＦｃ ＩＬ－１５ ＶｉｔｏＫｉｎｅ Ｐ－０２０３の活性評価を示している。高活性ＩＬ－１５融合タンパク質であるＰ－０１６５を陽性対照として含めた。 図１４は、Ａ）ＣＤ５６＋ＮＫ細胞上およびＢ）ＣＤ８＋Ｔ細胞上の活性化マーカーＣＤ６９の誘導を分析することによる、２つの形態のプロテアーゼ活性化Ｆｃ ＩＬ－１５ ＶｉｔｏＫｉｎｅ Ｐ－０３１５の活性評価を示している。Ｐ－０３１５の第２活性型はＭＭＰ－２消化から得て、Ｐ－０３１５の第３活性型はＭＭＰ－２およびｕＰＡの両方による二重タンパク質分解から得た。Ｐ－０３１５の第２活性型と構造的に類似した高活性ＩＬ－１５融合タンパク質であるＰ－０３１３を、陽性対照として含めた。 図１５は、Ａ）ＣＤ５６＋ＮＫ細胞上およびＢ）ＣＤ８＋Ｔ細胞上の増殖マーカーＫｉ６７の誘導を分析することによる、ＭＭＰ－２活性化ＩＬ－１５ ＶｉｔｏＫｉｎｅ Ｐ－０３１５（第２活性型）の活性評価を示している。切断不可なＬ１リンカーおよびＬ２リンカーの両方を含み、Ｐ－０３１５と同じＬ２リンカー長を共有するＰ－０３５１を、比較用に含めた。 図１６は、Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおける単回注射後の、末梢血中のＣＤ８＋Ｔ細胞（Ａ）、ＮＫ細胞（Ｂ）、および白血球（Ｃ）の増殖に対する、切断可能なＦｃ ＩＬ－１５ ＶｉｔｏＫｉｎｅ Ｐ－０３１５、切断不可なＦｃ ＩＬ－１５ ＶｉｔｏＫｉｎｅ Ｐ－０３５１の用量依存的および時間依存的な効果を示している。完全活性型ＩＬ－１５ Ｆｃ融合体のＰ－０３１３は比較用に含めた。－１日目、３日目、５日目、および７日目に血液を採取し、ＦＡＣＳ分析でリンパ球表現型検査を行った。データは平均値±ＳＥＭとして表されている。統計解析として、２元配置分散分析と、その後にテューキーの事後検定を行った。各時点のＰＢＳ群との比較で、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊ｐ＜０．０５。 図１７は、Ｐ－０３１５、Ｐ－０３５１、Ｐ－０３１３、またはＰＢＳ対照を５日おきに４回投与した１日後の、マウスＣＴ２６肺転移モデルにおける肺転移性結節の阻害を示している。ＣＴ２６細胞注射の１日後に最初の投与を開始した。特に記載がない限り全ての比較はＰＢＳ群に対する比較である；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；＊＊ｐ＜０．０１；＊ｐ＜０．０５。 図１８は、ＣＴ２６転移マウスの総血中リンパ球中の、Ａ）ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合（％）およびＢ）ＮＫ細胞の割合（％）を示している。Ｐ－０３１５、Ｐ－０３５１、Ｐ－０３１３、またはＰＢＳ対照の腹腔内注射を５日おきに３回行ってから４日後に、フローサイトメトリーで細胞数を求めた。全ての比較はＰＢＳ群に対する比較である；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；＊＊ｐ＜０．０１；＊ｐ＜０．０５。 図１９は、樹立されたＣＴ２６マウス大腸癌腫瘍モデルにおける、完全活性型ＩＬ－１５－Ｆｃ融合体Ｐ－０３１３と比較した、Ｆｃ ＩＬ－１５ ＶｉｔｏＫｉｎｅ Ｐ－０３１５の抗腫瘍活性を示している。Ａ）ＰＢＳ溶媒群、Ｂ）０．１ｍｇ／ｋｇ Ｐ－０３１５群、またはＣ）０．１ｍｇ／ｋｇ Ｐ－０３１３群について、処置を５日おきに２回行った後の個々のマウスにおけるＣＴ２６皮下腫瘍の成長曲線を示した。（Ｄ）各処置群の経時的な平均腫瘍体積±ＳＥＭ。全ての比較は溶媒処置に対する比較である；ｎ＝１１／群；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。 図２０は、ＣＴ２６マウス大腸癌腫瘍モデルにおけるＶｉｔｏＫｉｎｅ Ｐ－０３１５または高活性ＩＬ－１５－Ｆｃ融合体Ｐ－０３１３処置後のマウス末梢血の免疫薬力学的プロファイリング（ｉｍｍｕｎｏ－ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）を示している。腫瘍移植の１１日後から開始して、処置を５日おきに２回行った後に、１９日目のＡ）ＮＫ細胞およびＢ）ＣＤ８＋Ｔ細胞における増殖マーカーＫｉ６７の増加率を、フローサイトメトリーにより求めた。＊＊＊＊ＰＢＳとの比較でＰ＜０．０００１。 図２１は、ＣＴ２６マウス大腸癌腫瘍モデルにおけるＰ－０３１５またはＰ－０３１３処置後のマウス末梢血の免疫薬力学的プロファイリングを示している。腫瘍移植の１１日後から開始して、処置を５日おきに２回行った後に、１９日目の循環血（全血１μｌ当たり）中のＡ）総白血球、Ｂ）ＮＫ細胞、およびＣ）ＣＤ８＋Ｔ細胞の数の増加を、フローサイトメトリーにより求めた。＊＊＊＊ＰＢＳとの比較でＰ＜０．０００１。 図２２は、ＣＴ２６マウス大腸癌腫瘍モデルにおけるＰ－０３１５またはＰ－０３１３処置後の脾臓の免疫薬力学的プロファイリングを示している。腫瘍移植の１１日後から開始して、処置を５日おきに２回行った後に、１９日目の脾臓中のＡ）総白血球、Ｂ）ＮＫ細胞、およびＣ）ＣＤ８＋Ｔ細胞の数の増加を、フローサイトメトリーにより求めた。ＰＢＳとの比較で、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊Ｐ＜０．０５。 図２３は、Ａ）ＣＤ５６＋ＮＫ細胞上およびＢ）ＣＤ８＋Ｔ細胞上の増殖マーカーＫｉ６７の誘導を分析することによる、切断不可Ｆｃ ＩＬ－１５ ＶｉｔｏＫｉｎｅ Ｐ－０３５１と基準との活性比較を示している。 図２４は、プロテインＡ精製後の例示的なＩＬ－２ ＶｉｔｏＫｉｎｅ Ｐ－０３２０の、Ａ）還元剤の非存在下および存在下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥ、およびＢ）サイズ排除クロマトグラム、のタンパク質プロファイルを示している。 図２５は、新鮮ヒトＰＢＭＣ中のＡ）ＣＤ４陽性Ｆｏｘｐ３陽性／ＣＤ２５高発現のＴｒｅｇおよびＢ）ＣＤ４陽性Ｆｏｘｐ３陰性／Ｄ２５低発現のＣＤ４通常Ｔ細胞サブセットにおけるｐＳｔａｔ５レベルを分析することによる、２種類のＦｃ ＩＬ－２ ＶｉｔｏＫｉｎｅ、Ｐ－０３２０（ＩＬ－２がＦｃのＣ末端に融合している）およびＰ－０３２９（ＩＬ－２がＦｃのＮ末端に融合している）の活性評価を示している。高活性のＩＬ－２－Ｆｃ融合タンパク質であるＰ－０２５０を陽性対照として含めた。 図２６は、プロテアーゼ切断後にＤ２からＤ３が遊離し拡散することが好ましい場合の、図２の図示からの、ＶｉｔｏＫｉｎｅ活性化機構の変形例を示している。 図２７は、Ａ）ＩＬ－２ ＶｉｔｏＫｉｎｅ Ｐ－０３８２と、ＭＭＰ－２消化後のＮｉ－Ｅｘｃｅｌ精製によるその活性化との、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示している。Ｂ）結合／溶出モードでプロテインＡにより精製されたＭＭＰ－２活性化Ｐ－０３８２のタンパク質プロファイル。 図２８は、新鮮ヒトＰＢＭＣ中のＡ）ＣＤ４陽性Ｆｏｘｐ３陽性／ＣＤ２５高発現のＴｒｅｇおよびＢ）ＣＤ４陽性Ｆｏｘｐ３陰性／Ｄ２５低発現のＣＤ４通常Ｔ（Ｔｃｏｎｖ）細胞サブセットにおけるｐＳｔａｔ５レベルを分析することによる、プロテアーゼ活性化ＩＬ－２ ＶｉｔｏＫｉｎｅｓ Ｐ－０３８２の活性評価を示している。２種類の活性型試料を、Ｎｉ－Ｅｘｃｅｌ樹脂で精製してプロテアーゼを除去するか（第１活性型）、または、プロテインＡで精製してプロテアーゼとタンパク質分解で生じたＩＬ－２ＲαＳｕｓｈｉドメインの両方を除去した（第２活性型）。高活性のＩＬ－２－Ｆｃ融合タンパク質であるＰ－０２５０を陽性対照として含めた。 図２９は、新鮮ヒトＰＢＭＣ中のＡ）ＣＤ４陽性Ｆｏｘｐ３陽性／ＣＤ２５高発現のＴｒｅｇおよびＢ）ＣＤ４陽性Ｆｏｘｐ３陰性／Ｄ２５低発現のＣＤ４通常Ｔｃｏｎｖ細胞サブセットにおけるｐＳｔａｔ５レベルを分析することによる、ＭＭＰ－２タンパク質分解前後のＦｃ ＩＬ－２ ＶｉｔｏＫｉｎｅ Ｐ－０３９８の活性評価を示している。Ｐ－０３９８とＬ２リンカー長だけが異なるＰ－０３８２と、高活性のＩＬ－２－Ｆｃ融合タンパク質であるＰ－０２５０を、比較用に含めた。 図３０は、フローサイトメトリーで求められた、Ａ）ＣＤ５６＋ＮＫ細胞上およびＢ）ＣＤ８＋Ｔ細胞上の増殖マーカーＫｉ６７の誘導の分析による、抗体ＩＬ－１５ ＶｉｔｏＫｉｎｅ Ｐ－０４８５と比較した、Ｆｃ ＩＬ－１５ ＶｉｔｏＫｉｎｅ Ｐ－０３１５の活性評価を示している。 図３１は、ＥＬＩＳＡ形式の、ＩＬ－１５に対するブロッキングペプチド（Ｌ０１、Ｌ０２、Ｌ０３、Ｌ０４、およびＬ０５）の結合性を示している。 図３２は、プレート上にコーティングされたＩＬ－２Ｒβに対する、ＩＬ－２Ｒβベースのブロッキングペプチドを含むＩＬ－１５融合タンパク質（Ｐ－０１５３、Ｐ－０１５９、Ｐ－０１６０、およびＰ－０１６１）の結合性を示している。 図３３は、ＩＬ－２－Ｆｃ融合タンパク質Ｐ－０２５０のサイズ排除クロマトグラム（Ａ）と比較して、４種類のＩＬ－２ ＶｉｔｏＫｉｎｅ（Ｐ－０３２０、Ｐ－０３８２、Ｐ－０３６２、およびＰ－０３７９）（Ｂ～Ｆ）と、ＩＬ－２に１アミノ酸置換Ｓ１２５Ｉを有する１種類のＰ－０２５０対応物Ｆｃ融合タンパク質のサイズ排除クロマトグラムを示している。 図３４は、Ｆｃ ＩＬ－１５ ＶｉｔｏＫｉｎｅ Ｐ－０３８９（Ａ）のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルと、それと比較した、Ｐ－０３１５のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（Ｂ）を示している。
本開示は、がん、ウイルス感染症、自己免疫疾患、または炎症性疾患の治療における使用が意図された、全身性のオンターゲット毒性を低減し、サイトカインの治療指数を増大する、プラットフォーム技術としての新規の「ＶｉｔｏＫｉｎｅ」構築体を提供する。図１を参照して、このＶｉｔｏＫｉｎｅプラットフォームは、図１に示された構築体と、図２に示された、提唱された活性化法とにより規定される。図１を参照すると、本発明の新規ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体は以下の３つのドメインを含んでいる：１）組織標的ドメイン；半減期延長ドメイン；または二重機能性部分ドメインからなる群から選択されるＤ１ドメイン（「Ｄ１」）、２）「活性部分ドメイン」であるＤ２ドメイン（「Ｄ２」）、および３）「遮蔽部分ドメイン」であるＤ３ドメイン（「Ｄ３」）。重要なこととして、Ｄ３ドメインは、目的の治療部位で活性化を受けるまで、Ｄ２の機能活性を遮蔽することが可能である。
これら３つのドメインが、プロテアーゼ切断可能な配列を伴う、長さと剛直性が可変のリンカーを用いて連結されており、この配列が、患部において発現が上昇または調節不全となっている特定のプロテアーゼ亜型のペプチド基質となることで、機能的Ｄ２ドメインが当該患部で暴露または放出されることが可能となる。リンカーの長さと組成が最適化されて、Ｄ２ドメインのその受容体への到達性の最良な遮蔽が達成されたことで、Ｄ２ドメインの全身性の結合（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）が低減され、その一方で、血行中でのＶｉｔｏＫｉｎｅの安定性が維持され、目的患部で特定のプロテアーゼと遭遇してからの効率的な切断が可能となった。「ＶｉｔｏＫｉｎｅ」の設計はまた、サイトカイン類とそれらのコグネイト受容体との分子間相互作用の知見に基づいて合理的に進められた。サイトカイン受容体は、典型的には、２～４つの受容体サブユニットからなるオリゴマー複合体として機能する。これらの異なるサブユニットが、リガンド結合やシグナル伝達などの特殊化された機能を実行する。サイトカイン受容体のαサブユニットは結合用の受容体であって、リガンド特異性を付与し、シグナル伝達用の受容体とのリガンド相互作用を強化し、シグナル伝達用受容体を低親和性から高親和性へと変換するものである。ＶｉｔｏＫｉｎｅのＤ３ドメインは、すなわち、Ｄ２ドメインのコグネイトな結合性受容体であることが好ましい。切断後は、Ｄ３ドメインは解離してもＤ２ドメインと再会合し、局所的にＤ２ドメインの結合性とシグナル伝達活性を完全に回復させ得る。すなわち、Ｄ３ドメインは、Ｄ２ドメインの機能制御において二重の役割を有する場合がある。Ｄ３ドメインは、ＶｉｔｏＫｉｎｅが不活性化状態である場合はＤ２ドメインを不活性に保っており、ＶｉｔｏＫｉｎｅが切断され活性化されるとＤ２機能に関与し得る。しかし、Ｄ３ドメインは、Ｄ２の活性を遮蔽することができる、任意のタンパク質、ペプチド、抗体、抗体断片、またはポリマーまたはヌクレオチドとすることができる。
別の態様において、Ｄ３ドメインの付加により、ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体の開発適合性プロファイルが大きく改善され、発現収率が増強され、凝集傾向が低減される結果も得られ得る。
Ｄ１ドメインは、Ｄ２ドメインの機能活性を遮蔽する付加ドメインとして機能することに加えて、ＶｉｔｏＫｉｎｅの循環中半減期を延長させる半減期延長ドメインであり得る。Ｄ１ドメインは、ＶｉｔｏＫｉｎｅを特異的に目的部位に導く疾患ターゲティングモチーフまたは組織ターゲティングモチーフでもあり、ＶｉｔｏＫｉｎｅの活性化が局所に限定することで、治療指数をさらに向上させ得る。従って、「ＶｉｔｏＫｉｎｅ」プラットフォームは、目的部位におけるサイトカインの選択的な活性化を可能とし、全身毒性を低減させる一方で、患部における治療効果を増大させて、治療指数を向上させるという利点がある。
ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体のＤ２ドメインは活性部分ではあるが、患部組織で発現上昇しているプロテアーゼにより局所的な活性化を受けるまでは不活性状態を維持するため、これにより、当該活性部分が周辺の、または患部以外の細胞もしくは組織の細胞表面上の受容体に結合することが制限され、その経路の過剰な活性化が抑制され、望ましくない「オンターゲット」であるが「標的組織外に対する」毒性が低減される。さらに、プロテアーゼによる活性化前にＶｉｔｏＫｉｎｅ活性部分が不活性であることで、抗原シンクの可能性が大きく減少するため、生体内半減期が延長し、体内分布、治療目標部位における生物学的利用能および有効性が改善される結果となる。さらに、本発明に基づいて、ＶｉｔｏＫｉｎｅプラットフォームは、コグネイトな受容体αをＤ３ドメインとして使用した場合などで、発現レベルの向上および凝集傾向の低減を含むがこれらに限定はされない、タンパク質の開発適合性プロファイルを強化し得る。
切断可能な結合は、大部分のＶｉｔｏＫｉｎｅにとって、全身的な活性化を制限し、投与後に目的部位で活性ドメインを遊離するのに好ましいが、薬理学的に活性なＶｉｔｏＫｉｎｅの持続的な全身暴露を可能とし、治療効果を向上させるために、切断不可なリンカーが望ましい場合がある。
例示的な実施形態において、ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体は、ＩＬ－１５をベースとした、ＩＬ－１５バリアントをベースとした、ＩＬ－２をベースとした、またはＩＬ－２バリアントをベースとした、活性部分（Ｄ２）を含む。これらのＩＬ－１５をベースとしたＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体および／またはＩＬ－２をベースとしたＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体において、各サイトカインに対する受容体のユニークな非シグナル伝達性αサブユニットは、プロテアーゼ切断可能なリンカーを介して遮蔽部分ドメイン（Ｄ３）の１つとして用いられ、サイトカイン活性を可逆的に遮蔽する。各受容体複合体の対照的な特性、およびＶｉｔｏＫｉｎｅ分子によって治療されることが企図される各種疾患適応症の種々の要件に基づいて、遮蔽性αサブユニットは、プロテアーゼによるリンカーの切断後に非共有結合的な会合を通じて活性化型サイトカインと複合体形成することが好ましい場合もあれば（例えば、ＩＬ－１５の場合）、解離することが好ましい場合もある（例えば、選択的増殖中のＴｒｅｇ細胞におけるＩＬ－２の場合）。結果として、そのコグネイトなサイトカインに対する結合親和性を調節するためのα－受容体のアミノ酸修飾が必要になる場合がある。
目的の治療部位で活性化されるまで、その機能活性を遮蔽する活性化可能リンカーを介して、コグネイトな受容体、タンパク質、抗体、抗体断片、結合性ペプチドをサイトカインに結合させておくというこのコンセプトは、種々のサイトカイン、例えば、限定はされないが、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－２２、ＩＬ－２３、およびＴＧＦβ、ＣＸＣＲ３などのケモカイン、またはＴＮＦファミリー、ＴＧＦαおよびＴＧＦβなどの種々の増殖因子、並びにホルモンに合わせることができる。患部に対するターゲティングの強化を達成し、治療的有用性を広げるために、同じコンセプトを他のタンパク質に適用してプロタンパク質を作製することもできる。
定義
本明細書において、「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は同義的に使用されており、アミノ酸残基のポリマーを指している。種々の実施形態において、「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」は、α炭素同士がペプチド結合を通じて連結されているアミノ酸鎖である。鎖の一方の末端（アミノ末端）の末端アミノ酸はすなわち遊離アミノ基を有しており、一方、鎖の他方の末端（カルボキシ末端）の末端アミノ酸は遊離カルボキシル基を有している。本明細書で使用される場合、用語「アミノ末端」（Ｎ末端と省略）は、ペプチドのアミノ末端のアミノ酸上の遊離α－アミノ基を指すか、あるいは、ペプチド内の任意の他の場所のアミノ酸のα－アミノ基（ペプチド結合に参加している場合のアミノ基）を指す。同様に、用語「カルボキシ末端」（Ｃ末端と省略）は、ペプチドのカルボキシ末端の遊離カルボキシル基、またはペプチド内の任意の他の場所のアミノ酸のカルボキシル基を指す。ペプチドは、実質的に任意のポリアミノ酸も包含し、ペプチド模倣薬が挙げられるがこれに限定はされず、例えば、アミノ酸同士がアミド結合ではなくエーテルによって連結されているものなどである。
本開示のポリペプチドは、例えば、（１）タンパク質分解に対する感受性の低減、（２）酸化に対する感受性の低減、（３）タンパク質複合体形成を目的とした結合親和性の変化、（４）結合親和性の変化、および、（５）他の物理化学的特性または機能特性の付与または改変など、いかなる方法およびいかなる理由で改変されたポリペプチドも包含する。
アミノ酸の「置換」とは、本明細書で使用される場合、親ポリペプチド配列内の特定位置のあるアミノ酸の、異なるアミノ酸との、ポリペプチドにおける置換を指す。アミノ酸置換は、当該技術分野において周知の遺伝学的手法または化学的手法を用いて生じさせることができる。例えば、天然配列に（例えば、分子間接触を形成しているドメインの外側のポリペプチド部分に）、単一のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）がなされていてもよいし、複数のアミノ酸置換がなされていてもよい。「保存的アミノ酸置換」とは、ポリペプチド内の、あるアミノ酸の、機能的に類似したアミノ酸との置換を指す。下記の６つのグループはそれぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含んでいる：
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、およびスレオニン（Ｔ）
２）アスパラギン酸（Ｄ）、およびグルタミン酸（Ｅ）
３）アスパラギン（Ｎ）、およびグルタミン（Ｑ）
４）アルギニン（Ｒ）、およびリジン（Ｋ）
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、およびバリン（Ｖ）
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、およびトリプトファン（Ｗ）
「非保存的アミノ酸置換」とは、これらのクラスの１つの構成要素の別のクラスの構成要素への置換を指す。そのような変化を起こす際、種々の実施形態においては、アミノ酸の疎水性親水性指標が考慮される場合がある。各アミノ酸には、その疎水性および電荷特性に基づいて、疎水性親水性指標が割り振られている。それぞれの疎水性親水性指標は以下である、イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（－０．４）；トレオニン（－０．７）；セリン（－０．８）；トリプトファン（－０．９）；チロシン（－１．３）；プロリン（－１．６）；ヒスチジン（－３．２）；グルタミン酸（－３．５）；グルタミン（－３．５）；アスパラギン酸（－３．５）；アスパラギン（－３．５）；リジン（－３．９）；およびアルギニン（－４．５）。
タンパク質に相互作用的な生物学的機能を付与する際のアミノ酸疎水性親水性指標の重要性は、当該技術分野においては理解されているところである（例えば、Ｋｙｔｅら、１９８２年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１５７：１０５－１３１を参照）。ある特定のアミノ酸を、同様の疎水性親水性指標または疎水性親水性スコアを有する他のアミノ酸に置換しても、同様の生物活性が保持され得ることが知られている。疎水性親水性指標に基づいて変化を起こす際、種々の実施形態においては、両者の疎水性親水性指標が±２以内であるアミノ酸同士の置換が含まれる。種々の実施形態においては±１以内のものが含まれ、種々の実施形態においては±０．５以内のものが含まれる。
また、特に、このように作製された生物学的な機能を持つタンパク質またはペプチドの、本明細書において開示される免疫学的な実施形態での使用が意図されている場合、類似アミノ酸同士の置換は、親水性に基づくことで、効率的に為すことができると、当該技術分野では理解されている。種々の実施形態において、隣接アミノ酸の親水性によって制御される、タンパク質の局所的な平均親水性の最大値は、その免疫原性および抗原性と相関しており、すなわち、当該タンパク質の生物学的特性と相関している。
下記の親水性値がこれらのアミノ酸残基に割り振られている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０．＋－．１）；グルタミン酸（＋３．０．＋－．１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（－０．４）；プロリン（－０．５．＋－．１）；アラニン（－０．５）；ヒスチジン（－０．５）；システイン（－１．０）；メチオニン（－１．３）；バリン（－１．５）；ロイシン（－１．８）；イソロイシン（－１．８）；チロシン（－２．３）；フェニルアラニン（－２．５）、およびトリプトファン（－３．４）。同様の親水性値に基づいた変化を起こす際、種々の実施形態においては、親水性値が±２以内であるアミノ酸同士の置換が含まれ、種々の実施形態においては±１以内のものが含まれ、種々の実施形態においては±０．５以内のものが含まれる。
例示的なアミノ酸置換を表１に記載する。
Figure 0007477885000001
当業者であれば、周知の手法を用いて、本明細書に記載されているポリペプチドの好適なバリアントを決定することができる。種々の実施形態において、当業者は、活性に重要であるとは考えられていない領域を標的とすることにより、活性を破壊することなく変化を起こすことができる、上記分子の好適な領域を、特定することができる。他の実施形態において、当業者は、類似ポリペプチド間で保存されている、上記分子の残基および部分を特定することができる。さらなる実施形態においては、生物活性または構造にとって重要であり得る領域でさえも、生物活性を破壊することも、ポリペプチド構造に悪影響を与えることもなく、保存的アミノ酸置換を起こすことができる。
さらに、当業者は、活性または構造にとって重要な類似ポリペプチド内の残基を特定する構造・機能研究を調査することができる。そのような比較を考慮に入れて、当業者は、類似ポリペプチドの活性または構造にとって重要なアミノ酸残基に対応する、ポリペプチド内のアミノ酸残基の重要性を予測することができる。当業者は、そのような予測された重要アミノ酸残基のために、化学的に類似したアミノ酸置換を選択することができる。
また、当業者は、三次元構造およびアミノ酸配列を、類似ポリペプチドの当該構造と関連させて解析することができる。そのような情報に照らして、当業者は、その三次元構造に関して、ポリペプチドのアミノ酸残基の並びを予測することができる。種々の実施形態において、当業者は、ポリペプチドの表面上に存在すると予測されたアミノ酸残基に、このような残基は他の分子との重要な相互作用に関与している場合があるため、根本的な変化が生じないように、選択を行うことができる。さらに、当業者は、所望のアミノ酸残基のそれぞれに単一のアミノ酸置換を含む試験バリアントを作製することができる。その後、当業者に公知の活性定量法を用いて、バリアントのスクリーニングを行うことができる。そのようなバリアントを用いることで、好適なバリアントに関する情報を集めてもよい。例えば、特定のアミノ酸残基への変化が活性の破壊、活性の好ましくない低減、または不適切な活性をもたらすことが分かった場合、そのような変化を有するバリアントを避けることができる。言い換えれば、そのような通例の実験から集められた情報に基づいて、当業者は、単独または他の変異と組み合わせた、さらなる置換が避けられるべきアミノ酸を容易に確認することができる。
用語「ポリペプチド断片」および「切断型ポリペプチド」とは、本明細書で使用される場合、対応する完全長タンパク質と比較して、アミノ末端および／またはカルボキシ末端に欠失を有するポリペプチドを指す。種々の実施形態において、断片は、例えば、５以上、１０以上、２５以上、５０以上、１００以上、１５０以上、２００以上、２５０以上、３００以上、３５０以上、４００以上、４５０以上、５００以上、６００以上、７００以上、８００以上、９００以上、または１０００以上のアミノ酸長とすることができる。種々の実施形態において、断片は、例えば、１０００以下、９００以下、８００以下、７００以下、６００以下、５００以下、４５０以下、４００以下、３５０以下、３００以下、２５０以下、２００以下、１５０以下、１００以下、５０以下、２５以下、１０以下、または５以下のアミノ酸長ともすることができる。断片には、その一方または両方の末端に、１または複数の追加のアミノ酸をさらに含ませることができ、例えば、異なる天然タンパク質由来のアミノ酸配列（例えば、Ｆｃまたはロイシンジッパードメイン）または人工アミノ酸配列（例えば、人工リンカー配列）を含ませることができる。
「ポリペプチドバリアント」、「ハイブリッドポリペプチド」、および「ポリペプチド変異体」という用語は、本明細書で使用される場合、別のポリペプチド配列と比較して、１または複数のアミノ酸残基がアミノ酸配列に挿入されている、１または複数のアミノ酸残基がアミノ酸配列から欠失している、且つ／または、１または複数のアミノ酸残基がアミノ酸配列中に置換されている、アミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。種々の実施形態において、挿入、欠失、または置換されているアミノ酸残基の数は、例えば、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２２５、少なくとも２５０、少なくとも２７５、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、または少なくとも５００のアミノ酸長とすることができる。本開示のハイブリッドは融合タンパク質を包含する。
ポリペプチドの「誘導体」とは、化学的に修飾されたポリペプチドであって、例えば、ポリエチレングリコール、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）などの別の化学的部分への結合、リン酸化、およびグリコシル化などである。
本明細書において、用語「％配列同一性」は、用語「％同一性」と同義的に使用されており、配列アラインメント用プログラムを用いてアラインメントされた場合の、２以上のペプチド配列間のアミノ酸配列同一性の値、または２以上のヌクレオチド配列間のヌクレオチド配列同一性の値を指す。例えば、本明細書で使用される場合、８０％同一性は、規定のアルゴリズムで測定された８０％配列同一性と同じことを意味し、所与の配列が別の長さの別の配列に対して少なくとも８０％の同一性を有することを意味している。種々の実施形態において、％同一性は、所与の配列に対しての、例えば、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％、またはそれ以上の配列同一性から選択される。種々の実施形態において、％同一性は、例えば、約６０％～約７０％、約７０％～約８０％、約８０％～約８５％、約８５％～約９０％、約９０％～約９５％、または約９５％～約９９％の範囲内である。
本明細書において、用語「％配列相同性」は、用語「％相同性」と同義的に使用されており、配列アラインメント用プログラムを用いてアラインメントされた場合の、２以上のペプチド配列間のアミノ酸配列相同性の値、または２以上のヌクレオチド配列間のヌクレオチド配列相同性の値を指す。例えば、本明細書で使用される場合、８０％相同性は、規定のアルゴリズムで測定された８０％配列相同性と同じことを意味し、すなわち、所与の配列の相同体は所与の配列のある長さに亘って８０％超の配列相同性を有する。種々の実施形態において、％相同性は、所与の配列に対しての、例えば、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％、またはそれ以上の配列相同性から選択される。種々の実施形態において、％相同性は、例えば、約６０％～約７０％、約７０％～約８０％、約８０％～約８５％、約８５％～約９０％、約９０％～約９５％、または約９５％～約９９％の範囲内である。
２つの配列間の同一性を確認するために用いることができる例示的なコンピュータプログラムとしては、ＮＣＢＩウェブサイトにおいてインターネット上で一般に入手可能な一連のＢＬＡＳＴプログラム、例えば、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ、およびＴＢＬＡＳＴＸ、ＢＬＡＳＴＰおよびＴＢＬＡＳＴＮ、が挙げられるが、これらに限定はされない。また、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５巻：頁４０３－１０、１９９０年（公表された初期設定、すなわち、パラメーターｗ＝４、パラメーターｔ＝１７、に特に関連して）、およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５巻：頁３３８９－３４０２、１９９７年を参照されたい。ＧｅｎＢａｎｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓや他の公開データベースのアミノ酸配列と比較して所与のアミノ酸配列を評価する場合、配列検索は通常、ＢＬＡＳＴＰプログラムを用いて行う。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、ＧｅｎＢａｎｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓや他の公開データベースのアミノ酸配列に対して、全ての読み取り枠で翻訳された核酸配列の検索に好ましい。オープンギャップペナルティ＝１１．０、ギャップ伸長ペナルティ＝１．０という初期パラメーターを用いて、ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＸの両方を実行し、ＢＬＯＳＵＭ－６２行列を利用する。
パーセント配列同一性の算出に加え、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計解析も行う（例えば、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０巻：頁５８７３－５７８７、１９９３年を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性尺度の１つとして、最小和確率（ｓｍａｌｌｅｓｔ ｓｕｍ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）（Ｐ（Ｎ））があり、これは、２つのヌクレオチド配列間または２つのアミノ酸配列間で一致が偶然に生じる確率を示す。例えば、試験核酸を参照核酸と比較した場合の最小和確率が、例えば、約０．１未満、約０．０１未満、または約０．００１未満である場合、核酸は参照配列に類似しているとみなされる。
用語「修飾」とは、本明細書で使用される場合、ペプチド骨格（例えばアミノ酸配列）の任意の操作またはポリペプチドの翻訳後修飾（例えばグリコシル化）を指す。
用語「ノブ・イントゥ・ホール修飾（ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」とは、本明細書で使用される場合、ＣＨ３ドメインにおける、２つの免疫グロブリン重鎖間の境界面内の修飾を指す。１つの実施形態において、「ノブ・イントゥ・ホール修飾」は、一方の抗体重鎖にはアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗと所望によりアミノ酸置換Ｓ３５４Ｃとを含み、他方の抗体重鎖にはアミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖと、所望によりＹ３４９Ｃとを含む。ノブ・イントゥ・ホール技術は、米国特許第５，７３１，１６８号；米国特許第７，６９５，９３６号；Ｒｉｄｇｗａｙら、Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ、９巻、頁６１７－６２１（１９９６年）、およびＣａｒｔｅｒ、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ、２４８巻、頁７－１５（２００１年）などで説明されている。
用語「生理活性化薬剤」または「ＶｉｔｏＫｉｎｅ」とは、本明細書で使用される場合、薬剤前駆体である化合物であって、対象への投与後、当該生理活性化薬剤が標的組織に対して活性を持つ生成物に変換されるようないくつかの化学的または生理的過程を介して、当該薬剤を生体内で放出する、化合物を意味する。生理活性化薬剤は、生体内活性化を受けた後にその薬理作用を示す任意の化合物である。すなわち、生理活性化薬剤は、親分子の望ましくない特性を変化または取り除くために一過的に用いられる特殊な無毒性保護基を含む薬剤と見なすことができる。
用語「融合タンパク質」とは、本明細書で使用される場合、元は別々のタンパク質をコードしていた２以上の遺伝子を含む融合ポリペプチド分子であって、その構成成分は、直接またはペプチドリンカーを介して、ペプチド結合で互いに連結されている、融合ポリペプチド分子を指す。用語「融合した」とは、本明細書で使用される場合、構成成分が、直接または１もしくは複数のペプチドリンカーを介して、ペプチド結合で連結されていることを指す。
「リンカー」とは、共有結合的に、またはイオン結合、ファンデルワールス結合、もしくは水素結合を通じて、２つの他分子を連結する分子のことをいい、例えば、ある相補的配列の５’末端にハイブリダイズし、さらに、別の相補的配列の３’末端にハイブリダイズすることで、２つの非相補的配列を連結する核酸分子である。「切断可能なリンカー」とは、切断可能なリンカーによって連結されている２つの成分を分離するために、分解、消化、または他の方法による切断が可能なリンカーを指す。切断可能なリンカーは一般的には酵素によって切断され、典型的にはペプチダーゼ、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、リパーゼなどによって切断される。切断可能なリンカーは、例えば温度変化、ｐＨ変化、塩濃度変化などの、環境要因によって切断される場合もある。
用語「ペプチドリンカー」とは、本明細書で使用される場合、１または複数のアミノ酸、典型的には１～３０個程度のアミノ酸、を含むペプチドを指す。ペプチドリンカーは、当該技術分野において公知のものか、本明細書に記載のものである。好適な非免疫原性のリンカーペプチドとしては、（Ｇ４Ｓ）ｎペプチドリンカー、（ＳＧ４）ｎペプチドリンカー、またはＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーなどが挙げられる。「ｎ」は通常は１～１０の数字であり、典型的には２～４の数字である。
「医薬組成物」は、動物における製薬学的用途において好適な組成物を指す。医薬組成物は、薬理学的有効量の活性薬剤と、薬剤的に許容できる担体と、を含む。「薬理学的有効量」とは、意図された薬理学的結果を得るのに有効な薬剤量を指す。「薬剤的に許容できる担体」とは、任意の標準的な医薬担体、溶媒、緩衝液、および医薬品添加物を指し、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、５％ブドウ糖水溶液、水中油型エマルションまたは油中水型エマルションなどのエマルション、並びに、様々な種類の湿潤剤および／または補助剤などである。好適な医薬担体および製剤については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第２１版、２００５年、マック出版社（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ）、イーストン、に記載がある。「薬剤的に許容できる塩」は、製薬学的用途で化合物に配合できる塩であり、例えば、金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩など）、アンモニア塩、有機アミン塩が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「治療」（および「治療する」や「治療すること」などのその文法的変形語）は、治療を受けている個体における病気の自然経過を変化させるための臨床的介入を指し、予防のために実施することもできるし、臨床病理の経過中に実施することもできる。望ましい治療効果としては、疾患の発生または再発の予防、症状の緩和、疾患の任意の直接的または間接的な病理的帰結の低減、転移の予防、疾患増悪速度の減少、病状の改善または軽減、および寛解または予後の改善が挙げられるが、これらに限定はされない。本明細書で使用される場合、疾患、障害、または状態を「軽減する」とは、当該疾患、障害、または状態の症状の重症度および／または発生頻度を低減させることを意味する。さらに、本明細書における「治療」に関する記載は、治癒的、対症的および予防的な治療に関する記載を包含する。
「有効量」または「治療有効量」という用語は、本明細書で使用される場合、その症状の１または複数を改善、緩和、軽減、および／または遅延するなど、特定の障害、状態、または疾患を治療するのに十分な化合物または組成物の量を指す。がん、または他の望ましくない細胞の増殖に関して、有効量は、以下に十分な量を含む：（ｉ）がん細胞数の減少；（ｉｉ）腫瘍サイズの減少；（ｉｉｉ）末梢器官へのがん細胞浸潤の阻害、遅滞、ある程度の減速、好ましくは停止；（ｉｖ）腫瘍転移の阻害（すなわち、ある程度の減速、好ましくは停止）；（ｖ）腫瘍増殖の阻害；（ｖｉ）腫瘍の発生および／もしくは再発の抑制または遅延；並びに／または、（ｖｉｉ）がんと関連した症状のうちの１もしくは複数のある程度の軽減。有効量は、一回または複数回の投与で投与することができる。
「投与する」または「投与させる（ｃａｕｓｅ ｔｏ ｂｅ ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ）」という表現は、当該の薬剤／化合物の患者への投与を管理および／または許可する、医療専門家（例えば、医師）、または患者の医学的ケアを管理する人、によって行われる行為を指す。投与させることには、診断、および／または適切な治療レジメンの決定、および／または患者への特定の薬剤／化合物の処方が含まれ得る。このような処方は、例えば、処方箋書式の草案、医療記録の注釈などを包含し得る。投与が本明細書に記載されている場合、「投与させること」も企図される。
用語「患者」、「個体」、および「対象」は、同義的に使用されている場合があり、哺乳動物を指し、ヒトまたはヒト以外の霊長類が好ましいが、家畜化された哺乳類（例えば、イヌまたはネコ）、実験用の哺乳類（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット）、および農業用の哺乳類（例えば、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ）を指す場合もある。種々の実施形態において、患者は、病院、精神科医療施設で医師もしくは他の医療従事者の治療を受けている、外来患者としての、または他の臨床状況下の、ヒト（例えば、成人男性、成人女性、青年期男性、青年期女性、男児、女児）とすることができる。種々の実施形態において、患者は、免疫無防備状態の患者または免疫系が弱まった患者としてもよく、例えば、原発性免疫不全症患者、エイズ患者；ある特定の免疫抑制剤を服用しているがん患者および移植患者；並びに、免疫系に影響を及ぼす遺伝病（例えば、先天性無ガンマグロブリン血症、先天性ＩｇＡ欠損症）を有する患者が挙げられるが、これらに限定はされない。種々の実施形態において、患者は免疫原性のがんを有しており、例えば、膀胱がん、肺がん、黒色腫、および変異率が高いと報告されている他のがん（Ｌａｗｒｅｎｃｅら、Ｎａｔｕｒｅ、４９９巻（７４５７号）：頁２１４－２１８、２０１３年）が挙げられるが、これらに限定はされない。
用語「免疫療法」とは、がん治療のことをいい、例えば、特定の腫瘍抗原に対する枯渇抗体を用いた治療；抗体薬物複合体を用いた治療；共刺激分子または共抑制分子（免疫チェックポイント）、例えば、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、ＣＤ４０、ＯＸ－４０、ＣＤ１３７、ＧＩＴＲ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ－３、ＳＩＲＰａ、ＣＤ４７、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、Ｓｉｇｌｅｃ７、Ｓｉｇｌｅｃ８、Ｓｉｇｌｅｃ９、Ｓｉｇｌｅｃ１５、およびＶＩＳＴＡ、ＣＤ２７６、ＣＤ２７２、ＴＩＭ－３、Ｂ７－Ｈ４、に対するアゴニスト抗体、アンタゴニスト抗体、または阻止抗体を用いた治療；ブリナツモマブなどの二重特異性Ｔ細胞誘導抗体（ＢｉＴＥ（登録商標））を用いた治療：生物学的応答調節物質、例えばＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、およびＩＦＮ－γ、ＴＧＦ－βアンタゴニストまたはＴＧＦ－βトラップの投与を含む治療；シプロイセルＴなどの治療用ワクチンを用いた治療；Ｔ－ｖｅｃなどの腫瘍溶解性ウイルスを含むがこれらに限定はされない治療用ウイルスを用いた治療；樹状細胞ワクチン、または腫瘍抗原ペプチドもしくはネオアンチゲンワクチンを用いた治療；ＮＫ細胞を用いた治療；キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）－Ｔ細胞を用いた治療；ＣＡＲ－ＮＫ細胞を用いた治療；ＤＣまたはＴ細胞を用いた治療；ｉＰＳ誘導ＮＫ細胞を用いた治療；ｉＰＳ誘導Ｔ細胞を用いた治療、およびカルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）などのワクチンを用いた治療；腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を用いた治療；養子移植抗腫瘍Ｔ細胞（生体外で増殖された且つ／またはＴＣＲトランスジェニックの細胞）を用いた治療；ＴＡＬＬ－１０４細胞を用いた治療；並びに、免疫刺激剤、例えば、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストＣｐＧ、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、およびイミキモドを用いた治療。
「抵抗性または難治性のがん」とは、化学療法、外科手術、放射線療法、幹細胞移植、および免疫療法などをはじめとするこれまでの抗がん治療には反応しない腫瘍細胞またはがんを指す。腫瘍細胞は、治療開始時から抵抗性または難治性である可能性もあるし、治療の中で抵抗性または難治性になる場合もある。難治性の腫瘍細胞には、治療の開始に反応しない、または、短期間の初期反応は示すが、治療に反応はしない、腫瘍が含まれる。難治性の腫瘍細胞には、抗がん治療による治療に反応するが、その後引き続く治療には反応しない腫瘍も含まれる。本発明の目的上、難治性の腫瘍細胞は、抗がん療法による治療で阻害されたように見えたが、治療の中止後に５年以内、場合によっては１０年以内、またはそれ以上の期間以内に再発する腫瘍も包含する。抗がん治療では、化学療法剤単独、放射線単独、標的療法単独、外科手術単独、またはこれらの組み合わせが使用できる。説明の簡略化のためであり、限定を目的としたものではないが、上記の難治性腫瘍細胞は抵抗性腫瘍と交換可能であると理解されたい。
用語「腫瘍関連抗原」（ＴＡＡ）とは、例えば、がん細胞によって選択的に発現される、または大部分の正常細胞と比較してがん細胞において過剰発現される、細胞表面抗原を指す。「ＴＡＡバリアント」および「ＴＡＡ変異体」という用語は、本明細書で使用される場合、別のＴＡＡ配列と比較して、１または複数のアミノ酸残基がアミノ酸配列に挿入されている、１または複数のアミノ酸残基がアミノ酸配列から欠失している、且つ／または、１または複数のアミノ酸残基がアミノ酸配列中に置換されている、アミノ酸配列を含むＴＡＡを指す。種々の実施形態において、挿入、欠失、または置換されているアミノ酸残基の数は、例えば、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２２５、少なくとも２５０、少なくとも２７５、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、または少なくとも５００のアミノ酸長とすることができる。
用語「ネオアンチゲン」とは、例えば、免疫系が以前に暴露されたことがない細胞表面抗原、特に、がん細胞によって選択的に発現されている、または大部分の正常細胞と比較してがん細胞で過剰発現されている、放射線、化学療法、ウイルス感染、腫瘍形質転換／変異、薬物代謝などによる宿主抗原の変化によって生じる細胞表面抗原を指す。
用語「抗体」とは、本明細書で使用される場合、最も広い意味で用いられ、種々の抗体構造（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）を包含し、例えば、モノクローナル抗体と、ポリクローナル抗体と、多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体または二機能性抗体）と、目的の抗原結合活性を示す限りにおいて抗体断片と、が挙げられるがこれらに限定はされない。
用語「抗体断片」とは、本明細書で使用される場合、インタクト抗体の一部を含むインタクト抗体以外の分子であって、当該インタクト抗体が結合する抗原と結合する、分子を指す。抗体断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆａｂ′－ＳＨ、Ｆ（ａｂ′）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）、およびシングルドメイン抗体が挙げられるが、これらに限定はされない。
用語「Ｆａｂ断片」とは、本明細書で使用される場合、軽鎖のＶＬドメインおよび定常ドメイン（ＣＬ）と、重鎖のＶＨドメインおよび第一定常ドメイン（ＣＨ１）と、を含む、免疫グロブリン断片を指す。
「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、本明細書で使用される場合、免疫グロブリンまたは抗体の重鎖もしくは軽鎖のドメインであって、通常、当該免疫グロブリンまたは抗体の抗原への結合に関与するドメインを指す。免疫グロブリンまたは抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨおよびＶＬ）は、通常は同様の構造を有し、各ドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）と、を含む。
「ヒト免疫グロブリン」は、本明細書で使用される場合、ヒトもしくはヒト細胞によって産生される、または、ヒト免疫グロブリンレパートリーもしくは他のヒト免疫グロブリンコード配列を利用するヒト以外の供給源に由来する、免疫グロブリンのアミノ酸配列と一致するアミノ酸配列を有するものである。このヒト免疫グロブリンの定義は、非ヒト抗原結合性残基を含むヒト型化免疫グロブリンを明確に除外している。
「Ｆｃドメイン」または「Ｆｃ領域」という用語は、本明細書で使用される場合、定常領域の一部を少なくとも含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を規定するために使用される。この用語はネイティブ配列のＦｃ領域とバリアントＦｃ領域とを包含する。ＩｇＧのＦｃ領域はＩｇＧのＣＨ２ドメインとＩｇＧのＣＨ３ドメインとから構成される。ＣＨ３領域は、本明細書においては、ネイティブ配列のＣＨ３ドメインである場合と、バリアントＣＨ３ドメイン（例えば、その一方の鎖に「凸部」（「ノブ」）が導入され、そのもう一方の鎖に対応する「凹部」（「ホール」）が導入された、ＣＨ３ドメイン；参照によって本明細書に明確に援用される、米国特許第５，８２１，３３３号を参照）である場合がある。このようなバリアントＣＨ３ドメインを用いることで、本明細書に記載されているような２つの同一でない免疫グロブリン重鎖のヘテロ二量体化が促進され得る。本明細書においては特に記載がない限り、Ｆｃ領域または定常領域でのアミノ酸残基の番号付けは、ＥＵ付番方式に従うものとする。
用語「エフェクター機能」とは、本明細書で使用される場合、免疫グロブリンのＦｃ領域に起因する生物活性を指し、免疫グロブリンのアイソタイプによって異なる。免疫グロブリンのエフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑとの結合による補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体との結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体を介した抗原取り込み、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の発現低下、およびＢ細胞活性化が挙げられる。
「制御性Ｔ細胞」または「Ｔｒｅｇ細胞」という用語、本明細書で使用される場合、他のＴ細胞（エフェクターＴ細胞）の反応を抑制できる、特殊な種類のＣＤ４＋Ｔ細胞を意味する。Ｔｒｅｇ細胞は、ＣＤ４、ＩＬ－２ 受容体のａサブユニット（ＣＤ２５）、および転写因子であるフォークヘッドボックスＰ３（ＦＯＸＰ３）の発現を特徴としており（Ｓａｋａｇｕｃｈｉ、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２２巻、頁５３１－６２（２００４年））、腫瘍によって発現されたものを包含する抗原に対する末梢性自己寛容の誘導と維持において決定的役割な役割を果たす。
用語「通常ＣＤ４＋Ｔ細胞」とは、本明細書で使用される場合、制御性Ｔ細胞以外のＣＤ４＋Ｔ細胞を意味する。
用語「Ｔｒｅｇ細胞の選択的活性化」とは、本明細書で使用される場合、他のＴ細胞サブセット（ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞など）、またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性化を基本的に伴わない、Ｔｒｅｇ細胞の活性化を意味する。実施例で、これらの細胞型を同定・区別するための方法を説明している。活性化には、ＩＬ－２受容体シグナリングの誘導（リン酸化ＳＴＡＴ５ａの検出などにより測定）、増殖の誘導（Ｋｉ－６７の検出などにより測定）、および／または、活性化マーカーの発現の上方制御（例えばＣＤ２５など）が含まれる場合がある。
本明細書で使用される場合、「特異的結合」とは、結合が抗原に対して選択的であることを意味し、望ましくないまたは非特異的な相互作用とは区別できる。免疫グロブリンの特異的抗原に対する結合能は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、または表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法などの当業者に周知の他の方法を通じて測定できる。
「親和性」または「結合親和性」という用語は、本明細書で使用される場合、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合的な相互作用の総合計強度を指す。一般的に、分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は解離定数（ＫＤ）で表すことができ、ＫＤは解離速度定数と会合速度定数（それぞれｋｏｆｆおよびｋｏｎ）の比である。親和性を測定するための特定の方法として、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）がある。
用語「結合性の減少」とは、本明細書で使用される場合、ＳＰＲなどで測定された場合の、それぞれの相互作用における、親和性の減少を指す。逆に、「結合性の増加」とは、それぞれの相互作用における、結合親和性の増加を指す。
用語「ポリマー」とは、本明細書で使用される場合、通常、ホモポリマー；例えば、ブロックコポリマー、グラフトコポリマー、ランダムコポリマー、および交互コポリマーなどのコポリマー；並びにターポリマー；並びにこれらの混合物および修飾物を包含するが、これらに限定はされない。さらに、特に限定されていない限り、用語「ポリマー」は、その物質の全ての可能な幾何学的立体配置を包含するものとする。これらの立体配置は、アイソタクチックな対称性、シンジオタクチックな対称性、およびランダムな対称性を包含するが、これらに限定はされない。
「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチド単位から構成される重合体を指す。ポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）およびリボ核酸（「ＲＮＡ」）などの天然核酸だけでなく、核酸アナログも包含する。核酸アナログは、天然ホスホジエステル結合以外の他のヌクレオチドとの結合に参加しているヌクレオチドである非天然塩基を含むもの、ホスホジエステル結合以外の結合を通じて付加された塩基を含むもの、を包含する。すなわち、核酸アナログは、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロトリエステル、ホスホルアミダート、ボラノリン酸、メチルホスホン酸、キラル－メチルホスホン酸、２－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、ペプチド－核酸（ＰＮＡ）などを包含し、これらに限定はされない。このようなポリヌクレオチドは、自動ＤＮＡ合成装置などを用いて合成することができる。用語「核酸」は、通常、大型のポリヌクレオチドを指す。用語「オリゴヌクレオチド」は、通常は短いポリヌクレオチドを指し、通常は約５０ヌクレオチド以下である。ヌクレオチド配列がＤＮＡ配列（すなわち、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）で表されている場合、「Ｕ」が「Ｔ」と置き換わったＲＮＡ配列（すなわち、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）もこれに包含されることは理解されたい。
本明細書では従来の表示法を用いてポリヌクレオチド配列を記載している。一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側の末端が５’末端であり；二本鎖ポリヌクレオチド配列の左手方向を５’方向と称する。新生ＲＮＡ転写物への５’方向から３’方向へのヌクレオチド付加を転写方向と称する。ｍＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖を「コード鎖」と称し；ＤＮＡから転写されたｍＲＮＡと同じ配列を有し、ＲＮＡ転写物の５’末端の５’側に位置するＤＮＡ鎖上の配列を「上流配列」と称し；ＲＮＡと同じ配列を有し、コードＲＮＡ転写物の３’末端の３’側にあるＤＮＡ鎖上の配列を「下流配列」と称する。
「相補的」とは、位相幾何学的な適合性、すなわち、２つのポリヌクレオチドの相互作用し合う表面同士の一致性をいう。すなわち、この２つの分子は相補的と記載することができ、さらには、接触表面特徴が互いに相補的である。第一のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が第二のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド結合パートナーのヌクレオチド配列と実質的に同一である場合、または、第一のポリヌクレオチドがストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で第二のポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能である場合、第一のポリヌクレオチドは第二のポリヌクレオチドに相補的である。
「～に特異的にハイブリダイズすること」または「特異的なハイブリダイゼーション」または「～に選択的にハイブリダイズする」とは、核酸分子が、特定のヌクレオチド配列に対して、当該配列が混合物としての（例えば、全細胞）ＤＮＡまたはＲＮＡ中に存在している場合に、ストリンジェントな条件下で優先的に、結合、二本鎖形成、またはハイブリダイズすることを指す。用語「ストリンジェントな条件」とは、プローブが、その標的物質には優先的にハイブリダイズするが、他の配列に対してはより小さな程度にしかハイブリダイズしないか、または全くハイブリダイズしないであろう、条件を指す。サザンハイブリダイゼーションおよびノーザンハイブリダイゼーションなどの核酸ハイブリダイゼーション実験に関連して、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」および「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は、配列依存的であり、異なる環境パラメーター下では異なったものとなる。核酸のハイブリダイゼーションの詳細な手引きは、Ｔｉｊｓｓｅｎ、１９９３年、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ－－Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ、第Ｉ部、第２章、「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ」、エルゼビア社、ニューヨーク州；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、コールド・スプリング・ハーバー研究所、第３版、ニューヨーク州；および、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、グリーン・パブリッシング・アソシエート・アンド・ワイリー・インターサイエンス社（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ニューヨーク州に見出すことができる。
通常、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件および高度にストリンジェントな洗浄条件は、規定のイオン強度およびｐＨにおける特定の配列の融解温度（Ｔｍ）より５℃程度低くなるように選択される。Ｔｍは、標的配列の５０％が完全一致プローブにハイブリダイズする（規定のイオン強度およびｐＨ下での）温度である。非常にストリンジェントな条件は、特定のプローブのＴｍと同じになるように選択される。サザンブロットまたはノーザンブロットにおけるフィルター上の約１００超の相補的残基を有する相補的核酸同士のハイブリダイゼーションのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例は、５０％ホルマリン＋１ｍｇヘパリン、４２℃、一晩のハイブリダイゼーション実行である。高度にストリンジェントな洗浄条件の一例は、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、７２℃、約１５分である。ストリンジェントな洗浄条件の一例は、０．２×ＳＳＣ洗浄、６５℃、１５分である。ＳＳＣ緩衝液の説明については、Ｓａｍｂｒｏｏｋらを参照されたい。高度にストリンジェントな洗浄の前に、低度にストリンジェントな洗浄を行うことで、バックグラウンドのプローブシグナルを除去することができる。例えば約１００超のヌクレオチドの二本鎖に対する中程度にストリンジェントな洗浄の例は、１×ＳＳＣ、４５℃、１５分である。例えば約１００超のヌクレオチドの二本鎖に対する低度にストリンジェントな洗浄の例は、４～６×ＳＳＣ、４０℃、１５分である。通常、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおいて、無関係のプローブにおいて確認されたシグナル・ノイズ比の２倍（以上）のシグナル・ノイズ比が、特定のハイブリダイゼーションの検出を示す。
「プライマー」とは、指定のポリヌクレオチド鋳型に特異的にハイブリダイズし、相補的ポリヌクレオチドの合成開始点を与えることが可能な、ポリヌクレオチドを指す。このような合成は、ポリヌクレオチドプライマーが、合成が誘導される条件下に、すなわち、ヌクレオチド類と、相補的ポリヌクレオチド鋳型と、ＤＮＡポリメラーゼなどの重合用の物質と、の存在下に、置かれた場合に生じる。プライマーは典型的には一本鎖であるが、二本鎖であってもよい。プライマーは典型的にはデオキシリボ核酸であるが、幅広い種類の合成プライマーおよび天然プライマーが多くの適用で有用である。プライマーは鋳型に対して相補的であり、鋳型にハイブリダイズして合成開始部位として働くように設計されているが、鋳型の配列を厳密に反映している必要はない。このような場合の、鋳型に対するプライマーの特異的なハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシー次第である。プライマーは、発色性部分、放射性部分、または蛍光性部分などで標識でき、検出可能な部分として使用できる。
「プローブ」とは、ポリヌクレオチドを指して使用されている場合、別のポリヌクレオチドの指定の配列に特異的にハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドをいう。プローブは、標的の相補的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするものであるが、鋳型の相補的配列を厳密に反映している必要はない。このような場合の、標的に対するプローブの特異的なハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシー次第である。プローブは、発色性部分、放射性部分、または蛍光性部分などで標識でき、検出可能な部分として使用できる。プローブが相補的なポリヌクレオチドの合成開始点を与える場合、プローブをプライマーとすることもできる。
「ベクター」は、それに連結した別の核酸を細胞に導入するのに使用できるポリヌクレオチドである。ベクターの１種として「プラスミド」があるが、プラスミドとは、その中に追加の核酸セグメントを連結することができる、直鎖状または環状の二本鎖ＤＮＡ分子をいう。別の種類のベクターとしてウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、複製欠損アデノウイルス、および複製欠損アデノ随伴ウイルス）があり、このウイルスゲノムの中には追加のＤＮＡセグメントを導入することができる。ある特定のベクターは導入された宿主細胞内で自律増殖が可能である（例えば、細菌性複製開始点を含む細菌ベクターおよびエピソーム性の哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム性の哺乳類ベクター）は、宿主細胞内への導入後に宿主細胞のゲノムに組み入れられることで、宿主ゲノムと共に複製される。「発現ベクター」は選択されたポリヌクレオチドの発現を指示することができるベクターの一種である。
「制御配列」は、それが機能的に連結された核酸の発現（例えば、発現量、発現タイミング、または発現場所）に影響を与える核酸である。制御配列は、例えば、被制御核酸に対して直接、あるいは、１または複数の他の分子（例えば、当該制御配列および／または当該核酸に結合するポリペプチド）の作用を通じて、その効果を及ぼし得る。制御配列の例としては、プロモーター、エンハンサー、および他の発現調節エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）が挙げられる。制御配列のさらなる例が、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ、１９９０年、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８５巻、アカデミックプレス社、サンディエゴ、カリフォルニア州、およびＢａｒｏｎら、１９９５年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２３巻、頁３６０５－０６に記載されている。制御配列がヌクレオチド配列の発現（例えば、発現量、発現タイミング、または発現場所）に影響を及ぼしている場合、当該ヌクレオチド配列は当該制御配列に「機能的に連結」されていることになる。
「宿主細胞」は、本開示のポリヌクレオチドの発現に用いることができる細胞である。宿主細胞は原核生物とすることができ、例えば、大腸菌とすることができ、あるいは、宿主細胞は真核生物とすることができ、例えば、単細胞の真核生物（例えば、酵母または他の真菌）、植物細胞（例えば、タバコ植物細胞またはトマト植物細胞）、動物細胞（例えば、ヒト細胞、サル細胞、ハムスター細胞、ラット細胞、マウス細胞、または昆虫細胞）、またはハイブリドーマとすることができる。通常、宿主細胞は、ポリペプチドコード核酸による形質転換またはそのトランスフェクトが可能な培養細胞であり、当該宿主細胞においてこのポリペプチドコード核酸の発現が可能となる。発現対象の核酸で形質転換された、またはそれをトランスフェクトされた宿主細胞を表すために、「組換え宿主細胞」という表現が用いられている場合がある。宿主細胞はまた、上記核酸を含んではいるが、それを所望のレベルでは発現していない細胞とすることもできるが、ただし、上記核酸と機能的に連結するように制御配列が当該宿主細胞に導入されている場合は除く。宿主細胞という用語は、特定の対象細胞を指すだけでなく、そのような細胞の子孫や潜在的な子孫も指すと理解される。突然変異や環境の影響などによってある特定の改変が後の世代において生じ得るため、そのような子孫は実際には親細胞と同一でない場合があるが、その場合であっても、本明細書で使用される上記用語の範囲内に包含される。
用語「単離された分子」（ここで、分子はポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどである）は、その起源または派生源に基づいて、（１）天然状態のそれに伴っている天然付随成分を付随していない分子、（２）同じ種由来の他の分子を実質的に含んでいない分子、（３）異なる種由来の細胞によって発現された分子、または（４）天然では生じない分子である。すなわち、化学的に合成された分子、または天然にそれが生じる細胞とは異なる細胞系で発現された分子が、その天然付随成分から「単離」されることとなる。当該技術分野において周知の精製法を用いて、分子を、単離により天然付随成分を実質的に含まないものとしてもよい。当該技術分野において周知のいくつかの手段で、分子の純度または均一性を評価することができる。例えば、当該技術分野において周知の方法を用いて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびゲル染色によりポリペプチドを可視化することで、ポリペプチド試料の純度を評価することができる。ある特定の目的のために、ＨＰＬＣまたは当該技術分野において周知の他の精製手段を用いることで、より高い解像度を得てもよい。
試料の少なくとも約６０％～７５％が単一のポリペプチド種を示す場合に、タンパク質またはポリペプチドは「実質的に純粋な」、「実質的に均一な」、または「実質的に精製された」ものである。このポリペプチドまたはタンパク質は単量体であっても多量体であってもよい。実質的に純粋なポリペプチドまたはタンパク質は、通常、タンパク質試料の約５０％（Ｗ／Ｗ）、約６０％（Ｗ／Ｗ）、約７０％（Ｗ／Ｗ）、約８０％（Ｗ／Ｗ）、または約９０％（Ｗ／Ｗ）を構成しており、より頻繁には約９５％を構成しており、９９％超純粋となることが好ましい。タンパク質の純度または均一性は、タンパク質試料をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた後、当該技術分野において周知の染色法によるゲル染色で単一ポリペプチドバンドを可視化するなどの、当該技術分野において周知のいくつかの手段で、示すことができる。ある特定の目的のために、ＨＰＬＣまたは当該技術分野において周知の他の精製手段を用いることで、より高い解像度を得てもよい。
「標識」または「標識化」という用語は、本明細書で使用される場合、抗体に別の分子を組み込むことをいう。１つの実施形態において、標識は検出可能なマーカーであり、例えば、放射性標識されたアミノ酸の組み込み、またはマークを付けたアビジンにより検出可能なビオチニル部分のポリペプチドへの付加（例えば、光学的方法または熱量測定法（ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ）で検出可能な蛍光マーカーまたは酵素活性を含むストレプトアビジン）である。別の実施形態において、標識またはマーカーは、治療用の標識またはマーカーとすることができ、例えば、薬剤複合体または毒素である。ポリペプチドおよび糖タンパク質の種々の標識法が、当該技術分野において公知であり、使用されてよい。ポリペプチド用の標識の例として、以下が挙げられるが、これらに限定はされない：放射性同位元素または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光ラベル（例えば、ＦＩＴＣ蛍光体、ローダミン蛍光体、ランタニド蛍光体）、酵素標識（例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光マーカー、ビオチニル基、二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体に対する結合部位、金属結合ドメイン、エピトープ標識）、磁性を有する薬剤、例えばガドリニウムキレート、毒素、例えば百日咳毒素、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１－デヒドロテストステロン、グルココルチコイド類、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、並びにこれらのアナログまたはホモログ。種々の実施形態において、標識は、起こり得る立体障害を抑制するため、様々な長さのスペーサーアームによって付加される。
用語「異種の」とは、本明細書で使用される場合、構成や状態が天然のものではない、または天然には存在しないことを指し、例えば、既存の天然構成または天然状態を、別の供給源由来の構成または状態と置き替えることにより達成することができる構成や状態を指す。同様に、そのタンパク質が天然で発現される生物以外の生物でのタンパク質の発現は、異種の発現系および異種のタンパク質となる。
本明細書に記載の本開示の態様および実施形態は、態様および実施形態「からなるもの」、および／または態様および実施形態「から本質的になるもの」、を包含すると理解される。
本明細書における「約」値またはパラメーターを指す記載は、その値またはパラメーターそれ自体を対象とした変動を包含（および説明）する。例えば、「約Ｘ」を指す記載は、「Ｘ」という記載を包含する。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、文脈によって特に明示されていない限り、「ａ」、「または（ｏｒ）」、および「ｔｈｅ」といった単数形は複数形を包含する。本明細書に記載の本開示の態様および変更形態は、態様および変更形態「からなるもの」、および／または態様および変更形態「から本質的になるもの」、を包含すると理解される。
ＶｉｔｏＫｉｎｅプラットフォームの説明
本発明は、全身性機構（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）に基づいた毒性を低減し、サイトカインなどのタンパク質の治療的有用性を広げることを目的とした、サイトカインベースの生理活性化薬剤（「ＶｉｔｏＫｉｎｅ」）プラットフォームを提供する。図１を参照すると、本発明の新規ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体は、ターゲティングドメイン、半減期延長ドメイン、または二機能性もしくは多機能性部分ドメインであるＤ１ドメインと、「活性部分ドメイン」（Ｄ２）と、「遮蔽部分ドメイン」（Ｄ３）と、を含む。提案されたＶｉｔｏＫｉｎｅ Ｄ２ドメインの活性化方法が図２に示されている。重要なこととして、ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体のＤ２は患部組織で発現上昇しているプロテアーゼにより局所的な活性化を受けるまで不活性状態または活性が減弱された状態を維持するため、これにより、当該活性部分が周辺の、または患部以外の細胞の細胞表面上の受容体に結合することが制限され、その経路の過剰な活性化が抑制され、望ましくない「オンターゲット」であるが「標的組織外に対する」毒性が低減される。さらに、プロテアーゼによる活性化前にＶｉｔｏＫｉｎｅ活性部分が不活性であることで、抗原シンクや標的シンクの可能性が大きく減少するため、生体内半減期が延長し、体内分布および治療目標部位における生物学的利用能が改善される結果となる。
Ｄ１ドメイン（「ターゲティングドメイン、半減期延長ドメイン、または二機能性もしくは多機能性部分ドメイン」）
種々の実施形態において、本発明のＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体は、腫瘍関連抗原に対する抗体もしくは抗体断片またはタンパク質もしくはペプチドの形態のターゲティング部分であるＤ１ドメインを含む。種々の実施形態において、本発明のＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体は、免疫チェックポイント修飾因子に対する抗体、抗体断片、タンパク質、またはペプチドであるＤ１ドメインを含む。種々の実施形態において、本発明のＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体は、自己免疫調節物質として抗体もしくは抗体断片またはタンパク質もしくはペプチドであるＤ１ドメインを含む。種々の実施形態において、本発明のＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体は、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）または炎症組織部位などの組織部位にＤ２ドメインを滞留させる働きをするＤ１を含む。種々の実施形態において、本発明のＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体は、組織ターゲティングおよび組織滞留など、二機能性であるＤ１を含む。種々の実施形態において、本発明のＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体は、ポリマーであるＤ１ドメインを含む。種々の実施形態において、本発明のＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体は、半減期延長部分であるＤ１ドメインを含む。種々の実施形態において、本発明のＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体は、ＦｃドメインであるＤ１ドメインを含む。
Ｆｃドメイン
ＩｇＧクラスの免疫グロブリンはヒト血液中で最も豊富なタンパク質である。ＩｇＧクラス免疫グロブリンの循環血中半減期は２１日間もの長さに達し得る。ＩｇＧのＦｃ領域を種々のサイトカインや受容体などの別のタンパク質のドメインと組み合わせた、融合タンパク質の報告がある（例えば、Ｃａｐｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３７巻：頁５２５－５３１、１９８９年；Ｃｈａｍｏｗら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１４巻：頁５２－６０、１９９６年）；米国特許第５，１１６，９６４号および同第５，５４１，０８７号を参照）。融合タンパク質の原型は、ＩｇＧのＦｃのヒンジ領域内のシステイン残基を介して連結された、重鎖の可変領域およびＣＨ１ドメインと軽鎖がないＩｇＧ分子に似た分子となった、ホモ二量体タンパク質である。Ｆｃドメインを含む融合タンパク質の二量体特性は、他の分子とのより高次の相互作用（すなわち二価または二重特異的結合）を実現する際に有利となり得る。構造的な相同性により、Ｆｃ融合タンパク質は、同様のアイソタイプをもつヒトＩｇＧと同等のインビボ薬物動態プロファイルを示す。
用語「Ｆｃ」は、単量体形態であっても多量体形態であってもよい、全長抗体の非抗原結合性断片の配列を含む分子または配列を指す。ネイティブＦｃのオリジナルとなる免疫グロブリン供給源は、ヒト由来のものが好ましく、任意の免疫グロブリンであってよいが、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２が好ましい。ネイティブＦｃは、共有結合的結合（すなわち、ジスルフィド結合）および非共有結合的結合により、連結されて二量体形態または多量体形態になり得る、単量体ポリペプチドから構成される。ネイティブＦｃ分子の単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）またはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＧＡ２）に応じて、１～４の幅がある。ネイティブＦｃの一例として、ＩｇＧのパパイン分解から生じるジスルフィド結合二量体がある（Ｅｌｌｉｓｏｎら、（１９８２年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１０巻：頁４０７１－９）。用語「ネイティブＦｃ」とは、本明細書で使用される場合、単量体形態、二量体形態、および多量体形態の総称である。プロテインＡに対する結合部位、プロテインＧに対する結合部位、種々のＦｃ受容体に対する結合部位、および補体タンパク質に対する結合部位を含有するＦｃドメイン。
種々の実施形態において、用語「Ｆｃバリアント」とは、ネイティブＦｃから改変を受けたが、サルベージ受容体であるＦｃＲｎに対する結合部位を尚も含んでいる、分子または配列を指す。国際公開第９７／３４６３１号（１９９７年９月２５日に公開）および国際公開第９６／３２４７８号には、例示的なＦｃバリアント、およびサルベージ受容体との相互作用に関する記載があり、当該国際公開は参照により本明細書に援用される。さらに、ネイティブＦｃは、本発明の融合分子には必要とされない構造的特徴または生物活性を与えることから、除去されてもよい部位を含む。すなわち、種々の実施形態においては、用語「Ｆｃバリアント」は、以下に影響または関与する１または複数のネイティブＦｃ部位または残基を欠く分子または配列を含む：（１）ジスルフィド結合形成、（２）選択された宿主細胞との不適合性、（３）選択された宿主細胞における発現後のＮ末端の異種性、（４）グリコシル化、（５）ＣＤＣなどの、補体との相互作用、（６）サルベージ受容体以外のＦｃ受容体への結合、または、（７）抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）。
用語「Ｆｃドメイン」は、上記で定義された、ネイティブＦｃおよびＦｃバリアントの分子および配列を包含する。ＦｃバリアントおよびネイティブＦｃと同様、用語「Ｆｃドメイン」は、全長抗体から消化された、または組換え遺伝子発現もしくは他の手段で生成された、単量体形態または多量体形態の、分子を包含する。種々の実施形態において、「Ｆｃドメイン」とは、ヒンジ領域の全体または一部を通常含む、２つのＦｃドメイン単量体（配列番号１３）からなる二量体を指す。種々の実施形態において、Ｆｃドメインはエフェクター機能を欠くように変異を受けていてもよい。種々の実施形態において、ＦｃドメインのＦｃドメイン単量体の各々は、ＦｃドメインとＦｃγ受容体との間の相互作用または結合を減少させるために、ＣＨ２抗体定常ドメインにアミノ酸置換を含む。種々の実施形態において、Ｆｃドメインの各サブユニットは、活性化性Ｆｃ受容体への結合性および／またはエフェクター機能を低減する２つのアミノ酸置換（Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ）を含む。種々の実施形態において、Ｆｃドメインの各サブユニットは、活性化性Ｆｃ受容体への結合性および／またはエフェクター機能を低減する３つのアミノ酸置換（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＧ２３７Ａ）を含む（配列番号１４）。
種々の実施形態において、Ｆｃドメインは生体内半減期をさらに延長させるように変異を受けていてもよい。種々の実施形態において、Ｆｃドメインの各サブユニットは、米国特許第７，６５８，９２１号（配列番号１５６）で開示された、ヒトＦｃＲｎに対する結合性を増強する３つのアミノ酸置換（Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、およびＴ２５６Ｅ）を含む。種々の実施形態において、Ｆｃドメインの各サブユニットは、米国特許第７，３７１，８２６号で開示された、ヒトＦｃＲｎに対する結合性を増強させた１つのアミノ酸置換（Ｎ４３４Ａ）を含む（配列番号１６６）。種々の実施形態において、Ｆｃドメインの各サブユニットは、米国特許第８，５４６，５４３号で開示された、ヒトＦｃＲｎに対する結合性を増強させた１つのアミノ酸置換（Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓ）を含む。種々の実施形態において、半減期延長変異は、活性化性Ｆｃ受容体への結合性および／またはエフェクター機能を低減するアミノ酸置換と組み合わせることができる。
種々の実施形態において、Ｆｃドメインの２つのＦｃドメイン単量体は、それぞれ、これら２つの単量体のヘテロ二量体化を促すアミノ酸置換を含む。種々の他の実施形態において、Ｆｃドメイン単量体のヘテロ二量体化は、２つのＦｃドメイン単量体に異なっているが適合性の置換（「ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ）」残基対など）を導入することにより、促すことができる。この「ノブ・イントゥ・ホール」技術は米国特許第８，２１６，８０５号においても開示されている。さらに別の実施形態では、一方のＦｃドメイン単量体がノブ型変異Ｔ３６６Ｗを含み、他方のＦｃドメイン単量体がホール型変異のＴ３６６Ｓ、Ｌ３５８Ａ、およびＹ４０７Ｖを含む。種々の実施形態において、安定化ジスルフィド架橋を形成する２つのＣｙ残基が（「ノブ」側のＳ３５４Ｃと「ホール」側のＹ３４９Ｃ）が導入された（配列番号１５および配列番号１６）。ヘテロ二量体Ｆｃの使用により、一価ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体が得られ得る。
種々の実施形態において、ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体の製造に使用されるＦｃドメイン配列は、下記の配列番号１４に記載のヒトＩｇＧ１－Ｆｃドメイン配列であり：
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号１４）、
配列番号１４は、ＦｃγＲの結合やＣ１ｑの結合を断つアミノ酸置換（下線部）を含む。
種々の実施形態において、ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体の製造に使用されるヘテロ二量体Ｆｃドメイン配列は、下記の配列番号１５に記載のＫｎｏｂ－Ｆｃドメイン配であり：
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号１５）
配列番号１５は、ＦｃγＲの結合やＣ１ｑの結合を断つアミノ酸置換（下線部）を含む。
種々の実施形態において、ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体の製造に使用されるヘテロ二量体Ｆｃドメイン配列は、下記の配列番号１６に記載のＨｏｌｅ－Ｆｃドメイン配であり：
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号１６）、
配列番号１６は、ＦｃγＲの結合やＣ１ｑの結合を断つアミノ酸置換（下線部）を含む。
種々の実施形態において、ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体の製造に使用されるＦｃドメイン配列は、エフェクター機能が低減／消失し、半減期が延長された、下記の配列番号１５６に記載のアミノ酸配列を有する、ＩｇＧ１－Ｆｃドメインであり：
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＹＩＴＲＥＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号１５６）、
配列番号１５６は、ＦｃγＲの結合やＣ１ｑの結合を断つアミノ酸置換（下線部）と、半減期を延長させるアミノ酸置換（太字）とを含む。
種々の実施形態において、ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体の製造に使用されるＦｃドメイン配列は、下記の配列番号１６６に記載のヒトＩｇＧ１－Ｆｃドメイン配列であり：
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＡＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号１６６）、
配列番号１６６は、ＦｃγＲの結合やＣ１ｑの結合を断つアミノ酸置換（下線部）と、半減期を延長させるアミノ酸置換（太字）とを含む。
種々の実施形態において、ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体の製造に使用されるＦｃドメイン配列は、下記の配列番号１６７に記載の、生体内半減期が延長されたＫｎｏｂ－Ｆｃドメイン配列であり：
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＡＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号１６７）、
配列番号１６７は、ＦｃγＲの結合やＣ１ｑの結合を断つアミノ酸置換（下線部）と、半減期を延長させるアミノ酸置換（太字）とを含む。
種々の実施形態において、ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体の製造に使用されるＦｃドメイン配列は、下記の配列番号１６８に記載の、生体内半減期が延長されたＨｏｌｅ－Ｆｃドメイン配列であり：
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＡＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号１６８）、
配列番号１６８は、ＦｃγＲの結合やＣ１ｑの結合を断つアミノ酸置換（下線部）と、半減期を延長させるアミノ酸置換（太字）とを含む。
疾患関連標的または腫瘍関連抗原に対する抗体およびタンパク質／ペプチド結合体
種々の実施形態において、Ｄ１は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する抗体の形態のターゲティング部分とすることもできるし、患部細胞または患部組織に対し結合親和性を示す別のタンパク質またはペプチドの形態のターゲティング部分とすることもできる。上記のＴＡＡは、それに対する免疫応答が望まれる、任意の分子、高分子、分子の組み合わせなどであり得る。上記のＴＡＡは、２以上のポリペプチドサブユニットを含むタンパク質であり得る。例えば、上記のタンパク質は二量体、三量体、またはより高次の多量体であり得る。種々の実施形態において、上記のタンパク質の２以上のサブユニットは、例えばジスルフィド結合などの共有結合で連結されているとすることができる。種々の実施形態において、上記のタンパク質のサブユニットは、非共有結合性相互作用で結び付いているとすることができる。すなわち、ＴＡＡは、それに対する免疫応答の誘導が当業者により望まれる、任意のペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、脂質、炭水化物、もしくは有機小分子、またはこれらの任意の組み合わせとすることができる。種々の実施形態において、ＴＡＡは、約５個、約６個、約７個、約８個、約９個、約１０個、約１１個、約１２個、約１３個、約１４個、約１５個、約１６個、約１７個、約１８個、約１９個、約２０個、約２５個、約３０個、約３５個、約４０個、約４５個、約５０個、約５５個、約６０個、約６５個、約７０個、約７５個、約８０個、約８５個、約９０個、約９５個、約１００個、約１５０個、約２００個、約２５０個、約３００個、約４００個、約５００個、約６００個、約７００個、約８００個、約９００個、または約１０００個のアミノ酸を含むペプチドである。種々の実施形態において、上記のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、一般的には注射によって対象に投与される分子である。種々の実施形態において、投与後、腫瘍特異的な抗体または結合タンパク質は、ＶｉｔｏＫｉｎｅをがん部位などの患部に導くターゲティング部分として働き、当該患部で、活性ドメインが遊離し、患部細胞または患部組織上のそのコグネイトな受容体と相互作用し得る。
上記マーカーのいずれも、本発明のＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体の疾患関連標的またはＴＡＡ標的として用いることができる。種々の実施形態において、本開示のＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体および方法における使用が企図される１または複数の疾患関連標的もしくはそのバリアント、またはＴＡＡ、ＴＡＡバリアント、もしくはＴＡＡ変異体は、表２に示される一覧表から選択されるか、またはそれに由来する。
Figure 0007477885000002
Figure 0007477885000003
Figure 0007477885000004
Figure 0007477885000005
腫瘍関連抗原のさらなる例としては、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、ＭＡＧ－１、ＭＡＧＥ－３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ－１、ＧＡＧＥ－２、ｐ１５（５８）、ＣＥＡ、ＲＡＧＥ、ＮＹ－ＢＳＯ（ＬＡＧＥ）、ＳＣＰ－１、Ｈｏｍ／Ｍｅｌ－４０、Ｈ－Ｒａｓ、ＢＣＲ－ＡＢＬ、Ｅ２Ａ－ＰＲＬ、Ｈ４－ＲＥＴ、ＩＧＨ－ＩＧＫ、ＭＹＬ－ＲＡＲ、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原のＥ６およびＥ７、ＴＳＰ－１８０、ＭＡＧＥ－４、ＭＡＧＥ－５、ＭＡＧＥ－６、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ－３、ｃ－ｍｅｔ ｎｍ－２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＴＡＧ－７２－４、ＣＡ１９－９、ＣＡ７２－４、ＣＡＭ１７．１、Ｎｕｍａ、Ｋ－ｒａｓ、β－カテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｎｉ－１、ｐ１６、ＴＡＧＥ、ＰＳＣＡ、ＣＴ７、テロメラーゼ、４３－９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、β－ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ１５－３（ＣＡ２７．２９＼ＢＣＡＡ）、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ－５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼ＫＦ１、ＣＯ－０２９、ＦＧＦ－５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３（ＥｐＣＡＭ）、ＨＴｇｐ－１７５、Ｍ３４４、ＭＡ－５０、ＭＧ７－Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ－ＣＯ－１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ－９０（Ｍａｃ－２結合タンパク質￥シクロフィリンＣ関連タンパク質）、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、およびＴＰＳが挙げられる。
免疫チェックポイント修飾因子
いくつかの免疫チェックポイントタンパク質抗原が、種々の免疫細胞上で発現されていることが報告されており、例えば、ＣＤ１５２（活性化型のＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、および制御性Ｔ細胞によって発現）、ＣＤ２７９（腫瘍浸潤リンパ球上で発現、活性化Ｔ細胞（ＣＤ４およびＣＤ８の両方）、制御性Ｔ細胞、活性化Ｂ細胞、活性化ＮＫ細胞、免疫不応答状態のＴ細胞、単球、樹状細胞によって発現）、ＣＤ２７４（Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージ、血管内皮細胞、膵島細胞上で発現）、およびＣＤ２２３（活性化Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、免疫不応答状態（ａｎｇｅｒｇｉｃ）Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、および形質細胞様樹状細胞によって発現）（例えば、Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｄ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ、１２巻：頁２５２－２６４、２０１２年を参照）が挙げられる。免疫チェックポイントタンパク質であることが確認されている抗原に結合する抗体は、当業者に公知である。例えば、様々な抗ＣＤ２７６抗体が当該技術分野で報告されており（例えば、米国特許出願公開第２０１２０２９４７９６号（Ｊｏｈｎｓｏｎら）およびその引用文献を参照）；様々な抗ＣＤ２７２ 抗体が当該技術分野で報告されており（例えば、米国特許出願公開第２０１４００１７２５５号（Ｍａｔａｒａｚａら）およびその引用文献を参照）；様々な抗ＣＤ１５２／ＣＴＬＡ－４抗体が当該技術分野で報告されており（例えば、米国特許出願公開第２０１３０１３６７４９号（Ｋｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ）およびその引用文献を参照）；様々な抗ＬＡＧ－３／ＣＤ２２３抗体が当該技術分野で報告されており（例えば、米国特許出願公開第２０１１０１５０８９２号（Ｔｈｕｄｉｕｍら）およびその引用文献を参照）；様々な抗ＣＤ２７９／ＰＤ－１抗体が当該技術分野で報告されており（例えば、米国特許第７，４８８，８０２号（Ｃｏｌｌｉｎｓら）およびその引用文献を参照）；様々な抗ＰＤ－Ｌ１抗体が当該技術分野で報告されており（例えば、米国特許出願公開第２０１３０１２２０１４号（Ｋｏｒｍａｎら）およびその引用文献を参照）；様々な抗ＴＩＭ－３抗体が当該技術分野で報告されており（例えば、米国特許出願公開第２０１４００４４７２８号（Ｔａｋａｙａｎａｇｉら）およびその引用文献を参照）；様々な抗Ｂ７－Ｈ４抗体が当該技術分野で報告されている（例えば、米国特許出願公開第２０１１００８５９７０号（Ｔｅｒｒｅｔｔら）およびその引用文献を参照）。これらの参考文献の各々は、当該参考文献で教示された特定の抗体および配列について、その全体が参照によって本明細書に援用されたものとする。
種々の実施形態において、Ｄ１は、免疫細胞の表面上に存在する免疫チェックポイントタンパク質抗原に対して結合性を示す抗体、抗体断片、またはタンパク質もしくはペプチドを含み得る。種々の実施形態において、免疫チェックポイントタンパク質抗原は、ＣＤ２７６、ＣＤ２７２、ＣＤ１５２、ＣＤ２２３、ＣＤ２７９、ＣＤ２７４、ＣＤ４０、ＳＩＲＰａ、ＣＤ４７、ＯＸ－４０、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、４－１ＢＢ、ＴＩＭ－３、Ｂ７－Ｈ４、Ｓｉｇｌｅｃ７、Ｓｉｇｌｅｃ８、Ｓｉｇｌｅｃ９、Ｓｉｇｌｅｃ１５、およびＶＩＳＴＡからなる群から選択されるが、これらに限定はされない。
種々の実施形態において、Ｄ１は、腫瘍細胞の表面上に存在する、ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７－Ｈ３、およびＢ７－Ｈ４からなる群から選択されるが、これらに限定はされない、免疫チェックポイントタンパク質抗原に対する抗体を含み得る。
自己免疫性障害および炎症性障害の調節物質
様々な炎症組織または免疫細胞上で高発現されている上記のタンパク質のいずれも、本発明のＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体の自己免疫性疾患／炎症性疾患の標的として用いることができる。種々の実施形態において、本開示のＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体および方法における使用が企図される、１または複数の自己免疫性疾患／炎症性疾患の標的、そのバリアント、またはその変異体／アイソフォームは、表３に示される一覧表から選択されるか、またはそれに由来する。これらの標的はがん標的としても適用可能であり得る。
Figure 0007477885000006
Figure 0007477885000007
種々の実施形態において、Ｄ１ターゲティング部分は、ＴＮＦ、ＴＮＦＲ、インテグリンＡ４β７、ＩＬ－６Ｒα、ＢＬＹＳ、ＴＳＬＰなどの、患部細胞または患部微小環境に対して結合性を示す、炎症組織特異的な抗体、抗体断片、別のタンパク質またはペプチドとすることができる。
ポリマー
種々の実施形態において、Ｄ１は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリマーとすることができる。種々の実施形態において、ＰＥＧなどのポリマーは、化学的結合などの従来の化学的手法を用いて、Ｎ末端もしくはＣ末端、または内部位置に、共有結合的に取り付けられ得る。種々の実施形態において、ＰＥＧなどのポリマーは、部位特異的結合またはサイトカインの他のアミノ酸もしくは操作された特定のアミノ酸置換を介して、Ｄ２ドメインのＮ末端に共有結合的に取り付けられ得る。
半減期延長部分
種々の実施形態において、ＶｉｔｏＫｉｎｅの血中半減期を延長するために、本発明におけるＤ１ドメインとして用いることができる、他の半減期延長部分。半減期延長部分としては、Ｆｃドメイン、Ｆｃバリアント、抗体、抗体断片（Ｆａｂ、ＳｃＦｖ）、およびＥＸＴＥＮ（Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２７巻：頁１１８６－１１９２、２００９年）、およびヒト血清アルブミンタンパク質が挙げられるが、これらに限定はされない。
Ｄ２ドメイン（「活性部分ドメイン」）
Ｄ２は、ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体の活性部分であって、その活性は当該構築体において可逆的に遮蔽されており、患部でプロテアーゼ切断された際に回復され得る。この活性部分は、任意のネイティブまたはバリアントのインターロイキンまたはサイトカインポリペプチドを含むがこれらに限定はされない、任意のタンパク質であり得る。重要なこととして、ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体の「活性部分」は患部組織で発現上昇しているプロテアーゼにより局所的な活性化を受けるまで不活性状態または活性が減弱された状態を維持するため、これにより、当該活性部分が周辺の、または患部以外の細胞の細胞表面上の受容体に結合することが制限され、その経路の過剰な活性化が抑制され、望ましくない「オンターゲット」であるが「標的組織外に対する」毒性が低減される。さらに、プロテアーゼによる活性化前にＶｉｔｏＫｉｎｅ活性部分が不活性であることで、抗原シンクや標的シンクの可能性が大きく減少するため、生体内半減期が延長し、体内分布および治療目標部位における暴露が改善される結果となる。
ＩＬ－１５
インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）は、抗ＩＬ－２中和抗体の存在下でＩＬ－２依存性ＣＴＬＬ－２ Ｔ細胞株の増殖を刺激する能力に基づいて、２つの別個のグループにより同定されたサイトカインである（Ｓｔｅｅｌら、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、３３巻（１号）：頁３５－４１、２０１２年）。ＩＬ－１５およびインターロイキン－２（ＩＬ－２）は、受容体（Ｒ）シグナル伝達成分（ＩＬ－２／１５Ｒβγｃ）の共有にみられるように、インビトロにおいて同様の生物学的特性を有する。しかし、ＩＬ－２に対するＩＬ－１５の特殊性が独自の私有のα鎖受容体によってもたらされ、このα鎖受容体によりヘテロ三量体型の高親和性受容体複合体であるＩＬ－１５ＲαβγおよびＩＬ－２Ｒαβγが完成されることで、リガンドおよび発現された高親和性受容体に依存した応答性の差異が生じる。興味深いことに、ＩＬ－１５転写物およびＩＬ－１５Ｒα転写物は共に、ＩＬ－２／ＩＬ－２Ｒαよりもかなり広い組織分布を有する。さらに、複数の複雑な転写後制御機構がＩＬ－１５発現を厳密に制御している。すなわち、ＩＬ－１５およびＩＬ－１５Ｒαの発現の複雑な制御と、さらには発現パターンの差異から、この受容体／リガンド対の重要なインビボ機能は、ＩＬ－２とＩＬ－２Ｒαの機能とは異なる可能性がある。ＩＬ－１５の生物学的特性を調べている研究によって、現在までに、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫ－Ｔ細胞、および小腸上皮内リンパ細胞の発生および機能におけるＩＬ－１５の重要性など、いくつかの重要な非冗長的な役割が確認されている。関節リウマチなどの自己免疫プロセスや、成人Ｔ細胞白血病などの悪性腫瘍におけるＩＬ－１５の役割から、ＩＬ－１５の調節異常は宿主に有害作用をもたらす恐れが示唆される（Ｆｅｈｎｉｇｅｒら、Ｂｌｌｏｄ、９７巻：頁１４－３２、２００１年）。
本明細書で使用される場合、「ネイティブＩＬ－１５」および「ネイティブインターロイキン－１５」という用語は、タンパク質またはポリペプチドの文脈の中で、未成熟型または前駆型、および成熟型を包含して、任意の天然哺乳類インターロイキン－１５アミノ酸配列を指す。種々のネイティブ哺乳類インターロイキン－１５種のアミノ酸配列のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号の非限定例としては、ＮＰ＿０３２３８３（ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、未成熟型）、ＡＡＢ６０３９８（アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）、未成熟型）、ＮＰ＿０００５７６（ヒト、未成熟型）、ＣＡＡ６２６１６（ヒト、未成熟型）、ＡＡＩ００９６４（ヒト、未成熟型）、およびＡＡＨ１８１４９（ヒト）が挙げられる。本発明の種々の実施形態において、ネイティブＩＬ－１５は、天然哺乳類ＩＬ－１５の未成熟型または前駆型である。他の実施形態において、ネイティブＩＬ－１５は、天然哺乳類ＩＬ－１５の成熟型である。種々の実施形態において、ネイティブＩＬ－１５は、天然ヒトＩＬ－１５の前駆型である。種々の実施形態において、ネイティブＩＬ－１５は、天然ヒトＩＬ－１５の成熟型である。種々の実施形態において、ネイティブＩＬ－１５タンパク質／ポリペプチドは、単離または精製されたものである。種々の実施形態において、ＩＬ－１５ベースのドメインＤ２は、下記の配列番号１に記載のヒトＩＬ－１５前駆体配列のアミノ酸配列に由来するものである：
ＭＲＩＳＫＰＨＬＲＳＩＳＩＱＣＹＬＣＬＬＬＮＳＨＦＬＴＥＡＧＩＨＶＦＩＬＧＣＦＳＡＧＬＰＫＴＥＡＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳ（配列番号１）。
種々の実施形態において、ＩＬ－１５ベースのドメインＤ２は、下記の配列番号２に記載のヒトＩＬ－１５成熟型配列のアミノ酸配列を含む：
ＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳ（配列番号２）。
種々の実施形態において、ＩＬ－１５ベースのドメインＤ２は、配列番号２に記載の成熟ヒトＩＬ－１５ポリペプチドの配列に由来する配列を含むＩＬ－１５バリアント（または変異体）となるであろう。ＩＬ－１５のバリアント（または変異体）は、元のアミノ酸、成熟配列内での上記元のアミノ酸の位置、およびバリアント型のアミノ酸、を用いて呼称される。例えば、「ｈｕＩＬ－１５ Ｓ５８Ｄ」は、配列番号２の５８位にＳからＤへの置換を含むヒトＩＬ－１５を表す。種々の実施形態において、本発明のＤ２ドメインは、ＩＬ－１５バリアントであるＩＬ－１５ドメインを含む（以下、ＩＬ－１５変異ドメインとも称する）。種々の実施形態において、ＩＬ－１５バリアントは、ネイティブ（または野生型）ＩＬ－１５タンパク質とは異なるアミノ酸配列を含む。種々の実施形態において、ＩＬ－１５バリアントは、ＩＬ－１５Ｒαポリペプチドと結合し、ＩＬ－１５のアゴニストまたはアンタゴニストとして機能する。種々の実施形態において、アゴニスト活性を有するＩＬ－１５バリアントは、スーパーアゴニスト活性を有する。種々の実施形態において、ＩＬ－１５バリアントは、ＩＬ－１５Ｒαとの結び付きとは無関係に、ＩＬ－１５のアゴニストまたはアンタゴニストとして機能できる。ＩＬ－１５アゴニストは、野生型ＩＬ－１５と比較した場合の同等または増加した生物活性により例証される。ＩＬ－１５アンタゴニストは、野生型ＩＬ－１５と比較した場合の生物活性の減少、またはＩＬ－１５介在反応を阻害する能力により例証される。種々の実施形態において、ＩＬ－１５バリアントは、増加または減少した活性で、ＩＬ－１５ＲβγＣ受容体に結合する。種々の実施形態において、ＩＬ－１５バリアントの配列は、ネイティブＩＬ－１５配列と比較した場合に、少なくとも１つのアミノ酸変化、例えば置換または欠失、を有し、このような変化により、ＩＬ－１５アゴニスト活性またはＩＬ－１５アンタゴニスト活性が得られる。種々の実施形態において、アミノ酸置換／欠失は、ＩＬ－１５Ｒβおよび／またはγＣと相互作用するＩＬ－１５のドメイン内にある。種々の実施形態において、アミノ酸置換／欠失は、ＩＬ－１５Ｒαポリペプチドへの結合性にも、ＩＬ－１５バリアントの産生能にも、影響を与えない。ＩＬ－１５バリアントを作製するのに好適なアミノ酸置換／欠失は、既知のＩＬ－１５構に基づいて、ＩＬ－１５と構造既知のＩＬ－２などの類似分子との比較に基づいて、本明細書で提供されるような、合理的もしくは無作為の変異誘発と機能分析を通じて、または他の経験的方法を通じて、特定することができる。さらに、好適なアミノ酸置換は、保存的な変化および追加のアミノ酸の挿入とすることもできるし、非保存的な変化および追加のアミノ酸の挿入とすることもできる。種々の実施形態において、本発明のＩＬ－１５バリアントは、配列番号２に記載の成熟ヒトＩＬ－１５配列の３０位、３１位、３２位、５８位、６２位、６３位、６７位、６８位、または１０８位に、１または２以上のアミノ酸置換またはアミノ酸欠失を含有する。種々の実施形態において、Ｄ３０Ｔ（「Ｄ３０」は、ネイティブ成熟ヒトＩＬ－１５配列内のアミノ酸と残基位置を指し、「Ｔ」はＩＬ－１５バリアント内のその位置における置換後のアミノ酸残基を指す）置換、Ｖ３１Ｙ置換、Ｈ３２Ｅ置換、Ｄ６２Ｔ置換、Ｉ６８Ｆ置換、またはＱ１０８Ｍ置換は、アンタゴニスト活性を有するＩＬ－１５バリアントを生じ、Ｓ５８Ｄ置換は、アゴニスト活性を有するＩＬ－１５バリアントを生じる。種々の実施形態において、ＩＬ－１５バリアントは、下記の配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む：
ＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＤＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳ（配列番号３）。
例示的なＦｃ ＩＬ－１５ ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体を表４に示す。
Figure 0007477885000008
種々の実施形態において、抗体ＩＬ－１５ ＶｉｔｏＫｉｎｅまたはＩＬ－１５ Ｆｃ融合体の各分子は、表５に記載されるような２つ以上のヘテロ二量体鎖を含むであろう。
Figure 0007477885000009
種々の実施形態において、ＩＬ－１５ベースのＤ２ドメインは、配列番号６６～７０に記載のアミノ酸配列を有する構築体から選択されるＩＬ－２Ｒβベースのブロッキングペプチドを含むＩＬ－１５構築体を含むであろう。
種々の実施形態において、ＩＬ－１５ベースのＤ２ドメインは、ＩＬ－２Ｒβベースのブロッキングペプチドを含み、表６に記載されているようなヘテロ二量体鎖を２つ以上有する、ＩＬ－１５構築体を含むであろう。
Figure 0007477885000010
ＩＬ－２
インターロイキン－２（ＩＬ－２）は、古典的なＴｈ１サイトカインであり、Ｔ細胞抗原受容体と共起刺激分子ＣＤ２８を介した活性化後のＴ細胞によって産生される。ＩＬ－２の制御は、シグナル経路の活性化と、ＩＬ－２プロモーターに作用して遺伝子転写を新たに引き起こす転写因子と、を通じて起こるが、ＩＬ－２ｍＲＮＡの安定性の調節も伴う。ＩＬ－２は、Ｊａｋ－ＳＴＡＴ経路を通じたシグナル伝達を仲介する、高度に制御されたα鎖とβ鎖とγ鎖を含む多鎖受容体に結合する。ＩＬ－２は、活性化シグナル、増殖シグナル、および分化シグナルをＴ細胞、Ｂ細胞、およびＮＫ細胞に送達する。ＩＬ－２はまた、免疫応答を終了させるための必要不可欠な機構を与える機能である、活性化により誘導されるＴ細胞死の媒介において重要である。市販の非グリコシル化ヒト組換えＩＬ－２製品である、アルデスロイキン（カリフォルニア州サンディエゴのプロメテウス・ラボラトリーズ社（Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）から、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）という商標のデス－アラニル－１、セリン－１２５ヒトインターロイキン－２として入手可能）は、転移性腎細胞癌患者および転移性黒色腫患者への投与用に承認されている。ＩＬ－２はまた、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染患者、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染患者、急性骨髄性白血病患者、非ホジキンリンパ腫患者、皮膚Ｔ細胞リンパ腫患者、若年性関節リウマチ患者、アトピー性皮膚炎患者、乳がん患者、および膀胱がん患者における投与が提唱されている。残念ながら、半減期の短さと毒性の強さがＩＬ－２の最適用量に制限を設けている。
本明細書で使用される場合、「ネイティブＩＬ－２」および「ネイティブインターロイキン－２」という用語は、タンパク質またはポリペプチドの文脈の中で、未成熟型または前駆型、および成熟型を包含して、任意の天然哺乳類インターロイキン－２アミノ酸配列を指す。種々のネイティブ哺乳類インターロイキン－２種のアミノ酸配列のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号の非限定例としては、ＮＰ＿０３２３９２．１（ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、未成熟型）、ＮＰ＿００１０４０５９５．１（アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）、未成熟型）、ＮＰ＿０００５７７．２（ヒト、前駆型）、ＣＡＡ０１１９９，１（ヒト、未成熟型）、ＡＡＤ４８５０９．１（ヒト、未成熟型）、およびＡＡＢ２０９００．１（ヒト）が挙げられる。本発明の種々の実施形態において、ネイティブＩＬ－２は、天然哺乳類ＩＬ－２の未成熟型または前駆型である。他の実施形態において、ネイティブＩＬ－２は、天然哺乳類ＩＬ－２の成熟型である。種々の実施形態において、ネイティブＩＬ－２は、天然ヒトＩＬ－２の前駆型である。種々の実施形態において、ネイティブＩＬ－２は、天然ヒトＩＬ－２の成熟型である。種々の実施形態において、ＩＬ－２ベースのドメインＤ２は、下記の配列番号６に記載のヒトＩＬ－２前駆体配列のアミノ酸配列に由来するものである：
ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＣＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号６）。
種々の実施形態において、ＩＬ－２ベースのドメインＤ２は、下記の配列番号８に記載のヒトＩＬ－２成熟型野生型配列のアミノ酸配列を含み、当該アミノ酸配列は１２５位にシステインからセリンへの置換を含むが、天然ＩＬ－２との比較でＩＬ－２受容体との結合性は変化させていない：
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号８）。
種々の実施形態において、ＩＬ－２ベースのドメインＤ２は、配列番号８に記載の成熟ヒトＩＬ－２ポリペプチドの配列に由来する配列を含むＩＬ－２バリアント（または変異体）となるであろう。種々の実施形態において、ＩＬ－２バリアントは、ネイティブ（または野生型）ＩＬ－２タンパク質とは異なるアミノ酸配列を含む。種々の実施形態において、ＩＬ－２バリアントは、ＩＬ－２Ｒαポリペプチドと結合し、ＩＬ－２のアゴニストまたはアンタゴニストとして機能する。種々の実施形態において、アゴニスト活性を有するＩＬ－２バリアントは、スーパーアゴニスト活性を有する。種々の実施形態において、ＩＬ－２バリアントは、ＩＬ－２Ｒαとの結び付きとは無関係に、ＩＬ－２のアゴニストまたはアンタゴニストとして機能できる。ＩＬ－２アゴニストは、野生型ＩＬ－２と比較した場合の同等または増加した生物活性により例証される。ＩＬ－２アンタゴニストは、野生型ＩＬ－２と比較した場合の生物活性の減少、またはＩＬ－２介在反応を阻害する能力により例証される。種々の実施形態において、ＩＬ－２バリアントの配列は、ネイティブＩＬ－２配列と比較した場合に、少なくとも１つのアミノ酸変化、例えば置換または欠失、を有し、このような変化により、ＩＬ－２アゴニスト活性またはＩＬ－２アンタゴニスト活性が得られる。種々の実施形態において、ＩＬ－２バリアントは、ＩＬ－２Ｒαに対する結合性が減少／消失しており、がん治療に有効なＴ細胞（Ｔｅｆｆ）を選択的に活性化し増殖させる、配列番号８由来のアミノ酸配列を有する。例示的なアミノ酸置換を表７に挙げる。種々の実施形態において、ＩＬ－２バリアントは、ＩＬ－２Ｒβおよび／またはγｃに対する結合性が減少しており、自己免疫疾患治療用の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の活性化および増殖における選択性が増強された、配列番号８由来のアミノ酸配列を有する。例示的なアミノ酸置換を表７に挙げる。当業者には理解されることであるが、これら全ての変異は、所望により、独立して、任意に組み合わせることで、最適な親和性と活性化の調節を達成することができる。
Figure 0007477885000011
例示的なＩＬ－２ベースのＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体を表８に示す。
Figure 0007477885000012
種々の実施形態において、活性部分は、限定はされないが、インターロイキン－４（ＩＬ－４）（配列番号１７）、インターロイキン－７（ＩＬ－７）（配列番号１８）、インターロイキン－９（ＩＬ－９）（配列番号１９）、インターロイキン－１０（ＩＬ－１０）（配列番号２０）、インターロイキン－１２α（ＩＬ－１２α）（配列番号２１）、インターロイキン－１２β（ＩＬ－１２β）（配列番号２２）、インターロイキン－２３α（ＩＬ－２３α）（配列番号２３）、およびＴＧＦβ（配列番号２４）の各アミノ酸配列からなる配列の群から選択される。種々の実施形態において、活性部分は、第１鎖としての配列番号２１と、第２鎖としての配列番号２２と、を含むヘテロ二量体ヒトＩＬ－１２サイトカインである。種々の実施形態において、活性部分は、第１鎖としての配列番号２３と、第２鎖としての配列番号２２と、を含むヘテロ二量体ヒトＩＬ－２３サイトカインである。
Ｄ３ドメイン（「遮蔽部分ドメイン」）
Ｄ３ドメインは「遮蔽部分ドメイン」であり、主に、特定のＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体においてＤ２ドメインの活性を可逆的に遮蔽するために利用される。Ｄ３ドメインは、目的の治療部位で活性化を受けるまで、Ｄ２の機能活性を遮蔽することが可能である。種々の実施形態において、本発明のＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体は、Ｄ２のタンパク質またはサイトカインに対するコグネイト受容体／結合パートナーである、「遮蔽部分ドメイン」（Ｄ３）を含む。種々の実施形態において、Ｄ３ドメインは、Ｄ２ドメインに対するコグネイト受容体／結合パートナーのバリアント、またはペプチドもしくは抗体断片などの特異的結合体である。種々の実施形態において、Ｄ３ドメインは、野生型コグネイト受容体／結合パートナーと比較して、Ｄ２ドメインに対する結合性が増強されている。種々の実施形態において、Ｄ３ドメインは、野生型コグネイト受容体／結合パートナーと比較して、Ｄ２ドメインに対する結合性が減少または消失している。種々の実施形態において、Ｄ３ドメインは、Ｄ２の活性を遮蔽することができる、タンパク質、またはペプチド、または抗体、または抗体断片である。種々の実施形態において、Ｄ３ドメインは、切断可能なリンカーによる、ＤＮＡ、ＲＮＡ断片、またはＰＥＧなどのポリマーである。種々の実施形態において、本発明のＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体は、ＩＬ－１５Ｒα細胞外ドメインまたはその機能性断片もしくはバリアントであるＤ３ドメインを含む。種々の実施形態において、本発明のＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体は、ＩＬ－１５ＲαＳｕｓｈｉドメインであるＤ３ドメイン（配列番号５の１～６５位のアミノ酸）を含む。種々の好ましい実施形態において、本発明のＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体は、ＳｕｓｈｉドメインのＣ末端に１～３０個の追加のＩＬ－１５Ｒα残基を含む、ＩＬ－１５ＲαＳｕｓｈｉ＋ドメインであるＤ３ドメイン（例えば、配列番号５）を含む。種々の実施形態において、本発明のＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体は、ＩＬ－２Ｒα細胞外ドメインまたはその機能性断片であるＤ３ドメインを含む。種々の好ましい実施形態において、本発明のＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体は、ＩＬ－２ＲαＳｕｓｈｉドメインであるＤ３ドメインを含む。種々の実施形態において、Ｄ３ドメインは、目的の治療部位で活性化を受けるまで、Ｄ２の機能活性を遮蔽することが可能である。
ＩＬ－１５受容体α
ＩＬ－１５受容体は、ベータ（β）・ガンマ（γ）サブユニット（ＩＬ－２受容体と共有）と、アルファ（α）サブユニット（ＩＬ－１５と高親和性で結合）と、からなるＩ型サイトカイン受容体である。完全長ヒトＩＬ－１５Ｒαは、３２アミノ酸長のシグナルペプチド、１７３アミノ酸長の細胞外ドメイン、２１アミノ酸長の膜貫通領域、３７アミノ酸長の細胞質側末端、および複数のＮ結合型またはＯ結合型糖鎖付加部位を有するタイプ１膜貫通型タンパク質である（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７０巻：頁２９８６２－２９８６９、１９９５年）。以前に、ＩＬ－１５Ｒαの細胞外ドメイン全体に相当するＩＬ－１５Ｒα鎖の天然可溶型が、高親和性のＩＬ－１５アンタゴニストとして働くことが明らかにされた。しかし、その知見とは際立って対照的であることに、ＩＬ－１５に対する結合親和性の大部分を占める、ＩＬ－１５Ｒαの組換え型の可溶性ｓｕｓｈｉドメインが、ＩＬ－１５Ｒβ／γヘテロ二量体を介したＩＬ－１５の結合性および生物学的効果（増殖およびアポトーシスからの保護）を増強することで強力なＩＬ－１５アゴニストとして働き、一方で三分子型ＩＬ－１５Ｒα／β／γ膜受容体のＩＬ－１５結合性と機能には影響を与えないことが明らかとなった。これらの結果から、天然に産生されている場合、このような可溶性ｓｕｓｈｉドメインがＩＬ－１５のトランスプレゼンテーション機構に関与している可能性が示唆された（Ｍｏｒｔｉｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２８１巻（３号）：頁１６１２－１６１９、２００６年）。
本明細書で使用される場合、「ネイティブＩＬ－１５Ｒα」および「ネイティブインターロイキン－１５受容体α」という用語は、タンパク質またはポリペプチドの文脈の中で、未成熟型または前駆型、成熟型および天然アイソフォームを包含して、任意の天然哺乳類インターロイキン－１５受容体α（「ＩＬ－１５Ｒα」）アミノ酸配列を指す。種々のネイティブ哺乳類ＩＬ－１５Ｒαのアミノ酸配列のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号の非限定例としては、ＮＰ＿００２１８０（ヒト）、ＡＢＫ４１４３８（アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ））、ＮＰ＿０３２３８４（ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ））、Ｑ６０８１９（ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ））、ＣＡ１４１０８２（ヒト）が挙げられる。種々の実施形態において、ネイティブＩＬ－１５Ｒαは、天然哺乳類ＩＬ－１５Ｒαポリペプチドの未成熟型である。種々の実施形態において、ネイティブＩＬ－１５Ｒαは、天然哺乳類ＩＬ－１５Ｒαポリペプチドの成熟型である。種々の実施形態において、ネイティブＩＬ－１５Ｒαは、天然哺乳類ＩＬ－１５Ｒαポリペプチドの一形態である。種々の実施形態において、ネイティブＩＬ－１５Ｒαは、天然哺乳類ＩＬ－１５Ｒαポリペプチドの完全長形態である。種々の実施形態において、ネイティブＩＬ－１５Ｒαは、天然ヒトＩＬ－１５Ｒαポリペプチドの未成熟型である。種々の実施形態において、ネイティブＩＬ－１５Ｒαは、天然ヒトＩＬ－１５Ｒαポリペプチドの成熟型である。種々の実施形態において、ネイティブＩＬ－１５Ｒαは、天然ヒトＩＬ－１５Ｒαポリペプチドの完全長形態である。種々の実施形態において、ネイティブＩＬ－１５Ｒαタンパク質またはポリペプチドは、単離または精製されたものである。種々の実施形態において、ＩＬ－１５Ｒαドメインは、下記の配列番号４に記載のヒトＩＬ－１５Ｒα配列のアミノ酸配列に由来するものである：
ＭＡＰＲＲＡＲＧＣＲＴＬＧＬＰＡＬＬＬＬＬＬＬＲＰＰＡＴＲＧＩＴＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲＤＰＡＬＶＨＱＲＰＡＰＰＳＴＶＴＴＡＧＶＴＰＱＰＥＳＬＳＰＳＧＫＥＰＡＡＳＳＰＳＳＮＮＴＡＡＴＴＡＡＩＶＰＧＳＱＬＭＰＳＫＳＰＳＴＧＴＴＥＩＳＳＨＥＳＳＨＧＴＰＳＱＴＴＡＫＮＷＥＬＴＡＳＡＳＨＱＰＰＧＶＹＰＱＧＨＳＤＴＴＶＡＩＳＴＳＴＶＬＬＣＧＬＳＡＶＳＬＬＡＣＹＬＫＳＲＱＴＰＰＬＡＳＶＥＭＥＡＭＥＡＬＰＶＴＷＧＴＳＳＲＤＥＤＬＥＮＣＳＨＨＬ（配列番号４）。
種々の実施形態において、本発明のＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体は、下記の配列番号５に記載の成熟ヒトＩＬ－１５Ｒαポリペプチドのアミノ酸配列を含むＩＬ－１５ＲαＳｕｓｈｉ＋ドメインである、Ｄ３ドメインを含む：
ＩＴＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲＤＰＡＬＶＨＱＲＰＡＰＰ（配列番号５）。
種々の実施形態において、ＩＬ－１５の切断型コグネイト補助受容体であり、完全長ＩＬ－１５Ｒα（配列番号４）の結合親和性の大部分を再現している、ＩＬ－１５ＲαＳｕｓｈｉ＋（配列番号５）が、ＩＬ－１５ ＶｉｔｏＫｉｎｅを作製するために、ＩＬ－１５とＩＬ－１５ＲαＳｈｕｓｈｉ＋とを連結している切断可能なリンカーまたは切断不可なリンカーを調整することによって、ＩＬ－１５活性を遮蔽するためのＤ３ドメインとして使用された。当業者であれば理解できることであるが、Ｄ３ドメインの長さは、完全長ＩＬ－１５Ｒα（配列番号４）の結合活性の大部分を再現できる限り、すなわち機能性断片となる限り、配列番号５に記載の配列と異なっていてもよい。ＩＬ－１５ ＶｉｔｏＫｉｎｅ設計の他との明確な差異は、ＩＬ－１５とＩＬ－１５αとの間の並外れて高い親和性（３０ｐＭ）をはじめとする、ＩＬ－１５経路のユニークな特徴の完全利用と、ＩＬ－１５αの複合体形成が生体内におけるＩＬ－１５の活性を増強すること、にある。ＩＬ－１５とＩＬ－１５αＳｕｓｈｉ＋とを連結しているリンカーが、患部で発現上昇しているプロテアーゼによって切断された後も、ＩＬ－１５ＲαＳｈｕｓｈｉ＋または任意のＩＬ－１５ＲαＥＣＤ由来機能断片は、ＩＬ－１５の非共有結合性会合を残しており、ＩＬ－１５活性を増強すると期待される。
ＩＬ－２受容体
ＩＬ－２受容体（ＩＬ－２Ｒ）は、リンパ球などのある種の免疫細胞の表面上に発現されているヘテロ三量体タンパク質であり、ＩＬ－２と呼ばれるサイトカインに結合・応答する。ＩＬ－２Ｒは、以下の３種のサブユニットを有する：α（ＣＤ２５）、β（ＣＤ１２２）、およびγｃ（ＣＤ１３２、他の５種のサイトカイン受容体（ＩＬ－４Ｒ、ＩＬ－７Ｒ、ＩＬ－９Ｒ、ＩＬ－１５Ｒ、およびＩＬ－２１Ｒ）との共有鎖）。ヒト受容体のα鎖（別名：Ｔａｃ抗原またはｐ５５）は、ＩＬ－２ＲＡ遺伝子によって染色体１０ｐ１４－１５にコードされている。この受容体のヒトβ鎖（ＩＬ－２ＲＢ、ＣＤ１２２）の遺伝子は染色体２２ｑ１１．２－１２に位置しており、一方、共通ＩＬ－２ＲγＣ鎖（ＩＬ－２ＲＧ）の遺伝子は染色体Ｘｑ１３に位置している。この受容体の３種全てのサブユニットの集合は、Ｂ細胞およびＴ細胞へのシグナル伝達にとって重要である。ＩＬ－２Ｒは、リンパ系（ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｌｉｎａｇｅ）のＴ細胞、Ｂ細胞、およびＮＫ細胞、並びにマクロファージ、単球、および好中球のような骨髄系を含むほぼ全ての造血細胞で（一時的または恒常的に）細胞表面上に発見された。このシグナルは、ヤヌスキナーゼであるＪａｋ１およびＪａｋ３を介して細胞内に伝達される。受容体β鎖のサイトゾル内部分のリン酸化により、ＳＴＡＴ－３因子およびＳＴＡＴ－５因子のホモ二量体形成が可能となる。ＳＴＡＴ－３およびＳＴＡＴ－５のホモ二量体は核に対する親和性の増加を示し、核において、ＩＬ－２依存的遺伝子の転写を増強する特異的なＤＮＡエレメントに結合する。
本明細書で使用される場合、「ネイティブＩＬ－２Ｒα」および「ネイティブインターロイキン－２受容体α」という用語は、タンパク質またはポリペプチドの文脈の中で、未成熟型または前駆型、成熟型および天然アイソフォームを包含して、任意の天然哺乳類インターロイキン－２受容体α（「ＩＬ－２Ｒα」）アミノ酸配列を指す。種々のネイティブ哺乳類ＩＬ－２Ｒαのアミノ酸配列のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号の非限定例としては、ＮＰ＿０３２３９３．３（ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ））、ＣＡＫ２６５５３．１（ヒト）、およびＮＰ＿０００４０８．１（ヒト）が挙げられる。種々の実施形態において、ネイティブＩＬ－２Ｒαは、天然哺乳類ＩＬ－２Ｒαポリペプチドの未成熟型である。種々の実施形態において、ネイティブＩＬ－２Ｒαは、天然哺乳類ＩＬ－２Ｒαポリペプチドの成熟型である。種々の実施形態において、ネイティブＩＬ－２Ｒαは、天然哺乳類ＩＬ－２Ｒαポリペプチドの一形態である。種々の実施形態において、ネイティブＩＬ－２Ｒαは、天然哺乳類ＩＬ－２Ｒαポリペプチドの完全長形態である。種々の実施形態において、ネイティブＩＬ－２Ｒαは、天然ヒトＩＬ－２Ｒαポリペプチドの未成熟型である。種々の実施形態において、ネイティブＩＬ－２Ｒαは、天然ヒトＩＬ－２Ｒαポリペプチドの成熟型である。種々の実施形態において、ネイティブＩＬ－２Ｒαは、天然ヒトＩＬ－２Ｒαポリペプチドの完全長形態である。種々の実施形態において、ネイティブＩＬ－２Ｒαタンパク質またはポリペプチドは、単離または精製されたものである。種々の実施形態において、ＩＬ－２Ｒαドメインは、下記の配列番号９に記載のヒトＩＬ－２Ｒα配列のアミノ酸配列に由来するものである：
ＭＤＳＹＬＬＭＷＧＬＬＴＦＩＭＶＰＧＣＱＡＥＬＣＤＤＤＰＰＥＩＰＨＡＴＦＫＡＭＡＹＫＥＧＴＭＬＮＣＥＣＫＲＧＦＲＲＩＫＳＧＳＬＹＭＬＣＴＧＮＳＳＨＳＳＷＤＮＱＣＱＣＴＳＳＡＴＲＮＴＴＫＱＶＴＰＱＰＥＥＱＫＥＲＫＴＴＥＭＱＳＰＭＱＰＶＤＱＡＳＬＰＧＨＣＲＥＰＰＰＷＥＮＥＡＴＥＲＩＹＨＦＶＶＧＱＭＶＹＹＱＣＶＱＧＹＲＡＬＨＲＧＰＡＥＳＶＣＫＭＴＨＧＫＴＲＷＴＱＰＱＬＩＣＴＧＥＭＥＴＳＱＦＰＧＥＥＫＰＱＡＳＰＥＧＲＰＥＳＥＴＳＣＬＶＴＴＴＤＦＱＩＱＴＥＭＡＡＴＭＥＴＳＩＦＴＴＥＹＱＶＡＶＡＧＣＶＦＬＬＩＳＶＬＬＬＳＧＬＴＷＱＲＲＱＲＫＳＲＲＴＩ（配列番号９）。
種々の実施形態において、本発明のＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体は、下記の配列番号１０に記載の成熟ヒトＩＬ－２Ｒαポリペプチドのアミノ酸配列を含むＩＬ－２ＲαＳｕｓｈｉドメインである、Ｄ３ドメインを含む：
ＥＬＣＤＤＤＰＰＥＩＰＨＡＴＦＫＡＭＡＹＫＥＧＴＭＬＮＣＥＣＫＲＧＦＲＲＩＫＳＧＳＬＹＭＬＣＴＧＮＳＳＨＳＳＷＤＮＱＣＱＣＴＳＳＡＴＲＮＴＴＫＱＶＴＰＱＰＥＥＱＫＥＲＫＴＴＥＭＱＳＰＭＱＰＶＤＱＡＳＬＰＧＨＣＲＥＰＰＰＷＥＮＥＡＴＥＲＩＹＨＦＶＶＧＱＭＶＹＹＱＣＶＱＧＹＲＡＬＨＲＧＰＡＥＳＶＣＫＭＴＨＧＫＴＲＷＴＱＰＱＬＩＣＴＧ（配列番号１０）。
種々の実施形態において、ＩＬ－２活性を遮蔽するためにＩＬ－２ＲαＳｕｓｈｉ（配列番号１０）が用いられて、ＩＬ－２ ＶｉｔｏＫｉｎｅが作製される。単一のｓｕｓｈｉドメインを含んだＩＬ－１５Ｒαとは異なり、ＩＬ－２Ｒαは、リンカー領域で隔てられた２つのｓｕｓｈｉドメインを含む。種々の実施形態において、ＩＬ－２ ＶｉｔｏＫｉｎｅは、ＩＬ－２ＲαとＩＬ－２との間の特定の非共有結合性相互作用を壊すことで、ＩＬ－２に対するＩＬ－２Ｒαの結合親和性を減少させるためのアミノ酸置換を含有する、ＩＬ－２ＲαＳｕｓｈｉバリアントを含む。ネイティブＩＬ－２Ｒαは３０ｎＭという中程度の親和性でＩＬ－２に結合するが、リンカーの切断後も、ＩＬ－２Ｒαが解離しないという可能性がある。ＩＬ－２ＲαがＩＬ－２と会合することで、ＩＬ－２の活性が低減し、且つ／または、Ｔ細胞亜群のバランスが好ましくない方向に傾く場合がある。ＩＬ－２ＲαＳｕｓｈｉに導入された、親和性を減少させる変異（例えば、Ｋ３８Ｅ、もしくはＹ４３Ａ、またはこれら２つの置換の組み合わせ）により、ＩＬ－２Ｒαｓｕｓｈｉドメインはプロテアーゼによるリンカー切断後にＩＬ－２から解離しやすい。
Ｌ１リンカーおよびＬ２リンカー
切断可能なリンカー
切断可能なリンカー、すなわち疾患関連酵素に感受性のリンカーは、患部以外の組織と比較した場合に患部において高レベルで存在しているプロテアーゼによる特異的な切断が可能な、タンパク性基質などの部分を含有していてもよい。様々な種類のがん（例えば、固形腫瘍）においてレベルが増加している基質既知の酵素が、文献で報告されている。例えば、各々の全体が参照によって本明細書に援用される、Ｌａ Ｒｏｃｃａら、Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、９０巻：頁１４１４－１４２１、およびＤｕｃｒｙら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．、２１巻：頁５－１３、２０１０年を参照されたい。種々の実施形態において、プロテアーゼ切断可能なリンカーを切断することが可能なプロテアーゼは、メタロプロテイナーゼ、例えば、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）１～２８、セリンプロテアーゼ、例えば、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）およびマトリプターゼ、システインプロテアーゼ、例えば、レグマイン、アスパラギン酸プロテアーゼ、並びにカテプシンプロテアーゼからなる群から選択される。例示的なプロテアーゼ基質のペプチド配列を表９に示す。
Figure 0007477885000013
Ｄ２ドメインのＣ末端、Ｎ末端、または両端の、様々な長さのペプチドスペーサーを有するまたは有さない、プロテアーゼ切断可能なリンカーとして使用できる例示的なプロテアーゼ基質のペプチド配列を、表１０に示す。
Figure 0007477885000014
種々の実施形態において、プロテアーゼはＭＭＰ－９またはＭＭＰ－２である。さらなる特定の実施形態において、プロテアーゼはｕＰＡである。さらなる特定の実施形態において、プロテアーゼはＭＭＰ－１４である。さらに特定の実施形態において、プロテアーゼはレグマインである。種々の実施形態において、１つのＶｉｔｏＫｉｎｅ分子は２種の異なるプロテアーゼを含む。種々の実施形態において、プロテアーゼ切断可能なリンカーはプロテアーゼ認識配列「ＧＰＬＧＭＬＳＱ」（配列番号７７）を含む。種々の実施形態において、プロテアーゼ切断可能なリンカーはプロテアーゼ認識配列「ＬＧＧＳＧＲＳＡＮＡＩＬＥ」（配列番号８０）を含む。種々の実施形態において、プロテアーゼ切断可能なリンカーはプロテアーゼ認識配列「ＳＧＲＳＥＮＩＲＴＡ」（配列番号１５７）を含む。種々の実施形態において、プロテアーゼ切断可能なリンカーはプロテアーゼ認識配列「ＧＰＴＮＫＶＲ」（配列番号１５８）を含む。種々の実施形態において、リンカー（例えば、切断可能なリンカー）は、腫瘍関連プロテアーゼで切断されてもよい。種々の実施形態において、切断可能なリンカーは、炎症性疾患などのがん以外の疾患における、他の疾患特異的プロテアーゼで切断されてもよい。
種々の実施形態において、ペプチドスペーサーは、プロテアーゼ切断可能な配列のどちらかの側に挿入されてもよいし、あるいは、プロテアーゼ切断可能な配列の両側に隣接するように挿入されてもよいし、あるいは、プロテアーゼ基質部位を持たない切断不可なリンカーとして挿入されてもよい。ペプチドスペーサーは、切断に関与する酵素がより到達し易くなるように、切断可能なリンカーを位置付ける働きをする。スペーサーの長さは、酵素的切断のための到達性と、Ｄ２ドメインの生物活性の発現を可逆的に遮蔽するために必要とされる空間的制約とのバランスを取るように、変更または最適化してもよい。スペーサーは１～１００個のアミノ酸を含み得る。好適なペプチドスペーサーは当該技術分野において公知のものであり、グリシンおよびセリンなどの可動性アミノ酸残基を含有するペプチドリンカーを包含するが、それらに限定はされない。種々の実施形態において、スペーサーには、ＧＳモチーフ、ＧＧＳモチーフ、ＧＧＧＧＳモチーフ、ＧＧＳＧモチーフ、またはＳＧＧＧモチーフを含ませることができる。種々の実施形態において、スペーサーには、Ｇモチーフ、Ｓモチーフ、ＧＳモチーフ（配列番号１１６）、ＧＧＳモチーフ（配列番号１１７）、ＧＳＧＳモチーフ（配列番号１２１）、ＧＳＧＳＧＳモチーフ（配列番号１２２）、ＧＳＧＳＧＳＧＳモチーフ（配列番号１２３）、ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳモチーフ（配列番号１２４）、またはＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳモチーフ（配列番号１２５）をはじめとする、１～１２個のアミノ酸を含ませることができる。他の実施形態では、スペーサーには、（ＧＧＧＧＳ）ｎモチーフ（ｎは１～１０の整数）を含ませることができる。他の実施形態では、スペーサーには、グリシンおよびセリン以外のアミノ酸を含ませることもできる。
スペーサーペプチドがプロテアーゼ基質ペプチド（下線）に隣接している、例示的なプロテアーゼ切断可能なリンカーを表１１に示す。
Figure 0007477885000015
種々の実施形態において、切断可能なリンカーは、加水分解を包含するがこれに限定はされない、タンパク質分解以外の機構で活性化させることができ、例えば、様々なｐＨ下での制御放出機構を介して放出され得る遊離可能ペグ化ポリマーなどである。
切断不可なリンカー
切断不可なリンカーは、タンパク質ドメイン間に、共有結合と、構造的および／または空間的な追加の可動性とを与える。当該技術分野においては公知であるが、グリシンおよびセリンなどの可動性アミノ酸残基を含むペプチドリンカーは、切断不可なリンカーとして使用できる。種々の実施形態において、切断不可なリンカーは１～１００個のアミノ酸を含み得る。種々の実施形態において、スペーサーには、ＧＳモチーフ（配列番号１１６）、ＧＧＳモチーフ（配列番号１１７）、ＧＧＧＧＳモチーフ（配列番号１１８）、ＧＧＳＧモチーフ（配列番号１１９）、またはＳＧＧＧモチーフ（配列番号１２０）を含ませることができる。他の実施形態では、リンカーには、（ＧＧＧＧＳ）ｎモチーフ（ｎは１～１０の整数）を含ませることができる。他の実施形態では、リンカーには、グリシンおよびセリン以外のアミノ酸を含ませることもできる。別の実施形態では、切断不可なリンカーは、単純な化学結合であってよく、例えば、アミド結合（例えば、ＰＥＧの化学的な結合によるもの）である。切断不可なリンカーは、生理条件下だけでなく、がん部位や炎症性疾患部位などの患部においても安定である。
例示的な切断不可なリンカーを表１２に示す。
Figure 0007477885000016
切断可能なリンカーと切断不可なリンカーの組み合わせ
種々の実施形態において、Ｌ１リンカーおよびＬ２リンカーは、共に切断可能なリンカーとしたり、共に切断不可なリンカーとしたり、切断可能なリンカーと切断不可なリンカーの組み合わせとしたりすることで、Ｄ２ドメインの活性部分に様々な形態を取らせて、様々な治療目的を達成したり、リスク便益比のバランスを取ったり、サイトカインの様々な特性を確認したりすることができる。リンカーの切断によって遊離する活性型を図２に例示する。Ｌ１の切断から生じる活性型１、およびＬ１とＬ２両方の切断から生じる活性型３は、Ｄ３の高次構造に応じて様々な程度の機能活性を有する短時間作用性のサイトカインである。半減期延長部分または患部組織ターゲティング部分であるＤ１からの切断および遊離は、活性型Ｄ２ドメインの局所濃度を増加させるであろう。局所的に作用した後、この短時間作用性活性型は、体循環から迅速に排除され、毒性が低減され得る。対照的に、Ｌ２の切断から生じる第２活性型は、患部に持続的に残留しより長く且つ増強された有効性を示す、機能が完全に戻った、長時間作用性の、組織を標的とする保存されたサイトカインである。
ポリヌクレオチド
別の態様において、本開示は、本開示の、ＩＬ－１５、ＩＬ－１５バリアント、ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１５Ｒαバリアント、Ｆｃ、Ｆｃバリアント、ＩＬ－１５－Ｆｃ融合タンパク質、ＩＬ－１５ＲαＳｕｓｈｉ－Ｆｃ融合タンパク質、またはＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体をコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子を提供する。主題の核酸は一本鎖であっても二本鎖であってもよい。このような核酸はＤＮＡ分子であってもＲＮＡ分子であってもよい。ＤＮＡとしては、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ、およびこれらの組み合わせが挙げられる。ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体をコードするゲノムＤＮＡは、多くの種に対応したゲノムライブラリーから得られる。合成ＤＮＡは、重複するオリゴヌクレオチド断片を化学合成した後、それらの断片をアセンブルし、コード領域および隣接配列の一部または全部を再構成することにより得られる。ＲＮＡは、Ｔ７プロモーターを用いたベクターなどの高レベルのｍＲＮＡ合成を指示する原核生物発現ベクターと、ＲＮＡポリメラーゼとから得ることができる。本開示のＤＮＡ分子は、完全長遺伝子だけでなく、ポリヌクレオチドやその断片も包含する。完全長遺伝子は、Ｎ末端シグナル配列をコードする配列も包含し得る。このような核酸が、新規ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体を作製するための方法などで使用され得る。
種々の実施形態において、単離された核酸分子は、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含み、さらに、本明細書に記載の少なくとも１つの異種タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。種々の実施形態において、上記の核酸分子は、本明細書に記載のリンカーまたはヒンジリンカーをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。
種々の実施形態において、本開示の組換え核酸は、発現コンストラクト内の１または複数の制御ヌクレオチド配列に機能的に連結されていてもよい。制御配列は、当該技術分野において承認されたもので、ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体の発現を指示するように選択される。すなわち、制御配列という用語には、プロモーター、エンハンサー、および他の発現調節エレメントが包含される。例示的な制御配列が、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、アカデミックプレス社、サンディエゴ、カリフォルニア州（１９９０）に記載されている。典型的には、上記の１または複数の制御ヌクレオチド配列として、プロモーター配列、リーダー配列またはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始配列および転写終結配列、翻訳開始配列および翻訳終結配列、並びにエンハンサー配列またはアクチベーター配列を含むことができるが、これらに限定はされない。当該技術分野において公知の構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターが、本開示により企図されている。プロモーターは、天然プロモーターであってもよいし、あるいは、２つ以上のプロモーターエレメントを組み合わせたハイブリッドプロモーターであってもよい。発現コンストラクトは、プラスミドなどの、細胞内またはエピソーム内に存在するものであってもよいし、あるいは、発現コンストラクトを染色体に挿入してもよい。種々の実施形態において、形質転換宿主細胞のセレクションを可能とするために、発現ベクターは選択マーカー遺伝子を含む。選択マーカー遺伝子は当該技術分野において周知であり、使用される宿主細胞によって異なる。
本開示の別の態様において、主題の核酸は、ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体をコードしている、少なくとも１つの制御配列に機能的に連結されたヌクレオチド配列を含む発現ベクター内にある状態で、提供される。用語「発現ベクター」は、ポリヌクレオチド配列からポリペプチドを発現させるための、プラスミド、ファージ、ウイルス、またはベクターを指す。宿主細胞における発現に好適なベクターは容易に利用可能なものであり、ベクターへの核酸分子の挿入は標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて行われる。そのようなベクターには、作動可能なように連結されている場合にＤＮＡ配列の発現を調節する、ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体をコードするＤＮＡ配列を発現させるためにこれらのベクターに用いることができる、種々様々な発現調節配列を含ませることができる。このような有用な発現調節配列としては、例えば、ＳＶ４０の初期プロモーターおよび後期プロモーター、ｔｅｔプロモーター、アデノウイルスまたはサイトメガロウイルスの前初期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ系またはＴＲＣ系、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによって発現が指示されるＴ７プロモーター、λファージの主要なオペレーター領域およびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質に対する調節領域、３－ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖酵素に対するプロモーター、酸性ホスファターゼ（例えば、ＰｈｏＳ）のプロモーター、酵母α接合因子のプロモーター、バキュロウイルス系の多角体プロモーター、並びに、原核細胞もしくは真核細胞またはそれらのウイルスの遺伝子の発現を調節することが知られている他の配列、並びにこれらの種々の組み合わせ、が挙げられる。発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択および／または発現が所望されるタンパク質の種類などの要因によって異なる場合があることは理解されよう。さらに、ベクターのコピー数、そのコピー数を調節する能力、および当該ベクターにコードされる任意の他のタンパク質（抗生物質マーカーなど）の発現についても、考慮がなされるべきである。ＶｉｔｏＫｉｎｅの発現に好適な例示的な発現ベクターとして、ＶｉｔｏＫｉｎｅポリヌクレオチドと、当該技術分野において公知または以下に記載の任意の追加の好適なベクターとを含有するｐＤＳＲａ、およびその誘導体がある。
クローニングされた遺伝子またはその一部を、原核細胞もしくは真核細胞（酵母細胞、鳥類細胞、昆虫細胞、または哺乳類細胞）のいずれか、またはその両方での発現に好適なベクターにライゲーションすることで、本開示の組換え核酸を産生させることが可能となる。組換えＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体を産生させるための発現用溶媒は、プラスミドと他のベクターを含む。例えば、好適なベクターとしては、大腸菌などの原核細胞における発現用の、以下の各種プラスミドが挙げられる：ｐＢＲ３２２由来プラスミド、ｐＥＭＢＬ由来プラスミド、ｐＥＸ由来プラスミド、ｐＢＴａｃ由来プラスミド、およびｐＵＣ由来プラスミド。
哺乳類発現ベクターの中には、細菌内のベクターの増殖を促進する原核生物性配列と、真核細胞で発現される１または複数の真核生物性転写単位とを、両方含有するものがある。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ由来ベクター、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ由来ベクター、ｐＲｃ／ＣＭＶ由来ベクター、ｐＳＶ２ｇｐｔ由来ベクター、ｐＳＶ２ｎｅｏ由来ベクター、ｐＳＶ２－ｄｈｆｒ由来ベクター、ｐＴｋ２由来ベクター、ｐＲＳＶｎｅｏ由来ベクター、ｐＭＳＧ由来ベクター、ｐＳＶＴ７由来ベクター、ｐｋｏ－ｎｅｏ由来ベクター、およびｐＨｙｇ由来ベクターは、真核細胞のトランスフェクションに好適な哺乳類発現ベクターの例である。これらのベクターのいくつかは、原核細胞および真核細胞の両方における複製および薬剤耐性セレクションを促すための、ｐＢＲ３２２などの細菌性プラスミド由来の配列による改変を受けている。あるいは、真核細胞におけるタンパク質の一過性発現のために、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ－１）、またはエプスタイン・バーウイルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来、およびｐ２０５）などのウイルスの誘導体を用いることができる。他のウイルス（レトロウイルスを含む）発現系の例は、下記の遺伝子治療送達系の説明に見出すことができる。プラスミドの調製および宿主生物の形質転換で使用される種々の方法は、当該技術分野において周知である。原核細胞および真核細胞の両方に好適な他の発現系、並びに一般的な組換え法については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ、およびＭａｎｉａｔｉｓ（編）（コールド・スプリング・ハーバー研究所出版局、１９８９年）、１６章および１７章を参照されたい。場合によっては、バキュロウイルス発現系を使用して組換えポリペプチドを発現することが望ましいことがある。そのようなバキュロウイルス発現系の例としては、ｐＶＬ由来ベクター（ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、およびｐＶＬ９４１など）、ｐＡｃＵＷ由来ベクター（ｐＡｃＵＷ１など）、およびｐＢｌｕｅＢａｃ由来ベクター（Ｂ－ｇａｌ含有ｐＢｌｕｅＢａｃ ＩＩＩなど）が挙げられる。
種々の実施形態において、主題のＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体をＣＨＯ細胞で産生させるためのベクターが設計されることとなり、例えば、Ｐｃｍｖ－Ｓｃｒｉｐｔベクター（ストラタジーン社、ラ・ホーヤ、カリフォルニア州）、ｐｃＤＮＡ４ベクター（インビトロジェン社、カールズバッド、カリフォルニア州）、およびｐＣＩ－ｎｅｏベクター（プロメガ社、マディソン、ウィスコンシン州）などである。後述するように、主題の遺伝子コンストラクトを用いて、培養液中で増殖された細胞において主題のＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体の発現を引き起こし、例えば、タンパク質（融合タンパク質またはバリアントタンパク質を含む）を産生させ、精製を行うことができる。
本開示はまた、１または複数の主題のＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む組換え遺伝子をトランスフェクトされた宿主細胞に関する。宿主細胞は任意の原核細胞または真核細胞であり得る。例えば、本開示のＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体は、大腸菌などの細菌細胞で発現されてもよく、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現系を使用）で発現されてもよく、酵母で発現されてもよく、あるいは哺乳類細胞で発現されてもよい。他の好適な宿主細胞として、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはヒト胚腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞など、当業者に公知のものがある。
これを受けて、本開示はさらに、主題のＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体を生産する方法に関する。例えば、ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体をコードする発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を適切な条件下で培養することにより、ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体を発現させることができる。ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体は、分泌後、当該ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体を含有する細胞および培地の混合物から単離することができる。あるいは、ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体を細胞質または膜画分に保持させ、細胞を回収、溶解し、上記タンパク質を単離してもよい。細胞培養液には宿主細胞、培地、および他の副生成物が含まれる。細胞培養に好適な培地は当該技術分野において周知のものである。
本開示のポリペプチドおよびタンパク質は、当業者に周知のタンパク質精製法に従って精製することができる。これらの方法は、あるレベルでの、タンパク質性画分と非タンパク質性画分の粗分画を含む。ペプチドポリペプチドを他のタンパク質から分離した後、目的のペプチドまたはポリペプチドをクロマトグラフ法および電気泳動法によりさらに精製することで、部分的または完全な精製（すなわち均一になるまでの精製）を達成することができる。「単離されたポリペプチド」または「精製されたポリペプチド」という用語は、本明細書で使用される場合、ポリペプチドがその天然で入手可能な状態に対し任意の程度精製されている、他の成分から単離可能な組成物を指すことが意図されている。精製されたポリペプチドとは、そのため、それを天然に生じ得る環境から分離されたポリペプチドも指す。一般に、「精製された」とは、分画を受けて種々の他成分を除去された、発現されたその生物活性を実質的に保持している、ポリペプチド組成物を指す。用語「実質的に精製された」が用いられている場合、この呼称は、ポリペプチドまたはペプチドが組成物の主成分を形成している、例えば、組成物中のタンパク質の約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約８５％以上、または約９０％以上を構成している、ペプチド組成物またはポリペプチド組成物を指す。
精製に用いるのに好適な種々の方法は、当業者に周知なものである。これらの方法としては、例えば、硫酸アンモニウム、ＰＥＧ、抗体（免疫沈降）などを用いた沈降、または熱変性による沈降の後に、遠心分離；アフィニティークロマトグラフィー（プロテインＡカラム）、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー；等電点電気泳動；ゲル電気泳動；これらの方法の組み合わせ、を行うことが挙げられる。当該技術分野では周知のことであるが、種々の精製工程を実行する順番は変更しても、あるいは、ある特定の工程を省いても、尚も、実質的に精製されたポリペプチドを調製するのに好適な方法となり得ると考えられる。
医薬組成物
別の態様において、本開示は、ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体を、薬剤的に許容できる担体と混合して含む、医薬組成物を提供する。そのような薬剤的に許容できる担体は、当業者に周知で理解されるものであり、広範に説明がなされている（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ（編）、マック出版社、１９９０年を参照）。薬剤的に許容できる担体は、組成物のｐＨ、モル浸透圧濃度、粘度、透明度、色、等張性、匂い、無菌性、安定性、溶解速度、遊離速度、吸着性、または浸透性などを変化、維持または保存する目的で含まれ得る。このような医薬組成物は、当該ポリペプチドの物理的状態、安定性、インビボ放出速度、およびインビボクリアランス速度に影響し得る。好適な薬剤的に許容できる担体（ｃａｒｒｉｅｒ）としては、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジンなど）；抗菌剤；抗酸化剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、または亜硫酸水素ナトリウムなど）；緩衝剤（ホウ酸塩、炭酸水素塩、トリス塩酸、クエン酸塩、リン酸塩、他の有機酸など）；増量剤（ｂｕｌｋｉｎｇ ａｇｅｎｔ）（マンニトールまたはグリシンなど）、キレート化剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）；錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、β－シクロデキストリン、またはヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンなど）；充填剤（ｆｉｌｌｅｒ）；単糖類；二糖類および他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンなど）；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなど）；着色剤；着香剤および希釈剤（ｄｉｌｕｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）； 乳化剤；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）；低分子量ポリペプチド；塩形成性対イオン（ナトリウムなど）；保存剤（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸、または過酸化水素など）；溶媒（グリセリン、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコールなど）；糖アルコール（マンニトールまたはソルビトールなど）；懸濁化剤；界面活性剤または湿潤剤（プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート、例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサポール（ｔｙｌｏｘａｐａｌ）など）；安定化剤（スクロースまたはソルビトール）；等張化剤（ｔｏｎｉｃｉｔｙ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ａｇｅｎｔ）（ハロゲン化アルカリ金属（好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、マンニトール ソルビトールなど）；送達担体（ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｖｅｈｉｃｌｅ）；賦形剤（ｄｉｌｕｅｎｔ）；医薬品添加物（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）、および／または補助剤（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｄｊｕｖａｎｔ）が挙げられるが、これらに限定はされない。
医薬組成物中の主要な溶媒または担体は、本質的に水性であっても非水性であってもよい。例えば、好適な溶媒または担体は、注射用蒸留水であってもよく、生理的食塩水であってもよく、人工脳脊髄液であってもよく、非経口投与用の組成物に通常含まれる他の物質を添加することができる。さらなる例示的な溶媒として、血清アルブミンを混合した中性緩衝生理食塩水または生理食塩水がある。他の例示的な医薬組成物は、約ｐＨ７．０～８．５のトリス緩衝液、または約ｐＨ４．０～５．５の酢酸緩衝溶液を含み、当該緩衝液にはソルビトールまたはその好適な代替物をさらに含ませてもよい。本開示の１つの実施形態において、所望の純度を有する選択された組成物を任意の製剤化剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ）（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、上記）と混合することによって、凍結乾燥ケークまたは水溶液の形態で、保存用に、組成物を調製してもよい。さらに、治療用組成物は、スクロースなどの適切な医薬品添加物を用いて、凍結乾燥物として製剤化してもよい。最適な医薬組成物は、意図された投与経路、送達様式、および目的の用量などに基づいて、当業者によって決定される。
非経口投与が企図される場合、治療用医薬組成物は、薬剤的に許容できる溶媒中に所望のＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体を含む、発熱物質を含まない非経口投与において許容される水溶液の形態であり得る。特に好適な非経口注射用溶媒は滅菌蒸留水であり、滅菌蒸留水中では、ポリペプチドは適切に保存された無菌の等張液として製剤化される。種々の実施形態において、注射投与に好適な医薬製剤が、水溶液中で製剤化され得るが、ハンクス液、リンゲル液、または生理的緩衝食塩水などの生理的に適合性の緩衝液中で製剤化されることが好ましい。水性の注射用懸濁液には、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどの、当該懸濁液の粘度を増加させる物質を含有させてもよい。さらに、活性化合物の懸濁液は、適切な油性の注射用懸濁液として調製してもよい。所望により、懸濁液には、好適な安定剤、すなわち、化合物の溶解性を増加させることで高度に濃縮された溶液の調製を可能にする薬剤、を含有させてもよい。
種々の実施形態において、治療用医薬組成物は、コロイド分散系を用いた標的化送達用に製剤化され得る。コロイド分散系としては、高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、並びに、水中油型エマルション、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む脂質をベースとした系が挙げられる。リポソーム生成で有用な脂質の例としては、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミンなどのホスファチジル化合物、スフィンゴ脂質、セレブロシド、およびガングリオシドが挙げられる。例示的なリン脂質としては、卵ホスファチジルコリン（ｅｇｇ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン、およびジステアロイルホスファチジルコリンが挙げられる。リポソームのターゲティングは、例えば、臓器特異性、細胞特異性、および細胞小器官特異性に基づいても可能であり、当該技術分野において公知である。
種々の実施形態において、医薬組成物の経口投与が企図される。この様式で投与される医薬組成物は、錠剤およびカプセル剤などの固体剤形の調剤で通例使用される担体を含ませて製剤化することもできるし、含ませずに製剤化することもできる。経口投与用の固体剤形（カプセル剤、錠剤、丸剤、糖剤、散剤、粒剤など）では、１または複数の本開示の治療用化合物を、１または複数の薬剤的に許容できる担体と混合してよく、例えば、クエン酸ナトリウムもしくはリン酸二カルシウム、および／または下記のうち任意のものである：（１）デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、および／またはケイ酸などの充填剤または増量剤；（２）例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、および／またはアカシアなどの結合剤；（３）グリセロールなどの保湿剤；（４）寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモデンプンまたはタピオカデンプン、アルギン酸、ある種のケイ酸塩、および炭酸ナトリウムなどの崩壊剤；（５）パラフィンなどの溶解遅延剤（ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｒｅｔａｒｄｉｎｇ ａｇｅｎｔ）；（６）第４級アンモニウム化合物などの吸収促進剤；（７）例えば、セチルアルコールおよびグリセロールモノステアレートなどの湿潤剤；（８）カオリン粘土およびベントナイト粘土などの吸着剤；（９）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体のポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびこれらの混合物などの滑沢剤；並びに、（１０）着色剤。カプセル剤、錠剤、および丸剤の場合、医薬組成物は緩衝剤を含んでいてもよい。ラクトースすなわち乳糖、および高分子量ポリエチレングリコールなどの医薬品添加物を用いた、軟ゼラチンカプセル中および硬ゼラチンカプセル中の充填剤として、同様の種類の固体組成物を使用してもよい。経口投与用の液体剤形としては、薬剤的に許容できる乳剤、マイクロエマルション、水剤、懸濁剤、シロップ剤、およびエリキシル剤が挙げられる。有効成分に加えて、液体剤形には、当該技術分野において一般に使用される不活性な賦形剤を含有させてもよく、例えば、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、油（具体的には、綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステル、並びにこれらの混合物などである。
種々の実施形態において、医薬組成物の皮膚または粘膜への局所投与が企図される。局所製剤には、皮膚浸透促進剤または角質層浸透促進剤として有効であると知られている各種薬剤のうちの１または複数をさらに含ませてもよい。これらの例としては、２－ピロリドン、Ｎ－メチル－２－ピロリドン、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、プロピレングリコール、メチルアルコール、イソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド、およびアゾン（ａｚｏｎｅ）がある。製剤を美容上許容できるものにするために、追加の薬剤をさらに含ませてもよい。これらの例としては、脂肪、ろう、油、色素、香料、保存剤、安定剤、および界面活性剤がある。当該技術分野において公知のものなどの、角質溶解薬を含ませてもよい。例としてはサリチル酸および硫黄がある。局所的投与用または経皮投与用の剤形としては、散剤、噴霧剤、軟膏剤、パスタ剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、水剤、貼付剤、および吸入剤が挙げられる。活性化合物は、無菌条件下で、薬剤的に許容できる担体（ｃａｒｒｉｅｒ）と、必要な場合、任意の保存剤、緩衝剤、または噴射剤と混合してよい。軟膏剤、パスタ剤、クリーム剤、およびゲル剤には、本開示の主題の化合物（例えば、ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体）の他に、動物性脂肪、植物性脂肪、油、ろう、パラフィン、デンプン、トラガント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルク、および酸化亜鉛などの医薬品添加物、またはこれらの混合物、を含有させてもよい。
本明細書における使用が企図される追加の医薬組成物としては、持続送達製剤または送達制御製剤において、ポリペプチドを含む製剤が挙げられる。リポソーム担体、生体内分解性の微小粒子または多孔質ビーズ、およびデポ剤などの、種々の他の持続送達手段または制御送達手段を製剤化するための方法も、当業者に公知である。
治療的に使用される医薬組成物の有効量は、治療の内容および目的などによって異なる。すなわち、当業者には理解されることであるが、治療に適した用量レベルは、部分的には、送達される分子、ポリペプチドが使用される予定の適応症、投与経路、並びに、患者のサイズ（体重、体表面、または臓器サイズ）および状態（年齢、および全体的な健康）に応じて変動することとなる。このため、臨床医は、最適な治療効果を得るために、用量設定と、投与経路の変更を行うことができる。典型的な用量は、上記の要因に応じて、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上の範囲を取り得る。好ましくは、ポリペプチド組成物を静脈内に注射または投与してもよい。持効性の医薬組成物を、特定の製剤の半減期およびクリアランス速度に応じて、３日～４日毎、毎週、または隔週、投与してもよい。投与頻度は、使用される製剤でのポリペプチドの薬物動態パラメーターに依存することとなる。典型的には、組成物は、目的の効果を達成する用量に達するまで投与される。組成物は、そのため、単回投与として投与されてもよいし、あるいは長期に亘る複数回投与（投与当たり同じまたは異なる濃度）として投与されてもよいし、あるいは持続点滴として投与されてもよい。適切な投与量のさらなる改善が定期的に行われる。適切な用量反応データを用いて、適切な投与量を確認してもよい。
医薬組成物の投与経路は、公知の方法に従うものであり、例えば、経口、静脈内経路、腹腔内経路、腫瘍内経路、脳内経路（脳実質内経路）、脳室内経路、筋肉内経路、眼内経路、動脈内経路、門脈内経路、病巣内経路による注射、髄内、くも膜下腔内、心室内、膀胱内、経皮、皮下、もしくは腹腔内；並びに、鼻腔内手段、経腸手段、局所的手段、舌下手段、経尿道手段、経膣手段、もしくは経直腸手段、持続放出系、または埋込デバイスによる投与経路である。所望により、組成物は、ボーラス投与で投与してもよいし、点滴で持続的に投与してもよいし、あるいは、埋込デバイスにより投与してもよい。あるいはまたはさらに、組成物は、目的分子が吸着または封入されている膜、スポンジ、または別の適切な材料の埋め込みによって、局所的に投与してもよい。埋込デバイスが使用される場合、デバイスは任意の好適な組織または臓器に埋め込むことができ、目的分子の送達は、拡散、時限放出ボーラス（ｔｉｍｅｄ－ｒｅｌｅａｓｅ ｂｏｌｕｓ）、または連続投与を介してもよい。
治療用途
本開示は、対象におけるがん細胞を治療する方法であって、上記対象に、薬剤的に許容できる担体中の、治療有効量（単独療法レジメンとして、または併用療法レジメンにおいて）の本開示のＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体を投与することを含み、そのような投与によってがん細胞の成長および／または増殖が阻害される、上記方法を提供する。特に、本開示のＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体は、がんとして特徴付けられる障害を治療する際に有用である。このような障害としては、固形腫瘍、例えば、乳がん、気道がん、脳がん、生殖器がん、消化管がん、尿路がん、眼がん、肝臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、およびこれらの遠隔転移、リンパ腫、肉腫、多発性骨髄腫、並びに白血病が挙げられるが、これらに限定はされない。乳がんの例としては、浸潤性乳管癌、浸潤性小葉癌、乳管内上皮内癌、および非浸潤性小葉癌が挙げられるが、これらに限定はされない。気道のがんの例としては、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、気管支腺腫、および胸膜肺芽腫が挙げられるが、これらに限定はされない。脳がんの例としては、脳幹神経膠腫、視床下部神経膠腫、小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫、神経芽細胞腫、髄芽腫、上衣腫、神経外胚葉性腫瘍、および松果体腫瘍が挙げられるが、これらに限定はされない。男性生殖器の腫瘍としては、前立腺がんおよび精巣がんが挙げられるが、これらに限定はされない。女性生殖器の腫瘍としては、子宮内膜がん、子宮頸部がん、卵巣がん、膣がん、および外陰がん、並びに子宮肉腫が挙げられるが、これらに限定はされない。消化管の腫瘍としては、肛門がん、結腸がん、大腸がん、食道がん、胆嚢がん、胃がん、肝がん、乳がん、膵がん、直腸がん、小腸がん、および唾液腺がんが挙げられるが、これらに限定はされない。尿路の腫瘍としては、膀胱がん、陰茎がん、腎がん、腎盂がん、尿管がん、および尿道がんが挙げられるが、これらに限定はされない。眼がんとしては、眼球内黒色腫および網膜芽細胞腫が挙げられるが、これらに限定はされない。肝がんの例としては、肝細胞癌（線維層板状異型を伴うまたは伴わない肝細胞癌）、胆管癌（肝内胆管癌）、および肝細胞癌と胆管癌の混合型が挙げられるが、これらに限定はされない。皮膚がんとしては、扁平上皮癌、カポジ肉腫、悪性黒色腫、メルケル細胞皮膚がん、および非黒色腫皮膚がんが挙げられるが、これらに限定はされない。頭頸部がんとしては、鼻咽腔がん、並びに唇および口腔のがんが挙げられるが、これらに限定はされない。リンパ腫としては、エイズ関連リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキン病、および中枢神経系のリンパ腫が挙げられるが、これらに限定はされない。肉腫としては、軟部組織の肉腫、骨肉腫、悪性線維性組織球腫、リンパ肉腫、および横紋筋肉腫が挙げられるが、これらに限定はされない。白血病としては、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、および毛様細胞性白血病が挙げられるが、これらに限定はされない。種々の実施形態において、がんは、アクチビンＡ、ミオスタチン、ＴＧＦ－β、およびＧＤＦ１５などのＴＧＦ－βファミリーメンバーの発現量が多いがんとなり、例えば、膵がん、胃がん、肝臓がん、 乳がん、卵巣がん、大腸がん、黒色腫 白血病、肺がん、前立腺がん、脳がん、膀胱がん、および頭頸部がんである。
種々の実施形態において、ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体は、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、黒色腫、腎細胞癌、尿路上皮がん、肝がん、乳がん、膵がん、大腸がん、胃がん、前立腺がん、および肉腫を含むがこれらに限定はされない、全ての種類のがんの治療用の単剤として用いることができる。
別の態様において、本開示は、対象における自己免疫疾患を治療する方法であって、上記対象に、薬剤的に許容できる担体中の、治療有効量（単独療法レジメンとして、または併用療法レジメンにおいて）の本開示のＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体を投与することを含む、上記方法を提供する。「自己免疫疾患」とは、個体それ自身の組織に起因する、個体それ自身の組織を対象とした、非悪性の疾患または障害を指す。自己免疫性の疾患または障害の例としては、乾癬および皮膚炎（例えばアトピー性皮膚炎）を包含する炎症性皮膚疾患などの炎症反応；炎症性腸疾患に伴う反応（クローン病および潰瘍性大腸炎など）；皮膚炎；湿疹および喘息などのアレルギー状態；関節リウマチ；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）（ループス腎炎、皮膚ループスを含むがこれらに限定はされない）；真性糖尿病（例えば、１型真性糖尿病またはインスリン依存性糖尿病）；多発性硬化症および若年発症糖尿病が挙げられるが、これらに限定はされない。
別の態様において、本開示は、対象における炎症性疾患を治療する方法であって、上記対象に、薬剤的に許容できる担体中の、治療有効量（単独療法レジメンとして、または併用療法レジメンにおいて）の本開示のＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体を投与することを含む、上記方法を提供する。「炎症性疾患」は急性炎症または慢性炎症を伴う全ての疾患を包含する。急性炎症は有害な刺激に対する身体の初期反応であり、血液から傷害組織への血漿および白血球（例えば顆粒球など）の移動が増加することにより生じる。局所的な脈管系と、免疫系と、傷害組織内の各種細胞とを含む、いくつかの生化学的イベントが、炎症反応を伝搬・成熟させる。遷延性の炎症は慢性炎症と呼ばれ、炎症部位に存在する細胞の種類に段階的な変化をもたらし、炎症過程からの組織の破壊と回復が同時に起きていることを特徴とする。炎症性疾患の例は当該技術分野において周知である。種々の実施形態において、炎症性疾患は炎症性腸疾患、乾癬、および細菌性敗血症からなる群から選択される。用語「炎症性腸疾患」とは、本明細書で使用される場合、結腸および小腸の炎症状態の一群を指し、例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎、コラーゲン大腸炎、リンパ球性大腸炎、虚血性大腸炎、空置大腸炎、ベーチェット症候群、および分類不能大腸炎が挙げられる。
別の態様において、本開示は、対象におけるウイルス感染症を治療する方法であって、上記対象に、薬剤的に許容できる担体中の、治療有効量（単独療法レジメンとして、または併用療法レジメンにおいて）の本開示のＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体を投与することを含む、上記方法を提供する。種々の実施形態において、治療対象のウイルス感染症は、細菌、真菌、原虫（ｐｒｏｔｏｚａｅ）、およびウイルスを含むがこれらに限定はされない感染体によって引き起こされ得る。本明細書に記載の方法に従って予防、治療、および／または管理できるウイルス性疾患としては、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、水痘、アデノウイルス、単純ヘルペスＩ型（ＨＳＹ－Ｉ）、単純ヘルペスＩＩ型（ＨＳＹ－ＩＩ）、牛疫、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パピローマウイルス、パポーバウイルス、サイトメガロウイルス、エキノウイルス（ｅｃｈｉｎｏｖｉｒｕｓ））、アルボウイルス、ハンタウイルス、コクサッキーウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、天然痘、エプスタイン・バーウイルス、ヒト免疫不全ウイルスＩ型（ＨＩＶ－Ｉ）、ヒト免疫不全ウイルスＩＩ型（ＨＩＶ－ＩＩ）、およびウイルス性髄膜炎、脳炎、デング熱、または天然痘などのウイルス性疾患の媒介物によって引き起こされるウイルス性疾患が挙げられるが、これらに限定はされない。
本明細書に記載の方法に従って予防、治療、および／または管理できる、細菌（例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、スタフィロコッカス・ビリジアンス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｖｉｒｉｄｉａｎｓ）、および緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ））によって引き起こされる細菌性疾患としては、マイコバクテリア リケッチア、マイコプラズマ、ナイセリア、肺炎球菌（Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、ライム病菌（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）（ライム病）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｒａｃｉｓ）（炭疽）、テタヌス、連鎖球菌、ブドウ球菌、マイコバクテリウム、百日咳、コレラ、ペスト、ジフテリア、クラミジア、黄色ブドウ球菌（Ｓ． ａｕｒｅｕｓ）、およびレジオネラが挙げられるが、これらに限定はされない。
本明細書に記載の方法に従って予防、治療、および／または管理できる原虫によって引き起こされる原虫性疾患としては、リーシュマニア、コクジディオア（ｋｏｋｚｉｄｉｏａ）、トリパノソーマ、またはマラリアが挙げられるが、これらに限定はされない。
本明細書に記載の方法に従って予防、治療、および／または管理できる寄生虫によって引き起こされる寄生虫病としては、クラミジアおよびリケッチアが挙げられるが、これらに限定はされない。
「治療有効量」または「治療有効用量」とは、治療予定の障害の１または複数の症状をある程度軽減する、投与予定の治療薬の量を指す。
初めに、ＩＣ５０測定により、細胞培養アッセイから治療有効量が評価され得る。次に、動物モデルにおいて、細胞培養液中で測定された上記ＩＣ５０を含む循環血漿中濃度範囲を達成するように、用量が製剤化され得る。そのような情報を用いることで、ヒトで有用な用量をより正確に求めることができる。血漿中レベルがＨＰＬＣなどによって測定され得る。対象の状態を鑑みて、個々の医師により、的確な組成、投与経路、および用量が選択され得る。
投与計画は最適な所望の反応（例えば、治療的反応または予防的反応）が得られるように調整できる。例えば、単回ボーラス投与が行われ、何回かの分割量（複数回投与量または反復投与量または維持投与量）が長期に亘って投与され、治療状況の必要性に比例して用量が増減され得る。投与のしやすさと投与量の均一性のために、投薬単位形態で非経口組成物を製剤化することが、特に有利である。投薬単位形態とは、本明細書で使用される場合、治療される哺乳類対象に対する統一された用量として適した物理的に分離している単位を指し、それぞれの単位は必要な医薬担体と併せて目的の治療効果を生むと計算された所定量の活性化合物を含有する。本開示の投薬単位形態の規格は、主に、抗体の独自の特徴、および達成されるべき特定の治療効果または予防効果によって決定される。
すなわち、当業者には理解されることであるが、本明細書に提供される開示に基づいて、用量および投与計画は当該治療分野で周知の方法に従って調整される。すなわち、最大耐量を容易に確立でき、検出可能な治療効果を対象に与える有効量も決定でき、同様に、検出可能な治療効果を対象に与えるようにそれぞれの薬剤を投与するための時間的要件も決定できる。よって、本明細書にはある特定の用量および投与計画が例示されているが、これらの例は、本開示を実施する際に対象に与えられ得る用量および投与計画を何ら限定するものではない。
なお、用量の値は、改善されるべき状態の種類および重症度によって異なり、単回用量または反復用量を含み得る。さらには、いかなる特定の対象に対しても、具体的な投与計画は、個々の必要性や組成物の投与を管理または監督する人の専門家としての判断に従って長期間に亘って調整されるべきということ、並びに、本明細書に記載された用量範囲は例示のみを目的としており、特許請求された組成物の範囲や実践を限定する意図はないことも、理解されたい。さらに、本開示の組成物を用いた投与計画は、疾患の種類、対象の年齢、体重、性別、医学的状態、状態の重症度、投与経路、および使用される特定の抗体を含む様々な要因に基づかせてもよい。すなわち、投与計画は多様であり得るが、標準的な方法を用いてルーチンに決定できる。例えば、用量は薬物動態パラメーターまたは薬力学的パラメーターに基づいて調整され得るが、これらのパラメーターとしては、毒性作用および／または実験室値などの臨床的効果が含まれ得る。すなわち、本開示は、当業者によって求められる、対象者内用量漸増を包含する。適切な用量および投与計画の決定は、関連技術分野で周知であり、本明細書で開示された教示が提供されれば当業者に達成されることは理解される。
治療有効量または予防有効量の本開示のＶｉｔｏＫｉｎｅまたはＶｉｔｏＫｉｎｅバリアントの、例示的であり非限定的な一日量の範囲は、０．０００１～１００ｍｇ／ｋｇ体重、０．０００１～９０ｍｇ／ｋｇ体重、０．０００１～８０ｍｇ／ｋｇ体重、０．０００１～７０ｍｇ／ｋｇ体重、０．０００１～６０ｍｇ／ｋｇ体重、０．０００１～５０ｍｇ／ｋｇ体重、０．０００１～４０ｍｇ／ｋｇ体重、０．０００１～３０ｍｇ／ｋｇ体重、０．０００１～２０ｍｇ／ｋｇ体重、０．０００１～１０ｍｇ／ｋｇ体重、０．０００１～５ｍｇ／ｋｇ体重、０．０００１～４ｍｇ／ｋｇ体重、０．０００１～３ｍｇ／ｋｇ体重、０．０００１～２ｍｇ／ｋｇ体重、０．０００１～１ｍｇ／ｋｇ体重、０．００１～５０ｍｇ／ｋｇ体重、０．００１～４０ｍｇ／ｋｇ体重、０．００１～３０ｍｇ／ｋｇ体重、０．００１～２０ｍｇ／ｋｇ体重、０．００１～１０ｍｇ／ｋｇ体重、０．００１～５ｍｇ／ｋｇ体重、０．００１～４ｍｇ／ｋｇ体重、０．００１～３ｍｇ／ｋｇ体重、０．００１～２ｍｇ／ｋｇ体重、０．００１～１ｍｇ／ｋｇ体重、０．０１０～５０ｍｇ／ｋｇ体重、０．０１０～４０ｍｇ／ｋｇ体重、０．０１０～３０ｍｇ／ｋｇ体重、０．０１０～２０ｍｇ／ｋｇ体重、０．０１０～１０ｍｇ／ｋｇ体重、０．０１０～５ｍｇ／ｋｇ体重、０．０１０～４ｍｇ／ｋｇ体重、０．０１０～３ｍｇ／ｋｇ体重、０．０１０～２ｍｇ／ｋｇ体重、０．０１０～１ｍｇ／ｋｇ体重、０．１～５０ｍｇ／ｋｇ体重、０．１～４０ｍｇ／ｋｇ体重、０．１～３０ｍｇ／ｋｇ体重、０．１～２０ｍｇ／ｋｇ体重、０．１～１０ｍｇ／ｋｇ体重、０．１～５ｍｇ／ｋｇ体重、０．１～４ｍｇ／ｋｇ体重、０．１～３ｍｇ／ｋｇ体重、０．１～２ｍｇ／ｋｇ体重、０．１～１ｍｇ／ｋｇ体重、１～５０ｍｇ／ｋｇ体重、１～４０ｍｇ／ｋｇ体重、１～３０ｍｇ／ｋｇ体重、１～２０ｍｇ／ｋｇ体重、１～１０ｍｇ／ｋｇ体重、１～５ｍｇ／ｋｇ体重、１～４ｍｇ／ｋｇ体重、１～３ｍｇ／ｋｇ体重、１～２ｍｇ／ｋｇ体重、または１～１ｍｇ／ｋｇ体重とすることができる。なお、用量の値は、改善されるべき状態の種類および重症度によって異なり得る。さらには、いかなる特定の対象に対しても、具体的な投与計画は、個々の必要性や組成物の投与を管理または監督する人の専門家としての判断に従って長期間に亘って調整されるべきということ、並びに、本明細書に記載された用量範囲は例示のみを目的としており、特許請求された組成物の範囲や実践を限定する意図はないことも、理解されたい。
本開示の医薬組成物の毒性および治療指数は、ＬＤ５０（集団の５０％に対し致死的な用量）やＥＤ５０（集団の５０％に治療効果のある用量）などを求めるための、細胞培養液または実験動物における標準的な薬学的手法で求めることができる。中毒量と治療有効量との間の用量比が治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表すことができる。大きな治療指数を示す組成物が一般的に好ましい。
ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体医薬組成物の投与の投与頻度は、治療方法および治療される特定の疾患の性質に応じたものとなる。対象は、毎週または毎月などの一定間隔を置いて、目的の治療結果が達成されるまで治療できる。例示的な投与頻度として、限定はされないが：毎週１回；隔週で週１回；２週間に１回；３週間に１回；２週間毎週１回、その後月１回；３週間毎週１回、その後月１回；月１回；２ヵ月に１回；３ヵ月に１回；４ヵ月に１回；５ヵ月に１回；もしくは６ヶ月に１回、または年１回が挙げられる。
併用療法
本明細書で使用される場合、本開示のＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体と１または複数の他の治療薬とを参照した、「同時投与」、「同時投与される」、および「～と組み合わせて」という用語は、以下を意味することが意図され、以下を指して包含する：治療を必要としている対象への本開示のＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体と治療薬とのそのような組み合わせの同時投与であって、そのような成分が合剤化されて単一剤形となり、上記各成分が実質的に同時に上記対象に放出される、同時投与；治療を必要としている対象への本開示のＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体と治療薬とのそのような組み合わせの実質的な同時投与であって、そのような成分が互いに別々に製剤化されて別々の剤形となり、それらが上記対象によって実質的に同時に摂取された際、上記各成分が実質的に同時に上記対象に放出される、実質的な同時投与；治療を必要としている対象への本開示のＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体と治療薬とのそのような組み合わせの連続投与であって、そのような成分が互いに別々に製剤化されて別々の剤形となり、それらが各投与の間にかなりの時間間隔を置いて上記対象によって連続した時間に摂取された際、上記各成分が実質的に異なる時間に上記対象に放出される、連続投与；並びに、治療を必要としている対象への本開示のＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体と治療薬とのそのような組み合わせの連続投与であって、そのような成分が合剤化されて単一剤形となり、上記各成分が徐放的に放出される際、それらが同時および／または異なる時間に同時発生的、連続的、および／または重複的に上記対象に放出され、各部分は同じ経路または異なる経路で投与され得る、連続投与。
別の態様において、本開示は、対象におけるがんまたはがん転移を治療するための方法であって、免疫療法、細胞障害性化学療法、小分子キナーゼ阻害剤標的療法、外科手術、放射線療法、および幹細胞移植を包含するがこれらに限定はされない第二の治療方法と組み合わせて、治療有効量の本発明の医薬組成物を投与することを含む、上記方法を提供する。例えば、そのような方法は、予防的に、がんの予防、外科手術後のがんの再発および転移の予防で、他の従来のがん治療法の補助療法として、用いることができる。本開示が認めるところによれば、本明細書に記載の併用法の使用を通じて、従来のがん治療法（例えば、化学療法、放射線療法、光線療法、免疫療法、および外科手術）の有効性を増強することができる。
幅広い従来化合物が抗悪性腫瘍活性を有することが示されている。これらの化合物は、固形腫瘍を退縮させる、転移とさらなる成長を抑制する、または、白血病性もしくは骨髄の悪性腫瘍における悪性Ｔ細胞の数を減少させる、化学療法における医薬品として使用されている。化学療法は様々な種類の悪性腫瘍の治療で有効であったが、多くの抗悪性腫瘍化合物は望ましくない副作用を誘導する。２種以上の異なる治療を組み合わせた場合、それらの治療が、相乗的に働いて、各治療の用量の削減を可能とすることにより、より高用量で各化合物が発現する有害な副作用が低減される場合があることが示されている。他の例では、治療に対して抵抗性の悪性腫瘍は、２種以上の異なる治療の併用療法に対して反応する場合がある。
種々の実施形態において、化学療法剤などの第二の抗がん剤が患者に投与されることとなる。例示的な化学療法剤の一覧には、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、ナイトロジェンマスタード、クロラムブシル、メルファラン、シクロホスファミド、６－メルカプトプリン、６－チオグアニン、ベンダムスチン、シタラビン（ＣＡ）、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）、フロクスウリジン（５－ＦＵｄＲ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、コルヒチン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、テニポシド、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ペントスタチン、クラドリビン、シタラビン、ゲムシタビン、プララトレキサート、ミトキサントロン、ジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）、フルダラビン（ｆｌｕｒａｄａｂｉｎｅ）、イホスファミド、ヒドロキシ尿素タキサン類（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａｔａｘａｎｅｓ）（パクリタキセルおよびドセタキセル（ｄｏｘｅｔａｘｅｌ）など）、および／または、アントラサイクリン系抗生物質、並びに、限定はされないが、ＤＡ－ＥＰＯＣＨ、ＣＨＯＰ、ＣＶＰ、またはＦＯＬＦＯＸなどの薬剤の組み合わせが挙げられるが、これらに限定はされない。種々の実施形態において、そのような化学療法剤の用量としては以下が挙げられるが、これらに限定はされない：約１０ｍｇ／ｍ２、約２０ｍｇ／ｍ２、約３０ｍｇ／ｍ２、約４０ｍｇ／ｍ２、約５０ｍｇ／ｍ２、約６０ｍｇ／ｍ２、約７５ｍｇ／ｍ２、約８０ｍｇ／ｍ２、約９０ｍｇ／ｍ２、約１００ｍｇ／ｍ２、約１２０ｍｇ／ｍ２、約１５０ｍｇ／ｍ２、約１７５ｍｇ／ｍ２、約２００ｍｇ／ｍ２、約２１０ｍｇ／ｍ２、約２２０ｍｇ／ｍ２、約２３０ｍｇ／ｍ２、約２４０ｍｇ／ｍ２、約２５０ｍｇ／ｍ２、約２６０ｍｇ／ｍ２、および約３００ｍｇ／ｍ２のうちのいずれか。
種々の実施形態において、本開示の併用療法は、治療有効量の免疫療法を対象に投与することをさらに含んでいてもよく、例えば、特定の腫瘍抗原に対する枯渇抗体を用いた治療；抗体薬物複合体を用いた治療；ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、ＣＤ４０、ＯＸ－４０、ＣＤ１３７、ＧＩＴＲ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ－３、ＳＩＲＰａ、ＣＤ４７、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、Ｓｉｇｌｅｃ７、Ｓｉｇｌｅｃ８、Ｓｉｇｌｅｃ９、Ｓｉｇｌｅｃ１５、およびＶＩＳＴＡ、ＣＤ２７６、ＣＤ２７２、ＴＩＭ－３、Ｂ７－Ｈ４に対する抗体などを含むがこれらに限定はされない、共刺激分子または共抑制分子（免疫チェックポイント）に対するアゴニスト抗体、アンタゴニスト抗体、または阻止抗体を用いた治療；ブリナツモマブなどの二重特異性Ｔ細胞誘導抗体（ＢｉＴＥ（登録商標））を用いた治療：ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、ＴＧＦ－βアンタゴニスト、またはＴＧＦ－βトラップなどの生物学的応答調節物質の投与を含む治療；Ｔ－ｖｅｃなどの腫瘍溶解性ウイルス、またはシプロイセルＴなどの治療用ワクチンを含むがこれらに限定はされない治療用ワクチンを用いた治療；樹状細胞ワクチン、または腫瘍抗原ペプチドワクチンもしくはネオアンチゲンワクチンを用いた治療；キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）－Ｔ細胞を用いた治療；ＣＡＲ－ＮＫ細胞を用いた治療；ＮＫ細胞を用いた治療；ｉＰＳ誘導ＮＫ細胞を用いた治療；ｉＰＳ誘導Ｔ細胞を用いた治療；ｉＰＳ誘導ＣＡＲ－Ｔ細胞またはｉＰＳ誘導ＣＡＲ－ＮＫ細胞を用いた治療 腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を用いた治療；養子移植抗腫瘍Ｔ細胞（生体外で増殖された且つ／またはＴＣＲ－Ｔ細胞）を用いた治療；ＴＡＬＬ－１０４細胞を用いた治療；免疫刺激剤、例えば、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストのＣｐＧ、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、およびカルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）などのワクチン、およびイミキモドを用いた治療が挙げられるが、これらに限定はされず；上記の併用療法はエフェクター細胞による腫瘍細胞の殺傷を増大させ、すなわち、同時に投与された場合、ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体と免疫療法との間には相乗作用が存在する。
種々の実施形態において、本開示の併用療法は、自己免疫疾患、炎症性疾患、および他の免疫不全に対する治療有効量の抗炎症剤を対象に投与することをさらに含んでいてもよく、例えば、特定の免疫細胞に対する枯渇抗体を用いた治療；ＩＬ－１α、ＩＬ－１βまたはＩＬ－１Ｒ、ＩＬ－４またはＩＬ－４Ｒ、ＩＬ－５またはＩＬ－５Ｒ、ＩＬ－６またはＩＬ－６Ｒ、ＩＬ－８またはＩＬ－８Ｒ、ＩＬ－７またはＩＬ－７Ｒ、ＩＬ－１０またはＩＬ－１０Ｒ、ＩＬ－１１またはＩＬ－１１Ｒ、ＩＬ－１２またはＩＬ－１２Ｒ、ＩＬ－１７またはＩＬ－１７Ｒ、ＩＬ－１８またはＩＬ－１８Ｒ、ＩＬ－２１またはＩＬ－１８Ｒ、ＩＬ－２２またはＩＬ－２２Ｒ、ＩＬ－２３またはＩＬ－２３Ｒ、ＭＣＳＦまたはＭＣＳＦ－Ｒ、ＧＭ－ＣＳＦまたはＧＭ－ＣＳＦＲ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、ＴＧＦ－α、ＴＧＦ－βまたはＴＧＦ－β、ＴＮＦファミリーまたはその関連受容体、インテグリンファミリー（例えばα４β７）、ＴＳＬＰ、補体Ｃ５（Ｃ５）またはＣ５ａ、ＩｇＥ、ＡＰＲＩＬ、ＴＡＣＩ、ＢＣＭＡ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ、Ｂ７Ｈ１、Ｂ７Ｈ２、ＩＣＯＳ、ＢＡＦＦ、ＢＣＲ、ＢＬｙｓ、Ｂ７ＲＰ１、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９を含むがこれらに限定はされない標的（リガンドまたはその受容体）に対する免疫応答標的調節物質として調節抗体（アゴニスト抗体、アンタゴニスト抗体、または阻止抗体）を用いた治療；ＮＦｋＢ、Ｊａｋ１、Ｊａｋ２、Ｊａｋ３、Ｔｙｋ２、Ｓｙｋ、ＢＴＫ、ＰＩＫ３、シクロオキシゲナーゼ２、およびＮＭＤＡ受容体を含むがこれらに限定はされない標的に対する免疫応答標的調節物質として調節小分子（アゴニストまたはアンタゴニスト）を用いた治療が挙げられるがこれらには限定されず；上記の併用療法は免疫応答調節の有効性を増大させ、すなわち、同時に投与された場合、ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体と抗炎症療法との間には相乗作用が存在する。
種々の実施形態において、併用療法は、同一の医薬組成物中で、または別々の医薬組成物中で、ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体と第二の薬剤組成物とを同時に投与することを含む。種々の実施形態において、ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体組成物と第二の薬剤組成物は、逐次的に投与され、すなわち、第二の薬剤組成物の投与の前または後に、ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体組成物が投与される。種々の実施形態において、ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体組成物と第二の薬剤組成物の投与は同時発生的であり、すなわち、ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体組成物の投与時期と第二の薬剤組成物の投与時期は互いに重なっている。種々の実施形態において、ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体組成物と第二の薬剤組成物の投与は、同時発生的ではない。例えば、種々の実施形態においては、ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体組成物の投与は、第二の薬剤組成物が投与される前に終了される。種々の実施形態において、第二の薬剤組成物投与は、ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体組成物が投与される前に終了される。
以下の実施例は、本開示をより十分に例示するために提供されており、本開示の範囲を限定するものとは解釈されない。
実施例１
ＩＬ－１５ ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体の構築および作製
がんまたは患部組織で発現上昇しているプロテアーゼにより局所的な活性化を受けるまで不活性状態を維持する、ＩＬ－１５ ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体を設計することを目標とした。活性部分としての野生型ＩＬ－１５（配列番号２）またはＩＬ－１５変異タンパク質（例えば、配列番号３）が、ＦｃドメインとＩＬ－１５ＲαＳｕｓｈｉ＋（配列番号５）との間で可逆的に遮蔽されているＶｉｔｏＫｉｎｅｓが、本明細書に記載される。これらの構築体は、腫瘍特異性プロテアーゼによって認識される切断可能なリンカーを１つまたは２つ含む。プロテアーゼを発現する腫瘍細胞の存在下で、ＦｃとＩＬ－１５変異タンパク質とを連結しているリンカーおよび／またはＩＬ－１５とＩＬ－１５αＳｕｓｈｉ＋とを連結しているリンカーが切断を受けることで、ＩＬ－１５活性が回復する。注目すべきこととして、タンパク質分解後の遊離型ＩＬ－１５αＳｕｓｈｉ＋は、ＩＬ－１５とＩＬ－１５Ｒαとの間の並外れて高い親和性（３０ｐＭ）により、ＩＬ－１５との非共有結合的な会合状態を維持することが予想される。リンカーとペプチドスペーサーとを様々に組み合わせたＦｃ ＩＬ－１５ ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体を作製した。図１にその模式図に示し、それら各々の配列は配列番号２５～４３、１６２～１６５、および１６９～１７４として一覧表に記載する。
全ての遺伝子には、哺乳類細胞における発現用のコドン最適化を行い、合成して、レシピエント哺乳類発現ベクター（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）にサブクローニングした。ＣＭＶプロモーターによってタンパク質発現が駆動され、ＣＤＳの３’末端には合成ＳＶ４０ポリＡシグナル配列が存在している。上記コンストラクトのＮ末端にはリーダー配列が設けられており、これにより、分泌のための適切なシグナル伝達とプロセシングが実行される。
ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、分子量２５，０００、直鎖、ポリサイエンス社（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ））を用いて、浮遊液中で増殖中のＨＥＫ２９３－Ｆ細胞を上記哺乳類発現ベクターでコトランスフェクトすることにより、上記構築体を産生させた。２種以上の発現ベクターが存在していた場合、ベクターは１：１の比でトランスフェクトされることとなる。トランスフェクションにおいては、ＨＥＫ２９３細胞は無血清ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ））中で培養した。１０００ｍｌの振盪フラスコ（ワーキングボリュームは３３０ｍＬ）内で産生させる場合、トランスフェクションの２４時間前に、ＨＥＫ２９３細胞を０．８×１０６細胞／ｍｌの密度で播種した。総量３３０μｇのＤＮＡに達する発現ベクターを、１６．７ｍｌのＯｐｔｉ－ＭｅＭ培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）と混合した。１６．７ｍｌのＯｐｔｉ－ＭｅＭ培地で希釈した０．３３ｍｇのＰＥＩを添加した後、その混合物を１５秒間ボルテックスし、次いで室温で１０分間静置した。その後、このＤＮＡ／ＰＥＩ液を上記細胞に添加し、８％ＣＯ２雰囲気の恒温器内で３７℃でインキュベートした。終濃度２ｍｇ／Ｌの酪酸ナトリウム（ミリポアシグマ社）を４日目の細胞培養液に添加することで、タンパク質発現の維持を補助した。６日間の培養後、上清を収集し、２２００ｒｐｍで２０分間の遠心分離により精製を行った。この液を滅菌ろ過（０．２２μｍフィルター、コーニング社）した。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて、細胞培養上清から分泌タンパク質を精製した。
アフィニティークロマトグラフィーにおいては、２５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）で平衡化したＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＦＦカラム（ＣＶ＝５ｍＬ、ＧＥヘルスケア社）に上清をロードした。５カラム体積分のＰＢＳ（ｐＨ７．２）で洗浄することで未結合のタンパク質を除去し、２５ｍＭクエン酸ナトリウム、２５ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ３．２）で標的タンパク質を溶出させた。３％１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ１０．２）の添加によりタンパク質溶液を中和した。Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ－１５コンセントレーター１０ＫＤａ ＮＭＷＣ（メルクミリポア社）を用いて、標的タンパク質を濃縮した。
精製された構築体の純度および分子量の分析は、還元剤の存在下および非存在下のＳＤＳ－ＰＡＧＥと、クーマシー（Ｉｍｐｅｒｉａｌ（商標）Ｓｔａｉｎ）染色により、行った。ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ－Ｃａｓｔゲルシステム（４～１２％または８～１６％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を製造業者の説明書に従い使用した。２８０ｎｍのＵＶ吸光度を測定し（Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、アミノ酸配列に基づいて算出されたモル吸光係数で除算することにより、精製されたタンパク質試料のタンパク質濃度を求めた。Ａｇｉｌｅｎｔ １２００高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システムで構築体の凝集量を分析した。２５℃の、１５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）を移動相として用いる、ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏサイズ排除カラム（３００Å、４．６×１５０ｍｍ、２．７μｍ、ＬＣカラム、アジレント社）に試料を注入した。
Ｐ－０３１５は、ｕＰＡ切断配列およびＭＭＰ切断配列をＬ１リンカーおよびＬ２リンカーのそれぞれに含む、二量体Ｃ末端Ｆｃ融合ＩＬ－１５ ＶｉｔｏＫｉｎｅである。ＩＬ－１５はＳ５８Ｄバリアントタンパク質である。Ｆｃ ＩＬ－１５ ＶｉｔｏＫｉｎｅのタンパク質プロファイルを示す一例として、Ｐ－０３１５（配列番号３３）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を図３Ａに示す。サイズ排除クロマトグラム（図３Ｂ）。
実施例２
ＶｉｔｏＫｉｎｅ形態においてＩＬ－１５のインビトロ活性は効果的に遮蔽された
ＩＬ－１５ ＶｉｔｏＫｉｎｅ Ｐ－０１７２（配列番号２７）は、短ＧＳ（配列番号１１６）ペプチドリンカーで連結されたＩＬ－１５／ＩＬ－１５ＲαＳｕｓｈｉ＋融合ポリペプチドを含み、当該融合ポリペプチドは、ホモ二量体融合体型で、ｕＰＡで切断可能なリンカーを介してホモ二量体ＦｃドメインのＣ末端に結合している。Ｐ－０１９８は、非共有結合的に複合体化したＩＬ－１５ＲαＳｕｓｈｉを有する二量体Ｃ末端Ｆｃ－ＩＬ－１５融合タンパク質である。これら２つの分子は、ＦｃとＩＬ－１５融合との間には同様の立体配置を有しており、主な違いはＩＬ－１５ＲαＳｕｓｈｉ組み込みにある。一方は短ＧＳリンカーで融合されており（Ｐ－０１７２）、もう一方は非共有結合性により遊離型である（Ｐ－０１９８）。ＩＬ－２Ｒβに対するＰ－０１７２の結合活性を、高活性のＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質であるＰ－０１９８（配列番号４５、配列番号４４、および配列番号５を含む）と比較して、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）により求めた。
簡潔に説明すると、ＩＬ－２Ｒβ－ＥＣＤ（配列番号１２）を１μｇ／ウェルでヌンク社製９６ウェルマイクロプレートＭａｘｉｓｏｒｐの各ウェルにコートした。４℃で一晩インキュベートし、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）でブロッキングした後、１００ｎＭから開始して３倍段階希釈したＩＬ－１５化合物を各ウェルに１００μｌ／ウェルで添加した。室温で１時間インキュベートした後、１００μｌ／ウェルのヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ－ＨＲＰ（希釈液で１：５０００希釈）を各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。各ステップの後、ウェルには十分な吸引を行い、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０で３回洗浄した。最後に、１００μｌのＴＭＢ基質を各ウェルに添加し、室温の暗所で１０分間プレートを発色させ、１００μｌ／ウェルの停止液（２Ｎ硫酸、リッカ・ケミカル社（Ｒｉｃｃａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ））を添加した。４５０ｎｍの吸光度を求め、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（グラフパッド社）を用いて曲線の当てはめを行った。図４Ａに示されているように、ＶｉｔｏＫｉｎｅ Ｐ－０１７２のＩＬ－２Ｒβに対する結合活性は、Ｐ－０１９８と比較して顕著に減少しているが（１２．２ｎＭ対０．２１ｎＭ）、これは、ＩＬ－１５とＩＬ－１５ＲαＳｕｓｈｉとの間にある短い共有結合に起因する空間的な制約が原因である可能性があり、このことは、ＶｉｔｏＫｉｎｅプラットフォームにおけるＩＬ－１５ＲαＳｕｓｈｉが、受容体に結合しようとするＩＬ－１５ドメインを、効果的に遮蔽したことを示唆している。
Ｐ－０１９８と比較したＩＬ－１５ ＶｉｔｏＫｉｎｅ Ｐ－０１７２の機能活性を、ＦＡＣＳ分析で、新鮮ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）由来のヒトＮＫ細胞およびヒトＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ６９発現のＩＬ－１５媒介性誘導を調べることにより、さらに評価した。ＣＤ６９は、ＮＫ細胞およびＴ細胞を含むリンパ系活性化の際、初期に誘導される細胞表面糖タンパク質である。
簡潔に説明すると、オクラホマ血液研究所（Ｏｋｌａｈｏｍａ Ｂｌｏｏｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）より購入したバフィーコートからのフィコール・ハイパック遠心分離によって、ヒトＰＢＭＣを単離した。精製後のヒトＰＢＭＣを各ＩＬ－１５試験化合物の段階希釈系列で処理し、３７℃で４８時間インキュベートした。細胞を３００×ｇの遠心分離で収集し、ＦＡＣＳ用緩衝液に再懸濁した。Ｈｕｍａｎ ＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ（１：５０希釈）を添加してＦｃ受容体をブロッキングした後、抗ヒトＣＤ５６－ＦＩＴＣ抗体、抗ヒトＣＤ６９－ＰＥ抗体、および抗ヒトＣＤ８－ＡＰＣ抗体（１：５０希釈）を用いて細胞を染色した。上記抗体と一緒に室温で３０分間インキュベートした後、細胞を収集し、洗浄し、ＦＡＣＳ用緩衝液に再懸濁し、フローサイトメトリーで分析した。ＣＤ５６＋ＮＫ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞にゲートをかけることによりＣＤ６９発現を測定した。データはゲートをかけられた集団中のＣＤ６９陽性細胞の割合（％）として表現される。
図４Ｂおよび図４Ｃに示されているように、ＶｉｔｏＫｉｎｅ Ｐ－０１７２によるＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞上のＣＤ６９活性化は激減しており、最高試験濃度でのみ測定可能なものであり、結合強度はＰ－０１９８の結合強度よりも少なくとも２～３対数低かった。このことは、ＶｉｔｏＫｉｎｅ形態においてのＩＬ－１５活性の効率的な遮蔽を示している。この遮蔽効果は、ＩＬ－２Ｒβ ＥＬＩＳＡ結合アッセイでよりも、ＰＢＭＣ ＣＤ６９活性化アッセイでより顕著であったが、このことは、インビトロで再構成されたＥＬＩＳＡ条件でよりも、生理的条件で、ＩＬ－１５活性の重度障害がより明白であることを示唆している。空間的な制約が存在するため、ＶｉｔｏＫｉｎｅは、リンパ球上に発現されたＩＬ－２ＲβおよびγＣ複合体へのＩＬ－１５の結合を著しく障害し、その結果、経路の活性化が不十分となり、活性が著しく障害された。
単量体ＩＬ－１５ ＶｉｔｏＫｉｎｅの生物活性も調べた。Ｐ－０１７０（配列番号２６および配列番号１５）は、リンカーおよび融合の立体配置が同じである、Ｐ－０１７２の単量体型対応物である。高活性のＩＬ－１５ Ｆｃ融合タンパク質Ｐ－０１６６と比較して、Ｐ－０１７２は、ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ６９を活性化する能力が著しく減少しており（図５）、このことは、単量体型ＶｉｔｏＫｉｎｅプラットフォームが、Ｄ２ドメインにおけるＩＬ－１５の生物活性を効率的に遮蔽したことを示唆している。
実施例３
ＩＬ－１５とＩＬ－１５ＲαＳｕｓｈｉ＋との間、およびＦｃとＩＬ１５との間の、リンカー長および組成が異なる場合の、Ｆｃ ＩＬ－１５ ＶｉｔｏＫｉｎｅの遮蔽効率の比較
ＩＬ－１５ ＶｉｔｏＫｉｎｅは、図１に示されているように、ペプチドリンカーであるＬ１およびＬ２を介して、半減期延長ＦｃドメインおよびヒトＩＬ－１５のコグネイトな高親和性補助受容体αドメインなどの２つの異なるドメインの間にヒトＩＬ－１５が融合されることにより、構築される。ＩＬ－１５の生物活性に対する、ＦｃとＩＬ－１５とを繋ぐリンカー、およびＩＬ－１５と１５ＲαＳｕｓｈｉドメインとを繋ぐリンカーという、２つのリンカーの効果の違いと、各リンカーの長さおよび組成の効果の違いを、所望の活性障害について調べた。
新鮮ヒトＰＢＭＣの免疫細胞亜分画の活性化マーカーＣＤ６９のＦＡＣＳ分析を実施し、ＩＬ－１５とＩＬ－１５ＲαＳｕｓｈｉ＋との間の切断不可なリンカー（Ｌ２）の長さが異なるＩＬ－１５ ＶｉｔｏＫｉｎｅｓを評価した。実施例２と同じプロトコルに従った。
Ｐ－０２０４（配列番号３０）、Ｐ－０２０５（配列番号３１）、およびＰ－０２０６（配列番号３２）は、ＦｃとＩＬ－１５との間に同じｕＰＡ切断可能なリンカーの配列（Ｌ１）を共有しているＦｃ ＩＬ－１５ ＶｉｔｏＫｉｎｅであるが、これら３種のＶｉｔｏＫｉｎｅのＩＬ－１５とＩＬ－１５ＲαＳｕｓｈｉ＋ドメインとを連結しているリンカー（Ｌ２）は、長さが異なっており、それぞれ、（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号１２７）、（ＧＧＧＧＳ）２（配列番号１２６）、ＧＧＧＧＳ（配列番号１１８）である。
図６に示されているように、ＩＬ－１５とＩＬ－１５ＲαＳｕｓｈｉ＋との間で５～１５アミノ酸長でリンカー長が異なるＦｃ ＩＬ－１５ ＶｉｔｏＫｉｎｅは、全て、ＣＤ８＋Ｔ細胞（図６Ａ）またはＮＫ細胞（図６Ｂ）に対する活性化能が著しく減少していた。Ｐ－０２０６、Ｐ－０２０５、およびＰ－０２０４の活性を比較して、ＩＬ－１５とＩＬ－１５ＲαＳｕｓｈｉ＋ドメインとを連結しているリンカーの長さが短いほど、ＶｉｔｏＫｉｎｅはより不活性となることが明らかとなったが；このことは、Ｌ２リンカーの長さによって活性低減の程度がさらに調整可能であることを示唆している。要約すると、ＩＬ－１５とＩＬ－１５Ｒαとの間のリンカー（Ｌ２）の長さを調整して適切なレベルの空間的制約をつくり出すことにより、ＦｃドメインとＩＬ－１５のコグネイトな高親和性補助受容体αとの間にＩＬ－１５を遮蔽することによって、ＩＬ－１５活性がほぼ完全に消失することが示された。
ＶｉｔｏＫｉｎｅの生物活性に対する、ＦｃとＩＬ－１５とを連結しているリンカー（Ｌ１）の影響についても調べた（図７に示す）。Ｐ－０２０４およびＰ－０２０３（配列番号２９）は、ＩＬ－１５とＩＬ－１５Ｒαとの間に同じ１５アミノ酸長の柔軟な（Ｇ４Ｓ）３リンカー（Ｌ２）を共有しているが、Ｌ１リンカーの長さは異なっており、Ｐ－０２０３は、ＦｃとＩＬ－１５とを連結しているｕＰＡ基質ペプチドを挟んでいる７つのＧＳ残基分だけ、Ｐ－０２０４より長いペプチドスペーサーを含んでいる。ＦｃとＩＬ－１５とを連結しているＬ１リンカーの長さが異なっているにもかかわらず、Ｐ－０２０４とＰ－０２０３の生物活性は類似しており（図７）、このことは、ＦｃとＩＬ－１５とを連結するＬ１リンカーが、１３～３５アミノ酸残基の長さである場合に、ＩＬ－１５活性の障害に対する影響が最小限となることを示唆している。しかし、Ｌ１リンカーの長さが１３～３５アミノ酸残基よりも少ない、またはそれよりも多い場合、あるいは異なるサイトカインが関連している場合は、Ｄ２ドメインに対する遮蔽活性に影響が生じ得る。同一の研究に、Ｐ－０２０３と比較して、ＦｃとＩＬ－１５とを連結しているＬ１リンカーは同じものを共有しているが、ＩＬ－１５とＩＬ－１５ＲαＳｕｓｈｉドメインとを連結しているＬ２リンカーが１３アミノ酸だけ短い、Ｐ－０２０２を採用した。Ｐ－０２０２はＰ－０２０３よりも低い生物活性を示し、ＶｉｔｏＫｉｎｅの遮蔽活性においてはリンカーＬ２がリンカーＬ１よりも重要であることが確認された。
ＩＬ－１５ ＶｉｔｏＫｉｎｅ処理後の、ＮＫ細胞およびＣＤ８ Ｔ細胞の核内のＫｉ６７発現を測定することにより、ＶｉｔｏＫｉｎｅ活性に対するリンカー組成すなわちリンカーのペプチド配列の影響を調べた。Ｋｉ６７は細胞増殖のマーカーである。エキソビボのヒトＰＢＭＣアッセイを確立した。簡潔に述べると、精製後のヒトＰＢＭＣをＩＬ－１５ ＶｉｔｏＫｉｎｅ化合物の段階希釈系列で処理し、３７℃で５日間インキュベートした。５日目、細胞をＦＡＣＳ用緩衝液（１％ＦＢＳ／ＰＢＳ）で１回洗浄し、Ｆｃブロッカーと、抗ヒトＣＤ５６－ＦＩＴＣおよび抗ヒトＣＤ８－ＡＰＣ（１：５０希釈）を含む表面マーカー抗体とで１回目の染色を行った。３０分間のインキュベーションと洗浄の後、細胞ペレットを２００μｌ／ウェルの１×Ｆｏｘｐ３固定・透過処理用ワーキング溶液で完全に再懸濁し、室温の暗所で３０分間インキュベートした。遠心分離後、２００μｌの１×透過処理用緩衝液を各ウェルに添加し、さらなる洗浄を行った。細胞ペレットを抗ヒトＫｉ６７－ＰＥ（１：２５希釈）を含む透過処理用緩衝液で再懸濁した。室温で３０分間インキュベートした後、細胞を収集し、洗浄し、ＦＡＣＳ用緩衝液に再懸濁し、フローサイトメトリーで分析した。データは、ゲーティングされた集団におけるＫｉ６７陽性細胞の割合（％）として表される。
Ｌ１リンカーと比較してＬ２リンカーはＩＬ－１５ ＶｉｔｏＫｉｎｅの活性に重大な影響を及ぼすため、ＩＬ－１５ ＶｉｔｏＫｉｎｅの生物活性に対する種々のＬ２リンカー配列組成の影響を調べた。Ｐ－０３５１（配列番号２５）、Ｐ－０４８８（配列番号１６３）、およびＰ－０４８９（配列番号１６４）は全て、ＦｃとＩＬ－１５とを連結している同じ（Ｇ４Ｓ）３リンカー（Ｌ１）を共有している。ＩＬ－１５とＩＬ－１５Ｒαとを連結しているリンカーは全て１０アミノ酸長であるが、配列が異なる。リンカーは、Ｐ－０３５１では（Ｇ４Ｓ）２、Ｐ－０４８８ではＭＭＰ－１４基質ペプチド（配列番号１５７）、またはＰ－０４８９ではレグマイン基質ペプチド（配列番号１６０）である。
図８に示されているように、３種全てのＩＬ－１５ ＶｉｔｏＫｉｎｅが、高活性ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα Ｆｃ融合タンパク質Ｐ－０１５６（配列番号１７５＋１７６）と比較して、ＮＫ細胞（図８Ａ）またはＣＤ８＋Ｔ細胞（図８Ｂ）の増殖において、活性に強い障害を受けていた。ペプチドリンカー配列が異なる場合でも、各々のＶｉｔｏＫｉｎｅの生物活性にはわずかな影響しかなく（図８Ａおよび図８Ｂ）、これは、各リンカーペプチドの構造的柔軟性によるものである可能性がある。Ｌ２リンカーペプチドがより剛直になるほど、ＶｉｔｏＫｉｎｅ分子に及ぼす構造的な制約はより大きなものとなり、活性障害はより顕著になり得る。しかし、ＶｉｔｏＫｉｎｅ活性に対するＬ２リンカー配列組成の影響は最低限であったことから、このデータは、Ｄ２ドメインの活性を効率的に遮蔽するように、種々の切断可能なリンカーをＬ２リンカーとして組み込むことができ、それにより、ＶｉｔｏＫｉｎｅの設計および有用性の幅を広げられることを裏付けている。
要約すると、これらのデータを併せて、ＩＬ－１５ドメイン（Ｄ２）とＩＬ－１５ＲαＳｕｓｈｉ＋ドメイン（Ｄ３）とを連結しているＬ２リンカーが、不活性なＶｉｔｏＫｉｎｅを得るためのＤ２活性の遮蔽において重要な役割を担っていることが示された。不活性さのレベルは、Ｌ２リンカーの長さを調整し、リンカーの配列／柔軟性を変えることによって、さらに調整することができた。切断可能なＬ２リンカーの長さおよび配列の選択は、目的の適応疾病部位における特異的プロテアーゼの存在と、当該プロテアーゼに対する基質ペプチドの到達性と、所望のタンパク質分解速度との、バランスをとるべきである。
実施例４
完全なプロテアーゼ切断に適した反応条件の決定
ＩＬ－１５ ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体Ｐ－０３１５およびＰ－０２０３を用いて最初のインビトロプロテアーゼ切断実験を行い、それぞれＭＭＰ－２およびｕＰＡの、プロテアーゼ切断性および最適な切断条件を求めた。Ｐ－０３１５（配列番号３３）は、ＦｃドメインおよびＩＬ－１５ドメインを連結しているｕＰＡ切断可能なリンカーと、ＩＬ－１５ドメインおよびＩＬ－１５ＲαＳｕｓｈｉ＋ドメインを連結しているＭＭＰ－２／９切断可能なリンカーと、を含む。Ｐ－０２０３（配列番号２９）は、ＦｃドメインとＩＬ－１５ドメインとを連結している単一のプロテアーゼ切断可能なリンカー（ｕＰＡ）を含む。Ｐ－０２０３におけるＩＬ－１５ドメインとＩＬ－１５ＲαＳｕｓｈｉ＋ドメインとの間のリンカーは、柔軟な（Ｇ４Ｓ）３リンカーである。組み換えヒトｕＰＡおよび組み換えヒトＭＭＰ－２をバイオレジェンド社（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）から購入した。ＭＭＰ－２は、潜在型（ｌａｔｅｎｔ ｆｏｒｍ）で供給を受け、製造業者の説明書に従ってｐ－アミノフェニル水銀アセタート（ＡＰＭＡ、ミリポア・シグマ社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ））で活性化させた。
ＭＭＰ－２によるタンパク質切断においては、４μｇのＰ－０３１５を、３０ｎｇ、１００ｎｇ、または３００ｎｇの、ＡＰＭＡで活性化させたＭＭＰ－２と一緒に、製造業者の推奨アッセイ用緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、２０ｍＭ ＣａＣｌ２、３００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％（ｗ／ｖ）Ｂｒｉｊ３５、ｐＨ７．５）中、３７℃で３時間インキュベートした。反応を止めるため、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ用ローディングダイを反応液に添加し、その混合物を９５℃で５分間加熱した。切断の評価を行うため、消化後の試料を、４～１２％Ｔｒｉｓ－Ｂｉｓ ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で分離させた。未処理試料と処理試料の比較により、ＩＬ－１５ ＶｉｔｏＫｉｎｅが、全ての試験濃度において、ＭＭＰ－２処理後に完全に切断されたことが示された。これは、ＳＤＳ ｐａｇｅゲル（図９）におけるサイズシフトと約９ＫＤａのシャープなバンドの出現とにより示され、このシャープなバンドはＰ－０３１５から切断されたＩＬ－１５ＲαＳｕｓｈｉ＋ドメインであるとされた。
ｕＰＡの切断能を、Ｐ－０２０３を用いて評価した。まず、種々の量のｕＰＡを、２０μｌのＰＢＳ（ｐＨ７．２）緩衝液中の２μｇのＰ－０２０３に添加し、その反応混合物を３７℃で２時間インキュベートした。０、２５ｎｇ、５０ｎｇ、１００ｎｇ、および３００ｎｇのｕＰＡを用いて実行された切断を、図１０Ａに示す。図１０Ａの３本の矢印は非還元（ＮＲ）試料についてのものであり、ｕＰＡタンパク質分解によるＦｃ鎖の変化を示している。「部分切断」では、２つのＦｃ鎖の一方のみからＩＬ－１５／ＩＬ－１５ＲαＳｕｓｈｉ＋融合ポリペプチドが切断され、一方、「全切断」では、両方のＦｃ鎖からＩＬ－１５／ＩＬ－１５ＲαＳｕｓｈｉ＋融合ポリペプチドが切断された。図１０Ａで丸で囲んだスメア状のバンドは、Ｆｃから切断されたＩＬ－１５／ＩＬ－１５ＲαＳｕｓｈｉ＋融合ポリペプチドであり、このスメア状の外観はグリコシル化が原因である可能性が最も高い。還元（Ｒ）試料では、上側のバンドはＩＬ－１５／ＩＬ－１５ＲαＳｕｓｈｉ＋融合ポリペプチドに連結されたＦｃ鎖であり、下側のシャープなバンドはＩＬ－１５／ＩＬ－１５ＲαＳｕｓｈｉ＋融合ポリペプチドが切断されたＦｃ鎖であるとされた。
ｕＰＡの量が増加するにつれて、非還元試料の全切断型タンパク質の量が漸増したことを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルは明瞭に示している。同様に、還元試料では切断型Ｆｃ鎖の量が増加しており、これは、切断レベルの増加を示している。しかし、完全な切断を達成した条件はなかった。完全な消化を達成するため、同様のｕＰＡ消化反応液をより長い時間インキュベートした。図１０Ｂは、５０ｎｇ、１００ｎｇ、および３００ｎｇのｕＰＡによる、３７℃で２４時間の、２μｇのＰ－０２０３の切断を示している。データから、１００ｎｇのｕＰＡと２４時間のインキュベーションにより、ほぼ完全な切断が達成されたことが分かる。
実施例５
活性型ＩＬ－１５産物を得るためのＦｃ ＩＬ－１５ ＶｉｔｏＫｉｎｅ Ｐ－０２０３のプロテアーゼ切断
ＶｉｔｏＫｉｎｅ Ｐ－０２０３（配列番号２９）は、ＦｃとＩＬ－１５とを連結している、スペーサーペプチドが両端を挟んでいるｕＰＡ基質ペプチドリンカー（配列番号９０）を含んでおり、第２の１５アミノ酸の柔軟なリンカー（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号１２７）がＩＬ－１５ドメインとＩＬ－１５ＲαＳｕｓｈｉ＋ドメインとを連結している。１００μｇのＶｉｔｏＫｉｎｅ Ｐ－０２０３を、５μｇの組み換えヒトｕＰＡ（バイオレジェンド社）と一緒に、５００μｌのＰＢＳ（ｐＨ７．２）緩衝液中、３７℃で２４時間インキュベートすることにより、インビトロでのプロテアーゼ切断を達成した。反応を止めるため、２５μｌのＮｉ－Ｅｘｃｅｌ樹脂（ＰＢＳで平衡化された５０％スラリー、ＧＥヘルスケア社）を添加して、６×ＨｉｓタグｕＰＡを溶液から除去した。一方で、５０μｌのＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ樹脂（ＰＢＳで平衡化された５０％スラリー、ＧＥヘルスケア社）を反応液に添加することで、切断型Ｆｃ画分と、未切断のまたは不完全に消化されたＰ－０２０３の除去も行った。両方の親和性樹脂と共に室温で１５分間インキュベートした後、遠心分離で樹脂を取り除き、プロテアーゼ活性型Ｐ－０２０３、すなわちＩＬ－１５／ＩＬ－１５αＳｕｓｈｉ＋融合ポリペプチド（図２に第１活性型として模式的に図示）を含有するフロースルーを回収した。図１１Ａおよび図１１Ｂから分かるように、活性型Ｐ－０２０３断片がスメア状のバンド形成をしながら移動しており、このスメア状のバンド形成はグリコシル化が原因である可能性が最も高い。
実施例６
活性型ＩＬ－１５産物を得るためのＦｃ ＩＬ－１５ ＶｉｔｏＫｉｎｅ Ｐ－０３１５のプロテアーゼ切断
ＶｉｔｏＫｉｎｅ Ｐ－０３１５（配列番号３３）は、ＦｃおよびＩＬ－１５を連結しているｕＰＡ基質ペプチドリンカー（配列番号９２）と、ＩＬ－１５ドメインおよびＩＬ－１５ＲαＳｕｓｈｉ＋ドメインを連結している第２の１０アミノ酸のＭＭＰ－２／９切断可能なリンカー（配列番号９５）と、を含有している。Ｐ－０３１５のＩＬ－１５ドメインは、受容体βサブユニットに対する結合性を増強するためのＳ５８Ｄ置換を含んでいる。プロテアーゼ消化により、Ｐ－０３１５の活性型を２種類作製した。
Ｐ－０３１５の一方の活性型（図２に第２活性型として模式的に図示）は、ＭＭＰ－２を用いたインビトロでのプロテアーゼ切断によって得た。簡潔に説明すると、６６０ｎｇの潜在型ＭＭＰ－２（バイオレジェンド社）を、製造業者の説明書に従ってＡＰＭＡ（ミリポア・シグマ社）で活性化し、緩衝液を交換し、０．４ｍｌの製造業者推奨のアッセイ用緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、２０ｍＭ ＣａＣｌ２、３００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％（ｗ／ｖ）Ｂｒｉｊ３５、ｐＨ７．５）中のＰ－０３１５（８０μｇ）に添加した。３７℃で３時間インキュベートした後、５０μｌのＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ樹脂（ＰＢＳで平衡化された５０％スラリー、ＧＥヘルスケア社）を反応液に添加した。目的の第１活性型を２５ｍＭクエン酸ナトリウム、２５ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ３．２）で溶出させた。３％１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ１０．２）の添加によりタンパク質を中和した。切断の評価を行うため、試料を４～１２％Ｔｒｉｓ－Ｂｉｓ ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で分離させた（図１２Ａ）。還元剤の存在下のＭＭＰ－２消化前のＰ－０３１５をレーン１に示した。レーン２およびレーン３は、ＭＭＰ－２タンパク質分解後であるがプロテインＡ精製前の非還元型Ｐ－０３１５および還元型Ｐ－０３１５である。ＩＬ－１５Ｒα－ｓｕｓｈｉ＋ドメインがゲルの９ＫＤａの位置にシャープなバンドとして出現しており、これにより、ＭＭＰ－２／９基質ペプチドリンカーにおける効率的なＭＭＰ－２切断が確認された。プロテインＡ精製後、各試料（レーン４およびレーン５）は同一の移動パターンを示している。このデータは、図２に第２活性型として図示されているように、共有結合から解放されたＩＬ－１５ＲαＳｕｓｈｉ＋ドメインが、Ｆｃと融合したＩＬ－１５と非共有結合的に会合したままであり；このような会合が、プロテインＡ溶出の際の低ｐＨ条件を耐えるのに十分な強さがあったことを示唆している。図１２Ｂには、この活性型の、非共有結合的に会合した２種類の成分がさらに示されている。
Ｐ－０３１５の他の活性型（図２に第３活性型として模式的に図示）は、ｕＰＡおよびＭＭＰ－２の両方を用いたＰ－０３１５のプロテアーゼ切断によって得た。簡潔に説明すると、１００μｇのＰ－０３１５を、５μｇと一緒に、４００μｌのＰＢＳ（ｐＨ７．２）緩衝液中で２０時間インキュベートした。次いで、２００ｍＭ Ｔｒｉｓ、４０ｍＭ ＣａＣｌ２、４５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２％（ｗ／ｖ）Ｂｒｉｊ３５を含有する等量の緩衝液（ｐＨ７．５）を反応液に加え、製造業者推奨のＭＭＰ－２アッセイ緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、２０ｍＭ ＣａＣｌ２、３００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％（ｗ／ｖ）Ｂｒｉｊ３５、ｐＨ７．５）に近づくように緩衝液を調整した。潜在型ＭＭＰ－２（６６０ｎｇ）をＡＰＭＡで活性化し、緩衝液を上記アッセイ用緩衝液と置換し、上記反応液に添加し、３７℃で３時間インキュベートした。Ｎｉ－Ｅｘｃｅｌ樹脂（ＰＢＳで平衡化された５０μｌの５０％スラリー、ＧＥヘルスケア社）を添加して、Ｈｉｓタグを付けたＭＭＰ－２およびｕＰＡを溶液から除去した。一方で、１００μｌのＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ樹脂（ＰＢＳで平衡化された５０％スラリー、ＧＥヘルスケア社）を反応液に添加することで、切断型Ｆｃ画分と、未切断のままのまたは不完全に消化されたＰ－０３１５を除去した。両方の親和性樹脂と共に室温で１５分間インキュベートした後、遠心分離で樹脂を取り除き、図２に模式図が示されたＰ－０３１５の第３活性型を含有するフロースルーを回収した。図１２Ｃに示されているように、Ｐ－０３１５の第３活性型は、二重タンパク質分解反応から予想される通りの、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５αＳｕｓｈｉ＋非共有結合複合体を含有しており；ＩＬ－１５はスメアバンド形成として移動しているものであり、ＩＬ－１５ＲαＳｕｓｈｉ＋は第２活性型（図１２Ｂ）で見られたような約９ＫＤａの位置にあるシャープなバンドである。
実施例７
ヒトＰＢＭＣアッセイによるプロテアーゼ活性型Ｆｃ ＩＬ－１５ ＶｉｔｏＫｉｎｅの活性評価
新鮮ヒトＰＢＭＣの免疫細胞亜分画の活性化マーカーＣＤ６９のＦＡＣＳ分析を、実施例２に詳述した通りに実施し、プロテアーゼ活性型ＩＬ－１５ ＶｉｔｏＫｉｎｅの活性を評価した。Ｐ－０２０３と、ｕＰＡ消化から得られた対応するその活性型（活性型Ｐ－０２０３；図２に第１活性型として模式的に図示）との比較を図１３に示す。プロテアーゼ活性化前のＶｉｔｏＫｉｎｅの活性は高活性ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα Ｆｃ融合タンパク質Ｐ－０１６５よりも約３対数分低く、実施例３に記載したＶｉｔｏＫｉｎｅ活性と一致した。ＣＤ５６＋ＮＫ細胞（図１３Ａ）およびＣＤ８＋Ｔ細胞（図１３Ｂ）に対する両方の活性化能が、ｕＰＡ消化により大幅に回復したが、Ｐ－０１６５の活性化能よりは尚も明白に低く、これは、ＩＬ－１５とＩＬ－１５Ｒαドメインとの共有結合が原因である可能性がある。ＩＬ－１５とＩＬ－１５Ｒαとを連結している柔軟リンカーの長さを伸ばすことは、活性型の活性を増強すると予想される。逆説的ではあるが、リンカー長の延長は、Ｄ３ドメインの活性遮蔽効率を低下させ、その結果、基礎活性がより高いＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体をもたらす可能性もある。
別のＩＬ－１５ Ｆｃ ＶｉｔｏＫｉｎｅ Ｐ－０３１５と、２種類のその活性型の生物活性を、新鮮ヒトＰＢＭＣの免疫細胞亜分画の活性化におけるＣＤ６９活性化を測定することにより、評価した。図１４から分かるように、非切断型Ｐ－０３１５の活性はほぼ測定不可であったが、これにより、ＶｉｔｏＫｉｎｅ型の活性部分の効果的な遮蔽が確認された。Ｐ－０３１５の第２活性型は、図２に示されているように、ＭＭＰ－２切断により遊離したＩＬ－１５ＲαＳｕｓｈｉ＋ドメインと非共有結合的に複合体形成しているＦｃ融合型ＩＬ－１５を含んでおり；高活性ＩＬ－１５ ＩＬ－１５Ｒα Ｆｃ融合タンパク質であるＰ－０３１３陽性対照と構造が似ている。Ｐ－０３１５の第３活性型は、図２に示されているように、ｕＰＡによってＦｃドメインから切断された遊離型のＩＬ－１５ドメインと、ＭＭＰ－２切断により放出されたＩＬ－１５ＲαＳｕｓｈｉ＋ドメインと、を含んでおり、これら２つは非共有結合的な複合体を形成している。Ｐ－０３１５の両方の活性型が、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞（図１４Ａ）およびＣＣＤ８＋Ｔ細胞（図１４Ｂ）の両方の活性化において、完全またはほぼ完全な活性の回復を示し；第３活性型は第２活性型よりも活性が多少高かった。腫瘍微小環境における目的経路の一過的な活性化が望ましい場合、第３活性型におけるＦｃドメインの欠如が有益である場合がある。
また、ＭＭＰ－２タンパク質分解前後のＰ－０３１５の活性を、処理後のＮＫ細胞（図１５Ａ）およびＣＤ８＋Ｔ細胞（図１５Ｂ）の核内のＫｉ６７発現を測定することにより、調べた。２つの切断不可な柔軟リンカーを含むＰ－０３５１を比較用に採用した。これらのデータから、ＶｉｔｏＫｉｎｅに活性がないことと、インビトロにおけるタンパク質分解性の活性化の後、ＮＫ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方において、およそ３対数分の活性回復が起こったことがさらに示された。Ｐ－０３５１とＰ－０３１５が同一の活性を有しることが確認されたが、このことは、Ｐ－０３１５の２つの切断可能なリンカーが、作製、発現、および保存の間にインタクトなままであり、各プロテアーゼに対して特異的であったことを示唆している。
要約すると、ＭＭＰ－２／９および／またはｕＰＡによるＩＬ－１５ ＶｉｔｏＫｉｎｅ Ｐ－０３１５の切断は、当該分子の活性化をもたらし、当該サイトカインの活性は、ｎＭ以下の範囲のＥＣ５０を有する高活性ＩＬ－１５化合物のＰ－０３１３と同様のレベルにまで回復した。
実施例８
健常マウスでＦｃ ＩＬ－１５ ＶｉｔｏＫｉｎｅを用いた場合の最小の全身性サイトカイン作用
ＶｉｔｏＫｉｎｅプラットフォーム技術の目標は、全身的なオンターゲット毒性を低減させ、治療濃度域を拡大することである。ＶｉｔｏＫｉｎｅは、活性サイトカインを不活性状態で遮蔽しており、当該サイトカインが周辺の、または患部以外の細胞の細胞表面上の受容体に結合することを防ぐ。結果として、ＶｉｔｏＫｉｎｅプラットフォームは、サイトカイン経路の過剰な活性化を制限し、望ましくない「オンターゲット」であるが「標的組織外に対する」毒性を低減する。ＶｉｔｏＫｉｎｅは、患部組織で発現増加しているプロテアーゼにより局所的な活性化を受けるよう意図されている。この前提の評価を行うため、プロテアーゼ切断可能なＶｉｔｏＫｉｎｅおよび切断不可なＶｉｔｏＫｉｎｅを健常マウスに投与し、高活性ＩＬ－１５ Ｆｃ融合タンパク質と比較して、全身性サイトカイン作用を評価した。
Ｐ－０３１３（配列番号４７および配列番号５）は陽性対照としての完全活性型ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα Ｆｃ融合分子である。Ｐ－０３１５（配列番号３３）は２つのプロテアーゼ切断可能なリンカーを含むＦｃ ＩＬ－１５ ＶｉｔｏＫｉｎｅである。Ｐ－０３５１（配列番号２５）は２つの切断不可なリンカーを含むＦｃ ＩＬ－１５ ＶｉｔｏＫｉｎｅである。陰性対照としては溶媒（ＰＢＳ）を用いた。化合物の投与は、単回腹腔内注射を１回、健常ＢＡＬＢ／ｃマウス（８～１０週齢、ｎ＝６匹／群）に、０．１ｍｇ／ｋｇおよび０．３ｍｇ／ｋｇの用量で行った。血液試料を投与前（－１日目）、または投与後３日目、５日目、および７日目に採取し、免疫表現型検査にかけた。
ＢＤ ｐｈａｒｍ溶解緩衝液で赤血球を溶解させた後、トリパンブルー死細胞排除法で総生単核血液細胞をカウントした。精製抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２（１：５０希釈）でＦｃ受容体をブロッキングした後、抗マウスＣＤ３－ＦＩＴＣ、抗マウスＣＤ４９ｂ－ＡＰＣ、および抗マウスＣＤ８－Ｐｅｒｃｐｃｙ５．５（１：５０希釈）で細胞を染色した。３０分間インキュベートした後、細胞を収集し、洗浄し、ＦＡＣＳ用緩衝液に再懸濁し、フローサイトメトリーで分析した。
図１６に示されているように、完全活性型ＩＬ－１５ Ｆｃ融合タンパク質であるＰ－０３１３は、末梢血中の細胞傷害性のＣＤ８＋Ｔ細胞（図１６Ａ）、ＮＫ細胞（図１６Ｂ）、および総白血球（図１６Ｃ）を、２つの試験用量で用量依存的に、劇的に増殖させた。細胞増殖は、３日目に確認され、５日目にピークを迎え、７日目にはベースライン近くにまで戻った。対照的に、切断可能なＶｉｔｏＫｉｎｅ（Ｐ－０３１５）および切断不可なＶｉｔｏＫｉｎｅ（Ｐ－０３５１）は共に、ＣＤ８ Ｔ細胞においては、７日間の全試験期間中に増加を示さなかった。ＮＫ細胞増殖においては、高用量の切断可能なＶｉｔｏＫｉｎｅ Ｐ－０３１５で処置されたマウスで、小さな増加が遅れて確認された。Ｐ－０３５１と、低用量のＰ－０３１５は、試験されたいずれの標的細胞集団においても、増加の兆候を示さなかった。全体として、活性分子Ｐ－０３１３と比較して、試験された２つのＶｉｔｏＫｉｎｅは、標的リンパ球集団の全身的な活性化および増殖を最小限にしか示さず、周辺部におけるＩＬ－１５の活性を遮蔽・遅延できることを示した。
実施例９
マウスにおけるＦｃ ＩＬ－１５ ＶｉｔｏＫｉｎｅを用いた結腸がん細胞の肺転移の阻害
マウスＣＴ２６肺転移モデルにおいて、ＩＬ－１５ Ｆｃ ＶｉｔｏＫｉｎｅ分子の転移抑制効果および免疫応答を調べた。簡潔に説明すると、１×１０５個のマウス結腸癌細胞ＣＴ２６－ＷＴ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２６３８）を、雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス（９～１１週齢）に静脈内注射した。翌日（１日目）から、腹腔内注射で、５日おきに４回の処置を開始した。処置群（計６群、ｎ＝７匹／群）は、０．３ｍｇ／ｋｇ Ｐ－０３１５群、０．３ｍｇ／ｋｇ Ｐ－０３５１群、および０．１ｍｇ／ｋｇ Ｐ－０３１３群を含む。Ｐ－０３１５（配列番号３３）は２つのプロテアーゼ切断可能なリンカーを含むＦｃ ＩＬ－１５ ＶｉｔｏＫｉｎｅである。Ｐ－０３５１（配列番号２５）は切断不可なＦｃ ＩＬ－１５ ＶｉｔｏＫｉｎｅである。Ｐ－０３１３（配列番号４７および配列番号５）は完全活性型ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα Ｆｃ融合分子である。陰性対照としては溶媒（ＰＢＳ）を用いた。１７日目、全てのマウスを屠殺し、組織摘出を行った。肺を１５％墨汁で膨らませ、Ｆｅｋｅｔｅ液（１０％ホルムアルデヒド、５％氷酢酸、および６０％エタノール）で脱染した。肺腫瘍小結節をカウントし、処置群と溶媒対照との間の腫瘍小結節数の違いにより転移抑制効果を表した。
図１７に示されているように、Ｐ－０３１３は肺転移の形成および成長の抑制において著しい効果を示した。０．１ｍｇ／ｋｇで、Ｐ－０３１３処置は完全に近い肺転移阻害を達成した。切断可能なＶｉｔｏＫｉｎｅ Ｐ－０３１５は、肺小結節の発生に７０％の阻害を示し；転移抑制効果は３つ全ての用量（０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、または３ｍｇ／ｋｇ）で同等であった。切断不可なＶｉｔｏＫｉｎｅ Ｐ－０３５１は、転移発生の減少に比較的弱いが有意な効果を示し、高用量においてのいくらかの固有の基礎活性が示唆された。しかし、Ｐ－０３１５はＰ－０３５１よりもはっきりと良好な転移抑制効果を示し（ｐ＜０．０５；図１７）、Ｐ－０３１５における一方または両方のリンカーのタンパク質切断と、その後の活性型ＩＬ－１５の遊離が、Ｐ－０３５１に対するＰ－０３１５のインビボ有効性における優位性に寄与している可能性が示唆される。腫瘍転移の発生は、腫瘍微小環境付近のタンパク質分解活性の増加をもたらし得る。
１５日目（３回目の処置の４日後）のマウス末梢血のフローサイトメトリー分析により、ＩＬ－１５化合物処置後の免疫応答を調べた。対照と比較して、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖は、活性ＩＬ－１５ Ｆｃ融合体のＰ－０３１３で処置されたマウスでは確認されたが、切断可能なＶｉｔｏＫｉｎｅのＰ－０３１５で処置されたマウスや切断不可なＶｉｔｏＫｉｎｅのＰ－０３５１で処置されたマウスでは確認されず、このことは、ＶｉｔｏＫｉｎｅによる全身的なＣＤ８＋Ｔ細胞の増加が生じていない場合において、結腸がん転移抑制効果が確認されたことを示唆している（図１７および図１８Ａ）。しかし、末梢血中のＮＫ細胞は３つ全てのＩＬ－１５化合物処置群で増加しており、最も顕著な増加は反復投与後の切断不可ＶｉｔｏＫｉｎｅ群で見られた（図１８Ｂ）。ＶｉｔｏＫｉｎｅ処置群ではＮＫ細胞の全身的な増殖は増加したが、ＣＤ８＋Ｔ細胞の全身的な増殖は増加せず、このことは、ＮＫ細胞がＩＬ－１５処置に対してＣＤ８＋Ｔ細胞よりも応答性が高く、ＶｉｔｏＫｉｎｅの固有の基礎活性がＮＫ細胞増殖をもたらし得ることを示唆している。すなわち、残りの全身作用を低減させるには、ＩＬ－１５ ＶｉｔｏＫｉｎｅの投与濃度を調整することが重要となる。Ｐ－０３５１群におけるＮＫ細胞の顕著な増加から、この低活性の切断不可ＶｉｔｏＫｉｎｅが、弱くではあるが持続的に経路を活性化し、長期の免疫応答をもたらし得ることも示唆される。
実施例１０
Ｆｃ ＩＬ－１５ ＶｉｔｏＫｉｎｅ Ｐ－０３１５はマウスにおける樹立されたＣＴ２６腫瘍の増殖を阻害し、全身性サイトカインの活性化は最小限であった
Ｆｃ ＩＬ－１５ ＶｉｔｏＫｉｎｅ Ｐ－０３１５の抗腫瘍活性および免疫応答を、ＣＴ２６マウス大腸癌腫瘍モデルで、完全活性型ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質Ｐ－０３１３と比較して、調べた。簡潔に説明すると、雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス（１０～１２週齢）の右側腹部に、１×１０５個のＣＴ２６細胞を皮下注射した。１１日目、平均腫瘍体積が約７０ｍｍ３となったとき、マウスを無作為に３つの群（ｎ＝１１匹／群）に分け、無作為化の同日に、溶媒（ＰＢＳ）、または０．１ｍｇ／ｋｇのＰ－０３１５もしくはＰ－０３１３の腹腔内注射を行った。１６日目に、各試験薬剤の腹腔内注射を追加で１回行った（５日おきに２回）。週３回ノギスを用いて腫瘍を測定し、腫瘍体積を以下の通りに算出した：体積＝０．５×（幅）２×（長さ）。１９日目、免疫応答の研究のために、非終末部の末梢血をヘパリン処理チューブに採取した。２１日目、全てのマウスを屠殺し、組織摘出を行った。
図１９Ａに示されているように、ＰＢＳ処置マウスは巨大な皮下腫瘍を急速に発達させ、Ｐ－０３１５またはＰ－０３１３によるマウスの処置は腫瘍増殖遅延ではおよそ等効力であった（図１９Ｂおよび１９Ｃ）。腫瘍接種後２１日目、対照処置マウスの平均腫瘍体積は約１０００ｍｍ３であったが、それに対し、Ｐ－０３１５処置マウスやＰ－０３１３処置マウスでは約４５０ｍｍ３であった（＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；一元配置分散分析とテューキーの事後検定（Ｔｕｋｅｙ’ｓ ｐｏｓｔ－ｔｅｓｔ））（図１９Ｄ）。注目すべきことに、Ｐ－０３１３は初期にはＰ－０３１５よりも大きな腫瘍量減少を示したが、治療が進むにつれてその差異は次第に小さくなっていった。Ｐ－０３１５の抗腫瘍効果の遅れは、基質ペプチドリンカーにアクセスし切断してＶｉｔｏＫｉｎｅを活性化するのに適した量のプロテアーゼを発生させるのに時間がかかったためと考えられる。
次に、末梢血中のＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の増殖に対するＰ－０３１５の効果を、Ｐ－０３１３および溶媒と比較して、フローサイトメトリーで調べた。末梢血中および脾臓内の総ＷＢＣおよびリンパ球サブセット（ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞）の各集団に対するＰ－０３１５の効果についても、同様の評価を行った。
担癌マウスに完全活性型ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα Ｆｃ融合体Ｐ－０３１３の注射を行ったところ、末梢血中および脾臓内の両方で、リンパ球の増殖能および増殖が強く誘導された（図２０～図２２）。ＰＢＳ群と比較して、Ｐ－０３１３処理後では、Ｋｉ６７増殖（Ｋｉ６７ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）は、末梢ＮＫ細胞では４倍の増殖（６１％対１５％；図２０Ａ）を見せ、ＣＤ８＋細胞では５．３倍の増殖（４６％対８．６％；図２０Ｂ）を見せた。同様に、Ｐ－０３１３処理は、末梢血中（図２１Ａ～図２１Ｃ）および脾臓内（図２２Ａ～２２Ｃ）の両方の総白血球、ＮＫ細胞、およびＣＤ８＋Ｔ細胞の、著しい細胞増殖をもたらした。例えば、末梢総ＷＣＢ細胞数は、６倍に増加し、ＣＤ８＋Ｔ細胞数は５倍に増加し；ＮＫ細胞数は８５倍という劇的な増加を見せた。脾臓においても、最も顕著な細胞増殖はＮＫ細胞で見られ（１０倍）、次いでＣＤ８＋Ｔ細胞であり、２．９倍の増加であった。脾臓内総ＷＢＣは１．７倍という控えめな増加であった。細胞傷害性のＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞のロバストな活性化は、ＩＬ－１５の全体的な免疫調節性と一貫しており、この強力な免疫応答がインビボにおけるＰ－０３１３の抗腫瘍活性の主要な寄与因子になったと考えられる。しかし、血液中のリンパ球サブセットの劇的な変化は、毒性を引き起こし、治療指数を低下させる場合がある。
Ｐ－０３１３とは著しい対照をなして、Ｆｃ ＩＬ－１５ ＶｉｔｏＫｉｎｅ Ｐ－０３１５による処置は、血液中のリンパ球サブセットの恒常性に最小限の変化しかもたらさなかった。この所見は、図２０においては末梢血中のＮＫ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞のＫｉ６７増殖で示され、図２１においては末梢血中の総白血球、ＮＫ細胞、およびＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞増殖で示された。Ｐ－０３１５処置後の唯一注目に値する免疫薬力学的効果は、脾臓内のＮＫ細胞数の４倍の増加であった（図２２Ｂ）。Ｐ－０３１５は樹立ＣＴ２６腫瘍の増殖遅延ではＰ－０３１３とおよそ等効力であったことから（図１９Ａ～１９Ｄ）、Ｐ－０３１５のインビボ抗腫瘍活性は、腫瘍微小環境付近で切断可能なリンカーがタンパク質分解を受けた後のＶｉｔｏＫｉｎｅの活性化によるものであったと考えられる。活性型ＶｉｔｏＫｉｎｅは腫瘍付近でのみ現れるため、不活性ＶｉｔｏＫｉｎｅ分子の投与に対する末梢リンパ球の応答は、完全活性型Ｐ－０３１３よりも、ずっとより程度の低いものであった。
まとめると、Ｐ－０３１５で例示されたＩＬ－１５ Ｆｃ ＶｉｔｏＫｉｎｅは、腫瘍増殖を効率的に遅延することができ、血液中および脾臓内のリンパ球サブセットの増殖能および増殖に著しい変化はもたらさなかった。結果的に、ＶｉｔｏＫｉｎｅ型により、抗腫瘍効果を損なうことなく、完全活性型サイトカインには通常付随する、経路の過剰な活性化、好ましくない「オンターゲット」ではあるが「標的組織外に対する」毒性、および望ましくない標的シンクを、抑制または低減することができた。
実施例１１
活性減弱型サイトカインとしての切断不可ＶｉｔｏＫｉｎｅ
インビトロでは強力なサイトカインがインビボでは最も強いリンパ球応答を誘発しない場合があることが、当該技術分野で知られている。高活性のサイトカインは、より強い受容体刺激、内部移行、および脱感作を伴い、シグナル伝達、増殖、および機能を減弱し、細胞死の増加やクローン枯渇をもたらす場合が多い。従って、過剰に強いリンパ球活性化を抑制し、持続的且つ増強されたインビボ薬力学的効果および抗腫瘍活性を達成するために、活性減弱型のサイトカインが極めて好ましい場合がある。
切断不可なＦｃ ＩＬ－１５ ＶｉｔｏＫｉｎｅ Ｐ－０３５１は、インビトロにおいては完全活性型ＩＬ－１５化合物と比較して顕著に抑制された活性を示したが、マウスＣＴ２６肺転移モデルにおいては転移抑制効果と顕著なＮＫ細胞応答とを示した（実施例８）。すなわち、切断不可なＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体を用いて、持続的な活性を有する活性減弱型サイトカインとして機能させることで、インビボ薬力学的作用を最適化することができる。
Ｐ－０３５１は、ＮＫ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞（図２３Ａおよび図２３Ｂ）の両方におけるＫｉ６７増殖能の誘導において、特許出願ＷＯ２０１８０７１９１９Ａ１におけるＸＥＮＰ０２４３０６と同等の基準分子（配列番号１７７および配列番号１７８）と同じ活性を示した。ＸＥＮＰ０２４３０６は、ＩＬ－１５にアミノ酸置換（Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ）を含み、Ｆｃに半減期延長変異を含む、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα Ｆｃ融合分子である。ＸＥＮＰ０２４３０６のＩＬ－１５鎖におけるこの三変異は、インビトロで２００倍の強さの抑制をもたらすことが報告された。ＸＥＮＰ０２４３０６は、インビボではより高い活性を有することが示されたが、これは、薬力学的特性がインビボにおいて最適化されているためと考えられる。
同様に、Ｐ－０３５１の活性の減弱化は、完全活性型サイトカインには通常付随する過剰な活性化や望ましくない標的シンクを回避または低減することにより、暴露をより持続的なものにし、薬力学的作用（ＰＤ）を改善すると期待される。すなわち、Ｐ－０３５１の半減期延長型対応物であるＰ－０６５１（配列番号１７０）は、半減期をより長期のものへと促し、インビボにおけるＰＤをさらに拡張する。
実施例１２
自己免疫疾患、炎症性障害、移植、および他の障害を治療するための制御性Ｔ細胞の選択的増殖のためのＦｃ ＩＬ－２ ＶｉｔｏＫｉｎｅ（Ｔｒｅｇ ＩＬ－２ ＶｉｔｏＫｉｎｅ）の構築および作製
炎症部位で発現上昇しているプロテアーゼにより局所的な活性化を受けるまで不活性状態を維持する、ＩＬ－２ ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体を設計することを目標としている。低用量の野生型ＩＬ－２はエフェクターＴ細胞よりも優先的にＴｒｅｇを刺激し、ＩＬ－２Ｒβに対する結合親和性が減少したＩＬ－２変異タンパク質は選択性の窓（ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ｗｉｎｄｏｗ）を広げることが報告されている。これらの分子は自己免疫疾患の予防療法として開発できる。ＩＬ－２Ｒβ結合性および／またはγＣ結合性には干渉するがＩＬ－２Ｒαとの相互作用には影響しない他の変異も、Ｔｅｆｆに対して以上にＴｒｅｇ活性化に対して、選択性の窓を広げることができる。
野生型ＩＬ－２または、エフェクターＴ細胞以上にＴｒｅｇを刺激するように選択性が増加したＩＬ－２変異タンパク質を含むＩＬ－２ Ｆｃ ＶｉｔｏＫｉｎｅを活性部分として用いた。この活性部分はＦｃドメインとＩＬ－２ＲαＳｕｓｈｉ（配列番号１０）との間で可逆的に遮蔽される。ＩＬ－２Ｒα（配列番号９）は、天然ペプチドリンカー領域で隔てられた２つのｓｕｓｈｉドメインを含む。ＩＬ－２ ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体は、炎症性障害部位で発現増加していることが報告されているプロテアーゼに認識される１つまたは２つの切断可能なリンカーを含む。ＦｃとＩＬ－２／変異タンパク質とを連結するリンカーは切断可能および切断不可の両方の場合が可能であるが、ＩＬ－２とＩＬ－２αＳｕｓｈｉとを連結するリンカーはプロテアーゼにより特異的に切断可能であることが好ましい。
Ｔｒｅｇを選択的に刺激するＩＬ－２変異タンパク質の活性は、プロテアーゼ切断後の、ＩＬ－２からのＩＬ－２Ｒαの遊離および拡散の後に回復することが予想される。ＩＬ－２ＲαとＩＬ－２との間のｎＭ結合親和性により、ＩＬ－２ＲαＳｕｓｈｉはリンカーの切断後もＩＬ－２と非共有結合的に会合し続け；結果的に、ＩＬ－２の、Ｔｒｅｇ細胞上のＩＬ－２Ｒαとの相互作用が遮断されたままとなる可能性がある。この潜在的な問題を解決するため、ＩＬ－２に対する結合性を弱めるように、ＩＬ－２との接触面にアミノ酸置換を有するＩＬ－２Ｒα変異タンパク質を設計した。すなわち、リンカーのプロテアーゼ切断後、上記ＩＬ－２ＲαＳｕｓｈｉ変異体はＩＬ－２から解離・拡散することとなり、この活性化メカニズム（図２６に模式的に図示）は図２に図示されているものとは若干異なる。
代表的なアミノ酸置換はＩＬ－２Ｒαドメインの３８位（すなわち、Ｋ３８Ｅ）および４３位（すなわちＹ４３Ａ）になされた。ＩＬ－２相互作用残基に置換を有する他のＩＬ－２Ｒαバリアントは、ＩＬ－２とＩＬ－２Ｒαの相互作用を壊すことが予想され、同様に組み入れることができる。当業者には理解されることであるが、これら全ての変異は、所望により、独立して、任意に組み合わせることで、最適な親和性の調節を達成することができる。異なるリンカーの組み合わせと、野生型またはバリアント型のＩＬ－２と、野生型またはバリアント型のＩＬ－２ＲαＳｕｓｈｉとを含む、ＩＬ－２ ＶｉｔｏＫｉｎｅ分子を作製した（その各々の配列は配列番号４９～６５として列挙）。
遺伝子合成、発現ベクター構成、並びにタンパク質の生成、精製、および特性評価は、実施例１に詳述した同じ手順に従って行った。ＩＬ－２ ＶｉｔｏＫｉｎｅのタンパク質プロファイルを示す一例として、Ｐ－０３２０のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を図２４Ａに示す。図２４Ｂのサイズ排除クロマトグラムから、ポリッシング工程を行っていない初期のプロテインＡ捕捉工程後に見られた凝集は５％未満であったことが示された。この低い凝集傾向により、ＩＬ－２ ＶｉｔｏＫｉｎｅの開発適合性プロファイルが好ましいものであることが示唆された。
実施例１３
がんおよび他の障害を治療するためのエフェクターＴ細胞の選択的増殖のためのＦｃ ＩＬ－２ ＶｉｔｏＫｉｎｅ（Ｔｅｆｆ ＩＬ－２ ＶｉｔｏＫｉｎｅ）の構築および作製
腫瘍部位にのみ存在している、または腫瘍部位で発現上昇しているプロテアーゼにより局所的な活性化を受けるまで不活性状態を維持する、ＩＬ－２ ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体を設計することを目標としている。ＴｒｅｇはエフェクターＴ細胞応答を抑制し得るため、ＩＬ－２によるＴｒｅｇの優先的な増殖はがん免疫療法にとってのＩＬ－２の望ましくない効果である。これらの制限を克服するため、ＩＬ－２に対して、ＩＬ－２Ｒαとの結合面に、Ｆ４２ＡおよびＲ３８Ｅを含むアミノ酸置換を設計し（ＰＮＡＳ、１９９１． ８８：４６３６－４６４０）、ＩＬ－２Ｒαに対する結合性を減少／消失させた。ＩＬ－２Ｒα結合のみに干渉し、ＩＬ－２Ｒβγとの相互作用には影響しない他の変異（例えば、Ｒ３８Ａ、Ｔ４１Ａ、Ｔ４１Ｇ、Ｔ４１Ｖ、Ｙ１０７Ｇ、Ｙ１０７Ｈ、Ｙ１０７Ｌ、またはＹ１０７Ｖ）も、組み込むことができる。当業者には理解されることであるが、これら全ての変異は、所望により、独立して、任意に組み合わせることで、最適な親和性の調節を達成することができる。
Ｆｃ ＩＬ－２ ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体は、野生型ＩＬ－２、またはＩＬ－２Ｒαに対する結合性が減少／消失したＩＬ－２バリアントを活性部分として含み、この活性部分はＦｃドメインとＩＬ－２ＲαＳｕｓｈｉ（配列番号１０）との間で可逆的に遮蔽される。これらの構築体は、様々な種類のがん（例えば、固形腫瘍）における発現増加が報告されているプロテアーゼに認識される１つまたは２つの切断可能なリンカーを含む。ＦｃとＩＬ－２／変異タンパク質とを連結するリンカーは切断可能なリンカーおよび切断不可なリンカーの両方が可能であるが、ＩＬ－２とＩＬ－２αＳｕｓｈｉとを連結するリンカーはプロテアーゼにより特異的に切断可能であることが好ましい。Ｔｅｆｆ機能に対する選択性を増加させるため、ＩＬ－２Ｒαは、切断後にＩＬ－２と会合していることが好ましい場合がある。ＩＬ－２変異タンパク質の活性は、プロテアーゼ切断後の、ＩＬ－２からのＩＬ－２Ｒαの遊離および拡散の後に回復することが予想される。活性部分として種々のＩＬ－２変異タンパク質を組み入れたＩＬ－２ ＶｉｔｏＫｉｎｅ分子を図１に模式的に示す。Ｔｅｆｆ細胞の選択的増殖のための例示的なＦｃ ＩＬ－２ ＶｉｔｏＫｉｎｅ分子を構築および作製した（その各々の配列は配列番号５９～６１として列挙）。
遺伝子合成、発現ベクター構成、並びにタンパク質の生成、精製、および特性評価は、実施例１に詳述した同じ手順に従って行った。
実施例１４
Ｆｃ ＩＬ－２ ＶｉｔｏＫｉｎｅのインビトロ活性評価
新鮮ヒトＰＢＭＣの特定Ｔ細胞サブセットのリン酸化ＳＴＡＴ５（ｐＳｔａｔ５）レベルを測定することにより、Ｔ細胞に対するＩＬ－２ ＶｉｔｏＫｉｎｅの生理活性を求めた。Ｓｔａｔ５は、膜貫通型ＩＬ－１２ＲβγＣ複合体へのＩＬ－２結合により誘導される、下流の細胞内シグナル伝達に関与していることが知られている。ｐＳｔａｔ５ペプチドに対する抗体を用いて、固定と透過処理を行った細胞におけるフローサイトメトリーにより、ｐＳｔａｔ５のレベルを測定した。簡潔に説明すると、オクラホマ血液研究所（Ｏｋｌａｈｏｍａ Ｂｌｏｏｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）より購入した健常ドナーのバフィーコートからのフィコール・ハイパック遠心分離によって、ヒトＰＢＭＣを単離した。２×１０５個のＰＢＭＣを試験化合物の段階希釈系列で３７℃で３０分間処理した。その後、製造業者の取扱説明書に従ってＦｏｘｐ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ（ＥＢＩＯ）で細胞を処理した。次いで、細胞をＣｙｔｏｆｉｘ緩衝液で固定し、Ｐｅｒｍ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩＩ（ＢＤバイオサイエンス社）で透過処理した後、洗浄した。ヒトＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ（１：５０希釈）を添加することでＦｃ受容体をブロッキングした後、製造業者が推奨する濃度の抗ＣＤ２５－ＰＥ抗体、抗ＦＯＸＰ３－ＡＰＣ抗体、抗ｐＳＴＡＴ５－ＦＩＴＣ抗体、および抗ＣＤ４－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５抗体の混合物で、室温で６０分間、細胞を染色した。次いで、細胞を収集し、洗浄し、ＦＡＣＳ用緩衝液に再懸濁し、フローサイトメトリーで分析した。フローサイトメトリーのデータにゲーティングをかけ、Ｆｏｘｐ３陽性／ＣＤ２５高発現群およびＦｏｘｐ３陰性／Ｄ２５低発現群（それぞれＴｒｅｇ細胞サブセットおよびＣＤ４エフェクターＴ細胞サブセット）とした。データは、ゲーティングされた集団におけるｐＳｔａｔ５陽性細胞の割合（％）として表される。
ＩＬ－２ ＶｉｔｏＫｉｎｅのＰ－０３２０（配列番号４９）およびＰ－０３２９（配列番号６２）を、Ｐ－０２５０（配列番号４８）と比較して、ｐＳｔａｔ５活性化について評価した。Ｐ－０３２０は野生型ＩＬ－２ドメインを含んでおり、野生型ＩＬ－２ドメインのＮ末端はｕＰＡ切断可能なリンカーを介してＦｃドメインと融合しており、野生型ＩＬ－２ドメインのＣ末端は柔軟な（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号１２７）リンカーでＩＬ－２ＲαＳｕｓｈｉドメインに連結されている。Ｐ－０３２９は野生型ＩＬ－２ドメインを含んでおり、野生型ＩＬ－２ドメインのＣ末端はｕＰＡ切断可能なリンカーを介してＦｃドメインと融合しており、野生型ＩＬ－２ドメインのＮ末端は柔軟な（ＧＧＧＧＳ）３リンカーでＩＬ－２ＲαＳｕｓｈｉドメインに連結されている。Ｐ－０２５０は高活性ＩＬ－２ Ｆｃ融合タンパク質である。各試験化合物について、Ｔｒｅｇ細胞サブセットおよびＣＤ４＋通常Ｔ細胞（Ｔｃｏｎｖ）サブセット中のｐＳｔａｔ５陽性細胞の割合を図２５に示す。完全活性型ＩＬ－２融合タンパク質と比較して、両方のＩＬ－２ ＶｉｔｏＫｉｎｅの場合で、ｐＳｔａｔ５活性化がＴｒｅｇにおいて劇的に減少していることが明らかである。ＣＤ４＋Ｔｃｏｎｖ細胞においては、ｐＳｔａｔ５活性化はほとんど測定できなかった。このデータは、ＶｉｔｏＫｉｎｅ形態においてのＩＬ－２活性の効率的な遮蔽を示している。
実施例１５
ＩＬ－２ ＶｉｔｏＫｉｎｅのプロテアーゼ活性化およびインビトロ活性評価
ＩＬ－２ ＶｉｔｏＫｉｎｅ Ｐ－０３８２（配列番号５１）は、ＦｃおよびＩＬ－２を連結している柔軟なＧＧＧＳＧＧＧＳリンカー（配列番号１１５）と、ＩＬ－２ドメインおよびＩＬ－２ＲαＳｕｓｈｉドメインを連結している１０アミノ酸ＭＭＰ－２／９切断可能なリンカー（配列番号７７）と、を含有している。Ｐ－０３８２のＩＬ－２ＲαＳｕｓｈｉドメインに、ＩＬ－２に対するその結合親和性を減少させるように設計されたアミノ酸置換（Ｋ３８Ｅ）を含ませることで、リンカーのプロテアーゼ切断後にＩＬ－２から解離しその後拡散するようにしている。
Ｐ－０３８２は、ＭＭＰ－２を用いたインビトロプロテアーゼ切断で活性化した。簡潔に説明すると、３．３μｇの潜在型ＭＭＰ－２（バイオレジェンド社）をまず、製造業者の説明書に従ってＡＰＭＡ（ミリポア・シグマ社）で活性化し、次いで緩衝液を交換し、０．４ｍｌの製造業者推奨のアッセイ用緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、２０ｍＭ ＣａＣｌ２、３００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％（ｗ／ｖ）Ｂｒｉｊ３５、ｐＨ７．５）中の１２０μｇのＰ－０３８２に添加した。３７℃で２０時間インキュベートした後、反応液の半分を、ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ樹脂を用いた精製にかけ、２５ｍＭクエン酸ナトリウム、２５ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ３．２）により活性型ＶｉｔｏＫｉｎｅを溶出させた。３％１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ１０．２）の添加によりタンパク質を中和した。もう半分の試料はＮｉ－Ｅｘｃｅｌ樹脂とインキュベートしＨｉｓタグＭＭＰ－２タンパク質を除去することにより反応を止め、遠心分離でＮｉ樹脂を除去することにより活性型ＶｉｔｏＫｉｎｅを収集した。プロテインＡ精製は、ＩＬ－２ＲαＳｕｓｈｉドメインが、図２６に模式的に図示されているように、ポリペプチド鎖切断後もＩＬ－２と非共有結合的に会合していないことを確認するためのものであった。図２７に示される４～１２％Ｔｒｉｓ－Ｂｉｓ ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で試料の評価を行った。構造的に類似したＩＬ－１５ ＶｉｔｏＫｉｎｅ（例えばＰ－０３１５）と比較して、プロテアーゼ量の増加と反応時間の延長にもかかわらず、反応は完全な切断をもたらさなかった。プロテインＡ精製を行ったＭＭＰ－２処理試料とプロテインＡ精製を行っていないＭＭＰ－２処理試料の比較（図２７Ａおよび図２７Ｂ）により、ＩＬ－２ＲαＳｕｓｈｉドメインが共有結合から解放され、Ｆｃ－ＩＬ－２融合ポリペプチドと共精製されていないことが確認された。
切断は不完全であるが、２種類のＭＭＰ－２活性化試料を、１つはＮｉ－Ｅｘｃｅｌフロースルー（第１活性型）として、他方はプロテインＡ溶離液（第２活性型）として、実施例１３に記載されたｐＳｔａｔ５活性化アッセイで評価し、データを図２８に示した。Ｐ－０３８２の活性は、Ｔｒｅｇにおいては非常に低く、ＣＤ４＋Ｔｃｏｎｖ細胞の場合ではほとんど測定できず、ＩＬ－２ ＶｉｔｏＫｉｎｅ形態での活性部分の効果的な遮蔽が再度確認された。両方の活性型試料がほぼ完全な活性回復を示した。Ｐ－０２５０と比較して活性が若干低いのは、タンパク質分解が不完全であるためと考えられた。
第１活性型および第２活性型はＴｒｅｇ細胞およびＴｃｏｎｖ細胞両方のｐＳｔａｔ５リン酸化の誘導において同等の活性を有する（図２８Ａおよび図２８Ｂ）ため、第１活性型試料中のＭＭＰ－２で切断されたＩＬ－２ＲαＳｕｓｈｉドメインの存在は、活性型ＩＬ－２ ＶｉｔｏＫｉｎｅの活性を変化させないと思われた。データから、ＭＭＰ－２切断により生じたＩＬ－２ＲαＳｕｓｈｉドメインはＩＬ－２と会合しなかったため、ＩＬ－２の、リンパ球上に発現している受容体複合体との結合を妨害しないはずであることが示唆された。
Ｐ－０３８２のＭＭＰ－２タンパク質分解は完全な切断をもたらさず、切断可能なリンカーの延長によって、基質ペプチドが、切断を担うプロテアーゼによりアクセスし易くなり得ることが考えられた。Ｐ－０３８２の１０アミノ酸リンカー（配列番号９５）を、余分な隣接残基を含む１５アミノ酸ＭＭＰ－２／９切断可能なリンカー（配列番号９４）と置き換えることで、新規のＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体Ｐ－０３９８（配列番号５２）を得た。上記で詳述された同じプロトコルに従った、ＭＭＰ－２を用いたインビトロプロテアーゼ切断により、Ｐ－０３９８を活性化した。ＭＭＰ－２量を１／３倍に少なくした場合でも（１８０μｇのＰ－０３９８の場合の１．５μｇのＭＭＰ－２に対し、１２０μｇのＰ－０３８２の場合の３．３μｇのＭＭＰ－２）、Ｐ－０３９８の完全な消化が達成されたことが、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上に「全切断」バンドのみが存在していた（データ未記載）ことから明らかとなった。
プロテインＡ精製によりＩＬ－２ＲαＳｕｓｈｉドメインが除去された活性型Ｐ－０３９８の生理活性をｐＳｔａｔ５アッセイで測定した（図２９Ａおよび図２９Ｂ）。活性型Ｐ－０３９８は配列および構造においてＩＬ－２ Ｆｃ融合分子であるＰ－０２５０と似ており、これらはＴｒｅｇ細胞およびＴｃｏｎｖ細胞の両方でのＳｔａｔ５リン酸化の誘導においてほぼ同一の活性を有する。ＶｉｔｏＫｉｎｅのＰ－０３８２およびＰ－０３９８は共に、ＩＬ－２ＲαＳｕｓｈｉドメインに共有結合的に連結されていることにより、生理活性が著しく障害されているが（４対数分）、より長いＬ２リンカーを含むＰ－０３９８がより高活性となる傾向があるように思われた。ＩＬ－１５ Ｆｃ ＶｉｔｏＫｉｎｅで確認されたことと同様に、Ｌ２リンカー長を調節することにより、ＩＬ－２ ＶｉｔｏＫｉｎｅの不活性さのレベルをさらに調整することができた。同様に、切断可能なＬ２リンカーの長さおよび配列の選択は、目的の適応疾病部位における特異的プロテアーゼの存在と、当該プロテアーゼに対する基質ペプチドの到達性と、所望のタンパク質分解速度との、バランスをとるべきである。
要約すると、ＩＬ－１５ ＶｉｔｏＫｉｎｅと比較して、ＩＬ－２ ＶｉｔｏＫｉｎｅは、完全なタンパク質分解を達成するための最適な酵素到達性のために、より長いＬ２リンカーを必要とした。ＭＭＰ－２による例示的なＩＬ－２ ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体であるＰ－０３８２およびＰ－０３９８の切断は、各分子の完全活性化をもたらした。これらの活性型ＩＬ－２ ＶｉｔｏＫｉｎｅは、高活性のＩＬ－２ Ｆｃ融合体化合物であるＰ－０２５０と同様の生理活性を達成した。
実施例１６
抗体型ＶｉｔｏＫｉｎｅの構築
組換え抗体－サイトカイン融合タンパク質（免疫サイトカイン）の使用は、当該サイトカインを患部に標的化することにより、サイトカインの治療指数を増強する見込みがある。しかし、完全活性型サイトカインを抗体に融合すると、周辺部の活性化や、腫瘍標的化の不足が生じる場合がある。目的治療部位における活性化前のＶｉｔｏＫｉｎｅの活性をなくすことで、抗体型ＶｉｔｏＫｉｎｅは、新規且つ革新的な免疫サイトカイン形態となる。腫瘍標的抗体に加えて、腫瘍微小環境における免疫抑制効果を回避する免疫チェックポイント阻止抗体や、既存の反応を増強する免疫刺激抗体も、抗体型ＶｉｔｏＫｉｎｅを構築するのに使用することができ、それにより、腫瘍に対する免疫系の活性をさらに増強することができる。さらに、炎症性の問題を有する部位（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｉｓｓｕｅ ｓｉｔｅ）を標的とする抗体型ＶｉｔｏＫｉｎｅは、抗自己免疫性慢性炎症性障害の治療に利用することができる。
このコンセプトに従って、Ｄ２ドメインとしてＩＬ－１５またはＩＬ－２のどちらかを含む抗体型ＶｉｔｏＫｉｎｅタンパク質を構築した。抗体の例としては、ＰＤ－１阻止抗体ＪＳ－００１、ＰＤ－Ｌ１阻止抗体テセントリク、抗ＣＴＬＡ４抗体イピリムマブ、アゴニストＣＤ４０抗体ＲＯ７００９７８９、腫瘍抗原標的抗体、例えば、フィブロネクチンの外部ドメイン（ｅｘｔｒａ－ｄｏｍａｉｎ）に対するＬ１９、ＣＤ２０に対するリツキシマブ、Ｈｅｒ－２に対するハーセプチン、ＥＧＦＲに対するセツキシマブ、並びに、抗炎症抗体の、インテグリンα４β７に対するベドリズマブおよびＴＮＦαに対するヒュミラが挙げられる。例示的な抗体型ＶｉｔｏＫｉｎｅの配列を配列番号１２８～１４３に列挙する。
遺伝子合成、発現ベクター構成、並びにタンパク質の生成、精製、および特性評価は、実施例１に詳述した同じ手順に従って行った。ヒトＰＢＭＣを各ＩＬ－１５ ＶｉｔｏＫｉｎｅ化合物で処理した後にＮＫ細胞（図３０Ａ）およびＣＤ８＋Ｔ細胞（図３０Ｂ）におけるＫｉ６７発現を測定することにより、例示的な抗ＰＤＬ１抗体ＩＬ－１５ ＶｉｔｏＫｉｎｅ Ｐ－０４８５（配列番号１８０および配列番号１８１）の生理活性を調べた。Ｐ－０４８５は、そのＦｃ ＶｉｔｏＫｉｎｅ型の対応物であるＰ－０３１５と同一の、Ｌ１リンカーとＬ２リンカーおよびＤ２ドメインとＤ３ドメインを共有している。図２９のデータから、両方のＶｉｔｏＫｉｎｅが、図１５に示される活性型Ｐ－０３１５と比較して、同等の強く障害された生理活性を有することが示唆された。Ｐ－０４８５は若干より高い活性を有しているように見えたが、これは、ＰＤ－Ｌ１遮断によるリンパ球活性化に起因している可能性がある。
実施例１７
プロテアーゼで活性化可能な不活性なＩＬ－１５融合タンパク質またはＩＬ－２融合タンパク質の作製物に対するＩＬ－１５Ｒβベースのブロッキングペプチド
プロテアーゼで活性化可能な不活性なＩＬ－１５融合タンパク質またはＩＬ－２融合タンパク質を作製するための異なるアプローチは、遺伝子的に、ブロッキングペプチド（例えば、ＩＬ－２Ｒβベースのブロッキングペプチド）を、切断可能なリンカーを介してＩＬ－１５またはＩＬ－２に融合することである。探索されたブロッキングペプチドは、ＩＬ－１５と直接接する重要な残基を含む２つのＩＬ－２Ｒβループ（配列番号９７および配列番号９８）をベースとしている。表１３に記載のペプチドは、これら２つのループの配列をベースとしている。
Figure 0007477885000017
表１３の５種のペプチドＬ０１～Ｌ０５（配列番号９７～１０１）を合成し、それらのＩＬ－１５に対する結合性をＥＬＩＳＡ形式で評価した。簡潔に説明すると、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５ＲαＳｕｓｈｉ＋Ｆｃ融合タンパク質であるＰ－０１５３（配列番号４４および配列番号４６）を、ヌンク社製Ｍａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェルマイクロプレートの各ウェル上に１μｇ／ウェルでコートし、１００μＭから開始して３倍段階希釈したビオチン化ペプチドを各ウェルに添加した。製造業者推奨の濃度のストレプトアビジン－ＨＲＰ複合体を添加し、ＴＭＢ基質によりシグナルを発色させた。図３０に示されているように、Ｌ０３（配列番号９９）に特異的結合が確認され、これは環化型ループ２（配列番号９８）であった。
ループ２をベースとした配列をブロッキングペプチドとして採用し、ＩＬ－１５融合タンパク質に組み込んだ。切断可能なリンカーおよびペプチドスペーサー（配列番号１０２～１０６）を介してＩＬ－１５に融合されたＩＬ－２Ｒβベースのブロッキングペプチドを含む融合タンパク質の配列の例が表１３に示されているが、表中、太字はＩＬ－１５Ｒβベースのブロッキングペプチドを示しており、波状の下線は切断可能なリンカーを示しており、直線状の下線はスペーサーペプチドを示している。ＩＬ－１５ＲαＳｕｓｈｉ＋（配列番号５）が共発現されたが、これはブロッキングペプチド含有ＩＬ－１５融合タンパク質と非共有結合性の複合体を形成する。
遺伝子合成、発現ベクター構成、並びにタンパク質の生成、精製、および特性評価は、実施例１に詳述した同じ手順に従って行った。これらのブロッキングペプチド含有ＩＬ－１５融合タンパク質をまず、ＩＬ－２Ｒβに対する結合能を評価するため、ＥＬＩＳＡアッセイで試験した。図３２に示されているように、Ｐ－０１５３と比較して、連結しているブロッキングペプチドの違いにより、結合親和性に若干の減少があった。しかしながら、これらのブロッキングペプチド含有ＩＬ－１５融合タンパク質によるＣＤ５６＋ＮＫ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞を含む免疫細胞の活性化の発現を評価するＰＢＭＣアッセイでは、注目に値する活性減少は示されず（データ未記載）、試験されたブロッキングペプチドの遮蔽効率が不十分であることが示唆された。活性遮蔽の効率を見るために、ＩＬ－２Ｒβの細胞外ドメイン全体を含む、様々な長さのブロッキングペプチドが探索される場合がある。ＩＬ－２にも同様に、同じアプローチを適用できた。
実施例１８
ＶｉｔｏＫｉｎｅ型は融合タンパク質の開発適合性を向上させる
当該技術分野において、天然起源のＩＬ－２タンパク質は、あまり安定ではない傾向にあり、凝集しやすいことが知られている。このことは、野生型ＩＬ－２ Ｆｃ融合タンパク質（Ｐ－０２５０）を低レベル（ＨＥＫ－２９３Ｆ細胞で一過的に約３ｍｇ／Ｌ）で発現させた実験において、図３３Ａに図示されるＳＥＣクロマトグラムにより高い凝集傾向が示されたことにより、実証された。４種類のＩＬ－２ ＶｉｔｏＫｉｎｅ分子、Ｐ－０３２０、Ｐ－０３８２、Ｐ－０３６２、およびＰ－０３７９を、Ｐ－０２５０と比較した。Ｐ－０３２０（配列番号４９）は、そのＮ末端がＦｃドメインと融合しており、そのＣ末端がＩＬ－２ＲαＳｕｓｈｉドメインに連結されている、野生型ＩＬ－２ドメインを含む。ＦｃとＩＬ－２とを連結しているＬ１リンカーはｕＰＡ基質ペプチドと隣接スペーサーペプチドを含む切断可能なリンカー（配列番号９２）であり、ＩＬ－２とＩＬ－２２ＲαＳｕｓｈｉとの間のＬ２リンカーは柔軟な（ＧＧＧＧＳ）３リンカー（配列番号１２７）である。Ｐ－０３８２（配列番号５１）は、リンカー配列においてのみＰ－０３２０と異なっており；Ｐ－０３８２のＬ１リンカーは柔軟な（Ｇ３Ｓ）２リンカー（ｌｉｎｅｒ）（配列番号１１５）であり、Ｌ２リンカーはＭＭＰ－２／９切断可能なリンカー（配列番号９５）である。Ｐ－０３６２（配列番号：）およびＰ－０３７９（配列番号５９）は、単一点突然変異でもって、Ｐ－３８２と異なっている。Ｐ－０３６２はＩＬ－２ＲαＳｕｓｈｉドメインにＫ３８Ｅ変異を含み、一方、Ｐ－０３７９はＩＬ－２ドメインにＦ４２Ａ置換を含む。Ｐ－０２５０（配列番号４８）は、ＩＬ－２が柔軟な（Ｇ３Ｓ）２（配列番号１１５）リンカーを用いてＦｃのＣ末端と融合されている、ＩＬ－２ Ｆｃ融合タンパク質である。
５種類の分子のサイズ排除分離の図表を図３３Ａ～図３３Ｅに示す。上記クロマトグラムから、４種全てのＩＬ－２ ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体が、ＩＬ－２ Ｆｃ融合タンパク質に優る、大幅に改善された純度プロファイルを有することは、非常に明白である。Ｐ－０２５０は好ましくない高分子量種を２５％超も含有している。対照的に、４種のＶｉｔｏＫｉｎｅ分子は全て、９６％超の単量体含量で、シャープな単量体ピークを示している。リンカーの変更も、ＩＬ－２における変異も、ＩＬ－２ＲαＳｕｓｈｉにおける変異も、質に対して注目に値する影響を与えなかった。このようなタンパク質の質における著しい増強は、ＶｉｔｏＫｉｎｅにおけるＩＬ－２αＳｕｓｈｉドメインの融合に起因しているように思われた。
タンパク質の質に加えて、ＩＬ－２ ＶｉｔｏＫｉｎｅの発現レベルも増強され、特に、ＦｃとＩＬ－２との間にＧＳリンカーを有し、ＩＬ－２とＩＬ－２ＲαＳｕｓｈｉとの間に１０アミノ酸のＭＭＰ－２／９で活性化可能なリンカーを有するＶｉｔｏＫｉｎｅ型が増強された。タンパク質発現レベルは細胞の増殖条件を原因として異なるバッチ間で異なる場合があるが、ＶｉｔｏＫｉｎｅの発現レベルは、明らかに、ＩＬ－２ Ｆｃ融合タンパク質よりも一貫して数倍高い。ｍｇ／Ｌ単位のタンパク質の発現価（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｔｉｔｅｒ）を、タンパク質の単量体の割合と共に、表１４に示す。
Figure 0007477885000018
さらに、本発明者らのＩＬ－２に対する技術的努力により、生物活性を完全に保持したまま、ＩＬ－２ Ｆｃ融合構築体の開発適合性に普遍的な改善をもたらした、１２５位におけるセリンのイソロイシンとの１アミノ酸置換も同定された。Ｆｃ融合体型における、野生型ＩＬ－２、および異なる変異構成のＩＬ－２バリアント、の１２５位におけるＩｌｅ置換は、全て、４～１１倍に増強された発現レベルおよび一様に低い凝集傾向をもたらした。例示的な分子の、発現レベル（ｍｇ／Ｌ）、およびＳＥＣクロマトグラフィーで評価されたプロテインＡ精製物の純度（凝集率）を表１５にまとめる。表１５の同じ列にある２分子は、他のアミノ酸置換に関しては同じものを共有しており、１２５番残基がセリンであるかイソロイシンであるかのみ異なる。一例として、Ｐ－２５０のＩＬ－２－Ｓ１２５Ｉ型の対応分子のＳＥＣクロマトグラムを、図３３Ｆにさらに例示する。
Figure 0007477885000019
結論として、ＶｉｔｏＫｉｎｅプラットフォームがタンパク質の開発適合性プロファイルを大幅に改善することが、Ｆｃ ＩＬ－２ ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体のタンパク質発現増加と凝集傾向のかなりの低減とにより示された。さらに、有益なＩＬ－２ Ｓ１２５Ｉアミノ酸を組み込んでいるＩＬ－２（野生型ＩＬ－２またはバリアントＩＬ－２）ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体は、開発適合性プロファイルがさらに増強されることとなる。
実施例１９
ＶｉｔｏＫｉｎｅ Ｄ３ドメインの選択はタンパク質発現に劇的な影響を与え得る
Ｄ３ドメインが、Ｄ２ドメインのコグネイト受容体のバリアントである、または無関係なタンパク質ドメインである、ＶｉｔｏＫｉｎｅプラットフォームも、探索された。結晶構造解析（Ｗａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１０巻：頁１１５９－１１６３、２００５年）によれば、ＩＬ－２Ｒαのｓｕｓｈｉドメイン１とｓｕｓｈｉドメイン２とは、鎖交換事象において会合する。その結果、ＩＬ－２Ｒαの第１～１９残基はｓｕｓｈｉドメイン２の一部であり、第１０２～１２２残基はｓｕｓｈｉドメイン１の一部であった。このような構造配置を、Ｎ末端にＩＬ－２Ｒα（配列番号１０）の第１０２～１２２残基を含み、Ｃ末端にＩＬ－２Ｒαの第２０～６８残基を含む、ＩＬ－２ＲαＳｕｓｈｉバリアント（配列番号１４７）に反映させた。そのようなＩＬ－２ＲαＳｕｓｈｉバリアントは、ＩＬ－２との相互作用残基の大部分を含み、構造的な完全性が想定される場合の活性の大部分を再現するはずである。Ｐ－０３２０（配列番号４９）のＩＬ－２ＲαＳｕｓｈｉドメインをＩＬ－２ＲαＳｕｓｈｉバリアントと置換することで、ＩＬ－２ ＶｉｔｏＫｉｎｅ Ｐ－０３２１（配列番号１７９）を得た。予想外にも、Ｄ３ドメインとしてＩＬ－２ＲαＳｕｓｈｉバリアントを含むＰ－０３２１は、全く発現しないか、あるいは発現レベルが低く、物質を捕捉・精製することができなかった。
同様に、ＶｉｔｏＫｉｎｅ Ｐ－０３１５（配列番号３３）のＩＬ－１５αＳｕｓｈｉ＋ドメインをＩＬ－２ＲαＳｕｓｈｉ（配列番号１０）と置換した。得られたタンパク質はＰ－０３８９（配列番号４２）である。Ｐ－０３８９はＰ－０３１５と比較して著しく低いレベルで発現した。さらに驚くべきことに、図３４Ａに示されるＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル像から分かるように、精製されたＰ－０３８９は主に高分子量の凝集体であった。比較する目的で、対応分子であるＰ－０３１５のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル像を図３４Ｂに示す。さらに、精製されたＰ－０３８９は、その配列中にＭＭＰ－２／９基質ペプチドが存在しているにもかかわらず、ＭＭＰ－２消化に対して耐性を示し、このことは、当該分子が正しくフォールディングされなかったか、あるいは、凝集によってプロテアーゼのアクセスが制限されたことを示唆している。
要約すると、Ｄ３はＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体の非常に重要な成分である。遮蔽部分としての機能に加え、Ｄ３はタンパク質の開発適合性プロファイルに対して正および負の劇的な影響を与え得る。
本願で開示および特許請求されている物品および方法は全て、本開示に照らし合わせることで、必要以上の実験を行うことなく作製および実行することができる。本開示の物品および方法を好ましい実施形態の観点から説明したが、本開示の精神および範囲から逸脱しない範囲で、物品および方法に変更を適用してもよいことは、当業者には明らかである。当業者には明らかな、そのような変更形態および均等物は全て、現存するものであれ後に開発されるものであれ、添付の特許請求の範囲によって定義される本開示の精神および範囲に包含されると見なされる。本明細書で言及された特許、特許出願、および刊行物は全て、本開示が属する技術分野における当業者の水準を示すものである。全ての特許、特許出願、および刊行物は、あたかも個々の刊行物が、その全体があらゆる目的で参照により援用されると明確且つ個別に示されているのと同程度に、それらの全体があらゆる目的で参照により本明細書に援用される。本明細書に例示的に記載された開示は、本明細書に特には開示されていない任意の要素の非存在下で、好適に実施されている場合がある。すなわち、本開示は好ましい実施形態および任意の特徴によって具体的に開示されたが、本明細書で開示された概念の変更および変形が当業者によって為されてもよいこと、並びに、そのような変更形態および変形形態が添付の特許請求の範囲によって定義される本開示の範囲内であると見なされることを理解されたい。
［配列表］
添付の配列表に列挙された核酸配列およびアミノ酸配列では、米国特許法施行規則§１．８２２の規定の通り、ヌクレオチド塩基は標準的な略語を用いて示しており、アミノ酸は３文字表記を用いて示している。
配列番号１はヒトＩＬ－１５前駆体のアミノ酸配列である。
配列番号２はヒトＩＬ－１５成熟型のアミノ酸配列である。
配列番号３はＩＬ－１５バリアントポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号４はヒトＩＬ－１５Ｒαのアミノ酸配列である。
配列番号５はヒトＩＬ－１５Ｒαのｓｕｓｈｉドメイン＋のアミノ酸配列である。
配列番号６はヒトＩＬ－２前駆体のアミノ酸配列である。
配列番号７はヒトＩＬ－２成熟型の天然アミノ酸配列である。
配列番号８はヒトＩＬ－２成熟型の野生型アミノ酸配列である。
配列番号９はヒトＩＬ－２Ｒα（ＣＤ２５）前駆体のアミノ酸配列である。
配列番号１０はヒトＩＬ－２Ｒαのｓｕｓｈｉドメインのアミノ酸配列である。
配列番号１１はヒトＩＬ－２Ｒβ前駆体のアミノ酸配列である。
配列番号１２はヒトＩＬ－２Ｒβの細胞外ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号１３はヒトＩｇＧ１－Ｆｃのアミノ酸配列である。
配列番号１４はエフェクター機能が低減／消失したヒトＩｇＧ１－Ｆｃの配列である。
配列番号１５はＫｎｏｂ－Ｆｃのアミノ酸配列である。
配列番号１６はＨｏｌｅ－Ｆｃのアミノ酸配列である。
配列番号１７はヒトＩＬ－４成熟型のアミノ酸配列である。
配列番号１８はヒトＩＬ－７成熟型のアミノ酸配列である。
配列番号１９はヒトＩＬ－９成熟型のアミノ酸配列である。
配列番号２０はヒトＩＬ－１０成熟型のアミノ酸配列である。
配列番号２１はヒトＩＬ－１２サブユニットα成熟型の配列である。
配列番号２２はヒトＩＬ－１２サブユニットβ成熟型の配列である。
配列番号２３はヒトＩＬ－２３サブユニットα成熟型の配列である。
配列番号２４はヒトＩＬ－２７サブユニットβ成熟型の配列である。
配列番号２５～４３は各種Ｆｃ ＩＬ－１５ ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体のアミノ酸配列である。
配列番号４４はＨｏｌｅ－Ｆｃ－ＩＬ－１５融合タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号４５はＫｎｏｂ－Ｆｃ－ＩＬ－１５融合タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号４６はＫｎｏｂ－Ｆｃ－ＩＬ－１５Ｒα－Ｓｕｓｈｉ＋融合タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号４７はＦｃ－ＩＬ－１５ Ｓ５８Ｄ融合タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号４８はＩＬ－２融合タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号４９～６５は各種Ｆｃ ＩＬ－２ ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体のアミノ酸配列である。
配列番号６６～７０はブロッキングペプチドを含む各種ＩＬ－１５構築体のアミノ酸配列である。
配列番号７１～８７および配列番号１５７～１５９は各種プロテアーゼ基質ペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号８８～９６および配列番号１６０～１６１は、各種スペーサーペプチドが隣接しているプロテアーゼ基質ペプチドを含む、プロテアーゼ切断可能な各種リンカーのアミノ酸配列である。
配列番号９７～１０６は各種ブロッキングペプチド配列のアミノ酸配列である。
配列番号１０７～１２７は各種切断不可なリンカー配列のアミノ酸配列である。
配列番号１２８～１４６は各種抗体ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体のアミノ酸配列である。
配列番号１４７はヒトＩＬ－２Ｒαのバリアント配列である。
配列番号１４８～１４９はＨｏｌｅ－Ｆｃ－ＩＬ－１５融合構築体のアミノ酸配列である。
配列番号１５０～１５５は各種Ｆｃ ＩＬ－２ ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体のアミノ酸配列である。
配列番号１５６は、エフェクター機能が低減／消失し、半減期が延長したヒトＩｇＧ１－Ｆｃの配列である。
配列番号１６２～１６５は各種Ｆｃ ＩＬ－１５ ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体のアミノ酸配列である。
配列番号１６６は、エフェクター機能が低減／消失し、半減期が延長したヒトＩｇＧ１－Ｆｃの配列である。
配列番号１６７は半減期が延長したＫｎｏｂ－Ｆｃのアミノ酸配列である。
配列番号１６８は半減期が延長したＨｏｌｅ－Ｆｃのアミノ酸配列である。
配列番号１６９～１７４は各種Ｆｃ ＩＬ－１５ ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体のアミノ酸配列である。
配列番号１７５～１７８は各種ＩＬ－１５ Ｆｃ融合構築体のアミノ酸配列である。
配列番号１７９はＦｃ ＩＬ－２ ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体のアミノ酸配列である。
配列番号１８０～１８１は抗体ＩＬ－１５ ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体のアミノ酸配列である。
配列番号１８２～１９２は各種Ｆｃ ＩＬ－１５ ＶｉｔｏＫｉｎｅ構築体のヌクレオチド配列である。

配列表
ヒトＩＬ－１５前駆体の配列
ＭＲＩＳＫＰＨＬＲＳＩＳＩＱＣＹＬＣＬＬＬＮＳＨＦＬＴＥＡＧＩＨＶＦＩＬＧＣＦＳＡＧＬＰＫＴＥＡＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳ（配列番号１）
ヒトＩＬ－１５成熟型の配列
ＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳ（配列番号２）
ヒトＩＬ－１５ Ｓ５８Ｄ 変異タンパク質
ＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＤＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳ（配列番号３）
ヒトＩＬ－１５Ｒ𝛼前駆体の配列
ＭＡＰＲＲＡＲＧＣＲＴＬＧＬＰＡＬＬＬＬＬＬＬＲＰＰＡＴＲＧＩＴＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲＤＰＡＬＶＨＱＲＰＡＰＰＳＴＶＴＴＡＧＶＴＰＱＰＥＳＬＳＰＳＧＫＥＰＡＡＳＳＰＳＳＮＮＴＡＡＴＴＡＡＩＶＰＧＳＱＬＭＰＳＫＳＰＳＴＧＴＴＥＩＳＳＨＥＳＳＨＧＴＰＳＱＴＴＡＫＮＷＥＬＴＡＳＡＳＨＱＰＰＧＶＹＰＱＧＨＳＤＴＴＶＡＩＳＴＳＴＶＬＬＣＧＬＳＡＶＳＬＬＡＣＹＬＫＳＲＱＴＰＰＬＡＳＶＥＭＥＡＭＥＡＬＰＶＴＷＧＴＳＳＲＤＥＤＬＥＮＣＳＨＨＬ（配列番号４）
ヒトＩＬ－１５Ｒ𝛼、ｓｕｓｈｉドメイン＋
ＩＴＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲＤＰＡＬＶＨＱＲＰＡＰＰ（配列番号５）
ヒトＩＬ－２前駆体の配列
ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＣＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号６）
ヒトＩＬ－２成熟型の天然配列
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＣＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号７）
ヒトＩＬ－２成熟型の野生型配列
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号８）
ヒトＩＬ－２Ｒα（ＣＤ２５）前駆体の配列
ＭＤＳＹＬＬＭＷＧＬＬＴＦＩＭＶＰＧＣＱＡＥＬＣＤＤＤＰＰＥＩＰＨＡＴＦＫＡＭＡＹＫＥＧＴＭＬＮＣＥＣＫＲＧＦＲＲＩＫＳＧＳＬＹＭＬＣＴＧＮＳＳＨＳＳＷＤＮＱＣＱＣＴＳＳＡＴＲＮＴＴＫＱＶＴＰＱＰＥＥＱＫＥＲＫＴＴＥＭＱＳＰＭＱＰＶＤＱＡＳＬＰＧＨＣＲＥＰＰＰＷＥＮＥＡＴＥＲＩＹＨＦＶＶＧＱＭＶＹＹＱＣＶＱＧＹＲＡＬＨＲＧＰＡＥＳＶＣＫＭＴＨＧＫＴＲＷＴＱＰＱＬＩＣＴＧＥＭＥＴＳＱＦＰＧＥＥＫＰＱＡＳＰＥＧＲＰＥＳＥＴＳＣＬＶＴＴＴＤＦＱＩＱＴＥＭＡＡＴＭＥＴＳＩＦＴＴＥＹＱＶＡＶＡＧＣＶＦＬＬＩＳＶＬＬＬＳＧＬＴＷＱＲＲＱＲＫＳＲＲＴＩ（配列番号９）
ヒトＩＬ－２Ｒα Ｓｕｓｈｉ
ＥＬＣＤＤＤＰＰＥＩＰＨＡＴＦＫＡＭＡＹＫＥＧＴＭＬＮＣＥＣＫＲＧＦＲＲＩＫＳＧＳＬＹＭＬＣＴＧＮＳＳＨＳＳＷＤＮＱＣＱＣＴＳＳＡＴＲＮＴＴＫＱＶＴＰＱＰＥＥＱＫＥＲＫＴＴＥＭＱＳＰＭＱＰＶＤＱＡＳＬＰＧＨＣＲＥＰＰＰＷＥＮＥＡＴＥＲＩＹＨＦＶＶＧＱＭＶＹＹＱＣＶＱＧＹＲＡＬＨＲＧＰＡＥＳＶＣＫＭＴＨＧＫＴＲＷＴＱＰＱＬＩＣＴＧ（配列番号１０）
ヒトＩＬ－２Ｒβ前駆体の配列
ＭＡＡＰＡＬＳＷＲＬＰＬＬＩＬＬＬＰＬＡＴＳＷＡＳＡＡＶＮＧＴＳＱＦＴＣＦＹＮＳＲＡＮＩＳＣＶＷＳＱＤＧＡＬＱＤＴＳＣＱＶＨＡＷＰＤＲＲＲＷＮＱＴＣＥＬＬＰＶＳＱＡＳＷＡＣＮＬＩＬＧＡＰＤＳＱＫＬＴＴＶＤＩＶＴＬＲＶＬＣＲＥＧＶＲＷＲＶＭＡＩＱＤＦＫＰＦＥＮＬＲＬＭＡＰＩＳＬＱＶＶＨＶＥＴＨＲＣＮＩＳＷＥＩＳＱＡＳＨＹＦＥＲＨＬＥＦＥＡＲＴＬＳＰＧＨＴＷＥＥＡＰＬＬＴＬＫＱＫＱＥＷＩＣＬＥＴＬＴＰＤＴＱＹＥＦＱＶＲＶＫＰＬＱＧＥＦＴＴＷＳＰＷＳＱＰＬＡＦＲＴＫＰＡＡＬＧＫＤＴＩＰＷＬＧＨＬＬＶＧＬＳＧＡＦＧＦＩＩＬＶＹＬＬＩＮＣＲＮＴＧＰＷＬＫＫＶＬＫＣＮＴＰＤＰＳＫＦＦＳＱＬＳＳＥＨＧＧＤＶＱＫＷＬＳＳＰＦＰＳＳＳＦＳＰＧＧＬＡＰＥＩＳＰＬＥＶＬＥＲＤＫＶＴＱＬＬＬＱＱＤＫＶＰＥＰＡＳＬＳＳＮＨＳＬＴＳＣＦＴＮＱＧＹＦＦＦＨＬＰＤＡＬＥＩＥＡＣＱＶＹＦＴＹＤＰＹＳＥＥＤＰＤＥＧＶＡＧＡＰＴＧＳＳＰＱＰＬＱＰＬＳＧＥＤＤＡＹＣＴＦＰＳＲＤＤＬＬＬＦＳＰＳＬＬＧＧＰＳＰＰＳＴＡＰＧＧＳＧＡＧＥＥＲＭＰＰＳＬＱＥＲＶＰＲＤＷＤＰＱＰＬＧＰＰＴＰＧＶＰＤＬＶＤＦＱＰＰＰＥＬＶＬＲＥＡＧＥＥＶＰＤＡＧＰＲＥＧＶＳＦＰＷＳＲＰＰＧＱＧＥＦＲＡＬＮＡＲＬＰＬＮＴＤＡＹＬＳＬＱＥＬＱＧＱＤＰＴＨＬＶ（配列番号１１）
ヒトＩＬ－２Ｒβの細胞外ドメインの配列
ＡＶＮＧＴＳＱＦＴＣＦＹＮＳＲＡＮＩＳＣＶＷＳＱＤＧＡＬＱＤＴＳＣＱＶＨＡＷＰＤＲＲＲＷＮＱＴＣＥＬＬＰＶＳＱＡＳＷＡＣＮＬＩＬＧＡＰＤＳＱＫＬＴＴＶＤＩＶＴＬＲＶＬＣＲＥＧＶＲＷＲＶＭＡＩＱＤＦＫＰＦＥＮＬＲＬＭＡＰＩＳＬＱＶＶＨＶＥＴＨＲＣＮＩＳＷＥＩＳＱＡＳＨＹＦＥＲＨＬＥＦＥＡＲＴＬＳＰＧＨＴＷＥＥＡＰＬＬＴＬＫＱＫＱＥＷＩＣＬＥＴＬＴＰＤＴＱＹＥＦＱＶＲＶＫＰＬＱＧＥＦＴＴＷＳＰＷＳＱＰＬＡＦＲＴＫＰＡＡＬＧＫＤＴ（配列番号１２）
ヒトＩｇＧ１－Ｆｃ
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号１３）
エフェクター機能が低減／消失したヒトＩｇＧ１－Ｆｃ
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号１４）
Ｋｎｏｂ－Ｆｃ
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号１５）
Ｈｏｌｅ－Ｆｃ
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号１６）
ヒトＩＬ－４成熟型の配列
ＨＫＣＤＩＴＬＱＥＩＩＫＴＬＮＳＬＴＥＱＫＴＬＣＴＥＬＴＶＴＤＩＦＡＡＳＫＮＴＴＥＫＥＴＦＣＲＡＡＴＶＬＲＱＦＹＳＨＨＥＫＤＴＲＣＬＧＡＴＡＱＱＦＨＲＨＫＱＬＩＲＦＬＫＲＬＤＲＮＬＷＧＬＡＧＬＮＳＣＰＶＫＥＡＮＱＳＴＬＥＮＦＬＥＲＬＫＴＩＭＲＥＫＹＳＫＣＳＳ（配列番号１７）
ヒトＩＬ－７成熟型の配列
ＤＣＤＩＥＧＫＤＧＫＱＹＥＳＶＬＭＶＳＩＤＱＬＬＤＳＭＫＥＩＧＳＮＣＬＮＮＥＦＮＦＦＫＲＨＩＣＤＡＮＫＥＧＭＦＬＦＲＡＡＲＫＬＲＱＦＬＫＭＮＳＴＧＤＦＤＬＨＬＬＫＶＳＥＧＴＴＩＬＬＮＣＴＧＱＶＫＧＲＫＰＡＡＬＧＥＡＱＰＴＫＳＬＥＥＮＫＳＬＫＥＱＫＫＬＮＤＬＣＦＬＫＲＬＬＱＥＩＫＴＣＷＮＫＩＬＭＧＴＫＥＨ（配列番号１８）
ヒトＩＬ－９成熟型の配列
ＱＧＣＰＴＬＡＧＩＬＤＩＮＦＬＩＮＫＭＱＥＤＰＡＳＫＣＨＣＳＡＮＶＴＳＣＬＣＬＧＩＰＳＤＮＣＴＲＰＣＦＳＥＲＬＳＱＭＴＮＴＴＭＱＴＲＹＰＬＩＦＳＲＶＫＫＳＶＥＶＬＫＮＮＫＣＰＹＦＳＣＥＱＰＣＮＱＴＴＡＧＮＡＬＴＦＬＫＳＬＬＥＩＦＱＫＥＫＭＲＧＭＲＧＫＩ（配列番号１９）
ヒトＩＬ－１０成熟型の配列
ＳＰＧＱＧＴＱＳＥＮＳＣＴＨＦＰＧＮＬＰＮＭＬＲＤＬＲＤＡＦＳＲＶＫＴＦＦＱＭＫＤＱＬＤＮＬＬＬＫＥＳＬＬＥＤＦＫＧＹＬＧＣＱＡＬＳＥＭＩＱＦＹＬＥＥＶＭＰＱＡＥＮＱＤＰＤＩＫＡＨＶＮＳＬＧＥＮＬＫＴＬＲＬＲＬＲＲＣＨＲＦＬＰＣＥＮＫＳＫＡＶＥＱＶＫＮＡＦＮＫＬＱＥＫＧＩＹＫＡＭＳＥＦＤＩＦＩＮＹＩＥＡＹＭＴＭＫＩＲＮ（配列番号２０）
ヒトＩＬ－１２サブユニットα成熟型の配列
ＲＮＬＰＶＡＴＰＤＰＧＭＦＰＣＬＨＨＳＱＮＬＬＲＡＶＳＮＭＬＱＫＡＲＱＴＬＥＦＹＰＣＴＳＥＥＩＤＨＥＤＩＴＫＤＫＴＳＴＶＥＡＣＬＰＬＥＬＴＫＮＥＳＣＬＮＳＲＥＴＳＦＩＴＮＧＳＣＬＡＳＲＫＴＳＦＭＭＡＬＣＬＳＳＩＹＥＤＬＫＭＹＱＶＥＦＫＴＭＮＡＫＬＬＭＤＰＫＲＱＩＦＬＤＱＮＭＬＡＶＩＤＥＬＭＱＡＬＮＦＮＳＥＴＶＰＱＫＳＳＬＥＥＰＤＦＹＫＴＫＩＫＬＣＩＬＬＨＡＦＲＩＲＡＶＴＩＤＲＶＭＳＹＬＮＡＳ（配列番号２１）
ヒトＩＬ－１２サブユニットβ成熟型の配列
ＩＷＥＬＫＫＤＶＹＶＶＥＬＤＷＹＰＤＡＰＧＥＭＶＶＬＴＣＤＴＰＥＥＤＧＩＴＷＴＬＤＱＳＳＥＶＬＧＳＧＫＴＬＴＩＱＶＫＥＦＧＤＡＧＱＹＴＣＨＫＧＧＥＶＬＳＨＳＬＬＬＬＨＫＫＥＤＧＩＷＳＴＤＩＬＫＤＱＫＥＰＫＮＫＴＦＬＲＣＥＡＫＮＹＳＧＲＦＴＣＷＷＬＴＴＩＳＴＤＬＴＦＳＶＫＳＳＲＧＳＳＤＰＱＧＶＴＣＧＡＡＴＬＳＡＥＲＶＲＧＤＮＫＥＹＥＹＳＶＥＣＱＥＤＳＡＣＰＡＡＥＥＳＬＰＩＥＶＭＶＤＡＶＨＫＬＫＹＥＮＹＴＳＳＦＦＩＲＤＩＩＫＰＤＰＰＫＮＬＱＬＫＰＬＫＮＳＲＱＶＥＶＳＷＥＹＰＤＴＷＳＴＰＨＳＹＦＳＬＴＦＣＶＱＶＱＧＫＳＫＲＥＫＫＤＲＶＦＴＤＫＴＳＡＴＶＩＣＲＫＮＡＳＩＳＶＲＡＱＤＲＹＹＳＳＳＷＳＥＷＡＳＶＰＣＳ（配列番号２２）
ヒトＩＬ－２３サブユニットα成熟型の配列
ＲＡＶＰＧＧＳＳＰＡＷＴＱＣＱＱＬＳＱＫＬＣＴＬＡＷＳＡＨＰＬＶＧＨＭＤＬＲＥＥＧＤＥＥＴＴＮＤＶＰＨＩＱＣＧＤＧＣＤＰＱＧＬＲＤＮＳＱＦＣＬＱＲＩＨＱＧＬＩＦＹＥＫＬＬＧＳＤＩＦＴＧＥＰＳＬＬＰＤＳＰＶＧＱＬＨＡＳＬＬＧＬＳＱＬＬＱＰＥＧＨＨＷＥＴＱＱＩＰＳＬＳＰＳＱＰＷＱＲＬＬＬＲＦＫＩＬＲＳＬＱＡＦＶＡＶＡＡＲＶＦＡＨＧＡＡＴＬＳＰ（配列番号２３）
ヒトＴＧＦβ成熟型の配列
ＡＬＤＴＮＹＣＦＳＳＴＥＫＮＣＣＶＲＱＬＹＩＤＦＲＫＤＬＧＷＫＷＩＨＥＰＫＧＹＨＡＮＦＣＬＧＰＣＰＹＩＷＳＬＤＴＱＹＳＫＶＬＡＬＹＮＱＨＮＰＧＡＳＡＡＰＣＣＶＰＱＡＬＥＰＬＰＩＶＹＹＶＧＲＫＰＫＶＥＱＬＳＮＭＩＶＲＳＣＫＣＳ（配列番号２４）
Ｐ－０３５１
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＤＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＩＴＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲＤＰＡＬＶＨＱＲＰＡＰＰ（配列番号２５）
Ｐ－０１７０のＨｏｌｅ鎖
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＬＧＧＳＧＲＳＡＮＡＩＬＥＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳＧＳＩＴＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲＤＰＡＬＶＨＱＲＰＡＰＰ（配列番号２６）
Ｐ－０１７２
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＬＧＧＳＧＲＳＡＮＡＩＬＥＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳＧＳＩＴＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲＤＰＡＬＶＨＱＲＰＡＰＰ（配列番号２７）
Ｐ－０２０２
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＳＧＲＳＤＮＨＧＧＳＧＧＧＧＳＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳＧＳＩＴＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲＤＰＡＬＶＨＱＲＰＡＰＰ（配列番号２８）
Ｐ－０２０３
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＬＧＧＳＧＲＳＡＮＡＩＬＥＧＧＳＧＧＧＧＳＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＩＴＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲＤＰＡＬＶＨＱＲＰＡＰＰ（配列番号２９）
Ｐ－０２０４
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＧＧＳＧＲＳＡＮＡＩＬＥＧＧＧＧＳＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＩＴＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲＤＰＡＬＶＨＱＲＰＡＰＰ（配列番号３０）
Ｐ－０２０５
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＧＧＳＧＲＳＡＮＡＩＬＥＧＧＧＧＳＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＩＴＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲＤＰＡＬＶＨＱＲＰＡＰＰ（配列番号３１）
Ｐ－０２０６
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＧＧＳＧＲＳＡＮＡＩＬＥＧＧＧＧＳＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳＧＧＧＧＳＩＴＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲＤＰＡＬＶＨＱＲＰＡＰＰ（配列番号３２）
Ｐ－０３１５
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＳＬＧＧＳＧＲＳＡＮＡＩＬＥＧＧＳＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＤＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳＧＧＰＬＧＭＬＳＱＳＩＴＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲＤＰＡＬＶＨＱＲＰＡＰＰ（配列番号３３）
Ｐ－０３１６
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＳＬＧＧＳＧＲＳＡＮＡＩＬＥＧＧＳＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＤＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳＧＧＧＰＬＧＭＬＳＱＧＧＳＩＴＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲＤＰＡＬＶＨＱＲＰＡＰＰ（配列番号３４）
Ｐ－０３５０
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＤＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳＧＧＰＬＧＭＬＳＱＳＩＴＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲＤＰＡＬＶＨＱＲＰＡＰＰ（配列番号３５）
Ｐ－０３５４
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＳＧＰＬＧＭＬＳＱＧＧＧＳＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＤＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳＧＧＳＧＲＳＡＮＡＩＩＴＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲＤＰＡＬＶＨＱＲＰＡＰＰ（配列番号３６）
Ｐ－０３５５
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（配列番号５０）
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Ｈｏｌｅ－Ｆｃ－１５ｐ１
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＳＰＰＳＰＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳＧＧＧＳＬＧＧＳＧＲＳＡＮＡＩＬＥＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＩＹＮＣＥＩＳＱＡＳＨＹＦＥＲＨＬＣＹＳＩ（配列番号６６）
Ｈｏｌｅ－Ｆｃ－１５ｐ２
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＳＰＰＳＰＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳＧＧＧＳＬＧＧＳＧＲＳＡＮＡＩＬＥＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＩＹＮＣＥＬＨＲＥＦＹＨＳＡＱＳＩＥＷＣＹＳＩ（配列番号６７）
Ｈｏｌｅ－Ｆｃ－１５ｐ３
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＳＰＰＳＰＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳＧＧＧＳＬＧＧＳＧＲＳＡＮＡＩＬＥＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＥＴＨＲＣＮＩＳＷＥＩＳＱＡＳＨＹＦＥＲＨＬＥＦＥＡＲＴＬＣＰＧＨ（配列番号６８）
ｐ１’－１５－Ｆｃ
ＱＧＱＳＧＱＣＥＩＳＱＡＳＨＹＦＥＲＨＬＣＹＳＩＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＬＳＧＲＳＤＮＨＧＳＳＧＴＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳＧＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号６９）
ｐ３’－１５－Ｆｃ
ＱＧＱＳＧＱＣＮＩＳＷＥＩＳＱＡＳＨＹＦＥＲＨＬＥＦＥＡＲＴＬＣＰＧＨＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＬＳＧＲＳＤＮＨＧＳＳＧＴＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳＧＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号７０）
プロテアーゼ基質ペプチドの配列
ＳＰＬＧＬＡＧＳ（配列番号７１）
プロテアーゼ基質ペプチドの配列
ＥＰＬＥＬＲＡＧ（配列番号７２）
プロテアーゼ基質ペプチドの配列
ＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号７３）
プロテアーゼ基質ペプチドの配列
ＧＰＬＧＩＡＧＱ（配列番号７４）
プロテアーゼ基質ペプチドの配列
ＧＴＡＨＬＭＧＧ（配列番号７５）
プロテアーゼ基質ペプチドの配列
ＲＩＧＳＬＲＴＡ（配列番号７６）
プロテアーゼ基質ペプチドの配列
ＧＰＬＧＭＬＳＱ（配列番号７７）
プロテアーゼ基質ペプチドの配列
ＲＰＳＡＳＲＳＡ（配列番号７８）
プロテアーゼ基質ペプチドの配列
ＰＬＧＬＡＧ（配列番号７９）
プロテアーゼ基質ペプチドの配列
ＬＧＧＳＧＲＳＡＮＡＩＬＥ（配列番号８０）
プロテアーゼ基質ペプチドの配列
ＧＧＳＧＲＳＡＮＡＩ（配列番号８１）
プロテアーゼ基質ペプチドの配列
ＳＧＲＳＡ（配列番号８２）
プロテアーゼ基質ペプチドの配列
ＡＡＮＬ（配列番号８３）
プロテアーゼ基質ペプチドの配列
ＧＦＦＹ（配列番号８４）
プロテアーゼ基質ペプチドの配列
ＧＰＩＣＦＲＬＧ（配列番号８５）
プロテアーゼ基質ペプチドの配列
ＲＱＡＧＦＳＬ（配列番号８６）
プロテアーゼ基質ペプチドの配列
ＨＳＳＫＬＱ（配列番号８７）
プロテアーゼ切断可能なリンカーの配列
ＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＳＧＲＳＤＮＨＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８８）
プロテアーゼ切断可能なリンカーの配列
ＧＳＳＳＧＲＳＥＮＩＲＴＡＧＴ（配列番号８９）
プロテアーゼ切断可能なリンカーの配列
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＬＧＧＳＧＲＳＡＮＡＩＬＥＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９０）
プロテアーゼ切断可能なリンカーの配列
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＧＧＳＧＲＳＡＮＡＩＬＥＧＧＧＧＳ（配列番号９１）
プロテアーゼ切断可能なリンカーの配列
ＧＧＧＧＳＬＧＧＳＧＲＳＡＮＡＩＬＥＧＧＳ（配列番号９２）
プロテアーゼ切断可能なリンカーの配列
ＧＧＧＳＧＰＴＮＫＶＲＧＧＳ（配列番号９３）
プロテアーゼ切断可能なリンカーの配列
ＧＧＳＧＰＬＧＭＬＳＱＧＧＧＳ（配列番号９４）
プロテアーゼ切断可能なリンカーの配列
ＧＧＰＬＧＭＬＳＱＳ（配列番号９５）
プロテアーゼ切断可能なリンカーの配列
ＧＧＧＰＬＧＭＬＳＱＧＧＳ（配列番号９６）
ペプチド配列
ＬＧＡＰＤＳＱＫＬＴＴＶＤＩＶ（配列番号９７）
ペプチド配列
ＥＩＳＱＡＳＨＹＦＥＲＨＬ（配列番号９８）
ペプチド配列
ＣＥＩＳＱＡＳＨＹＦＥＲＨＬＣ（配列番号９９）
ペプチド配列
ＬＧＡＰＤＳＱＫＬＴＴＶＤＩＶＧＧＧＧＧＧＧＧＥＩＳＱＡＳＨＹＦＥＲＨＬ（配列番号１００）
ペプチド配列
ＫＰＦＥＮＬＲＬＭＡＰＩＳ（配列番号１０１）
ペプチド配列
ＧＧＧＳＬＧＧＳＧＲＳＡＮＡＩＬＥＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＩＹＮＣＥＩＳＱＡＳＨＹＦＥＲＨＬＣＹＳＩ（配列番号１０２）
ペプチド配列
ＧＧＧＳＬＧＧＳＧＲＳＡＮＡＩＬＥＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＩＹＮＣＥＬＨＲＥＦＹＨＳＡＱＳＩＥＷＣＹＳＩ
（配列番号１０３）
ペプチド配列
ＧＧＧＳＬＧＧＳＧＲＳＡＮＡＩＬＥＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＥＴＨＲＣＮＩＳＷＥＩＳＱＡＳＨＹＦＥＲＨＬＥＦＥＡＲＴＬＣＰＧＨ（配列番号１０４）
ペプチド配列
ＱＧＱＳＧＱＣＥＩＳＱＡＳＨＹＦＥＲＨＬＣＹＳＩＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＬＳＧＲＳＤＮＨＧＳＳＧＴ
（配列番号１０５）
ペプチド配列
ＱＧＱＳＧＱＣＮＩＳＷＥＩＳＱＡＳＨＹＦＥＲＨＬＥＦＥＡＲＴＬＣＰＧＨＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＬＳＧＲＳＤＮＨＧＳＳＧＴ（配列番号１０６）
切断不可なリンカーの配列
ＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＳＰＰＳ（配列番号１０７）
切断不可なリンカーの配列
ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号１０８）
切断不可なリンカーの配列
ＧＧＧＳ（配列番号１０９）
切断不可なリンカーの配列
ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号１１０）
切断不可なリンカーの配列
ＧＳＳＧＴ（配列番号１１１）
切断不可なリンカーの配列
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１１２）
切断不可なリンカーの配列
ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号１１３）
切断不可なリンカーの配列
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１１４）
切断不可なリンカーの配列
ＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号１１５）
切断不可なリンカーの配列
ＧＳ（配列番号１１６）
切断不可なリンカーの配列
ＧＧＳ（配列番号１１７）
切断不可なリンカーの配列
ＧＧＧＧＳ（配列番号１１８）
切断不可なリンカーの配列
ＧＧＳＧ（配列番号１１９）
切断不可なリンカーの配列
ＳＧＧＧ（配列番号１２０）
切断不可なリンカーの配列
ＧＳＧＳ（配列番号１２１）
切断不可なリンカーの配列
ＧＳＧＳＧＳ（配列番号１２２）
切断不可なリンカーの配列
ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号１２３）
切断不可なリンカーの配列
ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号１２４）
切断不可なリンカーの配列
ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号１２５）
切断不可なリンカーの配列
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１２６）
切断不可なリンカーの配列
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１２７）
ＪＳ００１－ＩＬ－１５－ＶｉｔｏＫｉｎｅ－ＨＣ
ＱＧＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＥＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＶＩＥＳＥＴＧＧＴＡＹＮＱＫＦＫＧＲＡＫＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＴＲＥＧＩＴＴＶＡＴＴＹＹＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＳＬＧＧＳＧＲＳＡＮＡＩＬＥＧＧＳＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＤＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳＧＧＰＬＧＭＬＳＱＳＩＴＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲＤＰＡＬＶＨＱＲＰＡＰＰ（配列番号１２８）
ＪＳ００１－Ｌκ
ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号１２９）
イピリムマブ－ＩＬ－１５－ＶｉｔｏＫｉｎｅ－ＨＣ
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＴＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＴＦＩＳＹＤＧＮＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＩＹＹＣＡＲＴＧＷＬＧＰＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＳＬＧＧＳＧＲＳＡＮＡＩＬＥＧＧＳＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＤＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳＧＧＰＬＧＭＬＳＱＳＩＴＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲＤＰＡＬＶＨＱＲＰＡＰＰ（配列番号１３０）
イピリムマブ－Ｌκ
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＧＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＦＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＧＳＳＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号１３１）
ＲＯ７００９７８９－ＩＬ－１５－ＶｉｔｏＫｉｎｅ－ＨＣ
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＤＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＮＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＱＰＬＧＹＣＴＮＧＶＣＳＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＳＬＧＧＳＧＲＳＡＮＡＩＬＥＧＧＳＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＤＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳＧＧＰＬＧＭＬＳＱＳＩＴＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲＤＰＡＬＶＨＱＲＰＡＰＰ（配列番号１３２）
ＲＯ７００９７８９－Ｌκ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＹＳＷＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＮＬＬＩＹＴＡＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＡＮＩＦＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号１３３）
Ｌ１９－ＩＬ－１５－ＶｉｔｏＫｉｎｅ－ＨＣ
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Ｌ１９－Ｌκ
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リツキシマブ－ＩＬ－２－ＶｉｔｏＫｉｎｅ－ＨＣ
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リツキシマブ－Ｌκ
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ハーセプチン－ＩＬ－２－ＶｉｔｏＫｉｎｅ－ＨＣ
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＤＴＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＳＧＧＧＳＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＱＳＩＩＳＴＬＴＧＧＰＬＧＭＬＳＱＳＥＬＣＤＤＤＰＰＥＩＰＨＡＴＦＫＡＭＡＹＫＥＧＴＭＬＮＣＥＣＫＲＧＦＲＲＩＫＳＧＳＬＹＭＬＣＴＧＮＳＳＨＳＳＷＤＮＱＣＱＣＴＳＳＡＴＲＮＴＴＫＱＶＴＰＱＰＥＥＱＫＥＲＫＴＴＥＭＱＳＰＭＱＰＶＤＱＡＳＬＰＧＨＣＲＥＰＰＰＷＥＮＥＡＴＥＲＩＹＨＦＶＶＧＱＭＶＹＹＱＣＶＱＧＹＲＡＬＨＲＧＰＡＥＳＶＣＫＭＴＨＧＫＴＲＷＴＱＰＱＬＩＣＴＧ（配列番号１３８）
ハーセプチン－Ｌκ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号１３９）
セツキシマブ－ＩＬ－２－ＶｉｔｏＫｉｎｅ－ＨＣ
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セツキシマブ－Ｌκ
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ＪＳ００１－ＩＬ－２－ＶｉｔｏＫｉｎｅ－ＨＣ
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ベドリズマブ－ＩＬ－２－ＶｉｔｏＫｉｎｅ－ＨＣ
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ベドリズマブ－Ｌκ
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ヒュミラ－Ｌκ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣＱＲＹＮＲＡＰＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号１４６）
ＩＬ－２Ｒαドメインの交換後のＳｕｓｈｉ
ＧＨＣＲＥＰＰＰＷＥＮＥＡＴＥＲＩＹＨＦＶＹＫＥＧＴＭＬＮＣＥＣＫＲＧＦＲＲＩＫＳＧＳＬＹＭＬＣＴＧＮＳＳＨＳＳＷＤＮＱＣＱＣＴＳＳＡＴＲＮ（配列番号１４７）
Ｈｏｌｅ－Ｆｃ－ＩＬ－１５－２
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳ（配列番号１４８）
Ｈｏｌｅ－Ｆｃ－ＩＬ－１５－３
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Ｐ－０４２０
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Ｐ－０４２１
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Ｐ－０４２４
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エフェクター機能が低減／消失し、半減期が延長したヒトＩｇＧ１－Ｆｃ
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プロテアーゼ基質ペプチドの配列
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プロテアーゼ基質ペプチドの配列
ＧＰＴＮＫＶＲ（配列番号１５８）
プロテアーゼ基質ペプチドの配列
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プロテアーゼ切断可能なリンカーの配列
ＧＧＰＴＮＫＶＲＧＳ（配列番号１６０）
プロテアーゼ切断可能なリンカーの配列
ＧＲＱＡＲＡＶＧＧＳ（配列番号１６１）
Ｐ－０６６０
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Ｐ－０６６１
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生体内半減期が延長したＫｎｏｂ－Ｆｃ
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Ｐ－０６５０
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Ｐ－０６６２のＨｏｌｅ鎖
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半減期が延長したＰ－０６６３のＨｏｌｅ鎖
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半減期が延長したＰ－０６６４のＨｏｌｅ鎖
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＡＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＤＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳＧＧＰＬＧＭＬＳＱＳＩＴＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲＤＰＡＬＶＨＱＲＰＡＰＰ（配列番号１７３）
半減期が延長したＰ－０６６５のＨｏｌｅ鎖
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＡＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＳＳＳＧＲＳＥＮＩＲＴＡＧＴＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＤＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳＧＧＰＬＧＭＬＳＱＳＩＴＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲＤＰＡＬＶＨＱＲＰＡＰＰ（配列番号１７４）
Ｐ－０１５６のＫｎｏｂ鎖
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Ｐ－０１５６のｈｏｌｅ鎖
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標準の第１鎖
ＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＮＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＱＤＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳＧＧＧＧＳＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＫＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＥＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＤＶＳＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＤＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＥＱＧＤＶＦＳＣＳＶＬＨＥＡＬＨＳＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号１７７）
標準の第２鎖
ＩＴＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲＧＧＧＧＳＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＫＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＱＭＴＫＮＱＶＫＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＬＨＥＡＬＨＳＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号１７８）
Ｐ－０３２１
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＳＬＧＧＳＧＲＳＡＮＡＩＬＥＧＧＳＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＱＳＩＩＳＴＬＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＨＣＲＥＰＰＰＷＥＮＥＡＴＥＲＩＹＨＦＶＹＫＥＧＴＭＬＮＣＥＣＫＲＧＦＲＲＩＫＳＧＳＬＹＭＬＣＴＧＮＳＳＨＳＳＷＤＮＱＣＱＣＴＳＳＡＴＲＮ（配列番号１７９）
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テセントリク－Ｌκ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＬＹＨＰＡＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号１８１）
Ｐ－０３１５
ａｔｇｇａｔａｔｇｃｇｇｇｔｇｃｃｔｇｃｔｃａｇｃｔｇｃｔｇｇｇｃｃｔｇｃｔｇｃｔｇｃｔｇｔｇｇｃｔｇｃｇａｇｇｇｇｃｔａｇａｔｇｔｇａｔａａａａｃｔｃａｔａｃｔｔｇｔｃｃｔｃｃａｔｇｃｃｃａｇｃａｃｃｔｇａｇｇｃａｇｃａｇｇｃｇｃｃｃｃａｔｃｃｇｔｇｔｔｃｃｔｇｔｔｔｃｃｃｃｃｔａａｇｃｃｃａａｇｇａｃａｃａｃｔｇａｔｇａｔｃｔｃｃｃｇｔａｃｇｃｃａｇａｇｇｔｇａｃａｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｇｔｇａｇｃｃａｃｇａｇｇａｃｃｃｃｇａｇｇｔｇａａｇｔｔｔａａｃｔｇｇｔａｃｇｔｇｇａｃｇｇｃｇｔｇｇａｇｇｔｇｃａｃａａｔｇｃｃａａｇａｃａａａｇｃｃｔａｇｇｇａｇｇａｇｃａｇｔａｃａａｔｔｃｔａｃｃｔａｔｃｇｃｇｔｇｇｔｇａｇｃｇｔｇｃｔｇａｃａｇｔｇｃｔｇｃａｃｃａｇｇａｔｔｇｇｃｔｇａａｃｇｇｃａａｇｇａｇｔａｔａａｇｔｇｃａａｇｇｔｇｔｃｃａａｔａａｇｇｃｃｃｔｇｃｃｔｇｃｃｃｃａａｔｃｇａｇａａｇａｃｃａｔｃｔｃｔａａｇｇｃｃａａｇｇｇｃｃａｇｃｃｃａｇａｇａｇｃｃｔｃａｇｇｔｇｔａｃａｃａｃｔｇｃｃｔｃｃａａｇｃａｇａｇａｃｇａｇｃｔｇａｃｃａａｇａａｃｃａｇｇｔｇｔｃｃｃｔｇａｃａｔｇｔｃｔｇｇｔｇａａｇｇｇｃｔｔｃｔａｔｃｃｃｔｃｔｇａｔａｔｃｇｃｃｇｔｇｇａｇｔｇｇｇａｇａｇｃａａｔｇｇｃｃａｇｃｃｔｇａｇａａｃａａｔｔａｃａａｇａｃｃａｃａｃｃｃｃｃｔｇｔｇｃｔｇｇａｃａｇｃｇａｔｇｇｃｔｃｃｔｔｃｔｔｔｃｔｇｔａｔｔｃｃａａｇｃｔｇａｃｃｇｔｇｇａｔａａｇｔｃｔｃｇｇｔｇｇｃａｇｃａｇｇｇｃａａｃｇｔｇｔｔｔｔｃｃｔｇｃｔｃｔｇｔｇａｔｇｃａｃｇａａｇｃａｃｔｇｃａｔａａｃｃａｃｔａｃａｃｃｃａｇａａｇａｇｃｃｔｇａｇｃｃｔｇｔｃｃｃｃｃｇｇｇｇｇｃｇｇｃｇｇａｇｇａａｇｔｃｔｇｇｇａｇｇｇａｇｔｇｇｇｃｇａａｇｔｇｃｃａａｃｇｃｔａｔｔｃｔｇｇａｇｇｇｃｇｇａａｇｔａａｃｔｇｇｇｔｃａａｔｇｔｇａｔｔａｇｔｇａｔｃｔｇａａｇａａｇａｔｃｇａｇｇａｃｃｔｇａｔｃｃａｇａｇｃａｔｇｃａｃａｔｃｇａｔｇｃｃａｃｃｃｔｇｔａｃａｃａｇａｇｔｃｃｇａｃｇｔｇｃａｃｃｃｃｔｃｔｔｇｃａａｇｇｔｇａｃｃｇｃｃａｔｇａａｇｔｇｔｔｔｃｃｔｇｃｔｇｇａｇｃｔｇｃａｇｇｔｃａｔｃａｇｃｃｔｇｇａｇａｇｃｇｇｃｇａｃｇｃｃｇａｔａｔｃｃａｃｇａｔａｃｃｇｔｇｇａｇａａｃｃｔｇａｔｃａｔｃｃｔｇｇｃｃａａｃａａｔｔｃｔｃｔｇａｇｃｔｃｃａａｃｇｇｃａａｔｇｔｇａｃａｇａｇａｇｃｇｇｃｔｇｃａａｇｇａｇｔｇｔｇａｇｇａｇｃｔｇｇａｇｇａｇａａｇａａｃａｔｃａａｇｇａｇｔｔｃｃｔｇｃａｇｔｃｃｔｔｔｇｔｇｃａｃａｔｃｇｔｇｃａｇａｔｇｔｔｃａｔｃａａｔａｃｃｔｃｔｇｇａｇｇａｃｃａｃｔｇｇｇａａｔｇｃｔｇｔｃｃｃａｇｔｃｔａｔｃａｃａｔｇｃｃｃａｃｃｔｃｃａａｔｇｔｃｃｇｔｇｇａｇｃａｃｇｃａｇａｃａｔｃｔｇｇｇｔｇａａｇａｇｃｔａｃｔｃｃｃｔｇｔａｔａｇｃｃｇｇｇａｇａｇａｔａｔａｔｃｔｇｃａａｔｔｃｃｇｇｃｔｔｔａａｇｃｇｇａａｇｇｃｃｇｇｃａｃｃｔｃｔａｇｃｃｔｇａｃａｇａｇｔｇｃｇｔｇｃｔｇａａｃａａｇｇｃｃａｃｃａａｔｇｔｇｇｃｃｃａｃｔｇｇａｃａａｃｃｃｃａａｇｃｃｔｇａａａｔｇｔａｔｔｃｇｃｇａｃｃｃｔｇｃｃｃｔｇｇｔｃｃａｃｃａｇｃｇｃｃｃｔｇｃｃｃｃｃｃｃｃ（配列番号１８２）
Ｐ－０３５０
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Ｐ－０３５１
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Ｐ－０６６２の第１鎖
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Ｐ－０６６２の第２鎖
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Ｐ－０６６３の第１鎖
ａｔｇｇａｔａｔｇｃｇｇｇｔｇｃｃｔｇｃｔｃａｇｃｔｇｃｔｇｇｇｃｃｔｇｃｔｇｃｔｇｃｔｇｔｇｇｃｔｇｃｇａｇｇｇｇｃｔａｇａｔｇｔｇａｔａａａａｃｔｃａｔａｃｃｔｇｔｃｃｔｃｃａｔｇｃｃｃａｇｃａｃｃｔｇａｇｇｃａｇｃａｇｇｃｇｃｃｃｃａｔｃｃｇｔｇｔｔｃｃｔｇｔｔｔｃｃｃｃｃｔａａｇｃｃｃａａｇｇａｃａｃｃｃｔｇａｔｇａｔｃｔｃｔｃｇｔａｃｇｃｃｃｇａｇｇｔｇａｃａｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｇｔｇａｇｃｃａｃｇａｇｇａｃｃｃｃｇａｇｇｔｇａａｇｔｔｃａａｃｔｇｇｔａｃｇｔｇｇａｔｇｇｃｇｔｇｇａｇｇｔｇｃａｃａａｔｇｃｃａａｇａｃａａａｇｃｃｔｃｇｇｇａｇｇａｇｃａｇｔａｃａａｃｔｃｃａｃｃｔａｔａｇａｇｔｇｇｔｇｔｃｔｇｔｇｃｔｇａｃａｇｔｇｃｔｇｃａｃｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａａｃｇｇｃａａｇｇａｇｔａｃａａｇｔｇｃａａｇｇｔｇｔｃｃａａｔａａｇｇｃｃｃｔｇｃｃａｇｃｃｃｃｃａｔｃｇａｇａａｇａｃｃａｔｃａｇｃａａｇｇｃｃａａｇｇｇｃｃａｇｃｃｔａｇｇｇａｇｃｃａｃａｇｇｔｇｔａｔａｃｃｃｔｇｃｃａｃｃｃｔｇｃｃｇｃｇａｇｇａｇａｔｇａｃａａａｇａａｃｃａｇｇｔｇｔｃｃｃｔｇｔｃｔｔｇｔｇｃｃｇｔｇａａｇｇｇｃｔｔｃｔａｃｃｃｔｔｃｔｇａｃａｔｃｇｃｃｇｔｇｇａｇｔｇｇｇａｇａｇｃａａｔｇｇｃｃａｇｃｃａｇａｇａａｃａａｔｔａｔａａｇａｃｃａｃａｃｃｔｃｃａｇｔｇｃｔｇｇａｃｔｃｔｇａｔｇｇｃａｇｃｔｔｃｔｔｔｃｔｇｇｔｇａｇｃａａｇｃｔｇａｃｃｇｔｇｇａｔａａｇｔｃｃａｇｇｔｇｇｃａｇｃａｇｇｇｃａａｃｇｔｇｔｔｔａｇｃｔｇｔｔｃｃｇｔｇａｔｇｃａｃｇａｇｇｃｃｃｔｇｃａｃｇｃｔｃａｃｔａｃａｃａｃａｇａａｇｔｃｔｃｔｇａｇｃｃｔｇｔｃｃｃｃｃｇｇｇｇｇｃｇｇｃｇｇａｇｇａａｇｔｃｔｇｇｇａｇｇｇａｇｔｇｇｇｃｇａａｇｔｇｃｃａａｃｇｃｔａｔｔｃｔｇｇａｇｇｇｃｇｇａａｇｔａａｃｔｇｇｇｔｃａａｔｇｔｇａｔｔａｇｔｇａｔｃｔｇａａｇａａｇａｔｃｇａｇｇａｃｃｔｇａｔｃｃａｇａｇｃａｔｇｃａｃａｔｃｇａｔｇｃｃａｃｃｃｔｇｔａｃａｃａｇａｇｔｃｃｇａｃｇｔｇｃａｃｃｃｃｔｃｔｔｇｃａａｇｇｔｇａｃｃｇｃｃａｔｇａａｇｔｇｔｔｔｃｃｔｇｃｔｇｇａｇｃｔｇｃａｇｇｔｃａｔｃａｇｃｃｔｇｇａｇａｇｃｇｇｃｇａｃｇｃｃｇａｔａｔｃｃａｃｇａｔａｃｃｇｔｇｇａｇａａｃｃｔｇａｔｃａｔｃｃｔｇｇｃｃａａｃａａｔｔｃｔｃｔｇａｇｃｔｃｃａａｃｇｇｃａａｔｇｔｇａｃａｇａｇａｇｃｇｇｃｔｇｃａａｇｇａｇｔｇｔｇａｇｇａｇｃｔｇｇａｇｇａｇａａｇａａｃａｔｃａａｇｇａｇｔｔｃｃｔｇｃａｇｔｃｃｔｔｔｇｔｇｃａｃａｔｃｇｔｇｃａｇａｔｇｔｔｃａｔｃａａｔａｃｃｔｃｔｇｇａｇｇａｃｃａｃｔｇｇｇａａｔｇｃｔｇｔｃｃｃａｇｔｃｔａｔｃａｃａｔｇｃｃｃａｃｃｔｃｃａａｔｇｔｃｃｇｔｇｇａｇｃａｃｇｃａｇａｃａｔｃｔｇｇｇｔｇａａｇａｇｃｔａｃｔｃｃｃｔｇｔａｔａｇｃｃｇｇｇａｇａｇａｔａｔａｔｃｔｇｃａａｔｔｃｃｇｇｃｔｔｔａａｇｃｇｇａａｇｇｃｃｇｇｃａｃｃｔｃｔａｇｃｃｔｇａｃａｇａｇｔｇｃｇｔｇｃｔｇａａｃａａｇｇｃｃａｃｃａａｔｇｔｇｇｃｃｃａｃｔｇｇａｃａａｃｃｃｃａａｇｃｃｔｇａａａｔｇｔａｔｔｃｇｃｇａｃｃｃｔｇｃｃｃｔｇｇｔｃｃａｃｃａｇｃｇｃｃｃｔｇｃｃｃｃｃｃｃｃ（配列番号１８９）
Ｐ－０６６４の第１鎖
ａｔｇｇａｔａｔｇｃｇｇｇｔｇｃｃｔｇｃｔｃａｇｃｔｇｃｔｇｇｇｃｃｔｇｃｔｇｃｔｇｃｔｇｔｇｇｃｔｇｃｇａｇｇｇｇｃｔａｇａｔｇｔｇａｔａａａａｃｔｃａｔａｃｃｔｇｔｃｃｔｃｃａｔｇｃｃｃａｇｃａｃｃｔｇａｇｇｃａｇｃａｇｇｃｇｃｃｃｃａｔｃｃｇｔｇｔｔｃｃｔｇｔｔｔｃｃｃｃｃｔａａｇｃｃｃａａｇｇａｃａｃｃｃｔｇａｔｇａｔｃｔｃｔｃｇｔａｃｇｃｃｃｇａｇｇｔｇａｃａｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｇｔｇａｇｃｃａｃｇａｇｇａｃｃｃｃｇａｇｇｔｇａａｇｔｔｃａａｃｔｇｇｔａｃｇｔｇｇａｔｇｇｃｇｔｇｇａｇｇｔｇｃａｃａａｔｇｃｃａａｇａｃａａａｇｃｃｔｃｇｇｇａｇｇａｇｃａｇｔａｃａａｃｔｃｃａｃｃｔａｔａｇａｇｔｇｇｔｇｔｃｔｇｔｇｃｔｇａｃａｇｔｇｃｔｇｃａｃｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａａｃｇｇｃａａｇｇａｇｔａｃａａｇｔｇｃａａｇｇｔｇｔｃｃａａｔａａｇｇｃｃｃｔｇｃｃａｇｃｃｃｃｃａｔｃｇａｇａａｇａｃｃａｔｃａｇｃａａｇｇｃｃａａｇｇｇｃｃａｇｃｃｔａｇｇｇａｇｃｃａｃａｇｇｔｇｔａｔａｃｃｃｔｇｃｃａｃｃｃｔｇｃｃｇｃｇａｇｇａｇａｔｇａｃａａａｇａａｃｃａｇｇｔｇｔｃｃｃｔｇｔｃｔｔｇｔｇｃｃｇｔｇａａｇｇｇｃｔｔｃｔａｃｃｃｔｔｃｔｇａｃａｔｃｇｃｃｇｔｇｇａｇｔｇｇｇａｇａｇｃａａｔｇｇｃｃａｇｃｃａｇａｇａａｃａａｔｔａｔａａｇａｃｃａｃａｃｃｔｃｃａｇｔｇｃｔｇｇａｃｔｃｔｇａｔｇｇｃａｇｃｔｔｃｔｔｔｃｔｇｇｔｇａｇｃａａｇｃｔｇａｃｃｇｔｇｇａｔａａｇｔｃｃａｇｇｔｇｇｃａｇｃａｇｇｇｃａａｃｇｔｇｔｔｔａｇｃｔｇｔｔｃｃｇｔｇａｔｇｃａｃｇａｇｇｃｃｃｔｇｃａｃｇｃｔｃａｃｔａｃａｃａｃａｇａａｇｔｃｔｃｔｇａｇｃｃｔｇｔｃｃｃｃｃｇｇｇｇｇｃｇｇｃｇｇａｇｇａａｇｔｇｇｃｇｇａｇｇａｇｇｃｔｃｔｇｇｃｇｇａｇｇｃｇｇａａｇｔａａｃｔｇｇｇｔｃａａｔｇｔｇａｔｔａｇｔｇａｔｃｔｇａａｇａａｇａｔｃｇａｇｇａｃｃｔｇａｔｃｃａｇａｇｃａｔｇｃａｃａｔｃｇａｔｇｃｃａｃｃｃｔｇｔａｃａｃａｇａｇｔｃｃｇａｃｇｔｇｃａｃｃｃｃｔｃｔｔｇｃａａｇｇｔｇａｃｃｇｃｃａｔｇａａｇｔｇｔｔｔｃｃｔｇｃｔｇｇａｇｃｔｇｃａｇｇｔｃａｔｃａｇｃｃｔｇｇａｇａｇｃｇｇｃｇａｃｇｃｃｇａｔａｔｃｃａｃｇａｔａｃｃｇｔｇｇａｇａａｃｃｔｇａｔｃａｔｃｃｔｇｇｃｃａａｃａａｔｔｃｔｃｔｇａｇｃｔｃｃａａｃｇｇｃａａｔｇｔｇａｃａｇａｇａｇｃｇｇｃｔｇｃａａｇｇａｇｔｇｔｇａｇｇａｇｃｔｇｇａｇｇａｇａａｇａａｃａｔｃａａｇｇａｇｔｔｃｃｔｇｃａｇｔｃｃｔｔｔｇｔｇｃａｃａｔｃｇｔｇｃａｇａｔｇｔｔｃａｔｃａａｔａｃｃｔｃｔｇｇａｇｇａｃｃａｃｔｇｇｇａａｔｇｃｔｇｔｃｃｃａｇｔｃｔａｔｃａｃａｔｇｃｃｃａｃｃｔｃｃａａｔｇｔｃｃｇｔｇｇａｇｃａｃｇｃａｇａｃａｔｃｔｇｇｇｔｇａａｇａｇｃｔａｃｔｃｃｃｔｇｔａｔａｇｃｃｇｇｇａｇａｇａｔａｔａｔｃｔｇｃａａｔｔｃｃｇｇｃｔｔｔａａｇｃｇｇａａｇｇｃｃｇｇｃａｃｃｔｃｔａｇｃｃｔｇａｃａｇａｇｔｇｃｇｔｇｃｔｇａａｃａａｇｇｃｃａｃｃａａｔｇｔｇｇｃｃｃａｃｔｇｇａｃａａｃｃｃｃａａｇｃｃｔｇａａａｔｇｔａｔｔｃｇｃｇａｃｃｃｔｇｃｃｃｔｇｇｔｃｃａｃｃａｇｃｇｃｃｃｔｇｃｃｃｃｃｃｃｃ（配列番号１９０）
Ｐ－０６６５の第１鎖
ａｔｇｇａｔａｔｇｃｇｇｇｔｇｃｃｔｇｃｔｃａｇｃｔｇｃｔｇｇｇｃｃｔｇｃｔｇｃｔｇｃｔｇｔｇｇｃｔｇｃｇａｇｇｇｇｃｔａｇａｔｇｔｇａｔａａａａｃｔｃａｔａｃｃｔｇｔｃｃｔｃｃａｔｇｃｃｃａｇｃａｃｃｔｇａｇｇｃａｇｃａｇｇｃｇｃｃｃｃａｔｃｃｇｔｇｔｔｃｃｔｇｔｔｔｃｃｃｃｃｔａａｇｃｃｃａａｇｇａｃａｃｃｃｔｇａｔｇａｔｃｔｃｔｃｇｔａｃｇｃｃｃｇａｇｇｔｇａｃａｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｇｔｇａｇｃｃａｃｇａｇｇａｃｃｃｃｇａｇｇｔｇａａｇｔｔｃａａｃｔｇｇｔａｃｇｔｇｇａｔｇｇｃｇｔｇｇａｇｇｔｇｃａｃａａｔｇｃｃａａｇａｃａａａｇｃｃｔｃｇｇｇａｇｇａｇｃａｇｔａｃａａｃｔｃｃａｃｃｔａｔａｇａｇｔｇｇｔｇｔｃｔｇｔｇｃｔｇａｃａｇｔｇｃｔｇｃａｃｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａａｃｇｇｃａａｇｇａｇｔａｃａａｇｔｇｃａａｇｇｔｇｔｃｃａａｔａａｇｇｃｃｃｔｇｃｃａｇｃｃｃｃｃａｔｃｇａｇａａｇａｃｃａｔｃａｇｃａａｇｇｃｃａａｇｇｇｃｃａｇｃｃｔａｇｇｇａｇｃｃａｃａｇｇｔｇｔａｔａｃｃｃｔｇｃｃａｃｃｃｔｇｃｃｇｃｇａｇｇａｇａｔｇａｃａａａｇａａｃｃａｇｇｔｇｔｃｃｃｔｇｔｃｔｔｇｔｇｃｃｇｔｇａａｇｇｇｃｔｔｃｔａｃｃｃｔｔｃｔｇａｃａｔｃｇｃｃｇｔｇｇａｇｔｇｇｇａｇａｇｃａａｔｇｇｃｃａｇｃｃａｇａｇａａｃａａｔｔａｔａａｇａｃｃａｃａｃｃｔｃｃａｇｔｇｃｔｇｇａｃｔｃｔｇａｔｇｇｃａｇｃｔｔｃｔｔｔｃｔｇｇｔｇａｇｃａａｇｃｔｇａｃｃｇｔｇｇａｔａａｇｔｃｃａｇｇｔｇｇｃａｇｃａｇｇｇｃａａｃｇｔｇｔｔｔａｇｃｔｇｔｔｃｃｇｔｇａｔｇｃａｃｇａｇｇｃｃｃｔｇｃａｃｇｃｔｃａｃｔａｃａｃａｃａｇａａｇｔｃｔｃｔｇａｇｃｃｔｇｔｃｃｃｃｃｇｇｇｇｇｃａｇｃｔｃｃｇｇａａｇｃｇｇｃａｇｇｔｃｃｇａｇａａｔａｔｃｃｇｃａｃｃｇｃｃｇｇａａｃａａａｃｔｇｇｇｔｃａａｔｇｔｇａｔｔａｇｔｇａｔｃｔｇａａｇａａｇａｔｃｇａｇｇａｃｃｔｇａｔｃｃａｇａｇｃａｔｇｃａｃａｔｃｇａｔｇｃｃａｃｃｃｔｇｔａｃａｃａｇａｇｔｃｃｇａｃｇｔｇｃａｃｃｃｃｔｃｔｔｇｃａａｇｇｔｇａｃｃｇｃｃａｔｇａａｇｔｇｔｔｔｃｃｔｇｃｔｇｇａｇｃｔｇｃａｇｇｔｃａｔｃａｇｃｃｔｇｇａｇａｇｃｇｇｃｇａｃｇｃｃｇａｔａｔｃｃａｃｇａｔａｃｃｇｔｇｇａｇａａｃｃｔｇａｔｃａｔｃｃｔｇｇｃｃａａｃａａｔｔｃｔｃｔｇａｇｃｔｃｃａａｃｇｇｃａａｔｇｔｇａｃａｇａｇａｇｃｇｇｃｔｇｃａａｇｇａｇｔｇｔｇａｇｇａｇｃｔｇｇａｇｇａｇａａｇａａｃａｔｃａａｇｇａｇｔｔｃｃｔｇｃａｇｔｃｃｔｔｔｇｔｇｃａｃａｔｃｇｔｇｃａｇａｔｇｔｔｃａｔｃａａｔａｃｃｔｃｔｇｇａｇｇａｃｃａｃｔｇｇｇａａｔｇｃｔｇｔｃｃｃａｇｔｃｔａｔｃａｃａｔｇｃｃｃａｃｃｔｃｃａａｔｇｔｃｃｇｔｇｇａｇｃａｃｇｃａｇａｃａｔｃｔｇｇｇｔｇａａｇａｇｃｔａｃｔｃｃｃｔｇｔａｔａｇｃｃｇｇｇａｇａｇａｔａｔａｔｃｔｇｃａａｔｔｃｃｇｇｃｔｔｔａａｇｃｇｇａａｇｇｃｃｇｇｃａｃｃｔｃｔａｇｃｃｔｇａｃａｇａｇｔｇｃｇｔｇｃｔｇａａｃａａｇｇｃｃａｃｃａａｔｇｔｇｇｃｃｃａｃｔｇｇａｃａａｃｃｃｃａａｇｃｃｔｇａａａｔｇｔａｔｔｃｇｃｇａｃｃｃｔｇｃｃｃｔｇｇｔｃｃａｃｃａｇｃｇｃｃｃｔｇｃｃｃｃｃｃｃｃ（配列番号１９１）
Ｐ－０６６３／Ｐ－０６６４／Ｐ－０６６５の第２鎖
ａｔｇｇａｔａｔｇｃｇｇｇｔｇｃｃｔｇｃｔｃａｇｃｔｇｃｔｇｇｇｃｃｔｇｃｔｇｃｔｇｃｔｇｔｇｇｃｔｇｃｇａｇｇｇｇｃｔａｇａｔｇｔｇａｔａａａａｃｔｃａｔａｃｔｔｇｔｃｃｔｃｃａｔｇｃｃｃａｇｃａｃｃｔｇａｇｇｃａｇｃａｇｇｃｇｃｃｃｃａｔｃｃｇｔｇｔｔｃｃｔｇｔｔｔｃｃｃｃｃｔａａｇｃｃｃａａｇｇａｃａｃａｃｔｇａｔｇａｔｃｔｃｃｃｇｔａｃｇｃｃａｇａｇｇｔｇａｃａｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｇｔｇｔｃｔｃａｃｇａｇｇａｃｃｃｃｇａｇｇｔｇａａｇｔｔｃａａｃｔｇｇｔａｃｇｔｇｇａｔｇｇｃｇｔｇｇａｇｇｔｇｃａｃａａｔｇｃｃａａｇａｃｃａａｇｃｃｃａｇｇｇａｇｇａｇｃａｇｔａｃａａｃａｇｃａｃｃｔａｔｃｇｃｇｔｇｇｔｇｔｃｃｇｔｇｃｔｇａｃａｇｔｇｃｔｇｃａｃｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａａｃｇｇｃａａｇｇａｇｔａｔａａｇｔｇｃａａｇｇｔｇｔｃｃａａｔａａｇｇｃｃｃｔｇｃｃａｇｃｃｃｃｃａｔｃｇａｇａａｇａｃｃａｔｃａｇｃａａｇｇｃａａａｇｇｇａｃａｇｃｃｔｃｇｇｇａｇｃｃａｃａｇｇｔｇｔｇｃａｃｃｃｔｇｃｃａｃｃｃｔｃｔａｇａｇａｇｇａｇａｔｇａｃａａａｇａａｃｃａｇｇｔｇａｇｃｃｔｇｔｇｇｔｇｔｃｔｇｇｔｇａａｇｇｇｃｔｔｃｔａｃｃｃｔｔｃｃｇａｃａｔｃｇｃｃｇｔｇｇａｇｔｇｇｇａｇｔｃｔａａｔｇｇｃｃａｇｃｃａｇａｇａａｃａａｔｔａｃａａｇａｃｃａｃａｃｃｔｃｃａｇｔｇｃｔｇｇａｃｔｃｔｇａｔｇｇｃａｇｃｔｔｃｔｔｔｃｔｇｔａｔｔｃｔａａｇｃｔｇａｃｃｇｔｇｇａｔａａｇａｇｃａｇｇｔｇｇｃａｇｃａｇｇｇｃａａｃｇｔｇｔｔｔｔｃｃｔｇｃｔｃｔｇｔｇａｔｇｃａｃｇａｇｇｃｃｃｔｇｃａｃｇｃｔｃａｃｔａｃａｃａｃａｇａａｇａｇｃｃｔｇｔｃｃｃｔｇｔｃｔｃｃｃｇｇｇ（配列番号１９２）

Claims (21)

  1. 生理活性化ポリペプチド薬構築体であって、Ｎ末端からＣ末端方向（Ｄ１－Ｄ２－Ｄ３）に、
    １）機能部分であるＤ１ドメイン（「Ｄ１」）と、
    ２）生理活性化部分であるＤ２ドメイン（「Ｄ２」）と、
    ３）遮蔽部分であるＤ３ドメイン（「Ｄ３」）と、
    を含み、
    前記機能Ｄ１ドメインは、前記生理活性化部分を目的の治療部位にターゲティングさせる働きをするＤ１ドメイン、前記生理活性化部分を目的の治療部位にターゲティングさせ、Ｄ２の半減期を延長させる働きをするＤ１ドメイン、および前記生理活性化部分を目的の治療部位にターゲティングさせ保持する働きをするＤ１ドメインからなる群から選択され、
    Ｄ３は、目的の治療部位で活性化されるまでＤ２の機能活性を遮蔽することが可能であり、
    前記Ｄ１が、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１５６、および配列番号１６６～１６８に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＦｃドメインであり、
    前記Ｄ２が、配列番号２、３に記載のアミノ酸配列を有するＩＬ－１５ポリペプチドであり、
    前記Ｄ３が、ＩＬ－１５に対するコグネイト受容体／結合パートナー（またはそのバリアント）であり、配列番号４に記載のアミノ酸配列または任意のその機能性断片を含む、または、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含む、
    生理活性化ポリペプチド薬構築体。
  2. 生理活性化ポリペプチド薬構築体であって、Ｎ末端からＣ末端方向（Ｄ１－Ｄ２－Ｄ３）に、
    １）機能部分であるＤ１ドメイン（「Ｄ１」）と、
    ２）生理活性化部分であるＤ２ドメイン（「Ｄ２」）と、
    ３）遮蔽部分であるＤ３ドメイン（「Ｄ３」）と、
    を含み、
    前記機能Ｄ１ドメインは、前記生理活性化部分を目的の治療部位にターゲティングさせる働きをするＤ１ドメイン、前記生理活性化部分を目的の治療部位にターゲティングさせ、Ｄ２の半減期を延長させる働きをするＤ１ドメイン、および前記生理活性化部分を目的の治療部位にターゲティングさせ保持する働きをするＤ１ドメインからなる群から選択され、
    Ｄ３は、目的の治療部位で活性化されるまでＤ２の機能活性を遮蔽することが可能であり、
    前記Ｄ１が、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１５６、および配列番号１６６～１６８に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＦｃドメインであり、
    前記Ｄ２が、配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するＩＬ－２ポリペプチド、または、配列番号８の１９位、２０位、３８位、４１位、４２位、４４位、８８位、１０７位、１２５位、または１２６位における１または複数のアミノ酸置換または欠失を含むポリペプチドの群から選択されるＩＬ－２バリアントポリペプチドであり、
    前記Ｄ３が、ＩＬ－２に対するコグネイト受容体／結合パートナー（またはそのバリアント）であり、配列番号１０に記載のアミノ酸配列または任意のその機能性断片を含む、または、配列番号９に記載のアミノ酸配列を含む、
    生理活性化ポリペプチド薬構築体。
  3. プロテアーゼ切断可能なペプチドリンカー、および切断不可なペプチドリンカーからなる群から選択されるペプチドリンカー（「Ｌ１」）によって、Ｄ２がＤ１に取り付けられている、請求項１～２のいずれか一項に記載の構築体。
  4. プロテアーゼ切断可能なペプチドリンカーが、配列番号７１～９６および配列番号１５７～１６１に記載の各配列からなる群から選択される、請求項３に記載の構築体。
  5. 切断不可なペプチドリンカーが、配列番号１０７～１２７に記載の各配列からなる群から選択される、請求項３に記載の構築体。
  6. プロテアーゼ切断可能なペプチドリンカー、および切断不可なペプチドリンカーからなる群から選択されるペプチドリンカー（「Ｌ２」）によって、Ｄ２がＤ３に取り付けられている、請求項１～５のいずれか一項に記載の構築体。
  7. プロテアーゼ切断可能なペプチドリンカーが、配列番号７１～９６および配列番号１５７～１６１に記載の各配列からなる群から選択される、請求項６に記載の構築体。
  8. 切断不可なペプチドリンカーが、配列番号１０７～１２７に記載の各配列からなる群から選択される、請求項６に記載の構築体。
  9. Ｌ１およびＬ２の両方が、プロテアーゼ切断可能なペプチドリンカーである、請求項１～８のいずれか一項に記載の構築体。
  10. Ｌ１およびＬ２の両方が、切断不可なペプチドリンカーである、請求項１～８のいずれか一項に記載の構築体。
  11. Ｌ１がプロテアーゼ切断可能なペプチドリンカーであり、Ｌ２が切断不可なペプチドリンカーである、請求項１～８のいずれか一項に記載の構築体。
  12. Ｌ１が切断不可なペプチドリンカーであり、Ｌ２がプロテアーゼ切断可能なペプチドリンカーである、請求項１～８のいずれか一項に記載の構築体。
  13. 配列番号２５～４３、１６２～１６５、および１６９～１７４に記載のアミノ酸配列を含む構築体の群から選択される、請求項１に記載の構築体。
  14. 配列番号４９～６５、１５０～１５５、および１７９に記載のアミノ酸配列を含む構築体の群から選択される、請求項２に記載の構築体。
  15. 請求項１～１４のいずれか一項に記載の構築体を、薬剤的に許容できる担体と混合して含む、医薬組成物であって、前記医薬組成物が、対象におけるがんまたはがん転移の治療のためのものであり、前記がんが、膵がん、胃がん、肝臓がん、乳がん、卵巣がん、大腸がん、黒色腫、白血病、骨髄異形成症候群、肺がん、前立腺がん、脳がん、膀胱がん、頭頸部がん、および横紋筋肉腫からなる群から選択される、医薬組成物。
  16. 前記治療が、対象におけるがんまたはがん転移を治療することが可能な第二の治療薬または治療方法をさらに含む、請求項１５に記載の医薬組成物。
  17. 請求項１～１４のいずれか一項に記載の生理活性化ポリペプチド薬構築体をコードする核酸分子。
  18. 請求項１７に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
  19. 請求項１８に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
  20. 請求項１～１４のいずれか一項に記載の生理活性化ポリペプチド薬構築体の製造方法であって、生理活性化ポリペプチド薬構築体の発現を促進する条件下で請求項１９に記載の宿主細胞を培養することと、生理活性化ポリペプチド薬構築体タンパク質を回収することと、を含む、製造方法。
  21. 請求項２０に記載の方法によって製造される、単離された生理活性化ポリペプチド薬構築体タンパク質。
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