KR20240075802A - 면역접합체 분자 및 관련 방법 및 이의 조성물 - Google Patents

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KR20240075802A
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취페이 리
루카스 베일리
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Abstract

면역접합체 분자는 적합한 조건 하에서 IL-2 활성을 저해하고 활성화시킬 수 있는 차폐 모이어티와 인터류킨-2(IL-2) 폴리펩타이드를 함유한다. 또한, 상기 면역접합체 분자를 제조하는 방법을 제공한다. 마지막으로, 암 및 다른 만성 감염성 질환과 같은 질환을 치료하기 위한, 면역계에 대한 조절 효과로 인한 면역접합체 분자의 치료적 용도를 제공한다.

Description

면역접합체 분자 및 관련 방법 및 이의 조성물
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2021년 6월 17일자 출원된 PCT/CN2021/100705에 대한 우선권을 주장하며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다.
전자문서로 제출된 서열목록에 대한 참조
본 출원은 2022년 5월 10일자에 90,098 바이트 크기로 생성되어 ASCII 형식의 서열목록으로 전자문서로 제출된 파일명 "14625-006-228_SEQLIST.txt"의 서열목록을 포함한다. 전자문서로 제출된 서열목록은 본 명세서의 일부이며, 그 전체가 본원에 참조로 인용된다.
기술분야
본 개시내용은 일반적으로 인터류킨-2(IL-2) 함유 면역접합체 분자에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시내용은 면역계를 조절하는 능력으로 인해 면역치료제로서 사용하는 데 있어 개선된 특성을 나타내는 면역접합체 분자에 관한 것이다. 본 개시내용은 나아가 암 및 다른 만성 감염성 질환과 같은 질환을 치료하기 위한 면역접합체 분자의 치료적 용도 및 약학적 조성물에 관한 것이다.
T세포 성장인자(TCGF)로도 알려진 인터류킨-2(IL-2)는 림프구 생성, 생존 및 항상성에 있어서 중심 역할을 하는 15.5 kDa의 구형 당단백질이다. 생체내에서 림프구 집단을 확장시키고 이러한 세포의 이펙터 기능을 증가시키는 IL-2의 능력은 IL-2에 항종양 효과를 부여하여, IL-2 면역요법을 특정 전이성 암에 대한 매력적인 치료 옵션으로 만든다. 결과적으로, 고용량 IL-2 치료는 전이성 신세포 암종 및 악성 흑색종 환자에 사용하도록 승인되었다. 하지만, IL-2는 이펙터 세포의 확장 및 활성을 매개할 뿐 아니라, 말초 면역 관용을 유지하는 데 결정적으로 관여하는 면역 반응에서 이중 기능을 가지고 있기 때문에, 가용성 IL-2는 종양 성장을 저해하는 데 최적이 아니다. IL-2 면역요법과 관련된 추가의 우려사항은 재조합 인간 IL-2 치료에 의해 생기는 부작용이다. 예를 들어, 고용량 IL-2 치료를 받는 환자는 중증 심혈관, 폐, 신장, 간, 위장관, 신경, 피부, 혈액 및 전신 유해사례를 흔히 경험하기 때문에, 집중적인 모니터링과 입원 환자 관리가 필요하다. 따라서, IL-2 단백질의 치료적 유용성을 추가로 증강시켜야 하는 필요성이 당업계에 여전히 남아있다. 본 개시내용은 이러한 요구를 충족시킨다.
본 개시내용은 사이토카인 폴리펩타이드를 포함하는 면역접합체 분자를 제공한다. 본 개시내용은 또한, 특정 실시형태에서, 이러한 면역접합체 분자를 인코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및 벡터와, 이러한 면역접합체 분자를 포함하는 조성물, 시약 및 키트를 제공한다. 관련 양태에서, 본 개시내용에 따른 면역접합체 분자의 사용을 통해 표적 부위에 사이토카인 활성을 전달 및/또는 활성화시키는 방법, 또는 대상에서 사이토카인 활성에 대한 전신 노출과 관련된 독성 및/또는 다른 부작용을 감소시키는 방법이 또한 본원에 제공된다.
본 개시내용은 또한, 특정 실시형태에서, 본 개시내용의 이러한 면역접합체 분자의 일부를 형성할 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 같은 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 제공한다. 특정 실시형태에서, 섬유증 활성화 단백질(FAP: fibrosis activation protein)에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 포함하는 결합 단백질이 본원에 제공된다. 특정 실시형태에서, FAP과 인터류킨-2(IL-2) 둘 모두에 결합하는 투인원(two-in-one) 항체 또는 이의 단편을 포함하는 이중특이적 결합 단백질이 본원에 제공된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 면역접합체 분자는 사이토카인 활성을 갖는 사이토카인 폴리펩타이드를 포함하는 사이토카인 모이어티와, 차폐 모이어티(masking moiety)를 포함한다. 이러한 차폐 모이어티는 사이토카인 폴리펩타이드와 제1 표적 항원에 결합할 수 있는 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 사이토카인 폴리펩타이드에 결합하는 경우, 차폐 모이어티는 사이토카인 활성을 감소시키거나 저해하고, 제2 표적 항원에 결합하는 경우, 차폐 모이어티는 사이토카인 폴리펩타이드에서 해리되어 사이토카인 활성을 활성화시킨다.
일부 실시형태에서, 차폐 모이어티는 온전한 항체, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, dsFv, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 또는 항체 단편으로부터 형성된 VHH를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이중특이적 항체는 투인원 항체이다.
일부 실시형태에서, 제1 표적 항원은 사이토카인 폴리펩타이드가 아니다. 일부 실시형태에서, 제1 표적 항원은 세포 표면에서 발현된다. 일부 실시형태에서, 세포는 암 세포 또는 종양 미세환경 내 세포이다. 일부 실시형태에서, 제1 표적 항원은 가용성이다. 일부 실시형태에서, 제1 표적 항원은 종양 관련 항원이다. 일부 실시형태에서, 제1 표적 항원은 섬유증 활성화 단백질(FAP)이다.
일부 실시형태에서, 사이토카인 모이어티는 야생형 또는 돌연변이형 인터류킨-2(IL-2)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 모이어티는 인간 IL-2 또는 돌연변이형 인간 IL-2를 포함한다.
일부 실시형태에서, 면역접합체 분자는 제2 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 고정 모이어티(anchoring moiety)를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 표적 항원은 세포 표면에서 발현된다. 일부 실시형태에서, 세포는 암 세포 또는 종양 미세환경 내 세포이다. 일부 실시형태에서, 제2 표적 항원은 가용성이다. 일부 실시형태에서, 제2 표적 항원은 종양 관련 항원이다.
일부 실시형태에서, 제1 표적 항원과 제2 표적 항원은 동일하다. 일부 실시형태에서, 이중특이적 차폐 모이어티와 고정 모이어티는 제1 표적 항원 또는 제2 표적 항원의 동일한 에피토프에 결합한다. 일부 실시형태에서, 이중특이적 차폐 모이어티와 고정 모이어티는 제1 표적 항원 또는 제2 표적 항원의 상이한 에피토프에 결합한다. 일부 실시형태에서, 제1 표적 항원과 제2 표적 항원은 상이하다. 일부 실시형태에서, 제2 표적 항원은 섬유증 활성화 단백질(fibrosis activation protein, FAP)이다.
일부 실시형태에서, 고정 모이어티는 온전한 항체, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, dsFv, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 또는 항체 단편으로부터 형성된 VHH를 포함한다. 특정 실시형태에서, 차폐 모이어티의 이중특이적 항체 또는 항원 결합 단편은 Fab, ScFv 또는 VHH이다. 특정 실시형태에서, 고정 모이어티의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Fab, ScFv 또는 VHH이다.
일부 실시형태에서, 면역접합체 분자는 접합 모이어티(conjugating moiety)를 추가로 포함하며, 여기서 접합 모이어티는 면역접합체 분자의 사이토카인 모이어티, 차폐 모이어티 및 고정 모이어티 중 둘 이상을 작동 가능하게 연결한다.
일부 실시형태에서, 접합 모이어티는 면역글로불린 Fc 도메인 또는 이의 돌연변이체를 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인은 2개의 동일하지 않은 폴리펩타이드 사슬인 제1 서브유닛과 제2 서브유닛을 포함하고, Fc 도메인은 2개의 동일하지 않은 폴리펩타이드 사슬의 이종이량체화를 촉진하는 제1 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 변형은 제1 서브유닛의 놉(knob) 변형과 제2 서브유닛의 홀(hole) 변형을 포함하는 놉인투홀(knob-into-hole) 변형이다.
일부 실시형태에서, Fc 도메인은 제2 변형을 포함하며, 여기서 Fc 도메인은 상기 제2 변형이 없는 천연 Fc 도메인과 비교하여 Fc 수용체에 대한 결합 친화도가 감소되어 있다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인은 상기 제2 변형이 없는 천연 Fc 도메인과 비교하여 Fcγ 수용체에 대한 결합 친화도가 감소되어 있다. 일부 실시형태에서, Fcγ 수용체는 FcγRIIIα, FcγRI 또는 FcγRIIα 수용체이다.
일부 실시형태에서, Fc 도메인은 상기 제2 변형이 없는 천연 Fc 도메인과 비교하여 보체 구성요소에 대한 결합 친화도가 감소되어 있다. 일부 실시형태에서, 보체 구성요소는 C1q이다.
일부 실시형태에서, Fc 도메인은 상기 제2 변형이 없는 Fc 도메인과 비교하여 Fc 이펙터 기능이 감소되어 있다. 일부 실시형태에서, 감소된 Fc 이펙터 기능은 보체 의존성 세포독성(complement dependent cytotoxicity, CDC), 항체 의존성 세포 매개 세포독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC), 항체 의존성 세포 포식작용(antibody-dependent cellular phagocytosis, ADCP), 사이토카인 분비, 세포 표면 수용체의 하향조절 및 B세포 활성화에서 선택된다.
일부 실시형태에서, 제2 변형은 S228P, E233P, L234V, L234A, L235A, L235E, ΔG236, D265G, N297A, N297D, P329E, P329S, P329A, P329G, A330S 또는 P331S에서 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 포함하며, 여기서 넘버링은 Kabat에서와 같이 EU 인덱스에 따른다. 일부 실시형태에서, 제2 변형은 E233P, L234V, L234A, L235A, ΔG236, D265G, P327E, A328S, P329E, A330S 또는 P331S에서 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 포함하며, 여기서 넘버링은 Kabat에서와 같이 EU 인덱스에 따른다.
일부 실시형태에서, 사이토카인 모이어티는 Fc 도메인의 제1 서브유닛과 제2 서브유닛 중 하나의 C-말단에 연결되어 있고, 차폐 모이어티는 Fc 도메인의 제1 서브유닛과 제2 서브유닛 중 다른 하나의 C-말단에 연결되어 있다. 일부 실시형태에서, 고정 모이어티는 Fc 도메인의 제1 서브유닛과 제2 서브유닛 중 하나의 N-말단에 연결되어 있다. 일부 실시형태에서, 고정 모이어티와 사이토카인 모이어티는 Fc 도메인의 동일한 서브유닛에 연결되어 있다. 일부 실시형태에서, 고정 모이어티와 차폐 모이어티는 Fc 도메인의 동일한 서브유닛에 연결되어 있다. 일부 실시형태에서, 차폐 모이어티는 Fc 도메인의 제1 서브유닛과 제2 서브유닛 중 하나의 C-말단에 연결되어 있고, 사이토카인 모이어티는 차폐 모이어티에 연결되어 있다. 일부 실시형태에서, 고정 모이어티는 Fc 도메인의 제1 서브유닛과 제2 서브유닛 중 하나의 N-말단에 연결되어 있다. 일부 실시형태에서, 고정 모이어티와 차폐 모이어티는 Fc 도메인의 동일한 서브유닛에 연결되어 있거나, 고정 모이어티와 차폐 모이어티는 Fc 도메인의 상이한 서브유닛에 연결되어 있다. 일부 실시형태에서, 차폐 모이어티는 Fc 도메인의 제1 서브유닛과 제2 서브유닛 중 하나의 N-말단에 연결되어 있고, 사이토카인 모이어티는 차폐 모이어티에 연결되어 있다. 일부 실시형태에서, 차폐 모이어티는 Fc 도메인의 제1 서브유닛과 제2 서브유닛 중 하나의 N-말단에 연결되어 있고, 고정 모이어티는 Fc 도메인의 제1 서브유닛과 제2 서브유닛 중 다른 하나의 N-말단에 연결되어 있다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 모이어티는 차폐 모이어티에 연결되어 있다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 모이어티는 고정 모이어티에 연결되어 있다.
일부 실시형태에서, 차폐 모이어티의 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Fab, ScFv 또는 VHH이다. 일부 실시형태에서, 고정 모이어티의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Fab, ScFv 또는 VHH이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 모이어티, 차폐 모이어티, 고정 모이어티 및 접합 모이어티 중 둘 이상 사이의 연결은 펩타이드 링커를 통해 이루어진다.
일부 실시형태에서, 사이토카인은 IL-2 폴리펩타이드이다. 특정 실시형태에서, 사이토카인 폴리펩타이드는 서열번호 1, 3, 7 내지 15, 및 107 내지 110에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 표적 항원과 제2 표적 항원은 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)이다. 특정 실시형태에서, 제1 표적 항원과 제2 표적 항원은 인간 FAP이다.
특정 실시형태에서, 차폐 모이어티는 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 인터류킨-2(IL-2)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은 (a) 표 1에 제시된 바와 같은 항체 D001, D002, D029, D029LV1, D029LV2, D029LV3, D029LV4, D029LV5, D003, D047, D049 또는 B10 중 어느 하나의 VL 상보성 결정 영역 1(complementarity determining region 1, CDR1), VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(light chain variable region, VL); 및/또는 (b) 표 2에 제시된 바와 같은 항체 D001, D002, D029, D029HV1, D029HV2, D029HV3, D029HV4, D029HV5, D029HV6, D003, D047, D049 또는 B10 중 어느 하나의 VH 상보성 결정 영역 1(CDR1), VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(heavy chain variable region, VH)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 차폐 모이어티는 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 인터류킨-2(IL-2)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은, 각각, 서열번호 16, 17 및 18의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3과, 각각, 서열번호 36, 37 및 38의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 차폐 모이어티는 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 인터류킨-2(IL-2)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은, 각각, 서열번호 19, 17 및 20의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3과, 각각, 서열번호 36, 39 및 38의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 차폐 모이어티는 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 인터류킨-2(IL-2)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은, 각각, 서열번호 21, 22 및 23의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3과, 각각, 서열번호 40, 41 및 38의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 차폐 모이어티는 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 인터류킨-2(IL-2)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은, 각각, 서열번호 30, 17 및 31의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3과, 각각, 서열번호 46, 47 및 48의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 차폐 모이어티는 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 인터류킨-2(IL-2)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은, 각각, 서열번호 32, 17 및 33의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3과, 각각, 서열번호 49, 50 및 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 차폐 모이어티는 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 인터류킨-2(IL-2)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은, 각각, 서열번호 34, 17 및 35의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3과, 각각, 서열번호 52, 53 및 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 차폐 모이어티는 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 인터류킨-2(IL-2)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은, 각각, 서열번호 24, 25 및 23의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3과, 각각, 서열번호 40, 42 및 38의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 차폐 모이어티는 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 인터류킨-2(IL-2)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은, 각각, 서열번호 26, 25 및 28의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3과, 각각, 서열번호 43, 42 및 38의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 차폐 모이어티는 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 인터류킨-2(IL-2)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은, 각각, 서열번호 26, 25 및 29의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3과, 각각, 서열번호 43, 42 및 38의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 차폐 모이어티는 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 인터류킨-2(IL-2)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은, 각각, 서열번호 24, 25 및 29의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3과, 각각, 서열번호 40, 42 및 38의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 차폐 모이어티는 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 인터류킨-2(IL-2)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은, 각각, 서열번호 26, 25 및 27의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3과, 각각, 서열번호 43, 42 및 38의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 차폐 모이어티는 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 인터류킨-2(IL-2)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은, 각각, 서열번호 26, 25 및 27의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3과, 각각, 서열번호 44, 42 및 38의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 차폐 모이어티는 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 인터류킨-2(IL-2)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은, 각각, 서열번호 26, 25 및 27의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3과, 각각, 서열번호 45, 42 및 38의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 차폐 모이어티는 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 인터류킨-2(IL-2)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은, 각각, 서열번호 103, 17 및 104의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3과, 각각, 서열번호 105, 106 및 38의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 차폐 모이어티는 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 인터류킨-2(IL-2)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은 (a) 표 3에 제시된 바와 같은 항체 D001, D002, D029, D029LV1, D029LV2, D029LV3, D029LV4, D029LV5, D003, D047, D049 또는 B10 중 어느 하나의 VL을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 및/또는 (b) 표 4에 제시된 바와 같은 항체 D001, D002, D029, D029LV1, D029LV2, D029LV3, D029LV4, D029LV5, D003, D047, D049 또는 B10 중 어느 하나의 VH를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 차폐 모이어티는 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 인터류킨-2(IL-2)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 68, 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72, 서열번호 73, 서열번호 74, 서열번호 75, 서열번호 76, 서열번호 77, 서열번호 78 또는 서열번호 101의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시형태에서, 차폐 모이어티는 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 인터류킨-2(IL-2)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 79, 서열번호 80, 서열번호 81, 서열번호 82, 서열번호 83, 서열번호 84, 서열번호 85, 서열번호 86, 서열번호 87, 서열번호 88, 서열번호 89, 서열번호 90 또는 서열번호 102의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
일부 실시형태에서, 차폐 모이어티는 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 인터류킨-2(IL-2)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 VL과 서열번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
일부 실시형태에서, 차폐 모이어티는 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 인터류킨-2(IL-2)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 VL과 서열번호 80의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
일부 실시형태에서, 차폐 모이어티는 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 인터류킨-2(IL-2)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 VL과 서열번호 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
일부 실시형태에서, 차폐 모이어티는 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 인터류킨-2(IL-2)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 76의 아미노산 서열을 포함하는 VL과 서열번호 88의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
일부 실시형태에서, 차폐 모이어티는 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 인터류킨-2(IL-2)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 77의 아미노산 서열을 포함하는 VL과 서열번호 89의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
일부 실시형태에서, 차폐 모이어티는 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 인터류킨-2(IL-2)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 78의 아미노산 서열을 포함하는 VL과 서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
일부 실시형태에서, 차폐 모이어티는 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 인터류킨-2(IL-2)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 VL과 서열번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
일부 실시형태에서, 차폐 모이어티는 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 인터류킨-2(IL-2)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 VL과 서열번호 83의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
일부 실시형태에서, 차폐 모이어티는 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 인터류킨-2(IL-2)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 VL과 서열번호 83의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
일부 실시형태에서, 차폐 모이어티는 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 인터류킨-2(IL-2)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL과 서열번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
일부 실시형태에서, 차폐 모이어티는 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 인터류킨-2(IL-2)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 VL과 서열번호 84의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
일부 실시형태에서, 차폐 모이어티는 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 인터류킨-2(IL-2)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 VL과 서열번호 85의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
일부 실시형태에서, 차폐 모이어티는 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 인터류킨-2(IL-2)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 VL과 서열번호 87의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
일부 실시형태에서, 차폐 모이어티는 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 인터류킨-2(IL-2)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 101의 아미노산 서열을 포함하는 VL과 서열번호 102의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
일부 실시형태에서, 고정 모이어티는 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은 (a) 표 5에 제시된 바와 같은 항체 872-5, 872-59, 872-70 또는 872-5V1 중 어느 하나의 VL 상보성 결정 영역 1(CDR1), VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VH); 및/또는 (b) 표 6에 제시된 바와 같은 항체 872-5, 872-59, 872-70, 872-5V1 또는 VHH6 중 어느 하나의 VH 상보성 결정 영역 1(CDR1), VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 고정 모이어티는 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은, 각각, 서열번호 30, 17 및 54의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3과, 각각, 서열번호 58, 59 및 60의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 고정 모이어티는 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은, 각각, 서열번호 30, 17 및 55의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3과, 각각, 서열번호 61, 62 및 48의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 고정 모이어티는 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은, 각각, 서열번호 30, 17 및 56의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3과, 각각, 서열번호 36, 63 및 38의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 고정 모이어티는 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은, 각각, 서열번호 30, 17 및 57의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3과, 각각, 서열번호 58, 64 및 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 고정 모이어티는 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은, 각각, 서열번호 65, 66 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하는 VHH인 항체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 고정 모이어티는 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은 (a) 표 7에 제시된 바와 같은 항체 872-5, 872-59, 872-70 또는 872-5V1 중 어느 하나의 VL을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 및/또는 (b) 표 8에 제시된 바와 같은 항체 872-5, 872-59, 872-70, 872-5V1 또는 VHH6 중 어느 하나의 VH를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 고정 모이어티는 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 91, 서열번호 92, 서열번호 93 또는 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시형태에서, 고정 모이어티는 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 95, 서열번호 96, 서열번호 97, 서열번호 98 또는 서열번호 99의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
일부 실시형태에서, 고정 모이어티는 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 VL과 서열번호 95의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
일부 실시형태에서, 고정 모이어티는 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 VL과 서열번호 96의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
일부 실시형태에서, 고정 모이어티는 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL과 서열번호 97의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
일부 실시형태에서, 고정 모이어티는 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 VL과 서열번호 98의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
일부 실시형태에서, 고정 모이어티는 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 99의 아미노산 서열을 포함하는 VHH를 포함한다.
본 개시내용은, 특정 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 면역접합체 분자와 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 개시내용은, 특정 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 면역접합체 분자, 또는 이의 서브유닛 또는 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 있다. 본 개시내용에 따른 면역접합체 분자, 또는 이의 서브유닛 또는 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 집단이 또한 본원에 제공된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 제1 폴리뉴클레오타이드는 면역접합체 분자의 일부를 형성하는 제1 서브유닛 또는 폴리펩타이드를 인코딩하고, 제2 폴리뉴클레오타이드는 면역접합체 분자의 일부를 형성하는 제2 서브유닛 또는 폴리펩타이드를 인코딩한다. 일부 실시형태에서, 제1 폴리뉴클레오타이드는 제1 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 있고, 제2 폴리뉴클레오타이드는 제2 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 있다.
본 개시내용은, 특정 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 제공한다. 본 개시내용은 나아가, 특정 실시형태에서, (a) 제1 프로모터에 작동 가능하게 연결된 본원에 제공된 면역접합체 분자의 일부를 형성하는 제1 서브유닛 또는 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 벡터, 및, (b) 제2 프로모터에 작동 가능하게 연결된 본원에 제공된 면역접합체 분자의 일부를 형성하는 제2 서브유닛 또는 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 벡터를 포함하는 벡터 집단을 추가로 제공한다.
본 개시내용은, 특정 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포를 제공한다. 본 개시내용에 따른 벡터 또는 벡터 집단을 포함하는 세포가 또한 본원에 제공된다. 본 개시내용은, 특정 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 면역접합체 분자를 생산하는 단리된 세포를 제공한다.
(a) 본원에 제공된 면역접합체 분자의 일부를 형성하는 폴리펩타이드의 제1 서브유닛을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제1 숙주세포, 및 (b) 본원에 제공된 면역접합체 분자의 일부를 형성하는 폴리펩타이드의 제2 서브유닛을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제2 숙주세포를 포함하는 세포 집단이 또한 본원에 제공된다.
(a) 제1 프로모터에 작동 가능하게 연결된 본원에 제공된 면역접합체 분자의 일부를 형성하는 폴리펩타이드의 제1 서브유닛을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제1 숙주세포, 및 (b) 제2 프로모터에 작동 가능하게 연결된 본원에 제공된 면역접합체 분자의 일부를 형성하는 폴리펩타이드의 제2 서브유닛을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제2 숙주세포를 포함하는 세포 집단이 추가로 본원에 제공된다.
본 개시내용은, 특정 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 면역접합체 분자를 포함하는 키트를 제공한다.
본 개시내용에 따른 면역접합체 분자, 또는 이의 서브유닛 또는 단편을 제조하는 방법이 또한 본원에 제공된다. 특정 실시형태에서, 상기 방법은 면역접합체 분자, 또는 이의 서브유닛 또는 단편을 발현시키기 위해 본원에 제공된 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 방법은 본원에 제공된 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 단계를 포함한다.
관련 양태에서, 표적 부위에서 사이토카인 매개 효과를 활성화시키는 방법으로서, 사이토카인과 차폐 모이어티를 포함하는 면역접합체 분자를 표적 부위로 전달하는 단계를 포함하며, 여기서 차폐 모이어티는 분자내 상호작용을 통해 사이토카인에 결합하여 사이토카인 매개 효과를 저해하는 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고, 여기서 투인원 항체 또는 항원 결합 단편은 표적 부위의 제1 표적 항원에 결합할 수 있으며, 면역접합체 분자가 표적 부위에 있을 때, 투인원 항체는 제1 표적 항원에 결합하고 사이토카인에서 해리되고, 사이토카인 매개 효과가 표적 부위에서 활성화되는 방법이 본원에 제공된다.
일부 실시형태에서, 면역접합체 분자는 고정 모이어티를 추가로 포함하며, 여기서 고정 모이어티는 표적 부위의 제2 표적 항원에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
일부 실시형태에서, 면역접합체 분자가 표적 부위에 있을 때, 고정 모이어티의 항체 또는 항원 결합 단편은 제2 표적 항원에 결합하고, 면역접합체 분자는 표적 부위에 고정화된다.
일부 실시형태에서, 면역접합체 분자를 표적 부위로 전달하는 단계는 면역접합체 분자를 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 활성은 면역접합체 분자를 대상에게 투여한 후 표적 부위에서의 사이토카인 활성과 비교하여 비(non)-표적 부위에서 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 더 낮다.
관련 양태에서, 표적 부위에 사이토카인을 농축시키는 방법으로서, 사이토카인과 고정 모이어티를 포함하는 면역접합체 분자를 표적 부위로 전달하는 단계를 포함하며, 여기서 고정 모이어티는 표적 부위의 제2 표적 항원에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고, 면역접합체 분자가 표적 부위에 있을 때, 고정 모이어티는 제2 표적 항원에 결합하고, 사이토카인이 비-표적 부위와 비교하여 표적 부위에서 더 높은 농도로 분포되는 방법이 본원에 제공된다.
일부 실시형태에서, 면역접합체 분자를 표적 부위로 전달하는 단계는 면역접합체 분자를 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 농도는 면역접합체 분자를 대상에게 투여한 후 표적 부위에서의 사이토카인 활성과 비교하여 비-표적 부위에서 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 더 낮다.
일부 실시형태에서, 면역접합체 분자는 차폐 모이어티를 추가로 포함하며, 여기서 차폐 모이어티는 분자내 상호작용을 통해 사이토카인에 결합하여 사이토카인 매개 효과를 저해하는 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고, 여기서 투인원 항체 또는 항원 결합 단편은 표적 부위의 제1 표적 항원에 결합할 수 있으며, 면역접합체 분자가 표적 부위에 있을 때, 투인원 항체는 제1 표적 항원에 결합하고 사이토카인에서 해리되고, 사이토카인 매개 효과가 표적 부위에서 활성화된다.
일부 실시형태에서, 면역접합체 분자를 대상에게 투여하면 대상에서 사이토카인과 관련된 독성 또는 부작용이 감소한다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 독성 또는 부작용은 접합되지 않은 형태의 사이토카인을 등가량으로 대상에게 투여한 경우와 비교하여 본 발명의 방법에서 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 감소된다. 일부 실시형태에서, 사이토카인과 관련된 독성 또는 부작용의 감소는 투여된 대상의 수명 연장으로 측정된다. 일부 실시형태에서, 사이토카인과 관련된 독성 또는 부작용의 감소는 투여된 대상의 체중 손실 감소로 측정된다. 일부 실시형태에서, 사이토카인과 관련된 독성 또는 부작용의 감소는 투여된 대상에서 면역 반응 수준의 변화로 측정된다. 일부 실시형태에서, 사이토카인과 관련된 독성 또는 부작용의 감소는 투여된 대상에서 염증 반응의 변화로 측정된다.
본 발명의 방법의 일부 실시형태에서, 제1 항원과 제2 항원은 동일한 항원이거나 상이한 항원이다. 일부 실시형태에서, 표적 부위는 종양 미세환경이다. 일부 실시형태에서, 표적 부위는 암성 세포이다. 일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 항원은 암 세포의 표면에서 발현된다. 일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 항원은 종양 미세환경 내 세포에 의해 발현된다. 일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 항원은 섬유증 활성화 단백질(FAP)이다. 일부 실시형태에서, 면역접합체 분자는 사이토카인 폴리펩타이드, 차폐 모이어티 및 고정 모이어티 중 둘 이상을 작동 가능하게 연결하도록 구성된 접합 모이어티를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 접합 모이어티는 2개의 동일하지 않은 폴리펩타이드 사슬인 제1 서브유닛과 제2 서브유닛을 포함하는 면역글로불린 Fc 도메인이며, 여기서 Fc 도메인은 2개의 동일하지 않은 폴리펩타이드 사슬의 이종이량체화를 촉진하는 제1 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역글로불린 도메인은 제2 변형을 포함하며, 여기서 Fc 도메인은 상기 제2 변형이 없는 천연 Fc 도메인과 비교하여 Fc 수용체에 대한 결합 친화도가 감소되어 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법에 사용되는 면역접합체 분자는 본 개시내용에 따른 면역접합체 분자이다.
본 개시내용은, 특정 실시형태에서, 본 개시내용의 면역접합체 분자의 일부를 형성할 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 일부 실시형태에서, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 인터류킨-2(IL-2)에 결합하는 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, (a) 표 1에 제시된 바와 같은 항체 D001, D002, D029, D029LV1, D029LV2, D029LV3, D029LV4, D029LV5, D003, D047, D049 또는 B10 중 어느 하나의 VL 상보성 결정 영역 1(CDR1), VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VH); 및/또는 (b) 표 2에 제시된 바와 같은 항체 D001, D002, D029, D029HV1, D029HV2, D029HV3, D029HV4, D029HV5, D029HV6, D003, D047, D049 또는 B10 중 어느 하나의 VH 상보성 결정 영역 1(CDR1), VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다.
일부 실시형태에서, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 인터류킨-2(IL-2)에 결합하는 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 각각, 서열번호 16, 17 및 18의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3과, 각각, 서열번호 36, 37 및 38의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 인터류킨-2(IL-2)에 결합하는 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 각각, 서열번호 19, 17 및 20의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3과, 각각, 서열번호 36, 39 및 38의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 인터류킨-2(IL-2)에 결합하는 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 각각, 서열번호 21, 22 및 23의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3과, 각각, 서열번호 40, 41 및 38의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 인터류킨-2(IL-2)에 결합하는 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 각각, 서열번호 30, 17 및 31의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3과, 각각, 서열번호 46, 47 및 48의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 인터류킨-2(IL-2)에 결합하는 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 각각, 서열번호 32, 17 및 33의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3과, 각각, 서열번호 49, 50 및 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 인터류킨-2(IL-2)에 결합하는 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 각각, 서열번호 34, 17 및 35의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3과, 각각, 서열번호 52, 53 및 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 인터류킨-2(IL-2)에 결합하는 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 각각, 서열번호 24, 25 및 23의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3과, 각각, 서열번호 40, 42 및 38의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 인터류킨-2(IL-2)에 결합하는 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 각각, 서열번호 26, 25 및 28의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3과, 각각, 서열번호 43, 42 및 38의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 인터류킨-2(IL-2)에 결합하는 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 각각, 서열번호 26, 25 및 29의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3과, 각각, 서열번호 43, 42 및 38의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 인터류킨-2(IL-2)에 결합하는 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 각각, 서열번호 24, 25 및 29의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3과, 각각, 서열번호 40, 42 및 38의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 인터류킨-2(IL-2)에 결합하는 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 각각, 서열번호 26, 25 및 27의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3과, 각각, 서열번호 43, 42 및 38의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 인터류킨-2(IL-2)에 결합하는 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 각각, 서열번호 26, 25 및 27의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3과, 각각, 서열번호 44, 42 및 38의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 인터류킨-2(IL-2)에 결합하는 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 각각, 서열번호 26, 25 및 27의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3과, 각각, 서열번호 45, 42 및 38의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 인터류킨-2(IL-2)에 결합하는 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 각각, 서열번호 103, 17 및 104의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3과, 각각, 서열번호 105, 106 및 38의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 인터류킨-2(IL-2)에 결합하는 투인원 항체 또는 이의 항원 결합은 (a) 표 3에 제시된 바와 같은 항체 D001, D002, D029, D029LV1, D029LV2, D029LV3, D029LV4, D029LV5, D003, D047, D049 또는 B10 중 어느 하나의 VL을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 및/또는 (b) 표 4에 제시된 바와 같은 항체 D001, D002, D029, D029LV1, D029LV2, D029LV3, D029LV4, D029LV5, D003, D047, D049 또는 B10 중 어느 하나의 VH를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 인터류킨-2(IL-2)에 결합하는 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 68, 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72, 서열번호 73, 서열번호 74, 서열번호 75, 서열번호 76, 서열번호 77, 서열번호 78 또는 서열번호 101의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시형태에서, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 인터류킨-2(IL-2)에 결합하는 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 79, 서열번호 80, 서열번호 81, 서열번호 82, 서열번호 83, 서열번호 84, 서열번호 85, 서열번호 86, 서열번호 87, 서열번호 88, 서열번호 89, 서열번호 90 또는 서열번호 102의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
일부 실시형태에서, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 인터류킨-2(IL-2)에 결합하는 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 VL과 서열번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
일부 실시형태에서, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 인터류킨-2(IL-2)에 결합하는 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 VL과 서열번호 80의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
일부 실시형태에서, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 인터류킨-2(IL-2)에 결합하는 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 VL과 서열번호 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
일부 실시형태에서, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 인터류킨-2(IL-2)에 결합하는 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 76의 아미노산 서열을 포함하는 VL과 서열번호 88의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
일부 실시형태에서, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 인터류킨-2(IL-2)에 결합하는 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 77의 아미노산 서열을 포함하는 VL과 서열번호 89의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
일부 실시형태에서, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 인터류킨-2(IL-2)에 결합하는 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 78의 아미노산 서열을 포함하는 VL과 서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
일부 실시형태에서, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 인터류킨-2(IL-2)에 결합하는 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 VL과 서열번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
일부 실시형태에서, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 인터류킨-2(IL-2)에 결합하는 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 VL과 서열번호 83의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
일부 실시형태에서, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 인터류킨-2(IL-2)에 결합하는 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 VL과 서열번호 83의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
일부 실시형태에서, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 인터류킨-2(IL-2)에 결합하는 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL과 서열번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
일부 실시형태에서, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 인터류킨-2(IL-2)에 결합하는 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 VL과 서열번호 84의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
일부 실시형태에서, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 인터류킨-2(IL-2)에 결합하는 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 VL과 서열번호 85의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
일부 실시형태에서, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 인터류킨-2(IL-2)에 결합하는 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 VL과 서열번호 87의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
일부 실시형태에서, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 인터류킨-2(IL-2)에 결합하는 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 101의 아미노산 서열을 포함하는 VL과 서열번호 102의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
본 개시내용은, 특정 실시형태에서, 본원에 개시된 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 인터류킨-2(IL-2)에 결합하는 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편과, IL-2 폴리펩타이드를 포함하는 면역접합체 분자를 제공한다. 일부 실시형태에서, IL-2 폴리펩타이드는 인간 IL-2이다. 일부 실시형태에서, IL-2 폴리펩타이드는 본원에 기재된 바와 같은 야생형 또는 돌연변이형 IL-2이다.
본 개시내용은 또한, 특정 실시형태에서, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, (a) 표 5에 제시된 바와 같은 항체 872-5, 872-59, 872-70 또는 872-5V1 중 어느 하나의 VL 상보성 결정 영역 1(CDR1), VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VH); 및/또는 (b) 표 6에 제시된 바와 같은 항체 872-5, 872-59, 872-70, 872-5V1 또는 VHH6 중 어느 하나의 VH 상보성 결정 영역 1(CDR1), VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편을 제공한다.
일부 실시형태에서, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 각각, 서열번호 30, 17 및 54의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3과, 각각, 서열번호 58, 59 및 60의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 각각, 서열번호 30, 17 및 55의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3과, 각각, 서열번호 61, 62 및 48의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 각각, 서열번호 30, 17 및 56의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3과, 각각, 서열번호 36, 63 및 38의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 각각, 서열번호 30, 17 및 57의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3과, 각각, 서열번호 58, 64 및 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 각각, 서열번호 65, 66 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하는 VHH인 항체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 (a) 표 7에 제시된 바와 같은 항체 872-5, 872-59, 872-70 또는 872-5V1 중 어느 하나의 VL을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 및/또는 (b) 표 8에 제시된 바와 같은 항체 872-5, 872-59, 872-70, 872-5V1 또는 VHH6 중 어느 하나의 VH를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 91, 서열번호 92, 서열번호 93 또는 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시형태에서, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 95, 서열번호 96, 서열번호 97, 서열번호 98 또는 서열번호 99의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
일부 실시형태에서, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 VL과 서열번호 95의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
일부 실시형태에서, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 VL과 서열번호 96의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
일부 실시형태에서, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL과 서열번호 97의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
일부 실시형태에서, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 VL과 서열번호 98의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
일부 실시형태에서, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 99의 아미노산 서열을 포함하는 VHH를 포함한다.
본 개시내용은, 특정 실시형태에서, 본원에 개시된 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편과, IL-2 폴리펩타이드를 포함하는 면역접합체 분자를 제공한다. 일부 실시형태에서, IL-2 폴리펩타이드는 인간 IL-2이다. 일부 실시형태에서, IL-2 폴리펩타이드는 본원에 기재된 바와 같은 야생형 또는 돌연변이형 IL-2이다.
또 다른 양태에서, 차폐 모이어티에 접합된 IL-2 폴리펩타이드를 포함하는 면역접합체 분자로서, 여기서 차폐 모이어티는 IL-2 폴리펩타이드와 제1 표적 항원에 결합할 수 있는 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며, IL-2 폴리펩타이드에 결합하는 경우, 차폐 모이어티는 제1 IL-2 수용체(IL-2R) 서브유닛에 대한 IL-2 폴리펩타이드의 결합을 차단하고, 제1 표적 항원에 결합하는 경우, 차폐 모이어티는 IL-2 폴리펩타이드에서 해리되어 제1 IL-2R 서브유닛과 결합하기 위한 IL-2 폴리펩타이드를 방출하는 면역접합체 분자가 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, IL-2 폴리펩타이드는 제2 IL-2R 서브유닛에 대한 IL-2 폴리펩타이드의 결합을 약화시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 IL-2R 서브유닛은 IL-2R α-사슬(IL-2Rα)이고, 제2 IL-2R 서브유닛은 IL-2R β-사슬(IL-2Rβ)이다. 일부 실시형태에서, 제2 IL-2R 서브유닛에 대한 IL-2 폴리펩타이드의 결합은 야생형 IL-2와 비교하여 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99% 감소된다.
일부 실시형태에서, IL-2Rβ에 대한 IL-2 폴리펩타이드의 결합을 약화시키는 하나 이상의 돌연변이는 D20T, D20G, D20A, H16E, H16R, H16A, N88D, N88S, N88R, V91G, V91A, V91R 및 V91S, 또는 이들의 조합에서 선택된다. 일부 실시형태에서, 차폐 모이어티는 IL-2의 잔기 P34, K35, R38, T41, F42, K43, F44, Y45, E61, E62, K64, P65, E68, V69, N71, L72, Q74, Y107 및 D109 중 하나 이상을 포함하는 IL-2의 에피토프에 결합한다.
일부 실시형태에서, 차폐 모이어티는 서열번호 101의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역과 서열번호 102의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체에 의해 인식되는 IL-2의 에피토프에 결합한다. 일부 실시형태에서, 차폐 모이어티는 서열번호 101의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역과 서열번호 102의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 IL-2에 대한 결합에 대해 경쟁한다.
일부 실시형태에서, 차폐 모이어티는 (a) 표 1에 제시된 바와 같은 항체 B10의 VL 상보성 결정 영역 1(CDR1), VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 및/또는 (b) 표 2에 제시된 바와 같은 항체 B10의 VH 상보성 결정 영역 1(CDR1), VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 차폐 모이어티는 (a) 각각, 서열번호 103, 17 및 104의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3과, (b) 각각, 서열번호 105, 106 및 38의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 차폐 모이어티는 (a) 표 3에 제시된 바와 같은 항체 B10의 VL을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 및/또는 (b) 표 4에 제시된 바와 같은 항체 B10의 VH를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 차폐 모이어티는 서열번호 101의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 차폐 모이어티는 서열번호 102의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시형태에서, 차폐 모이어티는 (a) 서열번호 101의 아미노산 서열을 포함하는 VL과, (b) 서열번호 102의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 IL-2R 서브유닛은 IL-2Rβ이고, 제2 IL-2R 서브유닛은 IL-2Rα이다. 일부 실시형태에서, IL-2Rα에 대한 IL-2 폴리펩타이드의 결합은 야생형 IL-2와 비교하여 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99% 감소된다.
일부 실시형태에서, IL-2Rα에 대한 IL-2 폴리펩타이드의 결합을 약화시키는 하나 이상의 돌연변이는 K35E, R38A, R38E, R38D, F42A, F42K, K43E, Y45A, E61R, E62A, L72G, 또는 이들의 조합에서 선택된다. 일부 실시형태에서, IL-2Rα에 대한 IL-2 폴리펩타이드의 결합을 약화시키는 하나 이상의 돌연변이는 (a) F42A; 또는 (b) K35E와 F42A이다. 일부 실시형태에서, 차폐 모이어티는 IL-2의 잔기 L12, Q13, E15, H16, L19, D20, M23, R81, D84, D87, N88, V91, I92 및 E95 중 하나 이상을 포함하는 IL-2의 에피토프에 결합한다.
일부 실시형태에서, 차폐 모이어티는 항체 5UTZ에 의해 인식되는 IL-2의 에피토프에 결합한다. 일부 실시형태에서, 차폐 모이어티는 항체 5UTZ와 IL-2에 대한 결합에 대해 경쟁한다.
일부 실시형태에서, IL-2 폴리펩타이드는 IL-2R γ-사슬(IL-2Rγ)에 대한 IL-2 폴리펩타이드의 결합을 변형시키는 하나 이상의 돌연변이를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2Rγ에 대한 IL-2 폴리펩타이드의 결합을 변형시키는 하나 이상의 돌연변이는 L18R, Q22E, T123A, Q126T, I129V, S130A, S130R, 또는 이들의 조합에서 선택된다.
일부 실시형태에서, 면역접합체는 고정 모이어티를 추가로 포함하며, 여기서 고정 모이어티는 제2 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 차폐 모이어티는 제1 세포의 표면에서 발현되는 제1 표적 항원의 존재 하에서 IL-2 폴리펩타이드로부터 해리된다.
일부 실시형태에서, 제2 표적 항원은 제1 세포 또는 제1 세포에 근접한 제2 세포의 표면에서 발현된다. 일부 실시형태에서, 제1 표적 항원과 제2 표적 항원은 동일하거나 상이하다. 일부 실시형태에서, 제1 표적 항원 및/또는 제2 표적 항원은 종양 관련 항원이다. 일부 실시형태에서, 제1 표적 항원과 제2 표적 항원은, 각각 독립적으로, FAP, Her2, Her3, CD19, CD20, BCMA, PSMA, CEA, cMET, EGFR, CA-125, MUC-1, EpCAM 또는 Trop-2에서 선택된다. 일부 실시형태에서, 제1 표적 항원은 FAP이다.
또 다른 양태에서, IL-2R을 활성화시키는 방법으로서, 본원에 제공된 바와 같은 IL-2 폴리펩타이드를 포함하는 면역접합체 분자의 유효량을 IL-2R과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, IL-2R은 IL-2Rβ를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2R은 IL-2Rα를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2R은 IL-2Rγ를 포함한다.
일부 실시형태에서, IL-2R은 IL-2Rβ를 포함하며, 여기서 IL-2Rβ는 제1 세포의 표면에서 발현된다. 일부 실시형태에서, IL-2R은 IL-2Rγ를 추가로 포함하며, 여기서 IL-2Rγ는 제1 세포의 표면에서 발현된다.
일부 실시형태에서, IL-2R은 IL-2Rα를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2Rα는 세포 표면에 회합되어 있다. 일부 실시형태에서, IL-2Rα는 제1 세포의 표면에 회합되어 있다(시스-제시, cis-presentation). 일부 실시형태에서, IL-2Rα는 제2 세포의 표면에 회합되어 있다(트랜스-제시, trans-presentation). 일부 실시형태에서, IL-2Rα는 세포 표면에 회합되어 있지 않다. 일부 실시형태에서, IL-2R은 IL-2Rα를 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, 제1 세포 및/또는 제2 세포는 면역세포이며, IL-2R의 활성화 시, 면역세포가 활성화된다. 일부 실시형태에서, 면역세포의 활성화는 면역세포의 증식 또는 성숙의 증가로 측정된다. 일부 실시형태에서, 표적세포의 증식 또는 성숙은 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 100%, 약 125%, 약 150%, 약 175%, 약 200%, 약 250%, 약 300%, 약 400%, 약 500%, 약 600%, 약 700%, 약 800%, 약 900% 또는 약 1000% 만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, 면역세포의 활성화는 면역세포의 생존 기간 연장으로 측정된다. 일부 실시형태에서, 표적세포의 생존 기간은 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 100%, 약 125%, 약 150%, 약 175%, 약 200%, 약 250%, 약 300%, 약 400%, 약 500%, 약 600%, 약 700%, 약 800%, 약 900% 또는 약 1000% 만큼 증가된다.
일부 실시형태에서, 면역세포는 이펙터 T세포, 기억 T세포, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 면역세포는 CD4+ T세포, CD8+ T세포, 헬퍼 T세포, 세포독성 T세포, SLEC(단기 이펙터 세포, short-lived effector cells), MPEC(기억 전구 이펙터 세포, memory precursor effector cells), TE(말단 이펙터 세포, terminal effector cells), NK(자연살해세포), NKT(자연살해 T세포), 선천성 림프구 세포(I형 내지 III형), 또는 이들의 조합이다.
일부 실시형태에서, 면역세포는 조절 T세포(Treg)이다. 일부 실시형태에서, 면역세포는 천연 Treg(nTreg) 세포, 유도된 Treg(iTreg) 세포, 또는 이들의 조합이다.
일부 실시형태에서, 제1 세포 및/또는 제2 세포는 병든 세포이며, IL-2R의 활성화 시, 병든 세포는 사멸한다. 일부 실시형태에서, 병든 세포는 암 세포이다. 일부 실시형태에서, 병든 세포는 감염성 병원체에 의해 감염된 세포이다. 일부 실시형태에서, 감염성 병원체는 바이러스, 박테리아, 진균, 기생충, 또는 이들의 조합이다.
일 양태에서, IL-2R을 발현하는 표적세포를 활성화시키는 방법으로서, 본원에 기재된 바와 같은 IL-2 폴리펩타이드를 포함하는 면역접합체 분자의 유효량을 표적세포와 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 IL-2 폴리펩타이드와 IL-2R의 결합 시, 표적세포가 활성화되는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 표적세포는 면역세포이다. 일부 실시형태에서, 표적세포는 이펙터 T세포, 기억 T세포, 조절 T세포, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 표적세포는 CD4+ T세포, CD8+ T세포, 헬퍼 T세포, 세포독성 T세포, SLEC(단기 이펙터 세포), MPEC(기억 전구 이펙터 세포), TE(말단 이펙터 세포), NK(자연살해세포), NKT(자연살해 T세포), 선천성 림프구 세포(I형 내지 III형), 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 표적세포는 천연 Treg(nTreg) 세포, 유도된 Treg(iTreg) 세포, 또는 이들의 조합이다.
일부 실시형태에서, 표적세포의 활성화는 표적세포의 증식 또는 성숙의 증가로 측정된다. 일부 실시형태에서, 표적세포의 증식 또는 성숙은 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 100%, 약 125%, 약 150%, 약 175%, 약 200%, 약 250%, 약 300%, 약 400%, 약 500%, 약 600%, 약 700%, 약 800%, 약 900% 또는 약 1000% 만큼 증가된다.
일부 실시형태에서, 표적세포의 활성화는 표적세포의 생존 기간 연장으로 측정된다. 일부 실시형태에서, 표적세포의 생존 기간은 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 100%, 약 125%, 약 150%, 약 175%, 약 200%, 약 250%, 약 300%, 약 400%, 약 500%, 약 600%, 약 700%, 약 800%, 약 900% 또는 약 1000% 만큼 증가된다.
일부 실시형태에서, 상기 접촉시키는 단계는 약학적으로 허용 가능한 담체와, 본원에 기재된 바와 같은 IL-2 폴리펩타이드를 포함하는 면역접합체 분자를 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 접촉시키는 단계는 항신생물성 면역 반응을 증강시킨다. 일부 실시형태에서, 상기 접촉시키는 단계는 항감염 면역 반응을 증강시킨다.
일 양태에서, T세포 집단의 항원 특이적 면역 반응을 증강시키는 방법으로서, 본원에 기재된 바와 같은 IL-2 폴리펩타이드를 포함하는 면역접합체 분자의 유효량을 T세포 집단과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 상기 접촉시키는 단계는 항원 특이적 이펙터 T세포의 증식 또는 성숙을 증강시킨다. 일부 실시형태에서, 상기 접촉시키는 단계는 항원 특이적 기억 T세포의 형성을 증강시킨다. 일부 실시형태에서, 상기 접촉시키는 단계는 항원의 존재 하에서 수행된다. 일부 실시형태에서, 항원은 암, 종양, 병원체 또는 알레르겐의 항원이다.
일 양태에서, T세포 집단에 의한 전염증성 사이토카인의 분비를 증가시키는 방법으로서, 본원에 기재된 바와 같은 IL-2 폴리펩타이드를 포함하는 면역접합체 분자를 T세포 집단과 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 상기 IL-2 폴리펩타이드는 결합 시 T세포를 활성화시키는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 사이토카인은 IL-1, IL-2, IL-6, IL-12, IL-17, IL-22, IL-23, GM-CSF, TNF-α, IFN-γ, 또는 이들의 임의의 조합이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 생산은 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 100%, 약 125%, 약 150%, 약 175%, 약 200%, 약 250%, 약 300%, 약 400%, 약 500%, 약 600%, 약 700%, 약 800%, 약 900% 또는 약 1000% 만큼 증가된다.
일 양태에서, 표적세포의 표면에 IL-2R의 어셈블리를 증가시키는 방법으로서, 본원에 기재된 바와 같은 IL-2 폴리펩타이드를 포함하는 면역접합체 분자의 유효량을 표적세포와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, IL-2R은 표적세포의 표면에 IL-2Rα, IL-2Rβ, IL-2Rγ, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2R은 표적세포의 표면에 IL-2Rβ 및 IL-2Rγ를 포함하고, 표적세포에 근접한 제2 세포의 표면에 IL-2Rα를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2R은 표적세포의 표면에 IL-2Rβ 및 IL-2Rγ를 포함하고, IL-2Rα는 세포 표면에 회합되어 있지 않다. 일부 실시형태에서, 표적세포의 표면 상의 IL-2R의 어셈블리는 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 100%, 약 125%, 약 150%, 약 175%, 약 200%, 약 250%, 약 300%, 약 400%, 약 500%, 약 600%, 약 700%, 약 800%, 약 900% 또는 약 1000% 만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, 표적세포는 면역세포이다. 일부 실시형태에서, 표적세포는 이펙터 T세포, 기억 T세포, 조절 T세포, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 표적세포는 CD4+ T세포, CD8+ T세포, 헬퍼 T세포, 세포독성 T세포, SLEC(단기 이펙터 세포), MPEC(기억 전구 이펙터 세포), TE(말단 이펙터 세포), NK(자연살해세포), NKT(자연살해 T세포), 선천성 림프구 세포(I형 내지 III형), 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 표적세포는 천연 Treg(nTreg) 세포, 유도된 Treg(iTreg) 세포, 또는 이들의 조합이다.
일 양태에서, 병든 세포 집단을 둘러싸는 조직에 전염증성 환경을 형성하는 방법으로서, 본원에 기재된 바와 같은 IL-2 폴리펩타이드를 포함하는 면역접합체 분자의 유효량을 조직과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 조직 내 활성화된 B세포, CD4+ 이펙터 T세포, CD8+ 이펙터 T세포, 수지상세포, 대식세포, 자연살해세포, 단핵구, 과립구, 호산구 및/또는 호중구의 농도가 증가된다. 일부 실시형태에서, 조직 내 조절 T세포의 농도가 감소된다. 일부 실시형태에서, 전염증성 사이토카인의 농도가 조직에서 증가된다. 일부 실시형태에서, 전염증성 사이토카인은 IL-1, IL-2, IL-6, IL-12, IL-17, IL-22, IL-23, GM-CSF, TNF-α, IFN-γ, 또는 이들의 임의의 조합이다. 일부 실시형태에서, 병든 세포에서 유래하거나 유도된 항원에 결합하는 항체의 농도가 조직에서 증가된다. 일부 실시형태에서, 항원제시세포에 의한 병든 세포에서 유래하거나 유도된 항원의 제시가 조직에서 증가된다. 일부 실시형태에서, 병든 세포의 포식작용이 조직에서 증가된다. 일부 실시형태에서, 세포 매개 세포독성에 의해 유도된 병든 세포의 세포자멸사가 조직에서 증가된다. 일부 실시형태에서, 항체 의존성 세포독성에 의해 유도된 병든 세포의 세포자멸사가 조직에서 증가된다. 일부 실시형태에서, 병든 세포 집단이 조직에서 감소된다. 일부 실시형태에서, 병든 세포 집단이 조직에서 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99% 만큼 감소된다.
일 양태에서, 대상에서 병든 세포를 제거하는 방법으로서, 본원에 기재된 바와 같은 IL-2 폴리펩타이드를 포함하는 면역접합체 분자의 유효량을 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 병든 세포는 암 세포이다. 일부 실시형태에서, 병든 세포는 감염성 병원체에 의해 감염된 세포이다. 일부 실시형태에서, 감염성 병원체는 바이러스, 박테리아, 진균, 기생충, 또는 이들의 조합이다.
일 양태에서, 암 치료를 필요로 하는 대상에서 암을 치료하는 방법으로서, 본원에 기재된 바와 같은 IL-2 폴리펩타이드를 포함하는 면역접합체 분자의 유효량을 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 상기 치료는 선천성, 체액성 또는 세포 매개 항신생물성 면역 반응을 증강시킨다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 제2 요법의 병용투여를 추가로 포함한다.
일 양태에서, 감염의 치료를 필요로 하는 대상에서 감염을 치료하는 방법으로서, 본원에 기재된 바와 같은 IL-2 폴리펩타이드를 포함하는 면역접합체 분자의 유효량을 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 상기 치료는 선천성, 체액성 또는 세포 매개 항감염성 면역 반응을 증강시킨다. 일부 실시형태에서, 대상에서 감염을 예방하기 위한 백신 조성물이 대상에게 병용투여된다. 일부 실시형태에서, 백신 조성물은 동시에 또는 순차적으로 병용투여된다.
일 양태에서, 항원에 대한 반응 증가를 필요로 하는 대상에서 항원에 대한 반응을 증가시키는 방법으로서, 본원에 기재된 바와 같은 IL-2 폴리펩타이드를 포함하는 면역접합체 분자의 유효량을 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 항원은 암, 종양, 병원체 또는 알레르겐의 항원이다. 일부 실시형태에서, 항원은 감염성 병원체에서 유래하거나 유도된다. 일부 실시형태에서, 감염성 병원체는 바이러스, 박테리아, 진균, 기생충, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 항원은 병든 세포에서 유래하거나 유도된다. 일부 실시형태에서, 항원은 감염성 병원체에 의해 감염된 세포에서 유래하거나 유도된다. 일부 실시형태에서, 감염성 병원체는 바이러스, 박테리아, 진균, 기생충, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 항원은 암 세포에서 유래하거나 유도된다.
일 양태에서, 백신에 대한 반응 증가를 필요로 하는 대상에서 백신에 대한 반응을 증가시키는 방법으로서, 본원에 기재된 바와 같은 IL-2 폴리펩타이드를 포함하는 면역접합체 분자의 유효량과 백신을 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 백신은 종양, 암, 병원체 또는 알레르겐에 대한 백신이다. 일부 실시형태에서, 면역접합체 분자는 백신용 아쥬반트 조성물로 제형화된다.
일 양태에서, 항원을 둘러싸는 조직에 항원의 면역 관용을 확립하는 방법으로서, 본원에 기재된 바와 같은 IL-2 폴리펩타이드를 포함하는 면역접합체 분자의 유효량을 조직과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 조직 내 활성화된 B세포, CD4+ 이펙터 T세포, CD8+ 이펙터 T세포, 수지상세포, 대식세포, 자연살해세포, 단핵구, 과립구, 호산구 및/또는 호중구의 농도가 감소된다. 일부 실시형태에서, 조직 내 조절 T세포의 농도가 증가된다. 일부 실시형태에서, 전염증성 사이토카인의 농도가 조직에서 감소된다. 일부 실시형태에서, 전염증성 사이토카인은 IL-1, IL-2, IL-6, IL-12, IL-17, IL-22, IL-23, GM-CSF, TNF-α, IFN-γ, 또는 이들의 임의의 조합이다. 일부 실시형태에서, 항원에 결합하는 항체의 농도가 조직에서 감소된다. 일부 실시형태에서, 항원제시세포에 의한 항원의 제시가 조직에서 감소된다. 일부 실시형태에서, 항원을 발현하는 세포의 포식작용이 조직에서 감소된다. 일부 실시형태에서, 항원을 발현하는 세포의 세포자멸사가 조직에서 감소된다. 일부 실시형태에서, 조직은 대상에 존재하고, 항원은 대상의 자가 항원이다. 일부 실시형태에서, 대상은 자가면역 질환을 앓고 있다.
또 다른 양태에서, 자가면역 질환의 치료를 필요로 하는 대상에서 자가면역 질환을 치료하는 방법으로서, 본원에 기재된 바와 같은 IL-2 폴리펩타이드를 포함하는 면역접합체 분자의 유효량을 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 상기 치료는 자가 항원에 대한 선천성, 체액성 또는 세포 매개 면역 반응을 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 제2 요법의 병용투여를 추가로 포함한다.
도 1은, 본 개시내용의 일 실시형태에 따른 항체-사이토카인 면역접합체 분자의 개략도이다. 예시적인 실시형태에서, 면역접합체는 (i) 세포 효과를 매개할 수 있는 사이토카인 폴리펩타이드, (ii) (a) 사이토카인에 결합하여 사이토카인의 세포 효과를 저해하고, (b) 해당 환경 내 항원(예를 들어, TAA)에 결합할 수 있고, 이러한 결합 시 사이토카인을 방출할 수 있는 차폐 모이어티, (iii) 항원에 결합하여, 항원이 농축된 환경에 면역접합체를 고정시킬 수 있는 고정 모이어티; 및 (iv) 면역접합체의 (i), (ii) 및 (iii)에 기재된 부분을 연결하는 접합 모이어티를 포함한다.
도 2는, 본 개시내용의 일 실시형태에 따른 IL-2 함유 면역접합체 분자와, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)의 부재 또는 존재 하에서의 이러한 면역접합체의 작동에 대한 개략도이다. 이러한 예시적인 실시형태에서, 면역접합체는 (i) 면역글로불린 Fc 도메인의 N-말단에 융합된 항-IL-2/항-FAP 투인원 Fab 항체, (ii) 이러한 투인원 항체의 N-말단에 융합된 IL-2 폴리펩타이드, 및 (iii) 면역글로불린 Fc 도메인의 N-말단에 융합된 항-FAP 항체 또는 이의 결합 단편을 포함한다. 상단 패널은, 주변 환경에 FAP가 없는 경우, 분자내 상호작용의 우세로 인해 투인원 항체의 평형이 IL-2와의 결합 방향으로 이동함에 따라, IL-2가 세포 표면 수용체와 결합하는 것을 방지하고 IL-2 세포 효과를 저해함을 보여준다. 하단 패널은, FAP에 대한 항-FAP 항체의 결합을 통해 FAP가 농축된 환경에 고정되는 경우, 투인원 항체의 평형이 IL-2로부터의 해리 및 FAP와의 결합 방향으로 이동함에 따라, 결합된 IL-2가 방출되어 세포 표면 수용체와 결합하고 세포 효과를 유도함을 보여준다.
도 3a는, 스트렙타비딘 센서 상에 고정되고 생체층 간섭계로 측정된 비오틴화된(biotinylated) FAP에 대한 872-5로 지정된 항-FAP 항체의 결합 동역학을 보여준다. 872-5의 KD 값은 6.6 nM이었다.
도 3b는, 스트렙타비딘 센서 상에 고정되고 생체층 간섭계로 측정된 비오틴화된 FAP에 대한 872-59로 지정된 항-FAP 항체의 결합 동역학을 보여준다. 872-59의 KD 값은 15.5 nM이었다.
도 3c는, 스트렙타비딘 센서 상에 고정되고 생체층 간섭계로 측정된 비오틴화된 FAP에 대한 872-70으로 지정된 항-FAP 항체의 결합 동역학을 보여준다. 872-70의 KD 값은 <1 nM이었다.
도 4a는, 스트렙타비딘 센서 상에 고정되고 생체층 간섭계로 측정된 비오틴화된 IL-2에 대한 D002의 1가 Fab-Fc 융합체의 결합 동역학을 보여준다.
도 4b는, 평형 결합 분석으로 측정 시 D002와 IL-2의 상호작용에 대한 KD 값이 3.4 μM이었음을 보여준다.
도 4c는, 스트렙타비딘 센서 상에 고정되고 생체층 간섭계로 측정된 FAP에 대한 D002의 1가 Fab-Fc 융합체의 결합 동역학을 보여준다. D002와 FAP의 상호작용에 대한 KD 값은 50 nM이었다(데이터는 제시되지 않음).
도 5a는, 가용성 사이토카인 폴리펩타이드의 개략도이다.
도 5b 내지 도 5u는, 본 개시내용에 따른 상이한 분자 입체배치를 갖는 항체-사이토카인 면역접합체의 개략도이다. 특히, 도 5b는, 면역글로불린 Fc 도메인의 2개의 중쇄 단편 중 하나(예를 들어, Fc-놉)의 C-말단에 융합된 사이토카인 폴리펩타이드를 함유하는 면역접합체를 보여준다.
도 5c는, (a) 면역글로불린 Fc 도메인의 중쇄 단편 중 하나(예를 들어, Fc-홀)의 C-말단에 이의 중쇄 단편의 N-말단이 융합된 항-사이토카인/항-TAA 투인원 Fab 항체와, (b) 면역글로불린 Fc 도메인의 다른 하나의 중쇄 단편(예를 들어, Fc-놉)의 C-말단에 융합된 사이토카인 폴리펩타이드를 함유하는 면역접합체를 보여준다.
도 5d는, (a) 면역글로불린 Fc 도메인의 중쇄 단편 중 하나(예를 들어, Fc-홀)의 C-말단에 이의 중쇄 단편의 N-말단이 융합된 항-사이토카인/항-TAA 투인원 Fab 항체, (b) 면역글로불린 Fc 도메인의 2개의 중쇄 단편 중 다른 하나(예를 들어, Fc-놉)의 C-말단에 융합된 사이토카인 폴리펩타이드, 및 (c) 면역글로불린 Fc 도메인의 2개의 중쇄 단편 중 하나(예를 들어, Fc-놉)의 N-말단에 융합된 항-TAA scFv 항체를 함유하는 면역접합체를 보여준다.
도 5e는, (a) 면역글로불린 Fc 도메인의 중쇄 단편 중 하나(예를 들어, Fc-홀)의 C-말단에 이의 중쇄 단편의 N-말단이 융합된 항-사이토카인/항-TAA 투인원 Fab 항체와, (b) Fab 항체의 경쇄 단편의 N-말단에 융합된 사이토카인 폴리펩타이드를 함유하는 면역접합체를 보여준다.
도 5f는, (a) 면역글로불린 Fc 도메인의 중쇄 단편 중 하나(예를 들어, Fc-놉)의 C-말단에 이의 중쇄 단편의 N-말단이 융합된 항-사이토카인/항-TAA 투인원 Fab 항체, (b) 면역글로불린 Fc 도메인의 다른 하나의 중쇄 단편(예를 들어, Fc-홀)의 C-말단에 융합된 사이토카인 폴리펩타이드, 및 (c) 면역글로불린 Fc 도메인의 2개의 중쇄 단편 중 하나(예를 들어, Fc-놉)의 N-말단에 융합된 항-TAA 단일 도메인 항체를 함유하는 면역접합체를 보여준다.
도 5g는, (a) 면역글로불린 Fc 도메인의 중쇄 단편 중 하나(예를 들어, Fc-홀)의 N-말단에 이의 중쇄 단편의 C-말단이 융합된 항-사이토카인/항-TAA 투인원 scFv 항체, (b) 면역글로불린 Fc 도메인의 다른 하나의 중쇄 단편(예를 들어, Fc-놉)의 C-말단에 융합된 사이토카인 폴리펩타이드, 및 (c) 면역글로불린 Fc 도메인의 2개의 중쇄 단편 중 하나(예를 들어, Fc-놉)의 N-말단에 융합된 항-TAA Fab 항체를 함유하는 면역접합체를 보여준다.
도 5h는, (a) 면역글로불린 Fc 도메인의 2개의 중쇄 단편 중 하나(예를 들어, Fc-놉)의 C-말단에 이의 중쇄 단편의 N-말단이 융합된 항-사이토카인/항-TAA 투인원 Fab 항체, (b) Fab 항체의 경쇄 단편의 N-말단에 융합된 사이토카인 폴리펩타이드, 및 (c) 면역글로불린 Fc 도메인의 2개의 중쇄 단편 중 하나(예를 들어, Fc-홀)의 N-말단에 융합된 항-TAA scFv 항체를 함유하는 면역접합체를 보여준다.
도 5i는, (a) 면역글로불린 Fc 도메인의 2개의 중쇄 단편 중 하나(예를 들어, Fc-홀)의 C-말단에 이의 중쇄 단편의 N-말단이 융합된 항-사이토카인/항-TAA 투인원 Fab 항체, (b) 면역글로불린 Fc 도메인의 다른 하나의 중쇄 단편(예를 들어, Fc-놉)의 C-말단에 융합된 사이토카인 펩타이드, 및 (c) 면역글로불린 Fc 도메인의 2개의 중쇄 단편 중 하나(예를 들어, Fc-놉)의 N-말단에 융합된 항-TAA Fab 항체를 함유하는 면역접합체를 보여준다.
도 5j는, (a) 면역글로불린 Fc 도메인의 2개의 중쇄 단편 중 하나(예를 들어, Fc-홀)의 C-말단에 이의 중쇄 단편의 N-말단이 융합된 항-사이토카인/항-TAA 투인원 Fab 항체, (b) Fab 항체의 경쇄 단편의 N-말단에 융합된 사이토카인 펩타이드, 및 (c) 면역글로불린 Fc 도메인의 2개의 중쇄 단편 중 하나(예를 들어, Fc-놉)의 N-말단에 융합된 항-TAA scFv 항체를 함유하는 면역접합체를 보여준다.
도 5k는, (a) 면역글로불린 Fc 도메인의 중쇄 단편 중 하나(예를 들어, Fc-놉)의 N-말단에 이의 중쇄 단편의 C-말단이 융합된 항-사이토카인/항-TAA 투인원 Fab 항체, (b) Fab 항체의 중쇄 단편의 N-말단에 융합된 사이토카인 펩타이드, 및 (c) 면역글로불린 Fc 도메인의 다른 하나의 중쇄(예를 들어, Fc-홀)의 N-말단에 이의 중쇄 단편의 C-말단이 융합된 항-TAA Fab 항체를 함유하는 면역접합체를 보여준다.
도 5l은, (a) 면역글로불린 Fc 도메인의 중쇄 단편 중 하나(예를 들어, Fc-홀)의 C-말단에 이의 중쇄 단편의 N-말단이 융합된 항-사이토카인/항-TAA 투인원 Fab 항체, (b) 면역글로불린 Fc 도메인의 다른 하나의 중쇄 단편(예를 들어, Fc-놉)의 C-말단에 융합된 사이토카인 폴리펩타이드, 및 (c) 면역글로불린 Fc 도메인의 2개의 중쇄 단편 중 하나(예를 들어, Fc-홀)의 N-말단에 융합된 항-TAA scFv 항체를 함유하는 면역접합체를 보여준다.
도 5m은, (a) 면역글로불린 Fc 도메인의 중쇄 단편 중 하나(예를 들어, Fc-홀)의 C-말단에 이의 중쇄 단편의 N-말단이 융합된 항-사이토카인/항-TAA 투인원 Fab 항체, (b) 면역글로불린 Fc 도메인의 다른 하나의 중쇄 단편(예를 들어, Fc-놉)의 C-말단에 융합된 사이토카인 펩타이드, 및 (c) 항-사이토카인/항-TAA 투인원 Fab 항체의 중쇄 단편의 C-말단에 융합된 항-TAA scFv 항체를 함유하는 면역접합체를 보여준다.
도 5n은, (a) 면역글로불린 Fc 도메인의 중쇄 단편 중 하나(예를 들어, Fc-홀)의 N-말단에 이의 중쇄 단편의 C-말단이 융합된 항-사이토카인/항-TAA 투인원 Fab 항체, (b) Fab 항체의 중쇄 단편의 N-말단에 융합된 사이토카인 펩타이드, 및 (c) 면역글로불린 Fc 도메인의 다른 하나의 중쇄 단편(예를 들어, Fc-놉)의 N-말단에 이의 중쇄 단편의 C-말단이 융합된 항-TAA Fab 항체를 함유하는 면역접합체를 보여준다.
도 5o는, (a) 면역글로불린 Fc 도메인의 중쇄 단편 중 하나(예를 들어, Fc-놉)의 N-말단에 이의 중쇄 단편의 C-말단이 융합된 항-사이토카인/항-TAA 투인원 Fab 항체, (b) Fab 항체의 중쇄 단편의 N-말단에 융합된 사이토카인 펩타이드, 및 (c) 면역글로불린 Fc 도메인의 2개의 중쇄 단편 중 다른 하나(예를 들어, Fc-홀)의 N-말단에 융합된 항-TAA 단일 도메인 항체를 함유하는 면역접합체를 보여준다.
도 5p는, (a) 면역글로불린 Fc 도메인의 중쇄 단편 중 하나(예를 들어, Fc-놉)의 N-말단에 이의 중쇄 단편의 C-말단이 융합된 항-사이토카인/항-TAA 투인원 Fab 항체, (b) Fab 항체의 중쇄 단편의 N-말단에 융합된 사이토카인 펩타이드, 및 (c) 면역글로불린 Fc 도메인의 2개의 중쇄 단편 중 다른 하나(예를 들어, Fc-홀)의 N-말단에 융합된 항-TAA scFv 항체를 함유하는 면역접합체를 보여준다.
도 5q는, (a) 면역글로불린 Fc 도메인의 중쇄 단편 중 하나(예를 들어, Fc-홀)의 N-말단에 이의 중쇄 단편의 C-말단이 융합된 항-사이토카인/항-TAA 투인원 Fab 항체, (b) Fab 항체의 중쇄 단편의 N-말단에 융합된 사이토카인 펩타이드, 및 (c) 면역글로불린 Fc 도메인의 2개의 중쇄 단편 중 다른 하나(예를 들어, Fc-놉)의 N-말단에 융합된 항-TAA scFv 항체를 함유하는 면역접합체를 보여준다.
도 5r은, (a) 면역글로불린 Fc 도메인의 중쇄 단편 중 하나(예를 들어, Fc-홀)의 N-말단에 이의 중쇄 단편의 C-말단이 융합된 항-사이토카인/항-TAA 투인원 Fab 항체, (b) Fab 항체의 경쇄 단편의 N-말단에 융합된 사이토카인 펩타이드, 및 (c) 면역글로불린 Fc 도메인의 2개의 중쇄 단편 중 다른 하나(예를 들어, Fc-놉)의 N-말단에 융합된 항-TAA scFv 항체를 함유하는 면역접합체를 보여준다.
도 5s는, (a) 면역글로불린 Fc 도메인의 중쇄 단편 중 하나(예를 들어, Fc-놉)의 N-말단에 이의 중쇄 단편의 C-말단이 융합된 항-사이토카인/항-TAA 투인원 Fab 항체, (b) Fab 항체의 경쇄 단편의 N-말단에 융합된 사이토카인 펩타이드, 및 (c) 면역글로불린 Fc 도메인의 2개의 중쇄 단편 중 다른 하나(예를 들어, Fc-홀)의 N-말단에 융합된 항-TAA scFv 항체를 함유하는 면역접합체를 보여준다.
도 5t는, (a) 면역글로불린 Fc 도메인의 중쇄 단편 중 하나(예를 들어, Fc-놉)의 N-말단에 이의 중쇄 단편의 C-말단이 융합된 항-사이토카인/항-TAA 투인원 Fab 항체, (b) 면역글로불린 Fc 도메인의 다른 하나의 중쇄 단편(예를 들어, Fc-홀)의 N-말단에 이의 중쇄 단편의 C-말단이 융합된 항-TAA Fab 항체, 및 (c) Fab 항체의 중쇄 단편의 N-말단에 융합된 사이토카인 펩타이드를 함유하는 면역접합체를 보여준다.
도 5u는, (a) 면역글로불린 Fc 도메인의 중쇄 단편 중 하나(예를 들어, Fc-놉)의 N-말단에 이의 중쇄 단편의 C-말단이 융합된 항-사이토카인/항-TAA 투인원 Fab 항체와, (b) Fab 항체의 중쇄 단편의 N-말단에 융합된 사이토카인 펩타이드를 함유하는 면역접합체를 보여준다.
도 6a는, TOSH SW3000 컬럼이 장착된 HPLC로 측정된, 아이소타입 대조군 항체(DP47GS), 입체배치 2를 갖는 면역접합체 분자(FB-225) 및 네이키드 사이토카인(Knob-IL2hex)의 균질성을 보여준다. 도면에 제시된 바와 같이, 네이키드 사이토카인(Knob-IL2hex)을 사이토카인을 안정화시키는 IL-2 결합 항체를 함유하는 면역접합체(FB-255)와 비교하면 균질성이 유의하게 개선되었다.
도 6b는, 시차 주사 형광측정법으로 측정된, 대조군 항체(DP47GS), 입체배치 2를 갖는 면역접합체 분자(FB-FB225) 및 네이키드 사이토카인(Knob-IL2hex)의 열안정성을 보여준다. 53℃에서의 피크는 유의하게 우측으로 이동한 IL-2hex(IL-2헥스)의 변성을 나타내며, 이는 IL-2가 면역사이토카인 분자(FB-225) 형태의 투인원 차폐 항체에 의해 안정화되었음을 나타낸다.
도 6c는, 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 사용하여 측정된, 본원에 기재된 바와 같은 IL-2 함유 면역접합체의 가속화된 안정성을 보여준다. 도면에 제시된 바와 같이, 단백질은 40℃에서 4주 보관 후 또는 5회의 동결-해동 주기 후 안정적으로 유지되었다.
도 7a는, 다양한 투여량의 단회 투여로 마우스에 투여 시, 각각, 네이키드 사이토카인(Knob-IL2hex) 대조군, 입체배치 2를 갖는 면역접합체 분자(FB-476) 및 입체배치 20을 갖는 면역접합체 분자(FB-559)의 약동학을 보여준다. 단백질 농도는 항-인간 Fc ELISA로 측정하였다.
도 7b는, 도 5c에 제시된 바와 같은 입체배치 2를 갖는 면역사이토카인 FB-476의 개략도이다. FB-476은 IL2hex에 대한 친화도 KD가 약 20 nM인 항-사이토카인/항-hFAP 투인원 Fab 항체 D047을 함유한다.
도 7c는, 도 5u에 제시된 바와 같은 입체배치 20을 갖는 면역사이토카인 FB-559의 개략도이다. FB-559는 IL2hex에 대한 친화도 KD가 약 400 nM인 항-사이토카인/항-hFAP 투인원 Fab 항체 D029 돌연변이체를 함유한다.
도 8a는, 각각, 도 6b와 도 6c에 제시된 입체배치 1(원) 또는 입체배치 2(삼각형, 역삼각형, 다이아몬드 및 좌향 삼각형)를 갖는 IL-2 함유 면역접합체의 존재 하에서 IL-2 리포터 세포주를 사용하여 측정된 IL-2 활성을 보여준다. 네이키드 IL-2(정사각형)의 존재 하에서 수행된 검정을 양성 대조군으로 포함시켰다. X축은 IL-2 또는 IL-2 함유 면역접합체의 농도(pM)를 나타내고, Y축은 TECAN 플레이트 판독기를 사용하여 측정된 635 nm에서의 흡광도(A635)(이는 분비된 배아 알칼리성 포스파타아제(SEAP) 수준과 IL-2에 대한 반응을 반영함)를 나타낸다. 도 8b는, 본 개시내용에 따른 입체배치 1을 갖는 면역접합체 분자의 개략도이다. 도 8c는, 본 개시내용에 따른 입체배치 2를 갖는 면역접합체 분자의 개략도이다.
도 9a는, 각각, 도 7b, 도 7c 및 도 7d에 제시된 입체배치 1(정사각형), 입체배치 2(원) 또는 입체배치 4(삼각형)를 갖는 IL-2 함유 면역접합체의 존재 하에서 IL-2 리포터 세포주를 사용하여 측정된 IL-2 활성을 보여준다. X축은 IL-2 함유 면역접합체의 농도(pM)를 나타내고, Y축은 TECAN 플레이트 판독기를 사용하여 측정된 635 nm에서의 흡광도(A635)(이는 분비된 배아 알칼리성 포스파타아제(SEAP) 수준과 IL-2에 대한 반응을 반영함)를 나타낸다. 도 9b는, 본 개시내용에 따른 입체배치 1을 갖는 면역접합체 분자의 개략도이다. 도 9c는, 본 개시내용에 따른 입체배치 2를 갖는 면역접합체 분자의 개략도이다. 도 9d는, 본 개시내용에 따른 입체배치 4를 갖는 면역접합체 분자의 개략도이다.
도 10a는, 각각, 도 8b와 도 8c에 제시된 입체배치 1(흰색 정사각형) 또는 입체배치 2(X 표시가 있는 흰색 정사각형, 청색 정사각형, 분홍색 정사각형, 적색 정사각형)를 갖는 IL-2 함유 면역접합체의 존재 하에서 IL-2 리포터 세포주를 사용하여 측정된 IL-2 활성을 보여준다. 가용성 인간 섬유아세포 활성화 단백질(hFAP)의 존재(분홍색 정사각형, 적색 정사각형) 또는 부재(흰색 정사각형, X 표시가 있는 흰색 정사각형, 청색 정사각형) 하에서 검정을 수행하였다. 네이키드 IL-2의 존재 하에서 수행된 검정(검은색 정사각형)을 양성 대조군으로 포함시켰고, 가용성 FAP는 존재하지만 면역접합체 분자는 없이 수행된 검정(파선이 있는 흰 정사각형)을 음성 대조군으로 포함시켰다. X축은 IL-2 함유 면역접합체의 농도(pM)를 나타내고, Y축은 TECAN 플레이트 판독기를 사용하여 측정된 635 nm에서의 흡광도(A635)(이는 분비된 배아 알칼리성 포스파타아제(SEAP) 수준과 IL-2에 대한 반응을 반영함)를 나타낸다. 도 10b는, 본 개시내용에 따른 입체배치 1을 갖는 면역접합체 분자의 개략도이다. 도 10c는, 본 개시내용에 따른 입체배치 2를 갖는 면역접합체 분자의 개략도이다.
도 11a는, 각각, 도 9b와 도 9c에 제시된 입체배치 1(정사각형) 또는 입체배치 3(삼각형; 원)을 갖는 IL-2 함유 면역접합체의 존재 하에서 IL-2 리포터 세포주를 사용하여 측정된 IL-2 활성을 보여준다. 세포 표면에서 인간 섬유아세포 활성화 단백질(hFAP)을 발현하는 세포의 존재(삼각형) 또는 부재(정사각형, 원) 하에서 검정을 수행하였다. X축은 IL-2 함유 면역접합체의 농도(pM)를 나타내고, Y축은 TECAN 플레이트 판독기를 사용하여 측정된 635 nm에서의 흡광도(A635)(이는 분비된 배아 알칼리성 포스파타아제(SEAP) 수준과 IL-2에 대한 반응을 반영함)를 나타낸다. 도 11b는, 본 개시내용에 따른 입체배치 1을 갖는 면역접합체 분자의 개략도이다. 도 11c는, 본 개시내용에 따른 입체배치 3을 갖는 면역접합체 분자의 개략도이다.
도 11d는, 각각, 도 9b와 도 9c에 제시된 입체배치 1(정사각형) 또는 입체배치 3(삼각형; 원)을 갖는 IL-2 함유 면역접합체의 존재 하에서 IL-2 리포터 세포주를 사용하여 측정된 IL-2 활성을 보여준다. 세포 표면에서 인간 섬유아세포 활성화 단백질(hFAP)을 발현하는 세포의 존재(청색 삼각형, 적색 삼각형, 크기 1 내지 4의 육각형) 또는 부재(정사각형, 원) 하에서, 가용성 FAP 분자의 존재(적색 삼각형, 크기 1 내지 4의 육각형) 또는 부재(정사각형, 원, 삼각형, 역삼각형) 하에서 검정을 수행하였다. X축은 IL-2 함유 면역접합체의 농도(pM)를 나타내고, Y축은 TECAN 플레이트 판독기를 사용하여 측정된 635 nm에서의 흡광도(A635)(이는 분비된 배아 알칼리성 포스파타아제(SEAP) 수준과 IL-2에 대한 반응을 반영함)를 나타낸다.
도 11e는, 각각, 도 9b와 도 9c에 제시된 입체배치 1(정사각형) 또는 입체배치 3(삼각형; 원)을 갖는 IL-2 함유 면역접합체의 존재 하에서 IL-2 리포터 세포주를 사용하여 측정된 IL-2 활성을 보여준다. 세포 표면에서 인간 섬유아세포 활성화 단백질(hFAP)을 발현하는 세포의 존재(아래쪽 삼각형, 다이아몬드, 오각형, 육각형) 또는 부재(정사각형, 원, 삼각형) 하에서, 가용성 항체의 존재(다이아몬드, 오각형, 육각형) 또는 부재(정사각형, 원, 삼각형, 역삼각형) 하에서 검정을 수행하였다. X축은 IL-2 함유 면역접합체의 농도(pM)를 나타내고, Y축은 TECAN 플레이트 판독기를 사용하여 측정된 635 nm에서의 흡광도(A635)(이는 분비된 배아 알칼리성 포스파타아제(SEAP) 수준과 IL-2에 대한 반응을 반영함)를 나타낸다.
도 12a는, 각각, 도 10b와 도 10c에 제시된 입체배치 1(검은색 정사각형; 흰색 정사각형) 또는 입체배치 2(검은색 삼각형; 흰색 삼각형)를 갖는 IL-2 함유 면역접합체의 존재 하에서 IL-2 리포터 세포주를 사용하여 측정된 IL-2 활성을 보여준다. 변형되지 않은 HEK293T 세포의 존재(검은색 정사각형, 흰색 정사각형, 흰색 삼각형) 또는 세포 표면에서 인간 섬유아세포 활성화 단백질(hFAP)을 발현하는 HEK293T 세포의 존재(검은색 삼각형) 하에서 검정을 수행하였다. X축은 IL-2 함유 면역접합체의 농도(pM)를 나타내고, Y축은 TECAN 플레이트 판독기를 사용하여 측정된 635 nm에서의 흡광도(A635)(이는 분비된 배아 알칼리성 포스파타아제(SEAP) 수준과 IL-2에 대한 반응을 반영함)를 나타낸다. 도 12b는, 본 개시내용에 따른 입체배치 1을 갖는 면역접합체 분자의 개략도이다. 도 12c는, 본 개시내용에 따른 입체배치 2를 갖는 면역접합체 분자의 개략도이다.
도 13a는, 도 13b에 제시된 입체배치 3을 갖는 IL-2 함유 면역접합체의 존재 하에서 IL-2 리포터 세포주를 사용하여 측정된 IL-2 활성을 보여준다. 세포 표면에서 인간 섬유아세포 활성화 단백질(hFAP)을 발현하는 세포의 존재(실선, 흰색 원 및 흰색 삼각형) 또는 부재(실선, 검은색 원 및 검은색 삼각형) 하에서 검정을 수행하였다. X축은 IL-2 함유 면역접합체의 농도(pM)를 나타내고, Y축은 TECAN 플레이트 판독기를 사용하여 측정된 635 nm에서의 흡광도(A635)(이는 분비된 배아 알칼리성 포스파타아제(SEAP) 수준과 IL-2에 대한 반응을 반영함)를 나타낸다. 시험된 두 가지 면역접합체 분자(FB-387과 FB-392)는 동일한 투인원 Fab D029를 함유하며 입체배치 3을 가지고 있었다. FB-387의 고정 모이어티는 hFAP에 대한 KD가 약 5 nM이고 D029와 상이한 hFAP의 에피토프에 결합하는 scFv5였고, FB-392의 고정 모이어티는 hFAP에 대한 KD가 약 1 nM이고 D029와 동일한 hFAP의 에피토프에 결합하는 scFv70이었다. 두 가지 분자는 hFAP 발현 세포의 존재 또는 부재 하에서 유사한 활성을 나타냈다.
도 13b는, 본 개시내용에 따른 입체배치 3을 갖는 면역접합체 분자의 개략도를 보여준다.
도 14는, 본 개시내용의 면역접합체 분자에 함유된 IL-2의 가용성 FAP 유도 차폐 해제(de-shielding)에 대한 개략도이다. 2개의 FAP 결합 모이어티(고정 모이어티와 투인원 차폐 모이어티)의 동시 결합은 차폐 모이어티로부터 사이토카인 펩타이드의 해리를 가능하게 하여, 도면에 제시된 인간 IL-2/Fab 복합체인 5UTZ에 결합할 수 있게 한다.
도 15는, 4가지 면역접합체 분자 FB-604, FB-675, FB-676 및 FB-626에서 차폐 해제된 IL2hex에 대한 고정된 5UTZ의 생체층 간섭계(Biolayer interferometry, BLI) 결합 곡선을 보여준다.
도 16은, 가용성 Fc-hFAP과 Knob-IL2hex에 대한 고정된 5UTZ 분자의 생체층 간섭계(BLI) 결합 곡선을 보여준다.
도 17a는, 가용성 Fc-hFAP의 존재 하에서는 고정된 5UTZ 분자에 결합할 수 있었지만, 가용성 Fc-hFAP의 부재 하에서는 결합할 수 없었던 면역접합체 분자 FB-604의 생체층 간섭계(BLI) 곡선을 보여준다.
도 17b는, 입체배치 2를 갖는 면역접합체 분자 FB-604의 개략도이다. FB-604 내 투인원 항체는 약 1.53 nM의 KD 값으로 FAP에 결합하고, 약 1.59 μM의 KD 값으로 IL2hex에 결합한다.
도 18a는, 가용성 Fc-hFAP의 존재 하에서는 고정된 5UTZ 분자에 결합할 수 있었지만, 가용성 Fc-hFAP의 부재 하에서는 결합할 수 없었던 면역접합체 분자 FB-675의 생체층 간섭계(BLI) 곡선을 보여준다.
도 18b는, 입체배치 3을 갖는 면역접합체 분자 FB-675의 개략도이다. FB-675 내 투인원 항체는 약 3.66 nM의 KD 값으로 FAP에 결합하고, 약 217 nM의 KD 값으로 IL2hex에 결합한다. FB-675의 고정 모이어티는 약 5 nM의 KD 값으로 FAP에 결합한다.
도 19a는, 가용성 Fc-hFAP의 존재 하에서는 고정된 5UTZ 분자에 결합할 수 있었지만, 가용성 Fc-hFAP의 부재 하에서는 결합할 수 없었던 면역접합체 분자 FB-676의 생체층 간섭계(BLI) 곡선을 보여준다.
도 19b는, 입체배치 3을 갖는 면역접합체 분자 FB-676의 개략도이다. FB-675 내 투인원 항체는 약 1.53 nM의 KD 값으로 FAP에 결합하고, 약 1.59 μM의 KD 값으로 IL2hex에 결합한다. 고정 모이어티는 약 5 nM의 KD 값으로 FAP에 결합한다.
도 20a는, 가용성 Fc-hFAP의 존재 또는 부재에 관계없이 고정된 5UTZ 분자에 결합할 수 없었던 면역접합체 분자 FB-626의 생체층 간섭계(BLI) 곡선을 보여준다.
도 20b는, 입체배치 14를 갖는 면역접합체 분자 FB-626의 개략도이다. FB-626 내 투인원 항체는 약 5 μM 초과의 KD 값으로 FAP에 결합하고, 약 237 μM의 KD 값으로 IL2hex에 결합한다.
도 21a는, 도 21b와 도 21c에 제시된 입체배치 1(정사각형) 또는 입체배치 3(검은색 원, 검은색 삼각형, 흰색 원, 흰색 삼각형)을 갖는 IL-2 함유 면역접합체의 존재 하에서 IL-2 리포터 세포주를 사용하여 측정된 IL-2 활성을 보여준다. 세포 표면에서 인간 섬유아세포 활성화 단백질(hFAP)을 발현하는 HEK293T 세포의 존재(흰색 원, 흰색 삼각형) 또는 부재(정사각형, 검은색 원, 검은색 삼각형) 하에서 검정을 수행하였다. X축은 IL-2 함유 면역접합체의 농도(pM)를 나타내고, Y축은 TECAN 플레이트 판독기를 사용하여 측정된 635 nm에서의 흡광도(A635)(이는 분비된 배아 알칼리성 포스파타아제(SEAP) 수준과 IL-2에 대한 반응을 반영함)를 나타낸다. 도 21b는, 본 개시내용에 따른 입체배치 1을 갖는 면역접합체 분자의 개략도이다. 도 21c는, 본 개시내용에 따른 입체배치 3을 갖는 면역접합체 분자의 개략도이다.
도 22a는, FAP 발현 세포 HEK 293T-hFAP-E5의 존재 또는 부재 하에서 IL-2 리포터 세포주를 사용하여 측정된 IL-2 활성을 보여준다. 시험된 두 가지 면역접합체 분자는 모두 도 22b에 제시된 바와 같은 입체배치 3을 갖고, scFv872-5를 갖는 동일한 고정 모이어티를 함유하고 있었다. 시험된 두 가지 면역접합체 분자는, 각각, D001과 D002의 투인원 항체를 함유하는 상이한 차폐 모이어티를 가지고 있었다. 도면에 제시된 바와 같이, 두 가지 면역접합체 분자는 hFAP 발현 세포의 부재 하에서 사이토카인에 대해 유사한 차폐 효과를 나타냈다. 나아가, 두 가지 면역접합체 분자는 모두 hFAP 발현 세포의 존재 하에서 사이토카인 활성을 차폐 해제하고 활성화시킬 수 있었다.
도 22b는, 본 개시내용에 따른 입체배치 3을 갖는 면역접합체 분자의 개략도이다.
도 23a는, FAP 발현 세포 HEK 293T-hFAP-E5의 존재 또는 부재 하에서 IL-2 리포터 세포주를 사용하여 측정된 IL-2 활성을 보여준다. 시험된 두 가지 면역접합체 분자는 모두 도 23b에 제시된 바와 같은 입체배치 3을 갖고, scFv872-59를 포함하는 동일한 고정 모이어티를 함유하고 있었다. 시험된 두 가지 면역접합체 분자는, 각각, D001과 D002의 투인원 항체를 함유하는 상이한 차폐 모이어티를 가지고 있었다. 도면에 제시된 바와 같이, 두 가지 면역접합체 분자는 hFAP 발현 세포의 부재 하에서 사이토카인에 대해 유사한 차폐 효과를 나타냈다. 나아가, 두 가지 면역접합체 분자는 모두 hFAP 발현 세포의 존재 하에서 사이토카인 활성을 차폐 해제하고 활성화시킬 수 있었다.
도 23b는, 본 개시내용에 따른 입체배치 3을 갖는 면역접합체 분자의 개략도이다.
도 24a는, FAP 발현 세포 HEK 293T-hFAP-E5의 존재 또는 부재 하에서 IL-2 리포터 세포주를 사용하여 측정된 IL-2 활성을 보여준다. 시험된 두 가지 면역접합체 분자는 모두 도 24b에 제시된 바와 같은 입체배치 3을 갖고, scFv872-70을 포함하는 동일한 고정 모이어티를 함유하고 있었다. 시험된 두 가지 면역접합체 분자는, 각각, D001과 D002의 투인원 항체를 함유하는 상이한 차폐 모이어티를 가지고 있었다. 도면에 제시된 바와 같이, 두 가지 면역접합체 분자는 hFAP 발현 세포의 부재 하에서 사이토카인에 대해 유사한 차폐 효과를 나타냈다. 나아가, 두 가지 면역접합체 분자는 모두 hFAP 발현 세포의 존재 하에서 사이토카인 활성을 차폐 해제하고 활성화시킬 수 있었다.
도 24b는, 본 개시내용에 따른 입체배치 3을 갖는 면역접합체 분자의 개략도이다.
도 25a는, 각각, 도 12b와 도 12c에 제시된 입체배치 1(원, 정사각형) 또는 입체배치 5(흰색 다이아몬드, 검은색 다이아몬드)를 갖는 IL-2 함유 면역접합체의 존재 하에서 IL-2 리포터 세포주를 사용하여 측정된 IL-2 활성을 보여준다. 세포 표면에서 인간 섬유아세포 활성화 단백질(hFAP)을 발현하는 HEK293T 세포의 존재(검은색 다이아몬드) 또는 부재(정사각형, 원, 흰색 다이아몬드) 하에서 검정을 수행하였다. X축은 IL-2 함유 면역접합체의 농도(pM)를 나타내고, Y축은 TECAN 플레이트 판독기를 사용하여 측정된 635 nm에서의 흡광도(A635)(이는 분비된 배아 알칼리성 포스파타아제(SEAP) 수준과 IL-2에 대한 반응을 반영함)를 나타낸다. 도 25b는, 본 개시내용에 따른 입체배치 1을 갖는 면역접합체 분자의 개략도이다. 도 25c는, 본 개시내용에 따른 입체배치 5를 갖는 면역접합체 분자의 개략도이다.
도 26a는, 각각, 도 13b와 도 13c에 제시된 입체배치 1(원, 정사각형) 또는 입체배치 6(흰색 다이아몬드, 흰색 삼각형, 흰색 좌향 삼각형, 검은색 다이아몬드, 검은색 역삼각형, 검은색 좌향 삼각형)을 갖는 IL-2 함유 면역접합체의 존재 하에서 IL-2 리포터 세포주를 사용하여 측정된 IL-2 활성을 보여준다. 세포 표면에서 인간 섬유아세포 활성화 단백질(hFAP)을 발현하는 HEK293T 세포의 존재(흰색 다이아몬드, 흰색 역삼각형, 흰색 좌향 삼각형) 또는 부재(정사각형, 원, 검은색 다이아몬드, 검은색 삼각형, 검은색 좌향 삼각형) 하에서 검정을 수행하였다. X축은 IL-2 함유 면역접합체의 농도(pM)를 나타내고, Y축은 TECAN 플레이트 판독기를 사용하여 측정된 635 nm에서의 흡광도(A635)(이는 분비된 배아 알칼리성 포스파타아제(SEAP) 수준과 IL-2에 대한 반응을 반영함)를 나타낸다. 도 26b는, 본 개시내용에 따른 입체배치 1을 갖는 면역접합체 분자의 개략도이다. 도 26c는, 본 개시내용에 따른 입체배치 6을 갖는 면역접합체 분자의 개략도이다. 도 26d는, 본 연구의 검정에 대한 정량화된 EC50(pM) 값을 보여주는 막대 그래프이다.
도 27a는, 두 가지 면역접합체 분자 FB-676과 FB-707에 대한, FAP 발현 세포 HEK 293T-hFAP-E5의 존재 또는 부재 하에서 IL-2 리포터 세포주를 사용하여 측정된 IL-2 활성을 보여준다. 차폐된 FB-676의 경우 EC50은 약 14 nM이었고, 차폐 해제된 FB-676의 경우는 약 40 pM이었으며, 차폐된 FB-707의 경우 EC50은 약 12 nM이었고, 차폐 해제된 FB-707의 경우는 약 11 pM이었다. IL-2 효능은 FAP 발현 세포의 부재 하에서와 비교하여 FAP 발현 세포의 존재 하에서 약 700배 내지 1000배 증가하였다.
도 27b는, 입체배치 15를 갖는 면역접합체 분자 FB-707의 개략도이다. FB-707 내 투인원 항체는 약 1.53 nM의 KD 값으로 FAP에 결합하고, 약 1.59 μM의 KD 값으로 IL2hex에 결합한다. 고정 모이어티는 약 5 nM의 KD 값으로 FAP에 결합한다.
도 27c는, 입체배치 3을 갖는 면역접합체 분자 FB-676의 개략도이다. FB-675 내 투인원 항체는 약 1.53 nM의 KD 값으로 FAP에 결합하고, 약 1.59 μM의 KD 값으로 IL2hex에 결합한다. 고정 모이어티는 약 50 nM의 KD 값으로 FAP에 결합한다.
도 28a는, pSTAT5 염색 검정을 사용하여 측정된 본 개시내용의 면역접합체 분자에 의한 인간 CD4+ T세포 활성화를 보여준다. 사전 활성화된 인간 CD4+ 세포를 자극시키는 면역접합체 분자 FB-604, FB-674, FB-675 및 FB-676의 능력을 200 nM Fc-hFAP의 존재 또는 부재 하에서 측정하였다. 도면에 제시된 바와 같이, IL2hex의 효능은 고정 모이어티를 갖지 않는 면역접합체 분자 FB-604를 이용한 경우 약 2배 증가했으며, 고정 모이어티를 갖는 모든 다른 시험된 면역접합체 분자의 경우에는 약 10배 증가하였다.
도 28b는, pSTAT5 염색 검정을 사용하여 측정된 본 개시내용의 면역접합체 분자에 의한 인간 CD4+ T세포 활성화를 보여준다. 사전 활성화된 인간 CD4+ 세포를 자극시키는 면역접합체 분자 FB-801, FB-794, FB-818 및 FB-834의 능력을 200 nM Fc-hFAP의 존재 또는 부재 하에서 측정하였다. 도면에 제시된 바와 같이, IL2hex의 효능은 고정 모이어티를 갖는 모든 시험된 면역접합체 분자에 대해 약 30배 증가하였다.
도 29a는, pSTAT5 염색 검정을 사용하여 측정된 본 개시내용의 면역접합체 분자에 의한 인간 CD4+ T세포 활성화를 보여준다. 사전 활성화된 인간 CD4+ 세포를 자극시키는 면역접합체 분자 FB-611, FB-610, FB-609, FB-608, FB-607, FB-601, FB-600, FB-599, FB-598, FB-676, FB-675, FB-674 및 FB-604의 능력을 200 nM Fc-hFAP의 존재 또는 부재 하에서 측정하였다.
도 29b는, 도 Q-A의 검정으로 측정된 EC50 값의 정량을 보여준다.
도 30은, 사망(좌측)과 체중 손실(우측)로 측정된 C57BL/6J 마우스와 CB-17 SCID 마우스에 대한 Knob-IL2hex의 급성 독성을 보여준다.
도 31a는, 4가지 단백질 샘플인 대조군(Knob-IL2hex, MW=66.8 kDa), FB-439(MW=92.3 kDa), FB-449(MW=120 kDa), 및 FB-476(MW=116 kDa)에 대한, 비환원 및 환원 SDS-PAGE 겔에서의 정제된 면역접합체 분자를 보여준다.
도 31b 내지 도 31d는, 각각, CTLL2 증식 검정, NK92 증식 검정 및 HEK Blue IL-2 활성화 검정으로 측정된 면역접합체 분자 FB-439, FB-449 및 FB-476의 효능을 보여준다.
도 31e는, Alarma Blue 형광으로 측정된 본 개시내용의 면역접합체 분자에 의한 인간 CD4+ T세포 증식을 보여준다. 사전 활성화된 인간 CD4+ 세포를 자극시키는 면역접합체 분자 FB-794의 능력을 200 nM Fc-hFAP의 존재 또는 부재 하에서 측정하고, 표면에 hFAP 수용체가 있거나 없는 40k 고정된 ExpiCHO 세포와 함께 공동 배양하였다.
도 32a는, 면역접합체 분자인 대조군(Knob-IL2hex), FB-439, FB-449, FB-476를 투여한 마우스에서의 사망(좌측)과 체중 손실(우측)의 측정을 보여준다.
도 32b는, 면역접합체 분자 sKnob-IL2hex(대조군), FB-439, FB-476 또는 PBS(대조군)를 투여한 마우스에서의 체중 손실 측정을 보여준다.
도 33a는, IL-2R α, β 및 γ 서브유닛과 결합하는 IL-2 분자의 3D 예시이다(PDB: 2ERJ).
도 33b와 도 33c는, 각각, 2개의 다른 IL-2 항체(즉, IL-2Rβ(CD122)에 대한 IL-2 결합을 차단하는 5UTZ와, IL-2Rα(CD25)에 대한 IL-2 결합을 차단하는 NARA1)와 비교한, IL-2와 FAP에 대한 투인원 항체(B10)의 결합 동역학을 보여준다. B10은 NARA1과 중첩되는 에피토프의 IL-2에 결합하지만, 5UTZ와 중첩되는 에피토프에는 결합하지 않는다.
도 34a는, 면역접합체 분자 FB-1097에 대한, FAP 발현 세포의 존재 또는 부재 하에서 IL-2 리포터 세포주를 사용하여 측정된 IL-2 활성을 보여준다. 시험된 면역접합체는 도 34b에 제시된 바와 같은 입체배치 15를 가지고 있었다. 면역접합체는 IL-2에 점 돌연변이(T3A, K35E, F42A, Y45A, L72G, C125S)를 함유하고 있었다. 면역접합체는 또한 차폐 모이어티로서 D029 Fab의 변이체를 함유하고 고정 모이어티로서 scFv 872-5의 변이체를 함유하고 있었다. 야생형 IL-2(검은색 원)와 돌연변이형 IL-2hex(정사각형)를 모두 포함하는 입체배치 1을 갖는 IL-2 Fc 융합 단백질을 대조군으로 포함시켰다. 세포 표면에서 인간 섬유아세포 활성화 단백질(hFAP)을 발현하는 세포의 존재(HEK 293T-hFAP-E5, 삼각형), 또는 FAP을 발현하지 않는 세포의 존재(HEK 293T, 역삼각형) 하에서 검정을 수행하였다. X축은 IL-2 함유 면역접합체의 농도(pM)를 나타내고; Y축은 TECAN 플레이트 판독기를 사용하여 측정된 면역접합체의 활성(이는 분비된 배아 알칼리성 포스파타아제(SEAP) 수준과 IL-2에 대한 반응을 반영함)을 나타낸다. 도 34c는, 비히클(PBS), CTRL-IL2hex, 55 μg FB-1097 또는 220 μg FB1097을 투여한 C57BL/6 마우스의 MC38-FAP 종양 모델에서의 종양 크기와 체중을 보여준다.
도 34d는, 비히클(PBS), 12.5 μg CTRL-IL2WT, 12.5 μg CTRL-IL2hex 또는 220 μg FB-1097을 투여한 C57BL/6 마우스의 MC38-FAP 종양 모델에서의 CD3+CD4+ 세포, CD3+CD8+ 세포 및 NK세포의 전신 확장을 보여준다. 도 34e는, 비히클(PBS), 12.5 μg CTRL-IL2WT, 12.5 μg CTRL-IL2hex 또는 220 μg FB-1097을 투여한 C57BL/6 마우스의 MC38-FAP 종양 모델에서의 폐 중량을 보여준다.
도 35a는, 면역접합체 분자 #1112에 대한, FAP 발현 세포의 존재 또는 부재 하에서 IL-2 리포터 세포주를 사용하여 측정된 IL-2 활성을 보여준다. 시험된 면역접합체는 도 35b에 제시된 바와 같은 입체배치 14를 가지고 있었다. 면역접합체는 IL-2에 점 돌연변이(T3A, K35E, F42A, C125S)를 함유하고 있었다. 면역접합체는 또한 차폐 모이어티 D029H 및 D029L과 고정 모이어티 VHH-E33을 함유하고 있었다. 야생형 IL-2(원)와 돌연변이형 IL-2hex(검은색 정사각형)를 모두 포함하는 입체배치 1을 갖는 IL-2 Fc 융합 단백질을 대조군으로 포함시켰다. 세포 표면에서 인간 섬유아세포 활성화 단백질(hFAP)을 발현하는 세포의 존재(HEK 293T-hFAP-E5, 흰색 정사각형), 또는 FAP을 발현하지 않는 세포의 존재(HEK 293T, 삼각형) 하에서 검정을 수행하였다. X축은 IL-2 함유 면역접합체의 농도(pM)를 나타내고, Y축은 TECAN 플레이트 판독기를 사용하여 측정된 면역접합체의 활성(이는 분비된 배아 알칼리성 포스파타아제(SEAP) 수준과 IL-2에 대한 반응을 반영함)을 나타낸다.
도 35c는, 비히클(PBS), 25 μg CTRL-IL2 F42A, 55 μg FB-1112 또는 220 μg FB-1112를 투여한 C57BL/6 마우스의 MC38-FAP 종양 모델에서의 종양 크기와 체중을 보여준다.
도 35d는, 비히클(PBS), 12.5 μg CTRL-IL2hex, 55 μg FB-1112 또는 220 μg FB-1112를 투여한 C57BL/6 마우스의 MC38-FAP 종양 모델에서의 CD3+CD4+ 세포, CD3+CD8+ 세포 및 NK세포의 전신 확장을 보여준다.
도 35e는, 비히클(PBS), 12.5 μg CTRL-IL2hex, 55 μg FB-1112 또는 220 μg FB-1112를 투여한 C57BL/6 마우스의 MC38-FAP 종양 모델에서의 폐 중량을 보여준다.
도 36a는, 면역접합체 분자 #1150에 대한, FAP 발현 세포의 존재 또는 부재 하에서 IL-2 리포터 세포주를 사용하여 측정된 IL-2 활성을 보여준다. 시험된 면역접합체는 도 36b에 제시된 바와 같은 입체배치 14를 가지고 있었다. 면역접합체는 또한 차폐 모이어티로서 항체 B10에서 유도된 Fab과 고정 모이어티로서 VHH-E33을 함유하고 있었다. 야생형 IL-2(검은색 원)와 돌연변이형 IL-2hex(흰색 원)를 모두 포함하는 입체배치 1을 갖는 IL-2 Fc 융합 단백질을 대조군으로 포함시켰다. 세포 표면에서 인간 섬유아세포 활성화 단백질(hFAP)을 발현하는 세포의 존재(B-MC38-FAP, 흰색 삼각형), 또는 FAP을 발현하지 않는 세포의 존재(MC38, 검은색 삼각형) 하에서 검정을 수행하였다. X축은 IL-2 함유 면역접합체의 농도(pM)를 나타내고, Y축은 TECAN 플레이트 판독기를 사용하여 측정된 면역접합체의 활성(이는 분비된 배아 알칼리성 포스파타아제(SEAP) 수준과 IL-2에 대한 반응을 반영함)을 나타낸다.
도 36c 내지 도 36d는, 비히클(PBS), 12.5 μg CTRL-IL2D20T 또는 55 μg FB-1150을 투여한 C57BL/6 마우스의 MC38-FAP 종양 모델에서 측정한 종양 크기(도 36c), 생존율(도 36d) 및 체중 변화(도 36e)를 보여준다.
도 37a는, 면역접합체 분자 #1125에 대한, FAP 발현 세포의 존재 또는 부재 하에서 IL-2 리포터 세포주를 사용하여 측정된 IL-2 활성을 보여준다. 시험된 면역접합체는 도 37b에 제시된 바와 같은 입체배치 14를 가지고 있었다. 면역접합체는 또한 차폐 모이어티로서 항체 B10에서 유도된 Fab과 고정 모이어티로서 scFv872-5를 함유하고 있었다. 야생형 IL-2(검은색 원)와 돌연변이형 IL-2hex(흰색 원)를 모두 포함하는 입체배치 1을 갖는 IL-2 Fc 융합 단백질을 대조군으로 포함시켰다. 세포 표면에서 인간 섬유아세포 활성화 단백질(hFAP)을 발현하는 세포의 존재(B-MC38-FAP, 흰색 삼각형), 또는 FAP을 발현하지 않는 세포의 존재(MC38, 검은색 삼각형) 하에서 검정을 수행하였다. X축은 IL-2 함유 면역접합체의 농도(pM)를 나타내고, Y축은 TECAN 플레이트 판독기를 사용하여 측정된 면역접합체의 활성(이는 분비된 배아 알칼리성 포스파타아제(SEAP) 수준과 IL-2에 대한 반응을 반영함)을 나타낸다.
도 37c는, PBS, 12.5 μg CTRL D20T 또는 220 μg FB-1125를 투여한 C57BL/6 마우스의 MC38 종양 모델에서의 종양 부피를 보여준다.
도 37d는, 12.5 μg CTRL D20T, 55 μg FB-1125 또는 55 μg FB-1125, 및 100 μg si-4B9를 투여한 C57BL/6 마우스의 MC38-FAP 종양 모델에서의 종양 부피를 보여준다.
도 38a 및 도 38b는, 면역접합체 분자 A와 상응하는 분자 입체배치를 스크리닝하는 방식으로 다양한 세포에서 IL-2 리포터 세포주를 사용하여 측정된 IL-2 활성을 보여준다. 면역접합체 분자 A는 IL-2 모이어티, IL-2와 EpCAM에 결합할 수 있는 투인원 차폐 모이어티(항체 FL78에서 유도된 Fab), 및 항-EpCAM 고정 모이어티(MOC31에서 유도된 scFv)를 함유하고 있었다. 세포 표면에서 EpCAM을 발현하는 HEK 293T EpCAM(high) 세포의 존재 하에서 검정을 수행하였다. HEK 293T 세포는 EpCAM을 발현하지 않는 세포였다. 분자 A는 입체배치 15와 동일한 스캐폴드를 가지고 있었다. X축은 IL-2 함유 면역접합체의 농도(pM)를 나타내고, Y축은 TECAN 플레이트 판독기를 사용하여 측정된 635 nm에서의 흡광도(A635)(이는 분비된 배아 알칼리성 포스파타아제(SEAP) 수준과 IL-2에 대한 반응을 반영함)를 나타낸다.
도 38c는, 도 38a에 제시된 면역접합체 분자 A에 대한 고정된 EpCAM과 돌연변이형 IL-2인 IL-2hex(K35E) 분자의 생체층 간섭계(BLI) 결합 곡선을 보여준다.
본 개시내용은 사이토카인 폴리펩타이드를 포함하는 면역접합체 분자를 제공한다. 본 개시내용은 또한, 특정 실시형태에서, 이러한 면역접합체 분자를 인코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및 벡터와, 이러한 면역접합체 분자를 포함하는 조성물, 시약 및 키트를 제공한다. 관련 양태에서, 본 개시내용에 따른 면역접합체 분자의 사용을 통해 표적 부위에 사이토카인 활성을 전달 및/또는 활성화시키는 방법, 또는 대상에서 사이토카인 활성에 대한 전신 노출과 관련된 독성 및/또는 다른 부작용을 감소시키는 방법이 또한 본원에 제공된다.
본 개시내용은 또한, 특정 실시형태에서, 본 개시내용의 이러한 면역접합체 분자의 일부를 형성할 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 같은 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 제공한다. 특정 실시형태에서, 섬유증 활성화 단백질(FAP: fibrosis activation protein)에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 포함하는 결합 단백질이 본원에 제공된다. 특정 실시형태에서, FAP과 인터류킨-2(IL-2) 둘 모두에 결합하는 투인원(two-in-one) 항체 또는 이의 단편을 포함하는 이중특이적 결합 단백질이 본원에 제공된다.
5.1 일반 기술
본원에 기재되거나 언급된 기술과 절차에는 일반적으로 널리 이해되고/되거나 당업자에 의해 통상적인 방법, 예를 들어 하기에 기재된 널리 이용되는 방법을 사용하여 통상적으로 이용되는 것들이 포함된다: 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3d ed. 2001)]; 문헌[Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al. eds., 2003)]; 문헌[Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic (An ed. 2009)]; 문헌[Monoclonal Antibodies: Methods and Protocols (Albitar ed. 2010)]; 문헌[Phage Display in Biotechnology and Drug Discovery (Sidhu and Geyer eds., 2d ed. 2005)]; 문헌[Phage Display: a Laboratory Manual (Barbas et al. eds., 2004)]; 및 문헌[Antibody Engineering Vols 1 and 2 (Kontermann and Dubel eds., 2d ed. 2010)].
5.2 용어
달리 기재되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서를 해석하기 위해, 용어에 대한 하기 설명이 적용될 것이며, 적절한 경우, 단수 형태로 사용된 용어는 복수 형태를 포함할 것이고, 그 반대도 마찬가지일 것이다. 모든 특허, 특허출원, 공개된 출원 및 다른 간행물은 그 전문이 참조로 인용된다. 제시된 용어의 임의의 설명이 본원에 참조로 인용된 임의의 문헌과 상충하는 경우, 하기 제시된 용어의 설명이 우선한다.
본원에 사용된 단수 형태의 표현은, 문맥에서 달리 명백하게 지시되지 않는 한, 복수의 언급대상을 포함한다.
달리 지시되지 않는 한, "올리고뉴클레오타이드"와 "핵산"이라는 용어는 상호교환적으로 사용되며, 5'에서 3' 배향으로 좌측에서 우측으로 기재되고, 아미노산 서열은, 각각, 아미노에서 카르복시 배향으로 좌측에서 우측으로 기재된다. 따라서, 일반적으로, 올리고뉴클레오타이드의 5'-말단에 있는 코돈은 번역된 단백질 또는 펩타이드 산물에 혼입되는 N-말단 아미노산 잔기에 해당할 것이다. 유사하게, 일반적으로, 올리고뉴클레오타이드의 3'-말단에 있는 코돈은 번역된 단백질 또는 펩타이드 산물에 혼입되는 C-말단 아미노산 잔기에 해당할 것이다. 본 발명의 개시내용은 당업자가 사용하는 상황에 따라 달라질 수 있기 때문에, 기재된 특정 방법, 프로토콜 및 시약에 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다.
본원에 사용된 "인터류킨-2" 또는 "IL-2"라는 용어는, 달리 지시되지 않는 한, 영장류(예를 들어 인간) 및 설치류(예를 들어, 마우스와 래트)와 같은 포유동물을 포함하는 임의의 척추동물 공급원에서 유래한 임의의 천연 IL-2를 나타낸다. 상기 용어는 처리되지 않은 IL-2뿐 아니라, 세포에서의 처리로 인해 생성된 임의의 형태의 IL-2를 포함한다. 상기 용어는 또한 IL-2의 자연 발생 변이체, 예를 들어 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다. 예시적인 인간 IL-2의 아미노산 서열은 APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT(서열번호 1)이다. 처리되지 않은 인간 IL-2는 N-말단에 20개의 아미노산 신호 펩타이드(밑줄 그어짐, 성숙한 IL-2 분자에는 존재하지 않음)를 추가로 포함하고, 하기 제시되는 바와 같은 서열을 갖는다: MYRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT(서열번호 2).
이론에 구애됨 없이, IL-2 폴리펩타이드는 IL-2R 수용체 복합체의 α, β 및/또는 γ-서브유닛(들)에서 IL-2 수용체(IL-2R)에 결합하는 것으로 고려된다. 나아가, IL-2Rα(CD-25)에 대한 결합에 참여하는 IL-2의 영역에는 P34(3.2 Å2), K35(37 Å2), R38(130 Å2), T41(25 Å2), F42(95 Å2), K43(61 Å2), F44(4 Å2), Y45(90 Å2), E61(67 Å2), E62(15 Å2), K64(46 Å2), P65(46 Å2), E68(78 Å2), V69(6 Å2), N71(3 Å2), L72(49 Å2), Q74(43 Å2), Y107(35 Å2), D109(3 Å2)가 포함되고; IL-2Rβ(CD122)에 대한 결합에 참여하는 IL-2의 영역에는 L12(40 Å2), Q13(29 Å2), E15(37 Å2), H16(89 Å2), L19(68 Å2), D20(24 Å2), M23(33 Å2), R81(51 Å2), D84(57 Å2), D87(16 Å2), N88(62 Å2), V91(85 Å2), I92(34 Å2), E95(45 Å2)가 포함되고; IL-2Rγ(CD-132)에 대한 결합에 참여하는 IL-2의 영역에는 Q11(9 Å2), L12(3 Å2), E15(41 Å2), L18(19 Å2), L19(12 Å2), Q22(28 Å2), K48(8 Å2), T51(1 Å2), E110(26 Å2), N119(59 Å2), R120(5 Å2), I122(5 Å2), T123(59 Å2), Q126(82 Å2), S127(32 Å2), I129(40 Å2), S130(55 Å2), T131(<1 Å2), T133(29 Å2)이 포함되며, 여기서 괄호 안의 숫자는 Protein Databank ID 2B5I를 이용하여 IL-2 수용체 단백질 복합체에서 계산된 매립된 표면적이다.
본원에 사용된 "IL-2 돌연변이체" 또는 "돌연변이형 IL-2 폴리펩타이드"라는 용어는, 전장 IL-2, IL-2의 절단된 형태, 및 IL-2 폴리펩타이드가 서열에 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 함유하는 형태를 포함하는 다양한 형태의 IL-2 분자의 임의의 돌연변이 형태를 포함하는 것으로 의도된다. IL-2와 관련하여 사용되는 "전장"은 성숙한 천연 길이의 IL-2 분자를 의미하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 전장 인간 IL-2는 133개 아미노산을 갖는 분자를 나타낸다(예를 들어, 서열번호 1 참조). 다양한 형태의 IL-2 돌연변이체는 IL-2와 CD25의 상호작용에 영향을 미치는 아미노산 돌연변이를 적어도 하나 가지고 있는 것을 특징으로 한다. 이러한 돌연변이는 통상적으로 해당 위치에 위치하는 야생형 아미노산 잔기의 치환, 결실, 절단 또는 변형을 포함할 수 있다. 달리 지시되지 않는 한, IL-2 돌연변이체는 본원에서 IL-2 돌연변이 펩타이드 서열, IL-2 돌연변이 폴리펩타이드, IL-2 돌연변이 단백질 또는 IL-2 돌연변이 유사체로 지칭될 수 있다. IL-2의 다양한 형태의 지정은 본원에서 서열번호 1에 제시된 서열과 관련하여 이루어진다. 동일한 돌연변이를 나타내기 위해 본원에서 다양한 지정이 사용될 수 있다. 예를 들어, 42번 위치에 있는 페닐알라닌의 알라닌으로의 돌연변이는 42A, A42, A42, F42A 또는 Phe42Ala로 표시될 수 있다. "IL-2hex"의 지정은 인간 IL-2 서열에 ΔA1/T3A/F42A/Y45A/L72G/C125S 돌연변이를 함유하는, 하기 제시되는 바와 같은 인간 IL-2의 돌연변이 형태를 나타낸다(아미노산 치환은 밑줄 그어져 있고 볼드체로 표시됨): P A SSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLT A KF A MPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLN G AQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITF S QSIISTLT(서열번호 3). 돌연변이된 아미노산 잔기의 위치 넘버링은 야생형 인간 IL-2 서열(서열번호 1)에 따른다. 이론에 구애됨 없이, 돌연변이 ΔA1은 IL-2의 성숙한 형태의 N-말단 잔기를 제거하고; 돌연변이 T3A는 잠재적인 글리코실화 부위를 제거하고; F42A/Y45A/L72G 돌연변이는 CD25에 대한 IL-2의 결합을 감소시키고; C125S 돌연변이는 IL-2 내 쌍을 이루지 않은 시스테인을 제거하는 것으로 고려된다.
이론에 구애됨 없이, 하나의 IL-2R 서브유닛과 IL-2의 상호작용을 담당하는 IL-2 폴리펩타이드의 영역에 있는 돌연변이는 해당 IL-2R 서브유닛에 대한 IL-2 결합에 영향을 미칠 수 있지만, 또 다른 IL-2R 서브유닛에 대한 IL-2R 결합에는 영향을 미치지 않는 것으로 고려된다. 예를 들어, 다양한 IL-2 돌연변이가 IL-2Rα(CD25)에 대한 IL-2의 결합에 부정적인 영향을 미치는 것으로 알려져 있으며, 이에는, 비제한적으로, K35E, R38A, R38D, R38E, F42A, F42K, K43E, Y45A, E61R, E62A, L72G, 또는 이들의 조합이 포함된다. 예를 들어, F42A 단일 돌연변이는 IL-2α에 대한 IL-2의 결합을 대략 100배 감소시키는 것으로 확인되었으며, (a) F42A/Y45A/L72G, (b) R38D/K43E/E61R 또는 (c) R38A/F42A/Y45A/E62A의 조합은 IL-2α에 대한 IL-2의 결합을 완전히 파괴하는 것으로 확인되었다. 다양한 IL-2 돌연변이가 IL-2Rβ(CD122)에 대한 IL-2의 결합에 부정적인 영향을 미치는 것으로 알려져 있으며, 이에는, 비제한적으로, D20T, D20G, D20A, H16E, H16R, H16A, N88D, N88S, N88R, V91G, V91A, V91R, V91S, 또는 이들의 조합이 포함된다. 다양한 IL-2 돌연변이가 IL-2Rγ(CD132)에 대한 IL-2의 결합에 영향을 미치는 것으로 알려져 있으며, 이에는, 비제한적으로, L18R, Q22E, T123A, Q126X(여기서, X=H, M, K, R, E, S, G, A, C, D, I 또는 T임), I129V, S130A, S130R, 또는 이들의 조합이 포함된다. IL-2Rγ에 대한 결합에 영향을 미치는 IL-2 돌연변이의 조합은 IL-2 신호전달의 작용제와 저해제를 생성하는 데 사용되었다. 예를 들어, Q74H/L80F/R81D/L85V/I92F 돌연변이와 조합된 Q126T 돌연변이는 IL-2Rγ에 대한 IL-2의 결합을 증강시키는 것으로 확인되었으며, IL-2 수용체 신호전달의 부분 작용제로 작용할 수 있다. 또 다른 예로서, IL-2의 L18R/Q22E/Q126T/S130R 돌연변이 조합은 IL-2 신호전달을 파괴하는 것으로 확인되었으며, 야생형 IL-2의 신호전달을 저해하는 역할을 할 수 있다.
본 개시내용과 관련하여 사용될 수 있는 추가의 예시적인 IL-2 돌연변이체에는 또한 하기가 포함된다: 하기 서열을 갖는 IL2 C125S(1번 내지 153번 잔기, 신호 펩타이드 없음, 아미노산 치환은 밑줄이 그어져 있고 볼드체로 표시됨)
AP T SSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLT F KF Y MPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLN L AQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITF S QSIISTLT (서열번호 7);
하기 서열을 갖는 IL2 C125A(1번 내지 153번 잔기, 신호 펩타이드 없음, 아미노산 치환은 밑줄이 그어져 있고 볼드체로 표시됨)
AP T SSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLT F KF Y MPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLN L AQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITF A QSIISTLT (서열번호 8);
하기 서열을 갖는 IL2-F42A/Y45A/L72G/C125A(1번 내지 153번 잔기, 신호 펩타이드 없음, 아미노산 치환은 밑줄이 그어져 있고 볼드체로 표시됨)
AP T SSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLT A KF A MPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLN G AQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITF A QSIISTLT (서열번호 9);
하기 서열을 갖는 IL2-R38A/F42A/Y45A/E62A/C125S(1번 내지 153번 잔기, 아미노산 치환은 밑줄이 그어져 있고 볼드체로 표시됨)
AP T SSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLT A MLT A KF A MPKKATELKHLQCLEE A LKPLEEVLN L AQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITF S QSIISTLT (서열번호 10);
하기 서열을 갖는 IL2-T3A/R38E/F42A/C125S(1번 내지 153번 잔기, 아미노산 치환은 밑줄이 그어져 있고 볼드체로 표시됨)
AP A SSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLT E MLT A KF Y MPKKATELKHLQCLEE E LKPLEEVLN L AQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITF S QSIISTLT (서열번호 11);
하기 서열을 갖는 IL2-T3A/R38E/Y45A/C125S(1번 내지 153번 잔기, 아미노산 치환은 밑줄이 그어져 있고 볼드체로 표시됨)
AP A SSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLT E MLT F KF A MPKKATELKHLQCLEE E LKPLEEVLN L AQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITF S QSIISTLT (서열번호 12);
하기 서열을 갖는 IL2-T3A/R38E/L72G/C125S(1번 내지 153번 잔기, 아미노산 치환은 밑줄이 그어져 있고 볼드체로 표시됨)
AP A SSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLT E MLT F KF Y MPKKATELKHLQCLEE E LKPLEEVLN G AQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITF S QSIISTLT (서열번호 13);
하기 서열을 갖는 IL2-ΔA2/T3A/F42A/Y45A/L72G/C125S(2번 내지 153번 잔기, 신호 펩타이드 "hex" 없음, 아미노산 치환은 밑줄이 그어져 있고 볼드체로 표시됨)
P A SSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLT A KF A MPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLN G AQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITF S QSIISTLT (서열번호 14);
하기 서열을 갖는 IL2-ΔA2/T3A/K35E/F42A/Y45A/L72G/C125S(2번 내지 153번 잔기, 신호 펩타이드 "hex/K35E" 없음, 아미노산 치환은 밑줄이 그어져 있고 볼드체로 표시됨)
P A SSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNP E LTRMLT A KF A MPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLN G AQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITF S QSIISTLT (서열번호 15);하기 서열을 갖는 IL2-T3A/K35E/F42A/Y45A/L72G/C125S(1번 내지 153번 잔기, 신호 펩타이드 없음, 아미노산 치환은 밑줄이 그어져 있고 볼드체로 표시됨)
AP A SSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNP E LTRMLT A KF A MPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLN G AQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITF S QSIISTLT (서열번호 107);
하기 서열을 갖는 IL2-T3A/K35E/F42A/C125S(1번 내지 153번 잔기, 신호 펩타이드 없음, 아미노산 치환은 밑줄이 그어져 있고 볼드체로 표시됨)
AP A SSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNP E LTRMLT A KFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITF S QSIISTLT (서열번호 108);
하기 서열을 갖는 IL2-T3A/D20T/K35E/C125S(1번 내지 153번 잔기, 신호 펩타이드 없음, 아미노산 치환은 밑줄이 그어져 있고 볼드체로 표시됨)
AP A SSSTKKTQLQLEHLLL T LQMILNGINNYKNP E LTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITF S QSIISTLT (서열번호 109); 및
하기 서열을 갖는 IL2-T3A/H16A/K35E/C125S(1번 내지 153번 잔기, 신호 펩타이드 없음, 아미노산 치환은 밑줄이 그어져 있고 볼드체로 표시됨)
AP A SSSTKKTQLQLE A LLLDLQMILNGINNYKNP E LTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITF S QSIISTLT (서열번호 110).
본 개시내용과 관련하여 사용될 수 있는 추가의 돌연변이형 IL-2 폴리펩타이드에는, 예를 들어 미국 특허 제10,184,009호 및 제5,229,109호, 및 국제 특허출원 공개공보 WO2012107417A1호에 기재된 것들이 포함되며, 상기 문헌들 각각의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다.
본원에 사용된 IL-2의 "야생형" 형태는, 야생형 형태가 돌연변이형 IL-2 폴리펩타이드의 각 아미노산 위치에 야생형 아미노산을 갖는다는 점을 제외하고는 돌연변이형 IL-2 폴리펩타이드와 동일한 IL-2의 형태이다. 예를 들어, IL-2 돌연변이체가 전장 IL-2(즉, 임의의 다른 분자에 융합되거나 접합되지 않은 IL-2)인 경우, 이러한 돌연변이체의 야생형 형태는 전장 천연 IL-2이다. IL-2 돌연변이체가 IL-2와, IL-2의 다운스트림에서 인코딩된 또 다른 폴리펩타이드(예를 들어, 항체 사슬) 사이의 융합체인 경우, 이러한 IL-2 돌연변이체의 야생형 형태는 동일한 다운스트림 폴리펩타이드에 융합된 야생형 아미노산 서열을 갖는 IL-2이다. 나아가, IL-2 돌연변이체가 IL-2의 절단된 형태(IL-2의 절단되지 않은 부분 내 돌연변이되거나 변형된 서열)인 경우, 이러한 IL-2 돌연변이체의 야생형 형태는 야생형 서열을 갖는 유사하게 절단된 IL-2이다. 다양한 형태의 IL-2 돌연변이체의 IL-2 수용체 결합 친화도 또는 생물학적 활성을 상응하는 IL-2의 야생형 형태와 비교하기 위해, 야생형이라는 용어는 자연 발생 천연 IL-2와 비교하여 IL-2 수용체 결합에 영향을 미치지 않는 하나 이상의 아미노산 돌연변이, 예를 들어 인간 IL-2의 125번 잔기에 상응하는 위치에 있는 시스테인의 알라닌으로의 치환을 포함하는 IL-2의 형태를 포함한다. 본 발명에 따른 특정 실시형태에서, 돌연변이형 IL-2 폴리펩타이드와 비교되는 야생형 IL-2 폴리펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 사용된 "CD25" 또는 "IL-2 수용체의 α-서브유닛" 또는 "IL-2Rα"라는 용어는, 달리 지시되지 않는 한, 영장류(예를 들어 인간) 및 설치류(예를 들어, 마우스와 래트)와 같은 포유동물을 포함하는 임의의 척추동물 공급원에서 유래한 임의의 천연 CD25를 나타낸다. 상기 용어는 "전장"의 처리되지 않은 CD25뿐 아니라, 세포에서의 처리로 인해 생성된 임의의 형태의 CD25를 포함한다. 상기 용어는 또한 CD25의 자연 발생 변이체, 예를 들어 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다. 특정 실시형태에서, CD25는 인간 CD25이다. 예시적인 인간 CD25의 아미노산 서열(신호 서열 포함, 밑줄 그어짐)은 하기 제시되는 바와 같다: MDSYLLMWGLLTFIMVPGCQAELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKSGSLYMLCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTGEEKPQASPEGRPESETSCLVTTTDFQIQTEMAATMETSIFTTEYQVAVAGCVFLLISVLLLSGLTWQRRQRKSRRTI(서열번호 4).
본원에 사용된 "CD122" 또는 "IL-2 수용체의 β-서브유닛" 또는 "IL-2Rβ"라는 용어는, 달리 지시되지 않는 한, 영장류(예를 들어 인간) 및 설치류(예를 들어, 마우스와 래트)와 같은 포유동물을 포함하는 임의의 척추동물 공급원에서 유래한 임의의 천연 CD122를 나타낸다. 상기 용어는 "전장"의 처리되지 않은 CD122뿐 아니라, 세포에서의 처리로 인해 생성된 임의의 형태의 CD122를 포함한다. 상기 용어는 또한 CD122의 자연 발생 변이체, 예를 들어 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다. 특정 실시형태에서, CD122는 인간 CD122이다. 예시적인 인간 CD122의 아미노산 서열은 하기 제시되는 바와 같다:
MAAPALSWRLPLLILLLPLATSWASAAVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQASWACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPISLQVVHVETHRCNISWEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTWEEAPLLTLKQKQEWICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKDTIPWLGHLLVGLSGAFGFIILVYLLINCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHGGDVQKWLSSPFPSSSFSPGGLAPEISPLEVLERDKVTQLLLQQDKVPEPASLSSNHSLTSCFTNQGYFFFHLPDALEIEACQVYFTYDPYSEEDPDEGVAGAPTGSSPQPLQPLSGEDDAYCTFPSRDDLLLFSPSLLGGPSPPSTAPGGSGAGEERMPPSLQERVPRDWDPQPLGPPTPGVPDLVDFQPPPELVLREAGEEVPDAGPREGVSFPWSRPPGQGEFRALNARLPLNTDAYLSLQELQGQDPTHLV(서열번호 111).
본원에 사용된 "CD132" 또는 "IL-2 수용체의 γ-서브유닛 " 또는 "IL-2Rγ"라는 용어는, 달리 지시되지 않는 한, 영장류(예를 들어 인간) 및 설치류(예를 들어, 마우스와 래트)와 같은 포유동물을 포함하는 임의의 척추동물 공급원에서 유래한 임의의 천연 CD132를 나타낸다. 상기 용어는 "전장"의 처리되지 않은 CD132뿐 아니라, 세포에서의 처리로 인해 생성된 임의의 형태의 CD132를 포함한다. 상기 용어는 또한 CD132의 자연 발생 변이체, 예를 들어 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다. 특정 실시형태에서, CD132는 인간 CD132이다. 예시적인 인간 CD132의 아미노산 서열(신호 서열 포함, 밑줄 그어짐)은 하기 제시되는 바와 같다:
MLKPSLPFTSLLFLQLPLLGVGLNTTILTPNGNEDTTADFFLTTMPTDSLSVSTLPLPEVQCFVFNVEYMNCTWNSSSEPQPTNLTLHYWYKNSDNDKVQKCSHYLFSEEITSGCQLQKKEIHLYQTFVVQLQDPREPRRQATQMLKLQNLVIPWAPENLTLHKLSESQLELNWNNRFLNHCLEHLVQYRTDWDHSWTEQSVDYRHKFSLPSVDGQKRYTFRVRSRFNPLCGSAQHWSEWSHPIHWGSNTSKENPFLFALEAVVISVGSMGLIISLLCVYFWLERTMPRIPTLKNLEDLVTEYHGNFSAWSGVSKGLAESLQPDYSERLCLVSEIPPKGGALGEGPGASPCNQHSPYWAPPCYTLKPET(서열번호 112).
본원에 사용된 "고친화도 IL-2 수용체"라는 용어는, 수용체 γ-서브유닛(공통 사이토카인 수용체 γ-서브유닛, γc 또는 CD132로도 알려짐), 수용체 β-서브유닛(CD122 또는 p70으로도 알려짐) 및 수용체 α-서브유닛(CD25 또는 p55로도 알려짐)로 이루어진 IL-2 수용체의 이종이량체 형태, 또는 이의 기능성 변이체를 나타낸다. 대조적으로, "중간 친화도 IL-2 수용체"라는 용어는, α-서브유닛 없이 γ-서브유닛과 β-서브유닛만 포함하는 IL-2 수용체, 또는 이의 기능성 변이체를 나타낸다(검토를 위해서는, 예를 들어 문헌[Olejniczak and Kasprzak, Med Sci Monit 14, RA179-189 (2008)] 참조).
본원에 사용된 "종양 관련 항원" 또는 "TAA"라는 용어는, 암 세포에 의해 또는 고형 종양의 간질(stroma)에서 발현되는 항원을 나타낸다. TAA는 단백질, 핵산, 지질 또는 다른 항원일 수 있다. 특정 실시형태에서, TAA는 세포 표면에서 발현되는 TAA일 수 있다. 고형 종양의 맥락에서, TAA는 고형 종양 덩어리의 간질에서 발현될 수 있다. 본원에 사용된 "간질"이라는 용어는, 암 세포 이외의 고형 종양 덩어리의 구성요소를 나타낸다. 예를 들어, 간질은 섬유아세포, 상피세포, 다른 혈관 구성요소 또는 세포외 기질 구성요소를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 "간질"이라는 용어는, 면역세포(예를 들어, B세포, T세포, 수지상세포, 대식세포, 자연살해세포 등)와 같은 면역계의 구성요소를 포함하지 않는다. 다양한 TAA가 당업계에 알려져 있다. TAA의 식별은 문헌[Zhang et al., Methods Mol. Biol., 520:1-10 (2009)]에 개시된 바와 같이 당업계에 알려진 방법을 사용하여 수행될 수 있으며, 상기 문헌의 내용은 본원에 참조로 인용된다.
본원에 사용된 "섬유아세포 활성화 단백질" 또는 "FAP"이라는 용어는, 달리 지시되지 않는 한, 영장류(예를 들어 인간) 및 설치류(예를 들어, 마우스와 래트)와 같은 포유동물을 포함하는 임의의 척추동물 공급원에서 유래한 임의의 천연 FAP을 나타낸다. 상기 용어는 처리되지 않은 FAP뿐 아니라, 세포에서의 처리로 인해 생성된 임의의 형태의 FAP을 포함한다. 상기 용어는 또한 FAP의 자연 발생 변이체, 예를 들어 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다. 예시적인 인간 FAP의 아미노산 서열은 하기 제시되는 바와 같다: MKTWVKIVFGVATSAVLALLVMCIVLRPSRVHNSEENTMRALTLKDILNGTFSYKTFFPNWISGQEYLHQSADNNIVLYNIETGQSYTILSNRTMKSVNASNYGLSPDRQFVYLESDYSKLWRYSYTATYYIYDLSNGEFVRGNELPRPIQYLCWSPVGSKLAYVYQNNIYLKQRPGDPPFQITFNGRENKIFNGIPDWVYEEEMLATKYALWWSPNGKFLAYAEFNDTDIPVIAYSYYGDEQYPRTINIPYPKAGAKNPVVRIFIIDTTYPAYVGPQEVPVPAMIASSDYYFSWLTWVTDERVCLQWLKRVQNVSVLSICDFREDWQTWDCPKTQEHIEESRTGWAGGFFVSTPVFSYDAISYYKIFSDKDGYKHIHYIKDTVENAIQITSGKWEAINIFRVTQDSLFYSSNEFEEYPGRRNIYRISIGSYPPSKKCVTCHLRKERCQYYTASFSDYAKYYALVCYGPGIPISTLHDGRTDQEIKILEENKELENALKNIQLPKEEIKKLEVDEITLWYKMILPPQFDRSKKYPLLIQVYGGPCSQSVRSVFAVNWISYLASKEGMVIALVDGRGTAFQGDKLLYAVYRKLGVYEVEDQITAVRKFIEMGFIDEKRIAIWGWSYGGYVSSLALASGTGLFKCGIAVAPVSSWEYYASVYTERFMGLPTKDDNLEHYKNSTVMARAEYFRNVDYLLIHGTADDNVHFQNSAQIAKALVNAQVDFQAMWYSDQNHGLSGLSTNHLYTHMTHFLKQCFSLSD(서열번호 5).
"종양 미세환경"이라는 용어는, 신생물 과정을 생존, 확장 및/또는 확산시키기 위한 구조적 및/또는 기능적 환경을 생성하는 신생물 환경의 임의의 및 모든 요소를 나타낸다. 비제한적인 예로서, 종양 미세환경은 고형 종양과 같은 하나 이상의 신생물 세포를 둘러싸고/싸거나 이에 영양을 공급하는 세포, 분자, 섬유아세포, 세포외 기질 및/또는 혈관으로 구성된다. 특정 실시형태에서, 신생물 질환은 고형 종양이다. 종양 미세환경 내 예시적인 세포 또는 조직에는, 비제한적으로, 종양 혈관계, 종양 침윤 림프구, 섬유아세포 망상세포, 혈관내피 전구세포(EPC), 암 관련 섬유아세포, 혈관주위세포, 다른 간질세포, 세포외 기질(ECM) 구성요소, 수지상세포, 항원제시세포, T세포, 조절 T세포, 대식세포, 호중구, 및 종양 근처에 위치한 다른 면역세포가 포함된다. 종양 미세환경에 영향을 미치는 예시적인 세포 기능에는, 비제한적으로, 사이토카인 및/또는 케모카인의 생산, 사이토카인에 대한 반응, 펩타이드 항원의 항원 처리 및 제시, 백혈구 화학주성 및 이동의 조절, 유전자 발현의 조절, 보체 활성화, 신호전달 경로의 조절, 세포 매개 세포독성, 세포 매개 면역, 체액성 면역 반응, 및 선천성 면역 반응 등이 포함된다.
"항체", "면역글로불린" 또는 "Ig"라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 가장 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로, 예를 들어 하기 기재되는 바와 같은, 개별 단클론 항체(작용제, 길항제, 중화 항체, 전장 또는 온전한 단클론 항체 포함), 다중 에피토프 또는 단일 에피토프 특이성을 갖는 항체 조성물, 다클론 또는 1가 항체, 다가 항체, 적어도 2개의 온전한 항체로 형성된 다중특이적 항체(예를 들어, 목적하는 생물학적 활성을 갖는 한 이중특이적 항체), 단일 사슬 항체, 및 항체의 단편을 포함한다. 항체는 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체 및/또는 친화도 성숙된 항체뿐 아니라, 다른 종, 예를 들어 마우스 및 토끼 등의 항체일 수 있다. "항체"라는 용어는, 특정 분자 항원에 결합할 수 있고 2개의 동일한 폴리펩타이드 사슬 쌍(여기서 각각의 쌍은 하나의 중쇄(약 50 kDa 내지 70 kDa)와 하나의 경쇄(약 25 kDa)를 갖고, 각 사슬의 각각의 아미노 말단 부분은 약 100개 내지 약 130개 이상 아미노산의 가변 영역을 포함하고, 각 사슬의 각각의 카르복시 말단 부분은 불변 영역을 포함함)으로 구성된 폴리펩타이드의 면역글로불린 클래스 내 B세포의 폴리펩타이드 산물을 포함하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 문헌[Antibody Engineering (Borrebaeck ed., 2d ed. 1995)]; 및 문헌[Kuby, Immunology (3d ed. 1997)] 참조. 특정 실시형태에서, 특정 분자 항원은 IL-2 폴리펩타이드, IL-2 단편 또는 IL-2 에피토프와 같은 본원에 제공된 항체에 의해 결합될 수 있다. 항체에는 또한, 비제한적으로, 합성 항체, 재조합적으로 생산된 항체, 낙타화 항체, 인트라바디, 항-이디오타입(항-Id) 항체, 및 상기 중 임의의 것의 기능성 단편(예를 들어, IL-2-결합 단편과 같은 항원 결합 단편)(이는 단편이 유도되는 항체의 결합 활성의 일부 또는 전부를 보유하는 항체 중쇄 또는 경쇄 폴리펩타이드의 일부를 나타냄)이 포함된다. 기능성 단편(예를 들어, IL-2-결합 단편과 같은 항원 결합 단편)의 비제한적인 예에는, 단일 사슬 Fv(scFv)(예를 들어, 단일특이적, 이중특이적 등의 scFv 포함), Fab 단편(예를 들어, 단일특이적, 이중특이적 등의 Fab 단편 포함), F(ab') 단편, F(ab)2 단편, F(ab')2 단편, 디설파이드 결합된 Fv(dsFv), Fd 단편, Fv 단편, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 미니바디 및 단일 도메인 항체(VHH 또는 나노바디)가 포함된다. 특히, 본원에 제공된 항체에는 면역글로불린 분자와 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 부분, 예를 들어 IL-2 항원에 결합하는 항원 결합 부위(예를 들어, 항-IL-2 항체의 하나 이상의 CDR)를 함유하는 항원 결합 도메인 또는 분자가 포함된다. 이러한 항체 단편은, 예를 들어 하기 문헌에서 확인할 수 있다: 문헌[Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (1989)]; 문헌[Mol. Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference (Myers ed., 1995)]; 문헌[Huston et al., 1993, Cell Biophysics 22:189-224]; 문헌[Pluckthun and Skerra, 1989, Meth. Enzymol. 178:497-515]; 및 문헌[Day, Advanced Immunochemistry (2d ed. 1990)]. 본원에 제공된 항체는 면역글로불린 분자의 임의의 클래스(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD 및 IgA) 또는 임의의 서브클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2)의 것일 수 있다.
본원에 사용된 "단클론 항체"라는 용어는, 실질적으로 균질한 항체 집단에서 얻은 항체를 나타내며, 예를 들어 이러한 집단을 구성하는 개별 항체들은, 미미한 양으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하고, 각각의 단클론 항체는 전형적으로 항원의 단일 에피토프를 인식한다. 특정 실시형태에서, 본원에 사용된 "단클론 항체"는 단일 하이브리도마 또는 다른 세포에 의해 생산된 항체로서, 예를 들어 ELISA, 또는 당업계에 알려진 다른 항원 결합 또는 경쟁 결합 검정으로 측정 시 단 하나의 에피토프에만 결합하는 항체이다. "단클론"이라는 용어는, 항체를 제조하는 임의의 특정 방법에 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 개시내용에 유용한 단클론 항체는 문헌[Kohler et al., 1975, Nature 256:495]에 최초로 기재된 하이브리도마 방법으로 제조될 수 있거나, 박테리아, 또는 진핵 동물 또는 식물 세포에 재조합 DNA 방법(예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호 참조)을 사용하여 제조될 수 있다. "단클론 항체"는 또한, 예를 들어 문헌[Clackson et al., 1991, Nature 352:624-28]과 문헌[Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222:581-97]에 기재된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 클론 세포주와 이에 의해 발현되는 단클론 항체의 다른 제조 방법이 당업계에 널리 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al. eds., 5th ed. 2002)] 참조. 단클론 항체를 생산하는 예시적인 방법이 본원의 실시예에 제시되어 있다.
본원에 사용된 "다클론 항체"는 다수의 에피토프를 갖는 단백질에 대한 면역원성 반응에서 생성된 항체 집단을 나타내기 때문에, 단백질 내 동일하거나 상이한 에피토프에 대해 지시된 다양한 상이한 항체를 포함한다. 다클론 항체를 생산하는 방법은 당업계에 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al. eds., 5th ed. 2002)] 참조).
"항원"은 항체가 선택적으로 결합할 수 있는 사전 결정된 항원이다. 표적 항원은 폴리펩타이드, 탄수화물, 핵산, 지질, 합텐, 또는 다른 자연 발생 또는 합성 화합물일 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 항원은 폴리펩타이드이다.
"항원 결합 단편", "항원 결합 도메인", "항원 결합 영역"과 같은 용어 및 유사한 용어는, 항원과 상호작용하며 항원에 대한 특이성과 친화도를 결합제에 부여하는 아미노산 잔기를 포함하는 항체의 해당 부분(예를 들어, CDR)을 나타낸다.
본원에 사용된 "이중특이적 항체"는, 2개의 상이한 표적 항원에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 나타낸다. 본원에 사용된 "투인원 항체"는, 단일 항원 결합 도메인을 통해 2개의 상이한 표적 항원에 결합할 수 있는 이중특이적 항체를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 표적 항원들은 투인원 항체의 단일 항원 결합 도메인과의 결합에 대해 서로 경쟁하므로, 투인원 항체는, 하나의 표적 항원과 결합 시, 다른 표적 항원에서 해리된다.
"에피토프"는 단일 항체 분자가 결합하는 항원 분자의 표면 상의 부위, 예컨대 IL-2 폴리펩타이드 또는 IL-2 폴리펩타이드 단편과 같은 항원 표면 상의 국소화된 영역으로, 항체의 하나 이상의 항원 결합 영역에 결합할 수 있고, 포유동물(예를 들어, 인간)과 같은 동물에서 면역 반응을 이끌어낼 수 있는 항원성 또는 면역원성 활성을 갖는 영역이다. 면역원성 활성을 갖는 에피토프는 동물에서 항체 반응을 이끌어내는 폴리펩타이드의 일부이다. 항원성 활성을 갖는 에피토프는, 예를 들어 면역분석법을 포함하는 당업계에 널리 알려진 임의의 방법으로 측정 시, 항체가 결합하는 폴리펩타이드의 일부이다. 항원성 에피토프가 반드시 면역원성일 필요는 없다. 에피토프는 종종 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹으로 이루어지며, 특정한 3차원 구조 특징뿐 아니라 특정한 전하 특징이 있다. 항체 에피토프는 선형 에피토프 또는 입체형태 에피토프일 수 있다. 선형 에피토프는 단백질 내 아미노산의 연속 배열로 형성되어 있다. 입체형태 에피토프는 단백질 서열에서 불연속적이지만, 단백질이 3차원 구조로 폴딩될 때 함께 모이는 아미노산으로 형성되어 있다. 단백질의 3차원 구조가, 예컨대 또 다른 단백질 또는 리간드의 활성화 또는 결합에 의해 변경된 입체형태인 경우, 유도된 에피토프가 형성된다. 일반적으로, 항원은 몇몇 또는 다수의 상이한 에피토프를 가지고 있으며, 다수의 상이한 항체와 반응할 수 있다. 특정 실시형태에서, 항원(예를 들어, FAP)은 상이한 항-FAP 항체에 의해 인식되고 결합되는 하나 초과의 에피토프를 가질 수 있다. 특정 실시형태에서, 상이한 항-FAP 항체들은 FAP의 동일한 에피토프와의 결합에 대해 서로 경쟁한다.
2개의 항체가 3차원 공간에서 동일하거나, 중첩되거나 또는 인접한 에피토프를 인식하는 경우, 항체는 "하나의 에피토프", 또는 참조 항체와 "본질적으로 동일한 에피토프" 또는 "동일한 에피토프"에 결합한다. 2개의 항체가 3차원 공간에서 동일하거나, 중첩되거나 또는 인접한 에피토프에 결합하는지를 결정하는 가장 널리 사용되고 신속한 방법은, 예를 들어 표지된 항원 또는 표지된 항체를 사용하여 다수의 상이한 형식으로 구성될 수 있는 경쟁 검정이다. 일부 검정에서, 항원을 96웰 플레이트에 고정시키거나 세포 표면에서 발현시키고, 방사성 표지, 형광 표지 또는 효소 표지를 사용하여 표지된 항체의 결합을 차단하는 표지되지 않은 항체의 능력을 측정한다.
"에피토프 매핑(mapping)"은 표적 항원에 있는 항체의 결합 부위 또는 에피토프를 식별하는 과정이다. "에피토프 비닝(binning)"은 항체가 인식하는 에피토프에 기반하여 항체를 그룹화하는 과정이다. 보다 구체적으로, 에피토프 비닝은 에피토프 인식 특성에 기반하여 항체를 클러스터링하고 별개의 결합 특이성을 갖는 항체를 식별하는 컴퓨터처리 과정과 조합된 경쟁 검정을 사용하여 상이한 항체의 에피토프 인식 특성을 구별하기 위한 방법 및 시스템을 포함한다.
"결합한다" 또는 "결합"이라는 용어는, 예를 들어 복합체를 형성하는 것을 포함하는 분자간 상호작용을 나타낸다. 상호작용은, 예를 들어 수소 결합, 이온 결합, 소수성 상호작용 및/또는 반데르발스(van der Waals) 상호작용을 포함하는 비공유결합형 상호작용일 수 있다. 복합체는 또한 공유결합형 또는 비공유결합형 결합, 상호작용 또는 힘에 의해 함께 모여있는 2개 이상의 분자의 결합을 포함할 수 있다. 항체의 단일 항원 결합 부위와 IL-2와 같은 표적 분자의 단일 에피토프 사이의 전체적인 비공유결합형 상호작용의 강도는, 해당 에피토프에 대한 항체 또는 기능성 단편의 친화도이다. 1가 항원에 대한 항체의 해리 속도(koff) 대 회합 속도(kon)의 비(koff/kon)는, 친화도와 반비례하는 해리 상수 KD이다. KD 값이 낮을수록, 항체의 친화도는 높아진다. KD 값은 항체와 항원의 상이한 복합체에 따라 다르며, kon와 koff에 따라 달라진다. 본원에 제공된 항체에 대한 해리 상수 KD는 본원에 제공된 임의의 방법 또는 당업자에게 널리 알려진 임의의 다른 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 하나의 결합 부위에서의 친화도가 항상 항체와 항원 사이의 실제 상호작용 강도를 반영하는 것은 아니다. 다가 IL-2와 같은 다수의 반복된 항원 결정기를 함유하는 복합 항원이 다수의 결합 부위를 함유하는 항체와 접촉하게 되는 경우, 하나의 부위에서 항체와 항원의 상호작용은 제2 부위에서의 반응 가능성을 증가시킨다. 다가 항체와 항원 사이의 이러한 다중 상호작용의 강도는 결합력(avidity)이라고 불린다. 항체의 결합력은 개별 결합 부위의 친화도보다 이의 결합 능력을 더 잘 측정할 수 있다. 예를 들어, IgG보다 낮은 친화도를 가질 수 있는 오량체 IgM 항체에서 때때로 확인되는 바와 같이 높은 결합력은 낮은 친화도를 보상할 수 있지만, IgM의 높은 결합력은 이의 다가성으로 인해 항원에 효과적으로 결합할 수 있게 한다.
"항원에 특이적으로 결합하는 항체", "에피토프에 특이적으로 결합하는 항체"라는 용어와 유사한 용어는 또한 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 항원, 또는 항원의 단편 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 나타낸다. 항원에 특이적으로 결합하는 항체는, 예를 들어 면역검정인 Biacore®, 또는 당업자에게 알려진 다른 기술에 의해 식별될 수 있다. 항체는 항원에 결합할 때, 방사면역측정법(RIA) 및 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA)과 같은 실험 기법을 사용하여 측정 시, 임의의 교차 반응성 항원보다 더 높은 친화도로 해당 항원에 특이적으로 결합한다. 전형적으로, 특정 또는 선택적 반응은 배경 신호 또는 노이즈의 적어도 2배이며, 배경의 10배 초과일 수 있다. 항체 특이성에 관한 논의에 대해서는, 예를 들어 문헌[Fundamental Immunology 332-36 (Paul ed., 2d ed. 1989)] 참조. "관심 항원(예를 들어, IL-2와 같은 표적 항원)에 결합하는" 항체는, 항체가 항원을 발현하는 세포 또는 조직을 표적으로 하는 치료제로서 유용할 만큼 충분한 친화도로 항원에 결합하며, 다른 단백질과 유의하게 교차 반응하지 않는 항체이다. 이러한 실시형태에서, "비(non)-표적" 단백질에 대한 항체의 결합 정도는, 예를 들어 형광 활성화 세포 분류(FACS) 분석 또는 RIA로 측정 시, 특정 표적 단백질에 대한 항체의 결합의 약 10% 미만일 수 있다. 표적 분자에 대한 항체의 결합과 관련하여, 특정 폴리펩타이드 또는 특정 폴리펩타이드 표적 상의 에피토프"에 대한 특이적 결합", "에 특이적으로 결합하는" 또는 "에 대해 특이적이다"라는 용어는, 비특이적 상호작용과 측정 가능하게 상이한 결합을 의미한다. 특이적 결합은, 예를 들어 분자의 결합을, 일반적으로 결합 활성을 나타내지 않는 유사한 구조의 분자인 대조군 분자의 결합과 비교하여 결정하는 방식으로 측정될 수 있다. 예를 들어, 특이적 결합은 표적과 유사한 대조군 분자, 예를 들어 과량의 표지되지 않은 표적과의 경쟁에 의해 결정될 수 있다. 이러한 경우, 프로브에 대한 표지된 표적의 결합이 과량의 표지되지 않은 표적에 의해 경쟁적으로 저해될 때, 특이적 결합이 나타난다. 본원에 사용된 특정 폴리펩타이드 또는 특정 폴리펩타이드 표적 상의 에피토프"에 대한 특이적 결합", "에 특이적으로 결합하는" 또는 "에 대해 특이적이다"라는 용어는, 분자가 임의의 다른 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 에피토프에 실질적으로 결합하지 않으면서, 특정 폴리펩타이드 또는 특정 폴리펩타이드 상의 에피토프에 결합하는 결합을 나타낸다. 특정 실시형태에서, 본 개시내용의 항원에 결합하는 항체의 해리 상수(KD)는 10 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0.9 nM, 0.8 nM, 0.7 nM, 0.6 nM, 0.5 nM, 0.4 nM, 0.3 nM, 0.2 nM 또는 0.1 nM 이하이다.
항체(예를 들어, 세포 표면 항원에 결합하고 표적 상의 동일한 에피토프 또는 결합 부위에 대해 경쟁하는 항체 및 결합 단백질)의 맥락에서 사용되는 "경쟁하다"라는 용어는, 연구 중인 항체(또는 이의 결합 단편)가 공통 항원(예를 들어, FAP 또는 이의 단편)에 대한 참조 분자(예를 들어, 참조 리간드 또는 참조 항원 결합 단백질, 예컨대 참조 항체)의 특이적 결합을 방지하거나 저해하는지에 대해 검정에 의해 결정된 경쟁을 의미한다. 시험 항체가 항원(예를 들어, 인간 FAP)에 대한 결합에 대해 참조 항체와 경쟁하는지를 결정하는 데 다수의 유형의 경쟁 결합 검정이 사용될 수 있다. 이용될 수 있는 검정의 예에는, 고체상 직접 또는 간접 RIA, 고체상 직접 또는 간접 효소 면역검정(EIA), 샌드위치 경쟁 검정(예를 들어, 문헌[Stahli et al., 1983, Methods in Enzymology 9:242-53] 참조), 고체상 직접 비오틴-아비딘 EIA(예를 들어, 문헌[Kirkland et al., 1986, J. Immunol. 137:3614-19] 참조), 고체상 직접 표지된 검정, 고체상 직접 표지된 샌드위치 검정(예를 들어, 문헌[Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988)] 참조), I-125 표지를 사용한 고체상 직접 표지 RIA(예를 들어, 문헌[Morel et al., 1988, Mol. Immunol. 25:7-15] 참조), 및 직접 표지된 RIA(문헌[Moldenhauer et al., 1990, Scand. J. Immunol. 32:77-82])가 포함된다. 전형적으로, 이러한 검정은 표지되지 않은 시험 항원 결합 단백질(예를 들어, 시험 항-IL-2 항체) 또는 표지된 참조 항원 결합 단백질(예를 들어, 참조 항-IL-2 항체)을 함유하는 세포, 또는 고체 표면에 결합된 정제된 항원(예를 들어, IL-2)의 사용을 포함한다. 경쟁적 저해는 시험 항원 결합 단백질 존재 하의 세포 또는 고체 표면에 결합된 표지의 양을 측정하는 방식으로 측정될 수 있다. 통상적으로, 시험 항원 결합 단백질은 과량으로 존재한다. 경쟁 검정에 의해 식별된 항체(경쟁 항체)에는, 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체 및/또는 항체 입체 장애가 발생하도록 참조 항체에 의해 결합된 에피토프에 충분히 가까운 인접한 에피토프에 결합하는 항체가 포함된다. 경쟁 결합을 결정하는 방법에 관한 추가의 세부사항이 본원에 기재되어 있다. 통상적으로, 경쟁 항체 단백질이 과량으로 존재하는 경우, 이는 공통 항원에 대한 참조 항체의 특이적 결합을 적어도 30%, 예를 들어 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% 또는 75% 저해할 것이다. 일부 경우에, 결합은 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 저해된다.
항체와 관련하여 사용되는 "중쇄"라는 용어는, 아미노 말단 부분이 약 120개 내지 130개 이상 아미노산의 가변 영역을 포함하고, 카르복시 말단 부분이 불변 영역을 포함하는, 약 50 kDa 내지 70 kDa의 폴리펩타이드 사슬을 나타낸다. 불변 영역은 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열에 기반하여, 알파(α), 델타(δ), 엡실론(ε), 감마(γ) 및 뮤(μ)로 지칭되는 5가지 별개의 유형(예를 들어, 아이소타입) 중 하나일 수 있다. 별개의 중쇄는 크기가 상이하다: α, δ 및 γ는 대략 450개 아미노산을 함유하고, μ와 ε은 대략 550개 아미노산을 함유함. 경쇄와 조합되는 경우, 이러한 별개의 중쇄 유형은, 각각, 항체의 널리 알려진 5가지 클래스(예를 들어, 아이소타입)인 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM(IgG의 4가지 서브클래스, 즉 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 포함)을 생성한다. 중쇄는 인간 중쇄일 수 있다.
항체와 관련하여 사용되는 "경쇄"라는 용어는, 아미노 말단 부분이 약 100개 내지 110개 이상 아미노산의 가변 영역을 포함하고, 카르복시 말단 부분이 불변 영역을 포함하는, 약 25 kDa의 폴리펩타이드 사슬을 나타낸다. 경쇄의 대략적인 길이는 211개 내지 217개 아미노산이다. 불변 도메인의 아미노산 서열에 기반하여 카파(κ) 또는 람다(λ)로 지칭되는 2개의 별개의 유형이 존재한다. 경쇄 아미노산 서열은 당업계에 널리 알려져 있다. 경쇄는 인간 경쇄일 수 있다.
"가변 영역", "가변 도메인", "V 영역" 또는 "V 도메인"이라는 용어는, 일반적으로 경쇄 또는 중쇄의 아미노 말단에 위치하고, 중쇄에 약 120개 내지 130개 아미노산과 경쇄에 약 100개 내지 110개 아미노산 길이를 가지며, 특정 항원에 대한 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에 사용되는 항체의 경쇄 또는 중쇄의 일부를 나타낸다. 중쇄의 가변 영역은 "VH"로 지칭될 수 있다. 경쇄의 가변 영역은 "VL"로 지칭될 수 있다. "가변"이라는 용어는, 가변 영역의 특정 분절이 항체들 간 서열에서 광범위하게 상이하다는 사실을 나타낸다. V 영역은 항원 결합을 매개하며, 특정 항원에 대한 특정 항체의 특이성을 정의한다. 하지만, 가변성은 가변 영역의 110개 아미노산 범위에 걸쳐 고르게 분포되어 있지 않다. 대신, V 영역은 각각 약 9개 내지 12개 아미노산 길이인 "초가변 영역"으로 불리는 더 큰 가변성인(극도로 가변성인) 짧은 영역에 의해 분리된, 약 15개 내지 30개 아미노산의 프레임워크 영역(FR)으로 불리는 덜 가변성인(상대적으로 불변성인) 스트레치로 이루어진다. 중쇄와 경쇄의 가변 영역은 각각, 주로 β 시트 입체배치를 취하고, 3개의 초가변 영역에 의해 연결되어 연결 루프를 형성하며, 일부 경우에는 β 시트 구조의 일부를 형성하는 4개의 FR을 포함한다. 각 사슬의 초가변 영역은 FR에 의해 근접하게 함께 모여있으며, 다른 사슬의 초가변 영역과 함께 항체의 항원 결합 부위를 형성하는 데 기여한다(예를 들어, 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (5th ed. 1991)] 참조). 불변 영역은 항체가 항원에 결합하는 데 직접 관여하지 않지만, 항체 의존성 세포독성(ADCC)과 보체 의존성 세포독성(CDC)에의 항체의 참여와 같은 다양한 이펙터 기능을 나타낸다. 가변 영역은 상이한 항체들 간 서열에서 광범위하게 상이하다. 특정 실시형태에서, 가변 영역은 인간 가변 영역이다.
"Kabat에서와 같은 가변 영역 잔기 넘버링" 또는 "Kabat에서와 같은 아미노산 위치 넘버링"이라는 용어 및 이의 변형은, 상기 Kabat 등의 문헌의 항체 편집에서 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역에 사용되는 넘버링 시스템을 나타낸다. 이러한 넘버링 시스템을 사용하면, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 CDR의 단축, 또는 이러한 FR 또는 CDR에의 삽입에 해당하는 더 적은 또는 추가의 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 52번 잔기 뒤에 단일 아미노산 삽입물(Kabat에 따른 52a번 잔기)과 82번 잔기 뒤에 3개의 삽입된 잔기(예를 들어, Kabat에 따른 82a번, 82b번 및 82c번 잔기 등)를 포함할 수 있다. 잔기의 Kabat 넘버링은 소정의 항체에 대해 항체 서열 중 상동성 영역을 "표준" Kabat 넘버링 서열과 정렬하는 방식으로 결정될 수 있다. Kabat 넘버링 시스템은 일반적으로 가변 도메인 내 잔기(대략, 경쇄의 1번 내지 107번 잔기와 중쇄의 1번 내지 113번 잔기)를 언급할 때 사용된다(예를 들어, 상기 Kabat 등의 문헌). "EU 넘버링 시스템" 또는 "EU 인덱스"는 일반적으로 면역글로불린 중쇄 불변 영역의 잔기를 언급할 때 사용된다(예를 들어, 상기 Kabat 등의 문헌에 보고된 EU 인덱스). "Kabat에서와 같은 EU 인덱스"는 인간 IgG 1 EU 항체의 잔기 넘버링을 나타낸다. AbM, Chothia, Contact, IMGT 및 AHon과 같은 다른 넘버링 시스템도 설명되어 있다.
"CDR"은 면역글로불린(Ig 또는 항체) VH β-시트 프레임워크의 비(non)-프레임워크 영역 내 3개의 초가변 영역 중 하나(H1, H2 또는 H3), 또는 항체 VL β 시트 프레임워크의 비-프레임워크 영역 내 3개의 초가변 영역 중 하나(L1, L2 또는 L3)를 나타낸다. 따라서, CDR은 프레임워크 영역 서열 내에 산재된 가변 영역 서열이다. CDR 영역은 당업자에게 널리 알려져 있으며, 예를 들어 Kabat에 따라, 항체 가변(V) 도메인 내 초가변성이 가장 큰 영역으로 정의되어 있다(문헌[Kabat et al., 1997, J. Biol. Chem. 252:6609-16]; 문헌[Kabat, 1978, Adv. Prot. Chem. 32:1-75]). CDR 영역 서열은 또한 Chothia에 따라, 보존된 β 시트 프레임워크의 일부가 아니기 때문에 상이한 입체형태를 취할 수 있는 잔기로 구조적으로 정의되어 있다(문헌[Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-17]). 두 가지 용어 모두 당업계에 널리 알려져 있다. CDR 영역 서열은 또한 AbM, Contact 및 IMGT에 따라 정의되었다. 표준 항체 가변 영역 내 CDR의 위치는 다수의 구조를 비교하는 방식으로 결정되었다(문헌[Al-Lazikani et al., 1997, J. Mol. Biol. 273:927-48]; 문헌[Morea et al., 2000, Methods 20:267-79]). 초가변 영역 내 잔기 수는 서로 다른 항체마다 다르기 때문에, 표준 위치에 대한 추가의 잔기는 전형적으로 표준 가변 영역 넘버링 지정 방식에서 잔기 번호 옆에 a, b, c 등으로 넘버링된다(상기 Al-Lazikani 등의 문헌). 이러한 명명법은 당업자에게 유사하게 널리 알려져 있다.
본원에 사용된 "초가변 영역", "HVR" 또는 "HV"라는 용어는, 서열에서 초가변성이고/이거나 구조적으로 정의된 루프를 형성하는 항체 가변 영역의 영역을 나타낸다. 일반적으로, 항체는 6개의 초가변 영역, 즉, VH에 3개(H1, H2, H3)와 VL에 3개(L1, L2, L3)를 포함한다. 다수의 초가변 영역 묘사가 사용되고 있으며, 본원에 포함되어 있다. Kabat 상보성 결정 영역(CDR)은 서열 가변성을 기반으로 하며, 가장 일반적으로 사용된다(예를 들어, 상기 Kabat 등의 문헌 참조). Chothia는 대신 구조 루프의 위치를 나타낸다(예를 들어, 문헌[Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-17] 참조). Kabat 넘버링 지정 규칙을 사용하여 넘버링될 때 Chothia CDR-H1 루프의 말단은 루프의 길이에 따라 H32와 H34 사이에서 달라진다(이는 Kabat 넘버링 지정 방식이 H35A와 H35B에 삽입을 배치하기 때문이며; 35A도 35B도 존재하지 않는 경우, 루프는 32에서 종결되고; 35A만 존재하는 경우, 루프는 33에서 종결되고; 35A와 35B가 모두 존재하는 경우, 루프는 34에서 종결됨). AbM 초가변 영역은 Kabat CDR과 Chothia 구조 루프 사이의 절충안을 나타내며, Oxford Molecular's AbM 항체모델링 소프트웨어에 사용된다(예를 들어, 문헌[Antibody Engineering Vol. 2 (Kontermann and Dubel eds., 2d ed. 2010)] 참조). "Contact" 초가변 영역은 이용 가능한 복합 결정 구조의 분석을 기반으로 한다. 이러한 초가변 영역 또는 CDR 각각의 잔기가 하기에 표시되어 있다.
최근, ImMunoGeneTics(IMGT) Information System®의 범용 넘버링 시스템이 개발되어 널리 채택되고 있다(문헌[Lafranc et al., 2003, Dev. Comp. Immunol. 27(1):55-77]). IMGT는 인간 및 다른 척추동물의 면역글로불린(IG), T세포 수용체(TCR) 및 주조직적합복합체(MHC)에 특화된 통합 정보 시스템이다. 여기서, CDR은 경쇄 또는 중쇄 내 아미노산 서열과 위치 둘 모두의 관점에서 지칭된다. 면역글로불린 가변 도메인의 구조 내 CDR의 "위치"는 종 사이에서 보존되고 루프로 불리는 구조에 존재하기 때문에, 구조 특징에 따라 가변 도메인 서열을 정렬하는 넘버링 시스템을 사용하면, CDR과 프레임워크 잔기가 용이하게 식별된다. 이러한 정보는 하나의 종의 면역글로불린의 CDR 잔기를 전형적으로 인간 항체의 수용체 프레임워크 형태에 이식하여 대체하는 데 사용될 수 있다. 추가의 넘버링 시스템(AHon)이 개발되었다(문헌[Honegger and Pluckthun, 2001, J. Mol. Biol. 309: 657-70]). 예를 들어 Kabat 넘버링과 IMGT 고유 넘버링 시스템을 포함하는 넘버링 시스템 사이의 대응은 당업자에게 널리 알려져 있다(예를 들어, 상기 Kabat 등의 문헌; 상기 Chothia과 Lesk의 문헌; 상기 Martin의 문헌; 상기 Lefranc 등의 문헌 참조). 일부 실시형태에서, CDR은 IMGT 넘버링 시스템에 따라 정의된 바와 같다. 다른 실시형태에서, CDR은 Kabat 넘버링 시스템에 따라 정의된 바와 같다. 특정 실시형태에서, CDR은 AbM 넘버링 시스템에 따라 정의된 바와 같다. 다른 실시형태에서, CDR은 Chothia 시스템에 따라 정의된 바와 같다. 또 다른 실시형태에서, CDR은 Contact 넘버링 시스템에 따라 정의된 바와 같다.
초가변 영역은 하기와 같은 "연장된 초가변 영역"을 포함할 수 있다: VL에 24번 내지 36번 또는 24번 내지 34번(L1), 46번 내지 56번 또는 50번 내지 56번(L2) 및 89번 내지 97번 또는 89번 내지 96번(L3)과, VH 도메인에 26번 내지 35번 또는 26번 내지 35A번(H1), 50번 내지 65번 또는 49번 내지 65번(H2), 및 93번 내지 102번, 94번 내지 102번 또는 95번 내지 102번(H3). 본원에 사용된 "HVR"과 "CDR"이라는 용어는 상호교환적으로 사용된다.
"불변 영역" 또는 "불변 도메인"이라는 용어는, 항체가 항원에 결합하는 데 직접적으로 관여하지 않지만, Fc 수용체와의 상호작용과 같은 다양한 이펙터 기능을 나타내는 경쇄와 중쇄의 카르복시 말단 부분을 나타낸다. 상기 용어는 면역글로불린의 다른 부분, 즉, 항원 결합 부위를 함유하는 가변 영역에 비해 더 보존된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 분자의 부분을 나타낸다. 불변 영역은 중쇄의 CH1, CH2 및 CH3 영역과 경쇄의 CL 영역을 함유할 수 있다.
"프레임워크" 또는 "FR"이라는 용어는, CDR을 플랭킹하는 가변 영역 잔기를 나타낸다. FR 잔기는, 예를 들어 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 도메인 항체, 디아바디, 선형 항체 및 이중특이적 항체에 존재한다. FR 잔기는 초가변 영역 잔기 또는 CDR 잔기가 아닌 가변 도메인 잔기이다.
본원에서 "Fc 영역"이라는 용어는, 예를 들어 천연 서열 Fc 영역, 재조합 Fc 영역 및 변이형 Fc 영역을 포함하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는 데 사용된다. 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계는 다양할 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226번 위치의 아미노산 잔기 또는 Pro230에서부터 이의 카르복시 말단까지 이어지는 것으로 정의된다. Fc 영역의 C-말단 리신(EU 넘버링 시스템에 따른 447번 잔기)은, 예를 들어 항체의 생산 또는 정제 동안, 또는 항체의 중쇄를 인코딩하는 핵산을 재조합적으로 조작하는 방식으로 제거될 수 있다. 따라서, 온전한 항체의 조성은 K447 잔기가 모두 제거된 항체 집단, K447 잔기가 제거되지 않은 항체 집단, 및 K447 잔기가 있거나 없는 항체 혼합물을 갖는 항체 집단을 포함할 수 있다.
"기능성 Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역의 "이펙터 기능"을 보유한다. 예시적인 "이펙터 기능"에는, C1q 결합, 보체 의존성 세포독성(CDC), Fc 수용체 결합, 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC), 항체 의존성 세포 포식작용(ADCP), 사이토카인 분비, 세포 표면 수용체(예를 들어, B세포 수용체)의 하향조절 및 B세포 활성화 등이 포함된다. 이러한 이펙터 기능은 일반적으로 Fc 영역이 결합 영역 또는 결합 도메인(예를 들어, 항체 가변 영역 또는 도메인)과 조합되는 것을 필요로 하며, 개시된 바와 같은 다양한 검정을 사용하여 평가될 수 있다.
"활성화 Fc 수용체"는 항체의 Fc 영역에 의한 결합 후, 이펙터 기능을 수행하도록 수용체 보유 세포를 자극하는 신호전달 사건을 유도하는 Fc 수용체이다. 예시적인 활성화 Fc 수용체에는, FcγRIIIα(CD16α), FcγRI(CD64), FcγRIIα(CD32) 및 FcαRI(CD89)가 포함된다.
"천연 서열 Fc 영역"은 자연에서 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일하며, 인간에 의해 조작, 변형 및/또는 변경(예를 들어, 단리, 정제, 선별, 또는 가변 영역 서열과 같은 다른 서열의 포함 또는 이러한 서열과의 조합)되지 않은 아미노산 서열을 포함한다. 천연 서열 인간 IgG1 Fc 영역에는, 천연 서열 인간 IgG1 Fc 영역(A가 아닌 동종이형 및 A 동종이형); 천연 서열 인간 IgG2 Fc 영역; 천연 서열 인간 IgG3 Fc 영역; 및 천연 서열 인간 IgG4 Fc 영역뿐 아니라, 이들의 자연 발생 변이체가 포함된다. 예를 들어, 천연 인간 IgG1 Fc 영역 아미노산 서열이 하기에 제공된다: DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(서열번호 6).
"변이형 Fc 영역"은 적어도 하나의 아미노산 변형(예를 들어, 치환, 부가 또는 결실)으로 인해 천연 서열 Fc 영역과 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 변이형 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩타이드의 Fc 영역에, 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩타이드의 Fc 영역과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환, 예를 들어 약 1개 내지 약 10개의 아미노산 치환, 또는 약 1개 내지 약 5개의 아미노산 치환을 갖는다. 본원의 변이형 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 및/또는 모 폴리펩타이드의 Fc 영역과 적어도 약 80% 상동성, 또는 적어도 약 90% 상동성, 예를 들어 적어도 약 95% 상동성을 보유할 수 있다. 예를 들어, 변이체.
아미노산 잔기/위치의 "변형"은 출발 아미노산 서열과 비교한 1차 아미노산 서열의 변화를 나타내며, 여기서 변화는 상기 아미노산 잔기/위치가 관여하는 서열 변경으로 인해 발생한다. 예를 들어, 전형적인 변형에는 또 다른 아미노산으로의 잔기의 치환(예를 들어, 보존적 또는 비보존적 치환), 상기 잔기/위치에 인접한 하나 이상(예를 들어, 일반적으로 5개, 4개 또는 3개 미만)의 아미노산의 삽입, 및/또는 상기 잔기/위치의 결실이 포함된다.
"이종이량체화를 촉진하는 변형"은 동종이량체를 형성하기 위해 해당 폴리펩타이드와 동일한 폴리펩타이드의 회합을 감소시키거나 방지하는 폴리펩타이드, 예를 들어 면역글로불린 중쇄의 번역 후 변형 또는 펩타이드 백본의 조작이다. 본원에 사용된 이종이량체화를 촉진하는 변형은 특히 이량체를 형성하기 위해 목적하는 2개의 폴리펩타이드 각각에 이루어진 별도의 변형을 포함하며, 여기서 변형은 2개의 폴리펩타이드의 회합을 촉진하도록 서로 상보적이다. 예를 들어, 이종이량체화를 촉진하는 변형은 이량체를 형성하기 위해 목적하는 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두의 구조 또는 전하를 변경시켜, 각각, 입체적으로 또는 정전기적으로 유리한 회합을 만들 수 있다. 이종이량체화는 2개의 동일하지 않은 폴리펩타이드, 예컨대 각 중쇄에 융합된 추가의 면역접합체 구성요소(예를 들어, IL-2 폴리펩타이드)가 동일하지 않은 2개의 면역글로불린 중쇄 사이에서 일어난다. 본 개시내용의 면역접합체에서, 이종이량체화를 촉진하는 변형은 중쇄(들), 구체적으로 면역글로불린 분자의 Fc 도메인에 있다. 일부 실시형태에서, 이종이량체화를 촉진하는 변형은 아미노산 돌연변이, 구체적으로 아미노산 치환을 포함한다. 특정 실시형태에서, 이종이량체화를 촉진하는 변형은 2개의 면역글로불린 중쇄 각각에 별도의 아미노산 돌연변이, 구체적으로 아미노산 치환을 포함한다.
본원에서 "Fc 도메인"이라는 용어는, 면역글로불린의 양쪽 중쇄의 Fc 영역으로 구성된 면역글로불린의 C-말단 부분을 정의하는 데 사용된다. Fc 도메인의 각 중쇄 Fc 영역은 본원에서 Fc 도메인의 서브유닛으로 지칭된다. Fc 도메인의 2개의 서브유닛은 두 개의 천연 서열 Fc 영역, 또는 2개의 변이형 Fc 영역, 또는 하나의 천연 서열 Fc 영역과 하나의 변이형 Fc 영역일 수 있다. 특정 실시형태에서, Fc 도메인은 2개의 동일하지 않은 면역글로불린 중쇄의 이종이량체화를 촉진하는 변형을 포함한다. 인간 IgG Fc 도메인의 2개의 폴리펩타이드 사슬 사이의 가장 광범위한 단백질-단백질 상호작용 부위는 Fc 영역의 CH3 도메인이다. 따라서, 일 실시형태에서, 상기 변형은 Fc 영역의 CH3 도메인에 있다. 특정 실시형태에서, 상기 변형은 "Fc-놉"으로 지칭되는 Fc 서브유닛 중 하나의 놉 변형과 "Fc-홀"로 지칭되는 Fc 서브유닛 중 다른 하나의 홀 변형을 포함하는 놉인투홀 변형이다. 놉인투홀 기술은, 예를 들어 미국 특허 제5,731,168호; 미국 특허 제7,695,936호; 문헌[Ridgway et al., Prat Eng 9, 617-621 (1996)] 및 문헌[Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)]에 기재되어 있다. 일반적으로, 상기 방법은 제1 폴리펩타이드의 경계면에 돌출부("놉")를 도입하고 제2 폴리펩타이드의 경계면에 상응하는 공동("홀")을 도입하여, 이종이량체 형성을 촉진하고 동종이량체 형성을 방해할 수 있도록 돌출부가 공동 안에 위치하게 하는 것을 포함한다. 돌출부는 제1 폴리펩타이드의 경계면의 작은 아미노산 측쇄를 더 큰 측쇄(예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체하는 방식으로 작제된다. 돌출부와 동일하거나 이와 유사한 크기의 상보적(compensatory) 공동은 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 측쇄(예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체하는 방식으로 제2 폴리펩타이드의 경계면에 형성된다. 돌출부와 공동은, 예를 들어 부위 특이적 돌연변이유발 또는 펩타이드 합성에 의해 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 변경하는 방식으로 만들어질 수 있다. 특정 실시형태에서, 놉 변형은 2개의 Fc 서브유닛 중 하나에 아미노산 치환 T366W를 포함하고, 홀 변형은 2개의 Fc 서브유닛 중 다른 하나에 아미노산 치환 T366S, L368A 및 Y407V를 포함한다. 추가의 특정 실시형태에서, 놉 변형을 포함하는 Fc 서브유닛은 아미노산 치환 S354C를 추가로 포함하고, 홀 변형을 포함하는 면역글로불린 중쇄는 아미노산 치환 Y349C를 추가로 포함한다. 이러한 2개의 시스테인 잔기의 도입은 2개의 중쇄 사이에 디설파이드 브릿지를 형성하여, 이량체를 추가로 안정화시킨다(문헌[Carter, J. Immunol Methods 248, 7-15 (2001)]).
펩타이드 또는 폴리펩타이드, 또는 항체와 관련하여 사용된 "변이체"라는 용어는, 천연 또는 변형되지 않은 서열과 비교하여 하나 이상(예컨대, 약 1개 내지 약 25개, 약 1개 내지 약 20개, 약 1개 내지 약 15개, 약 1개 내지 약 10개, 또는 약 1개 내지 약 5개)의 아미노산 서열 치환, 결실 및/또는 부가를 포함하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 나타낼 수 있다. 예를 들어, IL-2 변이체는 천연 IL-2의 아미노산 서열에 대한 하나 이상(예컨대, 약 1개 내지 약 25개, 약 1개 내지 약 20개, 약 1개 내지 약 15개, 약 1개 내지 약 10개, 또는 약 1개 내지 약 5개)의 변화로 인해 생성될 수 있다. 또한, 예로서, 항-FAP 항체의 변이체는 천연 또는 이전에 변형되지 않은 항-FAP 항체의 아미노산 서열에 대한 하나 이상(예컨대, 약 1개 내지 약 25개, 약 1개 내지 약 20개, 약 1개 내지 약 15개, 약 1개 내지 약 10개, 또는 약 1개 내지 약 5개)의 변화로 인해 생성될 수 있다. 변이체는 대립유전자 또는 스플라이스 변이체와 같이 자연 발생일 수 있거나, 인공적으로 작제될 수 있다. 폴리펩타이드 변이체는 변이체를 인코딩하는 상응하는 핵산 분자로부터 제조될 수 있다. 특정 실시형태에서, IL-2 변이체 또는 항-FAP 항체 변이체는, 각각, 적어도 IL-2 또는 항-FAP 항체 기능적 활성을 보유한다. 특정 실시형태에서, 항-FAP 항체 변이체는 FAP과 IL-2 둘 모두에 결합하는 이중특이적 항체이다. 특정 실시형태에서, 변이체는 IL-2 또는 항-FAP 항체의 VH 또는 VL 영역 또는 하위영역, 예컨대 하나 이상의 CDR을 인코딩하는 핵산 분자의 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP) 변이체에 의해 인코딩된다.
"온전한" 항체는 항원 결합 부위뿐 아니라, CL과 적어도 중쇄 불변 영역인 CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 항체이다. 불변 영역은 인간 불변 영역 또는 이의 아미노산 서열 변이체를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 온전한 항체는 하나 이상의 이펙터 기능을 갖는다.
"항체 단편"은 온전한 항체의 일부, 예컨대 온전한 항체의 항원 결합 영역 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예에는, 비제한적으로, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디 및 디-디아바디(예를 들어, 문헌[Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. 90:6444-48]; 문헌[Lu et al., 2005, J. Biol. Chem. 280:19665-72]; 문헌[Hudson et al., 2003, Nat. Med. 9:129-34]; WO 93/11161; 및 미국 특허 제5,837,242호 및 제6,492,123호 참조); 단일 사슬 항체 분자(예를 들어, 미국 특허 제4,946,778호; 제5,260,203호; 제5,482,858호; 및 제5,476,786호 참조); 이중 가변 도메인 항체(예를 들어, 미국 특허 제7,612,181호 참조); 단일 도메인 항체(sdAb)(예를 들어, 문헌[Woolven et al., 1999, Immunogenetics 50: 98-101]; 및 문헌[Streltsov et al., 2004, Proc Natl Acad Sci USA. 101:12444-49] 참조); 및 항체 단편으로 형성된 다중특이적 항체가 포함된다.
치료용 항체의 "기능성 단편", "결합 단편" 또는 "항원 결합 단편"은 온전한 항체에 기인하는 생물학적 기능 중 일부 또는 전부는 아니더라도 적어도 하나를 나타낼 것이며, 이러한 기능은 적어도 표적 항원에 대한 결합을 포함한다(예를 들어, IL-2 결합 단편 또는 IL-2에 결합하는 단편).
본원에 사용된 "면역접합체"라는 용어는, 적어도 하나의 사이토카인 모이어티와 적어도 하나의 항원 결합 모이어티를 포함하는 폴리펩타이드 분자를 나타낸다. 특정 실시형태에서, 면역접합체는 적어도 하나의 사이토카인 모이어티(예를 들어, IL-2)와 적어도 2개의 항원 결합 모이어티(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 차폐 모이어티와 고정 모이어티)를 포함한다. 특히, 특정 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 면역접합체는 하나의 사이토카인 모이어티와, 하나 이상의 링커 서열에 의해 연결된 2개의 항원 결합 모이어티를 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 면역접합체는 하나의 사이토카인 모이어티와, 면역글로불린의 Fc 도메인에 의해 연결된 2개의 항원 결합 모이어티를 포함한다. 본 개시내용의 다양한 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 본원에 기재된 바와 같은 다양한 상호작용과 다양한 입체배치에 의해 사이토카인 모이어티에 연결될 수 있다.
펩타이드 또는 폴리펩타이드, 또는 항체와 관련하여 사용된 "융합", "융합하다" 또는 다른 문법적 변형은, 펩타이드 또는 폴리펩타이드, 또는 이의 단편, 변이체 및/또는 유도체를, 이종 펩타이드 또는 폴리펩타이드와 연결시키는 것을 나타낸다.
"친화도 성숙된" 항체는 하나 이상의 HVR에 하나 이상의 변경(예를 들어, 변경, 부가 및/또는 결실을 포함하는 아미노산 서열 변이)을 가짐으로써, 이러한 변경(들)을 갖지 않는 모 항체와 비교하여 항원에 대한 항체의 친화도가 개선된 항체이다. 친화도 성숙된 항체는 표적 항원에 대하여 나노몰 또는 심지어 피코몰 수준의 친화도를 가질 수 있다. 친화도 성숙된 항체는 당업계에 알려진 절차에 따라 생산된다. 검토는, 문헌[Hudson and Souriau, 2003, Nature Medicine 9:129-34]; 문헌[Hoogenboom, 2005, Nature Biotechnol. 23:1105-16]; 문헌[Quiroz and Sinclair, 2010, Revista Ingeneria Biomedia 4:39-51] 참조.
"결합 친화도"는 일반적으로 분자의 단일 결합 부위(예를 들어, 항체와 같은 결합 단백질)와 이의 결합 파트너(예를 들어, 항원) 사이의 비공유결합형 상호작용의 총합의 강도를 나타낸다. 달리 지시되지 않는 한, 본원에 사용된 "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원들(예를 들어, 항체와 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 나타낸다. 분자 X의 이의 결합 파트너 Y에의 결합에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수(KD)로 표시될 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 것들을 포함하여 당업계에 알려진 일반적인 방법으로 측정될 수 있다. 저친화도 항체는 일반적으로 항원에 서서히 결합하고 쉽게 해리되는 경향이 있지만, 고친화도 항체는 일반적으로 항원에 더 빨리 결합하고 결합된 상태를 더 오래 유지하는 경향이 있다. 결합 친화도를 측정하는 다양한 방법이 당업계에 알려져 있으며, 이들 중 임의의 것이 본 개시내용의 목적을 위해 사용될 수 있다. 특정한 예시적인 실시형태에는 하기가 포함된다. 하나의 실시형태에서, "KD" 또는 "KD 값"은 당업계에 알려진 검정, 예를 들어 결합 검정으로 측정될 수 있다. KD는, 예를 들어 관심 항체의 Fab 버전과 이의 항원을 이용하여 수행되는 RIA로 측정될 수 있다(문헌[Chen et al., 1999, J. Mol Biol 293:865-81]). KD 또는 KD 값은 또한, 예를 들어 Biacore®TM-2000 또는 Biacore®TM-3000을 사용하여 Biacore®에 의한 표면 플라즈몬 공명 검정을 사용하거나, 예를 들어 Octet®QK384 또는 GatorTM 시스템을 사용하여 생체층 간섭계를 통해 측정될 수 있다. "온 속도(on-rate)" 또는 "회합의 속도" 또는 "회합 속도" 또는 "kon"은 또한, 예를 들어 Biacore®TM-2000 또는 Biacore®TM-3000, 또는 Octet®QK384 또는 GatorTM 시스템을 사용하여 상기 기재된 바와 동일한 표면 플라즈몬 공명 또는 생체층 간섭계 기술을 이용하여 결정될 수 있다.
본원에 사용된 "저해" 또는 "저해하다"라는 용어는, 부분적(예컨대, 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 25%, 50%, 75%, 90%, 95%, 99%) 또는 완전한(즉, 100%) 저해를 나타낸다.
"Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 나타낸다. 예시적인 FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 나아가, 예시적인 FcR은 IgG 항체에 결합하는 수용체(예를 들어, 감마 수용체)이며, 이에는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 서브클래스의 수용체(이러한 수용체의 대립유전자 변이체 및 대안적으로 스플라이싱된 형태 포함)가 포함된다. FcγRII 수용체에는 FcγRIIA("활성화 수용체")와 FcγRIIB("저해 수용체")가 포함되며, 이들은 주로 이의 세포질 도메인이 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다(예를 들어, 문헌[Daeron, 1997, Annu. Rev. Immunol. 15:203-34] 참조). 다양한 FcR이 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Ravetch and Kinet, 1991, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92]; 문헌[Capel et al., 1994, Immunomethods 4:25-34]; 및 문헌[de Haas et al., 1995, J. Lab. Clin. Med. 126:330-41] 참조). 본원의 "FcR"이라는 용어에 다른 FcR(향후 확인될 것들 포함)도 포함된다. 상기 용어는 또한 모체의 IgG를 태아로 전달하는 것을 담당하는 신생아 수용체인 FcRn을 포함한다(예를 들어, 문헌[Guyer et al., 1976, J. Immunol. 117:587-93]; 및 문헌[Kim et al., 1994, Eu. J. Immunol. 24:2429-34] 참조). FcR에 대한 결합이 개선되거나 감소된 항체 변이체도 설명되어 있다(예를 들어, 국제공개 WO 2000/42072; 미국 특허 제7,183,387호; 제7,332,581호; 및 제7.335,742호; 문헌[Shields et al. 2001, J. Biol. Chem. 9(2):6591-604] 참조).
"벡터"라는 용어는, 핵산 서열을 숙주세포에 도입하기 위해, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 사이토카인 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 서열을 운반하거나 포함하는 데 사용되는 물질을 나타낸다. 사용하기에 적합한 벡터에는, 예를 들어 발현 벡터, 플라스미드, 파지 벡터, 바이러스 벡터, 에피솜 및 인공 염색체가 포함되며, 이는 숙주세포의 염색체로의 안정적인 통합을 위해 작동 가능한 선별 서열 또는 마커를 포함할 수 있다. 또한, 벡터는 하나 이상의 선별 마커 유전자와 적절한 발현 제어 서열을 포함할 수 있다. 포함될 수 있는 선별 마커 유전자는, 예를 들어 항생제 또는 독소에 대한 내성을 제공하거나, 영양요구성 결핍을 보완하거나, 또는 배양 배지에 없는 중요한 영양소를 공급한다. 발현 제어 서열은 당업계에 널리 알려져 있는 구성적 및 유도성 프로모터, 전사 인핸서, 전사 종결인자 등을 포함할 수 있다. 2개 이상의 핵산 분자가 공동 발현되는 경우(예를 들어, 항체의 중쇄와 경쇄, 또는 항체의 VH와 VL 둘 모두), 2개의 핵산 분자는, 예를 들어 단일 발현 벡터 또는 별개의 발현 벡터에 삽입될 수 있다. 단일 벡터 발현의 경우, 인코딩 핵산은 하나의 공통 발현 제어 서열에 작동적으로 연결되거나, 하나의 유도성 프로모터와 하나의 구성적 프로모터와 같은 상이한 발현 제어 서열에 연결될 수 있다. 숙주세포에의 핵산 분자의 도입은 당업계에 널리 알려진 방법을 사용하여 확인할 수 있다. 이러한 방법에는, 예를 들어 mRNA의 노던 블롯 또는 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭과 같은 핵산 분석, 유전자 산물의 발현을 위한 면역블롯팅, 또는 도입된 핵산 서열 또는 이의 상응하는 유전자 산물의 발현을 시험하는 데 적합한 다른 분석 방법이 포함된다. 당업자는, 핵산 분자가 목적하는 산물(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 항-FAP 항체)를 생산하는 데 충분한 양으로 발현된다는 것을 이해하고, 발현 수준은 당업계에 널리 알려진 방법을 사용하여 충분한 발현을 얻도록 최적화될 수 있다는 것을 추가로 이해해야 한다.
"단리된 핵산"은 다른 게놈 DNA 서열뿐 아니라, 천연 서열에 자연적으로 수반되는 리보솜 및 폴리머라아제와 같은 단백질 또는 복합체에서 실질적으로 분리된 핵산, 예를 들어 RNA, DNA 또는 혼합 핵산이다. "단리된" 핵산 분자는 핵산 분자의 천연 공급원에 존재하는 다른 핵산 분자에서 분리된 핵산 분자이다. 나아가, cDNA 분자와 같은 "단리된" 핵산 분자는, 다른 세포 물질, 또는 재조합 기술에 의해 생산되는 경우 배양 배지가 실질적으로 유리되어 있을 수 있거나, 화학적으로 합성되는 경우 화학 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 유리되어 있을 수 있다. 특정 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 항체를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자는 단리되거나 정제된다. 상기 용어는 자연 발생 환경에서 제거된 핵산 서열을 포함하며, 이에는 재조합 또는 클로닝된 DNA 단리물과, 화학적으로 합성된 유사체 또는 이종 시스템에 의해 생물학적으로 합성된 유사체가 포함된다. 실질적으로 순수한 분자는 분자의 단리된 형태를 포함할 수 있다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 "폴리뉴클레오타이드" 또는 "핵산"은, 임의의 길이의 뉴클레오타이드 중합체를 나타내며, 이에는 DNA와 RNA가 포함된다. 뉴클레오타이드는 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드 또는 염기, 및/또는 이의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라아제, 또는 합성 반응에 의해 중합체에 혼입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오타이드와 이의 유사체를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 "올리고뉴클레오타이드"는, 반드시는 아니지만 일반적으로 길이가 약 200개 미만인 뉴클레오타이드인, 짧고, 일반적으로 단일 가닥인 합성 폴리뉴클레오타이드를 나타낸다. "올리고뉴클레오타이드"와 "폴리뉴클레오타이드"라는 용어는 상호 배타적이지 않다. 폴리뉴클레오타이드에 대한 상기 설명은 올리고뉴클레오타이드에 완전히 동일하게 적용 가능하다. 본 개시내용의 항체를 생산하는 세포는 모 하이브리도마 세포뿐 아니라, 항체를 인코딩하는 핵산이 도입된 박테리아 및 진핵생물 숙주세포를 포함할 수 있다. 적합한 숙주세포가 하기 개시된다.
달리 명시되지 않는 한, 본원에 개시된 임의의 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드 서열의 좌측 말단은 5' 말단이고; 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드 서열의 좌측 방향은 5' 방향으로 지칭된다. 초기 RNA 전사체의 5'→3' 부가 방향은 전사 방향으로 지칭되고; RNA 전사체의 5' 말단에 대해 5'에 있는 RNA 전사체와 동일한 서열을 갖는 DNA 가닥 상의 서열 영역은 "업스트림 서열"로 지칭되고; RNA 전사체의 3' 말단에 대해 3'에 있는 RNA 전사체와 동일한 서열을 갖는 DNA 가닥 상의 서열 영역은 "다운스트림 서열"로 지칭된다.
핵산 분자와 관련하여 사용되는 "인코딩 핵산"이라는 용어 또는 이의 문법적 등가 표현은, 전사되어 mRNA를 생산할 수 있고, 이어서 폴리펩타이드 및/또는 이의 단편으로 번역될 수 있는, 천연 상태의 또는 당업자에게 널리 알려진 방법으로 조작된 핵산 분자를 나타낸다. 안티센스 가닥은 이러한 핵산 분자의 보체이며, 인코딩 서열은 이로부터 도출될 수 있다.
"재조합 항체"라는 용어는, 재조합 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나 또는 단리된 항체를 나타낸다. 재조합 항체는 숙주세포에 트랜스펙션된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 항체, 재조합 복합 항체 라이브러리에서 단리된 항체, 인간 면역글로불린 유전자에 대해 유전자이식 및/또는 염색체이식된 동물(예를 들어, 마우스 또는 소)에서 단리된 항체(예를 들어, 문헌[Taylor et al., 1992, Nucl. Acids Res. 20:6287-95] 참조), 또는 면역글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열에 스플라이싱하는 것을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나 또는 단리된 항체일 수 있다. 이러한 재조합 항체는 가변 영역과 불변 영역(인간 생식계열 면역글로불린 서열에서 유도된 것들 포함)을 가질 수 있다(상기 Kabat 등의 문헌 참조). 하지만, 특정 실시형태에서, 이러한 재조합 항체는 시험관내 돌연변이유발(또는, 인간 Ig 서열에 대해 유전자이식된 동물이 사용되는 경우, 생체내 체세포 돌연변이유발)에 적용되어, 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열이, 인간 생식계열 VH 및 VL 서열에서 유도되고 이와 관련이 있지만, 생체내 인간 항체 생식계열 레파토리 내에 자연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이 될 수 있다.
"조성물"이라는 용어는, 명시된 성분(예를 들어, 본원에 제공된 면역접합체 분자)이, 선택적으로 명시된 양으로 함유된 생성물을 포함하는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 "담체"는 이용되는 투여량 및 농도에서 이에 노출되는 세포 또는 포유동물에 비독성인 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제를 포함한다. 종종, 생리학적으로 허용 가능한 담체는 pH 완충 수용액이다. 생리학적으로 허용 가능한 담체의 예에는, 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산을 포함하는 항산화제; 저분자량(예를 들어, 약 10개 미만의 아미노산 잔기) 폴리펩타이드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 단당류, 이당류, 및 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 만니톨 또는 소르비톨과 같은 당 알코올; 소듐과 같은 염 형성 반대 이온; 및/또는 TWEEN™, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 및 PLURONICS™과 같은 비이온성 계면활성제가 포함된다. "담체"라는 용어는 또한, 희석제, 아쥬반트(예를 들어, 프로인트(Freund) 아쥬반트(완전 및 불완전)), 부형제 또는 비히클을 나타낼 수 있다. 이러한 담체(약학적 담체 포함)는, 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 것을 포함하는 물 및 오일과 같은 멸균 액체, 예컨대 땅콩유, 대두유, 미네랄 오일, 참기름 등일 수 있다. 조성물(예를 들어, 약학적 조성물)이 정맥내 투여되는 경우, 예시적인 담체는 물이다. 식염수, 및 덱스트로오스 및 글리세롤 수용액이 또한, 특히 주사 용액을 위한 액체 담체로 이용될 수 있다. 적합한 부형제(예를 들어, 약학적 부형제)에는, 전분, 글루코오스, 락토오스, 수크로오스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악(chalk), 실리카겔, 스테아르산소듐, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화소듐, 탈지분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등이 포함된다. 조성물은, 목적하는 경우, 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 또한 미량 함유할 수 있다. 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 환제, 캡슐, 분말, 서방형 제형 등의 형태를 취할 수 있다. 경구 조성물(제형 포함)은 약학적 등급의 만니톨, 락토오스, 전분, 스테아르산마그네슘, 소듐 사카린, 셀룰로오스, 탄산마그네슘 등과 같은 표준 담체를 포함할 수 있다. 적합한 약학적 담체의 예는 문헌[Remington and Gennaro, Remington's Pharmaceutical Sciences (18th ed. 1990)]에 기재되어 있다. 조성물(약학적 화합물 포함)은, 예를 들어 적합한 양의 담체와 함께 단리된 또는 정제된 형태의 항체를 함유할 수 있다.
본원에 사용된 "약학적으로 허용 가능한"이라는 용어는, 동물, 보다 특히 인간에서의 사용을 위해, 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되었거나, 미국 약전, 유럽 약전, 또는 일반적으로 인정되는 다른 약전에 열거되어 있음을 의미한다.
"부형제"라는 용어는, 희석제, 비히클, 보존제, 결합제 또는 안정화제로서 통상적으로 사용되는 불활성 물질을 나타내며, 이에는, 비제한적으로, 단백질(예를 들어, 혈청 알부민 등), 아미노산(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산, 리신, 아르기닌, 글리신, 히스티딘 등), 지방산 및 인지질(예를 들어, 알킬 설포네이트, 카프릴레이트 등), 계면활성제(예를 들어, SDS, 폴리소르베이트, 비이온성 계면활성제 등), 다당류(예를 들어, 수크로오스, 말토오스, 트레할로오스 등) 및 폴리올(예를 들어, 만니톨, 소르비톨 등)이 포함된다. 또한, 문헌[Remington and Gennaro, Remington's Pharmaceutical Sciencess (18th ed. 1990)](상기 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 인용됨) 참조.
"대상"과 "환자"라는 용어는 상호교환적으로 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 본원에 사용된 대상은 비영장류(예를 들어, 소, 돼지, 말, 고양이, 개, 래트 등) 또는 영장류(예를 들어, 원숭이 및 인간)와 같은 포유동물이다. 특정 실시형태에서, 대상은 인간이다.
"투여하다" 또는 "투여"는, 체외에 존재하는 물질(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 면역접합체 분자)을 환자에게, 예컨대 점막, 피내, 정맥내, 근육내 전달, 및/또는 본원에 기재되어 있거나 당업계에 알려진 임의의 다른 물리적 전달 방법에 의해 주사하거나 다르게는 물리적으로 전달하는 행위를 나타낸다.
본원에 사용된 "유효량"이라는 용어는, 목적하는 결과를 생성하는 데 충분한 본원에 제공된 항체 또는 약학적 조성물의 양을 나타낸다.
"약" 및 "대략"이라는 용어는, 소정의 값 또는 범위의 20% 이내, 15% 이내, 10% 이내, 9% 이내, 8% 이내, 7% 이내, 6% 이내, 5% 이내, 4% 이내, 3% 이내, 2% 이내, 1% 이내 또는 그 미만을 의미한다.
"실질적으로 모든"은 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%를 나타낸다.
"실질적으로 유사한" 또는 "실질적으로 동일한"이라는 구절은, 2개의 수치 값(예를 들어, 본 개시내용의 항체와 관련된 하나의 값과 참조 항체와 관련된 다른 하나의 값) 사이의 충분히 높은 정도의 유사성을 나타내므로, 당업자는 2개의 값 사이의 차이가 해당 값(예를 들어, KD 값)으로 측정되는 생물학적 특징의 맥락에서 생물학적 및/또는 통계적 유의성이 없거나 거의 없다고 간주할 수 있다. 예를 들어, 2개의 값 사이의 차이는, 참조 항체에 대한 값의 함수로서 약 50% 미만, 약 40% 미만, 약 30% 미만, 약 20% 미만, 약 10% 미만 또는 약 5% 미만일 수 있다.
본원에 사용된 "실질적으로 증가된", "실질적으로 감소된" 또는 "실질적으로 상이한"이라는 구절은, 2개의 수치 값(예를 들어, 본 개시내용의 항체와 관련된 하나의 값과 참조 항체와 관련된 다른 하나의 값) 사이의 충분히 높은 정도의 차이를 나타내므로, 당업자는 2개의 값 사이의 차이가 해당 값으로 측정되는 생물학적 특징의 맥락에서 통계적 유의성이 있다고 간주할 수 있다. 예를 들어, 상기 2개의 값 사이의 차이는, 참조 항체에 대한 값의 함수로서 약 10% 초과, 약 20% 초과, 약 30% 초과, 약 40% 초과 또는 약 50% 초과일 수 있다.
5.3 조성물 및 이의 제조 방법
본 개시내용의 일 양태에서, 사이토카인 함유 면역접합체 분자가 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 면역접합체 분자는 서로 작동 가능하게 연결된 사이토카인 모이어티와 비(non)-사이토카인 부분을 포함하는 융합 단백질이다. 본 개시내용에 따르면, 사이토카인 함유 면역접합체 분자는 대상의 특정 조직 또는 세포 위치에 사이토카인의 세포 활성을 전달하고 해당 위치에서 사이토카인의 세포 활성을 활성화시킬 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 면역접합체 분자가 사이토카인에 대한 활성화 신호가 결여된 환경에 존재하는 경우, 사이토카인 활성은 감소되거나 차단된다. 일부 실시형태에서, 면역접합체 분자가 사이토카인에 대한 활성화 신호를 함유하거나 이러한 신호가 농축된 환경에 존재하는 경우, 사이토카인 활성은 활성화되거나 증강된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 면역접합체 분자는 대상에의 투여 시 조직 특이적으로 분포되도록 구성된다. 특정 실시형태에서, 면역접합체 분자는 사이토카인에 대한 활성화 신호를 제공하는 특정 조직 또는 세포 환경에 농축되어, 이러한 조직 또는 세포 환경에서 사이토카인 활성을 특이적으로 활성화시킬 수 있다.
특정 실시형태에서, 사이토카인에 대한 활성화 신호는 사이토카인 활성이 활성화되는 표적 조직 또는 세포 환경 내 신호 분자의 존재이다. 일부 실시형태에서, 신호 분자는 표적 조직 또는 세포 환경에 농축되어 있지만, 다른 비-표적 조직 또는 세포 환경에는 더 적은 양 또는 농도로 존재한다. 일부 실시형태에서, 사이토카인에 대한 활성화 신호는 표적 조직 또는 세포 환경에 신호 분자가 임계값보다 높은 농도로 존재하는 것이다. 일부 실시형태에서, 신호 분자는 면역접합체 분자와 상호작용하여, 사이토카인 활성을 활성화시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 신호 분자는 펩타이드 분자이다.
특정 실시형태에서, 면역접합체 분자는 종양과 같은 암성 조직에서의 사이토카인 활성의 표적화된 전달 및 활성화를 위해 구성된다. 이러한 실시형태에서, 사이토카인 활성화를 위한 신호 분자는 종양 미세환경과 같은 암성 조직에서 발현되거나 이러한 조직에 농축되어 있는 항원일 수 있다. 특정 실시형태에서, 사이토카인에 대한 활성화 신호는 종양 세포에서 발현되는 항원이다. 다른 실시형태에서, 사이토카인에 대한 활성화 신호는 종양 간질세포와 같은 종양 미세환경 내 세포에서 발현되는 항원이다. 특정 실시형태에서, 사이토카인에 대한 활성화 신호는 종양 관련 항원이다.
일부 실시형태에서, 면역접합체 분자의 비-사이토카인 부분은 사이토카인 모이어티와 결합할 수 있는 차폐 모이어티를 포함하며, 결합 시, 차폐 모이어티는 사이토카인 활성을 감소시키거나 차단한다. 일부 실시형태에서, 면역접합체 분자는 사이토카인 폴리펩타이드에 융합되는 항체 또는 이의 항원 결합 단편과, 사이토카인 폴리펩타이드와 결합하여 사이토카인 활성을 감소시키거나 차단할 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
일부 실시형태에서, 면역접합체 분자의 사이토카인 모이어티와 차폐 모이어티 사이의 분자내 결합은 가역적이다. 따라서, 일부 실시형태에서, 면역접합체 분자는 사이토카인 모이어티와 차폐 모이어티 사이의 가역적 결합 및 해리를 통해 사이토카인 활성 상태와 비활성 상태 사이에서 전환될 수 있다.
일부 실시형태에서, 차폐 모이어티는 사이토카인 모이어티와, 사이토카인과 상이한 제2 표적 항원에 결합할 수 있는 이중특이적 투인원 항체 또는 이의 결합 단편이다. 특정 실시형태에서, 면역접합체 분자가 제2 표적 항원이 존재하지 않는 환경에 존재하는 경우, 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 차폐 모이어티는 면역접합체 분자의 사이토카인 모이어티와 결합하여, 사이토카인 활성을 저해한다. 특정 실시형태에서, 면역접합체 분자가 제2 표적 항원이 특정 임계값보다 낮은 양 또는 농도로 존재하는 환경에 존재하는 경우, 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 차폐 모이어티는 면역접합체 분자의 사이토카인 모이어티와 결합하여, 사이토카인 활성을 저해한다. 다양한 실시형태에서, 환경은 세포 환경 또는 조직 특이적 환경이다. 특정 실시형태에서, 환경은 암성 조직 또는 종양 미세환경이다. 특정 실시형태에서, 제2 표적 항원은 암 세포에 의해 발현되는 항원이다. 다른 실시형태에서, 제2 표적 항원은 종양 간질세포와 같은 종양 미세환경 내 세포에 의해 발현되는 항원이다. 일부 실시형태에서, 제2 표적 항원은 종양 관련 항원이다.
일부 실시형태에서, 차폐 모이어티는 사이토카인 모이어티와, 사이토카인과 상이한 제2 표적 항원에 결합할 수 있는 이중특이적 투인원 항체 또는 이의 결합 단편이다. 특정 실시형태에서, 면역접합체 분자가 제2 표적 항원이 존재하는 환경에 존재하는 경우, 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 차폐 모이어티는 제2 항원에 결합하고 면역접합체 분자의 사이토카인 모이어티에서 해리되어, 사이토카인 활성을 활성화시킨다. 특정 실시형태에서, 면역접합체 분자가 제2 표적 항원이 특정 임계값보다 높은 양 또는 농도로 존재하는 환경에 존재하는 경우, 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 차폐 모이어티는 제2 항원에 결합하고 면역접합체 분자의 사이토카인 모이어티에서 해리되어, 사이토카인 활성을 활성화시킨다. 다양한 실시형태에서, 환경은 세포 환경 또는 조직 특이적 환경이다. 특정 실시형태에서, 환경은 암성 조직 또는 종양 미세환경이다. 특정 실시형태에서, 제2 표적 항원은 종양 세포에 의해 발현되는 항원이다. 다른 실시형태에서, 제2 표적 항원은 종양 간질세포와 같은 종양 미세환경 내 세포에 의해 발현되는 항원이다. 일부 실시형태에서, 제2 표적 항원은 종양 관련 항원이다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용의 면역접합체 분자는 사이토카인 모이어티와 비-사이토카인 부분을 포함하며, 여기서 사이토카인 모이어티는 인터류킨-2(IL-2) 폴리펩타이드를 포함하고, 비-사이토카인 부분은 면역접합체 분자 내 IL-2 폴리펩타이드와 IL-2가 아닌 제2 표적 항원에 모두 결합할 수 있는 이중특이적 투인원 항체를 포함한다. 특정 실시형태에서, 제2 표적 항원은 종양 세포에 의해 발현되는 항원이다. 다른 실시형태에서, 제2 표적 항원은 종양 간질세포와 같은 종양 미세환경 내 세포에 의해 발현되는 항원이다. 일부 실시형태에서, 제2 표적 항원은 종양 관련 항원이다. 특정 실시형태에서, 제2 표적 항원은 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)이다. 또 다른 특정 실시형태에서, IL-2 폴리펩타이드는 야생형 IL-2 폴리펩타이드이다. 다른 실시형태에서, IL-2 폴리펩타이드는 돌연변이형 IL-2 폴리펩타이드이다. 일부 실시형태에서, IL-2 폴리펩타이드는 인간 IL-2 폴리펩타이드이다. 일부 실시형태에서, IL-2 폴리펩타이드는 원숭이 IL-2 폴리펩타이드이다. 일부 실시형태에서, IL-2 폴리펩타이드는 마우스 IL-2 폴리펩타이드이다. 일부 실시형태에서, IL-2 폴리펩타이드는 본원에 기재된 바와 같은 돌연변이형 IL-2 폴리펩타이드이다. 특정 실시형태에서, 돌연변이형 IL-2 폴리펩타이드는 IL-2hex이다. 본 개시내용과 관련하여 사용될 수 있는 추가의 돌연변이형 IL-2 폴리펩타이드는 미국 특허 제10,184,009호 및 제5,229,109호, 및 국제공개 WO2012107417A1호에서 확인할 수 있으며, 상기 문헌들 각각의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다.
일부 실시형태에서, 면역접합체 분자의 비-사이토카인 부분은 면역접합체 분자를 전달의 표적 위치에 고정시키도록 구성된 고정 모이어티를 포함한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 고정 모이어티를 갖는 본 개시내용의 면역접합체 분자는 대상에게 투여된 후, 예컨대 대상에게 전신 투여된 후, 조직 특이적 분포를 달성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역접합체 분자의 고정 모이어티는 전달의 표적 위치에 존재하는 표적 분자에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역접합체 분자의 고정 모이어티는 전달의 표적 위치에 존재하는 항원에 결합하여 면역접합체 분자를 전달의 표적 위치에 고정시킬 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
일부 실시형태에서, 전달의 표적 위치는 세포 환경 또는 조직 특이적 환경이다. 일부 실시형태에서, 전달의 표적 위치는 또한 사이토카인 활성이 표적 위치에서 활성화될 수 있도록 면역접합체 분자의 사이토카인에 대한 활성화 신호를 함유한다.
특정 실시형태에서, 전달의 표적 위치는 암성 조직 또는 종양 미세환경이다. 일부 실시형태에서, 전달의 표적 위치는 대상 내 특정 유형의 조직 또는 세포 집단이다. 일부 실시형태에서, 면역접합체 분자의 고정 모이어티는 암 세포에서 발현되는 항원에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 따라서, 이러한 실시형태에서, 면역접합체 분자는, 암을 앓고 있는 대상에게의 투여 시, 대상의 암 세포 집단에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역접합체 분자의 고정 모이어티는 종양 미세환경에 존재하는 항원, 예컨대 종양 세포의 표면에서 발현되는 항원, 또는 종양 간질세포와 같은 종양 미세환경 내 세포에 의해 분비되는 항원에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 따라서, 이러한 실시형태에서, 면역접합체 분자는, 고형 종양이 있는 대상에게의 투여 시, 대상의 종양 미세환경에 농축될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 면역접합체 분자는 서로 작동 가능하게 연결된 사이토카인 모이어티, 차폐 모이어티 및 고정 모이어티를 포함한다. 특정 실시형태에서, 차폐 모이어티는 사이토카인 모이어티와 사이토카인이 아닌 제2 표적 항원 둘 모두에 결합할 수 있는 이중특이적 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 특정 실시형태에서, 고정 모이어티는 면역접합체 분자 전달의 표적 위치에 존재하는 항원과 같은 제3 표적 항원에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 일부 실시형태에서, 전달의 표적 위치는 또한 차폐 모이어티와의 결합에 대해 사이토카인과 경쟁하기에 충분한 양으로 제2 표적 항원을 함유하여, 사이토카인으로부터 차폐 모이어티를 해리시키고, 전달의 표적 위치에서 사이토카인 활성을 활성화시킨다.
일부 실시형태에서, 면역접합체 분자는, 대상에게의 투여 시, 조직 특이적 분포를 달성하여, 충분한 양의 제3 항원을 함유하는 대상의 표적 조직 또는 세포 환경에 농축될 수 있다. 특정 실시형태에서, 표적 조직 또는 세포 환경은 또한 차폐 모이어티와의 결합에 대해 사이토카인과 경쟁하기에 충분한 양으로 제2 표적 항원을 함유하여, 사이토카인으로부터 차폐 모이어티를 해리시키고, 표적 조직 또는 세포 환경에서 사이토카인 활성을 활성화시킨다.
특정 실시형태에서, 면역접합체의 차폐 모이어티 및 고정 모이어티에 의해 각각 인식되는 제2 표적 항원과 제3 표적 항원은 동일한 항원이다. 대안적인 실시형태에서, 면역접합체의 차폐 모이어티 및 고정 모이어티에 의해 각각 인식되는 제2 표적 항원과 제3 표적 항원은 상이한 항원이다.
특정 실시형태에서, 사이토카인 모이어티는 인터류킨-2(IL-2) 폴리펩타이드를 포함하고, 면역접합체 분자의 비-사이토카인 부분은 면역접합체 분자 내 IL-2 폴리펩타이드와 IL-2가 아닌 제2 표적 항원에 모두 결합할 수 있는 이중특이적 투인원 항체를 포함하는 차폐 모이어티를 포함한다. 특정 실시형태에서, 제2 표적 항원은 종양 세포에 의해 발현되는 항원이다. 다른 실시형태에서, 제2 표적 항원은 종양 간질세포와 같은 종양 미세환경 내 세포에 의해 발현되는 항원이다. 일부 실시형태에서, 제2 표적 항원은 종양 관련 항원이다. 특정 실시형태에서, 제2 표적 항원은 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)이다. 특정 실시형태에서, 면역접합체 분자의 비-사이토카인 부분은 IL-2가 아닌 제3 표적 항원에 결합할 수 있는 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 고정 모이어티를 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서, 제3 표적 항원은 종양 세포에 의해 발현되는 항원이다. 일부 실시형태에서, 제3 표적 항원은 종양 간질세포와 같은 종양 미세환경 내 세포에 의해 발현되는 항원이다. 일부 실시형태에서, 제3 표적 항원은 종양 관련 항원이다. 특정 실시형태에서, 제3 표적 항원은 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)이다. 또 다른 특정 실시형태에서, IL-2 폴리펩타이드는 야생형 IL-2 폴리펩타이드이다. 또 다른 특정 실시형태에서, IL-2 폴리펩타이드는 야생형 IL-2 폴리펩타이드이다. 다른 실시형태에서, IL-2 폴리펩타이드는 돌연변이형 IL-2 폴리펩타이드이다. 일부 실시형태에서, IL-2 폴리펩타이드는 인간 IL-2 폴리펩타이드이다. 일부 실시형태에서, IL-2 폴리펩타이드는 원숭이 IL-2 폴리펩타이드이다. 일부 실시형태에서, IL-2 폴리펩타이드는 마우스 IL-2 폴리펩타이드이다. 일부 실시형태에서, IL-2 폴리펩타이드는 본원에 기재된 바와 같은 돌연변이형 IL-2 폴리펩타이드이다. 특정 실시형태에서, 돌연변이형 IL-2 폴리펩타이드는 IL-2hex이다. 본 개시내용과 관련하여 사용될 수 있는 추가의 돌연변이형 IL-2 폴리펩타이드는 미국 특허 제10,184,009호 및 제5,229,109호, 및 국제공개 WO2012107417A1호에서 확인할 수 있으며, 상기 문헌들 각각의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 면역접합체 분자는 접합 모이어티를 통해 서로 작동 가능하게 연결된 고정 모이어티, 차폐 모이어티 및 사이토카인 모이어티를 포함한다. 일부 실시형태에서, 접합 모이어티는 면역글로불린의 양쪽 중쇄의 Fc 영역(각각 Fc 도메인의 서브유닛)으로 구성된 면역글로불린 Fc 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인은 IgG 분자(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)의 Fc 도메인이다.
일부 실시형태에서, Fc 도메인의 2개의 서브유닛은 모두 천연 서열 Fc 영역일 수 있다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인의 2개의 서브유닛은 모두 변이형 Fc 영역일 수 있다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인의 2개의 서브유닛은 하나의 천연 서열 Fc 영역과 하나의 변이형 Fc 영역일 수 있다. 특정 실시형태에서, Fc 도메인은 2개의 동일하지 않은 면역글로불린 중쇄의 이종이량체화를 촉진하는 변형을 포함한다. 인간 IgG Fc 도메인의 2개의 폴리펩타이드 사슬 사이의 가장 광범위한 단백질-단백질 상호작용 부위는 Fc 영역의 CH3 도메인이다. 따라서, 일 실시형태에서, 상기 변형은 Fc 영역의 CH3 도메인에 있다. 특정 실시형태에서, 상기 변형은 Fc 서브유닛 중 하나의 놉 변형과 Fc 서브유닛 중 다른 하나의 홀 변형을 포함하는 놉인투홀 변형이다. 놉인투홀 기술은, 예를 들어 미국 특허 제5,731,168호; 미국 특허 제7,695,936호; 문헌[Ridgway et al., Prat Eng 9, 617-621 (1996)] 및 문헌[Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)]에 기재되어 있다. 일반적으로, 상기 방법은 제1 폴리펩타이드의 경계면에 돌출부("놉")를 도입하고 제2 폴리펩타이드의 경계면에 상응하는 공동("홀")을 도입하여, 이종이량체 형성을 촉진하고 동종이량체 형성을 방해할 수 있도록 돌출부가 공동 안에 위치하게 하는 것을 포함한다. 돌출부는 제1 폴리펩타이드의 경계면의 작은 아미노산 측쇄를 더 큰 측쇄(예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체하는 방식으로 작제된다. 돌출부와 동일하거나 이와 유사한 크기의 상보적(compensatory) 공동은 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 측쇄(예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체하는 방식으로 제2 폴리펩타이드의 경계면에 형성된다. 돌출부와 공동은, 예를 들어 부위 특이적 돌연변이유발 또는 펩타이드 합성에 의해 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 변경하는 방식으로 만들어질 수 있다. 특정 실시형태에서, 놉 변형은 2개의 Fc 서브유닛 중 하나에 아미노산 치환 T366W를 포함하고, 홀 변형은 2개의 Fc 서브유닛 중 다른 하나에 아미노산 치환 T366S, L368A 및 Y407V를 포함한다. 추가의 특정 실시형태에서, 놉 변형을 포함하는 Fc 서브유닛은 아미노산 치환 S354C를 추가로 포함하고, 홀 변형을 포함하는 면역글로불린 중쇄는 아미노산 치환 Y349C를 추가로 포함한다. 이러한 2개의 시스테인 잔기의 도입은 2개의 중쇄 사이에 디설파이드 브릿지를 형성하여, 이량체를 추가로 안정화시킨다(문헌[Carter, J. Immunol Methods 248, 7-15 (2001)]).
대안적인 실시형태에서, 2개의 동일하지 않은 폴리펩타이드 사슬의 이종이량체화를 촉진하는 변형은, 예를 들어 PCT 국제공개 WO 2009/089004에 기재된 바와 같은 정전기적 스티어링(electrostatic steering) 효과를 매개하는 변형을 포함한다. 일반적으로, 이러한 방법은 2개의 폴리펩타이드 사슬의 경계면에 있는 하나 이상의 아미노산 잔기를 하전된 아미노산 잔기로 대체하여, 동종이량체 형성은 정전기적으로 유리하지 않게 만들지만 이종이량체화는 정전기적으로 유리하게 만드는 것을 포함한다.
이론에 구애됨 없이, Fc 도메인은, 표적 조직에의 양호한 축적에 기여하는 긴 혈청 반감기와 유리한 조직-혈액 분포 비를 포함하는 유리한 약동학적 특성을 면역접합체 분자에 부여하는 것으로 고려된다. 동시에, Fc 도메인은 표적 항원 보유 세포가 아닌 Fc 수용체를 발현하는 세포에 대한 면역접합체 분자의 바람직하지 않은 표적화를 초래할 수 있다. 나아가, Fc 수용체 신호전달 경로의 공동 활성화는, 면역접합체 분자 내 사이토카인 폴리펩타이드 및 면역접합체의 긴 반감기와 조합으로 사이토카인 방출을 유도하여, 전신 투여 시 사이토카인 수용체의 과도한 활성화와 심각한 부작용을 초래할 수 있다. 이러한 맥락에서, 통상의 IgG-IL-2 면역접합체는 주입 반응과 관련이 있는 것으로 설명되었다(예를 들어, 문헌[King et al., J Clin Oneal 22, 4463-4473 (2004)] 참조).
특정 실시형태에서, 항체의 Fc 영역에 대한 변형은 항체의 이펙터 기능의 감소 또는 제거를 유도한다. 특정 실시형태에서, 이펙터 기능은 ADCC, ADCP 및/또는 CDC이다. 일부 실시형태에서, 이펙터 기능은 ADCC이다. 다른 실시형태에서, 이펙터 기능은 ADCP이다. 다른 실시형태에서, 이펙터 기능은 CDC이다. 일 실시형태에서, 이펙터 기능은 ADCC 및 ADCP이다. 일 실시형태에서, 이펙터 기능은 ADCC 및 CDC이다. 일 실시형태에서, 이펙터 기능은 ADCP 및 CDC이다. 일 실시형태에서, 이펙터 기능은 ADCC, ADCP 및 CDC이다. 이는 항체의 Fc 영역에 하나 이상의 아미노산 치환을 도입하는 방식으로 달성될 수 있다. 예를 들어, 233번 내지 236번 위치의 IgG2 잔기와 327번, 330번 및 331번 위치의 IgG4 잔기를 사용한 인간 IgG1에의 치환은 ADCC와 CDC를 크게 감소시키는 것으로 나타났다(예를 들어, 문헌[Armour et al., 1999, Eur. J. Immunol. 29(8):2613-24]; 및 문헌[Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. 276(9): 6591-604] 참조). 다른 Fc 변이체는 본원의 다른 곳에 제시되어 있다.
항체의 혈청 반감기를 증가시키기 위해, 예를 들어 미국 특허 제5,739,277호에 기재된 바와 같이 구제(salvage) 수용체 결합 에피토프를 항체(특히, 항체 단편)에 혼입시킬 수 있다. "구제 수용체 결합 에피토프"라는 용어는, IgG 분자의 생체내 혈청 반감기를 증가시키는 역할을 하는 IgG 분자(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)의 Fc 영역의 에피토프를 나타낸다.
따라서, 일부 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 면역접합체 분자의 일부를 형성하는 Fc 도메인은 Fc 수용체에 대한 결합 친화도가 감소되도록 조작된다. 이러한 일 실시형태에서, Fc 도메인은 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화도를 감소시키는 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 이러한 일 실시형태에서, 하나 이상의 이러한 아미노산 돌연변이는 Fc 도메인의 2개의 Fc 서브유닛 중 하나에 존재한다. 또 다른 이러한 실시형태에서, 하나 이상의 이러한 아미노산 돌연변이는 Fc 도메인의 2개의 Fc 서브유닛 모두에 존재한다. 다양한 실시형태에서, 이러한 아미노산 돌연변이는 Fc 수용체에 대한 면역접합체의 결합 친화도를 적어도 2배, 적어도 5배 또는 적어도 10배 만큼 감소시킨다.
Fc 수용체에 대한 본 발명의 면역접합체 분자로 구성된 Fc 도메인의 결합 친화도를 감소시키는 하나 초과의 아미노산 돌연변이가 존재하는 일부 실시형태에서, 이러한 아미노산 돌연변이들의 조합은 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화도를 적어도 10배, 적어도 20배 또는 심지어 적어도 50배 만큼 감소시킬 수 있다. 일 실시형태에서, 조작된 면역글로불린 분자를 포함하는 면역접합체는 조작되지 않은 면역글로불린 분자를 포함하는 면역접합체와 비교하여 Fc 수용체에 대한 결합 친화도를 20% 미만, 특히 10% 미만, 보다 특히 5% 미만으로 나타낸다.
일부 실시형태에서, Fc 수용체는 활성화 Fc 수용체이다. 특정 실시형태에서, Fc 수용체는 Fcγ 수용체이다. 보다 구체적으로, 일부 실시형태에서, Fc 수용체는 FcγRIIIα, FcγRI 또는 FcγRIIα 수용체이다. 일부 실시형태에서, 이러한 예시적인 수용체 각각에 대한 Fc 도메인의 결합이 감소된다. 일부 실시형태에서, 보체 구성요소에 대한 Fc 도메인의 결합 친화도가 감소된다. 일부 실시형태에서, 구체적으로, C1q에 대한 Fc 도메인의 결합 친화도가 감소된다. 일 실시형태에서, 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 결합 친화도는 감소되지 않는다. FcRn에 대한 실질적으로 유사한 결합, 즉, 상기 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화도의 보존은, 상기 Fc 도메인을 포함하는 면역접합체가, FcRn에 대해, 상기 조작되지 않은 형태의 Fc를 포함하는 조작되지 않은 형태의 면역접합체 분자의 결합 친화도의 약 70% 초과를 나타내는 경우에 달성된다. 면역글로불린 또는 상기 면역글로불린을 포함하는 면역접합체는 이러한 친화도의 약 80% 초과 및 심지어 약 90% 초과를 나타낼 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 면역접합체 분자의 일부를 형성하는 Fc 도메인은 천연 서열 Fc 도메인이 아니며, 이의 Fc 서브유닛 중 하나에 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 면역접합체 분자의 일부를 형성하는 Fc 도메인은 천연 서열 Fc 도메인이 아니며, 이의 Fc 서브유닛 둘 모두에 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 갖는다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인의 2개의 Fc 서브유닛에 있는 아미노산 돌연변이는 동일한 돌연변이이다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인의 2개의 Fc 서브유닛에 있는 아미노산 돌연변이는 상이한 돌연변이이다. 일부 실시형태에서, 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환, 아미노산 결실 및 아미노산 삽입에서 선택된다. 특정 실시형태에서, 면역접합체 분자의 Fc 도메인 내 Fc 서브유닛 중 하나 또는 둘 모두는 Fc 서브유닛의 228번, 233번, 234번, 235번, 236번, 265번, 297번, 329번, 330번 및 331번 아미노산 위치 중 임의의 하나 이상의 아미노산 위치에 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함하며, 여기서 Fc 서브유닛의 잔기 번호는 Kabat에서와 같은 EU 인덱스의 번호이다. 특정 실시형태에서, 이러한 하나 이상의 아미노산 치환은 S228P를 포함한다. 특정 실시형태에서, 이러한 하나 이상의 아미노산 치환은 E233P를 포함한다. 특정 실시형태에서, 이러한 하나 이상의 아미노산 치환은 L234V 또는 L234A를 포함한다. 특정 실시형태에서, 이러한 하나 이상의 아미노산 치환은 L235A 또는 L235E를 포함한다. 특정 실시형태에서, 이러한 하나 이상의 아미노산 결실은 ΔG236을 포함한다. 특정 실시형태에서, 이러한 하나 이상의 아미노산 치환은 D265G를 포함한다. 특정 실시형태에서, 이러한 하나 이상의 아미노산 치환은 N297A 또는 N297D를 포함한다. 특정 실시형태에서, 이러한 하나 이상의 아미노산 치환은 P329E, P329A 또는 P329G, 특히 P329E를 포함한다. 특정 실시형태에서, 이러한 하나 이상의 아미노산 치환은 A330S를 포함한다. 특정 실시형태에서, 이러한 하나 이상의 아미노산 치환은 P331S를 포함한다.
특정 실시형태에서, Fc 도메인은 E233, L234, L235, G236, A330 및 P331 위치에 아미노산 돌연변이를 포함한다. 특정 실시형태에서, 2개의 Fc 서브유닛은 모두 E233, L234, L235, G236, A330 및 P331 위치에 아미노산 돌연변이를 포함한다. 특정 실시형태에서, Fc 도메인은 E233P, L234V, L235A, ΔG236, A330S 및 P331S의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 특정 실시형태에서, 2개의 Fc 서브유닛은 모두 E233P, L234V, L235A, ΔG236, P329S, A330S 및 P331S의 아미노산 돌연변이를 포함한다.
특정 실시형태에서, Fc 도메인은 L234, L235, A330, P331 위치에 아미노산 돌연변이를 포함한다. 특정 실시형태에서, 2개의 Fc 서브유닛은 모두 L234, L235, A330, P331 위치에 아미노산 돌연변이를 포함한다. 특정 실시형태에서, Fc 도메인은 L234A, L235A, A330S 및 P331S의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 특정 실시형태에서, 2개의 Fc 서브유닛은 모두 L234A, L235A, A330S 및 P331S의 아미노산 돌연변이를 포함한다.
특정 실시형태에서, Fc 도메인은 E233, L234, L235, G236, P329, A330 및 P331 위치에 아미노산 돌연변이를 포함한다. 특정 실시형태에서, 2개의 Fc 서브유닛은 모두 E233, L234, L235, G236, P329, A330 및 P331 위치에 아미노산 돌연변이를 포함한다. 특정 실시형태에서, Fc 도메인은 E233P, L234V, L235A, ΔG236, P329E, A330S 및 P331S의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 특정 실시형태에서, 2개의 Fc 서브유닛은 모두 E233P, L234V, L235A, ΔG236, P329E, A330S 및 P331S의 아미노산 돌연변이를 포함한다.
특정 실시형태에서, Fc 도메인은 L234, L235, P329, A330 및 P331 위치에 아미노산 돌연변이를 포함한다. 특정 실시형태에서, 2개의 Fc 서브유닛은 모두 L234, L235, P329, A330 및 P331 위치에 아미노산 돌연변이를 포함한다. 특정 실시형태에서, Fc 도메인은 L234A, L235A, P329E, A330S 및 P331S의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 특정 실시형태에서, 2개의 Fc 서브유닛은 모두 L234A, L235A, P329E, A330S 및 P331S의 아미노산 돌연변이를 포함한다.
특정 실시형태에서, Fc 도메인은 E233, L234, L235, G236 및 P329 위치에 아미노산 돌연변이를 포함한다. 특정 실시형태에서, 2개의 Fc 서브유닛은 모두 E233, L234, L235, G236 및 P329 위치에 아미노산 돌연변이를 포함한다. 특정 실시형태에서, Fc 도메인은 E233P, L234V, L235A, ΔG236 및 P329E의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 특정 실시형태에서, 2개의 Fc 서브유닛은 모두 E233P, L234V, L235A, ΔG236 및 P329E의 아미노산 돌연변이를 포함한다.
특정 실시형태에서, Fc 도메인은 L234, L235 및 P329 위치에 아미노산 돌연변이를 포함한다. 특정 실시형태에서, 2개의 Fc 서브유닛은 모두 L234, L235 및 P329 위치에 아미노산 돌연변이를 포함한다. 특정 실시형태에서, Fc 도메인은 L234A, L235A 및 P329E의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 특정 실시형태에서, 2개의 Fc 서브유닛은 모두 L234A, L235A 및 P329E의 아미노산 돌연변이를 포함한다.
특정 실시형태에서, Fc 도메인은 E233, L234, L235, G236, D265, A330 및 P331 위치에 아미노산 돌연변이를 포함한다. 특정 실시형태에서, 2개의 Fc 서브유닛은 모두 E233, L234, L235, G236, D265, A330 및 P331 위치에 아미노산 돌연변이를 포함한다. 특정 실시형태에서, Fc 도메인은 E233P, L234V, L235A, ΔG236, D265G, A330S 및 P331S의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 특정 실시형태에서, 2개의 Fc 서브유닛은 모두 E233P, L234V, L235A, ΔG236, D265G, A330S 및 P331S의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 이러한 실시형태에서, Fc 도메인은 Fcγ 수용체에 대한 결합 친화도가 감소되어 있다.
특정 실시형태에서, Fc 도메인은 L234, L235, D265, A330 및 P331 위치에 아미노산 돌연변이를 포함한다. 특정 실시형태에서, 2개의 Fc 서브유닛은 모두 L234, L235, D265, A330 및 P331 위치에 아미노산 돌연변이를 포함한다. 특정 실시형태에서, Fc 도메인은 L234A, L235A, D265G, A330S 및 P331S의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 특정 실시형태에서, 2개의 Fc 서브유닛은 모두 L234A, L235A, D265G, A330S 및 P331S의 아미노산 돌연변이를 포함한다.
특정 실시형태에서, Fc 도메인은 E233, L234, L235, G236, D265, P329, A330 및 P331 위치에 아미노산 돌연변이를 포함한다. 특정 실시형태에서, 2개의 Fc 서브유닛은 모두 E233, L234, L235, G236, D265, P329, A330 및 P331 위치에 아미노산 돌연변이를 포함한다. 특정 실시형태에서, Fc 도메인은 E233P, L234V, L235A, ΔG236, D265G, P329E, A330S 및 P331S의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 특정 실시형태에서, 2개의 Fc 서브유닛은 모두 E233P, L234V, L235A, ΔG236, D265G, P329E, A330S 및 P331S의 아미노산 돌연변이를 포함한다.
특정 실시형태에서, Fc 도메인은 L234, L235, D265, P329, A330 및 P331 위치에 아미노산 돌연변이를 포함한다. 특정 실시형태에서, 2개의 Fc 서브유닛은 모두 L234, L235, D265, P329, A330 및 P331 위치에 아미노산 돌연변이를 포함한다. 특정 실시형태에서, Fc 도메인은 L234A, L235A, D265G, P329E, A330S 및 P331S의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 특정 실시형태에서, 2개의 Fc 서브유닛은 모두 L234A, L235A, D265G, P329E, A330S 및 P331S의 아미노산 돌연변이를 포함한다.
특정 실시형태에서, Fc 도메인은 E233, L234, L235, G236, D265 및 P329 위치에 아미노산 돌연변이를 포함한다. 특정 실시형태에서, 2개의 Fc 서브유닛은 모두 E233, L234, L235, G236, D265 및 P329 위치에 아미노산 돌연변이를 포함한다. 특정 실시형태에서, Fc 도메인은 E233P, L234V, L235A, ΔG236, D265G 및 P329E의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 특정 실시형태에서, 2개의 Fc 서브유닛은 모두 E233P, L234V, L235A, ΔG236, D265G 및 P329E의 아미노산 돌연변이를 포함한다.
특정 실시형태에서, Fc 도메인은 L234, L235, D265 및 P329 위치에 아미노산 돌연변이를 포함한다. 특정 실시형태에서, 2개의 Fc 서브유닛은 모두 L234, L235, D265 및 P329 위치에 아미노산 돌연변이를 포함한다. 특정 실시형태에서, Fc 도메인은 L234A, L235A, D265G 및 P329E의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 특정 실시형태에서, 2개의 Fc 서브유닛은 모두 L234A, L235A, D265G 및 P329E의 아미노산 돌연변이를 포함한다.
특정 실시형태에서, Fc 도메인은 L234, L235 및 P329 위치에 아미노산 돌연변이를 포함한다. 특정 실시형태에서, 2개의 Fc 서브유닛은 모두 L234, L235 및 P329 위치에 아미노산 돌연변이를 포함한다. 특정 실시형태에서, Fc 도메인은 L234A, L235A 및 P329G의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 특정 실시형태에서, 2개의 Fc 서브유닛은 모두 L234A, L235A 및 P329G의 아미노산 돌연변이를 포함한다.
본 개시내용에 따르면, 본 발명의 면역접합체 분자는 접합 모이어티를 통해 서로 작동 가능하게 연결된 고정 모이어티, 차폐 모이어티 및 사이토카인 모이어티를 포함한다. 특정 실시형태에서, 사이토카인 모이어티는 사이토카인 폴리펩타이드를 포함한다. 특정 실시형태에서, 차폐 모이어티는 사이토카인 폴리펩타이드와 제2 표적 항원에 결합할 수 있는 이중특이적 투인원 항체 또는 항원 결합 단편을 포함한다. 특정 실시형태에서, 고정 모이어티는 제3 표적 항원에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 특정 실시형태에서, 접합 모이어티는 면역글로불린 중쇄의 2개의 Fc 영역(각각의 Fc 영역은 Fc 도메인의 서브유닛 또는 "Fc 서브유닛"으로 지칭됨)으로 구성된 면역글로불린 Fc 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인은 2개의 Fc 서브유닛의 이종이량체화를 촉진하는 변형을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 변형은 Fc 서브유닛 중 하나의 놉 변형(Fc-놉)과 Fc 서브유닛 중 다른 하나의 홀 변형(Fc-홀)을 포함하는 놉인투홀 변형이다.
본 개시내용에 따르면, 이러한 실시형태에서, 면역접합체 분자의 사이토카인 모이어티, 차폐 모이어티 및 고정 모이어티는 접합 모이어티를 통해 다양한 상이한 입체배치로 서로 작동 가능하게 연결될 수 있다. 일 예시적인 실시형태에서, 사이토카인 모이어티는 하나의 Fc 서브유닛의 C-말단에 융합된 사이토카인 폴리펩타이드를 포함한다. 일 예시적인 실시형태에서, 차폐 모이어티는 하나의 Fc 서브유닛의 C-말단에 융합된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 일 예시적인 실시형태에서, 사이토카인 모이어티는 Fc 도메인의 하나의 서브유닛의 C-말단에 융합된 사이토카인 폴리펩타이드를 포함하고, 차폐 모이어티는 다른 하나의 Fc 서브유닛의 C-말단에 융합된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 차폐 모이어티는 Fc 서브유닛의 C-말단에 융합되어 있다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인은 2개의 Fc 서브유닛의 이종이량체화를 촉진하는 변형을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 변형은 Fc 서브유닛 중 하나(Fc-놉 서브유닛)의 놉 변형과 Fc 서브유닛 중 다른 하나(Fc-홀 서브유닛)의 홀 변형을 포함하는 놉인투홀 변형이다.
일 예시적인 실시형태에서, 사이토카인 모이어티는 하나의 Fc 서브유닛의 C-말단에 융합된 사이토카인 폴리펩타이드를 포함한다. 일 예시적인 실시형태에서, 차폐 모이어티는 하나의 Fc 서브유닛의 C-말단에 융합된 이중특이적 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 일 예시적인 실시형태에서, 고정 모이어티는 하나의 Fc 서브유닛의 N-말단에 융합된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 일 예시적인 실시형태에서, 사이토카인 모이어티는 Fc 도메인의 하나의 서브유닛의 C-말단에 융합된 사이토카인 폴리펩타이드를 포함하고, 차폐 모이어티는 다른 하나의 Fc 서브유닛의 C-말단에 융합된 이중특이적 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 일 예시적인 실시형태에서, 사이토카인 모이어티는 Fc 도메인의 하나의 서브유닛의 C-말단에 융합된 사이토카인 폴리펩타이드를 포함하고, 차폐 모이어티는 다른 하나의 Fc 서브유닛의 C-말단에 융합된 이중특이적 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고, 고정 모이어티는 Fc 도메인의 하나의 서브유닛의 N-말단에 융합된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 특정 실시형태에서, 고정 모이어티와 사이토카인 모이어티는, 각각, 동일한 Fc 서브유닛의 N-말단과 C-말단에 융합되어 있다. 특정 실시형태에서, 차폐 모이어티와 사이토카인 모이어티는, 각각, 동일한 Fc 서브유닛의 N-말단과 C-말단에 융합되어 있다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인은 2개의 Fc 서브유닛의 이종이량체화를 촉진하는 변형을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 변형은 Fc 서브유닛 중 하나(Fc-놉 서브유닛)의 놉 변형과 Fc 서브유닛 중 다른 하나(Fc-홀 서브유닛)의 홀 변형을 포함하는 놉인투홀 변형이다.
일 예시적인 실시형태에서, 차폐 모이어티는 하나의 Fc 서브유닛의 N-말단에 융합된 이중특이적 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 일 예시적인 실시형태에서, 사이토카인 모이어티는 차폐 모이어티에 융합된 사이토카인 폴리펩타이드를 포함한다. 일 예시적인 실시형태에서, 차폐 모이어티는 하나의 Fc 서브유닛의 N-말단에 융합된 이중특이적 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고, 사이토카인 모이어티는 차폐 모이어티에 융합된 사이토카인 폴리펩타이드를 포함한다. 일 예시적인 실시형태에서, 고정 모이어티는 하나의 Fc 서브유닛의 N-말단에 융합된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 일 예시적인 실시형태에서, 사이토카인 모이어티는 고정 모이어티에 융합된 사이토카인 폴리펩타이드를 포함한다. 일 예시적인 실시형태에서, 차폐 모이어티는 하나의 Fc 서브유닛의 N-말단에 융합된 이중특이적 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고, 고정 모이어티는 다른 하나의 Fc 서브유닛의 N-말단에 융합된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고, 사이토카인 모이어티는 차폐 모이어티에 융합된 사이토카인 폴리펩타이드를 포함한다. 일 예시적인 실시형태에서, 차폐 모이어티는 하나의 Fc 서브유닛의 N-말단에 융합된 이중특이적 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고, 고정 모이어티는 다른 하나의 Fc 서브유닛의 N-말단에 융합된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고, 사이토카인 모이어티는 고정 모이어티에 융합된 사이토카인 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인은 2개의 Fc 서브유닛의 이종이량체화를 촉진하는 변형을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 변형은 Fc 서브유닛 중 하나(Fc-놉 서브유닛)의 놉 변형과 Fc 서브유닛 중 다른 하나(Fc-홀 서브유닛)의 홀 변형을 포함하는 놉인투홀 변형이다.
일 예시적인 실시형태에서, 차폐 모이어티는 하나의 Fc 서브유닛의 C-말단에 융합된 이중특이적 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 일 예시적인 실시형태에서, 사이토카인 모이어티는 차폐 모이어티에 융합된 사이토카인 폴리펩타이드를 포함한다. 일 예시적인 실시형태에서, 차폐 모이어티는 하나의 Fc 서브유닛의 C-말단에 융합된 이중특이적 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고, 사이토카인 모이어티는 차폐 모이어티에 융합된 사이토카인 폴리펩타이드를 포함한다. 일 예시적인 실시형태에서, 고정 모이어티는 하나의 Fc 서브유닛의 N-말단에 융합된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 일 예시적인 실시형태에서, 차폐 모이어티는 하나의 Fc 서브유닛의 C-말단에 융합된 이중특이적 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고, 고정 모이어티는 다른 하나의 Fc 서브유닛의 N-말단에 융합된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고, 사이토카인 모이어티는 차폐 모이어티에 융합된 사이토카인 폴리펩타이드를 포함한다. 특정 실시형태에서, 차폐 모이어티 및 고정 모이어티는 동일한 Fc 서브유닛에 결합한다. 특정 실시형태에서, 차폐 모이어티 및 고정 모이어티는 상이한 Fc 서브유닛에 결합한다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인은 2개의 Fc 서브유닛의 이종이량체화를 촉진하는 변형을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 변형은 Fc 서브유닛 중 하나(Fc-놉 서브유닛)의 놉 변형과 Fc 서브유닛 중 다른 하나(Fc-홀 서브유닛)의 홀 변형을 포함하는 놉인투홀 변형이다.
일 예시적인 실시형태에서, 차폐 모이어티는 하나의 Fc 서브유닛의 C-말단에 융합된 이중특이적 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 일 예시적인 실시형태에서, 사이토카인 모이어티는 하나의 Fc 서브유닛의 C-말단에 융합된 사이토카인 폴리펩타이드를 포함한다. 일 예시적인 실시형태에서, 고정 모이어티는 차폐 모이어티에 융합된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인은 2개의 Fc 서브유닛의 이종이량체화를 촉진하는 변형을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 변형은 Fc 서브유닛 중 하나(Fc-놉 서브유닛)의 놉 변형과 Fc 서브유닛 중 다른 하나(Fc-홀 서브유닛)의 홀 변형을 포함하는 놉인투홀 변형이다.
일 예시적인 실시형태에서, 차폐 모이어티는 하나의 Fc 서브유닛의 N-말단에 융합된 이중특이적 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 일 예시적인 실시형태에서, 사이토카인 모이어티는 하나의 Fc 서브유닛의 N-말단에 융합된 사이토카인 폴리펩타이드를 포함한다. 일 예시적인 실시형태에서, 고정 모이어티는 차폐 모이어티에 융합된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인은 2개의 Fc 서브유닛의 이종이량체화를 촉진하는 변형을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 변형은 Fc 서브유닛 중 하나(Fc-놉 서브유닛)의 놉 변형과 Fc 서브유닛 중 다른 하나(Fc-홀 서브유닛)의 홀 변형을 포함하는 놉인투홀 변형이다.
본 개시내용에 따르면, 본원에 기재된 임의의 실시형태에서, 면역접합체 분자의 상이한 모이어티는 펩타이드 링커 서열과 연결될 수 있다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 링커는 적어도 5개의 아미노산 잔기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 링커는 적어도 7개의 아미노산 잔기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 링커는 적어도 10개의 아미노산 잔기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 링커는 적어도 15개의 아미노산 잔기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 링커는 적어도 20개의 아미노산 잔기를 갖는다.
본 개시내용에 따르면, 본원에 기재된 임의의 실시형태에서, 면역접합체 분자의 일부를 형성하는 항체의 비제한적인 예는, 합성 항체, 재조합적으로 생산된 항체, 낙타화 항체, 인트라바디, 항-이디오타입(항-Id) 항체일 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역접합체 분자의 일부를 형성하는 항체는 단클론 항체이다. 본원에 기재된 임의의 실시형태에서, 면역접합체 분자의 일부를 형성하는 항원 결합 단편은 해당 단편이 유도되는 항체의 결합 활성의 일부 또는 전부를 보유하는 항체의 기능성 단편일 수 있다. 기능성 단편(예를 들어, IL-2-결합 단편과 같은 항원 결합 단편)의 비제한적인 예에는, 단일 사슬 Fv(scFv)(예를 들어, 단일특이적, 이중특이적 등의 scFv 포함), Fab 단편(예를 들어, 단일특이적, 이중특이적 등의 Fab 단편 포함), F(ab') 단편, F(ab)2 단편, F(ab')2 단편, 디설파이드 결합된 Fv(dsFv), Fd 단편, Fv 단편, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 미니바디 및 단일 도메인 항체(VHH 또는 나노바디)가 포함된다. 특정 실시형태에서, 면역접합체 분자는 도 5에 제시된 바와 같은 입체배치 1 내지 20 중 임의의 것을 가질 수 있다.
예를 들어, 특정 실시형태에서, 본 발명의 면역접합체 분자의 차폐 모이어티 내 이중특이적 투인원 항체는 Fab 단편이다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, 본 발명의 면역접합체 분자의 차폐 모이어티 내 이중특이적 투인원 항체는 ScFv 단편이다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, 본 발명의 면역접합체 분자의 차폐 모이어티 내 이중특이적 투인원 항체는 단일 도메인(VHH) 항체이다.
예를 들어, 특정 실시형태에서, 본 발명의 면역접합체 분자의 고정 모이어티 내 항체는 Fab 단편이다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, 본 발명의 면역접합체 분자의 고정 모이어티 내 항체는 ScFv 단편이다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, 본 발명의 면역접합체 분자의 고정 모이어티 내 항체는 단일 도메인(VHH) 항체이다.
예를 들어, 특정 실시형태에서, 본 발명의 면역접합체 분자의 차폐 모이어티 내 이중특이적 투인원 항체는 Fab 단편이고, 면역접합체 분자의 고정 모이어티 내 항체도 Fab 단편이다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, 본 발명의 면역접합체 분자의 차폐 모이어티 내 이중특이적 투인원 항체는 Fab 단편이고, 면역접합체 분자의 고정 모이어티 내 항체는 ScFv 단편이다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, 본 발명의 면역접합체 분자의 차폐 모이어티 내 이중특이적 투인원 항체는 Fab 단편이고, 면역접합체 분자의 고정 모이어티 내 항체는 단일 도메인(VHH) 단편이다.
예를 들어, 특정 실시형태에서, 본 발명의 면역접합체 분자의 차폐 모이어티 내 이중특이적 투인원 항체는 ScFv 단편이고, 면역접합체 분자의 고정 모이어티 내 항체는 Fab 단편이다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, 본 발명의 면역접합체 분자의 차폐 모이어티 내 이중특이적 투인원 항체는 ScFv 단편이고, 면역접합체 분자의 고정 모이어티 내 항체도 ScFv 단편이다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, 본 발명의 면역접합체 분자의 차폐 모이어티 내 이중특이적 투인원 항체는 ScFv 단편이고, 면역접합체 분자의 고정 모이어티 내 항체는 단일 도메인(VHH) 단편이다.
예를 들어, 특정 실시형태에서, 본 발명의 면역접합체 분자의 차폐 모이어티 내 이중특이적 투인원 항체는 단일 도메인(VHH) 항체이고, 면역접합체 분자의 고정 모이어티 내 항체는 Fab 단편이다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, 본 발명의 면역접합체 분자의 차폐 모이어티 내 이중특이적 투인원 항체는 단일 도메인(VHH) 항체이고, 면역접합체 분자의 고정 모이어티 내 항체는 ScFv 단편이다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, 본 발명의 면역접합체 분자의 차폐 모이어티 내 이중특이적 투인원 항체는 단일 도메인(VHH) 항체이고, 면역접합체 분자의 고정 모이어티 내 항체도 단일 도메인(VHH) 단편이다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 면역접합체 분자의 일부를 형성하는 이중특이적 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 IL-2 폴리펩타이드와 섬유증 활성화 단백질(FAP) 둘 모두에 결합할 수 있다. 특정 실시형태에서, 이중특이적 투인원 항체는 표 1 내지 표 4에 도시된 아미노산 서열의 VH 영역, VL 영역, VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 및/또는 VL CDR3을 포함한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 투인원 항체 또는 이의 기능성 단편은, 표 1과 표 2에 제시된 바와 같은 (a) 항체 D001, (b) 항체 D002, (c) 항체 D029, (d) 항체 D003, (e) 항체 D047, (f) 항체 D049, (g) 경쇄 변이체 D029LV1, D029LV2, D029LV3, D029LV4 및 D029LV5 중 임의의 하나, (h) 중쇄 변이체 D029HV1, D029HV2, D029HV3, D029HV4, D029HV5 및 D029HV6 중 임의의 하나, 또는 (i) 항체 B10 유래의 1개, 2개 및/또는 3개의 중쇄 CDR 및/또는 1개, 2개 및/또는 3개의 경쇄 CDR을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본원에 제공된 투인원 항체 또는 이의 기능성 단편은 항체 D029-HV1LV1, 항체 D029-HV2LV3, 항체 D029-HV2LV4, 항체 D029-HV1LV5, 항체 D029-HV3LV2, 항체 D029-HV4LV2 또는 항체 D029-HV6LV2 유래의 1개, 2개 및/또는 3개의 중쇄 CDR 및/또는 1개, 2개 및/또는 3개의 경쇄 CDR을 포함한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 투인원 항체 또는 이의 기능성 단편은, 표 3과 표 4에 제시된 바와 같은 (a) 항체 D001, (b) 항체 D002, (c) 항체 D029, (d) 항체 D003, (e) 항체 D047, (f) 항체 D049, (g) 경쇄 변이체 D029LV1, D029LV2, D029LV3, D029LV4 및 D029LV5 중 임의의 하나, (h) 중쇄 변이체 D029HV1, D029HV2, D029HV3, D029HV4, D029HV5 및 D029HV6 중 임의의 하나, 또는 (i) 항체 B10에서 선택되는 VH 영역과 VL 영역을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본원에 제공된 투인원 항체 또는 이의 기능성 단편은 항체 D029-HV1LV1, 항체 D029-HV2LV3, 항체 D029-HV2LV4, 항체 D029-HV1LV5, 항체 D029-HV3LV2, 항체 D029-HV4LV2 또는 항체 D029-HV6LV2 유래의 VH 영역과 VL 영역을 포함한다. "D029-HVxLVx"라는 명명법은 표 3과 표 4에 제시된 바와 같은 상응하는 번호의 VH 도메인 서열과 VL 도메인 서열의 조합을 포함하는 항체를 나타낸다. 예를 들어, "D029-HV2LV3"은 표 3과 표 4에 제시된 바와 같은 D029HV2의 VH 도메인 서열과 D029LV3의 VL 도메인 서열을 포함하는 항체를 나타낸다.
[표 1]
[표 2]
[표 3]
[표 4]
특정 실시형태에서, 본 발명의 면역접합체 분자의 고정 모이어티는 섬유증 활성화 단백질(FAP)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 특정 실시형태에서, 항-FAP 항체는 표 5 내지 표 8에 도시된 아미노산 서열의 VH 영역, VL 영역, VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 및/또는 VL CDR3을 포함한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 항-FAP 항체 또는 이의 기능성 단편은 표 5와 표 6에 제시된 바와 같은 (a) 항체 872-5, (b) 항체 872-59, (c) 872-70, (d) 872-5V1, 또는 (e) VHH6 유래의 1개, 2개 및/또는 3개의 중쇄 CDR 및/또는 1개, 2개 및/또는 3개의 경쇄 CDR을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 항-FAP 항체 또는 이의 기능성 단편은 표 7과 표 8에 제시된 바와 같은 (a) 항체 872-5, (b) 항체 872-59, (c) 872-70, (d) 872-5V1, 또는 (e) VHH6 유래의 VH 영역과 VL 영역을 포함한다.
[표 5]
[표 6]
[표 7]
[표 8]
특정 일 양태에서, 특정 IL-2R 서브유닛과의 결합을 담당하는 IL-2 영역에 대한 가역적 결합 및 해리를 통해 IL-2 활성을 조절하는 IL-2 함유 면역접합체 분자가 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 면역접합체 분자 내 IL-2 폴리펩타이드는 특정 IL-2R 서브유닛에 대한 IL-2 폴리펩타이드의 결합 활성을 변형시키는 하나 이상의 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 면역접합체 분자는 차폐 모이어티에 접합된 IL-2 폴리펩타이드를 포함하며, 여기서 차폐 모이어티는 IL-2 폴리펩타이드와 제1 표적 항원에 결합할 수 있는 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고, IL-2 폴리펩타이드에 결합하는 경우, 차폐 모이어티는 IL-2 수용체 α 서브유닛(IL-2Rα)에 대한 IL-2 폴리펩타이드의 결합을 차단하고, 제1 표적 항원에 결합하는 경우, 차폐 모이어티는 IL-2 폴리펩타이드에서 해리되어 IL-2Rα와 결합하기 위한 IL-2 폴리펩타이드를 방출하며, 여기서 IL-2 폴리펩타이드는 IL-2Rβ에 대한 IL-2 폴리펩타이드의 결합을 약화시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2 폴리펩타이드는 IL-2Rγ에 대한 IL-2 폴리펩타이드의 결합을 변형시키는 하나 이상의 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 면역접합체 분자는 차폐 모이어티에 접합된 IL-2 폴리펩타이드를 포함하며, 여기서 차폐 모이어티는 IL-2 폴리펩타이드와 제1 표적 항원에 결합할 수 있는 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고, IL-2 폴리펩타이드에 결합하는 경우, 차폐 모이어티는 IL-2 수용체 α 서브유닛(IL-2Rβ)에 대한 IL-2 폴리펩타이드의 결합을 차단하고, 제1 표적 항원에 결합하는 경우, 차폐 모이어티는 IL-2 폴리펩타이드에서 해리되어 IL-2Rβ와 결합하기 위한 IL-2 폴리펩타이드를 방출하며, 여기서 IL-2 폴리펩타이드는 IL-2Rα에 대한 IL-2 폴리펩타이드의 결합을 약화시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2 폴리펩타이드는 IL-2Rγ에 대한 IL-2 폴리펩타이드의 결합을 변형시키는 하나 이상의 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 차폐 모이어티는 IL-2Rα 서브유닛에 대한 IL-2 폴리펩타이드의 결합을 차단한다. 일부 실시형태에서, 차폐 모이어티는 IL-2의 잔기 P34, K35, R38, T41, F42, K43, F44, Y45, E61, E62, K64, P65, E68, V69, N71, L72, Q74, Y107 및 D109 중 하나 이상을 포함하는 IL-2의 에피토프에 결합한다.
일부 실시형태에서, 차폐 모이어티는 IL-2Rα 서브유닛에 대한 IL-2 폴리펩타이드의 결합을 차단한다. 특정 실시형태에서, 차폐 모이어티는 서열번호 101의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역과 서열번호 102의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체에 의해 인식되는 IL-2의 에피토프에 결합한다. 일부 실시형태에서, 차폐 모이어티는 서열번호 101의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역과 서열번호 102의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 IL-2에 대한 결합에 대해 경쟁한다. 일부 실시형태에서, 차폐 모이어티는 (a) 표 1에 제시된 바와 같은 항체 B10의 VL 상보성 결정 영역 1(CDR1), VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 및/또는 (b) 표 2에 제시된 바와 같은 항체 B10의 VH 상보성 결정 영역 1(CDR1), VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 차폐 모이어티는 (a) 각각, 서열번호 103, 17 및 104의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3과, (b) 각각, 서열번호 105, 106 및 38의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 차폐 모이어티는 (a) 표 3에 제시된 바와 같은 항체 B10의 VL을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 및/또는 (b) 표 4에 제시된 바와 같은 항체 B10의 VH를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 차폐 모이어티는 서열번호 101의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 차폐 모이어티는 서열번호 102의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시형태에서, 차폐 모이어티는 (a) 서열번호 101의 아미노산 서열을 포함하는 VL과, (b) 서열번호 102의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
일부 실시형태에서, 차폐 모이어티는 IL-2Rβ에 대한 IL-2 폴리펩타이드의 결합을 차단한다. 일부 실시형태에서, 차폐 모이어티는 IL-2의 잔기 L12, Q13, E15, H16, L19, D20, M23, R81, D84, D87, N88, V91, I92 및 E95 중 하나 이상을 포함하는 IL-2의 에피토프에 결합한다. 일부 실시형태에서, 차폐 모이어티는 항체 5UTZ에 의해 인식되는 IL-2의 에피토프에 결합한다. 일부 실시형태에서, 차폐 모이어티는 항체 5UTZ와 IL-2에 대한 결합에 대해 경쟁한다.
일부 실시형태에서, 면역접합체 분자의 IL-2 폴리펩타이드는 IL-2Rα에 대한 IL-2 폴리펩타이드의 결합을 약화시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2Rα에 대한 IL-2 폴리펩타이드의 결합을 약화시키는 하나 이상의 돌연변이는 K35E, R38A, R38E, R38D, F42A, F42K, K43E, Y45A, E61R, E62A, L72G, 또는 이들의 조합에서 선택된다. 일부 실시형태에서, IL-2Rα에 대한 IL-2 폴리펩타이드의 결합을 약화시키는 하나 이상의 돌연변이는 K35E, R38A, R38E, R38D, F42A, F42K, K43E, Y45A, E61R, E62A, L72G에서 선택되는 임의의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 8개의 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, IL-2Rα에 대한 IL-2 폴리펩타이드의 결합을 약화시키는 하나 이상의 돌연변이는 F42A를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2Rα에 대한 IL-2 폴리펩타이드의 결합을 약화시키는 하나 이상의 돌연변이는 K35E와 F42A를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2Rα에 대한 IL-2 폴리펩타이드의 결합을 약화시키는 하나 이상의 돌연변이는 F42A, Y45A 및 L72G를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2Rα에 대한 IL-2 폴리펩타이드의 결합을 약화시키는 하나 이상의 돌연변이는 R38D, K43E 및 E61R을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2Rα에 대한 IL-2 폴리펩타이드의 결합을 약화시키는 하나 이상의 돌연변이는 R38A, F42A, Y45A 및 E62A를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2Rα 서브유닛에 대한 IL-2 폴리펩타이드의 결합은 야생형 IL-2와 비교하여 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99% 감소된다. 일부 실시형태에서, IL-2Rα 서브유닛에 대한 IL-2 폴리펩타이드의 결합은 야생형 IL-2와 비교하여 약 0.5% 내지 10%, 약 10% 내지 20%, 약 20% 내지 30%, 약 30% 내지 40%, 약 40% 내지 45%, 약 45% 내지 50%, 약 50% 내지 55%, 약 55% 내지 60%, 약 60% 내지 65%, 약 65% 내지 70%, 약 70% 내지 75%, 약 75% 내지 80%, 약 80% 내지 85%, 약 85% 내지 90%, 약 90% 내지 95% 또는 95% 내지 약 99% 감소된다.
일부 실시형태에서, 면역접합체 분자의 IL-2 폴리펩타이드는 IL-2Rβ에 대한 IL-2 폴리펩타이드의 결합을 약화시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2Rβ에 대한 IL-2 폴리펩타이드의 결합을 약화시키는 하나 이상의 돌연변이는 H16E, H16R, H16A, D20T, D20G, D20A, N88D, N88S, N88R, V91G, V91A, V91R 및 V91S, 또는 이들의 조합에서 선택된다. 일부 실시형태에서, IL-2Rβ에 대한 IL-2 폴리펩타이드의 결합을 약화시키는 하나 이상의 돌연변이는 H16E, H16R, H16A, D20T, D20G, D20A, N88D, N88S, N88R, V91G, V91A, V91R 및 V91S에서 선택되는 임의의 1개, 2개, 3개 또는 4개의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2Rβ 서브유닛에 대한 IL-2 폴리펩타이드의 결합은 야생형 IL-2와 비교하여 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99% 감소된다. 일부 실시형태에서, IL-2Rα 서브유닛에 대한 IL-2 폴리펩타이드의 결합은 야생형 IL-2와 비교하여 약 0.5% 내지 10%, 약 10% 내지 20%, 약 20% 내지 30%, 약 30% 내지 40%, 약 40% 내지 45%, 약 45% 내지 50%, 약 50% 내지 55%, 약 55% 내지 60%, 약 60% 내지 65%, 약 65% 내지 70%, 약 70% 내지 75%, 약 75% 내지 80%, 약 80% 내지 85%, 약 85% 내지 90%, 약 90% 내지 95% 또는 95% 내지 약 99% 감소된다.
일부 실시형태에서, IL-2 폴리펩타이드는 IL-2R γ-사슬(IL-2Rγ)에 대한 IL-2 폴리펩타이드의 결합을 변형시키는 하나 이상의 돌연변이를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2Rγ에 대한 IL-2 폴리펩타이드의 결합을 변형시키는 하나 이상의 돌연변이는 L18R, Q22E, Q74H, L80F, R81D, L85V, I92F, T123A, Q126X(여기서, X=H, M, K, R, E, S, G, A, C, D, I 또는 T임), I129V, S130A, S130R, 또는 이들의 조합에서 선택된다. 일부 실시형태에서, IL-2Rγ에 대한 IL-2 폴리펩타이드의 결합을 변형시키는 하나 이상의 돌연변이는 L18R, Q22E, Q74H, L80F, R81D, L85V, I92F, T123A, Q126X(여기서, X=H, M, K, R, E, S, G, A, C, D, I 또는 T임), I129V, S130A 및 S130R에서 선택되는 임의의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 11개의 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, IL-2Rγ에 대한 IL-2 폴리펩타이드의 결합을 변형시키는 하나 이상의 돌연변이는 Q126T, Q74H, L80F, R81D, L85V 및 I92F를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2Rγ에 대한 IL-2 폴리펩타이드의 결합을 변형시키는 하나 이상의 돌연변이는 L18R, Q22E, Q126T 및 S130R을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2Rγ 서브유닛에 대한 IL-2 폴리펩타이드의 결합은 야생형 IL-2와 비교하여 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99% 증강되거나 감소된다. 일부 실시형태에서, IL-2Rα 서브유닛에 대한 IL-2 폴리펩타이드의 결합은 야생형 IL-2와 비교하여 약 0.5% 내지 10%, 약 10% 내지 20%, 약 20% 내지 30%, 약 30% 내지 40%, 약 40% 내지 45%, 약 45% 내지 50%, 약 50% 내지 55%, 약 55% 내지 60%, 약 60% 내지 65%, 약 65% 내지 70%, 약 70% 내지 75%, 약 75% 내지 80%, 약 80% 내지 85%, 약 85% 내지 90%, 약 90% 내지 95% 또는 95% 내지 약 99% 감소된다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 IL-2 함유 면역접합체 분자는 본원에 기재된 바와 같은 고정 모이어티를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 고정 모이어티는 제2 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 차폐 모이어티는 제1 세포의 표면에서 발현되는 제1 표적 항원의 존재 하에서 IL-2 폴리펩타이드로부터 해리된다.
일부 실시형태에서, 제2 표적 항원은 제1 세포 또는 제1 세포에 근접한 제2 세포의 표면에서 발현된다. 일부 실시형태에서, 제1 표적 항원과 제2 표적 항원은 동일하거나 상이하다. 일부 실시형태에서, 제1 표적 항원 및/또는 제2 표적 항원은 종양 관련 항원이다. 일부 실시형태에서, 제1 표적 항원과 제2 표적 항원은, 각각 독립적으로, FAP, Her2, Her3, CD19, CD20, BCMA, PSMA, CEA, cMET, EGFR, CA-125, MUC-1, EpCAM 또는 Trop-2에서 선택된다. 일부 실시형태에서, 제1 표적 항원은 FAP이다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 IL-2 함유 면역접합체 분자는 본원에 기재된 바와 같은 접합 모이어티를 추가로 포함한다.
5.3.1 다클론 항체
본 개시내용의 면역접합체 분자의 일부를 형성하는 항체는 다클론 항체를 포함할 수 있다. 다클론 항체를 제조하는 방법은 당업자에게 알려져 있다. 다클론 항체는, 예를 들어 면역화제와, 목적하는 경우, 아쥬반트를 1회 이상 주사하는 방식으로 포유동물에서 생성될 수 있다. 전형적으로, 면역화제 및/또는 아쥬반트는 다회의 피하 또는 복강내 주사를 통해 포유동물에 주사된다. 면역화제는 폴리펩타이드 또는 이의 융합 단백질(예를 들어, IL-2 폴리펩타이드 또는 FAP 폴리펩타이드)을 포함할 수 있다. 면역화시키고자 하는 포유동물에서 면역원성이 있는 것으로 알려진 단백질에 면역화제를 접합시키거나, 단백질과 하나 이상의 아쥬반트로 포유동물을 면역화시키는 것이 유용할 수 있다. 이러한 면역원성 단백질의 예에는, 비제한적으로, 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin), 혈청 알부민, 소 티로글로불린 및 대두 트립신 저해제가 포함된다. 이용될 수 있는 아쥬반트의 예에는, Ribi, CpG, Poly 1C, 프로인트 완전 아쥬반트 및 MPL-TDM 아쥬반트(모노포스포릴 지질 A, 합성 트레할로오스 디코리노마이콜레이트(synthetic trehalose dicorynomycolate))가 포함된다. 면역화 프로토콜은 과도한 실험 없이 당업자에 의해 선택될 수 있다. 이어서, 포유동물을 채혈하고, 항체 역가에 대해 혈청을 검정할 수 있다. 목적하는 경우, 항체 역가가 증가하거나 안정될 때까지 포유동물을 부스팅할 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 하기 기재되는 바와 같이 하이브리도마로부터 단클론 항체를 융합하고 제조하기 위해 면역화된 동물에서 림프구를 얻을 수 있다.
5.3.2 단클론 항체
본 개시내용의 면역접합체 분자의 일부를 형성하는 항체는 대안적으로 단클론 항체일 수 있다. 단클론 항체는 문헌[Kohler et al., 1975, Nature 256:495-97]에 최초로 기재된 하이브리도마 방법을 사용하여 제조될 수 있거나, 재조합 DNA 방법(예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호 참조)을 통해 제조될 수 있다.
하이브리도마 방법에서, 면역화에 사용되는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유도하기 위해, 상기 기재된 바와 같이 마우스, 또는 햄스터와 같은 다른 적절한 숙주 동물을 면역화시킨다. 대안적으로, 림프구는 시험관내에서 면역화될 수 있다. 면역화 후, 림프구를 단리하고, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적합한 융합제를 사용하여 골수종 세포주와 융합하여 하이브리도마 세포를 형성한다(문헌[Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice 59-103 (1986)]).
이와 같이 제조된 하이브리도마 세포를 적합한 배양 배지에 씨딩하고 성장시키며, 특정 실시형태에서, 이러한 배양 배지는 융합되지 않은 모 골수종 세포(융합 파트너로도 지칭됨)의 성장 또는 생존을 저해하는 하나 이상의 물질을 함유한다. 예를 들어, 모 골수종 세포에 효소 하이포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라아제(HGPRT 또는 HPRT)가 결여되어 있는 경우, 하이브리도마를 위해 선택된 배양 배지는 전형적으로 HGPRT 결핍 세포의 성장을 방지하는 하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘(HAT 배지)을 포함할 것이다.
예시적인 융합 파트너 골수종 세포는 효율적으로 융합하고, 선택된 항체 생산 세포에 의한 안정적인 높은 수준의 항체 생산을 지원하며, 융합되지 않은 모 세포를 선택하는 선택 배지에 민감한 세포이다. 예시적인 골수종 세포주는 쥣과 골수종 세포주, 예컨대 SP-2 및 유도체, 예를 들어 American Type Culture Collection(버지니아주 머내서스 소재)에서 입수 가능한 X63-Ag8-653 세포와, Salk Institute Cell Distribution Center(캘리포니아주 샌디에이고 소재)에서 입수 가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양에서 유도된 세포주이다. 인간 골수종 세포주와 마우스-인간 이종골수종 세포주도 인간 단클론 항체의 생산에 대해 기재되어 있다(문헌[Kozbor, 1984, Immunol. 133:3001-05]; 및 문헌[Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications 51-63 (1987)]).
하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지를 항원에 대한 단클론 항체의 생산에 대해 검정한다. 하이브리도마 세포에 의해 생산된 단클론 항체의 결합 특이성은 면역침강법, 또는 RIA 또는 ELISA와 같은 시험관내 결합 검정에 의해 결정된다. 단클론 항체의 결합 친화도는, 예를 들어 문헌[Munson et al., 1980, Anal. Biochem. 107:220-39]에 기재된 Scatchard 분석을 통해 결정될 수 있다.
목적하는 특이성, 친화도 및/또는 활성을 갖는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포가 식별되면, 클론을 제한 희석 절차에 따라 서브클로닝하고 표준 방법(상기 Goding의 문헌)에 따라 성장시킬 수 있다. 이러한 목적에 적합한 배양 배지에는, 예를 들어 DMEM 또는 RPMI-1640 배지가 포함된다. 또한, 하이브리도마 세포를, 예를 들어 마우스에 세포를 i.p. 주사하는 방식으로 동물에서 복수 종양으로서 생체내 성장시킬 수 있다.
서브클론에 의해 분비된 단클론 항체를, 예를 들어 친화도 크로마토그래피(예를 들어, 단백질 A 또는 단백질 G-세파로오스 사용) 또는 이온 교환 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 등과 같은 통상의 항체 정제 절차를 통해 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 적합하게 분리한다.
단클론 항체를 인코딩하는 DNA를 통상의 절차를 사용하여(예를 들어, 쥣과 항체의 중쇄와 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용하여) 용이하게 단리하고 시퀀싱한다. 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 공급원 역할을 할 수 있다. 단리되면, DNA를 발현 벡터에 배치하고, 대장균 세포, 원숭이 COS 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 또는 달리 항체 단백질을 생산하지 않는 골수종 세포와 같은 숙주세포에 트랜스펙션시켜 재조합 숙주세포에서 단클론 항체의 합성을 달성할 수 있다. 항체를 인코딩하는 DNA의 박테리아에서의 재조합 발현에 대한 검토 문헌에는, 문헌[Skerra et al., 1993, Curr. Opinion in Immunol. 5:256-62] 및 문헌[Pluckthun, 1992, Immunol. Revs. 130:151-88]이 포함된다.
일부 실시형태에서, 에피토프에 결합하는 항체는 (1) 엄격한 조건(예를 들어, 약 45℃에서 6X 염화소듐/시트르산소듐(SSC) 중 필터 결합된 DNA에의 혼성화 후, 약 50℃ 내지 65℃에서 0.2X SSC/0.1% SDS로의 1회 이상의 세척), 고도로 엄격한 조건(예를 들어, 약 45℃에서 6X SSC 중 필터 결합된 핵산에의 혼성화 후, 약 68℃에서 0.1X SSC/0.2% SDS로의 1회 이상의 세척), 또는 당업자에게 알려진 다른 엄격한 혼성화 조건 하에서 본원에 기재된 VH 도메인 및/또는 VL 도메인 중 임의의 하나를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 보체에 혼성화되는 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩되는 VH 도메인의 아미노산 서열 및/또는 VL 도메인의 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology Vol. I, 6.3.1-6.3.6 and 2.10.3(Ausubel et al. eds., 1989)]을 참조한다.
일부 실시형태에서, FAP 에피토프에 결합하는 항체는 (1) 엄격한 조건(예를 들어, 약 45℃에서 6X SSC 중 필터 결합된 DNA에의 혼성화 후, 약 50℃ 내지 65℃에서 0.2X SSC/0.1% SDS로의 1회 이상의 세척), 고도로 엄격한 조건(예를 들어, 약 45℃에서 6X SSC 중 필터 결합된 핵산에의 혼성화 후, 약 68℃에서 0.1X SSC/0.2% SDS로의 1회 이상의 세척), 또는 당업자에게 알려진 다른 엄격한 혼성화 조건(예를 들어, 상기 Ausubel 등의 문헌 참조) 하에서 표 5와 표 6에 도시된 VH CDR 및/또는 VL CDR 중 임의의 하나를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 보체에 혼성화되는 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩되는 VH CDR의 아미노산 서열 또는 VL CDR의 아미노산 서열을 포함한다.
추가 실시형태에서, 단클론 항체 또는 항체 단편은, 예를 들어 문헌[Antibody Phage Display: Methods and Protocols (O'Brien and Aitken eds., 2002)]에 기재된 기술을 사용하여 생성된 항체 파지 라이브러리에서 단리될 수 있다. 이론적으로, 합성 항체 클론은 파지 코트 단백질에 융합된 항체 가변 영역(Fv)의 다양한 단편을 디스플레이하는 파지를 함유하는 파지 라이브러리를 스크리닝하는 방식으로 선택된다. 이러한 파지 라이브러리를 목적하는 항원에 대해 스크리닝한다. 목적하는 항원에 결합할 수 있는 Fv 단편을 발현하는 클론은 항원에 흡착되어 라이브러리 내 결합하지 않는 클론에서 분리된다. 이어서, 결합 클론을 항원에서 용리시키고, 항원 흡착/용리의 추가 주기를 통해 추가로 농축시킬 수 있다.
가변 도메인은, 예를 들어 문헌[Winter et al., 1994, Ann. Rev. Immunol. 12:433-55]에 기재된 바와 같이, VH와 VL이 짧고 가요성인 펩타이드를 통해 공유결합으로 연결되는 단일 사슬 Fv(scFv) 단편, 또는 VH와 VL이 각각 불변 도메인에 융합되어 비공유결합적으로 상호작용하는 Fab 단편으로서 파지에서 기능성으로 디스플레이될 수 있다.
VH 유전자와 VL 유전자의 레파토리를 PCR에 의해 개별적으로 클로닝하고 파지 라이브러리에서 무작위로 재조합할 수 있으며, 이후 상기 Winter 등의 문헌에 기재된 바와 같이 항원 결합 클론에 대해 검색할 수 있다. 면역화된 공급원의 라이브러리는 하이브리도마를 작제할 필요 없이 면역원에 대한 고친화도 항체를 제공한다. 대안적으로, 문헌[Griffiths et al., 1993, EMBO J 12:725-34]에 기재된 바와 같이, 어떠한 면역화 없이 광범위한 비-자가(non-self) 및 또한 자가 항원에 대한 인간 항체의 단일 공급원을 제공하기 위해 나이브(naive) 레파토리를 클로닝할 수 있다. 최종적으로, 나이브 라이브러리는 또한, 예를 들어 문헌[Hoogenboom and Winter, 1992, J. Mol. Biol. 227:381-88]에 기재된 바와 같이, 줄기세포에서 재배열되지 않은 V-유전자 분절을 클로닝하고, 고도로 가변적인 CDR3 영역을 인코딩하고 시험관내에서 재배열을 달성하기 위해 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용하는 방식으로 합성적으로 제조될 수 있다.
라이브러리의 스크리닝은 당업계에 알려진 다양한 기술에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 항원(예를 들어, IL-2 폴리펩타이드, 단편 또는 에피토프)은 흡착 플레이트의 웰을 코팅하는 데 사용되거나, 흡착 플레이트에 부착된 숙주세포에서 발현되거나, 세포 분류에 사용되거나, 스트렙타비딘 코팅된 비드를 이용한 포획을 위해 비오틴에 접합되거나, 또는 디스플레이 라이브러리를 패닝하는 임의의 다른 방법에 사용될 수 있다. 느린 해리 속도(예를 들어, 양호한 결합 친화도)를 갖는 항체의 선택은 문헌[Bass et al., 1990, Proteins 8:309-14] 및 국제공개 WO 92/09690호에 기재된 바와 같이 장시간 세척 및 1가 파지 디스플레이를 사용하고, 문헌[Marks et al., 1992, Biotechnol. 10:779-83]에 기재된 바와 같이 항원의 낮은 코팅 밀도를 사용하는 방식으로 촉진될 수 있다.
본원에 기재된 면역접합체 분자의 일부를 형성하는 항체는, 관심 파지 클론을 선택하기 위한 적합한 항원 스크리닝 절차를 설계한 후, 관심 파지 클론의 VH 서열 및/또는 VL 서열(예를 들어, Fv 서열), 또는 VH 서열과 VL 서열의 다양한 CDR 서열과, 상기 Kabat 등의 문헌에 기재된 적합한 불변 영역(예를 들어, Fc) 서열을 사용하여 전장 항체 클론을 작제하는 방식으로 얻을 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 면역접합체 분자의 일부를 형성하는 항체는 문헌[Bowers et al., 2011, Proc Natl Acad Sci USA. 108:20455-60]에 기재된 바와 같은 방법, 예를 들어 SHM-XHLTM 플랫폼(AnaptysBio, 캘리포니아주 샌디에이고 소재)을 사용하여 생성된다. 간략하게, 이러한 접근법에서, IgG의 완전 인간 라이브러리는 포유류 세포주(예를 들어, HEK293)에서 출발 라이브러리로 작제된다. 표적 펩타이드 또는 에피토프에 결합하는 면역글로불린을 디스플레이하는 포유류 세포를 (예를 들어, FACS 분류를 통해) 선택한 후, 활성화 유도 시티딘 데아미나아제(AID) 촉발 체세포 과돌연변이를 시험관내에서 재현하여 초기에 선택된 항체 풀의 다양성을 확장시킨다. 포유류 세포 표면 디스플레이를 시험관내 체세포 과돌연변이와 결합하는 방식으로 수차례 친화도 성숙을 거친 후, 고친화도 고특이성 항체가 생성된다. 항체 라이브러리 및/또는 항체 친화도 성숙을 생성하는 데 사용될 수 있는 추가 방법은, 예를 들어 미국 특허 제8,685,897호 및 제8,603,930호, 및 미국 특허출원공개 2014/0170705호, 2014/0094392호, 2012/0028301호, 2011/0183855호 및 2009/0075378호에 개시되어 있으며, 상기 문헌들은 각각 본원에 참조로 인용된다.
5.3.2.1 항체 단편
본 개시내용은 면역접합체 분자의 일부를 형성하는 항체와 항체 단편을 제공한다. 특정 상황에서, 전체 항체보다 항체 단편을 사용하는 것이 유리하다. 단편의 크기가 작을수록 신속한 제거가 가능하며, 세포, 조직 또는 기관으로의 접근이 개선될 수 있다. 특정 항체 단편에 대한 검토는, 문헌[Hudson et al., 2003, Nature Med. 9:129-34]을 참조한다.
항체 단편의 생산을 위한 다양한 기술이 개발되었다. 전형적으로, 이러한 단편은 온전한 항체의 단백질분해 소화를 통해 유도되었다(예를 들어, 문헌[Morimoto et al., 1992, J. Biochem. Biophys. Methods 24:107-17]; 및 문헌[Brennan et al., 1985, Science 229:81-83] 참조). 하지만, 이러한 단편은 이제 재조합 숙주세포에 의해 직접 생산될 수 있다. Fab, Fv 및 scFv 항체 단편은 모두 대장균 또는 효모 세포에서 발현되고 이로부터 분비될 수 있기 때문에, 이러한 단편을 대량으로 용이하게 생산할 수 있다. 항체 단편은 상기 논의된 항체 파지 라이브러리에서 단리될 수 있다. 대안적으로, Fab'-SH 단편은 대장균에서 직접 회수하고 화학적으로 결합하여 F(ab')2 단편을 형성할 수 있다(문헌[Carter et al., 1992, Bio/Technology 10:163-67]). 또 다른 접근법에 따르면, F(ab')2 단편은 재조합 숙주세포 배양물에서 직접 단리될 수 있다. 구제 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하는 생체내 반감기가 증가된 Fab 단편과 F(ab')2 단편은, 예를 들어 미국 특허 제5,869,046호에 기재되어 있다. 항체 단편을 생산하는 다른 기술이 당업자에게 명백할 것이다. 특정 실시형태에서, 항체는 단일 사슬 Fv 단편(scFv)이다(예를 들어, 국제공개 WO 93/16185호; 미국 특허 제5,571,894호 및 제5,587,458호 참조). Fv와 scFv는 불변 영역이 없는 온전한 결합 부위를 가지고 있기 때문에, 생체내 사용 동안 비특이적 결합을 감소시키는 데 적합할 수 있다. scFv 융합 단백질은 scFv의 아미노 또는 카르복시 말단에 이펙터 단백질의 융합을 생성하도록 작제될 수 있다(예를 들어, 상기 Borrebaeck 등의 문헌 참조). 항체 단편은 또한, 예를 들어 상기 인용된 참고문헌에 기재된 바와 같이 "선형 항체"일 수 있다. 이러한 선형 항체는 단일특이적 또는 다중특이적, 예컨대 이중특이적일 수 있다.
더 작은 항체 유래 결합 구조는 단일 가변 도메인 항체(sdAb)로도 지칭되는 별도의 가변 도메인(V 도메인)이다. 특정 유형의 유기체인 낙타와 연골 어류는 면역계의 일부로서 Fc 등가 도메인 구조에 장착된 고친화도 단일 V-유사 도메인을 보유한다. (문헌[Woolven et al., 1999, Immunogenetics 50: 98-101]; 및 문헌[Streltsov et al., 2004, Proc Natl Acad Sci USA. 101:12444-49]). V-유사 도메인(낙타에서는 VhH로 상어에서는 V-NAR로 지칭됨)은 전형적으로 표적 항원의 공동을 관통할 수 있는 긴 표면 루프를 디스플레이한다. 이는 또한 소수성 표면 패치를 차폐하는 방식으로 단리된 VH 도메인을 안정화시킨다.
이러한 VhH 도메인과 V-NAR 도메인은 sdAb를 조작하는 데 사용되었다. 인간 V 도메인 변이체는 파지 라이브러리로부터의 선택과, 안정한 고결합성 VL 및 VH 유래 도메인을 생성하는 다른 접근법을 사용하여 설계되었다.
본원에 제공된 항체에는, 비제한적으로, 면역글로불린 분자와, 면역글로불린 분자, 예를 들어 에피토프(예를 들어, IL-2 에피토프 또는 FAP 에피토프)에 결합하는 항원 결합 부위를 함유하는 분자의 면역학적 활성 부분이 포함된다. 본원에 제공된 면역글로불린 분자는 면역글로불린 분자의 임의의 클래스(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD 및 IgA) 또는 임의의 서브클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2)의 것일 수 있다.
항체의 변이체 및 유도체에는, 에피토프(예를 들어, IL-2 에피토프 또는 FAP 에피토프)에 결합하는 능력을 보유하는 항체 기능성 단편이 포함된다. 예시적인 기능성 단편에는, Fab 단편(예를 들어, 항원 결합 도메인을 함유하고, 디설파이드 결합에 의해 브릿지된 경쇄와 중쇄의 일부를 포함하는 항체 단편); Fab'(예를 들어, 단일 항원 결합 도메인을 함유하고, Fab와 힌지 영역을 통한 중쇄의 추가 부분을 포함하는 항체 단편); F(ab')2(예를 들어, 중쇄의 힌지 영역에서 사슬간 디설파이드 결합으로 연결된 2개의 Fab' 분자; Fab' 분자는 동일하거나 상이한 에피토프에 대해 지시될 수 있음); 이중특이적 Fab(예를 들어, 2개의 항원 결합 도메인을 갖는 Fab 분자, 항원 결합 도메인은 각각 상이한 에피토프에 대해 지시될 수 있음); scFv 로도 알려진, 가변 영역을 포함하는 단일 사슬(예를 들어, 10개 내지 25개 아미노산의 사슬에 의해 함께 연결된 항체의 단일 경쇄와 중쇄의 가변 항원 결합 결정 영역); 디설파이드 결합된 Fv 또는 dsFv(예를 들어, 디설파이드 결합에 의해 함께 연결된 항체의 단일 경쇄와 중쇄의 가변 항원 결합 결정 영역); 낙타화 VH(예를 들어, VH 경계면의 일부 아미노산이 자연 발생 낙타 항체의 중쇄에서 발견되는 아미노산인 항체의 단일 중쇄의 가변 항원 결합 결정 영역); 이중특이적 scFv(예를 들어, 2개의 항원 결합 도메인을 갖는 scFv 또는 dsFv 분자, 항원 결합 도메인은 각각 상이한 에피토프에 대해 지시될 수 있음); 디아바디(예를 들어, 제1 scFv의 VH 도메인이 제2 scFv의 VL 도메인과 어셈블링되고, 제1 scFv의 VL 도메인이 제2 scFv의 VH 도메인과 어셈블링될 때 형성되는 이량체화 scFv; 디아바디의 2개의 항원 결합 영역은 동일하거나 상이한 에피토프에 대해 지시될 수 있음); 및 트리아바디(예를 들어, 디아바디와 유사한 방식으로 형성되었지만, 3개의 항원 결합 도메인이 단일 복합체에서 생성된 삼량체화 scFv; 3개의 항원 결합 도메인은 동일하거나 상이한 에피토프에 대해 지시될 수 있음)가 포함된다.
5.3.2.2 인간화 항체
일부 실시형태에서, 본원에 제공된 면역접합체 분자의 일부를 형성하는 항체는 인간 및/또는 시노몰구스 항원(예컨대, 인간 IL-2 또는 인간 FAP)을 포함하는 항원에 결합하는 인간화 항체일 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 인간화 항체는 표 1 및 표 2와 표 5 및 표 6에 제시된 바와 같은 하나 이상의 CDR을 포함할 수 있다. 비인간 항체의 다양한 인간화 방법이 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 인간화 항체는 인간이 아닌 공급원에서 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 이러한 비인간 아미노산 잔기는 종종 "임포트(import)" 잔기로 지칭되며, 전형적으로 "임포트" 가변 도메인에서 취해진다. 인간화는 문헌[Jones et al., 1986, Nature 321:522-25]; 문헌[Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-27]; 및 문헌[Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-36]의 방법에 따라, 예를 들어 초가변 영역 서열을 인간 항체의 상응하는 서열로 대체하는 방식으로 수행될 수 있다.
일부 경우에, 인간화 항체는 모 비인간 항체(예를 들어, 설치류)의 6개의 CDR의 아미노산 서열을 인간 항체 프레임워크에 이식하는 CDR 이식에 의해 작제된다. 예를 들어, Padlan 등은, CDR의 잔기 중 약 1/3만 항원과 실제로 접촉한다는 것을 확인하고, 이를 "특이성 결정 잔기" 또는 SDR로 지칭하였다(문헌[Padlan et al., 1995, FASEB J. 9:133-39]). SDR 이식 기술에서, SDR 잔기만 인간 항체 프레임워크에 이식된다(예를 들어, 문헌[Kashmiri et al., 2005, Methods 36:25-34] 참조).
인간화 항체를 제조하는 데 사용되는 인간 가변 도메인(경쇄와 중쇄 둘 모두)의 선택은 항원성을 감소시키는 데 중요할 수 있다. 예를 들어, 소위 "최적합(best-fit)" 방법에 따르면, 비인간(예를 들어, 설치류) 항체의 가변 도메인 서열을 알려진 인간 가변 도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝한다. 설치류와 가장 가까운 인간 서열이 인간화 항체에 대한 인간 프레임워크로 선택될 수 있다(문헌[Sims et al., 1993, J. Immunol. 151:2296-308]; 및 문헌[Chothia et al., 1987, J. Mol. Biol. 196:901-17]). 또 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위그룹의 모든 인간 항체의 공통 서열에서 유도된 특정 프레임워크를 사용한다. 몇몇 상이한 인간화 항체에 대해 동일한 프레임워크가 사용될 수 있다(문헌[Carter et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285-89]; 및 문헌[Presta et al., 1993, J. Immunol. 151:2623-32]). 일부 경우에, 프레임워크는 가장 풍부한 인간 서브클래스인, VL6 하위그룹 I(VL6I)과 VH 하위그룹 III(VHIII)의 공통 서열에서 유도된다. 또 다른 방법에서, 인간 생식계열 유전자가 프레임워크 영역의 공급원으로 사용된다.
초인간화로 불리는 CDR의 비교를 기반으로 하는 대안적인 패러다임에서, FR 상동성은 상관이 없다. 상기 방법은 비인간 서열을 기능성 인간 생식계열 유전자 레파토리와 비교하는 것으로 이루어진다. 이어서, 쥣과 서열과 동일하거나 밀접하게 관련된 표준 구조를 인코딩하는 유전자가 선택된다. 다음으로, 비인간 항체와 표준 구조를 공유하는 유전자 내에서, CDR 내 상동성이 가장 높은 유전자가 FR 공여체로서 선택된다. 최종적으로, 비인간 CDR이 이러한 FR에 이식된다(예를 들어, 문헌[Tan et al., 2002, J. Immunol. 169:1119-25] 참조).
나아가, 항체는 항원에 대한 친화도와 다른 유리한 생물학적 특성을 유지하면서 인간화되는 것이 일반적으로 바람직하다. 이러한 목표를 달성하기 위해, 하나의 방법에 따르면, 인간화 항체는 모 서열과 인간화 서열의 3차원 모델을 사용하여 모 서열과 다양한 개념적 인간화 생성물을 분석하는 과정을 통해 제조된다. 3차원 면역글로불린 모델이 통상적으로 이용 가능하며, 당업자에게 친숙하다. 선별된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 입체형태 구조를 예시하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 이용 가능하다. 이에는, 예를 들어 WAM(문헌[Whitelegg and Rees, 2000, Protein Eng. 13:819-24]), Modeller(문헌[Sali and Blundell, 1993, J. Mol. Biol. 234:779-815]) 및 Swiss PDB Viewer(문헌[Guex and Peitsch, 1997, Electrophoresis 18:2714-23])가 포함된다. 이러한 디스플레이를 검사하면, 후보 면역글로불린 서열의 기능성에서 잔기의 잠재적인 역할, 예를 들어 항원에 결합하는 후보 면역글로불린의 능력에 영향을 미치는 잔기를 분석할 수 있다. 이러한 방식으로, 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화도와 같은 목적하는 항체 특징이 달성되도록, 수용 및 임포트 서열로부터 FR 잔기를 선택하고 조합할 수 있다. 일반적으로, 초가변 영역 잔기가 항원 결합에 영향을 미치는 데 직접적이고 가장 실질적으로 관여한다.
또 다른 항체 인간화 방법은 HSC(Human String Content)로 지칭되는 항체 인간성의 척도를 기반으로 한다. 이러한 방법은 마우스 서열을 인간 생식계열 유전자의 레파토리와 비교하고, 차이를 HSC로 점수화한다. 이어서, 다수의 다양한 인간화 변이체를 생성하기 위해 포괄적인 동일성 척도를 사용하는 대신 HSC를 최대화하는 방식으로 표적 서열을 인간화한다(문헌[Lazar et al., 2007, Mol. Immunol. 44:1986-98]).
상기 기재된 방법에 더하여, 인간화 항체를 생성하고 선택하는 데 경험적인 방법이 사용될 수 있다. 이러한 방법에는, 인간화 변이체의 대규모 라이브러리를 생성하고, 농축 기술 또는 고처리량 스크리닝 기술을 사용하여 최상의 클론을 선택하는 것을 기반으로 하는 방법이 포함된다. 항체 변이체는 파지, 리보솜 및 효모 디스플레이 라이브러리뿐 아니라, 박테리아 콜로니 스크리닝을 통해 단리될 수 있다(예를 들어, 문헌[Hoogenboom, 2005, Nat. Biotechnol. 23:1105-16]; 문헌[Dufner et al., 2006, Trends Biotechnol. 24:523-29]; 문헌[Feldhaus et al., 2003, Nat. Biotechnol. 21:163-70]; 및 문헌[Schlapschy et al., 2004, Protein Eng. Des. Sel. 17:847-60] 참조).
FR 라이브러리 접근법에서, 잔기 변이체의 집합을 FR의 특정 위치에 도입한 후, 라이브러리를 스크리닝하여 이식된 CDR을 최상으로 지원하는 FR을 선택한다. 치환하고자 하는 잔기는 CDR 구조에 잠재적으로 기여하는 것으로 확인된 "버니어(Vernier)" 잔기의 일부 또는 전부를 포함하거나(예를 들어, 문헌[Foote and Winter, 1992, J. Mol. Biol. 224:487-99] 참조), 문헌[Baca et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:10678-84]에 의해 확인된 보다 제한된 표적 잔기 세트에서 유래할 수 있다.
FR 셔플링에서, 전체 FR은 선택된 잔기 변이체의 복합 라이브러리를 생성하는 대신 비인간 CDR과 조합된다(예를 들어, 문헌[Dall'Acqua et al., 2005, Methods 36:43-60] 참조). 먼저 VL을 인간화한 후, VH를 인간화하는 2단계 과정으로 라이브러리를 결합에 대해 스크리닝할 수 있다. 대안적으로, 1단계 FR 셔플링 과정이 사용될 수 있다. 이러한 과정은 생성된 항체가 증강된 발현, 증가된 친화도 및 열 안정성을 포함하는 개선된 생화학적 및 생리화학적 특성을 나타냈기 때문에, 2단계 스크리닝보다 더 효율적인 것으로 나타났다(예를 들어, 문헌[Damschroder et al., 2007, Mol. Immunol. 44:3049-60] 참조).
"휴머니어링(humaneering)" 방법은 필수 최소 특이성 결정인자(MSD: minimum specificity determinant)의 실험적 식별을 기반으로 하며, 비인간 단편을 인간 FR의 라이브러리로 순차적으로 대체하고 결합을 평가하는 것에 기반한다. 이는 비인간 VH 사슬과 VL 사슬의 CDR3 영역으로 시작하며, VH와 VL 둘 모두의 CDR1과 CDR2를 포함하여 비인간 항체의 다른 영역을 인간 FR로 점진적으로 대체한다. 이러한 방법은 전형적으로 에피토프를 유지하고, 별개의 인간 V-분절 CDR을 갖는 다수의 서브클래스에서 항체의 식별을 가능하게 한다. 휴머니어링은 인간 생식계열 유전자 항체와 91% 내지 96% 상동인 항체의 단리를 가능하게 한다(예를 들어, 문헌[Alfenito, Cambridge Healthtech Institute's Third Annual PEGS, The Protein Engineering Summit, 2007] 참조).
"인간 공학(human engineering)" 방법은 본래 비인간 항체의 바람직한 결합 특성을 유지하면서도 인간에서 면역원성이 감소된 변형된 항체를 생성하기 위해 항체의 아미노산 서열에 특정한 변화를 가하는 방식으로, 마우스 또는 키메라 항체 또는 항체 단편과 같은 비인간 항체 또는 항체 단편을 변경하는 것을 포함한다. 일반적으로, 이러한 기술은 비인간(예를 들어, 마우스) 항체의 아미노산 잔기를 "저위험", "중간 위험" 또는 "고위험" 잔기로 분류하는 것을 포함한다. 분류는, 치환이 생성된 항체의 폴딩에 영향을 미치는 위험에 대해 (예를 들어, 인간에서의 면역원성에 대한) 특정 치환을 수행할 때 예상되는 이점을 평가하는 전체 위험/보상 계산을 사용하여 수행된다. 비인간(예를 들어, 마우스) 항체 서열의 소정의 위치(예를 들어, 저위험 또는 중간 위험)에서 치환하고자 하는 특정 인간 아미노산 잔기는, 비인간 항체의 가변 영역의 아미노산 서열을 특정 또는 공통 인간 항체 서열의 상응하는 영역과 정렬하는 방식으로 선택될 수 있다. 비인간 서열에서 저위험 또는 중간 위험의 아미노산 잔기는 정렬에 따라 인간 항체 서열의 상응하는 잔기로 치환될 수 있다. 인간 조작된 단백질을 제조하는 기술은 문헌[Studnicka et al., 1994, Protein Engineering 7:805-14]; 미국 특허 제5,766,886호; 제5,770,196호; 제5,821,123호; 및 제5,869,619호; 및 PCT 국제공개 WO 93/11794호에 보다 상세하게 기재되어 있다.
5.3.2.3 인간 항체
인간 항체는 인간 유래 파지 디스플레이 라이브러리에서 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열(들)을 알려진 인간 불변 도메인 서열(들)과 조합하는 방식으로 작제될 수 있다. 대안적으로, 본 개시내용의 인간 단클론 항체는 하이브리도마 방법으로 제조될 수 있다. 인간 단클론 항체의 생산을 위한 인간 골수종 세포주와 마우스-인간 이종골수종 세포주는, 예를 들어 문헌[Kozbor, 1984, Immunol. 133:3001-05]; 문헌[Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications 51-63 (1987)]; 및 문헌[Boerner et al., 1991, J. Immunol. 147:86-95]에 기재되어 있다.
내인성 면역글로불린 생산 없이, 면역화 시 인간 항체의 전체 레파토리를 생산할 수 있는 유전자이식 동물(예를 들어, 마우스)를 생산하는 것도 가능하다. 인간 항체 레파토리를 발현하는 유전자이식 마우스는 다양한 잠재적인 약물 표적에 대한 고친화도 인간 서열 단클론 항체를 생성하는 데 사용되었다(예를 들어, 문헌[Jakobovits, A., 1995, Curr. Opin. Biotechnol. 6(5):561-66]; 문헌[Bruggemann and Taussing, 1997, Curr. Opin. Biotechnol. 8(4):455-58]; 미국 특허 제6,075,181호 및 제6,150,584호; 및 문헌[Lonberg et al., 2005, Nature Biotechnol. 23:1117-25] 참조).
대안적으로, 인간 항체는 표적 항원에 대한 항체를 생산하는 인간 B림프구(예를 들어, 이러한 B림프구는 개인에서 회수되거나 시험관내에서 면역화될 수 있음)의 불멸화를 통해 제조될 수 있다(예를 들어, 문헌[Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (1985)]; 문헌[Boerner et al., 1991, J. Immunol. 147(1):86-95]; 및 미국 특허 제5,750,373호 참조).
유전자 셔플링은 또한 비인간, 예를 들어 설치류 항체에서 인간 항체를 유도하는 데 사용될 수 있으며, 여기서 인간 항체는 출발 비인간 항체와 유사한 친화도와 특이성을 갖는다. "에피토프 임프린팅" 또는 "유도 선택(guided selection)"으로도 불리는 이러한 방법에 따르면, 본원에 기재된 바와 같은 파지 디스플레이 기술을 통해 얻은 비인간 항체 단편의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역이 인간 V 도메인 유전자의 레파토리로 대체되어, 비인간 사슬/인간 사슬 scFv 또는 Fab 키메라의 집단이 생성된다. 항원을 이용한 선택으로 비인간 사슬/인간 사슬 키메라 scFv 또는 Fab이 단리되며, 여기서 인간 사슬은 1차 파지 디스플레이 클론에서 상응하는 비인간 사슬의 제거 시(예를 들어, 에피토프는 인간 사슬 파트너의 선택을 안내(임프린팅)함) 파괴된 항원 결합 부위를 복원한다. 나머지 비인간 사슬을 대체하기 위해 과정을 반복하면, 인간 항체가 얻어진다(예를 들어, PCT 국제공개 WO 93/06213호; 및 문헌[Osbourn et al., 2005, Methods 36:61-68] 참조). CDR 이식에 의한 비인간 항체의 전형적인 인간화와 달리, 이러한 기술은 비인간 기원의 FR 또는 CDR 잔기가 없는 완전한 인간 항체를 제공한다. 세포 표면 항원에 대한 마우스 항체를 인간화하기 위한 유도 선택의 예에는, 난소암 세포에 존재하는 폴레이트 결합 단백질(예를 들어, 문헌[Figini et al., 1998, Cancer Res. 58:991-96] 참조)과 간세포 암종에서 고도로 발현되는 CD147(예를 들어, 문헌[Bao et al., 2005, Cancer Biol. Ther. 4:1374-80] 참조)이 포함된다.
유도 선택 접근법의 잠재적인 단점은, 다른 항체 사슬을 유지하면서 하나의 항체 사슬을 셔플링하면 에피토프 드리프트가 일어날 수 있다는 점이다. 비인간 항체에 의해 인식되는 에피토프를 유지하기 위해, CDR 보유가 적용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Klimka et al., 2000, Br. J. Cancer. 83:252-60]; 및 문헌[Beiboer et al., 2000, J. Mol. Biol. 296:833-49] 참조). 이러한 방법에서, 비인간 VH CDR3이 통상적으로 유지되는데, 이러한 CDR이 항원 결합 부위의 중심에 존재하고, 항원 인식을 위한 항체의 가장 중요한 영역일 수 있기 때문이다. 하지만, 일부 경우에, 비인간 항체의 VH CDR3 및 VL CDR3뿐 아니라, VH CDR2, VL CDR2 및 VL CDR1이 유지될 수 있다.
5.3.3 항체 변이체
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 면역접합체 분자의 일부를 형성하는 항체의 아미노산 서열 변형(들)이 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화도, 및/또는 비제한적으로, 특이성, 열안정성, 발현 수준, 이펙터 기능, 글리코실화, 감소된 면역원성 또는 용해성을 포함하는 다른 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 본원에 제공된 특정 항체에 더하여, 항체 변이체가 제조될 수 있다는 것이 고려된다. 예를 들어, 항체 변이체는 인코딩 DNA에 적절한 뉴클레오타이드 변화를 도입하고/하거나, 목적하는 항체 또는 폴리펩타이드를 합성하는 방식으로 제조될 수 있다. 당업자는, 아미노산 변화가 글리코실화 부위의 수 또는 위치를 변경시키거나, 막 고정 특징을 변경시키는 것과 같이 항체의 번역 후 과정을 변경시킬 수 있다는 것을 이해한다.
일부 실시형태에서, 본원에 제공된 항체는, 예를 들어 항체에 임의의 유형의 분자를 공유결합으로 부착시키는 방식으로 화학적으로 변형된다. 항체 유도체는, 예를 들어 글리코실화, 아세틸화, PEG화, 인산화, 아미드화, 알려진 보호기/차단기에 의한 유도체화, 화학적 절단, 단백질분해 절단, 세포 리간드 또는 다른 단백질에의 연결 등의 증가 또는 감소에 의해 화학적으로 변형된 항체를 포함할 수 있다. 또한, 항체는 하나 이상의 비(non)전형적인 아미노산을 함유할 수 있다.
변이는 천연 서열 항체 또는 폴리펩타이드와 비교하여 아미노산 서열에 변화를 생성하는 항체 또는 폴리펩타이드를 인코딩하는 하나 이상의 코돈의 치환, 결실 또는 삽입일 수 있다. 아미노산 치환은 하나의 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 특성을 갖는 또 다른 아미노산으로 대체한 결과, 예컨대 류신의 세린으로의 대체, 예를 들어 보존적 아미노산 대체일 수 있다. 삽입 또는 결실은 선택적으로 약 1개 내지 5개 아미노산 범위일 수 있다. 특정 실시형태에서, 치환, 결실 또는 삽입은 본래 분자에 비해 25개 미만의 아미노산 치환, 20개 미만의 아미노산 치환, 15개 미만의 아미노산 치환, 10개 미만의 아미노산 치환, 5개 미만의 아미노산 치환, 4개 미만의 아미노산 치환, 3개 미만의 아미노산 치환 또는 2개 미만의 아미노산 치환을 포함한다. 특정 실시형태에서, 치환은 하나 이상의 예측된 비필수 아미노산 잔기에 이루어진 보존적 아미노산 치환이다. 허용되는 변이는 서열에 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환을 체계적으로 만들고, 생성된 변이체를 전장 또는 성숙한 천연 서열에 의해 나타내는 활성에 대해 시험하는 방식으로 결정될 수 있다.
아미노산 서열 삽입에는 하나의 잔기에서 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩타이드 길이 범위의 아미노 및/또는 카르복실 말단 융합뿐 아니라, 단일 또는 다수의 아미노산 잔기의 서열내 삽입이 포함된다. 말단 삽입의 예에는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체가 포함된다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체에는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩타이드 또는 효소(예를 들어, 항체 지향 효소 약물 요법의 경우)에 대한 항체의 N-말단 또는 C-말단의 융합이 포함된다.
항체의 생물학적 특성의 실질적인 변형은 (a) 치환의 영역에서 폴리펩타이드 백본의 구조를, 예를 들어 시트 또는 나선 입체형태로 유지하는 효과, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성을 유지하는 효과, 또는 (c) 측쇄의 벌크를 유지하는 효과가 유의하게 상이한 치환을 선택하는 방식으로 달성된다. 대안적으로, 해당 특성을 유지하거나 유의하게 변화시키지 않도록 (예를 들어, 유사한 특성 및/또는 측쇄를 갖는 아미노산 그룹 내) 보존적 치환이 이루어질 수 있다. 아미노산은 이의 측쇄 특성의 유사성에 따라 분류될 수 있다(예를 들어, 문헌[Lehninger, Biochemistry 73-75 (2d ed. 1975)] 참조): (1) 비극성: Ala(A), Val(V), Leu(L), Ile(I), Pro(P), Phe(F), Trp(W), Met(M); (2) 하전되지 않은 극성: Gly(G), Ser(S), Thr(T), Cys(C), Tyr(Y), Asn(N), Gln(Q); (3) 산성: Asp(D), Glu(E); 및 (4) 염기성: Lys(K), Arg(R), His(H).
대안적으로, 자연 발생 잔기는 공통 측쇄 특성에 기반하여 하기와 같은 그룹으로 분류될 수 있다: (1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) 산성: Asp, Glu; (4) 염기성: His, Lys, Arg; (5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; 및 (6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비보존적 치환은 이러한 클래스의 하나의 구성원을 또 다른 클래스로 교환하는 것을 포함한다. 이러한 치환된 잔기는 또한 보존적 치환 부위 또는 나머지(보존되지 않은) 부위에 도입될 수 있다. 따라서, 일 실시형태에서, 에피토프에 결합하는 항체 또는 이의 단편은 본원에 제공된 쥣과 단클론 항체의 아미노산 서열과 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 에피토프에 결합하는 항체 또는 이의 단편은 표 1 내지 표 8에 도시된 아미노산 서열과 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 면역접합체 분자의 일부를 형성하는 항체 또는 이의 단편은, 표 2에 도시된 VH CDR 아미노산 서열 및/또는 표 1에 도시된 VL CDR 아미노산 서열과 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 VH CDR 아미노산 서열 및/또는 VL CDR 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 면역접합체 분자의 일부를 형성하는 항체 또는 이의 단편은, 표 6에 도시된 VH CDR 아미노산 서열 및/또는 표 5에 도시된 VL CDR 아미노산 서열과 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 VH CDR 아미노산 서열 및/또는 VL CDR 아미노산 서열을 포함한다. 변이는 올리고뉴클레오타이드 매개(부위 지정) 돌연변이유발, 알라닌 스캐닝 및 PCR 돌연변이유발과 같은 당업계에 알려진 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 항체 변이체 DNA를 생산하기 위해, 부위 지정 돌연변이유발(예를 들어, 문헌[Carter, 1986, Biochem J. 237:1-7]; 및 문헌[Zoller et al., 1982, Nucl. Acids Res. 10:6487-500] 참조), 카세트 돌연변이유발(예를 들어, 문헌[Wells et al., 1985, Gene 34:315-23] 참조) 또는 다른 알려진 기술이 클로닝된 DNA에 수행될 수 있다.
분자의 산화 안정성을 개선하고 비정상적인 가교를 방지하기 위해, 항체의 적절한 입체형태를 유지하는 데 관여하지 않는 임의의 시스테인 잔기가 또한, 예를 들어 알라닌 또는 세린과 같은 또 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 반대로, 안정성을 개선시키기 위해 시스테인 결합(들)이 항체에 부가될 수 있다(예를 들어, 여기서 항체는 Fv 단편과 같은 항체 단편임).
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 면역접합체 분자의 일부를 형성하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 "탈면역화된(de-immunized)" 항체이다. "탈면역화된" 항체는 인간화 또는 키메라 항체에서 유도된 항체로서, 각각의 본래 탈면역화되지 않은 항체와 비교하여 아미노산 서열에 하나 이상의 변경이 있어 항체의 면역원성이 감소된 항체이다. 이러한 항체 돌연변이체를 생성하는 절차 중 하나는 항체 분자의 T세포 에피토프를 식별하고 제거하는 것을 포함한다. 첫 번째 단계에서, 당업계에 알려진 바와 같은 몇 가지 방법, 예를 들어 T세포 에피토프의 시험관내 결정 또는 이러한 에피토프의 가상(in silico) 예측을 통해 항체 분자의 면역원성을 결정할 수 있다. T세포 에피토프 기능에 중요한 잔기가 확인되면, 면역원성을 제거하고 항체 활성을 유지하기 위해 돌연변이를 생성할 수 있다. 검토를 위해서는, 예를 들어 문헌[Jones et al., 2009, Methods in Molecular Biology 525:405-23]을 참조한다.
5.3.3.1 시험관내 친화도 성숙
일부 실시형태에서, 모 항체와 비교하여 친화도, 안정성 또는 발현 수준과 같은 특성이 개선된 항체 변이체가 시험관내 친화도 성숙에 의해 제조될 수 있다. 천연 원형과 같이, 시험관내 친화도 성숙은 돌연변이와 선별의 원리를 기반으로 한다. 항체의 라이브러리는 유기체(예를 들어, 파지, 박테리아, 효모 또는 포유류 세포)의 표면에, 또는 이의 인코딩 mRNA 또는 DNA와 (예를 들어, 공유결합 또는 비공유결합으로) 회합 시 Fab, scFv 또는 V 도메인 단편으로 디스플레이된다. 디스플레이된 항체의 친화도 선별은 항체를 인코딩하는 유전 정보를 운반하는 유기체 또는 복합체의 단리를 가능하게 한다. 파지 디스플레이와 같은 디스플레이 방법을 사용한 2회 또는 3회의 돌연변이 및 선택은 통상적으로 낮은 나노몰 범위의 친화도를 갖는 항체 단편을 생성한다. 친화도 성숙된 항체는 표적 항원에 대하여 나노몰 또는 심지어 피코몰 수준의 친화도를 가질 수 있다.
파지 디스플레이는 항체의 디스플레이 및 선별을 위해 널리 사용되는 방법이다. 항체는 박테리오파지 코트 단백질에 대한 융합체로서 Fd 또는 M13 박테리오파지의 표면에 디스플레이된다. 선택은 파지 디스플레이된 항체가 표적에 결합할 수 있도록 항원에 노출시키는 "패닝(panning)"으로 지칭되는 과정을 포함한다. 항원에 결합된 파지를 회수하고, 박테리아를 감염시키는 데 사용하여 추가 회차의 선택을 위한 파지를 생산한다. 검토를 위해서는, 예를 들어 문헌[Hoogenboom, 2002, Methods. Mol. Biol. 178:1-37]; 및 문헌[Bradbury and Marks, 2004, J. Immunol. Methods 290:29-49]을 참조한다.
효모 디스플레이 시스템(예를 들어, 문헌[Boder et al., 1997, Nat. Biotech. 15:553-57]; 및 문헌[Chao et al., 2006, Nat. Protocols 1:755-68] 참조)에서, 항체는 중쇄와 경쇄가 가요성 링커로 연결된 단일 사슬 가변 융합체(scFv)로 디스플레이될 수 있다. scFv는 Aga1p에 대한 디설파이드 결합을 통해 효모 세포벽에 부착되는 효모 응집소 단백질 Aga2p의 부착 서브유닛에 융합된다. Aga2p를 통한 단백질의 디스플레이는 단백질을 세포 표면에서 멀리 투사하여, 효모 세포벽에서의 다른 분자와의 잠재적인 상호작용을 최소화한다. 친화도 또는 안정성이 개선된 항체를 선별하기 위해, 자성 분리와 유세포분석을 사용하여 라이브러리를 스크리닝한다. 관심 가용성 항원에의 결합은 효모를 비오틴화된 항원과 2차 시약(예컨대, 형광단에 접합된 스트렙타비딘)으로 표지하는 방식으로 결정된다. 항체의 표면 발현의 변화는 scFv를 플랭킹하는 c-Myc 에피토프 태그 또는 헤마글루티닌의 면역형광 표지화를 통해 측정될 수 있다. 발현이 디스플레이된 단백질의 안정성과 상관관계가 있는 것으로 나타났기 때문에, 항체는 개선된 친화도뿐 아니라 개선된 안정성에 대해 선택될 수 있다(예를 들어, 문헌[Shusta et al., 1999, J. Mol. Biol. 292:949-56] 참조). 효모 디스플레이의 추가 이점은, 디스플레이된 단백질이 소포체 샤페론과 품질 관리 기구를 통해 진핵생물 효모 세포의 소포체에 폴딩된다는 점이다. 성숙이 완료되면, 효모의 표면에 디스플레이되는 동안 항체 친화도를 편리하게 "적정"할 수 있기 때문에, 각각의 클론을 발현시키고 정제할 필요가 없다. 효모 표면 디스플레이의 이론적 한계는 다른 디스플레이 방법보다 기능성 라이브러리 크기가 더 작을 수 있다는 것이지만; 최근 접근법은 효모 세포의 교배 시스템을 사용하여 크기가 1014인 것으로 추정되는 복합 다양성을 생성한다(예를 들어, 미국 특허출원공개 2003/0186374; 및 문헌[Blaise et al., 2004, Gene 342:211-18] 참조).
리보솜 디스플레이에서는, 무세포 시스템에서의 선별을 위해 항체-리보솜-mRNA(ARM) 복합체가 생성된다. 항체의 특정 라이브러리를 코딩하는 DNA 라이브러리는 정지 코돈이 결여된 스페이서 서열에 유전적으로 융합된다. 이러한 스페이서 서열은, 번역될 때, 펩티딜 tRNA에 여전히 부착되어 리보솜 터널을 차지하기 때문에, 관심 단백질이 리보솜 밖으로 튀어나와 폴딩되게 할 수 있다. 생성된 mRNA, 리보솜 및 단백질의 복합체는 표면 결합 리간드에 결합하여, 리간드를 이용한 친화도 포획을 통해 항체와 이의 인코딩 mRNA를 동시에 단리되게 할 수 있다. 이어서, 리보솜 결합 mRNA는 cDNA로 역전사되어, 돌연변이유발을 거쳐 다음 선별 회차에 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Fukuda et al., 2006, Nucleic Acids Res. 34:e127] 참조). mRNA 디스플레이에서, 항체와 mRNA 사이의 공유결합은 어댑터 분자로서 퓨로마이신을 사용하여 확립된다(문헌[Wilson et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:3750-55]).
이러한 방법은 전적으로 시험관내에서 수행되기 때문에, 다른 선별 기술에 비해 2가지 주요한 이점을 제공한다. 첫 번째는, 라이브러리의 다양성이 박테리아 세포의 형질전환 효율에 의해 제한되는 것이 아니라, 시험관에 존재하는 리보솜과 상이한 mRNA 분자의 수에 의해서만 제한된다는 점이다. 두 번째는, 다양화 단계 후 라이브러리는 형질전환될 필요가 없기 때문에, 각 선별 회차 후, 예를 들어 비(non)-교정 폴리머라아제에 의해 무작위 돌연변이가 용이하게 도입될 수 있다는 점이다.
포유류 세포 디스플레이 시스템(예를 들어, 문헌[Bowers et al., 2011, Proc Natl Acad Sci USA. 108:20455-60] 참조)에서, IgG의 완전 인간 라이브러리는 사전 재조합된 D(J) 영역에 연결된 생식계열 서열 V-유전자 분절에 기반하여 작제된다. 중쇄와 경쇄의 전장 V 영역을 인간 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역과 어셈블링하여 포유류 세포주(예를 들어, HEK293)에 트랜스펙션(transfection)시킨다. 트랜스펙션된 라이브러리를 확장시키고 스트렙타비딘(SA) 결합된 자성 비드에 대한 수차례 음성 선별에 적용한 후, 비오틴화된 표적 단백질, 펩타이드 단편 또는 에피토프로 코팅된 SA 결합된 자성 비드에 대한 한 차례의 양성 선별에 적용한다. 양성으로 선별된 세포를 확장시킨 후, 수차례 FACS에 의해 분류하여 표적 단백질, 펩타이드 단편 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 디스플레이하는 단일 세포 클론을 단리한다. 이러한 단일 세포 클론의 중쇄 및 경쇄 쌍을 추가 성숙을 위해 AID로 재트랜스펙션시킨다. AID 촉발 체세포 과돌연변이와 결합된 수차례의 포유류 세포 디스플레이를 통해 고특이성 고친화도 항체를 생성한다.
다양성은 또한 표적화된 방식 또는 무작위 도입을 통해 항체 라이브러리의 CDR 또는 전체 V 유전자에 도입될 수 있다. 전자의 접근법은 고수준 또는 저수준의 돌연변이유발을 통해 항체의 모든 CDR을 순차적으로 표적으로 삼거나, 실험적 기초 또는 구조적 이유로 친화도에 영향을 미치는 것으로 의심되는 잔기 또는 체세포 과돌연변이의 단리된 핫 스폿(예를 들어, 문헌[Ho et al., 2005, J. Biol. Chem. 280:607-17] 참조)을 표적으로 하는 것을 포함한다. 특정 실시형태에서, 체세포 과돌연변이는, 예를 들어 SHM-XELTM 플랫폼(AnaptysBio, 캘리포니아주 샌디에이고 소재)을 사용하여 AID 촉발 체세포 과돌연변이를 통해 수행된다. 무작위 돌연변이는 대장균 돌연변이 균주, DNA 폴리머라아제를 이용한 오류 빈발(error-prone) 복제(예를 들어, 문헌[Hawkins et al., 1992, J. Mol. Biol. 226:889-96] 참조) 또는 RNA 레플리카아제를 사용하여 전체 V 유전자에 걸쳐 도입될 수 있다. 다양성은 또한 DNA 셔플링 또는 유사한 기술(예를 들어, 문헌[Lu et al., 2003, J. Biol. Chem. 278:43496-507]; 미국 특허 제5,565,332호 및 제6,989,250호 참조)을 통해 자연적으로 다양한 영역을 대체하는 방식으로 도입될 수 있다. 프레임워크 영역 잔기로 연장되는 과가변 루프를 표적으로 하는 대안적인 기술(예를 들어, 문헌[Bond et al., 2005, J. Mol. Biol. 348:699-709] 참조)은 CDR에서의 루프 결실 및 삽입을 이용하거나, 혼성화 기반 다양화(예를 들어, 미국 특허출원공개 제2004/0005709호 참조)를 사용한다. CDR에 다양성을 생성하는 추가의 방법은, 예를 들어 미국 특허 제7,985,840호에 개시되어 있다. 항체 라이브러리 및/또는 항체 친화도 성숙을 생성하는 데 사용될 수 있는 추가 방법은, 예를 들어 미국 특허 제8,685,897호 및 제8,603,930호, 및 미국 특허출원공개 2014/0170705호, 2014/0094392호, 2012/0028301호, 2011/0183855호 및 2009/0075378호에 개시되어 있으며, 상기 문헌들은 각각 본원에 참조로 인용된다.
라이브러리의 스크리닝은 당업계에 알려진 다양한 기술에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 표적 항원(예컨대, IL-2 또는 FAP 폴리펩타이드)은 고체 지지체, 컬럼, 핀, 또는 셀룰로오스/폴리(비닐리덴 플루오라이드) 막/다른 필터 상에 고정되거나, 흡착 플레이트에 부착된 숙주세포에서 발현되거나, 세포 분류에 사용되거나, 스트렙타비딘 코팅된 비드를 이용한 포획을 위해 비오틴에 접합되거나, 또는 디스플레이 라이브러리를 패닝하는 임의의 다른 방법에 사용될 수 있다.
시험관내 친화도 성숙 방법에 대한 검토를 위해서는, 예를 들어 문헌[Hoogenboom, 2005, Nature Biotechnology 23:1105-16]; 문헌[Quiroz and Sinclair, 2010, Revista Ingeneria Biomedia 4:39-51]; 및 상기 문헌들에 기재된 참고문헌을 참조한다.
5.3.3.2 항체의 변형
본 개시내용의 면역접합체 분자의 일부를 형성하는 항체의 공유결합 변형은 본 개시내용의 범위에 포함된다. 공유결합 변형은 항체의 표적화된 아미노산 잔기를, 항체의 선택된 측쇄, 또는 N-말단 또는 C-말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 반응시키는 것을 포함한다. 다른 변형에는, 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기의, 각각, 상응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로의 탈아미드화, 프롤린 및 리신의 히드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 히드록실기의 인산화, 리신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 α-아미노기의 메틸화(예를 들어, 문헌[Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties 79-86 (1983)] 참조), N-말단 아민의 아세틸화, 및 임의의 C-말단 카르복시기의 아미드화가 포함된다.
본 발명의 개시내용의 범위에 포함되는 항체의 다른 유형의 공유결합 변형에는, 항체 또는 폴리펩타이드의 천연 글리코실화 패턴을 변경하는 것(예를 들어, 문헌[Beck et al., 2008, Curr. Pharm. Biotechnol. 9:482-501]; 및 문헌[Walsh, 2010, Drug Discov. Today 15:773-80] 참조)과, 항체를 다양한 비단백질성 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌 중 하나에 연결하는 것(예를 들어 미국 특허 제4,640,835호; 제4,496,689호; 제4,301,144호; 제4,670,417호; 제4,791,192호; 또는 제4,179,337호에 제시된 방식으로)이 포함된다.
본 개시내용의 면역접합체 분자의 일부를 형성하는 항체는 또한, 또 다른 이종 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열, 예를 들어 사이토카인 폴리펩타이드(예를 들어, 문헌[Terpe, 2003, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60:523-33] 참조) 또는 IgG 분자의 Fc 영역(예를 들어, 문헌[Aruffo, Antibody Fusion Proteins 221-42 (Chamow and Ashkenazi eds., 1999)] 참조)에 융합된 항체를 포함하는 키메라 분자를 형성하도록 변형될 수 있다.
표적 항원에 결합하는 본원에 제공된 항체와 이종 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질이 또한 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 항체는, 세포 표면 발현 표적 항원을 갖는 세포에 항체가 융합된 이종 폴리펩타이드를 전달하고/하거나 고정시키는 데 유용하다.
표적 항원(예를 들어, IL-2 또는 FAP)에 결합하는 항체의 패널이 또한 본원에 제공된다. 특정 실시형태에서, 항체의 패널은 상이한 회합 속도, 상이한 해리 속도, 표적 항원에 대한 상이한 친화도 및/또는 표적 항원에 대한 상이한 특이성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 패널은 약 10개, 약 25개, 약 50개, 약 75개, 약 100개, 약 125개, 약 150개, 약 175개, 약 200개, 약 250개, 약 300개, 약 350개, 약 400개, 약 450개, 약 500개, 약 550개, 약 600개, 약 650개, 약 700개, 약 750개, 약 800개, 약 850개, 약 900개, 약 950개 또는 약 1000개 이상의 항체를 포함하거나 이로 이루어져 있다. 항체 패널은 ELISA와 같은 검정을 위해, 예를 들어 96웰 또는 384웰 플레이트에 사용될 수 있다.
5.3.4 항체와 면역접합체 분자의 제조
본 발명의 면역접합체 분자의 일부를 형성하는 항체 및 다른 펩티드 구성요소(예를 들어, 사이토카인 폴리펩타이드)는 인코딩 핵산을 함유하는 벡터로 형질전환되거나 트랜스펙션된 세포를 배양하는 방식으로 생산될 수 있다. 본 개시내용의 항체의 폴리펩타이드 구성요소를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 표준 재조합 기술을 사용하여 얻을 수 있다. 하이브리도마 세포와 같은 항체 생산 세포에서 목적하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 단리하고 시퀀싱할 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 합성기 또는 PCR 기술을 사용하여 합성할 수 있다. 수득 후, 폴리펩타이드를 인코딩하는 서열은 숙주세포에서 이종 폴리뉴클레오타이드를 복제하고 발현시킬 수 있는 재조합 벡터에 삽입된다. 당업계에 알려진 이용 가능한 다수의 벡터가 본 개시내용의 목적을 위해 사용될 수 있다. 적절한 벡터의 선택은 주로 벡터에 삽입되는 핵산의 크기와 벡터로 형질전환되는 특정 숙주세포에 따라 달라진다. 본 개시내용의 항체를 발현시키는 데 적합한 숙주세포에는, 고세균(Archaebacteria) 및 진정세균(Eubacteria)(그람 음성 또는 그람 양성 유기체 포함)과 같은 원핵생물, 사상성 진균 또는 효모와 같은 진핵 미생물, 곤충 또는 식물 세포와 같은 무척추동물 세포, 및 포유류 숙주 세포주와 같은 척추동물 세포가 포함된다. 숙주세포를 상기 기재된 발현 벡터로 형질전환시키고, 프로모터의 유도, 형질전환체의 선택, 또는 목적하는 서열을 인코딩하는 유전자의 증폭을 위해 적절하게 변형된 통상의 영양 배지에서 배양한다. 숙주세포에 의해 생산된 항체를 당업계에 알려진 바와 같은 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 정제한다.
벡터 작제, 발현 및 정제를 포함하는 항체 생산 방법은, 문헌[Pluckthun et al., Antibody Engineering: Producing antibodies in Escherichia coli: From PCR to fermentation 203-52 (McCafferty et al. eds., 1996)]; 문헌[Kwong and Rader, E. coli Expression and Purification of Fab Antibody Fragments, in Current Protocols in Protein Science (2009)]; 문헌[Tachibana and Takekoshi, Production of Antibody Fab Fragments in Escherischia coli, in Antibody Expression and Production (Al-Rubeai ed., 2011)]; 및 문헌[Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic (An ed., 2009)]에 추가로 설명되어 있다.
물론, 당업계에 널리 알려진 대안적인 방법을 이용하여 항체를 제조할 수 있다는 것이 고려된다. 예를 들어, 적절한 아미노산 서열 또는 이의 일부는, 고체상 기술을 사용하여 직접 펩타이드 합성을 통해 생산될 수 있다(예를 들어, 문헌[Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis (1969)]; 및 문헌[Merrifield, 1963, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-54] 참조). 시험관내 단백질 합성은 수동 기술을 사용하거나 자동화를 통해 수행될 수 있다. 항체의 다양한 부분을 별도로 화학적으로 합성하고, 화학적 또는 효소적 방법을 사용하여 조합하는 방식으로 목적하는 항체를 생산할 수 있다. 대안적으로, 항체는, 예를 들어 미국 특허 제5,545,807호 및 제5,827,690호에 개시된 바와 같이, 항체를 발현하도록 조작된 유전자이식 동물의 세포 또는 체액(예컨대, 젖)에서 정제될 수 있다.
융합 단백질은, 예를 들어 유전자 셔플링, 모티프 셔플링, 엑손 셔플링 및/또는 코돈 셔플링("DNA 셔플링"으로 총칭됨)의 기술의 통해 생성될 수 있다. DNA 셔플링은, 예를 들어 친화도가 더 높고 해리 속도가 더 낮은 항체를 포함하여 본원에 제공된 바와 같은 항체의 활성을 변경시키는 데 이용될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,605,793호; 제5,811,238호; 제5,830,721호; 제5,834,252호; 및 제5,837,458호; 문헌[Patten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33]; 문헌[Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16(2):76-82]; 문헌[Hansson et al., 1999, J. Mol. Biol. 287:265-76]; 및 문헌[Lorenzo and Blasco, 1998, Biotechniques 24(2):308-13] 참조). 항체 또는 인코딩된 항체는 오류 빈발 PCR, 무작위 뉴클레오타이드 삽입, 또는 재조합 전 다른 방법에 의한 무작위 돌연변이유발에 적용되어 변경될 수 있다. 본원에 제공된 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 이종 분자의 하나 이상의 구성요소, 모티프, 삽입물, 부분, 도메인, 단편 등과 재조합될 수 있다.
모이어티(폴리펩타이드 포함)를 항체에 융합하거나 접합시키는 방법은 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Arnon et al., Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy 243-56 (Reisfeld et al. eds., 1985)]; 문헌[Hellstrom et al., Antibodies for Drug Delivery, in Controlled Drug Delivery 623-53 (Robinson et al. eds., 2d ed. 1987)]; 문헌[Thorpe, Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy: A Review, in Monoclonal Antibodies: Biological and Clinical Applications 475-506 (Pinchera et al. eds., 1985)]; 문헌[Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy, in Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy 303-16 (Baldwin et al. eds., 1985)]; 문헌[Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58]; 미국 특허 제5,336,603호; 제5,622,929호; 제5,359,046호; 제5,349,053호; 제5,447,851호; 제5,723,125호; 제5,783,181호; 제5,908,626호; 제5,844,095호; 및 제5,112,946호; EP 307,434; EP 367,166; EP 394,827; PCT 국제공개 WO 91/06570호, WO 96/04388호, WO 96/22024호, WO 97/34631호 및 WO 99/04813호; 문헌[Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 10535-39]; 문헌[Traunecker et al., 1988, Nature, 331:84-86]; 문헌[Zheng et al., 1995, J. Immunol. 154:5590-600]; 및 문헌[Vil et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337-41] 참조).
융합 단백질은, 예를 들어 유전자 셔플링, 모티프 셔플링, 엑손 셔플링 및/또는 코돈 셔플링("DNA 셔플링"으로 총칭됨)의 기술의 통해 생성될 수 있다. DNA 셔플링은, 예를 들어 친화도가 더 높고 해리 속도가 더 낮은 항체를 포함하여 본원에 제공된 바와 같은 항체의 활성을 변경시키는 데 이용될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,605,793호; 제5,811,238호; 제5,830,721호; 제5,834,252호; 및 제5,837,458호; 문헌[Patten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33]; 문헌[Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16(2):76-82]; 문헌[Hansson et al., 1999, J. Mol. Biol. 287:265-76]; 및 문헌[Lorenzo and Blasco, 1998, Biotechniques 24(2):308-13] 참조). 항체 또는 인코딩된 항체는 오류 빈발 PCR, 무작위 뉴클레오타이드 삽입, 또는 재조합 전 다른 방법에 의한 무작위 돌연변이유발에 적용되어 변경될 수 있다. 본원에 제공된 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 이종 분자의 하나 이상의 구성요소, 모티프, 삽입물, 부분, 도메인, 단편 등과 재조합될 수 있다.
항체와 작용제의 접합체는 BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 설포-EMCS, 설포-GMBS, 설포-KMUS, 설포-MBS, 설포-SIAB, 설포-SMCC, 설포-SMPB 및 SVSB(석신이미딜-(4-비닐설폰)벤조에이트)와 같은 다양한 이관능성 단백질 커플링제를 사용하여 생성될 수 있다. 본 개시내용은, 항체와 작용제의 접합체가 당업계에 개시된 바와 같은(예를 들어, 문헌[Bioconjugate Techniques (Hermanson ed., 2d ed. 2008)] 참조) 임의의 적합한 방법을 사용하여 제조될 수 있다는 것을 추가로 고려한다.
항체와 작용제에 대한 통상의 접합 전략은 Lys 잔기의 ε-아미노기 또는 Cys 잔기의 티올기를 포함하는 무작위 접합 화학을 기반으로 하여 이종 접합체를 생성해왔다. 최근 개발된 기술은 항체에 부위 특이적 접합을 가능하게 하여 균일한 로딩을 유도하고, 항원 결합 또는 약동학이 변경된 접합체 하위집단을 회피할 수 있게 한다. 이에는, 반응성 티올기를 제공하고, 면역글로불린 폴딩 및 어셈블리를 방해하거나 항원 결합을 변경시키지 않는 중쇄와 경쇄 상의 위치에 시스테인 치환을 포함하는 "티오맙(thiomab)"의 조작이 포함된다(예를 들어, 문헌[Junutula et al., 2008, J. Immunol. Meth. 332: 41-52]; 및 문헌[Junutula et al., 2008, Nature Biotechnol. 26:925-32] 참조). 또 다른 방법에서는, 정지 코돈 UGA를 종결에서 셀레노시스테인 삽입까지 다시 코딩하는 방식으로 셀레노시스테인을 항체 서열에 동시번역으로 삽입하여, 다른 천연 아미노산의 존재 하에서 셀레노시스테인의 친핵성 셀레노기에 부위 특이적 공유결합 접합을 가능하게 한다(예를 들어, 문헌[Hofer et al., 2008, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:12451-56]; 및 문헌[Hofer et al., 2009, Biochemistry 48(50):12047-57] 참조).
5.4 면역접합체 분자와 조성물의 사용 방법
본 개시내용을 통해 이해할 수 있는 바와 같이, 본 개시내용에 따른 면역접합체 분자는 대상의 관심 표적 부위에 사이토카인을 전달 및/또는 활성화시키는 데 사용될 수 있다. 이론에 구애됨 없이, 특정 사이토카인 활성에 대한 전신 노출이 대상에서 독성 부작용을 초래할 수 있는 경우, 본 개시내용의 면역접합체 분자는 대상의 표적 부위 이외의 위치에서 사이토카인 매개 효과의 활성화를 방지하는 방식으로 사이토카인의 독성 또는 다른 부작용을 감소시키는 데 사용될 수 있는 것으로도 고려된다.
따라서, 일 양태에서, 대상에서 사이토카인 분자의 부위 특이적 전달 방법으로서, 사이토카인을 본 개시내용에 따른 면역접합체 분자에 혼입시키고, 면역접합체 분자를 대상에게 전달하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 특히, 특정 실시형태에서, 면역접합체 분자는 사이토카인과, 대상의 표적 부위에 존재하는 표적 항원에 결합할 수 있는 고정 모이어티를 포함하므로, 면역접합체 분자가 표적 부위에 도달했을 때, 고정 모이어티가 표적 항원에 결합하여 면역접합체 분자를 표적 부위에 고정시킨다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 비-표적 부위와 비교하여 대상의 표적 부위에서 투여된 면역접합체 분자의 농도를 더 높게 만든다.
관련 양태에서, 대상에서 사이토카인 활성의 부위 특이적 활성화 방법으로서, 사이토카인을 본 개시내용에 따른 면역접합체 분자에 혼입시키고, 면역접합체 분자를 대상에게 전달하는 단계를 포함하는 방법이 또한 본원에 제공된다. 특히, 특정 실시형태에서, 면역접합체 분자는 사이토카인과, 분자내 상호작용을 통해 사이토카인에 결합하여 사이토카인 활성을 저해하는 차폐 모이어티를 포함한다. 특히, 차폐 모이어티는 또한 표적 부위에 존재하는 표적 항원에 결합할 수 있으므로, 면역접합체 분자가 표적 부위에 도달했을 때, 차폐 모이어티가 표적 항원에 결합하고 사이토카인에서 해리되어 표적 부위에서 사이토카인 활성을 활성화시킨다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 비-표적 부위와 비교하여 대상의 표적 부위에서 더 높은 사이토카인 활성을 생성한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 방법에 사용되는 면역접합체 분자는 차폐 모이어티와 고정 모이어티를 모두 포함한다. 다양한 실시형태에서, 면역접합체 분자의 차폐 모이어티와 고정 모이어티에 의해 인식되는 표적 항원은 동일한 항원이거나 상이한 항원일 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 방법에 사용되는 면역접합체 분자는 사이토카인 모이어티, 차폐 모이어티 및 고정 모이어티 중 하나 이상을 작동 가능하게 연결하는 접합 모이어티를 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 방법에 사용되는 면역접합체 분자는 섹션 5.3에 기재된 바와 같은 임의의 면역접합체 분자일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 접합되지 않은 형태의 사이토카인을 등가량으로 투여하는 방법과 비교하여 대상에 대한 사이토카인 독성을 감소시킨다. 따라서, 관련 양태에서, 대상에 대한 접합되지 않은 형태의 사이토카인의 투여와 관련된 부작용을 감소시키는 방법이 또한 본원에 제공된다. 특정 실시형태에서, 상기 방법은 접합되지 않은 형태의 사이토카인을 투여하는 대신 대상에게 사이토카인을 포함하는 면역접합체 분자를 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시형태에서, 대상은 접합되지 않은 형태의 사이토카인의 투여를 포함하는 진행 중인 사이토카인 치료를 받고 있으며, 상기 방법은 진행 중인 사이토카인 치료를 중단하고 등가량의 사이토카인을 포함하는 면역접합체 분자를 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시형태에서, 부작용은 사이토카인의 독성이다. 특정 실시형태에서, 부작용은 사이토카인으로 치료받은 대상의 체중 변화로 측정된다. 특정 실시형태에서, 부작용은 사이토카인으로 치료받은 대상의 수명 변화로 측정된다. 특정 실시형태에서, 부작용은 사이토카인으로 치료받은 대상에서 면역 반응 수준의 변화로 측정된다. 특정 실시형태에서, 부작용은 사이토카인으로 치료받은 대상에서 염증 반응 수준의 변화로 측정된다.
일부 실시형태에서, 사이토카인은 IL-2이고, 본 발명의 방법에 따른 사이토카인 매개 효과는 대상에서 T세포 활성의 활성화를 포함한다. T세포 활성화의 비제한적인 예는 T세포의 증식 증가이다. 따라서, 특정 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 IL-2 함유 면역접합체 분자를 투여하는 방식으로 대상의 표적 부위에서 T세포 증식 및 활성을 촉진시키는 방법이 또한 본원에 제공된다.
T세포 활성의 또 다른 비제한적인 예는 사이토카인의 분비이다. 따라서, 특정 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 IL-2 함유 면역접합체 분자를 투여하는 방식으로 대상의 표적 부위에서 사이토카인의 분비를 촉진시키는 방법이 또한 본원에 제공된다. 특정 실시형태에서, 사이토카인은 IL-1, IL-2, IL-6, IL-12, IL-17, IL-22, IL-23, GM-CSF, IFN-γ 및 TNF-α로 이루어지는 군에서 선택된다. 일부 실시형태에서, 사이토카인은 IL-2, IL-17, IFN-γ, 또는 이들의 임의의 조합이다. 특정 실시형태에서, 사이토카인은 IL-2이다. 다른 실시형태에서, 사이토카인은 IL-17이다. 또 다른 실시형태에서, 사이토카인은 IFN-γ이다. 특정 실시형태에서, 사이토카인은 IL-2와 IL-17이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인은 IL-2와 IFN-γ이다. 또 다른 실시형태에서, 사이토카인은 IL-17과 IFN-γ이다. 또 다른 실시형태에서, 사이토카인은 IL-2, IL-17 및 IFN-γ이다. 특정 실시형태에서, 사이토카인은 IL-1이다. 다른 실시형태에서, 사이토카인은 IL-6이다. 또 다른 실시형태에서, 사이토카인은 IL-12이다. 또 다른 실시형태에서, 사이토카인은 IL-22이다. 특정 실시형태에서, 사이토카인은 IL-23이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인은 GM-CSF이다. 다른 실시형태에서, 사이토카인은 TNF-α이다. 상기 언급된 사이토카인 중 2개, 3개 또는 그 이상의 다른 조합이 또한 고려된다.
본 발명의 방법에 따른 사이토카인 활성의 전달 및/또는 활성화를 위한 예시적인 표적 부위에는, 비제한적으로, 특정 유형의 조직, 특정 기관, 특정 세포 집단과 같은 세포 환경이 포함된다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법의 표적 부위는 본 발명의 방법에 사용되는 면역접합체 분자에 의해 인식되는 표적 항원의 발현에 기반하여 비-표적 부위와 구별될 수 있다. 특히, 일부 실시형태에서, 표적 항원은 표적 부위에 존재하지만, 비-표적 부위에는 존재하지 않는다. 일부 실시형태에서, 표적 항원은 표적 부위에 존재하지만, 비-표적 부위에는 존재하지 않는 세포에 의해 생산된다. 일부 실시형태에서, 표적 항원은 비-표적 부위에 있는 표적 항원과 비교하여 더 높은 농도 또는 더 많은 양으로 표적 부위에 존재한다. 특정 실시형태에서, 표적 항원은, 면역접합체 분자의 고정 모이어티가 표적 항원에의 결합을 통해 면역접합체 분자를 표적 부위에 고정시킬 수 있게 하는 데 충분한 양으로 표적 부위(비-표적 부위는 아님)에 존재한다. 특정 실시형태에서, 표적 항원은, 면역접합체 분자의 차폐 모이어티가 표적 항원에의 결합을 통해 사이토카인으로부터 해리될 수 있게 하는 데 충분한 양으로 표적 부위(비-표적 부위는 아님)에 존재한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 방법의 표적 부위는 암 세포 집단을 함유한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 방법의 표적 부위는 고형 종양의 종양 미세환경이다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 방법에 사용되는 면역접합체 분자에 의해 인식되는 표적 항원은 종양 관련 항원(TAA)과 같은 암 세포에 의해 발현되는 항원이다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 방법에 사용되는 면역접합체 분자에 의해 인식되는 표적 항원은 간질세포와 같은 종양 미세환경 내 비(non)-암 세포에 의해 발현되는 항원이다.
본 발명의 방법의 특정 실시형태에서, 사이토카인은 IL-2이다. 특정 실시형태에서, 표적 항원은 섬유증 활성화 단백질(FAP)이다. 따라서, 특정 실시형태에서, 본 발명의 방법에 사용되는 면역접합체 분자는 IL-2와 FAP 둘 모두에 결합할 수 있는 투인원 항체를 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 면역접합체 분자의 일부를 형성하는 투인원 항체는 표 1과 표 2에 열거된 바와 같은 VH CDR 서열과 VL CDR 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 면역접합체 분자의 일부를 형성하는 투인원 항체는 표 3과 표 4에 열거된 바와 같은 VH 서열과 VL 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 면역접합체 분자의 고정 모이어티는 FAP에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 특정 실시형태에서, 항-FAP 항체는 표 5와 표 6에 열거된 바와 같은 VH CDR 서열과 VL CDR 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 항-FAP 항체는 표 7과 표 8에 열거된 바와 같은 VH 서열과 VL 서열을 포함한다.
일 양태에서, IL-2R을 활성화시키는 방법으로서, 본원에 제공된 바와 같은 IL-2 폴리펩타이드를 포함하는 면역접합체 분자의 유효량을 IL-2R과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, IL-2R은 IL-2Rβ를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2R은 IL-2Rα를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2R은 IL-2Rγ를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2R은 IL-2Rα 및 IL-2Rβ를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2R은 IL-2Rα 및 IL-2Rγ를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2R은 IL-2Rβ 및 IL-2Rγ를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2R은 IL-2Rα, IL-2Rβ 및 IL-2Rγ를 포함한다.
일부 실시형태에서, 활성화 가능한 IL-2R을 형성하는 하나 이상의 서브유닛은 동일한 세포 표면에서 발현된다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 IL-2R을 형성하는 하나 이상의 서브유닛은 상이한 세포 표면에서 발현된다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 IL-2R을 형성하는 하나 이상의 서브유닛은 가용성이다.
특정 실시형태에서, 활성화 가능한 IL-2R은 IL-2Rβ를 포함하며, 여기서 IL-2Rβ는 제1 세포의 표면에서 발현된다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 IL-2R은 IL-2Rγ를 추가로 포함하며, 여기서 IL-2Rγ는 제1 세포의 표면에서 발현된다.
일부 실시형태에서, 활성화 가능한 IL-2R은 IL-2Rα를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2Rα는 세포 표면에 회합되어 있다. 일부 실시형태에서, IL-2Rα는 제1 세포의 표면에 회합되어 있다(시스-제시). 일부 실시형태에서, IL-2Rα는 제2 세포의 표면에 회합되어 있다(트랜스-제시). 일부 실시형태에서, IL-2Rα는 세포 표면에 회합되어 있지 않다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 IL-2R은 IL-2Rα를 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, 활성화 가능한 IL-2R의 서브유닛(들)을 발현하는 제1 세포 및/또는 제2 세포는 면역세포이다. 일부 실시형태에서, IL-2R의 활성화 시, 면역세포가 활성화된다. 일부 실시형태에서, 면역세포의 활성화는 면역세포의 증식 또는 성숙의 증가로 측정된다. 일부 실시형태에서, 표적세포의 증식 또는 성숙은 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 100%, 약 125%, 약 150%, 약 175%, 약 200%, 약 250%, 약 300%, 약 400%, 약 500%, 약 600%, 약 700%, 약 800%, 약 900% 또는 약 1000% 만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, 면역세포의 활성화는 면역세포의 생존 기간 연장으로 측정된다. 일부 실시형태에서, 표적세포의 생존 기간은 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 100%, 약 125%, 약 150%, 약 175%, 약 200%, 약 250%, 약 300%, 약 400%, 약 500%, 약 600%, 약 700%, 약 800%, 약 900% 또는 약 1000% 만큼 증가된다.
일부 실시형태에서, 면역세포는 이펙터 T세포, 기억 T세포, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 면역세포는 CD4+ T세포, CD8+ T세포, 헬퍼 T세포, 세포독성 T세포, SLEC(단기 이펙터 세포), MPEC(기억 전구 이펙터 세포), TE(말단 이펙터 세포), NK(자연살해세포), NKT(자연살해 T세포), 선천성 림프구 세포(I형 내지 III형), 또는 이들의 조합이다.
일부 실시형태에서, 면역세포는 조절 T세포(Treg)이다. 일부 실시형태에서, 면역세포는 천연 Treg(nTreg) 세포, 유도된 Treg(iTreg) 세포, 또는 이들의 조합이다.
일부 실시형태에서, 활성화 가능한 IL-2R의 서브유닛(들)을 발현하는 제1 세포 및/또는 제2 세포는 병든 세포이다. 일부 실시형태에서, IL-2R의 활성화 시, 병든 세포가 사멸한다. 일부 실시형태에서, 병든 세포는 암 세포이다. 일부 실시형태에서, 병든 세포는 감염성 병원체에 의해 감염된 세포이다. 일부 실시형태에서, 감염성 병원체는 바이러스, 박테리아, 진균, 기생충, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 감염성 병원체는 바이러스이다. 일부 실시형태에서, 감염성 병원체는 박테리아이다. 일부 실시형태에서, 감염성 병원체는 진균이다. 일부 실시형태에서, 감염성 병원체는 기생충이다.
일 양태에서, IL-2R을 발현하는 표적세포를 활성화시키는 방법으로서, 본원에 기재된 바와 같은 IL-2 폴리펩타이드를 포함하는 면역접합체 분자의 유효량을 표적세포와 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 IL-2 폴리펩타이드와 IL-2R의 결합 시, 표적세포가 활성화되는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 표적세포는 면역세포이다. 일부 실시형태에서, 표적세포는 이펙터 T세포, 기억 T세포, 조절 T세포, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 표적세포는 이펙터 T세포이다. 일부 실시형태에서, 표적세포는 기억 T세포이다. 일부 실시형태에서, 표적세포는 조절 T세포이다.
일부 실시형태에서, 표적세포는 CD4+ T세포, CD8+ T세포, 헬퍼 T세포, 세포독성 T세포, SLEC(단기 이펙터 세포), MPEC(기억 전구 이펙터 세포), TE(말단 이펙터 세포), NK(자연살해세포), NKT(자연살해 T세포), 선천성 림프구 세포(I형 내지 III형), 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 표적세포는 CD4+ T세포이다. 일부 실시형태에서, 표적세포는 CD8+ T세포이다. 일부 실시형태에서, 표적세포는 헬퍼 T세포이다. 일부 실시형태에서, 표적세포는 세포독성 T세포이다. 일부 실시형태에서, 표적세포는 SLEC(단기 이펙터 세포)이다. 일부 실시형태에서, 표적세포는 MPEC(기억 전구 이펙터 세포)이다. 일부 실시형태에서, 표적세포는 TE(말단 이펙터 세포)이다. 일부 실시형태에서, 표적세포는 NK(자연살해세포)이다. 일부 실시형태에서, 표적세포는 NKT(자연살해 T세포)이다. 일부 실시형태에서, 표적세포는 선천성 림프구 세포(I형 내지 III형)이다.
일부 실시형태에서, 표적세포는 천연 Treg(nTreg) 세포, 유도된 Treg(iTreg) 세포, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 표적세포는 천연 Treg(nTreg) 세포이다. 일부 실시형태에서, 표적세포는 유도된 Treg(iTreg) 세포이다.
일부 실시형태에서, 표적세포의 활성화는 표적세포의 증식 또는 성숙의 증가로 측정된다. 일부 실시형태에서, 표적세포의 증식 또는 성숙은 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 100%, 약 125%, 약 150%, 약 175%, 약 200%, 약 250%, 약 300%, 약 400%, 약 500%, 약 600%, 약 700%, 약 800%, 약 900% 또는 약 1000% 만큼 증가된다.
일부 실시형태에서, 표적세포의 활성화는 표적세포의 생존 기간 연장으로 측정된다. 일부 실시형태에서, 표적세포의 생존 기간은 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 100%, 약 125%, 약 150%, 약 175%, 약 200%, 약 250%, 약 300%, 약 400%, 약 500%, 약 600%, 약 700%, 약 800%, 약 900% 또는 약 1000% 만큼 증가된다.
일부 실시형태에서, 상기 접촉시키는 단계는 약학적으로 허용 가능한 담체와, 본원에 기재된 바와 같은 IL-2 폴리펩타이드를 포함하는 면역접합체 분자를 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 접촉시키는 단계는 항신생물성 면역 반응을 증강시킨다. 일부 실시형태에서, 상기 접촉시키는 단계는 항감염 면역 반응을 증강시킨다.
일 양태에서, T세포 집단의 항원 특이적 면역 반응을 증강시키는 방법으로서, 본원에 기재된 바와 같은 IL-2 폴리펩타이드를 포함하는 면역접합체 분자의 유효량을 T세포 집단과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 상기 접촉시키는 단계는 항원 특이적 이펙터 T세포의 증식 또는 성숙을 증강시킨다. 일부 실시형태에서, 상기 접촉시키는 단계는 항원 특이적 기억 T세포의 형성을 증강시킨다. 일부 실시형태에서, 상기 접촉시키는 단계는 항원의 존재 하에서 수행된다. 일부 실시형태에서, 항원은 암, 종양, 병원체 또는 알레르겐의 항원이다.
일 양태에서, T세포 집단에 의한 전염증성 사이토카인의 분비를 증가시키는 방법으로서, 본원에 기재된 바와 같은 IL-2 폴리펩타이드를 포함하는 면역접합체 분자를 T세포 집단과 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 상기 IL-2 폴리펩타이드는 결합 시 T세포를 활성화시키는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 사이토카인은 IL-1, IL-2, IL-6, IL-12, IL-17, IL-22, IL-23, GM-CSF, TNF-α, IFN-γ, 또는 이들의 임의의 조합이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인은 IL-1이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인은 IL-2이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인은 IL-6이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인은 IL-12이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인은 IL-17이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인은 IL-22이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인은 IL-23이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인은 GM-CSF이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인은 TNF-α이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인은 IFN-γ이다.
일부 실시형태에서, 사이토카인 생산은 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 100%, 약 125%, 약 150%, 약 175%, 약 200%, 약 250%, 약 300%, 약 400%, 약 500%, 약 600%, 약 700%, 약 800%, 약 900% 또는 약 1000% 만큼 증가된다.
일 양태에서, 표적세포의 표면에 IL-2R의 어셈블리를 증가시키는 방법으로서, 본원에 기재된 바와 같은 IL-2 폴리펩타이드를 포함하는 면역접합체 분자의 유효량을 표적세포와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, IL-2R은 표적세포의 표면에 IL-2Rα, IL-2Rβ, IL-2Rγ, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2R은 표적세포의 표면에 IL-2Rα를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2R은 표적세포의 표면에 IL-2Rβ를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2R은 표적세포의 표면에 IL-2Rγ를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2R은 표적세포의 표면에 IL-2Rα 및 IL-2Rβ를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2R은 표적세포의 표면에 IL-2Rα 및 IL-2Rγ를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2R은 표적세포의 표면에 IL-2Rβ 및 IL-2Rγ를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2R은 표적세포의 표면에 IL-2Rα, IL-2Rβ 및 IL-2Rγ를 포함한다.
일부 실시형태에서, IL-2R은 표적세포의 표면에 IL-2Rβ 및 IL-2Rγ를 포함하고, 표적세포에 근접한 제2 세포의 표면에 IL-2Rα를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2R은 표적세포의 표면에 IL-2Rβ 및 IL-2Rγ를 포함하고, IL-2Rα는 세포 표면에 회합되어 있지 않다.
일부 실시형태에서, 표적세포의 표면 상의 IL-2R의 어셈블리는 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 100%, 약 125%, 약 150%, 약 175%, 약 200%, 약 250%, 약 300%, 약 400%, 약 500%, 약 600%, 약 700%, 약 800%, 약 900% 또는 약 1000% 만큼 증가된다.
일부 실시형태에서, 표적세포는 면역세포이다. 일부 실시형태에서, 표적세포는 이펙터 T세포, 기억 T세포, 조절 T세포, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 표적세포는 이펙터 T세포이다. 일부 실시형태에서, 표적세포는 기억 T세포이다. 일부 실시형태에서, 표적세포는 조절 T세포이다.
일부 실시형태에서, 표적세포는 CD4+ T세포, CD8+ T세포, 헬퍼 T세포, 세포독성 T세포, SLEC(단기 이펙터 세포), MPEC(기억 전구 이펙터 세포), TE(말단 이펙터 세포), NK(자연살해세포), NKT(자연살해 T세포), 선천성 림프구 세포(I형 내지 III형), 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 표적세포는 CD4+ T세포이다. 일부 실시형태에서, 표적세포는 CD8+ T세포이다. 일부 실시형태에서, 표적세포는 헬퍼 T세포이다. 일부 실시형태에서, 표적세포는 세포독성 T세포이다. 일부 실시형태에서, 표적세포는 SLEC(단기 이펙터 세포)이다. 일부 실시형태에서, 표적세포는 MPEC(기억 전구 이펙터 세포)이다. 일부 실시형태에서, 표적세포는 TE(말단 이펙터 세포)이다. 일부 실시형태에서, 표적세포는 NK(자연살해세포)이다. 일부 실시형태에서, 표적세포는 NKT(자연살해 T세포)이다. 일부 실시형태에서, 표적세포는 선천성 림프구 세포(I형 내지 III형)이다.
일부 실시형태에서, 표적세포는 천연 Treg(nTreg) 세포, 유도된 Treg(iTreg) 세포, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 표적세포는 천연 Treg(nTreg) 세포이다. 일부 실시형태에서, 표적세포는 유도된 Treg(iTreg) 세포이다.
일 양태에서, 병든 세포 집단을 둘러싸는 조직에 전염증성 환경을 형성하는 방법으로서, 본원에 기재된 바와 같은 IL-2 폴리펩타이드를 포함하는 면역접합체 분자의 유효량을 조직과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다.
일부 실시형태에서, 조직 내 활성화된 B세포, CD4+ 이펙터 T세포, CD8+ 이펙터 T세포, 수지상세포, 대식세포, 자연살해세포, 단핵구, 과립구, 호산구 및/또는 호중구의 농도가 증가된다. 일부 실시형태에서, 조직 내 활성화된 B세포의 농도가 증가된다. 일부 실시형태에서, 조직 내 CD4+ 이펙터 T세포의 농도가 증가된다. 일부 실시형태에서, 조직 내 활성화된 B세포의 농도가 증가된다. 일부 실시형태에서, 조직 내 CD8+ 이펙터 T세포의 농도가 증가된다. 일부 실시형태에서, 조직 내 수지상세포의 농도가 증가된다. 일부 실시형태에서, 조직 내 대식세포의 농도가 증가된다. 일부 실시형태에서, 조직 내 자연살해세포의 농도가 증가된다. 일부 실시형태에서, 조직 내 단핵구의 농도가 증가된다. 일부 실시형태에서, 조직 내 과립구의 농도가 증가된다. 일부 실시형태에서, 조직 내 호산구의 농도가 증가된다. 일부 실시형태에서, 조직 내 호중구의 농도가 증가된다. 일부 실시형태에서, 조직 내 조절 T세포의 농도가 감소된다.
일부 실시형태에서, 전염증성 사이토카인의 농도가 조직에서 증가된다. 일부 실시형태에서, 전염증성 사이토카인은 IL-1, IL-2, IL-6, IL-12, IL-17, IL-22, IL-23, GM-CSF, TNF-α, IFN-γ, 또는 이들의 임의의 조합이다. 일부 실시형태에서, 병든 세포에서 유래하거나 유도된 항원에 결합하는 항체의 농도가 조직에서 증가된다. 일부 실시형태에서, 항원제시세포에 의한 병든 세포에서 유래하거나 유도된 항원의 제시가 조직에서 증가된다. 일부 실시형태에서, 병든 세포의 포식작용이 조직에서 증가된다. 일부 실시형태에서, 세포 매개 세포독성에 의해 유도된 병든 세포의 세포자멸사가 조직에서 증가된다. 일부 실시형태에서, 항체 의존성 세포독성에 의해 유도된 병든 세포의 세포자멸사가 조직에서 증가된다. 일부 실시형태에서, 병든 세포 집단이 조직에서 감소된다. 일부 실시형태에서, 병든 세포 집단이 조직에서 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99% 만큼 감소된다. 일부 실시형태에서, 병든 세포 집단이 조직에서 약 0.5% 내지 10%, 약 10% 내지 20%, 약 20% 내지 30%, 약 30% 내지 40%, 약 40% 내지 45%, 약 45% 내지 50%, 약 50% 내지 55%, 약 55% 내지 60%, 약 60% 내지 65%, 약 65% 내지 70%, 약 70% 내지 75%, 약 75% 내지 80%, 약 80% 내지 85%, 약 85% 내지 90%, 약 90% 내지 95% 또는 약 95% 내지 99% 만큼 감소된다.
일 양태에서, 대상에서 병든 세포를 제거하는 방법으로서, 본원에 기재된 바와 같은 IL-2 폴리펩타이드를 포함하는 면역접합체 분자의 유효량을 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 병든 세포는 암 세포이다. 일부 실시형태에서, 병든 세포는 감염성 병원체에 의해 감염된 세포이다. 일부 실시형태에서, 감염성 병원체는 바이러스, 박테리아, 진균, 기생충, 또는 이들의 조합이다.
일 양태에서, 암 치료를 필요로 하는 대상에서 암을 치료하는 방법으로서, 본원에 기재된 바와 같은 IL-2 폴리펩타이드를 포함하는 면역접합체 분자의 유효량을 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 상기 치료는 선천성, 체액성 또는 세포 매개 항신생물성 면역 반응을 증강시킨다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 제2 요법의 병용투여를 추가로 포함한다.
일 양태에서, 감염의 치료를 필요로 하는 대상에서 감염을 치료하는 방법으로서, 본원에 기재된 바와 같은 IL-2 폴리펩타이드를 포함하는 면역접합체 분자의 유효량을 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 상기 치료는 선천성, 체액성 또는 세포 매개 항감염성 면역 반응을 증강시킨다. 일부 실시형태에서, 대상에서 감염을 예방하기 위한 백신 조성물이 대상에게 병용투여된다. 일부 실시형태에서, 백신 조성물은 동시에 또는 순차적으로 병용투여된다.
일 양태에서, 항원에 대한 반응 증가를 필요로 하는 대상에서 항원에 대한 반응을 증가시키는 방법으로서, 본원에 기재된 바와 같은 IL-2 폴리펩타이드를 포함하는 면역접합체 분자의 유효량을 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 항원은 암, 종양, 병원체 또는 알레르겐의 항원이다. 일부 실시형태에서, 항원은 감염성 병원체에서 유래하거나 유도된다. 일부 실시형태에서, 감염성 병원체는 바이러스, 박테리아, 진균, 기생충, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 항원은 병든 세포에서 유래하거나 유도된다. 일부 실시형태에서, 항원은 감염성 병원체에 의해 감염된 세포에서 유래하거나 유도된다. 일부 실시형태에서, 감염성 병원체는 바이러스, 박테리아, 진균, 기생충, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 항원은 암 세포에서 유래하거나 유도된다.
일 양태에서, 백신에 대한 반응 증가를 필요로 하는 대상에서 백신에 대한 반응을 증가시키는 방법으로서, 본원에 기재된 바와 같은 IL-2 폴리펩타이드를 포함하는 면역접합체 분자의 유효량과 백신을 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 백신은 종양, 암, 병원체 또는 알레르겐에 대한 백신이다. 일부 실시형태에서, 면역접합체 분자는 백신용 아쥬반트 조성물로 제형화된다.
상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 본 발명의 면역접합체 분자는 고형 종양 암을 치료하는 데 사용된다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 면역접합체 분자는 혈액암을 치료하는 데 사용된다. 다른 실시형태에서, 질환 또는 장애는 자가면역 질환과 염증성 질환이다. 다른 실시형태에서, 질환 또는 장애는 감염성 질환이다.
상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 질환 또는 장애는 비정상 세포 성장 및/또는 조절이상 세포자멸사의 질환이다. 이러한 질환의 예에는, 비제한적으로, 암, 중피종, 방광암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 난소암, 유방암, 자궁암, 나팔관 암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 골암, 결장암, 직장암, 항문부위의 암, 위암, 위장관(위, 대장 및/또는 십이지장) 암, 만성 림프구성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 고환암, 간세포(간 및/또는 담도) 암, 원발성 또는 속발성 중추신경계 종양, 원발성 또는 속발성 뇌 종양, 호지킨병, 만성 또는 급성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 림프구성 림프종, 림프모구성 백혈병, 소포성 림프종, T세포 또는 B세포 기원의 림프성 악성종양, 흑색종, 다발성 골수종, 구강암, 비소세포폐암, 전립선암, 소세포폐암, 신장 및/또는 요관의 암, 신세포 암종, 신우 암종, 중추신경계 신생물, 원발성 중추신경계 림프종, 비호지킨 림프종, 척수축 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종, 부신피질암, 담낭암, 비장암, 담관암종, 섬유육종, 신경모세포종, 망막모세포종 또는 이들의 조합이 포함된다.
상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 질환 또는 장애는 방광암, 뇌암, 유방암, 골수암, 자궁경부암, 만성 림프구성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 대장암, 식도암, 간세포암, 림프모구성 백혈병, 소포성 림프종, T세포 또는 B세포 기원의 림프성 악성종양, 흑색종, 골수성 백혈병, 골수종, 구강암, 난소암, 비소세포폐암, 전립선암, 소세포폐암 및 비장암으로 이루어지는 군에서 선택된다.
상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 질환 또는 장애는 백혈병, 림프종 또는 골수종과 같은 혈액암이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 암은 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종(NHL), 피부 B세포 림프종, 활성화 B세포 림프종, 미만성 거대 B세포 림프종(DLBCL), 외투세포 림프종(MCL), 소포 중심 림프종, 형질전환된 림프종, 중간 분화 림프구성 림프종, 중간 림프구성 림프종(ILL), 미만성 저분화 림프구성 림프종(PDL), 중심세포 림프종, 미만성 소형 균열세포 림프종(DSCCL), 말초 T세포 림프종(PTCL), 피부 T세포 림프종, 변연부 림프종, 저등급 소포성 림프종, 다발성 골수종(MM), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 미만성 거대 B세포 림프종(DLBCL), 골수형성이상 증후군(MDS), 급성 T세포 백혈병, 급성 골수성 백혈병(AML), 급성 전골수구성 백혈병, 급성 골수모구성 백혈병, 급성 거대모구성 백혈병, 전구체 B 급성 림프모구성 백혈병, 전구체 T 급성 림프모구성 백혈병, 버킷 백혈병(버킷 림프종), 급성 이중표현형 백혈병, 만성 골수성 림프종, 만성 골수성 백혈병(CML) 및 만성 단핵구성 백혈병으로 이루어지는 군에서 선택된다. 특정 실시형태에서, 질환 또는 장애는 골수형성이상 증후군(MDS)이다. 또 다른 특정 실시형태에서, 질환 또는 장애는 급성 골수성 백혈병(AML)이다. 또 다른 특정 실시형태에서, 질환 또는 장애는 만성 림프구성 백혈병(CLL)이다. 또 다른 특정 실시형태에서, 질환 또는 장애는 다발성 골수종(MM)이다.
다른 실시형태에서, 질환 또는 장애는 고형 종양 암이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 고형 종양 암은 암종, 선암종, 부신피질 암종, 결장 선암종, 대장 선암종, 대장 암종, 도관세포 암종, 폐 암종, 갑상선 암종, 비인두 암종, 흑색종, 비흑색종 피부 암종, 간암 및 폐암으로 이루어지는 군에서 선택된다.
상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 일부 암은 부신암이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 일부 암은 항문암이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 일부 암은 충수암이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 일부 암은 담도암이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 일부 암은 방광암이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 일부 암은 골암이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 일부 암은 뇌암이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 일부 암은 유방암이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 일부 암은 자궁경부암이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 일부 암은 대장암이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 일부 암은 식도암이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 일부 암은 담낭암이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 일부 암은 임신 융모성 질환이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 일부 암은 두경부암이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 일부 암은 호지킨 림프종이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 일부 암은 장암이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 일부 암은 신장암이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 일부 암은 백혈병이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 일부 암은 간암이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 일부 암은 폐암이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 일부 암은 흑색종이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 일부 암은 중피종이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 일부 암은 다발성 골수종(MM)이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 일부 암은 신경내분비 종양이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 일부 암은 비호지킨 림프종이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 일부 암은 구강암이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 일부 암은 난소암이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 일부 암은 췌장암이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 일부 암은 전립선암이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 일부 암은 동암(sinus cancer)이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 일부 암은 피부암이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 일부 암은 연조직 육종 척수암이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 일부 암은 위암이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 일부 암은 고환암이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 일부 암은 인후암이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 일부 암은 갑상선암이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 일부 암은 자궁암, 자궁내막암이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 일부 암은 질암이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 일부 암은 외음부암이다.
상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 부신암은 부신피질 암종(ACC), 부신피질암, 크롬친화세포종 또는 신경모세포종이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 항문암은 편평세포 암종, 총배설강 암종, 선암종, 기저세포 암종 또는 흑색종이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 충수암은 신경내분비 종양(NET), 점액성 선암종, 배상세포 카르시노이드, 장형 선암종 또는 반지세포 선암종이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 담도암은 간외 담도암, 선암종, 폐문 담도암, 폐문주위 담도암, 원위 담도암 또는 간내 담도암이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 방광암은 이행세포 암종(TCC), 유두상 암종, 편평 암종, 편평세포 암종, 선암종, 소세포 암종 또는 육종이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 골암은 원발성 골암, 육종, 골육종, 연골육종, 육종, 섬유육종, 악성 섬유성 조직구종, 뼈의 거대세포 종양, 척삭종 또는 전이성 골암이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 뇌암은 성상세포종, 뇌간 신경교종, 교모세포종, 수막종, 뇌실막세포종, 희소돌기아교세포종, 혼합 신경교종, 뇌하수체 암종, 뇌하수체 선종, 두개인두종, 생식세포 종양, 송과체부 종양, 수모세포종 또는 원발성 CNS 림프종이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 유방암은 유방 선암종, 침습성 유방암, 비침습성 유방암, 유방 육종, 화생성 암종, 선낭종성 암종, 엽상 종양, 혈관육종, HER2 양성 유방암, 삼중음성 유방암 또는 염증성 유방암이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 자궁경부암은 편평세포 암종 또는 선암종이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 대장암은 대장 선암종, 원발성 대장 림프종, 위장관 간질 종양, 평활근육종, 카르시노이드 종양, 점액성 선암종, 반지세포 선암종, 위장관 카르시노이드 종양 또는 흑색종이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 식도암은 선암종 또는 편평세포 암종이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 담낭암은 선암종, 유두상 선암종, 선편평상피 암종, 편평세포 암종, 소세포 암종 또는 육종이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 임신 융모성 질환(GTD)은 포상기태, 임신 융모성 종양(GTN), 융모막암종, 태반부착부위 융모성 종양(PSTT) 또는 상피 융모성 종양(ETT)이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 두경부암은 후두암, 비인두암, 하인두암, 비강암, 부비동암, 타액선암, 구강암, 구인두암 또는 편도선암이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 호지킨 림프종은 전형적 호지킨 림프종, 결절성 경화증, 혼합 세포성, 림프구 풍부, 림프구 고갈 또는 결절성 림프구 우세형 호지킨 림프종(NLPHL)이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 장암은 소장암, 작은창자암, 선암종, 육종, 위장관 간질 종양, 카르시노이드 종양 또는 림프종이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 신장암은 신세포 암종(RCC), 투명세포 RCC, 유두상 RCC, 혐색소성 RCC, 집합관 RCC, 미분류 RCC, 이행세포 암종, 요로암, 신우 암종 또는 신장 육종이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 백혈병은 급성 림프구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 만성 골수성 백혈병(CML), 모발상세포 백혈병(HCL) 또는 골수형성이상 증후군(MDS)이다. 특정 실시형태에서, 백혈병은 AML이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 간암은 간세포 암종(HCC), 섬유층판 HCC, 담관암종, 혈관육종 또는 간 전이이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 폐암은 소세포 폐암, 소세포 암종, 복합 소세포 암종, 비소세포 폐암, 폐 선암종, 편평세포 폐암, 거대세포 미분화 암종, 폐결절, 전이성 폐암, 선편평상피 암종, 거대세포 신경내분비 암종, 타액선형 폐 암종, 폐 카르시노이드, 중피종, 폐의 육종성 암종 또는 악성 과립세포 폐 종양이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 흑색종은 표재 확산성 흑색종, 결절성 흑색종, 말단 흑자성 흑색종, 악성흑색점 흑색종, 멜라닌결핍 흑색종, 섬유조직형성 흑색종, 안구 흑색종 또는 전이성 흑색종이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 중피종은 흉막 중피종, 복막 중피종, 심낭 중피종 또는 고환 중피종이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 다발성 골수종은 활동성 골수종 또는 무증상 골수종이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 신경내분비 종양은 위장관 신경내분비 종양, 췌장 신경내분비 종양 또는 폐 신경내분비 종양이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 비호지킨 림프종은 역형성 거대세포 림프종, 림프모구성 림프종, 말초 T세포 림프종, 소포성 림프종, 피부 T세포 림프종, 림프형질세포 림프종, 변연부 B세포 림프종, MALT 림프종, 소세포 림프구성 림프종, 버킷 림프종, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 소림프구성 림프종(SLL), 전구체 T 림프모구성 백혈병/림프종, 급성 림프구성 백혈병(ALL), 성인 T세포 림프종/백혈병(ATLL), 모발상세포 백혈병, B세포 림프종, 미만성 거대 B세포 림프종(DLBCL), 원발성 종격동 B세포 림프종, 원발성 중추신경계(CNS) 림프종, 외투세포 림프종(MCL), 변연부 림프종, 점막 관련 림프 조직(MALT) 림프종, 결절 변연부 B세포 림프종, 비장 변연부 B세포 림프종, 림프형질세포 림프종, B세포 비호지킨 림프종, T세포 비호지킨 림프종, 자연살해세포 림프종, 피부 T세포 림프종, 알리베르트-바진 증후군(Alibert-Bazin syndrome), 세자리 증후군(Sezary syndrome), 원발성 피부 역형성 거대세포 림프종, 말초 T세포 림프종, 혈관면역모세포성 T세포 림프종(AITL), 역형성 거대세포 림프종(ALCL), 전신 ALCL, 장병증형 T세포 림프종(EATL) 또는 간비장 감마/델타 T세포 림프종이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 구강암은 편평세포 암종, 사마귀 암종, 경미한 타액선 암종, 림프종, 양성 구강 종양, 호산구성 육아종, 섬유종, 과립세포 종양, 각질가시세포종, 평활근종, 골연골종, 지방종, 신경초종, 신경섬유종, 유두종, 첨형 콘딜로마, 사마귀모양 황색종, 화농성 육아종, 횡문근종, 치원성 종양, 백반증, 홍반증, 편평세포 입술암, 기저세포 입술암, 구강암, 잇몸암 또는 혀암이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 난소암은 난소상피암, 점액 상피성 난소암, 자궁내막 상피성 난소암, 투명세포 상피성 난소암, 미분화 상피성 난소암, 난소 저급성 악성 종양, 원발성 복막 암종, 나팔관암, 생식세포 종양, 기형종, 미분화세포종, 난소 생식세포암, 내배엽동 종양, 성삭-기질 종양, 성삭-생식선 간질 종양, 난소 간질 종양, 과립막세포 종양, 과립막-테카 종양, 세르톨리-레이디그 종양(Sertoli-Leydig tumor), 난소 육종, 난소 암육종, 난소 선육종, 난소 평활근육종, 난소 섬유육종, 크루켄베르그 종양(Krukenberg tumor) 또는 난소낭이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 췌장암은 췌장 외분비선암, 췌장 내분비선암, 췌장 선암종, 섬세포 종양 또는 신경내분비 종양이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 전립선암은 전립선 선암종, 전립선 육종, 이행세포 암종, 소세포 암종 또는 신경내분비 종양이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 동암은 편평세포 암종, 점막세포 암종, 선양낭성세포 암종, 세엽세포 암종, 부비강 미분화 암종, 비강암, 부비동암, 상악동암, 사골동암 또는 비인두암이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 피부암은 기저세포 암종, 편평세포 암종, 흑색종, 메르켈세포(Merkel cell) 암종, 카포시 육종(KS), 광선각화증, 피부 림프종 또는 각질가시세포종이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 연조직암은 혈관육종, 피부섬유육종, 상피모양 육종, 유잉 육종(Ewing's sarcoma), 섬유육종, 위장관 간질 종양(GIST), 카포시 육종, 평활근육종, 지방육종, 탈분화 지방육종(DL), 점액낭/원형세포 지방육종(MRCL), 고분화 지방육종(WDL), 악성 섬유성 조직구종, 신경섬유육종, 횡문근육종(RMS) 또는 윤활막 육종이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 척수암은 척수 전이성 종양이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 위암은 위 선암종, 위 림프종, 위장관 간질 종양, 카르시노이드 종양, 위 카르시노이드 종양, I형 ECL 세포 카르시노이드, II형 ECL 세포 카르시노이드 또는 III형 ECL 세포 카르시노이드이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 고환암은 정상피종, 비(non)-정상피종, 배아 암종, 난황낭 암종, 융모막암종, 기형종, 생식선 간질 종양, 레이디그세포 종양 또는 세르톨리세포 종양이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 인후암은 편평세포 암종, 선암종, 육종, 후두암, 인두암, 비인두암, 구인두암, 하인두암, 후두암, 후두 편평세포 암종, 후두 선암종, 림프상피종, 방추세포 암종, 사마귀암, 미분화 암종 또는 림프절암이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 갑상선암은 유두상 암종, 소포성 암종, 허틀세포(Hurthle cell) 암종, 갑상선 수질 암종 또는 역형성 암종이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 자궁암은 자궁내막암, 자궁내막 선암종, 자궁내막모양 암종, 장액성 선암종, 선편평상피 암종, 자궁 암육종, 자궁 육종, 자궁 평활근육종, 자궁내막 간질성 육종 또는 미분화 육종이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 질암은 편평세포 암종, 선암종, 흑색종 또는 육종이다. 상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 외음부암은 편평세포 암종 또는 선암종이다.
일 양태에서, 항원을 둘러싸는 조직에 항원의 면역 관용을 확립하는 방법으로서, 본원에 기재된 바와 같은 IL-2 폴리펩타이드를 포함하는 면역접합체 분자의 유효량을 조직과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 조직 내 활성화된 B세포, CD4+ 이펙터 T세포, CD8+ 이펙터 T세포, 수지상세포, 대식세포, 자연살해세포, 단핵구, 과립구, 호산구 및/또는 호중구의 농도가 감소된다. 일부 실시형태에서, 조직 내 조절 T세포의 농도가 증가된다. 일부 실시형태에서, 전염증성 사이토카인의 농도가 조직에서 감소된다. 일부 실시형태에서, 전염증성 사이토카인은 IL-1, IL-2, IL-6, IL-12, IL-17, IL-22, IL-23, GM-CSF, TNF-α, IFN-γ, 또는 이들의 임의의 조합이다. 일부 실시형태에서, 항원에 결합하는 항체의 농도가 조직에서 감소된다. 일부 실시형태에서, 항원제시세포에 의한 항원의 제시가 조직에서 감소된다. 일부 실시형태에서, 항원을 발현하는 세포의 포식작용이 조직에서 감소된다. 일부 실시형태에서, 항원을 발현하는 세포의 세포자멸사가 조직에서 감소된다. 일부 실시형태에서, 조직은 대상에 존재하고, 항원은 대상의 자가 항원이다. 일부 실시형태에서, 대상은 자가면역 질환을 앓고 있다.
또 다른 양태에서, 자가면역 질환의 치료를 필요로 하는 대상에서 자가면역 질환을 치료하는 방법으로서, 본원에 기재된 바와 같은 IL-2 폴리펩타이드를 포함하는 면역접합체 분자의 유효량을 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 상기 치료는 자가 항원에 대한 선천성, 체액성 또는 세포 매개 면역 반응을 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 제2 요법의 병용투여를 추가로 포함한다.
상기 또는 하기 언급된 실시형태 중 임의의 것 또는 각각의 일부 실시형태에서, 질환 또는 장애는 면역 또는 자가면역 장애이다. 이러한 장애에는, 하기가 포함된다: 자가면역 수포성 질환, 무베타지질단백혈증, 후천성 면역결핍 관련 질환, 기관 이식과 관련된 급성 면역 질환, 후천성 말단청색증, 급성 및 만성 기생충 또는 감염 과정, 급성 췌장염, 급성 신부전, 급성 류마티스열, 급성 횡단 척수염, 선암종, 공기중 이소성 박동, 성인 (급성) 호흡곤란 증후군, AIDS 치매 복합증, 알코올성 간경변, 알코올 유발 간 손상, 알코올 유발 간염, 알레르기성 결막염, 알레르기성 접촉성 피부염, 알레르기성 비염, 알레르기 및 천식, 동족이식 거부반응, 알파-L-항트립신 결핍증, 알츠하이머병, 근위축성 측삭 경화증, 빈혈, 협심증, 강직성 척추염 관련 폐질환, 전각세포 변성, 항체 매개 세포독성, 항인지질 증후군, 항수용체 과민반응, 대동맥 및 말초 동맥류, 대동맥 박리, 동맥 고혈압, 동맥경화증, 동정맥루, 관절병증, 무력증, 천식, 운동실조증, 아토피성 알레르기, 심방세동(지속성 또는 발작성), 심방조동, 방실 차단, 위축성 자가면역 갑상선 기능 저하증, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 제1형 자가면역 간염(전형적 자가면역 또는 루포이드(lupoid) 간염), 자가면역 매개 저혈당증, 자가면역 호중구감소증, 자가면역 혈소판감소증, 자가면역 갑상선 질환, B세포 림프종, 뼈 이식 거부반응, 골수 이식(BMT) 거부반응, 폐쇄성 세기관지염, 다발 분지 차단, 화상, 악액질, 심장 부정맥, 심장 기절 증후군, 심장 종양, 심근병증, 심폐 우회 염증 반응, 연골 이식 거부반응, 소뇌 피질 변성, 소뇌 장애, 혼돈 또는 다초점성 심방 빈맥, 화학요법 관련 장애, 클라미디아, 담즙정체증, 만성 알코올 중독, 만성 활동성 간염, 만성 피로 증후군, 기관 이식과 관련된 만성 면역 질환, 만성 호산구성 폐렴, 만성 염증성 병리, 만성 피부점막 칸디다증, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 만성 살리실산 중독, 결장직장 공통 가변성 면역결핍증(공통 가변성 저감마글로불린혈증), 결막염, 결합조직 질환 관련 간질성 폐질환, 접촉성 피부염, 쿰스(Coombs) 양성 용혈성 빈혈, 폐심장증, 크로이펠츠-야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease), 잠재성 자가면역 간염, 잠재성 섬유화 폐포염, 배양 음성 패혈증, 낭포성 섬유증, 사이토카인 요법 관련 장애, 크론병, 권투선수 치매, 탈수초성 질환, 뎅기 출혈열, 피부염, 피부경화증, 피부과적 병태, 피부근염/다발근염 관련 폐질환, 당뇨병, 당뇨병성 동맥경화증, 진성 당뇨병, 미만성 루이소체 질환, 확장성 심근병증, 확장성 울혈성 심근병증, 원반형 홍반성 루푸스, 기저핵 장애, 파종성 혈관내 응고, 중년기 다운 증후군, 약물 유발 간질성 폐질환, 약물 유발 간염, CNS 도파민 수용체를 차단하는 약물에 의해 유발된 운동 장애, 약물 감수성, 습진, 뇌척수염, 심내막염, 내분비병증, 장병성 윤활막염, 후두개염, 엡스타인-바 바이러스(Epstein-Barr virus) 감염, 홍반사지통증, 추체외로 및 소뇌 장애, 가족성 식혈세포성 림프조직구증, 태아 흉선 이식 거부반응, 프리드리히 실조증(Friedreich's ataxia), 기능성 말초 동맥 장애, 여성 불임, 섬유증, 섬유성 폐질환, 진균 패혈증, 가스 괴저, 위궤양, 거대세포 동맥염, 사구체신장염, 사구체신염, 굿파스춰 증후군(Goodpasture's syndrome), 갑상선종 자가면역 갑상선 기능 저하증(하시모토병(Hashimoto's disease)), 통풍 관절염, 임의의 기관 또는 조직의 이식편 거부반응, 이식편대숙주병, 그람 양성 패혈증, 세포내 유기체로 인한 육아종, B군 연쇄구균(GBS) 감염, 그레이브스병(Graves' disease), 혈철소증 관련 폐질환, 모발상세포 백혈병, 할레로르덴-스파츠병(Hallerrorden-Spatz disease), 하시모토 갑상선염, 건초열, 심장 이식 거부반응, 혈색소증, 조혈 악성종양(백혈병 및 림프종), 용혈성 빈혈, 용혈성 요독 증후군/혈전용해성 혈소판 감소성 자반증, 출혈, 헤노흐-쇤라인 자반증(Henoch-Schoenlein purpura), A형 간염, B형 간염, C형 간염, HIV 감염/HIV 신경병증, 호지킨병, 부갑상선 기능 저하증, 헌팅턴 무도병(Huntington's chorea), 과운동성 운동 장애, 과민 반응, 과민성 폐렴, 갑상선 기능 항진증, 저운동성 운동 장애, 시상하부-뇌하수체-부신 축 평가, 특발성 에디슨병(Addison's disease), 특발성 백혈구감소증, 특발성 폐섬유증, 특발성 혈소판감소증, 특발성 간질환, 영아 척수근 위축증, 감염성 질환, 대동맥 염증, 염증성 장질환, 인슐린 의존성 진성 당뇨병, 간질성 폐렴, 홍채섬모체염/포도막염/시신경염, 허혈-재관류 손상, 허혈성 뇌졸중, 소아 악성 빈혈, 소아 류마티스 관절염, 소아 척수근 위축증, 카포시 육종, 카와사키병(Kawasaki's disease), 신장 이식 거부반응, 레지오넬라, 레슈마니아증, 나병, 피질척수계 병변, 선형 IgA 질환, 지질종, 간 이식 거부반응, 라임병, 림프부종, 림프구성 침윤성 폐질환, 말라리아, 특발성 또는 NOS 남성 불임, 악성 조직구증, 악성 흑색종, 수막염, 수막구균증, 신장의 미세혈관염, 편두통, 미토콘드리아 다계통 장애, 혼합 결합조직병, 혼합 결합조직병 관련 폐질환, 단클론 감마병증, 다발성 골수종, 다계통 변성(Mencel, Dejerine-Thomas, Shy-Drager 및 Machado-Joseph), 근육통성 뇌염/로얄프리병(Royal Free Disease), 중증근무력증, 신장의 미세혈관염, 마이코박테리움 아비움 인트라셀룰라레(mycobacterium avium intracellulare), 마이코박테리움 결핵, 골수이형성 증후군, 심근경색증, 심근허혈성 장애, 비인두 암종, 신생아 만성 폐질환, 신장염, 신장증, 신장 증후군, 신경변성 질환, 제1형 신경성 근위축증, 호중구감소성 열, 비알코올성 지방간염, 복부 대동맥 및 이의 분지 폐색, 폐색성 동맥 질환, 기관 이식 거부반응, 고환염/부고환염, 고환염/정관전환술, 기관비대증, 골관절증, 골다공증, 난소 부전, 췌장 이식 거부반응, 기생충 질환, 부갑상선 이식 거부반응, 파킨슨병, 골반 염증성 질환, 심상성 천포창, 낙엽상 천포창, 유사천포창, 사계절 비염, 심장막 질환, 말초 죽상경화 질환, 말초 혈관 장애, 복막염, 악성 빈혈, 수정체성 포도막염, 폐포자충 폐렴, 폐렴, POEMS 증후군(다발신경병증, 기관비대증, 내분비병증, 단클론 감마병증 및 피부 변화 증후군), 관류 후 증후군, 펌프 후 증후군, MI 후 심장절개 증후군, 감염후 간질성 폐질환, 조기 난소 부전, 원발성 담즙성 간경변, 원발성 경화성 간염, 원발성 점액부종, 원발성 폐고혈압, 원발성 경화성 담관염, 원발성 혈관염, 진행성 핵상 마비, 건선, 건선 1형, 건선 2형, 건선성 관절병증, 결합조직병에 따른 폐고혈압, 결절성 다발동맥염의 폐 발현, 염증 후 간질성 폐질환, 방사선 섬유증, 방사선 요법, 레이노 현상 및 레이노병(Raynaud's phenomenon and disease), 레이노병, 레프섬병(Refsum's disease), 규칙적인 좁은 QRS 빈맥, 라이터병(Reiter's disease), 신장질환 NOS, 신혈관성 고혈압, 재관류 손상, 제한성 심근병증, 류마티스 관절염 관련 간질성 폐질환, 류마티스 척추염, 유육종증, 슈미트 증후군(Schmidt's syndrome), 경피증, 노인성 무도병, 루이소체형 노인성 치매, 패혈증 증후군, 패혈성 쇼크, 혈청음성 관절병증, 쇼크, 겸상적혈구 빈혈, T세포 또는 FAB ALL, 타카야수병/타카야수 동맥염, 모세혈관확장증, Th2형 및 Th1형 매개 질환, 폐쇄성 혈전혈관염, 혈소판감소증, 갑상선염, 독성, 독성 쇼크 증후군, 이식, 외상/출혈, 제2형 자가면역 간염(항-LKM 항체 간염), 흑색 가시세포증을 동반한 B형 인슐린 내성, III형 과민 반응, IV형 과민증, 궤양성 대장염 관절병증, 궤양성 대장염, 불안정 협심증, 요독증, 요로패혈증, 두드러기, 포도막염, 판막성 심장병, 정맥류, 혈관염, 혈관염 미만성 폐질환, 정맥 질환, 정맥 혈전증, 심실 세동, 백반증 급성 간질환, 바이러스 및 진균 감염, 바이러스성 뇌염/무균성 뇌막염, 바이러스 관련 식혈세포 증후군, 베게너 육아종증, 베르니케-코르사코프 증후군(Wernicke-Korsakoff syndrome), 윌슨병(Wilson's disease), 임의의 기관 또는 조직의 이종이식편 거부반응, 예르시니아 및 살모넬라 관련 관절병증, 후천성 면역결핍 질환 증후군(AIDS), 자가면역 림프증식성 증후군, 용혈성 빈혈, 염증성 질환, 혈소판감소증, 기관 이식과 관련된 급성 및 만성 면역 질환, 애디슨병, 알레르기 질환, 탈모증, 원형탈모증, 죽상경화증/동맥경화증, 죽상동맥경화증, 관절염(골관절염, 소아 만성 관절염, 패혈성 관절염, 라임 관절염, 건선성 관절염 및 반응성 관절염 포함), 쇼그렌병(Sjogren's disease) 관련 폐질환, 쇼그렌 증후군, 피부 동종이식편 거부반응, 피부 변화 증후군, 소장 이식 거부반응, 정자 자가면역, 다발성 경화증(모든 하위유형), 척수성 실조증, 척수소뇌 변성, 척추관절병증, 산발성 다선성 결핍증 I형, 산발성 다선성 결핍증 II형, 스틸병, 연쇄구균 근육염, 뇌졸중, 소뇌의 구조적 병변, 아급성 경화성 범뇌염, 교감성 안염, 실신, 심혈관계 매독, 전신 아나필락시스, 전신 염증 반응 증후군, 전신 발병 소아 류마티스 관절염, 전신 홍반 루푸스, 전신 홍반 루푸스 관련 폐질환, 루푸스 신염, 전신 경화증, 및 전신 경화증 관련 간질성 폐질환.
5.5 약학적 조성물
일 양태에서, 본 개시내용은 적어도 하나의 본 개시내용의 면역접합체 분자를 포함하는 약학적 조성물을 추가로 제공한다. 일부 실시형태에서, 약학적 조성물은 1) 면역접합체 분자, 및 2) 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다.
항체 또는 항체 함유 면역접합체 분자를 포함하는 약학적 조성물은 수용액, 또는 동결건조 또는 다른 건조된 형태로, 목적하는 정도의 순도를 갖는 항체 또는 면역접합체 분자를 선택적인 생리학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합하는 방식으로 보관용으로 제조된다(예를 들어, 문헌[Remington, Remington's Pharmaceutical Sciences (18th ed. 1980)] 참조).
본 개시내용의 면역접합체 분자는 표적 세포/조직으로의 전달을 위해 임의의 적합한 형태, 예를 들어 마이크로캡슐 또는 마이크로에멀젼(Remington의 상기 문헌; 문헌[Park et al., 2005, Molecules 10:146-61]; 문헌[Malik et al., 2007, Curr. Drug. Deliv. 4:141-51]), 지속 방출 제형(문헌[Putney and Burke, 1998, Nature Biotechnol. 16:153-57]), 또는 리포솜(문헌[Maclean et al., 1997, Int. J. Oncol. 11:325-32]; 문헌[Kontermann, 2006, Curr. Opin. Mol. Ther. 8:39-45])으로 제형화될 수 있다.
본원에 제공된 면역접합체 분자는 또한, 예를 들어 코아세르베이션(coacervation) 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어, 각각, 히드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에, 콜로이드 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에, 또는 마크로에멀젼에 포획될 수 있다. 이러한 기술은, 예를 들어 상기 Remington의 문헌에 개시되어 있다.
다양한 조성물과 전달 시스템이 알려져 있고, 항체 또는 항체 함유 분자, 예컨대 본원에 기재된 바와 같은 면역접합체 분자와 함께 사용될 수 있으며, 이에는, 비제한적으로, 리포솜, 마이크로입자 또는 마이크로캡슐에의 캡슐화, 항체를 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체 매개 세포내이입(예를 들어, 문헌[Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-32] 참조), 레트로바이러스 또는 다른 벡터의 일부로서의 핵산 작제물 등이 포함된다. 또 다른 실시형태에서, 조성물은 제어 방출 또는 지속 방출 시스템으로 제공될 수 있다. 일 실시형태에서, 펌프가 제어 방출 또는 지속 방출을 달성하는 데 사용될 수 있다(예를 들어, 상기 Langer의 문헌; 문헌[Sefton, 1987, Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201-40]; 문헌[Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507-16]; 및 문헌[Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:569-74] 참조). 또 다른 실시형태에서, 중합체성 재료가 예방제 또는 치료제(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 PD-1에 결합하는 항체), 또는 본 발명의 조성물의 제어 방출 또는 지속 방출을 달성하는 데 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Medical Applications of Controlled Release (Langer and Wise eds., 1974)]; 문헌[Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance (Smolen and Ball eds., 1984)]; 문헌[Ranger and Peppas, 1983, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61-126]; 문헌[Levy et al., 1985, Science 228:190-92]; 문헌[During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351-56]; 문헌[Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105-12]; 미국 특허 제5,679,377호; 제5,916,597호; 제5,912,015호; 제5,989,463호; 및 제5,128,326호; PCT 국제공개 WO 99/15154호 및 WO 99/20253호 참조). 지속 방출 제형에 사용되는 중합체의 예에는, 비제한적으로, 폴리(2-히드록시 에틸 메타크릴레이트), 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(아크릴산), 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트), 폴리(메타크릴산), 폴리글리콜리드(PLG), 폴리무수물, 폴리(N-비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알코올), 폴리아크릴아미드, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리락티드(PLA), 폴리(락티드-코-글리콜리드)(PLGA) 및 폴리오르토에스테르가 포함된다. 일 실시형태에서, 지속 방출 제형에 사용되는 중합체는 불활성이고, 침출성 불순물이 없고, 저장 시 안정하고, 무균성이며 생분해성이다.
또 다른 실시형태에서, 제어 방출 또는 지속 방출 시스템은 특정 표적 조직, 예를 들어 비강 또는 폐 근처에 배치될 수 있기 때문에, 전신 용량의 일부만 필요하다(예를 들어, 문헌[Goodson, Medical Applications of Controlled Release Vol. 2, 115-38 (1984)] 참조). 제어 방출 시스템은, 예를 들어 문헌[Langer, 1990, Science 249:1527-33]에 논의되어 있다. 본원에 기재된 바와 같은 PD-1에 결합하는 하나 이상의 항체를 포함하는 지속 방출 제형을 제조하는 데 당업자에게 알려진 임의의 기술이 사용될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제4,526,938호, PCT 국제공개 WO 91/05548호 및 WO 96/20698호, 문헌[Ning et al., 1996, Radiotherapy & Oncology 39:179-89]; 문헌[Song et al., 1995, PDA J. of Pharma. Sci. & Tech. 50:372-97]; 문헌[Cleek et al., 1997, Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-54]; 및 문헌[Lam et al., 1997, Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-60] 참조).
5.6 키트
적합한 포장 재료에 포장된 본원에 제공된 바와 같은 면역접합체 분자 또는 이의 조성물(예를 들어, 약학적 조성물)을 포함하는 키트가 또한 본원에 제공된다. 키트는 선택적으로 구성요소에 대한 설명, 또는 해당 구성요소의 시험관내, 생체내 또는 생체외에서의 사용을 위한 설명서를 포함하는 라벨 또는 포장 삽입물을 포함한다.
"포장 재료"라는 용어는, 키트 구성요소를 덮고 있는 물리적 구조를 나타낸다. 포장 재료는 구성요소를 멸균 상태로 유지할 수 있으며, 이러한 목적에 통상적으로 사용되는 재료(예를 들어, 종이, 골판지, 유리, 플라스틱, 포일, 앰풀, 바이알, 튜브 등)로 만들어질 수 있다.
본원에 제공된 키트는 라벨 또는 삽입물을 포함할 수 있다. 라벨 또는 삽입물에는, 구성요소, 키트 또는 포장 재료(예를 들어, 박스)와 별도로 존재하거나, 이에 부착되어 있거나, 또는 예를 들어 키트 구성요소를 함유하는 앰풀, 튜브 또는 바이알에 부착되어 있는 "인쇄물", 예를 들어 종이 또는 골판지가 포함된다. 라벨 또는 삽입물은 추가로, 디스크(예를 들어, 하드 디스크, 카드, 메모리 디스크), 광학 디스크, 예컨대 CD 또는 DVD-ROM/RAM, DVD, MP3, 자기 테이프와 같은 컴퓨터 판독 가능한 매체, 또는 RAM 및 ROM과 같은 전기 저장 매체, 또는 자기/광학 저장 매체, FLASH 매체 또는 메모리형 카드와 같은 이들의 혼성 형태를 포함할 수 있다. 라벨 또는 삽입물은 제조업체 정보, 로트 번호, 제조업체 위치 및 일자를 확인할 수 있는 정보를 포함할 수 있다.
본원에 제공된 키트는 다른 구성요소를 추가로 포함할 수 있다. 키트의 각 구성요소는 개별 용기 내에 동봉되어 있을 수 있으며, 다양한 용기들은 모두 단일 포장물 내에 존재할 수 있다. 키트는 또한 저온 저장용으로 설계될 수 있다. 키트는 나아가 본원에 제공된 항체, 또는 본원에 제공된 항체를 인코딩하는 핵산을 함유하는 세포를 함유하도록 설계될 수 있다. 키트 내 세포는 사용 준비가 될 때까지 적절한 저장 조건 하에서 유지될 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본 발명에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시내용이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 바와 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료가 본원에 기재되어 있다.
본원에 인용된 모든 특허출원, 공개공보, 특허 및 다른 참조문헌, GenBank 인용 및 ATCC 인용은 그 전체가 본원에 참조로 인용된다. 상충하는 경우, 본 명세서(정의 부분 포함)가 우선할 것이다.
본원에 사용된 단수 형태의 표현은, 문맥에서 달리 명백하게 지시되지 않는 한, 복수의 언급대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "펩타이드 서열"에 대한 언급은 복수의 이러한 서열 등을 포함한다.
본원에 사용된 수치 값은 종종 본 문헌 전반에 걸쳐 범위 형식으로 제시된다. 범위 형식의 사용은 단지 편의성과 간결성을 위한 것으로, 문맥에서 달리 명백하게 지시되지 않는 한, 본 발명의 범위에 대한 융통성 없는 제한으로 해석되어서는 안된다. 따라서, 문맥에서 달리 명백하게 지시되지 않는 한, 범위의 사용은 명백하게 모든 가능한 하위범위, 해당 범위 내 모든 개별 수치 값, 및 해당 범위 내 정수 및 해당 범위 내 값 또는 정수의 분수를 포함하는 모든 수치 값 또는 수치 범위를 포함한다. 이러한 구성은 본 특허 문헌 전반에 걸쳐 모든 맥락 및 범위의 폭에 관계없이 적용된다. 따라서, 예를 들어, 90% 내지 100% 범위에 대한 언급은 91% 내지 99%, 92% 내지 98%, 93% 내지 95%, 91% 내지 98%, 91% 내지 97%, 91% 내지 96%, 91% 내지 95%, 91% 내지 94%, 91% 내지 93% 등을 포함한다. 90% 내지 100% 범위에 대한 언급은 또한, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95%, 97% 등뿐 아니라, 91.1%, 91.2%, 91.3%, 91.4%, 91.5% 등, 92.1%, 92.2%, 92.3%, 92.4%, 92.5% 등을 포함한다.
또한, 1 내지 3, 3 내지 5, 5 내지 10, 10 내지 20, 20 내지 30, 30 내지 40, 40 내지 50, 50 내지 60, 60 내지 70, 70 내지 80, 80 내지 90, 90 내지 100, 100 내지 110, 110 내지 120, 120 내지 130, 130 내지 140, 140 내지 150, 150 내지 160, 160 내지 170, 170 내지 180, 180 내지 190, 190 내지 200, 200 내지 225, 225 내지 250의 범위에 대한 언급은, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 등을 포함한다. 추가의 예에서, 25 내지 250, 250 내지 500, 500 내지 1,000, 1,000 내지 2,500, 2,500 내지 5,000, 5,000 내지 25,000, 25,000 내지 50,000의 범위에 대한 언급은, 이러한 값 내에 있거나 이러한 값을 포함하는 임의의 수치 값 또는 범위, 예를 들어 25, 26, 27, 28, 29…250, 251, 252, 253, 254…500, 501, 502, 503, 504…등을 포함한다.
또한, 본원에 사용된 일련의 범위가 본 문헌 전반에 걸쳐 개시되어 있다. 일련의 범위의 사용은 또 다른 범위를 제공하기 위한 상위 및 하위 범위의 조합을 포함한다. 이러한 구성은 본 특허 문헌 전반에 걸쳐 모든 맥락 및 범위의 폭에 관계없이 적용된다. 따라서, 예를 들어, 5 내지 10, 10 내지 20, 20 내지 30, 30 내지 40, 40 내지 50, 50 내지 75, 75 내지 100, 100 내지 150과 같은 일련의 범위에 대한 언급은, 5 내지 20, 5 내지 30, 5 내지 40, 5 내지 50, 5 내지 75, 5 내지 100, 5 내지 150, 및 10 내지 30, 10 내지 40, 10 내지 50, 10 내지 75, 10 내지 100, 10 내지 150 및 20 내지 40, 20 내지 50, 20 내지 75, 20 내지 100, 20 내지 150 등과 같은 범위를 포함한다.
간결성을 위해, 특정 약어가 본원에 사용된다. 하나의 예는, 아미노산 잔기를 나타내는 한 글자 약어이다. 아미노산과 이에 상응하는 세 글자 및 한 글자 약어는 하기와 같다:
본 발명은 일반적으로 다수의 실시형태를 설명하기 위해 긍정적인 표현을 사용하여 본원에 개시되어 있다. 본 발명은 또한 구체적으로, 물질 또는 재료, 방법 단계 및 조건, 프로토콜, 절차, 검정 또는 분석과 같은 특정 주제가 전체 또는 부분적으로 배제된 실시형태를 포함한다. 따라서, 본 발명은 일반적으로 본 발명이 포함하지 않는 측면에서는 본원에 표현되어 있지 않더라도, 본 발명에 명시적으로 포함되지 않은 양태가 본원에 개시되어 있다.
본 발명의 다수의 실시형태가 기재되어 있다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않는 한 다양한 변형이 이루어질 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 하기 실시예는 예시하기 위한 것으로, 청구범위에 기재된 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다.
6. 실시예
본 섹션(즉, 섹션 6)의 실시예는 제한이 아닌, 예시를 위해 제공된다.
6.1 실시예 1: 일반 방법.
6.1.1 세포주 및 배양 조건
달리 표시되지 않는 한, 모든 세포 배양 배지와 보충물은 Thermofisher의 Gibco에서 입수하였다. HEK 293T 세포는 구입하여(Fenghui ShengWu, 중국), 10% 소 태아 혈청(FBS), 1% L-글루타민(L-glu), 1% Na 피루베이트, 및 1% 페니실린 및 스트렙토마이신(P/S)이 보충된 DMEM에서 유지시켰다. HEK Blue IL-2 리포터 세포주는 InVivoGen(USA)에서 구입하여, 10% 열 불활성화 소 태아 혈청(FBS), 1% L-글루타민(L-glu), 1% Na 피루베이트, 1% 페니실린 및 스트렙토마이신(P/S)과 100 ug/mL 노르마신(Normacin)(InVivogen)이 보충된 DMEM에서 유지시켰다. CTLL-2 세포주는 ATCC(American Type Culture Collection)에서 구입하여, 10% 소 태아 혈청(FBS), 1% L-글루타민(L-glu), 1% Na 피루베이트, 및 1% 페니실린 및 스트렙토마이신(P/S)이 보충된 RPMI를 이용하여 배양하였다. NK-92 세포주는 Procell(중국)에서 구입하여, 20 U/mL IL-2, MEMα, 0.2 mM 이노시톨, 엽산, 0.1 mM β-메르캅토에탄올, 12.5% 말 혈청, 12.5% 소 태아 혈청 및 1% P/S가 보충된 RPMI로 이루어진 회사가 제공한 배지에서 유지시켰다(Expi293F, Cat#: A14635). ExpiCHO(Cat#: A29133) 세포는 Thermofisher에서 구입하여, 제조업체가 제공한 배지에서 유지시켰다.
6.1.2 안정한 hFAP 발현 세포주의 생성
hFAP을 안정적으로 발현하는 부착성 HEK 293T 세포를 하기 기재되는 바와 같이 생성하였다. 히그로마이신 내성 유전자가 있는 hFAP 발현 벡터를 Sino Biologics(Cat#: HG10464-UT)에서 구입하였다. 플라스미드를 Lipofectamine 2000(Thermofisher) 시스템을 사용하여 HEK 293T에 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 24시간 후, 150 μg/mL 히그로마이신을 세포 배양물에 첨가하고, 이후 2주 동안 필요 시 새로운 배지로 교체하였다. 생존 세포를 확장시키고, 항-FAP mAB(Cat#: BMS168, Thermofisher)와 염소 항-마우스 Alexa 488(Cat#: A32723, Thermofisher)이 표지된 유세포분석기(CYTOFLEX, Beckman Coulter)를 사용하여 hFAP 발현을 확인하였다. BD FACSAria III 분류기를 사용하여 FAP 발현 클론을 풀에서 분류하였다. HEK 293T-hFAP-E5로 지정된 고발현 클론을 선택하고, 하기 기재되는 바와 같이 검정에 사용하였으며, 이의 수용체 밀도는 Quantum Alexa Fluor 488 MESF 키트(Bangslab, USA)를 사용하여 대략 3x106/세포로 보정하였다.
세포를 현탁액에 유지시키고 배지를 교체하지 않았다는 점을 제외하고는, 상기 기재된 바와 유사하게 hFAP을 발현하는 현탁액 ExpiCHO 세포를 생성하였다. ExpiCHO-hFAP-G7로 지정된 고발현 클론을 선택하고, 하기 기재되는 바와 같이 검정에 사용하였다.
6.1.3 생체층 간섭계를 이용한 친화도 결정:
항체-항원 상호작용의 결합 동역학은 Gator BLI 시스템을 사용하여 생체층 간섭계로 결정하였다. 특히, 비오틴화된 항원을 스트렙타비딘으로 코팅된 센서에 약 0.5 nm 내지 1.0 nm의 반응 수준으로 고정시켰다. 후보 항체를 Fc 부분에 놉인홀 변형을 함유하는 1가 Fab-Fc 융합 단백질의 형태로 작제하고, 100 nM 내지 3.1 nM 범위의 최종 농도가 되도록 연속으로 2배 희석하였다. 항체 샘플을 센서에 적용하고, 최대 240초 동안 인큐베이션하여 항체-항원이 회합되게 한 후, PBST-BSA 중에서 센서를 최대 420초 동안 인큐베이션하여 해리되게 하였다. 고정된 항원이 없는 센서의 반응을 빼서 참조한 후 결합 상수(kon, koff 및 KD)를 결정하였다. 연결되지 않은 Rmax에 대한 반응을 핏팅하면서, 1:1 결합 상호작용을 사용하여 Gator 소프트웨어를 통해 데이터를 전반적으로 핏팅하였다. 모든 단백질 샘플은 PBST-BSA에 희석하였다.
KD 결정을 위한 전형적인 프로토콜:
6.2 실시예 2: 항체의 생성
6.2.1 항-FAP 항체의 생성
모 FAP mAb를 초기에 인간 섬유아세포 활성화 단백질(FAP) 항원을 사용하여 파지 디스플레이 방법으로 생성하였다. CDR의 코돈 기반 서열 다양화가 포스포르아미다이트 트리뉴클레오타이드 기반 프라이머에 의해 도입된 Kunkel 돌연변이유발에 의해 구축된 파지 항체 라이브러리에서 Fab를 단리하였다. 스트렙타비딘 비드 상에 고정된 항원을 이용하여 파지 패닝을 3회 내지 4회 수행하였다. 단클론 파지 ELISA에 의한 파지 풀의 초기 특징분석으로 가용성 FAP 항원에 대한 항-인간 FAP 항체(KD 약 1 nM 내지 100 nM)를 생성하는 82개 서브클론을 식별하고(데이터는 제시되지 않음), 각각, IgG-1 내지 IgG-82로 지정하였다. 추가 연구를 위해 항체를 IgG1 및 Fab-Fc 형식으로 서브클로닝하였다.
선택된 항체가 세포 표면 상의 에피토프에 결합할 수 있는지를 확인하고, 세포에 대해 비특이적 결합을 나타내는 항체를 제외시키기 위해, HEK 293T 세포와 HEK 293T-FAP-E5 세포를 세포 결합에 사용하였다. HEK 293T-FAP-E5는 약 1x106 FAP/세포를 발현하는 단일 클론이다. 이를 모 HEK 293T 세포에서 일시적 트랜스펙션으로 생성하고, FACS로 분류하고, 히그로마이신 내성에 대해 선택하였으며, 이의 수용체 밀도는 제조업체 제공 절차에 따라 Quantum MESF 488(Bangs Laboratories, USA)로 정량화하였다. 살아있는 세포와 고정된 세포를 모두 세포 결합에 사용하였다. 세포 고정을 위해, HEK 293T 세포와 HEK 293T-FAP-E5 세포를 분리하고, PBS로 2회 세척하고, 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, PBS-1% BSA 중에 보관하였다.
세포에 대한 항체 결합을 Cytoflex(Beckman Coulter)를 이용하여 유세포분석으로 검정하였다. 간략하게, 1 μg/mL의 정제된 항체를 5x104개의 세포와 함께 100 uL 부피로 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 원심분리하고, PBS-1% BSA로 1회 세척하였다. 1 μg/mL의 2차 항체 염소 항-인간 Alexa488(A-11013, Thermofisher)을 세척한 세포와 함께 100 μL 부피로 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 원심분리하고, PBS-1% BSA로 1회 세척하였다. 표지된 세포를 300 μL로 재현탁시키고, FTIC 설정을 사용하여 Cytoflex에 로딩하였다. 1차 다클론 FAP 항체(PA5-95481, Thermofisher)와 2차 염소 항-토끼 Alexa488(A-11008, Thermofisher)의 쌍을 양성 대조군으로 사용하였다. 아이소타입 항체 DP47GS와 2차 항체 염소 항-인간 Alexa488(A-11013, Thermofisher)을 포함하는 항체 쌍을 음성 대조군으로 사용하였다. 표 1 내지 표 8에 언급된 모든 항체는 HEK 293T-FAP-E5 세포에 결합할 수 있지만, HEK 293T 세포에는 결합할 수 없다.
13개 클론 패널(872-2, 872-5, 872-10, 872-11, 872-19, 872-26, 872-39, 872-44, 872-58, 872-59, 872-67, 872-70 및 872-75)을 선택하고, 에피토프 비닝 연구에 적용하였다.
6.2.2 에피토프 비닝
선택된 항-FAP 항체가 중첩되지 않는 에피토프를 공유하는지를 결정하기 위해, GatorTM 생체층 간섭계(BLI) 시스템에서 에피토프 비닝 연구를 수행하였다. 항원(비오틴화된 FAP)을 약 0.5 nm 내지 1 nm의 반응 수준으로 고정시켰다. 베이스라인을 확립한 후, 센서를 포화 수준(>1 μM)의 항-FAP IgG 항체에 적용하였다. 약 60초의 짧은 해리 후, 센서를 제2 항체를 함유하는 용액 중에서 인큐베이션하고, 반응을 모니터링하였다. 제2 항체의 결합 사건이 제1 항체 결합 사건의 >50% 반응을 생성한 경우, 항체 쌍이 상이한 에피토프를 가지고 있는 것으로 간주하였다. 제2 항체 사건이 제1 항체 결합 사건 후 신호의 임의의 추가 증가를 유도하지 않았던 항체 쌍은 중첩되는 에피토프를 공유하는 것으로 간주하였다. 하기 표 9는 에피토프 비닝 연구의 결과를 요약한 것이다.
[표 9]
6.2.3 세포 기반 FAP 결합 검정
이어서, 생체층 간섭계로 결합을 확인한 항체를 인간 FAP을 발현하는 HEK-293 세포에 결합하는 능력에 대해 스크리닝하였다. nM 수준의 해리 상수(표 10)로 FAP의 2개의 중첩되지 않는 에피토프에 결합하는 3가지 항-FAP IgG 항체(각각, 클론 IgG 5, IgG 59 및 IgG 70을 이용하여 생산되고, 각각, 항체 872-5, 872-59 및 872-70으로 지정됨)를, 항-IL-2/항-FAP 이중특이적 항체의 생성을 위한 출발 항체로 선택하였다.
[표 10]
6.2.4 항-IL-2/항-FAP 이중특이적 항체의 생성
3가지 출발 항-FAP 항체 각각에 대해 파지 디스플레이 라이브러리를 구축하였다. 특히, Kunkel 돌연변이유발에서는, 출발 항체의 6개의 상보성 결정 영역(CDR)의 아미노산 잔기를 인코딩하는 각각의 코돈을 한 번에 한 위치씩 축퇴 코돈 NNK로 대체하였다. 후속 라이브러리 제작 및 파지 패닝을 위해, CDR 내 각각의 돌연변이된 잔기의 포화 돌연변이유발을 풀링하였다. 구축된 라이브러리의 DNA를 공개된 절차에 따라 M13K07로 사전 감염시킨 SS320 세포에 전기천공하였다. 몇 가지 변형을 제외하고는 나이브 라이브러리의 선별과 유사하게 패닝을 위해 파지를 준비하였다. 파지 패닝에 1 pmol의 비오틴화된 항원을 사용하였다. 선별 과정 동안, KingFisher 플레이트의 E 웰에 1 μM의 가용성 경쟁자를 첨가하였다. 이는, 가용성 경쟁자의 막대한 몰 과량으로 인해 가용성 항원이 항원 코팅된 비드에서 해리된 후 파지에 대한 결합에 대해 경쟁할 수 있는 "해리 속도(off-rate)" 선택을 가능하게 하였다. 또한, 패닝 실험 내에서 발현 편향을 모니터링하기 위해 비오틴화된 항-CH1 항체를 이용하여 병렬 선별을 수행하였다. 3회의 파지 패닝을 수행하고, 생성된 결과물을 차세대 시퀀싱을 위해 준비하였다. 생성된 서열 데이터를 CDR 내 아미노산 분포 선호도에 대해 분석하였다.
포화 돌연변이유발-NGS 시퀀싱 분석에 의해 돌연변이가 잘 발생하는 것으로 확인된 CDR 위치에 아미노산 다양성을 도입하기 위해 2차 라이브러리를 구축하였다. M13K07 헬퍼 파지로 사전 감염시킨 대장균 균주 SS320에의 전기천공과 결합된 합성 프라이머를 이용한 Kunkel 돌연변이유발을 사용하여 나이브 항체 라이브러리와 유사한 방식으로 파지 라이브러리를 구축하였다. 다수의 IL-2 변이체에 대해 파지 패닝을 수행하여 IL-2의 적어도 2개의 중첩되지 않은 에피토프를 인식하는 항체를 생성하였다.
6.2.5 이중특이적 항체 단리를 위한 파지 패닝:
구축된 항체 라이브러리를 4회의 파지 패닝에 적용하였다. 특히, 출발 파지 라이브러리가 함유된 용액 500 μL를 PBST-BSA(0.2% Tween 20과 2% 소 혈청 알부민이 보충된 인산염 완충 식염수) 중에 A268=1(약 1x1012 콜로니 형성 단위/mL)로 희석하였다. 20 μL의 M280 스트렙타비딘 Dynabead와 함께 1시간 동안 인큐베이션하여 파지 라이브러리를 사전 정화하였다. 사전 정화 후, 파지 라이브러리를 50 pmole의 비오틴화된 IL-2(Acro Biosciences)로 코팅된 20 μL의 Dynabead와 함께 인큐베이션하였다. 샘플을 온건하게 혼합하면서 실온에서 약 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 결합되지 않은 파지를 제거하기 위해 자기 스탠드를 이용하여 비드를 침전시켰다. 샘플을 500 μL의 PBST-BSA로 3회 세척한 후, 200 μL의 0.1 M 글리신(pH 2.7)과 함께 15분 동안 인큐베이션하여 비드에서 파지를 용리시켰다. 이어서, 비드에서 용리액의 상청액을 분리하고, 40 μL의 1 M HEPES(pH 7.2)를 이용하여 중화시켰다. 용리액과 비드를 5 mL의 중간 대수증식기 XL1-Blue 세포에 첨가하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 암피실린(50 μg/mL)과 M13K07 헬퍼 파지(약 1010 pfu/mL)가 보충된 25 mL의 2xYT를 첨가하여 감염된 세포를 하위 배양하였다. 세포 배양물을 격렬하게 진탕하면서 37℃에서 약 16시간 동안 성장시켰다.
유사하게 2회 내지 4회의 파지 패닝을 수행하였다. 특히, 감염된 세포를 밤새 배양한 후, 세포를 원심분리하여 펠릿으로 만들어 제거하였다. 1/5 부피의 PEG/NaCl 용액을 첨가하여 생성된 상청액을 침전시키고, 30분 동안 얼음 위에서 인큐베이션하였다. 10,000 x g로 15분 동안 원심분리한 후, 상청액을 제거하고, 파지 펠릿을 200 μL의 PBS에 재현탁시켰다. 재현탁된 파지를 14,000 x g로 5분 동안 원심분리하여 불용성 물질을 제거하였다. 이어서, 파지를 새로운 Eppendorf® 튜브로 옮기고, 40 μL의 PEG/NaCl 용액을 첨가하여 두 번째로 침전시켰다. 샘플을 얼음 위에 약 15분 동안 위치시킨 후, 10,000 x g로 10분 동안 회전시켰다. 상청액을 제거하고, 파지를 200 μL의 PBS에 재현탁시켰다. 샘플을 다시 14,000 x g로 5분 동안 원심분리하여 불용성 물질을 제거하였다. 파지를 정량화하고, 스트렙타비딘 비드를 이용하여 사전 정화를 위해 준비하였다. 여기서, PBST-BSA 중 250 μL의 파지(A268=0.2 내지 0.5)(2회차에서는 A268=0.5 사용, 3회 및 4회차에서는 A268=0.2 사용)를 10 μL의 M280 스트렙타비딘 Dynabead와 함께 30분 동안 인큐베이션하였다. 사전 정화 후, 비드 조작을 위해 200 uL KingFisherTM 플레이트의 웰 C에 파지를 첨가하였다. 파지 패닝을 위해 KingFisherTM 플레이트에 하기를 첨가하였다:
파지 패닝에 사용된 KingFisherTM 프로토콜은 하기와 같았다:
KingFisherTM 파지 패닝 프로토콜 후, 파지를 20 μL의 1 M HEPES를 이용하여 중화시켰다. 감염을 위해 50 μL의 파지 용리액을 500 μL의 중간 대수증식기 XL1에 30분 동안 첨가하였다. 이어서, 감염된 세포를 암피실린(50 μg/mL)과 M13K07 헬퍼 파지(약 1010 pfu/mL)가 보충된 2.5 mL의 2×YT에서 하위 배양하였다. 파지를 증폭시키기 위해 세포 배양물을 격렬하게 진탕하면서 37℃에서 밤새 성장시켰다. 또한, 각 회차의 용리액 중 콜로니 형성 단위의 수를 모니터링하기 위해 감염의 연속 희석액을 플레이팅하는 방식으로 파지를 정량화하였다.
파지 패닝을 4회차까지 지속하였다. 각 회차 동안 사용한 항원의 농도는 100 nM 내지 10 nM 범위였으며, 마지막 회차 동안에는 더 낮은 농도를 사용하였다. 연속적인 패닝 회차에서 파지 역가의 증가에 대해 파지 패닝 실험을 모니터링하였다.
6.2.6 단클론 파지 ELISA:
파지 패닝 연구에서 목적하는 결합 특성(예를 들어, FAP과 IL-2 둘 모두에 결합할 수 있는 항체)을 갖는 개별 클론을 식별하기 위해, 단클론 파지 ELISA 연구를 수행하였다. 용리액의 파지를 사용하여 XL1-Blue 세포를 감염시켰다. 30분 후, 개별 콜로니를 단리하여 선택할 수 있도록 세포를 LB-암피실린 플레이트에 플레이팅하였다. 37℃에서 밤새 인큐베이션한 후, 플레이트 상의 콜로니를 선택하여 96-딥 웰 블록에 위치시키고, 암피실린(50 μg/mL)과 M13K07 헬퍼 파지(약 1010 pfu/mL)가 보충된 400 μL의 2×YT와 함께 인큐베이션하였다. 플레이트를 격렬하게 진탕하면서 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 약 14시간의 인큐베이션 후, 플레이트를 원심분리(4000 × g, 10분 동안)하여 세포를 펠릿으로 만들었다. 생성된 파지 함유 상청액을 PBST-BSA에 10배로 희석하였다. 50 μL의 희석된 파지 함유 상청액을 MaxisorpTM ELISA 플레이트의 3개의 별개의 웰에서 인큐베이션하였다. 웰 #1은 2.5 pmole의 고정된 인터류킨-2를 함유하고 있었고, 웰 #2는 2.5 pmole의 고정된 FAP을 함유하고 있었고, 웰 #3은 BSA로 코팅되어 있었다. 파지를 30분 동안 인큐베이션한 후, PBST로 3회 세척하였다. 이어서, 플레이트를 50 μL의 0.2 μg/mL 항-M13-HRP 항체(SinoBiological, Cat # 11973-MM05T-H)와 함께 30분 동안 인큐베이션하였다. ELISA 플레이트를 다시 PBST로 3회 세척하였다. 1-StepTM Ultra TMB-ELISA TMB 기질(ThermoFisher)을 이용하여 홀스래디쉬 퍼옥시다아제 활성을 검출하였다. ELISA 플레이트를 대략 5분 동안 전개시키고, 1 M 인산을 이용하여 반응을 켄칭하였다. 410 nm에서 흡광도를 측정하는 방식으로 반응을 정량화하였다. 유의한 신호(배경의 약 >3배)를 나타낸 샘플을 서열 분석을 위해 보냈다.
파지 라이브러리의 스크리닝을 통해, 872-70 모 항체의 3가지 변이체를 식별하고, D001, D002 및 D029 변이체로 지정하였다. 이러한 변이체는 (a) 야생형 IL-2 폴리펩타이드와, IL-2 수용체 CD25에 결합하지 않는 IL-2hex 돌연변이체에 결합할 수 있었다. IL-2 신호전달을 방해할 수 있는 에피토프 쪽으로 파지 패닝 선별을 편향시키기 위해, IL-2의 CD25 에피토프와 일치하게 결합하는 α-IL-2 항체 NARA의 존재 하에서 야생형 IL-2의 선별을 수행하였으며; 이러한 변이체는 (b) IL-2 활성을 저해하고; (c) FAP 결합 활성을 유지할 수 있었다.
도 4a는, 스트렙타비딘 센서 상에 고정되고 생체층 간섭계로 측정된 비오틴화된 IL-2에 대한 D002의 1가 Fab-Fc 융합체의 결합 동역학을 보여주고, 도 4b는, 평형 결합 분석으로 측정 시 D002와 IL-2의 상호작용에 대한 KD 값이 3.4 μM이었음을 보여준다. 도 4c는, 스트렙타비딘 센서 상에 고정되고 생체층 간섭계로 측정된 FAP에 대한 D002의 1가 Fab-Fc 융합체의 결합 동역학을 보여준다. D002와 FAP의 상호작용에 대한 KD 값은 50 nM이었다(데이터는 제시되지 않음).
6.2.7 항체 변이체의 생성
분자의 활성에 면역접합체의 분자 입체배치가 미치는 가능한 영향을 조사하기 위해, 출발 항-FAP 항체(872-5, 872-59 및 872-70)와 3가지 변이체(D001, D002 및 D029)에 대해, 각각, Fab 변이체와 scFv 변이체를 생성하였다.
특히, 항체의 Fab 변이체와 scFv 변이체는 모 항체의 결합 서열을 조합하는 방식으로 재조합적으로 생산하였다. 또한, 합성 VHH 파지 라이브러리에서 파지 디스플레이 패닝을 통해 단일 도메인 항-FAP 항체(VHH6으로 지정됨)를 생성하였다. Fab 기반 파지 라이브러리에 대해 기재된 바와 동일한 절차를 사용하여 파지 패닝을 수행하였다. 표 11은, 본 연구에서 생성된 변이체의 유형, 에피토프 빈(epitope bin) 및 생성된 변이체에 대해 측정된 결합 친화도를 요약한 것이다.
[표 11]
6.2.8 친화도 성숙
고정 아암(anchoring arm)의 친화도 성숙. 872-5 단클론 항체의 친화도 성숙은 차세대 시퀀싱을 통해 얻은 CDR 내 아미노산 서열 분포를 통해 확인할 수 있었다. 간략하게, 파지 패닝과 결합된 포화 돌연변이유발 후, 872-5의 CDR 내 4개의 위치에 모 잔기와 상이한 아미노산이 농축되어 있다는 것을 관찰하였다. 이러한 돌연변이체에는, VL A91G, VL R92T, VH S52G 및 VH Q96L이 포함되어 있었다. 단일 돌연변이체를 섹션 6.1.3에 기재된 바와 같이 생체층 간섭계로 인간 FAP에 대한 결합에 대해 시험하고, KD가 약 3배 내지 9배 개선된 것을 확인하였다(표 12). 이어서, 단일 점 돌연변이체를 조합하여 이중, 삼중 및 사중 돌연변이의 7가지 조합을 생성하였다. 관찰된 최고 친화도는 100 pM 미만이었으며, 모 872-5에 비해 친화도가 80배 초과로 개선되었다.
[표 12]
이중특이적 항체의 친화도 성숙. IL-2에 대한 결합을 유지하면서 FAP에 대한 결합을 복원하는 D029 변이체의 친화도 성숙은 차세대 시퀀싱을 통해 확인할 수 있었다. mAb 872-5, 872-59 및 872-70에 대해 기재된 방법과 유사하게 Kunkel 돌연변이유발을 통해 mAb D029의 CDR의 포괄적인 돌연변이유발을 수행하였다. 파지 패닝과, NGS 라이브러리 제작 및 분석 후, CDR의 아미노산 내 서열 분포를 872-70(D029의 모 단클론 항체)과 비교하였다. mAb D029의 서열과 mAb 872-70의 서열 사이의 차이를 평가하고, 일련의 복귀 돌연변이를 생성하였다. 결합을 시험하고 면역사이토카인 작제물로 재형식화하기 위해 이러한 돌연변이체를 단클론 항체 형식과 Fc-Fab 형식으로 재형식화하였다. 나아가, 표시된 차세대 시퀀싱이 872-70 또는 D029에 본래 존재하지 않았던 2개의 항원 사이에서 호환 가능했던 일련의 돌연변이를 생성하였다. D029의 이러한 돌연변이체를 섹션 6.1.3에 기재된 바와 같이 생체층 간섭계로 소규모 미정제 용해물과 정제된 형태에서의 결합에 대해 시험하였다(표 13).
[표 13a]
[표 13b]
6.3 실시예 3: 재조합 항체-사이토카인 면역접합체의 생성
6.3.1 상이한 분자 입체배치를 갖는 항체-사이토카인 면역접합체 단백질의 생성
도 5b 내지 도 5u에 예시된 바와 같은 상이한 분자 입체배치를 갖는 항체-사이토카인 면역접합체를 재조합적으로 생성하고, 차폐 및 차폐 해제 능력에 대해 스크리닝하였다(표 14 참조). 특히, 면역접합체의 DNA 서열을 코돈 최적화하고, 분비된 단백질로서 신호 펩타이드를 갖는 pcDNA3.4 벡터(Thermofisher)에 클로닝하였다. 각각의 펩타이드 사슬을 독립적인 벡터에 클로닝하였다. 융합 접합 시, CH3 도메인의 C-말단 리신 잔기가 제거되었다. 단백질을 Expi293F 발현 시스템(Thermofisher)에서 발현시키고, Fc 함유 단백질을 MonoA(Genescript) 단백질 A 친화도 수지를 이용하여 정제하였다. 간략하게, 개별 사슬의 플라스미드를 동일한 질량비로 조합하고, ExpiFectamine을 사용하여 Expi293F 세포에 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 후 약 18시간 동안 세포를 공급하고, 발현 후 5일 내지 7일 이내에 4000 rpm으로 5분 동안 원심분리하는 방식으로 상청액을 수확하였다. MonoA 수지를 상청액과 함께 인큐베이션하고 세척한 후, 단백질을 0.1 아세트산(pH 4.0)으로 용리하고, 1/5 부피의 1 M Tris(pH 8.0)를 이용하여 중화시키고, PBS(pH 7.4)로 투석하였다.
[표 14]
6.3.2 Fc 변이체의 생성
면역접합체 분자의 이종이량체 Fc를 놉인홀 돌연변이를 도입하는 방식으로 변형시켰다. 특히, 일부 실시형태에서, 돌연변이는 하나의 Fc 서브유닛에서는 S354C와 T366W였고, 다른 하나의 Fc 서브유닛에서는 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V였다. 나아가, 스크리닝 목적으로 Fc 이펙터 활성을 감소시키기 위해, P329G, L234A 및 L235A의 돌연변이 세트를 두 개의 Fc 서브유닛에 모두 도입하였다.
6.3.3 Fc 수용체에 대한 돌연변이형 Fc 항체 결합의 결정
Fc 돌연변이체 세트를 표 15에 제시된 바와 같이 FcR 수용체에 대한 Fc 결합을 폐지하는 이러한 돌연변이의 능력에 대해 평가하였다. 후속 시험을 위해 삼중 돌연변이 P329G, L234A 및 L235A를 Fc 도메인에 혼입시켰다.
[표 15]
6.4 실시예 4:
6.4.1 생물리학적 특성
시차 주사 형광측정법은, 형광단이 온도 상승에 의해 유도된 변성된 단백질에 결합하는 동안의 형광 변화를 측정하였다. 간략하게, 2 μM 내지 20 μM 단백질을 완충 PBS 중에 총 부피 25 μL로 1X SYPRO Orange(Thermofisher cat: 56650)와 혼합하였다. 온도가 0.02℃/초의 속도로 25℃에서 95℃까지 증가하는 동안 QPCR 기기 Roche Light Cycler 480으로 형광을 모니터링하였다. 형광 강도의 1차 도함수를 온도에 대해 플롯팅하였으며, 여기서 음의 피크 온도는 용융 온도로 단백질 변성 과정을 나타낸다. 용융 온도가 높을수록, 단백질이 더 안정하다.
소수성 상호작용 크로마토그래피는 TSKgel Butyl-NPR(14947, TOSH Bioscience) 컬럼이 장착된 Agilent 1200 HPLC 시스템에서 수행하였다. 간략하게, 5 μg의 단백질 샘플(1 mg/mL)을 이동상 A 용액(1.8 M 황산암모늄과 0.1 M 인산소듐(pH 6.5))과 혼합하여, 분석 전 최종 황산암모늄 농도 약 1 M을 만들었다. 1 mL/분의 유량으로 20분에 걸쳐 이동상 A 용액과 이동상 B 용액(0.1 M 인산소듐(pH 6.5))의 선형 구배를 이용하여 280 nm에서 UV 흡광도를 모니터링하였다.
크기 배제 크로마토그래피는 TSKgel G3000SW(05789, TOSH Bioscience) 컬럼이 장착된 Agilent 1200 HPLC 시스템에서 수행하였다. 러닝(running) 완충액으로 유량 0.35 mL/분의 PBS를 사용하였고, 주요 피크를 기준으로 각 샘플에 대한 머무름 시간을 지정하였다.
SMAC 검정은 Zenix SEC-300 컬럼(213300-4630, Sepax Technologies)이 장착된 Agilent 1200 HPLC 시스템에서 수행하였다. 러닝 완충액으로 유량 0.35 mL/분의 PBS를 사용하였고, 주요 피크를 기준으로 각 샘플에 대한 머무름 시간을 지정하였다.
Gator 시스템(ProbeLife, USA)을 사용하여 생체층 간섭계(BLI)로 단백질-단백질 상호작용을 측정하였다. 간략하게, 광섬유를 스트렙타비딘, 항-인간 Fc 항체 등과 같은 포획 시약으로 코팅하였다. 이러한 기기는, 굴절률이 광섬유 끝 부분의 단백질 결합에 따라 변화할 때 파장 이동으로 빛의 간섭을 정확하게 측정할 수 있다. 파장 이동의 동역학과 진폭은 단백질-단백질 상호작용의 방식을 직접적으로 반영한다. 예를 들어, 도 15에는 5단계 실험이 제시되어 있다. 제1 단계에서, 스트렙타비딘으로 코팅된 광섬유를 PBST-0.5% BSA에 침지시켜 평형화시켰다. 제2 단계에서, 광섬유를 50 nM 비오틴화된 5UTZ 분자에 침지시켜 센서의 표면에 5UTZ를 로딩하였다. 제3 단계에서, 광섬유를 PBST-0.5% BSA에 침지시켜 평형화시켰다. 제4 단계에서, 광섬유를 100 nM FB-604 + 100 nM Fc-hFAP과 같은 단백질 혼합물에 침지시켰다. 제5 단계에서, 광섬유를 PBST-0.5% BSA에 침지시켜 해리시켰다.
4가지 면역접합체 분자 FB-604, FB-675, FB-676, FB-626을 가용성 Fc-hFAP의 존재 또는 부재 하에서 5UTZ에 결합하는 능력에 대해 시험하였다. 도 15에 제시된 바와 같이, 가용성 Fc-hFAP의 부재 하에서, 4가지 면역접합체 분자 중 어느 것도 5UTZ에 결합할 수 없었으며, 이는 사이토카인 IL-2hex가 분자내 상호작용을 통해 투인원 항체에 의해 차폐되었음을 시사한다. 가용성 Fc-hFAP의 존재 하에서, 3가지 면역접합체 분자 FB-604, FB-675 및 FB-676은 5UTZ에 결합할 수 있었으며, 이는 가용성 FAP이 투인원 항체와의 결합에 대해 IL-2와 경쟁하여 분자내 상호작용을 통해 IL-2를 방출시키고 5UTZ에 결합할 수 있게 됨을 나타낸다. 도 16에 제시된 바와 같이, 5UTZ는 hFAP이 아니라 IL2hex에 특이적으로 결합한다.
6.4.2 생체내 반감기
건강한 C57BL/6 마우스에서 관심 분자의 약동학을 측정하였다. 마우스에 목적하는 양(50 μg 내지 900 μg)의 분자를 150 μL의 부피로 저속 푸시(slow push)를 사용하여 꼬리 정맥에 주사하였다. 다양한 시점에, 안와후 출혈로 소량의 혈액 샘플(20 μL 내지 100 μL)을 취하여, 응고를 방지하기 위해 헤파린으로 코팅된 튜브에 수집하였다. 원심분리하여 세포를 제거한 후, 포획 항체로 염소 항-인간 IgG, IgM, IgA(H+L) 항체(A18849, Invitrogen)를 이용하고 검출 항체로 염소 항-인간 IgG Fc Cross-Absorbed HRP(A18823, Invitrogen)를 이용하여 ELISA로 혈장을 검정하였다. 결과를 주사 직후 취한 각 마우스의 혈청 내 초기 농도로 정규화하였다. 도 7a에 제시된 바와 같이, Fc 도메인에 융합된 IL-2를 함유하는 대조군 분자(Knob-IL2Hex)의 반감기는 1.4일이었다. 시험된 면역접합체 분자는 모두 약 5일 내지 10일로 연장된 반감기를 나타냈으며, 이는 인간 IgG의 반감기와 비슷하였다. 최대 혈청 농도와 반감기를 분석하고, 표에 기록하였다. 900 μg 용량의 혈청 농도(마우스에서 45 mg/kg에 해당함)는 90 μg 용량에서부터 비례적으로 확대되었는데, 이는 90 μg 용량이 표적 매개 약물 배치(TMDD)를 초과하였으며, 면역사이토카인 분자 내 투인원 항체의 존재가 생체내에서 사이토카인 폴리펩타이드 IL2hex와 이의 수용체의 결합을 효과적으로 차폐했음을 시사한다.
6.5 실시예 5: 활성 검정
6.5.1 세포 기반 IL-2 신호전달 검정
HEK Blue IL-2 리포터 세포주(Cat#: hkb-il2, InVivogen)를 표면에서 고친화도 인간 IL-2 수용체(CD25, CD122 및 CD132)를 이용하여 조작하였다. IL-2에 대한 용량 의존적 반응은 세포 배양물의 상청액 중 분비된 배아 알칼리성 포스파타아제(SEAP)의 수준과 상관관계가 있었으며, 이러한 수준은 이후에 효소 검정을 사용하여 검정하였다. 본 연구에서, 제조업체 제공 설명서에 따라 QUANTI-Blue 완충액과 기질을 사용하여 IL-2 활성을 검정하였다. EC50 농도는 최소 제곱 분석(엑셀의 TREND 분석)을 사용하여 계산하였다.
특히, IL-2 활성을 검정하기 위해, 20,000개의 HEK Blue IL-2 세포를 편평 바닥 96웰 플레이트에서 배양하고, 네이키드 IL-2 폴리펩타이드 또는 IL-2 함유 면역접합체 분자를 세포 배양물에 표시된 농도 구배로 첨가하였다. 20시간 인큐베이션 후, 세포 배양물의 상청액 20 μL를 180 μL의 QUANTI-Blue 완충액(Cat#: rep-qbs, InVivoGen)에 첨가하고, 반응액을 37℃에서 1시간 내지 3시간 동안 인큐베이션하였다. TECAN 플레이트 판독기를 사용하여 635 nm에서의 흡광도(A635)를 측정하였는데, 이는 SEAP 수준과 IL-2에 대한 용량 의존적 반응을 반영하였다.
IL-2 함유 면역접합체 분자의 효능에 대한 가용성 인간 섬유아세포 활성화 단백질(hFAP)의 영향을 검정하기 위해, 20,000개의 HEK Blue IL-2 세포를 편평 바닥 96웰 플레이트에서 배양하였다. 가용성 hFAP을 세포 배양물에 200 nM 또는 2 μM의 시험 농도로 첨가하고, IL-2 함유 면역접합체 분자를 세포 배양물에 표시된 농도 구배로 첨가하였다. 20시간 인큐베이션 후, 세포 배양물의 상청액 20 μL를 180 μL의 QUANTI-Blue 완충액(Cat#: rep-qbs, InVivoGen)에 첨가하고, 반응액을 37℃에서 1시간 내지 3시간 동안 인큐베이션하였다. TECAN 플레이트 판독기를 사용하여 635 nm에서의 흡광도(A635)를 측정하였는데, 이는 SEAP 수준과 IL-2에 대한 용량 의존적 반응을 반영하였다.
IL-2 함유 면역접합체 분자의 효능에 대한 hFAP 발현 세포의 영향을 검정하기 위해, 20,000개의 HEK Blue IL-2 세포를 20,000개의 HEK293T 세포 또는 표면에서 hFAP을 발현하는 20,000개의 HEK293T 세포(HEK 293T-hFAP-E5 세포)와 함께 편평 바닥 96웰 플레이트에서 공동 배양하였다. IL-2 함유 면역접합체 분자를 세포 배양물에 표시된 농도 구배로 첨가하였다. 20시간 인큐베이션 후, 상청액 20 μL를 180 μL의 QUANTI-Blue 완충액(Cat#: rep-qbs, InVivoGen)에 첨가하고, 반응액을 37℃에서 1시간 내지 3시간 동안 인큐베이션하였다. TECAN 플레이트 판독기를 사용하여 635 nm에서의 흡광도(A635)를 측정하였는데, 이는 SEAP 수준과 IL-2에 대한 용량 의존적 반응을 반영하였다.
6.5.1.1 면역접합체 분자의 분자내 상호작용을 통한 사이토카인 활성의 저해
본 개시내용에 따른 면역접합체 분자 내 사이토카인 활성의 분자내 저해를 조사하기 위해, 도 5b와 도 5c(또는 도 8b와 도 8c)에 제시된 바와 같은 입체배치 1과 입체배치 2의 IL-2 함유 면역접합체 분자를 작제하고, 상기 기재된 바와 같이 세포 기반 IL-2 신호전달 검정에 적용하고, 결과를 도 8a에 표시하였다.
특히, 본 연구에서, 모든 면역접합체 분자는 2개의 폴리펩타이드 사슬의 이량체화를 촉진하는 놉인투홀 변형을 갖는 2개의 동일하지 않은 서브유닛을 갖는 Fc 도메인을 함유하고 있었다. 입체배치 1의 면역접합체 분자(원)는 Fc 서브유닛 중 하나의 C-말단에 융합된 IL-2 폴리펩타이드를 함유하고 있었다. 입체배치 2의 면역접합체 분자(원)는 하나의 Fc 서브유닛의 C-말단에 융합된 IL-2 폴리펩타이드와, 다른 하나의 Fc 서브유닛의 C-말단에 융합된 항-IL-2/항-FAP 이중특이적 Fab(또는 대조군 항체)을 함유하고 있었다. 특히, 본 연구에서 입체배치 2의 4가지 상이한 면역접합체 분자를 작제하였는데, 이 중 2개는, 각각, D001 항체(아래쪽 삼각형)와 D002 항체(다이아몬드)에서 유도된 상이한 항-IL-2/항-FAP 이중특이적 Fab 분자를 함유하고 있었다. 양성 대조군으로서, 입체배치 2의 제3 면역접합체 분자는 이중특이적 항체 대신 IL-2 신호전달을 저해할 수 있는(데이터는 제시되지 않음) 특정한 항-IL-2 Fab 항체(155-01; 삼각형)를 함유하고 있었으며, 음성 대조군으로서, 입체배치 2의 제4 면역접합체 분자는 이중특이적 항체 대신 IL-2 또는 FAP에 대한 검출 가능한 결합을 나타내지 않는(데이터는 제시되지 않음) Fab 분자(D003; 좌향 삼각형)를 함유하고 있었다. 네이키드 IL-2 폴리펩타이드(Sino Biological, Beijing, China)를 함유하는 샘플을 또한 음성 대조군(정사각형)으로 포함시켰다.
도 8a에 제시된 바와 같이, 네이키드 IL-2 폴리펩타이드(정사각형)와 시험된 입체배치 1의 면역접합체 분자(원)는 리포터 세포주에서 IL-2에 대해 유사한 용량 의존적 반응을 나타냈으며, 결과는 면역접합체 분자 내 차폐 모이어티의 결여와 일치하였다. 대조적으로, 시험된 입체배치 2의 면역접합체 분자(삼각형, 역삼각형, 다이아몬드)는 각각 유의하게 IL-2 활성을 저해하였는데, 이는 이러한 면역접합체 분자 내 이중특이적 항체와 IL-2 사이의 분자내 결합이 존재함을 시사한다.
상기 데이터는, 본 개시내용의 면역접합체 분자 내 사이토카인이 세포 표면 수용체를 활성화시키고 세포 반응을 유도하는 기능을 보유한다는 것을 입증한다. 나아가, 면역접합체 분자 내 이중특이적 항체(즉, 차폐 모이어티)는 사이토카인과 결합하여, 사이토카인 활성을 저해할 수 있다.
6.5.1.2 면역접합체 분자의 분자 입체배치는 사이토카인의 세포내 저해 효과에 영향을 미친다
본 개시내용에 따른 면역접합체 분자의 분자 입체배치(상이한 구성요소의 배향, 배열 및 형식 포함)가 관찰된 사이토카인 활성의 분자내 저해에 영향을 미치는지를 조사하기 위해, 도 5b, 도 5c 및 도 5e(또는 도 9b, 도 9c 및 도 9d)에 제시된 바와 같은 입체배치 1, 입체배치 2 또는 입체배치 4를 갖는 면역접합체를 작제하고, 상기 기재된 바와 같이 세포 기반 IL-2 신호전달 검정에 적용하고, 결과를 도 9a에 표시하였다.
특히, 본 연구에서, 모든 면역접합체 분자는 2개의 폴리펩타이드 사슬의 이량체화를 촉진하는 놉인투홀 변형을 갖는 2개의 동일하지 않은 서브유닛을 갖는 Fc 도메인을 함유하고 있었다. 입체배치 1의 면역접합체 분자(정사각형)는 Fc 서브유닛 중 하나의 C-말단에 융합된 IL-2 폴리펩타이드를 함유하고 있었다. 입체배치 2의 면역접합체 분자(원)는 하나의 Fc 서브유닛의 C-말단에 융합된 IL-2 폴리펩타이드와, 다른 하나의 Fc 서브유닛의 C-말단에 융합된 항-IL-2/항-FAP 이중특이적 Fab을 함유하고 있었다. 입체배치 4를 갖는 면역접합체 분자(역삼각형)는 항-IL-2/항-FAP 이중특이적 Fab을 함유하고 있었으며, 여기서 Fab 중쇄의 N-말단은 Fc 서브유닛 중 하나의 C-말단에 융합되어 있고, IL-2 폴리펩타이드는 Fab 경쇄의 N-말단에 융합되어 있었다. 특히, 본 연구에서, 입체배치 2와 입체배치 4 둘 모두의 항-IL-2/항-FAP 이중특이적 Fab은 D001 항체에서 유도된 것이었다.
도 9a에 제시된 바와 같이, 입체배치 1의 면역접합체(정사각형)는 리포터 세포주에서 IL-2에 대한 용량 의존적 반응을 나타냈다. 대조적으로, 입체배치 2의 면역접합체(원)와 입체배치 4의 면역접합체(역삼각형)는 모두 IL-2 활성을 유의하게 저해하였다. 나아가, 입체배치 4의 면역접합체(역삼각형)는 입체배치 2의 면역접합체(원)와 비교하여 IL-2 활성을 차단하는 데 더 효과적이었다. 이러한 데이터는, 면역접합체의 분자 입체배치가 차폐 모이어티와 사이토카인 사이의 분자내 상호작용의 효과에 영향을 미칠 수 있지만, 관찰된 사이토카인 저해는 본 연구에서 시험된 특정 분자 입체배치를 필요로 하지 않는다는 것을 시사한다.
6.5.1.3 생체내에서 사이토카인의 독성을 감소시키는 사이토카인의 세포내 저해
사이토카인에 대한 투인원 항체의 분자내 상호작용은 HEK Blue IL-2 검정, CTLL2 증식 검정 및 인간 CD4+ 증식 검정에서 입증된 바와 같이 시험관내 효능을 저해할 수 있다. 이러한 기능적 저해가 생체내에서 얼마나 관련이 있는지를 결정하기 위해, 마우스에서 급성 독성을 조사하였다.
고용량 IL-2 처리는 마우스에 치명적일 수 있는 것으로 보고되었다. 먼저, C57BL/6J 마우스와 CB-17 SCID 마우스 모두에게 2주 동안 1주일에 5일 동안 매일 네이키드 사이토카인 Knob-IL2hex를 투여하였다. 사망과 체중 손실로 관찰된 독성은 문헌(예를 들어, 문헌[Clin Cancer Res 17(11) 3673-85, 2011])에 보고된 결과와 일치하였다. 비교를 단순화하기 위해, 후속 급성 독성 연구를 위해 C57BL/6J 마우스를 선택하였다. 두 번째로, 2가지 면역접합체 분자(#449와 #476)를 Knob-IL2hex 및 시판용 대조군 #439 Akrevia-IL2hex와 함께 C57BL/6J에서 독성에 대해 평가하였다. Knob-IL2hex는 1주일 이내에 25 μg/용량/일에서 50 μg/용량/일로 독성의 증가를 나타냈지만, 다른 3가지 분자는 모두 25 μg/용량/일의 4배 몰 등가량인180 μg/용량/일에서 어떠한 독성의 징후도 나타내지 않았다. 이러한 실험은 4가지 면역접합체 분자 모두에 대해 최대 허용 용량에 도달하지 못했지만, 면역접합체 분자 내 투인원 항체가 IL-2의 독성을 유의하게 저해하였다는 것을 입증하였다(도 30). 면역접합체 분자의 반감기가 Knob-IL2hex와 비교하여 약 5배 연장되었음을 입증한 약동학 데이터와 함께 고려하면, 4배 몰 등가 용량에서 독성의 징후가 없었다는 것은 안전성 프로파일이 10배 초과로 개선되었음을 나타낸다.
6.5.1.4 가용성 항원은 고정되지 않은 면역접합체 분자에서 사이토카인 활성을 활성화하지 않는다
본 개시내용의 면역접합체 분자 내 사이토카인 활성의 활성화를 입증하기 위해, 먼저, 가용성 항원이 차폐 모이어티와의 결합에 대해 경쟁하고, 결합되지 않은 형태의 사이토카인을 방출하여 사이토카인 활성을 활성화시킬 수 있는지를 조사하였다. 하나의 연구에서, 도 5b와 도 5c(또는 도 10b와 도 10c)에 제시된 바와 같은 입체배치 1과 입체배치 2를 갖는 면역접합체 분자를 작제하고, 가용성 인간 섬유아세포 활성화 단백질(hFAP)의 존재 하에서 세포 기반 IL-2 신호전달 검정에 적용하고, 결과를 도 10a에 표시하였다.
특히, 본 연구에서, 모든 면역접합체 분자는 2개의 폴리펩타이드 사슬의 이량체화를 촉진하는 놉인투홀 변형을 갖는 2개의 동일하지 않은 서브유닛을 갖는 Fc 도메인을 함유하고 있었다. 입체배치 1의 면역접합체 분자(흰색 정사각형)는 Fc 서브유닛 중 하나의 C-말단에 융합된 IL-2 폴리펩타이드를 함유하고 있었다. 입체배치 2의 면역접합체 분자는 하나의 Fc 서브유닛의 C-말단에 융합된 IL-2 폴리펩타이드와, 다른 하나의 Fc 서브유닛의 C-말단에 융합된 항-IL-2/항-FAP 이중특이적 Fab을 함유하고 있었다. 특히, 각각, 155_01 항체(X 표시가 있는 흰색 정사각형)와 D002 항체(청색 정사각형)에서 유도된 항-IL-2/항-FAP 이중특이적 Fab을 함유하는 입체배치 2의 2가지 상이한 면역접합체를 작제하였다. D002 Fab을 함유하는 면역접합체 분자를 가용성 hFAP의 부재(청색 정사각형), 또는 200 nM의 가용성 hFAP의 존재(분홍색 정사각형) 또는 2 μM의 가용성 hFAP의 존재(적색 정사각형) 하에서 시험하였다. 네이키드 IL-2 폴리펩타이드(Sino Biological, Beijing, China)를 함유하는 샘플(검은색 정사각형)을 양성 대조군으로 포함시키고, 가용성 hFAP을 함유하는 샘플(점선이 표시된 흰색 정사각형)을 음성 대조군으로 포함시켰다.
도 10a에 제시된 바와 같이, 본 연구에서, 모든 조건 하에서 시험된 입체배치 2의 면역접합체 분자는 네이키드 IL-2, 또는 차폐 모이어티가 결여된 입체배치 1의 면역접합체와 비교하여 IL-2 활성을 유의하게 저해하였다. 가용성 hFAP은 200 nM과 2 μM의 시험된 농도에서 IL-2의 관찰 가능한 활성화를 나타내지 않았으며, 이는 가용성 FAP이 항-IL-2/항-FAP 이중특이적 차폐 모이어티와의 결합에 대한 약한 경쟁자이기 때문에, 세포 표면에서 발현된 hFAP과 비교하여 분자내 저해 하에서 IL-2 활성을 활성화시키는 데 덜 효과적이었음을 시사한다. 이러한 데이터는 또한, 본 개시내용의 면역접합체 분자가 사이토카인과 차폐 모이어티 사이의 강력한 세포내 자가 상호작용을 통해 사이토카인 활성을 효과적으로 저해할 수 있기 때문에, 사이토카인 활성의 표적외 활성화와 뒤이은 부작용을 효과적으로 방지할 수 있다는 것을 입증한다.
6.5.1.5 고정된 면역접합체는 사이토카인 활성의 항원 의존적 활성화를 나타낸다
다음으로, 세포 표면에서 항원을 발현하는 세포를 사용하여 면역접합체 분자 내 사이토카인 활성의 항원 의존적 활성화를 조사하였다. 특히, 도 5b와 도 5d(또는 도 11b와 도 11c)에 제시된 바와 같은 입체배치 1과 입체배치 3을 갖는 면역접합체 분자를 작제하고, 인간 섬유아세포 활성화 단백질(hFAP)을 발현하는 HEK293T 세포의 존재 하에서 세포 기반 IL-2 신호전달 검정에 적용하고, 결과를 도 11a에 표시하였다.
특히, 본 연구에서, 모든 면역접합체 분자는 2개의 폴리펩타이드 사슬의 이량체화를 촉진하는 놉인투홀 변형을 갖는 2개의 동일하지 않은 서브유닛을 갖는 Fc 도메인을 함유하고 있었다. 입체배치 1의 면역접합체 분자(정사각형)는 Fc 서브유닛 중 하나의 C-말단에 융합된 IL-2 폴리펩타이드를 함유하고 있었다. 입체배치 3의 면역접합체 분자는 (a) 하나의 Fc 서브유닛의 C-말단에 융합된 IL-2 폴리펩타이드, (b) D002 항체에서 유도되고 다른 하나의 Fc 서브유닛의 C-말단에 융합된 항-IL-2/항-FAP 이중특이적 Fab, 및 (c) 872-5 항체에서 유도되고 Fc 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합된 항-FAP scFv 항체를 함유하고 있었다. 입체배치 1의 면역접합체를 FAP 발현 세포의 부재(정사각형) 하에서 시험하고; 입체배치 3의 면역접합체를 변형되지 않은 HEK293T 세포의 존재(원) 또는 표면에서 hFAP을 발현하는HEK293T 세포의 존재(삼각형) 하에서 시험하였다.
도 11a에 제시된 바와 같이, FAP 발현 세포의 부재 하에서, 입체배치 3의 면역접합체(원)는 차폐 모이어티가 결여된 입체배치 1의 면역접합체(정사각형)와 비교하여 IL-2 활성을 유의하게 저해하였다. IL-2 활성의 활성화는 입체배치 3의 면역접합체가 FAP 발현 세포와 접촉했을 때(삼각형) 관찰되었는데, 이는 세포 표면 항원이 사이토카인에서 해리되는 방향으로 이중특이적 차폐 모이어티를 이동시킴에 따라, 결합되지 않은 형태의 사이토카인을 방출시켜 이의 활성을 활성화시킬 수 있음을 시사한다.
6.5.1.6 사이토카인 활성의 항원 의존적 활성화는 항원이 농축된 세포 환경에서 면역접합체 분자의 고정화에 의해 촉진된다.
다음으로, 관찰된 사이토카인 활성화에 항원 발현 세포에 대한 면역접합체 분자의 결합이 필요한지를 조사하기 위해, 결합을 방해하기 위해 가용성 FAP 또는 경쟁 항체를 반응 시스템에 첨가하면서 상기 기재된 바와 같이 세포 기반 IL-2 신호전달 검정을 사용하여 사이토카인 활성화를 측정하고, 결과를 도 11d와 도 11e에 표시하였다.
특히, 하나의 연구에서, 입체배치 1의 면역접합체를 FAP 발현 세포의 부재(정사각형) 하에서 시험하였다. 입체배치 3의 면역접합체를 변형되지 않은 HEK293T 세포의 존재(원), 표면에서 hFAP을 발현하는 HEK293T 세포의 존재(청색 삼각형), 표면에서 hFAP을 발현하는 HEK293T 세포와, 시험된 면역접합체 분자와 동일한 농도의 가용성 hFAP의 존재(적색 삼각형), 또는 표면에서 hFAP을 발현하는 HEK293T 세포와, 각각, 2 nM 농도의 가용성 hFAP의 존재(육각형 크기 1), 20 nM 농도의 가용성 hFAP의 존재(육각형 크기 2), 200 nM 농도의 가용성 hFAP의 존재(육각형 크기 3) 및 2 μM 농도의 가용성 hFAP의 존재(육각형 크기 4) 하에서 시험하였다. 변형되지 않은 HEK293T 세포만 첨가된 반응액을 음성 대조군(삼각형)으로 포함시켰다.
도 11d에 제시된 바와 같이, FAP 발현 세포 존재 하에서의 가용성 FAP의 적정은 IL-2 활성의 용량 의존적 저해를 나타냈으며, 이는 가용성 항원 분자가 면역접합체와의 결합에 대해 세포 표면 항원 분자와 경쟁하여, 세포에 대한 면역접합체 분자의 결합을 방해하고 사이토카인 활성을 저해함을 시사한다.
두 번째 연구에서, 입체배치 1의 면역접합체를 FAP 발현 세포의 부재(정사각형) 하에서 시험하였다. 입체배치 3의 면역접합체를 변형되지 않은 HEK293T 세포의 존재(원), 표면에서 hFAP을 발현하는 HEK293T 세포의 존재(역삼각형), 또는 표면에서 hFAP을 발현하는 HEK293T 세포와, 각각 200 nM 비결합 항체의 존재(다이아몬드), 200 nM 872-5 항-FAP 항체의 존재(육각형) 또는 200 nM 872-70 항-FAP 항체의 존재(오각형) 하에서 시험하였다. 변형되지 않은 HEK293T 세포만 첨가된 반응액을 음성 대조군(삼각형)으로 포함시켰다.
도 11e에 제시된 바와 같이, 872-70 항체의 존재(오각형)와 872-5 항체의 존재(육각형)는 모두 항-FAP 항체의 부재(역삼각형) 하에서 측정된 IL-2 활성과 비교하여 IL-2 활성을 감소시켰다. 비-결합 항체가 첨가된 반응액(다이아몬드)에서는 저해가 관찰되지 않았다. 이러한 데이터는, 항-FAP 항체가 세포 표면 FAP과의 결합에 대해 면역접합체 분자와 경쟁하여, 세포에 대한 면역접합체 분자의 결합을 방해하고 사이토카인 활성을 저해함을 시사한다.
상기 연구는, 면역접합체 분자가 항원 발현 세포에 결합할 때, 본 개시내용의 면역접합체 분자 내 사이토카인 활성의 항원 의존적 활성화가 발생할 수 있음을 시사한다. 다음으로, 결합이 세포 표면 항원 분자에 대한 고정 모이어티의 결합에 의해 매개되는지를 조사하기 위해, 세 번째 연구에서, 고정 모이어티가 결여된 면역접합체 분자의 사이토카인 활성화를 측정하였다. 특히, 도 5b와 도 5c(도 12b와 도 12c)에 제시된 바와 같은 입체배치 1과 입체배치 2를 갖는 면역접합체 분자를 작제하고, 상기 기재된 바와 같이 세포 기반 IL-2 신호전달 검정에 적용하고, 결과를 도 12a에 표시하였다.
특히, 본 연구에서, 모든 면역접합체 분자는 2개의 폴리펩타이드 사슬의 이량체화를 촉진하는 놉인투홀 변형을 갖는 2개의 동일하지 않은 서브유닛을 갖는 Fc 도메인을 함유하고 있었다. 입체배치 1의 면역접합체 분자는 Fc 서브유닛 중 하나의 C-말단에 융합된 야생형 IL-2 폴리펩타이드(검은색 정사각형) 또는 돌연변이형 IL-2hex 폴리펩타이드(흰색 정사각형)를 함유하고 있었다. 입체배치 2를 갖는 면역접합체 분자(흰색 삼각형, 검은색 삼각형)는 Fc 서브유닛 중 하나의 C-말단에 융합된 IL-2 폴리펩타이드와, 다른 하나의 Fc 서브유닛의 C-말단에 융합된 항-IL-2/항-FAP 이중특이적 Fab을 함유하고 있었다. 2가지 유형의 입체배치 1의 면역접합체를 변형되지 않은 HEK 293T 세포의 존재(흰색 정사각형, 검은색 정사각형) 하에서 시험하였다. 입체배치 2의 면역접합체를 변형되지 않은 HEK 293T 세포의 존재(흰색 삼각형) 또는 세포 표면에서 hFAP을 발현하는 HEK 293T 세포의 존재(검은색 삼각형) 하에서 시험하였다.
도 12a에 제시된 바와 같이, 두 가지 유형의 입체배치 1의 면역접합체는 모두 리포터 세포주에서 IL-2에 대해 용량 의존적 반응을 촉발시켰으며, 결과는 이러한 분자 내 차폐 모이어티의 결여와 일치하였다. FAP 발현 세포가 있거나 없는 입체배치 2의 면역접합체는 모두 IL-2 활성을 유의하게 저해하였으며, 이는 분자내 상호작용과 항-IL-2/항-FAP 이중특이적 Fab에 의한 IL-2의 저해를 나타낸다. 특히, FAP 발현 세포가 있는 경우(검은색 삼각형) 또는 FAP 발현 세포가 없는 경우(흰색 삼각형) 관찰된 저해 사이에 유의한 차이가 없었는데, 이는 이러한 분자 내 고정 모이어티의 결여로 인해 항원 의존적 IL-2 활성화가 폐지되었음을 시사한다.
이러한 연구는, 세포 표면 항원에 대한 면역접합체 분자의 고정 모이어티의 결합이 항원이 농축된 세포 환경에서 면역접합체 분자를 고정시킬 수 있기 때문에, 항원과 결합하는 방향으로 면역접합체 분자의 이중특이적 차폐 모이어티를 이동시키고, 사이토카인을 방출시켜 이러한 세포 환경에서 세포 기능을 활성화시킬 수 있음을 시사한다.
6.5.1.7 사이토카인 활성의 활성화와 저해에 대한 투인원 항체 내 친화도의 영향
IL2hex에 대한 D002의 친화도는 상대적으로 약하지만(KD = 약 3.4 μM), D002는 사이토카인 활성을 효과적으로 저해할 수 있었으며, 사이토카인은 입체배치 2를 갖는 면역접합체 분자에서 약 1 nM의 KD로 약 300배 초과로 더 단단하게 이의 수용체에 결합하였다. 분자내 상호작용이 분자간 상호작용보다 우세하고, 사이토카인 활성에 대한 효과적인 분자내 저해에 필요한 친화도는 상대적으로 낮으며, 입체배치 2의 경우 μM 범위의 KD 값이면 충분한 것으로 보인다. D002는 hFAP에 높은 친화도(KD = 약 50 nM)로 결합하지만, D002를 갖는 면역접합체 분자는 hFAP 발현 세포에 의해 활성화될 수 없으며, D002와 IL2hex 사이의 저해성 분자내 상호작용과 경쟁하여 사이토카인 활성을 활성화시키기 위해 hFAP에 대한 sudo-분자내 상호작용(고정된 hFAP-고정 모이어티-D002)을 생성하기 위해서는 입체배치 3에서와 같은 고정 모이어티가 필요하다.
이러한 가설은, 1 μM 농도에서 hFAP에 대한 명백한 결합이 나타나지 않았지만, 약 431 nM의 KD로 IL2hex에 결합했던 또 다른 예시적인 이중특이적 투인원 항체 D029에 의해 뒷받침된다. IL2hex에 대한 KD가 약 3.4 μM인 D002를 참조하면, D029는 입체배치 2의 면역접합체 형식에서도 IL-2를 저해할 수 있을 것으로 예상된다. 하지만, 다소 예상외로, 차폐 모이어티로서 D029와 입체배치 3의 고정 모이어티를 갖는 면역접합체는 hFAP 발현 세포의 존재 하에서 사이토카인 활성을 활성화시킬 수 있다. hFAP에 대해, 하지만 hFAP의 상이한 에피토프에 대해 비슷한 친화도를 나타내는 scFv70과 scFv5를 함유하는 2개의 상이한 고정 모이어티를 시험하였다. 특히, scFv70은 D029와 동일한 에피토프에 결합하고, scFv5는 별개의 에피토프에 결합한다. 도 13a에 제시된 바와 같이, 상이한 고정 모이어티는 입체배치 3의 D029 함유 면역접합체 분자에서 사이토카인 활성의 활성화에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.
면역접합체 분자에서 사이토카인 활성의 저해 및 활성화 효과에 대해서는, 분자내 상호작용의 논리 요건을 충족시키는 것이 더 중요한 것으로 보이며, 활성화 신호(예를 들어, 종양 미세환경 내 종양 관련 항원) 또는 분자내 사이토카인과의 결합에 대한 투인원 항체의 친화도는 덜 중요한 것으로 보인다. 그럼에도 불구하고, 활성화 신호 또는 사이토카인에 대한 최적의 친화도 범위가 있어야 한다. 예를 들어, 사이토카인에 대한 매우 높은 결합 친화도는 사이토카인의 친화도를 영구적으로 저해할 수 있으며, 사이토카인에 대한 매우 낮은 친화도는 활성화 신호의 부재 하에서도 사이토카인 활성을 효과적으로 저해하지 못할 수 있다. 따라서, 입체배치 3의 면역접합체를 사용하여, hFAP에 대한 친화도가 1 nM 내지 10 μM 범위로 상이하고 IL2hex에 대한 친화도가 100 nM 내지 10 μM 범위로 상이한 D029 돌연변이체 세트를 생성하는 방식으로, D029의 활성화 신호 및 사이토카인에 대한 친화도의 기능성 결과를 시험하였다. D029 돌연변이체 세트에 대한 hFAP 발현 세포의 존재 또는 부재 하에서의 KD 값과 EC50 값은 표 13B에 제시되어 있다.
6.5.1.8 가용성 항원에 의한 면역접합체 분자 내 사이토카인 활성의 활성화
이론에 구애됨 없이, 면역접합체 분자가 동일한 Fc-hFAP 이량체에 결합할 수 있는 한, 사이토카인을 방출할 수 있어야 하는 분자내 상호작용이면 충분할 것으로 고려된다. 실제로, 고정 모이어티와 투인원 차폐 항체가 hFAP 상의 별개의 에피토프에 결합하는 경우, 긴 링커는 동일한 Fc-hFAP 분자에 대한 동시 결합을 가능하게 할 수 있다. 몇몇 면역접합체 분자를 작제하고, 면역접합체 분자를 가용성 Fc-hFAP과 접촉시키는 방식으로 저해된 사이토카인 활성이 방출될 수 있는지를 조사하였다. 시험된 면역접합체 분자에는, FB-604, FB-675, FB-676 및 FB-626이 포함되어 있었다.
생체층 간섭계를 이용한 생물리학적 특징분석으로 시험을 시작하였다. IL-2 결합 분자 5UTZ를 시약으로 사용하였다. 5UTZ에 의해 인식된 에피토프가 투인원 항체에 의해 차폐된 상기 면역접합체 분자에서는 5UTZ가 유리된 IL-2에 결합할 수 있지만, IL-2에는 결합할 수 없다. 비오틴화된 5UTZ를 먼저 센서에 고정시켰다. 이어서, 5UTZ가 IL-2에 결합할 수 있는지를 조사하기 위해 면역접합체 분자 단독 또는 가용성 Fc-hFAP의 복합체를 적용하였다. 도 17 내지 도 20에 제시된 바와 같이, 50 nM 단독에서 시험된 4가지 면역접합체 분자 모두 검출 가능한 수준으로 5UTZ에 결합할 수 없었으며, 이러한 결과는, IL-2가 투인원 항체에 의해 효과적으로 차폐되었음을 확인시켜 준다. 50 nM의 복합체에서, 3가지 면역접합체 분자, 즉, FB-604, FB-675 및 FB-675는 5UTZ에 대한 유의한 결합을 나타냈으며, 이는 투인원 항체에 의한 저해가 가용성 Fc-hFAP에 의해 경쟁적으로 이루어졌음을 시사한다. FB-604가 입체배치 2를 가지고 있고 고정 모이어티가 없기 때문에, 현재 실험은 앵커에 관한 질문에는 해답을 주지 못했다. 하지만, 하나의 시냅토카인인 FB-626은 차폐 해제의 효과를 나타내지 않았으며, hFAP에 대한 결합을 거의 감지할 수 없었다.
본 실험 세트는, hFAP 친화도가 너무 낮지 않는 한 가용성 hFAP이 사이토카인의 차폐 해제를 유도할 수 있다는 것을 보여준다.
6.5.1.9 다중 에피토프 면역접합체에서 IL-2 활성의 활성화
다음으로, 고정된 면역접합체 분자 내 사이토카인 활성의 항원 의존적 활성화가 항원(예를 들어, FAP)의 동일한 에피토프에 대한 고정 모이어티(예를 들어, 항-FAP 항체)와 차폐 모이어티(예를 들어, 항-IL-2/항-FAP 이중특이적 항체)의 결합을 필요로 하는지를 조사하기 위해, 도 5b와 도 5d(또는 도 21b와 도 21c)에 제시된 바와 같은 입체배치 1과 입체배치 3을 갖는 면역접합체 분자를 작제하고, 상기 기재된 바와 같이 세포 기반 IL-2 신호전달 검정에 적용하고, 결과를 도 21a에 표시하였다.
특히, 본 연구에서, 모든 면역접합체 분자는 2개의 폴리펩타이드 사슬의 이량체화를 촉진하는 놉인투홀 변형을 갖는 2개의 동일하지 않은 서브유닛을 갖는 Fc 도메인을 함유하고 있었다. 입체배치 1의 면역접합체 분자는 Fc 서브유닛 중 하나의 C-말단에 융합된 IL-2 폴리펩타이드를 함유하고 있었다. 입체배치 3의 면역접합체 분자는 (a) Fc 서브유닛 중 하나의 C-말단에 융합된 IL-2 폴리펩타이드, (b) 다른 하나의 Fc 서브유닛의 C-말단에 융합된 D002 항체에서 유도된 항-IL-2/항-FAP 이중특이적 Fab, 및 (c) Fc 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합된 항-FAP scFv 항체를 함유하고 있었다. 본 연구에 사용된 면역접합체 분자를 생성하기 위해 각각 872-5 항체와 872-70 항체에서 유도된 2가지 상이한 항-FAP scFv 항체를 사용하였다. 특히, 표 9에 제시된 바와 같이, 이중특이적 D002 Fab과 872-70 scFv는 FAP의 동일한 에피토프에 결합하지만, 872-5 scFv는 FAP의 상이한 에피토프에 결합한다. 입체배치 1의 면역접합체를 hFAP을 발현하는 세포의 부재(정사각형) 하에서 시험하였고; 입체배치 3의 면역접합체를 FAP 발현 세포의 존재(흰색 원: 872-5 scFv, 흰색 삼각형: 872-70 scFv) 또는 FAP 발현 세포의 부재(검은색 원: 872-5 scFv, 검은색 삼각형: 872-70 scFv) 하에서 시험하였다.
도 21a에 제시된 바와 같이, FAP 발현 세포의 부재 하에서, 입체배치 1의 면역접합체는 리포터 세포주에서 IL-2에 대한 용량 의존적 반응을 촉발시켰다(정사각형). 대조적으로, 두 가지 유형의 입체배치 3의 면역접합체는 모두 IL-2 활성을 유의하게 저해하였다(검은색 원, 검은색 삼각형). 분자가 FAP 발현 세포와 접촉할 때(흰색 원, 흰색 삼각형), 두 가지 유형의 입체배치 3의 면역접합체 모두에서 IL-2 활성의 강력한 활성화(최대 200배로 증강된 EC50 값, 데이터는 제시되지 않음)가 관찰되었다.
본 연구에서, 단일 에피토프 면역접합체(즉, 고정 모이어티와 차폐 모이어티가 동일한 에피토프에 결합함)와 이중 에피토프 면역접합체는 모두 강력한 사이토카인 활성화를 나타냈으며, 이는 사이토카인의 항원 의존적 활성화가, 항원의 동일한 에피토프 또는 상이한 에피토프를 인식하고 이에 결합하는 데 면역접합체 분자의 고정 모이어티와 차폐 모이어티를 필요로 하지 않는다는 것을 나타낸다.
도 22 내지 도 24에 제시된 바와 같이, 각각, scFv872-5, scFv872-59 및 scFv-70을 포함하는 3가지 고정 모이어티는 hFAP의 별개의 에피토프에 결합한다. 도면에 제시된 바와 같이, 시험된 모든 면역접합체 분자는 hFAP 발현 세포의 부재 하에서 사이토카인에 대해 유사한 차폐 효과를 나타냈다. 나아가, 두 가지 면역접합체 분자는 모두 hFAP 발현 세포의 존재 하에서 사이토카인 활성을 차폐 해제하고 활성화시킬 수 있었다. 따라서, 이러한 실험은, 에피토프 특이성이 면역접합체 분자 내 차폐 모이어티에 의한 사이토카인 활성의 차폐/차폐 해제 능력에 영향을 미치지 않는 것으로 보인다는 것을 입증하였다.
6.5.1.10 사이토카인 활성의 항원 의존적 활성화는 다양한 입체배치의 면역접합체 분자에서 발생한다
면역접합체 분자 내 사이토카인 활성의 항원 의존적 활성화가 분자의 임의의 특정 분자 입체배치를 필요로 하는지를 조사하기 위해 하기 연구를 수행하였다.
특히, 하나의 연구에서, 도 5b와 도 5f(또는 도 25b와 도 25c)에 제시된 바와 같은 입체배치 1과 입체배치 5를 갖는 면역접합체 분자를 작제하고, 상기 기재된 바와 같이 세포 기반 IL-2 신호전달 검정에 적용하고, 결과를 도 25a에 표시하였다.
본 연구에서, 모든 면역접합체 분자는 2개의 폴리펩타이드 사슬의 이량체화를 촉진하는 놉인투홀 변형을 갖는 2개의 동일하지 않은 서브유닛을 갖는 Fc 도메인을 함유하고 있었다. 입체배치 1의 면역접합체는 Fc 서브유닛 중 하나의 C-말단에 융합된 야생형 IL-2 폴리펩타이드(원) 또는 돌연변이형 IL-2hex 폴리펩타이드(정사각형)를 함유하고 있었다. 입체배치 5의 면역접합체(흰색 다이아몬드; 검은색 다이아몬드)는 (a) Fc 서브유닛 중 하나의 C-말단에 융합된 IL-2 폴리펩타이드, (b) 다른 하나의 Fc 서브유닛의 C-말단에 융합된 항-IL-2/항-FAP 이중특이적 Fab 항체, 및 (c) Fc 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합된 항-FAP 단일 도메인 항체를 함유하고 있었다. 2가지 유형의 입체배치 1의 면역접합체를 hFAP을 발현하는 세포의 부재 하에서 시험하였다. 입체배치 5의 면역접합체를 변형되지 않은 HEK293T 세포의 존재(흰색 다이아몬드) 또는 hFAP을 발현하는 HEK293T 세포의 존재(검은색 다이아몬드) 하에서 시험하였다.
도 25a에 제시된 바와 같이, 입체배치 1의 면역접합체는 리포터 세포주에서 IL-2에 대해 용량 의존적 반응을 촉발시켰으며(정사각형; 원), 결과는 이러한 분자 내 차폐 모이어티의 결여와 일치하였다. FAP 발현 세포의 부재 하에서, 입체배치 5의 면역접합체는 IL-2 활성을 유의하게 저해하였으며(흰색 다이아몬드), 면역접합체 분자가 FAP 발현 세포와 접촉할 때 IL-2 활성화가 관찰되었다(검은색 다이아몬드).
또 다른 연구에서, 도 5b와 도 5g(또는 도 26b와 도 26c)에 제시된 바와 같은 입체배치 1과 입체배치 6을 갖는 면역접합체 분자를 작제하고, 상기 기재된 바와 같이 세포 기반 IL-2 신호전달 검정에 적용하고, 결과를 도 26a와 도 26d에 표시하였다.
본 연구에서, 모든 면역접합체 분자는 2개의 폴리펩타이드 사슬의 이량체화를 촉진하는 놉인투홀 변형을 갖는 2개의 동일하지 않은 서브유닛을 갖는 Fc 도메인을 함유하고 있었다. 입체배치 1의 면역접합체는 Fc 서브유닛 중 하나의 C-말단에 융합된 야생형 IL-2 폴리펩타이드(원) 또는 돌연변이형 IL-2hex 폴리펩타이드(정사각형)를 함유하고 있었다. 입체배치 6의 면역접합체는 (a) Fc 서브유닛 중 하나의 C-말단에 융합된 IL-2 폴리펩타이드, (b) 다른 하나의 Fc 서브유닛의 C-말단에 융합된 항-IL-2/항-FAP 이중특이적 scFv 항체, 및 (c) Fc 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합된 항-FAP Fab 항체를 함유하고 있었다. 특히, 입체배치 6의 면역접합체를 작제하는 데 사용된 항-IL-2/항-FAP 이중특이적 scFv 항체는 D002 항체에서 유도된 것으로, 본 연구에서 사용된 입체배치 6의 면역접합체를 작제하는 데, 각각, 872-5, 872-59 및 872-70 항체에서 유도된 3가지 상이한 항-FAP Fab 항체를 사용하였다. 특히, 표 9에 제시된 바와 같이, D002 scFv는 872-59 Fab 및 872-70 Fab와 동일한 FAP 에피토프에 결합하고, 872-5 Fab은 상이한 FAP 에피토프에 결합한다. 2가지 유형의 입체배치 1의 면역접합체를 hFAP을 발현하는 세포의 부재 하에서 시험하였다(정사각형; 원). 입체배치 6의 면역접합체를 변형되지 않은 HEK293T 세포의 존재(검은색 역삼각형; 검은색 다이아몬드; 검은색 좌향 삼각형) 또는 hFAP을 발현하는 HEK293T 세포의 존재(흰색 역삼각형; 흰색 다이아몬드; 흰색 좌향 삼각형) 하에서 시험하였다.
도 26a와 도 26d에 제시된 바와 같이, 본 연구에서 시험된 3가지 유형의 입체배치 6의 면역접합체는 모두 FAP 발현 세포의 부재 하에서 IL-2 활성을 유의하게 저해하였다(검은색 다이아몬드, 검은색 역삼각형, 검은색 좌향 삼각형). 대조적으로, FAP 발현 세포와 접촉할 때, 이러한 분자는 모두 입체배치 1의 면역접합체와 비슷한 IL-2 활성의 활성화를 나타냈다(흰색 다이아몬드, 흰색 역삼각형, 흰색 좌향 삼각형).
상기 연구는, 본 개시내용의 면역접합체 분자 내 사이토카인 활성의 항원 의존적 활성화가 다양한 입체배치의 분자에서 일어날 수 있다는 것을 입증한다. 예를 들어, 면역접합체의 고정 모이어티와 차폐 모이어티는 각각의 조건 하에서 분자의 동일하거나 상이한 항원 에피토프를 인식하여 사이토카인 활성의 차폐와 활성화를 제공할 수 있다. 나아가, 면역접합체 분자의 고정 모이어티와 차폐 모이어티는 Fab, scFv, 단일 도메인 항체와 같은 다양한 형태의 항체 또는 이의 항원 결합 단편에서 독립적으로 선택할 수 있다. 본원에 기재된 연구에서 시험된 면역접합체의 예시적인 실시형태가 특정한 공통 구조적 특징(예를 들어, 놉인홀 변형을 함유하는 Fc 도메인)을 공유할 수 있지만, 본 개시내용에 기반하여, 당업자는 본원에 예시된 분자 입체배치에 대한 가능한 변형을 구상할 수 있을 것이며, 이러한 대안적인 실시형태는 본 개시내용의 일부로 간주되어야 한다.
이론에 구애됨 없이, 분자내 상호작용에 의해 저해 효과를 생성하기 위해서는, 본 발명의 면역접합체 분자의 차폐 모이어티와 사이토카인 모이어티가 서로 근접해야 하는 것으로 고려된다. 따라서, Fc 도메인의 N-말단에 사이토카인과 차폐 모이어티가 모두 융합된 면역접합체 분자의 대안적인 입체배치를 생성하고 시험하였다.
시험된 입체배치 중에서, 몇몇은 비슷한 차폐 및 차폐 해제 능력을 나타냈다. 예를 들어, 입체배치 15의 FB-707은 입체배치 3의 FB-676과 동일한 고정 모이어티 및 투인원 항체를 함유하고 있었다. 도 27a 내지 도 27c에 제시된 바와 같이, 두 가지 분자는 모두 hFAP 발현 세포 존재 하의 차폐 및 차폐 해제 효과에 있어서 유사한 거동을 나타냈다.
6.5.2 STAT5의 인산화를 통한 IL-2R 신호전달
활발하게 성장하는 1차 마우스 T세포를 먼저 IL-2가 결여된 마우스 T세포 배지에서 37℃에서 밤새 고갈시키고, 이어서 IL-2와 FBS가 모두 결여된 마우스 T세포 배지에서 37℃에서 2시간 동안 고갈시켰다. 세포를 펠릿으로 만들고, 50 μL의 가온된 배지 중에 초저결합 96웰 둥근 바닥 플레이트 내 웰당 5x105개 세포의 밀도로 플레이팅하였다. 야생형 또는 돌연변이형 IL-2의 연속 희석 용액 50 μL를 37℃에서 20분 동안 첨가하여 세포를 자극시키고, 1.5% 파라포름알데히드를 이용하여 교반 하에서 실온(RT)에서 10분 동안 고정시키는 방식으로 반응을 종결시켰다. 세포를 펠릿으로 만들고, 디캔팅하고, 얼음 위에서 200 μL의 100% 얼음-냉각된(ice-cold) 메탄올로 적어도 30분 동안, 또는 -80℃에서 밤새 인큐베이션하는 방식으로 투과성으로 만들었다. 고정되고 투과성으로 된 세포를 FACS 완충액으로 3회 세척하고, FACS 완충액 중 1:50으로 희석된 Alexa647 표지된 항-STAT5 pY694(Cat. 612601, BD Biosciences)를 이용하여 세포내 인산화된 STAT5를 검출하고, 암실에서 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 세척하고, 고처리량 오토샘플러(Beckman Coulter)가 장착된 CytoFLEX에서 분석하였다. 데이터는 야생형 IL-2에 대해 최대 강도로 정규화한 평균 형광 강도를 나타내며, 포인트들을 log(작용제) 대 반응(3개 매개변수) 모델로 핏팅하였다.
인간 CD4+ T세포는 인간 PBMC에서 음성 선별된 동결된 형태(Saily Bio, 중국)로 구입하였다. 인간 CD4+ 세포를 이전에 기재된 바와 같이(문헌[Smith GA et al. Science Signaling 10 eaan4931 (2017)]) 사전 활성화시켰다. 간략하게, 1천만 개의 동결된 인간 CD4+ 세포를 해동시키고, 5 ug/mL 항-CD3 항체 OKT3(MA1-10176, Thermofisher)과 0.5 ug/mL 항-CD28 항체(14-0289-82, Thermofisher)로 코팅된 6웰 플레이트에서 72시간 동안 사전 활성화시켰다. 세포를 수확하고, 100 U/mL IL-2와 함께 36시간 동안 배양한 후, pSTAT5 활성화 및 증식 검정 전 36시간 동안 IL-2 없이 배양하였다. pSTAT5 염색과 증식에 대한 프로토콜은 상기 CTLL2 세포에 대한 것과 동일하다.
6.5.2.1 가용성 항원에 의한 사이토카인 활성의 활성화 후 면역접합체 분자의 T세포 활성화
이론에 구애됨 없이, IL-2의 면역종양학 잠재력은 주로 T세포와 NK세포를 자극시키는 능력에서 발생한다. 최적화된 분자의 치료적 관련성과 작용 메커니즘을 탐구하기 위해서, hFAP의 존재 하에서 저해 및 차폐 해제의 정도를 결정하기 위해 하기 연구를 수행하였다.
특히, 사전 활성화된 인간 CD4+ 세포를 자극시키는 면역접합체 분자 FB-604, FB-674, FB-675 및 FB-676의 능력을 200 nM Fc-hFAP의 존재 또는 부재 하에서 측정하였다. 도 28a에 제시된 바와 같이, IL2hex의 효능은 고정 모이어티를 갖지 않는 면역접합체 분자 FB-604를 이용한 경우 약 2배 증가했으며, 고정 모이어티를 갖는 모든 다른 시험된 면역접합체 분자의 경우에는 약 10배 증가하였다.
도 28b는, pSTAT5 염색 검정을 사용하여 측정된 본 개시내용의 면역접합체 분자에 의한 인간 CD4+ T세포 활성화를 보여준다. 사전 활성화된 인간 CD4+ 세포를 자극시키는 면역접합체 분자 FB-801, FB-794, FB-818 및 FB-834의 능력을 200 nM Fc-hFAP의 존재 또는 부재 하에서 측정하였다. 도면에 제시된 바와 같이, IL2hex의 효능은 고정 모이어티를 갖는 모든 시험된 면역접합체 분자에 대해 약 30배 증가하였다.
도 29a는, pSTAT5 염색 검정을 사용하여 측정된 본 개시내용의 면역접합체 분자에 의한 인간 CD4+ T세포 활성화를 보여준다. 사전 활성화된 인간 CD4+ 세포를 자극시키는 면역접합체 분자 FB-611, FB-610, FB-609, FB-608, FB-607, FB-601, FB-600, FB-599, FB-598, FB-676, FB-675, FB-674 및 FB-604의 능력을 200 nM Fc-hFAP의 존재 또는 부재 하에서 측정하였다. 도 29b는, 도 29a의 검정으로 측정된 EC50 값의 정량을 보여준다.
6.5.2.2 IL-2 유도 T세포 증식 검정.
인간 CD4+ 세포에서의 pSTAT5 활성화 검정과 일치하게, IL-2hex 돌연변이체는 야생형 IL-2와 비교하여 EC50으로 측정 시 약 100배 더 낮은 효능을 나타냈으며, FB-794는 IL-2hex보다 약 100배 더 낮은 효능을 나타냈다. 가용성 Fc-hFAP은 효능의 약 5배 증가를 나타냈지만, 고정된 Expi-CHO-hFAP-B7의 존재는 100 pM에서 10 nM 범위로 효능을 유의하게 상승시켰다. 100 μL 중 50 k Expi-CHO-hFAP-B7은 약 1 nM hFAP에 해당하였다. 이는, FB-794의 효능이 Expi-CHO-hFAP-B7에 의한 차폐 해제 및 고정화에 의해 증강될 수 있다는 것과 일치했으며, 증강은 비슷한 양의 가용성 Fc-hFAP보다 훨씬 더 효과적이었다. Expi-CHO-hFAP-B7의 유효 용량을 초과하는 과량의 FB-794(>> 1 nM)가 존재하는 경우, 가용성 FB-794가 증식을 지배하였다. FB-794가 고 hFAP 발현 세포, IL-2 민감성 면역세포 및 높은 국소 농도의 FB-794로 이루어진 제한된 환경에서 고도로 강력할 것이라고 예상하는 것이 합리적이었다.
6.5.3 생체내 독성 연구
C57BL/6J 마우스와 CB-17 SCID 마우스를 사용하여 면역접합체 분자의 생체내 독성을 평가하였다. Knob-IL2hex는 3X(GGGGS) 링커를 통해 Fc-놉의 C-말단에 1가 IL2hex가 융합된 침묵 놉인홀 도메인을 함유하고, 분자량이 66.8 kDa이었다. C57BL/6J 마우스에, 2주 동안 매주 1일차, 2일차, 3일차, 4일차, 5일차에 0 μg, 10 μg, 25 μg, 50 μg/용량으로 Knob-IL2hex를 150 μL 부피의 꼬리 정맥을 통한 정맥내 주입으로 투여하였다. 사망은 매일 모니터링하고, 체중은 주중에 모니터링하였다. 25 μg 및 50 μg 투여량 군에서는 사망이 발생했지만, 0 μg 및 10 μg 용량 군에서는 발생하지 않았다. 10 μg, 25 μg 및 50 μg 투여량 군에서는 모두 유의한 체중 손실이 관찰되었다. 결과는 도 30의 상단 패널에 플롯팅되어 있다.
CB-17 SCID 마우스에, 2주 동안 매주 1일차, 2일차, 3일차, 4일차, 5일차에 0 μg, 5 μg, 10 μg, 30 μg/용량으로 Knob-IL2hex를 투여하였다. CB-17 SCID 면역손상된 마우스는 V(D)J 재조합의 결함을 함유하고, T세포와 B세포가 모두 결여되어 있었다. 5 μg, 10 μg 및 30 μg 투여량 군 모두에서 사망이 발생했으며, 10 μg 및 30 μg 용량에서는 유의한 체중 손실이 있었다. 결과는 도 30의 하단 패널에 제시되어 있다.
상기 연구에 기반하여, 관심 면역접합체 분자의 급성 독성을 연구하기 위해 C57BL/6J 마우스에서의 매주 1일차, 2일차, 3일차, 4일차, 5일차 25 μg/용량의 계획을 선택하였다.
면역접합체 분자의 생체내 독성을 평가하기 위해, 대조군(Knob-IL2hex, MW=66.8 kDa), FB-439(MW=92.3 kDa), FB-449(MW=120 kDa) 및 FB-476(MW=116 kDa)을 포함하는 4가지 샘플을 사용하였다. 특히, 대조군은 Fc-놉의 C-말단에 융합된 차폐되지 않은 IL2hex를 함유하고 있었고; FB-439는 차폐 모이어티로서 CD122와 Fc-놉의 C-말단에 융합된 IL2hex를 함유하고 있었고; FB-449는 D049 차폐 모이어티와 Fc-놉의 C-말단에 융합된 IL2hex를 함유하고 있었고; FB-476은 D047 차폐 모이어티와 D047의 경쇄의 N-말단에 융합된 IL2hex를 함유하고 있었다. 도 31a에 제시된 바와 같이, 샘플 내 면역접합체 분자는 예상한 바와 같이 각각 접합 도메인을 함유하는 온전하고 순수한 형태였다.
Knob-IL2WT와 함께 3가지 면역접합체 분자의 효능을 CTLL2 증식 검정, NK92 증식 검정 및 HEK Blue IL-2 활성화 검정으로 검정하였다. 도 31b 내지 도 31d에 제시된 바와 같이, 3가지 분자 FB-439, FB-449 및 FB-476은 모두 3가지 검정 모두에서 약 10배 내지 1000배 정도로 Knob-IL2hex의 유의한 효능 변화를 나타냈다. FB-476 형식의 D047은 FB-439 형식의 CD122와 비슷한 차폐 효과를 나타냈다.
C57BL/6J 마우스에, 4가지 샘플을 1일차, 2일차, 3일차, 4일차, 5일차 및 6일차에 투여하였다. 25 μg/용량으로 Knob-IL2hex의 투여는 1주 이내에 유의한 체중 손실과 사망을 동반하는 급성 독성을 생성하였다. 도 32에 제시된 바와 같이, 차폐 모이어티를 갖는 3가지 면역접합체 분자(FB-439, FB-449 및 FB-476)를 4배 몰농도 초과로 투여한 경우 체중 손실이나 사망의 징후가 전혀 나타나지 않았으며, 이는 차폐 모이어티의 존재가 마우스에서 급성 독성을 유의하게 감소시켰음을 나타낸다. 특히, 앞서 도 7a에서 입증된 바와 같이, FB-449는 이러한 투여 범위에서 Knob-IL2hex보다 약 8배 더 긴 반감기를 나타냈다. FB-449의 조합된 독성 프로파일은 독성의 증거 없이 면역사이토카인 노출을 30배 초과로 증가시켰다.
또 다른 생체내 독성 연구에서, 암컷 C57BL/6J 마우스에, IL-2 함유 면역접합체 분자를 5일 연속으로 꼬리 정맥 주사를 통해 투여하였다. 샘플은 IL-2 Fc 융합 단백질(10 μg 또는 50 μg), FB-439(140 μg), FB-476(180 μg)을 포함하고 있었으며, PBS 대조군과 비교하였다. 체중과 마우스 생존을 매일 측정하는 방식으로 면역사이토카인의 독성을 모니터링하였다. 도 32b에 제시된 바와 같이, 10 μg의 IL-2 Fc 융합체(sKnob-IL2hex)의 투여는 투여 직후 명백한 체중 손실을 초래하였지만, 최대 180 μg의 본 개시내용에 따른 IL-2 함유 면역접합체 분자의 투여는 관찰 가능한 체중 변화를 초래하지 않았으며, 이는 본원에 기재된 면역접합체 분자의 IL-2 독성이 유의하게 감소되었음을 입증한다.
6.5.4 IL-2 수용체(IL-2R) 결합 부위에 돌연변이를 갖는 IL-2 함유 면역접합체 분자에 의한 사이토카인 활성의 시험관내 항원 의존적 활성화
기능성 IL-2R의 상이한 서브유닛에 대한 면역접합체 분자의 IL-2 모이어티의 결합을 조절하여 IL-2 유도 세포 활성을 미세 조정할 수 있는지를 조사하기 위해 하기 연구를 수행하였다. IL-2 모이어티 내 상이한 돌연변이, 상이한 투인원 항체 및 상이한 앵커 아암을 함유하는 3가지 IL-2 함유 면역접합체 분자(#1097, 1112, 1150 및 1125)를 설계하였다.
면역접합체 분자 1150은 도 5o에 제시된 바와 같은 입체배치 14를 가지고 있었고, 1097, 1112 및 1125는 도 5p에 제시된 바와 같은 입체배치 15를 가지고 있었다. 구체적으로, 1112에서, IL-2 모이어티는 다수의 점 돌연변이(T3A, K35E, F42A, C125S)(여기서 F42A 돌연변이는 IL-2Rα 결합 부위에 영향을 미침)를 함유하고 있었으며, IL-2Rα에 대한 IL-2 모이어티의 결합이 약화되어 있었다. 차폐 모이어티는 IL-2 모이어티에 결합하고 IL-2Rβ에 대한 결합을 차단하는 IL-2/FAP 투인원 항체였다. 앵커 아암은 scFv-872-5였다. 1150에서, IL-2 모이어티는 다수의 점 돌연변이(D20T, K35E, C125S)(여기서 D20T 돌연변이는 IL-2Rβ 결합 부위에 존재함)를 함유하고 있었으며, IL-2Rβ에 대한 IL-2 모이어티의 결합이 약화되어 있었다. 차폐 모이어티는 IL-2 모이어티에 결합하고 IL-2Rα에 대한 결합을 차단하는 IL-2/FAP 투인원 항체였다. 앵커 아암은 VHH-E33이었다. 1097에서, IL-2 모이어티는 다수의 점 돌연변이(T3A, K35E, F42A, Y45A, L72G, C125S)(여기서 F42A, Y45A 및 L72G는 IL-2Rα 결합 부위에 존재함)를 함유하고 있었으며, IL-2Rα에 대한 IL-2 모이어티의 결합이 폐지되어 있었다. 차폐 모이어티는 IL-2 모이어티에 결합하고 IL-2Rβ에 대한 결합을 차단하는 IL-2/FAP 투인원 항체였다. 앵커 아암은 scFv-872-5였다. 1125에서, IL-2 모이어티는 다수의 점 돌연변이(T3A, D20T, K35E, C125S)(여기서 D20T는 IL-2Rβ 결합 부위에 존재함)를 함유하고 있었으며, IL-2Rβ에 대한 IL-2 모이어티의 결합이 약화되어 있었다. 차폐 모이어티는 IL-2 모이어티에 결합하고 IL-2Rα에 대한 결합을 차단하는 IL-2/FAP 투인원 항체였다. 앵커 아암은 scFv872-5였다.
야생형 IL-2 폴리펩타이드(Knob-IL2) 또는 돌연변이형 IL-2hex 폴리펩타이드(Knob-IL2hex)를 함유하는 입체배치 1의 IL2-Fc 융합 단백질을 양성 대조군으로 사용하였다. 면역접합체 분자 1097, 1112, 1150 및1125와 대조군 분자를 작제하고, 상기 기재된 바와 같이 hFAP을 발현하는 세포(HEK 293T-hFAP-E5) 또는 hFAP을 발현하지 않는 세포(HEK 293T)의 존재 하에서 세포 기반 IL-2 신호전달 검정에 적용하였다. 결과는 도 34a, 도 35a, 도 36a 및 도 37a에 제시되어 있다.
도 34a에 제시된 바와 같이, 면역접합체 분자 1097은 FAP 발현 세포의 부재 하에서 IL-2의 강력한 저해를 나타냈고(삼각형, 흰색 원), FAP 발현 세포의 존재 하에서 강력한 IL-2 활성을 나타냈으며(역삼각형), 여기서 활성 수준은 양성 대조군(원, 정사각형)과 비슷하였다. 유사하게, 도 36a와 도 37a에 제시된 바와 같이, 면역접합체 분자 1150과 1125는 FAP 발현 세포의 부재 하에서 IL-2의 강력한 저해를 나타냈고(삼각형, 다이아몬드), FAP 발현 세포의 존재 하에서 강력한 IL-2 활성을 나타냈으며(역삼각형), 여기서 활성 수준은 양성 대조군(원, 정사각형)과 비슷하였다. 대조적으로 도 35a에 제시된 바와 같이, 면역접합체 분자 1112에서 차폐 효과는 덜 우세하였다. 구체적으로, 이러한 분자는 FAP의 존재 또는 부재 하에서 유사한 IL-2 활성을 나타냈으며, 이러한 활성은 차폐 모이어티를 갖지 않는 대조군 분자와 유사하였다.
6.5.5 IL-2 함유 면역접합체 분자의 생체내 항종양 활성
다음으로, 종양 보유 마우스를 사용하여 IL-2 함유 면역접합체 분자 1097, 1112, 1150 및 1125의 생체내 항종양 활성과 독성을 평가하였다. 특히, FAP을 이소성으로 발현하는 1.5 x 106개의 MC-38 마우스 결장 선암종 세포(B-FAP-MC38, Biocytogen)를 암컷 C57BL/6J 마우스의 옆구리에 피하 이식하여 MC38-FAP 종양 모델을 생성하였다. 종양 크기는 캘리퍼로 모니터링하였다(종양 부피(mm3) = (길이(mm) x 폭(mm)2)/2). 종양을 처리 시작 전 약 100 mm3까지 성장시켰다. 0일차, 3일차 및 6일차에, 꼬리 정맥을 통한 정맥내 주사로 PBS, IL-2 Fc 융합체(12.5 μg 또는 25 μg), 및 면역접합체 분자 1097(55 μg 또는 220 μg), 1112(55 μg 또는 220 μg), 1150(55 μg) 및 1125(55 μg)의 투여를 수행하였다. 체중 손실이 체중의 15%를 초과하거나 군에서 사망이 발생하는 경우 투여를 종결하였다. 종양 크기는 2일 내지 3일마다 측정하고, 체중은 매일 측정하였다. 대조군으로서 역할을 하기 위해, 1097을 평가하기 위해 사용된 IL-2 Fc 융합체는 돌연변이 T3A/F42A/Y45A/L72G/C125S를 함유하는 IL-2hex였고, 1112를 평가하기 위해 사용된 IL-2 Fc 융합체는 돌연변이 T3A/F42A/K35E/C125S를 함유하는 돌연변이형 IL-2였고, 및 1150과 1125를 평가하기 위해 사용된 IL-2 Fc 융합체는 돌연변이 T3A/D20T/K35E/C125S를 함유하는 돌연변이형 IL-2였다. 결과는 도 34c, 도 35c, 도 36c 및 도 37d에 제시되어 있다.
도 34c에 제시된 바와 같이, 220 μg의 투여량으로 면역접합체 분자 1097("FB-1097")의 투여는 C57BL/6J 마우스에서 25 μg의 투여량으로 투여된 돌연변이형 IL-2hex(CTRLhex)와 비슷하게 종양 성장을 억제하였다. 구체적으로, 암컷 C57BL/6 마우스(처리군 당 n=3마리)에, 1백만 개의 MC38-FAP 세포를 각 마우스의 우측 옆구리에 피하로 접종하였다. 종양이 80 mm3 내지 100 mm3에 이르렀을 때, 처리를 개시하였다. 접종 후 0일차, 3일차 및 6일차에, 비히클(PBS), 25 μg CTRL-IL2hex, 55 μg FB-1097 및 220 μg FB-1097을 투여하였다. 25 μg CTRL-IL2hex 군과 220 μg FB-1097 군은 비히클과 비교하여 인식 가능하고 유사한 종양 퇴행을 나타냈다. 25 μg CTRL-hex 군은 최대 약 20%의 유의한 체중 손실을 나타냈지만, 220 μg FB-1097 군은 어떠한 인식 가능한 체중 손실도 나타내지 않았다. 이러한 데이터는, FB-1097이 유의한 독성 감소와 함께, 상응하는 IL-2 돌연변이체의 효능과 일치할 수 있음을 보여준다.
도 34d에 제시된 바와 같이, 220 μg의 투여량으로 FB-1097의 투여는 PBS가 투여된 마우스와 비교하여 MC38-FAP C57BL/6 마우스의 말초 혈액에서 면역세포의 어떠한 변화도 나타내지 않았다. 구체적으로, 0일차와 3일차에, C57BL/6 마우스에게 비히클(PBS), 12.5 μg CTRL-IL2 WT, 12.5 μg CTRL-IL2hex 및 220 μg FB-1097을 투여하였다. 5일차에 혈액 중 절대 세포수를 계수하였다. 12.5 μg CTRL-IL2WT 군과 12.5 μg CTRL-IL2hex 군은 모두 말초 혈액에서 면역세포의 유의한 증식을 나타냈다. 220 μg FB-1097 군은 면역세포의 어떠한 변화도 나타내지 않았다.
도 34e에 제시된 바와 같이, 220 μg의 투여량으로 면역접합체 분자 1097의 투여는 PBS가 투여된 마우스와 비교하여 C57BL/6 마우스에서 폐 중량의 어떠한 변화도 나타내지 않았다. 구체적으로, 0일차와 3일차에, C57BL/6 마우스에게 비히클(PBS), 12.5 μg CTRL-IL2 WT, 12.5 μg CTRL-IL2hex 및 220 μg FB-1097을 투여하였다. 5일차에 폐의 무게를 측정하였다. 12.5 μg CTRL-IL2WT 군과 12.5 μg CTRL-IL2hex 군은 모두 폐 중량으로 측정 시 폐 부종의 유의한 증가를 나타냈다. 220 μg FB-1097 군은 폐 중량의 어떠한 변화도 나타내지 않았다. 이러한 데이터는, 면역접합체 분자 1097의 투여가 부종을 유도하지 않았음을 보여준다.
도 35c에 제시된 바와 같이, 220 μg의 투여량으로 면역접합체 분자 1112("FB-1112")의 투여는 C57BL/6J 마우스에서 25 μg의 F42A 돌연변이를 갖는 돌연변이형 IL-2(CTRLF42A)와 비슷하게 종양 성장을 억제하였으며, 두 가지 마우스 군 모두 관찰 기간의 종료 시 종양 거부(100% CR)를 나타냈다. 구체적으로, 암컷 C57BL/6 마우스(처리군 당 n=3마리)에, 1백만 개의 MC38-FAP 세포를 각 마우스의 우측 옆구리에 피하로 접종하였다. 종양이 80 mm3 내지 100 mm3에 이르렀을 때, 처리를 개시하였다. 접종 후 0일차, 3일차 및 6일차에, 비히클(PBS), 25 μg CTRL-IL2hex, 및 55 μg FB-1112 또는 220 μg FB-1112를 투여하였다. 25 μg CTRL-IL2hex 군과 220 μg FB-1112 군은 완전한 종양 퇴행을 나타냈으며, 1백만 개의 MC38-FAP 세포를 이용한 재접종 후 종양이 없는 상태를 유지하였다. 25 μg CTRL-F42A는 최대 약 10%의 유의한 체중 손실을 나타냈지만, 220 μg FB-1112는 인식 가능한 체중 손실을 나타내지 않았다. 이러한 데이터는, FB-1112가 유의한 독성 감소와 함께, 상응하는 IL-2 돌연변이체의 효능과 일치할 수 있음을 보여준다.
도 36c에 제시된 바와 같이, 55 μg의 투여량으로 면역접합체 분자 1150("FB-1150")의 투여는 C57BL/6J 마우스에서 종양 성장을 억제하였다. 구체적으로, 암컷 C57BL/6 마우스(처리군 당 n=3마리)에, 1백만 개의 MC38-FAP을 각 마우스의 우측 옆구리에 피하로 접종하였다. 종양이 80 mm3 내지 100 mm3에 이르렀을 때, 처리를 개시하였다. 접종 후 0일차, 3일차 및 6일차에, 비히클(PBS), 25 μg CTRL-IL2D20T 또는 55 μg FB-1150을 투여하였다. 25 μg CTRL-IL2D20T 군은 최소 체중 손실과 함께 완전한 종양 퇴행을 나타냈다. 이러한 데이터는, 55 μg FB-1150이 체중 손실 없이 유의한 종양 퇴행(TGI>50%)을 나타냈음을 보여준다.
도 36d에 제시된 바와 같이, 55 μg의 투여량으로 FB-1150의 투여는 MC38-FAP C57BL/6 마우스에서 어떠한 사망도 나타내지 않았지만, 12.5 μg CTRL-IL2D20T는 25% 사망률을 나타냈다.
도 36e에 제시된 바와 같이, 55 μg의 투여량으로 면역접합체 분자 1150의 투여는 MC38-FAP C57BL/6 마우스에서 어떠한 체중 변화도 나타내지 않았다.
도 37c에 제시된 바와 같이, FAP의 부재 하에서 220 μg의 투여량으로 면역접합체 분자 1125(FB-1125)의 투여는 12.5 μg CTRL D20T가 투여된 마우스와 비교하여 MC38 C57BL/6 마우스에서 종양 성장을 저해하지 못했다. 구체적으로, C57BL/6 마우스에, 1백만 개의 MC38 세포를 각 마우스의 우측 옆구리에 피하로 투여하였다. 종양이 80 mm3 내지 100 mm3에 이르렀을 때, 처리를 개시하였다. 접종 후 0일차, 3일차 및 6일차에, 비히클(PBS), 12.5 μg CTRL-D20T 또는 220 μg FB-1125를 투여하였다. 12.5 μg CTRL-IL2D20T 군은 둔화된 종양 성장을 나타냈다. 대조적으로, 220 μg FB-1125 군은 종양 부피가 PBS 처리군과 유사했기 때문에 종양 성장을 둔화시키는 데 어떠한 효과도 나타내지 못했다. 이러한 데이터는, FB-1125가 FAP 발현의 부재 하에서 종양 성장을 둔화시키는 데 효과적이지 않았음을 보여준다.
도 37d에 제시된 바와 같이, 55 μg의 투여량으로 면역접합체 분자 1125의 투여는 MC38-FAP C57BL/6 마우스에서 종양 부피 성장을 둔화시킬 수 있었다. 구체적으로, C57BL/6 마우스에, 1백만 개의 MC38-FAP을 각 마우스의 우측 옆구리에 피하로 투여하였다. 종양이 80 mm3 내지 100 mm3에 이르렀을 때, 처리를 개시하였다. 접종 후 0일차, 3일차 및 6일차에, 12.5 μg CTRL-D20T, 55 μg FB-1125, 또는 55 μg FB-1125 및 100 μg si-4B9를 투여하였다. FB-1125 군은 둔화된 종양 성장을 나타냈다. 대조적으로, FAP mAB의 존재 하 FB-1125(si-4B9)는 종양 성장을 둔화시키지 못했다. 이러한 데이터는, FB-1125가 MC38-hFAP 모델에서 종양 성장을 둔화시킬 수 있었지만, FB-1125 분자의 고정 모이어티와 차폐 모이어티 둘 모두와 경쟁할 수 있는 FAP mAB의 존재 하에서는 효능이 손상될 수 있음을 보여준다.
분자 1097, 1112, 1125 및 1150의 상기 시험관내 및 생체내 활성은, (a) IL-2Rα 서브유닛과 IL-2Rβ 서브유닛 중 하나에 대한 IL-2 결합을 약화시키는 IL-2 모이어티의 돌연변이와, (b) IL-2Rα 서브유닛과 IL-2Rβ 서브유닛 중 다른 하나의 결합 부위를 표적으로 하는 차폐 모이어티를 갖는 IL-2 면역접합체가, FAP이 결여된 세포 환경에서는 IL-2 활성을 효과적으로 차폐하는 방식으로 IL-2 독성을 유의하게 감소시킬 수 있지만, FAP이 존재하는 암 세포 근처에서는 IL-2를 차폐 해제하는 방식으로 강력한 항종양 효능을 유지한다는 것을 입증한다. 이러한 연구는, 면역접합체 분자의 생체내 활성과 독성을 미세 조정하기 위해 사이토카인의 맞춤형 차폐 표적과 함께 돌연변이 전략을 조합한 본원에 기재된 면역접합체 분자에 대한 설계 전략을 검증하였다.
6.5.6 IL-2 함유 면역접합체 분자의 생체내 항종양 활성
면역접합체 분자 1150(FB-1150)은 본원에 기재된 IL-2 함유 면역접합체 분자의 생체내 항종양 활성을 평가하기 위해 작제된 또 다른 IL-2 함유 면역접합체 분자였다. 특히, FB-1150은 도 5o에 제시된 바와 같은 입체배치 14를 가지고 있었다. 구체적으로, 1150에서, IL-2 모이어티는 IL-2Rβ 결합 부위에 점 돌연변이(D20T)를 함유하고 있었으며, IL-2Rβ에 대한 IL-2 모이어티의 결합이 약화되어 있었다. 차폐 모이어티는 IL-2 모이어티에 결합하고 IL-2Rα에 대한 결합을 차단하는 IL-2/FAP 투인원 항체였다.
구체적으로, C57BL/6 마우스에, 1백만 개의 MC38-FAP 세포를 각 마우스의 우측 옆구리에 피하로 투여하였다. 종양이 80 mm3 내지 100 mm3에 이르렀을 때, 처리를 개시하였다. 접종 후 0일차, 3일차 및 6일차에, 비히클(PBS), 12.5 μg sKnob-IL2D20T 또는 55 μg FB-1150을 투여하였다. 도 36c 내지 도 36e에 제시된 바와 같이, 55 μg의 투여량으로 면역접합체 분자 1150(FB-1150)의 투여는 MC38-FAP C57BL/6 마우스에서 12.5 μg sKnob-IL2D20T가 투여된 마우스와 유사하게 종양 성장을 저해하였다. 12.5 μg CTRL-IL2D20T 군과 55 μg FB-1150 군은 둔화된 종양 성장을 나타냈다. 나아가, FB-1150 군은 생존 변화에 있어서 어떠한 변화도 나타내지 않았지만, CTRL-IL2D20T는 생존율의 감소를 나타냈다. 어떠한 군도 체중 변화를 나타내지 않았다. 이러한 데이터는, FB-1150이 사망률 또는 체중의 측정에서 나타난 바와 같이, 견딜 수 없는 부작용 또는 독성을 유발하지 않으면서 종양 부피를 저해했음을 보여준다.
6.5.7 IL-2와 EpCAM에 결합하는 투인원 항체를 함유하는 면역접합체 분자의 활성화
사이토카인 활성의 항원 의존적 활성화가 IL-2/Ep-CAM 투인원 항체의 변이체를 함유하는 면역접합체 분자에서 일어나는지를 조사하기 위해 하기 연구를 수행하였다.
구체적으로, IL-2/Ep-CAM 투인원 항체를 함유하는 면역접합체 분자는 도 5p에 제시된 바와 같은 입체배치 15를 가지고 있었다. 이러한 면역접합체 분자를 작제하고, 상기 기재된 바와 같이 세포 기반 IL-2 신호전달 검정에 적용하였다.
본 연구의 경우, 면역접합체 분자는 2개의 폴리펩타이드 사슬의 이량체화를 촉진하는 놉인투홀 변형을 갖는 2개의 동일하지 않은 서브유닛을 갖는 Fc 도메인을 함유하고 있었다. 구체적으로, 이러한 면역접합체 분자는 (a) 상기 기재된 바와 같은 돌연변이와 K35E 돌연변이(IL2hex/K35E)를 함유하고, Fc 서브유닛 중 하나의 C-말단에 융합된 IL-2hex 폴리펩타이드, (b) 다른 하나의 Fc 서브유닛의 C-말단에 융합된 항-IL2/항-EpCAM 투인원 Fab 항체, 및 (c) 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합된 항-FAP 단일 도메인 항체를 함유하고 있었다. 또한, 야생형 IL-2 폴리펩타이드 또는 돌연변이형 IL-2hex 폴리펩타이드를 함유하는 입체배치 1의 면역접합체 폴리펩타이드(IL-2 Fc 융합체)를 대조군으로 사용하였다. 대조군 면역접합체 분자와, IL-2/Ep-CAM 투인원 항체의 변이체를 함유하는 면역접합체 분자를 hFAP을 발현하는 세포(hek 293T 세포)와 EpCAM의 높은 발현을 나타내는 세포에서 시험하였다.
도 38a는, 강력한 차폐 및 차폐 해제 효과를 나타내는 도 38b에 도시된 입체배치를 갖는 면역접합체 분자 A를 보여준다. 저농도의 IL-2 대조군은 TECAN 플레이트 판독기를 사용하여 측정 시 635 nm에서의 흡광도(AU635)가 증가했으며, 이는 분비된 배아 알칼리성 포스파타아제(SEAP) 수준과 IL-2에 대한 반응을 반영하는 것이었다. 대조적으로, 고농도의 면역접합체 분자 A는 HEK 293T 세포의 존재 하에서 IL-2에 대한 증가된 반응을 나타냈다. 나아가, 저농도의 면역접합체 분자 A는 Ep-CAM 발현 세포의 존재 하에서 IL-2 활성의 증가를 나타냈다. 이러한 결과는, IL2/Ep-CAM 투인원 항체를 함유하는 면역접합체 분자 A가 FAP의 존재 하에서 IL-2 활성을 강력하게 차폐 해제함을 보여준다. 상기 연구는, IL2/Ep-CAM 투인원 항체를 함유하는 면역접합체 분자가 FAP의 존재 하에서 IL-2 활성을 차폐 해제함을 입증한다.
도 38c는, EpCAM 및 IL-2 이중특이적 분자의 Fab-Fc 놉인투홀 1가 작제물에 대한 고정된 EpCAM 및 IL-2 변이형 hex/K35E 분자의 생체층 간섭계(BLI) 결합 곡선을 보여준다. 면역접합체 분자 A가 1) K35E 돌연변이를 함유하는 IL2hex와 2) EpCAM에 결합할 수 있는지를 결정하기 위해, 생체층 간섭계(BLI) 검정을 확립하였다. 간략하게, IL2hex/K35E와 EpCAM을 PBST-BSA에 15.6 nM로 희석하고, Gator BLI 기기 상의 스트렙타비딘 센서에 실험에 따라 1 nm 내지 2 nm의 고정 수준으로 고정하였다. PBST-BSA를 이용하여 기준선을 확립한 후, 센서를 면역접합체 분자 A(500 nM)와 함께 인큐베이션하였다. 이러한 회합 단계를 180초 동안 진행한 후, PBST-BSA에서 180초 동안 해리시켰다. 항체 분석물이 EpCAM을 함유하지 않는 빈 BLI 센서에 적용되었던 기준선의 값을 빼서 IL2hex/K35E 또는 EpCAM에 대한 면역접합체 분자 A의 결합을 정규화하였다. 이러한 데이터는, 면역접합체 분자 A가 IL2hex/K35E 또는 EpCAM에 모두 결합함을 나타낸다.
SEQUENCE LISTING <110> SUZHOU FUSE BIOSCIENCES LIMITED <120> IMMUNOCONJUGATE MOLECULES AND RELATED METHODS AND COMPOSITIONS THEREOF <130> 14625-006-228 <140> To be assigned <141> On even date herewith <150> PCT/CN2021/100705 <151> 2021-06-17 <160> 112 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 133 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> an exemplary human IL-2 <400> 1 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 2 <211> 153 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Unprocessed human IL-2 <400> 2 Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu 20 25 30 Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe 50 55 60 Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu 65 70 75 80 Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys 85 90 95 Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile 100 105 110 Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala 115 120 125 Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe 130 135 140 Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr 145 150 <210> 3 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Delta-A1/T3A/F42A/Y45A/L72G/C125S mutations in the human IL-2 sequence <400> 3 Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 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Sequence <220> <223> VL of B10 Antibody <400> 101 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Ala Arg Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Arg Tyr Ser Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 102 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH of B10 Antibody <400> 102 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile His Ser His Gly Ser Gly Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gln Tyr Gly Arg Tyr Tyr Ser Pro Asp Tyr Tyr Phe Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 103 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B10 Antibody - VL CDR1 <400> 103 Arg Ala Ser Gln Asn Ile Ala Arg Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 104 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B10 Antibody - VL CDR3 <400> 104 Gln Gln Gly Arg Tyr Ser Pro Phe Thr 1 5 <210> 105 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B10 Antibody - VH CDR1 <400> 105 Ser Arg Tyr Ser Met Gly 1 5 <210> 106 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B10 Antibody - VH CDR2 <400> 106 Thr Ile His Ser His Gly Ser Gly Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 107 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL2-T3A/K35E/F42A/Y45A/L72G/C125S <400> 107 Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 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<211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL2-T3A/H16A/K35E/C125S <400> 110 Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu Ala 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Glu Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 111 <211> 551 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> an exemplary human CD122 <400> 111 Met Ala Ala Pro Ala Leu Ser Trp Arg Leu Pro Leu Leu Ile Leu Leu 1 5 10 15 Leu Pro Leu Ala Thr Ser Trp Ala Ser Ala Ala Val Asn Gly Thr Ser 20 25 30 Gln Phe Thr Cys Phe Tyr Asn Ser Arg Ala Asn Ile 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Gly 245 250 255 Phe Ile Ile Leu Val Tyr Leu Leu Ile Asn Cys Arg Asn Thr Gly Pro 260 265 270 Trp Leu Lys Lys Val Leu Lys Cys Asn Thr Pro Asp Pro Ser Lys Phe 275 280 285 Phe Ser Gln Leu Ser Ser Glu His Gly Gly Asp Val Gln Lys Trp Leu 290 295 300 Ser Ser Pro Phe Pro Ser Ser Ser Phe Ser Pro Gly Gly Leu Ala Pro 305 310 315 320 Glu Ile Ser Pro Leu Glu Val Leu Glu Arg Asp Lys Val Thr Gln Leu 325 330 335 Leu Leu Gln Gln Asp Lys Val Pro Glu Pro Ala Ser Leu Ser Ser Asn 340 345 350 His Ser Leu Thr Ser Cys Phe Thr Asn Gln Gly Tyr Phe Phe Phe His 355 360 365 Leu Pro Asp Ala Leu Glu Ile Glu Ala Cys Gln Val Tyr Phe Thr Tyr 370 375 380 Asp Pro Tyr Ser Glu Glu Asp Pro Asp Glu Gly Val Ala Gly Ala Pro 385 390 395 400 Thr Gly Ser Ser Pro Gln Pro Leu Gln Pro Leu Ser Gly Glu Asp Asp 405 410 415 Ala Tyr Cys Thr Phe Pro Ser Arg Asp Asp Leu Leu Leu Phe Ser Pro 420 425 430 Ser Leu Leu Gly Gly Pro Ser Pro Pro Ser Thr Ala Pro Gly Gly Ser 435 440 445 Gly Ala Gly Glu Glu Arg Met Pro Pro Ser Leu Gln Glu Arg Val Pro 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Asp Lys Val Gln Lys Cys Ser His Tyr Leu Phe Ser Glu Glu Ile Thr 100 105 110 Ser Gly Cys Gln Leu Gln Lys Lys Glu Ile His Leu Tyr Gln Thr Phe 115 120 125 Val Val Gln Leu Gln Asp Pro Arg Glu Pro Arg Arg Gln Ala Thr Gln 130 135 140 Met Leu Lys Leu Gln Asn Leu Val Ile Pro Trp Ala Pro Glu Asn Leu 145 150 155 160 Thr Leu His Lys Leu Ser Glu Ser Gln Leu Glu Leu Asn Trp Asn Asn 165 170 175 Arg Phe Leu Asn His Cys Leu Glu His Leu Val Gln Tyr Arg Thr Asp 180 185 190 Trp Asp His Ser Trp Thr Glu Gln Ser Val Asp Tyr Arg His Lys Phe 195 200 205 Ser Leu Pro Ser Val Asp Gly Gln Lys Arg Tyr Thr Phe Arg Val Arg 210 215 220 Ser Arg Phe Asn Pro Leu Cys Gly Ser Ala Gln His Trp Ser Glu Trp 225 230 235 240 Ser His Pro Ile His Trp Gly Ser Asn Thr Ser Lys Glu Asn Pro Phe 245 250 255 Leu Phe Ala Leu Glu Ala Val Val Ile Ser Val Gly Ser Met Gly Leu 260 265 270 Ile Ile Ser Leu Leu Cys Val Tyr Phe Trp Leu Glu Arg Thr Met Pro 275 280 285 Arg Ile Pro Thr Leu Lys Asn Leu Glu Asp Leu Val Thr Glu Tyr His 290 295 300 Gly Asn Phe Ser Ala Trp Ser Gly Val Ser Lys Gly Leu Ala Glu Ser 305 310 315 320 Leu Gln Pro Asp Tyr Ser Glu Arg Leu Cys Leu Val Ser Glu Ile Pro 325 330 335 Pro Lys Gly Gly Ala Leu Gly Glu Gly Pro Gly Ala Ser Pro Cys Asn 340 345 350 Gln His Ser Pro Tyr Trp Ala Pro Pro Cys Tyr Thr Leu Lys Pro Glu 355 360 365 Thr

Claims (171)

  1. 면역접합체 분자로서,
    (a) 사이토카인 활성을 갖는 사이토카인 폴리펩타이드를 포함하는 사이토카인 모이어티; 및
    (b) 차폐 모이어티(masking moiety)를 포함하고;
    상기 차폐 모이어티는 상기 사이토카인 폴리펩타이드와 제1 표적 항원에 결합할 수 있는 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고;
    상기 사이토카인 폴리펩타이드에 결합하는 경우, 상기 차폐 모이어티는 상기사이토카인 활성을 감소시키거나 저해하고; 및
    상기 제1 표적 항원에 결합하는 경우, 상기 차폐 모이어티는 상기 사이토카인 폴리펩타이드에서 해리되어, 상기 사이토카인 활성을 활성화시키는, 면역접합체 분자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 차폐 모이어티는 온전한 항체, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, dsFv, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 또는 항체 단편으로부터 형성된 VHH를 포함하는, 면역접합체 분자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 이중특이적 항체는 투인원(two-in-one) 항체인, 면역접합체 분자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 표적 항원은 사이토카인 폴리펩타이드가 아닌, 면역접합체 분자.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 표적 항원은 세포 표면에서 발현되는, 면역접합체 분자.
  6. 제1항에 있어서, 상기 세포는 암 세포 또는 종양 미세환경 내 세포인, 면역접합체 분자.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 표적 항원은 가용성인, 면역접합체 분자.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 표적 항원은 종양 관련 항원인, 면역접합체 분자.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 표적 항원은 섬유증 활성화 단백질(FAP)인, 면역접합체 분자.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사이토카인 모이어티는 야생형 또는 돌연변이형 인터류킨-2(IL-2), 및 선택적으로 인간 IL-2를 포함하는, 면역접합체 분자.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    (c) 제2 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 고정 모이어티(anchoring moiety)를 추가로 포함하는, 면역접합체 분자.
  12. 제11항에 있어서, 상기 제2 표적 항원은 세포 표면에서 발현되는, 면역접합체 분자.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 세포는 암 세포 또는 종양 미세환경 내 세포인, 면역접합체 분자.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 표적 항원은 가용성인, 면역접합체 분자.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 표적 항원은 종양 관련 항원인, 면역접합체 분자.
  16. 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 표적 항원과 제2 표적 항원은 동일한, 면역접합체 분자.
  17. 제16항에 있어서, 상기 이중특이적 차폐 모이어티와 상기 고정 모이어티는 상기 제1 표적 항원 또는 제2 표적 항원의 동일한 에피토프에 결합하는, 면역접합체 분자.
  18. 제16항에 있어서, 상기 이중특이적 차폐 모이어티와 상기 고정 모이어티는 상기 제1 표적 항원 또는 제2 표적 항원의 상이한 에피토프에 결합하는, 면역접합체 분자.
  19. 제11항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 표적 항원은 섬유증 활성화 단백질(FAP)인, 면역접합체 분자.
  20. 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 표적 항원과 제2 표적 항원은 상이한, 면역접합체 분자.
  21. 제11항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고정 모이어티는 온전한 항체, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, dsFv, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 또는 항체 단편으로부터 형성된 VHH를 포함하는, 면역접합체 분자.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 차폐 모이어티의 이중특이적 항체 또는 항원 결합 단편은 Fab, ScFv 또는 VHH인, 면역접합체 분자.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고정 모이어티의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Fab, ScFv 또는 VHH인, 면역접합체 분자.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    (d) 접합 모이어티(conjugating moiety)를 추가로 포함하고, 여기서 접합 모이어티는 상기 사이토카인 모이어티, 상기 차폐 모이어티 및 상기 고정 모이어티 중 둘 이상을 작동 가능하게 연결하는, 면역접합체 분자.
  25. 제24항에 있어서, 상기 접합 모이어티는 면역글로불린 Fc 도메인 또는 이의 돌연변이체를 포함하는, 면역접합체 분자.
  26. 제25항에 있어서, 상기 Fc 도메인은 2개의 동일하지 않은 폴리펩타이드 사슬인 제1 서브유닛과 제2 서브유닛을 포함하고;및 상기 Fc 도메인은 2개의 동일하지 않은 폴리펩타이드 사슬의 이종이량체화를 촉진하는 제1 변형을 포함하는, 면역접합체 분자.
  27. 제26항에 있어서, 상기 제1 변형은 제1 서브유닛의 놉(knob) 변형과 제2 서브유닛의 홀(hole) 변형을 포함하는 놉인투홀(knob-into-hole) 변형인, 면역접합체 분자.
  28. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 도메인은 제2 변형을 포함하고, 상기 Fc 도메인은 상기 제2 변형이 없는 천연 Fc 도메인과 비교하여 Fc 수용체에 대한 결합 친화도가 감소되어 있는, 면역접합체 분자.
  29. 제28항에 있어서, 상기 Fc 도메인은 상기 제2 변형이 없는 천연 Fc 도메인과 비교하여 Fcγ 수용체에 대한 결합 친화도가 감소되어 있는, 면역접합체 분자.
  30. 제29항에 있어서, 상기 Fcγ 수용체는 FcγRIIIα, FcγRI 또는 FcγRIIα 수용체인, 면역접합체 분자.
  31. 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 도메인은 상기 제2 변형이 없는 천연 Fc 도메인과 비교하여 보체 구성요소에 대한 결합 친화도가 감소되어 있는, 면역접합체 분자.
  32. 제31항에 있어서, 상기 보체 구성요소는 C1q인, 면역접합체 분자.
  33. 제28항에 있어서, 상기 Fc 도메인은 상기 제2 변형이 없는 Fc 도메인과 비교하여 Fc 이펙터 기능이 감소되어 있는, 면역접합체 분자.
  34. 제33항에 있어서, 상기 감소된 Fc 이펙터 기능은 보체 의존성 세포독성(CDC), 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC), 항체 의존성 세포 포식작용(ADCP), 사이토카인 분비, 세포 표면 수용체의 하향조절 및 B세포 활성화에서 선택되는, 면역접합체 분자.
  35. 제28항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 변형은 S228P, E233P, L234V, L234A, L235A, L235E, ΔG236, D265G, N297A, N297D, P329E, P329S, P329A, P329G, A330S 또는 P331S에서 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 포함하고, 여기서 넘버링은 Kabat에서와 같이 EU 인덱스에 따르는 것인, 면역접합체 분자.
  36. 제28항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 변형은 E233P, L234V, L234A, L235A, ΔG236, D265G, P327E, A328S, P329E, A330S 또는 P331S에서 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 포함하고, 여기서 넘버링은 Kabat에서와 같이 EU 인덱스에 따르는 것인, 면역접합체 분자.
  37. 제24항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사이토카인 모이어티는 상기 Fc 도메인의 제1 서브유닛과 제2 서브유닛 중 하나의 C-말단에 연결되어 있고, 및 상기 차폐 모이어티는 상기 Fc 도메인의 제1 서브유닛과 제2 서브유닛 중 다른 하나의 C-말단에 연결되어 있는, 면역접합체 분자.
  38. 제37항에 있어서, 상기 고정 모이어티는 상기 Fc 도메인의 제1 서브유닛과 제2 서브유닛 중 하나의 N-말단에 연결되어 있는, 면역접합체 분자.
  39. 제38항에 있어서, 상기 고정 모이어티와 상기 사이토카인 모이어티는 상기 Fc 도메인의 동일한 서브유닛에 연결되어 있는, 면역접합체 분자.
  40. 제38항에 있어서, 상기 고정 모이어티와 상기 차폐 모이어티는 상기 Fc 도메인의 동일한 서브유닛에 연결되어 있는, 면역접합체 분자.
  41. 제24항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 차폐 모이어티는 상기Fc 도메인의 제1 서브유닛과 제2 서브유닛 중 하나의 C-말단에 연결되어 있고; 및 상기 사이토카인 모이어티는 상기 차폐 모이어티에 연결되어 있는, 면역접합체 분자.
  42. 제41항에 있어서, 상기 고정 모이어티는 상기 Fc 도메인의 제1 서브유닛과 제2 서브유닛 중 하나의 N-말단에 연결되어 있는, 면역접합체 분자.
  43. 제42항에 있어서, 상기 고정 모이어티와 상기 차폐 모이어티는 상기 Fc 도메인의 동일한 서브유닛에 연결되어 있거나, 상기 고정 모이어티와 상기 차폐 모이어티는 상기 Fc 도메인의 상이한 서브유닛에 연결되어 있는, 면역접합체 분자.
  44. 제24항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 차폐 모이어티는 상기Fc 도메인의 제1 서브유닛과 제2 서브유닛 중 하나의 N-말단에 연결되어 있고, 및 상기 사이토카인 모이어티는 상기 차폐 모이어티에 연결되어 있는, 면역접합체 분자.
  45. 제24항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 차폐 모이어티는 상기Fc 도메인의 제1 서브유닛과 제2 서브유닛 중 하나의 N-말단에 연결되어 있고, 및 상기 고정 모이어티가 상기 Fc 도메인의 제1 서브유닛과 제2 서브유닛 중 다른 하나의 N-말단에 연결되어 있는, 면역접합체 분자.
  46. 제45항에 있어서, 상기 사이토카인 모이어티는 상기 차폐 모이어티에 연결되어 있는, 면역접합체 분자.
  47. 제45항에 있어서, 상기 사이토카인 모이어티는 상기 고정 모이어티에 연결되어 있는, 면역접합체 분자.
  48. 제37항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 차폐 모이어티의 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Fab, ScFv 또는 VHH인, 면역접합체 분자.
  49. 제37항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고정 모이어티의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Fab, ScFv 또는 VHH인, 면역접합체 분자.
  50. 제24항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사이토카인 모이어티, 상기 차폐 모이어티, 상기 고정 모이어티 및 상기 접합 모이어티 중 둘 이상 사이의 연결은 펩타이드 링커를 통해 이루어져 있는, 면역접합체 분자.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사이토카인은 서열번호 1, 3, 7 내지 15, 및 107 내지 110을 갖는 IL-2 폴리펩타이드인, 면역접합체 분자.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 표적 항원과 제2 표적 항원은 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)인, 면역접합체 분자.
  53. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 차폐 모이어티는 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 인터류킨-2(IL-2)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은,
    (a) 표 1에 제시된 바와 같은 항체 D001, D002, D029, D029LV1, D029LV2, D029LV3, D029LV4, D029LV5, D003, D047, D049 또는 B10 중 어느 하나의 VL(a light chain variable region) 상보성 결정 영역 1(complementarity determining region 1, CDR1), VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VH); 및/또는
    (b) 표 2에 제시된 바와 같은 항체 D001, D002, D029, D029HV1, D029HV2, D029HV3, D029HV4, D029HV5, D029HV6, D003, D047, D049 또는 B10 중 어느 하나의 VH(a heavy chain variable region) 상보성 결정 영역 1(CDR1), VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는, 면역접합체 분자.
  54. 제53항에 있어서,
    (a) 상기 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3는, 각각, 서열번호 16, 17 및 18의 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3은, 각각, 서열번호 36, 37 및 38의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (b) 상기 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3은, 각각, 서열번호 19, 17 및 20의 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3은, 각각, 서열번호 36, 39 및 38의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (c) 상기 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3은, 각각, 서열번호 21, 22 및 23의 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3은, 각각, 서열번호 40, 41 및 38의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (d) 상기 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3은, 각각, 서열번호 30, 17 및 31의 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3은, 각각, 서열번호 46, 47 및 48의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (e) 상기 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3은, 각각, 서열번호 32, 17 및 33의 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3은, 각각, 서열번호 49, 50 및 51의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (f) 상기 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3은, 각각, 서열번호 34, 17 및 35의 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3은, 각각, 서열번호 52, 53 및 51의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (g) 상기 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3은, 각각, 서열번호 24, 25 및 23의 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3은, 각각, 서열번호 40, 42 및 38의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (h) 상기 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3은, 각각, 서열번호 26, 25 및 28의 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3은, 각각, 서열번호 43, 42 및 38의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (i) 상기 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3은, 각각, 서열번호 26, 25 및 29의 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3은, 각각, 서열번호 43, 42 및 38의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (j) 상기 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3은, 각각, 서열번호 24, 25 및 29의 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3은, 각각, 서열번호 40, 42 및 38의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (k) 상기 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3은, 각각, 서열번호 26, 25 및 27의 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3은, 각각, 서열번호 43, 42 및 38의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (l) 상기 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3은, 각각, 서열번호 26, 25 및 27의 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3은, 각각, 서열번호 44, 42 및 38의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (m) 상기 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3은, 각각, 서열번호 26, 25 및 27의 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3은, 각각, 서열번호 45, 42 및 38의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
    (n) 상기 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3은, 각각, 서열번호 103, 17 및 104의 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3은, 각각, 서열번호 105, 106 및 38의 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 항원 결합 단편.
  55. 제53항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편이
    (a) 표 3에 제시된 바와 같은 항체 D001, D002, D029, D029LV1, D029LV2, D029LV3, D029LV4, D029LV5, D003, D047, D049 또는 B10 중 어느 하나의 VL을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 및/또는
    (b) 표 4에 제시된 바와 같은 항체 D001, D002, D029, D029LV1, D029LV2, D029LV3, D029LV4, D029LV5, D003, D047, D049 또는 B10 중 어느 하나의 VH를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는, 면역접합체 분자.
  56. 제53항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 68, 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72, 서열번호 73, 서열번호 74, 서열번호 75, 서열번호 76, 서열번호 77, 서열번호 78 또는 서열번호 101의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 항체 또는 항원 결합 단편.
  57. 제54항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 79, 서열번호 80, 서열번호 81, 서열번호 82, 서열번호 83, 서열번호 84, 서열번호 85, 서열번호 86, 서열번호 87, 서열번호 88, 서열번호 89, 서열번호 90 또는 서열번호 102의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는, 항체 또는 항원 결합 단편.
  58. 제54항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은
    (a) 서열번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 VL과, 서열번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH;
    (b) 서열번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 VL과, 서열번호 80의 아미노산 서열을 포함하는 VH;
    (c) 서열번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 VL과, 서열번호 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH;
    (d) 서열번호 76의 아미노산 서열을 포함하는 VL과, 서열번호 88의 아미노산 서열을 포함하는 VH;
    (e) 서열번호 77의 아미노산 서열을 포함하는 VL과, 서열번호 89의 아미노산 서열을 포함하는 VH;
    (f) 서열번호 78의 아미노산 서열을 포함하는 VL과, 서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH;
    (g) 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 VL과, 서열번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 VH;
    (h) 서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 VL과, 서열번호 83의 아미노산 서열을 포함하는 VH;
    (i) 서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 VL과, 서열번호 83의 아미노산 서열을 포함하는 VH;
    (j) 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL과, 서열번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 VH;
    (k) 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 VL과, 서열번호 84의 아미노산 서열을 포함하는 VH;
    (l) 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 VL과, 서열번호 85의 아미노산 서열을 포함하는 VH;
    (m) 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 VL과, 서열번호 87의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 또는
    (n) 서열번호 101의 아미노산 서열을 포함하는 VL과, 서열번호 102의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  59. 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고정 모이어티는 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은
    (a) 표 5에 제시된 바와 같은 항체 872-5, 872-59, 872-70 또는 872-5V1 중 어느 하나의 VL 상보성 결정 영역 1(CDR1), VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 및/또는
    (b) 표 6에 제시된 바와 같은 항체 872-5, 872-59, 872-70, 872-5V1 또는 VHH6 중 어느 하나의 VH 상보성 결정 영역 1(CDR1), VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는, 면역접합체 분자.
  60. 제59항에 있어서,
    (a) 상기 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3은, 각각, 서열번호 30, 17 및 54의 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3은, 각각, 서열번호 58, 59 및 60의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (b) 상기 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3은, 각각, 서열번호 30, 17 및 55의 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3은, 각각, 서열번호 61, 62 및 48의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (c) 상기 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3은, 각각, 서열번호 30, 17 및 56의 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3은, 각각, 서열번호 36, 63 및 38의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (d) 상기 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3은, 각각, 서열번호 30, 17 및 57의 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3은, 각각, 서열번호 58, 64 및 51의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (e) 상기 항체가 각각, 서열번호 65, 66 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 상기 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하는 VHH인, 항체 또는 항원 결합 단편.
  61. 제59항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은:
    (a) 표 7에 제시된 바와 같은 항체 872-5, 872-59, 872-70 또는 872-5V1 중 어느 하나의 VL을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 및/또는
    (b) 표 8에 제시된 바와 같은 항체 872-5, 872-59, 872-70, 872-5V1 또는 VHH6 중 어느 하나의 VH를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)를 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  62. 제59항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 91, 서열번호 92, 서열번호 93 또는 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 항체 또는 항원 결합 단편.
  63. 제59항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 95, 서열번호 96, 서열번호 97, 서열번호 98 또는 서열번호 99의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는, 항체 또는 항원 결합 단편.
  64. 제59항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
    (a) 서열번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 VL과, 서열번호 95의 아미노산 서열을 포함하는 VH;
    (b) 서열번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 VL과, 서열번호 96의 아미노산 서열을 포함하는 VH;
    (c) 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL과, 서열번호 97의 아미노산 서열을 포함하는 VH;
    (d) 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 VL과, 서열번호 98의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 또는
    (e) 서열번호 99의 아미노산 서열을 포함하는 VHH를 포함하는, 항체 또는 항원 결합 단편.
  65. 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 따른 면역접합체 분자, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물.
  66. 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 따른 면역접합체 분자 또는 이의 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
  67. 제66항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 폴리뉴클레오타이드.
  68. 제66항 또는 제67항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
  69. 제65항 내지 제67항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포.
  70. 제68항의 벡터를 포함하는 세포.
  71. 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 따른 면역접합체 분자를 생산하는 단리된 세포.
  72. 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 따른 면역접합체 분자를 포함하는 키트.
  73. 면역접합체 분자를 제조하는 방법으로서, 면역접합체 분자를 발현시키기 위해 제57항 내지 제71항 중 어느 한 항에 따른 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  74. 면역접합체 분자를 제조하는 방법으로서, 제66항 또는 제67항의 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 단계를 포함하는, 방법.
  75. 표적 부위에서 사이토카인 매개 효과를 활성화시키는 방법으로서, 사이토카인과 차폐 모이어티를 포함하는 면역접합체 분자를 표적 부위로 전달하는 단계를 포함하고;
    상기 차폐 모이어티는 분자내 상호작용을 통해 상기 사이토카인에 결합하여 상기 사이토카인 매개 효과를 저해하는 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고;
    상기 투인원 항체 또는 항원 결합 단편은 표적 부위의 제1 표적 항원에 결합할 수 있고;
    상기 면역접합체 분자가 상기 표적 부위에 있을 때, 상기 투인원 항체는 제1 표적 항원에 결합하고 상기 사이토카인에서 해리되고; 및
    상기 사이토카인 매개 효과는 상기 표적 부위에서 활성화되는, 방법.
  76. 제75항에 있어서, 상기 면역접합체 분자는 고정 모이어티를 추가로 포함하며, 상기 고정 모이어티는 상기 표적 부위의 제2 표적 항원에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 방법.
  77. 제75항에 있어서, 상기 면역접합체 분자가 상기 표적 부위에 있을 때, 상기고정 모이어티의 상기 항체 또는 항원 결합 단편이 제2 표적 항원에 결합하고; 및 상기 면역접합체 분자는 상기 표적 부위에 고정되는, 방법.
  78. 제75항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역접합체 분자를 상기표적 부위로 전달하는 단계는 상기 면역접합체 분자를 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  79. 제78항에 있어서, 상기 사이토카인 활성은 상기 면역접합체 분자를 대상에게 투여한 후 상기 표적 부위에서의 사이토카인 활성과 비교하여 비(non)-표적 부위에서 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 더 낮은, 방법.
  80. 표적 부위에 사이토카인을 농축시키는 방법으로서, 사이토카인과 고정 모이어티를 포함하는 면역접합체 분자를 표적 부위로 전달하는 단계를 포함하고;
    상기 고정 모이어티는 상기 표적 부위의 제2 표적 항원에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고;
    상기 면역접합체 분자가 상기 표적 부위에 있을 때, 상기 고정 모이어티는 상기 제2 표적 항원에 결합하고; 및
    상기 사이토카인은 비-표적 부위와 비교하여 상기 표적 부위에서 더 높은 농도로 분포되는, 방법.
  81. 제80항에 있어서, 상기 면역접합체 분자를 상기 표적 부위로 전달하는 단계는 상기 면역접합체 분자를 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  82. 제81항에 있어서, 상기 사이토카인 농도는 상기 면역접합체 분자를 대상에게 투여한 후 상기 표적 부위에서의 사이토카인 활성과 비교하여 비-표적 부위에서 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 더 낮은, 방법.
  83. 제78항, 제79항, 제81항 또는 제82항에 있어서, 상기 대상에서 상기 사이토카인과 관련된 독성 또는 부작용이 감소되는, 방법.
  84. 제83항에 있어서, 사이토카인 독성 또는 부작용은 접합되지 않은 형태의 상기 사이토카인을 등가량으로 상기 대상에게 투여한 경우와 비교하여 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 감소되는, 방법.
  85. 제83항 또는 제84항에 있어서, 상기 독성 또는 부작용의 감소는 상기 투여된 대상의 수명 연장으로 측정되는, 방법.
  86. 제83항 또는 제84항에 있어서, 상기 사이토카인과 관련된 독성 또는 부작용의 감소는 상기 투여된 대상의 체중 손실 감소로 측정되는, 방법.
  87. 제83항 또는 제84항에 있어서, 상기 사이토카인과 관련된 독성 또는 부작용의 감소는 상기 투여된 대상에서 면역 반응 수준의 변화로 측정되는, 방법.
  88. 제83항 또는 제84항에 있어서, 상기 사이토카인과 관련된 독성 또는 부작용의 감소는 상기 투여된 대상에서 염증 반응의 변화로 측정되는, 방법.
  89. 제88항에 있어서, 상기 면역접합체 분자는 차폐 모이어티를 추가로 포함하고;
    상기 차폐 모이어티는 분자내 상호작용을 통해 상기 사이토카인에 결합하여 사이토카인 매개 효과를 저해하는 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고;
    상기 투인원 항체 또는 항원 결합 단편은 상기 표적 부위의 제1 표적 항원에 결합할 수 있고;
    상기 면역접합체 분자가 상기 표적 부위에 있을 때, 상기 투인원 항체는 상기 제1 표적 항원에 결합하고 사이토카인에서 해리되고; 및
    상기 사이토카인 매개 효과가 표적 부위에서 활성화되는, 방법.
  90. 제76항, 제77항 또는 제89항에 있어서, 상기 제1 항원과 제2 항원은 동일한 항원이거나 상이한 항원인, 방법.
  91. 제75항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 부위는 종양 미세환경인, 방법.
  92. 제75항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 부위는 암성 세포인, 방법.
  93. 제91항 또는 제92항에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 항원은 암 세포의 표면에서 발현되는, 방법.
  94. 제91항에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 항원은 상기 종양 미세환경 내 세포에 의해 발현되는, 방법.
  95. 제94항에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 항원은 섬유증 활성화 단백질(FAP)인, 방법.
  96. 제75항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역접합체 분자는 상기 사이토카인 폴리펩타이드, 상기 차폐 모이어티 및 상기 고정 모이어티 중 둘 이상을 작동 가능하게 연결하도록 구성된 접합 모이어티를 추가로 포함하는, 방법.
  97. 제96항에 있어서, 상기 접합 모이어티는 2개의 동일하지 않은 폴리펩타이드 사슬인 제1 서브유닛과 제2 서브유닛을 포함하는 면역글로불린 Fc 도메인이며, 여기서 Fc 도메인은 2개의 동일하지 않은 폴리펩타이드 사슬의 이종이량체화를 촉진하는 제1 변형을 포함하는, 방법.
  98. 제97항에 있어서, 상기 면역글로불린 도메인은 제2 변형을 포함하며, 상기 Fc 도메인은 상기 제2 변형이 없는 천연 Fc 도메인과 비교하여 Fc 수용체에 대한 결합 친화도가 감소되어 있는, 방법.
  99. 제75항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역접합체 분자는 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 따른 면역접합체 분자인, 방법.
  100. 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 인터류킨-2(IL-2)에 결합하는 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
    (a) 표 1에 제시된 바와 같은 항체 D001, D002, D029, D029LV1, D029LV2, D029LV3, D029LV4, D029LV5, D003, D047, D049 또는 B10 중 어느 하나의 VL 상보성 결정 영역 1(CDR1), VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VH); 및/또는
    (b) 표 2에 제시된 바와 같은 항체 D001, D002, D029, D029HV1, D029HV2, D029HV3, D029HV4, D029HV5, D029HV6, D003, D047, D049 또는 B10 중 어느 하나의 VH 상보성 결정 영역 1(CDR1), VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는, 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  101. 제100항에 있어서,
    (a) 상기 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3은, 각각, 서열번호 16, 17 및 18의 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3은, 각각, 서열번호 36, 37 및 38의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (b) 상기 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3은, 각각, 서열번호 19, 17 및 20의 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3은, 각각, 서열번호 36, 39 및 38의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (c) 상기 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3은, 각각, 서열번호 21, 22 및 23의 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3은, 각각, 서열번호 40, 41 및 38의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (d) 상기 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3은, 각각, 서열번호 30, 17 및 31의 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3은, 각각, 서열번호 46, 47 및 48의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (e) 상기 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3은, 각각, 서열번호 32, 17 및 33의 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3은, 각각, 서열번호 49, 50 및 51의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (f) 상기 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3은, 각각, 서열번호 34, 17 및 35의 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3은, 각각, 서열번호 52, 53 및 51의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (g) 상기 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3은, 각각, 서열번호 24, 25 및 23의 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3은, 각각, 서열번호 40, 42 및 38의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (h) 상기 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3은, 각각, 서열번호 26, 25 및 28의 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3은, 각각, 서열번호 43, 42 및 38의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (i) 상기 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3은, 각각, 서열번호 26, 25 및 29의 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3은, 각각, 서열번호 43, 42 및 38의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (j) 상기 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3은, 각각, 서열번호 24, 25 및 29의 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3은, 각각, 서열번호 40, 42 및 38의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (k) 상기 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3은, 각각, 서열번호 26, 25 및 27의 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3은, 각각, 서열번호 43, 42 및 38의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (l) 상기 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3은, 각각, 서열번호 26, 25 및 27의 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3은, 각각, 서열번호 44, 42 및 38의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (m) 상기 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3은, 각각, 서열번호 26, 25 및 27의 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3은, 각각, 서열번호 45, 42 및 38의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
    (n) 상기 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3은, 각각, 서열번호 103, 17 및 104의 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3은, 각각, 서열번호 105, 106 및 38의 아미노산 서열을 포함하는, 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  102. 제100항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은:
    (a) 표 3에 제시된 바와 같은 항체 D001, D002, D029, D029LV1, D029LV2, D029LV3, D029LV4, D029LV5, D003, D047, D049 또는 B10 중 어느 하나의 VL을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 및/또는
    (b) 표 4에 제시된 바와 같은 항체 D001, D002, D029, D029LV1, D029LV2, D029LV3, D029LV4, D029LV5, D003, D047, D049 또는 B10 중 어느 하나의 VH를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는, 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  103. 제100항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 68, 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72, 서열번호 73, 서열번호 74, 서열번호 75, 서열번호 76, 서열번호 77, 서열번호 78 또는 서열번호 101의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  104. 제100항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 79, 서열번호 80, 서열번호 81, 서열번호 82, 서열번호 83, 서열번호 84, 서열번호 85, 서열번호 86, 서열번호 87, 서열번호 88, 서열번호 89, 서열번호 90 또는 서열번호 102의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  105. 제100항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
    (a) 서열번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 VL과, 서열번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH;
    (b) 서열번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 VL과, 서열번호 80의 아미노산 서열을 포함하는 VH;
    (c) 서열번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 VL과, 서열번호 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH;
    (d) 서열번호 76의 아미노산 서열을 포함하는 VL과, 서열번호 88의 아미노산 서열을 포함하는 VH;
    (e) 서열번호 77의 아미노산 서열을 포함하는 VL과, 서열번호 89의 아미노산 서열을 포함하는 VH;
    (f) 서열번호 78의 아미노산 서열을 포함하는 VL과, 서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH;
    (g) 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 VL과, 서열번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 VH;
    (h) 서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 VL과, 서열번호 83의 아미노산 서열을 포함하는 VH;
    (i) 서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 VL과, 서열번호 83의 아미노산 서열을 포함하는 VH;
    (j) 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL과, 서열번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 VH;
    (k) 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 VL과, 서열번호 84의 아미노산 서열을 포함하는 VH;
    (l) 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 VL과, 서열번호 85의 아미노산 서열을 포함하는 VH;
    (m) 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 VL과, 서열번호 87의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 또는
    (n) 서열번호 101의 아미노산 서열을 포함하는 VL과, 서열번호 102의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는, 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  106. 제100항 내지 제105항 중 어느 한 항에 따른 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 IL-2 폴리펩타이드를 포함하는 면역접합체 분자.
  107. 제106항에 있어서, 상기 IL-2 폴리펩타이드는 야생형 또는 돌연변이형 IL-2인, 면역접합체 분자.
  108. 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
    (a) 표 5에 제시된 바와 같은 항체 872-5, 872-59, 872-70 또는 872-5V1 중 어느 하나의 VL 상보성 결정 영역 1(CDR1), VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 및/또는
    (b) 표 6에 제시된 바와 같은 항체 872-5, 872-59, 872-70, 872-5V1 또는 VHH6 중 어느 하나의 VH 상보성 결정 영역 1(CDR1), VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  109. 제108항에 있어서,
    (a) 상기 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3은, 각각, 서열번호 30, 17 및 54의 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3은, 각각, 서열번호 58, 59 및 60의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (b) 상기 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3은, 각각, 서열번호 30, 17 및 55의 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3은, 각각, 서열번호 61, 62 및 48의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (c) 상기 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3은, 각각, 서열번호 30, 17 및 56의 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3은, 각각, 서열번호 36, 63 및 38의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (d) 상기 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3은, 각각, 서열번호 30, 17 및 57의 아미노산 서열을 포함하고, 및 상기 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3은, 각각, 서열번호 58, 64 및 51의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
    (e) 상기 항체는 각각, 서열번호 65, 66 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 상기 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하는 VHH인, 항체 또는 항원 결합 단편.
  110. 제108항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
    (a) 표 7에 제시된 바와 같은 항체 872-5, 872-59, 872-70 또는 872-5V1 중 어느 하나의 VL을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 및/또는
    (b) 표 8에 제시된 바와 같은 항체 872-5, 872-59, 872-70, 872-5V1 또는 VHH6 중 어느 하나의 VH를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  111. 제108항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 91, 서열번호 92, 서열번호 93 또는 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 항체 또는 항원 결합 단편.
  112. 제108항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 95, 서열번호 96, 서열번호 97, 서열번호 98 또는 서열번호 99의 아미노산 서열을 포함하는, VH를 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  113. 제108항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
    (a) 서열번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 VL과, 서열번호 95의 아미노산 서열을 포함하는 VH;
    (b) 서열번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 VL과, 서열번호 96의 아미노산 서열을 포함하는 VH;
    (c) 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL과, 서열번호 97의 아미노산 서열을 포함하는 VH;
    (d) 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 VL과, 서열번호 98의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 또는
    (e) 서열번호 99의 아미노산 서열을 포함하는 VHH를 포함하는, 항체 또는 항원 결합 단편.
  114. 제108항 내지 제113항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하고, IL-2 폴리펩타이드를 추가로 포함하는 면역접합체 분자.
  115. 제114항에 있어서, 상기 IL-2 폴리펩타이드가 야생형 또는 돌연변이형 IL-2인, 면역접합체 분자.
  116. 차폐 모이어티에 접합된 IL-2 폴리펩타이드를 포함하는 면역접합체 분자로서,
    상기 차폐 모이어티는 상기 IL-2 폴리펩타이드 및 제1 표적 항원에 결합할 수 있는 투인원 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고,
    상기 IL-2 폴리펩타이드에 결합하는 경우, 상기 차폐 모이어티는 제1 IL-2 수용체(IL-2R) 서브유닛에 대한 상기 IL-2 폴리펩타이드의 결합을 차단하고, 및
    상기 제1 표적 항원에 결합하는 경우, 상기 차폐 모이어티는 상기 IL-2 폴리펩타이드에서 해리되어 제1 IL-2R 서브유닛과 결합하기 위한 상기 IL-2 폴리펩타이드를 방출하는, 면역접합체 분자.
  117. 제116항에 있어서, 상기 IL-2 폴리펩타이드는 제2 IL-2R 서브유닛에 대한 IL-2 폴리펩타이드의 결합을 약화시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는, 면역접합체 분자.
  118. 제116항 또는 제117항에 있어서, 상기 제1 IL-2R 서브유닛은 IL-2R α-사슬(IL-2Rα)이고, 및 상기 제2 IL-2R 서브유닛은 IL-2R β-사슬(IL-2Rβ)인, 면역접합체 분자.
  119. 제118항에 있어서, 상기 제2 IL-2R 서브유닛에 대한 IL-2 폴리펩타이드의 결합은 야생형 IL-2와 비교하여 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99% 감소되어 있는, 면역접합체 분자.
  120. 제118항 또는 제119항에 있어서, IL-2Rβ에 대한 상기 IL-2 폴리펩타이드의 결합을 약화시키는 상기 하나 이상의 돌연변이는 D20T, D20G, D20A, H16E, H16R, H16A, N88D, N88S, N88R, V91G, V91A, V91R 및 V91S, 또는 이들의 조합에서 선택되는, 면역접합체 분자.
  121. 제118항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 차폐 모이어티는 IL-2의 잔기 P34, K35, R38, T41, F42, K43, F44, Y45, E61, E62, K64, P65, E68, V69, N71, L72, Q74, Y107 및 D109 중 하나 이상을 포함하는 IL-2의 에피토프에 결합하는, 면역접합체 분자.
  122. 제118항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 차폐 모이어티는
    (a) 서열번호 101의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역과 서열번호 102의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체에 의해 인식되는 IL-2의 에피토프에 결합하고;
    (b) 서열번호 101의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역과 서열번호 102의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 IL-2에 대한 결합에 대해 경쟁하는, 면역접합체 분자.
  123. 제118항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 차폐 모이어티는
    (a) 표 1에 제시된 바와 같은 항체 B10의 VL 상보성 결정 영역 1(CDR1), VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 및/또는
    (b) 표 2에 제시된 바와 같은 항체 B10의 VH 상보성 결정 영역 1(CDR1), VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는, 면역접합체 분자.
  124. 제123항에 있어서, 상기 차폐 모이어티는
    (a) 각각, 서열번호 103, 17 및 104의 아미노산 서열을 포함하는 상기 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3, 및
    (b) 각각, 서열번호 105, 106 및 38의 아미노산 서열을 포함하는 상기 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하는, 면역접합체 분자.
  125. 제123항에 있어서, 상기 차폐 모이어티는
    (a) 표 3에 제시된 바와 같은 항체 B10의 VL을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 및/또는
    (b) 표 4에 제시된 바와 같은 항체 B10의 VH를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는, 면역접합체 분자.
  126. 제123항에 있어서, 상기 차폐 모이어티는 서열번호 101의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 면역접합체 분자.
  127. 제123항에 있어서, 상기 차폐 모이어티는 서열번호 102의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는, 면역접합체 분자.
  128. 제123항에 있어서, 상기 차폐 모이어티는
    (a) 서열번호 101의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 및
    (b) 서열번호 102의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는, 면역접합체 분자.
  129. 제116항 또는 제117항에 있어서, 상기 제1 IL-2R 서브유닛은 상기 IL-2Rβ이고, 상기 제2 IL-2R 서브유닛은 상기 IL-2Rα인, 면역접합체 분자.
  130. 제129항에 있어서, 상기 IL-2Rα에 대한 상기 IL-2 폴리펩타이드의 결합은 야생형 IL-2와 비교하여 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99% 감소되어 있는, 면역접합체 분자.
  131. 제129항 또는 제130항에 있어서, 상기 IL-2Rα에 대한 상기 IL-2 폴리펩타이드의 결합을 약화시키는 하나 이상의 돌연변이는 K35E, R38A, R38E, R38D, F42A, F42K, K43E, Y45A, E61R, E62A, L72G, 또는 이들의 조합에서 선택되고,
    선택적으로 상기 IL-2Rα에 대한 상기 IL-2 폴리펩타이드의 결합을 약화시키는 하나 이상의 돌연변이는
    (a) F42A; 또는
    (b) K35E와 F42A인, 면역접합체 분자.
  132. 제129항 내지 제131항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 차폐 모이어티는 IL-2의 잔기 L12, Q13, E15, H16, L19, D20, M23, R81, D84, D87, N88, V91, I92 및 E95 중 하나 이상을 포함하는 IL-2의 에피토프에 결합하는, 면역접합체 분자.
  133. 제129항 내지 제131항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 차폐 모이어티는
    (a) 항체 5UTZ에 의해 인식되는 IL-2의 에피토프에 결합하거나; 또는
    (b) 항체 5UTZ와 IL-2에 대한 결합에 대해 경쟁하는, 면역접합체 분자.
  134. 제116항 내지 제133항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-2 폴리펩타이드는 IL-2R γ-사슬(IL-2Rγ)에 대한 IL-2 폴리펩타이드의 결합을 변형시키는 하나 이상의 돌연변이를 추가로 포함하고, 여기서 선택적으로 IL-2Rγ에 대한 상기 IL-2 폴리펩타이드의 결합을 변형시키는 상기 하나 이상의 돌연변이는 L18R, Q22E, T123A, Q126T, I129V, S130A, S130R, 또는 이들의 조합에서 선택되는, 면역접합체 분자.
  135. 제116항 내지 제134항 중 어느 한 항에 있어서, 고정 모이어티를 추가로 포함하며, 상기 고정 모이어티는 제2 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 면역접합체 분자.
  136. 제116항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 차폐 모이어티는 제1 세포의 표면에서 발현되는 제1 표적 항원의 존재 하에서 상기 IL-2 폴리펩타이드로부터 해리되는, 면역접합체 분자.
  137. 제136항에 있어서, 상기 제2 표적 항원은 상기 제1 세포 또는 상기 제1 세포에 근접한 제2 세포의 표면에서 발현되는, 면역접합체 분자.
  138. 제137항에 있어서, 상기 제1 표적 항원과 상기 제2 표적 항원은 동일하거나 상이한, 면역접합체 분자.
  139. 제116항 내지 제138항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 표적 항원 및/또는 상기 제2 표적 항원은 종양 관련 항원인, 면역접합체 분자.
  140. 제116항 내지 제139항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 표적 항원과 상기제2 표적 항원은, 각각 독립적으로, FAP, Her2, Her3, CD19, CD20, BCMA, PSMA, CEA, cMET, EGFR, CA-125, MUC-1, EpCAM 또는 Trop-2에서 선택되는, 면역접합체 분자.
  141. 제140항에 있어서, 상기 제1 표적 항원은 FAP인, 면역접합체 분자.
  142. IL-2R을 활성화시키는 방법으로서, 제116항 내지 제141항 중 어느 한 항에 따른 면역접합체 분자의 유효량을 상기 IL-2R과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  143. 제142항에 있어서, 상기 IL-2R은 IL-2Rβ를 포함하는, 방법.
  144. 제142항 또는 제143항에 있어서, 상기 IL-2R은 IL-2Rα를 포함하는, 방법.
  145. 제142항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-2R은 IL-2Rγ를 포함하는, 방법.
  146. 제142항에 있어서, 상기 IL-2R은 IL-2Rβ를 포함하고, 여기서 IL-2Rβ는 제1 세포의 표면에서 발현되는, 방법.
  147. 제146항에 있어서, 상기 IL-2R은 IL-2Rγ를 추가로 포함하고, 여기서 IL-2Rγ는 제1 세포의 표면에서 발현되는, 방법.
  148. 제146항 또는 제147항에 있어서, 상기 IL-2R은 IL-2Rα를 추가로 포함하고;
    선택적으로 상기 IL-2Rα는 세포 표면에 회합되어 있고; 선택적으로 상기 IL-2Rα는 제1 세포의 표면에 회합되어 있거나(시스-제시); 또는 선택적으로 상기 IL-2Rα는 제2 세포의 표면에 회합되어 있고(트랜스-제시);
    선택적으로 상기 IL-2Rα는 세포 표면에 회합되어 있지 않는, 방법.
  149. 제146항 또는 제147항에 있어서, 상기 IL-2R은 IL-2Rα를 포함하지 않는, 방법.
  150. 제146항 내지 제149항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 세포 및/또는 상기 제2 세포는 면역세포이고, 상기 IL-2R의 활성화 시, 상기 면역세포는 활성화되는, 방법.
  151. 제150항에 있어서, 상기 면역세포의 활성화가 하기와 같이 측정되는, 방법:
    (a) 상기 면역세포의 증식 또는 성숙의 증가;
    선택적으로 표적세포의 증식 또는 성숙은 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 100%, 약 125%, 약 150%, 약 175%, 약 200%, 약 250%, 약 300%, 약 400%, 약 500%, 약 600%, 약 700%, 약 800%, 약 900% 또는 약 1000% 만큼 증가됨; 또는
    (b) 상기 면역세포의 생존 기간 연장;
    선택적으로 표적세포의 생존 기간은 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 100%, 약 125%, 약 150%, 약 175%, 약 200%, 약 250%, 약 300%, 약 400%, 약 500%, 약 600%, 약 700%, 약 800%, 약 900% 또는 약 1000% 만큼 증가됨.
  152. 제150항 또는 제151항에 있어서, 상기 면역세포는 이펙터 T세포, 기억 T세포, 또는 이들의 조합인, 방법.
  153. 제152항에 있어서, 상기 면역세포는 CD4+ T세포, CD8+ T세포, 헬퍼 T세포, 세포독성 T세포, SLEC(단기 이펙터 세포), MPEC(기억 전구 이펙터 세포), TE(말단 이펙터 세포), NK(자연살해세포), NKT(자연살해 T세포), 선천성 림프구 세포(I형 내지 III형), 또는 이들의 조합인, 방법.
  154. 제150항 또는 제151항에 있어서, 상기 면역세포는 조절 T세포(Treg)인, 방법.
  155. 제154항에 있어서, 상기 면역세포는 천연 Treg(nTreg) 세포, 유도된 Treg(iTreg) 세포, 또는 이들의 조합인, 방법.
  156. 제146항 내지 제149항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 세포 및/또는 제2 세포가 병든 세포이며, 및 상기 IL-2R의 활성화 시, 병든 세포가 사멸하는, 방법.
  157. 제156항에 있어서,
    (a) 상기 병든 세포가 암 세포이거나, 또는
    (d) 상기 병든 세포가 감염성 병원체에 의해 감염된 세포이고;
    선택적으로 상기 감염성 병원체는 바이러스, 박테리아, 진균, 기생충, 또는 이들의 조합인, 방법.
  158. IL-2R을 발현하는 표적세포를 활성화시키는 방법으로서, 제116항 내지 제141항 중 어느 한 항에 따른 면역접합체 분자의 유효량을 표적세포와 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 IL-2 폴리펩타이드와 상기 IL-2R의 결합 시, 표적세포가 활성화되고,
    선택적으로 상기 표적세포는 면역세포이고;
    선택적으로 상기 표적세포는 이펙터 T세포, 기억 T세포, 조절 T세포, 또는 이들의 조합이고;
    선택적으로 상기 표적세포는 CD4+ T세포, CD8+ T세포, 헬퍼 T세포, 세포독성 T세포, SLEC(단기 이펙터 세포), MPEC(기억 전구 이펙터 세포), TE(말단 이펙터 세포), NK(자연살해세포), NKT(자연살해 T세포), 선천성 림프구 세포(I형 내지 III형), 또는 이들의 조합이고;
    선택적으로 상기 표적세포는 천연 Treg(nTreg) 세포, 유도된 Treg(iTreg) 세포, 또는 이들의 조합이고;
    선택적으로 상기 표적세포의 활성화는 하기와 같이 측정되는 방법:
    (a) 상기 표적세포의 증식 또는 성숙의 증가;
    선택적으로 상기 표적세포의 증식 또는 성숙은 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 100%, 약 125%, 약 150%, 약 175%, 약 200%, 약 250%, 약 300%, 약 400%, 약 500%, 약 600%, 약 700%, 약 800%, 약 900% 또는 약 1000% 만큼 증가됨; 또는
    (b) 상기 표적세포의 생존 기간 연장;
    선택적으로 상기 표적세포의 생존 기간은 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 100%, 약 125%, 약 150%, 약 175%, 약 200%, 약 250%, 약 300%, 약 400%, 약 500%, 약 600%, 약 700%, 약 800%, 약 900% 또는 약 1000% 만큼 증가됨.
  159. 제158항에 있어서, 상기 접촉시키는 단계는 약학적으로 허용 가능한 담체와 제116항 내지 제141항 중 어느 한 항에 따른 면역접합체 분자를 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 것을 추가로 포함하고,
    선택적으로 상기 접촉시키는 단계는 항신생물성 면역 반응을 증강시키고;
    선택적으로 상기 접촉시키는 단계는 항감염 면역 반응을 증강시키는, 방법.
  160. T세포 집단의 항원 특이적 면역 반응을 증강시키는 방법으로서, 제116항 내지 제141항 중 어느 한 항에 따른 면역접합체 분자의 유효량을 T세포 집단과 접촉시키는 단계를 포함하고;
    선택적으로 상기 접촉시키는 단계는 항원 특이적 이펙터 T세포의 증식 또는 성숙을 증강시키고;
    선택적으로 상기 접촉시키는 단계는 항원 특이적 기억 T세포의 형성을 증강시키고;
    선택적으로 상기 접촉시키는 단계는 항원의 존재 하에서 수행되며; 및 선택적으로 상기 항원은 암, 종양, 병원체 또는 알레르겐의 항원인, 방법.
  161. T세포 집단에 의한 전염증성 사이토카인의 분비를 증가시키는 방법으로서, 제116항 내지 제141항 중 어느 한 항에 따른 면역접합체 분자를 T세포 집단과 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 상기 IL-2 폴리펩타이드는 결합 시 T세포를 활성화시키고;
    선택적으로 상기 사이토카인은 IL-1, IL-2, IL-6, IL-12, IL-17, IL-22, IL-23, GM-CSF, TNF-α, IFN-γ, 또는 이들의 임의의 조합이고;
    선택적으로 사이토카인 생산은 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 100%, 약 125%, 약 150%, 약 175%, 약 200%, 약 250%, 약 300%, 약 400%, 약 500%, 약 600%, 약 700%, 약 800%, 약 900% 또는 약 1000% 만큼 증가되는 방법.
  162. 표적세포의 표면에 IL-2R의 어셈블리를 증가시키는 방법으로서, 제116항 내지 제141항 중 어느 한 항에 따른 면역접합체 분자의 유효량을 표적세포와 접촉시키는 단계를 포함하고,
    선택적으로 상기 IL-2R은 상기 표적세포의 표면에 IL-2Rα, IL-2Rβ, IL-2Rγ, 또는 이들의 조합을 포함하고;
    선택적으로 상기 IL-2R은 상기 표적세포의 표면에 IL-2Rβ와 IL-2Rγ를 포함하고, 상기 표적세포에 근접한 제2 세포의 표면에 IL-2Rα를 포함하고;
    선택적으로 상기 IL-2R은 상기 표적세포의 표면에 IL-2Rβ와 IL-2Rγ를 포함하고, IL-2Rα는 세포 표면과 회합되어 있지 않으며;
    선택적으로 상기 표적세포의 표면 상의 IL-2R의 어셈블리는 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 100%, 약 125%, 약 150%, 약 175%, 약 200%, 약 250%, 약 300%, 약 400%, 약 500%, 약 600%, 약 700%, 약 800%, 약 900% 또는 약 1000% 만큼 증가되고;
    선택적으로 상기 표적세포는 면역세포이고;
    선택적으로 상기 표적세포는 이펙터 T세포, 기억 T세포, 조절 T세포, 또는 이들의 조합이고;
    선택적으로 상기 표적세포는 CD4+ T세포, CD8+ T세포, 헬퍼 T세포, 세포독성 T세포, SLEC(단기 이펙터 세포), MPEC(기억 전구 이펙터 세포), TE(말단 이펙터 세포), NK(자연살해세포), NKT(자연살해 T세포), 선천성 림프구 세포(I형 내지 III형), 또는 이들의 조합이고;
    선택적으로 상기 표적세포는 천연 Treg(nTreg) 세포, 유도된 Treg(iTreg) 세포, 또는 이들의 조합인 방법.
  163. 병든 세포 집단을 둘러싸는 조직에 전염증성 환경을 형성하는 방법으로서, 제116항 내지 제141항 중 어느 한 항에 따른 면역접합체 분자의 유효량을 조직과 접촉시키는 단계를 포함하고;
    선택적으로 여기서:
    (a) 상기 조직 내 활성화된 B세포, CD4+ 이펙터 T세포, CD8+ 이펙터 T세포, 수지상세포, 대식세포, 자연살해세포, 단핵구, 과립구, 호산구 및/또는 호중구의 농도가 증가되고/되거나;
    (b) 상기 조직 내 조절 T세포의 농도가 감소되고/되거나;
    (c) 전염증성 사이토카인의 농도가 상기 조직에서 증가되고;
    선택적으로 여기서 전염증성 사이토카인은 IL-1, IL-2, IL-6, IL-12, IL-17, IL-22, IL-23, GM-CSF, TNF-α, IFN-γ, 또는 이들의 임의의 조합이고/이거나;
    (d) 상기 병든 세포에서 유래하거나 유도된 항원에 결합하는 항체의 농도가 상기 조직에서 증가되고/되거나;
    (e) 항원제시세포에 의한 상기 병든 세포에서 유래하거나 유도된 항원의 제시가 상기 조직에서 증가되고/되거나;
    (f) 상기 병든 세포의 포식작용이 상기 조직에서 증가되고/되거나;
    (g) 세포 매개 세포독성에 의해 유도된 상기 병든 세포의 세포자멸사가 상기 조직에서 증가되고/되거나;
    (h) 항체 의존성 세포독성에 의해 유도된 상기 병든 세포의 세포자멸사가 상기 조직에서 증가되고/되거나;
    (i) 상기 병든 세포 집단이 상기 조직에서 감소되고,
    선택적으로 여기서 병든 세포 집단이 조직에서 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99% 만큼 감소되는, 방법.
  164. 대상에서 병든 세포를 제거하는 방법으로서, 제116항 내지 제141항 중 어느 한 항에 따른 면역접합체 분자의 유효량을 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함하며;
    선택적으로 여기서:
    (a) 상기 병든 세포는 암 세포이거나, 또는
    (d) 상기 병든 세포는 감염성 병원체에 의해 감염된 세포이고,
    선택적으로 여기서 감염성 병원체는 바이러스, 박테리아, 진균, 기생충, 또는 이들의 조합인, 방법.
  165. 암 치료를 필요로 하는 대상에서 암을 치료하는 방법으로서, 제116항 내지 제141항 중 어느 한 항에 따른 면역접합체 분자의 유효량을 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함하며;
    선택적으로 여기서
    (a) 상기 치료는 선천성, 체액성 또는 세포 매개 항신생물성 면역 반응을 증강시키고; 및/또는
    (b) 상기 방법은 제2 요법의 병용투여를 추가로 포함하는, 방법.
  166. 감염의 치료를 필요로 하는 대상에서 감염을 치료하는 방법으로서, 제116항 내지 제141항 중 어느 한 항에 따른 면역접합체 분자의 유효량을 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함하고;
    선택적으로 여기서:
    (a) 상기 치료는 선천성, 체액성 또는 세포 매개 항감염성 면역 반응을 증강시키고;
    (b) 상기 대상은 상기 감염을 예방하기 위한 백신 조성물이 상기 대상에게 병용투여되고;
    선택적으로 여기서 백신 조성물은 동시에 또는 순차적으로 병용투여되는, 방법.
  167. 항원에 대한 반응 증가를 필요로 하는 대상에서 항원에 대한 반응을 증가시키는 방법으로서, 제116항 내지 제141항 중 어느 한 항에 따른 면역접합체 분자의 유효량을 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함하며;
    선택적으로 상기 항원은 암, 종양, 병원체 또는 알레르겐의 항원이고,
    선택적으로 상기 항원은 하기에서 유래하거나 유도된 것인 방법:
    (a) 감염성 병원체;
    선택적으로 여기서 감염성 병원체는 바이러스, 박테리아, 진균, 기생충, 또는 이들의 조합임;
    (b) 병든 세포;
    (c) 감염성 병원체에 의해 감염된 세포,
    선택적으로 여기서 감염성 병원체는 바이러스, 박테리아, 진균, 기생충, 또는 이들의 조합임; 또는
    (d) 암 세포.
  168. 백신에 대한 반응 증가를 필요로 하는 대상에서 백신에 대한 반응을 증가시키는 방법으로서, 백신과 제116항 내지 제141항 중 어느 한 항에 따른 면역접합체 분자의 유효량을 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함하며;
    선택적으로 여기서 백신은 종양, 암, 병원체 또는 알레르겐에 대한 백신이고;
    선택적으로 여기서 면역접합체 분자는 백신용 아쥬반트 조성물로 제형화된 것인, 방법.
  169. 항원을 둘러싸는 조직에 항원의 면역 관용을 확립하는 방법으로서, 제116항 내지 제141항 중 어느 한 항에 따른 면역접합체 분자의 유효량을 조직과 접촉시키는 단계를 포함하고;
    선택적으로 여기서:
    (a) 상기 조직 내 활성화된 B세포, CD4+ 이펙터 T세포, CD8+ 이펙터 T세포, 수지상세포, 대식세포, 자연살해세포, 단핵구, 과립구, 호산구 및/또는 호중구의 농도가 감소되고;
    (b) 상기 조직 내 조절 T세포의 농도가 증가되고;
    (c) 전염증성 사이토카인의 농도가 상기 조직에서 감소되고,
    선택적으로 여기서 전염증성 사이토카인은 IL-1, IL-2, IL-6, IL-12, IL-17, IL-22, IL-23, GM-CSF, TNF-α, IFN-γ, 또는 이들의 임의의 조합이고;
    (d) 상기 항원에 결합하는 항체의 농도가 상기 조직에서 감소되고;
    (e) 항원제시세포에 의한 상기 항원의 제시가 상기 조직에서 감소되고;
    (f) 상기 항원을 발현하는 세포의 포식작용이 상기 조직에서 감소되고; 및/또는
    (g) 상기 항원을 발현하는 세포의 세포자멸사가 상기 조직에서 감소되는, 방법.
  170. 제169항에 있어서, 상기 조직이 대상에 존재하고, 상기 항원이 상기 대상의 자가 항원이고; 선택적으로 상기 대상은 자가면역 질환을 앓고 있는 대상인, 방법.
  171. 자가면역 질환의 치료를 필요로 하는 대상에서 자가면역 질환을 치료하는 방법으로서, 제116항 내지 제141항 중 어느 한 항에 따른 면역접합체 분자의 유효량을 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함하고;
    선택적으로 여기서
    (a) 상기 치료는 자가 항원에 대한 선천성, 체액성 또는 세포 매개 면역 반응을 감소시키고/시키거나;
    (b) 상기 방법은 제2 요법의 병용투여를 추가로 포함하는, 방법.
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