CN118043079A - 免疫缀合物分子及其相关方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

免疫缀合物分子含有白细胞介素‑2(IL‑2)多肽和能够在合适条件下抑制和激活IL‑2活性的掩蔽部分。用于产生免疫缀合物分子的方法。免疫缀合物分子由于它们对免疫系统的调节作用用于治疗疾病诸如癌症和其他慢性感染性疾病的治疗用途。

Description

免疫缀合物分子及其相关方法和组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求于2021年6月17日提交的PCT/CN2021/100705的优先权的权益，其内容通过引用以其整体并入本文。
对以电子形式提交的序列表的引用
本申请包含序列表，其作为ASCII格式的序列表以电子形式提交，文件名为“14625-006-228_SEQLIST.txt”且创建日期为2022年5月10日，并且具有90,098字节大小。以电子形式提交的序列表是说明书的一部分并且通过引用以其整体并入本文。
1.领域
本公开内容总体上涉及含有白细胞介素-2(IL-2)的免疫缀合物分子。更具体地，本公开内容涉及表现出由于调节免疫系统的能力用作免疫治疗剂的改进的性质的免疫缀合物分子。本公开内容还涉及免疫缀合物分子用于治疗疾病诸如癌症和其他慢性感染性疾病的治疗用途和药物组合物。
2.背景
白细胞介素-2(IL-2)，也被称为T细胞生长因子(TCGF)，是一种15.5kDa的球状糖蛋白，其在淋巴细胞生成、存活和体内平衡中发挥重要作用。IL-2在体内扩增淋巴细胞群体和增加这些细胞的效应子功能的能力赋予IL-2抗肿瘤作用，使得IL-2免疫疗法成为某些转移性癌症的有吸引力的治疗选择。因此，高剂量IL-2治疗已被批准用于患有转移性肾细胞癌和恶性黑色素瘤的患者。然而，可溶性IL-2对于抑制肿瘤生长不是最佳的，因为IL-2在免疫应答中具有双重功能，它不仅介导效应细胞的扩增和活性，而且还主要参与维持外周免疫耐受性。与IL-2免疫疗法相关的另外的问题是由重组人类IL-2治疗产生的副作用。例如，接受高剂量IL-2治疗的患者经常经历严重的心血管、肺、肾、肝、胃肠、神经、皮肤、血液和全身不良事件，这需要加强监测和住院管理。因此，本领域中仍然需要进一步增强IL-2蛋白的治疗实用性。本公开内容满足了这一需求。
3.概述
本公开内容提供了包含细胞因子多肽的免疫缀合物分子。在某些实施方案中，本公开内容还提供了包含编码这样的免疫缀合物分子的序列的多核苷酸和载体，以及包含这样的免疫缀合物分子的组合物、试剂和试剂盒。在相关方面中，本文还提供了通过使用根据本公开内容的免疫缀合物分子，用于递送和/或激活靶位点处的细胞因子活性，或降低受试者中与全身暴露于细胞因子活性相关的毒性和/或其他副作用的方法。
在某些实施方案中，本公开内容还提供了可以形成本公开内容的这样的免疫缀合物分子的一部分的肽或多肽，诸如抗体或其抗原结合片段。在具体实施方案中，本文提供了结合蛋白，包括与纤维化活化蛋白(FAP)结合的抗体或其片段。在具体实施方案中，本文提供了双特异性结合蛋白，包括与FAP和白细胞介素-2(IL-2)二者结合的二合一(two-in-one)抗体或其片段。
在一些实施方案中，本公开内容的免疫缀合物分子包含细胞因子部分和掩蔽部分，该细胞因子部分包含具有细胞因子活性的细胞因子多肽。这样的掩蔽部分包含能够与细胞因子多肽和第一靶抗原结合的双特异性抗体或其抗原结合片段。当与细胞因子多肽结合时，掩蔽部分降低或抑制细胞因子活性，并且当与第二靶抗原结合时，掩蔽部分从细胞因子多肽解离，从而激活细胞因子活性。
在一些实施方案中，掩蔽部分包含完整抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、dsFv、双抗体、三抗体、四抗体或由抗体片段形成的VHH。在一些实施方案中，双特异性抗体是二合一抗体。
在一些实施方案中，第一靶抗原不是细胞因子多肽。在一些实施方案中，第一靶抗原在细胞表面上表达。在一些实施方案中，细胞是癌细胞或肿瘤微环境中的细胞。在一些实施方案中，第一靶抗原是可溶的。在一些实施方案中，第一靶抗原是肿瘤相关抗原。在一些实施方案中，第一靶抗原是纤维化活化蛋白(FAP)。
在一些实施方案中，细胞因子部分包含野生型或突变型白细胞介素-2(IL-2)。在一些实施方案中，细胞因子部分包含人类IL-2或突变人类IL-2。
在一些实施方案中，免疫缀合物分子还包含锚定部分，该锚定部分包含与第二靶抗原特异性结合的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，第二靶抗原在细胞表面上表达。在一些实施方案中，细胞是癌细胞或肿瘤微环境中的细胞。在一些实施方案中，第二靶抗原是可溶的。在一些实施方案中，第二靶抗原是肿瘤相关抗原。
在一些实施方案中，第一靶抗原和第二靶抗原是相同的。在一些实施方案中，双特异性掩蔽部分和锚定部分与第一靶抗原或第二靶抗原的相同表位结合。在一些实施方案中，双特异性掩蔽部分和锚定部分与第一靶抗原或第二靶抗原的不同表位结合。在一些实施方案中，第一靶抗原和第二靶抗原是不同的。在一些实施方案中，第二靶抗原是纤维化活化蛋白(FAP)。
在一些实施方案中，锚定部分包含完整抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、dsFv、双抗体、三抗体、四抗体或由抗体片段形成的VHH。在具体实施方案中，掩蔽部分的双特异性抗体或抗原结合片段是Fab、ScFv或VHH。在具体实施方案中，锚定部分的抗体或其抗原结合片段是Fab、ScFv或VHH。
在一些实施方案中，免疫缀合物分子还包含缀合部分，其中缀合部分可操作地连接免疫缀合物分子的细胞因子部分、掩蔽部分和锚定部分中的两个或更多个。
在一些实施方案中，缀合部分包含免疫球蛋白Fc结构域或其突变体。在一些实施方案中，Fc结构域包含第一亚基和第二亚基，它们是两条不相同的(non-identical)多肽链；并且其中Fc结构域包含促进两条不相同的多肽链的异二聚化的第一修饰。在一些实施方案中，第一修饰是knob-into-hole修饰，该knob-into-hole修饰包括第一亚基中的knob修饰和第二亚基中的hole修饰。
在一些实施方案中，Fc结构域包含第二修饰，其中该Fc结构域与没有所述第二修饰的天然Fc结构域相比具有降低的与Fc受体的结合亲和力。在一些实施方案中，该Fc结构域与没有所述第二修饰的天然Fc结构域相比具有降低的与Fcγ受体的结合亲和力。在一些实施方案中，Fcγ受体是FcγRIIIα受体、FcγRI受体或FcγRIIα受体。
在一些实施方案中，该Fc结构域与没有所述第二修饰的天然Fc结构域相比具有降低的与补体组分的结合亲和力。在一些实施方案中，补体组分是C1q。
在一些实施方案中，该Fc结构域与没有所述第二修饰的Fc结构域相比具有降低的Fc效应子功能。在一些实施方案中，降低的Fc效应子功能选自补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、细胞表面受体的下调和B细胞激活。
在一些实施方案中，第二修饰包括选自S228P、E233P、L234V、L234A、L235A、L235E、ΔG236、D265G、N297A、N297D、P329E、P329S、P329A、P329G、A330S或P331S的一个或更多个突变，其中编号是Kabat中的EU索引的编号。在一些实施方案中，第二修饰包括选自E233P、L234V、L234A、L235A、ΔG236、D265G、P327E、A328S、P329E、A330S或P331S的一个或更多个突变，其中编号是Kabat中的EU索引的编号。
在一些实施方案中，细胞因子部分连接至Fc结构域的第一亚基和第二亚基中的一个的C末端，并且掩蔽部分连接至Fc结构域的第一亚基和第二亚基中的另一个的C末端。在一些实施方案中，锚定部分连接至Fc结构域的第一亚基和第二亚基中的一个的N末端。在一些实施方案中，锚定部分和细胞因子部分连接至Fc结构域的相同亚基。在一些实施方案中，锚定部分和掩蔽部分连接至Fc结构域的相同亚基。在一些实施方案中，掩蔽部分连接至Fc结构域的第一亚基和第二亚基中的一个的C末端；并且其中细胞因子部分连接至掩蔽部分。在一些实施方案中，锚定部分连接至Fc结构域的第一亚基和第二亚基中的一个的N末端。在一些实施方案中，锚定部分和掩蔽部分连接至Fc结构域的相同亚基；或者其中锚定部分和掩蔽部分连接至Fc结构域的不同亚基。在一些实施方案中，掩蔽部分连接至Fc结构域的第一亚基和第二亚基中的一个的N末端；并且细胞因子部分连接至掩蔽部分。在一些实施方案中，掩蔽部分连接至Fc结构域的第一亚基和第二亚基中的一个的N末端，并且其中锚定部分连接至Fc结构域的第一亚基和第二亚基中的另一个的N末端。在一些实施方案中，细胞因子部分连接至掩蔽部分。在一些实施方案中，细胞因子部分连接至锚定部分。
在一些实施方案中，掩蔽部分的二合一抗体或其抗原结合片段是Fab、ScFv或VHH。在一些实施方案中，锚定部分的抗体或其抗原结合片段是Fab、ScFv或VHH。在一些实施方案中，细胞因子部分、掩蔽部分、锚定部分和缀合部分中的两个或更多个之间的连接是经由肽接头。
在一些实施方案中，细胞因子是IL-2多肽。在具体实施方案中，细胞因子多肽包含选自SEQ ID NO:1、3、7至15和107-110的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一靶抗原和第二靶抗原是成纤维细胞活化蛋白(FAP)。在具体实施方案中，第一靶抗原和第二靶抗原是人类FAP。
在具体实施方案中，掩蔽部分包含与成纤维细胞活化蛋白(FAP)和白细胞介素-2(IL-2)结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段包含(a)轻链可变区(VH)，该轻链可变区(VH)包含表1中列出的抗体D001、D002、D029、D029LV1、D029LV2、D029LV3、D029LV4、D029LV5、D003、D047、D049或B10中任一种的VL互补决定区1(CDR1)、VL CDR2和VLCDR3；和/或(b)重链可变区(VH)，该重链可变区(VH)包含表2中列出的抗体D001、D002、D029、D029HV1、D029HV2、D029HV3、D029HV4、D029HV5、D029HV6、D003、D047、D049或B10中任一种的VH互补决定区1(CDR1)、VH CDR2和VH CDR3。
在一些实施方案中，掩蔽部分包含与成纤维细胞活化蛋白(FAP)和白细胞介素-2(IL-2)结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段包括分别包含SEQ ID NO:16、17和18的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，以及分别包含SEQ ID NO:36、37和38的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。
在一些实施方案中，掩蔽部分包含与成纤维细胞活化蛋白(FAP)和白细胞介素-2(IL-2)结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段包括分别包含SEQ ID NO:19、17和20的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，以及分别包含SEQ ID NO:36、39和38的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。
在一些实施方案中，掩蔽部分包含与成纤维细胞活化蛋白(FAP)和白细胞介素-2(IL-2)结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段包括分别包含SEQ ID NO:21、22和23的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，以及分别包含SEQ ID NO:40、41和38的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。
在一些实施方案中，掩蔽部分包含与成纤维细胞活化蛋白(FAP)和白细胞介素-2(IL-2)结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段包括分别包含SEQ ID NO:30、17和31的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，以及分别包含SEQ ID NO:46、47和48的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。
在一些实施方案中，掩蔽部分包含与成纤维细胞活化蛋白(FAP)和白细胞介素-2(IL-2)结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段包括分别包含SEQ ID NO:32、17和33的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，以及分别包含SEQ ID NO:49、50和51的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。
在一些实施方案中，掩蔽部分包含与成纤维细胞活化蛋白(FAP)和白细胞介素-2(IL-2)结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段包括分别包含SEQ ID NO:34、17和35的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，以及分别包含SEQ ID NO:52、53和51的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。
在一些实施方案中，掩蔽部分包含与成纤维细胞活化蛋白(FAP)和白细胞介素-2(IL-2)结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段包括分别包含SEQ ID NO:24、25和23的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，以及分别包含SEQ ID NO:40、42和38的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。
在一些实施方案中，掩蔽部分包含与成纤维细胞活化蛋白(FAP)和白细胞介素-2(IL-2)结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段包括分别包含SEQ ID NO:26、25和28的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，以及分别包含SEQ ID NO:43、42和38的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。
在一些实施方案中，掩蔽部分包含与成纤维细胞活化蛋白(FAP)和白细胞介素-2(IL-2)结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段包括分别包含SEQ ID NO:26、25和29的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，以及分别包含SEQ ID NO:43、42和38的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。
在一些实施方案中，掩蔽部分包含与成纤维细胞活化蛋白(FAP)和白细胞介素-2(IL-2)结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段包括分别包含SEQ ID NO:24、25和29的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，以及分别包含SEQ ID NO:40、42和38的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。
在一些实施方案中，掩蔽部分包含与成纤维细胞活化蛋白(FAP)和白细胞介素-2(IL-2)结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段包括分别包含SEQ ID NO:26、25和27的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，以及分别包含SEQ ID NO:43、42和38的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。
在一些实施方案中，掩蔽部分包含与成纤维细胞活化蛋白(FAP)和白细胞介素-2(IL-2)结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段包括分别包含SEQ ID NO:26、25和27的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，以及分别包含SEQ ID NO:44、42和38的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。
在一些实施方案中，掩蔽部分包含与成纤维细胞活化蛋白(FAP)和白细胞介素-2(IL-2)结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段包括分别包含SEQ ID NO:26、25和27的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，以及分别包含SEQ ID NO:45、42和38的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。
在一些实施方案中，掩蔽部分包含与成纤维细胞活化蛋白(FAP)和白细胞介素-2(IL-2)结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段包括分别包含SEQ ID NO:103、17和104的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，以及分别包含SEQ ID NO:105、106和38的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。
在一些实施方案中，掩蔽部分包含与成纤维细胞活化蛋白(FAP)和白细胞介素-2(IL-2)结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段包含：(a)轻链可变区(VL)，该轻链可变区(VL)包含表3中列出的抗体D001、D002、D029、D029LV1、D029LV2、D029LV3、D029LV4、D029LV5、D003、D047、D049或B10中任一种的VL；和/或(b)重链可变区(VH)，该重链可变区(VH)包含表4中列出的抗体D001、D002、D029、D029LV1、D029LV2、D029LV3、D029LV4、D029LV5、D003、D047、D049或B10中任一种的VH。
在一些实施方案中，掩蔽部分包含与成纤维细胞活化蛋白(FAP)和白细胞介素-2(IL-2)结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段包含：VL，该VL包含SEQ IDNO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ IDNO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78或SEQ ID NO:101的氨基酸序列。
在一些实施方案中，掩蔽部分包含与成纤维细胞活化蛋白(FAP)和白细胞介素-2(IL-2)结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段包含：VH，该VH包含SEQ IDNO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQ IDNO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90或SEQID NO:102的氨基酸序列。
在一些实施方案中，掩蔽部分包含与成纤维细胞活化蛋白(FAP)和白细胞介素-2(IL-2)结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段包括：包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列的VL；和包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的VH。
在一些实施方案中，掩蔽部分包含与成纤维细胞活化蛋白(FAP)和白细胞介素-2(IL-2)结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段包括：包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的VL；和包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列的VH。
在一些实施方案中，掩蔽部分包含与成纤维细胞活化蛋白(FAP)和白细胞介素-2(IL-2)结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段包括：包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的VL；和包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的VH。
在一些实施方案中，掩蔽部分包含与成纤维细胞活化蛋白(FAP)和白细胞介素-2(IL-2)结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段包括：包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的VL；和包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列的VH。
在一些实施方案中，掩蔽部分包含与成纤维细胞活化蛋白(FAP)和白细胞介素-2(IL-2)结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段包括：包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的VL；和包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列的VH。
在一些实施方案中，掩蔽部分包含与成纤维细胞活化蛋白(FAP)和白细胞介素-2(IL-2)结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段包括：包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的VL；和包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列的VH。
在一些实施方案中，掩蔽部分包含与成纤维细胞活化蛋白(FAP)和白细胞介素-2(IL-2)结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段包括：包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的VL；和包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的VH。
在一些实施方案中，掩蔽部分包含与成纤维细胞活化蛋白(FAP)和白细胞介素-2(IL-2)结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段包括：包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VL；和包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的VH。
在一些实施方案中，掩蔽部分包含与成纤维细胞活化蛋白(FAP)和白细胞介素-2(IL-2)结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段包括：包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的VL；和包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的VH。
在一些实施方案中，掩蔽部分包含与成纤维细胞活化蛋白(FAP)和白细胞介素-2(IL-2)结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段包括：包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的VL；和包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的VH。
在一些实施方案中，掩蔽部分包含与成纤维细胞活化蛋白(FAP)和白细胞介素-2(IL-2)结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段包括：包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的VL；和包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列的VH。
在一些实施方案中，掩蔽部分包含与成纤维细胞活化蛋白(FAP)和白细胞介素-2(IL-2)结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段包括：包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的VL；和包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列的VH。
在一些实施方案中，掩蔽部分包含与成纤维细胞活化蛋白(FAP)和白细胞介素-2(IL-2)结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段包括：包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的VL；和包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列的VH。
在一些实施方案中，掩蔽部分包含与成纤维细胞活化蛋白(FAP)和白细胞介素-2(IL-2)结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段包括：包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列的VL；和包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列的VH。
在一些实施方案中，锚定部分包含与成纤维细胞活化蛋白(FAP)结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段包含(a)轻链可变区(VH)，该轻链可变区(VH)包含表5中列出的抗体872-5、872-59、872-70或872-5V1中任一种的VL互补决定区1(CDR1)、VLCDR2和VL CDR3；和/或(b)重链可变区(VH)，该重链可变区(VH)包含表6中列出的抗体872-5、872-59、872-70、872-5V1或VHH6中任一种的VH互补决定区1(CDR1)、VH CDR2和VH CDR3。
在一些实施方案中，锚定部分包含与成纤维细胞活化蛋白(FAP)结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段包括分别包含SEQ ID NO:30、17和54的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，以及分别包含SEQ ID NO:58、59和60的氨基酸序列的VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3。
在一些实施方案中，锚定部分包含与成纤维细胞活化蛋白(FAP)结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段包括分别包含SEQ ID NO:30、17和55的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，以及分别包含SEQ ID NO:61、62和48的氨基酸序列的VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3。
在一些实施方案中，锚定部分包含与成纤维细胞活化蛋白(FAP)结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段包括分别包含SEQ ID NO:30、17和56的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，以及分别包含SEQ ID NO:36、63和38的氨基酸序列的VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3。
在一些实施方案中，锚定部分包含与成纤维细胞活化蛋白(FAP)结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段包括分别包含SEQ ID NO:30、17和57的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，以及分别包含SEQ ID NO:58、64和51的氨基酸序列的VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3。
在一些实施方案中，锚定部分包含与成纤维细胞活化蛋白(FAP)结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段是包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的VHH，所述VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3分别包含SEQ ID NO:65、66和67的氨基酸序列。
在一些实施方案中，锚定部分包含与成纤维细胞活化蛋白(FAP)结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段包含(a)轻链可变区(VL)，该轻链可变区(VL)包含表7中列出的抗体872-5、872-59、872-70或872-5V1中任一种的VL；和/或(b)重链可变区(VH)，该重链可变区(VH)包含表8中列出的抗体872-5、872-59、872-70、872-5V1或VHH6中任一种的VH。
在一些实施方案中，锚定部分包含与成纤维细胞活化蛋白(FAP)结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ IDNO:93或SEQ ID NO:94的氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，锚定部分包含与成纤维细胞活化蛋白(FAP)结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ IDNO:97、SEQ ID NO:98或SEQ ID NO:99的氨基酸序列的VH。
在一些实施方案中，锚定部分包含与成纤维细胞活化蛋白(FAP)结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列的VL；和包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列的VH。
在一些实施方案中，锚定部分包含与成纤维细胞活化蛋白(FAP)结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列的VL；和包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列的VH。
在一些实施方案中，锚定部分包含与成纤维细胞活化蛋白(FAP)结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列的VL；和包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列的VH。
在一些实施方案中，锚定部分包含与成纤维细胞活化蛋白(FAP)结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列的VL；和包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列的VH。
在一些实施方案中，锚定部分包含与成纤维细胞活化蛋白(FAP)结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列的VHH。
在某些实施方案中，本公开内容提供了包含根据本公开内容的免疫缀合物分子和药学上可接受的载体的组合物。
在某些实施方案中，本公开内容提供了编码根据本公开内容的免疫缀合物分子或其亚基或片段的多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸可操作地连接至启动子。本文还提供了编码根据本公开内容的免疫缀合物分子或其亚基或片段的多核苷酸群体。例如，在一些实施方案中，第一多核苷酸编码形成免疫缀合物分子的一部分的第一亚基或多肽，并且第二多核苷酸编码形成免疫缀合物分子的一部分的第二亚基或多肽。在一些实施方案中，第一多核苷酸可操作地连接至第一启动子，并且第二多核苷酸可操作地连接至第二启动子。
在某些实施方案中，本公开内容提供了包含根据本公开内容的多核苷酸的载体。在某些实施方案中，本公开内容还提供了载体群体，该载体群体包括：(a)可操作地连接至第一启动子的第一载体，该第一载体包含编码形成本文提供的免疫缀合物分子的一部分的第一亚基或多肽的核苷酸序列；和(b)可操作地连接至第二启动子的第二载体，该第二载体包含编码形成本文提供的免疫缀合物分子的一部分的第二亚基或多肽的核苷酸序列。
在某些实施方案中，本公开内容提供了包含根据本公开内容的多核苷酸的细胞。本文还提供了包含根据本公开内容的载体或载体群体的细胞。在某些实施方案中，本公开内容提供了产生根据本公开内容的免疫缀合物分子的分离的细胞。
本文还提供了一种细胞群体，包括：(a)包含多核苷酸的第一宿主细胞，该多核苷酸包含编码形成本文提供的免疫缀合物分子的一部分的第一亚基或多肽的核苷酸序列，和(b)包含多核苷酸的第二宿主细胞，该多核苷酸包含编码形成本文提供的免疫缀合物分子的一部分的第二亚基或多肽的核苷酸序列。
本文还提供了一种细胞群体，包括：(a)包含多核苷酸的第一宿主细胞，该多核苷酸包含可操作地连接至第一启动子的编码形成本文提供的免疫缀合物分子的一部分的第一亚基或多肽的核苷酸序列，和(b)包含多核苷酸的第二宿主细胞，该多核苷酸包含可操作地连接至第二启动子的编码形成本文提供的免疫缀合物分子的一部分的第二亚基或多肽的核苷酸序列。
在某些实施方案中，本公开内容提供了包含根据本公开内容的免疫缀合物分子的试剂盒。
本文还提供了一种制备根据本公开内容的免疫缀合物分子或其亚基或片段的方法。在某些实施方案中，该方法包括培养本文提供的细胞以表达免疫缀合物分子或其亚基或片段。在其他实施方案中，该方法包括表达本文提供的多核苷酸。
在相关方面中，本文提供了一种用于在靶位点激活细胞因子介导的效应的方法，该方法包括将包含细胞因子和掩蔽部分的免疫缀合物分子递送至靶位点；其中掩蔽部分包含二合一抗体或其抗原结合片段，所述二合一抗体或其抗原结合片段通过分子内相互作用与细胞因子结合并抑制细胞因子介导的效应；其中二合一抗体或抗原结合片段能够与靶位点中的第一靶抗原结合；其中当免疫缀合物分子在靶位点处时，二合一抗体与第一靶抗原结合并从细胞因子解离；并且其中细胞因子介导的效应在靶位点处被激活。
在一些实施方案中，免疫缀合物分子还包括锚定部分；其中锚定部分包含能够与靶位点中的第二靶抗原结合的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，当免疫缀合物分子在靶位点处时，锚定部分的抗体或抗原结合片段与第二靶抗原结合；并且其中免疫缀合物分子固定在靶位点处。
在一些实施方案中，将免疫缀合物分子递送至靶位点包括将免疫缀合物分子施用至受试者。在一些实施方案中，在将免疫缀合物分子施用至受试者后，非靶位点处的细胞因子活性与靶位点处的细胞因子活性相比低至少约10％、20％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％。
在相关方面中，本文提供了一种用于在靶位点处富集细胞因子的方法，该方法包括将包含细胞因子和锚定部分的免疫缀合物分子递送至靶位点；其中锚定部分包含能够与靶位点中的第二靶抗原结合的抗体或其抗原结合片段；其中当免疫缀合物分子在靶位点处时，锚定部分与第二靶抗原结合；并且其中与非靶位点相比，细胞因子以更高的浓度分布在靶位点。
在一些实施方案中，将免疫缀合物分子递送至靶位点包括将免疫缀合物分子施用至受试者。在一些实施方案中，在将免疫缀合物分子施用至受试者后，非靶位点处的细胞因子浓度与靶位点处的细胞因子活性相比低至少约10％、20％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％。
在一些实施方案中，免疫缀合物分子还包含掩蔽部分；其中掩蔽部分包含二合一抗体或其抗原结合片段，所述二合一抗体或其抗原结合片段通过分子内相互作用与细胞因子结合并抑制细胞因子介导的效应；其中二合一抗体或抗原结合片段能够与靶位点中的第一靶抗原结合；其中当免疫缀合物分子在靶位点处时，二合一抗体与第一靶抗原结合并从细胞因子解离；并且其中细胞因子介导的效应在靶位点处被激活。
在一些实施方案中，向受试者施用免疫缀合物分子降低了受试者中与细胞因子相关的毒性或副作用。在一些实施方案中，与施用至受试者等量的呈未缀合形式的细胞因子相比，在本发明方法中细胞因子毒性或副作用减少至少约10％、20％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％。在一些实施方案中，与细胞因子相关的毒性或副作用的减少被测量为施用的受试者的寿命的延长。在一些实施方案中，与细胞因子相关的毒性或副作用的减少被测量为施用的受试者的体重减轻的减少。在一些实施方案中，与细胞因子相关的毒性或副作用的减少被测量为施用的受试者中免疫应答水平的变化。在一些实施方案中，与细胞因子相关的毒性或副作用的减少被测量为施用的受试者中炎性应答的变化。
在本发明方法的一些实施方案中，第一抗原和第二抗原是相同的抗原或不同的抗原。在一些实施方案中，靶位点是肿瘤微环境。在一些实施方案中，靶位点是癌性细胞。在一些实施方案中，第一抗原和/或第二抗原在癌细胞的表面上表达。在一些实施方案中，第一抗原和/或第二抗原由肿瘤微环境中的细胞表达。在一些实施方案中，第一抗原和/或第二抗原是纤维化活化蛋白(FAP)。在一些实施方案中，免疫缀合物分子还包含被配置为可操作地连接细胞因子多肽、掩蔽部分和锚定部分中的两个或更多个的缀合部分。在一些实施方案中，缀合部分是免疫球蛋白Fc结构域，该免疫球蛋白Fc结构域包含第一亚基和第二亚基，它们是两条不相同的多肽链；并且其中Fc结构域包含促进两条不相同的多肽链的异二聚化的第一修饰。在一些实施方案中，免疫球蛋白结构域包含第二修饰，其中该Fc结构域与没有所述第二修饰的天然Fc结构域相比具有降低的与Fc受体的结合亲和力。在一些实施方案中，在本发明方法中使用的免疫缀合物分子是根据本公开内容的免疫缀合物分子。
在某些实施方案中，本公开内容提供了可以形成本公开内容的免疫缀合物分子的一部分的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，本文提供了与成纤维细胞活化蛋白(FAP)和白细胞介素-2(IL-2)结合的二合一抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段包含(a)轻链可变区(VH)，该轻链可变区(VH)包含表1中列出的抗体D001、D002、D029、D029LV1、D029LV2、D029LV3、D029LV4、D029LV5、D003、D047、D049或B10中任一种的VL互补决定区1(CDR1)、VL CDR2和VL CDR3；和/或(b)重链可变区(VH)，该重链可变区(VH)包含表2中列出的抗体D001、D002、D029、D029HV1、D029HV2、D029HV3、D029HV4、D029HV5、D029HV6、D003、D047、D049或B10中任一种的VH互补决定区1(CDR1)、VH CDR2和VH CDR3。
在一些实施方案中，与成纤维细胞活化蛋白(FAP)和白细胞介素-2(IL-2)结合的二合一抗体或其抗原结合片段包括分别包含SEQ ID NO:16、17和18的氨基酸序列的VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3，以及分别包含SEQ ID NO:36、37和38的氨基酸序列的VH CDR1、VHCDR2和VH CDR3。
在一些实施方案中，与成纤维细胞活化蛋白(FAP)和白细胞介素-2(IL-2)结合的二合一抗体或其抗原结合片段包括分别包含SEQ ID NO:19、17和20的氨基酸序列的VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3，以及分别包含SEQ ID NO:36、39和38的氨基酸序列的VH CDR1、VHCDR2和VH CDR3。
在一些实施方案中，与成纤维细胞活化蛋白(FAP)和白细胞介素-2(IL-2)结合的二合一抗体或其抗原结合片段包括分别包含SEQ ID NO:21、22和23的氨基酸序列的VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3，以及分别包含SEQ ID NO:40、41和38的氨基酸序列的VH CDR1、VHCDR2和VH CDR3。
在一些实施方案中，与成纤维细胞活化蛋白(FAP)和白细胞介素-2(IL-2)结合的二合一抗体或其抗原结合片段包括分别包含SEQ ID NO:30、17和31的氨基酸序列的VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3，以及分别包含SEQ ID NO:46、47和48的氨基酸序列的VH CDR1、VHCDR2和VH CDR3。
在一些实施方案中，与成纤维细胞活化蛋白(FAP)和白细胞介素-2(IL-2)结合的二合一抗体或其抗原结合片段包括分别包含SEQ ID NO:32、17和33的氨基酸序列的VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3，以及分别包含SEQ ID NO:49、50和51的氨基酸序列的VH CDR1、VHCDR2和VH CDR3。
在一些实施方案中，与成纤维细胞活化蛋白(FAP)和白细胞介素-2(IL-2)结合的二合一抗体或其抗原结合片段包括分别包含SEQ ID NO:34、17和35的氨基酸序列的VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3，以及分别包含SEQ ID NO:52、53和51的氨基酸序列的VH CDR1、VHCDR2和VH CDR3。
在一些实施方案中，与成纤维细胞活化蛋白(FAP)和白细胞介素-2(IL-2)结合的二合一抗体或其抗原结合片段包括分别包含SEQ ID NO:24、25和23的氨基酸序列的VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3，以及分别包含SEQ ID NO:40、42和38的氨基酸序列的VH CDR1、VHCDR2和VH CDR3。
在一些实施方案中，与成纤维细胞活化蛋白(FAP)和白细胞介素-2(IL-2)结合的二合一抗体或其抗原结合片段包括分别包含SEQ ID NO:26、25和28的氨基酸序列的VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3，以及分别包含SEQ ID NO:43、42和38的氨基酸序列的VH CDR1、VHCDR2和VH CDR3。
在一些实施方案中，与成纤维细胞活化蛋白(FAP)和白细胞介素-2(IL-2)结合的二合一抗体或其抗原结合片段包括分别包含SEQ ID NO:26、25和29的氨基酸序列的VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3，以及分别包含SEQ ID NO:43、42和38的氨基酸序列的VH CDR1、VHCDR2和VH CDR3。
在一些实施方案中，与成纤维细胞活化蛋白(FAP)和白细胞介素-2(IL-2)结合的二合一抗体或其抗原结合片段包括分别包含SEQ ID NO:24、25和29的氨基酸序列的VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3，以及分别包含SEQ ID NO:40、42和38的氨基酸序列的VH CDR1、VHCDR2和VH CDR3。
在一些实施方案中，与成纤维细胞活化蛋白(FAP)和白细胞介素-2(IL-2)结合的二合一抗体或其抗原结合片段包括分别包含SEQ ID NO:26、25和27的氨基酸序列的VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3，以及分别包含SEQ ID NO:43、42和38的氨基酸序列的VH CDR1、VHCDR2和VH CDR3。
在一些实施方案中，与成纤维细胞活化蛋白(FAP)和白细胞介素-2(IL-2)结合的二合一抗体或其抗原结合片段包括分别包含SEQ ID NO:26、25和27的氨基酸序列的VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3，以及分别包含SEQ ID NO:44、42和38的氨基酸序列的VH CDR1、VHCDR2和VH CDR3。
在一些实施方案中，与成纤维细胞活化蛋白(FAP)和白细胞介素-2(IL-2)结合的二合一抗体或其抗原结合片段包括分别包含SEQ ID NO:26、25和27的氨基酸序列的VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3，以及分别包含SEQ ID NO:45、42和38的氨基酸序列的VH CDR1、VHCDR2和VH CDR3。
在一些实施方案中，与成纤维细胞活化蛋白(FAP)和白细胞介素-2(IL-2)结合的二合一抗体或其抗原结合片段包括分别包含SEQ ID NO:103、17和104的氨基酸序列的VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3，以及分别包含SEQ ID NO:105、106和38的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。
在一些实施方案中，与成纤维细胞活化蛋白(FAP)和白细胞介素-2(IL-2)结合的二合一抗体或其抗原结合片段包含：(a)轻链可变区(VL)，该轻链可变区(VL)包含表3中列出的抗体D001、D002、D029、D029LV1、D029LV2、D029LV3、D029LV4、D029LV5、D003、D047、D049或B10中任一种的VL；和/或(b)重链可变区(VH)，该重链可变区(VH)包含表4中列出的抗体D001、D002、D029、D029LV1、D029LV2、D029LV3、D029LV4、D029LV5、D003、D047、D049或B10中任一种的VH。
在一些实施方案中，与成纤维细胞活化蛋白(FAP)和白细胞介素-2(IL-2)结合的二合一抗体或其抗原结合片段包含VL，该VL包含SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ IDNO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78或SEQ ID NO:101的氨基酸序列。
在一些实施方案中，与成纤维细胞活化蛋白(FAP)和白细胞介素-2(IL-2)结合的二合一抗体或其抗原结合片段包含VH，该VH包含SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ IDNO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90或SEQ ID NO:102的氨基酸序列。
在一些实施方案中，与成纤维细胞活化蛋白(FAP)和白细胞介素-2(IL-2)结合的二合一抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列的VL；和包含SEQ IDNO:79的氨基酸序列的VH。
在一些实施方案中，与成纤维细胞活化蛋白(FAP)和白细胞介素-2(IL-2)结合的二合一抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的VL；和包含SEQ IDNO:80的氨基酸序列的VH。
在一些实施方案中，与成纤维细胞活化蛋白(FAP)和白细胞介素-2(IL-2)结合的二合一抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的VL；和包含SEQ IDNO:81的氨基酸序列的VH。
在一些实施方案中，与成纤维细胞活化蛋白(FAP)和白细胞介素-2(IL-2)结合的二合一抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的VL；和包含SEQ IDNO:88的氨基酸序列的VH。
在一些实施方案中，与成纤维细胞活化蛋白(FAP)和白细胞介素-2(IL-2)结合的二合一抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的VL；和包含SEQ IDNO:89的氨基酸序列的VH。
在一些实施方案中，与成纤维细胞活化蛋白(FAP)和白细胞介素-2(IL-2)结合的二合一抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的VL；和包含SEQ IDNO:90的氨基酸序列的VH。
在一些实施方案中，与成纤维细胞活化蛋白(FAP)和白细胞介素-2(IL-2)结合的二合一抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的VL；和包含SEQ IDNO:82的氨基酸序列的VH。
在一些实施方案中，与成纤维细胞活化蛋白(FAP)和白细胞介素-2(IL-2)结合的二合一抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VL；和包含SEQ IDNO:83的氨基酸序列的VH。
在一些实施方案中，与成纤维细胞活化蛋白(FAP)和白细胞介素-2(IL-2)结合的二合一抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的VL；和包含SEQ IDNO:83的氨基酸序列的VH。
在一些实施方案中，与成纤维细胞活化蛋白(FAP)和白细胞介素-2(IL-2)结合的二合一抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的VL；和包含SEQ IDNO:82的氨基酸序列的VH。
在一些实施方案中，与成纤维细胞活化蛋白(FAP)和白细胞介素-2(IL-2)结合的二合一抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的VL；和包含SEQ IDNO:84的氨基酸序列的VH。
在一些实施方案中，与成纤维细胞活化蛋白(FAP)和白细胞介素-2(IL-2)结合的二合一抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的VL；和包含SEQ IDNO:85的氨基酸序列的VH。
在一些实施方案中，与成纤维细胞活化蛋白(FAP)和白细胞介素-2(IL-2)结合的二合一抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的VL；和包含SEQ IDNO:87的氨基酸序列的VH。
在一些实施方案中，与成纤维细胞活化蛋白(FAP)和白细胞介素-2(IL-2)结合的二合一抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列的VL；和包含SEQ IDNO:102的氨基酸序列的VH。
在某些实施方案中，本公开内容提供了一种免疫缀合物分子，该免疫缀合物分子包含与本文公开的成纤维细胞活化蛋白(FAP)和白细胞介素-2(IL-2)结合的二合一抗体或其抗原结合片段以及IL-2多肽。在一些实施方案中，IL-2多肽是人类IL-2。在一些实施方案中，IL-2多肽是如本文描述的野生型或突变型IL-2。
在某些实施方案中，本公开内容还提供了与成纤维细胞活化蛋白(FAP)结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段包含(a)轻链可变区(VH)，该轻链可变区(VH)包含表5中列出的抗体872-5、872-59、872-70或872-5V1中任一种的VL互补决定区1(CDR1)、VL CDR2和VL CDR3；和/或(b)重链可变区(VH)，该重链可变区(VH)包含表6中列出的抗体872-5、872-59、872-70、872-5V1或VHH6中任一种的VH互补决定区1(CDR1)、VH CDR2和VH CDR3。
在一些实施方案中，与成纤维细胞活化蛋白(FAP)结合的抗体或其抗原结合片段包括分别包含SEQ ID NO:30、17和54的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，以及分别包含SEQ ID NO:58、59和60的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。
在一些实施方案中，与成纤维细胞活化蛋白(FAP)结合的抗体或其抗原结合片段包括分别包含SEQ ID NO:30、17和55的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，以及分别包含SEQ ID NO:61、62和48的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。
在一些实施方案中，与成纤维细胞活化蛋白(FAP)结合的抗体或其抗原结合片段包括分别包含SEQ ID NO:30、17和56的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，以及分别包含SEQ ID NO:36、63和38的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。
在一些实施方案中，与成纤维细胞活化蛋白(FAP)结合的抗体或其抗原结合片段包括分别包含SEQ ID NO:30、17和57的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，以及分别包含SEQ ID NO:58、64和51的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。
在一些实施方案中，与成纤维细胞活化蛋白(FAP)结合的抗体或其抗原结合片段是包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的VHH，所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别包含SEQID NO:65、66和67的氨基酸序列。
在一些实施方案中，与成纤维细胞活化蛋白(FAP)结合的抗体或其抗原结合片段包含(a)轻链可变区(VL)，该轻链可变区(VL)包含表7中列出的抗体872-5、872-59、872-70或872-5V1中任一种的VL；和/或(b)重链可变区(VH)，该重链可变区(VH)包含表8中列出的抗体872-5、872-59、872-70、872-5V1或VHH6中任一种的VH。
在一些实施方案中，与成纤维细胞活化蛋白(FAP)结合的抗体或其抗原结合片段包含VL，该VL包含SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93或SEQ ID NO:94的氨基酸序列。
在一些实施方案中，与成纤维细胞活化蛋白(FAP)结合的抗体或其抗原结合片段包含VH，该VH包含SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98或SEQ IDNO:99的氨基酸序列。
在一些实施方案中，与成纤维细胞活化蛋白(FAP)结合的抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列的VL；和包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列的VH。
在一些实施方案中，与成纤维细胞活化蛋白(FAP)结合的抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列的VL；和包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列的VH。
在一些实施方案中，与成纤维细胞活化蛋白(FAP)结合的抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列的VL；和包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列的VH。
在一些实施方案中，与成纤维细胞活化蛋白(FAP)结合的抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列的VL；和包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列的VH。
在一些实施方案中，与成纤维细胞活化蛋白(FAP)结合的抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列的VHH。
在某些实施方案中，本公开内容提供了一种免疫缀合物分子，该免疫缀合物分子包含本文公开的与成纤维细胞活化蛋白(FAP)结合的抗体或其抗原结合片段以及IL-2多肽。在一些实施方案中，IL-2多肽是人类IL-2。在一些实施方案中，IL-2多肽是如本文描述的野生型或突变型IL-2。
在另一个方面中，本文提供了一种免疫缀合物分子，该免疫缀合物分子包含与掩蔽部分缀合的IL-2多肽，其中掩蔽部分包含能够与IL-2多肽和第一靶抗原结合的二合一抗体或其抗原结合片段；其中当与IL-2多肽结合时，掩蔽部分阻断IL-2多肽与第一IL-2受体(IL-2R)亚基的结合；并且其中当与第一靶抗原结合时，掩蔽部分从IL-2多肽解离，从而释放IL-2多肽用于与第一IL-2R亚基结合。在一些实施方案中，IL-2多肽包含一个或更多个突变，该一个或更多个突变减弱IL-2多肽与第二IL-2R亚基的结合。
在一些实施方案中，第一IL-2R亚基是IL-2Rα链(IL-2Rα)，并且第二IL-2R亚基是IL-2Rβ链(IL-2Rβ)。在一些实施方案中，与野生型IL-2相比，IL-2多肽与第二IL-2R亚基的结合减少约10％、约20％、约30％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％。
在一些实施方案中，减弱IL-2多肽与IL-2Rβ的结合的一个或更多个突变选自D20T、D20G、D20A、H16E、H16R、H16A、N88D、N88S、N88R、V91G、V91A、V91R和V91S或其组合。在一些实施方案中，掩蔽部分与IL-2的表位结合，该IL-2的表位包含IL-2的残基P34、K35、R38、T41、F42、K43、F44、Y45、E61、E62、K64、P65、E68、V69、N71、L72、Q74、Y107和D109中的一个或更多个。
在一些实施方案中，掩蔽部分与由抗体识别的IL-2的表位结合，该抗体包含具有SEQ ID NO:101的氨基酸序列的轻链可变区和具有SEQ ID NO:102的氨基酸序列的重链可变区。在一些实施方案中，掩蔽部分与包含具有SEQ ID NO:101的氨基酸序列的轻链可变区和具有SEQ ID NO:102的氨基酸序列的重链可变区的抗体竞争结合IL-2。
在一些实施方案中，掩蔽部分包含(a)轻链可变区(VL)，该轻链可变区(VL)包含表1中列出的抗体B10的VL互补决定区1(CDR1)、VL CDR2和VL CDR3；和/或(b)重链可变区(VH)，该重链可变区(VH)包含表2中列出的抗体B10的VH互补决定区1(CDR1)、VH CDR2和VHCDR3。
在一些实施方案中，其中掩蔽部分包括(a)分别包含SEQ ID NO:103、17和104的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，以及(b)分别包含SEQ ID NO:105、106和38的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。
在一些实施方案中，其中掩蔽部分包括：(a)包含表3中列出的抗体B10的VL的轻链可变区(VL)；和/或(b)包含表4中列出的抗体B10的VH的重链可变区(VH)。
在一些实施方案中，其中掩蔽部分包括包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，其中掩蔽部分包括包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，其中掩蔽部分包括(a)包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列的VL；和(b)包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列的VH。
在一些实施方案中，其中第一IL-2R亚基是IL-2Rβ，并且第二IL-2R亚基是IL-2Rα。在一些实施方案中，其中与野生型IL-2相比，IL-2多肽与IL-2Rα的结合减少约10％、约20％、约30％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％。
在一些实施方案中，减弱IL-2多肽与IL-2Rα的结合的一个或更多个突变选自K35E、R38A、R38E、R38D、F42A、F42K、K43E、Y45A、E61R、E62A、L72G或其组合。在一些实施方案中，减弱IL-2多肽与IL-2Rα的结合的一个或更多个突变是(a)F42A；或(b)K35E及F42A。在一些实施方案中，掩蔽部分与包含IL-2的残基L12、Q13、E15、H16、L19、D20、M23、R81、D84、D87、N88、V91、I92和E95中的一个或更多个的IL-2的表位结合。
在一些实施方案中，掩蔽部分与由抗体5UTZ识别的IL-2的表位结合。在一些实施方案中，掩蔽部分与抗体5UTZ竞争结合IL-2。
在一些实施方案中，IL-2多肽还包含修饰IL-2多肽与IL-2Rγ链(IL-2Rγ)的结合的一个或更多个突变。在一些实施方案中，修饰IL-2多肽与IL-2Rγ的结合的一个或更多个突变选自L18R、Q22E、T123A、Q126T、I129V、S130A、S130R或其组合。
在一些实施方案中，免疫缀合物还包含锚定部分，其中锚定部分包含与第二靶抗原特异性结合的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，其中在存在第一细胞的表面上表达的第一靶抗原的情况下，掩蔽部分从IL-2多肽解离。
在一些实施方案中，其中第二靶抗原在第一细胞或靠近第一细胞的第二细胞的表面上表达。在一些实施方案中，第一靶抗原和第二靶抗原是相同的或不同的。在一些实施方案中，第一靶抗原和/或第二靶抗原是肿瘤相关抗原。在一些实施方案中，第一靶抗原和第二靶抗原各自独立地选自FAP、Her2、Her3、CD19、CD20、BCMA、PSMA、CEA、cMET、EGFR、CA-125、MUC-1、EpCAM或Trop-2。在一些实施方案中，第一靶抗原是FAP。
在另一个方面中，本文提供了一种用于激活IL-2R的方法，该方法包括使IL-2R与有效量的如本文提供的包含IL-2R多肽的免疫缀合物分子接触。在一些实施方案中，IL-2R包括IL-2Rβ。在一些实施方案中，IL-2R包括IL-2Rα。在一些实施方案中，IL-2R包括IL-2Rγ。
在一些实施方案中，IL-2R包括IL-2Rβ，并且其中IL-2Rβ在第一细胞的表面上表达。在一些实施方案中，IL-2R还包括IL-2Rγ，并且其中IL-2Rγ在第一细胞的表面上表达。
在一些实施方案中，IL-2R还包括IL-2Rα。在一些实施方案中，IL-2Rα在细胞表面上缔合。在一些实施方案中，IL-2Rα在第一细胞的表面上缔合(顺式呈递)。在一些实施方案中，IL-2Rα在第二细胞的表面上缔合(反式呈递)。在一些实施方案中，IL-2Rα不在细胞表面上缔合。在一些实施方案中，IL-2R不包括IL-2Rα。
在一些实施方案中，第一细胞和/或第二细胞是免疫细胞，并且其中在激活IL-2R时，免疫细胞被激活。在一些实施方案中，免疫细胞的激活被测量为免疫细胞的增殖或成熟增加。在一些实施方案中，靶细胞的增殖或成熟增加约10％、约20％、约30％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％、约125％、约150％、约175％、约200％、约250％、约300％、约400％、约500％、约600％、约700％、约800％、约900％或约1000％。在一些实施方案中，免疫细胞的激活被测量为免疫细胞的存活时间延长。在一些实施方案中，靶细胞的存活时间增加约10％、约20％、约30％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％、约125％、约150％、约175％、约200％、约250％、约300％、约400％、约500％、约600％、约700％、约800％、约900％或约1000％。
在一些实施方案中，免疫细胞是效应T细胞、记忆T细胞或其组合。在一些实施方案中，免疫细胞是CD4+T细胞、CD8+T细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、SLEC(短寿命效应细胞)、MPEC(记忆前体效应细胞)、TE(终末效应细胞)、NK(自然杀伤细胞)、NKT(自然杀伤T细胞)、先天淋巴样细胞(I型-III型)或其组合。
在一些实施方案中，免疫细胞是调节性T细胞(Treg)。在一些实施方案中，免疫细胞是天然Treg(nTreg)细胞、诱导的Treg(iTreg)细胞或其组合。
在一些实施方案中，第一细胞和/或第二细胞是病变细胞，并且其中在激活IL-2R时，病变细胞死亡。在一些实施方案中，病变细胞是癌细胞。在一些实施方案中，病变细胞是被感染性病原体感染的细胞。在一些实施方案中，感染性病原体是病毒、细菌、真菌、寄生虫或其组合。
在一个方面中，本文提供了一种激活表达IL-2R的靶细胞的方法，该方法包括使靶细胞与有效量的如本文描述的包含IL-2多肽的免疫缀合物分子接触，其中在IL-2多肽与IL-2R结合时，靶细胞被激活。在一些实施方案中，靶细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，靶细胞是效应T细胞、记忆T细胞、调节性T细胞或其组合。在一些实施方案中，靶细胞是CD4+T细胞、CD8+T细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、SLEC(短寿命效应细胞)、MPEC(记忆前体效应细胞)、TE(终末效应细胞)、NK(自然杀伤细胞)、NKT(自然杀伤T细胞)、先天淋巴样细胞(I型-III型)或其组合。在一些实施方案中，靶细胞是天然Treg(nTreg)细胞、诱导的Treg(iTreg)细胞或其组合。
在一些实施方案中，靶细胞的激活被测量为靶细胞的增殖或成熟增加。在一些实施方案中，靶细胞的增殖或成熟增加约10％、约20％、约30％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％、约125％、约150％、约175％、约200％、约250％、约300％、约400％、约500％、约600％、约700％、约800％、约900％或约1000％。
在一些实施方案中，靶细胞的激活被测量为靶细胞的存活时间延长。在一些实施方案中，靶细胞的存活时间增加约10％、约20％、约30％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％、约125％、约150％、约175％、约200％、约250％、约300％、约400％、约500％、约600％、约700％、约800％、约900％或约1000％。
在一些实施方案中，其中接触还包括施用药物组合物，该药物组合物包含药学上可接受的载体和如本文描述的包含IL-2多肽的免疫缀合物分子。在一些实施方案中，接触增强抗肿瘤免疫应答。在一些实施方案中，接触增强抗感染免疫应答。
在一个方面中，本文提供了一种增强T细胞群体的抗原特异性免疫应答的方法，该方法包括使T细胞群体与有效量的如本文描述的包含IL-2多肽的免疫缀合物分子接触。在一些实施方案中，接触增强抗原特异性效应T细胞的增殖或成熟。在一些实施方案中，接触增强抗原特异性记忆T细胞的形成。在一些实施方案中，接触在存在抗原的情况下进行。在一些实施方案中，抗原是癌症、肿瘤、病原体或过敏原的抗原。
在一个方面中，本文提供了一种增加T细胞群体分泌促炎细胞因子的方法，该方法包括使T细胞群体与如本文描述的包含IL-2多肽的免疫缀合物分子接触，其中所述IL-2多肽在结合时激活T细胞。在一些实施方案中，细胞因子是IL-1、IL-2、IL-6、IL-12、IL-17、IL-22、IL-23、GM-CSF、TNF-α、IFN-γ或其任何组合。在一些实施方案中，细胞因子的产生增加约10％、约20％、约30％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％、约125％、约150％、约175％、约200％、约250％、约300％、约400％、约500％、约600％、约700％、约800％、约900％或约1000％。
在一个方面中，本文提供了一种增加IL-2R在靶细胞的表面上的组装的方法，该方法包括使靶细胞与有效量的如本文描述的包含IL-2多肽的免疫缀合物分子接触。在一些实施方案中，IL-2R包括在靶细胞的表面上的IL-2Rα、IL-2Rβ、IL-2Rγ或其组合。在一些实施方案中，IL-2R包括在靶细胞的表面上的IL-2Rβ和IL-2Rγ，以及在靠近靶细胞的第二细胞的表面上的IL-2Rα。在一些实施方案中，IL-2R包括在靶细胞的表面上的IL-2Rβ和IL-2Rγ，以及不与细胞表面缔合的IL-2Rα。在一些实施方案中，IL-2R在靶细胞的表面上的组装增加约10％、约20％、约30％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％、约125％、约150％、约175％、约200％、约250％、约300％、约400％、约500％、约600％、约700％、约800％、约900％或约1000％。在一些实施方案中，靶细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，靶细胞是效应T细胞、记忆T细胞、调节性T细胞或其组合。在一些实施方案中，靶细胞是CD4+T细胞、CD8+T细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、SLEC(短寿命效应细胞)、MPEC(记忆前体效应细胞)、TE(终末效应细胞)、NK(自然杀伤细胞)、NKT(自然杀伤T细胞)、先天淋巴样细胞(I型-III型)或其组合。在一些实施方案中，靶细胞是天然Treg(nTreg)细胞、诱导的Treg(iTreg)细胞或其组合。
在一个方面中，本文提供了一种在病变细胞的群体周围的组织中形成促炎环境的方法，该方法包括使组织与有效量的如本文描述的包含IL-2多肽的免疫缀合物分子接触。在一些实施方案中，组织中活化的B细胞、CD4+效应T细胞、CD8+效应T细胞、树突状细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、单核细胞、粒细胞、嗜酸性粒细胞和/或中性粒细胞的浓度增加。在一些实施方案中，组织中调节性T细胞的浓度降低。在一些实施方案中，组织中促炎细胞因子的浓度增加。在一些实施方案中，促炎细胞因子是IL-1、IL-2、IL-6、IL-12、IL-17、IL-22、IL-23、GM-CSF、TNF-α、IFN-γ或其任何组合。在一些实施方案中，与源自或衍生自病变细胞的抗原结合的抗体的浓度在组织中增加。在一些实施方案中，抗原呈递细胞对源自或衍生自病变细胞的抗原的呈递在组织中增加。在一些实施方案中，病变细胞的吞噬作用在组织中增加。在一些实施方案中，由细胞介导的细胞毒性诱导的病变细胞的凋亡在组织中增加。在一些实施方案中，由抗体依赖性细胞毒性诱导的病变细胞的凋亡在组织中增加。在一些实施方案中，病变细胞的群体在组织中减少。在一些实施方案中，病变细胞的群体在组织中减少约10％、约20％、约30％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％。
在一个方面中，本文提供了一种消除受试者中的病变细胞的方法，该方法包括向受试者施用有效量的如本文描述的包含IL-2多肽的免疫缀合物分子。在一些实施方案中，病变细胞是癌细胞。在一些实施方案中，病变细胞是被感染性病原体感染的细胞。在一些实施方案中，感染性病原体是病毒、细菌、真菌、寄生虫或其组合。
在一个方面中，本文提供了一种治疗有相应需要的受试者中的癌症的方法，该方法包括向受试者施用有效量的如本文描述的包含IL-2多肽的免疫缀合物分子。在一些实施方案中，所述治疗增强先天的、体液的或细胞介导的抗肿瘤免疫应答。在一些实施方案中，该方法还包括第二疗法的共施用。
在一个方面中，本文提供了一种治疗有相应需要的受试者中的感染的方法，该方法包括向受试者施用有效量的如本文描述的包含IL-2多肽的免疫缀合物分子。在一些实施方案中，所述治疗增强先天的、体液的或细胞介导的抗感染免疫应答。在一些实施方案中，受试者被共施用疫苗组合物，用于预防受试者中的感染。在一些实施方案中，疫苗组合物同时或顺序共施用。
在一个方面中，本文提供了一种增加有相应需要的受试者中对抗原的应答的方法，该方法包括向受试者施用有效量的如本文描述的包含IL-2多肽的免疫缀合物分子。在一些实施方案中，抗原是癌症、肿瘤、病原体或过敏原的抗原。在一些实施方案中，抗原源自或衍生自感染性病原体。在一些实施方案中，感染性病原体是病毒、细菌、真菌、寄生虫或其组合。在一些实施方案中，抗原源自或衍生自病变细胞。在一些实施方案中，抗原源自或衍生自被感染性病原体感染的细胞。在一些实施方案中，感染性病原体是病毒、细菌、真菌、寄生虫或其组合。在一些实施方案中，抗原源自或衍生自癌细胞。
在一个方面中，本文提供了一种增加有相应需要的受试者中对疫苗的应答的方法，该方法包括向受试者施用疫苗和有效量的如本文描述的包含IL-2多肽的免疫缀合物分子。在一些实施方案中，疫苗是针对肿瘤、癌症、病原体或过敏原的疫苗。在一些实施方案中，免疫缀合物分子被配制成用于疫苗的佐剂组合物。
在一个方面中，本文提供了一种在抗原周围的组织中建立抗原的免疫耐受性的方法，该方法包括使组织与有效量的如本文描述的包含IL-2多肽的免疫缀合物分子接触。在一些实施方案中，组织中活化的B细胞、CD4+效应T细胞、CD8+效应T细胞、树突状细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、单核细胞、粒细胞、嗜酸性粒细胞和/或中性粒细胞的浓度降低。在一些实施方案中，组织中调节性T细胞的浓度增加。在一些实施方案中，组织中促炎细胞因子的浓度降低。在一些实施方案中，促炎细胞因子是IL-1、IL-2、IL-6、IL-12、IL-17、IL-22、IL-23、GM-CSF、TNF-α、IFN-γ或其任何组合。在一些实施方案中，与抗原结合的抗体的浓度在组织中降低。在一些实施方案中，抗原呈递细胞对抗原的呈递在组织中减少。在一些实施方案中，表达抗原的细胞的吞噬作用在组织中减少。在一些实施方案中，表达抗原的细胞的凋亡在组织中减少。在一些实施方案中，其中组织在受试者中，并且其中抗原是受试者的自身抗原。在一些实施方案中，受试者患有自身免疫性疾病。
在又一个方面中，本文提供了一种用于治疗有相应需要的受试者中的自身免疫性疾病的方法，该方法包括向受试者施用有效量的如本文描述的包含IL-2多肽的免疫缀合物分子。在一些实施方案中，所述治疗减少对自身抗原的先天的、体液的或细胞介导的免疫应答。在一些实施方案中，该方法还包括第二疗法的共施用。
4.附图简述
图1是根据本公开内容的一种实施方案的抗体-细胞因子免疫缀合物分子的示意图。在示例性实施方案中，免疫缀合物包含(i)能够介导细胞效应的细胞因子多肽，(ii)能够(a)与细胞因子结合并抑制细胞因子的细胞效应，和(b)与环境中的抗原(例如TAA)结合，并在这样的结合时释放细胞因子的掩蔽部分，(iii)能够与抗原结合，从而将免疫缀合物固定在富含抗原的环境中的锚定部分；和(iv)连接免疫缀合物的(i)、(ii)和(iii)中描述的部分的缀合部分。
图2是根据本公开内容的一种实施方案的包含IL-2的免疫缀合物分子的示意图，以及该免疫缀合物在不存在或存在成纤维细胞活化蛋白(FAP)的情况下的操作。在该示例性实施方案中，免疫缀合物包含(i)与免疫球蛋白Fc结构域的N末端融合的抗IL-2/抗FAP二合一Fab抗体，(ii)与该二合一抗体的N末端融合的IL-2多肽，(iii)与免疫球蛋白Fc结构域的N末端融合的抗FAP抗体或其结合片段。上图图示出，在附近环境中不存在FAP的情况下，由于分子内相互作用的普遍存在，二合一抗体的平衡向与IL-2结合转变，从而防止IL-2与细胞表面受体结合并抑制IL-2细胞效应。下图图示出，当经由抗FAP抗体与FAP的结合固定在富含FAP的环境中时，二合一抗体的平衡向从IL-2解离和与FAP结合转变，从而释放拴系的IL-2以与细胞表面受体结合并引发细胞效应。
图3A示出了命名为872-5的抗FAP抗体与固定在链霉亲和素传感器上的生物素化的FAP的并通过生物层干涉测量法测量的结合动力学。对于872-5，KD值为6.6nM。
图3B示出了命名为872-59的抗FAP抗体与固定在链霉亲和素传感器上的生物素化的FAP的并通过生物层干涉测量法测量的结合动力学。对于872-59，KD值为15.5nM。
图3C示出了命名为872-70的抗FAP抗体与固定在链霉亲和素传感器上的生物素化的FAP的并通过生物层干涉测量法测量的结合动力学。对于872-70，KD值<1nM。
图4A示出了D002的单价Fab-Fc融合物与固定在链霉亲和素传感器上的生物素化的IL-2的并通过生物层干涉测量法测量的结合动力学。
图4B示出了对于D002与IL-2的相互作用，通过平衡结合分析确定的KD值为3.4μM。
图4C示出了D002的单价Fab-Fc融合物与固定在链霉亲和素传感器上的FAP的并通过生物层干涉测量法测量的结合动力学。对于D002与FAP相互作用，KD值为50nM(数据未示出)。
图5A是可溶性细胞因子多肽的示意图。
图5B至图5U是根据本公开内容的不同分子构型的抗体-细胞因子免疫缀合物的示意图。特别地，图5B示出了含有与免疫球蛋白Fc结构域中的两个重链片段中的一个(例如Fc-knob)的C末端融合的细胞因子多肽的免疫缀合物。
图5C示出了一种免疫缀合物，该免疫缀合物包含(a)抗细胞因子/抗TAA二合一Fab抗体，在其重链片段的N末端与免疫球蛋白Fc结构域的一个重链片段(例如Fc-hole)的C末端融合，和(b)与免疫球蛋白Fc结构域的另一个重链片段(例如Fc-knob)的C末端融合的细胞因子多肽。
图5D示出了一种免疫缀合物，该免疫缀合物包含(a)抗细胞因子/抗TAA二合一Fab抗体，在其重链片段的N末端与免疫球蛋白Fc结构域的一个重链片段(例如Fc-hole)的C末端融合，(b)与免疫球蛋白Fc结构域的两个重链片段中的另一个重链片段(例如Fc-knob)的C末端融合的细胞因子多肽，以及(c)与免疫球蛋白Fc结构域的两个重链片段中的一个重链片段(例如Fc-knob)的N末端融合的抗TAAscFv抗体。
图5E示出了一种免疫缀合物，该免疫缀合物包含(a)抗细胞因子/抗TAA二合一Fab抗体，在其重链片段的N末端与免疫球蛋白Fc结构域的两个重链片段中的一个重链片段(例如Fc-hole)的C末端融合，和(b)与Fab抗体的轻链片段的N末端融合的细胞因子多肽。
图5F示出了一种免疫缀合物，该免疫缀合物包含(a)抗细胞因子/抗TAA二合一Fab抗体，在其重链片段的N末端与免疫球蛋白Fc结构域的一个重链片段(例如Fc-knob)的C末端融合，(b)与免疫球蛋白Fc结构域的另一个重链片段(例如Fc-hole)的C末端融合的细胞因子多肽，以及(c)与免疫球蛋白Fc结构域的两个重链片段中的一个重链片段(例如Fc-knob)的N末端融合的抗TAA单结构域抗体。
图5G示出了一种免疫缀合物，该免疫缀合物包含(a)抗细胞因子/抗TAA二合一scFv抗体，在其重链片段的C末端与免疫球蛋白Fc结构域的一个重链片段(例如Fc-hole)的N末端融合，(b)与免疫球蛋白Fc结构域的另一个重链片段(例如Fc-knob)的C末端融合的细胞因子多肽，以及(c)与免疫球蛋白Fc结构域的两个重链片段中的一个重链片段(例如Fc-knob)的N末端融合的抗TAAFab抗体。
图5H示出了一种免疫缀合物，该免疫缀合物包含(a)抗细胞因子/抗TAA二合一Fab抗体，在其重链片段的N末端与免疫球蛋白Fc结构域的两个重链片段中的一个重链片段(例如Fc-knob)的C末端融合，(b)与Fab抗体的轻链片段的N末端融合的细胞因子多肽，以及(c)与免疫球蛋白Fc结构域的两个重链片段中的一个重链片段(例如Fc-hole)的N末端融合的抗TAAscFv抗体。
图5I示出了一种免疫缀合物，该免疫缀合物包含(a)抗细胞因子/抗TAA二合一Fab抗体，在其重链片段的N末端与免疫球蛋白Fc结构域的两个重链片段中的一个重链片段(例如Fc-hole)的C末端融合，(b)与免疫球蛋白Fc结构域的另一个重链片段(例如Fc-knob)的C末端融合的细胞因子多肽，以及(c)与免疫球蛋白Fc结构域的两个重链片段中的一个重链片段(例如Fc-knob)的N末端融合的抗TAAFab。
图5J示出了一种免疫缀合物，该免疫缀合物包含(a)抗细胞因子/抗TAA二合一Fab抗体，在其重链片段的N末端与免疫球蛋白Fc结构域的两个重链片段中的一个重链片段(例如Fc-hole)的C末端融合，(b)与Fab抗体的轻链片段的N末端融合的细胞因子肽，以及(c)与免疫球蛋白Fc结构域的两个重链片段中的一个重链片段(例如Fc-knob)的N末端融合的抗TAA scFv抗体。
图5K示出了一种免疫缀合物，该免疫缀合物包含(a)抗细胞因子/抗TAA二合一Fab抗体，在其重链片段的C末端与免疫球蛋白Fc结构域的一个重链片段(例如Fc-knob)的N末端融合，(b)与Fab抗体的重链片段的N末端融合的细胞因子肽，以及(c)抗TAA Fab抗体，在其重链片段的C末端与免疫球蛋白Fc结构域的另一个重链片段(例如Fc-hole)的N末端融合。
图5L示出了一种免疫缀合物，该免疫缀合物包含(a)抗细胞因子/抗TAA二合一Fab抗体，在其重链片段的N末端与免疫球蛋白Fc结构域的一个重链片段(例如Fc-hole)的C末端融合，(b)与免疫球蛋白Fc结构域的另一个重链片段(例如Fc-knob)的C末端融合的细胞因子多肽，以及(c)与免疫球蛋白Fc结构域的两个重链片段中的一个重链片段(例如Fc-hole)的N末端融合的抗TAA scFv抗体。
图5M示出了一种免疫缀合物，该免疫缀合物包含(a)抗细胞因子/抗TAA二合一Fab抗体，在其重链片段的N末端与免疫球蛋白Fc结构域的一个重链片段(例如Fc-hole)的C末端融合，(b)与免疫球蛋白Fc结构域的另一个重链片段(Fc-knob)的C末端融合的细胞因子肽，以及(c)与抗细胞因子/抗TAA二合一Fab抗体的重链片段的C末端融合的抗TAA scFv。
图5N示出了一种免疫缀合物，该免疫缀合物包含(a)抗细胞因子/抗TAA二合一Fab抗体，在其重链片段的C末端与免疫球蛋白Fc结构域的一个重链片段(例如Fc-hole)的N末端融合，(b)与Fab抗体的重链片段的N末端融合的细胞因子肽，以及(c)抗TAA Fab抗体，在其重链的C末端与免疫球蛋白Fc结构域的另一个重链片段(例如Fc-knob)的N末端融合。
图5O示出了一种免疫缀合物，该免疫缀合物包含(a)抗细胞因子/抗TAA二合一Fab抗体，在其重链片段的C末端与免疫球蛋白Fc结构域的一个重链片段(例如Fc-knob)的N末端融合，(b)与Fab抗体的重链片段的N末端融合的细胞因子肽，以及(c)与免疫球蛋白Fc结构域的两个重链片段中的另一个重链片段(例如Fc-hole)的N末端融合的抗TAA单结构域抗体。
图5P示出了一种免疫缀合物，该免疫缀合物包含(a)抗细胞因子/抗TAA二合一Fab抗体，在其重链片段的C末端与免疫球蛋白Fc结构域的一个重链片段(例如Fc-knob)的N末端融合，(b)与Fab抗体的重链片段的N末端融合的细胞因子肽，以及(c)与免疫球蛋白Fc结构域的两个重链片段中的另一个重链片段(例如Fc-hole)的N末端融合的抗TAA scFv抗体。
图5Q示出了一种免疫缀合物，该免疫缀合物包含(a)抗细胞因子/抗TAA二合一Fab抗体，在其重链片段的C末端与免疫球蛋白Fc结构域的一个重链片段(例如Fc-hole)的N末端融合，(b)与Fab抗体的重链片段的N末端融合的细胞因子肽，以及(c)与免疫球蛋白Fc结构域的两个重链片段中的另一个重链片段(例如Fc-knob)的N末端融合的抗TAA scFv抗体。
图5R示出了一种免疫缀合物，该免疫缀合物包含(a)抗细胞因子/抗TAA二合一Fab抗体，在其重链片段的C末端与免疫球蛋白Fc结构域的一个重链片段(例如Fc-hole)的N末端融合，(b)与Fab抗体的轻链片段的N末端融合的细胞因子肽，以及(c)与免疫球蛋白Fc结构域的两个重链片段中的另一个重链片段(例如Fc-knob)的N末端融合的抗TAA scFv抗体。
图5S示出了一种免疫缀合物，该免疫缀合物包含(a)抗细胞因子/抗TAA二合一Fab抗体，在其重链片段的C末端与免疫球蛋白Fc结构域的一个重链片段(例如Fc-knob)的N末端融合，(b)与Fab抗体的轻链片段的N末端融合的细胞因子肽，以及(c)与免疫球蛋白Fc结构域的两个重链片段中的另一个重链片段(例如Fc-hole)的N末端融合的抗TAA scFv抗体。
图5T示出了一种免疫缀合物，该免疫缀合物包含(a)抗细胞因子/抗TAA二合一Fab抗体，在其重链片段的C末端与免疫球蛋白Fc结构域的一个重链片段(例如Fc-knob)的N末端融合，(b)抗TAAFab抗体，在其重链片段的C末端与免疫球蛋白Fc结构域的另一个重链片段(例如Fc-hole)的N末端融合，以及(c)与Fab抗体的重链片段的N末端融合的细胞因子肽。
图5U示出了一种免疫缀合物，该免疫缀合物包含(a)抗细胞因子/抗TAA二合一Fab抗体，在其重链片段的C末端与免疫球蛋白Fc结构域的一个重链片段(例如Fc-knob)的N末端融合，和(b)与Fab抗体的重链片段的N末端融合的细胞因子肽。
图6A通过具有TOSH SW3000柱的HPLC示出了同种型对照抗体(DP47GS)、具有构型2的免疫缀合分子(FB-225)和裸细胞因子(Knob-IL2hex)的同质性。如图所示，比较裸细胞因子Knob-IL2hex与包含稳定细胞因子的IL-2结合抗体的免疫缀合物(FB-255)，同质性显著提高。
图6B示出了如通过差示扫描荧光法测量的对照抗体(DP47GS)、具有构型2的免疫缀合物分子(FB-FB225)、裸细胞因子(Knob-IL2hex)的热稳定性。在53℃的峰指示IL-2hex的变性，其显著右移，表明IL-2被呈免疫细胞因子分子(FB-225)形式的二合一掩蔽抗体稳定。
图6C示出了使用尺寸排阻色谱法(SEC)测量的如本文描述的包含IL-2的免疫缀合物的加速稳定性(accelerated stability)。如图所示，蛋白质在40℃储存持续四周或5轮冻融循环后保持稳定。
图7A示出了裸细胞因子(Knob-IL2hex)对照以及分别具有构型2的免疫缀合物分子(FB-476)和构型20的免疫缀合物分子(FB-559)在以各种剂量的单剂量施用至小鼠时的药代动力学。通过抗人类Fc ELISA确定蛋白质浓度。
图7B是呈如图5C所示的构型2的免疫细胞因子FB-476的示意图。FB-476包含抗细胞因子/抗hFAP二合一Fab抗体D047，其对IL2hex具有KD为约20nM的亲和力。
图7C是呈如图5U所示的构型20的免疫细胞因子FB-559的示意图。FB-559包含抗细胞因子/抗hFAP二合一Fab抗体D029突变体，其对IL2hex具有KD为约400nM的亲和力。
图8A示出了在存在分别具有如图6B和图6C所示的构型1(圆形)或构型2(上三角形；下三角形；菱形；和左三角形)的包含IL-2的免疫缀合物的情况下使用IL-2报告细胞系测量的IL-2活性。在存在裸IL-2(正方形)的情况下进行的测定被包括作为阳性对照。X轴示出了IL-2或包含IL-2的免疫缀合物的浓度(pM)；Y轴示出了使用TECAN板阅读器确定的在635nm处的吸光度(A635)，其反映了分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)水平和对IL2的应答。图8B是根据本公开内容的构型1的免疫缀合物分子的示意图。图8C是根据本公开内容的构型2的免疫缀合物分子的示意图。
图9A示出了在存在分别具有如图7B、图7C和图7D所示的构型1(正方形)、构型2(圆形)或构型4(三角形)的包含IL-2的免疫缀合物的情况下使用IL-2报告细胞系测量的IL-2活性。X轴示出了包含IL-2的免疫缀合物的浓度(pM)；Y轴示出了使用TECAN板阅读器确定的在635nm处的吸光度(A635)，其反映了分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)水平和对IL2的应答。图9B是根据本公开内容的构型1的免疫缀合物分子的示意图。图9C是根据本公开内容的构型2的免疫缀合物分子的示意图。图9D是根据本公开内容的构型4的免疫缀合物分子的示意图。
图10A示出了在存在分别具有如图8B和图8C所示的构型1(空心正方形)或构型2(带十字的空心正方形；蓝色正方形；粉色正方形；红色正方形)的包含IL-2的免疫缀合物的情况下使用IL-2报告细胞系测量的IL-2活性。在存在(粉色正方形、红色正方形)或不存在(空心正方形、带十字的空心正方形；蓝色正方形)可溶性人类成纤维细胞活化蛋白(hFAP)的情况下进行测定。在存在裸IL-2(实心正方形)的情况下进行的测定被包括作为阳性对照；在存在可溶性FAP但没有任何免疫缀合物分子(带虚线的空心正方形)的情况下进行的测定被包括作为阴性对照。X轴示出了包含IL-2的免疫缀合物的浓度(pM)；Y轴示出了使用TECAN板阅读器确定的在635nm处的吸光度(A635)，其反映了分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)水平和对IL-2的应答。图10B是根据本公开内容的构型1的免疫缀合物分子的示意图。图10C是根据本公开内容的构型2的免疫缀合物分子的示意图。
图11A示出了在存在分别具有如图9B和图9C所示的构型1(正方形)或构型3(三角形；圆形)的包含IL-2的免疫缀合物的情况下使用IL-2报告细胞系测量的IL-2活性。在存在(三角形)或不存在(正方形、圆形)细胞表面上表达人类成纤维细胞活化蛋白(hFAP)的细胞的情况下进行测定。X轴示出了包含IL-2的免疫缀合物的浓度(pM)；Y轴示出了使用TECAN板阅读器确定的在635nm处的吸光度(A635)，其反映了分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)水平和对IL-2的应答。图11B是根据本公开内容的构型1的免疫缀合物分子的示意图。图11C是根据本公开内容的构型3的免疫缀合物分子的示意图。
图11D示出了在存在分别具有如图9B和图9C所示的构型1(正方形)或构型3(三角形；圆形)的包含IL-2的免疫缀合物的情况下使用IL-2报告细胞系测量的IL-2活性。在有(蓝色三角形、红色三角形、大小为1-4的六边形)或没有(正方形、圆形)在细胞表面上表达人类成纤维细胞活化蛋白(hFAP)的细胞，以及有(红色三角形、大小为1-4的六边形)或没有(正方形、圆形、上三角形、蓝色三角形)可溶性FAP分子的情况下进行测定。X轴示出了包含IL-2的免疫缀合物的浓度(pM)；Y轴示出了使用TECAN板阅读器确定的在635nm处的吸光度(A635)，其反映了分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)水平和对IL-2的应答。
图11E示出了在存在分别具有如图9B和图9C所示的构型1(正方形)或构型3(三角形；圆形)的包含IL-2的免疫缀合物的情况下使用IL-2报告细胞系测量的IL-2活性。在有(下三角形、菱形、五边形、六边形)或没有(正方形、圆形、上三角形)在细胞表面上表达人类成纤维细胞活化蛋白(hFAP)的细胞，以及有(菱形、五边形、六边形)或没有(正方形、圆形、上三角形、下三角形)可溶性抗体的情况下进行测定。X轴示出了包含IL-2的免疫缀合物的浓度(pM)；Y轴示出了使用TECAN板阅读器确定的在635nm处的吸光度(A635)，其反映了分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)水平和对IL-2的应答。
图12A示出了在存在分别具有如图10B和图10C所示的构型1(实心正方形；空心正方形)或构型2(实心三角形；空心三角形)的包含IL-2的免疫缀合物的情况下使用IL-2报告细胞系测量的IL-2活性。在存在未修饰的HEK293T细胞(实心正方形、空心正方形、空心三角形)或在细胞表面上表达人类成纤维细胞活化蛋白(hFAP)的HEK293T细胞(实心三角形)的情况下进行测定。X轴示出了包含IL-2的免疫缀合物的浓度(pM)；Y轴示出了使用TECAN板阅读器确定的在635nm处的吸光度(A635)，其反映了分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)水平和对IL-2的应答。图12B是根据本公开内容的构型1的免疫缀合物分子的示意图。图12C是根据本公开内容的构型2的免疫缀合物分子的示意图。
图13A示出了在存在具有如图13B所示的构型3的包含IL-2的免疫缀合物的情况下使用IL-2报告细胞系测量的IL-2活性。在存在(实线、空心圆和空心三角形)或不存在(实线、实心圆和实心三角形)细胞表面上表达人类成纤维细胞活化蛋白(hFAP)的细胞的情况下进行测定。X轴示出了包含IL-2的免疫缀合物的浓度(pM)；Y轴示出了使用TECAN板阅读器确定的在635nm处的吸光度(A635)，其反映了分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)水平和对IL-2的应答。两种测试的免疫缀合物分子(FB-387)和(FB-392)都呈构型3，包含相同的二合一FabD029。FB-387的锚定部分是scFv5，scFv5对hFAP具有的KD为约5nM并且与hFAP上与D029不同的表位结合；FB-392的锚定部分是scFv70，scFv70与hFAP具有的KD为约1nM并且与hFAP上与D029相同的表位结合。在存在或不存在hFAP表达细胞的情况下，两种分子都示出类似的活性。
图13B示出了根据本公开内容的构型3的免疫缀合物分子的示意图。
图14是包含在本公开内容的免疫缀合物分子中的IL2的可溶性FAP诱导的去屏蔽的示意图。两个FAP结合部分(锚定部分和二合一掩蔽部分)的同时接合能够使细胞因子肽从掩蔽部分解离，并且能够与5UTZ结合，5UTZ是图中所示的人类IL-2/Fab复合物。
图15示出了四种免疫缀合物分子FB-604、FB-675、FB-676和FB-626中固定的5UTZ与去屏蔽的IL2hex的生物层干涉测量(BLI)结合曲线。
图16示出了固定的5UTZ分子与可溶性Fc-hFAP和Knob-IL2hex的生物层干涉测量(BLI)结合曲线。
图17A示出了免疫缀合物分子FB-604的生物层干涉测量(BLI)曲线，FB-604能够在存在可溶性Fc-hFAP的情况下与固定的5UTZ分子结合，但在不存在可溶性Fc-hFAP的情况下不能与固定的5UTZ分子结合。
图17B是呈构型2的免疫缀合物分子FB-604的示意图。FB-604中的二合一抗体与FAP结合，KD值为约1.53nM，并且与IL2hex结合，KD值为约1.59μM。
图18A示出了免疫缀合物分子FB-675的生物层干涉测量(BLI)曲线，FB-675能够在存在可溶性Fc-hFAP的情况下与固定的5UTZ分子结合，但在不存在可溶性Fc-hFAP的情况下不能与固定的5UTZ分子结合。
图18B是呈构型3的免疫缀合物分子FB-675的示意图。FB-675中的二合一抗体与FAP结合，KD值为约3.66nM，并且与IL2hex结合，KD值为约217nM。Fb-675中的锚定部分与FAP结合，KD为约5nM。
图19A示出了免疫缀合物分子FB-676的生物层干涉测量(BLI)曲线，FB-676能够在存在可溶性Fc-hFAP的情况下与固定的5UTZ分子结合，但在不存在可溶性Fc-hFAP的情况下不能与固定的5UTZ分子结合。
图19B是呈构型3的免疫缀合物分子FB-676的示意图。FB-675中的二合一抗体与FAP结合，KD为约1.53nM，并且与IL2hex结合，KD为约1.59μM。锚定部分与FAP结合，KD为约5nM。
图20A示出了免疫缀合物分子FB-626的生物层干涉测量(BLI)曲线，FB-626在存在或不存在可溶性Fc-hFAP的情况下都不能与固定的5UTZ分子结合。
图20B是呈构型14的免疫缀合物分子FB-626的示意图。FB-626中的二合一抗体与FAP结合，KD大于约5nM，并且与IL2hex结合，KD为约237μM。
图21A示出了在存在具有如图21B和图21C所示的构型1(正方形)或构型3(实心圆、实心三角形、空心圆、空心三角形)的包含IL-2的免疫缀合物的情况下使用IL-2报告细胞系测量的IL-2活性。在有(空心圆、空心三角形)或没有(正方形、实心圆、实心三角形)在细胞表面上表达人类成纤维细胞活化蛋白(hFAP)的HEK293T细胞的情况下进行测定。X轴示出了包含IL-2的免疫缀合物的浓度(pM)；Y轴示出了使用TECAN板阅读器确定的在635nm处的吸光度(A635)，其反映了分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)水平和对IL-2的应答。图21B是根据本公开内容的构型1的免疫缀合物分子的示意图。图21C是根据本公开内容的构型3的免疫缀合物分子的示意图。
图22A示出了在存在或不存在FAP表达细胞HEK 293T-hFAP-E5的情况下使用IL-2报告细胞系测量的IL-2活性。两种测试的免疫缀合物分子都具有如图22B所示的构型3，并且含有具有scFv872-5的相同的锚定部分。两种测试的免疫缀合物分子分别具有包含不同掩蔽部分的二合一抗体D001和D002。如图所示，在不存在hFAP表达细胞的情况下，两种免疫缀合物分子对细胞因子具有类似的掩蔽作用。此外，在存在hFAP表达细胞的情况下，两种免疫缀合物分子都能够去屏蔽(de-shield)并激活细胞因子活性。
图22B是根据本公开内容的构型3的免疫缀合物分子的示意图。
图23A示出了在存在或不存在FAP表达细胞HEK 293T-hFAP-E5的情况下使用IL-2报告细胞系测量的IL-2活性。两种测试的免疫缀合物分子都具有如图23B所示的构型3，并且含有包含scFv872-59的相同的锚定部分。两种测试的免疫缀合物分子分别具有包含不同掩蔽部分的二合一抗体D001和D002。如图所示，在不存在hFAP表达细胞的情况下，两种免疫缀合物分子对细胞因子具有类似的掩蔽作用。此外，在存在hFAP表达细胞的情况下，两种免疫缀合物分子都能够去屏蔽并激活细胞因子活性。
图23B是根据本公开内容的构型3的免疫缀合物分子的示意图。
图24A示出了在存在或不存在FAP表达细胞HEK 293T-hFAP-E5的情况下使用IL-2报告细胞系测量的IL-2活性。两种测试的免疫缀合物分子都具有如图24B所示的构型3，并且含有包含scFv872-70的相同的锚定部分。两种测试的免疫缀合物分子分别具有包含不同掩蔽部分的二合一抗体D001和D002。如图所示，在不存在hFAP表达细胞的情况下，两种免疫缀合物分子对细胞因子具有类似的掩蔽作用。此外，在存在hFAP表达细胞的情况下，两种免疫缀合物分子都能够去屏蔽并激活细胞因子活性。
图24B是根据本公开内容的构型3的免疫缀合物分子的示意图。
图25A示出了在存在分别具有如图12B和图12C所示的构型1(圆形、正方形)或构型5(空心菱形、实心菱形)的包含IL-2的免疫缀合物的情况下使用IL-2报告细胞系测量的IL-2活性。在有(实心菱形)或没有(正方形、圆形、空心菱形)在细胞表面上表达人类成纤维细胞活化蛋白(hFAP)的HEK293T细胞的情况下进行测定。X轴示出了包含IL-2的免疫缀合物的浓度(pM)；Y轴示出了使用TECAN板阅读器确定的在635nm处的吸光度(A635)，其反映了分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)水平和对IL-2的应答。图25B是根据本公开内容的构型1的免疫缀合物分子的示意图。图25C是根据本公开内容的构型5的免疫缀合物分子的示意图。
图26A示出了在存在分别具有如图13B和图13C所示的构型1(圆形、正方形)或构型6(空心菱形、空心下三角形、空心左三角形、实心菱形、实心下三角形、实心左三角形)的包含IL-2的免疫缀合物的情况下使用IL-2报告细胞系测量的IL-2活性。在有(空心菱形、空心下三角形、空心左三角形)或没有(正方形、圆形、实心菱形、实心下三角形、实心左三角形)在细胞表面上表达人类成纤维细胞活化蛋白(hFAP)的HEK293T细胞的情况下进行测定。X轴示出了包含IL-2的免疫缀合物的浓度(pM)；Y轴示出了使用TECAN板阅读器确定的在635nm处的吸光度(A635)，其反映了分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)水平和对IL-2的应答。图26B是根据本公开内容的构型1的免疫缀合物分子的示意图。图26C是根据本公开内容的构型6的免疫缀合物分子的示意图。图26D是柱状图，示出研究中用于测定的定量EC50(pM)值。
图27A示出了对于两种免疫缀合物分子FB-676和FB-707在存在或不存在FAP表达细胞HEK 293T-hFAP-E5的情况下使用IL-2报告细胞系测量的IL-2活性。对于屏蔽的FB-676，EC50为约14nM，并且对于去屏蔽的FB-676，EC50为约40pM；对于屏蔽的FB-707，EC50为约12nM，并且对于去屏蔽的FB-707，EC50为约11pM。与不存在FAP表达细胞相比，在存在FAP表达细胞的情况下IL-2效力增加约700倍至1000倍。
图27B是呈构型15的免疫缀合物分子FB-707的示意图。FB-707中的二合一抗体与FAP结合，KD为约1.53nM，并且与IL2hex结合，KD为约1.59μM。锚定部分与FAP结合，KD为约5nM。
图27C是呈构型3的免疫缀合物分子FB-676的示意图。FB-675中的二合一抗体与FAP结合，KD为约1.53nM，并且与IL2hex结合，KD为约1.59μM。锚定部分与FAP结合，KD为约50nM。
图28A示出了如使用pSTAT5染色测定法测量的用本公开内容的免疫缀合物分子的人类CD4+T细胞的活化。在存在或不存在200nM Fc-hFAP的情况下，测量免疫缀合物分子FB-604、FB-674、FB-675和FB-676刺激预活化的人类CD4+T细胞的能力。如图所示，在用不具有锚定部分的免疫缀合物分子FB-604的情况下，IL2hex的效力增加约2倍，并且对于具有锚定部分的所有其他测试的免疫缀合物分子，IL2hex的效力增加约10倍。
图28B示出了如使用pSTAT5染色测定法测量的用本公开内容的免疫缀合物分子的人类CD4+T细胞的活化。在存在或不存在200nM Fc-hFAP的情况下，测量免疫缀合物分子FB-801、FB-794、FB-818和FB-834刺激预活化的人类CD4+T细胞的能力。如图所示，对于具有锚定部分的所有测试的免疫缀合物分子，IL2hex的效力增加约30倍。
图29A示出了如使用pSTAT5染色测定法测量的用本公开内容的免疫缀合物分子的人类CD4+T细胞的活化。在存在或不存在200nM Fc-hFAP的情况下，测量免疫缀合物分子FB-611、FB-610、FB-609、FB-608、FB-607、FB-601、FB-600、FB-599、FB-598、FB-676、FB-675、FB-674和FB-604刺激预活化的人类CD4+T细胞的能力。
图29B示出了如通过图Q-A的测定测量的EC50值的定量。
图30示出了Knob-IL2hex对C57BL/6J和CB-17SCID小鼠的急性毒性，如以死亡(左)和体重减轻(右)测量的。
图31A示出了以下四种蛋白质样品的非还原和还原SDS-PAGE凝胶中的纯化的免疫缀合物分子：对照(Knob-IL2hex，MW＝66.8kDa)、FB-439(MW＝92.3kDa)、FB-449(MW＝120kDa)、FB-476(MW＝116kDa)。
图31B至图31D分别示出了如通过CTLL2增殖测定、NK92增殖测定和HEK Blue IL2活化测定测量的免疫缀合物分子FB-439、FB-449和FB-476的效力。
图31E示出了用本公开内容的免疫缀合物分子的人类CD4+T细胞的增殖，如通过Alarma Blue荧光测量的。免疫缀合物分子FB-794刺激预激活的人类CD4+T细胞的能力通过存在或不存在200nM Fc-hFAP，并在表面上有或没有hFAP受体的情况下与40k固定的ExpiCHO细胞共培养来测量。
图32A示出了施用以下免疫缀合物分子的小鼠的死亡(左)和体重减轻(右)的测量结果：对照(Knob-IL2hex)、FB-439、FB-449、FB-476。
图32B示出了施用免疫缀合物分子sKnob-IL2hex(对照)、FB-439、FB-476或PBS(对照)的小鼠的体重减轻的测量结果。
图33A是IL-2分子与IL-2Rα、IL-2Rβ和IL-2Rγ亚基结合的3D图示(PDB:2ERJ)。
图33B和图33C示出了与两种另外的IL-2抗体(即阻断IL-2与IL-2Rβ的结合的5UTZ(CD122)和阻断IL-2与IL-2Rα的结合的NARA1(CD25))相比，二合一抗体(B10)分别与IL-2和FAP的结合动力学。B10与IL2在如NARA1而不是5UTZ的重叠表位结合。
图34A示出了对于免疫缀合物分子FB-1097，在存在或不存在FAP表达细胞的情况下使用IL-2报告细胞系测量的IL-2活性。测试的免疫缀合物具有如图34B所示的构型15。免疫缀合物包含IL-2中的点突变(T3A、K35E、F42A、Y45A、L72G、C125S)。免疫缀合物还包含D029 Fab的变体作为掩蔽部分和scFv 872-5的变体作为锚定部分。在野生型IL-2(实心圆)和突变型IL-2hex(正方形)两者的情况下，具有构型1的IL-2Fc融合蛋白被包括作为对照。在存在细胞表面上表达人类成纤维细胞活化蛋白(hFAP)的细胞(HEK 293T-hFAP-E5；下三角形)的情况下进行测定，或在存在不表达FAP的细胞(HEK 293T，上三角形)的情况下进行测定。X轴示出了包含IL-2的免疫缀合物的浓度(pM)；Y轴示出了使用TECAN板阅读器的免疫缀合物的活性，其反映了分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)水平和对IL-2的应答。图34C示出了施用媒介物(PBS)、CTRL-IL2hex、55μg FB-1097或220μg FB1097的C57BL/6小鼠中MC38-FAP肿瘤模型的肿瘤尺寸和体重。
图34D示出了施用媒介物(PBS)、12.5μg CTRL-IL2WT、12.5μg CTRL-IL2hex或220μg FB-1097的C57BL/6小鼠的MC38-FAP肿瘤模型中CD3+CD4+细胞、CD3+CD8+细胞和NK细胞的全身扩增。图34E示出了施用媒介物(PBS)、12.5μg CTRL-IL2WT、12.5μg CTRL-IL2hex或220μg FB-1097的C57BL/6小鼠的MC38-FAP肿瘤模型中的肺重量。
图35A示出了对于免疫缀合物分子#1112，在存在或不存在FAP表达细胞的情况下使用IL-2报告细胞系测量的IL-2活性。测试的免疫缀合物具有如图35B所示的构型14。免疫缀合物含有IL-2中的点突变(T3A、K35E、F42A、C125S)。免疫缀合物还含有D029H和D029L掩蔽部分和锚定部分VHH-E33。在野生型IL-2(圆形)和突变型IL-2hex(实心正方形)两者的情况下，具有构型1的IL-2Fc融合蛋白被包括作为对照。在存在细胞表面上表达人类成纤维细胞活化蛋白(hFAP)的细胞(HEK 293T-hFAP-E5；空心正方形)的情况下进行测定，或在存在不表达FAP的细胞(HEK 293T；三角形)的情况下进行测定。X轴示出了包含IL-2的免疫缀合物的浓度(pM)；Y轴示出了使用TECAN板阅读器的免疫缀合物的活性，其反映了分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)水平和对IL-2的应答。
图35C示出了施用媒介物(PBS)、25μg CTRL-IL2 F42A、55μg FB-1112或220μg FB-1112的C57BL/6小鼠的MC38-FAP肿瘤模型中的肿瘤尺寸和体重。
图35D示出了施用媒介物(PBS)、12.5μg CTRL-IL2hex、12.5μg FB-1112或220μgFB-1112的C57BL/6小鼠的MC38-FAP肿瘤模型中CD3+CD4+细胞、CD3+CD8+细胞和NK细胞的全身扩增。
图35E示出了施用媒介物(PBS)、12.5μg CTRL-IL2hex、55μg FB-1112或220μg FB-1112的C57BL/6小鼠的MC38-FAP肿瘤模型中的肺重量。
图36A示出了对于免疫缀合物分子#1150，在存在或不存在FAP表达细胞的情况下使用IL-2报告细胞系测量的IL-2活性。测试的免疫缀合物具有如图36B所示的构型14。免疫缀合物还含有衍生自抗体B10的Fab作为掩蔽部分和锚定部分VHH-E33。在野生型IL-2(实心圆)和突变型IL-2hex(空心圆)两者的情况下，具有构型1的IL-2Fc融合蛋白被包括作为对照。在存在细胞表面上表达人类成纤维细胞活化蛋白(hFAP)的细胞(B-MC38-FAP；空心上三角形)的情况下进行测定，或在存在不表达FAP的细胞(MC38；实心上三角形)的情况下进行测定。X轴示出了包含IL-2的免疫缀合物的浓度(pM)；Y轴示出了使用TECAN板阅读器的免疫缀合物的活性，其反映了分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)水平和对IL-2的应答。
图36C至图36D示出了在施用媒介物(PBS)、12.5μg CTRL-IL2D20T或55μg FB-1150的C57BL/6小鼠的MC38-FAP肿瘤模型中测量肿瘤尺寸(图36C)、存活率(图36D)和体重变化(图36E)。
图37A示出了对于免疫缀合物分子#1125，在存在或不存在FAP表达细胞的情况下使用IL-2报告细胞系测量的IL-2活性。测试的免疫缀合物具有如图37B所示的构型14。免疫缀合物还含有衍生自抗体B10的Fab作为掩蔽部分和锚定部分scFv872-5。在野生型IL-2(实心圆)和突变型IL-2hex(空心圆)两者的情况下，具有构型1的IL-2Fc融合蛋白被包括作为对照。在存在细胞表面上表达人类成纤维细胞活化蛋白(hFAP)的细胞(B-MC38-FAP；空心上三角形)的情况下进行测定，或在存在不表达FAP的细胞(MC38；实心上三角形)的情况下进行测定。X轴示出了包含IL-2的免疫缀合物的浓度(pM)；Y轴示出了使用TECAN板阅读器的免疫缀合物的活性，其反映了分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)水平和对IL-2的应答。
图37C示出了在施用PBS、12.5μg CTRL D20T或220μg FB-1125的C57BL/6小鼠的MC38肿瘤模型中的肿瘤体积。
图37D示出了在施用12.5μg CTRL D20T、55μg FB-1125或55μg FB-1125和100μgsi-4B9的C57BL/6小鼠的MC38-FAP肿瘤模型中的肿瘤体积。
图38A和图38B示出了通过筛选免疫缀合物分子A和相应的分子构型，使用IL-2报告细胞系在各种细胞中测量的IL-2活性。免疫缀合物分子A包含IL-2部分、能够与IL-2和EpCAM结合的二合一掩蔽部分(衍生自抗体FL78的Fab)和抗EpCAM锚定部分(衍生自MOC31的scFv)。在存在细胞表面上表达EpCAM的HEK 293T EpCAM(高)细胞的情况下进行测定。不表达EpCAM的HEK 293T细胞。分子A具有与构型15相同的支架。X轴示出了包含IL-2的免疫缀合物的浓度(pM)；Y轴示出了使用TECAN板阅读器确定的在635nm处的吸光度(A635)，其反映了分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)水平和对IL2的应答。
图38C示出了固定的EpCAM和突变的IL2 IL-2hex(K35E)分子与图38A所示的免疫缀合物分子A的生物层干涉测量(BLI)结合曲线。
5.详述
本公开内容提供了包含细胞因子多肽的免疫缀合物分子。在某些实施方案中，本公开内容还提供了包含编码这样的免疫缀合物分子的序列的多核苷酸和载体，以及包含这样的免疫缀合物分子的组合物、试剂和试剂盒。在相关方面中，本文还提供了通过使用根据本公开内容的免疫缀合物分子递送和/或激活靶位点处的细胞因子活性，或降低受试者中与全身暴露于细胞因子活性相关的毒性和/或其他副作用的方法。
在某些实施方案中，本公开内容还提供了可以形成本公开内容的这样的免疫缀合物分子的一部分的肽或多肽，诸如抗体或其抗原结合片段。在具体实施方案中，本文提供了结合蛋白，包括与纤维化活化蛋白(FAP)结合的抗体或其片段。在具体实施方案中，本文提供了双特异性结合蛋白，包括与FAP和白细胞介素-2(IL-2)二者结合的二合一抗体或其片段。
5.1一般技术
本文描述或引用的技术和程序包括本领域技术人员通常很好理解和/或通常使用常规方法使用的那些技术和程序，诸如例如在Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2001，第3版)；Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人.编著,2003)；Therapeutic Monoclonal Antibodies:From Bench to Clinic(An编著.2009)；Monoclonal Antibodies:Methods and Protocols(Albitar编著2010)；Phage Display in Biotechnology and Drug Discovery(Sidhu和Geyer编著,第2版.2005)；Phage Display:a Laboratory Manual(Barbas等人.编著,2004)；以及Antibody Engineering第1和2卷(Kontermann和Dübel等人,第2版.2010)中描述的广泛使用的方法。
5.2术语
除非另外描述，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。为了解释本说明书的目的，以下术语的描述将适用，并且在适当的时候，以单数形式使用的术语也将包括复数，并且反之亦然。所有专利、申请、公布的申请和其他出版物都通过引用以其整体并入。在阐述的术语的任何描述与通过引用并入本文的任何文件相冲突的情况下，应以下文阐述的术语的描述为准。
除非上下文另外清楚地指出，否则如本文使用的单数术语“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数指示物。
除非另外指出，否则术语“寡核苷酸”和“核酸”可互换地使用，并且以5’到3’的方向从左到右书写；氨基酸序列分别以氨基到羧基的方向从左到右书写。因此，一般来说，在寡核苷酸的5’-末端的密码子将对应于并入到翻译的蛋白质或肽产物中的N末端氨基酸残基。类似地，一般来说，在寡核苷酸的3’-末端的密码子将对应于并入到翻译的蛋白质或肽产物中的C末端氨基酸残基。应理解本公开内容不限于所描述的特定方法、方案和试剂，因为根据本领域技术人员使用其的情况，这些可以改变。
除非另外指出，否则如本文使用的术语“白细胞介素-2”或“IL-2”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然IL-2，脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人类)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语涵盖未加工的IL-2以及在细胞中由加工产生的任何形式的IL-2。该术语还涵盖天然存在的IL-2变体，例如剪接变体或等位基因变体。示例性人类IL-2的氨基酸序列为
未加工的人类IL-2另外包含N末端20个氨基酸的信号肽(加下划线，在成熟的IL-2分子中不存在)，并且具有如下所示的序列
不受理论束缚，预期IL-2多肽与IL-2受体(IL-2R)在IL-2受体复合物的α-亚基、β-亚基和/或γ-亚基处结合。此外，预期参与与IL-2Rα(CD-25)结合的IL-2的区域包括：P34K35R38T41F42K43F44Y45E61E62K64P65E68V69N71L72Q74Y107D109参与与IL-2Rβ(CD122)结合的IL-2的区域包括：L12Q13E15H16L19D20M23R81D84D87N88V91I92E95并且参与与IL-2Rγ(CD-132)结合的IL-2的区域包括：Q11L12E15L18L19Q22K48T51E110N119R120I122T123Q126S127I129 S130T131T133其中括号中的数字是从具有蛋白质数据库ID2B5I的IL-2受体蛋白质复合物计算的埋藏表面积。
如本文使用的术语“IL-2突变体”或“突变IL-2多肽”意图涵盖IL-2分子的各种形式的任何突变体形式，包括全长IL-2、IL-2的截短形式和IL-2多肽在其序列中含有一个或更多个氨基酸突变的形式。“全长”，当用于提及IL-2时，意图意指成熟的、天然长度的IL-2分子。例如，全长人类IL-2是指具有133个氨基酸的分子(参见例如SEQ ID NO:1)。IL-2突变体的各种形式的特征在于具有至少一个影响IL-2与CD25的相互作用的氨基酸突变。该突变可能涉及通常位于该位置的野生型氨基酸残基的取代、缺失、截短或修饰。除非另外指出，否则IL-2突变体在本文中可以被称为IL-2突变体肽序列、IL-2突变体多肽、IL-2突变体蛋白或IL-2突变体类似物。IL-2的各种形式的命名在本文中关于SEQ ID NO:1中所示的序列进行。在本文中可以使用各种命名来指示相同的突变。例如，从位置42处的苯丙氨酸到丙氨酸的突变可以指示为42A、A42、A42、F42A或Phe42Ala。“IL-2hex”的命名是指如下所示的人类IL-2的突变体形式，其包含人类IL-2序列中的ΔA1/T3A/F42A/Y45A/L72G/C125S突变(氨基酸取代加下划线且加粗)： 突变的氨基酸残基的位置的编号是根据野生型人类IL-2序列(SEQ ID NO:1)。不受理论束缚，设想了突变ΔA1去除成熟形式的IL-2的N末端残基；突变T3A去除潜在的糖基化位点；F42A/Y45A/L72G突变减少IL-2与CD25的结合；并且C125S突变去除IL-2中未配对的半胱氨酸。
不受理论束缚，设想了IL-2多肽的负责IL-2与一个IL-2R亚基相互作用的区域中的突变可能影响IL-2与该IL-2R亚基的结合，而不影响IL-2R与另一个IL-2R亚基的结合。例如，已知各种IL-2突变不利地影响IL-2与IL-2Rα(CD25)的结合，所述突变包括但不限于K35E、R38A、R38D、R38E、F42A、F42K、K43E、Y45A、E61R、E62A、L72G或其组合。例如，F42A单突变已被证明将IL-2与IL-2α的结合减少约100倍，而(a)F42A/Y45A/L72G、(b)R38D/K43E/E61R或(c)R38A/F42A/Y45A/E62A的组合已被证明完全消除IL-2与IL-2α的结合。已知各种IL-2突变不利地影响IL-2与IL-2Rβ(CD122)的结合，所述突变包括但不限于D20T、D20G、D20A、H16E、H16R、H16A、N88D、N88S、N88R、V91G、V91A、V91R、V91S或其组合。已知各种IL-2突变影响IL-2与IL-2Rγ(CD132)的结合，所述突变包括但不限于L18R，Q22E，T123A，Q126X，其中X＝H、M、K、R、E、S、G、A、C、D、I或T，I129V，S130A，S130R或其组合。影响与IL-2Rγ的结合的IL-2突变的组合已被用于产生IL-2信号传导的激动剂和抑制剂。例如，Q126T突变与Q74H/L80F/R81D/L85V/I92F突变的组合已被证明增强了IL-2与IL-2Rγ的结合，并且可以充当IL-2受体信号传导的部分激动剂。对于另一个实例，IL-2的L18R/Q22E/Q126T/S130R突变组合已被证明消除了IL-2信号传导，并且可以用于抑制野生型IL-2的信号传导。
可以与本公开内容关联使用的另外的示例性IL-2突变体还包括：IL2 C125S(残基1-153，无信号肽，氨基酸取代加下划线和加粗)，具有序列
IL2 C125A(残基1-153，无信号肽，氨基酸取代加下划线和加粗)，具有序列
IL2-F42A/Y45A/L72G/C125A(残基1-153，无信号肽，氨基酸取代加下划线和加粗)，具有序列
IL2-R38A/F42A/Y45A/E62A/C125S(残基1-153，氨基酸取代加下划线和加粗)，具有序列
IL2-T3A/R38E/F42A/C125S(残基1-153，氨基酸取代加下划线和加粗)，具有序列
IL2-T3A/R38E/Y45A/C125S(残基1-153，氨基酸取代加下划线和加粗)，具有序列
IL2-T3A/R38E/L72G/C125S(残基1-153，氨基酸取代加下划线和加粗)，具有序列
IL2-ΔA2/T3A/F42A/Y45A/L72G/C125S(残基2-153，无信号肽“hex”，氨基酸取代加下划线和加粗)，具有序列
IL2-ΔA2/T3A/K35E/F42A/Y45A/L72G/C125S(残基2-153，无信号肽“hex/K35E”，氨基酸取代加下划线和加粗)，具有序列
IL2-T3A/K35E/F42A/Y45A/L72G/C125S(残基1-153，无信号肽，氨基酸取代加下划线和加粗)，具有序列
IL2-T3A/K35E/F42A/C125S(残基1-153，无信号肽，氨基酸取代加下划线和加粗)，具有序列
IL2-T3A/D20T/K35E/C125S(残基1-153，无信号肽，氨基酸取代加下划线和加粗)，具有序列
和
IL2-T3A/H16A/K35E/C125S(残基1-153，无信号肽，氨基酸取代加下划线和加粗)，具有序列
可以与本公开内容关联使用的另外的突变IL-2多肽包括在例如美国专利第10,184,009号和第5,229,109号以及国际专利公布第WO2012107417A1号中描述的那些，这些专利中的每一篇的公开内容通过引用以其整体包含在本文中。
如本文使用的，IL-2的“野生型”形式是除了野生型形式在突变IL-2多肽的每个氨基酸位置处具有野生型氨基酸之外，在其他方面与突变IL-2多肽相同的IL-2的形式。例如，如果IL-2突变体是全长IL-2(即未与任何其他分子融合或缀合的IL-2)，则该突变体的野生型形式是全长天然IL-2。如果IL-2突变体是IL-2和IL-2下游编码的另一种多肽(例如抗体链)之间的融合体，则该IL-2突变体的野生型形式是与相同下游多肽融合的具有野生型氨基酸序列的IL-2。此外，如果IL-2突变体是IL-2的截短形式(IL-2的非截短部分内的突变或修饰的序列)，那么该IL-2突变体的野生型形式是具有野生型序列的类似截短的IL-2。出于比较各种形式的IL-2突变体与对应的野生型形式的IL-2的IL-2受体结合亲和力或生物活性的目的，术语野生型涵盖包含一个或更多个氨基酸突变的IL-2形式，与天然存在的天然IL-2相比，该氨基酸突变不影响IL-2受体结合，诸如例如，在对应于人类IL-2的残基125的位置处的半胱氨酸取代为丙氨酸。在根据本发明的某些实施方案中，与突变IL-2多肽进行比较的野生型IL-2多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
除非另外指出，否则如本文使用的术语“CD25”或“IL-2受体的α-亚基”或“IL-2Rα”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然CD25，脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人类)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语涵盖“全长”、未加工的CD25以及在细胞中由加工产生的任何形式的CD25。该术语还涵盖天然存在的CD25变体，例如剪接变体或等位基因变体。在某些实施方案中，CD25是人类CD25。示例性的人类CD25的氨基酸序列(具有信号序列，加下划线)在下文示出：
除非另外指出，否则如本文使用的术语“CD122”或“IL-2受体的β-亚基”或“IL-2Rβ”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然CD122，脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人类)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语涵盖“全长”、未加工的CD122以及在细胞中由加工产生的任何形式的CD122。该术语还涵盖天然存在的CD122变体，例如剪接变体或等位基因变体。在某些实施方案中，CD122是人类CD122。示例性的人类CD122的氨基酸序列在下文示出：
除非另外指出，否则如本文使用的术语“CD132”或“IL-2受体的γ-亚基”或“IL-2Rγ”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然CD132，脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人类)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语涵盖“全长”、未加工的CD132以及在细胞中由加工产生的任何形式的CD132。该术语还涵盖天然存在的CD132变体，例如剪接变体或等位基因变体。在某些实施方案中，CD132是人类CD132。示例性的人类CD132的氨基酸序列(具有信号序列，加下划线)在下文示出：
如本文使用的术语“高亲和力IL-2受体”是指IL-2受体的异源三聚体形式，由受体γ亚基(也称为普通细胞因子受体γ亚基、γc或CD132)、受体β亚基(也称为CD122或p70)和受体α亚基(也称为CD25或p55)或其功能变体组成。相比之下，术语“中间亲和力IL-2受体”是指仅包括γ-亚基和β-亚基而不包括α-亚基的IL-2受体或其功能变体(综述参见例如Olejniczak和Kasprzak,Med Sci Monit 14,RA 179-189(2008))。
如本文使用的术语“肿瘤相关抗原”或“TAA”是指由癌细胞或在实体瘤的基质中表达的抗原。TAA可以是蛋白质、核酸、脂质或其他抗原。在某些实施方案中，TAA可以是细胞表面表达的TAA。在实体瘤的情况下，TAA可以在实体瘤块的基质中表达。如本文使用的术语“基质”是指实体肿瘤块中除癌细胞之外的组分。例如，基质可以包括成纤维细胞、上皮细胞、其他血管组分或细胞外基质组分。如本文使用的，术语“基质”不包括免疫系统的组分，诸如免疫细胞(例如，B细胞、T细胞、树突状细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞等)。本领域中已知各种TAA。可以使用本领域已知的方法进行鉴定TAA，所述方法诸如Zhang等人,MethodsMol.Biol.,520:1-10(2009)中公开的方法；其内容通过引用包含在本文中。
除非另外指出，否则如本文使用的术语“成纤维细胞活化蛋白”或“FAP”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然FAP，脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人类)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语涵盖未加工的FAP以及在细胞中由加工产生的任何形式的FAP。该术语还涵盖天然存在的FAP变体，例如剪接变体或等位基因变体。示例性的人类FAP的氨基酸序列在下文示出：
术语“肿瘤微环境”是指为肿瘤过程存活、扩增和/或扩散创造结构和/或功能环境的肿瘤形成环境的任何和所有要素。作为非限制性实例，肿瘤微环境由包围和/或滋养一个或更多个肿瘤细胞(诸如实体瘤)的细胞、分子、成纤维细胞、细胞外基质和/或血管构成。在某些实施方案中，肿瘤疾病是实体瘤。肿瘤微环境中的示例性细胞或组织包括但不限于肿瘤脉管系统、肿瘤浸润性淋巴细胞、成纤维细胞网状细胞、内皮祖细胞(EPC)、癌症相关成纤维细胞、周细胞、其他基质细胞、细胞外基质(ECM)的组分、树突状细胞、抗原呈递细胞、T细胞、调节性T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和位于肿瘤附近的其他免疫细胞。影响肿瘤微环境的示例性细胞功能包括但不限于细胞因子和/或趋化因子的产生、对细胞因子的应答、抗原加工和肽抗原的呈递、白细胞趋化性和迁移的调节、基因表达的调节、补体激活、信号传导途径的调节、细胞介导的细胞毒性、细胞介导的免疫、体液免疫应答和先天免疫应答等。
术语“抗体”、“免疫球蛋白”或“Ig”在本文中可互换地使用且在最广泛的意义上使用，并且具体涵盖例如由至少两种完整抗体、单链抗体和抗体片段形成的单个单克隆抗体(包括激动剂、拮抗剂、中和抗体、全长或完整单克隆抗体)、具有多表位或单表位特异性的抗体组合物、多克隆或单价抗体、多价抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体，只要它们表现出期望的生物活性)，如下文描述的。抗体可以是人类的、人源化的、嵌合的和/或亲和成熟的，以及来自其他物种例如小鼠和兔等的抗体。术语“抗体”意图包括多肽的免疫球蛋白类中B细胞的多肽产物，其能够与特定的分子抗原结合并且由两对相同的多肽链组成，其中每对具有一条重链(约50kDa-70kDa)和一条轻链(约25kDa)，每条链的每个氨基末端部分包括约100个至约130个或更多个氨基酸的可变区，并且每条链的每个羧基末端部分包括恒定区。参见，例如，Antibody Engineering(Borrebaeck编著,第2版.1995)；和Kuby,Immunology(第3版.1997)。在具体实施方案中，特定分子抗原可以被本文提供的抗体结合，所述抗体诸如IL-2多肽、IL-2片段或IL-2表位。抗体还包括但不限于合成抗体、重组产生的抗体、骆驼源化抗体、内抗体、抗独特型(抗Id)抗体和以上任一种的功能片段(例如抗原结合片段，诸如IL-2结合片段)，功能片段是指抗体重链或轻链多肽的一部分，其保留了该片段衍生自的抗体的一些或全部结合活性。功能片段(例如，抗原结合片段，诸如IL-2结合片段)的非限制性实例包括单链Fv(scFv)(例如，包括单特异性、双特异性等)、Fab片段(例如，包括单特异性、双特异性等)、F(ab’)片段、F(ab)2片段、F(ab’)2片段、二硫键连接的Fv(dsFv)、Fd片段、Fv片段、双抗体、三抗体、四抗体、微抗体和单结构域抗体(VHH或纳米抗体)。特别地，本文提供的抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，例如，包含与IL-2抗原结合的抗原结合位点的抗原结合结构域或分子(例如，抗IL-2抗体的一个或更多个CDR)。这样的抗体片段可以在例如Harlow和Lane,Antibodies:A Laboratory Manual(1989)；Mol.Biology and Biotechnology:A Comprehensive Desk Reference(Myers编著,1995)；Huston等人,1993,Cell Biophysics 22:189-224；Plückthun和Skerra,1989,Meth.Enzymol.178:497-515；以及Day,Advanced Immunochemistry(第2版，1990)中找到。本文提供的抗体可以是免疫球蛋白分子的任何类别(例如，IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)或任何亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。
如本文使用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体的群体中获得的抗体，例如，除了可能以少量存在的可能天然存在的突变之外构成该群体的个体抗体是相同的，并且每个单克隆抗体通常识别抗原上的单个表位。在具体实施方案中，如本文使用的“单克隆抗体”是由单个杂交瘤或其他细胞产生的抗体，其中该抗体仅结合一个表位，如例如通过ELISA或本领域已知的其他抗原结合或竞争结合测定确定的。术语“单克隆”不限于制造抗体的任何特定方法。例如，在本公开内容中有用的单克隆抗体可以通过首次由Kohler等人,1975,Nature 256:495描述的杂交瘤方法制备，或者可以在细菌或真核动物或植物细胞中使用重组DNA方法制备(参见例如美国专利第4,816,567号)。“单克隆抗体”还可以使用在例如Clackson等人,1991,Nature 352:624-28和Marks等人,1991,J.Mol.Biol.222:581-97中描述的技术从噬菌体抗体文库中分离。用于制备克隆细胞系和由此表达的单克隆抗体的其他方法是本领域中熟知的。参见，例如，Short Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人.编著,第5版.2002)。在本文的实施例中提供了产生单克隆抗体的示例性方法。
如本文使用的“多克隆抗体”是指在对具有许多表位的蛋白质的免疫原性应答中产生的抗体群体，并且因此包括针对蛋白质内相同或不同表位的各种不同抗体。用于产生多克隆抗体的方法是本领域已知的(参见例如Short Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人.编著,第5版.2002))。
“抗原”是抗体可以选择性结合的预定抗原。靶抗原可以是多肽、糖类、核酸、脂质、半抗原或其他天然存在或合成的化合物。在一些实施方案中，靶抗原是多肽。
术语“抗原结合片段”、“抗原结合结构域”、“抗原结合区”和类似术语是指抗体的包含与抗原相互作用并赋予结合剂对抗原的特异性和亲和力的氨基酸残基(例如CDR)的部分。
如本文使用的“双特异性抗体”是指能够与两种不同的靶抗原结合的抗体或其抗原结合片段。如本文使用的“二合一抗体”是指能够经由单个抗原结合结构域与两种不同的靶抗原结合的双特异性抗体。在一些实施方案中，靶抗原相互竞争结合二合一抗体的单个抗原结合结构域，使得二合一抗体在与一种靶抗原结合时，从另一种靶抗原解离。
“表位”是与单个抗体分子结合的抗原分子的表面上的位点，诸如抗原(诸如IL-2多肽或IL-2多肽片段)的表面上的定位区，其能够与抗体的一个或更多个抗原结合区结合，并且在动物诸如哺乳动物(例如人类)中具有抗原或免疫原性活性，能够引发免疫应答。具有免疫原性活性的表位是在动物中引发抗体应答的多肽的一部分。具有抗原活性的表位是与抗体结合的多肽的一部分，如通过本领域熟知的任何方法，包括例如通过免疫测定确定的。抗原表位不一定是免疫原性的。表位通常由化学活性表面分组的分子(chemicallyactive surface groupings of molecules)组成，诸如氨基酸或糖侧链，并且具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。抗体表位可以是线性表位或构象表位。线性表位由蛋白质中连续的氨基酸序列形成。构象表位由蛋白质序列中不连续的氨基酸形成，但在蛋白质折叠成其三维结构时聚集在一起。当蛋白质的三维结构处于改变的构象时，诸如在另一种蛋白质或配体激活或结合后，形成诱导表位。通常，抗原具有若干或许多不同的表位，并且可以与许多不同的抗体反应。在某些实施方案中，抗原(例如FAP)可以具有多于一个被不同的抗FAP抗体识别和结合的表位。在某些实施方案中，不同的抗FAP抗体相互竞争结合FAP的相同表位。
当两种抗体在三维空间中识别相同、重叠或相邻的表位时，抗体与参考抗体结合“表位”、“基本上相同的表位”或“相同的表位”。用于确定两种抗体是否在三维空间中结合相同、重叠或相邻的表位的最广泛使用和最快速的方法是竞争测定，其可以以许多不同的格式配置，例如，使用标记的抗原或标记的抗体。在一些测定中，抗原被固定在96孔板上，或在细胞表面上表达，并且使用放射性、荧光或酶标记来测量未标记的抗体阻断标记的抗体的结合的能力。
“表位作图”是鉴定抗体在其靶抗原上的结合位点或表位的过程。“表位分箱(Epitope binning)”是基于抗体识别的表位对抗体进行分组的过程。更具体地，表位分箱包括用于区分不同抗体的表位识别性质的方法和系统，使用与计算过程相组合的竞争测定，用于基于抗体的表位识别性质对抗体进行聚类并鉴定具有不同结合特异性的抗体。
术语“结合(bind)”或“结合(binding)”是指分子之间的相互作用，包括例如形成复合物。相互作用可以是例如非共价相互作用，包括氢键、离子键、疏水相互作用和/或范德华相互作用。复合物还可以包括通过共价键或非共价键、相互作用或力保持在一起的两个或更多个分子的结合。抗体上的单个抗原结合位点和靶分子(诸如IL-2)的单个表位之间的总的非共价相互作用的强度是抗体或功能片段对该表位的亲和力。抗体与单价抗原的解离速率(koff)与缔合速率(kon)的比率(koff/kon)是解离常数KD，它与亲和力成反比。KD值越低，抗体的亲和力越高。对于抗体和抗原的不同复合物，KD值不同，并且取决于kon和koff两者。本文提供的抗体的解离常数KD可以使用本文提供的任何方法或本领域技术人员熟知的任何其他方法来确定。在一个结合位点的亲和力并不总是反映抗体和抗原之间的相互作用的真实强度。当含有多个重复抗原决定簇的复合抗原(诸如多价IL-2)与含有多个结合位点的抗体接触时，抗体与抗原在一个位点的相互作用将增加在第二个位点发生反应的可能性。多价抗体和抗原之间的这样的多重相互作用的强度被称为亲合力(avidity)。抗体的亲合力与其个体结合位点的亲和力相比可以是其结合能力的更好的量度。例如，高亲合力可以补偿低亲和力，如对于五聚体IgM抗体有时发现的，五聚体IgM抗体可以具有比IgG低的亲和力，但由于其多价性IgM的高亲合力使其能够有效地结合抗原。
术语“与抗原特异性结合的抗体”、“与表位特异性结合的抗体”和类似术语在本文中也可互换地使用，并且是指与抗原或抗原的片段或表位特异性结合的抗体。与抗原特异性结合的抗体可以例如通过免疫测定、或本领域技术人员已知的其他技术来鉴定。当抗体以比与任何交叉反应性抗原结合更高的亲和力与抗原结合时，抗体与该抗原特异性结合，如使用实验技术，诸如放射免疫测定(RIA)和酶联免疫吸附测定(ELISA)所确定的。通常，特定或选择性反应将是背景信号或噪声的至少两倍，并且可以是背景的10倍以上。参见，例如，Fundamental Immunology 332-36(Paul编著,第2版.1989)关于抗体特异性的论述。“结合感兴趣的抗原”(例如，靶抗原诸如IL-2)的抗体是以足够的亲和力结合抗原的抗体，使得该抗体可用作靶向表达该抗原的细胞或组织的治疗剂，并且不会与其他蛋白质显著交叉反应。在这样的实施方案中，抗体与“非靶”蛋白的结合程度将小于抗体与其特定靶蛋白的结合程度的约10％，例如，如通过荧光激活细胞分选(FACS)分析或RIA确定的。关于抗体与靶分子的结合，术语“特异性结合(specific binding)”、“特异性结合(specifically binds to)”特定多肽或特定多肽靶上的表位、或“对特定多肽或特定多肽靶上的表位特异性的(is specific for)”意味着与非特异性相互作用显著不同的结合。特异性结合可以例如通过确定分子的结合与对照分子的结合进行比较来测量，对照分子通常是具有类似结构但不具有结合活性的分子。例如，特异性结合可以通过与对照分子竞争来确定，对照分子与靶，例如过量的未标记的靶类似。在此情况下，如果标记的靶与探针的结合被过量的未标记的靶竞争性抑制，则表明特异性结合。如本文使用的术语“特异性结合”、“特异性结合”特定多肽或特定多肽靶上的表位，或“对特定多肽或特定多肽靶上的表位特异性的”是指其中分子与特定多肽或特定多肽上的表位结合而基本上不与任何其他多肽或多肽表位结合的结合。在某些实施方案中，与本公开内容的抗原结合的抗体具有小于或等于10nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM或0.1nM的解离常数(KD)。
当在抗体(例如，与细胞表面抗原结合并竞争靶上的相同表位或结合位点的抗体和结合蛋白)的上下文中使用时，术语“竞争”意指如通过测定确定的竞争，其中所研究的抗体(或其结合片段)阻止或抑制参考分子(例如，参考配体或参考抗原结合蛋白，诸如参考抗体)与共同抗原(例如，FAP或其片段)的特异性结合。许多类型的竞争结合测定可以用于确定测试抗体是否与参考抗体竞争结合抗原(例如，人类FAP)。可以采用的测定的实例包括固相直接或间接RIA、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定(参见例如Stahli等人,1983,Methods in Enzymology 9:242-53)、固相直接生物素-亲和素EIA (参见，例如，Kirkland等人,1986,J.Immunol.137:3614-19)、固相直接标记的测定、固相直接标记的夹心测定(参见例如Harlow和Lane,Antibodies,A Laboratory Manual(1988))、使用I-125标记的固相直接标记RIA(参见例如Morel等人,1988,Mol.Immunol.25:7-15)和直接标记的RIA(Moldenhauer等人,1990,Scand.J.Immunol.32:77-82)。通常，这样的测定涉及使用与固体表面结合的纯化的抗原(例如IL-2)，或携带未标记的测试抗原结合蛋白(例如测试抗IL-2抗体)或标记的参考抗原结合蛋白(例如参考抗IL-2抗体)的细胞。竞争抑制可以通过在存在测试抗原结合蛋白的情况下确定与固体表面或细胞结合的标记的量来测量。通常，测试抗原结合蛋白过量存在。通过竞争测定鉴定的抗体(竞争抗体)包括与参考抗体结合相同表位的抗体和/或与邻近表位结合的抗体，该表位足够靠近由参考物结合的表位，以发生抗体空间位阻。本文描述了关于用于确定竞争结合的方法的另外的细节。通常，当竞争性抗体蛋白过量存在时，它将抑制参考抗体与共同抗原的特异性结合至少30％，例如40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％。在一些情况下，结合被抑制至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多。
术语“重链”，当用于指抗体时，是指约50kDa-70kDa的多肽链，其中氨基末端部分包括约120个至130个或更多个氨基酸的可变区，并且羧基末端部分包括恒定区。基于重链恒定区的氨基酸序列，恒定区可以是五种不同类型(例如同种型)中的一种，称为alpha(α)、delta(δ)、epsilon(ε)、gamma(γ)和mu(μ)。不同的重链大小不同：α、δ和γ含有约450个氨基酸，而μ和ε含有约550个氨基酸。当与轻链组合时，这些不同类型的重链分别产生五个熟知的抗体类别(例如同种型)：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，包括IgG的四个亚类，即IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。重链可以是人类重链。
术语“轻链”，当用于指抗体时，是指约25kDa的多肽链，其中氨基末端部分包括约100个至约110个或更多个氨基酸的可变区，并且羧基末端部分包括恒定区。轻链的近似长度是211个至217个氨基酸。基于恒定结构域的氨基酸序列存在两种不同的类型，称为kappa(κ)或lambda(λ)。轻链氨基酸序列是本领域熟知的。轻链可以是人类轻链。
术语“可变区”、“可变结构域”、“V区”或“V结构域”是指抗体的轻链或重链的一部分，其通常位于轻链或重链的氨基末端，并且在重链中具有约120个至130个氨基酸的长度且在轻链中具有约100个至110个氨基酸的长度，并且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。重链的可变区可以被称为“VH”。轻链的可变区可以被称为“VL”。术语“可变”是指可变区的某些区段的序列在抗体之间广泛不同的事实。V区介导抗原结合，并且限定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，可变性并不均匀地分布在可变区的110个氨基酸范围内。而是，V区由约15个-30个氨基酸的称为框架区(FR)的较小可变性(例如，相对不变)的链段组成，框架区被称为“高变区”的较大可变性(例如，极端可变性)的较短区分开，每个高变区长约9个-12个氨基酸。重链和轻链的可变区各自包含四个FR，FR主要采用由三个高变区连接的β折叠构型，所述三个高变区形成连接β折叠结构的环，并且在一些情况下形成β折叠结构的一部分。每条链中的高变区通过FR紧密地保持在一起，并且与来自另一条链的高变区一起，有助于抗体的抗原结合位点的形成(参见例如Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest(第5版.1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出各种效应子功能，诸如抗体参与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。可变区的序列在不同抗体之间广泛不同。在具体实施方案中，可变区是人类可变区。
术语“Kabat中的可变区残基编号”或“Kabat中的氨基酸位置编号”及其变化形式是指上文Kabat等人的抗体汇编中用于重链可变区或轻链可变区的编号系统。使用这种编号系统，实际的线性氨基酸序列可能包含更少或另外的氨基酸，对应于可变结构域的FR或CDR的缩短或插入。例如，重链可变结构域可以包括残基52之后的单个氨基酸插入(根据Kabat的残基52a)和残基82之后的三个插入的残基(例如，根据Kabat的残基82a、82b和82c等)。对于给定的抗体，残基的Kabat编号可以通过在抗体的序列的同源区与“标准”Kabat编号序列进行比对来确定。当提及可变结构域中的残基(大约轻链的残基1-107和重链的残基1-113)时，通常使用Kabat编号系统(例如，上文的Kabat等人)。当提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时，通常使用“EU编号系统”或“EU索引”(例如，在上文，Kabat等人报道的EU索引)。“Kabat中的EU索引”是指人类IgG 1EU抗体的残基编号。已经描述了其他编号系统，例如AbM、Chothia、Contact、IMGT和AHon。
“CDR”是指免疫球蛋白(Ig或抗体)VHβ-折叠框架的非框架区内的三个高变区(H1、H2或H3)中的一个，或抗体VLβ-折叠框架的非框架区内的三个高变区(L1、L2或L3)中的一个。因此，CDR是散布在框架区序列内的可变区序列。CDR区是本领域技术人员熟知的，并且已经由例如Kabat定义为抗体可变(V)结构域内最大高变性的区(Kabat等人,1997,J.Biol.Chem.252:6609-16；Kabat,1978,Adv.Prot.Chem.32:1-75)。CDR区序列在结构上也被Chothia定义为那些不是保守β-折叠框架的一部分并且因此能够适应不同构象的残基(Chothia和Lesk,1987,J.Mol.Biol.196:901-17)。这两个术语在本领域是公认的。AbM、Contact和IMGT也已经定义了CDR区序列。CDR在标准抗体可变区内的位置已经通过许多结构的比较来确定(Al-Lazikani等人,1997,J.Mol.Biol.273:927-48；Morea等人,2000,Methods 20:267-79)。因为高变区内残基的数量在不同抗体中变化，所以在标准可变区编号方案中，相对于标准位置的额外残基通常在残基数量旁边用a、b、c等编号(Al-Lazikani等人，同上)。这样的命名法对于本领域技术人员来说同样是熟知的。
术语“高变区”、“HVR”或“HV”当在本文中使用时是指抗体可变区中序列高变和/或形成结构限定的环的区。通常，抗体包含六个高变区，三个在VH(H1、H2、H3)，并且三个在VL(L1、L2、L3)。许多高变区的描述正在使用中，并且涵盖在本文中。Kabat互补决定区(CDR)是基于序列可变性，并且是最常用的(参见例如，Kabat等人，同上)。相反，Chothia是指结构环的位置(参见，例如，Chothia和Lesk,1987,J.Mol.Biol.196:901-1)。当使用Kabat编号惯例编号时，Chothia CDR-H1环的末端根据环的长度在H32和H34之间变化(这是因为Kabat编号方案将插入放在H35A和H35B；如果35A和35B都不存在，则环在32结束；如果仅35A存在，则环在33结束；如果35A和35B两者都存在，则环在34结束)。AbM高变区代表Kabat CDR和Chothia结构环之间的折衷，并且被Oxford Molecular的AbM抗体建模软件使用(参见，例如，Antibody Engineering第2卷(Kontermann和Dübel编著,第2版.2010))。“contact”高变区是基于对可用的复杂晶体结构的分析。来自这些高变区或CDR中的每一个的残基在下文提到。
最近，已经开发并广泛采用了通用编号系统，ImMunoGeneTics(IMGT)Information(Lafranc等人,2003,Dev.Comp.Immunol.27(1):55-77)。IMGT是专用于人类和其他脊椎动物的免疫球蛋白(IG)、T细胞受体(TCR)和主要组织相容性复合体(MHC)的集成的信息系统。在本文中，CDR关于轻链或重链中的氨基酸序列和位置方面被提及。由于CDR在免疫球蛋白可变结构域的结构内的“位置”在物种之间是保守的并且存在于称为环的结构中，通过使用根据结构特征比对可变结构域序列的编号系统，CDR和框架残基很容易被识别。该信息可以用于将来自一个物种的免疫球蛋白的CDR残基接枝和替换到通常来自人类抗体的受体框架中。Honegger和Plückthun,2001,J.Mol.Biol.309:657-70已经开发了一种另外的编号系统(AHon)。包括例如Kabat编号和IMGT独特编号系统的编号系统之间的对应关系对于本领域技术人员来说是熟知的(参见例如Kabat，同上；Chothia和Lesk，同上；Martin，同上；Lefranc等人，同上)。在一些实施方案中，CDR如由IMGT编号系统所定义。在其他实施方案中，CDR如由Kabat编号系统所定义。在某些实施方案中，CDR如由AbM编号系统所定义。在其他实施方案中，CDR如由Chothia系统所定义。在又其他实施方案中，CDR如由Contact编号系统所定义。
IMGT Kabat AbM Chothia Contact
VH CDR1 27-38 31-35 26-35 26-32 30-35
VH CDR2 56-65 50-65 50-58 53-55 47-58
VH CDR3 105-117 95-102 95-102 96-101 93-101
VL CDR1 27-38 24-34 24-34 26-32 30-36
VL CDR2 56-65 50-56 50-56 50-52 46-55
VL CDR3 105-117 89-97 89-97 91-96 89-96
高变区可以包括如下的“扩展的高变区”：VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)和89-97或89-96(L3)以及VH中的26-35或26-35A(H1)、50-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。如本文使用的，术语“HVR”和“CDR”可互换地使用。
术语“恒定区”或“恒定结构域”是指轻链和重链的羧基末端部分，它不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出各种效应子功能，诸如与Fc受体的相互作用。该术语是指相对于免疫球蛋白的另一部分，即包含抗原结合位点的可变区，具有更保守的氨基酸序列的免疫球蛋白分子的部分。恒定区可以包含重链的CH1、CH2和CH3区以及轻链的CL区。
术语“框架”或“FR”是指CDR侧翼的那些可变区残基。FR残基存在于例如嵌合的、人源化的、人类的、结构域抗体、双抗体、线性抗体和双特异性抗体中。FR残基是除高变区残基或CDR残基之外的可变结构域残基。
本文中的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区，包括例如天然序列Fc区、重组Fc区和变体Fc区。虽然免疫球蛋白重链的Fc区的边界可能变化，但人类IgG重链Fc区通常被定义为从位置Cys226处或从位置Pro230的氨基酸残基延伸到其羧基-末端。例如，在抗体的生产或纯化期间，或者通过重组工程化编码抗体的重链的核酸，可以去除Fc区的C末端赖氨酸(根据EU编号系统的残基447)。因此，完整抗体的组合物可以包括去除了所有K447残基的抗体群体、没有去除的K447残基的抗体群体以及具有含有和不含有K447残基的抗体混合物的抗体群体。
“功能Fc区”具有天然序列Fc区的“效应子功能”。示例性的“效应子功能”包括C1q结合；补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)；细胞因子分泌、细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调和B细胞活化等。这样的效应子功能通常需要Fc区与结合区或结合结构域(例如，抗体可变区或结构域)组合，并且可以使用如所公开的各种测定来评估。
“活化性Fc受体”是在被抗体的Fc区接合后引发信号传导事件，刺激携带受体的细胞执行效应子功能的Fc受体。示例性的活化性Fc受体包括FcγRIIIα(CD16α)、FcγRI(CD64)、FcγRIIα(CD32)和FcαRI(CD89)。
“天然序列Fc区”包括与自然界中发现的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列，并且未被人类操纵、修饰和/或改变(例如，分离、纯化、选择，包括或组合其他序列，诸如可变区序列)。天然序列人类IgG1 Fc区包括天然序列人类IgG1 Fc区(非A同种异型和A同种异型)；天然序列人类IgG2 Fc区；天然序列人类IgG3 Fc区；和天然序列人类IgG4 Fc区以及其天然存在的变体。例如，天然人类IgG1 Fc区氨基酸序列在下文提供：
“变体Fc区”包含由于至少一个氨基酸修饰(例如，取代、添加或缺失)而不同于天然序列Fc区的氨基酸序列。在某些实施方案中，与天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区相比，变体Fc区具有至少一个氨基酸取代，例如，在天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区中约1个至约10个氨基酸取代，或约1个至约5个氨基酸取代。本文中的变体Fc区可以与天然序列Fc区和/或与亲本多肽的Fc区具有至少约80％的同源性，或者与其具有至少约90％的同源性，例如，与其具有至少约95％的同源性。例如，一个变体。
氨基酸残基/位置的“修饰”是指与起始氨基酸序列相比，一级氨基酸序列的改变，其中该改变由涉及所述氨基酸残基/位置的序列改变引起。例如，典型的修饰包括用另一个氨基酸取代残基(例如，保守取代或非保守取代)，在所述残基/位置附近插入一个或更多个(例如，通常少于5个、4个或3个)氨基酸，和/或缺失所述残基/位置。
“促进异二聚化的修饰”是对肽主链的操纵或多肽(例如免疫球蛋白重链)的翻译后修饰，其减少或阻止多肽与相同多肽缔合形成同源二聚体。如本文使用的促进异二聚化的修饰特别地包括对期望形成二聚体的两种多肽中的每一种进行的单独修饰，其中修饰彼此互补，以促进两种多肽的缔合。例如，促进异二聚化的修饰可以改变期望形成二聚体的一种或两种多肽的结构或电荷，从而分别使它们的缔合在空间或静电上有利。异二聚化发生在两个不相同的多肽之间，诸如两条免疫球蛋白重链，其中与每条重链融合的另外的免疫缀合物组分(例如IL-2多肽)不是相同的。在本公开内容的免疫缀合物中，促进异二聚化的修饰在免疫球蛋白分子的重链中，特别是Fc结构域中。在一些实施方案中，促进异二聚化的修饰包括氨基酸突变，特别是氨基酸取代。在特定的实施方案中，促进异二聚化的修饰包括在两条免疫球蛋白重链的每条免疫球蛋白重链中的单独的氨基酸突变，特别是氨基酸取代。
本文中的术语“Fc结构域”用于定义由免疫球蛋白的两条重链的Fc区组成的免疫球蛋白的C末端部分。Fc结构域中的每个重链Fc区在本文中被称为Fc结构域的亚基。Fc结构域的两个亚基可以都是天然序列Fc区，或者都是变体Fc区，或者一个天然序列Fc区和一个变体Fc区。在某些实施方案中，Fc结构域包含促进两条不相同的免疫球蛋白重链的异二聚化的修饰。人类IgG Fc结构域的两条多肽链之间最广泛的蛋白质-蛋白质相互作用的位点在Fc区的CH3结构域中。因此，在一种实施方案中，所述修饰在Fc区的CH3结构域中。在具体实施方案中，所述修饰是knob-into-hole修饰，包括在一个Fc亚基中的knob修饰，被称为“Fc-Knob”，以及在另一个Fc亚基中的hole修饰，被称为“Fc-hole”。knob-into-hole技术在例如美国专利第5,731,168号；美国专利第7,695,936号；Ridgway等人,Prot Eng 9,617-621(1996)和Carter,J Immunol Meth 248,7-15(2001)中描述。通常，该方法包括在第一多肽的界面处引入突起(“knob”)和在第二多肽的界面处引入相应的空腔(“hole”)，使得突起可以定位在空腔中，从而促进异源二聚体形成并阻碍同二聚体形成。通过用较大的侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)替换第一多肽界面的小氨基酸侧链来构建突起。通过用较小的氨基酸侧链(例如，丙氨酸或苏氨酸)替换大氨基酸侧链，在第二多肽的界面上产生与突起相同或相似尺寸的补偿空腔。突起和空腔可以通过改变编码多肽的核酸，例如通过位点特异性诱变或通过肽合成来形成。在具体实施方案中，knob修饰包括两个Fc亚基之一中的氨基酸取代T366W，并且hole修饰包括两个Fc亚基中的另一个亚基中的氨基酸取代T366S、L368A和Y407V。在另外的具体实施方案中，包含knob修饰的Fc亚基另外包含氨基酸取代S354C，并且包含hole修饰的免疫球蛋白重链另外包含氨基酸取代Y349C。引入这两个半胱氨酸残基导致在两条重链之间形成二硫桥，从而进一步使二聚体稳定(Carter,J.Immunol Methods248,7-15(2001))。
术语“变体”，当与肽或多肽、抗体相关使用时，可以指与天然或未修饰的序列相比，包含一个或更多个(诸如例如约1个至约25个、约1个至约20个、约1个至约15个、约1个至约10个或约1个至约5个)氨基酸序列取代、缺失和/或添加的肽或多肽。例如，IL-2变体可以由天然IL-2的氨基酸序列的一个或更多个(诸如例如，约1个至约25个、约1个至约20个、约1个至约15个、约1个至约10个或约1个至约5个)改变产生。同样举例来说，抗FAP抗体的变体可以由天然或先前未修饰的抗FAP抗体的氨基酸序列的一个或更多个(诸如例如，约1个至约25个、约1个至约20个、约1个至约15个、约1个至约10个或约1个至约5个)改变产生。变体可以是天然存在的，诸如等位基因变体或剪接变体，或者可以是人工构建的。多肽变体可以由编码变体的相应核酸分子制备。在具体实施方案中，IL-2变体或抗FAP抗体变体分别至少保留IL-2或抗FAP抗体功能活性。在具体实施方案中，抗FAP抗体变体是与FAP和IL-2两者结合的双特异性抗体。在某些实施方案中，变体由编码IL-2或抗FAP抗体VH或VL区或亚区(诸如一个或更多个CDR)的核酸分子的单核苷酸多态性(SNP)变体编码。
“完整”抗体是包含抗原结合位点以及CL和至少重链恒定区CH1、CH2和CH3的抗体。恒定区可以包括人类恒定区或其氨基酸序列变体。在某些实施方案中，完整抗体具有一种或更多种效应子功能。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，诸如完整抗体的抗原结合或可变区。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；双抗体和二-双抗体(参见，例如，Holliger等人,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.90:6444-48；Lu等人,2005,J.Biol.Chem.280:19665-72；Hudson等人,2003,Nat.Med.9:129-34；WO 93/11161；和美国专利第5,837,242号和第6,492,123号)；单链抗体分子(参见，例如，美国专利第4,946,778号；第5,260,203号；第5,482,858号；和第5,476,786号)；双重可变结构域抗体(参见，例如，美国专利第7,612,181号)；单结构域抗体(sdAb)(参见，例如，Woolven等人,1999,Immunogenetics 50:98-101；和Streltsov等人,2004,Proc Natl Acad Sci USA.101:12444-49)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
治疗性抗体的“功能片段”、“结合片段”或“抗原结合片段”将表现出至少一种(如果不是部分或全部)归因于完整抗体的生物功能，该功能至少包括与靶抗原的结合(例如，IL-2结合片段或与IL-2结合的片段)。
如本文使用的，术语“免疫缀合物”是指包含至少一个细胞因子部分和至少一个抗原结合部分的多肽分子。在某些实施方案中，免疫缀合物包含至少一个细胞因子部分(例如IL-2)和至少两个抗原结合部分(例如，如本文描述的掩蔽部分和锚定部分)。特别地，在某些实施方案中，根据本公开内容的免疫缀合物包含一个细胞因子部分和两个由一个或更多个接头序列连接的抗原结合部分。在某些实施方案中，根据本公开内容的免疫缀合物包含一个细胞因子部分和两个由免疫球蛋白的Fc结构域连接的抗原结合部分。在本公开内容的各种实施方案中，抗原结合部分可以通过各种相互作用并以如本文描述的各种构型与细胞因子部分连接。
术语“融合(fusion)”、“融合(fuse)”或其其他语法变体，当与肽或多肽或抗体相关使用时，是指肽或多肽或其片段、变体和/或衍生物与异源肽或多肽的连接。
“亲和力成熟的”抗体是在其一个或更多个HVR中具有一个或更多个改变(例如，氨基酸序列变异，包括改变、添加和/或缺失)的抗体，与不具有这些改变的亲本抗体相比，这些改变导致抗体对抗原的亲和力提高。亲和力成熟的抗体可以对靶抗原具有纳摩尔或甚至皮摩尔的亲和力。亲和力成熟的抗体通过本领域已知的方法产生。综述参见Hudson和Souriau,2003,Nature Medicine 9:129-34；Hoogenboom,2005,Nature Biotechnol.23:1105-16；Quiroz和Sinclair,2010,Revista Ingeneria Biomedia 4:39-51。
“结合亲和力”通常是指分子(例如结合蛋白，诸如抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指出，如本文使用的，“结合亲和力”是指固有结合亲和力，其反映结合对(例如，抗体和抗原)的成员之间的1:1相互作用。结合分子X对其结合配偶体Y的亲和力通常可以用解离常数(KD)来表示。亲和力可以通过本领域已知的常用方法来测量，包括本文描述的方法。低亲和力抗体通常较慢地结合抗原并且倾向于容易解离，而高亲和力抗体通常较快地结合抗原并且倾向于保持结合更长时间。本领域已知多种测量结合亲和力的方法，其中任一种都可以用于本公开内容的目的。具体的说明性实施方案包括以下内容。在一种实施方案中，“KD”或“KD值”可以通过本领域已知的测定来测量，例如通过结合测定。KD可以在RIA中测量，例如，用感兴趣的抗体的Fab版本及其抗原进行(Chen等人,1999,J.Mol Biol 293:865-81)。KD或KD值还可以通过使用(例如使用TM-2000或TM-3000)的表面等离子共振测定来测量，或者通过使用例如QK 384或GatorTM系统的生物层干涉测量来测量。“结合速率(on-rate)”或“缔合速率(rate of association)”或“缔合速率(association rate)”或“kon”还可以使用上文描述的相同的表面等离子体共振或生物层干涉测量技术来确定，例如使用TM-2000或TM-3000、或QK 384、或GatorTM系统。
术语“抑制(inhibition)”或“抑制(inhibit)”，当在本文中使用时，是指部分(诸如1％、2％、5％、10％、20％、25％、50％、75％、90％、95％、99％)或完全(即100％)抑制。
“Fc受体”或“FcR”描述了与抗体的Fc区结合的受体。示例性的FcR是天然序列人类FcR。此外，示例性的FcR是结合IgG抗体(例如γ受体)并包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和选择性剪接形式的FcR。FcγRII受体包括FcγRIIA(一种“激活受体”)和FcγRIIB(一种“抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，主要在其细胞质结构域上不同(参见，例如，1997,Annu.Rev.Immunol.15:203-34)。各种FCR是已知的(参见，例如，Ravetch和Kinet,1991,Annu.Rev.Immunol.9:457-92；Capel等人,1994,Immunomethods 4:25-34；和de Haas等人,1995,J.Lab.Clin.Med.126:330-41)。其他FcR，包括将来要鉴定的FcR，由本文的术语“FcR”涵盖。该术语还包括新生儿受体FcRn，其负责将母体IgG转移到胎儿(参见，例如，Guyer等人,1976,J.Immunol.117:587-93；和Kim等人,1994,Eu.J.Immunol.24:2429-34)。已经描述了与FcR结合改善或减少的抗体变体(参见，例如，WO 2000/42072；美国专利第7,183,387号；第7,332,581号；和第7,335,742号；Shields等人.2001,J.Biol.Chem.9(2):6591-604)。
术语“载体”是指用于携带或包含核酸序列的物质，包括例如编码如本文描述的抗体或细胞因子多肽的核酸序列，以便将核酸序列引入宿主细胞。适用的载体包括例如表达载体、质粒、噬菌体载体、病毒载体、附加体和人工染色体，它们可以包括可操作用于稳定整合到宿主细胞染色体中的选择序列或标志物。此外，载体可以包括一个或更多个选择性标志物基因和适当的表达控制序列。例如，可以包含的选择性标志物基因提供对抗生素或毒素的抗性，补充营养缺陷型缺陷，或提供培养基中没有的关键营养物。表达控制序列可以包括本领域熟知的组成型和诱导型启动子、转录增强子、转录终止子等。当两个或更多个核酸分子要共表达时(例如，抗体重链和轻链或抗体VH和VL)，两个核酸分子都可以例如插入到单个表达载体或单独的表达载体中。对于单个载体表达，编码核酸可以操作地连接到一个共同的表达控制序列或连接到不同的表达控制序列，诸如一个诱导型启动子和一个组成型启动子。可以使用本领域熟知的方法来确认核酸分子引入到宿主细胞中。这样的方法包括，例如，核酸分析，诸如mRNA的RNA印迹或聚合酶链式反应(PCR)扩增，用于基因产物的表达的免疫印迹，或测试引入的核酸序列或其相应基因产物的表达的其他合适的分析方法。本领域技术人员应理解，核酸分子以足够的量表达以产生期望的产物(例如，如本文描述的抗FAP抗体)，并且还应理解，可以使用本领域熟知的方法来优化表达水平以获得足够的表达。
“分离的核酸”是核酸，例如RNA、DNA或混合的核酸，其基本上从其他基因组DNA序列以及天然伴随天然序列的蛋白质或复合物诸如核糖体和聚合酶分离。“分离的”核酸分子是从存在于核酸分子的天然来源中的其他核酸分子中分离出来的分子。此外，“分离的”核酸分子，诸如cDNA分子，当通过重组技术产生时，可以基本上不含其他细胞物质或培养基，或者当化学合成时，基本上不含化学前体或其他化学物质。在具体实施方案中，分离或纯化编码如本文描述的抗体的一种或更多种核酸分子。该术语包括已经从其天然存在的环境中取出的核酸序列，并且包括重组或克隆的DNA分离物和化学合成的类似物或由异源系统生物合成的类似物。基本上纯的分子可以包括该分子的分离形式。
如本文中可互换使用的“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸聚合物，并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基和/或它们的类似物，或者可以通过DNA聚合酶或RNA聚合酶或通过合成反应掺入聚合物中的任何底物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，诸如甲基化的核苷酸及其类似物。如本文使用的“寡核苷酸”是指长度通常(但不一定)小于约200个核苷酸的短的、通常为单链的合成多核苷酸。术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”并不相互排斥。上文对多核苷酸的描述同样且完全适用于寡核苷酸。产生本公开内容的抗体的细胞可以包括亲本杂交瘤细胞，以及已经引入编码抗体的核酸的细菌和真核宿主细胞。下文公开了合适的宿主细胞。
除非另外说明，本文公开的任何单链多核苷酸序列的左手末端是5’末端；双链多核苷酸序列的左手方向被称为5’方向。新生RNA转录物添加5’至3’方向被称为转录方向；DNA链上具有与RNA转录物相同序列的RNA转录物的5’末端5’的序列区被称为“上游序列”；DNA链上具有与RNA转录物相同序列的RNA转录物的3’末端3’的序列区被称为“下游序列”。
术语“编码核酸”或其语法等同物在提及核酸分子时是指处于其天然状态或通过本领域技术人员熟知的方法操纵时的核酸分子，其可以被转录以产生mRNA，然后被翻译成多肽和/或其片段。反义链是这样的核酸分子的互补物，并且可以由此推导出编码序列。
术语“重组抗体”是指通过重组手段制备、表达、产生或分离的抗体。重组抗体可以是使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体、从重组组合抗体文库中分离的抗体、从人类免疫球蛋白基因的转基因和/或转染色体动物(例如小鼠或牛)中分离的抗体(参见例如Taylor等人,1992,Nucl.Acids Res.20:6287-95)，或者通过包括免疫球蛋白基因序列与其他DNA序列的剪接的任何其他手段制备、表达、产生或分离的抗体。这样的重组抗体可以具有可变区和恒定区，包括那些来源于人类种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区(参见Kabat等人，同上)。然而，在某些实施方案中，这样的重组抗体可以经受体外诱变(或者，当使用对于人类Ig序列转基因的动物时，体内体细胞诱变)，因此重组抗体的VH区和VL区的氨基酸序列是这样的序列，即，虽然来源于并与人类种系VH和VL序列相关，但可以不天然存在于体内人类抗体种系谱库中。
术语“组合物”意图涵盖包含以任选地指定量的指定成分(例如，本文提供的免疫缀合物分子)的产物。
如本文使用的“载体(carrier)”包括药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂，它们在所用的剂量和浓度对暴露于其的细胞或哺乳动物无毒。通常生理上可接受的载体是pH缓冲水溶液。生理上可接受的载体的实例包括缓冲液，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(例如，少于约10个氨基酸残基)的多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他糖类，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖醇，诸如甘露醇或山梨醇；成盐平衡离子，诸如钠；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM。术语“载体”还可以指稀释剂、佐剂(例如，弗氏佐剂(完全或不完全))、赋形剂或媒介物。这样的载体，包括药学载体，可以是无菌液体，诸如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内施用组合物(例如药物组合物)时，水是示例性的载体。盐水溶液以及右旋糖水溶液和甘油溶液也可以用作液体载体，特别是用于可注射溶液。合适的赋形剂(例如药物赋形剂)包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻、面粉、白垩(chalk)、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂乳粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。如果需要，组合物还可以包含少量润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。组合物可以采取溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、持续释放制剂及类似物的形式。口服组合物，包括制剂，可以包括标准载体，诸如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药物载体的实例在Remington和Gennaro,Remington’s Pharmaceutical Sciences(第18版，1990)中描述。组合物，包括药物化合物，可以包含例如呈分离的或纯化的形式的抗体，以及合适量的载体。
如本文使用的术语“药学上可接受的”意指联邦或州政府的管理机构批准的或在美国药典、欧洲药典或其他一般公认的药典中列出的用于动物并且更特别地用于人类。
术语“赋形剂”是指通常用作稀释剂、媒介物、防腐剂、粘合剂或稳定剂的惰性物质，并且包括但不限于蛋白质(例如血清白蛋白等)、氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、甘氨酸、组氨酸等)、脂肪酸和磷脂(例如烷基磺酸盐/酯、辛酸盐/酯等)、表面活性剂(例如SDS、聚山梨醇酯、非离子表面活性剂等)、糖类(例如蔗糖、麦芽糖、海藻糖等)以及多元醇(例如甘露醇、山梨醇等)。还参见Remington和Gennaro,Remington’s Pharmaceutical Sciences(第18版.1990)，其通过引用以其整体并入本文。
术语“受试者”和“患者”可以可互换地使用。如本文使用的，在某些实施方案中，受试者是哺乳动物，诸如非灵长类动物(例如，牛、猪、马、猫、狗、大鼠等)或灵长类动物(例如，猴和人类)。在具体实施方案中，受试者是人类。
“施用(administer)”或“施用(administration)”是指将存在于体外的物质(例如，如本文描述的免疫缀合物分子)注射或以其他方式物理递送到患者中的行为，诸如通过粘膜、皮内、静脉内、肌肉内递送和/或本文描述或本领域已知的任何其他物理递送方法。
如本文使用的术语“有效量”是指本文提供的足以产生期望的结果的抗体或药物组合物的量。
术语“约(about)”和“约(approximately)”意指给定值或范围的20％内、15％内、10％内、9％内、8％内、7％内、6％内、5％内、4％内、3％内、2％内、1％内或以下。
“基本上全部”是指至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或约100％。
短语“基本上相似”或“基本上相同”表示两个数值(例如，一个与本公开内容的抗体相关，并且另一个与参考抗体相关)之间足够高程度的相似性，使得本领域技术人员将认为这两个值之间的差异在由这些值(例如，KD值)测量的生物学特性的背景中具有很少或没有生物学和/或统计学显著性。例如，随着参考抗体的值而变化，两个值之间的差异可以小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％、小于约10％或小于约5％。
如本文使用的短语“显著增加”、“显著减少”或“显著不同”表示两个数值(例如，一个与本公开内容的抗体相关，并且另一个与参考抗体相关)之间足够高程度的差异，使得本领域技术人员将认为这两个值之间的差异在由这些值测量的生物学特性的背景下具有统计学显著性。例如，随着参考抗体的值而变化，所述两个值之间的差异可以大于约10％、大于约20％、大于约30％、大于约40％或大于约50％。
5.3组合物及制备组合物的方法
在本公开内容的一个方面中，本文提供了包含细胞因子的免疫缀合物分子。在一些实施方案中，免疫缀合物分子是融合蛋白，包含彼此可操作地连接的细胞因子部分和非细胞因子部分。根据本公开内容，包含细胞因子的免疫缀合物分子能够在受试者的特定组织或细胞位置递送和激活细胞因子的细胞活性。例如，在一些实施方案中，当免疫缀合物分子存在于缺乏细胞因子的激活信号的环境中时，细胞因子活性被降低或阻断。在一些实施方案中，当免疫缀合物分子存在于含有或富含细胞因子的激活信号的环境中时，细胞因子活性被激活或增强。例如，在一些实施方案中，免疫缀合物分子被配置为在施用至受试者时的组织特异性分布。在特定实施方案中，免疫缀合物分子能够富集在提供细胞因子的激活信号的特定组织或细胞环境中，从而在这样的组织或细胞环境中特异性地激活细胞因子活性。
在具体实施方案中，细胞因子的激活信号是信号分子存在于细胞因子活性被激活的靶组织或细胞环境中。在一些实施方案中，信号分子在靶组织或细胞环境中富集，而在其他非靶组织或细胞环境中以较低的量或浓度存在。在一些实施方案中，细胞因子的激活信号是信号分子以高于阈值的浓度存在于靶组织或细胞环境中。在一些实施方案中，信号分子能够与免疫缀合物分子相互作用，从而激活细胞因子活性。在一些实施方案中，信号分子是肽分子。
在具体实施方案中，免疫缀合物分子被配置为靶向递送和激活癌组织诸如肿瘤中的细胞因子活性。在这些实施方案中，用于激活细胞因子的信号分子可以是在癌组织中(诸如在肿瘤微环境中)表达或富集的抗原。在具体实施方案中，细胞因子的激活信号是在肿瘤细胞上表达的抗原。在其他实施方案中，细胞因子的激活信号是在肿瘤微环境中的细胞(诸如肿瘤基质细胞)上表达的抗原。在具体实施方案中，细胞因子的激活信号是肿瘤相关抗原。
在一些实施方案中，免疫缀合物分子的非细胞因子部分包括能够与细胞因子部分结合的掩蔽部分，并且在结合时，掩蔽部分降低或阻断细胞因子活性。在一些实施方案中，免疫缀合物分子包含与细胞因子多肽融合的抗体或其抗原结合片段，并且抗体或其抗原结合片段能够与细胞因子多肽结合并降低或阻断细胞因子活性。
在一些实施方案中，免疫缀合物分子的细胞因子部分和掩蔽部分之间的分子内结合是可逆的。因此，在一些实施方案中，免疫缀合物分子可以通过细胞因子部分和掩蔽部分之间的可逆结合和解离在细胞因子活性状态和非活性状态之间切换。
在一些实施方案中，掩蔽部分是双特异性二合一抗体或其结合片段，它能够结合细胞因子部分和不同于细胞因子的第二靶抗原。在具体实施方案中，当免疫缀合物分子处于不存在第二靶抗原的环境中时，包含二合一抗体或其抗原结合片段的掩蔽部分与免疫缀合物分子的细胞因子部分结合，从而抑制细胞因子活性。在具体实施方案中，当免疫缀合物分子处于第二靶抗原以低于某个阈值的量或浓度存在的环境中时，包含二合一抗体或其抗原结合片段的掩蔽部分与免疫缀合物分子的细胞因子部分结合，从而抑制细胞因子活性。在各种实施方案中，环境是细胞环境或组织特异性环境。在特定实施方案中，环境是癌性组织或肿瘤微环境。在特定实施方案中，第二靶抗原是由癌细胞表达的抗原。在其他实施方案中，第二靶抗原是由肿瘤微环境中的细胞诸如肿瘤基质细胞表达的抗原。在一些实施方案中，第二靶抗原是肿瘤相关抗原。
在一些实施方案中，掩蔽部分是双特异性二合一抗体或其结合片段，它能够结合细胞因子部分和不同于细胞因子的第二靶抗原。在具体实施方案中，当免疫缀合物分子处于存在第二靶抗原的环境中时，包含二合一抗体或其抗原结合片段的掩蔽部分与第二抗原结合并从免疫缀合物分子的细胞因子部分解离，从而激活细胞因子活性。在具体实施方案中，当免疫缀合物分子处于第二靶抗原以高于某个阈值的量或浓度存在的环境中时，包含二合一抗体或其抗原结合片段的掩蔽部分与第二抗原结合并从免疫缀合物分子的细胞因子部分解离，从而激活细胞因子活性。在各种实施方案中，环境是细胞环境或组织特异性环境。在特定实施方案中，环境是癌性组织或肿瘤微环境。在特定实施方案中，第二靶抗原是由肿瘤细胞表达的抗原。在其他实施方案中，第二靶抗原是由肿瘤微环境中的细胞诸如肿瘤基质细胞表达的抗原。在一些实施方案中，第二靶抗原是肿瘤相关抗原。
在具体实施方案中，本公开内容的免疫缀合物分子包含细胞因子部分和非细胞因子部分，其中细胞因子部分包含白细胞介素-2(IL-2)多肽，并且非细胞因子部分包含能够与免疫缀合物分子中的IL-2多肽和不是IL-2的第二靶抗原两者结合的双特异性二合一抗体。在特定实施方案中，第二靶抗原是由肿瘤细胞表达的抗原。在其他实施方案中，第二靶抗原是由肿瘤微环境中的细胞诸如肿瘤基质细胞表达的抗原。在一些实施方案中，第二靶抗原是肿瘤相关抗原。在具体实施方案中，第二靶抗原是成纤维细胞活化蛋白(FAP)。在又具体实施方案中，IL-2多肽是野生型IL-2多肽。在其他实施方案中，IL-2多肽是突变IL-2多肽。在一些实施方案中，IL-2多肽是人类IL-2多肽。在一些实施方案中，IL-2多肽是猴IL-2多肽。在一些实施方案中，IL-2多肽是小鼠IL-2多肽。在一些实施方案中，IL-2多肽是如本文描述的突变IL-2多肽。在具体实施方案中，突变IL-2多肽是IL-2hex。可以与本公开内容关联使用的另外的突变IL-2多肽可以在美国专利第10,184,009号和第5,229,109号以及国际专利公布第WO2012107417A1号中找到，这些专利中的每一篇的公开内容通过引用以其整体包含在本文中。
在一些实施方案中，免疫缀合物分子的非细胞因子部分包括锚定部分，该锚定部分被配置为将免疫缀合物分子拴系到递送的靶位置。因此，在一些实施方案中，具有锚定部分的本公开内容的免疫缀合物分子在施用至受试者后，诸如在全身施用至受试者后，可以实现组织特异性分布。在一些实施方案中，免疫缀合物分子的锚定部分能够特异性结合存在于递送的靶位置的靶分子。在一些实施方案中，免疫缀合物分子的锚定部分包含抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段能够与存在于递送的靶位置的抗原结合，从而将免疫缀合物分子拴系到递送的靶位置。
在一些实施方案中，递送的靶位置是细胞环境或组织特异性环境。在一些实施方案中，递送的靶位置还包含免疫缀合物分子的细胞因子的激活信号，使得细胞因子活性可以在靶位置被激活。
在特定实施方案中，递送的靶位置是癌性组织或肿瘤微环境。在一些实施方案中，递送的靶位置是受试者中特定类型的组织或细胞群体。在一些实施方案中，免疫缀合物分子的锚定部分包含抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段与癌细胞上表达的抗原结合。因此，在这些实施方案中，免疫缀合物分子在施用至患有癌症的受试者时，可以与受试者中的癌细胞群体结合。在一些实施方案中，免疫缀合物分子的锚定部分包含抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段结合肿瘤微环境中存在的抗原，例如在肿瘤细胞的表面上表达的抗原或肿瘤微环境中细胞(诸如肿瘤基质细胞)分泌的抗原。因此，在这些实施方案中，免疫缀合物分子在施用至患有实体瘤的受试者时，可以在受试者的肿瘤微环境中富集。
在一些实施方案中，本公开内容的免疫缀合物分子包括彼此可操作地连接的细胞因子部分、掩蔽部分和锚定部分。在具体实施方案中，掩蔽部分是双特异性二合一抗体或其抗原结合片段，该双特异性二合一抗体或其抗原结合片段能够与细胞因子部分和不是细胞因子的第二靶抗原结合。在具体实施方案中，锚定部分是能够与第三靶抗原，诸如存在于免疫缀合物分子的递送的靶位置中的抗原结合的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，递送的靶位置还包含足够量的第二靶抗原，以与细胞因子竞争结合掩蔽部分，导致掩蔽部分从细胞因子解离，并激活递送的靶位置处的细胞因子活性。
在一些实施方案中，免疫缀合物分子在施用至受试者时，可以实现组织特异性分布，并在受试者中含有足够量的第三抗原的靶组织或细胞环境中富集。在具体实施方案中，靶组织或细胞环境还包含足够量的第二靶抗原，以与细胞因子竞争结合掩蔽部分，导致掩蔽部分从细胞因子解离并激活靶组织或细胞环境中的细胞因子活性。
在具体实施方案中，分别由免疫缀合物的掩蔽部分和锚定部分识别的第二靶抗原和第三靶抗原是相同的抗原。在可选择的实施方案中，分别由免疫缀合物的掩蔽部分和锚定部分识别的第二靶抗原和第三靶抗原是不同的抗原。
在具体实施方案中，细胞因子部分包含白细胞介素-2(IL-2)多肽，并且免疫缀合物分子的非细胞因子部分包括掩蔽部分，掩蔽部分包含能够与免疫缀合物分子中的IL-2多肽和不是IL-2的第二靶抗原两者结合的双特异性二合一抗体。在特定实施方案中，第二靶抗原是由肿瘤细胞表达的抗原。在其他实施方案中，第二靶抗原是由肿瘤微环境中的细胞诸如肿瘤基质细胞表达的抗原。在一些实施方案中，第二靶抗原是肿瘤相关抗原。在具体实施方案中，第二靶抗原是成纤维细胞活化蛋白(FAP)。在具体实施方案中，免疫缀合物分子的非细胞因子部分还包括锚定部分，该锚定部分包含能够与不是IL-2的第三靶抗原结合的抗体或抗原结合片段。在特定实施方案中，第三靶抗原是由肿瘤细胞表达的抗原。在一些实施方案中，第三靶抗原是由肿瘤微环境中的细胞诸如肿瘤基质细胞表达的抗原。在一些实施方案中，第三靶抗原是肿瘤相关抗原。在具体实施方案中，第三靶抗原是成纤维细胞活化蛋白(FAP)。在又具体实施方案中，IL-2多肽是野生型IL-2多肽。在又具体实施方案中，IL-2多肽是野生型IL-2多肽。在其他实施方案中，IL-2多肽是突变IL-2多肽。在一些实施方案中，IL-2多肽是人类IL-2多肽。在一些实施方案中，IL-2多肽是猴IL-2多肽。在一些实施方案中，IL-2多肽是小鼠IL-2多肽。在一些实施方案中，IL-2多肽是如本文描述的突变IL-2多肽。在具体实施方案中，突变IL-2多肽是IL-2hex。可以与本公开内容关联使用的另外的突变IL-2多肽可以在美国专利第10,184,009号和第5,229,109号以及国际专利公布第WO2012107417A1号中找到，这些专利中的每一篇的公开内容通过引用以其整体包含在本文中。
在一些实施方案中，本发明的免疫缀合物分子包含锚定部分、掩蔽部分和细胞因子部分，它们经由缀合部分彼此可操作地连接。在一些实施方案中，缀合部分包含免疫球蛋白Fc结构域，该Fc结构域由免疫球蛋白的两个重链的Fc区组成(每个是Fc结构域的亚基)。在一些实施方案中，Fc结构域是IgG分子(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc结构域。
在一些实施方案中，Fc结构域的两个亚基可以都是天然序列Fc区。在一些实施方案中，Fc结构域的两个亚基可以都是变体Fc区。在一些实施方案中，Fc结构域的两个亚基可以是一个天然序列Fc区和一个变体Fc区。在某些实施方案中，Fc结构域包含促进两条不相同的免疫球蛋白重链的异二聚化的修饰。人类IgG Fc结构域的两条多肽链之间最广泛的蛋白质-蛋白质相互作用的位点在Fc区的CH3结构域中。因此，在一种实施方案中，所述修饰在Fc区的CH3结构域中。在具体实施方案中，所述修饰是knob-into-hole修饰，包括Fc亚基之一中的knob修饰和Fc亚基中另一个亚基中的hole修饰。knob-into-hole技术在例如美国专利第5,731,168号；美国专利第7,695,936号；Ridgway等人,Prot Eng 9,617-621(1996)和Carter,J Immunol Meth 248,7-15(2001)中描述。通常，该方法包括在第一多肽的界面处引入突起(“knob”)和在第二多肽的界面处引入相应的空腔(“hole”)，使得突起可以定位在空腔中，从而促进异源二聚体形成并阻碍同源二聚体形成。通过用较大的侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)替换第一多肽界面的小氨基酸侧链来构建突起。通过用较小的氨基酸侧链(例如，丙氨酸或苏氨酸)替换大氨基酸侧链，在第二多肽的界面上产生与突起相同或相似尺寸的补偿空腔。突起和空腔可以通过改变编码多肽的核酸，例如通过位点特异性诱变或通过肽合成来形成。在具体实施方案中，knob修饰包括两个Fc亚基之一中的氨基酸取代T366W，并且hole修饰包括两个Fc亚基中的另一个亚基中的氨基酸取代T366S、L368A和Y407V。在另外的具体实施方案中，包含knob修饰的Fc亚基另外包含氨基酸取代S354C，并且包含hole修饰的免疫球蛋白重链另外包含氨基酸取代Y349C。引入这两个半胱氨酸残基导致在两条重链之间形成二硫桥，从而进一步使二聚体稳定(Carter,J.Immunol Methods 248,7-15(2001))。
在可选择的实施方案中，促进两条不相同的多肽链的异二聚化的修饰包括介导静电转向效应(electrostatic steering effects)的修饰，例如如PCT公布WO 2009/089004中描述的。通常，该方法包括在两条多肽链的界面处的一个或更多个氨基酸残基被带电的氨基酸残基替换，使得同源二聚体的形成在静电上变得不利，但异二聚化在静电上有利。
不受该理论束缚，设想了Fc结构域赋予免疫缀合物分子有利的药代动力学性质，包括有助于在靶组织中良好积累的长的血清半衰期和有利的组织-血液分布比。同时，Fc结构域可能导致免疫缀合物分子不期望地靶向表达Fc受体的细胞，而不是靶向携带靶抗原的细胞。此外，Fc受体信号传导途径的共激活可以导致细胞因子释放，该细胞因子释放与免疫缀合物分子中的细胞因子多肽和免疫缀合物的长半衰期相结合，导致细胞因子受体的过度激活和在全身施用时的严重副作用。与此一致，已经描述了常规IgG-IL-2免疫缀合物与输注反应相关(参见，例如，King等人,J Clin Oneal 22,4463-4473(2004))。
在某些实施方案中，对抗体的Fc区的修饰导致抗体的效应子功能的降低或消除。在某些实施方案中，效应子功能是ADCC、ADCP和/或CDC。在一些实施方案中，效应子功能是ADCC。在其他实施方案中，效应子功能是ADCP。在其他实施方案中，效应子功能是CDC。在一种实施方案中，效应子功能是ADCC和ADCP。在一种实施方案中，效应子功能是ADCC和CDC。在一种实施方案中，效应子功能是ADCP和CDC。在一种实施方案中，效应子功能是ADCC、ADCP和CDC。这可以通过在抗体的Fc区中引入一个或更多个氨基酸取代来实现。例如，已示出使用在位置233-236处的IgG2残基和在位置327、330和331处的IgG4残基取代人类IgG1大大降低ADCC和CDC(参见例如Armour等人,1999,Eur.J.Immunol.29(8):2613-24；和Shields等人,2001,J.Biol.Chem.276(9):6591-604)。本文别处提供了其他Fc变体。
为了增加抗体的血清半衰期，可以将补救受体结合表位并入抗体(特别是抗体片段)中，例如，如美国专利第5,739,277中描述的。术语“补救受体结合表位”是指IgG分子(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc区的表位，其负责增加IgG分子的体内血清半衰期。
因此，在一些实施方案中，形成根据本公开内容的免疫缀合物分子的一部分的Fc结构域被工程化成具有降低的与Fc受体的结合亲和力。在一种这样的实施方案中，Fc结构域包含一个或更多个氨基酸突变，其降低Fc结构域与Fc受体的结合亲和力。在一种这样的实施方案中，一个或更多个这样的氨基酸突变存在于Fc结构域的两个Fc亚基之一中。在另一种这样的实施方案中，一个或更多个这样的氨基酸突变存在于Fc结构域的两个Fc亚基中。在各种实施方案中，这样的氨基酸突变将免疫缀合物与Fc受体的结合亲和力降低至少2倍、至少5倍或至少10倍。
在一些实施方案中，其中存在降低构成本发明的免疫缀合物分子的Fc结构域与Fc受体的结合亲和力的多于一个氨基酸突变，这些氨基酸突变的组合可以将Fc结构域与Fc受体的结合亲和力降低至少10倍、至少20倍、或甚至至少50倍。在一种实施方案中，与包含未工程化的免疫球蛋白分子的免疫缀合物相比，包含工程化的免疫球蛋白分子的免疫缀合物表现出小于20％，特别地小于10％，更特别地小于5％的与Fc受体的结合亲和力。
在一些实施方案中，Fc受体是活化性Fc受体。在具体实施方案中，Fc受体是Fcγ受体。更具体地，在一些实施方案中，Fc受体是FcγRIIIα受体、FcγRI受体或FcγRIIα受体。在一些实施方案中，Fc结构域与这些示例性受体中的每一种的结合减少。在一些实施方案中，Fc结构域与补体组分的结合亲和力降低。具体地，在一些实施方案中，Fc结构域与C1q的结合亲和力降低。在一种实施方案中，与新生儿Fc受体(FcRn)的结合亲和力没有降低。当包含所述Fc结构域的免疫缀合物表现出包含所述未工程化形式的Fc的未工程化形式的免疫缀合物分子与FcRn的结合亲和力的大于约70％时，实现了与FcRn的基本上相似的结合，即Fc结构域与所述受体的结合亲和力的保持。免疫球蛋白或包含所述免疫球蛋白的免疫缀合物可以表现出这样的亲和力的大于约80％和甚至大于约90％。
在一些实施方案中，形成本发明的免疫缀合物分子的一部分的Fc结构域不是天然序列Fc结构域，并且在其Fc亚基之一中具有至少一个氨基酸突变。在一些实施方案中，形成本发明的免疫缀合物分子的一部分的Fc结构域不是天然序列Fc结构域，并且在其Fc亚基中的两个Fc亚基中具有至少一个氨基酸突变。在一些实施方案中，Fc结构域的两个Fc亚基中的氨基酸突变是相同的突变。在一些实施方案中，Fc结构域的两个Fc亚基中的氨基酸突变是不同的突变。在一些实施方案中，氨基酸突变选自氨基酸取代、氨基酸缺失和氨基酸插入。在特定实施方案中，免疫缀合物分子的Fc结构域中的一个或两个Fc亚基包含在Fc亚基的任一个或更多个氨基酸位置228、233、234、235、236、265、297、329、330和331处的一个或更多个氨基酸突变，其中Fc亚基中的残基的编号是如Kabat中的EU索引的编号。在特定实施方案中，这样的一个或更多个氨基酸取代包括S228P。在特定实施方案中，这样的一个或更多个氨基酸取代包括E233P。在特定实施方案中，这样的一个或更多个氨基酸取代包括L234V或L234A。在特定实施方案中，这样的一个或更多个氨基酸取代包括L235A或L235E。在特定实施方案中，这样的一个或更多个氨基酸缺失包括ΔG236。在特定实施方案中，这样的一个或更多个氨基酸取代包括D265G。在特定实施方案中，这样的一个或更多个氨基酸取代包括N297A或N297D。在特定实施方案中，这样的一个或更多个氨基酸取代包括P329E、P329A或P329G，特别是P329E。在特定实施方案中，这样的一个或更多个氨基酸取代包括A330S。在特定实施方案中，这样的一个或更多个氨基酸取代包括P331S。
在特定实施方案中，Fc结构域包含在位置E233、L234、L235、G236、A330和P331处的氨基酸突变。在具体实施方案中，两个Fc亚基都包含在位置E233、L234、L235、G236、A330和P331处的氨基酸突变。在特定实施方案中，Fc结构域包含氨基酸突变E233P、L234V、L235A、ΔG236、A330S和P331S。在具体实施方案中，两个Fc亚基都包含氨基酸突变E233P、L234V、L235A、ΔG236、P329S、A330S和P331S。
在特定实施方案中，Fc结构域包含在位置L234、L235、A330和P331处的氨基酸突变。在具体实施方案中，两个Fc亚基都包含在位置L234、L235、A330和P331处的氨基酸突变。在特定实施方案中，Fc结构域包含氨基酸突变L234A、L235A、A330S和P331S。在具体实施方案中，两个Fc亚基都包含氨基酸突变L234A、L235A、A330S和P331S。
在特定实施方案中，Fc结构域包含在位置E233、L234、L235、G236、P329、A330和P331处的氨基酸突变。在具体实施方案中，两个Fc亚基都包含在位置E233、L234、L235、G236、P329、A330和P331处的氨基酸突变。在特定实施方案中，Fc结构域包含氨基酸突变E233P、L234V、L235A、ΔG236、P329E、A330S和P331S。在具体实施方案中，两个Fc亚基都包含氨基酸突变E233P、L234V、L235A、ΔG236、P329E、A330S和P331S。
在特定实施方案中，Fc结构域包含在位置L234、L235、P329、A330和P331处的氨基酸突变。在具体实施方案中，两个Fc亚基都包含在位置L234、L235、P329、A330和P331处的氨基酸突变。在特定实施方案中，Fc结构域包含氨基酸突变L234A、L235A、P329E、A330S和P331S。在具体实施方案中，两个Fc亚基都包含氨基酸突变L234A、L235A、P329E、A330S和P331S。
在特定实施方案中，Fc结构域包含在位置E233、L234、L235、G236和P329处的氨基酸突变。在具体实施方案中，两个Fc亚基都包含在位置E233、L234、L235、G236和P329处的氨基酸突变。在特定实施方案中，Fc结构域包含氨基酸突变E233P、L234V、L235A、ΔG236和P329E。在具体实施方案中，两个Fc亚基都包含氨基酸突变E233P、L234V、L235A、ΔG236和P329E。
在特定实施方案中，Fc结构域包含在位置L234、L235、P329处的氨基酸突变。在具体实施方案中，两个Fc亚基都包含在位置L234、L235、P329处的氨基酸突变。在特定实施方案中，Fc结构域包含氨基酸突变L234A、L235A和P329E。在具体实施方案中，两个Fc亚基都包含氨基酸突变L234A、L235A和P329E。
在特定实施方案中，Fc结构域包含在位置E233、L234、L235、G236、D265、A330和P331处的氨基酸突变。在具体实施方案中，两个Fc亚基都包含在位置E233、L234、L235、G236、D265、A330和P331处的氨基酸突变。在特定实施方案中，Fc结构域包含氨基酸突变E233P、L234V、L235A、ΔG236、D265G、A330S和P331S。在具体实施方案中，两个Fc亚基都包含氨基酸突变E233P、L234V、L235A、ΔG236、D265G、A330S和P331S。在这些实施方案中，Fc结构域具有降低的与Fcγ受体的结合亲和力。
在特定实施方案中，Fc结构域包含在位置L234、L235、D265、A330和P331处的氨基酸突变。在具体实施方案中，两个Fc亚基都包含在位置L234、L235、D265、A330和P331处的氨基酸突变。在特定实施方案中，Fc结构域包含氨基酸突变L234A、L235A、D265G、A330S和P331S。在具体实施方案中，两个Fc亚基都包含氨基酸突变L234A、L235A、D265G、A330S和P331S。
在特定实施方案中，Fc结构域包含在位置E233、L234、L235、G236、D265、P329、A330和P331处的氨基酸突变。在具体实施方案中，两个Fc亚基都包含在位置E233、L234、L235、G236、D265、P329、A330和P331处的氨基酸突变。在特定实施方案中，Fc结构域包含氨基酸突变E233P、L234V、L235A、ΔG236、D265G、P329E、A330S和P331S。在具体实施方案中，两个Fc亚基都包含氨基酸突变E233P、L234V、L235A、ΔG236、D265G、P329E、A330S和P331S。
在特定实施方案中，Fc结构域包含在位置L234、L235、D265、P329、A330和P331处的氨基酸突变。在具体实施方案中，两个Fc亚基都包含在位置L234、L235、D265、P329、A330和P331处的氨基酸突变。在特定实施方案中，Fc结构域包含氨基酸突变L234A、L235A、D265G、P329E、A330S和P331S。在具体实施方案中，两个Fc亚基都包含氨基酸突变L234A、L235A、D265G、P329E、A330S和P331S。
在特定实施方案中，Fc结构域包含在位置E233、L234、L235、G236、D265和P329处的氨基酸突变。在具体实施方案中，两个Fc亚基都包含在位置E233、L234、L235、G236、D265和P329处的氨基酸突变。在特定实施方案中，Fc结构域包含氨基酸突变E233P、L234V、L235A、ΔG236、D265G和P329E。在具体实施方案中，两个Fc亚基都包含氨基酸突变E233P、L234V、L235A、ΔG236、D265G和P329E。
在特定实施方案中，Fc结构域包含在位置L234、L235、D265和P329处的氨基酸突变。在具体实施方案中，两个Fc亚基都包含在位置L234、L235、D265和P329处的氨基酸突变。在特定实施方案中，Fc结构域包含氨基酸突变L234A、L235A、D265G和P329E。在具体实施方案中，两个Fc亚基都包含氨基酸突变L234A、L235A、D265G和P329E。
在特定实施方案中，Fc结构域包含在位置L234、L235和P329处的氨基酸突变。在具体实施方案中，两个Fc亚基都包含在位置L234、L235和P329处的氨基酸突变。在特定实施方案中，Fc结构域包含氨基酸突变L234A、L235A和P329G。在具体实施方案中，两个Fc亚基都包含氨基酸突变L234A、L235A和P329G。
根据本公开内容，本发明的免疫缀合物分子包含锚定部分、掩蔽部分和细胞因子部分，它们经由缀合部分彼此可操作地连接。在具体实施方案中，细胞因子部分包含细胞因子多肽。在具体实施方案中，掩蔽部分包含能够与细胞因子多肽和第二靶抗原结合的双特异性二合一抗体或抗原结合片段。在具体实施方案中，锚定部分包含能够与第三靶抗原结合的抗体或其抗原结合片段。在具体实施方案中，缀合部分包含由免疫球蛋白重链的两个Fc区组成的免疫球蛋白Fc结构域(每个Fc区被称为Fc结构域的亚基或“Fc亚基”)。在一些实施方案中，Fc结构域包含促进两个Fc亚基的异二聚化的修饰。在具体实施方案中，所述修饰是knob-into-hole修饰，包括Fc亚基之一中的knob修饰(Fc-knob)和Fc亚基中另一个亚基中的hole修饰(Fc-hole)。
根据本公开内容，在这些实施方案中，免疫缀合物分子的细胞因子部分、掩蔽部分和锚定部分可以经由缀合部分以各种不同的构型彼此可操作地连接。在一种示例性实施方案中，细胞因子部分包含与一个Fc亚基的C末端融合的细胞因子多肽。在一种示例性实施方案中，掩蔽部分包含与一个Fc亚基的C末端融合的抗体或其抗原结合片段。在一种示例性实施方案中，细胞因子部分包含与Fc结构域的一个亚基的C末端融合的细胞因子多肽，并且掩蔽部分包含与另一个Fc亚基的C末端融合的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，掩蔽部分与Fc亚基的C末端融合。在一些实施方案中，Fc结构域包含促进两个Fc亚基的异二聚化的修饰。在具体实施方案中，所述修饰是knob-into-hole修饰，包括Fc亚基之一中的knob修饰(Fc-knob亚基)和Fc亚基中另一个亚基中的hole修饰(Fc-hole亚基)。
在一种示例性实施方案中，细胞因子部分包含与一个Fc亚基的C末端融合的细胞因子多肽。在一种示例性实施方案中，掩蔽部分包含与一个Fc亚基的C末端融合的双特异性二合一抗体或其抗原结合片段。在一种示例性实施方案中，锚定部分包含与一个Fc亚基的N末端融合的抗体或其抗原结合片段。在一种示例性实施方案中，细胞因子部分包含与Fc结构域的一个亚基的C末端融合的细胞因子多肽，并且掩蔽部分包含与另一个Fc亚基的C末端融合的双特异性二合一抗体或其抗原结合片段。在一种示例性实施方案中，细胞因子部分包含与Fc结构域的一个亚基的C末端融合的细胞因子多肽，掩蔽部分包含与另一个Fc亚基的C末端融合的双特异性二合一抗体或其抗原结合片段，并且锚定部分包含与Fc结构域的一个亚基的N末端融合的抗体或其抗原结合片段。在具体实施方案中，锚定部分和细胞因子部分分别与同一Fc亚基的N末端和C末端融合。在具体实施方案中，掩蔽部分和细胞因子部分分别与同一Fc亚基的N末端和C末端融合。在一些实施方案中，Fc结构域包含促进两个Fc亚基的异二聚化的修饰。在具体实施方案中，所述修饰是knob-into-hole修饰，包括Fc亚基之一中的knob修饰(Fc-knob亚基)和Fc亚基中另一个亚基中的hole修饰(Fc-hole亚基)。
在一种示例性实施方案中，掩蔽部分包含与一个Fc亚基的N末端融合的双特异性二合一抗体或其抗原结合片段。在一种示例性实施方案中，细胞因子部分包含与掩蔽部分融合的细胞因子多肽。在一种示例性实施方案中，掩蔽部分包含与一个Fc亚基的N末端融合的双特异性二合一抗体或其抗原结合片段，并且细胞因子部分包含与掩蔽部分融合的细胞因子多肽。在一种示例性实施方案中，锚定部分包含与一个Fc亚基的N末端融合的抗体或其抗原结合片段。在一种示例性实施方案中，细胞因子部分包含与锚定部分融合的细胞因子多肽。在一种示例性实施方案中，掩蔽部分包含与一个Fc亚基的N末端融合的双特异性二合一抗体或其抗原结合片段，锚定部分包含与另一个Fc亚基的N末端融合的抗体或其抗原结合片段，并且细胞因子部分包含与掩蔽部分融合的细胞因子多肽。在一种示例性实施方案中，掩蔽部分包含与一个Fc亚基的N末端融合的双特异性二合一抗体或其抗原结合片段，锚定部分包含与另一个Fc亚基的N末端融合的抗体或其抗原结合片段，并且细胞因子部分包含与锚定部分融合的细胞因子多肽。在一些实施方案中，Fc结构域包含促进两个Fc亚基的异二聚化的修饰。在具体实施方案中，所述修饰是knob-into-hole修饰，包括Fc亚基之一中的knob修饰(Fc-knob亚基)和Fc亚基中另一个亚基中的hole修饰(Fc-hole亚基)。
在一种示例性实施方案中，掩蔽部分包含与一个Fc亚基的C末端融合的双特异性二合一抗体或其抗原结合片段。在一种示例性实施方案中，细胞因子部分包含与掩蔽部分融合的细胞因子多肽。在一种示例性实施方案中，掩蔽部分包含与一个Fc亚基的C末端融合的双特异性二合一抗体或其抗原结合片段，并且细胞因子部分包含与掩蔽部分融合的细胞因子多肽。在一种示例性实施方案中，锚定部分包含与一个Fc亚基的N末端融合的抗体或其抗原结合片段。在一种示例性实施方案中，掩蔽部分包含与一个Fc亚基的C末端融合的双特异性二合一抗体或其抗原结合片段，锚定部分包含与另一个Fc亚基的N末端融合的抗体或其抗原结合片段，并且细胞因子部分包含与掩蔽部分融合的细胞因子多肽。在具体实施方案中，掩蔽部分和锚定部分与同一Fc亚基结合。在具体实施方案中，掩蔽部分和锚定部分与不同Fc亚基结合。在一些实施方案中，Fc结构域包含促进两个Fc亚基的异二聚化的修饰。在具体实施方案中，所述修饰是knob-into-hole修饰，包括Fc亚基之一中的knob修饰(Fc-knob亚基)和Fc亚基中另一个亚基中的hole修饰(Fc-hole亚基)。
在一种示例性实施方案中，掩蔽部分包含与一个Fc亚基的C末端融合的双特异性二合一抗体或其抗原结合片段。在一种示例性实施方案中，细胞因子部分包含与一个Fc亚基的C末端融合的细胞因子多肽。在一种示例性实施方案中，锚定部分包含与掩蔽部分融合的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，Fc结构域包含促进两个Fc亚基的异二聚化的修饰。在具体实施方案中，所述修饰是knob-into-hole修饰，包括Fc亚基之一中的knob修饰(Fc-knob亚基)和Fc亚基中另一个亚基中的hole修饰(Fc-hole亚基)。
在一种示例性实施方案中，掩蔽部分包含与一个Fc亚基的N末端融合的双特异性二合一抗体或其抗原结合片段。在一种示例性实施方案中，细胞因子部分包含与一个Fc亚基的N末端融合的细胞因子多肽。在一种示例性实施方案中，锚定部分包含与掩蔽部分融合的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，Fc结构域包含促进两个Fc亚基的异二聚化的修饰。在具体实施方案中，所述修饰是knob-into-hole修饰，包括Fc亚基之一中的knob修饰(Fc-knob亚基)和Fc亚基中另一个亚基中的hole修饰(Fc-hole亚基)。
根据本公开内容，在本文描述的任何实施方案中，免疫缀合物分子的不同部分可以与肽接头序列连接。在一些实施方案中，肽接头具有至少5个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽接头具有至少7个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽接头具有至少10个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽接头具有至少15个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽接头具有至少20个氨基酸残基。
根据本公开内容，在本文描述的任何实施方案中，形成免疫缀合物分子的一部分的抗体的非限制性实例可以是合成抗体、重组产生的抗体、骆驼源化抗体、内抗体、抗独特型(抗Id)抗体。在一些实施方案中，形成免疫缀合物分子的一部分的抗体是单克隆抗体。在本文描述的任何实施方案中，形成免疫缀合物分子的一部分的抗原结合片段可以是抗体的功能片段，该功能片段保留该片段所源自的抗体的部分或全部结合活性。功能片段(例如，抗原结合片段，诸如IL-2结合片段)的非限制性实例包括单链Fv(scFv)(例如，包括单特异性、双特异性等)、Fab片段(例如，包括单特异性、双特异性等)、F(ab’)片段、F(ab)2片段、F(ab’)2片段、二硫键连接的Fv(dsFv)、Fd片段、Fv片段、双抗体、三抗体、四抗体、微抗体和单结构域抗体(VHH或纳米抗体)。在具体实施方案中，免疫缀合物分子可以具有如图5所示的构型1至构型20中的任一种。
例如，在具体实施方案中，本发明的免疫缀合物分子的掩蔽部分中的双特异性二合一抗体是Fab片段。例如，在具体实施方案中，本发明的免疫缀合物分子的掩蔽部分中的双特异性二合一抗体是ScFv片段。例如，在具体实施方案中，本发明的免疫缀合物分子的掩蔽部分中的双特异性二合一抗体是单结构域(VHH)抗体。
例如，在具体实施方案中，本发明的免疫缀合物分子的锚定部分中的抗体是Fab片段。例如，在具体实施方案中，本发明的免疫缀合物分子的锚定部分中的抗体是ScFv片段。例如，在具体实施方案中，本发明的免疫缀合物分子的锚定部分中的抗体是单结构域(VHH)抗体。
例如，在具体实施方案中，本发明的免疫缀合物分子的掩蔽部分中的双特异性二合一抗体是Fab片段，并且免疫缀合物分子的锚定部分中的抗体也是Fab片段。例如，在具体实施方案中，本发明的免疫缀合物分子的掩蔽部分中的双特异性二合一抗体是Fab片段，并且免疫缀合物分子的锚定部分中的抗体是ScFv片段。例如，在具体实施方案中，本发明的免疫缀合物分子的掩蔽部分中的双特异性二合一抗体是Fab片段，并且免疫缀合物分子的锚定部分中的抗体是单结构域(VHH)片段。
例如，在具体实施方案中，本发明的免疫缀合物分子的掩蔽部分中的双特异性二合一抗体是ScFv片段，并且免疫缀合物分子的锚定部分中的抗体是Fab片段。例如，在具体实施方案中，本发明的免疫缀合物分子的掩蔽部分中的双特异性二合一抗体是ScFv片段，并且免疫缀合物分子的锚定部分中的抗体也是ScFv片段。例如，在具体实施方案中，本发明的免疫缀合物分子的掩蔽部分中的双特异性二合一抗体是ScFv片段，并且免疫缀合物分子的锚定部分中的抗体是单结构域(VHH)片段。
例如，在具体实施方案中，本发明的免疫缀合物分子的掩蔽部分中的双特异性二合一抗体是单结构域(VHH)抗体，并且免疫缀合物分子的锚定部分中的抗体是Fab片段。例如，在具体实施方案中，本发明的免疫缀合物分子的掩蔽部分中的双特异性二合一抗体是单结构域(VHH)抗体，并且免疫缀合物分子的锚定部分中的抗体是ScFv片段。例如，在具体实施方案中，本发明的免疫缀合物分子的掩蔽部分中的双特异性二合一抗体是单结构域(VHH)抗体，并且免疫缀合物分子的锚定部分中的抗体也是单结构域(VHH)片段。
在具体实施方案中，形成本发明的免疫缀合物分子的一部分的双特异性二合一抗体或其抗原结合片段能够与IL-2多肽和纤维化活化蛋白(FAP)两者结合。在具体实施方案中，双特异性二合一抗体包含表1-表4中描绘的氨基酸序列的VH区、VL区、VH CDR1、VHCDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和/或VL CDR3。因此，在一些实施方案中，本文提供的二合一抗体或其功能片段包含来自如表1-表2所示的以下项的一个、两个和/或三个重链CDR和/或一个、两个和/或三个轻链CDR：(a)抗体D001，(b)抗体D002，(c)抗体D029，(d)抗体D003，(e)抗体D047，(f)抗体D049，(g)轻链变体D029LV1、D029LV2、D029LV3、D029LV4和D029LV5中的任一种，(h)重链变体D029HV1、D029HV2、D029HV3、D029HV4、D029HV5和D029HV6中任一种，或(i)抗体B10。在具体实施方案中，本文提供的二合一抗体或其功能片段包含来自抗体D029-HV1LV1、抗体D029-HV2LV3、抗体D029-HV2LV4、抗体D029-HV1LV5、抗体D029-HV3LV2、抗体D029-HV4LV2或抗体D029-HV6LV2的一个、两个和/或三个重链CDR和/或一个、两个和/或三个轻链CDR。在一些实施方案中，本文提供的二合一抗体或其功能片段包含选自如表3-表4所示的以下项的VH区和VL区：(a)抗体D001，(b)抗体D002，(c)抗体D029，(d)抗体D003，(e)抗体D047，(f)抗体D049，(g)轻链变体D029LV1、D029LV2、D029LV3、D029LV4和D029LV5中的任一种，(h)重链变体D029HV1、D029HV2、D029HV3、D029HV4、D029HV5和D029HV6中任一种，或(i)抗体B10。在具体实施方案中，本文提供的二合一抗体或其功能片段包含来自抗体D029-HV1LV1、抗体D029-HV2LV3、抗体D029-HV2LV4、抗体D029-HV1LV5、抗体D029-HV3LV2、抗体D029-HV4LV2或抗体D029-HV6LV2的VH区和VL区。命名法“D029-HVxLVx”是指包含如表3-表4所示的相应编号的VH结构域序列和VL结构域序列的组合的抗体。例如，“D029-HV2LV3”是指包含如表3-表4所示的VH结构域序列D029HV2和VL结构域序列D029LV3的抗体。
表1.二合一VL CDR氨基酸序列
表2.二合一VH CDR氨基酸序列
表3.二合一VL结构域氨基酸序列
表4.二合一VH结构域氨基酸序列
在具体实施方案中，本发明的免疫缀合物分子的锚定部分包含与纤维化活化蛋白(FAP)结合的抗体或其抗原结合片段。在具体实施方案中，抗FAP抗体包含表5-表8中描绘的氨基酸序列的VH区、VL区、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和/或VL CDR3。因此，在一些实施方案中，本文提供的抗FAP抗体或其功能片段包含来自如表5-表6所示的以下项的一个、两个和/或三个重链CDR和/或一个、两个和/或三个轻链CDR：(a)抗体872-5、(b)抗体872-59、(c)872-70、(d)872-5V1或(e)VHH6。在一些实施方案中，本文提供的抗FAP抗体或其功能片段包含来自如表7-表8所示的以下项的VH区和VL区：(a)抗体872-5、(b)抗体872-59、(c)872-70、(d)872-5V1或(e)VHH6。
表5.抗FAP VL CDR氨基酸序列
表6.抗FAP VH CDR氨基酸序列
表7.抗FAP VL结构域氨基酸序列
表8.抗FAP VH结构域氨基酸序列
在一个特定方面中，本文提供了包含IL-2的免疫缀合物分子，该免疫缀合物分子通过与IL-2区可逆结合和解离来调节IL-2活性，该IL-2区负责与特定IL-2R亚基结合。在一些实施方案中，免疫缀合物分子中的IL-2多肽还包含一个或更多个突变，该一个或更多个突变修饰IL-2多肽与特定IL-2R亚基的结合活性。
在一些实施方案中，免疫缀合物分子包含与掩蔽部分缀合的IL-2多肽，其中掩蔽部分包含能够与IL-2多肽和第一靶抗原结合的二合一抗体或其抗原结合片段；其中当与IL-2多肽结合时，掩蔽部分阻断IL-2多肽与IL-2受体α亚基(IL-2Rα)的结合；并且其中当与第一靶抗原结合时，掩蔽部分从IL-2多肽解离，从而释放IL-2多肽用于与IL-2Rα结合，并且其中IL-2多肽包含减弱IL-2多肽与IL-2Rβ的结合的一个或更多个突变。在一些实施方案中，IL-2多肽还包含修饰IL-2多肽与IL-2Rγ的结合的一个或更多个突变。
在一些实施方案中，免疫缀合物分子包含与掩蔽部分缀合的IL-2多肽，其中掩蔽部分包含能够与IL-2多肽和第一靶抗原结合的二合一抗体或其抗原结合片段；其中当与IL-2多肽结合时，掩蔽部分阻断IL-2多肽与IL-2受体α亚基(IL-2Rβ)的结合；并且其中当与第一靶抗原结合时，掩蔽部分从IL-2多肽解离，从而释放IL-2多肽用于与IL-2Rβ结合，并且其中IL-2多肽包含减弱IL-2多肽与IL-2Rα的结合的一个或更多个突变。在一些实施方案中，IL-2多肽还包含修饰IL-2多肽与IL-2Rγ的结合的一个或更多个突变。
在一些实施方案中，掩蔽部分阻断IL-2多肽与IL-2Rα亚基的结合。在一些实施方案中，掩蔽部分与IL-2的表位结合，该IL-2的表位包含IL-2的残基P34、K35、R38、T41、F42、K43、F44、Y45、E61、E62、K64、P65、E68、V69、N71、L72、Q74、Y107和D109中的一个或更多个。
在一些实施方案中，掩蔽部分阻断IL-2多肽与IL-2Rα亚基的结合。在具体实施方案中，掩蔽部分与由抗体识别的IL-2的表位结合，该抗体包含具有SEQ ID NO:101的氨基酸序列的轻链可变区和具有SEQ ID NO:102的氨基酸序列的重链可变区。在一些实施方案中，掩蔽部分与包含具有SEQ ID NO:101的氨基酸序列的轻链可变区和具有SEQ ID NO:102的氨基酸序列的重链可变区的抗体竞争结合IL-2。在一些实施方案中，掩蔽部分包含(a)轻链可变区(VL)，该轻链可变区(VL)包含表1中列出的抗体B10的VL互补决定区1(CDR1)、VLCDR2和VL CDR3；和/或(b)重链可变区(VH)，该重链可变区(VH)包含表2中列出的抗体B10的VH互补决定区1(CDR1)、VH CDR2和VH CDR3。在一些实施方案中，其中掩蔽部分包括(a)分别包含SEQ ID NO:103、17和104的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，以及(b)分别包含SEQ ID NO:105、106和38的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。在一些实施方案中，其中掩蔽部分包括：(a)包含表3中列出的抗体B10的VL的轻链可变区(VL)；和/或(b)包含表4中列出的抗体B10的VH的重链可变区(VH)。在一些实施方案中，其中掩蔽部分包括包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，其中掩蔽部分包括包含SEQ IDNO:102的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，其中掩蔽部分包括(a)包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列的VL；和(b)包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列的VH。
在一些实施方案中，掩蔽部分阻断IL-2多肽与IL-2Rβ的结合。在一些实施方案中，掩蔽部分与包含IL-2的残基L12、Q13、E15、H16、L19、D20、M23、R81、D84、D87、N88、V91、I92和E95中的一个或更多个的IL-2的表位结合。在一些实施方案中，掩蔽部分与由抗体5UTZ识别的IL-2的表位结合。在一些实施方案中，掩蔽部分与抗体5UTZ竞争结合IL-2。
在一些实施方案中，免疫缀合物分子的IL-2多肽包含减弱IL-2多肽与IL-2Rα的结合的一个或更多个突变。在一些实施方案中，减弱IL-2多肽与IL-2Rα的结合的一个或更多个突变选自K35E、R38A、R38E、R38D、F42A、F42K、K43E、Y45A、E61R、E62A、L72G或其组合。在一些实施方案中，减弱IL-2多肽与IL-2Rα的结合的一个或更多个突变包括选自K35E、R38A、R38E、R38D、F42A、F42K、K43E、Y45A、E61R、E62A、L72G的任一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个突变。例如，在一些实施方案中，减弱IL-2多肽与IL-2Rα的结合的一个或更多个突变包括F42A。在一些实施方案中，减弱IL-2多肽与IL-2Rα的结合的一个或更多个突变包括K35E和F42A。在一些实施方案中，减弱IL-2多肽与IL-2Rα的结合的一个或更多个突变包括F42A、Y45A和L72G。在一些实施方案中，减弱IL-2多肽与IL-2Rα的结合的一个或更多个突变包括R38D、K43E、E61R。在一些实施方案中，减弱IL-2多肽与IL-2Rα的结合的一个或更多个突变包括R38A、F42A、Y45A和E62A。在一些实施方案中，与野生型IL-2相比，IL-2多肽与IL-2Rα亚基的结合减少约10％、约20％、约30％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％。在一些实施方案中，与野生型IL-2相比，IL-2多肽与IL-2Rα亚基的结合减少约0.5％至10％、约10％至20％、约20％至30％、约30％至40％、约40％至45％、约45％至50％、约55％至55％、约55％至60％、约60％至65％、约65％至70％、约70％至75％、约75％至80％、约80％至85％、约85％至90％、约90％至95％或95％至约99％。
在一些实施方案中，免疫缀合物分子的IL-2多肽包含减弱IL-2多肽与IL-2Rβ的结合的一个或更多个突变。在一些实施方案中，减弱IL-2多肽与IL-2Rβ的结合的一个或更多个突变选自H16E、H16R、H16A、D20T、D20G、D20A、N88D、N88S、N88R、V91G、V91A、V91R和V91S或其组合。在一些实施方案中，减弱IL-2多肽与IL-2Rβ的结合的一个或更多个突变包括选自H16E、H16R、H16A、D20T、D20G、D20A、N88D、N88S、N88R、V91G、V91A、V91R和V91S的任一个、两个、三个或四个突变。在一些实施方案中，与野生型IL-2相比，IL-2多肽与IL-2Rβ亚基的结合减少约10％、约20％、约30％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％。在一些实施方案中，与野生型IL-2相比，IL-2多肽与IL-2Rα亚基的结合减少约0.5％至10％、约10％至20％、约20％至30％、约30％至40％、约40％至45％、约45％至50％、约55％至55％、约55％至60％、约60％至65％、约65％至70％、约70％至75％、约75％至80％、约80％至85％、约85％至90％、约90％至95％或95％至约99％。
在一些实施方案中，IL-2多肽还包含修饰IL-2多肽与IL-2Rγ链(IL-2Rγ)的结合的一个或更多个突变。在一些实施方案中，修饰IL-2多肽与IL-2Rγ的结合的一个或更多个突变选自L18R，Q22E，Q74H，L80F，R81D，L85V，I92F，T123A，Q126X，其中X＝H、M、K、R、E、S、G、A、C、D、I或T，I129V，S130A，S130R或其组合。在一些实施方案中，修饰IL-2多肽与IL-2Rγ的结合的一个或更多个突变包括选自L18R，Q22E，Q74H，L80F，R81D，L85V，I92F，T123A，Q126X，其中X＝H、M、K、R、E、S、G、A、C、D、I或T，I129V、S130A和S130R的任一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或十一个突变。例如，在一些实施方案中，修饰IL-2多肽与IL-2Rγ的结合的一个或更多个突变包括Q126T、Q74H、L80F、R81D、L85V和I92F。在一些实施方案中，修饰IL-2多肽与IL-2Rγ的结合的一个或更多个突变包括L18R、Q22E、Q126T和S130R。在一些实施方案中，与野生型IL-2相比，IL-2多肽与IL-2Rγ亚基的结合增强或减少约10％、约20％、约30％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％。在一些实施方案中，与野生型IL-2相比，IL-2多肽与IL-2Rα亚基的结合减少约0.5％至10％、约10％至20％、约20％至30％、约30％至40％、约40％至45％、约45％至50％、约50％至55％、约55％至60％、约60％至65％、约65％至70％、约70％至75％、约75％至80％、约80％至85％、约85％至90％、约90％至95％或95％至约99％。
在一些实施方案中，如本文描述的包含IL-2的免疫缀合物分子还包含如本文描述的锚定部分。在一些实施方案中，锚定部分包含与第二靶抗原特异性结合的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，其中在存在在第一细胞的表面上表达的第一靶抗原的情况下，掩蔽部分从IL-2多肽解离。
在一些实施方案中，其中第二靶抗原在第一细胞或靠近第一细胞的第二细胞的表面上表达。在一些实施方案中，第一靶抗原和第二靶抗原是相同的或不同的。在一些实施方案中，第一靶抗原和/或第二靶抗原是肿瘤相关抗原。在一些实施方案中，第一靶抗原和第二靶抗原各自独立地选自FAP、Her2、Her3、CD19、CD20、BCMA、PSMA、CEA、cMET、EGFR、CA-125、MUC-1、EpCAM或Trop-2。在一些实施方案中，第一靶抗原是FAP。
在一些实施方案中，如本文描述的包含IL-2的免疫缀合物分子还包含如本文描述的缀合部分。
5.3.1多克隆抗体
形成本公开内容的免疫缀合物分子的一部分的抗体可以包括多克隆抗体。制备多克隆抗体的方法是本领域技术人员已知的。多克隆抗体可在哺乳动物中产生(raised)，例如，通过一次或更多次注射免疫剂和如果需要，佐剂。通常，免疫剂和/或佐剂将在哺乳动物中通过多次皮下或腹膜内注射注入。免疫剂可以包括多肽或其融合蛋白(例如，IL-2多肽或FAP多肽)。将免疫剂与已知在被免疫的哺乳动物中是免疫原性的蛋白缀合或用该蛋白和一种或更多种佐剂免疫哺乳动物可以是有用的。此类免疫原性蛋白的实例包括但不限于匙孔血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白和大豆胰蛋白酶抑制剂。可以采用的佐剂的实例包括Ribi、CpG、Poly 1C、弗氏完全佐剂和MPL-TDM佐剂(单磷酰基脂质A、合成的海藻糖二棒状杆菌枝菌酸酯(trehalose dicorynomycolate))。免疫方案可以由本领域技术人员选择而无需过度实验。然后可以将哺乳动物放血，并且对血清进行抗体滴度测定。如果需要，可以对哺乳动物加强，直到抗体滴度增加或稳定。另外地或可选地，可以从免疫的动物获得淋巴细胞，用于融合和制备来自杂交瘤的单克隆抗体，如下文描述的。
5.3.2单克隆抗体
形成本公开内容的免疫缀合物分子的一部分的抗体可以可选地是单克隆抗体。单克隆抗体可以使用由Kohler等人，1975,Nature 256:495-97首次描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过重组DNA方法(参见例如，美国专利第4,816,567号)制备。
在杂交瘤方法中，如以上描述对小鼠或其他适当的宿主动物，诸如仓鼠进行免疫，以引发产生或能够产生将与用于免疫的蛋白特异性结合的抗体的淋巴细胞。可选地，淋巴细胞可以在体外被免疫。免疫之后，分离淋巴细胞，并且然后使用合适的融合剂诸如聚乙二醇与骨髓瘤细胞系融合，以形成杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice 59-103(1986))。
将如此制备的杂交瘤细胞接种并且生长在合适的培养基中，在某些实施方案中，该培养基含有一种或更多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞(也称为融合配偶体)生长或存活的物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的选择性培养基通常将包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，它们阻止缺乏HGPRT的细胞生长。
示例性融合配偶体骨髓瘤细胞是那些有效融合、支持选择的抗体产生细胞稳定的高水平产生抗体、并对针对未融合亲本细胞进行选择的选择性培养基敏感的骨髓瘤细胞。示例性骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤细胞系，诸如SP-2和衍生物，例如，可从美国典型培养物保藏中心(Manassas,VA)获得的X63-Ag8-653细胞，以及那些衍生自可从Salk细胞配送中心研宄所(the Salk Institute Cell Distribution Center)(San Diego,CA)获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的细胞系。人类骨髓瘤和小鼠-人类异质骨髓瘤细胞系也已被描述用于产生人类单克隆抗体(Kozbor,1984,Immunol.133:3001-05；以及Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications 51-63(1987))。
测定其中杂交瘤细胞正在生长的培养基中针对抗原的单克隆抗体的产生。杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或通过体外结合测定，诸如RIA或ELISA来确定。单克隆抗体的结合亲和力可以例如通过Munson等人，1980,Anal.Biochem.107:220-39中描述的Scatchard分析来确定。
在鉴定了产生所期望的特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，可以通过有限的稀释程序对克隆进行亚克隆，并通过标准方法(Goding，同上)生长。适用于该目的的培养基包括例如DMEM或RPMI-1640培养基。此外，杂交瘤细胞可以在动物中作为腹水肿瘤体内生长，例如通过i.p.注射将细胞注射到小鼠中。
通过常规抗体纯化程序，诸如例如亲和层析(例如，使用蛋白A或蛋白G-Sepharose)或离子交换层析、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析等，将由亚克隆分泌的单克隆抗体从培养基、腹水或血清合适地分离。
编码单克隆抗体的DNA使用常规程序(例如，通过使用能够与编码鼠抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)容易地分离和测序。杂交瘤细胞可以用作这样的DNA的来源。在分离后，可以将DNA放置到表达载体中，然后将其转染到本来不产生抗体蛋白的宿主细胞，诸如大肠杆菌(E.coli)细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞中，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。关于编码抗体的DNA在细菌中的重组表达的综述文章包括Skerra等人，1993,Curr.Opinion in Immunol.5:256-62和Plückthun,1992,Immunol.Revs.130:151-88。
在一些实施方案中，结合表位的抗体包括由核苷酸序列编码的VH结构域的氨基酸序列和/或VL结构域的氨基酸序列，该核苷酸序列与(1)编码本文描述的VH结构域和/或VL结构域中任何一个的核苷酸序列的互补物在严格条件下(例如，在约45℃在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中与过滤结合的DNA杂交，随后在约50℃-65℃在0.2×SSC/0.1％ SDS中洗涤一次或更多次)、在高度严格条件下(例如，在约45℃在6×SSC中与过滤结合的核酸杂交，随后在约68℃在0.1×SSC/0.2％ SDS中洗涤一次或更多次))或在本领域技术人员已知的其他严格杂交条件下杂交。参见例如，Current Protocols in Molecular Biology第I卷，6.3.1-6.3.6和2.10.3(Ausubel等人编著,1989)。
在一些实施方案中，结合FAP表位的抗体包括由核苷酸序列编码的VH CDR的氨基酸序列或VL CDR的氨基酸序列，该核苷酸序列与编码表5-表6中描绘的VH CDR和/或VL CDR中任何一个的核苷酸序列的互补物在严格条件下(例如，在约45℃在6×SSC中与过滤结合的DNA杂交，随后在约50℃-65℃在0.2×SSC/0.1％ SDS中洗涤一次或更多次)、在高度严格条件下(例如，在约45℃在6×SSC中与过滤结合的核酸杂交，随后在约68℃在0.1×SSC/0.2％SDS中洗涤一次或更多次)或在本领域技术人员已知的其他严格杂交条件下(参见例如，Ausubel等人，同上)杂交。
在另外的实施方案中，单克隆抗体或抗体片段可以从使用例如Antibody Phage Display:Methods and Protocols(O’Brien和Aitken编著,2002)中描述的技术产生的抗体噬菌体文库中分离。原则上，合成抗体克隆通过筛选含有展示与噬菌体外壳蛋白融合的抗体可变区(Fv)的各种片段的噬菌体的噬菌体文库来选择。针对所期望的抗原对这样的噬菌体文库进行筛选。表达能够与所期望的抗原结合的Fv片段的克隆被吸附至抗原上，并且因此与文库中的非结合克隆分离。然后从抗原洗脱结合克隆，并且可以通过另外的抗原吸附/洗脱循环进一步富集。
可变结构域可以作为单链Fv(scFv)片段(其中VH和VL通过短柔性肽共价连接)或者作为Fab片段(其中它们各自与恒定结构域融合并且非共价相互作用)功能上展示在噬菌体上，如例如以下中描述的：Winter等人,1994,Ann.Rev.Immunol.12:433-55。
VH基因和VL基因的谱库可以通过PCR单独克隆，并且在噬菌体文库中随机重组，然后可以对其进行抗原结合克隆搜索，如Winter等人同上中描述的。来自免疫的来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体，而不需要构建杂交瘤。可选地，可以克隆天然谱库，以提供针对广泛范围的非自体抗原以及还有自体抗原的人类抗体的单一来源而无需任何免疫，如由Griffiths等人,1993,EMBO J 12:725-34描述的。最终，还可以通过从干细胞克隆未重排的V-基因区段，并使用含有随机序列的PCR引物编码高度可变的CDR3区域并实现体外重排来合成制备天然文库，如例如由Hoogenboom和Winter，1992,J.Mol.Biol.227:381-88描述的。
文库的筛选可以通过本领域已知的各种技术来完成。例如，抗原(例如，IL-2多肽、片段或表位)可以用于包被吸附板的孔，在附着至吸附板的宿主细胞上表达或用于细胞分选，与生物素缀合以用链霉抗生物素蛋白包被的珠捕获，或用于淘选展示文库的任何其他方法中。通过使用如Bass等人，1990,Proteins 8:309-14和WO 92/09690中描述的长洗涤和单价噬菌体展示，以及通过使用Marks等人，1992,Biotechnol.10:779-83中描述的抗原的低包被密度，可以促进具有慢解离动力学(例如，良好的结合亲和力)的抗体的选择。
形成本文描述的免疫缀合物分子一部分的抗体可以通过以下获得：设计合适的抗原筛选程序以选择感兴趣的噬菌体克隆，随后使用来自感兴趣的噬菌体克隆的VH序列和/或VL序列(例如Fv序列)或来自VH序列和VL序列的各种CDR序列和Kabat等人同上描述的合适的恒定区(例如Fc)序列构建全长抗体克隆。
在另一种实施方案中，形成免疫缀合物分子的一部分的抗体通过使用Bowers等人，2011，Proc Natl Acad Sci USA 108:20455-60中描述的方法例如SHM-XHLTM平台(AnaptysBio,San Diego,CA)产生。简言之，在这种方法中，在哺乳动物细胞系(例如HEK293)中构建完全人类IgG文库作为起始文库。(例如，通过FACS分选)选择展示与靶肽或表位结合的免疫球蛋白的哺乳动物细胞，然后在体外复制激活诱导的胞苷脱氨酶(AID)触发的体细胞高频突变，以扩增最初选择的抗体池的多样性。通过将哺乳动物细胞表面展示与体外体细胞高频突变偶联，在几轮亲和力成熟之后，产生高亲和力、高特异性的抗体。可以用于产生抗体文库和/或抗体亲和力成熟的另外的方法在以下中公开：例如，美国专利第8,685,897号和第8,603,930号以及美国公布第2014/0170705号、第2014/0094392号、第2012/0028301号、第2011/0183855号和第2009/0075378号，其的每一个通过引用并入本文。
5.3.2.1抗体片段
本公开内容提供了形成免疫缀合物分子部分的抗体和抗体片段。在某些情况下，使用抗体片段而不是完整抗体具有优点。较小尺寸的片段允许快速清除，并且可以导致对细胞、组织或器官的改进的接近。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson等人，2003,NatureMed.9:129-34。
已经开发了用于产生抗体片段的各种技术。传统上，这些片段是经由完整抗体的蛋白水解消化衍生的(参见，例如Morimoto等人，1992,J.Biochem.Biophys.Methods 24:107-17；和Brennan等人,1985,Science 229:81-83)。然而，这些片段现在可以由重组宿主细胞直接产生。Fab、Fv和scFv抗体片段都可以在大肠杆菌或酵母细胞中表达并分泌，因此允许这些片段的大量的容易的产生。抗体片段可以从以上讨论的抗体噬菌体文库中分离。可选地，Fab’-SH片段可以直接从大肠杆菌回收并化学偶联形成F(ab’)2片段(Carter等人,1992,Bio/Technology10:163-67)。根据另一种方法，F(ab’)2片段可以直接从重组宿主细胞培养物分离。包含补救受体结合表位残基的具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab’)2片段描述在例如美国专利第5,869,046号中。对于本领域技术人员来说，产生抗体片段的其他技术将是明显的。在某些实施方案中，抗体是单链Fv片段(scFv)(参见例如WO 93/16185；美国专利第5,571,894号和第5,587,458号)。Fv和scFv具有不含恒定区的完整组合位点；因此，它们可以适于在体内使用期间减少非特异性结合。可以构建scFv融合蛋白以在scFv的氨基末端或羧基末端产生效应蛋白的融合(参见例如，Borrebaeck编著，同上)。抗体片段也可以是“线性抗体”，例如，如以上引用的参考文献中描述的。这样的线性抗体可以是单特异性的或多特异性的，诸如双特异性的。
较小的抗体衍生的结合结构是单独的可变结构域(V结构域)，也称为单可变结构域抗体(sdAb)。某些类型的生物体，骆驼科动物和软骨鱼具有安装在Fc等效结构域结构上的高亲和力单V样结构域作为其免疫系统的一部分。(Woolven等人,1999,Immunogenetics50:98-101；和Streltsov等人,2004,Proc Natl Acad Sci USA.101:12444-49)。V样结构域(在骆驼科动物中称为VhH，并且在鲨鱼中称为V-NAR)通常展示长的表面环，这允许穿透靶抗原的腔。它们还通过掩蔽疏水表面片(patch)来稳定分离的VH结构域。
这些VhH结构域和V-NAR结构域已被用于工程化sdAb。已经使用从噬菌体文库中选择和已经产生稳定的、高结合的VL衍生和VH衍生的结构域的其他方法设计了人类V结构域变体。
本文提供的抗体包括但不限于免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，例如含有与表位(例如，IL-2表位或FAP表位)结合的抗原结合位点的分子。本文提供的免疫球蛋白分子可以是免疫球蛋白分子的任何类别(例如，IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)或任何亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。
抗体的变体和衍生物包括保留与表位(例如，IL-2表位或FAP表位)结合能力的抗体功能片段。示例性功能片段包括Fab片段(例如，含有抗原结合结构域并包含由二硫键桥接的轻链和重链的一部分的抗体片段)；Fab’(例如，含有包含Fab和穿过铰链区的重链的另外的部分的单抗原结合结构域的抗体片段)；F(ab’)2(例如，在重链的铰链区中通过链间二硫键连接的两个Fab’分子；Fab’分子可以针对相同或不同的表位)；双特异性Fab(例如，具有两个抗原结合结构域的Fab分子，两个抗原结合结构域中的每一个可以针对不同的表位)；包含可变区的单链(也称为scFv)(例如，通过10-25个氨基酸的链连接在一起的抗体的单个轻链和重链的可变抗原结合决定区)；二硫键连接的Fv或dsFv(例如，通过二硫键连接在一起的抗体的单个轻链和重链的可变抗原结合决定区)；骆驼源化VH(例如，抗体的单个重链的可变抗原结合决定区，其中VH界面处的一些氨基酸是那些在天然存在的骆驼抗体的重链中发现的氨基酸)；双特异性scFv(例如，具有两个抗原结合结构域的scFv或dsFv分子，两个抗原结合结构域中的每一个可以针对不同的表位)；双抗体(例如，当第一scFv的VH结构域与第二scFv的VL结构域组装并且第一scFv的VL结构域与第二scFv的VH结构域组装时形成的二聚化scFv；双抗体的两个抗原结合区可以针对相同或不同的表位)；和三抗体(例如，三聚化scFv，以类似于双抗体的方式形成，但是其中在单个复合物中产生三个抗原结合结构域；这三个抗原结合结构域可以针对相同或不同的表位)。
5.3.2.2人源化抗体
在一些实施方案中，形成本文提供的免疫缀合物分子的一部分的抗体可以是结合包括人类和/或食蟹猴抗原(诸如人类IL-2或人类FAP)的人源化抗体。例如，本公开内容的人源化抗体可以包含一个或更多个CDR，如表1-表2和表5-表6中示出的。用于人源化非人类抗体的各种方法是本领域已知的。例如，人源化抗体可以具有从非人类来源引入到它中的一个或更多个氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基通常被称为“输入”残基，其通常取自“输入”可变结构域。例如，人源化可以遵循Jones等人，1986,Nature 321:522-25；Riechmann等人，1988,Nature 332:323-27；和Verhoeyen等人，1988,Science 239:1534-36的方法，通过将高变区序列取代为人类抗体的对应序列来进行。
在一些情况下，人源化抗体通过CDR接枝构建，其中亲本非人类抗体(例如，啮齿动物)的六个CDR的氨基酸序列被接枝到人类抗体框架上。例如，Padlan等人确定，CDR中仅约三分之一的残基实际上接触抗原，并且将这些称为“特异性决定残基”或SDR(Padlan等人，1995,FASEB J.9:133-39)。在SDR接枝技术中，仅SDR残基被接枝到人类抗体框架上(参见例如，Kashmiri等人，2005,Methods 36:25-34)。
在产生人源化抗体中待被使用的人类可变结构域的选择(轻链和重链二者)对减少抗原性可以是重要的。例如，根据所谓的“最佳拟合”方法，针对已知人类可变结构域序列的整个文库筛选非人类(例如，啮齿动物)抗体的可变结构域序列。可以选择最接近啮齿动物序列的人类序列作为用于人源化抗体的人类框架(Sims等人，1993,J.Immunol.151:2296-308；和Chothia等人,1987,J.Mol.Biol.196:901-17)。另一种方法使用衍生自特定亚组的轻链或重链的所有人类抗体的共有序列的特定框架。相同的框架可以用于几种不同的人源化抗体(Carter等人，1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:4285-89；和Presta等人，1993,J.Immunol.151:2623-32)。在一些情况下，框架衍生自最丰富的人类亚类，VL6亚组I(VL6I)和VH亚组III(VHIII)的共有序列。在另一种方法中，人类种系基因被用作框架区的来源。
在可选的基于CDR比较的范式(称为超人源化(superhumanization))中，FR同源性是不相关的。该方法由将非人类序列与功能性人类种系基因谱库进行比较组成。然后选择那些编码与鼠序列相同或密切相关的典型结构的基因。接下来，在与非人类抗体共有典型结构的基因内，那些在CDR内具有最高同源性的基因被选择作为FR供体。最后，将非人类CDR接枝到这些FR上(参见例如，Tan等人，2002,J.Immunol.169:1119-25)。
此外，通常期望抗体被人源化，同时保留它们对抗原的亲和力和其他有利的生物学特性。为了实现这一目的，根据一种方法，通过使用亲本序列和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的过程来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的，并且是本领域技术人员所熟悉的。说明和展示所选择的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序是可得的。这些包括，例如，WAM(Whitelegg和Rees,2000,Protein Eng.13:819-24)、Modeller(Sali和Blundell,1993,J.Mol.Biol.234:779-815)以及Swiss PDB Viewer(Guex和Peitsch,1997,Electrophoresis 18:2714-23)。对这些展示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中可能的作用，例如，分析影响候选免疫球蛋白与其抗原结合的能力的残基。以这种方式，可以从受者和输入序列中选择和组合FR残基，使得实现所期望的抗体特性，诸如增加的对一种或更多种靶抗原的亲和力。通常，高变区残基直接且最大体上参与影响抗原结合。
用于抗体人源化的另一种方法是基于称为人类串含量(Human String Content，HSC)的抗体人性(humanness)的度量。该方法将小鼠序列与人类种系基因的谱库进行比较，并且将差异评分为HSC。然后靶序列通过使其HSC最大化而不是使用全局同一性量度来产生多个不同的人源化变体来人源化(Lazar等人，2007,Mol.Immunol.44:1986-98)。
除了以上描述的方法以外，可以使用经验方法产生和选择人源化抗体。这些方法包括那些基于使用富集技术或高通量筛选技术产生大型人源化变体文库和选择最佳克隆的方法。抗体变体可以从噬菌体、核糖体和酵母展示文库中以及通过细菌菌落筛选来分离(参见例如，Hoogenboom,2005,Nat.Biotechnol.23:1105-16；Dufner等人，2006,TrendsBiotechnol.24:523-29；Feldhaus等人，2003,Nat.Biotechnol.21:163-70；和Schlapschy等人，2004,Protein Eng.Des.Sel.17:847-60)。
在FR文库方法中，在FR的特定位置处引入残基变体的集合，随后筛选文库以选择最支持接枝的CDR的FR。将被取代的残基可以包括被鉴定为可能有助于CDR结构的“游标”残基中的一些或所有(参见例如，Foote和Winter,1992,J.Mol.Biol.224:487-99)或者来自由Baca等人(1997,J.Biol.Chem.272:10678-84)鉴定的更有限的靶残基组。
在FR混编中，完整FR与非人类CDR组合，而不是产生选择的残基变体的组合文库(参见例如，Dall’Acqua等人，2005,Methods 36:43-60)。可以在两步过程中对文库进行结合筛选，首先使VL人源化，随后是VH。可选地，可以使用一步FR混编过程。这样的方法已经显示出比两步筛选更有效，因为所得抗体表现出改进的生物化学和物理化学特性，包括增强的表达、增加的亲和力和热稳定性(参见例如，Damschroder等人，2007,Mol.Immunol.44:3049-60)。
“人类工程(humaneering)”方法是基于基本最小特异性决定簇(MSD)的实验鉴定，并且是基于将非人类片段顺序替换到人类FR文库中并对结合的评价。它开始于非人类VH链和VL链的CDR3区，并且逐渐将非人类抗体的其他区替换到人类FR中，包括VH和VL二者的CDR1和CDR2。这种方法通常导致表位保留和来自具有不同人类V区段CDR的多个亚类的抗体的鉴定。人类工程允许分离与人类种系基因抗体91％-96％同源的抗体(参见例如，Alfenito,Cambridge Healthtech Institute’s Third Annual PEGS,The ProteinEngineering Summit,2007)。
“人类工程化(human engineering)”方法包括通过对抗体的氨基酸序列进行特异性改变来改变非人类抗体或抗体片段，诸如小鼠或嵌合抗体或抗体片段，以便产生在人类中免疫原性减少但仍保留原始非人类抗体的期望结合特性的修饰的抗体。通常，该技术包括将非人类(例如，小鼠)抗体的氨基酸残基分类为“低风险”、“中等风险”或“高风险”残基。使用全局风险/回报计算进行分类，该计算评价进行特定取代(例如，对于人类中的免疫原性)针对该取代将影响所得抗体折叠的风险的预测的益处。通过将来自非人类抗体的可变区的氨基酸序列与特定或共有人类抗体序列的对应区比对，可以选择在非人类(例如，小鼠)抗体序列的给定位置(例如，低或中等风险)处被取代的特定人类氨基酸残基。根据比对，非人类序列中低或中等风险位置的氨基酸残基可以取代人类抗体序列中的对应残基。用于制备人类工程化蛋白的技术在以下中更详细描述：Studnicka等人，1994,ProteinEngineering 7:805-14；美国专利第5,766,886号；第5,770,196号；第5,821,123号；和第5,869,619号；以及PCT公布WO 93/11794。
5.3.2.3人类抗体
人类抗体可以通过将选自人类衍生的噬菌体展示文库的一个或更多个Fv克隆可变结构域序列与已知的一个或更多个人类恒定结构域序列组合来构建。可选地，本公开内容的人类单克隆抗体可以通过杂交瘤方法制备。用于生产人类单克隆抗体的人类骨髓瘤和小鼠-人类异质骨髓瘤细胞系已经由以下描述：例如，Kozbor,1984,J.Immunol.133:3001-05；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications 51-63(1987)；和Boerner等人，1991,J.Immunol.147:86-95。
还可以产生在免疫后能够在不存在内源免疫球蛋白产生的情况下产生完全的人类抗体谱库的转基因动物(例如，小鼠)。表达人类抗体谱库的转基因小鼠已经被用于产生针对各种可能药物靶的高亲和力人类序列单克隆抗体(参见例如，Jakobovits,A.,1995,Curr.Opin.Biotechnol.6(5):561-66；Brüggemann和Taussing,1997,Curr.Opin.Biotechnol.8(4):455-58；美国专利第6,075,181号和第6,150,584号；以及Lonberg等人，2005,Nature Biotechnol.23:1117-25)。
可选地，人类抗体可以经由永生化产生针对靶抗原的抗体的人类B淋巴细胞来制备(例如，这样的B淋巴细胞可以从个体中回收或者可以已经在体外免疫)(参见例如，Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy(1985)；Boerner等人，1991,J.Immunol.147(1):86-95；和美国专利第5,750,373号)。
基因混编也可以用于从非人类抗体，例如，啮齿动物抗体衍生人类抗体，其中人类抗体与起始的非人类抗体具有相似的亲和力和特异性。根据这种也被称为“表位印迹”或“引导选择”的方法，通过如本文描述的噬菌体展示技术获得的非人类抗体片段的重链可变区或轻链可变区被人类V结构域基因的谱库替换，产生非人类链/人类链scFv或Fab嵌合体的群体。用抗原选择导致非人类链/人类链嵌合scFv或Fab的分离，其中人类链恢复了在初级噬菌体展示克隆中去除对应非人类链时被破坏的抗原结合位点(例如，表位引导(印记)人类链配偶体的选择)。当重复该过程以替换剩余的非人类链时，获得人类抗体(参见例如，PCT WO 93/06213；和Osbourn等人，2005,Methods 36:61-68)。不同于通过CDR接枝对非人类抗体的传统人源化，这种技术提供完整人类抗体，其没有非人类来源的FR或CDR残基。朝向细胞表面抗原的引导选择使小鼠抗体人源化的实例包括存在于卵巢癌细胞上的叶酸结合蛋白(参见例如，Figini等人，1998,Cancer Res.58:991-96)和在肝细胞癌上高度表达的CD147(参见例如，Bao等人，2005,Cancer Biol.Ther.4:1374-80)。
引导选择方法的可能缺点是，混编一条抗体链同时保持另一条抗体链恒定可能导致表位漂移。为了维持被非人类抗体识别的表位，可以应用CDR保留(参见例如，Klimka等人，2000,Br.J.Cancer.83:252-60；和Beiboer等人，2000,J.Mol.Biol.296:833-49)。在这种方法中，非人类VH CDR3通常被保留，因为该CDR可能位于抗原结合位点的中心处，并且可能是抗体用于抗原识别的最重要区。然而，在一些情况下，非人类抗体的VH CDR3和VL CDR3以及VH CDR2、VL CDR2和VL CDR1可以被保留。
5.3.3抗体变体
在一些实施方案中，设想了形成本文描述的免疫缀合物分子的一部分的抗体的一个或更多个氨基酸序列修饰。例如，可能期望改进抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性，包括但不限于特异性、热稳定性、表达水平、效应子功能、糖基化、减少的免疫原性或溶解性。因此，除了本文提供的特异性抗体以外，还设想了可以制备抗体变体。例如，抗体变体可以通过将适当的核苷酸变化引入到编码DNA中和/或通过合成所期望的抗体或多肽来制备。本领域技术人员认识到氨基酸变化可以改变抗体的翻译后过程，诸如改变糖基化位点的数目或位置或改变膜锚定特性。
在一些实施方案中，本文提供的抗体被化学修饰，例如通过任何类型的分子与抗体的共价附接被化学修饰。抗体衍生物可以包括已经化学修饰的抗体，例如通过增加或减少糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/封闭基团的衍生化、化学裂解、蛋白水解裂解、与细胞配体或其他蛋白的连接等。另外地，抗体可以含有一个或更多个非经典氨基酸。
变异可以是编码抗体或多肽的一个或更多个密码子的取代、缺失或插入，导致氨基酸序列与天然序列抗体或多肽相比改变。氨基酸取代可以是将一种氨基酸用具有相似结构和/或化学特性的另一种氨基酸替换的结果，诸如亮氨酸用丝氨酸的替换，例如保守氨基酸替换。插入或缺失可以任选地在约1至5个氨基酸的范围内。在某些实施方案中，相对于原始分子，取代、缺失或插入包括少于25个氨基酸取代、少于20个氨基酸取代、少于15个氨基酸取代、少于10个氨基酸取代、少于5个氨基酸取代、少于4个氨基酸取代、少于3个氨基酸取代或少于2个氨基酸取代。在具体实施方案中，取代是在一个或更多个预测的非必需氨基酸残基处进行的保守氨基酸取代。允许的变异可以通过对序列中的氨基酸系统地进行插入、缺失或取代，并且针对由全长或成熟天然序列所表现出的活性对所得变体进行测试来确定。
氨基酸序列插入包括长度范围为一个残基至含有100个或更多个残基的多肽的氨基末端和/或羧基末端融合，以及单个或多于一个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N-末端甲硫氨酸残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括抗体的N-末端或C-末端与酶(例如，对于抗体导向的酶前药疗法)或增加抗体的血清半衰期的多肽的融合。
抗体生物学特性的大体修饰是通过选择在其对维持(a)取代的区域中的多肽骨架结构，例如，如折叠或螺旋构象，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积效应方面显著不同的取代来实现的。可选地，可以进行保守(例如，在具有相似特性和/或侧链的氨基酸组内)取代，以便维持特性或不显著改变特性。氨基酸可以根据其侧链特性中的相似性进行分组(参见例如，Lehninger,Biochemistry 73-75(第2版1975))：(1)非极性：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)；(2)不带电荷的极性：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)；(3)酸性：Asp(D)、Glu(E)；及(4)碱性：Lys(K)、Arg(R)、His(H)。
可选地，天然存在的残基可以基于共同的侧链特性分为数组：(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)碱性：His、Lys、Arg；(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；和(6)芳族的：Trp、Tyr、Phe。
非保守取代需要将这些类别中之一的成员交换为另一类别。这样的取代的残基也可以引入到保守取代位点或剩余的(非保守的)位点中。因此，在一种实施方案中，与表位结合的抗体或其片段包括与本文提供的鼠单克隆抗体的氨基酸序列至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的氨基酸序列。在一种实施方案中，与表位结合的抗体或其片段包括与表1-表8中描绘的氨基酸序列至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的氨基酸序列。在又另一种实施方案中，形成如本文描述的免疫缀合物分子的一部分的抗体或其片段包括与表2中描绘的VH CDR氨基酸序列和/或表1中描绘的VL CDR氨基酸序列至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的VH CDR氨基酸序列和/或VL CDR氨基酸序列。在又另一种实施方案中，形成如本文描述的免疫缀合物分子的一部分的抗体或其片段包括与表6中描绘的VH CDR氨基酸序列和/或表5中描绘的VL CDR氨基酸序列至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的VH CDR氨基酸序列和/或VL CDR氨基酸序列。可以使用本领域已知的方法，诸如寡核苷酸介导的(定点)诱变、丙氨酸扫描和PCR诱变进行变异。可以对克隆的DNA进行定点诱变(参见例如，Carter,1986,Biochem J.237:1-7；和Zoller等人，1982,Nucl.Acids Res.10:6487-500)、盒式诱变(参见例如，Wells等人，1985,Gene 34:315-23)或其他已知技术，以产生抗体变体DNA。
任何不参与维持抗体正确构象的半胱氨酸残基也可以被例如另一种氨基酸诸如丙氨酸或丝氨酸取代，以改进分子的氧化稳定性并防止异常交联。相反，一个或更多个半胱氨酸键可以添加至抗体以改进其稳定性(例如，在抗体是抗体片段诸如Fv片段的情况下)。
在一些实施方案中，形成本公开内容的免疫缀合物分子的一部分的抗体或其抗原结合片段是“去免疫”抗体。“去免疫”抗体是衍生自人源化或嵌合抗体的抗体，该抗体与相应的原始非去免疫抗体相比，在其氨基酸序列中具有导致抗体的免疫原性减少的一个或更多个改变。用于产生这样的抗体突变体的方法之一包括鉴定和去除抗体分子的T细胞表位。在第一步中，抗体分子的免疫原性可以通过几种方法来确定，例如，通过如本领域已知的T细胞表位的体外确定或这样的表位的计算机模拟预测。在已经鉴定T细胞表位功能的关键残基后，可以进行突变以去除免疫原性并保留抗体活性。关于综述，参见例如，Jones等人，2009,Methods in Molecular Biology 525:405-23。
5.3.3.1体外亲和力成熟
在一些实施方案中，与亲本抗体相比，具有改进的特性诸如亲和力、稳定性或表达水平的抗体变体可以通过体外亲和力成熟来制备。像自然原型一样，体外亲和力成熟是基于突变和选择的原理。抗体文库以Fab、scFv或V结构域片段的形式展示在生物体(例如，噬菌体、细菌、酵母或哺乳动物细胞)的表面上，或者与它们的编码mRNA或DNA缔合(例如，共价或非共价)。展示的抗体的亲和力选择允许分离携带编码抗体的遗传信息的生物体或复合物。使用展示方法诸如噬菌体展示的两轮或三轮突变和选择，通常产生具有在低纳摩尔范围内的亲和力的抗体片段。亲和力成熟的抗体可以对靶抗原具有纳摩尔或甚至皮摩尔的亲和力。
噬菌体展示是广泛用于展示和选择抗体的方法。抗体在Fd或M13噬菌体的表面上被展示为与噬菌体外壳蛋白的融合物(fusions)。选择包括暴露于抗原，以允许噬菌体展示的抗体结合它们的靶，这个过程被称为“淘选”。与抗原结合的噬菌体被回收并用于感染细菌以产生噬菌体用于下一轮选择。关于综述，参见例如，Hoogenboom,2002,Methods.Mol.Biol.178:1-37；以及Bradbury和Marks,2004,J.Immunol.Methods 290:29-49。
在酵母展示系统中(参见例如，Boder等人，1997,Nat.Biotech.15:553-57；和Chao等人，2006,Nat.Protocols 1:755-68)，抗体可以展示为其中重链和轻链通过柔性接头连接的单链可变融合物(scFv)。scFv与酵母凝集素蛋白Aga2p的黏附亚基融合，Aga2p通过与Aga1p的二硫键附接至酵母细胞壁。蛋白经由Aga2p的展示将蛋白远离细胞表面投射，使与酵母细胞壁上其他分子的可能相互作用最小化。使用磁分离和流式细胞术筛选文库，以选择具有改进的亲和力或稳定性的抗体。与感兴趣的可溶性抗原的结合通过用生物素化抗原和第二试剂诸如与荧光团缀合的链霉抗生物素蛋白标记酵母来确定。抗体表面表达的变异可以通过免疫荧光标记scFv侧翼的血凝素或c-Myc表位标签来测量。已经显示表达与展示的蛋白的稳定性相关，并且因此可以选择抗体用于改进的稳定性以及亲和力(参见例如，Shusta等人，1999,J.Mol.Biol.292:949-56)。酵母展示的另外的优点是，展示的蛋白在真核酵母细胞的内质网中利用内质网伴侣和质量控制机制折叠。在成熟完成后，抗体亲和力可以在被展示在酵母的表面上的同时方便地“滴定”，取消表达和纯化每个克隆的需要。酵母表面展示的理论限制是可能的比其他展示方法的文库尺寸更小的功能文库尺寸；然而，最近的方法使用酵母细胞的交配系统来产生估计为1014尺寸的组合多样性(参见例如，美国专利公布2003/0186374；和Blaise等人，2004,Gene 342:211-18)。
在核糖体展示中，抗体-核糖体-mRNA(ARM)复合物在无细胞系统中产生用于选择。编码特定抗体文库的DNA文库与缺乏终止密码子的间隔序列遗传融合。当翻译时，该间隔序列仍然附接至肽酰tRNA并占据核糖体通道，并且因此允许感兴趣的蛋白突出核糖体并折叠。所得的mRNA、核糖体和蛋白的复合物可以与表面结合的配体结合，允许通过与配体的亲和捕获同时分离抗体及其编码mRNA。然后，核糖体结合的mRNA被逆转录回cDNA，然后该cDNA可以经历诱变并用于下一轮选择(参见例如，Fukuda等人，2006,Nucleic Acids Res.34:e127)。在mRNA展示中，抗体和mRNA之间的共价键使用嘌呤霉素作为衔接子分子来建立(Wilson等人，2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:3750-55)。
由于这些方法完全在体外进行，它们提供了优于其他选择技术的两个主要优点。首先，文库的多样性不受细菌细胞转化效率的限制，而仅受试管中存在的核糖体和不同mRNA分子的数目的限制。第二，随机突变可以在每一轮选择之后容易地引入，例如，通过非校对聚合酶，因为在任何多样化步骤之后都不必转化文库。
在哺乳动物细胞展示系统中(参见例如，Bowers等人，2011,Proc Natl Acad SciUSA.108:20455-60)，完全人类IgG文库基于连接至预重组的D(J)区的种系序列V-基因区段构建。将重链和轻链的全长V区与人类重链和轻链恒定区组装，并且转染到哺乳动物细胞系(例如，HEK293)中。将转染的文库扩增并经历针对链霉抗生物素蛋白(SA)偶联的磁珠的几轮负选择，随后针对包被有生物素化靶蛋白、肽片段或表位的SA偶联的磁珠的一轮正选择。将正选择的细胞扩增，并且然后通过几轮FACS分选，以分离展示出与靶蛋白、肽片段或表位特异性结合的抗体的单细胞克隆。将来自这些单细胞克隆的重链和轻链对用AID再转染用于进一步成熟。与AID触发的体细胞高频突变偶联的几轮哺乳动物细胞展示产生高特异性、高亲和力的抗体。
多样性也可以以靶向方式或经由随机引入被引入到抗体文库的CDR或完整V基因中。前一种方法包括经由高水平或低水平的诱变顺序地靶向抗体的所有CDR或靶向体细胞高频突变的单独热点(参见例如，Ho等人，2005,J.Biol.Chem.280:607-17)或基于实验或结构原因怀疑影响亲和力的残基。在具体实施方案中，体细胞高频突变通过AID触发的体细胞高频突变来进行，例如使用SHM-XELTM平台(AnaptysBio,San Diego,CA)来进行。可以使用大肠杆菌增变基因(mutator)菌株、用DNA聚合酶的易错复制(参见例如，Hawkins等人，1992,J.Mol.Biol.226:889-96)或RNA复制酶在完整V基因中引入随机突变。多样性也可以通过经由DNA混编或相似技术替换天然多样的区域来引入(参见例如，Lu等人，2003,J.Biol.Chem.278:43496-507；美国专利第5,565,332号和第6,989,250号)。延伸到框架区残基中的替代技术靶高变环(参见例如，Bond等人，2005,J.Mol.Biol.348:699-709)在CDR中采用环缺失和插入，或者使用基于杂交的多样化(参见例如，美国专利公布第2004/0005709号)。在CDR中产生多样性的另外的方法在例如美国专利第7,985,840号中公开。可以用于产生抗体文库和/或抗体亲和力成熟的另外的方法在以下中公开：例如，美国专利第8,685,897号和第8,603,930号以及美国公布第2014/0170705号、第2014/0094392号、第2012/0028301号、第2011/0183855号和第2009/0075378号，其的每一个通过引用并入本文。
文库的筛选可以通过本领域已知的各种技术来完成。例如，靶抗原(诸如IL-2或FAP多肽)可以固定在固体支持物、柱、针或纤维素/聚(偏氟乙烯)膜/其他过滤器上，在附着至吸附板的宿主细胞上表达或用于细胞分选，或与生物素缀合以用链霉抗生物素蛋白包被的珠捕获，或用于淘选展示文库的任何其他方法中。
关于体外亲和力成熟方法的综述，参见例如，Hoogenboom,2005,NatureBiotechnology 23:1105-16；Quiroz和Sinclair,2010,Revista Ingeneria Biomedia 4:39-51；以及其中的参考文献。
5.3.3.2抗体的修饰
形成本公开内容的免疫缀合物分子的一部分的抗体的共价修饰被包括在本公开内容的范围内。共价修饰包括使抗体的靶向氨基酸残基与能够与抗体的选择的侧链或N-末端或C-末端残基反应的有机衍生剂反应。其他修饰包括谷氨酰胺基残基和天冬酰胺基残基分别脱酰胺为对应的谷氨酰残基和天冬氨酰残基，脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰残基或苏氨酰残基的羟基基团的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基基团的甲基化(参见例如，Creighton,Proteins:Structure and Molecular Properties 79-86(1983))，N-末端胺的乙酰化，以及任何C-末端羧基基团的酰胺化。
包括在本公开内容范围内的抗体的其他类型的共价修饰包括改变抗体或多肽的天然糖基化模式(参见例如，Beck等人，2008,Curr.Pharm.Biotechnol.9:482-501；和Walsh,2010,Drug Discov.Today 15:773-80)，并且以例如以下中阐述的方式将抗体连接至各种非蛋白聚合物中的一种，例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化烯：美国专利第4,640,835号；第4,496,689号；第4,301,144号；第4,670,417号；第4,791,192号；或第4,179,337号。
形成本公开内容的免疫缀合物分子的一部分的抗体也可以被修饰以形成包含与另一异源多肽或氨基酸序列，例如，细胞因子多肽(参见例如，Terpe,2003,Appl.Microbiol.Biotechnol.60:523-33)或IgG分子的Fc区(参见例如，Aruffo,Antibody Fusion Proteins 221-42(Chamow和Ashkenazi eds.,1999))融合的抗体的嵌合分子。
本文还提供了包含本文提供的与靶抗原结合的抗体和异源多肽的融合蛋白。在一些实施方案中，抗体可用于将抗体与之融合的异源多肽递送和/或固定至具有细胞表面表达的靶抗原的细胞。
本文还提供了与靶抗原(例如，IL-2或FAP)结合的抗体组。在具体实施方案中，抗体组具有不同的缔合率、不同的解离率、对靶抗原的不同的亲和力和/或对靶抗原的不同的特异性。在一些实施方案中，组包括以下或由以下组成：约10、约25、约50、约75、约100、约125、约150、约175、约200、约250、约300、约350、约400、约450、约500、约550、约600、约650、约700、约750、约800、约850、约900、约950或约1000个抗体或更多个抗体。抗体组可以用于例如96孔或384孔板中用于测定，诸如ELISA。
5.3.4抗体和免疫缀合物分子的制备
形成本发明免疫缀合物分子的一部分的抗体和其他肽组分(例如，细胞因子多肽)可以通过培养用含有编码核酸的载体转化或转染的细胞来产生。编码本公开内容的抗体的多肽组分的多核苷酸序列可以使用标准重组技术获得。所期望的多核苷酸序列可以从产生抗体的细胞诸如杂交瘤细胞中分离和测序。可选地，多核苷酸可以使用核苷酸合成仪或PCR技术合成。在获得后，编码多肽的序列被插入到能够在宿主细胞中复制和表达异源多核苷酸的重组载体中。许多本领域可用和已知的载体可以用于本公开内容的目的。适当的载体的选择将主要取决于将插入到载体中的核酸的尺寸和用该载体转化的特定宿主细胞。适用于表达本公开内容的抗体的宿主细胞包括原核生物诸如古细菌和真细菌，包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，真核微生物诸如丝状真菌或酵母，无脊椎动物细胞诸如昆虫或植物细胞，以及脊椎动物细胞诸如哺乳动物宿主细胞系。宿主细胞用以上描述的表达载体转化，并且在常规营养培养基中培养，所述培养基经适当修改以诱导启动子、选择转化体或扩增编码期望序列的基因。由宿主细胞产生的抗体使用如本领域已知的标准蛋白纯化方法纯化。
用于抗体生产的方法包括载体构建、表达和纯化，在以下中进一步描述：Plückthun等人，Antibody Engineering:Producing antibodies in Escherichia coli:From PCR to fermentation 203-52(McCafferty等人编著，1996)；Kwong和Rader,E.coliExpression and Purification of Fab Antibody Fragments,于Current Protocols in Protein Science(2009)；Tachibana和Takekoshi,Production of Antibody FabFragments in Escherischia coli,于Antibody Expression and Production(Al-Rubeai编著，2011)；以及Therapeutic Monoclonal Antibodies:From Bench to Clinic(An编著，2009)。
当然，设想了可以采用本领域熟知的替代方法来制备抗体。例如，适当的氨基酸序列或其部分可以通过使用固相技术的直接肽合成来产生(参见例如，Stewart等人，Solid- Phase Peptide Synthesis(1969)；和Merrifield,1963,J.Am.Chem.Soc.85:2149-54)。体外蛋白合成可以使用手动技术或通过自动化进行。抗体的不同部分可以单独化学合成，并且使用化学或酶方法组合以产生期望的抗体。可选地，抗体可以从被工程化为表达该抗体的转基因动物的细胞或体液诸如乳汁中纯化，如例如以下中公开的：美国专利第5,545,807号和第5,827,690号。
融合蛋白可以例如通过基因混编、基序混编、外显子混编和/或密码子混编(统称为“DNA混编”)的技术产生。可以采用DNA混编改变如本文提供的抗体的活性，包括例如具有更高亲和力和更低解离率的抗体的活性(参见例如，美国专利第5,605,793号；第5,811,238号；第5,830,721号；第5,834,252号；和第5,837,458号；Patten等人，1997,Curr.OpinionBiotechnol.8:724-33；Harayama,1998,Trends Biotechnol.16(2):76-82；Hansson等人，1999,J.Mol.Biol.287:265-76；以及Lorenzo和Blasco,1998,Biotechniques 24(2):308-13)。抗体或编码的抗体可以通过在重组前通过易错PCR、随机核苷酸插入或其他方法经历随机诱变来改变。编码本文提供的抗体的多核苷酸可以与一种或更多种异源分子的一种或更多种组分、基序、区段、部分、结构域、片段等重组。
用于将部分(包括多肽)与抗体融合或缀合的方法是已知的(参见例如，Arnon等人，Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy,于Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy 243-56(Reisfeld等人编著，1985)；Hellstrom等人，Antibodies for Drug Delivery,于Controlled Drug Delivery 623-53(Robinson等人编著，第2版1987)；Thorpe,Antibody Carriers of Cytotoxic Agents inCancer Therapy:A Review,于Monoclonal Antibodies:Biological and Clinical Applications 475-506(Pinchera等人编著，1985)；Analysis,Results,and FutureProspective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in CancerTherapy,于Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy 303-16(Baldwin等人编著，1985)；Thorpe等人，1982,Immunol.Rev.62:119-58；美国专利第5,336,603号；第5,622,929号；第5,359,046号；第5,349,053号；第5,447,851号；第5,723,125号；第5,783,181号；第5,908,626号；第5,844,095号；和第5,112,946号；EP 307,434；EP 367,166；EP 394,827；PCT公布WO 91/06570、WO 96/04388、WO 96/22024、WO 97/34631和WO 99/04813；Ashkenazi等人，1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:10535-39；Traunecker等人，1988,Nature,331:84-86；Zheng等人，1995,J.Immunol.154:5590-600；以及Vil等人，1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:11337-41)。
融合蛋白可以例如通过基因混编、基序混编、外显子混编和/或密码子混编(统称为“DNA混编”)的技术产生。可以采用DNA混编改变如本文提供的抗体的活性，包括例如具有更高亲和力和更低解离率的抗体的活性(参见例如，美国专利第5,605,793号；第5,811,238号；第5,830,721号；第5,834,252号；和第5,837,458号；Patten等人，1997,Curr.OpinionBiotechnol.8:724-33；Harayama,1998,Trends Biotechnol.16(2):76-82；Hansson等人，1999,J.Mol.Biol.287:265-76；以及Lorenzo和Blasco,1998,Biotechniques 24(2):308-13)。抗体或编码的抗体可以通过在重组前通过易错PCR、随机核苷酸插入或其他方法经历随机诱变来改变。编码本文提供的抗体的多核苷酸可以与一种或更多种异源分子的一种或更多种组分、基序、区段、部分、结构域、片段等重组。
抗体和剂的缀合物可以使用多种双功能蛋白偶联剂制备，该偶联剂诸如BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC、磺基-SMPB和SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)。本公开内容还设想了，使用如本领域公开的任何合适方法制备抗体和剂的缀合物(参见例如，Bioconjugate Techniques(Hermanson等人，第2版2008))。
用于抗体和剂的常规缀合策略已经是基于涉及Lys残基的ε-氨基基团或Cys残基的巯基基团的随机缀合化学，这产生异源缀合物。最近开发的技术允许与抗体的位点特异性缀合，导致均质装载并且避免具有改变的抗原结合或药代动力学的缀合物亚群。这些包括“thiomabs”的工程化，该“thiomabs”包含在重链和轻链上的位置处提供反应性硫醇基团并且不破坏免疫球蛋白折叠并组装或改变抗原结合的半胱氨酸取代(参见例如，Junutula等人，2008,J.Immunol.Meth.332:41-52；和Junutula等人，2008,Nature Biotechnol.26:925-32)。在另一种方法中，通过重新编码从终止至硒代半胱氨酸插入的终止密码子UGA，允许在存在其他天然氨基酸的情况下在硒代半胱氨酸的亲核硒醇基团处的位点特异性共价缀合，将硒代半胱氨酸共翻译插入到抗体序列中(参见例如，Hofer等人，2008,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105:12451-56；和Hofer等人，2009,Biochemistry 48(50):12047-57)。
5.4使用免疫缀合物分子和组合物的方法
如从本公开内容中应当理解，根据本公开内容的免疫缀合物分子可以用于在受试者的感兴趣的靶位点处递送细胞因子和/或激活细胞因子活性。不受理论的约束，还设想了，当全身暴露于某些细胞因子活性可以在受试者中导致毒性副作用时，本公开内容的免疫缀合物分子可以用于通过防止在受试者中除了靶位点以外的位置中激活细胞因子介导的效应来减少细胞因子的毒性或其他副作用。
因此，在一方面，本文提供了一种用于在受试者中位点特异性递送细胞因子分子的方法，该方法包括将细胞因子掺入到根据本公开内容的免疫缀合物分子中，并且将该免疫缀合物分子递送至受试者。特别地，在某些实施方案中，免疫缀合物分子包括细胞因子和能够与存在于受试者中靶位点处的靶抗原结合的锚定部分，使得当免疫缀合物分子到达靶位点处时，锚定部分与靶抗原结合，从而将免疫缀合物分子固定在靶位点处。在一些实施方案中，与非靶位点相比，方法在受试者中靶位点处导致更高浓度的施用的免疫缀合物分子。
在相关方面，本文还提供了一种用于在受试者中位点特异性激活细胞因子活性的方法，该方法包括将细胞因子掺入到根据本公开内容的免疫缀合物分子中，并且将该免疫缀合物分子递送至受试者。特别地，在某些实施方案中，免疫缀合物分子包括细胞因子和经由分子内相互作用与细胞因子结合并抑制细胞因子活性的掩蔽部分。特别地，掩蔽部分还能够与存在于靶位点处的靶抗原结合，使得当免疫缀合物分子到达靶位点时，掩蔽部分与靶抗原结合并从细胞因子解离，从而激活靶位点处的细胞因子活性。在一些实施方案中，与非靶位点相比，方法在受试者中靶位点处导致更高的细胞因子活性。
在具体实施方案中，本发明方法中使用的免疫缀合物分子包括掩蔽部分和锚定部分二者。在多种实施方案中，由免疫缀合物分子的掩蔽部分和锚定部分识别的靶抗原可以是相同的抗原或不同的抗原。在具体实施方案中，本发明方法中使用的免疫缀合物分子还包括可操作地连接细胞因子部分、掩蔽部分和锚定部分中的一个或更多个的缀合部分。在具体实施方案中，本发明方法中使用的免疫缀合物分子可以是如第5.3部分中描述的任何免疫缀合物分子。
在一些实施方案中，与施用等量的呈未缀合形式的细胞因子的方法相比，本发明方法导致减少的对受试者的细胞因子毒性。因此，在相关方面，本文还提供了一种用于减少与施用至受试者的未缀合形式的细胞因子相关的副作用的方法。在特定实施方案中，方法包括向受试者施用包括细胞因子的免疫缀合物分子，以替代施用未缀合形式的细胞因子。在特定实施方案中，受试者在包括施用呈未缀合形式的细胞因子的持续细胞因子治疗下，并且该方法包括停止持续细胞因子治疗并向受试者施用包括等量细胞因子的免疫缀合物分子。在特定实施方案中，副作用是细胞因子的毒性。在特定实施方案中，副作用通过用细胞因子治疗的受试者的体重改变来测量。在特定实施方案中，副作用通过用细胞因子治疗的受试者的寿命改变来测量。在特定实施方案中，副作用通过用细胞因子治疗的受试者中免疫应答水平的改变来测量。在特定实施方案中，副作用通过用细胞因子治疗的受试者中炎症反应水平的改变来测量。
在一些实施方案中，细胞因子是IL-2，并且根据本发明方法的细胞因子介导的效应包括受试者中T细胞活性的激活。T细胞激活的非限制性实例是增加的T细胞增殖。因此，在某些实施方案中，本文还提供了一种用于通过施用根据本公开内容的含有IL-2的免疫缀合物分子来促进受试者中靶位点处的T细胞增殖和活性的方法。
T细胞活性的另一个非限制性实例是细胞因子的分泌。因此，在某些实施方案中，本文还提供了一种用于通过施用根据本公开内容的含有IL-2的免疫缀合物分子来促进受试者中靶位点处的细胞因子分泌的方法。在某些实施方案中，细胞因子选自由以下组成的组：IL-1、IL-2、IL-6、IL-12、IL-17、IL-22、IL-23、GM-CSF、IFN-γ和TNF-α。在一些实施方案中，细胞因子是IL-2、IL-17、IFN-γ或其任何组合。在某些实施方案中，细胞因子是IL-2。在其他实施方案中，细胞因子是IL-17。在又其他实施方案中，细胞因子是IFN-γ。在某些实施方案中，细胞因子是IL-2和IL-17。在一些实施方案中，细胞因子是IL-2和IFN-γ。在又其他实施方案中，细胞因子是IL-17和IFN-γ。在又其他实施方案中，细胞因子是IL-2、IL-17和IFN-γ。在某些实施方案中，细胞因子是IL-1。在其他实施方案中，细胞因子是IL-6。在又其他实施方案中，细胞因子是IL-12。在又其他实施方案中，细胞因子是IL-22。在某些实施方案中，细胞因子是IL-23。在一些实施方案中，细胞因子是GM-CSF。在其他实施方案中，细胞因子是TNF-α。还设想了以上提及的细胞因子中的两种、三种或更多种的其他组合。
根据本发明方法用于递送细胞因子和/或激活细胞因子活性的示例性靶位点包括但不限于细胞环境，诸如特定类型的组织、特定器官、特定细胞群体。在一些实施方案中，可以基于由方法中使用的免疫缀合物分子识别的靶抗原的表达来区分本发明方法的靶位点与非靶位点。特别地，在一些实施方案中，靶抗原存在于靶位点处，但不存在于非靶位点中。在一些实施方案中，靶抗原由存在于靶位点处但不存在于非靶位点处的细胞产生。在一些实施方案中，与非靶位点处的靶抗原相比，靶抗原以更高的浓度或更大的量存在于靶位点处。在特定实施方案中，靶抗原以足够的量存在于靶位点(但不是非靶位点)处，使得免疫缀合物分子的锚定部分能够通过与靶抗原的结合将免疫缀合物分子固定在靶位点处。在特定实施方案中，靶抗原以足够的量存在于靶位点(但不是非靶位点)处，使得免疫缀合物分子的掩蔽部分能够通过与靶抗原的结合从细胞因子解离。在具体实施方案中，本发明方法的靶位点含有癌细胞群体。在具体实施方案中，本发明方法的靶位点是实体瘤的肿瘤微环境。在具体实施方案中，由方法中使用的免疫缀合物分子识别的靶抗原是由癌细胞表达的抗原，诸如肿瘤相关抗原(TAA)。在其他实施方案中，由方法中使用的免疫缀合物分子识别的靶抗原是由肿瘤微环境中的非癌细胞诸如基质细胞表达的抗原。
在本发明方法的特定实施方案中，细胞因子是IL-2。在特定实施方案中，靶抗原是纤维化激活蛋白(FAP)。因此，在特定实施方案中，本发明方法中使用的免疫缀合物分子包括能够与IL-2和FAP二者结合的二合一抗体。在特定实施方案中，形成本发明免疫缀合物分子的一部分的二合一抗体包括如表1和表2中列出的VH CDR序列和VL CDR序列。在特定实施方案中，形成本发明免疫缀合物分子的一部分的二合一抗体包括如表3和表4中列出的VH序列和VL序列。在特定实施方案中，免疫缀合物分子的锚定部分是与FAP结合的抗体或其抗原结合片段。在特定实施方案中，抗FAP抗体包括如表5和表6中列出的VH CDR序列和VL CDR序列。在特定实施方案中，抗FAP抗体包括如表7和表8中列出的VH序列和VL序列。
在一方面，本文提供了一种用于激活IL-2R的方法，该方法包括使IL-2R与有效量的如本文提供的包括IL-2多肽的免疫缀合物分子接触。在一些实施方案中，IL-2R包括IL-2Rβ。在一些实施方案中，IL-2R包括IL-2Rα。在一些实施方案中，IL-2R包括IL-2Rγ。在一些实施方案中，IL-2R包括IL-2Rα和IL-2Rβ。在一些实施方案中，IL-2R包括IL-2Rα和IL-2Rγ。在一些实施方案中，IL-2R包括IL-2Rβ和IL-2Rγ。在一些实施方案中，IL-2R包括IL-2Rα、IL-2Rβ和IL-2Rγ。
在一些实施方案中，形成可激活IL-2R的一个或更多个亚基在相同的细胞表面上表达。在一些实施方案中，形成可激活IL-2R的一个或更多个亚基在不同细胞的表面上表达。在一些实施方案中，形成可激活IL-2R的一个或更多个亚基是可溶的。
在特定实施方案中，可激活IL-2R包括IL-2Rβ，并且其中IL-2Rβ在第一细胞的表面上表达。在一些实施方案中，可激活IL-2R还包括IL-2Rγ，并且其中IL-2Rγ在第一细胞的表面上表达。
在一些实施方案中，可激活IL-2R还包括IL-2Rα。在一些实施方案中，IL-2Rα被缔合在细胞表面上。在一些实施方案中，IL-2Rα被缔合在第一细胞的表面(顺式呈递)。在一些实施方案中，IL-2Rα被缔合在第二细胞的表面(反式呈递)。在一些实施方案中，IL-2Rα不被缔合在细胞表面上。在一些实施方案中，可激活IL-2R不包括IL-2Rα。
在一些实施方案中，表达可激活IL-2R的一个或更多个亚基的第一细胞和/或第二细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，在IL-2R激活时，免疫细胞被激活。在一些实施方案中，免疫细胞的激活被测量为免疫细胞的增殖或成熟增加。在一些实施方案中，靶细胞的增殖或成熟增加约10％、约20％、约30％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％、约125％、约150％、约175％、约200％、约250％、约300％、约400％、约500％、约600％、约700％、约800％、约900％或约1000％。在一些实施方案中，免疫细胞的激活被测量为免疫细胞的存活时间延长。在一些实施方案中，靶细胞的存活时间增加约10％、约20％、约30％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％、约125％、约150％、约175％、约200％、约250％、约300％、约400％、约500％、约600％、约700％、约800％、约900％或约1000％。
在一些实施方案中，免疫细胞是效应T细胞、记忆T细胞或其组合。在一些实施方案中，免疫细胞是CD4+T细胞、CD8+T细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、SLEC(短寿命效应细胞)、MPEC(记忆前体效应细胞)、TE(终末效应细胞)、NK(自然杀伤细胞)、NKT(自然杀伤T细胞)、先天淋巴样细胞(I型-III型)或其组合。
在一些实施方案中，免疫细胞是调节性T细胞(Treg)。在一些实施方案中，免疫细胞是天然Treg(nTreg)细胞、诱导的Treg(iTreg)细胞或其组合。
在一些实施方案中，表达可激活IL-2R的一个或更多个亚基的第一细胞和/或第二细胞是病变细胞。在一些实施方案中，在IL-2R被激活时，病变细胞死亡。在一些实施方案中，病变细胞是癌细胞。在一些实施方案中，病变细胞是被感染性病原体感染的细胞。在一些实施方案中，感染性病原体是病毒、细菌、真菌、寄生虫或其组合。在一些实施方案中，感染性病原体是病毒。在一些实施方案中，感染性病原体是细菌。在一些实施方案中，感染性病原体是真菌。在一些实施方案中，感染性病原体是寄生虫。
在一方面，本文提供了一种激活表达IL-2R的靶细胞的方法，该方法包括使靶细胞与有效量的如本文描述的包括IL-2多肽的免疫缀合物分子接触，其中在IL-2多肽与IL-2R结合时，靶细胞被激活。在一些实施方案中，靶细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，靶细胞是效应T细胞、记忆T细胞、调节性T细胞或其组合。在一些实施方案中，靶细胞是效应T细胞。在一些实施方案中，靶细胞是记忆T细胞。在一些实施方案中，靶细胞是调节性T细胞。
在一些实施方案中，靶细胞是CD4+T细胞、CD8+T细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、SLEC(短寿命效应细胞)、MPEC(记忆前体效应细胞)、TE(终末效应细胞)、NK(自然杀伤细胞)、NKT(自然杀伤T细胞)、先天淋巴样细胞(I型-III型)或其组合。在一些实施方案中，靶细胞是CD4+T细胞。在一些实施方案中，靶细胞是CD8+T细胞。在一些实施方案中，靶细胞是辅助T细胞。在一些实施方案中，靶细胞是细胞毒性T细胞。在一些实施方案中，靶细胞是SLEC(短寿命效应细胞)。在一些实施方案中，靶细胞是MPEC(记忆前体效应细胞)。在一些实施方案中，靶细胞是TE(终末效应细胞)。在一些实施方案中，靶细胞是NK(自然杀伤细胞)。在一些实施方案中，靶细胞是NKT(自然杀伤T细胞)。在一些实施方案中，靶细胞是先天淋巴样细胞(I型-III型)。
在一些实施方案中，靶细胞是天然Treg(nTreg)细胞、诱导的Treg(iTreg)细胞或其组合。在一些实施方案中，靶细胞是天然Treg(nTreg)细胞。在一些实施方案中，靶细胞是诱导的Treg(iTreg)细胞。
在一些实施方案中，靶细胞的激活被测量为靶细胞的增殖或成熟增加。在一些实施方案中，靶细胞的增殖或成熟增加约10％、约20％、约30％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％、约125％、约150％、约175％、约200％、约250％、约300％、约400％、约500％、约600％、约700％、约800％、约900％或约1000％。
在一些实施方案中，靶细胞的激活被测量为靶细胞的存活时间延长。在一些实施方案中，靶细胞的存活时间增加约10％、约20％、约30％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％、约125％、约150％、约175％、约200％、约250％、约300％、约400％、约500％、约600％、约700％、约800％、约900％或约1000％。
在一些实施方案中，其中接触还包括施用包含药学上可接受的载体和如本文描述的包括IL-2多肽的免疫缀合物分子的药物组合物。在一些实施方案中，接触增强抗肿瘤免疫应答。在一些实施方案中，接触增强抗感染免疫应答。
在一方面，本文提供了一种增强T细胞群体的抗原特异性免疫应答的方法，该方法包括使T细胞的群体与有效量的如本文描述的包括IL-2多肽的免疫缀合物分子接触。在一些实施方案中，接触增强抗原特异性效应T细胞的增殖或成熟。在一些实施方案中，接触增强抗原特异性记忆T细胞的形成。在一些实施方案中，接触是在存在抗原的情况下进行的。在一些实施方案中，抗原是癌症、肿瘤、病原体或过敏原的抗原。
在一方面，本文提供了一种增加T细胞群体分泌促炎细胞因子的方法，该方法包括使T细胞的群体与如本文描述的包括IL-2多肽的免疫缀合物分子接触，其中所述IL-2多肽在结合时激活T细胞。在一些实施方案中，细胞因子是IL-1、IL-2、IL-6、IL-12、IL-17、IL-22、IL-23、GM-CSF、TNF-α、IFN-γ或其任何组合。在一些实施方案中，细胞因子是IL-1。在一些实施方案中，细胞因子是IL-2。在一些实施方案中，细胞因子是IL-6。在一些实施方案中，细胞因子是IL-12。在一些实施方案中，细胞因子是IL-17。在一些实施方案中，细胞因子是IL-22。在一些实施方案中，细胞因子是IL-23。在一些实施方案中，细胞因子是GM-CSF。在一些实施方案中，细胞因子是TNF-α。在一些实施方案中，细胞因子是IFN-γ。
在一些实施方案中，细胞因子产生增加约10％、约20％、约30％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％、约125％、约150％、约175％、约200％、约250％、约300％、约400％、约500％、约600％、约700％、约800％、约900％或约1000％。
在一方面，本文提供了一种增加IL-2R在靶细胞的表面上的组装的方法，该方法包括使靶细胞与有效量的如本文描述的包括IL-2多肽的免疫缀合物分子接触。在一些实施方案中，IL-2R包括在靶细胞的表面上的IL-2Rα、IL-2Rβ、IL-2Rγ或其组合。在一些实施方案中，IL-2R包括在靶细胞的表面上的IL-2Rα。在一些实施方案中，IL-2R包括在靶细胞的表面上的IL-2Rβ。在一些实施方案中，IL-2R包括在靶细胞的表面上的IL-2Rγ。在一些实施方案中，IL-2R包括在靶细胞的表面上的IL-2Rα和IL-2Rβ。在一些实施方案中，IL-2R包括在靶细胞的表面上的IL-2Rα和IL-2Rγ。在一些实施方案中，IL-2R包括在靶细胞的表面上的IL-2Rβ和IL-2Rγ。在一些实施方案中，IL-2R包括在靶细胞的表面上的IL-2Rα、IL-2Rβ和IL-2Rγ。
在一些实施方案中，IL-2R包括在靶细胞的表面上的IL-2Rβ和IL-2Rγ，以及在靠近靶细胞的第二细胞的表面上的IL-2Rα。在一些实施方案中，IL-2R包括在靶细胞的表面上的IL-2Rβ和IL-2Rγ，以及不与细胞表面缔合的IL-2Rα。
在一些实施方案中，IL-2R在靶细胞的表面上的组装增加约10％、约20％、约30％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％、约125％、约150％、约175％、约200％、约250％、约300％、约400％、约500％、约600％、约700％、约800％、约900％或约1000％。
在一些实施方案中，靶细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，靶细胞是效应T细胞、记忆T细胞、调节性T细胞或其组合。在一些实施方案中，靶细胞是效应T细胞。在一些实施方案中，靶细胞是记忆T细胞。在一些实施方案中，靶细胞是调节性T细胞。
在一些实施方案中，靶细胞是CD4+T细胞、CD8+T细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、SLEC(短寿命效应细胞)、MPEC(记忆前体效应细胞)、TE(终末效应细胞)、NK(自然杀伤细胞)、NKT(自然杀伤T细胞)、先天淋巴样细胞(I型-III型)或其组合。在一些实施方案中，靶细胞是CD4+T细胞。在一些实施方案中，靶细胞是CD8+T细胞。在一些实施方案中，靶细胞是辅助T细胞。在一些实施方案中，靶细胞是细胞毒性T细胞。在一些实施方案中，靶细胞是SLEC(短寿命效应细胞)。在一些实施方案中，靶细胞是MPEC(记忆前体效应细胞)。在一些实施方案中，靶细胞是TE(终末效应细胞)。在一些实施方案中，靶细胞是NK(自然杀伤细胞)。在一些实施方案中，靶细胞是NKT(自然杀伤T细胞)。在一些实施方案中，靶细胞是先天淋巴样细胞(I型-III型)。
在一些实施方案中，靶细胞是天然Treg(nTreg)细胞、诱导的Treg(iTreg)细胞或其组合。在一些实施方案中，靶细胞是天然Treg(nTreg)细胞。在一些实施方案中，靶细胞是诱导的Treg(iTreg)细胞。
在一方面，本文提供了一种在病变细胞的群体周围的组织中形成促炎环境的方法，该方法包括使组织与有效量的如本文描述的包括IL-2多肽的免疫缀合物分子接触。
在一些实施方案中，组织中激活的B细胞、CD4+效应T细胞、CD8+效应T细胞、树突状细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、单核细胞、粒细胞、嗜酸性粒细胞和/或中性粒细胞的浓度增加。在一些实施方案中，组织中激活的B细胞的浓度增加。在一些实施方案中，组织中CD4+效应T细胞的浓度增加。在一些实施方案中，组织中激活的B细胞的浓度增加。在一些实施方案中，组织中CD8+效应T细胞的浓度增加。在一些实施方案中，组织中树突状细胞的浓度增加。在一些实施方案中，组织中巨噬细胞的浓度增加。在一些实施方案中，组织中自然杀伤细胞的浓度增加。在一些实施方案中，组织中单核细胞的浓度增加。在一些实施方案中，组织中粒细胞的浓度增加。在一些实施方案中，组织中嗜酸性粒细胞的浓度增加。在一些实施方案中，组织中中性粒细胞的浓度增加。在一些实施方案中，组织中调节性T细胞的浓度减少。
在一些实施方案中，促炎细胞因子的浓度在组织中增加。在一些实施方案中，促炎细胞因子是IL-1、IL-2、IL-6、IL-12、IL-17、IL-22、IL-23、GM-CSF、TNF-α、IFN-γ或其任何组合。在一些实施方案中，与源自或衍生自病变细胞的抗原结合的抗体浓度在组织中增加。在一些实施方案中，抗原呈递细胞对源自或衍生自病变细胞的抗原的呈递在组织中增加。在一些实施方案中，病变细胞的吞噬作用在组织中增加。在一些实施方案中，由细胞介导的细胞毒性诱导的病变细胞的凋亡在组织中增加。在一些实施方案中，由抗体依赖性细胞毒性诱导的病变细胞的凋亡在组织中增加。在一些实施方案中，病变细胞的群体在组织中减少。在一些实施方案中，病变细胞的群体在组织中减少约10％、约20％、约30％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％。在一些实施方案中，病变细胞的群体在组织中减少约0.5％至10％、约10％至20％、约20％至30％、约30％至40％、约40％至45％、约45％至50％、约50％至55％、约55％至60％、约60％至65％、约65％至70％、约70％至75％、约75％至80％、约80％至85％、约85％至90％、约90％至95％或约95％至99％。
在一方面，本文提供了一种消除受试者中的病变细胞的方法，该方法包括向受试者施用有效量的如本文描述的包括IL-2多肽的免疫缀合物分子。在一些实施方案中，病变细胞是癌细胞。在一些实施方案中，病变细胞是被感染性病原体感染的细胞。在一些实施方案中，感染性病原体是病毒、细菌、真菌、寄生虫或其组合。
在一方面，本文提供了一种治疗有相应需要的受试者中的癌症的方法，该方法包括向受试者施用有效量的如本文描述的包括IL-2多肽的免疫缀合物分子。在一些实施方案中，治疗增强先天的、体液的或细胞介导的抗肿瘤免疫应答。在一些实施方案中，方法还包括第二疗法的共施用。
在一方面，本文提供了一种治疗有相应需要的受试者中的感染的方法，该方法包括向受试者施用有效量的如本文描述的包括IL-2多肽的免疫缀合物分子。在一些实施方案中，治疗增强先天的、体液的或细胞介导的抗感染免疫应答。在一些实施方案中，受试者被共施用疫苗组合物，用于预防受试者中的感染。在一些实施方案中，疫苗组合物同时或顺序共施用。
在一方面，本文提供了一种增加有相应需要的受试者中对抗原的应答的方法，该方法包括向受试者施用有效量的如本文描述的包括IL-2多肽的免疫缀合物分子。在一些实施方案中，抗原是癌症、肿瘤、病原体或过敏原的抗原。在一些实施方案中，抗原源自或衍生自感染性病原体。在一些实施方案中，感染性病原体是病毒、细菌、真菌、寄生虫或其组合。在一些实施方案中，抗原源自或衍生自病变细胞。在一些实施方案中，抗原源自或衍生自被感染性病原体感染的细胞。在一些实施方案中，感染性病原体是病毒、细菌、真菌、寄生虫或其组合。在一些实施方案中，抗原源自或衍生自癌细胞。
在一方面，本文提供了一种增加有相应需要的受试者中对疫苗的应答的方法，该方法包括向受试者施用疫苗和有效量的如本文描述的包括IL-2多肽的免疫缀合物分子。在一些实施方案中，疫苗是针对肿瘤、癌症、病原体或过敏原的疫苗。在一些实施方案中，免疫缀合物分子被配制成用于疫苗的佐剂组合物。
在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，本发明的免疫缀合物分子用于治疗实体瘤癌症。在其他实施方案中，本发明的免疫缀合物分子用于治疗血液癌症。在其他实施方案中，疾病或紊乱是自身免疫性疾病和炎性疾病。在其他实施方案中，疾病或紊乱是感染性疾病。
在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，疾病或紊乱是异常细胞生长和/或失调凋亡的疾病。这样的疾病的实例包括但不限于癌症、间皮瘤、膀胱癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内黑素瘤、卵巢癌、乳腺癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、骨癌、结肠癌、直肠癌、肛门区域的癌癌、胃癌、胃肠(胃、结肠直肠和/或十二指肠)癌、慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、睾丸癌、肝细胞(肝和/或胆管)癌、原发性或继发性中枢神经系统肿瘤、原发性或继发性脑肿瘤、霍奇金病、慢性或急性白血病、慢性髓系白血病、淋巴细胞淋巴瘤、淋巴母细胞白血病、滤泡性淋巴瘤、T细胞或B细胞来源的淋巴恶性肿瘤、黑素瘤、多发性骨髓瘤、口腔癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、肾癌和/或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统赘生物、原发性中枢神经系统淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、脊髓轴肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、肾上腺皮质癌、胆囊癌、脾脏癌、胆管癌、纤维肉瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤或其组合。
在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，疾病或紊乱选自由以下组成的组：膀胱癌、脑癌、乳腺癌、骨髓癌、宫颈癌、慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、结肠直肠癌、食管癌、肝细胞癌、淋巴母细胞白血病、滤泡性淋巴瘤、T细胞或B细胞来源的淋巴恶性肿瘤、黑素瘤、髓细胞性白血病、骨髓瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、小细胞肺癌和脾脏癌。
在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，疾病或紊乱是血液学癌症，诸如白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，癌症选自由以下组成的组：霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、皮肤B细胞淋巴瘤、激活的B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡中心性淋巴瘤、转化型淋巴瘤、中间分化淋巴细胞淋巴瘤、中间淋巴细胞淋巴瘤(ILL)、弥漫性低分化淋巴细胞淋巴瘤(PDL)、中心细胞淋巴瘤、弥漫性小裂细胞淋巴瘤(DSCCL)、外周T细胞淋巴瘤(PTCL)、皮肤T细胞淋巴瘤、外套层(mantle zone)淋巴瘤、低级别滤泡性淋巴瘤、多发性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、急性T细胞白血病、急性髓系白血病(AML)、急性早幼粒细胞白血病、急性成髓细胞性白血病、急性巨核母细胞性白血病、前体B急性淋巴母细胞白血病、前体T急性淋巴母细胞白血病、伯基特白血病(伯基特淋巴瘤)、急性双表型白血病、慢性髓系淋巴瘤、慢性髓细胞性白血病(CML)和慢性单核细胞白血病。在具体实施方案中，疾病或紊乱是骨髓增生异常综合征(MDS)。在另一具体实施方案中，疾病或紊乱是急性髓系白血病(AML)。在另一具体实施方案中，疾病或紊乱是慢性淋巴细胞白血病(CLL)。在又另一具体实施方案中，疾病或紊乱是多发性骨髓瘤(MM)。
在其他实施方案中，疾病或紊乱是实体瘤癌症。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，实体瘤癌症选自由以下组成的组：癌、腺癌、肾上腺皮质癌、结肠腺癌、结肠直肠腺癌、结肠直肠癌、导管细胞癌、肺癌、甲状腺癌、鼻咽癌、黑素瘤、非黑素瘤皮肤癌、肝癌和肺癌。
在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，癌症是肾上腺癌。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，癌症是肛门癌。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，癌症是阑尾癌。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，癌症是胆管癌。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，癌症是膀胱癌。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，癌症是骨癌。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，癌症是脑癌。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，癌症是乳腺癌。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，癌症是宫颈癌。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，癌症是结肠直肠癌。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，癌症是食管癌。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，癌症是胆囊癌。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，癌症是妊娠性滋养细胞疾病。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，癌症是头颈癌。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，癌症是霍奇金淋巴瘤。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，癌症是肠癌。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，癌症是肾癌。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，癌症是白血病。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，癌症是肝癌。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，癌症是肺癌。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，癌症是黑素瘤。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，癌症是间皮瘤。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，癌症是多发性骨髓瘤(MM)。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，癌症是神经内分泌肿瘤。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，癌症是非霍奇金淋巴瘤。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，癌症是口腔癌。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，癌症是卵巢癌。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，癌症是胰腺癌。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，癌症是前列腺癌。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，癌症是鼻窦癌。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，癌症是皮肤癌。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，癌症是软组织肉瘤脊柱癌。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，癌症是胃癌。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，癌症是睾丸癌。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，癌症是咽喉癌。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，癌症是甲状腺癌。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，癌症是子宫癌子宫内膜癌。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，癌症是阴道癌。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，癌症是外阴癌。
在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，肾上腺癌是肾上腺皮质癌(ACC)、副肾皮质癌(adrenal cortex cancer)、嗜铬细胞瘤或神经母细胞瘤。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，肛门癌是鳞状细胞癌、泄殖腔癌(cloacogenic carcinoma)、腺癌、基底细胞癌或黑素瘤。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，阑尾癌是神经内分泌肿瘤(NET)、黏液腺癌、杯状细胞类癌、肠型腺癌或印戒细胞腺癌。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，胆管癌是肝外胆管癌、腺癌、肝门胆管癌、肝门周围胆管癌、远端胆管癌或肝内胆管癌。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，膀胱癌是移行细胞癌(TCC)、乳头状癌、扁平癌、鳞状细胞癌、腺癌、小细胞癌或肉瘤。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，骨癌是原发性骨癌、肉瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、肉瘤、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、骨巨细胞瘤、脊索瘤或转移性骨癌。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，脑癌是星形细胞瘤、脑干神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、脑膜瘤、室管膜瘤、少突胶质细胞瘤、混合神经胶质瘤、垂体癌、垂体腺瘤、颅咽管瘤、生殖细胞瘤、松果体区肿瘤、髓母细胞瘤或原发性CNS淋巴瘤。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，乳腺癌是乳腺腺癌、侵袭性乳腺癌、非侵袭性乳腺癌、乳腺肉瘤、化生性癌、腺囊癌、叶状肿瘤、血管肉瘤、HER2阳性乳腺癌、三阴性乳腺癌或炎性乳腺癌。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，宫颈癌是鳞状细胞癌或腺癌。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，结肠直肠癌是结肠直肠腺癌、原发性结肠直肠淋巴瘤、胃肠间质瘤、平滑肌肉瘤、类癌、黏液腺癌、印戒细胞腺癌、胃肠类癌肿瘤或黑素瘤。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，食管癌是腺癌或鳞状细胞癌。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，胆囊癌是腺癌、乳头状腺癌、腺鳞癌、鳞状细胞癌、小细胞癌或肉瘤。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，妊娠性滋养细胞疾病(GTD)是葡萄胎、妊娠性滋养细胞赘生物(GTN)、绒毛膜癌、胎盘部位滋养细胞肿瘤(PSTT)或上皮样滋养细胞肿瘤(ETT)。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，头颈癌是喉癌、鼻咽癌、下咽癌、鼻腔癌、副鼻窦癌、唾液腺癌、口腔癌、口咽癌或扁桃体癌。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，霍奇金淋巴瘤是经典霍奇金淋巴瘤、结节性硬化型、混合细胞性、富含淋巴细胞型、淋巴细胞耗尽型或结节性淋巴细胞占优势的霍奇金淋巴瘤(NLPHL)。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，肠癌是小肠癌(small intestine cancer)、小肠癌(small bowel cancer)、腺癌、肉瘤、胃肠间质瘤、类癌肿瘤或淋巴瘤。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，肾癌是肾细胞癌(RCC)、透明细胞RCC、乳头状RCC、嫌色细胞RCC、集合管RCC、未分类RCC、移行细胞癌、尿路上皮癌、肾盂癌或肾肉瘤。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，白血病是急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓系白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓系白血病(CML)、毛细胞白血病(HCL)或骨髓增生异常综合征(MDS)。在具体实施方案中，白血病是AML。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，肝癌是肝细胞癌(HCC)、纤维板层HCC、胆管癌、血管肉瘤或肝转移。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，肺癌是小细胞肺癌、小细胞癌、组合的小细胞癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、鳞状细胞肺癌、大细胞未分化癌、肺结节、转移性肺癌、腺鳞癌、大细胞神经内分泌癌、唾液腺型肺癌、肺类癌、间皮瘤、肺肉瘤样癌或恶性颗粒细胞肺肿瘤。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，黑素瘤是浅表扩散性黑素瘤、结节性黑素瘤、肢端雀斑样痣黑素瘤、恶性雀斑样痣黑素瘤、无黑色素性黑素瘤、结缔组织增生性黑素瘤、眼黑素瘤或转移性黑素瘤。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，间皮瘤是胸膜间皮瘤、腹膜间皮瘤、心包间皮瘤或睾丸间皮瘤。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，多发性骨髓瘤是活动性骨髓瘤或郁积型骨髓瘤(smolderingmyeloma)。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，神经内分泌肿瘤是胃肠神经内分泌肿瘤、胰腺神经内分泌肿瘤或肺神经内分泌肿瘤。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，非霍奇金淋巴瘤是间变性大细胞淋巴瘤、淋巴母细胞淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、MALT淋巴瘤、小细胞淋巴细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、前体T淋巴母细胞白血病/淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病(ALL)、成人T细胞淋巴瘤/白血病(ATLL)、毛细胞白血病、B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、原发性纵隔B细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘区淋巴瘤、黏膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤、结边缘区B细胞淋巴瘤、脾边缘区B细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、B细胞非霍奇金淋巴瘤、T细胞非霍奇金淋巴瘤、自然杀伤细胞淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、Alibert-Bazin综合征、Sezary综合征、原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤(AITL)、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、系统性ALCL、肠病型T细胞淋巴瘤(EATL)或肝脾γ/δT细胞淋巴瘤。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，口腔癌是鳞状细胞癌、疣状癌、小唾液腺癌、淋巴瘤、良性口腔肿瘤、嗜酸细胞肉芽肿、纤维瘤、颗粒细胞瘤、角化棘皮瘤、平滑肌瘤、骨软骨瘤、脂肪瘤、神经鞘瘤、神经纤维瘤、乳头状瘤、尖锐湿疣、疣状黄瘤、化脓性肉芽肿、横纹肌瘤、牙源性肿瘤、黏膜白斑、黏膜红斑、鳞状细胞唇癌、基底细胞唇癌、口癌、牙龈癌或舌癌。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，卵巢癌是卵巢上皮癌、黏液上皮性卵巢癌、子宫内膜样上皮性卵巢癌、透明细胞上皮性卵巢癌、未分化上皮性卵巢癌、卵巢低度恶性可能肿瘤、原发性腹膜癌、输卵管癌、生殖细胞肿瘤、畸胎瘤、无性细胞瘤卵巢生殖细胞癌、内胚窦瘤、性索间质瘤、性索性腺间质瘤、卵巢间质瘤、卵巢颗粒细胞瘤、卵巢颗粒卵泡膜瘤、支持间质瘤、卵巢肉瘤、卵巢癌肉瘤、卵巢腺肉瘤、卵巢平滑肌肉瘤、卵巢纤维肉瘤、Krukenberg瘤或卵巢囊肿。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，胰腺癌是胰腺外分泌腺癌、胰腺内分泌腺癌或胰腺腺癌、胰岛细胞瘤或神经内分泌肿瘤。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，前列腺癌是前列腺腺癌、前列腺肉瘤、移行细胞癌、小细胞癌或神经内分泌肿瘤。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，鼻窦癌是鳞状细胞癌、黏膜细胞癌、腺样囊性细胞癌、腺泡细胞癌、鼻腔鼻窦未分化癌、鼻腔癌、副鼻窦癌、上颌窦癌、筛窦癌或鼻咽癌。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，皮肤癌是基底细胞癌、鳞状细胞癌、黑素瘤、Merkel细胞癌、卡波西肉瘤(KS)、光化性角化病、皮肤淋巴瘤或角化棘皮瘤。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，软组织癌是血管肉瘤、皮肤纤维肉瘤、上皮样肉瘤、尤文氏肉瘤、纤维肉瘤、胃肠间质瘤(GIST)、卡波西肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、去分化脂肪肉瘤(DL)、黏液样/圆细胞脂肪肉瘤(MRCL)、分化良好脂肪肉瘤(WDL)、恶性纤维组织细胞瘤、神经纤维肉瘤、横纹肌肉瘤(RMS)或滑膜肉瘤。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，脊柱癌是脊柱转移性肿瘤。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，胃癌是胃腺癌、胃淋巴瘤、胃肠间质瘤、类癌肿瘤、胃类癌肿瘤、I型ECL细胞类癌、II型ECL细胞类癌或III型ECL细胞类癌。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，睾丸癌是精原细胞瘤、非精原细胞瘤、胚胎癌、卵黄囊癌、绒毛膜癌、畸胎瘤、性腺间质瘤、睾丸间质细胞瘤或睾丸支持细胞瘤(sertoli cell tumor)。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，咽喉癌是鳞状细胞癌、腺癌、肉瘤、喉癌、咽癌、鼻咽癌、口咽癌、下咽癌、喉癌、喉鳞状细胞癌、喉腺癌、淋巴上皮瘤、梭形细胞癌、疣状癌、未分化癌或淋巴结癌。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，甲状腺癌是乳头状癌、滤泡性癌、Hürthle细胞癌、甲状腺髓样癌或间变性癌。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，子宫癌是子宫内膜癌、子宫内膜腺癌、子宫内膜样癌、浆液性腺癌、腺鳞癌、子宫癌肉瘤、子宫肉瘤、子宫平滑肌肉瘤、子宫内膜间质肉瘤或未分化肉瘤。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，阴道癌是鳞状细胞癌、腺癌、黑素瘤或肉瘤。在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，外阴癌是鳞状细胞癌或腺癌。
在一方面，本文提供了一种在抗原周围的组织中建立抗原的免疫耐受性的方法，该方法包括使组织与有效量的如本文描述的包括IL-2多肽的免疫缀合物分子接触。在一些实施方案中，组织中激活的B细胞、CD4+效应T细胞、CD8+效应T细胞、树突状细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、单核细胞、粒细胞、嗜酸性粒细胞和/或中性粒细胞的浓度减少。在一些实施方案中，组织中调节性T细胞的浓度增加。在一些实施方案中，促炎细胞因子的浓度在组织中减少。在一些实施方案中，促炎细胞因子是IL-1、IL-2、IL-6、IL-12、IL-17、IL-22、IL-23、GM-CSF、TNF-α、IFN-γ或其任何组合。在一些实施方案中，与抗原结合的抗体浓度在组织中减少。在一些实施方案中，抗原呈递细胞对抗原的呈递在组织中减少。在一些实施方案中，表达抗原的细胞的吞噬作用在组织中减少。在一些实施方案中，表达抗原的细胞的凋亡在组织中减少。在一些实施方案中，其中组织在受试者中，并且其中抗原是受试者的自身抗原。在一些实施方案中，受试者患有自身免疫性疾病。
在又另一方面，本文提供了一种用于治疗有相应需要的受试者中的自身免疫性疾病的方法，该方法包括向受试者施用有效量的如本文描述的包括IL-2多肽的免疫缀合物分子。在一些实施方案中，治疗减少对自身抗原的先天的、体液的或细胞介导的免疫应答。在一些实施方案中，方法还包括第二疗法的共施用。
在以上提及或下文提及的实施方案中的每一种或任何一种的一些实施方案中，疾病或紊乱是免疫性紊乱或自身免疫性紊乱。这样的紊乱包括自身免疫性大疱病、无β-脂蛋白血症、获得性免疫缺陷相关疾病、与器官移植相关的急性免疫疾病、获得性肢端发绀、急性和慢性寄生虫或感染过程、急性胰腺炎、急性肾衰竭、急性风湿热、急性横贯性脊髓炎、腺癌、心房异位搏动、成人(急性)呼吸窘迫综合征、AIDS痴呆综合征、酒精性肝硬化、酒精诱导的肝损伤、酒精诱导的肝炎、过敏性结膜炎、过敏性接触性皮炎、过敏性鼻炎、过敏和哮喘、同种异体移植物排斥反应、α-l-抗胰蛋白酶缺乏症、阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化、贫血、心绞痛、强直性脊柱炎相关肺病、前角细胞变性、抗体介导的细胞毒性、抗磷脂综合征、抗受体超敏反应、主动脉瘤和外周动脉瘤、主动脉夹层、动脉高压、动脉硬化、动静脉瘘、关节病、乏力、哮喘、共济失调、特应性过敏、心房颤动(持续性或阵发性)、心房扑动、房室传导阻滞、萎缩性自身免疫性甲状腺功能减退、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、1型自身免疫性肝炎(典型自身免疫性肝炎或狼疮性肝炎)、自身免疫性介导的低血糖、自身免疫性中性粒细胞减少症、自身免疫性血小板减少症、自身免疫性甲状腺疾病、B细胞淋巴瘤、骨移植物排斥反应、骨髓移植(BMT)排斥反应、闭塞性细支气管炎、束支性传导阻滞、烧伤、恶病质、心律失常、心脏眩晕综合征、心脏肿瘤、心肌病、心肺旁路炎症应答、软骨移植排斥反应、小脑皮质变性、小脑紊乱、混乱或多灶性房性心动过速、化学疗法相关紊乱、衣原体属(chlamydia)、胆汁郁积、慢性酒精中毒、慢性活动性肝炎、慢性疲劳综合征、与器官移植相关的慢性免疫性疾病、慢性嗜酸性粒细胞性肺炎、慢性炎性病变、慢性皮肤黏膜性念珠菌病、慢性阻塞性肺病(COPD)、慢性水杨酸盐中毒、结肠直肠常见变异免疫缺陷(常见变异型低丙种球蛋白血症)、结膜炎、结缔组织病相关的间质性肺病、接触性皮炎、库姆斯阳性溶血性贫血、肺心病(cor pulmonale)、Creutzfeldt-Jakob疾病、隐源性自身免疫性肝炎、隐源性纤维化肺泡炎、培养阴性脓毒症、囊性纤维化、细胞因子疗法相关紊乱、克罗恩病、拳击性痴呆(dementia pugilistica)、脱髓鞘性疾病、登革出血热、皮炎、硬皮性皮炎、皮肤状况、皮肌炎/多发性肌炎相关的肺病、糖尿病(diabetes)、糖尿病性动脉硬化病、糖尿病(diabetes mellitus)、弥漫性路易体病、扩张型心肌病、扩张型充血性心肌病、盘状红斑狼疮、基底神经节紊乱、弥散性血管内凝血、中年唐氏综合征、药物诱导的间质性肺病、药物诱导的肝炎、由阻断CNS多巴胺受体的药物诱导的运动障碍、药物敏感性、湿疹、脑脊髓炎、心内膜炎、内分泌病、肠病性滑膜炎(enteropathic synovitis)、会厌炎、EB病毒感染(Epstein-Barr virus infection)、红斑性肢痛症、锥体外系和小脑紊乱、家族性噬血细胞性淋巴组织细胞增生症、胎儿胸腺植入物排斥反应、Friedreich共济失调、功能性外周动脉紊乱、女性不孕症、纤维化、纤维化肺病、真菌性脓毒症、气性坏疽、胃溃疡、巨细胞性动脉炎、肾小球肾炎(glomerular nephritis)、肾小球性肾炎(glomerulonephritides)、Goodpasture综合征、甲状腺肿性自身免疫性甲状腺功能减退症(goitrous autoimmunehypothyroidism)(桥本氏病)、痛风性关节炎、任何器官或组织的移植物排斥反应、移植物抗宿主病、革兰氏阴性脓毒症、革兰氏阳性脓毒症、由细胞内生物引起的肉芽肿、B组链球菌(group B streptococci，GBS)感染、Graves病、含铁血黄素沉着症相关肺病、毛细胞白血病、Hallerrorden-Spatz病、桥本氏甲状腺炎、枯草热(hay fever)、心脏移植排斥反应、血色病、造血系统恶性肿瘤(白血病和淋巴瘤)、溶血性贫血、溶血性尿毒症综合征/溶栓性血小板减少性紫癜、出血、Henoch-Schoenlein紫癜、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、HIV感染/HIV神经病、霍奇金病、甲状旁腺功能减退症、亨廷顿舞蹈病、运动过度运动障碍(hyperkinetic movement disorders)、超敏反应、超敏性肺炎、甲状腺机能亢进、运动不足运动障碍、下丘脑-垂体-肾上腺轴评价、特发性Addison病、特发性白细胞减少症、特发性肺纤维化、特发性血小板减少症、特异性肝病、婴儿型脊髓性肌萎缩、感染性疾病、主动脉炎症、炎性肠病、胰岛素依赖型糖尿病、间质性肺炎、虹膜睫状体炎/葡萄膜炎/视神经炎、缺血-再灌注损伤、缺血性中风、幼年恶性贫血、幼年类风湿性关节炎、幼年脊髓性肌萎缩、卡波西肉瘤、川崎病、肾移植排斥反应、军团菌、利什曼病、麻风、皮质脊髓系统病变、线性IgA病、脂质水肿(lipidema)、肝移植排斥反应、莱姆病、淋巴皮病(lymphederma)、淋巴细胞浸润性肺病、疟疾、特发性男性不育症或NOS、恶性组织细胞增生症、恶性黑素瘤、脑膜炎、脑膜炎球菌败血症、肾显微镜下血管炎(microscopic vasculitis of the kidneys)、偏头痛、线粒体多系统紊乱、混合性结缔组织病、混合性结缔组织病相关的肺病、单克隆丙种球蛋白病、多发性骨髓瘤、多系统变性(Mencel、Dejerine-Thomas、Shy-Drager和Machado-Joseph)、肌痛性脑炎/Royal Free病、重症肌无力、肾脏显微镜下血管炎、鸟-胞内分枝杆菌、结核分枝杆菌、骨髓增生异常综合征、心肌梗死、心肌缺血性紊乱、鼻咽癌、新生儿慢性肺病、肾炎、肾病、肾病综合征、神经退行性疾病、神经源性I型肌萎缩、中性粒细胞减少性发热、非酒精性脂肪性肝炎、腹主动脉及其分支闭塞、闭塞性动脉紊乱、器官移植排斥反应、睾丸炎/附睾炎(epidydimitis)、睾丸炎/输精管结扎术逆转术、器官肿大(organomegaly)、骨关节病、骨质疏松、卵巢衰竭、胰腺移植排斥反应、寄生虫病、甲状旁腺移植排斥反应、帕金森病、盆腔炎、寻常型天疱疮、落叶型天疱疮、类天疱疮、常年性鼻炎、心包疾病、外周动脉粥样硬化性疾病、外周血管紊乱、腹膜炎、恶性贫血、晶状体相关葡萄膜炎(phacogenicuveitis)、肺孢子菌肺炎、肺炎、POEMS综合征(多发性神经病、器官肿大、内分泌病、单克隆丙种球蛋白病和皮肤改变综合征)、灌注后综合征、泵后综合征、MI心脏切开术后综合征(post-MI cardiotomy syndrome)、感染后间质性肺病、卵巢早衰、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性肝炎、原发性黏液水肿、原发性肺动脉高压、原发性硬化性胆管炎、原发性血管炎、进行性核上性麻痹、银屑病、1型银屑病、2型银屑病、银屑病关节病、继发于结缔组织病的肺动脉高压、结节性多动脉炎的肺部表现、炎性后间质性肺病、放射性纤维化、放射疗法、雷诺氏现象和疾病、雷诺氏病、Refsum病、规则性窄QRS心动过速、Reiter病、肾病NOS、肾血管性高血压、再灌注损伤、限制型心肌病、类风湿性关节炎相关间质性肺病、类风湿性脊椎炎、结节病、Schmidt综合征、硬皮病、老年性舞蹈症、路易体型老年痴呆、脓毒症综合征、脓毒性休克、血清阴性关节病、休克、镰状细胞贫血、T细胞或FAB ALL、Takayasu病/动脉炎、毛细血管扩张、Th2型和Thl型介导的疾病、血栓闭塞性脉管炎、血小板减少症、甲状腺炎、毒性、中毒性休克综合征、移植、创伤/出血、2型自身免疫性肝炎(抗LKM抗体肝炎)、B型胰岛素抵抗伴黑棘皮病、III型超敏反应、IV型超敏反应、溃疡性结肠炎关节病、溃疡性结肠炎、不稳定型心绞痛、尿毒症、尿脓毒血症、荨麻疹、葡萄膜炎、心脏瓣膜病、静脉曲张、血管炎、血管炎性弥漫性肺病、静脉疾病、静脉栓塞形成、心室颤动、白癜风、急性肝病、病毒和真菌感染、病毒性脑炎/无菌性脑膜炎、病毒相关嗜血细胞综合征、韦氏肉芽肿病、Wernicke-Korsakoff综合征、Wilson病、任何器官或组织的异种移植物排斥反应、耶尔森菌和沙门菌相关关节病、获得性免疫缺陷病综合征(AIDS)、自身免疫性淋巴增生综合征、溶血性贫血、炎性疾病、血小板减少症、与器官移植相关的急性和慢性免疫性疾病、Addison病、过敏性疾病、脱发、斑秃、动脉粥样硬化性疾病/动脉硬化、动脉粥样硬化、关节炎(包括骨关节炎、幼年慢性关节炎、脓毒性关节炎、莱姆病、银屑病关节炎和反应性关节炎)、Sjogren病相关肺病、Sjogren综合征、同种异体皮肤移植物排斥反应、皮肤改变综合征、小肠移植排斥反应、精子自身免疫、多发性硬化(所有亚型)、脊髓共济失调、脊髓小脑变性、脊椎关节病、I型散发性多腺体缺乏、II型散发性多腺体缺乏、Still病、链球菌性肌炎、中风、小脑结构性病变、亚急性硬化性全脑炎、交感性眼炎、晕厥、心血管系统梅毒、全身性过敏反应、全身性炎症反应综合征、全身性发病幼年类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、系统性红斑狼疮相关肺病、狼疮肾炎、系统性硬化和系统性硬化相关间质性肺病。
5.5药物组合物
在一方面，本公开内容还提供了包含至少一种本公开内容的免疫缀合物分子的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物包含1)免疫缀合物分子，和2)药学上可接受的载体。
包含抗体或含抗体的免疫缀合物分子的药物组合物通过将具有期望纯度的抗体或免疫缀合物分子与任选的生理上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合(参见例如，Remington,Remington’s Pharmaceutical Sciences(第18版1980))以水性溶液或冻干或其他干燥形式制备用于储存。
本公开内容的免疫缀合物分子可以以适合用于递送至靶细胞/组织的任何形式配制，例如，作为微胶囊或粗滴乳液(Remington，同上；Park等人，2005,Molecules 10:146-61；Malik等人，2007,Curr.Drug.Deliv.4:141-51)、作为缓释制剂(Putney和Burke，1998,Nature Biotechnol.16:153-57)或在脂质体中(Maclean等人，1997,Int.J.Oncol.11:325-32；Kontermann,2006,Curr.Opin.Mol.Ther.8:39-45)。
本文提供的免疫缀合物分子也可以包封在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中，例如分别包封在羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊中，包封在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)或粗滴乳液中。这样的技术例如，在Remington同上中公开。
各种组合物和递送系统是已知的，并且可以与抗体或含抗体的分子诸如本文描述的免疫缀合物分子一起使用，包括但不限于包封在脂质体、微粒、微胶囊、能够表达抗体的重组细胞中、受体介导的内吞中(参见例如，Wu和Wu，1987,J.Biol.Chem.262:4429-32)、作为逆转录病毒或其他载体的一部分的核酸的构建等。在另一种实施方案中，组合物可以作为控制释放或持续释放系统提供。在一种实施方案中，可以使用泵来实现控制释放或持续释放(参见例如，Langer，同上；Sefton,1987,Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201-40；Buchwald等人，1980,Surgery88:507-16；和Saudek等人，1989,N.Engl.J.Med.321:569-74)。在另一种实施方案中，可以使用聚合材料来实现预防剂或治疗剂(例如，如本文描述的与PD-1结合的抗体)或本发明组合物的控制释放或持续释放(参见例如，Medical Applications of Controlled Release(Langer和Wise编著，1974)；Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance(Smolen和Ball编著，1984)；Ranger和Peppas,1983,J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61-126；Levy等人，1985,Science 228:190-92；During等人，1989,Ann.Neurol.25:351-56；Howard等人，1989,J.Neurosurg.71:105-12；美国专利第5,679,377号；第5,916,597号；第5,912,015号；第5,989,463号；及第5,128,326号；PCT公布第WO 99/15154号和第WO 99/20253号)。用于持续释放制剂的聚合物的实例包括但不限于，聚(甲基丙烯酸2-羟基乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙交酯(PLG)、聚酸酐、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚丙交酯(PLA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)和聚原酸酯。在一种实施方案中，用于持续释放制剂的聚合物是惰性的、不含可浸出(leachable)的杂质、在储存时是稳定的、无菌的和可生物降解的。
在又另一种实施方案中，控制释放或持续释放系统可以被放置在特定靶组织(例如鼻道或肺)附近，因此仅需要全身剂量的一部分(参见例如，Goodson,Medical Applications of Controlled Release第2卷,115-38(1984))。例如，Langer,1990,Science 249:1527-33讨论了控制释放系统。本领域技术人员已知的任何技术都可以用于生产包含如本文描述的一种或更多种与PD-1结合的抗体的持续释放制剂(参见例如，美国专利第4,526,938号，PCT公布第WO 91/05548号和第WO 96/20698号，Ning等人，1996,Radiotherapy&Oncology 39:179-89；Song等人，1995,PDA J.of Pharma.Sci.&Tech.50:372-97；Cleek等人，1997,Pro.Int’l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24:853-54；和Lam等人，1997,Proc.Int’l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24:759-60)。
5.6试剂盒
本文还提供了包含如本文提供的免疫缀合物分子或其组合物(例如，药物组合物)的被包装在合适的包装材料中的试剂盒。试剂盒任选地包括标签或包装插入物，该标签或包装插入物包括组分的描述或其中组分的体外、体内或离体使用的说明。
术语“包装材料”是指容纳试剂盒的组分的物理结构。包装材料可以维持组分无菌，并且可以由通常用于这样的目的的材料(例如，纸、波纹纤维、玻璃、塑料、箔、安瓿、小瓶、管等)制成。
本文提供的试剂盒可以包括标签或插入物。标签或插入物包括“印刷品”，例如，纸或纸板，单独的或附着至组件、试剂盒或包装材料(例如，箱子)上，或附着至例如容纳试剂盒组分的安瓿、管或小瓶上。标签或插入物可以另外地包括计算机可读介质，诸如磁盘(例如，硬盘、卡、存储盘)、光盘诸如CD-或DVD-ROM/RAM、DVD、MP3、磁带或电存储介质诸如RAM和ROM或这些的混合物诸如磁/光存储介质、FLASH介质或存储类型卡。标签或插入物可以包括标识制造商信息、批号、制造商位置和日期的信息。
本文提供的试剂盒可以另外地包含其他组分。试剂盒的每种组分可以封装在单独的容器内，并且所有的不同容器可以在单个包装内。试剂盒也可以设计成用于冷藏。试剂盒可以进一步设计成含有本文提供的抗体或含有编码本文提供的抗体的核酸的细胞。试剂盒中的细胞可以维持在适当的储存条件下，直到准备使用。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的相同含义。尽管在本发明的实践或测试中可以使用与本文描述的方法和材料相似或等同的方法和材料，但本文描述了合适的方法和材料。
本文引用的所有申请、出版物、专利和其他参考文献、GenBank引文和ATCC引文通过引用以其整体并入。在冲突的情况下，将以包括定义的说明书为准。
除非上下文另外清楚地指明，否则如本文使用的单数形式"一(a)"、"一(an)"和"该(the)"包括复数指代物。因此，例如，提及“肽序列”包括多于一个这样的序列，诸如此类。
如本文使用的，数值通常在整个本文档中以范围格式呈现。除非上下文另外清楚地指明，否则范围格式的使用仅仅是为了方便和简洁，并且不应该被解释为对本发明范围的不可改变的限制。因此，除非上下文另外清楚地指明，否则范围的使用明确包括所有可能的子范围、该范围内的所有单独的数值、以及包括这样的范围内的整数的所有数值或数值范围和范围内的值或整数的分数。无论范围的广度如何，这种结构都适用，并且适用于本专利文件中的所有上下文中。因此，例如，提及90％-100％的范围包括91％-99％、92％-98％、93％-95％、91％-98％、91％-97％、91％-96％、91％-95％、91％-94％、91％-93％，诸如此类。提及90％-100％的范围还包括91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％等，以及91.1％、91.2％、91.3％、91.4％、91.5％等，92.1％、92.2％、92.3％、92.4％、92.5％等，诸如此类。
此外，提及1-3、3-5、5-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-110、110-120、120-130、130-140、140-150、150-160、160-170、170-180、180-190、190-200、200-225、225-250的范围包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20等。在另外的实例中，提及25-250、250-500、500-1,000、1,000-2,500、2,500-5,000、5,000-25,000、25,000-50,000的范围包括在这样的值内或涵盖这样的值的任何数值或范围，例如，25、26、27、28、29…250、251、252、253、254…500、501、502、503、504…等。
如本文使用的，在整个本文件中公开了一系列范围。一系列范围的使用包括上限范围和下限范围的组合，以提供另一个范围。无论范围的广度如何，这种结构都适用，并且适用于本专利文件中的所有上下文中。因此，例如，提及一系列范围诸如5-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-75、75-100、100-150，包括范围诸如5-20、5-30、5-40、5-50、5-75、5-100、5-150以及10-30、10-40、10-50、10-75、10-100、10-150以及20-40、20-50、20-75、20-100、20-150，诸如此类。
为了简洁起见，本文使用了某些缩写。一个实例是表示氨基酸残基的单字母缩写。氨基酸及其对应的三字母和单字母缩写如下：
本发明在本文一般使用肯定语言来描述许多实施方案。本发明还具体包括其中完全或部分排除了特定主题，诸如物质或材料、方法步骤和条件、方案、程序、测定或分析的实施方案。因此，尽管本发明一般不以本发明未包括的内容来表达，但本发明中未明确包括的方面仍然在本文公开。
已经描述了本发明的多种实施方案。尽管如此，将理解的是，可以做出各种改变而不偏离本发明的精神和范围。因此，以下实施例旨在说明但不限制权利要求中描述的发明范围。
6.实施例
本部分(即第6部分)中的实施例是作为说明而非限制提供的。
6.1实施例1：一般方法
6.1.1细胞系和培养条件
如果没有指明不同，所有的细胞培养基和补充剂都是从Thermofisher的Gibco获得的。HEK 293T细胞购自(Fenghui ShengWu,China)，并且维持在补充有10％胎牛血清(FBS)、1％ L-谷氨酰胺(L-glu)、1％丙酮酸钠、1％青霉素和链霉素(P/S)的DMEM中。HEKBlue IL2报告细胞系购自InVivoGen,USA，并且维持在补充有10％热灭活胎牛血清(FBS)、1％ L-谷氨酰胺(L-glu)、1％丙酮酸钠、1％青霉素和链霉素(P/S)与100ug/mL Normacin(InVivogen)的DMEM中。CTLL-2细胞系购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，并且用补充有10％胎牛血清(FBS)、1％L-谷氨酰胺(L-glu)、1％丙酮酸钠、1％青霉素和链霉素(P/S)的RPMI培养。NK-92细胞系购自Procell,China，并且维持在公司提供的由补充有20U/mL IL2、MEMa、0.2mM肌醇、叶酸、0.1mMβ-巯基乙醇、12.5％马血清、12.5％胎牛血清、1％ P/S的RPMI组成的培养基中。Expi293F(目录号：A14635)。ExpiCHO(目录号：A29133)细胞购自Thermofisher，并且维持在制造商提供的培养基中。
6.1.2稳定表达hFAP的细胞系的产生
如下文描述产生稳定表达hFAP的贴壁HEK 293T细胞。具有潮霉素抗性基因的hFAP表达载体购自Sino Biologics(目录号：HG10464-UT)。使用Lipofectamine 2000(Thermofisher)系统将质粒转染到HEK 293T中。在转染之后24小时，向细胞培养物中添加150μg/mL潮霉素，并且在随后两周中当必要时更换新鲜培养基。扩增存活细胞，并且hFAP表达使用用抗FAP mAB(目录号#：BMS168,Thermofisher)和山羊抗小鼠Alexa 488(目录号：A32723,Thermofisher)标记的流式细胞仪(CYTOFLEX,Beckman Coulter)来确认。FAP表达克隆使用BD FACSAria III分选仪从池中分选。选择命名为HEK 293T-hFAP-E5的高表达克隆并且用于如下文描述的测定，并且其受体密度使用Quantum Alexa Fluor 488MESF试剂盒(Bangslab,USA)校准为约3×106/细胞。
表达hFAP的悬浮液ExpiCHO细胞与以上描述相似地产生，不同之处在于细胞维持在悬浮液中并且培养基没有改变。选择命名为ExpiCHO-hFAP-G7的高表达克隆，并且用于如下文描述的测定。
6.1.3通过生物层干涉法的亲和力确定：
抗体-抗原相互作用的结合动力学通过使用Gator BLI系统的生物层干涉法来确定。特别地，生物素化的抗原被固定在包被有链霉抗生物素蛋白的传感器上，至～0.5-1.0nm的响应水平。候选抗体以在Fc部分含有Knob-in-Hole修饰的单价Fab-Fc融合蛋白的形式构建，并且经历连续两倍稀释，产生在100nM至3.1nM的范围内的最终浓度。将抗体样品应用于传感器并孵育长达240秒以允许抗体-抗原缀合，随后将传感器在PBST-BSA中孵育长达420秒以允许解离。结合常数(kon、koff和KD)在参考之后通过减去没有固定抗原的传感器的响应来确定。用Gator软件使用1:1结合相互作用对数据进行全局拟合，同时将响应拟合至未连接的Rmax。所有蛋白样品在PBST-BSA中稀释。
KD确定的典型方案：
步骤 时间 溶液
基线 120秒 PBST-BSA
抗原固定 180秒 生物素化的抗原(10-100nM)
基线 120秒 PBST-BSA
缔合 240秒 Fab-Fc(Knob-in-Hole)，_各种浓度
解离 240-420秒 PBST-BSA
6.2实施例2：抗体的产生
6.2.1抗FAP抗体的产生
亲本FAP mAb最初使用人类成纤维细胞激活蛋白(FAP)抗原通过噬菌体展示方法产生。从通过Kunkel诱变构建的噬菌体抗体文库(其中通过基于亚磷酰胺三核苷酸的引物引入基于密码子的CDR序列多样化)中分离Fab。用固定在链霉抗生物素蛋白珠上的抗原进行三至四轮噬菌体淘选。通过单克隆噬菌体ELISA对噬菌体池的初步表征鉴定了82个产生对可溶性FAP抗原具有KD～1-100nM的抗人类FAP抗体的亚克隆(数据未显示)，并且分别被命名为IgG-1至IgG-82。抗体被亚克隆成IgG1和Fab-Fc格式用于进一步研究。
HEK 293T和HEK 293T-FAP-E5细胞用于细胞结合，以确认选择的抗体能够与细胞表面上的表位结合，并且排除与细胞具有非特异性结合的抗体。HEK 293T-FAP-E5是表达～1×106FAP/细胞的单个克隆。HEK 293T-FAP-E5通过在亲本HEK 293T细胞上瞬时转染产生，通过FACS分选，通过潮霉素抗性选择，并且其受体密度遵循制造商提供的程序通过QuantumMESF 488(Bangs Laboratories,USA)定量。活细胞和固定细胞二者用于细胞结合。对于细胞固定，分离HEK 293T和HEK 293T-FAP-E5细胞，用PBS洗涤两次，用4％多聚甲醛固定，并且储存在PBS-1％ BSA中。
抗体与细胞的结合用Cytoflex(Beckman Coulter)通过流式细胞术测定。简言之，将1μg/mL纯化的抗体与5×104个细胞在100uL的体积中孵育30分钟。将细胞离心，并且用PBS-1％BSA洗涤一次。将1μg/mL山羊抗人类Alexa488的第二抗体(A-11013,Thermofisher)与洗涤的细胞在100μL的体积中孵育30分钟。将细胞离心，并且用PBS-1％ BSA洗涤一次。将标记的细胞重悬于300μL中并且使用FTIC设置装载到Cytoflex上。使用一对第一多克隆FAP抗体(PA5-95481,Thermofisher)和第二山羊抗兔Alexa488(A-11008,Thermofisher)作为阳性对照。使用一对抗体包括同种型抗体DP47GS和山羊抗人类Alexa488第二抗体(A-11013,Thermofisher)作为阴性对照。表1至表8中提及的所有抗体都可以与两种HEK 293T-FAP-E5细胞结合，但不能与HEK 293T细胞结合。
选择一组13个克隆(872-2、872-5、872-10、872-11、872-19、872-26、872-39、872-44、872-58、872-59、872-67、872-70和872-75)并且使其经历表位分箱研究。
6.2.2表位分箱
为了确定选择的抗FAP抗体是否共有非重叠表位，在GatorTM生物层干涉法(BLI)系统上进行表位分箱研究。将抗原(生物素化的FAP)固定至～0.5-1nm的响应水平。在建立基线之后，传感器经历饱和水平(>1μM)的抗FAP IgG抗体。在约60秒的短解离时间段之后，将传感器在含有第二抗体的溶液中孵育，并且监测响应。如果第二抗体的结合事件导致第一抗体结合事件的响应>50％，则认为抗体对具有不同的表位。在第一抗体结合事件之后，第二抗体事件未导致信号的任何进一步增加的抗体对被认为共有重叠表位。下文表9总结了表位分箱研究的结果。
表9
6.2.3基于细胞的FAP结合测定
随后筛选通过生物层干涉法确认结合的抗体与表达人类FAP的HEK-293细胞结合的能力。选择以nM水平的解离常数(表10)与FAP的两个非重叠表位结合的三种抗FAP IgG抗体(分别由克隆IgG 5、IgG 59和IgG 70产生，并且分别命名为抗体872-5、872-59和872-70)作为用于产生抗IL-2/抗FAP双特异性抗体的起始抗体。
表10
抗体 kon(M-1s-1) koff(s-1) KD(nM)
872-5 4.2×105 2.8×10-3 6.6
872-59 3.6×105 5.6×10-3 15.5
872-70 1.1×105 缓慢的 <1
6.2.4抗IL-2/抗FAP双特异性抗体的产生
为三种起始抗FAP抗体中的每一种构建噬菌体展示文库。特别地，Kunkel诱变，编码起始抗体的6个互补决定区(CDR)中的氨基酸残基的每个密码子被简并密码子NNK取代，一次一个位置。CDR内的每个突变的残基的饱和诱变被汇集用于随后的文库制备和噬菌体淘选。遵循公布的程序，将构建的文库的DNA电穿孔到用M13K07预感染的SS320细胞中。制备噬菌体用于淘选，与选择初始文库(libraries)相似，但有几处修改。使用1pmol生物素化的抗原用于噬菌体淘选。在选择过程期间，将1μM的可溶性竞争物添加至KingFisher板的孔E中。这允许“解离速率(off-rate)”选择，其中可溶性抗原由于大量摩尔过量的可溶性竞争物而与抗原包被的珠解离，因此可以竞争对噬菌体的结合。另外地，用生物素化的抗CH1抗体进行平行选择，以监测淘选实验内的表达偏倚。进行了三轮噬菌体淘选，并且准备所得输出用于下一代测序。对所得序列数据进行CDR内氨基酸分布偏好分析。
构建第二文库，将氨基酸多样性引入通过饱和诱变-NGS测序分析发现易于突变的CDR位置。噬菌体文库以与初始抗体文库相似的方式构建，使用Kunkel诱变和合成引物，并与电穿孔到用M13K07辅助噬菌体预感染的大肠杆菌菌株SS320中偶联。对许多IL-2变体进行噬菌体淘选，产生识别至少两个非重叠的IL-2表位的抗体。
6.2.5用于双特异性抗体分离的噬菌体淘选：
构建的抗体文库经历四轮噬菌体淘选。特别地，将含有起始噬菌体文库的500μL溶液在PBST-BSA(补充有0.2％ Tween 20、2％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲盐水)中稀释至A268＝1(～1×1012个菌落形成单位/mL)。通过与20μL M280链霉抗生物素蛋白Dynabeads孵育1小时来预先清洗(pre-clear)噬菌体文库。在预先清洗之后，将噬菌体文库与包被有50皮摩生物素化的IL2(Acro Biosciences)的20μL Dynabeads一起孵育。将样品在室温以轻轻混合孵育～1小时。然后将珠用磁力架沉淀以去除未结合的噬菌体。将样品用500μL PBST-BSA洗涤三次，并且然后与200μL 0.1M甘氨酸(pH 2.7)一起孵育15分钟，以从珠上洗脱噬菌体。然后将洗脱液的上清液与珠分离，用40μL 1M HEPES(pH 7.2)中和。将洗脱液和珠添加至5mL对数中期XL1-blue细胞中，并且允许在室温孵育30分钟。然后将感染的细胞通过添加补充有氨苄青霉素(50μg/mL)和M13K07辅助噬菌体(～1010pfu/mL)的25mL 2×YT来传代培养。允许细胞培养物在37℃以剧烈摇动生长～16小时。
相似地进行第2-4轮噬菌体淘选。特别地，在培养感染的细胞过夜之后，将细胞离心至沉淀并去除。将所得上清液通过添加1/5体积的PEG/NaCl溶液来沉淀，并且在冰上孵育30分钟。在以10,000×g离心15分钟之后，去除上清液，并且将噬菌体沉淀重悬于200μL PBS中。将重悬的噬菌体以14,000×g离心5分钟以去除不溶性物质。然后将噬菌体转移至新的管中，并且通过添加40μL PEG/NaCl溶液沉淀第二次。将样品放置在冰上～15分钟，然后以10,000×g旋转10分钟。去除上清液，并且将噬菌体重悬于200μL PBS中。将样品再次以14,000×g离心5分钟以去除不溶性物质。对噬菌体进行定量，并且制备用于用链霉抗生物素蛋白珠的预先清洗。这里，将在PBST-BSA中的250μL噬菌体A268＝0.2-0.5(第2轮使用A268＝0.5，第3轮和第4轮使用A268＝0.2)与10μL M280链霉抗生物素蛋白Dynabeads一起孵育30分钟。在预先清洗之后，将噬菌体添加至200uL KingFisherTM板的孔C中用于珠操作。将以下添加至KingFisherTM板用于噬菌体淘选：
孔 溶液 体积
孔A 链霉抗生物素蛋白珠+抗原(可变浓度) 100μL
孔B 在PBS中的10μM生物素溶液 100μL
孔C 预先清洗的噬菌体溶液 100μL
孔D PBST-BSA 100μL
孔E PBST-BSA 100μL
孔F PBST-BSA 100μL
孔G PBST-BSA 100μL
孔H 0.1M甘氨酸pH 2.7 100μL
用于噬菌体淘选的KingFisherTM方案如下：
孔 溶液 时间
孔A 孵育15分钟并快速混合 15min.
孔B 转移至孔B并快速混合 5min.
孔C 转移至孔C并快速混合 15min.
孔D 转移至孔D并快速混合 5min.
孔E 转移至孔E并快速混合 1min.
孔F 转移至孔F并快速混合 1min.
孔G 转移至孔G并快速混合 1min.
孔H 15分钟并快速混合 15min.
孔G 释放珠 N/A
在KingFisherTM噬菌体淘选方案之后，将噬菌体用20μL 1M HEPES中和。将50μL的噬菌体洗脱液添加至500μL对数中期XL1中持续30分钟用于感染。然后将感染的细胞在补充有氨苄青霉素(50μg/mL)和M13K07辅助噬菌体(～1010pfu/mL)的2.5mL 2×YT中来传代培养。将细胞培养物在37℃以剧烈摇动生长过夜以扩增噬菌体。另外地，通过铺板感染的系列稀释液来定量噬菌体，以监测每轮洗脱液中集落形成单位的数目。
噬菌体淘选持续至四轮。在每一轮期间使用的抗原的浓度在100nM至10nM的范围内，在随后的几轮期间使用较低的浓度。监测噬菌体淘选实验在连续几轮淘选中噬菌体滴度的增加。
6.2.6单克隆噬菌体ELISA：
为了从噬菌体淘选研究中鉴定具有期望结合特性的单独克隆(例如，能够与FAP和IL-2二者结合的抗体)，进行了单克隆噬菌体ELISA研究。使用来自洗脱液的噬菌体感染XL1-blue细胞。在30分钟之后，将细胞铺板在LB-氨苄青霉素板上，使得可以分离和挑选单独菌落。在37℃孵育过夜之后，将板上的菌落挑选并放置于96深孔块中，并且与补充有氨苄青霉素(50μg/mL)和M13K07辅助噬菌体(～1010pfu/mL)的400μL 2×YT一起孵育。将板在37℃以剧烈摇动孵育过夜。在孵育～14小时之后，将板离心(4000×g，持续10分钟)以使细胞沉淀。将所得含噬菌体的上清液在PBST-BSA中稀释10倍。将50μL的稀释的含噬菌体上清液在MaxisorpTM ELISA板的三个单独孔中孵育。孔#1含有2.5pmol固定的白细胞介素-2，孔#2含有2.5pmol固定的FAP，并且孔#3包被有BSA。将噬菌体孵育30分钟，然后用PBST洗涤三次。然后将板与50μL 0.2μg/mL抗M13-HRP抗体(SinoBiological,目录号11973-MM05T-H)一起孵育30分钟。将ELISA板在PBST再洗涤三次。辣根过氧化物酶活性用1-StepTM Ultra TMB-ELISA TMB底物(ThermoFisher)检测。允许ELISA板显影大约5分钟，并且用1M M磷酸猝灭反应。通过测量在410nm处的吸光度来定量反应物。将具有显著信号(>约背景的3倍)的样品送去用于序列分析。
通过噬菌体文库的筛选，鉴定出872-70亲本抗体的三个变体，并且将其命名为D001变体、D002变体和D029变体。这些变体能够(a)与野生型IL-2多肽和IL-2hex突变体(IL-2hex突变体不与IL-2受体CD25结合)结合。为了使噬菌体淘选选择偏向将可能损害IL-2信号传导的表位，野生型IL-2的选择在存在α-IL-2抗体NARA(其一致地结合IL-2的CD25表位)的情况下进行；(b)抑制IL-2活性；以及(c)保留FAP结合活性。
图4A示出了D002的单价Fab-Fc融合物与固定在链霉抗生物素蛋白传感器上的生物素化IL-2的并通过生物层干涉法测量的结合动力学，并且图4B示出了通过平衡结合分析确定的D002与IL-2相互作用的KD值为3.4μM。图4C示出了D002的单价Fab-Fc融合物与固定在链霉抗生物素蛋白传感器上的FAP的并通过生物层干涉法测量的结合动力学。D002与FAP相互作用的KD值为50nM(数据未示出)。
6.2.7抗体变体的产生
为了检查免疫缀合物的分子构型对分子活性的可能影响，分别为起始抗FAP抗体(872-5、872-59和872-70)和三种变体(D001、D002和D029)产生Fab和scFv变体。
特别地，抗体的Fab和scFv变体通过组合亲本抗体的结合序列重组产生。另外地，单结构域抗FAP抗体(命名为VHH6)通过从合成的VHH噬菌体文库中进行噬菌体展示淘选产生。噬菌体淘选使用对基于Fab的噬菌体文库描述的相同程序进行。表11总结了本研究中产生的变体的类型、对产生的变体测量的表位箱(epitope bin)和结合亲和力。
表11：抗体变体对FAP和IL-2的结合亲和力。
抗体 类型 表位箱 FAP KD IL-2KD
872-5 Fab/scFv 与872-59、872-70不同 7nM N.B.
872-59 Fab/scFv 与872-59、872-70不同 16nM N.B.
872-70 Fab/scFv 与872-59、872-70不同 <1nM N.B.
VHH6 单结构域 N/A ～μM N.B.
D001 Fab/scFv 与872-70相同 30nM >5μM
D002 Fab/scFv 与872-70相同 ～50nM** 3.4μM
N.B.＝没有可检测到的结合
**＝估计值
6.2.8亲和力成熟
锚定臂的亲和力成熟。872-5单克隆抗体的亲和力成熟由通过下一代测序获得的CDR内的氨基酸序列分布指导。简言之，我们观察到，872-5的CDR内的四个位置在饱和诱变偶联噬菌体淘选之后富含与亲本残基不同的氨基酸。这些突变体包括VL A91G、VL R92T、VHS52G和VH Q96L。通过第6.1.3部分中描述的生物层干涉法测试单个突变体与人类FAP的结合，并且导致～3倍至9倍的KD的改进(表12)。然后将单点突变体组合以产生双重、三重和四重突变的七种组合。观察到的最高亲和力小于100pM，这是相比于亲本872-5的亲和力的大于80倍的改进。
表12
双特异性抗体的亲和力成熟。通过下一代测序指导D029变体的亲和力成熟，以恢复与FAP的结合，同时维持与IL-2的结合。用对于mAb 872-5、872-59和872-70描述相似的方法，通过Kunkel诱变对mAb D029的CDR进行详尽诱变。在噬菌体淘选和NGS文库制备和分析之后，将CDR中氨基酸的序列分布与872-70(D029的亲本单克隆抗体)进行比较。评价了mAbD029和mAb 872-70的序列之间的差异，并且产生了一系列回复突变。将这些突变体重新格式化为单克隆抗体格式和Fc-Fab格式，以测试结合和重新格式化为免疫细胞因子构建体。此外，产生了在872-70或D029中最初不存在的下一代测序表明在两种抗原之间相容的一系列突变。如第6.1.3部分中描述，通过生物层干涉法测试D029的这些突变体在小规模粗制裂解物和纯化形式中的结合(表13)。
表13A
N.D.＝未确定
N.B.＝未检测到结合
表13B
“H1V10”＝D029VH结构域变体，含有T30S：W31R：S55L突变
“H1V11”＝D029VH结构域变体，含有W31Y：S32F：S55L突变
6.3实施例3：重组抗体-细胞因子免疫缀合物的产生
6.3.1不同分子构型的抗体-细胞因子免疫缀合物蛋白的产生
重组产生如图5B至图5U中所示的具有不同分子构型的抗体-细胞因子免疫缀合物，并且筛选其屏蔽和去屏蔽能力(参见表14)。特别地，免疫缀合物的DNA序列被密码子优化并克隆到pcDNA3.4载体(Thermofisher)中，具有信号肽，作为分泌蛋白。将每个肽链克隆到独立的载体中。在融合结合部处，CH3结构域的C-末端赖氨酸残基被去除。将蛋白在Expi293F表达系统(Thermofisher)中表达，并且将含Fc的蛋白用MonoA(Genescript)蛋白A亲和树脂纯化。简言之，将单独链的质粒以等质量比组合，并且使用ExpiFectamine转染至Expi293F细胞。在转染之后～18小时喂食细胞，并且在表达之后5-7天内通过以4000rpm离心5分钟收获上清液。在MonoA树脂与上清液孵育并洗涤之后，将蛋白通过0.1乙酸pH 4.0洗脱，用1/5体积的1M Tris pH 8.0中和，并且在PBS pH 7.4中透析。
6.3.2Fc变体的产生
免疫缀合物分子中的异二聚体Fc通过引入knob-in-hole突变进行修饰。特别地，在一些实施方案中，突变是一个Fc亚基中的S354C和T366W，以及另一个Fc亚基中的Y349C、T366S、L368A和Y407V。此外，为了减少Fc效应子活性用于筛选目的，将一组突变P329G、L234A和L235A引入到两个Fc亚基。
6.3.3突变体Fc抗体与Fc受体的结合的确定
为了确定Fc突变对与Fc受体结合的影响，建立了生物层干涉法(BLI)测定。简言之，将Avi加标签的Fc受体(CD16a(V176)或CD64，Acro Bio)在PBST-BSA中稀释至100nM，并且根据实验固定在Gator BLI仪器上的链霉抗生物素蛋白传感器上至1-2nm的固定水平。在用PBST-BSA建立基线之后，将传感器与赛妥珠单抗(Certolizumab)IgG或与TNFα复合的赛妥珠单抗IgG Fc突变体(500nM IgG+500nM TNFα亚基)一起孵育。该缔合步骤进行180秒，随后在PBST-BSA中解离180秒。Fc突变体与Fc受体的结合归一化为野生型赛妥珠单抗-IgG1结合的百分比。
评价了一组Fc突变体消除Fc与FcR受体结合的能力，如表15中示出的。将三重突变P329G、L234A和L235A掺入到Fc结构域中用于随后测试。
表15
6.4实施例4：
6.4.1生物物理特性
差示扫描荧光法通过在荧光团与由温度升高诱导的变性蛋白结合时的荧光改变来确定。简言之，将2-20μM蛋白与1×SYPRO Orange(Thermofisher目录号：56650)混合至在缓冲液PBS中的总体积为25μL。荧光通过QPCR仪器Roche Light Cycler 480监测，同时将温度以0.02℃/s的速度从25℃升高至95℃。将荧光强度的第一导数对温度作图，并且负峰温度是解链温度，并且指明蛋白变性的过程。解链温度越高，蛋白越稳定。
在Agilent 1200HPLC系统上用TSKgel Butyl-NPR(14947,TOSH Bioscience)柱进行疏水相互作用层析。简言之，将5μg蛋白样品(1mg/mL)与流动相A溶液(1.8M硫酸铵和0.1M磷酸钠，在pH 6.5)混合，以获得约1M的最终硫酸铵浓度，然后分析。流动相A和流动相B溶液(0.1M磷酸钠，pH 6.5)在20min内以1mL/min的流量进行线性梯度，在280nm处监测UV吸光度。
尺寸排阻层析在Agilent 1200HPLC系统上用TSKgel G3000SW(05789,TOSHBioscience)柱进行。使用0.35mL/mL的流量，用PBS作为运行缓冲液，并且根据主峰分配每个样品的保留时间。
SMAC测定在Agilent 1200HPLC系统上用Zenix SEC-300柱(213300-4630,SepaxTechnologies)进行。使用0.35mL/min的流量，用PBS作为运行缓冲液，并且根据主峰分配每个样品的保留时间。
使用生物层干涉法(BLI)以使用Gator系统(ProbeLife,USA)测量蛋白-蛋白相互作用。简言之，将光纤包被捕获试剂诸如链霉抗生物素蛋白、抗人类Fc抗体等。该仪器可以精确地测量当折射率改变时，光纤尖端处蛋白结合时波长偏移的光干涉。波长偏移的动力学和幅度直接反映了蛋白-蛋白相互作用的方式。例如，图15示出了五步实验。在第一步中，将包被有链霉抗生物素蛋白的光纤浸入PBST-0.5％ BSA中用于平衡。在第二步中，将光纤浸入50nM生物素化的5UTZ分子中，以将5UTZ装载到传感器表面上。在第三步中，将光纤浸入PBST-0.5％BSA中用于平衡。在第四步中，将光纤浸入蛋白混合物，诸如100nM FB-604+100nM Fc-hFAP中。在第五步中，将光纤浸入PBST-0.5％ BSA中用于解离。
测试了四种免疫缀合物分子FB-604、FB-675、FB-676、FB-626在不存在或存在可溶性Fc-hFAP的情况下与5UTZ结合的能力。如图15中示出的，在不存在可溶性Fc-hFAP的情况下，四种免疫缀合物分子中没有一种能够结合5UTZ，这表明细胞因子IL-2hex通过分子内相互作用被二合一抗体屏蔽。在存在可溶性Fc-hFAP的情况下，三种免疫缀合物分子FB-604、FB-675和FB-676变得能够与5UTZ结合，指明可溶性FAP与IL-2竞争与二合一抗体结合，从而从分子内相互作用中释放IL-2并且变得能够与5UTZ结合。如图16中示出的，5UTZ与IL2hex，但不与hFAP特异性结合。
6.4.2体内半衰期
在健康C57BL/6小鼠中测量感兴趣分子的药代动力学。使用缓慢推动，将小鼠在尾静脉中以150μL体积注射期望量的分子(50μg至900μg)。在不同时间点，通过眶后采血采集少量血液样品(20-100μL)，并且收集在包被有肝素以防止凝血的管中。在离心去除细胞之后，用山羊抗人类IgG、IgM、IgA (H+L)抗体(A18849,Invitrogen)作为捕获抗体以及山羊抗人类IgG Fc交叉吸收的HRP(A18823,Invitrogen)作为检测抗体，通过ELISA测定血浆。将结果归一化为注射之后立即采集的每只小鼠血清中的初始浓度。如图7A中示出的，含有与Fc结构域融合的IL-2的对照分子(Knob-IL2Hex)的半衰期为1.4天。测试的两种免疫缀合物分子的半衰期延长至约5至10天，这与人类IgG的半衰期相当。分析了最大血清浓度和半衰期，并且在表中列出。900μg剂量(等同于小鼠中的45mg/kg)的血清浓度从90μg剂量成比例扩大规模，表明90μg剂量超过了靶介导的药物处置(TMDD)，并且在免疫细胞因子分子内二合一抗体的存在有效地掩蔽了细胞因子多肽IL2hex与其体内受体的结合。
Cmax(ug/mL) Th(天)
CTRL-50 21.1 1.4
#476-90 46.7 10.0
#476-900 473.4 5.0
#559-90 52.0 4.9
#559-900 380.5 7.7
6.5实施例5：活性测定
6.5.1基于细胞的IL-2信号传导测定
将HEK Blue IL-2报告细胞系(目录号：hkb-il2,InVivogen)在表面上用高亲和力人类IL-2受体(CD25、CD122和CD132)工程化。其对IL-2的剂量依赖性响应与细胞培养物上清液中分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)的水平相关，然后这使用酶测定进行测定。在这项研究中，遵循制造商提供的说明，IL-2活性使用QUANTI-Blue缓冲液和底物进行测定。EC50浓度使用最小二乘分析(来自Excel的TREND分析)进行计算。
特别地，为了测定IL-2活性，将20,000个HEK Blue IL-2细胞培养在平底96孔板中，并且以指明的浓度梯度向细胞培养物中添加裸IL-2多肽或含有IL-2的免疫缀合物分子。在孵育20小时之后，将细胞培养物的20μL上清液添加到180μL QUANTI-Blue缓冲液(目录号：rep-qbs,InVivoGen)中，并且将反应在37℃孵育1～3小时。使用TECAN平板阅读器确定在635nm处的吸光度(A635)，其反映了SEAP水平和对IL-2的剂量依赖性响应。
为了测定可溶性人类成纤维细胞激活蛋白(hFAP)对含有IL-2的免疫缀合物分子效力的影响，将20,000个HEK Blue IL-2细胞在平底96孔板中培养。将可溶性hFAP添加至细胞培养物中至200nM或2μM的测试的浓度，并且以指明的浓度梯度将含有IL-2的免疫缀合物分子添加至细胞培养物中。在孵育20小时之后，将细胞培养物的20μL上清液添加到180μLQUANTI-Blue缓冲液(目录号：rep-qbs,InVivoGen)中，并且将反应在37℃孵育1～3小时。使用TECAN平板阅读器确定在635nm处的吸光度(A635)，其反映了SEAP水平和对IL-2的剂量依赖性响应。
为了测定表达hFAP的细胞对含有IL-2的免疫缀合物分子的效力的影响，将20,000个HEK Blue IL-2细胞与20,000个HEK293T细胞或20,000个表面上表达hFAP的HEK293T细胞(HEK 293T-hFAP-E5细胞)在平底96孔板中共培养。将含有IL-2的免疫缀合物分子以指明的浓度梯度添加至细胞培养物中。在孵育20小时之后，将20μL上清液添加到180μL QUANTI-Blue缓冲液(目录号：rep-qbs,InVivoGen)中，并且将反应在37℃孵育1～3小时。使用TECAN平板阅读器确定在635nm处的吸光度(A635)，其反映了SEAP水平和对IL2的剂量依赖性响应。
6.5.1.1经由免疫缀合物分子中的分子内相互作用对细胞因子活性的抑制
为了检查根据本公开内容的免疫缀合物分子中细胞因子活性的分子内抑制，构建如图5B和图5C(或图8B和图8C)中示出的构型1和构型2的含有IL-2的免疫缀合物分子，并且经历如以上描述的基于细胞的IL-2信号传导测定，并且结果在图8A中示出。
特别地，在这项研究中，所有免疫缀合物分子都含有具有两个不相同亚基的Fc结构域，该亚基具有促进两条多肽链二聚化的knob-into-hole修饰。构型1(圆形)的免疫缀合物分子含有与Fc亚基之一的C-末端融合的IL-2多肽。构型2(圆形)的免疫缀合物分子含有与一个Fc亚基的C-末端融合的IL-2多肽，以及与另一个Fc亚基的C-末端融合的抗IL-2/抗FAP双特异性Fab(或对照抗体)。特别地，在本研究中构建了构型2的四种不同的免疫缀合物分子，其中两种含有分别衍生自D001抗体(下三角形)和D002抗体(菱形)的不同的抗IL-2/抗FAP双特异性Fab分子。作为阳性对照，构型2的第三免疫缀合物分子含有能够抑制IL-2信号传导(数据未示出)的特异性抗IL-2Fab抗体(155-01；上三角形)代替双特异性抗体，并且作为阴性对照，构型2的第四免疫缀合物分子含有没有表现出与IL-2或FAP(数据未示出)的可检测结合的Fab分子(D003；左三角形)代替双特异性抗体。还包括含有裸IL-2多肽的样品(Sino Biological,Beijing,China)作为阴性对照(正方形)。
如图8A中示出的，裸IL-2多肽(正方形)和测试的构型1(圆形)的免疫缀合物分子在报告细胞系中引发了对IL-2的相似剂量依赖性响应，其结果与免疫缀合物分子中缺乏掩蔽部分一致。相比之下，测试的构型2(上三角形；下三角形；菱形)的免疫缀合物分子中的每一个显著抑制IL-2活性，表明在这些免疫缀合物分子中双特异性抗体和IL-2之间存在分子内结合。
以上数据显示，本公开内容的免疫缀合物分子中的细胞因子保留其激活细胞表面受体和引发细胞响应的功能。此外，免疫缀合物分子中的双特异性抗体(即掩蔽部分)能够与细胞因子结合，从而抑制细胞因子活性。
6.5.1.2免疫缀合物分子的分子构型影响细胞因子的细胞内抑制的有效性
为了检查根据本公开内容的免疫缀合物分子的分子构型，包括不同组分的取向、排列和格式，是否会影响观察到的细胞因子活性的分子内抑制，构建如图5B、图5C和图5E(或图9B、图9C和图9D)中示出的具有构型1、构型2或构型4的免疫缀合物，并且经历如以上描述的基于细胞的IL-2信号传导测定，并且结果在图9A中示出。
特别地，在这项研究中，所有免疫缀合物分子都含有具有两个不相同亚基的Fc结构域，该亚基具有促进两条多肽链二聚化的knob-into-hole修饰。构型1(正方形)的免疫缀合物分子含有与Fc亚基之一的C-末端融合的IL-2多肽。构型2(圆形)的免疫缀合物分子含有与一个Fc亚基的C-末端融合的IL-2多肽，以及与另一个Fc亚基的C-末端融合的抗IL-2/抗FAP双特异性Fab。具有构型4(下三角形)的免疫缀合物分子含有抗IL-2/抗FAP双特异性Fab，其中Fab重链的N-末端与Fc亚基之一的C-末端融合，并且IL-2多肽与Fab轻链的N-末端融合。特别地，在这项研究中，构型2和构型4二者中的抗IL-2/抗FAP双特异性Fab都衍生自D001抗体。
如图9A中示出的，构型1的免疫缀合物(正方形)在报告细胞系中引发了对IL-2的剂量依赖性响应。相比之下，构型2(圆形)和构型4(下三角形)的免疫缀合物都表现出对IL-2活性的显著抑制。此外，与构型2(圆形)相比，构型4(下三角形)的免疫缀合物在阻断IL-2活性方面更有效。这些数据表明，虽然免疫缀合物的分子构型可能影响掩蔽部分和细胞因子之间分子内相互作用的有效性，但观察到的细胞因子抑制也不需要本研究中测试的特定分子构型。
6.5.1.3细胞因子的细胞内抑制减少细胞因子的体内毒性
针对细胞因子的二合一抗体的分子内相互作用可以抑制其体外效力，如HEK BlueIL2测定、CTLL2增殖测定和人类CD4+增殖测定中显示的。为了确定这种功能抑制与体内的相关性，在小鼠中检查了急性毒性。
据报告，高剂量IL-2治疗对小鼠可能是致命的。首先，C57BL/6J小鼠和CB-17SCID小鼠二者每天给药裸细胞因子Knob-IL2hex，每周五天，持续两周。通过死亡和体重减轻观察到的毒性与文献中报告的结果一致(例如，Clin Cancer Res 17(11)3673-85,2011)。为了简化比较，选择C57BL/6J小鼠进行随后的急性毒性研究。第二，评价了两种免疫缀合物分子(#449和#476)连同Knob-IL2hex和商业对照#439Akrevia-IL2hex在C57BL/6J中的毒性。Knob-IL2hex在一周内显示出从25μg/剂/天至50μg/剂/天的递增毒性，而所有其他三种分子在180μg/剂/天(相当于25μg/剂/天的4倍摩尔当量)未显示出任何毒性迹象。虽然该实验尚未达到所有这四种免疫缀合物分子的最大耐受剂量，但已显示免疫缀合物分子中的二合一抗体显著抑制IL-2的毒性(图30)。与药代动力学数据一起显示，与Knob-IL2hex相比，免疫缀合物分子的半衰期延长约5倍，在4倍摩尔当量剂量没有毒性迹象显示安全谱大于10倍的改进。
6.5.1.4可溶性抗原不激活非锚定免疫缀合物分子中的细胞因子活性
为了显示本公开内容的免疫缀合物分子中细胞因子活性的激活，首先，检查可溶性抗原是否能够竞争与掩蔽部分的结合，并以未结合的形式释放细胞因子来激活活性。在一项研究中，构建如图5B和图5C(或图10B和图10C)中示出的具有构型1和构型2的免疫缀合物分子，并且在存在可溶性人类成纤维细胞激活蛋白(hFAP)的情况下经历基于细胞的IL-2信号传导测定，并且结果在图10A中示出。
特别地，在这项研究中，所有免疫缀合物分子都含有具有两个不相同亚基的Fc结构域，该亚基具有促进两条多肽链二聚化的knob-into-hole修饰。构型1(空心正方形)的免疫缀合物分子含有与Fc亚基之一的C-末端融合的IL-2多肽。构型2的免疫缀合物分子含有与一个Fc亚基的C-末端融合的IL-2多肽，以及与另一个Fc亚基的C-末端融合的抗IL-2/抗FAP双特异性Fab。特别地，构建了构型2的两种不同的免疫缀合物，分别含有衍生自155_01抗体(带十字的空心正方形)和D002抗体(蓝色正方形)的抗IL-2/抗FAP双特异性Fab。在不存在可溶性hFAP(蓝色正方形)或存在200nM(粉色正方形)或2μM(红色正方形)可溶性hFAP的情况下，测试含有D002 Fab的免疫缀合物分子。包括含有裸IL-2多肽(Sino Biological,Beijing,China)(实心正方形)的样品作为阳性对照，并且包括含有可溶性hFAP(空心正方形虚线)的样品作为阴性对照。
如图10A中示出的，在这项研究中，与裸IL-2或缺乏掩蔽部分的构型1的免疫缀合物相比，在所有条件下测试的构型2的免疫缀合物分子表现出对IL-2活性的显著抑制。可溶性hFAP在测试的200nM和2μM的浓度未产生可观察到的IL-2激活，这表明可溶性FAP是与抗IL-2/抗FAP双特异性掩蔽部分结合的弱竞争物，并且因此在分子内抑制下激活IL-2活性方面与细胞表面上表达的hFAP相比不太有效。这些数据还显示，本公开内容的免疫缀合物分子可以经由细胞因子和掩蔽部分之间的强细胞内自身相互作用有效地抑制细胞因子活性，并且因此有效地防止细胞因子活性的脱靶(off-target)激活和随之而来的副作用。
6.5.1.5锚定的免疫缀合物表现出细胞因子活性的抗原依赖性激活
接下来，使用在细胞表面上表达抗原的细胞检查免疫缀合物分子中细胞因子活性的抗原依赖性激活。特别地，构建如图5B和图5D(或图11B和图11C)中示出的具有构型1和构型3的免疫缀合物分子，并且在存在表面上表达人类成纤维细胞激活蛋白(hFAP)的HEK293T细胞的情况下经历基于细胞的IL-2信号传导测定，并且结果在图11A中示出。
特别地，在这项研究中，所有免疫缀合物分子都含有具有两个不相同亚基的Fc结构域，该亚基具有促进两条多肽链二聚化的knob-into-hole修饰。构型1(正方形)的免疫缀合物分子含有与Fc亚基之一的C-末端融合的IL-2多肽。构型3的免疫缀合物分子含有(a)与一个Fc亚基的C-末端融合的IL-2多肽；(b)衍生自D002抗体并与另一个Fc亚基的C-末端融合的抗IL-2/抗FAP双特异性Fab；和(c)衍生自872-5抗体并与Fc亚基之一的N-末端融合的抗FAP scFv抗体。在不存在表达FAP的细胞(正方形)的情况下测试构型1的免疫缀合物；并且在存在未修饰的HEK293T细胞(圆形)或表面上表达hFAP的HEK293T细胞(三角形)的情况下测试构型3的免疫缀合物。
如图11A中示出的，与缺乏掩蔽部分(正方形)的构型1的免疫缀合物相比，构型3(圆形)的免疫缀合物在不存在表达FAP的细胞的情况下表现出对IL-2活性的显著抑制。当构型3的免疫缀合物与表达FAP的细胞(三角形)接触时，观察到IL-2活性的激活，表明细胞表面抗原能够将双特异性掩蔽部分转向从细胞因子解离，从而以未结合的形式释放细胞因子以激活其活性。
6.5.1.6通过在富含抗原的细胞环境中固定免疫缀合物分子，促进细胞因子活性的抗原依赖性激活。
接下来，为了检查观察到的细胞因子激活是否需要免疫缀合物分子与表达抗原的细胞的结合，如以上描述的，使用基于细胞的IL-2信号传导测定来测量细胞因子激活，同时将可溶性FAP或竞争性抗体添加至反应系统中以破坏结合，并且结果在图11D和图11E中示出。
特别地，在一项研究中，在不存在表达FAP的细胞(正方形)的情况下测试构型1的免疫缀合物。分别在存在未修饰的HEK293T细胞(圆形)的情况下、在存在在表面上表达hFAP的HEK293T细胞(蓝色三角形)的情况下、在存在在表面上表达hFAP的HEK293T细胞和与测试的免疫缀合物分子为相同浓度的可溶性hFAP(红色三角形)的情况下或在存在在表面上表达hFAP的HEK293T细胞和浓度为2nM(六边形尺寸1)、20nM(六边形尺寸2)、200nM(六边形尺寸3)和2μM(六边形尺寸4)的可溶性hFAP的情况下，测试构型3的免疫缀合物。包括含有添加的单独的未修饰的HEK293T细胞的反应作为阴性对照(上三角形)。
如图11D中示出的，可溶性FAP在存在表达FAP的细胞的情况下的滴定表现出对IL-2活性的剂量依赖性抑制，表明可溶性抗原分子与细胞表面抗原分子竞争与免疫缀合物的结合，从而干扰免疫缀合物分子与细胞的结合并抑制细胞因子活性。
在第二项研究中，在不存在表达FAP的细胞(正方形)的情况下测试构型1的免疫缀合物。分别在存在未修饰的HEK293T细胞(圆形)的情况下、在存在在表面上表达hFAP的HEK293T细胞(下三角形)的情况下或在存在在表面上表达hFAP的HEK293T细胞和200nM非结合抗体(菱形)、200nM 872-5抗FAP抗体(六边形)或200nM 872-70抗FAP抗体(五边形)的情况下测试构型3的免疫缀合物。包括含有添加的单独的未修饰的HEK293T细胞的反应作为阴性对照(上三角形)。
如图11E中示出的，与在不存在抗FAP抗体(下三角形)的情况下测量的IL-2活性相比，872-70(五边形)和872-5(六边形)抗体二者的存在均减少IL-2活性。对于添加的非结合抗体(菱形)的反应，没有观察到抑制。这些数据表明，抗FAP抗体与免疫缀合物分子竞争与细胞表面FAP结合，从而干扰免疫缀合物分子与细胞的结合并抑制细胞因子活性。
以上研究表明，当免疫缀合物分子与表达抗原的细胞结合时，本公开内容的免疫缀合物分子中细胞因子活性的抗原依赖性激活可以发生。接下来，为了检查结合是否由锚定部分与细胞表面抗原分子的结合介导，在第三项研究中，测量了缺乏锚定部分的免疫缀合物分子中的细胞因子激活。特别地，构建如图5B和图5D(或图12B和图12C)中示出的具有构型1和构型2的免疫缀合物分子，并且经历如以上描述的基于细胞的IL-2信号传导测定，并且结果在图12A中示出。
特别地，在这项研究中，所有免疫缀合物分子都含有具有两个不相同亚基的Fc结构域，该亚基具有促进两条多肽链二聚化的knob-into-hole修饰。构型1的免疫缀合物分子含有与Fc亚基之一的C-末端融合的野生型IL-2多肽(实心正方形)或突变IL-2hex多肽(空心正方形)。具有构型2(空心三角形；实心三角形)的免疫缀合物分子含有与一个Fc亚基的C末端融合的IL-2多肽，和与另一个Fc亚基的C末端融合的抗IL-2/抗FAP双特异性Fab。在存在未修饰的HEK 293T细胞(空心正方形；实心正方形)的情况下测试构型1的两种类型的免疫缀合物。在存在未修饰的HEK 293T细胞(空心三角形)或在细胞表面上表达hFAP的HEK293T细胞(实心三角形)的情况下测试构型2的免疫缀合物。
如图12A中示出的，构型1的两种类型的免疫缀合物在报告细胞系中触发了对IL-2的剂量依赖性响应，这与这些分子中缺乏掩蔽部分一致。在有或没有表达FAP的细胞的情况下测试的构型2的免疫缀合物均表现出对IL-2活性的显著抑制，指明抗IL-2/抗FAP双特异性Fab的分子内相互作用和对IL-2的抑制。值得注意的是，在有(实心三角形)或没有(空心三角形)表达FAP的细胞的情况下观察到的抑制之间不存在显著差异，这表明这些分子中锚定部分的缺乏消除了抗原依赖性IL-2激活。
这些研究表明，免疫缀合物分子的锚定部分与细胞表面抗原的结合可以将免疫缀合物分子固定在富含抗原的细胞环境中，从而将免疫缀合物分子的双特异性掩蔽部分转向与抗原结合，并释放细胞因子以激活其在这样的细胞环境中的细胞功能。
6.5.1.7二合一抗体内的亲和力对细胞因子活性的抑制和激活的影响
D002对IL2hex的亲和力是相对弱的(KD＝～3.4μM)，但D002能够有效地抑制细胞因子活性，而在具有构型2的免疫缀合物分子中，细胞因子以约1nM的KD与其受体结合，大于约300倍更紧密。分子内相互作用相比于分子间相互作用占优势，并且对于针对细胞因子活性的有效分子内抑制的亲和力需要是相对低的，而在μM范围内的KD值显示对于构型2是足够的。尽管D002以更高的亲和力(KD＝～50nM)与hFAP结合，但具有D002的免疫缀合物分子不能被表达hFAP的细胞激活，并且需要锚定部分诸如以构型3来产生sudo-分子内相互作用：固定的hFAP-锚定部分-D002与hFAP，以竞争掉(compete off)D002和IL2hex之间的抑制性分子内相互作用，从而激活细胞因子活性。
该假设得到了另一种示例性双特异性二合一抗体D029的支持，该抗体D029在1μM浓度未显示出与hFAP的明显结合，而以约431nM的KD与IL2hex结合。参考D002对IL2hex具有约3.4μM的KD，预期D029也能以构型2的免疫缀合物的格式抑制IL2。然而，有些出乎意料的是，具有D029作为掩蔽部分和构型3中锚定部分的免疫缀合物可以在存在表达hFAP的细胞的情况下激活细胞因子活性。测试含有scFv70和scFv5的两种不同的锚定部分，它们对hFAP具有相当的亲和力，但针对hFAP的不同表位。特别地，scFv70在与D029相同的表位处结合，而scFv5结合在不同的表位上。如图13A中示出的，不同的锚定部分显示不影响含有构型3的免疫缀合物分子的D029中细胞因子活性的激活。
对于免疫缀合物分子中细胞因子活性的抑制和激活的有效性，满足分子内相互作用的逻辑需要似乎更重要，而用于与激活信号(例如，肿瘤微环境中的肿瘤相关抗原)或分子内细胞因子结合的二合一抗体的亲和力似乎不太重要。然而，对激活信号或细胞因子的最佳亲和力应该存在一个范围。例如，对细胞因子极高的结合亲和力可以永久抑制细胞因子的亲和力，而对细胞因子极低的亲和力可能即使在不存在激活信号的情况下也不能有效地抑制细胞因子活性。因此，通过使用免疫缀合物的构型3产生一组在1nM至10μM范围内对hFAP具有不同亲和力和在100nM至10μM范围内对IL2hex具有不同亲和力的D029突变体，测试对D029的激活信号和细胞因子的亲和力的功能结果。对于D029突变体组在存在或不存在表达hFAP的细胞的情况下的KD值和EC50值在表13B中示出。
6.5.1.8由可溶性抗原激活免疫缀合物分子中的细胞因子活性
不受理论的约束，设想了，只要免疫缀合物分子能够与相同的Fc-hFAP二聚体结合，它就将满足应该能够释放细胞因子的分子内相互作用。实际上，如果锚定部分和二合一掩蔽抗体在hFAP上的不同表位处结合，长接头将能够同时接合到相同的Fc-hFAP分子上。构建一些免疫缀合物分子，并且检查被抑制的细胞因子活性是否可以通过使免疫缀合物分子与可溶性Fc-hFAP接触来释放。测试的免疫缀合物分子包括FB-604、FB-675、FB-676和FB-626。
测试从通过生物层干涉法的生物物理表征开始。使用IL-2结合分子5UTZ作为试剂。5UTZ能够与游离IL-2结合，但不能与以上免疫缀合物分子中的IL-2结合，其中由5UTZ识别的表位被二合一抗体屏蔽。首先将生物素化的5UTZ固定在传感器上。然后应用单独的或与可溶性Fc-hFAP复合的免疫缀合物分子检查5UTZ是否能与IL-2结合。如图17至图20中示出的，对于所有四种以50nM测试的单独的免疫缀合物分子，没有一种能够以可检测的水平与5UTZ结合，并且该结果确认了IL-2被二合一抗体有效地屏蔽。在与50nM的复合物中，三种免疫缀合物分子，即FB-604、FB-675和FB-675，显示出与5UTZ的显著结合，表明被二合一抗体的抑制被可溶性Fc-hFAP竞争掉。由于FB-604处于构型2中并且没有锚定部分，当前的实验没有回答关于锚定的问题。但是一个synaptokine FB-626没有显示出去屏蔽的作用，它与hFAP几乎没有明显的结合。
这组实验显示，只要hFAP亲和力不太低，可溶性hFAP可以诱导细胞因子的去屏蔽。
6.5.1.9多表位免疫缀合物中IL-2活性的激活
接下来，为了检查锚定的免疫缀合物分子中细胞因子活性的抗原依赖性激活是否需要锚定部分(例如，抗FAP抗体)和掩蔽部分(例如，抗IL-2/抗FAP双特异性抗体)与抗原(例如，FAP)的相同表位结合，构建如图5B和图5D(或图21B和图21C)中示出的具有构型1和构型3的免疫缀合物分子，并且经历如以上描述的基于细胞的IL-2信号传导测定，并且结果在图21A中示出。
特别地，在这项研究中，所有免疫缀合物分子都含有具有两个不相同亚基的Fc结构域，该亚基具有促进两条多肽链二聚化的knob-into-hole修饰。构型1的免疫缀合物分子含有与Fc亚基之一的C-末端融合的IL-2多肽。构型3的免疫缀合物分子含有(a)与Fc亚基之一的C-末端融合的IL-2多肽；(b)衍生自D002抗体的与另一个Fc亚基的C-末端融合的抗IL-2/抗FAP双特异性Fab；和(c)与Fc亚基之一的N-末端融合的抗FAP scFv抗体。分别衍生自872-5和872-70抗体的两种不同的抗FAP scFv抗体用于产生本研究中使用的免疫缀合物分子。特别地，如表9中示出的，双特异性D002 Fab和872-70scFv与FAP的相同表位结合，而872-5scFv与FAP的不同表位结合。在没有表达hFAP的细胞(正方形)的情况下测试构型1的免疫缀合物；有(空心圆形：872-5scFv；空心三角形：872-70scFv)或没有(实心圆形：872-5scFv；实心三角形：872-70scFv)表达FAP的细胞的情况下测试构型3的免疫缀合物。
如图21A中示出的，在不存在表达FAP的细胞的情况下，构型1的免疫缀合物在报告细胞系中触发了对IL-2的剂量依赖性响应(正方形)。相比之下，构型3的两种类型的免疫缀合物均表现出对IL-2活性的显著抑制(实心圆形；实心三角形)。当分子与表达FAP的细胞(空心圆形；空心三角形)接触时，观察到构型3的两种类型的免疫缀合物的IL-2活性的有效激活(EC50值增强多达200倍；数据未示出)。
在这项研究中，单表位免疫缀合物(即锚定部分和掩蔽部分与相同的表位结合)和双表位免疫缀合物二者均表现出有效的细胞因子激活，指明细胞因子的抗原依赖性激活不需要免疫缀合物分子的锚定和掩蔽部分来识别抗原的相同表位或不同表位并与之结合。
如图22至图24中示出的，分别包含scFv872-5、scFv872-59和scFv-70的三个锚定部分与hFAP的不同表位结合。如图中示出的，在不存在表达hFAP的细胞的情况下，所有测试的免疫缀合物分子对细胞因子具有相似的掩蔽作用。此外，在存在表达hFAP的细胞的情况下，两种免疫缀合物分子均能够去屏蔽并激活细胞因子活性。因此，这些实验显示，表位特异性显示不影响由免疫缀合物分子中的掩蔽部分屏蔽/去屏蔽细胞因子活性的能力。
6.5.1.10细胞因子活性的抗原依赖性激活发生在多种构型的免疫缀合物分子中
进行以下研究以检查免疫缀合物分子中细胞因子活性的抗原依赖性激活是否需要该分子的任何特定分子构型。
特别地，在一项研究中，构建如图5B和图5F(或图25B和图25C)中示出的具有构型1和构型5的免疫缀合物分子，并且经历如以上描述的基于细胞的IL-2信号传导测定，并且结果在图25A中示出。
在这项研究中，所有免疫缀合物分子都含有具有两个不相同亚基的Fc结构域，该亚基具有促进两条多肽链二聚化的knob-into-hole修饰。构型1的免疫缀合物含有与Fc亚基之一的C-末端融合的野生型IL-2多肽(圆形)或突变IL-2hex多肽(正方形)。构型5的免疫缀合物(空心菱形；实心菱形)含有(a)与Fc亚基之一的C-末端融合的IL-2多肽，(b)与另一个Fc亚基的C-末端融合的抗IL-2/抗FAP双特异性Fab抗体，和(c)与Fc亚基之一的N-末端融合的抗FAP单结构域抗体。在没有表达hFAP的细胞的情况下测试构型1的两种类型的免疫缀合物。在存在未修饰的HEK293T细胞(空心菱形)的情况下或在存在表达hFAP的HEK293T细胞(实心菱形)的情况下测试构型5的免疫缀合物。
如图25A中示出的，构型1的免疫缀合物在报告细胞系中触发了对IL-2的剂量依赖性响应(正方形；圆形)，这与这些分子中缺乏掩蔽部分一致。在不存在表达FAP的细胞的情况下，构型5的免疫缀合物表现出对IL-2活性的显著抑制(空心菱形)，并且当免疫缀合物分子与表达FAP的细胞接触时观察到IL-2激活(实心菱形)。
在另一项研究中，构建如图5B和图5G(或图26B和图26C)中示出的具有构型1和构型6的免疫缀合物分子，并且经历如以上描述的基于细胞的IL-2信号传导测定，并且结果在图26A和图26D中示出。
在这项研究中，所有免疫缀合物分子都含有具有两个不相同亚基的Fc结构域，该亚基具有促进两条多肽链二聚化的knob-into-hole修饰。构型1的免疫缀合物含有与Fc亚基之一的C-末端融合的野生型IL-2多肽(圆形)或突变IL-2hex多肽(正方形)。构型6的免疫缀合物含有(a)与Fc亚基之一的C-末端融合的IL-2多肽，(b)与另一个Fc亚基的C-末端融合的抗IL-2/抗FAP双特异性scFv抗体，和(c)与Fc亚基之一的N-末端融合的抗FAP Fab抗体。特别地，用于构建构型6的免疫缀合物的抗IL-2/抗FAP双特异性scFv抗体衍生自D002抗体，并且使用分别衍生自872-5、872-59和872-70抗体的三种不同的抗FAP Fab抗体来构建本研究中使用的构型6的免疫缀合物。特别地，如表9中示出的，D002 scFv与872-59Fab和872-70Fab的相同FAP表位结合，并且872-5Fab与不同的FAP表位结合。在没有表达hFAP的细胞的情况下测试构型1的两种类型的免疫缀合物(正方形；圆形)。在存在未修饰的HEK293T细胞(实心下三角形；实心菱形；实心左三角形)的情况下，或者在存在表达hFAP的HEK293T细胞(空心下三角形；空心菱形；空心左三角形)的情况下测试构型6的免疫缀合物。
如图26A和图26D中示出的，本研究中测试的构型6的所有三种类型的免疫缀合物在不存在FAP表达细胞(实心菱形、实心下三角形、实心左三角形)的情况下都表现出对IL-2活性的显著抑制。相比之下，当与表达FAP的细胞接触时，这些分子都表现出IL-2活性的激活，这与构型1的免疫缀合物的相当(空心菱形、空心下三角形、空心左三角形)。
以上研究表明，本公开内容的免疫缀合物分子中细胞因子活性的抗原依赖性激活可以发生在多种构型的分子中。例如，免疫缀合物的锚定部分和掩蔽部分可以识别分子的相同或不同的抗原表位，以在各自的条件下提供细胞因子活性的掩蔽和激活。此外，免疫缀合物分子的锚定部分和掩蔽部分可以独立地选自各种形式的抗体或其抗原结合片段，诸如Fab、scFv、单结构域抗体。尽管在本文描述的研究中测试的免疫缀合物的示例性实施方案可以共有某些共同的结构特征(例如，含有knob-in-hole修饰的Fc结构域)，但是基于本公开内容，本领域普通技术人员将能够设想本文示例的分子构型的可能变化，并且这些替代实施方案应该被认为是本公开内容的一部分。
不受理论的约束，设想了，为了通过分子内相互作用产生抑制作用，本发明免疫缀合物分子的掩蔽部分和细胞因子部分将在彼此附近。因此，产生并测试了具有细胞因子和与Fc结构域N-末端融合的掩蔽部分二者的免疫缀合物分子的替代构型。
在测试的构型中，有几种显示出相当的屏蔽和去屏蔽能力。例如，构型15中的FB-707含有与构型3中的FB-676相同的锚定部分和二合一抗体。如图27A至图27C中示出的，在存在表达hFAP的细胞的情况下，两种分子在屏蔽和去屏蔽效应中表现相似。
6.5.2经由STAT5磷酸化的IL-2R信号传导
活跃生长的原代小鼠T细胞首先在缺乏IL-2的小鼠T细胞培养基中饥饿过夜，随后在缺乏IL-2和FBS二者的小鼠T细胞培养基中饥饿2小时，二者均在37℃。将细胞沉淀并且在50μL温培养基中以每孔5×105个细胞的密度在超低结合96孔圆底板上铺板。将细胞通过添加50μL野生型IL-2或突变IL-2的系列稀释液的溶液在37℃刺激20min，并且将反应通过以搅拌在室温(RT)用1.5％多聚甲醛固定10min来终止。将细胞沉淀、倾析，并且用200μL100％冰冷甲醇在冰上透化至少30min或在-80℃孵育过夜。将固定的透化细胞用FACS缓冲液洗涤三次，并且将细胞内磷酸化的STAT5用在FACS缓冲液中以1:50稀释的Alexa647标记的抗STAT5 pY694(目录612601,BD Biosciences)并且在4℃在黑暗中孵育1小时来检测。将细胞洗涤并且在配备有高通量自动进样器(Beckman Coulter)的CytoFLEX上进行分析。数据表示针对野生型IL-2的最大强度归一化的平均荧光强度，并且点拟合至对数(激动剂)对响应(三参数)模型。
人类CD4+T细胞以冷冻格式(Saily Bio,China)购买，从人类PBMC中进行负选择。人类CD4+T细胞如先前描述被预激活(Smith GA等人Science Signaling 10eaan4931(2017))。简言之，将1000万个冷冻的人类CD4+T细胞解冻，并且在包被有5ug/mL抗CD3抗体OKT3(MA1-10176,Thermofisher)和0.5ug/mL抗CD28抗体(14-0289-82,Thermofisher)的6孔板上预激活72小时。收获细胞并用100U/mLIL2培养36小时，并且然后在没有IL2的情况下培养36小时，然后pSTAT5激活和增殖测定。用于pSTAT5染色和增殖二者的方案与以上对于CTLL2细胞的相同。
6.5.2.1由可溶性抗原激活细胞因子活性后，由免疫缀合物分子激活T细胞
不受理论的约束，IL-2的免疫肿瘤学潜力主要来自其刺激T细胞和NK细胞的能力。为了探索优化的分子的治疗相关性和作用机制，进行了以下研究以确定在存在hFAP的情况下的抑制和去屏蔽的程度。
特别地，在存在或不存在200nM Fc-hFAP的情况下测量免疫缀合物分子FB-604、FB-674、FB-675和FB-676刺激预激活的人类CD4+T细胞的能力。如图28A在示出的，对于没有锚定部分的免疫缀合物分子FB-604，IL2hex的效力增加了约2倍，而对于具有锚定部分的所有其他测试的免疫缀合物分子，IL2hex的效力增加了约10倍。
图28B示出了如使用pSTAT5染色测定测量的用本公开内容的免疫缀合物分子的人类CD4+T细胞激活。在存在或不存在200nM Fc-hFAP的情况下测量免疫缀合物分子FB-801、FB-794、FB-818和FB-834刺激预激活的人类CD4+T细胞的能力。如图中示出的，对于具有锚定部分的所有测试的免疫缀合物分子，IL2hex的效力增加了约30倍。
图29A示出了如使用pSTAT5染色测定测量的用本公开内容的免疫缀合物分子的人类CD4+T细胞激活。在存在或不存在200nM Fc-hFAP的情况下，测量免疫缀合物分子FB-611、FB-610、FB-609、FB-608、FB-607、FB-601、FB-600、FB-599、FB-598、FB-676、FB-675、FB-674和FB-604刺激预激活的人类CD4+T细胞的能力。图29B示出了如通过图29A的测定测量的EC50值的定量。
6.5.2.2IL-2诱导的T细胞增殖测定。
与人类CD4+T细胞中的pSTAT5激活测定一致，IL-2hex突变体与野生型IL-2相比具有约100倍低的效力(如以EC50测量的)，而FB-794具有比IL-2hex低约100倍的效力。虽然可溶性Fc-hFAP提供了约5倍的效力增加，但固定的Expi-CHO-hFAP-B7的存在显著提高了100pM至10nM范围内的效力。在100μL中的50k Expi-CHO-hFAP-B7对应于～1nM hFAP。一致的是FB-794的效力可以通过由Expi-CHO-hFAP-B7的去屏蔽和固定来增强，并且该增强比相当量的可溶性Fc-hFAP更有效得多。当存在超过Expi-CHO-hFAP-B7的有效容量的过量FB-794(>>1nM)时，增殖以可溶性FB-794占优势。合理期望FB-794在由高表达hFAP的细胞、IL-2敏感免疫细胞和高局部浓度FB-794组成的受限环境中将是高度有效的。
6.5.3体内毒性研究
免疫缀合物分子的体内毒性使用C57BL/6J和CB-17SCID小鼠评价。Knob-IL2hex含有通过3X(GGGGS)接头在Fc-Knob的C-末端处与单价IL2hex融合的具有66.8kDa分子量的沉默Knob-in-Hole结构域。Knob-IL2hex在每周的第1天、第2天、第3天、第4天、第5天以0、10μg、25μg、50μg/剂量施用至C57BL/6J小鼠，持续2周，以150μL的体积在尾部通过静脉由静脉内输注。每天监测死亡，并且工作日期间监测体重。死亡发生在25μg和50μg剂量组中，但未发生在0和10μg剂量组中。在所有10μg、25μg和50μg剂量组中观察到显著的体重减轻。结果绘制在图30上图中。
Knob-IL2hex在每周的第1天、第2天、第3天、第4天、第5天以0、5μg、10μg、30μg/剂量施用至CB-17SCID小鼠，持续两周。CB-17SCID免疫受损小鼠含有V(D)J重组缺陷，缺乏T细胞和B细胞二者。死亡发生在所有5μg、10μg和30μg剂量组，并且显著体重减轻是在10μg和30μg剂量。结果显示在图30下图中。
基于以上研究，选择在C57BL/6J小鼠中每周的第1天、第2天、第3天、第4天、第5天的25μg/剂量的方案来研究感兴趣的免疫缀合物分子的急性毒性。
使用四个样品评价免疫缀合物分子的体内毒性，包括对照(Knob-IL2hex,MW＝66.8kDa)、FB-439(MW＝92.3kDa)、FB-449(MW＝120kDa)和FB-476(MW＝116kDa)。特别地，对照含有在Fc-Knob的C-末端处融合的未掩蔽的IL2hex；FB-439含有CD122作为掩蔽部分，并且IL2hex在Fc-Knob的C-末端处融合；FB-449含有D049掩蔽部分，并且IL2hex在Fc-Knob的C-末端处融合；FB-476含有D047掩蔽部分，并且IL2hex在D047轻链的N-末端处融合。如图31A中示出的，样品中的免疫缀合物分子是纯的，完整地含有如预期的缀合结构域中的每一个。
三种免疫缀合物分子以及Knob-IL2WT的效力通过CTLL2增殖测定、NK92增殖测定和HEK Blue IL2活化测定来测定。如图31B至图31D中示出的，所有三种分子FB-439、FB-449和FB-476在所有三个测定中显示出从Knob-IL2hex的显著效力转移约10至1000倍。呈FB-476格式的D047显示出与呈FB-439格式的CD122相当的屏蔽作用。
将四个样品在第1天、第2天、第3天、第4天、第5天和第6天施用至C57BL/6J小鼠。Knob-IL2hex的25μg/剂量和施用产生急性毒性，在一周内显著体重减轻并死亡。如图32中示出的，以4倍过量摩尔浓度施用的具有掩蔽部分的三种免疫缀合物分子(FB-439、FB-449和FB-476)既未显示出任何体重减轻的迹象又未显示出死亡的迹象，指明掩蔽部分的存在显著减少小鼠中的急性毒性。值得注意的是，正如早先在图7A中显示的，在该剂量范围内，FB-449显示出比Knob-IL2hex长约8倍的半衰期。FB-449的综合毒性谱使免疫细胞因子暴露增加大于30倍，而没有毒性证据。
在另一项体内毒性研究中，将含有IL-2的免疫缀合物分子连续五天通过尾静脉注射施用至雌性C57BL/6J小鼠。样品包括IL-2Fc融合蛋白(10或50μg)、FB-439(140μg)、FB-476(180μg)，并且与PBS对照进行比较。免疫细胞因子的毒性通过每天测量体重和小鼠存活率来监测。如图32B中示出的，10μg IL-2Fc融合物(sKnob-IL2hex)的施用在施用后立即导致明显的体重减轻，而多达180μg根据本公开内容的含有IL-2的免疫缀合物分子的施用未导致可观察到的体重改变，显示本文描述的免疫缀合物分子的IL-2毒性显著减少。
6.5.4在IL2受体(IL-2R)结合位点具有突变的含有IL-2的免疫缀合物分子对细胞因子活性的体外抗原依赖性激活
进行以下研究以检查IL-2诱导的细胞活性是否可以通过调节免疫缀合物分子的IL-2部分与功能性IL-2R的不同亚基的结合来微调。设计了三种含有IL-2的免疫缀合物分子(#1097、1112、1150和1125)，它们含有在IL-2部分中的不同的突变、不同的二合一抗体和不同的锚臂。
免疫缀合物分子1150具有如图5O中示出构型14，而1097、1112和1125具有如图5P中示出的构型15。具体地，在1112中，IL-2部分含有多个点突变(T3A、K35E、F42A、C125S)，其中F42A突变影响IL-2Rα结合位点，并且IL-2部分与IL-2Rα的结合被减弱。掩蔽部分是与IL-2部分结合并阻断其与IL-2Rβ的结合的IL-2/FAP二合一抗体。锚臂是scFv-872-5。在1150中，IL-2部分含有多个点突变(D20T、K35E、C125S)，其中D20T突变驻留在IL-2Rβ结合位点中，并且IL-2部分与IL-2Rβ的结合被减弱。掩蔽部分是与IL-2部分结合并阻断其与IL-2Rα的结合的IL-2/FAP二合一抗体。锚臂是VHH-E33。在1097中，IL-2部分含有多个点突变(T3A、K35E、F42A、Y45A、L72G、C125S)，其中F42A、Y45A和L72G驻留在IL-2Rα结合位点中，并且IL-2部分与IL-2Rα的结合被消除。掩蔽部分是与IL-2部分结合并阻断其与IL-2Rβ的结合的IL-2/FAP二合一抗体。锚臂是scFv-872-5。在1125中，IL-2部分含有多个点突变(T3A、D20T、K35E、C125S)，其中D20T驻留在IL-2Rβ结合位点中，并且IL-2部分与IL-2Rβ的结合被减弱。掩蔽部分是与IL-2部分结合并阻断其与IL-2Rα的结合的IL-2/FAP二合一抗体。锚臂是scFv872-5。
构型1的IL2-Fc融合蛋白含有野生型IL-2多肽(Knob-IL2)或突变IL-2hex多肽(Knob-IL2hex)，并且用作阳性对照。如以上描述的，构建免疫缀合物分子1097、1112、1150和1125以及对照分子，并且在存在表达hFAP的细胞(HEK 293T-hFAP-E5)或不表达hFAP的细胞(HEK 293T)的情况下经历基于细胞的IL-2信号传导测定。结果在图34A、图35A、图36A和图37A中示出。
如图34A中示出的，免疫缀合物分子1097在不存在表达FAP的细胞的情况下表现出对IL-2的强抑制(上三角形；空心圆形)，并且在存在表达FAP的细胞的情况下表现出强IL-2活性(下三角形)，其活性水平与阳性对照相当(圆形；正方形)。相似地，如图36A和图37A中示出的，免疫缀合物分子1150和1125在不存在表达FAP的细胞的情况下也表现出对IL-2的强抑制(上三角形；菱形)，并且在存在表达FAP的细胞的情况下表现出强IL-2活性(下三角形)，其活性水平与阳性对照相当(圆形；正方形)。相比之下，并且如图35A中示出的，掩蔽作用在免疫缀合物分子1112中不太突出。具体地，该分子在存在或不存在FAP的情况下表现出相似的IL-2活性，并且与没有掩蔽部分的对照分子相似。
6.5.5含有IL-2的免疫缀合物分子的体内抗肿瘤活性
接下来，含有IL-2的免疫缀合物分子1097、1112、1150和1125的体内抗肿瘤活性和毒性使用荷瘤小鼠来评价。特别地，MC38-FAP肿瘤模型通过将1.5×106个异位表达FAP的MC-38小鼠结肠腺癌细胞(B-FAP-MC38,Biocytogen)皮下植入雌性C57BL/6J小鼠的侧腹来产生。肿瘤尺寸通过卡尺监测(肿瘤体积(mm3)＝(长度(mm)×宽度(mm)2)/2)。允许肿瘤生长至～100mm3，然后开始治疗。PBS、IL-2Fc融合物(12.5或25μg)和免疫缀合物分子1097(55μg或220μg)、1112(55μg或220μg)、1150(55μg)和1125(55μg)的给药在第0天、第3天和第6天通过尾静脉经由静脉内注射进行。如果体重减轻超过体重的15％或该组存在死亡，则终止给药。每2-3天测量一次肿瘤尺寸，并且每天测量体重。为了用作对照，用于评价1097的IL-2Fc融合物是含有突变T3A/F42A/Y45A/L72G/C125S的IL-2hex，用于评价1112的IL-2Fc融合物是含有突变T3A/F42A/K35E/C125S的突变IL-2，并且用于评价1150和1125的IL-2Fc融合物是含有突变T3A/D20T/K35E/C125S的突变IL-2。结果在图34C、图35C、图36C和图37D中示出。
如图34C中示出的，免疫缀合物分子1097(“FB-1097”)以220μg剂量的施用在C57BL/6J小鼠中抑制肿瘤生长，与以25μg剂量施用的突变IL-2hex(CTRLhex)相当。具体地，将雌性C57BL/6小鼠(每个治疗组n＝3)在每只小鼠的右侧腹中皮下接种100万个MC38-FAP细胞。当肿瘤达到80-100mm3时开始治疗。在接种后第0天、第3天和第6天给药媒介物(PBS)、25μg CTRL-IL2hex、55μg FB-1097和220μg FB-1097。相对于媒介物，25μg CTRL-IL2hex组和220μg FB-1097组显示出明显且相似的肿瘤消退。25μg CTRL-hex组显示出高达～20％的显著重量减轻，而220μg FB-1097未显示出任何明显的重量减轻。这些数据显示，FB-1097可以与其对应的IL2突变体的功效连同显著毒性减少相匹配。
如图34D中示出的，与施用PBS的小鼠相比，FB-1097以220μg剂量的施用在MC38-FAP C57BL/6小鼠的外周血中未显示出免疫细胞的任何改变。具体地，在第0天和第3天将C57BL/6小鼠施用媒介物(PBS)、12.5μg CTRL-IL2 WT、12.5μg CTRL-IL2hex和220μg FB-1097。在第5天计数血液中的绝对细胞。12.5μg CTRL-IL2WT组和12.5μg CTRL-IL2hex组二者均显示外周血中免疫细胞的显著扩增。220μg FB-1097组在免疫细胞中未显示出任何改变。
如图34E中示出的，与施用PBS的小鼠相比，免疫缀合物分子1097以220μg剂量的施用在C57BL/6小鼠中未显示出肺重量的任何改变。具体地，在第0天和第3天将C57BL/6小鼠施用媒介物(PBS)、12.5μg CTRL-IL2 WT、12.5μg CTRL-IL2hex和220μg FB-1097。在第5天将肺称重。12.5μg CTRL-IL2WT组和12.5μg CTRL-IL2hex组二者均显示出肺水肿的显著增加，如通过肺重量示出的。220μg FB-1097组在肺重量中未显示出任何改变。这些数据显示，施用免疫缀合物分子1097不导致水肿。
如图35C中示出的，免疫缀合物分子1112(“FB-1112”)以220μg剂量的施用在C57BL/6J小鼠中抑制肿瘤生长，与25μg的具有F42A突变的突变IL-2(CTRLF42A)相当，并且在观察时间段结束时两组小鼠都表现出肿瘤排斥反应(100％ CR)。具体地，将雌性C57BL/6小鼠(每个治疗组n＝3)在每只小鼠的右侧腹中皮下接种100万个MC38-FAP细胞。当肿瘤达到80-100mm3时开始治疗。在接种后第0天、第3天和第6天给药媒介物(PBS)、25μg CTRL-IL2hex和55μg FB-1112或220μg FB-1112。25μg CTRL-IL2hex组和220μg FB-1112组在用100万个MC38-FAP细胞再次攻击后显示出完全的肿瘤消退并保持无肿瘤。25μg CTRL-F42A显示出多达～10％的显著重量减轻，而220μg FB-1112未显示出明显的重量减轻。这些数据显示，FB-1112可以与其对应的IL2突变体的功效连同显著毒性减少相匹配。
如图36C中示出的，免疫缀合物分子1150(“FB-1150”)以55μg剂量的施用抑制C57BL/6J小鼠中的肿瘤生长。具体地，将雌性C57BL/6小鼠(每个治疗组n＝3)在每只小鼠的右侧腹中皮下接种100万个MC38-FAP。当肿瘤达到80-100mm3时开始治疗。在接种后第0天、第3天和第6天给药媒介物(PBS)、25μg CTRL-IL2D20T或55μg FB-1150。25μg CTRL-IL2D20T组显示出肿瘤完全消退，体重减轻最小。这些数据显示，55μg FB-1150显示出显著的肿瘤消退(TGI>50％)且无体重减轻。
如图36D中示出的，FB-1150以55μg剂量的施用在MC38-FAP C57BL/6小鼠中未显示出任何死亡率，而12.5μg CTRL-IL2D20T显示出25％死亡率。
如图36E中示出的，免疫缀合物分子1150以55μg剂量的施用在MC38-FAP C57BL/6小鼠中未显示出体重的任何改变。
如图37C中示出的，与施用12.5μg CTRL D20T的小鼠相比，在不存在FAP的情况下免疫缀合物分子1125(FB-1125)以220μg剂量的施用在MC38 C57BL/6小鼠中未抑制肿瘤生长。具体地，将C57BL/6小鼠在每只小鼠的右侧腹中皮下施用100万个MC38细胞。当肿瘤达到80-100mm3时开始治疗。在接种后第0天、第3天和第6天给药媒介物(PBS)、12.5μg CTRL-D20T或220μg FB-1125。12.5μg CTRL-IL2D20T组显示出肿瘤生长迟缓(blunt)。相比之下，220μg FB-1125组在使肿瘤生长迟缓方面未显示出任何作用，因为肿瘤体积与PBS治疗组相似。这些数据显示，在不存在FAP表达的情况下，FB-1125在使肿瘤生长迟缓方面是无效的。
如图37D中示出的，免疫缀合物分子1125以55μg剂量的施用能够在MC38-FAPC57BL/6小鼠中使肿瘤体积生长迟缓。具体地，将C57BL/6小鼠在每只小鼠的右侧腹中皮下施用100万个MC38-FAP。当肿瘤达到80-100mm3时开始治疗。在接种后第0天、第3天和第6天给药12.5μg CTRL-D20T、55μg FB-1125或55μg FB-1125和100μg si-4B9。FB-1125组显示出肿瘤生长迟缓。相比之下，FB-1125在存在FAP mAB(si-4B9)的情况下不能使肿瘤生长迟缓。这些数据显示，FB-1125能够在MC38-hFAP模型中使肿瘤生长迟缓，但在存在可以与FB-1125分子的锚定部分和掩蔽部分二者竞争的FAP mAB的情况下，其功效可能会受损。
以上分子1097、1112、1125和1150的体外和体内活性显示，具有(a)在IL-2部分中的减弱IL-2与IL-2Rα和IL-2Rβ亚基之一的结合的突变、(b)靶向IL-2Rα和IL-2Rβ亚基中另一个亚基的结合位点的掩蔽部分的IL-2免疫缀合物可以通过在缺乏FAP的细胞环境中有效地屏蔽IL-2活性来显著减少IL-2毒性，同时通过在存在FAP的癌细胞附近去屏蔽IL-2而保留强的抗肿瘤功效。这些研究验证了本文描述的免疫缀合物分子的设计策略，该策略将突变策略与细胞因子中定制的掩蔽靶组合，以微调免疫缀合物分子的体内活性和毒性。
6.5.6含有IL-2的免疫缀合物分子的体内抗肿瘤活性
免疫缀合物分子1150(FB-1150)是另一种含有IL-2的免疫缀合物分子，其被构建用于评价本文描述的含有IL-2的免疫缀合物分子的体内抗肿瘤活性。特别地，FB-1150具有如图5O中示出的构型14。具体地，在1150中，IL-2部分在IL-2Rβ结合位点中含有点突变(D20T)，并且IL-2部分与IL-2Rβ的结合被减弱。掩蔽部分是与IL-2部分结合并阻断其与IL-2Rα的结合的IL-2/FAP二合一抗体。
具体地，将C57BL/6小鼠在每只小鼠的右侧腹中皮下施用100万个MC38-FAP细胞。当肿瘤达到80-100mm3时开始治疗。在接种后第0天、第3天和第6天给药媒介物(PBS)、12.5μg sKnob-IL2D20T或55μg FB-1150。如图36C至图36E中示出的，免疫缀合物分子1150(FB-1150)以55μg剂量的施用在MC38-FAP C57BL/6小鼠中抑制肿瘤生长，与施用12.5μg sKnob-IL2D20T的小鼠相似。12.5μg CTRL-IL2D20T和55μg FB-1150组显示出肿瘤生长迟缓。此外，FB-1150组显示出存活率改变的无改变，而CTRL-IL2D20T显示出存活百分比下降。没有一组显示出体重的任何改变。这些数据显示，FB-1150抑制肿瘤体积，但没有引起不可耐受的副作用或毒性，如死亡率或体重的测量结果所反映的。
6.5.7含有结合IL-2和EpCAM的二合一抗体的免疫缀合物分子的激活
进行以下研究以检查在含有IL-2/Ep-CAM二合一抗体变体的免疫缀合物分子中是否发生细胞因子活性的抗原依赖性激活。
具体地，含有IL-2/Ep-CAM二合一抗体的免疫缀合物分子具有如图5P中示出的构型15。如以上描述的，构建这些免疫缀合物分子并经历基于细胞的IL-2信号传导测定。
对于这项研究，免疫缀合物分子含有具有两个不相同亚基的Fc结构域，该亚基具有促进两条多肽链二聚化的knob-into-hole修饰。具体地，这些免疫缀合物分子含有：(a)将含有如以上描述的突变以及K35E突变的IL-2hex多肽(IL2hex/K35E)与Fc亚基之一的C-末端融合，(b)将抗IL2/抗EpCAM二合一Fab抗体与另一个Fc亚基的C-末端融合，以及(c)将抗FAP单结构域抗体与Fc亚基之一的N-末端融合。此外，含有野生型IL-2多肽或突变IL-2hex多肽的构型1(IL-2Fc融合物)的免疫缀合物多肽用作对照。对照免疫缀合物分子和含有IL-2/Ep-CAM二合一抗体变体的免疫缀合物分子在表达hFAP的细胞(hek 293T细胞)和具有高表达EpCAM的细胞中进行测试。
图38A示出了具有图38B中描绘的构型的免疫缀合物分子A，显示了强屏蔽和去屏蔽作用。使用TECAN板阅读器确定低浓度IL-2对照增加在635nm处的吸光度(AU635)，这反映了分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)水平和对IL-2的响应。相比之下，在存在HEK 293T细胞的情况下，高浓度的免疫缀合物分子A显示出对IL-2的响应增加。此外，在存在表达Ep-CAM的细胞的情况下，低浓度的免疫缀合物分子A显示出IL-2活性增加。这些结果显示，含有IL2/Ep-CAM二合一抗体的免疫缀合物分子A在存在FAP的情况下显示出强的IL2活性去屏蔽。以上研究显示，含有IL2/Ep-CAM二合一抗体的免疫缀合物分子在存在FAP的情况下显示出IL2活性的去屏蔽。
图38C示出了固定的EpCAM和IL2变体hex/K35E分子与EpCAM和IL2双重特异性分子的Fab-Fc knob-into-hole单价构建体的生物层干涉法(BLI)结合曲线。为了确定免疫缀合物分子A是否可以与1)含有K35E突变的IL2hex和2)EpCAM结合，建立了生物层干涉法(BLI)测定。简言之，将IL2hex/K35E和EpCAM在PBST-BSA中稀释至15.6nM，并且根据实验固定在Gator BLI仪器上的链霉抗生物素蛋白传感器上至1-2nm的固定水平。在用PBST-BSA建立基线之后，将传感器与免疫缀合物分子A(500nM)一起孵育。该缔合步骤进行180秒，随后在PBST-BSA中解离180秒。免疫缀合物分子A与IL2hex/K35E或EpCAM的结合通过减去基线来归一化，其中抗体分析物经历不含EpCAM的空BLI传感器。这些数据指明，免疫缀合物分子A与IL2hex/K35E或EpCAM二者结合。

Claims (171)

1.一种免疫缀合物分子，包括：
(a)细胞因子部分，所述细胞因子部分包含具有细胞因子活性的细胞因子多肽；
(b)掩蔽部分；并且
其中所述掩蔽部分包含能够与所述细胞因子多肽和第一靶抗原结合的双特异性抗体或其抗原结合片段；
其中当与所述细胞因子多肽结合时，所述掩蔽部分降低或抑制所述细胞因子活性；并且
其中当与所述第一靶抗原结合时，所述掩蔽部分从所述细胞因子多肽解离，从而激活所述细胞因子活性。
2.根据权利要求1所述的免疫缀合物分子，其中所述掩蔽部分包含完整抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、dsFv、双抗体、三抗体、四抗体或由抗体片段形成的VHH。
3.根据权利要求1或2所述的免疫缀合物分子，其中所述双特异性抗体是二合一抗体。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的免疫缀合物分子，其中所述第一靶抗原不是所述细胞因子多肽。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的免疫缀合物分子，其中所述第一靶抗原在细胞表面上表达。
6.根据权利要求1所述的免疫缀合物分子，其中所述细胞是癌细胞或在肿瘤微环境中的细胞。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的免疫缀合物分子，其中所述第一靶抗原是可溶的。
8.根据权利要求1至5中任一项所述的免疫缀合物分子，其中所述第一靶抗原是肿瘤相关抗原。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的免疫缀合物分子，其中所述第一靶抗原是纤维化活化蛋白(FAP)。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的免疫缀合物分子，其中所述细胞因子部分包含野生型或突变型白细胞介素-2(IL-2)和任选的人类IL-2。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的免疫缀合物分子，还包括：
(c)锚定部分，所述锚定部分包含与第二靶抗原特异性结合的抗体或其抗原结合片段。
12.根据权利要求11所述的免疫缀合物分子，其中所述第二靶抗原在细胞表面上表达。
13.根据权利要求11或12所述的免疫缀合物分子，其中所述细胞是癌细胞或在肿瘤微环境中的细胞。
14.根据权利要求11至13中任一项所述的免疫缀合物分子，其中所述第二靶抗原是可溶的。
15.根据权利要求11至14中任一项所述的免疫缀合物分子，其中所述第二靶抗原是肿瘤相关抗原。
16.根据权利要求11至15中任一项所述的免疫缀合物分子，其中所述第一靶抗原和所述第二靶抗原是相同的。
17.根据权利要求16所述的免疫缀合物分子，其中所述双特异性掩蔽部分和所述锚定部分与所述第一靶抗原或所述第二靶抗原的相同表位结合。
18.根据权利要求16所述的免疫缀合物分子，其中所述双特异性掩蔽部分和所述锚定部分与所述第一靶抗原或所述第二靶抗原的不同表位结合。
19.根据权利要求11至18中任一项所述的免疫缀合物分子，其中所述第二靶抗原是纤维化活化蛋白(FAP)。
20.根据权利要求11至15中任一项所述的免疫缀合物分子，其中所述第一靶抗原和所述第二靶抗原是不同的。
21.根据权利要求11至20中任一项所述的免疫缀合物分子，其中所述锚定部分包含完整抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、dsFv、双抗体、三抗体、四抗体或由抗体片段形成的VHH。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的免疫缀合物分子，其中所述掩蔽部分的所述双特异性抗体或抗原结合片段是Fab、ScFv或VHH。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的免疫缀合物分子，其中所述锚定部分的所述抗体或其抗原结合片段是Fab、ScFv或VHH。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的免疫缀合物分子，还包括：
(d)缀合部分，其中所述缀合部分可操作地连接所述细胞因子部分、所述掩蔽部分和所述锚定部分中的两个或更多个。
25.根据权利要求24所述的免疫缀合物分子，其中所述缀合部分包含免疫球蛋白Fc结构域或其突变体。
26.根据权利要求25所述的免疫缀合物分子，其中所述Fc结构域包含第一亚基和第二亚基，它们是两条不相同的多肽链；并且其中所述Fc结构域包含促进所述两条不相同的多肽链的异二聚化的第一修饰。
27.根据权利要求26所述的免疫缀合物分子，其中所述第一修饰是knob-into-hole修饰，所述knob-into-hole修饰包括所述第一亚基中的knob修饰和所述第二亚基中的hole修饰。
28.根据权利要求25至27中任一项所述的免疫缀合物分子，其中所述Fc结构域包含第二修饰，其中所述Fc结构域与没有所述第二修饰的天然Fc结构域相比具有降低的与Fc受体的结合亲和力。
29.根据权利要求28所述的免疫缀合物分子，其中所述Fc结构域与没有所述第二修饰的天然Fc结构域相比具有降低的与Fcγ受体的结合亲和力。
30.根据权利要求29所述的免疫缀合物分子，其中所述Fcγ受体是FcγRIIIα受体、FcγRI受体或FcγRIIα受体。
31.根据权利要求28至30中任一项所述的免疫缀合物分子，其中所述Fc结构域与没有所述第二修饰的天然Fc结构域相比具有降低的与补体组分的结合亲和力。
32.根据权利要求31所述的免疫缀合物分子，其中所述补体组分是C1q。
33.根据权利要求28所述的免疫缀合物分子，其中所述Fc结构域与没有所述第二修饰的Fc结构域相比具有降低的Fc效应子功能。
34.根据权利要求33所述的免疫缀合物分子，其中所述降低的Fc效应子功能选自补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、细胞表面受体的下调和B细胞激活。
35.根据权利要求28至34中任一项所述的免疫缀合物分子，其中所述第二修饰包括选自S228P、E233P、L234V、L234A、L235A、L235E、ΔG236、D265G、N297A、N297D、P329E、P329S、P329A、P329G、A330S或P331S的一个或更多个突变，其中编号是Kabat中的EU索引的编号。
36.根据权利要求28至35中任一项所述的免疫缀合物分子，其中所述第二修饰包括选自E233P、L234V、L234A、L235A、ΔG236、D265G、P327E、A328S、P329E、A330S或P331S的一个或更多个突变，其中编号是Kabat中的EU索引的编号。
37.根据权利要求24至36中任一项所述的免疫缀合物分子，其中所述细胞因子部分连接至所述Fc结构域的所述第一亚基和所述第二亚基中的一个的C末端，并且所述掩蔽部分连接至所述Fc结构域的所述第一亚基和所述第二亚基中的另一个的C末端。
38.根据权利要求37所述的免疫缀合物分子，其中所述锚定部分连接至所述Fc结构域的所述第一亚基和所述第二亚基中的一个的N末端。
39.根据权利要求38所述的免疫缀合物分子，其中所述锚定部分和所述细胞因子部分连接至所述Fc结构域的相同亚基。
40.根据权利要求38所述的免疫缀合物分子，其中所述锚定部分和所述掩蔽部分连接至所述Fc结构域的相同亚基。
41.根据权利要求24至36中任一项所述的免疫缀合物分子，其中所述掩蔽部分连接至所述Fc结构域的所述第一亚基和所述第二亚基中的一个的C-末端；并且其中所述细胞因子部分连接至所述掩蔽部分。
42.根据权利要求41所述的免疫缀合物分子，其中所述锚定部分连接至所述Fc结构域的所述第一亚基和所述第二亚基中的一个的N末端。
43.根据权利要求42所述的免疫缀合物分子，其中所述锚定部分和所述掩蔽部分连接至所述Fc结构域的相同亚基；或者其中所述锚定部分和所述掩蔽部分连接至所述Fc结构域的不同亚基。
44.根据权利要求24至36中任一项所述的免疫缀合物分子，其中所述掩蔽部分连接至所述Fc结构域的所述第一亚基和所述第二亚基中的一个的N末端，并且所述细胞因子部分连接至所述掩蔽部分。
45.根据权利要求24至36中任一项所述的免疫缀合物分子，其中所述掩蔽部分连接至所述Fc结构域的所述第一亚基和所述第二亚基中的一个的N末端，并且其中所述锚定部分连接至所述Fc结构域的所述第一亚基和所述第二亚基中的另一个的N末端。
46.根据权利要求45所述的免疫缀合物分子，其中所述细胞因子部分连接至所述掩蔽部分。
47.根据权利要求45所述的免疫缀合物分子，其中所述细胞因子部分连接至所述锚定部分。
48.根据权利要求37至47中任一项所述的免疫缀合物分子，其中所述掩蔽部分的二合一抗体或其抗原结合片段是Fab、ScFv或VHH。
49.根据权利要求37至48中任一项所述的免疫缀合物分子，其中所述锚定部分的所述抗体或其抗原结合片段是Fab、ScFv或VHH。
50.根据权利要求24至49中任一项所述的免疫缀合物分子，其中所述细胞因子部分、所述掩蔽部分、所述锚定部分和所述缀合部分中的两个或更多个之间的连接是经由肽接头。
51.根据权利要求1至50中任一项所述的免疫缀合物，其中所述细胞因子是具有SEQ IDNO:1、3、7至15和107-110的IL-2多肽。
52.根据权利要求1至51中任一项所述的免疫缀合物，其中所述第一靶抗原和所述第二靶抗原是成纤维细胞活化蛋白(FAP)。
53.根据权利要求1至52中任一项所述的免疫缀合物，其中所述掩蔽部分包含与成纤维细胞活化蛋白(FAP)和白细胞介素-2(IL-2)结合的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含
(a)轻链可变区(VH)，所述轻链可变区(VH)包含表1中列出的抗体D001、D002、D029、D029LV1、D029LV2、D029LV3、D029LV4、D029LV5、D003、D047、D049或B10中任一种的VL互补决定区1(CDR1)、VL CDR2和VL CDR3；和/或
(b)重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含表2中列出的抗体D001、D002、D029、D029HV1、D029HV2、D029HV3、D029HV4、D029HV5、D029HV6、D003、D047、D049或B10中任一种的VH互补决定区1(CDR1)、VH CDR2和VH CDR3。
54.根据权利要求53所述的抗体或抗原结合片段，其中
(a)所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别包含SEQ ID NO:16、17和18的氨基酸序列，并且所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别包含SEQ ID NO:36、37和38的氨基酸序列；
(b)所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别包含SEQ ID NO:19、17和20的氨基酸序列，并且所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别包含SEQ ID NO:36、39和38的氨基酸序列；
(c)所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别包含SEQ ID NO:21、22和23的氨基酸序列，并且所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别包含SEQ ID NO:40、41和38的氨基酸序列；
(d)所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别包含SEQ ID NO:30、17和31的氨基酸序列，并且所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别包含SEQ ID NO:46、47和48的氨基酸序列；
(e)所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别包含SEQ ID NO:32、17和33的氨基酸序列，并且所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别包含SEQ ID NO:49、50和51的氨基酸序列；
(f)所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别包含SEQ ID NO:34、17和35的氨基酸序列，并且所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别包含SEQ ID NO:52、53和51的氨基酸序列；
(g)所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别包含SEQ ID NO:24、25和23的氨基酸序列，并且所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别包含SEQ ID NO:40、42和38的氨基酸序列；
(h)所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别包含SEQ ID NO:26、25和28的氨基酸序列，并且所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别包含SEQ ID NO:43、42和38的氨基酸序列；
(i)所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别包含SEQ ID NO:26、25和29的氨基酸序列，并且所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别包含SEQ ID NO:43、42和38的氨基酸序列；
(j)所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别包含SEQ ID NO:24、25和29的氨基酸序列，并且所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别包含SEQ ID NO:40、42和38的氨基酸序列；
(k)所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别包含SEQ ID NO:26、25和27的氨基酸序列，并且所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别包含SEQ ID NO:43、42和38的氨基酸序列；
(l)所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别包含SEQ ID NO:26、25和27的氨基酸序列，并且所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别包含SEQ ID NO:44、42和38的氨基酸序列；
(m)所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别包含SEQ ID NO:26、25和27的氨基酸序列，并且所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别包含SEQ ID NO:45、42和38的氨基酸序列；或者
(n)所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别包含SEQ ID NO:103、17和104的氨基酸序列，并且所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别包含SEQ ID NO:105、106和38的氨基酸序列。
55.根据权利要求53所述的免疫缀合物，其中所述抗体或抗原结合片段包含：
(a)轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含表3中列出的抗体D001、D002、D029、D029LV1、D029LV2、D029LV3、D029LV4、D029LV5、D003、D047、D049或B10中任一种的VL；和/或
(b)重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含表4中列出的抗体D001、D002、D029、D029LV1、D029LV2、D029LV3、D029LV4、D029LV5、D003、D047、D049或B10中任一种的VH。
56.根据权利要求53所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含VL，所述VL包含SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ IDNO:78或SEQ ID NO:101的氨基酸序列。
57.根据权利要求54所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含VH，所述VH包含SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ IDNO:89、SEQ ID NO:90或SEQ ID NO:102的氨基酸序列。
58.根据权利要求54所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含以下：
(a)包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列的VL；和
包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的VH；
(b)包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的VL；和
包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列的VH；
(c)包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的VL；和
包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的VH；
(d)包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的VL；和
包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列的VH；
(e)包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的VL；和
包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列的VH；
(f)包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的VL；和
包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列的VH；
(g)包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的VL；和
包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的VH；
(h)包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VL；和
包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的VH；
(i)包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的VL；和
包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的VH；
(j)包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的VL；和
包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的VH；
(k)包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的VL；和
包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列的VH；
(l)包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的VL；和
包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列的VH；
(m)包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的VL；和
包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列的VH；或
(n)包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列的VL；和
包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列的VH。
59.根据权利要求1至58中任一项所述的免疫缀合物，其中所述锚定部分包含与成纤维细胞活化蛋白(FAP)结合的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含
(a)轻链可变区(VH)，所述轻链可变区(VH)包含表5中列出的抗体872-5、872-59、872-70或872-5V1中任一种的VL互补决定区1(CDR1)、VL CDR2和VL CDR3；和/或
(b)重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含表6中列出的抗体872-5、872-59、872-70、872-5V1或VHH6中任一种的VH互补决定区1(CDR1)、VH CDR2和VH CDR3。
60.根据权利要求59所述的抗体或抗原结合片段，其中
(a)所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别包含SEQ ID NO:30、17和54的氨基酸序列，并且所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别包含SEQ ID NO:58、59和60的氨基酸序列；
(b)所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别包含SEQ ID NO:30、17和55的氨基酸序列，并且所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别包含SEQ ID NO:61、62和48的氨基酸序列；
(c)所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别包含SEQ ID NO:30、17和56的氨基酸序列，并且所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别包含SEQ ID NO:36、63和38的氨基酸序列；
(d)所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别包含SEQ ID NO:30、17和57的氨基酸序列，并且所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别包含SEQ ID NO:58、64和51的氨基酸序列；或
(e)所述抗体是包含所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的VHH，所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别包含SEQ ID NO:65、66和67的氨基酸序列。
61.根据权利要求59所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含：
(a)轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含表7中列出的抗体872-5、872-59、872-70或872-5V1中任一种的VL；和/或
(b)重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含表8中列出的抗体872-5、872-59、872-70、872-5V1或VHH6中任一种的VH。
62.根据权利要求59所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93或SEQ ID NO:94的氨基酸序列的VL。
63.根据权利要求59所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98或SEQ ID NO:99的氨基酸序列的VH。
64.根据权利要求59所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含以下：
(a)包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列的VL；和
包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列的VH；
(b)包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列的VL；和
包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列的VH；
(c)包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列的VL；和
包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列的VH；
(d)包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列的VL；和
包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列的VH；或
(e)包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列的VHH。
65.一种组合物，包含根据权利要求1至64中任一项所述的免疫缀合物分子和药学上可接受的载体。
66.一种多核苷酸，编码根据权利要求1至64中任一项所述的免疫缀合物分子或其片段。
67.根据权利要求66所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸可操作地连接至启动子。
68.一种载体，包含根据权利要求66或67所述的多核苷酸。
69.一种细胞，包含根据权利要求65至67中任一项所述的多核苷酸。
70.一种细胞，包含根据权利要求68所述的载体。
71.一种分离的细胞，产生根据权利要求1至64中任一项所述的免疫缀合物分子。
72.一种试剂盒，包含根据权利要求1至64中任一项所述的免疫缀合物分子。
73.一种制备免疫缀合物分子的方法，包括培养根据权利要求57至71中任一项所述的细胞以表达所述免疫缀合物分子。
74.一种制备免疫缀合物分子的方法，包括表达根据权利要求66或67所述的多核苷酸。
75.一种用于在靶位点激活细胞因子介导的效应的方法，所述方法包括将包含所述细胞因子和掩蔽部分的免疫缀合物分子递送至所述靶位点；
其中所述掩蔽部分包含二合一抗体或其抗原结合片段，所述二合一抗体或其抗原结合片段通过分子内相互作用与所述细胞因子结合并抑制所述细胞因子介导的效应；
其中所述二合一抗体或抗原结合片段能够与所述靶位点中的第一靶抗原结合；
其中当所述免疫缀合物分子在所述靶位点处时，所述二合一抗体与所述第一靶抗原结合并从所述细胞因子解离；并且
其中所述细胞因子介导的效应在所述靶位点处被激活。
76.根据权利要求75所述的方法，其中所述免疫缀合物分子还包括锚定部分；其中所述锚定部分包含能够与所述靶位点中的第二靶抗原结合的抗体或其抗原结合片段。
77.根据权利要求75所述的方法，其中当所述免疫缀合物分子在所述靶位点处时，所述锚定部分的所述抗体或抗原结合片段与所述第二靶抗原结合；并且其中所述免疫缀合物分子固定在所述靶位点处。
78.根据权利要求75至77中任一项所述的方法，其中将所述免疫缀合物分子递送至所述靶位点包括将所述免疫缀合物分子施用至受试者。
79.根据权利要求78所述的方法，其中在将所述免疫缀合物分子施用至受试者后，非靶位点处的所述细胞因子活性与所述靶位点处的所述细胞因子活性相比低至少约10％、20％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％。
80.一种用于在靶位点处富集细胞因子的方法，所述方法包括将包含所述细胞因子和锚定部分的免疫缀合物分子递送至所述靶位点；
其中所述锚定部分包含能够与所述靶位点中的第二靶抗原结合的抗体或其抗原结合片段；
其中当所述免疫缀合物分子在所述靶位点处时，所述锚定部分与所述第二靶抗原结合；并且
其中与非靶位点相比，所述细胞因子以更高的浓度分布在所述靶位点。
81.根据权利要求80所述的方法，其中将所述免疫缀合物分子递送至所述靶位点包括将所述免疫缀合物分子施用至受试者。
82.根据权利要求81所述的方法，其中在将所述免疫缀合物分子施用至受试者后，非靶位点处的细胞因子浓度与所述靶位点处的细胞因子活性相比低至少约10％、20％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％。
83.根据权利要求78、79、81或82所述的方法，其中与所述受试者中的所述细胞因子相关的毒性或副作用减少。
84.根据权利要求83所述的方法，其中细胞因子毒性或副作用与施用至受试者等量的呈未缀合形式的所述细胞因子相比减少至少约10％、20％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％。
85.根据权利要求83或84所述的方法，其中毒性或副作用的减少被测量为施用的受试者的寿命的延长。
86.根据权利要求83或84所述的方法，其中与所述细胞因子相关的毒性或副作用的减少被测量为施用的受试者的体重减轻的减少。
87.根据权利要求83或84所述的方法，其中与所述细胞因子相关的毒性或副作用的减少被测量为施用的受试者中免疫应答水平的变化。
88.根据权利要求83或84所述的方法，其中与所述细胞因子相关的毒性或副作用的减少被测量为施用的受试者中炎性应答的变化。
89.根据权利要求88所述的方法，其中所述免疫缀合物分子还包含掩蔽部分；
其中所述掩蔽部分包含二合一抗体或其抗原结合片段，所述二合一抗体或其抗原结合片段通过分子内相互作用与所述细胞因子结合并抑制细胞因子介导的效应；
其中所述二合一抗体或抗原结合片段能够与所述靶位点中的第一靶抗原结合；
其中当所述免疫缀合物分子在所述靶位点处时，所述二合一抗体与所述第一靶抗原结合并从所述细胞因子解离；并且
其中所述细胞因子介导的效应在所述靶位点处被激活。
90.根据权利要求76、77或89所述的方法，其中所述第一抗原和第二抗原是相同的抗原或不同的抗原。
91.根据权利要求75至90中任一项所述的方法，其中所述靶位点是肿瘤微环境。
92.根据权利要求75至90中任一项所述的方法，其中所述靶位点是癌性细胞。
93.根据权利要求91或92所述的方法，其中所述第一抗原和/或所述第二抗原在癌细胞的表面上表达。
94.根据权利要求91所述的方法，其中所述第一抗原和/或所述第二抗原由所述肿瘤微环境中的细胞表达。
95.根据权利要求94所述的方法，其中所述第一抗原和/或所述第二抗原是纤维化活化蛋白(FAP)。
96.根据权利要求75至95中任一项所述的方法，其中所述免疫缀合物分子还包含被配置为用于可操作地连接所述细胞因子多肽、所述掩蔽部分和所述锚定部分中的两个或更多个的缀合部分。
97.根据权利要求96所述的方法，其中所述缀合部分是免疫球蛋白Fc结构域，所述免疫球蛋白Fc结构域包含第一亚基和第二亚基，它们是两条不相同的多肽链；并且其中所述Fc结构域包含促进所述两条不相同的多肽链的异二聚化的第一修饰。
98.根据权利要求97所述的方法，其中所述免疫球蛋白结构域包含第二修饰，其中所述Fc结构域与没有所述第二修饰的天然Fc结构域相比具有降低的与Fc受体的结合亲和力。
99.根据权利要求75至98中任一项所述的方法，其中所述免疫缀合物分子是根据权利要求1至64中任一项所述的免疫缀合物分子。
100.一种二合一抗体或其抗原结合片段，所述二合一抗体或其抗原结合片段与成纤维细胞活化蛋白(FAP)和白细胞介素-2(IL-2)结合，其中所述抗体或抗原结合片段包含
(a)轻链可变区(VH)，所述轻链可变区(VH)包含表1中列出的抗体D001、D002、D029、D029LV1、D029LV2、D029LV3、D029LV4、D029LV5、D003、D047、D049或B10中任一种的VL互补决定区1(CDR1)、VL CDR2和VL CDR3；和/或
(b)重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含表2中列出的抗体D001、D002、D029、D029HV1、D029HV2、D029HV3、D029HV4、D029HV5、D029HV6、D003、D047、D049或B10中任一种的VH互补决定区1(CDR1)、VH CDR2和VH CDR3。
101.根据权利要求100所述的抗体或抗原结合片段，其中
(a)所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别包含SEQ ID NO:16、17和18的氨基酸序列，并且所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别包含SEQ ID NO:36、37和38的氨基酸序列；
(b)所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别包含SEQ ID NO:19、17和20的氨基酸序列，并且所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别包含SEQ ID NO:36、39和38的氨基酸序列；
(c)所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别包含SEQ ID NO:21、22和23的氨基酸序列，并且所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别包含SEQ ID NO:40、41和38的氨基酸序列；
(d)所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别包含SEQ ID NO:30、17和31的氨基酸序列，并且所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别包含SEQ ID NO:46、47和48的氨基酸序列；
(e)所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别包含SEQ ID NO:32、17和33的氨基酸序列，并且所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别包含SEQ ID NO:49、50和51的氨基酸序列；
(f)所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别包含SEQ ID NO:34、17和35的氨基酸序列，并且所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别包含SEQ ID NO:52、53和51的氨基酸序列；
(g)所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别包含SEQ ID NO:24、25和23的氨基酸序列，并且所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别包含SEQ ID NO:40、42和38的氨基酸序列；
(h)所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别包含SEQ ID NO:26、25和28的氨基酸序列，并且所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别包含SEQ ID NO:43、42和38的氨基酸序列；
(i)所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别包含SEQ ID NO:26、25和29的氨基酸序列，并且所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别包含SEQ ID NO:43、42和38的氨基酸序列；
(j)所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别包含SEQ ID NO:24、25和29的氨基酸序列，并且所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别包含SEQ ID NO:40、42和38的氨基酸序列；
(k)所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别包含SEQ ID NO:26、25和27的氨基酸序列，并且所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别包含SEQ ID NO:43、42和38的氨基酸序列；
(l)所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别包含SEQ ID NO:26、25和27的氨基酸序列，并且所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别包含SEQ ID NO:44、42和38的氨基酸序列；
(m)所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别包含SEQ ID NO:26、25和27的氨基酸序列，并且所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别包含SEQ ID NO:45、42和38的氨基酸序列；或者
(n)所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别包含SEQ ID NO:103、17和104的氨基酸序列，并且所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别包含SEQ ID NO:105、106和38的氨基酸序列。
102.根据权利要求100所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含：
(a)轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含表3中列出的抗体D001、D002、D029、D029LV1、D029LV2、D029LV3、D029LV4、D029LV5、D003、D047、D049或B10中任一种的VL；和/或
(b)重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含表4中列出的抗体D001、D002、D029、D029LV1、D029LV2、D029LV3、D029LV4、D029LV5、D003、D047、D049或B10中任一种的VH。
103.根据权利要求100所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含VL，所述VL包含SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ IDNO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ IDNO:78或SEQ ID NO:101的氨基酸序列。
104.根据权利要求100所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含VH，所述VH包含SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ IDNO:83、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ IDNO:89、SEQ ID NO:90或SEQ ID NO:102的氨基酸序列。
105.根据权利要求100所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含以下：
(a)包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列的VL；和
包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的VH；
(b)包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的VL；和
包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列的VH；
(c)包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的VL；和
包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的VH；
(d)包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的VL；和
包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列的VH；
(e)包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的VL；和
包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列的VH；
(f)包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的VL；和
包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列的VH；
(g)包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的VL；和
包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的VH；
(h)包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VL；和
包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的VH；
(i)包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的VL；和
包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的VH；
(j)包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的VL；和
包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的VH；
(k)包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的VL；和
包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列的VH；
(l)包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的VL；和
包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列的VH；
(m)包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的VL；和
包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列的VH；或
(n)包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列的VL；和
包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列的VH。
106.一种免疫缀合物分子，包含根据权利要求100至105中任一项所述的二合一抗体或抗原结合片段和IL-2多肽。
107.根据权利要求106所述的免疫缀合物分子，其中所述IL-2多肽是野生型或突变型IL-2。
108.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与成纤维细胞活化蛋白(FAP)结合，其中所述抗体或抗原结合片段包含
(a)轻链可变区(VH)，所述轻链可变区(VH)包含表5中列出的抗体872-5、872-59、872-70或872-5V1中任一种的VL互补决定区1(CDR1)、VL CDR2和VL CDR3；和/或
(b)重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含表6中列出的抗体872-5、872-59、872-70、872-5V1或VHH6中任一种的VH互补决定区1(CDR1)、VH CDR2和VH CDR3。
109.根据权利要求108所述的抗体或抗原结合片段，其中
(a)所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别包含SEQ ID NO:30、17和54的氨基酸序列，并且所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别包含SEQ ID NO:58、59和60的氨基酸序列；
(b)所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别包含SEQ ID NO:30、17和55的氨基酸序列，并且所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别包含SEQ ID NO:61、62和48的氨基酸序列；
(c)所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别包含SEQ ID NO:30、17和56的氨基酸序列，并且所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别包含SEQ ID NO:36、63和38的氨基酸序列；
(d)所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别包含SEQ ID NO:30、17和57的氨基酸序列，并且所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别包含SEQ ID NO:58、64和51的氨基酸序列；或
(e)所述抗体是包含所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的VHH，所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别包含SEQ ID NO:65、66和67的氨基酸序列。
110.根据权利要求108所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含：
(a)轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含表7中列出的抗体872-5、872-59、872-70或872-5V1中任一种的VL；和/或
(b)重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含表8中列出的抗体872-5、872-59、872-70、872-5V1或VHH6中任一种的VH。
111.根据权利要求108所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93或SEQ ID NO:94的氨基酸序列的VL。
112.根据权利要求108所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98或SEQ ID NO:99的氨基酸序列的VH。
113.根据权利要求108所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含以下：
(a)包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列的VL；和
包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列的VH；
(b)包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列的VL；和
包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列的VH；
(c)包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列的VL；和
包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列的VH；
(d)包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列的VL；和
包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列的VH；或
(e)包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列的VHH。
114.一种免疫缀合物分子，包含根据权利要求108至113中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述免疫缀合物分子还包含IL-2多肽。
115.根据权利要求114所述的免疫缀合物分子，其中所述IL-2多肽是野生型或突变型IL-2。
116.一种免疫缀合物分子，包含与掩蔽部分缀合的IL-2多肽，
其中所述掩蔽部分包含能够与所述IL-2多肽和第一靶抗原结合的二合一抗体或其抗原结合片段；
其中当与所述IL-2多肽结合时，所述掩蔽部分阻断所述IL-2多肽与第一IL-2受体(IL-2R)亚基的结合；并且
其中当与所述第一靶抗原结合时，所述掩蔽部分从所述IL-2多肽解离，从而释放所述IL-2多肽用于与所述第一IL-2R亚基结合。
117.根据权利要求116所述的免疫缀合物分子，其中所述IL-2多肽包含一个或更多个突变，所述一个或更多个突变减弱所述IL-2多肽与第二IL-2R亚基的结合。
118.根据权利要求116或117所述的免疫缀合物分子，其中所述第一IL-2R亚基是IL-2Rα链(IL-2Rα)，并且所述第二IL-2R亚基是IL-2Rβ链(IL-2Rβ)。
119.根据权利要求118所述的免疫缀合物分子，其中与野生型IL-2相比，所述IL-2多肽与所述第二IL-2R亚基的结合减少约10％、约20％、约30％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％。
120.根据权利要求118或119所述的免疫缀合物分子，其中减弱所述IL-2多肽与IL-2Rβ的结合的所述一个或更多个突变选自D20T、D20G、D20A、H16E、H16R、H16A、N88D、N88S、N88R、V91G、V91A、V91R和V91S或其组合。
121.根据权利要求118至120中任一项所述的免疫缀合物分子，其中所述掩蔽部分与IL-2的表位结合，所述IL-2的表位包含IL-2的残基P34、K35、R38、T41、F42、K43、F44、Y45、E61、E62、K64、P65、E68、V69、N71、L72、Q74、Y107和D109中的一个或更多个。
122.根据权利要求118至120中任一项所述的免疫缀合物分子，其中所述掩蔽部分
(a)与由抗体识别的IL-2的表位结合，所述抗体包含具有SEQ ID NO:101的氨基酸序列的轻链可变区和具有SEQ ID NO:102的氨基酸序列的重链可变区；
(b)与包含具有SEQ ID NO:101的氨基酸序列的轻链可变区和具有SEQ ID NO:102的氨基酸序列的重链可变区的抗体竞争结合IL-2。
123.根据权利要求118至120中任一项所述的免疫缀合物分子，其中所述掩蔽部分包含
(a)轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含表1中列出的抗体B10的VL互补决定区1(CDR1)、VL CDR2和VL CDR3；和/或
(b)重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含表2中列出的抗体B10的VH互补决定区1(CDR1)、VH CDR2和VH CDR3。
124.根据权利要求123所述的免疫缀合物分子，其中所述掩蔽部分包括
(a)分别包含SEQ ID NO:103、17和104的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，以及
(b)分别包含SEQ ID NO:105、106和38的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。
125.根据权利要求123所述的免疫缀合物分子，其中所述掩蔽部分包括：
(a)包含表3中列出的抗体B10的VL的轻链可变区(VL)；和/或
(b)包含表4中列出的抗体B10的VH的重链可变区(VH)。
126.根据权利要求123所述的免疫缀合物分子，其中所述掩蔽部分包括包含SEQ IDNO:101的氨基酸序列的VL。
127.根据权利要求123所述的免疫缀合物分子，其中所述掩蔽部分包括包含SEQ IDNO:102的氨基酸序列的VH。
128.根据权利要求123所述的免疫缀合物分子，其中所述掩蔽部分包括
(a)包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列的VL；和
(b)包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列的VH。
129.根据权利要求116或117所述的免疫缀合物分子，其中所述第一IL-2R亚基是IL-2Rβ，并且所述第二IL-2R亚基是IL-2Rα。
130.根据权利要求129所述的免疫缀合物分子，其中与野生型IL-2相比，所述IL-2多肽与所述IL-2Rα的结合减少约10％、约20％、约30％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％。
131.根据权利要求129或130所述的免疫缀合物分子，其中减弱所述IL-2多肽与IL-2Rα的结合的所述一个或更多个突变选自K35E、R38A、R38E、R38D、F42A、F42K、K43E、Y45A、E61R、E62A、L72G或其组合；
任选地其中减弱所述IL-2多肽与IL-2Rα的结合的所述一个或更多个突变是
(a)F42A；或
(b)K35E和F42A。
132.根据权利要求129至131中任一项所述的免疫缀合物分子，其中所述掩蔽部分与包含IL-2的残基L12、Q13、E15、H16、L19、D20、M23、R81、D84、D87、N88、V91、I92和E95中的一个或更多个的IL-2的表位结合。
133.根据权利要求129至131中任一项所述的免疫缀合物分子，其中所述掩蔽部分
(a)与由抗体5UTZ识别的IL-2的表位结合；或
(b)与抗体5UTZ竞争结合IL-2。
134.根据权利要求116至133中任一项所述的免疫缀合物分子，其中所述IL-2多肽还包含修饰所述IL-2多肽与IL-2Rγ链(IL-2Rγ)的结合的一个或更多个突变，其中任选地修饰所述IL-2多肽与IL-2Rγ的结合的所述一个或更多个突变选自L18R、Q22E、T123A、Q126T、I129V、S130A、S130R或其组合。
135.根据权利要求116至134中任一项所述的免疫缀合物分子，还包含锚定部分，其中所述锚定部分包含与第二靶抗原特异性结合的抗体或其抗原结合片段。
136.根据权利要求116至135中任一项所述的免疫缀合物分子，其中在存在第一细胞的表面上表达的第一靶抗原的情况下，所述掩蔽部分从所述IL-2多肽解离。
137.根据权利要求136所述的免疫缀合物分子，其中所述第二靶抗原在所述第一细胞或靠近所述第一细胞的第二细胞的表面上表达。
138.根据权利要求137所述的免疫缀合物分子，其中所述第一靶抗原和所述第二靶抗原是相同的或不同的。
139.根据权利要求116至138中任一项所述的免疫缀合物分子，其中所述第一靶抗原和/或所述第二靶抗原是肿瘤相关抗原。
140.根据权利要求116至139中任一项所述的免疫缀合物分子，其中所述第一靶抗原和所述第二靶抗原各自独立地选自FAP、Her2、Her3、CD19、CD20、BCMA、PSMA、CEA、cMET、EGFR、CA-125、MUC-1、EpCAM或Trop-2。
141.根据权利要求140所述的免疫缀合物分子，其中所述第一靶抗原是FAP。
142.一种用于激活IL-2R的方法，包括使所述IL-2R与有效量的根据权利要求116至141中任一项所述的免疫缀合物分子接触。
143.根据权利要求142所述的方法，其中所述IL-2R包括IL-2Rβ。
144.根据权利要求142或143所述的方法，其中所述IL-2R包括IL-2Rα。
145.根据权利要求142至144中任一项所述的方法，其中所述IL-2R包括IL-2Rγ。
146.根据权利要求142所述的方法，其中所述IL-2R包括所述IL-2Rβ，并且其中所述IL-2Rβ在第一细胞的表面上表达。
147.根据权利要求146所述的方法，其中所述IL-2R还包括所述IL-2Rγ，并且其中所述IL-2Rγ在所述第一细胞的表面上表达。
148.根据权利要求146或147所述的方法，其中所述IL-2R还包括所述IL-2Rα；
任选地其中所述IL-2Rα在细胞表面上缔合；任选地其中所述IL-2Rα在所述第一细胞的表面上缔合(顺式呈递)；或者任选地，其中所述IL-2Rα在第二细胞的表面上缔合(反式呈递)；
任选地其中所述IL-2Rα不在细胞表面上缔合。
149.根据权利要求146或147所述的方法，其中所述IL-2R不包括所述IL-2Rα。
150.根据权利要求146至149中任一项所述的方法，其中所述第一细胞和/或所述第二细胞是免疫细胞，并且其中在激活所述IL-2R时，所述免疫细胞被激活。
151.根据权利要求150所述的方法，其中所述免疫细胞的激活被测量为：
(a)所述免疫细胞的增殖或成熟增加；
任选地，其中所述靶细胞的增殖或成熟增加约10％、约20％、约30％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％、约125％、约150％、约175％、约200％、约250％、约300％、约400％、约500％、约600％、约700％、约800％、约900％或约1000％；或
(b)所述免疫细胞的存活时间延长；
任选地，其中所述靶细胞的存活时间增加约10％、约20％、约30％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％、约125％、约150％、约175％、约200％、约250％、约300％、约400％、约500％、约600％、约700％、约800％、约900％或约1000％。
152.根据权利要求150或151所述的方法，其中所述免疫细胞是效应T细胞、记忆T细胞或其组合。
153.根据权利要求152所述的方法，其中免疫细胞是CD4+T细胞、CD8+T细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、SLEC(短寿命效应细胞)、MPEC(记忆前体效应细胞)、TE(终末效应细胞)、NK(自然杀伤细胞)、NKT(自然杀伤T细胞)、先天淋巴样细胞(I型-III型)或其组合。
154.根据权利要求150或151所述的方法，其中所述免疫细胞是调节性T细胞(Treg)。
155.根据权利要求154所述的方法，其中所述免疫细胞是天然Treg(nTreg)细胞、诱导的Treg(iTreg)细胞或其组合。
156.根据权利要求146至149中任一项所述的方法，其中所述第一细胞和/或所述第二细胞是病变细胞，并且其中在激活所述IL-2R时，所述病变细胞死亡。
157.根据权利要求156所述的方法，其中
(a)所述病变细胞是癌细胞；或
(d)所述病变细胞是被感染性病原体感染的细胞；
任选地，其中所述感染性病原体是病毒、细菌、真菌、寄生虫或其组合。
158.一种激活表达IL-2R的靶细胞的方法，所述方法包括使所述靶细胞与有效量的根据权利要求116至141中任一项所述的免疫缀合物分子接触，其中在所述IL-2多肽与所述IL-2R结合时，所述靶细胞被激活，
任选地，其中所述靶细胞是免疫细胞；
任选地，其中所述靶细胞是效应T细胞、记忆T细胞、调节性T细胞或其组合；
任选地，其中所述靶细胞是CD4+T细胞、CD8+T细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、SLEC(短寿命效应细胞)、MPEC(记忆前体效应细胞)、TE(终末效应细胞)、NK(自然杀伤细胞)、NKT(自然杀伤T细胞)、先天淋巴样细胞(I型-III型)或其组合；
任选地，其中所述靶细胞是天然Treg(nTreg)细胞、诱导的Treg(iTreg)细胞或其组合；
任选地，其中所述靶细胞的激活被测量为：
(a)所述靶细胞的增殖或成熟增加；
任选地，其中所述靶细胞的增殖或成熟增加约10％、约20％、约30％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％、约125％、约150％、约175％、约200％、约250％、约300％、约400％、约500％、约600％、约700％、约800％、约900％或约1000％；或
(b)所述靶细胞的存活时间延长；
任选地，其中所述靶细胞的存活时间增加约10％、约20％、约30％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％、约125％、约150％、约175％、约200％、约250％、约300％、约400％、约500％、约600％、约700％、约800％、约900％或约1000％。
159.根据权利要求158所述的方法，其中所述接触还包括施用药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的载体和根据权利要求116至141中任一项所述的免疫缀合物分子，
任选地，其中所述接触增强抗肿瘤免疫应答；
任选地，其中所述接触增强抗感染免疫应答。
160.一种增强T细胞群体的抗原特异性免疫应答的方法，所述方法包括使所述T细胞群体与有效量的根据权利要求116至141中任一项所述的免疫缀合物分子接触；
任选地，其中所述接触增强抗原特异性效应T细胞的增殖或成熟；
任选地，其中所述接触增强抗原特异性记忆T细胞的形成；
任选地，其中在存在所述抗原的情况下进行所述接触；并且任选地，其中所述抗原是癌症、肿瘤、病原体或过敏原的抗原。
161.一种增加T细胞群体分泌促炎细胞因子的方法，所述方法包括使所述T细胞群体与根据权利要求116至141中任一项所述的免疫缀合物分子接触，其中所述IL-2多肽在结合时激活所述T细胞；
任选地，其中所述细胞因子是IL-1、IL-2、IL-6、IL-12、IL-17、IL-22、IL-23、GM-CSF、TNF-α、IFN-γ或其任何组合；
任选地，其中所述细胞因子的产生增加约10％、约20％、约30％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％、约125％、约150％、约175％、约200％、约250％、约300％、约400％、约500％、约600％、约700％、约800％、约900％或约1000％。
162.一种增加IL-2R在靶细胞的表面上的组装的方法，所述方法包括使所述靶细胞与有效量的根据权利要求116至141中任一项所述的免疫缀合物分子接触，
任选地，其中所述IL-2R包括在所述靶细胞的表面上的IL-2Rα、IL-2Rβ、IL-2Rγ或其组合；
任选地，其中所述IL-2R包括在所述靶细胞的表面上的IL-2Rβ和IL-2Rγ，以及在靠近所述靶细胞的第二细胞的表面上的IL-2Rα；
任选地，其中所述IL-2R包括在所述靶细胞的表面上的IL-2Rβ和IL-2Rγ，以及不与细胞表面缔合的IL-2Rα；
任选地，其中IL-2R在所述靶细胞的表面上的组装增加约10％、约20％、约30％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％、约125％、约150％、约175％、约200％、约250％、约300％、约400％、约500％、约600％、约700％、约800％、约900％或约1000％；
任选地，其中所述靶细胞是免疫细胞；
任选地，其中所述靶细胞是效应T细胞、记忆T细胞、调节性T细胞或其组合；
任选地，其中所述靶细胞是CD4+T细胞、CD8+T细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、SLEC(短寿命效应细胞)、MPEC(记忆前体效应细胞)、TE(终末效应细胞)、NK(自然杀伤细胞)、NKT(自然杀伤T细胞)、先天淋巴样细胞(I型-III型)或其组合；
任选地，其中所述靶细胞是天然Treg(nTreg)细胞、诱导的Treg(iTreg)细胞或其组合。
163.一种在病变细胞的群体周围的组织中形成促炎环境的方法，所述方法包括使所述组织与有效量的根据权利要求116至141中任一项所述的免疫缀合物分子接触；
任选地，其中：
(a)所述组织中活化的B细胞、CD4+效应T细胞、CD8+效应T细胞、树突状细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、单核细胞、粒细胞、嗜酸性粒细胞和/或中性粒细胞的浓度增加；
(b)所述组织中调节性T细胞的浓度降低；
(c)所述组织中促炎细胞因子的浓度增加；
任选地，其中所述促炎细胞因子是IL-1、IL-2、IL-6、IL-12、IL-17、IL-22、IL-23、GM-CSF、TNF-α、IFN-γ或其任何组合；
(d)与源自或衍生自所述病变细胞的抗原结合的抗体的浓度在所述组织中增加；
(e)抗原呈递细胞对源自或衍生自所述病变细胞的抗原的呈递在所述组织中增加；
(f)所述病变细胞的吞噬作用在所述组织中增加；
(g)由细胞介导的细胞毒性诱导的所述病变细胞的凋亡在所述组织中增加；
(h)由抗体依赖性细胞毒性诱导的所述病变细胞的凋亡在所述组织中增加；和/或
(i)所述病变细胞的群体在所述组织中减少；
任选地，其中所述病变细胞的群体在所述组织中减少约10％、约20％、约30％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％。
164.一种消除受试者中的病变细胞的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求116至141中任一项所述的免疫缀合物分子；
任选地，其中：
(a)所述病变细胞是癌细胞；或
(d)所述病变细胞是被感染性病原体感染的细胞；
任选地，其中所述感染性病原体是病毒、细菌、真菌、寄生虫或其组合。
165.一种治疗有相应需要的受试者中的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求116至141中任一项所述的免疫缀合物分子；
任选地，其中
(a)所述治疗增强先天的、体液的或细胞介导的抗肿瘤免疫应答；和/或
(b)所述方法还包括第二疗法的共施用。
166.一种治疗有相应需要的受试者中的感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求116至141中任一项所述的免疫缀合物分子；
任选地，其中：
(a)所述治疗增强先天的、体液的或细胞介导的抗感染免疫应答；
(b)所述受试者被共施用疫苗组合物，用于预防所述受试者中的所述感染；
任选地，其中所述疫苗组合物同时或顺序共施用。
167.一种增加有相应需要的受试者中对抗原的应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求116至141中任一项所述的免疫缀合物分子；
任选地，其中所述抗原是癌症、肿瘤、病原体或过敏原的抗原，
任选地，其中所述抗原源自或衍生自
(a)感染性病原体；
任选地，其中所述感染性病原体是病毒、细菌、真菌、寄生虫或其组合；
(b)病变细胞；
(c)被感染性病原体感染的细胞；
任选地，其中所述感染性病原体是病毒、细菌、真菌、寄生虫或其组合；或
(d)癌细胞。
168.一种增加有相应需要的受试者中对疫苗的应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用所述疫苗和有效量的根据权利要求116至141中任一项所述的免疫缀合物分子；
任选地，其中所述疫苗是针对肿瘤、癌症、病原体或过敏原的疫苗；
任选地，其中所述免疫缀合物分子被配制成用于所述疫苗的佐剂组合物。
169.一种在抗原周围的组织中建立所述抗原的免疫耐受性的方法，所述方法包括使所述组织与有效量的根据权利要求116至141中任一项所述的免疫缀合物分子接触；
任选地，其中：
(a)所述组织中活化的B细胞、CD4+效应T细胞、CD8+效应T细胞、树突状细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、单核细胞、粒细胞、嗜酸性粒细胞和/或中性粒细胞的浓度降低；
(b)所述组织中调节性T细胞的浓度增加；
(c)所述组织中促炎细胞因子的浓度降低；
任选地，其中所述促炎细胞因子是IL-1、IL-2、IL-6、IL-12、IL-17、IL-22、IL-23、GM-CSF、TNF-α、IFN-γ或其任何组合；
(d)与所述抗原结合的抗体的浓度在所述组织中降低；
(e)抗原呈递细胞对所述抗原的呈递在所述组织中减少；
(f)表达所述抗原的细胞的吞噬作用在所述组织中减少；和/或
(g)表达所述抗原的细胞的凋亡在所述组织中减少。
170.根据权利要求169所述的方法，其中所述组织在受试者中，并且其中所述抗原是所述受试者的自身抗原；任选地，其中所述受试者患有自身免疫性疾病。
171.一种用于治疗有相应需要的受试者中的自身免疫性疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求116至141中任一项所述的免疫缀合物分子；
任选地，其中
(a)所述治疗减少对自身抗原的先天的、体液的或细胞介导的免疫应答；和/或
(b)所述方法还包括第二疗法的共施用。
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