JP7386161B2 - 腫瘍ホーミング及び細胞透過性ペプチド免疫抗がん剤複合体、ならびにそれらの使用方法 - Google Patents

腫瘍ホーミング及び細胞透過性ペプチド免疫抗がん剤複合体、ならびにそれらの使用方法 Download PDF

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Description

相互参照
本出願は、あらゆる目的で本明細書に参照によりそれらの全容を援用するところの2017年12月19日出願の米国特許仮出願第62/607,893号、及び2018年1月26日出願の米国特許仮出願第62/622,711号の利益を主張する。
配列表
本出願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出され、その全容を参照によって本明細書に援用する配列表を含む。前記ASCIIコピーは、2018年7月13日に作成され、45639-715_601_SL.txtの名前が付けられており、そのサイズは1,042,425バイトである。
がん治療は、腫瘍細胞を根絶するための特定の治療の特異性と選択性に関して、多くの課題に直面してきた。特に、がん細胞に対する宿主の免疫活性を刺激することが可能な薬剤は、全身的に投与される場合に特異性の欠如が問題となり、健康な細胞に対するオフターゲット作用を生じる場合がある。さらに、宿主の免疫活性を刺激することが可能な他の薬剤は、それらの作用部位(細胞質中へ、または血液脳関門を通過して、など)に効率的に到達しない場合がある。したがって、当該技術分野において依然として存在する重要な課題として、腫瘍微小環境への免疫抗がん剤の標的化送達、腫瘍細胞内の適当な細胞内区画内への免疫抗がん剤の取り込み、及び脳などのアクセス不能な腫瘍部位への免疫抗がん剤の送達がある。本明細書では、がん治療用の免疫抗がん剤と結合することが可能な、腫瘍ホーミング特性、細胞透過特性、及び/または血液脳関門通過特性を備えたペプチドを提供する。
さまざまな態様において、本開示は、ペプチド免疫抗がん剤複合体(ペプチドI/O複合体)を含む組成物であって、ペプチドI/O複合体のペプチドが腫瘍ホーミング性を有し、ペプチドI/O複合体の免疫抗がん剤(I/O)が、IL-15剤、RIG-Iリガンド、4-1BBリガンド、STINGリガンド、MDA5リガンド、CGASリガンド、TLR3リガンド、TLR7/8リガンド、またはTLR9リガンドである、組成物を提供する。
さまざまな態様において、本開示は、ペプチド免疫抗がん剤複合体(ペプチドI/O複合体)を含む組成物であって、ペプチドI/O複合体のペプチドが細胞透過性を有し、ペプチドI/O複合体の免疫抗がん剤(I/O)が、IL-15剤、RIG-Iリガンド、4-1BBリガンド、STINGリガンド、MDA5リガンド、CGASリガンド、TLR3リガンド、TLR7/8リガンド、またはTLR9リガンドである、組成物を提供する。
さまざまな態様において、本開示は、ペプチド免疫抗がん剤複合体(ペプチドI/O複合体)を含む組成物であって、ペプチドI/O複合体のペプチドが血液脳関門(BBB)透過性を有し、ペプチドI/O複合体の免疫抗がん剤(I/O)が、IL-15剤、RIG-Iリガンド、4-1BBリガンド、STINGリガンド、MDA5リガンド、CGASリガンド、TLR3リガンド、TLR7/8リガンド、またはTLR9リガンドである、組成物を提供する。いくつかの態様では、I/Oは受容体のアゴニストを含み、受容体はIL-15R、RIG-I、4-1BB、STING、MDA5、CGAS、TLR3、TLR7/8、またはTLR9を含む。
さまざまな態様において、本開示は、ペプチド免疫抗がん剤複合体(ペプチドI/O複合体)を含む組成物であって、ペプチドI/O複合体が、a)ペプチドであって、ペプチドI/O複合体のペプチドは、配列番号1~配列番号567、配列番号1243~配列番号1252、配列番号1263~配列番号1289のうちのいずれか1つと少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも100%の配列同一性を有する配列を含む腫瘍ホーミングペプチドであり、ペプチドは、対象に投与されると、対象の腫瘍にホーミング、ターゲティング、移動、蓄積、結合し、対象の腫瘍によって保持され、対象の腫瘍によってプロセシングされ、または対象の腫瘍に誘導される、ペプチドと、b)免疫抗がん剤(I/O)であって、ペプチドI/O複合体のI/Oは、腫瘍に対する宿主免疫応答を刺激する、I/Oと、を含む、組成物を提供する。
さまざまな態様において、本開示は、ペプチド免疫抗がん剤複合体(ペプチドI/O複合体)を含む組成物であって、ペプチドI/O複合体が、a)ペプチドであって、ペプチドI/O複合体のペプチドは、配列番号568~配列番号1134、配列番号1253~配列番号1262、配列番号1290~配列番号1316のいずれか1つと少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも100%の配列同一性を有する配列を含む腫瘍ホーミングペプチドであり、ペプチドは、対象に投与されると、対象の腫瘍にホーミング、ターゲティング、移動、蓄積、結合し、対象の腫瘍によって保持され、対象の腫瘍によってプロセシングされ、または対象の腫瘍に誘導される、ペプチドと、b)免疫抗がん剤(I/O)であって、ペプチドI/O複合体のI/Oは、腫瘍に対する宿主免疫応答を刺激する、I/Oと、を含む、組成物を提供する。
さまざまな態様において、本開示は、ペプチド免疫抗がん剤複合体(ペプチドI/O複合体)を含む組成物であって、ペプチドI/O複合体が、a)ペプチドであって、ペプチドI/O複合体のペプチドは、配列番号1~配列番号567、配列番号1243~配列番号1252、または配列番号1263~配列番号1289のうちのいずれか1つと少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも98%、または少なくとも100%の配列同一性を有する配列を含む細胞透過性ペプチドである、ペプチドと、b)免疫抗がん剤(I/O)であって、ペプチドI/O複合体のI/Oは、腫瘍に対する宿主免疫応答を刺激する、I/Oと、を含む、組成物を提供する。
さまざまな態様において、本開示は、ペプチド免疫抗がん剤複合体(ペプチドI/O複合体)を含む組成物であって、ペプチドI/O複合体が、a)ペプチドであって、ペプチドI/O複合体のペプチドは、配列番号568~配列番号1134、配列番号1253~配列番号1262、または配列番号1290~配列番号1316のうちのいずれか1つと少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも98%、または少なくとも100%の配列同一性を有する配列を含む細胞透過性ペプチドであり、ペプチドは、対象に投与されると、細胞透過性である、ペプチドと、b)免疫抗がん剤(I/O)であって、ペプチドI/O複合体のI/Oは、腫瘍に対する宿主免疫応答を刺激する、I/Oと、を含む、組成物を提供する。
さまざまな態様において、本開示は、ペプチド免疫抗がん剤複合体(ペプチドI/O複合体)を含む組成物であって、ペプチドI/O複合体が、a)ペプチドであって、ペプチドI/O複合体のペプチドは、配列番号1~配列番号567、配列番号1243~配列番号1252、または配列番号1263~配列番号1289のうちのいずれか1つと少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも98%、または少なくとも100%の配列同一性を有する配列を含む血液脳関門(BBB)透過性ペプチドであり、ペプチドは、対象に投与されると、血液脳関門(BBB)透過性である、ペプチドと、b)免疫抗がん剤(I/O)であって、ペプチドI/O複合体のI/Oは、腫瘍に対する宿主免疫応答を刺激する、I/Oと、を含む、組成物を提供する。
さまざまな態様において、本開示は、ペプチド免疫抗がん剤複合体(ペプチドI/O複合体)を含む組成物であって、ペプチドI/O複合体が、a)ペプチドであって、ペプチドI/O複合体のペプチドは、配列番号568~配列番号1134、配列番号1253~配列番号1262、または配列番号1290~配列番号1316のうちのいずれか1つと少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも98%、または少なくとも100%の配列同一性を有する配列を含む血液脳関門(BBB)透過性ペプチドであり、ペプチドは、対象に投与されると、血液脳関門(BBB)透過性である、ペプチドと、b)免疫抗がん剤(I/O)であって、ペプチドI/O複合体のI/Oは、腫瘍に対する宿主免疫応答を刺激する、I/Oと、を含む、組成物を提供する。
いくつかの態様では、I/Oは、IL-15剤、RIG-Iリガンド、4-1BBリガンド、STINGリガンド、MDA5リガンド、CGASリガンド、TLR3リガンド、TLR7/8リガンド、またはTLR9リガンドを含む。
いくつかの態様では、I/Oは受容体または標的のアゴニストを含み、受容体または標的はIL-15R、RIG-I、4-1BB、STING、MDA5、CGAS、TLR、TLR7/8、またはTLR9を含む。
いくつかの態様では、ペプチドは腫瘍ホーミング特性を有する。いくつかの態様では、ペプチドは細胞透過特性を有する。いくつかの態様では、細胞透過特性は、エンドソーム内への取り込み、細胞内区画内への取り込み、細胞内区画内の取り込み及びプロセシングならびに分泌、細胞質への取り込み及び送達、取り込み及びトランスサイトーシス、取り込み及び核局在化、取り込み及び細胞外提示、ピノサイトーシス、腫瘍微小環境への取り込み、切断、及び分泌、または細胞表面タンパク質への取り込み及び提示を含む。いくつかの態様では、ペプチドI/O複合体はサイトゾルをターゲティングする。いくつかの態様では、ペプチドI/O複合体は、取り込まれ、プロセシングされ、細胞外に提示される。
いくつかの態様では、ペプチドI/O複合体は、細胞区画に進入、蓄積するか、または細胞区画内でプロセシングされ、前記細胞区画が、細胞内区画、細胞質、小胞体、ゴルジ装置、エンドソーム、またはリソソームを含む。いくつかの態様では、ペプチドは、対象の腫瘍にホーミングするか、ターゲティングするか、移動するか、蓄積するか、結合するか、対象の腫瘍によって保持され、対象の腫瘍によってプロセシングされ、または対象の腫瘍に誘導される。いくつかの態様では、ペプチドは、腫瘍細胞環境中、細胞内、エンドソーム内、リソソーム内、サイトゾル内、小胞体内、またはゴルジ装置内でペプチドI/O複合体から切断される。
いくつかの態様では、ペプチドは血液脳関門(BBB)を通過する。いくつかの態様では、ペプチドI/O複合体、ペプチド、I/O、またはそれらの任意の組み合わせが、細胞サイトゾル、細胞内区画、小胞体、ゴルジ装置、エンドソーム、リソソームに進入する。いくつかの態様では、I/Oは免疫原性細胞死(ICD)を刺激する。いくつかの態様では、ペプチドI/O複合体は、細胞または腫瘍微小環境によってプロセシングされる。いくつかの態様では、細胞または腫瘍微小環境によるペプチドI/O複合体のプロセシングは、ペプチドI/O複合体の活性、濃度、方法、または場所を変化させる。
いくつかの態様では、IL-15剤はIL-15超アゴニストを含む。いくつかの態様では、IL-15剤は、IL-15ドメインとIL-15Rα sushi+ドメインとの融合体を含む。
いくつかの態様では、IL-15剤は、下式:L-X-L-Y-L(式中、X、Yのいずれか1つは、配列番号1177または配列番号1178または配列番号1491を含み、X、Yのいずれか1つは、配列番号1176または配列番号1179を含み、L、L、Lは、配列番号1163~配列番号1172または配列番号1359~配列番号1366または配列番号1139~配列番号1161のうちのいずれか1つを含み、またはL、L、Lは、Xnを含み、ただし各Xは、個々に任意のアミノ酸を含み、nは1~50の任意の数であるかまたは存在しない)を含む。
いくつかの態様では、IL-15剤は、2個の配列番号1177の部分と、1個の配列番号1179の部分とを含む。いくつかの態様では、IL-15剤は、2個の配列番号1178の部分と、1個の配列番号1179の部分とを含む。いくつかの態様では、IL-15剤は、表3から選択される。いくつかの態様では、ペプチド-IL-15剤は、配列番号1317~配列番号1341、及び配列番号1343~配列番号1348から選択される。いくつかの態様では、IL-15剤は、L0-X-L-Y-Lから選択される(ただし、任意の組み合わせで、Lは、配列番号1169または配列番号1163であってよく、Xは、配列番号1176または配列番号1179であってよく、Yは、配列番号1177、配列番号1178であってよい)。いくつかの態様では、ペプチドI/O複合体は、表4から選択される。
いくつかの態様では、RIG-Iリガンドは、二本鎖RNA(dsRNA)を含む。いくつかの態様では、RIG-Iリガンドは、ヘアピンRNAを含む。いくつかの態様では、MDA5リガンドは、二本鎖RNA(dsRNA)を含む。いくつかの態様では、MDA5リガンドは、ヘアピンRNAを含む。いくつかの態様では、dsRNAは、10~60塩基対を含む。いくつかの態様では、dsRNAは、11~18塩基対を含む。いくつかの態様では、dsRNAは、7~10塩基対を含む。いくつかの態様では、dsRNAは、ヘアピンRNAを含む。いくつかの態様では、ヘアピンRNAは、14~120塩基対を含む。いくつかの態様では、ヘアピンRNAは、7~60塩基対を含む。いくつかの態様では、単一のヘアピンRNAの少なくとも1個の塩基対は、前記ヘアピンRNA内で第2の塩基と対合した第1の塩基を含む。いくつかの態様では、ヘアピンRNAは、5’三リン酸を含む。いくつかの態様では、ヘアピンRNAは、単一のヘアピンRNAである。いくつかの態様では、RIG-Iリガンドは、5’三リン酸を含む。いくつかの態様では、RIG-Iリガンドは、5’二リン酸を含む。いくつかの態様では、RIG-Iリガンドは、キャップされていない5’AまたはGを含む。いくつかの態様では、RIG-Iリガンドは、平滑末端に5’三リン酸を含む。いくつかの態様では、RIG-Iリガンドは、マイナス鎖RNAウイルスのパンハンドル領域を含む。
いくつかの態様では、RIG-Iリガンドは、ベンゾビスチアゾール化合物を含む。いくつかの態様では、RIG-IリガンドのRNA骨格は、RIG-Iリガンドの非修飾RNA骨格と比較してインビボ安定性を高める修飾を含む。いくつかの態様では、修飾は、2’-フルオロ-修飾、ホスホロチオエート置換、メチルホスホネート修飾、2’-Oメチル修飾、2’-F RNA塩基、架橋核酸、モルホリノ核酸、PNA、LNA、エチルcEt核酸、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、RIG-Iリガンドは、それ自身の二本鎖を形成する。いくつかの態様では、RIG-Iリガンドは表6から選択される。
いくつかの態様では、RIG-Iリガンドは、配列番号1180及び配列番号1181、配列番号1182及び配列番号1183、配列番号1184及び配列番号1185、配列番号1186及び配列番号1187、配列番号1189及び配列番号1190、配列番号1191及び配列番号1192、配列番号1203及び配列番号1204、配列番号1205及び配列番号1206、配列番号1235及び配列番号1236、配列番号1237及び配列番号1238、配列番号1239及び配列番号1240、ならびに配列番号1241及び配列番号1242である。いくつかの態様では、配列番号1189、配列番号1191、配列番号1196、または配列番号1198が、センス鎖の5’末端に三リン酸を含む。いくつかの態様では、配列番号1196は、三リン酸を含まない。いくつかの態様では、配列番号1180~配列番号1187は、5’三リン酸基を含む。いくつかの態様では、RIG-Iリガンドは、配列番号1371である。
いくつかの態様では、MDA5リガンドは、キャップされていない5’AまたはGを含む。いくつかの態様では、MDA5リガンドは、マイナス鎖RNAウイルスのパンハンドル領域を含む。いくつかの態様では、MDA5リガンドは、ベンゾビスチアゾール化合物を含む。いくつかの態様では、MDA5リガンドのRNA骨格は、MDA5リガンドの非修飾RNA骨格と比較してインビトロまたはインビボ安定性を高める修飾を含む。
いくつかの態様では、修飾は、2’-フルオロ-修飾、ホスホロチオエート置換、メチルホスホネート置換、2’-Oメチル修飾、2’-F RNA塩基、架橋核酸、モルホリノ核酸、PNA、LNA、エチルcEt核酸、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、MDA5リガンドは、それ自身の二本鎖を形成する。いくつかの態様では、MDA5リガンドは表6から選択される。いくつかの態様では、MDA5リガンドは、配列番号1180及び配列番号1181、配列番号1182及び配列番号1183、配列番号1184及び配列番号1185、配列番号1186及び配列番号1187、配列番号1189及び配列番号1190、配列番号1191及び配列番号1192、配列番号1203及び配列番号1204、配列番号1205及び配列番号1206、配列番号1235及び配列番号1236、配列番号1237及び配列番号1238、配列番号1239及び配列番号1240、ならびに配列番号1241及び配列番号1242、及び配列番号1193、及び配列番号1194、及び配列番号1195、及び配列番号1196、及び配列番号1197、及び配列番号1198、及び配列番号1200である。
いくつかの態様では、MDA5リガンドは、5’三リン酸、5’二リン酸、5’一リン酸、及びリボースの2’-O-メチル化の5’キャップの1つ以上を含まない。いくつかの態様では、MDA5リガンドが、5’三リン酸を欠いてもよく、リボース2’-O-メチル化の5’キャップを欠いてもよい。いくつかの態様では、MDA5リガンドまたはTLR3リガンドは、二本鎖RNA(dsRNA)である。いくつかの態様では、dsRNAは、12~6000塩基対を含む。いくつかの態様では、dsRNAは、11個よりも多い塩基対を含む。いくつかの態様では、ヘアピンRNAは、12~6000塩基対を含む。いくつかの態様では、ヘアピンRNAは、12~40塩基対を含む。いくつかの態様では、MDA5リガンドは、12~40bpの任意のdsRNAである。いくつかの態様では、dsRNAは、三リン酸を含まない。
いくつかの態様では、4-1BBリガンドは、ヒト4-1BBリガンド(4-1BBL)ペプチドの自然配列またはそのフラグメントを含む。いくつかの態様では、4-1BBリガンドは、ヒトもしくはヒト化モノクローナル抗体、モノクローナル抗体またはFc融合タンパク質を含むか、または前記抗体が、scFv、Fab、Fc、重鎖、軽鎖、一本鎖、もしくは相補性決定領域(CDR)、またはそれらの任意の組み合わせを含む抗体フラグメントである。いくつかの態様では、4-1BBリガンドは、抗4-1BB抗体を含む。
いくつかの態様では、抗4-1BBモノクローナル抗体は、scFv部分と融合されて二重特異性分子を形成する。いくつかの態様では、4-1BBリガンドは、ヒトコラーゲンのコラーゲンC-プロペプチドなどの三量体化ドメインと融合される。いくつかの態様では、4-1BBリガンドは、ヒト4-1BBに結合してこれを活性化する抗イディオタイプ抗体、及びscFv、Fab、Fc、重鎖、軽鎖、一本鎖、もしくは相補性決定領域(CDR)、またはそれらの任意の組み合わせを含む抗体フラグメントを含む。いくつかの態様では、4-1BBリガンドは、ウレルマブを含む。いくつかの態様では、ウレルマブは、2個の配列番号1225の部分と、2個の配列番号1226の部分との複合体を含む。いくつかの態様では、4-1BBリガンドは、ウトミルマブを含む。いくつかの態様では、ウトミルマブは、2個の配列番号1228の部分と、2個の配列番号1229の部分との複合体を含む。いくつかの態様では、4-1BBリガンドは表5から選択される。いくつかの態様では、4-1BBリガンドは、配列番号1225~配列番号1229のうちのいずれか1つである。
いくつかの態様では、STINGリガンドは、環状ジヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、環状ジヌクレオチドは、2’,3’-cGAMPを含む。いくつかの態様では、STINGリガンドは、DMXAA類似体を含む。いくつかの態様では、STINGリガンドまたはアゴニストは、4-(2-クロロ-6-フルオロベンジル)-N-(フラン-2-イルメチル)-3-オキソ-3,4-ジヒドロ-2H-ベンゾ[b][1,4]チアジン-6-カルボキサミドを含む。いくつかの態様では、STINGリガンドは、1個のアデノシンヌクレオシド及び1個のイノシンヌクレオシドを含む。いくつかの態様では、STINGリガンドが、ジスピロジケトピペリジン(DSDP)を含む。いくつかの態様では、STINGリガンドは、cGMPの合成類似体を含む。いくつかの態様では、STINGリガンドは、ホスホチオエステルを含む。いくつかの態様では、STINGリガンドは、表8から選択される。
いくつかの態様では、STINGリガンドは、その標的に対するアゴニストとして作用する。いくつかの態様では、ペプチドは、前記ペプチドのN末端において、内部リシン残基のεアミンにおいて、アスパラギン酸またはグルタミン酸残基のカルボン酸において、システイン残基において、またはC末端において前記I/Oに連結される。いくつかの態様では、ペプチドは非天然アミノ酸をさらに含み、前記非天然アミノ酸が別のアミノ酸に対する挿入、付加、または置換である。いくつかの態様では、ペプチドとI/Oとは、融合体として組換えにより発現される。いくつかの態様では、ペプチドは、リンカーによって非天然アミノ酸においてI/Oに連結される。
いくつかの態様では、リンカーは、アミド結合、エステル結合、カルバメート結合、カーボネート結合、ヒドラゾン結合、オキシム結合、ジスルフィド結合、チオエステル結合、チオエーテル結合、ボロン酸エステル複合体、トリアゾール、炭素-炭素結合、炭素-窒素結合、または天然アミノ酸を含む。いくつかの態様では、リンカーは、腫瘍内または細胞内で選択的に切断されるように調整可能な切断速度を有する。いくつかの態様では、ペプチドI/O複合体は、スペーサーを含む。いくつかの態様では、ペプチドとI/Oとは結合されている。いくつかの態様では、ペプチドとI/Oとは化学的に結合されるか、または組換え融合体により結合される。いくつかの態様では、ペプチドとI/Oとは、切断可能なリンカーによって連結される。
いくつかの態様では、切断可能なリンカーは、低pH、還元剤、グルタチオン、プロテアーゼ、酵素によって切断されるか、または加水分解に不安定であることにより、切断されたI/Oを生成する。いくつかの態様では、酵素は、マトリックスメタロプロテイナーゼ、エステラーゼ、トロンビン、カテプシン、ペプシノーゲン、ゼラチナーゼ、エラスターゼ、トリプシン、プラスミノーゲン活性化因子、ヒアルロニダーゼ、またはグルクロニダーゼである。いくつかの態様では、切断可能なリンカーは、腫瘍微小環境に送達されたとき、腫瘍微小環境内の細胞の表面で、腫瘍細胞の表面で、細胞の細胞質内で、または細胞内区画でのみ、またはそこで選択的に切断される。いくつかの態様では、細胞内区画は、小胞体、エンドソーム、リソソーム、またはゴルジ装置を含む。
いくつかの態様では、酵素切断可能なリンカーは、配列番号1139~配列番号1161、配列番号1360~配列番号1363、及び配列番号1365のうちのいずれか1つを含む。いくつかの態様では、切断されたI/Oは、I/Oと比較して化学的に修飾されている。いくつかの態様では、切断されたI/Oは、I/Oと比較して化学的に修飾されていない。いくつかの態様では、切断されたI/Oは、I/Oと比較して異なる効力または活性を有する。いくつかの態様では、切断されたI/Oは、ペプチドI/O複合体と比較して異なる効力または活性を含む。いくつかの態様では、ペプチドとI/Oとは、安定的なリンカーを介して化学的に結合されている。いくつかの態様では、安定的なリンカーは、配列番号1163~配列番号1168のうちのいずれか1つを含む。いくつかの態様では、ペプチドとI/Oとは共配合される。
いくつかの態様では、ペプチドとI/Oとはナノ粒子に配合される。いくつかの態様では、I/Oはナノ粒子内に配合され、ペプチドはナノ粒子の外側に結合される。いくつかの態様では、I/Oがベクターにコードされてナノ粒子内に配合され、ペプチドがナノ粒子の外側に結合される。いくつかの態様では、ナノ粒子が、リポソームである。いくつかの態様では、ベクターが、DNAまたはmRNAを送達する。いくつかの態様では、ペプチドとI/Oとの比が、1:1、1:2、1:3、1:4、1:8、2:1、3:1、4:1、または8:1である。
いくつかの態様では、投与は、吸入、鼻腔内、経口、局所、非経口、静脈内、皮下、腫瘍内注射、筋肉内投与、腹腔内投与、皮膚投与、経皮投与、脳室内投与、または髄腔内投与、またはこれらの組み合わせによるものである。
いくつかの態様では、ペプチドは、配列番号1~配列番号567、配列番号1243~配列番号1252、または配列番号1263~配列番号1289のうちのいずれか1つと少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも100%の配列同一性を有し、ペプチドは、対象に投与されると、対象の腫瘍にホーミング、ターゲティング、移動、蓄積、結合し、対象の腫瘍によって保持され、対象の腫瘍によってプロセシングされ、または対象の腫瘍に誘導される。
いくつかの態様では、ペプチドは、配列番号568~配列番号1134、配列番号1253~配列番号1262、または配列番号1290~配列番号1316のうちのいずれか1つと少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも100%の配列同一性を有し、ペプチドは、対象に投与されると、対象の腫瘍にホーミング、ターゲティング、移動、蓄積、結合し、対象の腫瘍によって保持され、対象の腫瘍によってプロセシングされ、または対象の腫瘍に誘導される。いくつかの態様では、ペプチドは、I/Oを、細胞内の細胞質、小胞体、ゴルジ装置、エンドソーム、リソソーム、またはこれらの任意の組み合わせにターゲティングする。いくつかの態様では、ペプチドは、がんにホーミングする。いくつかの態様では、がんは、脳癌、脳腫瘍、乳癌、黒色腫、肉腫、基底細胞癌、扁平上皮癌、肺癌、結腸直腸癌、前立腺癌及び膀胱癌、またはそれらの任意の組み合わせである。
いくつかの態様では、組成物は、PD-1またはPDL1療法を投与することをさらに含む。いくつかの態様では、PD-1またはPDL1療法は、PD-1阻害剤、PDL1阻害剤、チェックポイント阻害剤、またはこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、ペプチドは、4個以上のシステイン残基を含む。いくつかの態様では、ペプチドは、6個以上のシステイン残基を含む。いくつかの態様では、ペプチドは、システイン残基間に形成された3つ以上のジスルフィド架橋を含む。
いくつかの態様では、ペプチドは、システイン残基間に形成された3つ以上のジスルフィド架橋を含み、前記ジスルフィド架橋の1つが他の2個のジスルフィド架橋によって形成されるループを通っている。いくつかの態様では、ペプチドは、システイン残基間に形成された複数のジスルフィド架橋を含む。いくつかの態様では、ペプチドは、ジスルフィドノットを通るジスルフィドを含む。いくつかの態様では、ペプチドの少なくとも1つのアミノ酸残基がL配置であるか、またはペプチドの少なくとも1つのアミノ酸残基がD配置である。
いくつかの態様では、配列は、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個、少なくとも20個、少なくとも21個、少なくとも22個、少なくとも23個、少なくとも24個、少なくとも25個、少なくとも26個、少なくとも27個、少なくとも28個、少なくとも29個、少なくとも30個、少なくとも31個、少なくとも32個、少なくとも33個、少なくとも34個、少なくとも35個、少なくとも36個、少なくとも37個、少なくとも38個、少なくとも39個、少なくとも40個、少なくとも41個、少なくとも42個、少なくとも43個、少なくとも44個、少なくとも45個、少なくとも46個、少なくとも47個、少なくとも48個、少なくとも49個、少なくとも50個、少なくとも51個、少なくとも52個、少なくとも53個、少なくとも54個、少なくとも55個、少なくとも56個、少なくとも57個、少なくとも58個の残基、少なくとも59個、少なくとも60個、少なくとも61個、少なくとも62個、少なくとも63個、少なくとも64個、少なくとも65個、少なくとも66個、少なくとも67個、少なくとも68個、少なくとも69個、少なくとも70個、少なくとも71個、少なくとも72個、少なくとも73個、少なくとも74個、少なくとも75個、少なくとも76個、少なくとも77個、少なくとも78個、少なくとも79個、少なくとも80個、または少なくとも81個の残基を含む。
いくつかの態様では、K残基のいずれか1つ以上は、R残基により置換されるか、またはR残基のいずれか1つ以上は、K残基により置換されている。いくつかの態様では、M残基のいずれか1つ以上は、I、L、またはV残基のいずれか1つによって置換されている。いくつかの態様では、L残基のいずれか1つ以上は、V、I、またはM残基のいずれか1つにより置換されている。いくつかの態様では、I残基のいずれか1つ以上は、M、L、またはV残基のいずれかによって置換されている。いくつかの態様では、V残基のいずれか1つ以上は、M、I、またはL残基のいずれかによって置換されている。いくつかの態様では、G残基のいずれか1つ以上は、A残基により置換されるか、またはA残基のいずれか1つ以上は、G残基により置換されている。いくつかの態様では、S残基のいずれか1つ以上は、T残基により置換されるか、またはT残基のいずれか1つ以上は、S残基により置換されている。いくつかの態様では、Q残基のいずれか1つ以上は、N残基により置換されるか、またはN残基のいずれか1つ以上は、Q残基により置換されている。いくつかの態様では、D残基のいずれか1つ以上は、E残基により置換されるか、またはE残基のいずれか1つ以上は、D残基により置換されている。
いくつかの態様では、ペプチドの少なくとも1つの残基は化学修飾を含む。いくつかの態様では、化学修飾はペプチドのN末端をブロックしている。いくつかの態様では、化学修飾は、メチル化、アセチル化、またはアシル化である。いくつかの態様では、化学修飾は、1つ以上のリシン残基またはその類似体のメチル化;N末端のメチル化;または1つ以上のリシン残基またはその類似体のメチル化及びN末端のメチル化である。
いくつかの態様では、ペプチドは、アシル付加物である。一部の態様では、ペプチドは、配列番号1である。いくつかの態様では、ペプチドは、配列番号2である。いくつかの態様では、ペプチドは、配列番号568である。いくつかの態様では、ペプチドは、配列番号569である。いくつかの態様では、ペプチドは、配列番号570である。いくつかの態様では、ペプチドI/O複合体は、さらなる細胞透過性ペプチドをさらに含む。いくつかの態様では、細胞透過性ペプチドは、ペプチドI/O複合体の細胞透過、細胞質送達、エンドソーム取り込み、エンドソーム脱出、またはそれらの任意の組み合わせを高める。
いくつかの態様では、細胞透過性ペプチドは、配列番号1207~配列番号1224、または配列番号1382~配列番号1400、または配列番号1442~配列番号1490のうちのいずれか1つを含む。いくつかの態様では、細胞透過性ペプチドは、システイン高密度ペプチドである。
いくつかの態様では、システイン高密度ペプチドは、インペラトキシンA、マウロカルシン、MCoTI-II、EETI-II、kalata B1、SFTI-1、CyLoP-1、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、ペプチドに改変が行われる。いくつかの態様では、改変は、ペプチドのループ領域のアミノ酸の付加、ペプチドのループ領域のアミノ酸の改変である。いくつかの態様では、改変は、非ペプチド分子、小分子、ポリマー、脂質、またはそれらの任意の組み合わせの組み込みである。いくつかの態様では、改変は、配合、非共有結合による複合体化、グラフト化、融合、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
いくつかの態様では、ペプチドは、配列番号1、配列番号2、配列番号568、配列番号569、または配列番号570と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも100%の同一性を有する配列を含み、前記I/Oが、配列番号1135、配列番号1169、配列番号1163、配列番号1176、配列番号1177、配列番号1178、配列番号1179の配列、またはそれらのフラグメントもしくは変異体を含む。
いくつかの態様では、ペプチドI/O複合体は、下式を含む。
いくつかの態様では、ペプチドI/O複合体は、1つ以上の修飾ヌクレオチド塩基を含むRIG-Iリガンドを含む。いくつかの態様では、ペプチドI/O複合体は、2’フルオロ基、ホスホロチオエート結合、LNAもしくはBNA核酸、または2’OMe基で修飾された1つ以上のヌクレオチド塩基を含むRIG-Iリガンドを含む。いくつかの態様では、ペプチドI/O複合体は、2’フルオロ修飾を有する1つ以上の塩基を含むRIG-Iリガンドを含む。いくつかの態様では、ペプチドI/O複合体は、2’フルオロ修飾を有する25%、50%、75%、または100%の塩基を含む。いくつかの態様では、ペプチドI/O複合体は、ホスホロチオエート結合を有する1つ以上の塩基を含むRIG-Iリガンドを含む。いくつかの態様では、ペプチドI/O複合体は、5’末端及び3’末端のそれぞれのヌクレオチドのうちの少なくとも2個がホスホロチオエート結合を含むRIG-Iを含む。いくつかの態様では、ペプチドI/O複合体は、3’末端のそれぞれのヌクレオチドのうちの少なくとも2個がホスホロチオエート結合を含むRIG-Iを含む。
いくつかの態様では、ペプチドI/O複合体は、
(式中、X及びYは、それぞれ5~200塩基の長さであるRNAの相補鎖であり、ペプチドは配列番号569または配列番号570を含む)を含む。いくつかの態様では、ペプチドは、配列番号569または配列番号570を含み、I/Oは、5’ppp dsRNAを含み、dsRNAは、二本鎖RNAまたはヘアピンRNAであり、dsRNAは、5~100塩基対または10~40塩基対を含む。
いくつかの態様では、ペプチドは、配列番号1、配列番号2、配列番号568、配列番号569、または配列番号570と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも100%の同一性を有する配列を含み、前記I/Oが、配列番号1371、配列番号1424、及び配列番号1425、配列番号1375、配列番号1376の配列、またはそれらのフラグメントもしくは変異体を含む。いくつかの態様では、組成物は、CD28-CTLA4、Lag-3、またはTIGIT療法をさらに含む。いくつかの態様では、ペプチドI/O複合体は、図34~図44及び図55~図79のいずれか1つに記載の構造を含む。いくつかの態様では、ペプチドは、化学物質、放射性標識剤、放射線増感剤、フルオロフォア、造影剤、診断薬、タンパク質、ペプチド、または小分子などの診断薬または造影剤をさらに含む。
さまざまな態様において、本開示は、治療を必要とする対象のがんを治療する方法であって、対象に治療有効量の上記の組成物のいずれか1つを投与することを含む、方法を提供する。
さまざまな態様において、本開示は、免疫抗がん剤(I/O)を腫瘍に送達する方法であって、a)上記の組成物のいずれか1つのペプチド免疫抗がん剤複合体(ペプチドI/O複合体)を与えることと、b)ペプチドI/O複合体をそれを必要とする対象に投与することと、を含み、ペプチドI/O複合体が投与後に腫瘍にホーミングする、方法を提供する。
さまざまな態様において、本開示は、免疫抗がん剤(I/O)を細胞内に送達する方法であって、a)上記の組成物のいずれか1つのペプチド免疫抗がん剤複合体(ペプチドI/O複合体)を与えることと、b)ペプチドI/O複合体をそれを必要とする対象に投与することと、を含み、ペプチドI/O複合体が投与後に細胞を透過する、方法を提供する。
さまざまな態様において、本開示は、免疫抗がん剤(I/O)を、血液脳関門(BBB)を通過して送達する方法であって、a)上記の組成物のいずれか1つのペプチド免疫抗がん剤複合体(ペプチドI/O複合体)を与えることと、b)ペプチドI/O複合体をそれを必要とする対象に投与することと、を含み、ペプチドI/O複合体が投与後にBBBを透過する、方法を提供する。
さまざまな態様では、請求項189~192のいずれか1項に記載のペプチドI/O複合体をそれを必要とする対象に送達するまたは治療する方法であって、コンパニオン診断薬または造影剤を投与することをさらに含み、コンパニオン診断薬または造影剤が、a)上記の組成物のいずれかのペプチドI/O複合体、b)上記の組成物のいずれかのペプチドI/O複合体であって、ペプチドがさらに、化学物質、放射性標識剤、放射線増感剤、フルオロフォア、造影剤、診断薬、タンパク質、ペプチド、または小分子などの診断薬または造影剤を含む、ペプチドI/O複合体、またはc)診断薬または造影剤をさらに含む配列番号1~配列番号1316のペプチドであって、診断薬または造影剤が、化学物質、放射性標識剤、放射線増感剤、フルオロフォア、造影剤、診断薬、タンパク質、ペプチド、または小分子などの診断薬または造影剤を含む、ペプチドを含む、方法を提供する。いくつかの態様では、コンパニオン診断薬または造影剤は、装置によって検出される。いくつかの態様では、装置は、X線ラジオグラフィー、磁気共鳴イメージング(MRI)、超音波、内視鏡、弾性イメージング法、触覚イメージング、サーモグラフィー、フローサイトメトリー、医療用撮影術、核医療機能的イメージング法、陽電子放射断層撮影法(PET)、単一光子放射断層撮影(SPECT)、外科用器具、手術用顕微鏡、共焦点顕微鏡、蛍光スコープ、外視鏡、または外科用ロボットを含む放射線医学または蛍光を取り入れたものである。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される:
(項目1)
ペプチド免疫抗がん剤複合体(ペプチドI/O複合体)を含む組成物であって、
前記ペプチドI/O複合体の前記ペプチドが腫瘍ホーミング性を有し、
前記ペプチドI/O複合体の前記免疫抗がん剤(I/O)が、IL-15剤、RIG-Iリガンド、4-1BBリガンド、STINGリガンド、MDA5リガンド、CGASリガンド、TLR3リガンド、TLR7/8リガンド、またはTLR9リガンドである、前記組成物。
(項目2)
ペプチド免疫抗がん剤複合体(ペプチドI/O複合体)を含む組成物であって、
前記ペプチドI/O複合体の前記ペプチドが細胞透過性を有し、
前記ペプチドI/O複合体の前記免疫抗がん剤(I/O)が、IL-15剤、RIG-Iリガンド、4-1BBリガンド、STINGリガンド、MDA5リガンド、CGASリガンド、TLR3リガンド、TLR7/8リガンド、またはTLR9リガンドである、前記組成物。
(項目3)
ペプチド免疫抗がん剤複合体(ペプチドI/O複合体)を含む組成物であって、
前記ペプチドI/O複合体の前記ペプチドが血液脳関門(BBB)透過性を有し、
前記ペプチドI/O複合体の前記免疫抗がん剤(I/O)が、IL-15剤、RIG-Iリガンド、4-1BBリガンド、STINGリガンド、MDA5リガンド、CGASリガンド、TLR3リガンド、TLR7/8リガンド、またはTLR9リガンドである、前記組成物。
(項目4)
前記I/Oが受容体のアゴニストを含み、前記受容体が、IL-15R、RIG-I、4-1BB、STING、MDA5、CGAS、TLR3、TLR7/8、またはTLR9を含む、項目1~3のいずれか1項に記載の組成物。
(項目5)
ペプチド免疫抗がん剤複合体(ペプチドI/O複合体)を含む組成物であって、前記ペプチドI/O複合体が、
a)ペプチドであって、
前記ペプチドI/O複合体の前記ペプチドは、配列番号1~配列番号567、配列番号1243~配列番号1252、配列番号1263~配列番号1289のうちのいずれか1つと少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも100%の配列同一性を有する配列を含む腫瘍ホーミングペプチドであり、前記ペプチドは、対象に投与されると、前記対象の腫瘍にホーミング、ターゲティング、移動、蓄積、結合し、前記対象の腫瘍によって保持され、前記対象の腫瘍によってプロセシングされ、または前記対象の腫瘍に誘導される、前記ペプチドと、b)免疫抗がん剤(I/O)であって、
前記ペプチドI/O複合体の前記I/Oは、前記腫瘍に対する宿主免疫応答を刺激する、前記I/Oと、を含む、前記組成物。
(項目6)
ペプチド免疫抗がん剤複合体(ペプチドI/O複合体)を含む組成物であって、前記ペプチドI/O複合体が、
a)ペプチドであって、
前記ペプチドI/O複合体の前記ペプチドが、配列番号568~配列番号1134、配列番号1253~配列番号1262、配列番号1290~配列番号1316のいずれか1つと少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも100%の配列同一性を有する配列を含む腫瘍ホーミングペプチドであり、前記ペプチドは、対象に投与されると、前記対象の腫瘍にホーミング、ターゲティング、移動、蓄積、結合し、前記対象の腫瘍によって保持され、前記対象の腫瘍によってプロセシングされ、または前記対象の腫瘍に誘導される、前記ペプチドと、b)免疫抗がん剤(I/O)であって、
前記ペプチドI/O複合体の前記I/Oは、前記腫瘍に対する宿主免疫応答を刺激する、前記I/Oと、を含む、前記組成物。
(項目7)
ペプチド免疫抗がん剤複合体(ペプチドI/O複合体)を含む組成物であって、前記ペプチドI/O複合体が、
a)ペプチドであって、
前記ペプチドI/O複合体の前記ペプチドは、配列番号1~配列番号567、配列番号1243~配列番号1252、または配列番号1263~配列番号1289のうちのいずれか1つと少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも98%、または少なくとも100%の配列同一性を有する配列を含む細胞透過性ペプチドである、前記ペプチドと、
b)免疫抗がん剤(I/O)であって、
前記ペプチドI/O複合体の前記I/Oは、前記腫瘍に対する宿主免疫応答を刺激する、前記I/Oと、を含む、前記組成物。
(項目8)
ペプチド免疫抗がん剤複合体(ペプチドI/O複合体)を含む組成物であって、前記ペプチドI/O複合体が、
a)ペプチドであって、
前記ペプチドI/O複合体の前記ペプチドは、配列番号568~配列番号1134、配列番号1253~配列番号1262、または配列番号1290~配列番号1316のうちのいずれか1つと少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも98%、または少なくとも100%の配列同一性を有する配列を含む細胞透過性ペプチドであり、対象に投与されると前記ペプチドは細胞透過性である、前記ペプチドと、
b)免疫抗がん剤(I/O)であって、
前記ペプチドI/O複合体の前記I/Oは、前記腫瘍に対する宿主免疫応答を刺激する、前記I/Oと、を含む、前記組成物。
(項目9)
ペプチド免疫抗がん剤複合体(ペプチドI/O複合体)を含む組成物であって、前記ペプチドI/O複合体が、
a)ペプチドであって、
前記ペプチドI/O複合体の前記ペプチドは、配列番号1~配列番号567、配列番号1243~配列番号1252、配列番号1263~配列番号1289のうちのいずれか1つと少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも98%、または少なくとも100%の配列同一性を有する配列を含む血液脳関門(BBB)透過性ペプチドであり、対象に投与されると前記ペプチドは血液脳関門(BBB)透過性である、前記ペプチドと、
b)免疫抗がん剤(I/O)であって、
前記ペプチドI/O複合体の前記I/Oは、前記腫瘍に対する宿主免疫応答を刺激する、前記I/Oと、を含む、前記組成物。
(項目10)
ペプチド免疫抗がん剤複合体(ペプチドI/O複合体)を含む組成物であって、前記ペプチドI/O複合体が、
a)ペプチドであって、
前記ペプチドI/O複合体の前記ペプチドは、配列番号568~配列番号1134、配列番号1253~配列番号1262、配列番号1290~配列番号1316のうちのいずれか1つと少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも98%、または少なくとも100%の配列同一性を有する配列を含む血液脳関門(BBB)透過性ペプチドであり、対象に投与されると前記ペプチドは血液脳関門(BBB)透過性である、前記ペプチドと、
b)免疫抗がん剤(I/O)であって、
前記ペプチドI/O複合体の前記I/Oは、前記腫瘍に対する宿主免疫応答を刺激する、前記I/Oと、を含む、前記組成物。
(項目11)
前記I/Oが、IL-15剤、RIG-Iリガンド、4-1BBリガンド、STINGリガンド、MDA5リガンド、CGASリガンド、TLR3リガンド、TLR7/8リガンド、またはTLR9リガンドを含む、項目5~10のいずれか1項に記載の組成物。
(項目12)
前記I/Oが、受容体または標的のアゴニストを含み、前記受容体または標的が、IL-15R、RIG-I、4-1BB、STING、MDA5、CGAS、TLR、TLR7/8、またはTLR9を含む、項目5~10のいずれか1項に記載の組成物。
(項目13)
前記ペプチドが、腫瘍ホーミング特性を有する、項目2~3または項目7~10のいずれか1項に記載の組成物。
(項目14)
前記ペプチドが、細胞透過特性を有する、項目1、項目3~6、または項目9~10のいずれか1項に記載の組成物。
(項目15)
前記細胞透過特性が、エンドソーム内への取り込み、細胞内区画内への取り込み、細胞内区画内の取り込み及びプロセシングならびに分泌、細胞質への取り込み及び送達、取り込み及びトランスサイトーシス、取り込み及び核局在化、取り込み及び細胞外提示、ピノサイトーシス、腫瘍微小環境への取り込み、切断、及び分泌、または細胞表面タンパク質への取り込み及び提示を含む、項目14に記載の組成物。
(項目16)
前記ペプチドI/O複合体が前記サイトゾルをターゲティングする、項目1~15のいずれか1項に記載の組成物。
(項目17)
前記ペプチドI/O複合体が、取り込まれ、プロセシングされ、細胞外に提示される、項目1~16のいずれか1項に記載の組成物。
(項目18)
前記ペプチドI/O複合体が、細胞区画に進入、蓄積するか、または細胞区画内でプロセシングされ、前記細胞区画が、細胞内区画、細胞質、小胞体、ゴルジ装置、エンドソーム、またはリソソームを含む、項目1~17のいずれか1項に記載の組成物。
(項目19)
前記ペプチドが、前記対象の腫瘍にホーミングするか、ターゲティングするか、移動するか、蓄積するか、結合するか、前記対象の腫瘍によって保持され、前記対象の腫瘍によってプロセシングされ、または前記対象の腫瘍に誘導される、項目1~18のいずれか1項に記載の組成物。
(項目20)
前記ペプチドが、腫瘍細胞環境中、細胞内、エンドソーム内、リソソーム内、サイトゾル内、小胞体内、またはゴルジ装置内で前記ペプチドI/O複合体から切断される、項目1~19のいずれか1項に記載の組成物。
(項目21)
前記ペプチドが、前記血液脳関門(BBB)を通過する、項目1~2または項目5~8のいずれか1項に記載の組成物。
(項目22)
前記ペプチドI/O複合体、前記ペプチド、前記I/O、またはそれらの任意の組み合わせが、前記細胞サイトゾル、細胞内区画、小胞体、ゴルジ装置、エンドソーム、リソソームに入る、項目1~21のいずれか1項に記載の組成物。
(項目23)
前記I/Oが、免疫原性細胞死(ICD)を刺激する、項目1~22のいずれか1項に記載の組成物。
(項目24)
前記ペプチドI/O複合体が、細胞または腫瘍微小環境によってプロセシングされる、項目1~23のいずれか1項に記載の組成物。
(項目25)
前記細胞または腫瘍微小環境による前記ペプチドI/O複合体の前記プロセシングが、前記ペプチドI/O複合体の活性、濃度、方法、または提示の場所を変化させる、項目24に記載の組成物。
(項目26)
前記IL-15剤が、IL-15超アゴニストを含む、項目1~4または項目11~25のいずれか1項に記載の組成物。
(項目27)
前記IL-15剤が、IL-15ドメインとIL-15Rα sushi+ドメインとの融合体を含む、項目1~4または項目11~26のいずれか1項に記載の組成物。
(項目28)
前記IL-15剤が、下式:L -X-L -Y-L (式中、X、Yのいずれか1つは、配列番号1177または配列番号1178または配列番号1491を含み、X、Yのいずれか1つは、配列番号1176または配列番号1179を含み、L 、L 、L は、配列番号1163~配列番号1172または配列番号1359~配列番号1366または配列番号1139~配列番号1161のうちのいずれか1つを含み、またはL 、L 、L は、Xnを含み、ただし各Xは、個々に任意のアミノ酸を含み、nは1~50の任意の数であるかまたは存在しない)を有する、項目1~4または項目11~27のいずれか1項に記載の組成物。
(項目29)
前記IL-15剤が、2個の配列番号1177の部分と、1個の配列番号1179の部分とを含む、項目1~4または項目11~28のいずれか1項に記載の組成物。
(項目30)
前記IL-15剤が、2個の配列番号1178の部分と、1個の配列番号1179の部分とを含む、項目1~4または項目11~26のいずれか1項に記載の組成物。
(項目31)
前記IL-15剤が表3から選択される、項目1~4または項目11~30のいずれか1項に記載の組成物。
(項目32)
前記ペプチド-IL-15剤が、配列番号1317~配列番号1341、及び配列番号1343~配列番号1348から選択される、項目1~4または項目11~31のいずれか1項に記載の組成物。
(項目33)
前記IL-15剤が、L 0- X-L -Y-L (式中、任意の組み合わせで、L は、配列番号1169または配列番号1163であってよく、Xは、配列番号1176または配列番号1179であってよく、Yは、配列番号1177、配列番号1178であってよい)から選択される、項目1~4または項目11~31のいずれか1項に記載の組成物。
(項目34)
前記ペプチドI/O複合体が、表4から選択される、項目1~4または項目11~33のいずれか1項に記載の組成物。
(項目35)
前記RIG-Iリガンドが、二本鎖RNA(dsRNA)を含む、項目1~4または項目11~34のいずれか1項に記載の組成物。
(項目36)
前記RIG-Iリガンドが、ヘアピンRNAを含む、項目1~4または項目11~34に記載の組成物。
(項目37)
前記MDA5リガンドが、二本鎖RNA(dsRNA)を含む、項目1~4または項目11~36のいずれか1項に記載の組成物。
(項目38)
前記MDA5リガンドが、ヘアピンRNAを含む、項目1~4または項目11~36のいずれか1項に記載の組成物。
(項目39)
前記dsRNAが、10~60塩基対を含む、項目35または38のいずれか1項に記載の組成物。
(項目40)
前記dsRNAが、11~18塩基対を含む、項目35または項目38~39のいずれか1項に記載の組成物。
(項目41)
前記dsRNAが、7~10塩基対を含む、項目35または項目38~40のいずれか1項に記載の組成物。
(項目42)
前記dsRNAが、ヘアピンRNAを含む、項目35または項目38~51に記載の組成物。
(項目43)
前記ヘアピンRNAが、14~120塩基対を含む、項目42に記載の組成物。
(項目44)
前記ヘアピンRNAが、7~60塩基対を含む、項目42~43のいずれか1項に記載の組成物。
(項目45)
前記単一のヘアピンRNAの少なくとも1個の塩基対が、前記ヘアピンRNA内で第2の塩基と対合した第1の塩基を含む、項目42~44のいずれか1項に記載の組成物。
(項目46)
前記ヘアピンRNAが、5’三リン酸を含む、項目42~45のいずれか1項に記載の組成物。
(項目47)
前記ヘアピンRNAが、単一のヘアピンRNAである、項目34~42のいずれか1項に記載の組成物。
(項目48)
前記RIG-Iリガンドが、5’三リン酸を含む、項目1~4または項目11~47のいずれか1項に記載の組成物。
(項目49)
前記RIG-Iリガンドが、5’二リン酸を含む、項目1~4または項目11~48のいずれか1項に記載の組成物。
(項目50)
前記RIG-Iリガンドが、キャップされていない5’AまたはGを含む、項目1~4または項目11~49のいずれか1項に記載の組成物。
(項目51)
前記RIG-Iリガンドが、平滑末端に5’三リン酸を含む、項目1~4または項目11~50のいずれか1項に記載の組成物。
(項目52)
前記RIG-Iリガンドが、マイナス鎖RNAウイルスのパンハンドル領域を含む、項目1~4または項目11~51のいずれか1項に記載の組成物。
(項目53)
前記RIG-Iリガンドが、ベンゾビスチアゾール化合物を含む、項目1~4または項目11~52のいずれか1項に記載の組成物。
(項目54)
前記RIG-IリガンドのRNA骨格が、前記RIG-Iリガンドの非修飾RNA骨格と比較してインビボ安定性を高める修飾を含む、項目1~4または項目11~53のいずれか1項に記載の組成物。
(項目55)
前記修飾が、2’-フルオロ-修飾、ホスホロチオエート置換、メチルホスホネート修飾、2’-Oメチル修飾、2’-F RNA塩基、架橋核酸、モルホリノ核酸、PNA、LNA、エチルcEt核酸、またはそれらの任意の組み合わせを含む、項目54に記載の組成物。
(項目56)
前記RIG-Iリガンドが、それ自身の二本鎖を形成する、項目1~4または項目11~55のいずれか1項に記載の組成物。
(項目57)
前記RIG-Iリガンドが、表6から選択される、項目1~4または項目11~56のいずれか1項に記載の組成物。
(項目58)
前記RIG-Iリガンドが、配列番号1180及び配列番号1181、配列番号1182及び配列番号1183、配列番号1184及び配列番号1185、配列番号1186及び配列番号1187、配列番号1189及び配列番号1190、配列番号1191及び配列番号1192、配列番号1203及び配列番号1204、配列番号1205及び配列番号1206、配列番号1235及び配列番号1236、配列番号1237及び配列番号1238、配列番号1239及び配列番号1240、ならびに配列番号1241及び配列番号1242である、項目57に記載の組成物。
(項目59)
配列番号1189、配列番号1191、配列番号1196、または配列番号1198が、センス鎖の5’末端に三リン酸を含む、項目57~58のいずれか1項に記載の組成物。
(項目60)
配列番号1196が三リン酸を含まない、項目57~58のいずれか1項に記載の組成物。
(項目61)
配列番号1180~配列番号1187が、5’三リン酸基を含む、項目57~58のいずれか1項に記載の組成物。
(項目62)
前記RIG-Iリガンドが、配列番号1371である、項目1~4または項目11~61のいずれか1項に記載の組成物。
(項目63)
前記MDA5リガンドが、キャップされていない5’AまたはGを含む、項目1~4または項目11~62のいずれか1項に記載の組成物。
(項目64)
前記MDA5リガンドが、マイナス鎖RNAウイルスのパンハンドル領域を含む、項目1~4または項目11~63のいずれか1項に記載の組成物。
(項目65)
前記MDA5リガンドが、べンゾビスチアゾール化合物を含む、項目1~4または項目11~64のいずれか1項に記載の組成物。
(項目66)
前記MDA5リガンドのRNA骨格が、前記MDA5リガンドの非修飾RNA骨格と比較してインビトロまたはインビボ安定性を高める修飾を含む、項目1~4または項目11~65のいずれか1項に記載の組成物。
(項目67)
前記修飾が、2’-フルオロ-修飾、ホスホロチオエート置換、メチルホスホネート修飾、2’-Oメチル修飾、2’-F RNA塩基、架橋核酸、モルホリノ核酸、PNA、LNA、エチルcEt核酸、またはそれらの任意の組み合わせを含む、項目66に記載の組成物。
(項目68)
前記MDA5リガンドが、それ自身の二本鎖を形成する、項目1~4または項目11~67のいずれか1項に記載の組成物。
(項目69)
前記MDA5リガンドが表6から選択される、項目1~4または項目11~68のいずれか1項に記載の組成物。
(項目70)
前記MDA5リガンドが、配列番号1180及び配列番号1181、配列番号1182及び配列番号1183、配列番号1184及び配列番号1185、配列番号1186及び配列番号1187、配列番号1189及び配列番号1190、配列番号1191及び配列番号1192、配列番号1203及び配列番号1204、配列番号1205及び配列番号1206、配列番号1235及び配列番号1236、配列番号1237及び配列番号1238、配列番号1239及び配列番号1240、ならびに配列番号1241及び配列番号1242、及び配列番号1193、及び配列番号1194、及び配列番号1195、及び配列番号1196、及び配列番号1197、及び配列番号1198、及び配列番号1200である、項目1~4または項目11~69のいずれか1項に記載の組成物。
(項目71)
前記MDA5リガンドが、5’三リン酸、5’二リン酸、5’一リン酸、及びリボースの2’-O-メチル化の5’キャップの1つ以上を含まない、項目1~4または項目11~70のいずれか1項に記載の組成物。
(項目72)
前記MDA5リガンドが、5’三リン酸を欠いてもよく、リボース2’-O-メチル化の5’キャップを欠いてもよい、項目1~4または項目11~71のいずれか1項に記載の組成物。
(項目73)
前記MDA5リガンドまたはTLR3リガンドが、二本鎖RNA(dsRNA)を含む、項目1~4または項目11~72のいずれか1項に記載の組成物。
(項目74)
前記dsRNAが、12~6000塩基対を含む、項目35、37、または項目39~42のいずれか1項に記載の組成物。
(項目75)
前記dsRNAが、11個よりも多い塩基対を含む、項目35、37、項目39~42、または項目74のいずれか1項に記載の組成物。
(項目76)
前記ヘアピンRNAが、12~6000塩基対を含む、項目36、38、または項目42~47のいずれか1項に記載の組成物。
(項目77)
前記ヘアピンRNAが、12~40塩基対を含む、項目36,38、項目42~47、または76のいずれか1項に記載の組成物。
(項目78)
前記MDA5リガンドが、12~40bpの任意のdsRNAである、項目1~4または項目11~77のいずれか1項に記載の組成物。
(項目79)
前記dsRNAが、三リン酸を含まない、項目35、37、項目39~42、または項目74~75のいずれか1項に記載の組成物。
(項目80)
前記4-1BBリガンドが、ヒト4-1BBリガンド(4-1BBL)ペプチドまたはそのフラグメントを含む、項目1~4または項目11~79のいずれか1項に記載の組成物。
(項目81)
前記4-1BBリガンドが、ヒトもしくはヒト化モノクローナル抗体、モノクローナル抗体またはFc融合タンパク質を含むか、または前記抗体が、scFv、Fab、Fc、重鎖、軽鎖、一本鎖、もしくは相補性決定領域(CDR)、またはそれらの任意の組み合わせを含む抗体フラグメントである、項目1~4または項目11~80のいずれか1項に記載の組成物。
(項目82)
前記4-1BBリガンドが、抗4-1BB抗体を含む、項目1~4または項目11~81のいずれか1項に記載の組成物。
(項目83)
前記抗4-1BBモノクローナル抗体が、scFv部分と融合されて二重特異性分子を形成する、項目82に記載の組成物。
(項目84)
前記4-1BBリガンドが、ヒトコラーゲンのコラーゲンC-プロペプチドなどの三量体化ドメインと融合される、項目82に記載の組成物。
(項目85)
前記4-1BBリガンドが、ヒト4-1BBに結合してこれを活性化する抗イディオタイプ抗体、及びscFv、Fab、Fc、重鎖、軽鎖、一本鎖、もしくは相補性決定領域(CDR)、またはそれらの任意の組み合わせを含む抗体フラグメントを含む、項目82に記載の組成物。
(項目86)
前記4-1BBリガンドが、ウレルマブを含む、項目1~4または項目11~85のいずれか1項に記載の組成物。
(項目87)
前記ウレルマブが、2個の配列番号1225の部分と、2個の配列番号1226の部分との複合体を含む、項目86に記載の組成物。
(項目88)
前記4-1BBリガンドが、ウトミルマブを含む、項目1~4または項目11~87のいずれか1項に記載の組成物。
(項目89)
前記ウトミルマブが、2個の配列番号1228の部分と、2個の配列番号1229の部分との複合体を含む、項目88に記載の組成物。
(項目90)
前記4-1BBリガンドが、表5から選択される、項目1~4または項目11~89のいずれか1項に記載の組成物。
(項目91)
前記4-1BBリガンドが、配列番号1225~配列番号1229のうちのいずれか1つである、項目90に記載の組成物。
(項目92)
前記STINGリガンドが、環状ジヌクレオチドを含む、項目1~4または項目11~91のいずれか1項に記載の組成物。
(項目93)
前記環状ジヌクレオチドが、2’,3’-cGAMPを含む、項目92に記載の組成物。
(項目94)
前記STINGリガンドが、DMXAA類似体を含む、項目1~4または項目11~93のいずれか1項に記載の組成物。
(項目95)
前記STINGリガンドが、4-(2-クロロ-6-フルオロベンジル)-N-(フラン-2-イルメチル)-3-オキソ-3,4-ジヒドロ-2H-ベンゾ[b][1,4]チアジン-6-カルボキサミドを含む、項目1~4または項目11~93のいずれか1項に記載の組成物。
(項目96)
前記STINGリガンドが、1個のアデノシンヌクレオシド及び1個のイノシンヌクレオシドを含む、項目1~4または項目11~93のいずれか1項に記載の組成物。
(項目97)
前記STINGリガンドが、ジスピロジケトピペリジン(DSDP)を含む、項目1~4または項目11~93のいずれか1項に記載の組成物。
(項目98)
前記STINGリガンドが、cGMPの合成類似体を含む、項目1~4または項目11~93のいずれか1項に記載の組成物。
(項目99)
前記STINGリガンドが、ホスホチオエステルを含む、項目1~4または項目11~98のいずれか1項に記載の組成物。
(項目100)
前記STINGリガンドが、表8から選択される、項目1~4または項目11~99のいずれか1項に記載の組成物。
(項目101)
前記STINGリガンドがその標的に対するアゴニストとして作用する、項目1~4または項目11~100の1項に記載の組成物。
(項目102)
前記ペプチドが、前記ペプチドのN末端において、内部リシン残基のεアミンにおいて、アスパラギン酸またはグルタミン酸残基のカルボン酸において、システイン残基において、またはC末端において前記I/Oに連結される、項目1~101のいずれか1項に記載の組成物。
(項目103)
前記ペプチドが非天然アミノ酸をさらに含み、前記非天然アミノ酸が別のアミノ酸に対する挿入、付加、または置換である、項目1~102のいずれか1項に記載の組成物。
(項目104)
前記ペプチドと前記I/Oとが、融合体として組換えにより発現される、項目1~103のいずれか1項に記載の組成物。
(項目105)
前記ペプチドが、リンカーによって前記非天然アミノ酸において前記I/Oに連結される、項目1~104のいずれか1項に記載の組成物。
(項目106)
リンカーが、アミド結合、エステル結合、カルバメート結合、カーボネート結合、ヒドラゾン結合、オキシム結合、ジスルフィド結合、チオエステル結合、チオエーテル結合、ボロン酸エステル複合体、トリアゾール、炭素-炭素結合、炭素-窒素結合、または天然アミノ酸を含む、項目102~105に記載の組成物。
(項目107)
前記リンカーが、腫瘍内または細胞内で選択的に切断されるように調整可能な切断速度を有する、項目105~106のいずれか1項に記載の組成物。
(項目108)
前記ペプチドI/O複合体が、スペーサーを含む、項目1~107のいずれか1項に記載の組成物。
(項目109)
前記ペプチドとI/Oとが結合されている、項目1~103または項目105~108のいずれか1項に記載の組成物。
(項目110)
前記ペプチドとI/Oとが化学的に結合されるか、または組換え融合により結合される、項目109に記載の組成物。
(項目111)
前記ペプチドと前記I/Oとが、切断可能なリンカーによって連結される、項目1~110のいずれか1項に記載の組成物。
(項目112)
前記切断可能なリンカーが、低pH、還元剤、グルタチオン、プロテアーゼ、酵素によって切断されるか、または加水分解に不安定であることにより、切断されたI/Oを生成する、項目111に記載の組成物。
(項目113)
前記酵素が、マトリックスメタロプロテイナーゼ、エステラーゼ、トロンビン、カテプシン、ペプシノーゲン、ゼラチナーゼ、エラスターゼ、トリプシン、プラスミノーゲン活性化因子、ヒアルロニダーゼ、またはグルクロニダーゼである、項目112に記載の組成物。
(項目114)
前記切断可能なリンカーが、腫瘍微小環境に送達されたとき、前記腫瘍微小環境内の細胞の表面で、腫瘍細胞の前記表面で、細胞の細胞質内で、または細胞内区画でのみ、またはそこで選択的に切断される、項目111~113のいずれか1項に記載の組成物。
(項目115)
前記細胞内区画が、小胞体、エンドソーム、リソソーム、またはゴルジ装置を含む、項目114に記載の組成物。
(項目116)
前記切断可能なリンカーが、配列番号1139~配列番号1161、または配列番号1360~配列番号1363、及び配列番号1365のうちのいずれか1つを含む、項目111~115のいずれか1項に記載の組成物。
(項目117)
前記切断されたI/Oが、前記I/Oと比較して化学的に修飾されている、項目104~116のいずれか1項に記載の組成物。
(項目118)
前記切断されたI/Oが、前記I/Oと比較して化学的に修飾されていない、項目104~116のいずれか1項に記載の組成物。
(項目119)
前記切断されたI/Oが、前記I/Oと比較して異なる効力または活性を有する、項目104~116のいずれか1項に記載の組成物。
(項目120)
前記切断されたI/Oが、前記ペプチドI/O複合体と比較して異なる効力または活性を有する、項目104~116のいずれか1項に記載の組成物。
(項目121)
前記ペプチドと前記I/Oとが、安定的なリンカーを介して化学的に結合されている、項目1~109のいずれか1項に記載の組成物。
(項目122)
前記安定的なリンカーが、配列番号1163~配列番号1168のうちのいずれか1つを含む、項目121に記載の組成物。
(項目123)
前記ペプチド及びI/Oとが共配合される、項目1~103のいずれか1項に記載の組成物。
(項目124)
前記ペプチド及びI/Oとがナノ粒子に配合される、項目1~103及び項目123のいずれか1項に記載の組成物。
(項目125)
前記I/Oがナノ粒子内に配合され、前記ペプチドが前記ナノ粒子の外側に結合される、項目1~103及び項目123~124のいずれか1項に記載の組成物。
(項目126)
前記I/Oがベクターにコードされてナノ粒子内に配合され、前記ペプチドが前記ナノ粒子の外側に結合される、項目1~103及び項目123~125のいずれか1項に記載の組成物。
(項目127)
前記ナノ粒子が、リポソームである、項目124~126のいずれか1項に記載の組成物。
(項目128)
前記ベクターが、DNAまたはmRNAを送達する、項目126に記載の組成物。
(項目129)
前記ペプチドと前記I/Oとの比が、1:1、1:2、1:3、1:4,1:8、2:1、3:1、4:1、または8:1である、項目1~128のいずれか1項に記載の組成物。
(項目130)
前記投与が、吸入、鼻腔内、経口、局所、非経口、静脈内、皮下、腫瘍内注射、筋肉内投与、腹腔内投与、皮膚投与、経皮投与、脳室内投与、または髄腔内投与、またはこれらの組み合わせによるものである、項目1~129のいずれか1項に記載の組成物。
(項目131)
前記ペプチドが、配列番号1~配列番号567、配列番号1243~配列番号1252、または配列番号1263~配列番号1289のうちのいずれか1つと少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも100%の配列同一性を有し、前記ペプチドは、対象に投与されると、前記対象の腫瘍にホーミング、ターゲティング、移動、蓄積、結合し、前記対象の腫瘍によって保持され、または前記対象の腫瘍によってプロセシングされ、前記対象の腫瘍に誘導される、項目1に記載の組成物。
(項目132)
前記ペプチドが、配列番号568~配列番号1134、配列番号1253~配列番号1262、または配列番号1290~配列番号1316のうちのいずれか1つと少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも100%の配列同一性を有し、前記ペプチドは、対象に投与されると、前記対象の腫瘍にホーミング、ターゲティング、移動、蓄積、結合し、前記対象の腫瘍によって保持され、前記対象の腫瘍によってプロセシングされ、または前記対象の腫瘍に誘導される、項目1に記載の組成物。
(項目133)
前記ペプチドが、前記I/Oを、細胞内の細胞質、小胞体、ゴルジ装置、エンドソーム、リソソーム、またはこれらの任意の組み合わせにターゲティングする、項目1~132のいずれか1項に記載の組成物。
(項目134)
前記ペプチドが、がんにホーミングする、項目1~133のいずれか1項に記載の組成物。
(項目135)
前記がんが、脳癌、脳腫瘍、乳癌、黒色腫、肉腫、基底細胞癌、扁平上皮癌、肺癌、結腸直腸癌、前立腺癌及び膀胱癌、またはそれらの任意の組み合わせである、項目134に記載の組成物。
(項目136)
PD-1またはPDL1療法を投与することをさらに含む、項目1~135のいずれか1項に記載の組成物。
(項目137)
前記PD-1またはPDL1療法が、PD-1阻害剤、PDL1阻害剤、チェックポイント阻害剤、またはこれらの任意の組み合わせを含む、項目136に記載の組成物。
(項目138)
前記ペプチドが、4個以上のシステイン残基を含む、項目1~137のいずれか1項に記載の組成物。
(項目139)
前記ペプチドが、6個以上のシステイン残基を含む、項目1~138のいずれか1項に記載の組成物。
(項目140)
前記ペプチドが、システイン残基間に形成された3つ以上のジスルフィド架橋を含む、項目1~139のいずれか1項に記載の組成物。
(項目141)
前記ペプチドが、システイン残基間に形成された3つ以上のジスルフィド架橋を含み、前記ジスルフィド架橋の1つが他の2個のジスルフィド架橋によって形成されるループを通っている、項目1~140のいずれか1項に記載の組成物。
(項目142)
前記ペプチドが、システイン残基間に形成された複数のジスルフィド架橋を含む、項目1~141のいずれか1項に記載の組成物。
(項目143)
前記ペプチドが、ジスルフィドノットを通るジスルフィドを含む、項目1~142のいずれか1項に記載の組成物。
(項目144)
前記ペプチドの少なくとも1つのアミノ酸残基がL配置であるか、または前記ペプチドの少なくとも1つのアミノ酸残基がD配置である、項目1~143のいずれか1項に記載の組成物。
(項目145)
前記配列が、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個、少なくとも20個、少なくとも21個、少なくとも22個、少なくとも23個、少なくとも24個、少なくとも25個、少なくとも26個、少なくとも27個、少なくとも28個、少なくとも29個、少なくとも30個、少なくとも31個、少なくとも32個、少なくとも33個、少なくとも34個、少なくとも35個、少なくとも36個、少なくとも37個、少なくとも38個、少なくとも39個、少なくとも40個、少なくとも41個、少なくとも42個、少なくとも43個、少なくとも44個、少なくとも45個、少なくとも46個、少なくとも47個、少なくとも48個、少なくとも49個、少なくとも50個、少なくとも51個、少なくとも52個、少なくとも53個、少なくとも54個、少なくとも55個、少なくとも56個、少なくとも57個、少なくとも58個の残基、少なくとも59個、少なくとも60個、少なくとも61個、少なくとも62個、少なくとも63個、少なくとも64個、少なくとも65個、少なくとも66個、少なくとも67個、少なくとも68個、少なくとも69個、少なくとも70個、少なくとも71個、少なくとも72個、少なくとも73個、少なくとも74個、少なくとも75個、少なくとも76個、少なくとも77個、少なくとも78個、少なくとも79個、少なくとも80個、または少なくとも81個の残基を含む、項目1~144のいずれか1項に記載の組成物。
(項目146)
K残基のいずれか1つ以上がR残基により置換されるか、またはR残基のいずれか1つ以上がK残基により置換されている、項目1~145のいずれか1項に記載の組成物。
(項目147)
M残基のいずれか1つ以上が、I、L、またはV残基のいずれか1つによって置換されている、項目1~146のいずれか1項に記載の組成物。
(項目148)
L残基のいずれか1つ以上が、V、I、またはM残基のいずれか1つにより置換されている、項目1~147のいずれか1項に記載の組成物。
(項目149)
I残基のいずれか1つ以上が、M、L、またはV残基のいずれかによって置換されている、項目1~148のいずれか1項に記載の組成物。
(項目150)
V残基のいずれか1つ以上が、M、I、またはL残基のいずれかによって置換されている、項目1~149のいずれか1項に記載の組成物。
(項目151)
G残基のいずれか1つ以上がA残基により置換されるか、またはA残基のいずれか1つ以上がG残基により置換されている、項目1~150のいずれか1項に記載の組成物。
(項目152)
S残基のいずれか1つ以上がT残基により置換されるか、またはT残基のいずれか1つ以上がS残基により置換されている、項目1~151のいずれか1項に記載の組成物。
(項目153)
Q残基のいずれか1つ以上がN残基により置換されるか、またはN残基のいずれか1つ以上がQ残基により置換されている、項目1~152のいずれか1項に記載の組成物。
(項目154)
D残基のいずれか1つ以上がE残基により置換されるか、またはE残基のいずれか1つ以上がD残基により置換されている、項目1~153のいずれか1項に記載の組成物。
(項目155)
前記ペプチドの少なくとも1つの残基が化学修飾を含む、項目1~154のいずれか1項に記載の組成物。
(項目156)
前記化学修飾が前記ペプチドの前記N末端をブロックしている、項目155に記載の組成物。
(項目157)
前記化学修飾が、メチル化、アセチル化、またはアシル化である、項目156に記載の組成物。
(項目158)
前記化学修飾が、
1つ以上のリシン残基またはその類似体のメチル化;
N末端のメチル化;または
1つ以上のリシン残基またはその類似体のメチル化及び前記N末端のメチル化である、項目157に記載の組成物。
(項目159)
前記ペプチドが、アシル付加物である、項目1~158のいずれか1項に記載の組成物。
(項目160)
前記ペプチドが、配列番号1である、項目1~159のいずれか1項に記載の組成物。
(項目161)
前記ペプチドが、配列番号2である、項目1~159のいずれか1項に記載の組成物。
(項目162)
前記ペプチドが、配列番号568である、項目1~159のいずれか1項に記載の組成物。
(項目163)
前記ペプチドが、配列番号569である、項目1~159のいずれか1項に記載の組成物。
(項目164)
前記ペプチドが、配列番号570である、項目1~159のいずれか1項に記載の組成物。
(項目165)
前記ペプチドI/O複合体が、さらなる細胞透過性ペプチドをさらに含む、項目1~164のいずれか1項に記載の組成物。
(項目166)
前記細胞透過性ペプチドが、前記ペプチドI/O複合体の細胞透過、細胞質送達、エンドソーム取り込み、エンドソーム脱出、またはそれらの組み合わせを高める、項目165に記載の組成物。
(項目167)
前記細胞透過性ペプチドが、配列番号1207~配列番号1224、または配列番号1382~配列番号1400、または配列番号1442~配列番号1490のうちのいずれか1つを含む、項目165~166のいずれか1項に記載の組成物。
(項目168)
前記細胞透過性ペプチドが、システイン高密度ペプチドである、項目167に記載の組成物。
(項目169)
前記システイン高密度ペプチドが、インペラトキシンA、マウロカルシン、MCoTI-II、EETI-II、kalata B1、SFTI-1、CyLoP-1、またはそれらの任意の組み合わせを含む、項目168に記載の組成物。
(項目170)
前記ペプチドに改変が行われる、項目1~169のいずれか1項に記載の組成物。
(項目171)
前記改変が、前記ペプチドのループ領域のアミノ酸の付加、前記ペプチドのループ領域のアミノ酸の改変である、項目170に記載の組成物。
(項目172)
前記改変が、非ペプチド分子、小分子、ポリペプチド、脂質、またはそれらの任意の組み合わせの組み込みである、項目170に記載の組成物。
(項目173)
前記改変が、配合、非共有結合による複合体化、グラフト化、融合、またはそれらの任意の組み合わせを含む、項目170に記載の組成物。
(項目174)
前記ペプチドが、配列番号1、配列番号2、配列番号568、配列番号569、または配列番号570と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも100%の同一性を有する配列を含み、前記I/Oが、配列番号1135、配列番号1169、配列番号1163、配列番号1176、配列番号1177、配列番号1178、配列番号1179の配列、またはそれらのフラグメントもしくは変異体を含む、項目1~173のいずれか1項に記載の組成物。
(項目175)
前記ペプチドI/O複合体が、下式を含む、項目1~174のいずれか1項に記載の組成物。
(項目176)
前記ペプチドI/O複合体が、1つ以上の修飾ヌクレオチド塩基を含むRIG-Iリガンドを含む、項目1~175のいずれか1項に記載の組成物。
(項目177)
前記ペプチドI/O複合体が、2’フルオロ基、ホスホロチオエート結合、LNAもしくはBNA核酸、または2’OMe基で修飾された1つ以上のヌクレオチド塩基を含むRIG-Iリガンドを含む、項目1~176のいずれか1項に記載の組成物。
(項目178)
前記ペプチドI/O複合体が、2’フルオロ修飾を有する1つ以上の塩基を含むRIG-Iリガンドを含む、項目1~176のいずれか1項に記載の組成物。
(項目179)
前記ペプチドI/O複合体が、2’フルオロ修飾を有する25%、50%、75%、または100%の塩基を含む、項目1~176のいずれか1項に記載の組成物。
(項目180)
前記ペプチドI/O複合体が、ホスホロチオエート結合を有する1つ以上の塩基を含むRIG-Iリガンドを含む、項目1~176のいずれか1項に記載の組成物。
(項目181)
前記ペプチドI/O複合体が、5’末端及び3’末端のそれぞれのヌクレオチドのうちの少なくとも2個がホスホロチオエート結合を含むRIG-Iを含む、項目1~176のいずれか1項に記載の組成物。
(項目182)
前記ペプチドI/O複合体が、3’末端のそれぞれのヌクレオチドのうちの少なくとも2個がホスホロチオエート結合を含むRIG-Iリガンドを含む、項目1~176のいずれか1項に記載の組成物。
(項目183)
前記ペプチドI/O複合体が、
(式中、X及びYは、それぞれ5~200塩基の長さであるRNAの相補鎖であり、ペプチドは配列番号569または配列番号570を含む)を含む、項目1~182のいずれか1項に記載の組成物。
(項目184)
前記ペプチドが配列番号569または配列番号570を含み、前記I/Oが5’ppp
dsRNAを含み、前記dsRNAは二本鎖RNAまたはヘアピンRNAであり、前記dsRNAは5~100塩基対または10~40塩基対を含む、項目1~183のいずれか1項に記載の組成物。
(項目185)
前記ペプチドが、配列番号1、配列番号2、配列番号568、配列番号569、または配列番号570と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも100%の同一性を有する配列を含み、前記I/Oが、配列番号1371、配列番号1424、及び配列番号1425、配列番号1375、配列番号1376の配列、またはそれらのフラグメントもしくは変異体を含む、項目1~184のいずれか1項に記載の組成物。
(項目186)
CD28-CTLA4、Lag-3、またはTIGIT療法をさらに含む、項目1~185のいずれか1項に記載の組成物。
(項目187)
前記ペプチドI/O複合体が、図34~図44及び図55~図79のいずれか1つに記載の構造を有する、項目1~186のいずれか1項に記載の組成物。
(項目188)
前記ペプチドが、化学物質、放射性標識剤、放射線増感剤、フルオロフォア、造影剤、診断薬、タンパク質、ペプチド、または小分子などの診断薬または造影剤をさらに含む、項目1~187のいずれか1項に記載の組成物。
(項目189)
治療を必要とする対象のがんを治療する方法であって、前記対象に治療有効量の項目1~188のいずれか1項に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
(項目190)
免疫抗がん剤(I/O)を腫瘍に送達する方法であって、
a)項目1~188のいずれか1項に記載のペプチド免疫抗がん剤複合体(ペプチドI/O複合体)を与えることと、
b)前記ペプチドI/O複合体をそれを必要とする対象に投与することと、を含み、前記ペプチドI/O複合体が投与後に腫瘍にホーミングする、前記方法。
(項目191)
免疫抗がん剤(I/O)を細胞内に送達する方法であって、
a)項目1~188のいずれか1項に記載のペプチド免疫抗がん剤複合体(ペプチドI/O複合体)を与えることと、
b)前記ペプチドI/O複合体をそれを必要とする対象に投与することと、を含み、前記ペプチドI/Oが投与後に細胞を透過する、前記方法。
(項目192)
血液脳関門(BBB)を通過して免疫抗がん剤(I/O)を送達する方法であって、
a)項目1~188のいずれか1項に記載のペプチド免疫抗がん剤複合体(ペプチドI/O複合体)を与えることと、
b)前記ペプチドI/O複合体をそれを必要とする対象に投与することと、を含み、前記ペプチドI/Oが投与後に前記BBBを透過する、前記方法。
(項目193)
項目189~192のいずれか1項に記載のペプチドI/O複合体をそれを必要とする対象に送達するまたは治療する方法であって、コンパニオン診断薬または造影剤を投与することをさらに含み、前記コンパニオン診断薬または造影剤が、
a)項目1~188のいずれかに記載のペプチドI/O複合体、
b)項目188に記載のペプチドI/O複合体、または
c)さらに診断薬または造影剤を含む配列番号1~配列番号1316のペプチドを含み、前記診断薬または造影剤が、化学物質、放射性標識剤、放射線増感剤、フルオロフォア、造影剤、診断薬、タンパク質、ペプチド、または小分子を含む、前記方法。
(項目194)
前記コンパニオン診断薬または造影剤が、装置によって検出される、項目193に記載の方法。
(項目195)
前記装置が、X線ラジオグラフィー、磁気共鳴イメージング(MRI)、超音波、内視鏡、弾性イメージング法、触覚イメージング、サーモグラフィー、フローサイトメトリー、医療用撮影術、核医療機能的イメージング法、陽電子放射断層撮影法(PET)、単一光子放射断層撮影(SPECT)、外科用器具、手術用顕微鏡、共焦点顕微鏡、蛍光スコープ、外視鏡、内視鏡、または外科用ロボットを含む放射線医学または蛍光を取り入れたものである、項目194に記載の方法。
参照による援用
本明細書で言及、開示、または参照するすべての刊行物、特許、及び特許出願は、あたかもそれぞれの個々の刊行物、特許、及び特許出願が詳細かつ個別に参照により援用されていることが示されているものと同様にして、それらの全容を参照により本明細書に援用するものである。
本発明の新規な特徴は付属の特許請求の範囲において詳細に記載する。本開示の特徴及び利点のより深い理解が、本開示の原理を利用した例示的な実施形態を記載した以下の詳細な説明、及び添付の図面を参照することで得られよう。
示された基のRNAまたはDNAへの組み込みを示す。5’末端チオール(チオヘキシル、C6)修飾(左)、及び3’末端チオール(C3)修飾(右)を有するオリゴヌクレオチドの構造を示す。 示された基のRNAまたはDNAへの組み込みを示す。MMT-ヘキシルアミノリンカーホスホロアミダイトを示す。 示された基のRNAまたはDNAへの組み込みを示す。TFA-ペンチルアミノリンカーホスホロアミダイトを示す。 示された基のRNAまたはDNAへの組み込みを示す。アミンまたはチオール残基を組み込んだRNA残基を示す。 示された基のRNAまたはDNAへの組み込みを示す。5’末端(左)及び3’末端(右)にアミノヘキシル修飾を有するオリゴヌクレオチドを示す。 骨格の安定性を高めるために2’-フルオロピリミジンを使用して合成されたRIG-1リガンドの例を示す。配列番号1197を開示する。 例示的なクロロトキシンまたはクロロトキシン誘導体ペプチドとの例示的なIL-15超アゴニスト融合体を含む例示的なRLIXペプチド-免疫抗がん剤複合体(RLIXペプチドI/O複合体)を含む特定のペプチド-免疫抗がん剤複合体(ペプチドI/O複合体)を示す。 例示的なIL-15Ra、リンカー、IL-15、及びクロロトキシンまたはクロロトキシン誘導体ペプチドを有する、N末端からC末端方向への例示的なRLIXペプチドI/O複合体の描画を示す。 図3Aの例示的なRLIXペプチドI/O複合体の配列を示す。配列番号1173を開示する。 例示的なクロロトキシンまたはクロロトキシン誘導体ペプチドとの例示的なIL-15超アゴニスト融合体を含む例示的なILRXペプチド-免疫抗がん剤複合体(ILRXペプチドI/O複合体)を含む特定のペプチド-I/O複合体を示す。 例示的なIL-15、リンカー、IL-15Ra、及びクロロトキシンまたはクロロトキシン誘導体ペプチドを有する、N末端からC末端方向への例示的なILRXペプチドI/O複合体の描画を示す。 図4Aの例示的なILRXペプチドI/O複合体の配列を示す。配列番号1174を開示する。 Probst et al.(Vaccine.2017 Apr 4;35(15):1964-1971)により提供される、RIG-Iリガンドとなり得る非核酸ベンゾビスチアゾール化合物を含むI/Oの2つの例を示す。 Lee et al.(Nucleic Acid Therapeutics.2016 26(3):173-182)により提供される、RIG-Iリガンド、詳細には一本鎖RNAを含むI/Oの例を示す。記載順に、それぞれ、配列番号1199、1201、1202、1516及び1200を開示する。 Lee et al.(Nucleic Acid Therapeutics.2016 26(3):173-182)により提供される、RIG-Iリガンド、詳細には一本鎖RNAを含むI/Oの例を示す。記載順に、それぞれ、配列番号1199、1201、1202、1516及び1200を開示する。 Kato et al.(J Interferon Cytokine Res.2017 May,37(5):207-213)に提供される、I/Oとして本開示のいずれかのペプチドと複合体化することができるSTINGリガンドを示す。 Li et al.(Nat Chem Biol.2015 Sep,11(9):741)に提供される、I/Oとして本開示のいずれかのペプチドと複合体化することができる環状ジヌクレオチド(CDN)を示す。 Lioux et al.(J Med Chem.2016 Nov 23,59(22):10253-10267)に提供される、I/Oとして本開示のいずれかのペプチドと複合体化することができる環状ジヌクレオチド(CDN)を示す。 Liu et al.(Antiviral Res.2017 Nov;147:37-46)に提供される、I/Oとして本開示のいずれかのペプチドと複合体化することができるDSDP STINGリガンドを示す。 米国特許第9,724,408号に提供される、I/Oとして本開示のいずれかのペプチドと複合体化することができるcGAMPの合成類似体を示す。 I/Oとして本開示のいずれかのペプチドと複合体化することができるSTINGリガンドを示す。結合の際に反応性チオールとして機能し得る、環状ホスホジエステル内のビス-ホスホロチオエートを含むSTINGリガンドI/Oを示す。上記チオールを、マレイミド、ブロモアセチル、ヨードアセチル、またはピリジルジチオール基と反応させることができる。 I/Oとして本開示のいずれかのペプチドと複合体化することができるSTINGリガンドを示す。CDN内のプリン塩基を含む5員環のC8位をN-ブロモスクシンイミド(NBS)で臭素化して反応性臭素基を与えることができることを示す。この臭素基は、機能的ハンドル、例えばチオールまたは保護されたアミンを含むアミン含有基と結合させるための反応基として機能する。 ペプチド(例えば、クロロトキシンまたはクロロトキシン誘導体ペプチド)と環状ジヌクレオチドとの間の切断可能なジスルフィド結合の生成を示す。 Schlee et al.により提供される、短いFlu Aゲノム(セグメント5;NC-002019)を示す。配列番号1193などの、ヘアピン構造を与える5’->3’ ssRNA ssRNAを模倣した類似の構造を類似体として使用できる。配列番号1517を開示する。 Schlee et al.により提供される、ゲノムRNA配列(NC-002617)を示す。配列番号1194などの、ヘアピン構造を与える5’->3’ ssRNA ssRNAを模倣した類似の構造を類似体として使用できる。配列番号1518を開示する。 図37のペプチドI/O複合体、図37のペプチドI/O複合体+クロロキン、クロロキン(CQ)、または5’ppp dsRNA+PEIをマイクロインジェクションし、処理の4時間後に採取して染色したCT26腫瘍試料を示す。破線の矢印は、注射の位置のいくつかを示し、白い点状斑はCC3染色を示す。図37のペプチドI/O複合体+クロロキンを注射した部位では大きな領域がCC3染色を示したのに対して、図37のペプチドI/O複合体、クロロキン、または5’ppp dsRNA+PEIを注射した部位は、顕著なCC3染色の領域を有さなかった。 図37のペプチドI/O複合体、図37のペプチドI/O複合体+クロロキン、クロロキン、または5’ppp dsRNA+PEIをマイクロインジェクションし、処理の24時間後に採取して染色した、異なる動物由来のCT26腫瘍試料を示す。破線の矢印は、注射の位置のいくつかを示し、白い点状斑はCC3染色の一部を示す。図37のペプチドI/O複合体を注射した部位、及び図37のペプチドI/O複合体+クロロキンを注射した部位では大きな領域がCC3染色を示したのに対して、5’ppp dsRNA+PEIを注射した部位は、顕著なCC3染色の領域を有さなかった。クロロキンを注射した部位はこの腫瘍試料では存在していない。 図37のペプチドI/O複合体、図37のペプチドI/O複合体+クロロキン、クロロキン、または5’ppp dsRNA+PEIをマイクロインジェクションし、処理の24時間後に採取して染色した、異なる動物由来のCT26腫瘍試料を示す。矢印または丸で囲った領域は、注射の位置のいくつかを示し、白い点状斑はCC3染色の一部を示す。図37のペプチドI/O複合体を注射した部位、及び5’ppp dsRNA+PEIを注射した部位では大きな領域がCC3染色を示した。CQ及び図37のペプチドIO複合体+クロロキンは、この試料における腫瘍壊死の大まかな領域との融合のために解釈不能である。 細胞を、12pmolまたは120pmolの図37のペプチドI/O複合体、配列番号1424(5’末端に三リン酸を有する)と配列番号1425(末端のリン酸なし)とが互いに複合体化されたものである5’ppp dsRNA(図37のペプチドI/O複合体におけるのと同じ5’ppp RNAの配列。二本鎖だがペプチドリンカーのないもの)(図19で「5’ppp dsRNAポジティブコントロール」として示される)、または配列番号1424と配列番号1425(両方の鎖に末端リン酸なし)とが互いに複合体化されたものであるdsRNA(図37のペプチドI/O複合体におけるのと同じRNA二本鎖の配列だが、5’pppがなく、かつペプチドリンカーのないもの)(図19で「dsRNAネガティブコントロール」として示される)により、細胞を処理した、24、48、または72時間後のSEAPレポーター細胞のIFN経路の活性化からの発光シグナルを相対発光量(RLU)で示す。 図19に記載される5’ppp dsRNAと比較して12pmolまたは120pmolの図37のペプチドI/O複合体を投与することによる、処置後24、48、及び72時間のシグナルの増加倍率を示す。 12pmolの図37のペプチドI/O複合体、図34のペプチドI/O複合体、図19で述べたポジティブコントロールの5’ppp dsRNA(「5’ppp dsRNA」として示す)、または図19で述べたネガティブコントロールのdsRNA(「dsRNA(5’pppなし)」として示す)(二本鎖だが、5’PPPがなく、ペプチドリンカーもない同じRNAの配列)で細胞を処理した24時間後の相対発光量(RLU)を示す。 図19に記載される5’ppp dsRNAポジティブコントロール(「5’PPP dsRNA」として示される)+tfxn、図37のペプチドI/O複合体+tfxn、図34のペプチドI/O複合体+tfxn、または図19に記載されるdsRNAネガティブコントロール(「dsRNA(5’PPPなし)」として示される)+tfxnの投与によるRLUシグナルを示す(リポフェクタミントランスフェクション試薬(「tfxn」)も各試験物の配合に添加)。 注射されていないコントロールマウスのCT26腫瘍における白色光画像(上列)及び蛍光シグナル(下列)、及びICG色素を結合した配列番号569のペプチドを注射した2匹のマウスから得た腫瘍におけるシグナルを示す(図27に示される分子を参照)。 注射されていないコントロールマウスのB16F10腫瘍における白色光画像(上列)及び蛍光シグナル(下列)、及びICG色素を結合した配列番号569のペプチドを注射した2匹のマウスから得た腫瘍におけるシグナルを示す(図27に示される分子を参照)。 注射されていないコントロールマウスのA20腫瘍及び筋肉における白色光画像(上列)及び蛍光シグナル、及びICG色素を結合した配列番号569のペプチドを注射した2匹のマウスから得た腫瘍及び筋肉(対側の側腹部)におけるシグナルを示す(図27に示される分子を参照)。 本開示のさまざまな化学構造を示す。 KIN1148の構造を示す。 本開示のさまざまな化学構造を示す。ADU-S100の構造を示す。 本開示のさまざまな化学構造を示す。DMXAAの構造を示す。 ICG色素に結合した配列番号569のペプチドの構造を示し、各線は、システイン残基間のジスルフィド結合を表す。 CTLL2細胞の増殖曲線を示す。 増加する濃度の配列番号1317、配列番号1318、配列番号1319、及び配列番号1321及びHisタグ付けしたRLIタンパク質(配列番号1342)に曝露した後のCTLL2細胞の増殖曲線を示す。 CTLL2細胞の増殖曲線を示す。配列番号1320、IL-15(配列番号1177)、及びHisタグ付けしたRLI(配列番号1342)についてのCTLL2増殖曲線を示す。各データ点は、n=3の平均を表す。RFU-相対蛍光単位。 増加する濃度の配列番号1317、配列番号1318、配列番号1319、配列番号1320、及び配列番号1321及びHisタグ付けしたRLI(配列番号1342)に曝露した後のMo7e細胞の増殖曲線を示す。各曲線は各群n=3を示し、エラーバーは標準誤差(SEM)を表す。 増加する濃度の配列番号1317、配列番号1318、配列番号1319、配列番号1320、及び配列番号1321及びHisタグ付けしたRLI(配列番号1342)に曝露した後のMo7e細胞の増殖曲線を示す。各曲線は各群n=3を示し、エラーバーは標準誤差(SEM)を表す。 CD8+初代ヒトT細胞及び同じCD8T細胞ドナーからのPHA誘導T細胞芽球の増殖曲線を示す。増加する濃度の配列番号1317、配列番号1318、配列番号1319、配列番号1320、及び配列番号1321及びHisタグ付けしたRLI(配列番号1342)に曝露した後のCD8+初代ヒトT細胞の増殖曲線を示す。曲線上の各点は、各群n=3の平均を示す。RFU-相対蛍光単位。 CD8+初代ヒトT細胞及び同じCD8T細胞ドナーからのPHA誘導T細胞芽球の増殖曲線を示す。増加する濃度の配列番号1317、配列番号1318、配列番号1319、配列番号1320、及び配列番号1321及びHisタグ付けしたRLI(配列番号1342)に曝露した後の図30Aと同じCD8T細胞ドナーからのPHA誘導T細胞芽球の増殖曲線を示す。曲線上の各点は、各群n=3の平均を示す。RFU-相対蛍光単位。 Mo7e細胞中のHisタグ付きRLI(配列番号1342)及び配列番号1318のペプチド-IL-15剤複合体について、示された異なる濃度(nM)のペプチド-IL-15剤複合体またはRLIでpH5におけるカテプシンB処理をした場合(+)としない場合(-)のサイトカイン活性を示す。曲線上の各点は、各群n=3の平均を示す。曲線上の各点は、各群n=3の平均を示す。 CTLL2増殖アッセイにおけるカテプシンB切断を示す。 CTLL2細胞中の配列番号1319の、pH7でのカテプシンB処理後のサイトカイン活性を示す。曲線上の各点は、各群n=3の平均を示す。 CTLL2増殖アッセイにおけるカテプシンB切断を示す。CTLL2細胞中の配列番号1321の、pH7でのカテプシンB処理後のサイトカイン活性を示す。曲線上の各点は、各群n=3の平均を示す。 CTLL2細胞中の配列番号1317の、pH5でのカテプシンB処理後のサイトカイン活性を示す。曲線上の各点は、各群n=3の平均を示す。 ジスルフィド切断可能リンカーによって互いに連結された、配列番号568のペプチドとdsRNA(配列番号1371)を含むI/Oとから構成されるペプチドI/O複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるdsRNA中の改変塩基に結合されている(例えば、図に示されるように、配列番号1371中のウリジンが、リンカーに結合される延長アミンを有するウリジンに改変されており、このリンカーがペプチドにも結合されている[図示のように])。)このペプチドI/O複合体中の配列番号1371のdsRNAは、5’ppp(三リン酸)を有し、ヘアピン構造として形成されている点に留意されたい。 図34のペプチドI/O複合体のペプチドのジスルフィド切断産物を示す。 延長された安定的なリンカーによって互いに連結された、配列番号568のペプチドとdsRNA(配列番号1371)を含むI/Oとから構成されるペプチドI/O複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるdsRNA中の改変塩基に結合されている(例えば、図に示されるように、配列番号1371中のウリジンが、リンカーに結合される延長されたアミンを有するウリジンに改変されており、このリンカーがペプチドにも結合されている[図示のように])。このペプチドI/O複合体中の配列番号1371のdsRNAは、5’ppp(三リン酸)を有し、ヘアピン構造として形成されている。 延長された安定的なリンカーによって互いに連結された、配列番号569のペプチドとdsRNA(配列番号1371)を含むI/Oとから構成されるペプチドI/O複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるdsRNA中の改変塩基に結合されている(例えば、図に示されるように、配列番号1371中のウリジンが、リンカーに結合される延長されたアミンを有するウリジンに改変されており、このリンカーがペプチドにも結合されている[図示のように])。このペプチドI/O複合体中の配列番号1371のdsRNAは、5’ppp(三リン酸)を有し、ヘアピン構造として形成されている。 延長された安定的なリンカーによって互いに連結された、ICG色素に結合された配列番号569のペプチド(図27のペプチド複合体を参照)とdsRNA(配列番号1371)を含むI/Oとから構成されるペプチドI/O複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるdsRNA中の改変塩基に結合されている(例えば、図に示されるように、配列番号1371中のウリジンが、リンカーに結合される延長されたアミンを有するウリジンに改変されており、このリンカーがペプチドにも結合されている[図示のように])。このペプチドI/O複合体中の配列番号1371のdsRNAは、5’ppp(三リン酸)を有し、ヘアピン構造として形成されている。 ヒドラゾン/PEGリンカーによって互いに連結された、配列番号569のペプチドとdsRNA(配列番号1371)を含むI/Oとから構成されるペプチドI/O複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるdsRNA中の改変塩基に結合されている(例えば、図に示されるように、配列番号1371中のグアノシンが、リンカーに結合される改変グアノシンであり、このリンカーがペプチドにも結合されている[図示のように])。このペプチドI/O複合体中の配列番号1371のdsRNAは、5’ppp(三リン酸)を有し、ヘアピン構造として形成されている。 ジスルフィド/PEGリンカーによって互いに連結された、配列番号569のペプチドとdsRNA(配列番号1371)を含むI/Oとから構成されるペプチドI/O複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるdsRNA中の改変塩基に結合されている(例えば、図に示されるように、配列番号1371中のグアノシンが、リンカーに結合される改変グアノシンであり、このリンカーがペプチドにも結合されている[図示のように])。このペプチドI/O複合体中の配列番号1371のdsRNAは、5’ppp(三リン酸)を有し、ヘアピン構造として形成されている。 ジスルフィド/PEGリンカーによって互いに連結された、ICG色素に結合された配列番号569のペプチドとdsRNA(配列番号1371)を含むI/Oとから構成されるペプチドI/O複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるdsRNA中の改変塩基に結合されている(例えば、図に示されるように、配列番号1371中のグアノシンが、リンカーに結合される改変グアノシンであり、このリンカーがペプチドにも結合されている[図示のように])。このペプチドI/O複合体中の配列番号1371のdsRNAは、5’ppp(三リン酸)を有し、ヘアピン構造として形成されている。 ヒドラゾンリンカーによって互いに連結された、配列番号569のペプチドとdsRNA(配列番号1371)を含むI/Oとから構成されるペプチドI/O複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるdsRNA中の改変塩基に結合されている(例えば、図に示されるように、配列番号1371中のグアノシンが、リンカーに結合される改変グアノシンであり、このリンカーがペプチドにも結合されている[図示のように])。このペプチドI/O複合体中の配列番号1371のdsRNAは、5’ppp(三リン酸)を有し、ヘアピン構造として形成されている。 長いジスルフィドリンカーによって互いに連結された、配列番号569のペプチドとdsRNA(配列番号1371)を含むI/Oとから構成されるペプチドI/O複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるdsRNA中の改変塩基に結合されている(例えば、図に示されるように、配列番号1371中のグアノシンが、リンカーに結合される改変グアノシンであり、このリンカーがペプチドにも結合されている[図示のように])。このペプチドI/O複合体中の配列番号1371のdsRNAは、5’ppp(三リン酸)を有し、ヘアピン構造として形成されている。 短いジスルフィドリンカーによって互いに連結された、配列番号569のペプチドとdsRNA(配列番号1371)を含むI/Oとから構成されるペプチドI/O複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるdsRNA中の改変塩基に結合されている(例えば、図に示されるように、配列番号1371中のグアノシンが、リンカーに結合される改変グアノシンであり、このリンカーがペプチドにも結合されている[図示のように])。このペプチドI/O複合体中の配列番号1371のdsRNAは、5’ppp(三リン酸)を有し、ヘアピン構造として形成されている。 Hisタグ付けされたRLIタンパク質(配列番号1342)としてのRLIタンパク質(例えば、配列番号1169、配列番号1176、及び配列番号1177を含む)のクーマシー染色したSDS-PAGE及び抗Hisウエスタン分析を示し、約25~26kDa及び30~34kDaに2本のバンドの強いシグナルを示している。 Hisタグ付けされたRLIタンパク質(配列番号1342)としてのRLIタンパク質のIMAC精製のクロマトグラム及びSDS-PAGE分析を示す。 配列番号1317~配列番号1321の発現からの馴化培地のクーマシー染色したSDS-PAGE及び抗Hisウェスタン分析を示す。 配列番号1317及び配列番号1321のペプチド-IL-15剤複合体の小規模精製から得られた画分のクーマシー染色されたSDS-PAGEを示す。 プールし、PBS中でバッファー交換した後の配列番号1317(#3)及び配列番号1321(#5)の各ペプチド-IL-15剤複合体の精製画分E2~E3のクーマシー染色されたSDS-PAGEを示す。 配列番号1318の小規模精製から得られた画分のクーマシー染色されたSDS-PAGEを示す。 プールし、PBS中でバッファー交換した後の配列番号1318(#4)のペプチド-IL-15剤複合体の精製画分E2~E3のクーマシー染色されたSDS-PAGEを示す。 配列番号1319及び配列番号1320の小規模精製から得られた画分のクーマシー染色されたSDS-PAGEを示す。 配列番号1317及び配列番号1321の大規模精製から得られた画分のクーマシー染色されたSDS-PAGEを示す。 プールし、PBS中でバッファー交換し、還元及び非還元条件下で更に分析した、配列番号1317(#3)及び配列番号1321(#5)のペプチド-IL-15剤複合体の画分E2~E4のクーマシー染色されたSDS-PAGEを示す。 安定的なリンカーによって連結された、配列番号568のペプチドと配列番号1375のdsRNAを含むI/Oとから構成される本開示のペプチドI/O複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるdsRNA中の改変塩基に結合されている(例えば、図に示されるように、配列番号1375中のウリジンが、リンカーに結合される延長されたアミンを有するウリジンに改変されており、このリンカーがペプチドにも結合されている[図示のように])。このペプチドI/O複合体中の配列番号1375のdsRNAは、5’ppp(三リン酸)を有し、ヘアピン構造として形成されている。 安定的なリンカーによって連結された、配列番号569のペプチドと配列番号1375のdsRNAを含むI/Oとから構成される本開示のペプチドI/O複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるdsRNA中の改変塩基に結合されている(例えば、図に示されるように、配列番号1375中のウリジンが、リンカーに結合される延長されたアミンを有するウリジンに改変されており、このリンカーがペプチドにも結合されている[図示のように])。このペプチドI/O複合体中の配列番号1375のdsRNAは、5’ppp(三リン酸)を有し、ヘアピン構造として形成されている。 安定的なリンカーによって連結された、配列番号570のペプチドと配列番号1375のdsRNAを含むI/Oとから構成される本開示のペプチドI/O複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるdsRNA中の改変塩基に結合されている(例えば、図に示されるように、配列番号1375中のウリジンが、リンカーに結合される延長されたアミンを有するウリジンに改変されており、このリンカーがペプチドにも結合されている[図示のように])。このペプチドI/O複合体中の配列番号1375のdsRNAは、5’ppp(三リン酸)を有し、ヘアピン構造として形成されている。 安定的なリンカーによって連結された、配列番号568のペプチドと配列番号1376のdsRNAを含むI/Oとから構成される本開示のペプチドI/O複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるdsRNA中の改変塩基に結合されている(例えば、図に示されるように、配列番号1376中のウリジンが、リンカーに結合される延長されたアミンを有するウリジンに改変されており、このリンカーがペプチドにも結合されている[図示のように])。このペプチドI/O複合体中の配列番号1376のdsRNAは、5’ppp(三リン酸)を有し、ヘアピン構造として形成されている。 安定的なリンカーによって連結された、配列番号569のペプチドと配列番号1376のdsRNAを含むI/Oとから構成される本開示のペプチドI/O複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるdsRNA中の改変塩基に結合されている(例えば、図に示されるように、配列番号1376中のウリジンが、リンカーに結合される延長されたアミンを有するウリジンに改変されており、このリンカーがペプチドにも結合されている[図示のように])。このペプチドI/O複合体中の配列番号1376のdsRNAは、5’ppp(三リン酸)を有し、ヘアピン構造として形成されている。 安定的なリンカーによって連結された、配列番号570のペプチドと配列番号1376のdsRNAを含むI/Oとから構成される本開示のペプチドI/O複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるdsRNA中の改変塩基に結合されている(例えば、図に示されるように、配列番号1376中のウリジンが、リンカーに結合される延長されたアミンを有するウリジンに改変されており、このリンカーがペプチドにも結合されている[図示のように])。このペプチドI/O複合体中の配列番号1376のdsRNAは、5’ppp(三リン酸)を有し、ヘアピン構造として形成されている。 安定的なリンカーによって連結された、配列番号568のペプチドと配列番号1371のdsRNAを含むI/Oとから構成される本開示のペプチドI/O複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるdsRNA中の改変塩基に結合されている(例えば、図に示されるように、配列番号1371中のウリジンが、リンカーに結合される延長されたアミンを有するウリジンに改変されており、このリンカーがペプチドにも結合されている[図示のように])。このペプチドI/O複合体中の配列番号1371のdsRNAは、5’ppp(三リン酸)を有し、ヘアピン構造として形成されている。 安定的なリンカーによって連結された、配列番号569のペプチドと配列番号1371のdsRNAを含むI/Oとから構成される本開示のペプチドI/O複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるdsRNA中の改変塩基に結合されている(例えば、図に示されるように、配列番号1371中のウリジンが、リンカーに結合される延長されたアミンを有するウリジンに改変されており、このリンカーがペプチドにも結合されている[図示のように])。このペプチドI/O複合体中の配列番号1371のdsRNAは、5’ppp(三リン酸)を有し、ヘアピン構造として形成されている。 安定的なリンカーによって連結された、配列番号570のペプチドと配列番号1371のdsRNAを含むI/Oとから構成される本開示のペプチドI/O複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるdsRNA中の改変塩基に結合されている(例えば、図に示されるように、配列番号1371中のウリジンが、リンカーに結合される延長されたアミンを有するウリジンに改変されており、このリンカーがペプチドにも結合されている[図示のように])。このペプチドI/O複合体中の配列番号1371のdsRNAは、5’ppp(三リン酸)を有し、ヘアピン構造として形成されている。 安定的なリンカーによって連結された、配列番号568のペプチドと配列番号1376のdsRNAを含むI/Oとから構成される本開示のペプチドI/O複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるdsRNA中の改変塩基に結合されている(例えば、図に示されるように、配列番号1376中のウリジンが、リンカーに結合される延長されたアミンを有するウリジンに改変されており、このリンカーがペプチドにも結合されている[図示のように])。このペプチドI/O複合体中の配列番号1376のdsRNAは、5’pp(二リン酸)を有し、ヘアピン構造として形成されている。 安定的なリンカーによって連結された、配列番号569のペプチドと配列番号1376のdsRNAを含むI/Oとから構成される本開示のペプチドI/O複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるdsRNA中の改変塩基に結合されている(例えば、図に示されるように、配列番号1376中のウリジンが、リンカーに結合される延長されたアミンを有するウリジンに改変されており、このリンカーがペプチドにも結合されている[図示のように])。このペプチドI/O複合体中の配列番号1376のdsRNAは、5’pp(二リン酸)を有し、ヘアピン構造として形成されている。 安定的なリンカーによって連結された、配列番号570のペプチドと配列番号1376のdsRNAを含むI/Oとから構成される本開示のペプチドI/O複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるdsRNA中の改変塩基に結合されている(例えば、図に示されるように、配列番号1376中のウリジンが、リンカーに結合される延長されたアミンを有するウリジンに改変されており、このリンカーがペプチドにも結合されている[図示のように])。このペプチドI/O複合体中の配列番号1376のdsRNAは、5’pp(二リン酸)を有し、ヘアピン構造として形成されている。 安定的なリンカーによって連結された、配列番号568のペプチドと、配列番号1426と配列番号1427とを含む2本の別々のRNA鎖が互いに複合体化されたdsRNA(5’pppは配列番号1426上に位置している)を含むI/Oとから構成される本開示のペプチドI/O複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるdsRNAに付加された改変塩基に結合されている(例えば、図に示されるように、配列番号1426に付加されたウリジンが、リンカーに結合される延長されたアミンを有するウリジンに改変されており、このリンカーがペプチドにも結合されている[図示のように])。 安定的なリンカーによって連結された、配列番号569のペプチドと、配列番号1426と配列番号1427とを含む2本の別々のRNA鎖が互いに複合体化されたdsRNA(5’pppは配列番号1426上に位置している)を含むI/Oとから構成される本開示のペプチドI/O複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるdsRNAに付加された改変塩基に結合されている(例えば、図に示されるように、配列番号1426に付加されたウリジンが、リンカーに結合される延長されたアミンを有するウリジンに改変されており、このリンカーがペプチドにも結合されている[図示のように])。 安定的なリンカーによって連結された、配列番号570のペプチドと、配列番号1426と配列番号1427とを含む2本の別々のRNA鎖が互いに複合体化されたdsRNA(5’pppは配列番号1426上に位置している)を含むI/Oとから構成される本開示のペプチドI/O複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるdsRNAに付加された改変塩基に結合されている(例えば、図に示されるように、配列番号1426に付加されたウリジンが、リンカーに結合される延長されたアミンを有するウリジンに改変されており、このリンカーがペプチドにも結合されている[図示のように])。 安定的なリンカーによって連結された、配列番号568のペプチドと、配列番号1424と配列番号1425とを含む2本の別々のRNA鎖が互いに複合体化されたdsRNA(5’pppは配列番号1424上に位置している)を含むI/Oとから構成される本開示のペプチドI/O複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるdsRNAに付加された改変塩基に結合されている(例えば、図に示されるように、配列番号1424に付加されたウリジンが、リンカーに結合される延長されたアミンを有するウリジンに改変されており、このリンカーがペプチドにも結合されている[図示のように])。配列番号1424と配列番号1425とを含む2本の別々のRNA鎖が互いに複合体化されたdsRNA(5’pppは配列番号1424上に位置している)を含むI/Oは、図81では、「5’ppp dsRNA」としても示されている。 安定的なリンカーによって連結された、配列番号569のペプチドと、配列番号1424と配列番号1425とを含む2本の別々のRNA鎖が互いに複合体化されたdsRNA(5’pppは配列番号1424上に位置している)を含むI/Oとから構成される本開示のペプチドI/O複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるdsRNAに付加された改変塩基に結合されている(例えば、図に示されるように、配列番号1424に付加されたウリジンが、リンカーに結合される延長されたアミンを有するウリジンに改変されており、このリンカーがペプチドにも結合されている[図示のように])。 安定的なリンカーによって連結された、配列番号570のペプチドと、配列番号1424と配列番号1425とを含む2本の別々のRNA鎖が互いに複合体化されたdsRNA(5’pppは配列番号1424上に位置している)を含むI/Oとから構成される本開示のペプチドI/O複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるdsRNAに付加された改変塩基に結合されている(例えば、図に示されるように、配列番号1424に付加されたウリジンが、リンカーに結合される延長されたアミンを有するウリジンに改変されており、このリンカーがペプチドにも結合されている[図示のように])。 安定的なリンカーによって連結された、配列番号568のペプチドと配列番号1379のI/Oとから構成される本開示のペプチドI/O複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるdsRNA中の改変塩基に結合されている(例えば、図に示されるように、配列番号1379中のウリジンが、リンカーに結合される延長されたアミンを有するウリジンに改変されており、このリンカーがペプチドにも結合されている[図示のように])。このペプチドI/O複合体中の配列番号1379のdsRNAは、5’ppp(三リン酸)を有し、ヘアピン構造として形成されている。 安定的なリンカーによって連結された、配列番号569のペプチドと配列番号1379のI/Oとから構成される本開示のペプチドI/O複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるdsRNA中の改変塩基に結合されている(例えば、図に示されるように、配列番号1371中のウリジンが、リンカーに結合される延長されたアミンを有するウリジンに改変されており、このリンカーがペプチドにも結合されている[図示のように])。このペプチドI/O複合体中の配列番号1379のdsRNAは、5’ppp(三リン酸)を有し、ヘアピン構造として形成されている。 安定的なリンカーによって連結された、配列番号570のペプチドと配列番号1379のI/Oとから構成される本開示のペプチドI/O複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるdsRNA中の改変塩基に結合されている(例えば、図に示されるように、配列番号1371中のウリジンが、リンカーに結合される延長されたアミンを有するウリジンに改変されており、このリンカーがペプチドにも結合されている[図示のように])。このペプチドI/O複合体中の配列番号1379のdsRNAは、5’ppp(三リン酸)を有し、ヘアピン構造として形成されている。 安定的なリンカーによって連結された、配列番号569のペプチドと配列番号1371のI/Oとから構成される本開示のペプチドI/O複合体を示し(ホスホロチオエート結合はアスタリスク()で示されている)、リンカーは、結合または連結部位として用いられるdsRNA中の改変塩基に結合されている(例えば、図に示されるように、配列番号1371中のウリジンが、リンカーに結合される延長されたアミンを有するウリジンに改変されており、このリンカーがペプチドにも結合されている[図示のように])。このペプチドI/O複合体中の配列番号1371のdsRNAは、5’ppp(三リン酸)を有し、ヘアピン構造として形成されている。 安定的なリンカーによって連結された、配列番号569のペプチドと配列番号1371のI/Oとから構成される本開示のペプチドI/O複合体を示し(ホスホロチオエート結合及び2’フルオロRNAはそれぞれアスタリスク()及び文字「f」で示されている)、リンカーは、結合または連結部位として用いられるdsRNA中の改変塩基に結合されている(例えば、図に示されるように、配列番号1371中のウリジンが、リンカーに結合される延長されたアミンを有するウリジンに改変されており、このリンカーがペプチドにも結合されている[図示のように])。このペプチドI/O複合体中の配列番号1371のdsRNAは、5’ppp(三リン酸)を有し、ヘアピン構造として形成されている。 安定的なリンカーによって連結された、配列番号569のペプチドと配列番号1371のI/Oとから構成される本開示のペプチドI/O複合体を示し(ホスホロチオエート結合及び2’フルオロRNAはそれぞれアスタリスク()及び文字「f」で示されている)、リンカーは、結合または連結部位として用いられるdsRNA中の改変塩基に結合されている(例えば、図に示されるように、配列番号1371中のウリジンが、リンカーに結合される延長されたアミンを有するウリジンに改変されており、このリンカーがペプチドにも結合されている[図示のように])。このペプチドI/O複合体中の配列番号1371のdsRNAは、5’ppp(三リン酸)を有し、ヘアピン構造として形成されている。 安定的なリンカーによって連結された、配列番号569のペプチドと配列番号1371のI/Oとから構成される本開示のペプチドI/O複合体を示し(ホスホロチオエート結合及びBNA/LNAはそれぞれアスタリスク()及びプラス記号「+」で示されている)、リンカーは、結合または連結部位として用いられるdsRNA中の改変塩基に結合されている(例えば、図に示されるように、配列番号1371中のウリジンが、リンカーに結合される延長されたアミンを有するウリジンに改変されており、このリンカーがペプチドにも結合されている[図示のように])。このペプチドI/O複合体中の配列番号1371のdsRNAは、5’ppp(三リン酸)を有し、ヘアピン構造として形成されている。 トランスフェクション試薬であるリポフェクタミンを、16.2pmolの図34のペプチドI/O複合体、図36のペプチドI/O複合体、図35のI/O(図34のペプチドI/Oの切断産物)、5’pppを有する配列番号1371(図34及び図36のペプチドI/O複合体におけるのと同じ5’pppヘアピンRNAの配列だが改変及びペプチドへの結合のないもの)、または配列番号1424と配列番号1425とを含む2本の別々のRNA鎖が互いに複合体化されたdsRNAを含むI/O(図34及び図36のペプチドI/O複合体におけるのと同じ二本鎖RNAの配列だが5’pppがなく、改変及びペプチドへの結合のないもの)のそれぞれと共に用いて細胞を処理した24時間後のSEAPレポーター細胞内のIFN経路の活性化による発光シグナルを相対発光量(RLU)で示す。 図81は、図37のペプチドI/O複合体、PBS、DMXAA、5’ppp dsRNA+in vivo jet PEI、及び5’ppp hpRNAをマイクロインジェクションしたA20リンパ腫試料を示す。白い点状斑は、CC3染色を示す。投与24時間後に画像を撮影した。「5’ppp dsRNA」はまた、配列番号1424と配列番号1425とを含む2本の別々のRNA鎖が互いに複合体化されたdsRNAを含むI/Oである(5’pppは、配列番号1424上に位置している)。「5’ppp hpRNA」は、5’pppを有する配列番号1371のdsRNAを含むI/Oである(配列番号1371はヘアピン構造を形成する)。図81Aは、1ug及び2ugの図37のペプチドI/O複合体、PBS、DMXAA、5’ppp dsRNA+in vivo jet PEI、及び5’ppp hpRNAをマイクロインジェクションしたA20リンパ腫試料の縮小画像を示す。図81は、図37のペプチドI/O複合体、PBS、DMXAA、5’ppp dsRNA+in vivo jet PEI、及び5’ppp hpRNAをマイクロインジェクションしたA20リンパ腫試料を示す。白い点状斑は、CC3染色を示す。投与24時間後に画像を撮影した。「5’ppp dsRNA」はまた、配列番号1424と配列番号1425とを含む2本の別々のRNA鎖が互いに複合体化されたdsRNAを含むI/Oである(5’pppは、配列番号1424上に位置している)。「5’ppp hpRNA」は、5’pppを有する配列番号1371のdsRNAを含むI/Oである(配列番号1371はヘアピン構造を形成する)。図81Bは、PBS領域、5’ppp hpRNA領域、2ug用量の図37のペプチドI/O複合体が活性を示した領域、及び1ug用量の図37のペプチドI/O複合体が活性を示した領域の拡大画像を示す。CC3染色は白い点状斑で示される。 投与の4時間及び24時間後でペプチドI/O複合体を遊離I/O及びネガティブコントロール(PBS)と比較した放射状プロット分析を示す。 Mo7e細胞を、配列番号1328の発現ベクターをトランスフェクトしたHEK293細胞で馴化した培地、またはトランスフェクトしていない細胞(モックネガティブコントロール)から得られたHEK293馴化培地で処理した3日後にPrestoBlue生細胞アッセイからの相対蛍光単位(RLU)で表した蛍光シグナルを示す。非処理のMo7e細胞も追加のネガティブコントロールとして含めた。エラーバーは、標準偏差を示す(n=3)。 雌Balbcマウスで増殖させたA20リンパ腫細胞を用いたインビボで腫瘍内のインターフェロンβ(Ifnβ)応答を誘導する図37のペプチドI/O複合体の活性を示す。A20リンパ腫試料に図37のペプチドI/O複合体、PBS、DMXAA、5’ppp dsRNA+in vivo jet PEI、及び5’ppp hpRNAをマイクロインジェクションした。 ラベルで示したように、4時間後のA20リンパ腫腫瘍内の試験部位の低倍率画像を示す。 雌Balbcマウスで増殖させたA20リンパ腫細胞を用いたインビボで腫瘍内のインターフェロンβ(Ifnβ)応答を誘導する図37のペプチドI/O複合体の活性を示す。A20リンパ腫試料に図37のペプチドI/O複合体、PBS、DMXAA、5’ppp dsRNA+in vivo jet PEI、及び5’ppp hpRNAをマイクロインジェクションした。ラベルで示したように、4時間後に異なる選択試験物をA20リンパ腫腫瘍に注射した領域の高倍率画像を示す。 雌Balbcマウスで増殖させたCT26結腸癌細胞を用いたインビボで腫瘍内のインターフェロンβ(Ifnβ)応答を誘導する図37のペプチドI/O複合体の活性を示す。CT26腫瘍試料に、図37のペプチドI/O複合体、クロロキン、図37のペプチドI/O複合体+クロロキン、または5’ppp-dsRNA(図81に記載されるdsRNA)をマイクロインジェクションした。ラベルで示したように、図は、腫瘍試料の低倍率画像と、4時間後のCT26大腸癌細胞内の選択された試験部位の高倍率画像とを示す。
本開示は、一般的には、本明細書において「I/O」または「I/O剤」と称する免疫抗がん剤の適用を用いたがん治療のための組成物及び方法に関する。本明細書で使用するところの「I/O」または「I/O剤」は非限定的であり、単一剤、複数剤、または複数剤の複合体を含むことができ、かかる剤は、単量体、二量体(例えば、ホモ二量体またはヘテロ二量体)、または多量体(例えば、ホモ多量体またはヘテロ多量体)の構造を有し、また、かかる剤は、一重、二重、または多重に複合体化、凝集、修飾、融合、連結されるか、または上記の任意の組み合わせである。詳細には、本開示は、本明細書でがんの治療用の「ペプチドI/O複合体」と称するペプチド-免疫抗がん剤複合体に関する。いくつかの実施形態では、本明細書の組成物及び方法は、腫瘍細胞にホーミングし、腫瘍細胞を標的化し、腫瘍細胞に誘導され、腫瘍細胞に保持され、腫瘍細胞に蓄積し、腫瘍細胞へと移動し、腫瘍細胞によってプロセシングされ、腫瘍細胞に透過し、及び/または腫瘍細胞に結合するペプチドを、免疫抗がん剤と組み合わせて用いる。いくつかの実施形態では、ペプチド及びペプチドI/O複合体は、腫瘍ホーミング性であり得る。腫瘍ホーミング性とは、ペプチドが腫瘍の特定の領域、組織、構造、または細胞にホーミングし、これらを標的化し、これらに誘導され、これらへ移動し、これらに保持され、これらに蓄積し、またはこれらに結合することができることを含み得るものであり、また、腫瘍またはがん性組織もしくは細胞中の蓄積または保持、腫瘍組織または腫瘍細胞の選択的蓄積もしくは浸透を含み得るものであり、または周囲の組織または細胞と比較して腫瘍組織または細胞中のペプチド及び/または前記ペプチドと複合体を形成する任意の物質のレベルの増加、またはより高いレベルをもたらし得ることを含み得るものとして理解される。いくつかの実施形態では、ペプチド及びペプチドI/O複合体は、細胞透過性であり得る。いくつかの実施形態では、ペプチド及びペプチドI/O複合体は、血液脳関門(BBB)を通過し得る。いくつかの実施形態では、ペプチド及びペプチドI/O複合体は、細胞に取り込まれることによって細胞透過性を示して細胞内区画にアクセスでき、エンドサイトーシスされ、ピノサイトーシスされ、細胞膜を通過して移動でき、血液脳関門(BBB)を通過でき、または特定の細胞内位置に蓄積するかもしくはペプチドI/O複合体またはI/Oを送達することができる。いくつかの実施形態では、ペプチド及びペプチドI/O複合体は腫瘍ホーミング性であってよく、特定の腫瘍組織、細胞、細胞区画、及び/またはサイトゾルに蓄積または送達され得る。いくつかの実施形態では、ペプチド及びペプチドI/O複合体は、BBBを通過することも可能であり、脳腫瘍、転移性がん病変(例えば、CNS内の)ならびに他の脳障害及び疾患をはじめとする中枢神経系(CNS)がんの治療に使用することができる。例えば、本明細書に記載されるペプチドI/O複合体は、BBBを通過して神経実質に入り、治療活性を有する分子をCNSがんを含む神経疾患の標的に送達することができる。いくつかの実施形態では、ペプチド及びペプチドI/O複合体は、上記の特性の任意の組み合わせで機能することができ、したがって、細胞透過性、腫瘍ホーミング性、血液脳関門通過性、またはそれらの任意の組み合わせを有することができる。かかる特性は、所望の治療または疾患に応じて、本明細書に記載されるように、改変、最適化、及びペプチド自体またはペプチドI/O複合体に組み込むことができる。いくつかの実施形態では、ペプチドI/O複合体及びI/Oは、本明細書に記載される治療効果のいずれかを刺激することを含む、宿主免疫応答を刺激することができる。いくつかの実施形態では、本開示は、腫瘍ホーミングペプチドI/O複合体、細胞透過性ペプチドI/O複合体、BBB透過性ペプチドI/O複合体、腫瘍ホーミング及び細胞透過性及びBBB透過性ペプチドI/O複合体、腫瘍ホーミング及び細胞透過性ペプチドI/O複合体、細胞透過性及びBBB透過性ペプチドI/O複合体、または腫瘍ホーミング及びBBB透過性ペプチドI/O複合体を提供する。
特定の実施形態では、本開示のペプチドとI/Oの組み合わせは、腫瘍微小環境、腫瘍組織、細胞、細胞区画、及び/またはサイトゾルへのI/Oの局所送達を可能にする。かかる送達も、腫瘍ホーミング及び/または細胞透過性を含み得る。本開示の腫瘍ホーミング及び/または細胞透過性ペプチドを用いてI/Oを送達することによって、I/Oの濃度を標的となる腫瘍微小環境中で増加させ、そこでI/Oの治療活性を発揮することができる。I/Oは極めて強力で重篤な副作用を伴う場合があり、そのようなオフターゲット効果は腫瘍学におけるI/Oの使用を制限し得る。本開示のペプチドの使用は、I/Oの投与の治療ウィンドウを効果的に増大させ、ペプチドを伴わないI/Oの全身性の非特異的送達から生じ得る毒性を低下させ得る。いくつかの実施形態では、ペプチド及びペプチドI/O複合体は、エンドサイトーシスまたはピノサイトーシスなどによって細胞に取り込まれることにより細胞透過性であり、切断されて、腫瘍微小環境中に分泌され得る。いくつかの実施形態では、ペプチドI/O複合体は、細胞外で、または腫瘍微小環境中の細胞表面で切断され得る。いくつかの実施形態では、細胞透過性は、エンドソームによる取り込みのみ、エンドソームによる取り込み、プロセシング、及び分泌、または細胞質への取り込み及び送達を示す。いくつかの実施形態では、細胞透過性は、任意の細胞内区画への送達を含み得る。いくつかの実施形態では、細胞透過性は、エンドソーム、リソソーム、ゴルジ装置、小胞体、サイトゾル、または核などの特定の細胞内区画への送達を含み得る。I/O単独またはペプチドI/O複合体の効力または活性は、腫瘍微小環境または細胞内でのプロセシングまたは切断後に増大させることができ、これにより、ペプチドI/O複合体の効力は全身輸送中にはより低く、腫瘍または腫瘍微小環境中でのプロセシング後にはより高くなる。固形腫瘍は、抗体のような大きな分子などの治療薬では透過しにくい場合がある。抗体のような一部の大きな分子は、腫瘍の外側部分を覆うことはできるが、腫瘍の各部分の内部には治療濃度以下のより低い濃度でしか透過することができない。本開示のペプチドは、固形腫瘍に透過することができる。本開示のペプチドによる固形腫瘍へのこのような透過は、ペプチドのより小さなサイズ、より速い解離速度、特異的な結合相互作用、それらの組み合わせ、他の特性、またはそれらの組み合わせによるものであり、これにより、腫瘍内への、または腫瘍全体にわたった、または腫瘍の特定の領域へのI/Oの送達を増大させ得る。いくつかの実施形態では、本開示の任意のペプチド、例えば、配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のうちのいずれか1つは、例えば、腫瘍、組織、細胞、細胞区画、またはそれらの任意の組み合わせなどの特定の標的にホーミングする能力を高めるように改変(例えば変異)することができる。いくつかの実施形態では、本開示の任意のペプチド、例えば、配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のうちのいずれか1つは、任意のがんの治療において有効性を高めるように改変(例えば変異)することができる。特定の実施形態では、I/Oと組み合わせた本開示のペプチドは、ペプチドの細胞透過特性により、細胞質、またはエンドソーム、または腫瘍微小環境の細胞の他の細胞内区画へのI/Oの送達を可能とし得る。ペプチドは、I/Oを細胞膜を通過して細胞質に運ぶことができる。例えば、ペプチドは、小胞体またはゴルジ装置の近くなどの細胞質内の特定の場所に細胞膜を横切ってI/Oを運ぶことができる。これに対して、本開示のペプチドなしでは、I/Oは、細胞内に効率的に、またはまったく入ることができない可能性がある。したがって、本開示のペプチドは、I/Oがその細胞内標的にアクセスしてその治療効果を発揮することを可能とし得る。いくつかの実施形態では、ペプチドI/O複合体のペプチドは、細胞への進入、細胞内でのペプチドI/O複合体のプロセシング、またはそれらの組み合わせを可能にすることができ、I/Oはその後、細胞表面に提示されるか、または腫瘍微小環境内に分泌される。いくつかの実施形態では、ペプチドI/O複合体のI/Oは、ペプチドI/O複合体の形態にあるときは不活性であるか、または低い活性を有するが、その後、ペプチドI/Oが細胞外空間または細胞内でプロセシングされた後、I/Oは放出または活性化されてペプチドI/O複合体の形態にある場合よりも高い活性を示すことができる。これにより、I/O単独の投与と比較して、ペプチドI/O複合体の投与後には、腫瘍細胞、腫瘍微小環境、またはそれらの組み合わせにおける活性化I/Oの濃度の増加をもたらし得る。さらに、これにより、I/O単独の投与と比較して、ペプチドI/O複合体としてのI/Oの投与の結果として、I/Oの治療ウィンドウ及び有効性が向上し得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、I/O剤を血液脳関門を通過してCNS内に運ぶことができ、I/O剤のCNSへの送達を可能とする。本開示のペプチドの腫瘍ホーミング特性は、腫瘍微小環境中への蓄積、腫瘍微小環境内での保持、他の組織よりも高いレベルでの腫瘍内での存在、腫瘍の細胞内での保持を含み得る。本明細書で使用するところの「腫瘍」なる用語は、がん細胞、間質細胞、血管、及びさまざまな浸潤細胞からなる総質量を指すことができる。
いくつかの実施形態では、本開示のペプチド及びI/Oは、複合体として一緒に送達される。これを、本明細書では「ペプチドI/O複合体」と称する。このペプチドI/O複合体は、直接的結合、共配合、送達ビヒクル(例えば、リポソームまたはナノ粒子)中への配合、または融合体としてペプチドとI/Oを一緒に組換え発現することによって形成することが可能である。ペプチドI/O複合体は、高親和性受容体-リガンド型相互作用などの非共有結合相互作用によっても互いに保持され得る。ペプチドI/O複合体は、特定の臓器及び/または腫瘍に特異的な区画にホーミングすることができる。例えば、ペプチドI/O複合体のI/Oは、腫瘍微小環境中の標的、脳内の標的、及び/または細胞表面もしくは細胞質、小胞体内、もしくはゴルジ装置内の標的にアクセスすることができる。
本開示の例示的なI/Oとしては、IL-15剤、RIG-Iリガンド、4-1BBリガンド、STINGリガンド、MDA5リガンド、CGASリガンド、TLR3リガンド、TLR7/8リガンド、またはTLR9リガンドを含む免疫抗がん剤(I/O)が挙げられる。IL-15剤、RIG-Iリガンド、4-1BBリガンド、STINGリガンド、MDA5リガンド、CGASリガンド、TLR3リガンド、TLR7/8リガンド、またはTLR9リガンドには、それぞれの受容体または標的の機能または活性を活性化、刺激または増強するアゴニストとして作用するものなどのアゴニスト活性を有する薬剤またはリガンドが含まれる。例えば、本明細書で使用するところの「リガンド」または「薬剤」とは、標的(IL-15受容体(IL-15R)、RIG-I、4-1BB、STING、MDA5、CGAS、TLR3、TLR7/8、またはTLR9)と結合または相互作用することによって、例えば、腫瘍の微小環境、腫瘍組織、細胞、細胞内区画、及び/またはサイトゾル中での標的の活性または機能を調節することが可能な任意の部分を包含するものを意味する。「リガンド」または「薬剤」である本開示のI/Oは、ペプチドI/O複合体のI/Oの相互作用及び所望の効果に応じて、それらの標的に対するさまざまな活性を調節する。例えば、リガンドまたは薬剤は、その標的と結合または相互作用する際、標的の機能を活性化、刺激または増強するアゴニストとして作用することにより、または標的の機能を遮断、阻止または低減するアンタゴニストとして作用することにより、標的の活性を調節することができる。
「リガンド」なる用語は、本明細書では、結合活性を示す、例えば、IL-15受容体、RIG-I I、4-1BB、STING、MDA5、CGAS、TLR3、TLR7/8、またはTLR9などの受容体への結合を示す広範囲のI/Oを指して用いることができる。リガンドは、アゴニストまたはアンタゴニストであり得る。例えば、STINGに結合することができる「STINGリガンド」は、STINGアゴニストであり得る。アゴニストは、それが結合する受容体または標的を活性化する特定のI/Oを指すことができる。アンタゴニストは、受容体または標的の天然のアゴニストを遮断するか、または受容体または標的のシグナル伝達経路を遮断し、それにより活性を阻害する特定のI/Oを指すことができる。
本開示の例示的なI/Oとしては、これらに限定されるものではないが、I型インターフェロン;インターフェロンγ;インターロイキン(IL)-2、IL-7、IL-15、IL-21、IL-12、IL-22、IL-23、IL-24、IL-27、IL-28、IL-29、IL-1、IL-18、IL-33を含むサイトカイン;これらに限定されるものではないが、CTLA-4、PD-1、PD-L1、TIM-3、LAG-3、VISTA、B7-H3、B7-H4、B7S1、ガレクチン9、CD244、BTLA、CD160、CIS、LIGHT、TIGITの阻害剤を含むチェックポイント阻害剤;これらに限定されるものではないが、TLR、NLR、ALR、CLR、RLR、RIG-I、MDA5、及びSTINGを含むパターン認識受容体(PRR)のリガンド;これらに限定されるものではないが、がん細胞の細胞表面のCD47発現を下方制御させることができる、またはCD47-SIRPα相互作用を直接遮断することができるSIRPαを含むマクロファージチェックポイントCD47を阻害する分子;酵素インドールアミン-2,3-ジオキシゲナーゼ(IDO)の活性を阻害する分子;これらに限定されるものではないが、CIS、KIR2DL1-3、KIR3DL1、CD94/NKG2Aを含むナチュラルキラー(NK)細胞のチェックポイントを遮断する分子;ならびに、これらに限定されるものではないが、CD40、4-1BB、OX40、ICOS、CD27、TL-1A、TRAIL、FAS、及びGITRを含むTNFファミリーメンバーのリガンドまたは他のアゴニストもしくはアンタゴニストをさらに挙げることができる。いくつかの実施形態では、ペプチドI/O複合体は、トランス提示され得るIL-15/IL-15Rαスシドメインと複合体化された本開示のペプチドである。この場合、ペプチドはIL-15/IL-15Rαスシドメインを腫瘍微小環境に送達することができ、そこでI/Oは細胞外または細胞表面で活性化することができる。いくつかの実施形態では、ペプチドI/O複合体は、RIG-Iリガンド(例えば、5’ppp-RNA、少なくとも20塩基または2個のフルオロピラミジン)、STINGリガンド(2’-3’cGAMPまたは変異体)、またはMDA5リガンドと複合体化された、腫瘍ホーミング性でもあり得る細胞透過性ペプチドであり、これにより、これらのリガンドはいずれも、細胞質の標的にアクセスしてアゴニストとして作用することができる。
本開示のさらなる態様及び利点が、本開示の例示的実施形態を示し、記載した、以下の詳細な説明より当業者には明らかとなるであろう。認識されるように、本開示は、他の実施形態及び異なる実施形態が可能であり、そのいくつかの細部は、いずれも本開示から逸脱することなくさまざまな点で改変が可能である。したがって、図面及び説明文は、本質的に例示的なものとしてみなされるべきであり、制限的なものとしてみなされるべきではない。
本明細書で使用する場合、天然のl-エナンチオマーアミノ酸の略語は従来のものであり、以下のとおりである。すなわち、アラニン(A、Ala)、アルギニン(R、Arg)、アスパラギン(N、Asn)、アスパラギン酸(D、Asp)、システイン(C、Cys)、グルタミン酸(E、Glu)、グルタミン(Q、Gln)、グリシン(G、Gly)、ヒスチジン(H、His)、イソロイシン(I、Ile)、ロイシン(L、Leu)、リシン(K、Lys)、メチオニン(M、Met)、フェニルアラニン(F、Phe)、プロリン(P、Pro)、セリン(S、Ser)、スレオニン(T、Thr)、トリプトファン(W、Trp)、チロシン(Y、Tyr)、バリン(V、Val)。通常、Xaaは任意のアミノ酸を示すことができる。いくつかの実施形態では、Xは、アスパラギン(N)、グルタミン(Q)、ヒスチジン(H)、リシン(K)、またはアルギニン(R)であり得る。一般的でないタンパク質構成α-アミノ酸または天然のL-エナンチオマーアミノ酸前駆体または中間体を含む他のL-エナンチオマーアミノ酸の略語は、従来のものである場合もあり、例えば以下のように1文字コードがある場合とない場合とがある。すなわち、シトルリン(Cit、しばしば、Xとして示される)、セレノシステイン(U、Sec)、及びピロリシン(O、Pyl)。
本開示のいくつかの実施形態では、任意の標準的もしくは非標準的アミノ酸またはその類似体のD-アミノ酸残基を想到している。アミノ酸配列が一連の3文字または1文字のアミノ酸略語で表記されている場合、標準的な使用法及び慣習に従って、左方向がアミノ末端方向、右方向がカルボキシ末端方向である。
ペプチド
本開示では、システイン高密度ペプチドを含むか、またはそれから誘導することが可能なペプチドを提供する。本明細書で使用するところの「システイン高密度ペプチド」なる用語は、「結節ペプチド」、「ノッティン」、及び「オプチド」なる用語と互換可能であり、また、システイン高密度ペプチドは「CDP」と略記することもできる。ヒチン類は、他のジスルフィド含有ペプチドの中でも、本開示の目的では「結節ペプチド」とみなすこともできる。例えば、ノッティン類は、しばしばコンパクトな構造にフォールディングされた、アミノ酸約11個から約80個の長さを有するシステイン高密度ペプチドのクラスである。ノッティン類と他のシステイン高密度ペプチドは通常、分子内ジスルフィド架橋の数によって特徴付けられる複雑な三次構造にアセンブルされ、β鎖、α螺旋、及び他の二次構造を含み得る。ジスルフィド結合の存在は、システイン高密度ペプチドに優れた環境安定性を与えることにより、システイン高密度ペプチドが極端な温度及びpHに耐え、血流中または消化管内のタンパク質分解酵素に耐性を示すことを可能とし、さらに、特定の生体内分布、薬物動態、結合相互作用、細胞プロセシング、または生理学的及び治療的価値を有する他の特性を与えることができる。本明細書に開示されるペプチドは、特定のシステイン高密度ペプチドから誘導することができる。
いくつかの実施形態では、システイン高密度ペプチドは、そのコンパクトなサイズのために組織に透過することができる。システイン高密度ペプチドはさらに固形腫瘍に透過し、抗体などの他の分子よりも高い濃度で、より深く、またはより完全にこうした固形腫瘍に透過することができる。システイン高密度ペプチドは、血液脳関門(BBB)、細胞膜、または特異的または非特異的な結合相互作用によって生じ得る他の生理学的バリアなどのバリアを通過することもできる。システイン高密度ペプチドは、例えば抗体よりも速やかに循環中から除去される一方で、腫瘍組織または細胞などの他の組織中に蓄積または保持され得る。システイン高密度ペプチドは、他のペプチド、タンパク質、または抗体よりも免疫原性が低くなり得るが、これは、免疫細胞によるプロセシング及び提示を低下させるシステイン高密度ペプチドのコンパクトな構造及び/またはプロテアーゼに対する耐性に起因するものである。システイン高密度ペプチドは、コンパクトな構造、プロテアーゼ耐性、腫瘍透過性、またはその他の特性を維持したままで、アミノ酸及びループ領域の変異を可能とする。
システイン高密度ペプチドの剛性は、軟らかいペプチドが標的に結合する際に発生する「エントロピーペナルティ」を支払うことなく、システイン高密度ペプチドが標的に結合することを可能とし得る。例えば、結合は、ペプチドが標的に結合して複合体を形成する際に生じるエントロピーの損失によって悪影響を受ける。したがって、「エントロピーペナルティ」は結合に対する悪影響であり、この結合に際して発生するエントロピー損失が大きいほど、「エントロピーペナルティ」も大きくなる。さらに、柔軟な未結合分子は、複合体として結合すると柔軟性が失われるため、強固に構造化された分子よりも複合体を形成する際により多くのエントロピーを失う。しかし、未結合分子の剛性は、分子が形成できる複合体の数を制限することにより特異性も一般的に高める。
本明細書のシステイン高密度ペプチドは、抗体と同様の親和性で標的に結合することができる。システイン高密度ペプチドは、アネキシンA2、マトリックスメタロプロテイナーゼ2、ニューロピリン1、リン脂質、脂質ラフトの成分、またはその他の標的に結合することができる。さらに、いくつかの実施形態では、システイン高密度ペプチドは細胞内に透過することができる。他の実施形態では、システイン高密度ペプチドは、他のタイプの分子と比較して、より迅速なクリアランス及び細胞取り込みを示す。
システイン高密度ペプチドは、ジスルフィド架橋を含むことができる。システイン高密度ペプチドは、残基の5%以上が分子内ジスルフィド結合を形成するシステインであるようなペプチドであり得る。システイン高密度ペプチドは、残基の10%以上が分子内ジスルフィド結合を形成するシステインであるようなペプチドであり得る。ジスルフィド結合ペプチドは薬物の足場となり得る。いくつかの実施形態では、ジスルフィド架橋はノットを形成する。ジスルフィド架橋は、システイン残基間、例えばシステイン1と4、2と5、または3と6の間で形成され得る。場合により、1個のジスルフィド架橋が、他の2個のジスルフィド架橋によって形成されるループを通過することによって阻害剤ノットを形成する。他の場合では、ジスルフィド架橋は、任意の2個のシステイン残基の間に形成され得る。
本開示は、例えば、腫瘍微小環境、腫瘍組織、細胞、細胞区画、及び/またはサイトゾルを標的として、それらにホーミングすることができるさらなるペプチドを生成するための開始点として使用できるペプチドの足場として使用することが可能な、配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のうちのいずれか1つのペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、これらの足場は、各種のシステイン高密度ペプチドから誘導することができる。特定の実施形態では、システイン高密度ペプチドは、分子内ジスルフィド架橋の数によって特徴付けられる複雑な三次構造にアセンブルされ、β鎖及びα螺旋などの他の二次構造を含むことができる。例えば、システイン高密度ペプチドは、ジスルフィドノットを通じたジスルフィドによって特徴付けられる、ジスルフィドに富む小さなタンパク質を含み得る。このノットは、例えば、1個のジスルフィド架橋が2個の他のジスルフィドとそれらを相互接続する主鎖とによって形成された大環状分子と交差する際に得られる。いくつかの実施形態では、システイン高密度ペプチドは、成長因子のシステインノットまたは阻害剤のシステインノットを含むことができる。他の可能なペプチド構造は、βシートなしで2個のジスルフィド架橋によって連結された2個の平行な螺旋を有するペプチド(例えば、ヘフトキシン)を含み得る。
システイン高密度ペプチドは、L配置の少なくとも1つのアミノ酸残基を含むことができる。システイン高密度ペプチドは、D配置の少なくとも1つのアミノ酸残基を含むことができる。いくつかの実施形態では、システイン高密度ペプチドは、少なくとも11~81個のアミノ酸残基からなる長さである。いくつかの実施形態では、システイン高密度ペプチドは、少なくとも22~63個のアミノ酸残基からなる長さである。いくつかの実施形態では、システイン高密度ペプチドは、少なくとも15~40個のアミノ酸残基からなる長さである。他の実施形態では、システイン高密度ペプチドは、少なくとも11~57個のアミノ酸残基からなる長さである。さらなる実施形態では、システイン高密度ペプチドは、少なくとも20個のアミノ酸残基からなる長さである。さらに、上記の各実施形態、またはその活性フラグメントは、所望の特性(例えば、腫瘍ホーミング、結合、細胞透過性など)を与えるために他のペプチドに挿入または他のペプチドと融合することができる。
本開示のペプチドは、システインアミノ酸残基を含むことができる。いくつかの実施形態では、ペプチドは少なくとも4個のシステインアミノ酸残基を有することができる。場合によっては、、ペプチドは少なくとも6個のシステインアミノ酸残基を有することができる。他の場合では、ペプチドは、少なくとも8個のシステインアミノ酸残基、少なくとも10個のシステインアミノ酸残基、少なくとも12個のシステインアミノ酸残基、少なくとも14個のシステインアミノ酸残基、または少なくとも16個のシステインアミノ酸残基を有することができる。特定の実施形態では、ペプチドは、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、または少なくとも16個のシステイン残基を含むことができる。
システイン高密度ペプチドは、ジスルフィド架橋を含むことができる。システイン高密度ペプチドは、残基の5%以上が分子内ジスルフィド結合を形成するシステインであるようなペプチドであり得る。ジスルフィド結合で連結されたペプチドは薬物の足場となり得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、阻害剤ノットを形成する複数のジスルフィド架橋を含む。特定の実施形態では、ジスルフィド架橋は、ペプチドのシステイン残基間に形成され得る。例えば、配列中の1番目のシステイン残基は、配列中の4番目のシステイン残基とジスルフィド結合することができ、配列中の2番目のシステイン残基は、配列中の5番目のシステイン残基とジスルフィド結合することができ、及び/または配列中の3番目のシステイン残基は、配列中の6番目のシステイン残基とジスルフィド結合することができる。代替的な実施形態では、ジスルフィド架橋は、任意の2個のシステイン残基間に形成され得る。場合によっては、1個のジスルフィド架橋が、他の2個のジスルフィド架橋によって形成されたループまたはリングを通過することで「ツーアンドスルー」系としても知られるジスルフィドノット(例えば、阻害剤ノット)を介してジスルフィドを形成することができる。
表1に、本開示によるいくつかの例示的なペプチドを示す。
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いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるペプチドI/O複合体における本開示のペプチドは、配列番号1と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも82%、少なくとも84%、少なくとも86%、少なくとも88%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも100%の配列同一性を有するペプチド、またはその変異体、ホモログ、もしくはフラグメントであってよい。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるペプチドI/O複合体における本開示のペプチドは、配列番号2と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも82%、少なくとも84%、少なくとも86%、少なくとも88%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも100%の配列同一性を有するペプチド、またはその変異体、ホモログ、もしくはフラグメントであってよい。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるペプチドI/O複合体における本開示のペプチドは、配列番号568と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも82%、少なくとも84%、少なくとも86%、少なくとも88%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも100%の配列同一性を有するペプチド、またはその変異体、ホモログ、もしくはフラグメントであってよい。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるペプチドI/O複合体における本開示のペプチドは、配列番号569と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも82%、少なくとも84%、少なくとも86%、少なくとも88%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも100%の配列同一性を有するペプチド、またはその変異体、ホモログ、もしくはフラグメントであってよい。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるペプチドI/O複合体における本開示のペプチドは、配列番号570と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも82%、少なくとも84%、少なくとも86%、少なくとも88%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも100%の配列同一性を有するペプチド、またはその変異体、ホモログ、もしくはフラグメントであってよい。
いくつかの実施形態において、クロロトキシン(CTX)ペプチド及びその変異体のいくつかは、多くの異なるタイプのヒト腫瘍に結合することができる(Dardevet et al.,Toxins(Basel)7:1079-1101(2015);Ojeda et al.,Biopolymers 106:25-36(2016);Stroud et al.,Current Pharmaceutical Design 17:4362-4371(2011))。必要に応じて蛍光標識または放射標識されたクロロトキシンは、脳腫瘍、前立腺癌、肉腫、及び結腸癌のマウスモデルで腫瘍選択的な取り込みを示すことができる(Veiseh et al., Cancer Res 67:6882-6888 (2007);Kovar et al.,Anal Biochem 440:212-219(2013))。CTXの蛍光標識変異体であるトズレリスチドは、げっ歯類モデルにおいて(Butte et al.,Neurosurgical Focus 36:E1(2014);Baik et al.,JAMA Otolaryngol Head Neck Surg 142:330-338 (2016))、及び自然腫瘍を有するイヌにおいて(Fidel et al.,Cancer Res 75:4283-4291(2015))、複数の腫瘍タイプで腫瘍選択的取り込みを示す。放射性標識クロロトキシンは、第1相及び第2相の臨床試験で試験されている。放射性標識クロロトキシンは、結腸癌、前立腺癌、非小細胞肺癌、転移性黒色腫、膵臓癌、及び神経膠腫をはじめとする固形腫瘍に選択的に結合することができる(Hockaday et al.,J Nucl Med 46:580-586(2005);Mamelak et al.,J Clin Oncol 24:3644-3650(2006);Gribbin et al.,J Clin Oncol 27:abstr e14507(2009);O’Neill及びJacoby,米国特許出願第20100215575号(2010))。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、対象への投与後に高い腫瘍対バックグラウンドシグナルを示し、対象はヒトまたは非ヒト動物である。腫瘍組織と比較して正常組織への結合が最小限であることは、クロロトキシンペプチド及びその変異体のいくつかが腫瘍ホーミングできる能力を示している。いくつかの実施形態では、本開示の任意のペプチドは、これらに限定されるものではないが、結腸癌、前立腺癌、非小細胞肺癌、黒色腫、乳癌、及び神経膠腫を含む固形腫瘍に結合でき、正常組織へのオフターゲット結合が最小である。
15位及び23位にアラニンまたはアルギニン置換(K15A K23A、またはK15R K23R)を有するクロロトキシン変異体は、腫瘍結合特性を保持し、環状化形態は腫瘍結合特性を保持し、また直鎖状ペプチドと比較してより長い血清中半減期を有する(Akcan et al, J Med Chem 54:782-787(2011))。Alaスキャン(ペプチド配列全体を通じて1個以上の残基をAlaで置換する)によって、例えば、変異体ペプチドを作製し、腫瘍の蓄積、血液脳関門の透過、正しいフォールディング、及びI/O経路の関与などの機能について試験することなどにより、ペプチドが機能するうえで重要なペプチドの領域を特定することができる。例えば配列番号568などの本開示のペプチド内の1個以上のアミノ酸残基をAlaで置換することができる。放射性標識(Hockaday et al.,J Nucl Med 46:580-586 (2005))及び蛍光タグ付け(Veiseh et al.,Cancer Res 67:6882-6888(2007))されたクロロトキシンで観察される長い保持時間は、単純な細胞表面に対する結合速度論以外の機構を示唆するものである。クロロトキシンペプチド及びその変異体の一部は、15位及び23位のリシンからアルギニンへの置換によって促進される能動的プロセスによって、がん細胞に内在化されることが示されている(Ojeda et al.,Biopolymers 108(2017))(Ojeda et al.,Biopolymers 108(2017);Wiranowska et al.,Cancer Cell Intl 11:1-13(2011))。クロロトキシンは、細胞表面のアネキシンA2(ANXA2)と会合することができ(Kesavan et al.,J Biol Chem 285:4366-4374 (2010))、アネキシンA2は、S100A10とともにカルパクチンIまたはAIItと呼ばれる94kDaのヘテロ四量体を形成する(MacLeod et al.,J Biol Chem 278:25577-25584(2003))。アネキシンA2は脂質ラフトと会合する能力があることが知られており、内在化されて、分解ではなくリサイクルされるようにターゲティングされる(Valapala and Vishwanatha,J Biol Chem 286:30911-30925(2011))。クロロトキシンは、MMP-2の細胞表面発現と相互作用して発現を低下させることもできる(Deshane et al., J Biol Chem 278:4135-4144(2003))。標識されたクロロトキシンの内在化は、クロロトキシン:Cy5.5への曝露後の培養細胞内の点状シグナルによって確認することができる(Veiseh et al.,Cancer Res 67:6882-6888(2007))。さらなる研究により、クロロトキシンはクラスリン介在性エンドサイトーシスによりがん細胞に内在化され得ること、及び核周囲のゴルジ領域にさらに局在化できることが示されている(Wiranowska et al.,Cancer Cell International 11:27(2011))。クロロトキシンは、オンコナーゼなどの細胞毒性薬に結合させることができ、細胞への取り込みを増加させることにより、細胞毒性薬の抗腫瘍作用を高めることができる(Wang and Guo,Oncol Lett 9:1337-1342(2015))。いくつかの実施形態では、本開示の任意のペプチドは、細胞表面の標的への結合により、またはペプチドの任意の残基におけるリシンからアルギニンへの変異によって促進される能動的プロセスにより、またはピノサイトーシスにより、アネキシンA2と会合することができ、またはカルパクチンと会合することができ、または脂質ラフトと会合することができ、またはカベオリン介在性内在化によってMMP-2と相互作用でき、またはクラスリン介在性エンドサイトーシスによって内在化され得る。
また、インビボ研究によって、例えば、配列番号1243~配列番号1262のペプチドのような、LCMI-IIペプチド、THP1ペプチド、及びキモトリプシン阻害剤としても知られるパシファスチンペプチドが腫瘍の細胞に蓄積し、細胞を透過する能力も示されている(Sottero et al,Anticancer Research 38:51-60(2018))。配列番号1243~配列番号1262に記載されるものなどのこれらのペプチドは、セリンプロテアーゼであるキモトリプシン及びエラスターゼなどのプロテアーゼと相互作用することができる。腫瘍微小環境中で、II型膜貫通セリンプロテアーゼであるマトリプターゼ、ヘプシン、TMPRSS2、TMPRSS4などのがん関連セリンプロテアーゼなどのプロテアーゼが上方制御してより高い濃度で存在し、これらとの結合または相互作用によって、腫瘍及び腫瘍細胞中のパシファスチンペプチドの選択的蓄積が引き起こされている可能性がある。これらのペプチド、例えば、配列番号1243~配列番号1262に記載されるものは、変異に対して高い耐性を有し得る。I/O剤を配列番号1243~配列番号1262に記載されるものなどのパシファスチンペプチドまたはそれらの変異体と複合体化することにより、I/O剤を腫瘍に選択的に送達し、腫瘍に蓄積させ、または、腫瘍細胞の細胞内区画もしくは細胞質または腫瘍微小環境に送達することができる。さらに、本発明のペプチドI/O複合体を使用して、セリンプロテアーゼ、キモトリプシン及びエラスターゼセリンプロテアーゼ、II型膜貫通セリンプロテアーゼ、マトリプターゼ、ヘプシン、TMPRSS2、TMPRSS4などのがん関連プロテアーゼが上方制御または存在しているがん及び腫瘍へのI/Oの送達を行うことができる。
本明細書に開示されるペプチドのいずれのもの、例えば、配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のいずれも、細胞透過特性、BBB通過特性、腫瘍ホーミング特性、またはそれらの組み合わせを有することができる。配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316、またはそれらのフラグメントのいずれにおいても、任意の1個以上のK残基をR残基で置き換えることができ、または任意の1個以上のR残基をK残基で置き換えることができる。配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316、またはそれらの任意のフラグメントのいずれにおいても、任意の1個以上のM残基を、I、L、またはV残基のうちのいずれか1つで置き換えることができ、1個以上のL残基を、V、I、またはM残基のうちのいずれか1つで置き換えることができ、任意の1個以上のI残基を、M、L、またはV残基のうちのいずれか1つで置き換えることができ、または、任意の1個以上のV残基を、I、L、またはM残基のうちのいずれか1つで置き換えることができる。いずれの実施形態においても、ペプチドまたはペプチドフラグメント中の少なくとも1つのアミノ酸を単独でまたは組み合わせて以下、すなわち、K/R、M/I、L/V、G/A、S/T、Q/N、及びD/Eのように交換することができる(ただし、各文字はそれぞれ個々に任意のアミノ酸またはアミノ酸類似体である)。いくつかの例では、ペプチドはリシン残基を1個だけ含む場合も、リシン残基を含まない場合もある。配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316、またはそれらのフラグメントのいずれにおいても、任意のアミノ酸をシトルリン(Cit)で置き換えることができる。いくつかの場合では、ペプチドは、配列番号1~配列番号567、配列番号1243~配列番号1252、または配列番号1263~配列番号1289のペプチドと同様に、最初の2個のN末端アミノ酸としてGSを含むことができるか、またはそのようなN末端アミノ酸(GS)を他の任意の1個または2個のアミノ酸で置換することができる。他の場合では、ペプチドは、配列番号568~配列番号1134、配列番号1253~配列番号1262、または配列番号1290~配列番号1316のペプチドと同様に、最初の2個のN末端アミノ酸としてGSを含まない。いくつかの場合では、ペプチドのN末端がアセチル基などによってブロックされてもよく、他の例では、ペプチドのC末端がアミド基などによってブロックされてもよい。
いくつかの例では、ペプチドは、配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のうちのいずれか1つまたはそれらの機能性フラグメントであり、それらの機能性フラグメントは、それが機能性フラグメントであるペプチドと同様に、腫瘍の特定の領域、組織、構造、または細胞にホーミング、標的化、誘導、移動、保持、蓄積、または結合することができる。他の実施形態では、本開示のペプチドは、配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のうちのいずれか1つに対して99%、98%、97%、96、%、95%、90%、85%、または80%の相同性を有するペプチドをさらに含む。さらなる実施形態では、それらの機能性フラグメントは、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個、少なくとも20個、少なくとも21個、少なくとも22個、少なくとも23個、少なくとも24個、少なくとも25個、少なくとも26個、少なくとも27個、少なくとも28個、少なくとも29個、少なくとも30個、少なくとも31個、少なくとも32個、少なくとも33個、少なくとも34個、少なくとも35個、少なくとも36個、少なくとも37個、少なくとも38個、少なくとも39個、少なくとも40個、少なくとも41個、少なくとも42個、少なくとも43個、少なくとも44個、少なくとも45個、少なくとも46個の残基長である配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のうちのいずれか1つの連続したフラグメントを含んでよく、それらの機能性フラグメントはペプチドの任意の部分から選択することができる。いくつかの実施形態では、それらの機能性フラグメントは、フラグメントがホーミングする細胞と接触することができ、ペプチド及びペプチドI/O複合体について本明細書に記載されているものの特性を示すことができる。いくつかの実施形態では、本開示の任意のペプチドを、表2の細胞透過性ペプチド(CPP)、本明細書に開示される任意のCPP、またはCPP特性を有する任意の他の部分にさらに結合または融合させることができる。
場合によって、ペプチド内に1つ以上の変異を操作することにより、生理学的pHで等電点、電荷、表面電荷、またはレオロジーが変化したペプチドを得ることができる。サソリまたはクモ由来のペプチドへのそのような変異の操作は、例えば、正味電荷を1、2、3、4、または5だけ減少させることにより、または正味電荷を1、2、3、4、または5だけ増加させることにより、複合体の正味電荷を変化させることができる。そのような場合、操作された変異は、ペプチドが腫瘍に接触する能力を促進することができる。ペプチドのレオロジー及び効力を向上させるのに適したアミノ酸の改変は、保存的または非保存的変異を含むことができる。ペプチドは、最大1個のアミノ酸変異、最大2個のアミノ酸変異、最大3個のアミノ酸変異、最大4個のアミノ酸変異、最大5個のアミノ酸変異、最大6個のアミノ酸変異、最大7個のアミノ酸変異、最大8個のアミノ酸変異、最大9個のアミノ酸変異、最大10個のアミノ酸変異、またはペプチドが由来する毒成分ペプチドまたは毒素の配列と比較して別の適当な数の変異を有することができる。他の場合では、ペプチド、またはその機能性フラグメントは、少なくとも1個のアミノ酸変異、少なくとも2個のアミノ酸変異、少なくとも3個のアミノ酸変異、少なくとも4個のアミノ酸変異、少なくとも5個のアミノ酸変異、少なくとも6個のアミノ酸変異、少なくとも7個のアミノ酸変異、少なくとも8個のアミノ酸変異、少なくとも9個のアミノ酸変異、少なくとも10個のアミノ酸変異、またはペプチドが由来する毒成分ペプチドまたは毒素の配列と比較して別の適当な数の変異を有することができる。いくつかの実施形態では、変異をペプチド内で操作して、生理学的pHで所望の電荷または安定性を有するペプチドを提供することができる。
NMRソリューション構造、X線結晶分析、または関連する構造ホモログの結晶構造を用いて、ペプチドが腫瘍にホーミングする能力を維持ながら、ペプチドのフォールディング、安定性、及び製造性を改善することができる変異手法を提供することができる。これらを用いて、構造的に相同な一群の足場の3Dファーマコフォアを予測し、関連するタンパク質の可能なグラフト領域を予測することで特性が改善された特性を有するキメラを作製することができる。例えば、この手法を用いることで、改善された特性を有する薬剤を設計するために、また、ペプチドのフォールディング及び製造性を困難とする有害な変異を修正するために使用することができる重要なアミノ酸位置及びループを特定することができる。これらの重要なアミノ酸の位置及びループを維持しつつ、ペプチド配列中の他の残基を変異させて、ペプチドの機能、ホーミング、及び活性を改善、変更、除去、または他の形で改変することができる。
さらに、2個以上のペプチドの一次配列及び三次配列の比較を用いて、ペプチドを改善し、またこれらのペプチドの生物活性を解析するために活用できる配列及び3Dフォールディングパターンを明らかにすることができる。例えば、腫瘍にホーミングする2個の異なるペプチド足場(例えば、配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のいずれか1つのペプチド)同士の比較によって、フォールディング特性が改善された変異体を設計するといった、操作手法を導くことができる保存されたファーマコフォアを同定することができる。例えば、重要なファーマコフォアは、結合において重要となり得る芳香族残基または塩基性残基を含み得る。本発明のペプチドのいずれ(配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号番号1316のうちのいずれか1つのペプチド)も、ペプチド足場として用いることができる。
改善されたペプチドは、TEPITOPE及びTEPITOPEpanまたは他のインシリコの免疫原性予測方法によって予測される免疫原性情報などの免疫原性情報に基づいて操作することもできる。TEPITOPEは、位置固有のスコアリング行列を用いて、あるペプチドが51種類の異なるHLA-DRアレルに結合するかどうかについての予測ルールを提供する計算手法であり、TEPITOPEpanは、TEPITOPEを使用して、ポケットの類似性に基づいて既知の結合特異性を有するHLA-DR分子から未知の結合特異性を有するHLA-DR分子を外挿する方法である。例えば、TEPITOPE及びTEPITOPEpanを使用して、細胞透過特性、BBB通過特性、腫瘍へのホーミング特性、またはそれらの組み合わせを有するペプチドの免疫原性を決定することが可能である。免疫原性の高いペプチドと免疫原性の低いペプチドの比較は、免疫原性が低下した変異体を設計するための、または類似の細胞透過性、腫瘍ホーミング活性、BBB通過活性、またはそれらの組み合わせを有する一群のペプチドの中で、どのペプチドが最も低い免疫原性を誘発するかを特定するための操作手法を導くことができる。
本開示はまた、本明細書に記載されるさまざまなペプチドの多量体も包含することができる。多量体の例としては、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体などが挙げられる。多量体は、複数の同じサブユニットで形成されるホモマー、または複数の異なるサブユニットで形成されるヘテロマーであり得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、少なくとも1個の他のペプチド、または2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、またはそれ以上の他のペプチドとの多量体構造として構成される。特定の実施形態では、多量体構造の各ペプチドはそれぞれ同じ配列を有することができる。別の実施形態では、多量体構造の各ペプチドのうちの一部のものまたはすべてが異なる配列を有することができる。さらなる実施形態では、多量体構造は、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、または七量体を含むことができる。多量体は必要に応じて、多量体内の各ペプチド間にリンカー、例えば配列番号1163~配列番号1172を含むリンカーを有するペプチド配列の融合体を形成することにより、または多量体内の各ペプチドをポリマーまたはデンドリマーなどの基質と結合することにより、またはそれらの任意の組み合わせによって形成することができる。
本開示は、例えば、さらなるペプチドを生成するための開始点として使用できるペプチド足場として使用することが可能な、配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のうちのいずれか1つのペプチドをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、足場は、ノッティンまたはヒッチンなどの各種のシステイン高密度ペプチドから誘導することができる。足場として適当ないくつかのペプチドとしては、これらに限定されるものではないが、クロロトキシン、ブラゼイン、サーキュリン、ステクリスプ、ハナトキシン、ミドカイン、ヘフトキシン、ジャガイモカルボキシペプチダーゼ阻害剤、起泡性タンパク質、アトラクチン、α-GI、α-GID、μ-PIIIA、ω-MVIIA、ω-CVID、χ-MrIA、ρ-TIA、コナントキンG、コンツラキンG、GsMTx4、マーガトキシン、shK、毒素K、キモトリプシン阻害剤(CTI)、及びEGFエピレグリンコアが挙げられる。
さらに、配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のうちのいずれか1つを同様にさらなるペプチドを生成するための開始点または足場として使用することができる。いくつかの実施形態では、本開示のペプチド配列には、さらなるアミノ酸が隣接する。1つ以上のさらなるアミノ酸は、例えば、所望のインビボ電荷、等電点、化学結合部位、安定性、標識、または生理学的特性をペプチドに付与することができる。
配列相同性の特定は、腫瘍のホーミング機能を維持する重要な残基を決定するうえで重要となる場合がある。
2個以上のペプチドは、一定の相同性を共有し、インビボで似た特性を共有することができる。例えば、あるペプチドは、本開示のペプチドと一定の相同性を共有することができる。場合によっては、本開示のペプチドは、第2のペプチドと最大約20%のペアワイズ相同性、最大約25%のペアワイズ相同性、最大約30%のペアワイズ相同性、最大約35%のペアワイズ相同性、最大約40%のペアワイズ相同性、最大約45%のペアワイズ相同性、最大約50%のペアワイズ相同性、最大約55%のペアワイズ相同性、最大約60%のペアワイズ相同性、最大約65%のペアワイズ相同性、最大約70%のペアワイズ相同性、最大約75%のペアワイズ相同性、最大約80%のペアワイズ相同性、最大約85%のペアワイズ相同性、最大約90%のペアワイズ相同性、最大約95%のペアワイズ相同性、最大約96%のペアワイズ相同性、最大約97%のペアワイズ相同性、最大約98%のペアワイズ相同性、最大約99%のペアワイズ相同性、最大約99.5%のペアワイズ相同性、または最大約99.9%のペアワイズ相同性を有することができる。場合によっては、本開示のペプチドは、第2のペプチドと少なくとも約20%のペアワイズ相同性、少なくとも約25%のペアワイズ相同性、少なくとも約30%のペアワイズ相同性、少なくとも約35%のペアワイズ相同性、少なくとも約40%のペアワイズ相同性、少なくとも約45%のペアワイズ相同性、少なくとも約50%のペアワイズ相同性、少なくとも約55%のペアワイズ相同性、少なくとも約60%のペアワイズ相同性、少なくとも約65%のペアワイズ相同性、少なくとも約70%のペアワイズ相同性、少なくとも約75%のペアワイズ相同性、少なくとも約80%のペアワイズ相同性、少なくとも約85%のペアワイズ相同性、少なくとも約90%のペアワイズ相同性、少なくとも約95%のペアワイズ相同性、少なくとも約96%のペアワイズ相同性、少なくとも約97%のペアワイズ相同性、少なくとも約98%のペアワイズ相同性、少なくとも約99%のペアワイズ相同性、少なくとも約99.5%のペアワイズ相同性、少なくとも約99.9%のペアワイズ相同性を有することができる。NCBI BLAST、Clustal W、MAFFT、Clustal Omega、AlignMe、Praline、または別の適当な方法またはアルゴリズムなどのさまざまな方法及びソフトウェアプログラムを使用して2個以上のペプチド間の相同性を決定することができる。
さらに他の例では、配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のうちのいずれか1つのペプチドをコードし得る変異体核酸分子は、コードされたペプチドのアミノ酸配列と、配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のうちのいずれか1つのペプチドのアミノ酸配列との配列同一性または相同性を決定することによって、または核酸ハイブリダイゼーションアッセイによって同定することができる。かかるペプチド変異体としては、(1)洗浄のストリンジェンシーが、55~65℃で0.1%SDSを含む0.5×-2×SSCと同等であるストリンジェントな洗浄条件下で配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のうちのいずれか1つのペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子(または上記の配列の任意の相補体)とハイブリダイズした状態に維持され、かつ、(2)配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のうちのいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、もしくはそれ以上の配列同一性または相同性、または95%よりも高い配列同一性もしくは相同性を有するペプチドをコードする核酸分子によってコードされるものが挙げられる。あるいは、配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のうちのいずれか1つのペプチド変異体は、(1)洗浄ストリンジェンシーが50~65℃で0.1%SDSを含む0.1×-0.2×SSCと同等である高度にストリンジェントな洗浄条件下で配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のヌクレオチド配列を有する核酸分子(または上記の配列の任意の相補体)とハイブリダイズした状態に維持され、かつ、(2)配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のうちのいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、もしくはそれ以上の配列同一性もしくは相同性、または95%よりも高い配列同一性もしくは相同性を有するペプチドをコードする核酸分子によってコードされるものとして特徴付けることができる。
配列同一率(%)または配列相同率(%)は、従来の方法によって決定することができる。例えば、Altschul et al.,Bull.Math.Bio.48:603(1986),及びHenikoff and Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915(1992)を参照。簡単に述べると、2個のアミノ酸配列同士をアラインし、ギャップオープンペナルティ=10、ギャップ延長ペナルティ=1、及びHenikoff及びHenikoff(同上)の「BLOSUM62」スコアリング行列を使用して、アラインメントスコアが最適化される。次に、配列同一性または配列相同性を([同一の一致の総数]/[長い方の配列の長さ+2個の配列をアラインするために長い方の配列に導入されたギャップの数])(100)として計算する。
さらに、2個のアミノ酸配列同士をアラインするために利用できる確立された多くのアルゴリズムが存在する。例えば、Pearson及びLipmanの「FASTA」類似性検索アルゴリズムは、本明細書に開示されるペプチドのアミノ酸配列とペプチド変異体のアミノ酸配列とによって共有される配列同一性または相同性のレベルを調べるうえで適当なタンパク質アラインメント法である。FASTAアルゴリズムは、Pearson and Lipman,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 85:2444(1988),及びPearson,Meth.Enzymol.183:63(1990)に記載されている。簡単に述べると、FASTAは最初に、保存的アミノ酸置換、挿入、または欠失は考慮せずに、クエリ配列(例えば、配列番号1)と、最も高い密度の一致(ktup変数が1の場合)、または一致のペア(ktup=2の場合)を有する試験配列とによって共有される領域を同定することにより配列類似性を特徴付ける。次いで、一致の密度が最も高い10個の領域を、ペアリングされたすべてのアミノ酸の類似性をアミノ酸置換行列を用いて比較することによって再スコアリングし、最も高いスコアに寄与する残基のみが含まれるように各領域の端部を「トリミング」する。スコアが「カットオフ」値(配列の長さとktup値に基づいて所定の式によって計算される)よりも大きい複数の領域がある場合、トリミングされた最初の領域を調べて、各領域同士を連結してギャップを含むおおよそのアラインメントを形成することができるかどうかを判断する。最後に、アミノ酸を挿入及び欠失させることができるNeedleman-Wunsch-Sellersアルゴリズムの改変を用いて2個のアミノ酸配列の最も高いスコアの領域同士をアラインする(Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.48:444(1970);Sellers,Siam J.Appl.Math.26:787(1974))。FASTA分析の例示的なパラメータは、ktup=1、ギャップオープンペナルティ=10、ギャップ延長ペナルティ=1、及び置換行列=BLOSUM62である。これらのパラメータは、Pearson,Meth.Enzymol.183:63(1990)の補遺2に説明されるようにして、スコアリング行列ファイル(「SMATRIX」)を改変することによりFASTAプログラムに導入することができる。
FASTAはまた、上記に開示した比を用いて核酸分子同士の配列同一性または相同性を決定するためにも使用することができる。ヌクレオチド配列を比較する場合、ktup値は1~6の範囲、好ましくは3~6の範囲であってよく、最も好ましくは3であり、他のパラメータは上記のように設定する。
「保存的アミノ酸置換」である一般的なアミノ酸のいくつかの例は、以下の各群、すなわち、(1)グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシン、(2)フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン、(3)セリン及びスレオニン、(4)アスパラギン酸及びグルタミン酸、(5)グルタミン及びアスパラギン、ならびに(6)リシン、アルギニン、及びヒスチジンのアミノ酸間の置換によって例示される。BLOSUM62テーブルは、タンパク質配列セグメントのおよそ2,000の局所的な多数のアラインメントから導出された、500以上の関連タンパク質群の高度に保存された領域を表すアミノ酸置換行列である(Henikoff and Henikoff,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 89:10915(1992))。したがって、BLOSUM62の置換頻度を用いて、本発明のアミノ酸配列に導入することが可能な保存的アミノ酸置換を定義することができる。(上述のように)化学的性質のみに基づいてアミノ酸置換を設計することは可能であるが、「保存的アミノ酸置換」という用語は、好ましくは、-1よりも大きいBLOSUM62値によって表される置換を指す。例えば、アミノ酸置換は、置換が0、1、2、または3のBLOSUM62値によって特徴付けられる場合に保存的である。このシステムによれば、好ましい保存的アミノ酸置換は、少なくとも1(例えば、1、2または3)のBLOSUM62値によって特徴付けられ、より好ましい保存的アミノ酸置換は、少なくとも2(例えば、2または3)のBLOSUM62値によって特徴付けられる。
構造的完全性を維持するうえで重要な領域またはドメイン内にあるアミノ酸残基を決定することができる。これらの領域内で、変化に対するある程度の耐性があり、分子の全体的な三次構造を維持することができる特定の残基を決定することができる。配列構造を分析する方法としては、これらに限定されるものではないが、アミノ酸またはヌクレオチドの同一性または相同性が高い複数の配列のアラインメント、及び利用可能なソフトウェア(Insight II.RTMビューア及び相同性モデリングツール、MSI,San Diego,Calif.)を用いたコンピュータ分析、二次構造の傾向、バイナリパターン、相補的充填及び埋没極性相互作用が挙げられる(Barton,G.J., Current Opin.Struct.Biol. 5:372-6 (1995)及びCordes, M.H. et al., Current Opin.Struct.Biol. 6:3-10 (1996))。一般に、分子に対する改変を設計する場合、または特定のフラグメントを識別する場合には、構造の決定は、通常、改変された分子の活性を評価することにより行うことができる。
ペアワイズ配列アラインメントを用いることで、2個の生物学的配列(タンパク質または核酸)間の機能的、構造的及び/または進化的関係を示すことができる類似領域を特定することができる。対照的に、複数配列アライメント(MSA)は、3つ以上の生物学的配列のアライメントである。MSAアプリケーションの出力から相同性を推定し、配列間の進化的関係を評価することができる。当業者は、本明細書中で使用される場合、「配列相同性」及び「配列同一性」ならびに「配列同一率(%)」及び「配列相同率(%)」は、必要に応じて参照ポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列に対する配列の関連性または変動を意味するために互換的に使用されている点は認識されるであろう。
同様に、ペプチドI/O複合体は、任意のポリヌクレオチド長、化学的性質、または構造のポリヌクレオチド(例えば、天然または非天然のDNAもしくはRNA、一本鎖、二本鎖、三本鎖以上、一次、二次、または三次ポリヌクレオチド構造、またはそれらの任意の組み合わせ)に適用される、本開示のペプチドについて上記に記載したものと同じ方法によって改変することができる。
配列番号1、または配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、もしくは配列番号1263~配列番号1316のうちのいずれか1つなどの本開示のいずれのペプチドまたはペプチドI/O複合体も、腫瘍細胞によって内在化され得るものであり、したがって、細胞透過性である。配列番号1、または配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、もしくは配列番号1263~配列番号1316のうちのいずれか1つなどの本開示のいずれのペプチドまたはペプチドI/O複合体も、クラスリン依存的に、または別の機構によってエンドソーム区画内に内在化され得る。エンドソーム輸送経路及び本開示のペプチドまたはペプチドI/O複合体によってアクセスされ得るエンドソーム輸送経路については、Hu et al.(Transl Neurodegener.2015 Sep 30;4:18)及びJuliano et al.(Nucleic Acids Res.2016 Aug 19;44(14):6518-48)で考察されている。内在化に続き、初期エンドソーム内へと、異なる積荷は異なる運命を辿る。すなわち、積荷は、リソソームにエスコートされて分解されるか、例えばFcRnの場合のように細胞膜または外部にリサイクルされるか、または選択されたタンパク質がレトロマー複合体によって選別されてトランスゴルジネットワークに運ばれて回収され得る。多小胞体及び後期エンドソームを含むリソソームへとつながる小胞は徐々に酸性になり、小胞がリソソームに移動すると受容体-リガンド複合体の解離が生じる。小胞がエンドソームからリソソームに移動するにしたがって、酵素の含有量も変化する。解離した受容体は、レトロマー複合体及びRab7を介して再びゴルジ体にリサイクルされ得る(Purushothaman 2018)。初期エンドソームは、タンパク質を細胞表面に直接リサイクルすることができる。ペプチドはまた、「逆行性輸送」として知られる経路を辿って核周囲ゴルジまたはトランスゴルジネットワーク(TGN)に輸送され得る。エンドソーム輸送経路は、細胞表面または細胞外空間へのタンパク質のリサイクル、またはサイトゾルへのペプチドまたは解離したリガンドの進入を生じることができる。エンドソームはまた、リソソーム内へと酸性化することができ、それにより、ペプチドは細胞によって分解され得る。エンドソームの酸性化は、ペプチドと免疫抗がん剤(I/O)とを接続する酸不安定リンカーなどの酸不安定リンカーが切断され得る環境を形成することができる。エンドソーム-リソソーム経路は、pHの段階的な低下とさまざまなプロテアーゼのレベルの増加を伴い、pH感受性の切断、プロテアーゼによる切断、または他の機構による不安定な結合の切断を可能にする。本開示のペプチド及びペプチドI/O複合体はまた、カベオラ、ピノサイトーシス、直接透過、エネルギー依存性または非依存性の機構などの他の機構、他の移行機構、またはそれらの任意の組み合わせによって細胞質に入ることもできる。さらに、ペプチドI/O複合体は、必要に応じて、細胞表面に提示される(エンドソーム、TGN、またはリソソーム経路を介して)ことによって細胞表面における生理学的I/O応答を活性化するか、または腫瘍微小環境中に再び分泌されるか(例えば、本開示のIL-15剤または本開示の4-1BBリガンドをI/Oとして含むペプチドI/O複合体によって)、または細胞質内などの内部に分泌される(例えば、本開示のRIG-IリガンドI/Oまたは本開示のSTINGリガンドI/Oを含むペプチドI/O複合体により)ように設計することができる。さらに、ペプチドI/O複合体は、細胞内で活性化及び分解されることで例えばがん治療における細胞内の作用部位にI/Oをターゲティングするように設計することができる。このように、本開示のペプチドI/O複合体は、I/Oを、固体または液体腫瘍に、腫瘍微小環境に、腫瘍組織、細胞、細胞区画、サイトゾルに、腫瘍細胞内部に、腫瘍細胞内の特定の区画もしくは場所に、またはそれらの任意の組み合わせに送達するように効果的にターゲティングされることで、I/Oを場合によりエンドソーム、TGN、及び/またはリソソーム経路を介して作用部位に送達することができる。
異なるI/O剤を異なる細胞内区画に送達することができるが、これは異なる細胞透過特性によるものと考えられる。望ましいターゲティングは、RIG-IもしくはSTINGリガンドの細胞質への送達、IL-15剤の細胞表面への提示もしくは細胞外腫瘍微小環境への分泌、または4-1BBリガンドの細胞表面への提示もしくは分泌を含むI/Oの細胞内送達を含み得る。これら及び他のI/O剤は、本明細書に記載されるペプチドを介して、腫瘍細胞のエンドソームネットワークに送達され得る。ペプチドI/O複合体は、エンドソームネットワーク内部に入ると、分子設計に基づいてその最終目的地に誘導され得る。いくつかの例では、I/OがRIG-1リガンドを含むペプチドI/O複合体は、ペプチドが依然RIG-1リガンドと複合体を形成していて、プロセシングを受けていない状態で完全に活性であり得る。これらのコンストラクトはエンドソームから細胞質へと脱出することができ、これには、本明細書に記載されるペプチドの存在が助けとなり得る。必要に応じて、本明細書に記載されるペプチドI/O複合体のペプチドは、酵素によって、またはエンドソーム、リソソーム内で、もしくは細胞質への送達後に化学的に、除去、分解、または解離するようにプロセシングされ得る。細胞質への送達の効率を高めるため、細胞透過性ペプチドまたはペプチドのアミノ酸配列の改変、疎水性リンカーの使用、またはペプチドI/O複合体の配合などの改変を必要に応じてペプチドI/O複合体に加えることができる。ペプチド-IL-15剤複合体が免疫系に対してシグナル伝達を行うためには、IL-15剤は、場合により細胞表面に分泌または提示されることにより、細胞外の腫瘍微小環境に提示され得る。さらに、IL-15剤は体循環中で毒性を示す場合がある。I/OがIL-15剤を含むペプチドI/O複合体(ペプチド-IL-15剤複合体)の設計は、プロセシングが(腫瘍細胞内または腫瘍微小環境内などで)行われてIL-15剤活性の活性化が生じるまでの間、IL-15剤の活性を阻害するペプチドI/O複合体内の位置にペプチドを配置することを含み得る。このように、ペプチド-IL-15剤複合体は、IL-15剤プロドラッグとして機能することができる。エンドソームにおけるプロセシングの間のカテプシンBなどの酵素によるプロセシング、または細胞外カテプシンまたは細胞表面もしくは腫瘍微小環境に存在する他の酵素によるプロセシングによって、ペプチド-IL-15剤複合体のペプチド部分が放出され、残りのIL-15剤コンストラクトの効力を高めることができる。そのため、全身または他の臓器でIL-15剤の作用への曝露を減少させる一方で、腫瘍微小環境でのIL-15剤の作用への曝露をより高くすることができ、これにより、IL-15剤の効果を腫瘍にターゲティングして、他の部位では毒性を低減することができる。カテプシンBによるプロセシングは、カテプシンBが初期エンドソームを含むエンドソームシステム全体に存在し、タンパク質がリソソームなどの酸性区画内に移動する必要なくプロセシングが可能であることから選択することができる。(Blum 1991,Lautwein 2004,Guha 2008,Diederich 2012)。本明細書に記載されるペプチドの特性は、必要に応じてペプチドを解離させるプロテアーゼ切断部位または他の切断部位と組み合わされて、細胞内選別経路を決定することができる。カテプシンBは、多くのがんの細胞表面または細胞周囲空間にもみられる(Fonovic and Turk,Biochim Biophys Acta 1840:2560-2570(2014))。したがって、ペプチドI/O複合体プロドラッグの切断を、内在化の前、または内在化及び分泌の後で行うことができる。これらの場合、ペプチドI/O複合体はプロドラッグを腫瘍にターゲティングし、そこで細胞周囲空間内のプロセシングを受け、腫瘍微小環境中で治療レベルのI/O(例えば、IL-15剤)を生じる。エンドソーム/リソソーム経路に存在する、または腫瘍の微小環境もしくは細胞周囲空間に存在する他の酵素も、プロドラッグのプロセシング機構に対してターゲティングされ得る。これらの酵素としては、これらに限定されるものではないが、β-グルクロニダーゼ、ヒアルロニダーゼ、及びMMP-1、2、7、9、13、または14のようなマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)などのグルクロニダーゼが挙げられる。
本開示のペプチドはまた、20種の標準アミノ酸の一部ではない任意のアミノ酸などの非天然、非共通、または修飾アミノ酸も含むことができる。非天然アミノ酸は、化学的結合のための、または結合相互作用、安定性、もしくはコンフォメーションといったタンパク質の生物物理学的または生化学的特性を改変するための固有の官能基を有することができる。非天然アミノ酸は、組み換えにより、または合成により組み込むことができ、または酵素的に導入することもできる。非天然アミノ酸は、これらに限定されるものではないが、アジドホモアラニン、ホモプロパルギルグリシン、p-アセチル-フェニルアラニン、またはフルオロアラニンを含むことができ、これらに限定されるものではないが、アジド、アルキン、ケトン、もしくはアルデヒド官能基、またはそれらの任意の組み合わせを有することができる。非共通アミノ酸は、これらに限定されるものではないが、アミノ酸前駆体もしくは中間体、シトルリン(Cit;しばしばXで示される)、セレノシステイン(U;Sec)及びピロリシン(O;Pyl)、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。
本開示のペプチドは、ペプチドのないI/Oと比較してより効果的に免疫抗がん剤(I/O)を、腫瘍微小環境に、腫瘍組織、細胞、細胞区画、サイトゾルに、腫瘍細胞内部または腫瘍細胞内の特定の区画もしくは場所に、及び/または血液脳関門(BBB)を通過してターゲティングすることができる。本開示のペプチドはまた、腫瘍細胞によるより高量の、より一貫した取り込みも示し、それにより、複合体化I/Oのより高い細胞内送達をもたらすことができる。さらに、本開示のペプチドは、オフターゲットの蓄積を減少させることができる。本開示のペプチドI/O複合体は、腫瘍細胞または腫瘍微小環境中でプロセシングまたは修飾されるまで、より低い効力を有することもできる。これらの効果のいずれかの結果として、本開示のペプチドI/O複合体の投与は、遊離I/Oと比較してオフターゲットの正常組織における毒性を低減することができる。
本開示のペプチドは、I/Oを含み得る脂質ナノ粒子の表面に結合させることができる。その後、脂質ナノ粒子を腫瘍細胞に誘導することができ、そこでナノ粒子は内在化されてI/Oを直接細胞質に送達することができる。さらに、本開示のペプチドI/O複合体は、ペプチドのないI/Oよりもより効率的に細胞質または細胞内区画内にI/Oを送達することができ、治療効果を有するのに充分なレベルのI/Oを腫瘍に送達することができる。
さらに、本開示のペプチドまたはペプチドI/O複合体は、細胞透過、サイトゾル送達、エンドソーム取り込み、またはエンドソーム脱出、及び細胞質または他の細胞内区画へのI/Oの送達をさらに向上させるように改変することができる。I/Oの細胞質への送達は、RIG-I経路の活性化など、所望の経路を活性化するうえで必要とされる場合がある。例えば、細胞透過性を高めることができるペプチドを、ペプチドまたはペプチドI/O複合体に融合または結合することで細胞透過性を高めることができる。そのような細胞透過性ペプチドは、ペプチドI/O複合体のペプチドとI/O剤との間のリンカー内に配置するか、またはペプチドI/O複合体のI/O剤またはペプチドのいずれかまたは両方に配置することができ、必要に応じてそれらの間にリンカーが配置される。1個、または複数個、または場合により1~10個のそのような細胞透過性ペプチドをペプチドI/O複合体に付加することができる。細胞透過性を向上させる例示的なペプチドとしては、これらに限定されるものではないが、Tat(GRKKRRQRRRPPQ、配列番号1207)、Rxで示されるオリゴ-Arg(R、ただし=6~12(配列番号1382)、またはx=3~20(配列番号1495)、またはそれよりも多いR(Arg)残基)、ペネトラチン(RQIKIWFQNRRMKWKK、配列番号1208)、pVEC(LLIILRRRIRKQAHAHSK、配列番号1209)、トランスポータン(GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL、配列番号1210)、MPG(GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV、配列番号1211)、Pep-1(KETWWETWWTEWSQPKKKRKV、配列番号1212)、MAP(KLALKLALKALKAALKLA、配列番号1213)、及びR6W3(RRWWRRWRR、配列番号1214)、Oct4(DVVRVWFCNRRQKGKR、配列番号1215)、WT1-pTj(KDCERRFSRSDQLKRHQRRHTGVKPFQ、配列番号1216)、DPV3(RKKRRRESRKKRRRES、配列番号1217)、VP22(DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE:配列番号1218)、KW(KRKRWHW、配列番号1219)、KFGF(AAVLLPVLLAAP、配列番号1220)、FGF12(PIEVCMYREP、配列番号1221)、インテグリンβ3ペプチド(VTVLALGALAGVGVG、配列番号1222)、C105Y(PFVYLI、配列番号1223)、及びTP2(PLIYLRLLRGQF、配列番号1224)、ならびにRaucher et al.(Trends Mol Med.2015 Sep;21(9):560-70)、Ramsey et al.(Pharmacol Ther.2015 Oct;154:78-86)、Bechara et al.(FEBS Lett.2013 Jun 19;587(12):1693-702)に記載されるその他のペプチドが挙げられる。他の例示的な細胞透過性ペプチドとしては、インペラトキシンA、マウロカルシン、MCoTI-II、EETI-II、kalataB1、SFTI-1、及びCyLoP-1などのシステイン高密度ペプチドも挙げられる。
多くの細胞透過性ペプチド(CPP)が、本明細書に開示されるペプチドI/O複合体の細胞取り入れ/取り込み、または細胞膜を通過したペプチドI/O複合体の移動、またはサイトゾルもしくは細胞内区画へのペプチドI/O複合体の送達を促進する送達ビヒクルとして機能することができる。膜を通過して積荷を送達することができるカチオン性または両親媒性配列を有するアミノ酸8~30個の長さの特定のCPPが記載されている。かかる積荷としては、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、及びさまざまな小分子が挙げられる。通常、これらのCPPは、CPP-積荷のエンドソーム区画への進入を促進し、積荷はエンドソーム区画に蓄積するかそこでプロセシングされる。エンドソーム膜を通過して細胞質または核に積荷を効率的に送達するには、場合によってはさらなる改変が必要とされる。1つの例は、HIV TATに由来するものである(Sawant 2010,Rizzuti 2015)。TATペプチドは、エンドソームへの局在化は効率的に行えるが、細胞質送達にはそれほど効率的ではない。このTATペプチドの二量体化は、細胞質への透過を促進する(Monreal 2015,Kim 2018,Erazo-Oliveras 2014)。
本明細書に記載されるペプチドI/O複合体の送達に使用することができるCPPとしては、アルギニンリッチ配列TATp 48-60:GRKKRRQRRRPPQ(配列番号1207)及び最もよく知られているTATペプチドであるCPP:YGRKKRRQRRR(配列番号1395)、及びCGYGRKKRRQRRRGC(配列番号1492)(TAT)、GVFVLGFLGFLA(HIV bp160エンベロープタンパク質の膜融合ペプチド;配列番号1384)、RRRRRRRR(R8;配列番号1385)などのエンドサイトーシス及びエンドソーム放出を高めるカチオン性Argリッチ及び疎水性ペプチド、DSHAKRHHGYKRKFHEKHHSHRGY(ヒスタチン5及び誘導体ペプチド;den Hertog 2004;配列番号1386)、KRLFKKLLFSLRKY(dhvar4;配列番号1387)、CIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ(メリチン;配列番号1388)、CLIKKALAALAKLNIKLLYGASNLTWG(トランスポータン;配列番号1389)、YKQSHKKGGKKGSG(NrTP6-C核小体ターゲティングペプチド;Rodrigues 2011;配列番号1390)、(VRLPPP)3(トウモロコシγ-ゼイン由来のプロリンリッチペプチド;Fernundez-Carneado 2004;配列番号1391)、VSRRRRRRGGRRRR(低分子量プロタミン;配列番号1392)、EARPALLTSRLRFIPK(GV1001は、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)タンパク質の残基611~626に相当するペプチドである。配列番号1393)、KALLAL(Grijalvo 2018;配列番号1394)、以下の表2に記載されるCPP(Peraro 2018より)YGRKKRRQRRR(TAT;配列番号1395)、RRRRRRRRR(R9;配列番号1396)、AGYLLGKINLKALAALAKKIL(TP10;配列番号1397)、LSTAADMQGVVTDGMASGLDKDYLKPDD(P28;配列番号:1398)、CSIPPEVKFNKPFVYLI(C105Y;配列番号1399)、及びSDLWEMMMVSLACQY(Pep-7;配列番号1400)が挙げられる。
本開示と適合する他のTATペプチドとしては、GRKKRRQRRRPQ(配列番号1487)、GRKKRRQRRRP(配列番号1488)、GRKKRRQRRRG(配列番号1489)、CGYGRKKRRQRRRGC(配列番号1492)、RKKRRQRRR(配列番号1490)、及び他の配列が挙げられる。多くの細胞透過性ペプチド配列がCPPsite2.0(http://crdd.osdd.net/raghava/cppsite/index.html)に記載されているが、主な配列を以下に記載する。
本開示のCPPはまた、本明細書にその全容を援用するところのVarkouhi(2011)に概説されるような他の細胞透過性化合物も含み得る。本開示のCPPは、Agrawal(2016)により記載されたCPPsite2.0データベース(http://crdd.osdd.net/raghava/cppsite/)において言及されるものも含むことができ、これらをいずれも本明細書にその全容にわたって援用するものである。
本開示のペプチドI/O複合体と組み合わされた上記のペプチドのいずれも、膜を通過した細胞質への積荷の送達を高めることができる。ペプチドI/O複合体の送達におけるCPPの使用は、RIG-I、MDA5、及びSTINGなどの細胞内標的を有するI/O剤において望ましいと考えられる。
本開示のペプチドI/O複合体と組み合わせて使用することができる細胞透過性ペプチドの概要を下記表2に示す。
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ウイルスベクターは、核酸分子を標的細胞の細胞質及び核に送達するための効率的な方法である。ウイルスベクターの使用とは対照的な遺伝子送達を促進するための新しい戦略の開発では、配合及び共有結合に基づくアプローチの両方を採用することができる。ウイルスのエンベロープタンパク質は、エンドソーム膜との融合を誘導することが可能であり、ウイルス核酸を挿入するための孔形成を可能にすることができる。これらのタンパク質は、膜融合を担う重要なペプチド配列を有している。1つは、HIV及びSIV gp160膜貫通エンベロープタンパク質のN末端にある疎水性の膜融合ヘリックスペプチドであるpH依存性融合ペプチド(GVFVLGFLGFLA;配列番号1384)であり、脂質層を局所的に破壊することが見出されており、これは融合プロセスにおいて必要なステップである(Horth 1991)。他のエンベロープウイルスも、酸性化されたエンドソームから細胞質に侵入するためにpH依存性融合ペプチドを利用している。これらのペプチドには、インフルエンザウイルス及びその融合ペプチドであるヘマグルチニンA、パラミクソウイルスFのFペプチド、SARSスパイク糖タンパク質S、パピローマウイルスのマイナーカプシドタンパク質L2(Kamper 2006)、及びエボラGP2(Lamb 2007)が含まれる。これらのウイルスは、ウイルスの遺伝物質を細胞内に輸送するためにさまざまな戦略を用いているが、これらはいずれもエンドソーム膜の挿入と破壊を必要とする。本開示のペプチドI/O複合体と組み合わされたこのような膜破壊ウイルスペプチドは、膜を通過した細胞質への積荷の送達を高めることができる。
ペプチドI/O複合体の送達におけるウイルスタンパク質の使用は、RIG-I、MDA5、STINGなどの細胞内標的を有するI/O剤を送達するうえで望ましいと考えられる。ペプチドI/O複合体を送達するためのウイルスタンパク質には、ヒト唾液抗菌ペプチドであるヒスタチン5ペプチド及びその誘導体ペプチドdhvar5、LLLFLLKKRKKRKY(dhvar5;配列番号1401)であるヒスタチン5ペプチドに類似性を示すHPVのL2カプシドペプチドが含まれ得る。HPV L2カプシドペプチドとしては(Kamper 2006)、SYFILRRRRKRFPY(HPV3 3L2;配列番号1402)、SYYMLRKRRKRLPY(HPV1 6L2;配列番号1403)、LYYFIRKKRKRVPY(hpv1 8L2;配列番号1404)が挙げられる。
パラミクソウイルス科の代表的なメンバーのFタンパク質から得られる融合ペプチドのアミノ酸配列の比較(Russell 2004)により、以下の配列を有するペプチドI/O複合体を送達するためのウイルスタンパク質が明らかとなっている。すなわち、
FAGVVIGLAALGVATAAQVTAAVALV(SV5;配列番号1405)、
FIGAIIGSVALGVATAAQITAASALI(NDV;配列番号1406)、
FFGGVIGTIALGVATSAQIYAAVALV(HPIV3;配列番号1407)、
FAGVVLAGAALGVATAAQITAGIALH(麻疹;配列番号1408)、及び
LAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALY(ニパ;配列番号1409)。
ペプチドI/O複合体を送達するためのウイルスタンパク質として、SARS Sタンパク質を含めることができるが、これは、SFIEDLLFNKVTLADAGFMKQY(FP1;配列番号1410)及びKQYGECLGDINARDLICAQKF(FP2;配列番号1411)を含む、協調して作用する2つの融合ペプチドF1とF2を有するものである(Lai 2017)。
ペプチドI/O複合体を送達するためのウイルスタンパク質には、インフルエンザウイルスX-31(H3N2)のヘマグルチニンサブユニットHA-2のアミノ末端配列であるInf HA-2を含めることができる。COOH末端のシステイン残基間のジスルフィド結合の形成によりCOOH末端において二量体化されたInf HA-2の対応する二量体類似体ペプチドdiINF-7も、I/O剤の細胞質への送達に使用される。これらのペプチドは、(Mastrobattista 2002)に記載されるような以下の配列を有する。すなわち、
GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYG(Inf HA2;配列番号1412)、
GLFEAIEGFIENGWEGMIDGWYGC(diINF-7;配列番号1413)。
上記のペプチドのいずれも(例えば、配列番号1401~配列番号1414のうちのいずれか1つ)、標的への細胞質送達を助けるために、ペプチドI/O複合体に必要に応じて付加することができる。
本開示のペプチド、例えば、配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のいずれか1つもまた、エンドソームの膜融合及び透過性をさらに高めるために改変することができる。1つの関連する例として、細胞質への透過のためのモノクローナル抗体(mAb)の改変があり、mAbによる低効率レベルの透過の観察が、mAbのトリプトファン、リシン、及びヒスチジンによる部位特異的改変によって増加し、mAbの細胞質への透過が改善された(Kim 2016)。本開示のペプチドも、初期エンドソームにおけるその放出性を高めるため、または膜孔形成性を高めるため、または細胞質透過性を高めるために、主要な位置でTrp、Lys、及びHis残基により同様に改変することができる。
エンドソームエスケープドメイン(EED)を使用して、本開示のI/O剤またはペプチドI/O複合体の細胞質への送達性を高めることもできる。エンドソームエスケープドメイン(EED)は、エンドソームからのウイルスの脱出に必要とされる短い疎水性アミノ酸配列で構成され得る。エンドソーム脱出を最適化するためにさまざまなEEDが設計されており、CPP(例えば、TAT)にポリエチレングリコール(PEG)単位を少なくとも6個、12個、及び18個の固定距離で結合されている。疎水性EEDを含む試験されたペプチドには、-GFFG(配列番号1415)、-GWG(配列番号1416)、-GFWG(配列番号1417)、-GFWFG(配列番号1418)、-GWWG(配列番号1419)、-GWGGWG(配列番号1420)、及び-GWWWG(配列番号1421)が含まれる。最適なエンドソーム脱出のためには、ペプチドは、少なくとも1個の芳香族インドール環及び場合により2個(例:GWWG;配列番号1419)または少なくとも1個のインドール環と少なくとも1個及び場合により2個の芳香族フェニル基(例:GFWFG;配列番号1418)を少なくともPEG単位6個の距離で有するアミノ酸を含むことができる。例えば、1つのグループは、2個の芳香族インドール環(GWWG;配列番号1419)または1個のインドール環と少なくとも2個の芳香族フェニル基(GFWFG;配列番号1418)をPEG単位6個の固定距離で有するアミノ酸を含むペプチドのエンドソーム脱出を示した(Lonn,P.et al.2016 Sci.Rep.6,32301)。
カテプシンDの切断可能なGKPILFF(配列番号1423)配列に由来する合成ペプチドFFLIPKG(配列番号1422)などの透過促進配列(PAS)も、本開示のペプチドI/O複合体と組み合わせてカチオン性CPPの細胞質進入を高めるために使用することができる(Takayama,K. et al.2012 Mol.Pharm.9,1222-1230)。
さらに、細胞透過性に関連する要素を、例えば、本開示のペプチドのループ領域内でアミノ酸を付加または改変することなどにより本開示のペプチドにグラフトすることで、細胞透過性を高めることができる。細胞透過に関連するこれらの要素には、上記の細胞透過性ペプチドの細胞透過に関連する任意の要素を含むことができる。さらに、細胞透過性を高める小分子、ポリマー、脂質などを含む非ペプチド分子を、本開示のペプチドI/O複合体と組み合わせることができる。また、グラフト化及び融合アプローチに加えて、上記または他のものなどの細胞透過性に関連する要素を、配合物中で、及び/または非共有結合による組み合わせによって組み合わせることができる。
細胞質に積荷を送達させるウイルス融合ペプチドを模倣した合成ポリマーなどのペプチド以外のポリマーも開発されている。(Bulmus 2006,Convertine 2009)。そのようなポリマーは、エンドソーム膜を破壊し、細胞質及び核へのオリゴヌクレオチド(RIG-Iリガンドなど)の送達を促進するように設計されている。そのようなポリマーの最も標準的な例としては、ポリエチレンイミンがある。このカチオン性ポリマー及び他のカチオン性ポリマーは、積荷核酸と複合体を形成してナノ粒子を形成する。しかしながら、これはエンドソーム放出を可能にする遊離ポリマーであってもよい(Chen 2018)。多くのポリマーは、エンドソーム放出を促進するためのpH応答性基としてアミド基を使用している。酸性で赤血球を溶解するが中性pHでは溶解しないウイルス融合ペプチドを模倣した合成ポリマーが開発されている(Bulmus 2006、Convertine 2009)。上記のポリマーのいずれかを、細胞質送達性を高めるために本開示のペプチドI/O複合体との複合体、結合体、または配合物として使用することができる。
さらに、疎水性ドメインを本開示のペプチドI/Oに付加することによりエンドソーム脱出、エンドソーム取り込み、及び/または細胞質送達性を高めることができる。高分子複合体の細胞質への取り込みと送達を改善するため、疎水性ドメインを含めてCPPに付加することでエンドソーム放出を高めることが行われている。例えば、CPP TP-10のN末端のステアリル化は、エンドソーム脱出と負に帯電したオリゴヌクレオチドの細胞質への送達を促進する(Mae,M.et al.2009 J. Control.Release,143,221-227.)。疎水性ドメインの付加は、細胞取り込み、膜透過化、エンドソーム放出、及び細胞質への送達を促進することもできる(de Paula,Bentley, and Mahata.RNA,13:431-456(2007))。有用な疎水性ドメインとしては、脂質、脂肪酸、コレステロール、リトコール酸、ラウリン酸、ドコサヘキサエン酸、ドコサン酸、(CH2)x(x=1~40)が挙げられる。疎水性ドメインはリンカー内にあってもよく、リンカーもしくはペプチドもしくはI/O剤の側部に付加してもよく、または分子のいずれかの端部に付加してもよい。細胞透過、エンドソーム脱出、エンドソーム取り込み、または細胞質送達を支援するために、さまざまな長さの複数の疎水性ドメインを付加することができる。疎水性ドメインは、直鎖、環状ドメイン(芳香族または非芳香族)、及び場合により1個または複数の二重結合または三重結合を含むことができる。同様に、そのような疎水性ドメインを使用して、本開示のペプチドI/O複合体の細胞取り込み、膜透過化、エンドソーム放出、及び細胞質への送達を促進することができる。
化学修飾
本開示のペプチドを化学的に修飾することができる。いくつかの実施形態では、機能を付加する、機能を欠失させる、またはペプチドのインビボ挙動を改変するようにペプチドを変異させることができる。ジスルフィド結合間の1個以上のループを他のペプチドからの活性要素を含むように修飾または置換することができる(Moore and Cochran,Methods in Enzymology,503,p.223-251,2012に記載されるものなど)。アミノ酸は、半減期またはバイオアベイラビリティーを増大させ、インビボでの結合挙動を改変、付加または欠失させ、新たなターゲティング機能を付加し、表面電荷及び疎水性を改変し、及び/または結合部位を与えるといった目的で変異させることもできる。N-メチル化は、本開示のペプチドで生じ得るメチル化の一例である。いくつかの実施形態では、ペプチドは、遊離アミンのメチル化によって修飾することができる。例えば、完全メチル化は、ホルムアルデヒド及びシアノ水素化ホウ素ナトリウムを用いた還元的メチル化を使用することによって行うことができる。本開示のペプチドのN末端は、結合時のN末端のアミンとの反応をブロックするために、アセチル化またはメチル化などによってブロックすることができる。
化学修飾は、例えば、ペプチドの終末相半減期、吸収相半減期、分布相半減期を延長するか、またはペプチドの生体内分布または薬物動態プロファイルを変化させることができる。化学修飾は、ポリマー、ポリエーテル、ポリエチレングリコール、生体高分子、ポリアミノ酸、脂肪酸、デンドリマー、Fc領域、パルミチン酸やミリストレイン酸などの単純な飽和炭素鎖、糖、ヒアルロン酸、またはアルブミンを含むことができる。Fc領域によるペプチドの化学修飾は、Fc-ペプチド融合体であり得る。ポリアミノ酸は、例えば、単一のアミノ酸が繰り返されるポリアミノ酸配列(例えば、ポリグリシン)、一定のパターンに従うかまたは従わない場合がある、混在するポリアミノ酸配列を有するポリアミノ酸配列(例えば、gly-ala-gly-ala(配列番号1496))、または上記の任意の組み合わせを含むことができる。
いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、例えば、ペプチドの特性を改変または変化させることができる別の部分に結合(例えば、コンジュゲート)することができる。特定の実施形態では、本明細書に記載のペプチドは、がんに対する治療効果を与えるI/Oなどの別の分子に結合することができる。特定の実施形態では、本明細書に記載のペプチドは、これらに限定されるものではないが、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ポリリボヌクレオチド、DNA、cDNA、ssDNA、RNA、dsRNA、ヘアピンRNA、マイクロRNA、オリゴヌクレオチド、抗体、抗体フラグメント、一本鎖Fv、アプタマー、サイトカイン、酵素、成長因子、ケモカイン、神経伝達物質、化学薬品、フルオロフォア、金属、金属キレート、X線造影剤、PET剤、放射性同位体、光増感剤、放射線増感剤、放射性核種キレート剤、治療用小分子、ステロイド、コルチコステロイド、抗炎症剤、免疫調節剤、プロテアーゼ阻害剤、アミノ糖、化学療法剤、細胞毒性化学物質、毒素、チロシンキナーゼ阻害剤、抗感染剤、抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌剤、アミノグリコシド、ケトロラックまたはイブプロフェンなどの非ステロイド系抗炎症薬(NSAID)、スタチン、ナノ粒子、リポソーム、ポリマー、生体高分子、多糖類、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、デンドリマー、脂肪酸、またはFc領域、またはそれらの活性フラグメントもしくは修飾体を含み得る活性剤と結合することができる。いくつかの実施形態では、ペプチドは、例えば、直接またはリンカーを介して、またはリポソーム内などの製剤によって、I/Oまたは活性剤に共有結合または非共有結合によって結合される。いくつかの実施形態では、ペプチドは、I/O、例えば、サイトカインとの融合タンパク質として発現させることができる。
いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、修飾がペプチドの安定性及び/または半減期を増加させるように修飾することができる。いくつかの実施形態では、N末端、C末端、または内部アミノ酸などへの疎水性部分の結合を利用して、本開示のペプチドの半減期を延ばすことができる。他の実施形態では、本開示のペプチドは、例えば、血清中半減期に影響を及ぼし得る翻訳後修飾(例えば、メチル化及び/またはアミド化)を含むことができる。いくつかの実施形態では、(例えばミリストイル化及び/またはパルミチル化により)単純な炭素鎖をペプチドに結合させることができる。いくつかの実施形態では、例えば、単純な炭素鎖は、結合したペプチドを非結合物質から容易に分離可能とすることができる。例えば、本発明の所望のペプチドを非結合物質から分離するために使用できる方法としては、これらに限定されるものではないが、溶媒抽出及び逆相クロマトグラフィーが挙げられる。いくつかの実施形態では、親油性部分をペプチドに結合させることができ、血清アルブミンへの可逆的結合を介して半減期を延ばすことができる。さらに、結合される部分は、血清アルブミンへの可逆的結合を介してペプチドの半減期を延ばす親油性部分とすることができる。いくつかの実施形態では、親油性部分は、コレステロール、またはコレステン、コレスタン、コレスタジエン、及びオキシステロールを含むコレステロール誘導体であり得る。いくつかの実施形態では、ペプチドをミリスチン酸(テトラデカン酸)またはその誘導体に結合することができる。他の実施形態では、本開示のペプチドを半減期改変剤に結合(例えば、コンジュゲート)することができる。半減期改変剤の例としては、これらに限定されるものではないが、ポリマー、ポリエチレングリコール(PEG)、ヒドロキシエチルデンプン、ポリビニルアルコール、水溶性ポリマー、両性イオン水溶性ポリマー、水溶性ポリ(アミノ酸)、プロリン、アラニン及びセリンの水溶性ポリマー、グリシン、グルタミン酸、及びセリンを含む水溶性ポリマー、Fc領域、脂肪酸、パルミチン酸、抗体、またはアルブミンに結合する分子が挙げられる。
いくつかの実施形態では、配列番号1~配列番号567、配列番号1243~配列番号1252、または配列番号1263~配列番号1289の最初の2個のN末端アミノ酸(GS)は、別の分子との結合または融合を促進するための、また、かかる結合分子または融合分子からのペプチドの切断を促進するためのスペーサーまたはリンカーとして機能することができる。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、例えば、ペプチドの特性を改変または変化させることができる他の部分に結合することができる。
免疫抗がん剤(「I/O」)
本開示は、本明細書で「I/O」(複数可)と称する、がん治療で使用するためにやはり本明細書に開示されるペプチドと複合体化される免疫抗がん剤を提供する。本明細書で使用するところの「I/O」(複数可)は非限定的であり、単一剤、複数剤、または複数剤の複合体を含むことができ、かかる剤は、単量体、二量体(例えば、ホモ二量体またはヘテロ二量体)、または多量体(例えば、ホモ多量体またはヘテロ多量体)の構造を有し、また、かかる剤は、一重、二重、または多重に複合体化、凝集、修飾、融合、連結されるか、または上記の任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、本開示のI/Oは、抗腫瘍宿主免疫応答を促進することができる。例えば、I/Oは、腫瘍微小環境内の抗腫瘍宿主免疫応答を促進することができる。腫瘍に対する強力な免疫応答を得るために使用できる手法としては、これらに限定されるものではないが、サイトカインまたはケモカイン分泌の誘導、共刺激分子の上方制御、T細胞(例えば、エフェクターメモリーT細胞)の活性化及び増殖、ナチュラルキラー(NK)細胞の活性化及び増殖、適当な共刺激シグナル、ケモカイン、及び/または成長因子による抗原のプロセシング及び提示のための樹状細胞(DC)の活性化及び増殖、制御性T細胞(Treg)及び骨髄由来抑制細胞の阻害、腫瘍細胞における免疫原性細胞死(ICD)の誘導、インフラマソームの活性化、アポトーシスの誘導、またはこれらの組み合わせが挙げられる。上記に述べた手法によって抗腫瘍免疫を促進することができるI/Oとしては、インターフェロン(IFN)、インターロイキン(IL)-2、IL-12、及びIL-1ファミリー(例えば、IL-2、IL-15、IL-21、IL-12、IL-23、IL-27、IL-1、IL-18、IL-33)からのサイトカイン、これらに限定されるものではないが、CTLA-4、PD-1、PD-L1、TIM-3、LAG-3、VISTA、TIGIT、B7-H3、B7-H4、B7S1、ガレクチン9、CD244、BTLA、CD160、CIS、LIGHT、TIGITの阻害剤を含むチェックポイント阻害剤;これらに限定されるものではないが、TLR、NLR、ALR、CLR、RLR、RIG-I、MDA5、及びSTINGを含むパターン認識受容体(PRR)のリガンド;これらに限定されるものではないが、がん細胞の細胞表面のCD47発現を下方制御させる剤、高親和性の競合阻害剤となるように操作された可溶性SIRPα、またはSIRPαもしくはCD47のいずれかに直接結合してそれらの相互作用及びSIRPαシグナルを遮断する他のアンタゴニストなどの、SIRPαを阻害する剤を含む、マクロファージSIRPα-CD47のチェックポイントを阻害する分子;酵素インドールアミン-2,3-ジオキシゲナーゼ(IDO)の活性を阻害する分子;これらに限定されるものではないが、KIR2DL1-3、KIR3DL1、及びCD94/NKG2Aを含むナチュラルキラー(NK)細胞のチェックポイントを遮断する分子;ならびに、これらに限定されるものではないが、CD40、4-1BB、OX40、ICOS、CD27、TL-1A、TRAIL、FAS、及びGITRを含むTNFファミリーメンバーのリガンドまたは他のアゴニストもしくはアンタゴニストが挙げられる。これらに限定されるものではないが、BCL2、Mcl-1、BCLXL、BFLa/A1、BCLW、Bax、Bak、Bok、Bad、Bik、Bid、Bim、Noxa、Puma、BMF及びHRKを含むBCL2ファミリーのアゴニストまたはアンタゴニストをターゲティングすることができる。Bcl-2調節因子であるFLIPは可能な標的である。特定の実施形態において、本開示は、本明細書に開示されるペプチドI/O複合体との併用治療、及びがんの治療のためのPD-1阻害剤またはPD-L1阻害剤またはチェックポイント阻害剤の任意の組み合わせを提供する。これらに限定されるものではないが、カスパーゼ、カテプシン、カルパインを含む細胞内プロテアーゼを標的とすることができる。いくつかの実施形態では、Burugu et al.(Semin Cancer Biol.2017 Oct 5.pii:S1044-579X(17)30182-70)に記載されるI/Oを、参照により本明細書に援用する。いくつかの実施形態では、I/Oは、IL-15及びIL-12のような強力かつ効果的な抗腫瘍免疫応答を促進することができるサイトカインであってよい。いくつかの実施形態では、I/Oは、RIG-Iリガンド、MDA5リガンド、またはSTINGリガンドなどのPRRリガンドであってよい。いくつかの実施形態では、I/Oは、天然ヒト4-1BBリガンド、OX40L、またはCD40LなどのTNFファミリーのリガンドであってよい。ペプチドI/O複合体によるこれらのI/Oの送達は、抗腫瘍免疫を促進することができる一方で、全身投与された遊離I/Oと比較して毒性が低減されるため、さまざまながんの効果的な治療を促進するものである。
A. IL-15剤を含むI/O
本開示の免疫抗がん剤(I/O)は、IL-15剤を含むことができる。本明細書に記載されるIL-15剤は、IL-15受容体に結合する任意の剤を含み得る。例えば、本明細書に開示されるIL-15剤は、インターロイキン-15(IL-15)自体、IL-15のフラグメント、IL-15の変異体、IL-15N72DなどのIL-15の突然変異体、任意のIL-15受容体リガンド、ならびにかかるIL-15分子とIL-15受容体α鎖の全体または一部との融合体もしくは複合体、例えば、IL-15/IL-15Rα融合体もしくは複合体またはIL-15/sushi+ドメイン融合体もしくは複合体(例えば、IL-15またはIL-15N72DとIL-15RαまたはIL-15RαSuとの融合体)を含むことができる。IL-15剤の成分同士は、組換え融合体または化学的結合体などによって共有結合で、またはIL-15とα受容体鎖の全体または一部との間の非共有結合性の高親和性の会合などによって非共有結合で連結することができる。いくつかの実施形態では、IL-15は、ヒトに、NK細胞、エフェクターメモリーT細胞、及びγ/δT細胞を強力に誘導することができる。いくつかの実施形態では、IL-15は、IFN-γ及びグランザイムを誘導することができ、それによって細胞毒性活性を増大させることができる。IL-15は、さらにRORγtCD4+T細胞(Th17)を阻害することができ、活性化誘発細胞死(AICD)を刺激せず、Tregにほとんどまたはまったく影響を及ぼさない場合がある(Waldmann,Cancer Immunol Res 3:219-227(2015))。Delconte et al.(Nat Immunol.2016 Jul;17(7):816-24)に記載されるように、IL-15産生は、サイトカイン誘導性SH2含有(CIS)タンパク質、サイトカインシグナル伝達(SOCS)タンパク質の抑制因子、及びNKチェックポイントによって調節され得る(Nat Immunol.2016 Jul;17(7):816-24)。IL-15は、ヒト、非ヒト霊長類、または他の任意の動物などの対象において腫瘍退縮を誘発し、及び/または転移を阻害または低減し、及び/または腫瘍進行を防止または低減し、及び/または生存率を増大させることができる。IL-15剤としては、Altor Bioscienceより販売されるAlt-803(IL-15受容体α/IgG1 Fc融合タンパク質に結合されたIL-15突然変異体(IL-15N72D)からなる新規なIL-15スーパーアゴニスト複合体)(Margolin 2018、Wrangle 2018、Romee 2018)、IL-15及びIL-2のPEG化形態(Nektar/BMSにより開発されたように、IL-2に対する高い親和性を与えるIL-2Rα鎖を利用しないように設計されたもの(NKTR-214、NCT031388899、NCT02983045)及びArmo)、ALKS4230(Alkermes、NCT02799095)、及びヘテロ二量体IL-15(Admune/NovartisによるhetIL15、NCT02452268)が挙げられる。これらの初期の研究は、安全な用量及びIL-15アゴニスト治療に対する重要な薬力学的反応を確立している。がん治療における可能性、及び毒性及び短い半減期といったかかる治療としてのIL-15に関する問題は、Robinson and Schluns,Immunol Lett 190:159-168(2017)に概説されている。IL-15剤によるがん治療の有効性及び安全性は、本開示のペプチドI/O複合体などにより、IL-15剤を腫瘍にターゲティングすることにより、または腫瘍細胞でプロセシングされる前にIL-15剤の活性を低下させることにより、または腫瘍細胞によるIL-15剤のトラフィッキング及び提示により高めることができる。
IL-15剤の影響を受ける免疫細胞サブセットは、腫瘍を根絶する能力を有する可能性がある。IL-15剤は、IL-2との重要な違いを含み、複数の細胞タイプに影響を与える可能性がある。IL-15剤は、IL-15Rαとの融合体を含み得るが、この融合体は裸のIL-15剤と比較して顕著に高い効力及びインビボの循環時間を有し得る。
ペプチドI/O複合体のいくつかの実施形態では、ペプチドI/O複合体は、ペプチド-IL-15剤複合体(本明細書では、かかる複合体をIL-15 I/Oとも称する)である。かかるペプチド-IL-15剤複合体のIL-15剤は、IL-15またはIL-15フラグメントを含み得る。さらに、かかるペプチド-IL-15剤複合体のIL-15剤は、IL-15とIL-15Rα(IL-15RαはIL-15受容体のα受容体鎖である)との融合体であり得る。したがって、ペプチドI/O複合体は、少なくともIL-15/IL-15Rαのヘテロ二量体融合体を含むことができ、このヘテロ二量体融合体は、IL-15Rβ/γ受容体と結合または相互作用して、IL-15Rβ/γに対する生物学的活性を誘導、活性化、または増強する、またはIL-15Rβ/γに対する活性を低減、遮断または阻害するといった所望の生物学的活性を得ることができる。いくつかの実施形態では、ペプチド-IL-15剤複合体のIL-15剤部分は、少なくとも1つのIL-15剤とその受容体の少なくとも1つのサブユニット(例えばIL-15Rα)とを含む融合体である。他の態様では、IL-15剤は、IL-15の少なくとも1つのフラグメントとその受容体サブユニットの少なくとも1つのフラグメント(例えばIL-15Rαのフラグメント)とを含む融合体であると理解される。IL-15剤のIL-15Rα部分のそのようなフラグメントとして、本明細書に記載されるものの中でもとりわけ、例えば、スシドメインとも呼ばれるIL-15Rαのエクソン2ドメイン、またはそのN末端にアミノ酸13個のペプチドを含むエクソン3ドメイン、またはスシドメイン+エクソン3由来のアミノ酸13個のペプチドが挙げられる。かかる複合体及びフラグメントは、IL-15Rβ/γに対する生物学的活性を誘導、活性化、または増強するか、またはIL-15Rβ/γに対する活性を低減、遮断、または阻害するようなかたちでIL-15Rβ/γと結合または相互作用する。さらに、IL-15剤中のIL-15自体またはIL-15Rαとの組み合わせは、本明細書中に記載されるような変異を有することができる。IL-15Rβ/γ受容体は、ヒトまたは非ヒト霊長類などのT細胞やNK細胞の表面に発現され得る。
このIL-15Rβ/γ受容体は、IL-2及びIL-15受容体の共通のサブユニットを含むことができ、IL-15剤に対して低~中程度の親和性を有し得る。IL-2及びIL-15剤に対する高親和性受容体はそれぞれが、サイトカイン特異的であり、サイトカイン結合の親和性を高める第3のα鎖を含んでもよい。いくつかの実施形態では、IL-15剤は、完全長IL-15Rαと細胞表面で非共有結合的に融合または複合体化されてもよい。いくつかの実施形態では、IL-15剤は、投与に先立ってIL-15Rαと非共有結合的に融合または複合体化される。IL-15剤とIL-15Rαまたはその一部との組み合わせはスーパーアゴニストとして作用することができ、IL-15単独よりも高い効力を示すことができる。他の実施形態では、IL-15剤は、投与後にIL-15Rαの可溶形態と複合体化されて循環することができる。いくつかの実施形態では、IL-15Rβγは、Mortier et al.(J Biol Chem.2006 Jan 20;281(3):1612-9)に記載されるように、IL-15/IL-15Rα融合体によって活性化され得る。いくつかの実施形態では、IL-15Rαのエクソン2ドメインはスシドメインとも呼ばれ、IL-15自体に融合させるうえで重要である可能性があり、そのN末端にアミノ酸13個のペプチドを含むエクソン3ドメインは、IL-15/IL-15Rα融合体を安定化させるうえで重要である可能性がある。スシドメインとエクソン3のアミノ酸13個のペプチドは、IL-15Rα「sushi+」または「sushiプラス」とも呼ばれる場合もあり、これについてはBouchaud et al.(J Mol Biol.2008 Sep 26;382(1):1-12)に記載されている。IL-15Rαの「IL-15Ra sushi+」の配列は
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPP(配列番号1176)である。いくつかの実施形態では、IL-15剤は、IL-15またはIL-15N72DとIL-15Ra sushi+との融合体であり得る。いくつかの実施形態では、IL-15Ra sushi+とのIL-15融合体は、配列番号1135~配列番号1138、配列番号1176~配列番号1179、または配列番号1342に記載される配列のいずれか1つを含むことができ、配列はすべて表3に記載されている。
いくつかの実施形態では、本発明のIL-15剤は、IL-15 N72Dと二量体IL-15Rα sushiドメイン-IgG1 Fc融合タンパク質とを含む可溶性複合体(IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc)とすることができるが、これは、Fcドメインに融合されたIL-15RαSuとの非共有結合性の高親和性相互作用によって複合体化されたIL-15 N72D突然変異体である。いくつかの実施形態では、IL-15剤は、配列番号1179
、Fcドメインに融合されたIL-15RαSu、IL-15RαSu/Fc融合体、太字部分はIL-15RαSuを示し、太字でない部分はIgG1のCH2-CH3(Fcドメイン)を示す)、配列番号1179(Fcドメインに融合されたIL-15RαSu)、配列番号1178
(NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS,IL-15 N72D突然変異体)、及び配列番号1178(IL-15 N72D突然変異体)を含む複合体を含み得る。言い換えると、2個の配列番号1179の部分が2個の配列番号1178の部分と複合体化されてIL-15 I/Oを形成する。いくつかの実施形態では、IL-15剤は、配列番号1179(Fcドメインに融合されたIL-15RαSu)、配列番号1179(Fcドメインに融合されたIL-15RαSu)、配列番号1177(IL-15)、及び配列番号1177
(NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS、IL-15)を含むことができる。言い換えると、2個の配列番号1179の部分が2個の配列番号1177の部分と複合体化されてIL-15剤を形成する。
いくつかの実施形態では、IL-15剤は、L-X-L-Y-L(ただし、XまたはYの一方は配列番号1177または配列番号1178のいずれか一方であってよく、XまたはYの一方は配列番号1179または配列番号1176であってよい)とすることができる。また、L、L、及びLは、配列番号1163~配列番号1172、配列番号1139~配列番号1161、または配列番号1359~配列番号1366のいずれかを含んでよく、またはXn(ただし、Xは任意のアミノ酸であり、n=1~50であるか、または存在しなくともよい)であってよい。いくつかの実施形態では、IL-15剤は、2個の配列番号1177の部分と配列番号1179の部分との複合体であってよい。他の実施形態では、IL-15剤は、2個の配列番号1178の部分と配列番号1179の部分との複合体であってよい。例えば、IL-15剤は、L0-X-L-Y-Lであってよい(ただし、任意の組み合わせで、Lは、配列番号1169または配列番号1163であってよく、Xは、配列番号1176または配列番号1179であってよく、Yは、配列番号1177、配列番号1178であってよい)。さらに、ペプチド-IL-15複合体は、表4の複合体のいずれを含んでもよい。
いくつかの実施形態では、IL-15剤のIL-15
(NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS;配列番号1177)部分は、以下の変異、すなわち、L45D(Bernard et al.J Biol Chem.2004 Jun 4;279(23):24313-22)、L45E(Bernard et al.J Biol Chem.2004 Jun 4;279(23):24313-22)、Q48K(Bernard et al.J Biol Chem.2004 Jun 4;279(23):24313-22)、V49D(Bernard et al.J Biol Chem.2004 Jun 4;279(23):24313-22)、S51D(Bernard et al.J Biol Chem.2004 Jun 4;279(23):24313-22)、L52D(Bernard et al.J Biol Chem.2004 Jun 4;279(23):24313-22)、N72D(Zhu 2009及びUS008163879)、N72E(Zhu 2009)、N72A(Zhu 2009)、N72S(Zhu 2009)、N72Y(Zhu 2009)、N72R(US008163879)、D61A(US008163879)、またはそれらの任意の組み合わせのうちの1つ以上を有することができる。いくつかの実施形態では、上記に述べた変異のうちのいずれか1つまたは複数のものは、IL-15の変異形態中に存在するか、または配列番号1135~配列番号1138に組み込むことができ、IL-15部分に充てた番号付けは以下、すなわち、N72D、L45D、L45E、Q48K、V49D、S51D、L52D、N72E、N72A、N72S、N72Y、N72R、またはD61Aである。かかる変異の任意の組み合わせまたは多くのものが、IL-15突然変異体中に存在するか、または配列番号1135~配列番号1138に組み込むことができる点は理解されよう。
いくつかの実施形態では、本開示のペプチドとI/Oとの複合体(ただし、I/OはALT-803である)は、細胞内取り込みまたは腫瘍内濃度の増大、ならびに長期生存及び腫瘍に対する強力な抗腫瘍免疫応答を含む治療効果をもたらすことができる。ALT-803及びIL-15剤は、本明細書に参照により援用するところのUS20140134128及びHan et al.(Cytokine.2011 Dec;56(3):804-10)に記載されている。ペプチドは必要に応じて、分子のIL-15 N72D部分、分子のIL-15RαSu-Fc部分、またはそれらの任意の組み合わせと、切断可能なリンカーまたは安定的なリンカーによって融合することができる。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドとI/Oとの複合体(ただし、I/OはIL-15Rα/IL-15Fcである)は、細胞内取り込みまたは腫瘍内濃度の増大、ならびに腫瘍に対する抗腫瘍活性を含む治療効果をもたらすことができる。腫瘍は、膠芽腫及び黒色腫などの、本明細書に記載されるような任意の種類の腫瘍であってよい。
いくつかの実施形態では、IL-15剤は、機能及び活性を保持した任意のIL-15剤配列またはその任意のフラグメントもしくは変異体を含むことができる。すなわち、本開示のIL-15剤は、IL-15受容体に結合して下流の細胞応答を刺激することが依然可能である、短縮及び/または変異されたIL-15剤であってよい。いくつかの実施形態では、IL-15剤は、
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFIN(配列番号1491)
の配列を含むことができる。
いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、配列番号1233
(MAPRRARGCRTLGLPALLLLLLLRPPATRGDYKDDDDKIEGRITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPGGSGGGGSGGGSGGGGSLQNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSX1011121314151617181920212223242526272829303132333435363738394041424344454647484950MCMPCFTTDHQMARKCDDCCGGKGRGKCYGPQCLCR)または配列番号1234
(MAPRRARGCRTLGLPALLLLLLLRPPATRGDYKDDDDKIEGRNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPP
1011121314151617181920212223242526272829303132333435363738394041424344454647484950MCMPCFTTDHQMARKCDDCCGGKGRGKCYGPQCLCR)、
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSGGSGGGGSGGGSGGGGSLQNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSX1011121314151617181920212223242526272829303132333435363738394041424344454647484950MCMPCFTTDHQMARKCDDCCGGKGRGKCYGPQCLCR(配列番号1349)、または
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPX1011121314151617181920212223242526272829303132333435363738394041424344454647484950MCMPCFTTDHQMARKCDDCCGGKGRGKCYGPQCLCR(配列番号1350)に示されるIL-15超アゴニストに融合することができ、細胞内取り込みまたは腫瘍内濃度の増大、ならびに長期生存及び腫瘍に対する強力な抗腫瘍免疫応答を含む治療効果をもたらすことができる。配列番号1233、配列番号1234、または配列番号1349、または配列番号1350中のX、X、X、X、X、X、X、X、X、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X19、X20、X21、X22、X23、X24、X25、X26、X27、X28、X29、X30、X31、X32、X33、X34、X35、X36、X37、X38、X39、X40、X41、X42、X43、X44、X45、X46、X47、X48、X49、及びX50のうちのいずれのものも、それぞれ個々に任意のアミノ酸残基であってよく、または存在しなくてもよい。いくつかの実施形態では、X、X、X、X、X、X、X、X、X、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X19、X20、X21、X22、X23、X24、X25、X26、X27、X28、X29、X30、X31、X32、X33、X34、X35、X36、X37、X38、X39、X40、X41、X42、X43、X44、X45、X46、X47、X48、X49、及びX50のうちのいずれのものも、配列番号1139~配列番号1161、配列番号1360~配列番号1363、または配列番号1365のうちのいずれか1つなどの本開示の任意の切断可能なリンカーを含むことができる。いくつかの実施形態では、X、X、X、X、X、X、X、X、X、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X19、X20、X21、X22、X23、X24、X25、X26、X27、X28、X29、X30、X31、X32、X33、X34、X35、X36、X37、X38、X39、X40、X41、X42、X43、X44、X45、X46、X47、X48、X49、及びX50のうちのいずれのものも、配列番号1163~配列番号1172のうちのいずれか1つ、または配列番号1359、配列番号1364、配列番号1366のうちのいずれか1つなどの安定的なリンカーを含むことができ、さらに、場合により、切断可能なリンカーを含むことができる。前記融合体の前にはシグナルペプチドが配置されてもよく、その例示的な配列は、配列番号1232
(MAPRRARGCRTLGLPALLLLLLLPPATRG)またはIgGκリーダー配列(METDLLLLWVLLLVVPGSTG;配列番号1367)に示され、さらに、配列番号1162に示されるFLAG-Xa(DYKDDDDKIEGR)などの精製タグ、またはHis(x=1~20(配列番号1368)などのHisタグがその前またはその後に配置されてもよい。配列番号1233及び配列番号1234をそれぞれ図3及び図4に示す。図3及び図4におけるXは、X1011121314151617181920212223242526272829303132333435363738394041424344454647484950を表す。
IL-15は腫瘍では細胞外で活性であるため、本開示は、ペプチドが腫瘍微小環境にホーミングし、分布し、ターゲティングし、移動し、プロセシングされ、または蓄積することができるペプチド-IL-15剤複合体を含むペプチドI/O複合体を提供することができる。その後、ペプチドは細胞透過に介在し、細胞内プロセシングにより、必要に応じて、高い局所濃度で、またはより高い生物活性で、または細胞表面においてペプチドI/O複合体からIL-15を放出することができ、または、ペプチドは腫瘍透過、及び/または腫瘍微小環境中のIL-15の細胞外送達に介在することができる。いくつかの実施形態では、ペプチド-IL-15剤複合体は、本開示のペプチドとの融合体として化学的に結合されるかまたは組換えにより発現されたIL-15剤を含むことができる。これらの場合では、ペプチドとIL-15剤とは、必要に応じて切断可能なリンカーによって連結され、リンカーが腫瘍微小環境または腫瘍細胞内で選択的に切断され、それによりIL-15を切断後のより高い濃度及び/またはより高い効力で放出することができる。あるいは、ペプチドとIL-15剤とは、安定的なリンカーによって連結されてもよく、ペプチド-IL-15剤複合体として活性であり得るか、またはリンカーが異化作用によって切断されるようにしてもよい。いくつかの実施形態では、ペプチドとI/Oとは、本明細書にさらに記載されるように、切断、解離、分解、プロセシングされ得る。いくつかの実施形態では、IL-15剤は、ペプチドの細胞透過特性により、エンドソーム、リソソーム、小胞体、またはゴルジ装置などの細胞内区画に到達することができる。そのような場合、リンカーは酸に対して不安定であってよく、エンドソームの酸性環境中で切断され得るか、または酵素的に切断可能であり得るか、または還元により切断され得る。この後、細胞表面へのサイトカインリサイクルが生じてもよく、その位置で必要に応じて切断が生じてもよい。他の実施形態では、ペプチド-IL-15剤複合体は共配合される。いくつかの実施形態では、ペプチド-IL-15剤複合体は、リポソームなどの送達ビヒクル中に配合される。例えば、リポソーム粒子を本開示のペプチドでコーティングすることができ、さらにIL-15を配合することができる。粒子状ビヒクルは、細胞内区画への細胞取り込みを高めることができ、それにより、より高い濃度のIL-15がサイトカインリサイクル経路にアクセスできるようになる。他の実施形態では、IL-15 mRNA剤をリポソームに封入することができ、これを本開示のペプチドでさらにコーティングすることができる。他の実施形態では、IL-15剤を発現ベクターによってコードすることもできる。DNAをリポソームに封入してもよく、これを本開示のペプチドでさらにコーティングすることができる。このために、プロモーターを発現ベクター中に用いて、IL-15剤ががん細胞内で一度だけ活発に発現されるようにすることができる。いくつかの実施形態では、以下の表3に示されるIL-15剤のいずれのものも、本開示の任意のペプチドと複合体化されたI/Oであってよい。本出願においてI/Oとして使用することができる他のIL-15剤としては、いずれも本明細書に参照によりその全容を援用するところのChertova et al.(J Biol Chem.2013 Jun;288(25):18093-103),Ochoa et al.(Cancer Res.2012;73(1):139-149),Bouchaud et al.(J Mol Biol.2008;283:1-12),Kermer et al.(Mol Cancer Ther.2012 June;11(6):1279-1288),Kermer et al.(Mol Cancer Ther.2014 Jan;13(1):112-121),Dubois et al.(J Immunol.2008;180:2099-2106),Cheng et al.(OncoImmunology.2014 Nov;3(11):e963409),Stone et al.(Biotechnol Prog.2012 Nov;28(6):1588-1597),Wong et al.(Protectin Engineering,Design,& Selection.2011;24(4):373-383),Wu and Xu.(Journal of Molecular Cell Biology.2010;2:217-222)に記載されるものが挙げられる。
ペプチド-IL-15剤複合体は、毒性を最小限にするために、IL-15剤単独と比較して効力が大幅に低くなるようにプロドラッグとして設計されたペプチド融合体とすることもできる。腫瘍標的細胞によるこのペプチド-IL-15剤複合体の取り込み及びプロセシングによって、ペプチド-IL-15剤複合体からペプチドが除去され、IL-15剤のより高いまたは完全な効力の回復がもたらされる。このプロドラッグ形態は、プロドラッグでない場合に可能であるよりも高い用量のIL-15剤の投与を可能とする。腫瘍ターゲティングとペプチド-IL-15剤複合体のプロドラッグ形態との組み合わせは、IL-15療法の治療効果を改善することができる。
プロドラッグ切断及びペプチド-IL-15剤複合体からの完全な効力を有するIL-15剤の放出は、表面に発現されるか分泌される酵素のため、細胞表面及び/または腫瘍微小環境中でも生じ得る。このプロセスは、循環による場合と比較して腫瘍内により高い濃度の薬物を放出することができ、全身毒性を低く抑えた有効量の投与を可能とする。
特定の場合では、ペプチド-IL-15剤複合体は、潜在的なリガンド/受容体相互作用の検討後にのみ改変すればよい。例えば、IL-15剤のD8を含む領域は、IL-2/15受容体β鎖と相互作用し、この相互作用は、完全に機能するリガンド/受容体複合体に対して維持され得る。同様に、2個の自由にアクセスできるリシンK10及びK11のPEG化は、IL-2/15受容体β鎖との相互作用が妨げられることからシグナル伝達ができないIL-15剤を生じる。Q108を含むIL-15剤の領域は、共通のγ受容体鎖と相互作用することができ、完全に機能するリガンド/受容体複合体で保存されている可能性がある(Pettit et.al 1997)。IL-15剤は、O-またはN-結合グリコシル化タンパク質を生成することができず、生物学的アッセイで活性を有しうるE.coliを用いた生産系で生産することが可能であることから、IL-15剤のO-及び/またはN-結合グリコシル化は、活発なシグナル伝達またはリガンド/受容体相互作用にとって必要ではない可能性がある。したがって、IL-15自体はグリコシル化されてもされなくてもよく、E.coliなどのグリコシル化を行わない細胞、またはCHO、ピキア、もしくはHEK細胞などのグリコシル化を行う細胞で産生することができる。
いくつかの実施形態では、IL-15剤は、配列番号1177の配列を有するポリペプチドと会合した配列番号1179の配列を有する2個のポリペプチドから構成さる複合体である(天然のIL-15)。特定の実施形態では、このIL-15剤は、配列番号1179の2個のポリペプチド同士がジスルフィド結合によって共有結合され、さらに配列番号1179のそれぞれと配列番号1177との間の高親和性結合を介して非共有結合的に会合した複合体から構成される。
いくつかの実施形態では、IL-15剤は、配列番号1178の配列を有する2個のポリペプチドと会合した配列番号1179の配列を有する2個のポリペプチドの複合体を含む(IL-15のN72D突然変異体)。特定の実施形態では、このIL-15剤は、配列番号1179の2個のポリペプチド同士がジスルフィド結合によって共有結合され、さらに配列番号1179のそれぞれと配列番号1178との間の高親和性結合を介して非共有結合的に会合した複合体から構成される。
本明細書で使用するところの「RLI」または「ILR」は、IL-15「受容体」(本明細書に記載されるIL-15受容体の変異体またはフラグメントのいずれかを意味する)とIL-15R「リガンド」(本明細書に記載されるIL-15の変異体またはフラグメントのいずれかを意味する)とを、これらの任意の組み合わせで連結したポリヌクレオチドまたはペプチドの複合体、及びこれらの任意のフラグメントを含むIL-15剤であるI/Oを記述して用いられる略語として用いられる。
Figure 0007386161000077
Figure 0007386161000078
Figure 0007386161000079
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下記表4に、ペプチド-IL-15剤複合体の配列を示す。表4の配列番号1317~配列番号1358及び配列番号1428~配列番号1431では、タグは太字で示し、Sushiドメインは下線で示し、IL-15剤のリンカーはイタリック体で示し、IL-15剤は太字及び下線で示し、ペプチドとのリンカーは太字及びイタリック体で示し、切断可能な部位はイタリック体及び下線で示し、ペプチドは書式なしで示す。表4の配列番号1434~配列番号1441では、IL-15Ra Sushi、それに続くIgG1ヒンジ(太字)、CH2+CH3領域(Fc)(書式なし)、柔軟なリンカー(配列番号1359または配列番号1362)(下線)、及び配列番号569のペプチド(イタリック体で示す)を示す。
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Figure 0007386161000082
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Figure 0007386161000092
B. 4-1BBリガンドを含むI/O
いくつかの実施形態では、本開示は、4-1BBリガンドを含むI/Oを提供し、ここで本開示の4-1BBリガンドは、場合により本開示のペプチドと複合体化されたアゴニストとすることができる。本開示の4-1BBリガンドは、4-1BBL、TNFSF9、またはTNFL9とも呼ばれる腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー9とすることができる。ペプチドと4-1BBリガンドとから構成されるペプチドI/O複合体は、本明細書では「ペプチド-4-1BBリガンド複合体」と称する場合がある。本開示の4-1BBリガンドは、天然のヒト4-1BBリガンド(4-1BBL)タンパク質の活性な受容体結合形態である三量体として分泌され得る。いくつかの実施形態では、ペプチド-4-1BBリガンド複合体中の本開示の4-1BBリガンドは、これらに限定されるものではないが、CD4+T細胞、CD8+T細胞、Treg、B細胞、NK細胞、及び骨髄細胞(DC及び破骨細胞を含む)を含むさまざまな免疫細胞で発現される4-1BBと相互作用することができる。さらなる態様では、4-1BBリガンドは、ヒトコラーゲンのコラーゲンC-プロペプチドまたは他の三量体化ドメインなどの三量体化ドメインに融合することができる。いくつかの実施形態では、ペプチド-4-1BBリガンド複合体中の本開示の4-1BBリガンドは、CNSで発現される4-1BBと相互作用することができる。4-1BBリガンドは、エフェクターCD8+T細胞、NK細胞、DCを含むTh1応答を刺激し、メモリー機能、増殖機能、及び高いエフェクター機能(例えば、エフェクターCD8+T細胞による腫瘍細胞溶解)を促進する。いくつかの実施形態では、4-1BBリガンドは、サイトカイン、白血球増殖、腫瘍阻害、またはそれらの任意の組み合わせを誘導することができる。いくつかの実施形態では、4-1BBリガンドは、Th2及びTh17応答ならびにAICDを阻害することができる。いくつかの実施形態では、4-1BBリガンドは、ヒト、非ヒト霊長類、または任意の他の動物において腫瘍退縮を誘発することができる(Bartkowiak and Curran,Front Oncol 5:117 (2015))。
いくつかの実施形態では、4-1BBリガンドは、4-1BBに対するモノクローナル抗体、CDR、または抗体フラグメントとすることができる。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体、CDR、または抗体フラグメントである4-1BBリガンドは、強力な抗腫瘍応答を誘発することができる。抗4-1BBモノクローナル抗体のscFvは、本開示のペプチドに融合することが可能なI/Oであってよい。いくつかの実施形態では、4-1BBリガンドは、ウレルマブもしくはウレルマブのscFv、ウレルマブCDR、またはウレルマブ抗体フラグメントであってよい。いくつかの実施形態では、4-1BBリガンドは、ウトミルマブまたはウトミルマブのscFvである。ウレルマブ及びウトミルマブの初期の臨床経験において、腫瘍応答のエビデンスを含む有望な結果が得られている(Chester 2018,Tolcher 2017,Segal 2018)。しかしながら、これらの治療に関連した顕著な毒性もあり(Atkins 2018,Chester 2018)、これは、奏功する4-1BBリガンド療法は、本明細書に記載のペプチドI/O複合体を使用した腫瘍ターゲティングから利することを示唆するものである。
4-1BBリガンドは細胞外で活性であるため、本開示は、ペプチドが腫瘍微小環境にホーミングし、分布し、ターゲティングし、移動し、プロセシングされ、または蓄積することができるペプチド-4-1BBリガンド複合体を含むペプチドI/O複合体を提供することができる。いくつかの実施形態では、ペプチド-4-1BBリガンド複合体は、本開示のペプチドとの融合体として化学的に結合するかまたは組換えにより発現させることができる。いくつかの実施形態では、ペプチドと4-1BBリガンドI/Oとは、切断可能なリンカーによって連結されることで、腫瘍微小環境中でリンカーが選択的に切断されることにより4-1BBリガンドを高い濃度で放出することができる。場合により、ペプチド-4-1BBリガンド複合体は、切断前により低い効力を有し、切断後はより高い効力を有し得るプロドラッグである。いくつかの実施形態では、4-1BBリガンドI/Oは、ペプチドの細胞透過特性により、エンドソームもしくはリソソーム、小胞体、またはゴルジ装置などの細胞内区画にアクセスすることができる。そのような場合、リンカーは酸に対して不安定でエンドソームの酸性環境中で切断され得るか、またはリンカーは酵素的に不安定でエンドソーム内で酵素によって切断され得る。この後、細胞表面または細胞外空間へのサイトカインリサイクルが生じてもよい。いくつかの実施形態では、4-1BBリガンドは、安定的なリンカーによってペプチドに連結することができ、活性であるが、ペプチドのホーミング、細胞透過特性、またはその両方のために、腫瘍微小環境中により高い濃度で蓄積する。いくつかの実施形態では、4-1BBリガンドは、小胞体及び/またはゴルジ装置の区画に集合し、その後、表面上で発現され得る。
いくつかの実施形態では、4-1BBリガンドは、ヒトコラーゲンのC-プロペプチド(テナシン-C三量体化ドメイン;配列番号1370)(Cui et al.Sci Rep.2018 May 9;8(1):7327.doi:10.1038/s41598-018-25652-w.;Berg et al.Cell Death Differ.2007 Dec;14(12):2021-34.Epub 2007 Aug 17)またはコラーゲンα1(XVIII)NC1ドメイン(配列番号1369)(Pan et al.Appl Microbiol Biotechnol.2013 Aug;97(16):7253-64.doi:10.1007/s00253-012-4604-0.Epub 2012 Dec 4.)などの三量体化ドメインとの融合タンパク質として発現させることができる。
いくつかの実施形態では、使用される4-1BBリガンドがモノクローナル抗体である場合、4-1BBリガンドを本開示の複数のペプチドに化学的に連結することができる。いくつかの実施形態では、4-1BBリガンドは、細胞外でまたは内在化後に腫瘍細胞プロセシングの間に酵素的に切断され得る切断可能なリンカーを介してscFvと組換えによって融合することができる。他の実施形態では、ペプチド-4-1BBリガンド複合体は共配合することができる。いくつかの実施形態では、ペプチド-4-1BBリガンド複合体は、リポソームなどの送達ビヒクル中に配合することができる。例えば、4-1BBリガンドをリポソームナノ粒子中に配合することができ、これを本開示のペプチドでコーティングすることができる。他の実施形態では、4-1BBリガンドmRNAをリポソームに封入することができ、これを本開示のペプチドでさらにコーティングすることができる。他の実施形態では、4-1BBリガンドを発現ベクターによってコードすることもできる。DNAをリポソームに封入してもよく、これを本開示のペプチドでさらにコーティングすることができる。これらの場合では、プロモーターを発現ベクター中に用いて、4-1BBリガンドががん細胞内で一度だけ活発に発現されるようにすることができる。他の実施形態では、4-1BBリガンドはアゴニストアプタマーであってもよい(Schrand 2014)。
Figure 0007386161000093
Figure 0007386161000094
Figure 0007386161000095
C. RIG-Iリガンドを含むI/O
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示のペプチドと複合体化されたMDA5リガンドまたはTLR3リガンドなどのRIG-Iリガンドまたは関連するリガンドを含むI/Oを提供する。ペプチドとRIG-Iリガンドとから構成されるペプチドI/O複合体は、本明細書では「ペプチド-RIG-Iリガンド複合体」と称する場合がある。ペプチドとMDA5リガンドとから構成されるペプチドI/O複合体は、本明細書では「ペプチド-MDA5リガンド複合体」と称する場合がある。ペプチドとTLR3リガンドとから構成されるペプチドI/O複合体は、本明細書では「ペプチド-TLR3リガンド複合体」と称する場合がある。
TLR3はエンドソーム受容体であり、RIG-I及びMDA5は、ウイルス感染に関連するものなど、5’末端の二リン酸または三リン酸(RIG-Iの場合)を有する異常な二本鎖RNAの細胞質受容体である。RIG-I及びMDA5リガンドは、マウスにおける抗腫瘍免疫及びアポトーシスの促進に有効であり得る(Wu 2017,Yu 2016)。RIG-I及びMDA5はいずれもRNAヘリカーゼであり、いずれもリガンド特異性に関与するC末端ドメインと、MAVSを介したシグナル伝達を可能にする2個のN末端CARDドメインを有し、いずれも細胞質に存在する。どちらも内部RNA二本鎖構造を認識するが、RIG-IはdsRNAの5’末端も認識することができる(Wu 2013)。
RIG-IまたはMDA5のリガンド結合はMAVS依存性シグナル伝達経路の活性化をもたらし、抗ウイルス免疫及び抗腫瘍免疫につながり(Elion 2018)、TLR3の活性化によって誘導される遺伝子発現とは異なるI型IFNを含む炎症性物質の産生を引き起こす。RIG-IまたはMDA5の活性化はさらにインフラマソームの活性化をもたらし、IL-1、IL-18、及びDAMPSの分泌など、抗腫瘍免疫を促進する腫瘍微小環境の変化をもたらす。ポリI:CがTLR3ではなくMDA5をターゲティングするようにトランスフェクトされると、マウスの抗腫瘍免疫が効果的に増強される(Bhoopathi 2014)。MDA5とTLR3は同様の二本鎖RNAリガンドを認識し、5’末端の三リン酸を必要としない(Linehan 2018)。詳細には、MDA5及びTLR3はいずれもポリI:Cを認識するが、異なる細胞区画においてもポリI:C認識する。TLR3以外に、TLR7、8、及び10を含む、dsRNAを検知する他のTLRがエンドソームに存在する。いくつかの実施形態では、RNAリガンドを本開示のペプチドに結合することでその複合体はRIG-1またはMDA5を活性化し、場合によってはさらに、エンドソームのRNA検知TLRの1つを活性化することができる。場合によっては、エンドソームTLRのみがトリガーされるか、複合体が1つまたは他の受容体に対して特異的である場合もある。
ヒトの疾患を引き起こす多くの生物は、パターン認識受容体(PRR)に結合することなどによって宿主によって検出され得ることで、感染から宿主を保護する自然免疫応答を活性化する、核酸、糖、またはリポタンパク質などのいわゆる病原体関連分子パターン(PAMP)または微生物関連分子パターン(MAMP)を有している。異常RNAは、抗ウイルス免疫応答の開始につながるウイルス感染からの主要な病原体関連分子パターン(PAMP)である。これらのRNAは、ウイルスの感染時に、主として分節マイナス鎖ウイルスによって生じ得る。これらのウイルスとしては、限定されるものではないが、高病原性ウイルス、インフルエンザ、麻疹、おたふく風邪、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)、及びパラインフルエンザ、ならびにニューカッスル病ウイルス、ハンタウイルス、マールブルクウイルス、エボラウイルス、及び狂犬病ウイルスが含まれる。これらのRNAは、C型肝炎ウイルス、日本脳炎ウイルスなどのプラス鎖RNAウイルス、ならびにアデノウイルス、ワクシニア、及び単純ヘルペスウイルスなどの一部のDNAウイルスに感染する際にも生じ得る。TLR3は、レオウイルス、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルス、脳心筋炎ウイルス(EMCV)、フラビウイルス、及び西ナイルウイルス由来のRNAを認識する。TLR7及びTLR8は、エンドソームにおいても、センダイウイルス(SeV)、パラインフルエンザウイルス(PIV)、インフルエンザウイルス、コクサッキーウイルス、ワクシニアウイルス、麻疹ウイルス(MV)、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)、及びレトロウイルスの感染によって生じるRNAを認識する。TLR10は、RNAを認識する別のエンドソームTLRであるが、そのリガンドについてはあまり知られていない。MDA5は、EMCV、ポリオ、及びコクサッキーウイルス、ならびにレオウイルスからのdsRNAを認識する(Chen 2017)。
RIG-I及びMDA5はいずれも、ミトコンドリア抗ウイルスシグナル伝達(MAVS)タンパク質を介してシグナル伝達し、これにより、IRF3/7及びNFκB因子を介したシグナル伝達が開始される(Wu 2017)。MAVSはまた、免疫原性細胞死(ICD)につながる腫瘍細胞アポトーシスのRLR活性化による開始にとっても重要である。さらに、RIG-Iは複数のインターフェロン調節因子(IRF)を利用することができる。したがって、RIG-IまたはMDA5とRIG-I特異的リガンドとの結合は抗ウイルス免疫機構を活性化することができ、それにより腫瘍に対する治療効果をもたらし得る。いくつかの実施形態では、RIG-1またはMDA5とRIG-1リガンドとの結合は、腫瘍細胞の直接的な免疫原性細胞死(ICD)を誘導することができるが、正常細胞の細胞死は誘導しない。これにより、免疫系に対する腫瘍抗原のDCによる提示が生じ得る。5’末端の三リン酸dsRNAによるRIG-IまたはMDA5の結合により、炎症性サイトカインI型インターフェロン(IFN)、CXCL10、CCL5、IL-6、IL-23、IL-1β、TNFα、IFNβ、及びその他の分泌が生じ得る。いくつかの実施形態では、RIG-1またはMDA5リガンドは、インフラマソーム活性を含むDC活性化を刺激することができる。いくつかの実施形態では、RIG-Iリガンドは、腫瘍細胞がIRF3経路を介してIFN及びCXCL10を産生するように誘導することができる。RIG-I及びMDA5リガンドの多様な免疫原性活性の結果として、抗腫瘍T細胞が誘導され得る。いくつかの実施形態では、RIG-1またはmDA5リガンドは、ヒト、非ヒト霊長類、または他の任意の動物などの対象において腫瘍退縮を誘導することができる(Bhoopathi 2014,Elion 2018)。RIG-IリガンドはさらにTh17及びTreg応答を阻害することができる(Yang 2017)。
いくつかの実施形態では、本開示のI/Oは、RIG-1と同じ機能の多くを共有する、dsRNAに対する関連する細胞質センサーであるMDA5をターゲティングとすることができる。RIG-I及びMDA5はいずれもRNAヘリカーゼファミリーに属し、いずれもウイルスのdsRNAに結合し、MAVSを介してシグナル伝達する。
いくつかの実施形態では、RIG-Iまたは他のRNAセンサーに対するオリゴヌクレオチドリガンドは、特定の遺伝子の発現を調節するように機能する配列も含む。このような配列としては、アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)、mRNA、低分子干渉RNA(siRNA)、アプタマー及びマイクロRNA(miRNA)(Laina 2018)、及び非コーディングRNA(ncRNA)、ならびにスプライス修正オリゴヌクレオチド(SCO)(Thierry 2006)、及びCRISPR-Cas9システム(Majo 2018)が挙げられる。かかる薬剤は、特定のタンパク質の翻訳を調節するか、または特定のタンパク質標的を直接阻害または活性化するように作用し得る。
RIG-Iリガンドは、短いdsRNAを含み得る(少なくとも5~60塩基対、少なくとも5~10塩基対、少なくとも7~10塩基対、少なくとも11~18塩基対、少なくとも14~120塩基対、少なくとも5~15塩基対、少なくとも15~25塩基対、少なくとも25~40塩基対、少なくとも40~60塩基対、少なくとも60~80塩基対、少なくとも80~100塩基対、少なくとも100~120塩基対、少なくとも120~140塩基対、少なくとも140~160塩基対、及び、最適には少なくとも19~60塩基対であり、少なくとも1つの5’末端の三リン酸(二リン酸も許容できる)、及びキャップされていない5’末端のAまたはG、平滑末端の5’末端三リン酸(3リン酸を有する5’末端における1ヌクレオチドの重複である1nt 5’重複も許容される)を有する)。(Hornung et al,Science.2006 Nov 10;314(5801):994-7;Schmidt et al,Proc Natl Acad Sci U S A.2009 Jul 21;106(29):12067-72を参照)。少なくとも1つの5’三リン酸または5’二リン酸は、好ましくは得られるdsRNAのセンス鎖の5’末端に位置し得る。5’三リン酸から遠位に位置する場合、例えば、5’末端から8塩基対以上離れている場合、dsRNA内のミスマッチが許容できる。このことは、本開示のリンカー及び/またはペプチドとの結合などの他のRNA修飾も、5’三リン酸部位から遠位に位置する、例えば5’末端から8塩基対以上離れている場合には許容され得ることも示す。いくつかの態様では、dsRNAは、そのリボシドの一部が同じヘアピン内のパートナーと対をなしたヘアピンRNAであり、5’三リン酸をさらに有する。RIG-Iリガンドとなり得る短い5’三リン酸dsRNAとしては、配列番号1180~配列番号1187、配列番号1203、配列番号1205、及び配列番号1193~配列番号1202に記載されるようなポリリボヌクレオチドから構成されるもの(それ自身の上に折り返され得ることでdsRNAを形成するヘアピン構造を示す)、ならびに本明細書に記載される5’三リン酸を有し、二本鎖(センス/アンチセンスとして、またはヘアピンとして)RNAである他の多くの配列が挙げられる。本明細書に記載されるdsRNAの塩基対合領域は、RNA配列のより長い及び/または一本鎖との関連において、または別々のポリリボヌクレオチドとの関連において、対合する際に本明細書に記載されるような二本鎖部分を有するようになる対合したポリリボヌクレオチドであり得る点は理解されよう。
さらなる配列は、Schlee et al.(Immunity.2009 Jul 17;31(1):25-34)にも記載されている。RIG-Iリガンドを含む二本鎖RNA(dsRNA)は、RNAのセンス鎖とアンチセンス鎖とを二本鎖の形態に組み合わせるために用いられるさまざまな方法によって作製することができる。いくつかの実施形態では、dsRNAのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、各種の組換え技術または合成技術を用いて別々に転写または合成してから、dsRNA構造に組み合わせることができる。他の実施形態では、dsRNAのセンス鎖及びアンチセンス鎖をループ構造(ヘアピン)を含む一本鎖RNAとして転写または合成し、このループ構造を必要に応じて後でRNAseで切断することによりdsRNAを得ることもできる。ループ構造(ヘアピンなど)は、ポリリボヌクレオチドの長さ及び組成において異なり得る。いくつかの実施形態では、ヘアピン構造はループ構造を有することができる。他の実施形態では、ヘアピン構造はループ構造を有さない。いくつかの実施形態では、ヘアピン構造は、対合したdsRNA構造内にミスマッチを含む。いくつかの実施形態では、RNase LによるUリッチなサイトゾルRNAの切断により生成される短いdsRNAがRIG-1リガンドとなり得る。分節マイナス鎖RNAウイルスの場合、そのようなRIG-Iリガンドは、保存された相補的な5’及び3’ゲノム末端の塩基対合によって形成された「パンハンドル」に見出され、これがRIG-Iを活性化することができる。狂犬病ウイルスのパンハンドルに相当するRIG-Iリガンドを一例として配列番号1188に示す。一部のウイルスでは、RIG-Iを回避するために、RNAの5’末端にミスマッチを進化させている。インフルエンザウイルスゲノムプロモーターは、そのほぼ相補的なゲノム末端に含まれ、配列番号1189~配列番号1192のうちのいずれか1つに記載されるものなどの、RIG-Iを活性化することができる5’ppp平滑末端dsRNAを形成することができる(Anchisi et al.J Virol.2015 Oct 7;90(1):586-90)。RIG-Iリガンドとして機能し得るさらなるウイルスパンハンドル配列としては、配列番号1193~配列番号1198が挙げられる。Lee et al.(Nucleic Acids Res.2016 Sep 30;44(17):8407-16),Goldeck et al.(Methods Mol Biol.2014;1169:15-25),及びSchmidt et al.(Proc Natl Acad Sci U S A.2009 Jul 21;106(29):12067-72)に記載されるRIG-Iリガンドを、本明細書においてI/Oとしてさらに使用することができる。そのような場合、RIG-Iリガンドは、一方または両方の鎖に5’二リン酸または三リン酸基を有する、2本鎖として互いに複合体化された2本のRNA鎖から構成されるものとするか、または分子の1つ以上の位置で二本鎖となるヘアピンとして互いに複合体化された1本鎖RNAから構成されるものとすることができる。二本鎖は配列全体にわたって延在してもよく、またはミスマッチの領域があってもよく、一方または両方の鎖内にヘアピンで自己会合する1つ以上の位置があってもよい。さらに、二本鎖の末端は同じ平滑位置にあってもよく、または一方または他方の末端が突出してもよい。RNA複合体内のヘアピンやその他の構造は、より免疫原性が高い場合があり、RIG-I経路をより高いレベルで活性化することができる。MDA5リガンドもまた、上記の構造的バリエーションのすべてを呈してもよいが、5’リン酸を有さずともまたは1個の5’リン酸を有してもよい。いくつかの実施形態では、RIG-Iリガンドは、図5に示され、また、Probst et al.(Vaccine.2017 Apr 4;35(15):1964-1971)に記載されるように、非核酸ベンゾビスチアゾール化合物としてもよい。
RIG-IリガンドのRNA骨格または塩基を修飾することにより、血清中安定性を含むインビトロ及びインビボの安定性、製造性、保存安定性、または塩基対合親和性及び免疫系の活性化を含む分子の他の特性を向上させることができる。ピリミジンは2’-フルオロ修飾することができ(Lee et al,Mol Ther.2017 Jun 7;25(6):1295-1305)、これによりヌクレアーゼに対する安定性を高めるだけでなく、免疫系の活性化を高めることができる。RNA骨格は、ホスホロチオエート置換(非架橋酸素が硫黄で置換される)することができ、これにより、ヌクレアーゼ消化に対する耐性を高めることができるばかりでなく、生体内分布及び組織保持率を改変し、タンパク質結合を増大させることなどによって薬物動態を高め、また、より多くの免疫刺激を誘導することができる。RNAのホスホン酸メチル修飾を用いることもできる。2’-Oメチル及び2’-F RNA塩基を使用することができ、これにより、塩基の加水分解及びヌクレアーゼから保護し、二本鎖の融解温度を上げることができる。修飾はまた、架橋された核酸、モルホリノ核酸、PNA、LNA、エチルcEt核酸も含み得る。リボースの2’位の酸素と4’位の炭素間のN-O結合などの任意の化学架橋を含む架橋形態、ロック形態、及び他の同様の形態のBridged Nucleic Acids(BNA、LNA、cEt)を組み込むことでエキソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼに対する耐性を高め、生物学的安定性を高めることができる。このようなものとしてはBridged Nucleic Acids(BNA)が挙げられ、その場合、2’位と4’位の炭素間にN-O結合が存在し、架橋内の窒素(NH、N-CH、N-ベンゼンを含むがこれに限定されない)の任意の化学修飾を加えることで安定性を高めることができる。RNAの骨格または塩基の修飾は、1個、複数個、またはすべての塩基の位置など、RNA配列内の任意の場所に行うことができる。必要に応じて、修飾は、5’三リン酸を有し、ヘリカーゼと相互作用するdsRNA複合体の末端から遠位に行うことができる。このようなRNAの骨格または塩基の修飾は、ペプチド-RIG-Iリガンド複合体によるRIG-I活性化のレベルを高めるか、低めるか、または影響を及ぼさない場合がある。必要に応じて、ホスホロチオエート核酸を、一方または両方の配列の2~3個の末端核酸に使用することができる。必要に応じて、2’F修飾核酸を、内部位置の少なくとも2~4個の位置、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも25%、内部位置の少なくとも50%、少なくとも75%、または最大100%に用いるか、すべての内部位置またはすべての位置に用いることができる。
RIG-Iリガンドは、例えば、リンカー及びペプチドへの結合、または脂質、コレステロール、もしくは炭化水素鎖などのさらなる送達剤への結合などの化学修飾を可能にするために、配列内に存在するさらなる修飾ヌクレオチドまたは塩基を有してもよい。
RIG-Iは細胞内で活性であることから、本開示は、ペプチドが腫瘍微小環境にホーミング、分布、ターゲティング、移動、プロセシング、または蓄積することができるか、またはペプチドが、RIG-Iリガンドが標的細胞の細胞質にアクセスできるように細胞に透過することが可能であるようなペプチド-RIG-Iリガンド複合体を提供する。RIG-IリガンドはRIG-Iヘリカーゼと接触する場合にはそれ自体でRIG-Iヘリカーゼを活性化できると考えられるが、インビボまたはインビトロで細胞に適用する場合には低濃度でしか細胞質にアクセスできず、そのため、RIGにアクセスして活性化することができないと考えられる。本開示のペプチドを用いない場合、RIG-Iリガンドは、トランスフェクション試薬または細胞質にアクセスするための他の成分を含む製剤を必要とすると考えられるが、これは、毒性、安定性、安全性の問題、または製剤を全身に適用できない(静脈内または皮下投与などにより)ことにより、ヒトのがん治療には実用的でなく、充分な量の活性剤を腫瘍に送達することができないものと考えられる。本開示のペプチドをI/Oと組み合わせて、ペプチド-RIG-Iリガンド複合体を含むペプチドI/O複合体を作製することにより、RIG-Iをインビボで活性化させて抗がん治療を行うことができる。例えば、ペプチド-RIG-I I/O複合体中のRIG-Iリガンドは、エンドソーム内でのペプチドI/Oの切断によって標的細胞の細胞質にアクセスできるか、またはエンドソームからサイトゾル中に出た後、複合体から解離したRIG-Iリガンドが細胞質にアクセスすることができるか、または本明細書に記載される他の任意の機構を介して細胞質にアクセスすることができる。RIG-Iリガンドは、場合により、切断されることなく細胞質及びRIG-Iにアクセスすることもできる。ペプチド-RIG-Iリガンド複合体は、ペプチドが、ヘリカーゼを活性化するRIG-Iリガンドの末端から遠位に位置するように設計することができ、こうすることで、ペプチド-RIG-Iリガンド複合体は切断されずに活性を示すことができる。Devarker et al., Proc Natl Acad Sci,113(3):596-601,2016の結晶構造に示されるような、RIG-IリガンドとRIG-Iヘリカーゼとの間の相互作用を分析してペプチド-RIG-Iリガンド複合体を設計することができる。ペプチドI/O複合体において、本開示のペプチドは、RIG-I I/Oの5’ppp末端から3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、またはそれ以上の塩基対のように5’ppp末端から所定数の塩基対だけ離れた位置に配置することができる。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、5’ppp末端から7~20個の塩基対だけ離れて結合される。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、5’ppp末端から20個よりも多くの塩基対だけ離れて結合される。いくつかの実施形態では、RIG-1リガンドI/Oは、ペプチドに化学的に結合させることができる。例えば、ペプチドとRIG-IリガンドI/Oとは切断可能なリンカーによって連結することができるため、リンカーは、エンドソームまたはサイトゾル中といった細胞内に入ると選択的に切断され、それにより、RIG-Iリガンドが高い濃度で細胞内に適宜放出されることで細胞内RIG-Iにターゲティングすることができる。ペプチドとRIG-Iリガンドとは、ペプチドが除去されるまでRIG-Iが不活性であるかまたはペプチドによってその受容体への結合が阻害されるように連結することができ、それにより非がん性組織のI/Oへの曝露を低減することができる。例えば、リンカーは、細胞質、エンドソーム-リソソーム経路、細胞の表面上、または腫瘍微小環境中の還元的環境で切断されるジスルフィド結合とすることができる。他の実施形態では、リンカーは、酸に不安定であってもよく、それによりリンカーはエンドソーム-リソソーム経路の酸性環境中で切断される。他の実施形態では、リンカーは、酵素的に切断可能であってもよく、それによりリンカーはエンドソーム-リソソーム経路、サイトゾル内、または腫瘍微小環境中の酵素によって切断される。他の実施形態において、ペプチド-RIG-1リガンド複合体は、異化経路の一部として切断されてもよい。他の実施形態では、ペプチド-RIG-Iリガンド複合体は共配合することができる。いくつかの実施形態では、ペプチド-RIG-Iリガンド複合体は、リポソームなどの送達ビヒクル中に配合することができる。他の実施形態では、ペプチド-RIG-Iリガンド複合体は、リポソームに封入することができるRIG-Iリガンドを含み、リポソームを本開示のペプチドでさらにコーティングすることができる。他の実施形態では、ペプチド-RIG-Iリガンド複合体は、安定的なリンカーによって連結することができ、複合体として活性である。リンカーは、エンドソームからの脱出、エンドソームへの取り込み、腫瘍への組織生体内分布、または細胞透過性を高めるペプチドまたは化学構造としてのさらなる機能を有することができる。細胞透過性またはエンドソーム脱出性のペプチド配列を、リンカーに、またはペプチドの他方の端部に付加することができる。リンカーは、疎水性ドメイン((CH2)x(ただしx=1-30)など)、コレステロール、LCA、DHA、またはDLA、親水性ドメイン(ヒドロキシル基またはオリゴエチレングリコールなど)、または細胞成分と相互作用を行うためのペプチドとRIG-Iリガンドとの運動自由度を与える柔軟なドメイン((CH2-CH2-O)x(ただしx=1~10、1~30、20~100、100~1000)など)から構成されるものとすることができる。
本開示のペプチドは細胞透過性であってよく、エンドサイトーシスされ、ピノサイトーシスされ、細胞によって取り込まれ、及び/またはがん細胞などの細胞の細胞質にアクセスすることができる。本開示のペプチド及びその変異体の一部のものは、エンドサイトーシスによる膜輸送に関与するカルシウム調節リン脂質結合タンパク質(Lizarbe 2013)であるアネキシンA2の特異性により、腫瘍細胞に選択的に結合することができる(Morel 2009)。アネキシンA2はがん細胞の表面で過剰発現し、これは予後不良と関連している(Sharma 2018)。アネキシンA2は、微小小胞体形成、小胞凝集、食作用、ヌクレオチド及びタンパク質のトラフィッキングなどの膜トラフィッキング事象に関与し、さらに、パピローマウイルスのエンドソームへの送達、及びウイルスDNAのMVE及びTGNを介した核への輸送において役割を担っている(Taylor 2018)。アネキシンA2は、治療用オリゴヌクレオチドの輸送にも関与しており、エンドソーム放出を促進すると考えられる(Wang 2016)。DNA送達におけるアネキシンA2の役割、及びTGNを含むさまざまなエンドソーム区画へのクロロトキシンペプチドの既知の輸送(Wiranowska et al.,Cancer Cell Intl 11:1-13 (2011))を考慮すると、本開示のペプチド-RIG-I複合体は、細胞質へのRIG-Iリガンドの送達を促進することができる。同様に、インビボ研究によって、例えば、配列番号1243~配列番号1262のペプチドのような、LCMI-IIペプチド、THP1ペプチド、及びキモトリプシン阻害剤としても知られるパシファスチンペプチドが腫瘍の細胞に蓄積し、細胞を透過する能力も示されている(Sottero et al,Anticancer Research 38:51-60(2018))。
いくつかの実施形態では、I/OとしてRIG-Iリガンドを含む本開示の例示的なペプチドI/O複合体は、図34~図44及び図55~図79に記載される構造で示される。特定の実施形態では、I/OとしてRIG-Iリガンドを含む本開示のペプチドI/O複合体の1つが図37に示される。いくつかの実施形態では、RIG-Iリガンドを含む本開示のペプチドI/O複合体は、配列番号569のペプチドと少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも100%の配列同一性を有するペプチドを含み、安定的なリンカーを含み、配列番号1371のRIGリガンドを含む。
いくつかの実施形態では、配列番号1180~配列番号1206のいずれのものも、センス鎖の5’末端に少なくとも三リン酸または二リン酸を有することができる。いくつかの実施形態では、配列番号1180~配列番号1206は、センス鎖、アンチセンス鎖、またはその両方の5’末端に1つ以上の5’三リン酸または1つ以上の5’二リン酸を有することができる。いくつかの実施形態では、配列番号1180~配列番号1206のいずれのRIG-1刺激活性も、センス鎖上の5’pppの存在を必要とし得る。他の実施形態では、配列番号1180~配列番号1206のいずれのものも、5’三リン酸を含まない。いくつかの実施形態では、Lee 2016で考察されているように、dsRNA配列のいずれかへの2’フルオロピラミジンの組み込みによって、RIG-Iの活性化を高めることができる。下記表6に、本開示の例示的なRIG-1リガンドを含む例示的なI/Oを列挙する。表6に記載されるすべての配列において、5’末端は、5’三リン酸(5’ppp)、5’二リン酸(5’pp)、5’一リン酸(5’p)を有するか、またはリン酸を有さなくともよい。
Figure 0007386161000096
Figure 0007386161000097
Figure 0007386161000098
Figure 0007386161000099
Figure 0007386161000100
D.インターフェロン遺伝子タンパク質(STING)リガンドの刺激物質を含むI/O
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示のペプチドと複合体化されたSTINGリガンド、例えばアゴニストを含むI/Oを提供する。ペプチドと、標的に対してアゴニストとして作用するSTINGリガンドなどのSTINGリガンドとから構成されるペプチドI/O複合体は、本明細書では「ペプチド-STINGリガンド複合体」と称する場合がある。STINGは、ウイルス感染に対する自然免疫の重要な要素であり、サイトゾルのdsDNA(ウイルスシグナル)に応じてI型IFNの産生を調節することができる。STINGは、細胞質酵素cGAS(パターン認識受容体(PRR)によって生成され得る環状ジヌクレオチド(例えば、Kato et al.(J Interferon Cytokine Res.2017 May;37(5):207-213))に開示される2’,3’-cGAMP)と反応することができる。STINGは、ERに付随して細胞質中に存在し得るタンパク質であり、dsDNAを放出するウイルスによる細胞の感染に応じたI型IFNなどの炎症性サイトカインの産生の主要な調節因子と考えられている。細胞質内のdsDNAの存在は、cGASを刺激して環状ジヌクレオチド(CDN)の合成を触媒することができる。この分子は、2’3’-cGAMPと呼ばれ、Kato et al.(J Interferon Cytokine Res.2017 May;37(5):207-213)に記載されるように他のホスホジエステル結合の組み合わせを含むcGAMP分子よりも大幅に高い親和性でSTINGと結合することができる。2’,3’-cGAMPは、STINGをトリガーしてIRF3及びNF-kBシグナル伝達を活性化することができる。2’,3’-cGAMPはSTINGの生理学的リガンドになり得るが、他の環状ジヌクレオチドも活性を示す。図7は、Kato et al.(J Interferon Cytokine Res.2017 May;37(5):207-213)に提供される、I/Oとして本開示のいずれかのペプチドと複合体化することができる上記のSTINGリガンドを示す。STINGは核周囲小胞体(ER)に付随して位置し、活性化されるとゴルジ体に移行することができる。いくつかの実施形態では、STINGリガンドは、抗PDL1チェックポイント阻害剤との相乗作用を有することができる。いくつかの実施形態では、STINGリガンドは、エフェクターCD8+T細胞媒介性抗腫瘍活性を促進する。いくつかの実施形態では、T細胞媒介性抗腫瘍活性の相乗作用及び促進は、インターフェロン分泌を介するなど、STINGリガンドの間接的活性によるものであり得る。2’3’-cGAMPが非常に強力なそのSTINGリガンドである腫瘍内環状ジヌクレオチドは、腫瘍退縮の誘導に効果的であると考えられる。いくつかの実施形態では、STINGリガンドは、IRF3及びNFKBをトリガーすることができ、腫瘍細胞及びインフラマソームアセンブリによるI型IFN及び他の炎症性サイトカインの産生をもたらす(IL-1/IL-18分泌を含む)。いくつかの実施形態では、STINGリガンドは、腫瘍細胞由来のDNAのDCによる取り込み後の骨髄細胞によるインターフェロン分泌及び共刺激性リガンド発現を活性化することにより、腫瘍特異的エフェクターT細胞応答を促進することができる。STINGリガンドはがんのマウスモデルにおいて強力な抗腫瘍活性を有し、いくつかの強力なヒトSTINGリガンドが臨床試験にまで進んでいる(Vargas et al,Eur J Cancer 75:86-97(2017))。STINGはまた、cGASを刺激してcGAMPを生成することによって間接的にも刺激され得る。cGAMPは、細胞質中のdsDNAを長さに依存して検出する。cGASは、細胞質内のmtDNAだけでなく、細菌またはウイルス病原体に由来する短い(20bp)または50bp以上のdsDNAに最もよく反応する。cGASリガンドはsstDNAを含み、これは、
CAGACGGGCACACACTACTTGAAGCACTCAAGGCAAGCTTTATTGAGGCTTAAGCAGTGGGTTCCCTAGT(配列番号1513)または
CAGGGGGGACCACTCTTAAGCCTCAAGGCAAGCTTTGTTGAGGCTTAAGAGTGGTCCCGGGT(配列番号1514)または
CAGGGGGGCACACACTACTTGAAGCACTCAAGGCAAGCTTTGTTGAGGCTTAAGCAGTGGGTTCCCGGGT(配列番号1515)
などのHIV感染の際に生じるもののような一本鎖のステムループ構造である(Herzner 2015)。
環状ジヌクレオチド(CDN)は、RIG-I及びMDA5リガンドと同様、細胞内区画にアクセスできないために治療効果が低くなり得るSTINGリガンドである。CDNの配合物は、マウスモデルにおいて抗腫瘍免疫応答の活性化を促進し(Fu et al.,Sci Transl Med.2015 Apr 15;7(283):283ra52)、低い細胞膜透過性及び代謝不安定性を有し、そのため、医療へのその応用は限定され得る。したがって、細胞のエクトヌクレオチドピロホスファターゼ/ホスホジエステラーゼ(ENPP1)の分解に耐性を有する新規CDNを生成するために、薬化学的な取り組みが行われている(Li et al.(Nat Chem Biol.2015 Sep;11(9):741)及びLiouxら(J Med Chem.2016 Nov 23;59(22):10253-10267))。いくつかの実施形態では、Li et al.(Nat Chem Biol.2015 Sep;11(9):741)及びLioux et al.(J Med Chem.2016 Nov 23;59(22):10253-10267)に開示されるCDNを、本開示の任意のペプチドとのI/Oとして使用することができる。ナノ粒子またはリポソームによるCDNの送達はインビボでの抗腫瘍活性を向上させることができる(Hanson et al.,J Clin Invest.2015 Jun;125(6):2532-46)。さらに、ヒトSTINGの単一のS162A置換はDMXAA感度を付与することができる(Gao et al.Cell.2013 Aug 15;154(4):748-62)。いくつかの実施形態では、本開示のSTINGリガンドは、Gao et al.(Cell.2013 Aug 15;154(4):748-62)に開示されるようなDMXAA類似体とすることができる。G10、または4-(2-クロロ-6-フルオロベンジル)-N-(フラン-2-イルメチル)-3-オキソ-3,4-ジヒドロ-2H-ベンゾ[b][1,4]チアジン-6-カルボキサミドは、STING特異的アゴニストである可能性がある。本開示のI/Oは、ヒト線維芽細胞においてアルファウイルスに対する抗ウイルス応答を誘導することができる(Sali et al.(PLoS Pathog.2015 Dec 8;11(12):e1005324))。いくつかの実施形態では、G10、または4-(2-クロロ-6-フルオロベンジル)-N-(フラン-2-イルメチル)-3-オキソ-3,4-ジヒドロ-2H-ベンゾ[b][1,4]チアジン-6-カルボキサミドは、Sali et al.(PLoS Pathog.2015 Dec 8;11(12):e1005324)に開示されるように、STINGリガンドである可能性がある。いくつかの実施形態では、本開示のSTINGリガンドは、Li et al.(Nat Chem Biol.2015 Sep;11(9):741)に開示されるように、ホスホロチオエート結合を有するものとして開発された加水分解耐性を有する類似体とすることができる。例えば、Li et al.(Nat Chem Biol.2015 Sep;11(9):741)に報告されているように、酵素エクトヌクレオチドピロホスファターゼ/ホスホジエステラーゼ(ENPP1)は、細胞、組織抽出物、及び血液中の主要な2’3’-cGAMPヒドロラーゼである可能性がある。これらの結合を2’-5’及び3’-5’ホスホジエステル結合のいずれかまたは両方の代わりに用いることができる(2’3’-cGMP)。二重置換類似体は、活性であると同時に加水分解に耐性を有し得る。図8は、Li et al.(Nat Chem Biol.2015 Sep;11(9):741)に提供される、I/Oとして本開示のいずれかのペプチドと複合体化することができる例示的なCDNを示す。いくつかの実施形態では、本開示のSTINGリガンドは、Lioux et al.(J Med Chem.2016 Nov 23;59(22):10253-10267)に記載されるように、1個のアデノシンヌクレオシドと1個のイノシンヌクレオシド(cAIMP)を含み得る。類似体は、糖(リボース、2’-デオキシリボース、または2’-フルオロ-2’-デオキシリボース)、ヌクレオチド間の結合位置(2’,2’;2’,3’;3’,3’;または3’,2’)、リン酸修飾(ビスホスホジエステルまたはビスホスホロチオエート)、またはそれらの組み合わせにおいて異なり得る。図9は、Lioux et al.(J Med Chem.2016 Nov 23;59(22):10253-10267)に提供される、I/Oとして本開示のいずれかのペプチドと複合体化することができる例示的なCDNを示す。いくつかの実施形態では、本開示のSTINGリガンドは、Liu et al.(Antiviral Res.2017 Nov;147:37-46)に記載されるような、ジスピロジケトピペルジン(DSDP)とすることができる。図10は、Liu et al.(Antiviral Res.2017 Nov;147:37-46)に提供される、I/Oとして本開示のいずれかのペプチドと複合体化することができる例示的なDSDP STINGリガンドを示す。いくつかの実施形態では、本開示のSTINGリガンドは、本明細書に参照によりその全容を援用するところの米国特許第9,724,408号に記載されるようなcGAMPの合成類似体とすることができる。図11は、米国特許第9,724,408号に提供される、I/Oとして本開示のいずれかのペプチドと複合体化することができる例示的なcGAMPの合成類似体を示す。
糖(リボース、2’-デオキシリボース、または2’-フルオロ-2’-デオキシリボース)、及びヌクレオチド間の結合位置(2’,2’;2’,3’;3’,3’;または3’,2’)、及びリン酸修飾(ビスホスホジエステルまたはビスホスホロチオエート)において異なるcAIMPの類似体が上記の論文及び特許において試験されている。表7は、Lioux et al.(J Med Chem.2016 Nov 23;59(22):10253-10267)からの引用であり、図9にも示される試験化合物において糖の変化が生じる位置を示す。
Figure 0007386161000101
上記の類似体はいずれも、STINGをアゴナイズするI/Oである。類似体9、10、23、51、54、及び55は、2’,3’-cGAMPと同等の活性を示し、類似体13、52、53、56は、2’,3’-cGAMPよりも強力であり得る。
STINGは細胞内で活性であることから、本開示は、ペプチドが腫瘍微小環境にホーミング、分布、ターゲティング、移動、プロセシング、または蓄積することができるか、またはペプチドが、細胞に透過することが可能であるようなペプチド-STINGリガンド複合体を提供する。いくつかの実施形態では、ペプチドは、エンドソームまたはリソソームを含む細胞内区画を継続して通過することができ、STINGが存在することができるトランスゴルジ領域に達することができる。いくつかの実施形態では、ペプチド-STINGリガンド複合体は、本開示のペプチドに化学的に結合することができる。例えば、ペプチドとSTINGリガンドI/Oとは切断可能なリンカーによって連結することができるため、リンカーは、細胞内に入ると選択的に切断され、それにより、STINGリガンドが高い濃度で放出されて細胞内STINGにターゲティングされる。リンカーは、サイトゾルの還元的環境またはエンドソーム/リソソーム経路の還元的環境によって切断され得るジスルフィド結合であってもよく、酵素的に切断可能なものとして、サイトゾルまたはエンドソーム/リソソーム経路の酵素によって切断されてもよく、または酸に不安定であってもよく、それにより、リンカーはエンドソーム-リソソーム経路の酸性環境中で切断され得る。いくつかの実施形態では、ペプチド-STINGリガンド複合体は、安定的なリンカーによって連結することができる。いくつかの実施形態では、ペプチド-STINGリガンド複合体は、複合体として活性であってもよく、または活性な代謝産物に異化されてもよい。他の実施形態では、ペプチド-STINGリガンド複合体は共配合することができる。いくつかの実施形態では、ペプチド-STINGリガンド複合体は、リポソームなどの送達ビヒクル中に配合することができる。他の実施形態では、STINGリガンドをリポソームに封入することができ、これを本開示のペプチドでさらにコーティングすることができる。
Figure 0007386161000102
Figure 0007386161000103
E. MDA5、TLR、またはRLRリガンドを含むI/O
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示のペプチドと複合体化されたMDA5リガンド、TLRリガンド、またはRLRリガンドを含むI/Oを提供する。いくつかの実施形態では、上記のリガンドのいずれもアゴニストとして作用する。ペプチドとMDA5リガンドとから構成されるペプチドI/O複合体は、本明細書では「ペプチド-MDA5リガンド複合体」と称する場合がある。ペプチドとTLRリガンドとから構成されるペプチドI/O複合体は、本明細書では「ペプチド-TLRリガンド複合体」と称する場合がある。ペプチドとRLRリガンドとから構成されるペプチドI/O複合体は、本明細書では「ペプチド-RLRリガンド複合体」と称する場合がある。
RIG-IとMDA5とは関連する細胞質センサータンパク質である。これらはいずれもRNAヘリカーゼであり、リガンドの特異性に関与するC末端領域と、MAVS介在型シグナル伝達を可能とする2個のN末端のCARDドメインを有している。どちらもdsRNA二本鎖構造を認識できるが、RIG-Iは一部のdsRNAの5’末端のリン酸基も認識することができる(Wu 2013)。MDA5はポリI:Cのような二本鎖RNAを認識できるが、RIG-Iとは異なり、MDA5は、5’三リン酸、リボースの5’キャップの2’-O-メチル化、またはどちらも必要としない。上記の表6は、本開示の例示的なMDA5リガンドを含む例示的なI/Oも列挙してるが、これらの配列は、5’三リン酸(5’ppp)、5’二リン酸(5’pp)、5’一リン酸(5’p)、またはリボースの5’キャップの2’-O-メチル化、または上記のいずれか1つ以上を含まない。いくつかの実施形態では、MDA5リガンドは、5’三リン酸を欠くか、リボースの5’キャップの2’-O-メチル化を欠くか、またはその両方を欠く。ポリI:CもTLR3のリガンドであり、したがってTLR3 I/Oである。TLR3は、二本鎖RNAに対するエンドソームセンサーとして機能することができる。RIG-IまたはMDA5のリガンド結合はMAVS依存性シグナル伝達経路の活性化をもたらし、抗ウイルス免疫及び抗腫瘍免疫につながり(Elion 2018)、I型IFNを含む炎症性物質の産生を引き起こすが、これはTLR3の活性化によって誘導される遺伝子発現とは異なり得る。RIG-IまたはMDA5の活性化はさらにインフラマソームの活性化をもたら、IL-1、IL-18、及びDAMPSの分泌など、抗腫瘍免疫を促進する腫瘍微小環境の変化をもたらす。ポリI:CがTLR3ではなくMDA5をターゲティングするようにトランスフェクトされると、マウスの抗腫瘍免疫が効果的に増強され得る(Bhoopathi 2014)。TLR3以外に、TLR7、TLR8、TLR10を含む他のTLRが、dsRNA、ssRNA、及びRNA分解産物を検知するエンドソーム及びリソソームに存在する(Miyake 2018)。TLR9はエンドソームにも存在し、非メチル化CpGオリゴデオキシヌクレオチドを認識できる。TLR7及びTLR8は、パピローマウイルスいぼの局所治療に用いられるレシキモド(R-848)及びイミキモド合成イミダゾキノリン化合物などのアゴニストとして機能する小分子リガンドに結合する。小分子TLR8アゴニストであるモトリモドは、がん治療にも使用できる(Ferris 2018,Dang 2018)。いくつかの実施形態では、本開示は、エンドリソソームTLRファミリーのリガンドを含むI/Oを提供し、このTLRリガンドを本開示のペプチドと複合体化してペプチド-TLRリガンド複合体を形成することができる。かかるペプチド-TLRリガンド複合体は、TLRのアゴニストとして作用し得る。
おそらくはウイルス感染経路においてエンドサイトーシスが共通して用いられているために、他のRNA及びDNA検知TLRもエンドソームに存在する可能性がある。MDA5リガンドI/O(ペプチド-MDA5リガンド複合体)またはTLR I/O(ペプチド-TLRリガンドI/O))を含むI/Oを有するものなどの本開示のペプチドI/O複合体によるエンドサイトーシス経路のターゲティングを用いてこれらのTLR経路を活性化することができる。
いくつかの実施形態では、本開示は、本開示のペプチドと複合体化されるI/Oとして、RLR及びTLRの両方を活性化するRLRリガンドを提供する。本明細書に開示されるペプチドI/O複合体のエンドソームへの進入は、エンドソームに存在するTLRのターゲティングを可能にする。さらに、ペプチド-核酸結合体のエンドソームからの放出を促進する能力により、細胞質のRLRのターゲティングが可能となり得る。本明細書に開示されるペプチドI/O複合体中のI/OとしてのRLRリガンドは、単一の薬剤によってRLRだけでなく、1つ以上のTLRをターゲティングすることができることから、ペプチドI/O複合体のシグナル伝達及び応答を大幅に増強することができる。免疫応答の増強は、細胞質RLRによって媒介されるMAVS依存性シグナル伝達経路、ならびにエンドソームTLRによって媒介されるTRIF/TICAM及びMyD88依存性シグナル伝達経路を含む、TLR及びRLRによって利用される個別のシグナル伝達経路の調節または活性化の組み合わせによって引き起こされると考えられる(Matsumoto 2017)。複数のシグナル伝達経路の調節または活性化の組み合わせは、さらなる免疫エフェクター細胞を動員し、抗腫瘍免疫応答を増幅することができる。TLRリガンド及びRLRリガンドなどのこれらの核酸リガンドは、アポトーシス及び免疫の誘導などの抗ウイルス応答も促進する。活性化または刺激された場合の同じ抗ウイルス免疫系機構は、本開示のペプチドI/O複合体のI/Oとして作用することにより、腫瘍細胞を殺滅するのにも有効である。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドI/O複合体のI/Oとして作用するRNAリガンドは、RIG-1またはMDA5、またはエンドソームのRNA検知TLRまたはRLRを活性化する。場合によっては、エンドソームTLRのみがトリガーされる。本開示のペプチド-MDA5 I/Oリガンドの分子設計は、本明細書に記載される(例えば、RIG-Iについて)任意の設計要素、例えば、安定的で、切断可能な、疎水性または親水性の、RNA長及び改変、及び細胞質への送達のための細胞透過性を与える改変、ならびにエンドソーム取り込みまたはエンドソーム脱出ペプチドなどを含むことができる。
RIG-Iは、RNA配列とは無関係に、10塩基対以上(Schmidt 2009)の短い、平滑な5’末端及び非修飾ヌクレオチドを有する5’二リン酸または三リン酸dsRNAを最も効率的に認識することができる(Uchikawa 2016)。MDA5はdsRNAを認識し、末端ではなくステムに結合すると考えられており、特定のRNA末端構造を必要とない(Wu 2012)。MDA5は12量体のdsRNAに結合し、15量体はATP加水分解を刺激することが示されている。RNAの長さが長くなるにしたがって、高い活性を有するMDA5の繊維状オリゴマーが形成される。5’三リン酸のないポリ(I:C)は、MDA5を活性化することができ、15~39塩基対の長さである場合にはMDA5は活性化するがTLR3は活性化しない場合がある。TLR3も、好ましくは少なくとも40塩基対の長さのポリ(I:C)に反応する。
結合、融合、及びプロセシング
本開示によるペプチドは、腫瘍の治療に使用するために、ペプチド生物薬剤またはアミノ酸を含む他の剤(例えば、抗体または抗体フラグメント、受容体または受容体フラグメント、リガンドまたはリガンドフラグメント、ホルモンまたはホルモンフラグメント、成長因子及び成長因子フラグメント、生物毒素及びそのフラグメント、またはペプチドの他の活性部分)と結合または融合させることができる。ペプチドI/O複合体は、本明細書に記載される任意の機構によってI/Oに結合されたペプチドであり得る。例えば、ペプチドをI/Oに共有結合によって結合させてペプチドI/O複合体を形成することができる。ペプチドをI/Oに化学的に結合させてペプチドI/O複合体を形成することができる。ペプチドはまた、分子のI/Oまたは他の部分と会合させることにより非共有結合的に複合体化することで2つの剤を一体とすることができる。ペプチドとI/Oとは、融合タンパク質として発現させることでペプチドI/O融合タンパク質を形成することができる。例えば、抗体またそのフラグメントまたはサイトカインとペプチドとを融合タンパク質として発現させることでペプチドI/O融合タンパク質を形成することができる。例えば、特定の実施形態では、本明細書に記載されるペプチドは、抗がん活性を与えるI/Oなどの別の分子と融合することができる。ペプチドは、ペプチドの配列をI/Oの配列と共に含むベクターの発現によってI/Oと融合することができる。異なる実施形態において、ペプチドの配列とI/Oの配列とは、同じオープンリーディングフレーム(ORF)から発現される。異なる実施形態において、ペプチドの配列とI/Oの配列とは、連続した配列を構成することができる。当該技術分野では周知のさまざまなベクター及び組換え系を用いてそのような融合ペプチドを作製することができる。ペプチドとI/Oとは、別々に発現される場合のそれらの機能的能力と比較して、融合ペプチド中でそれぞれ同様の機能的能力を保持することができる。いくつかの実施形態では、I/Oは、ペプチドI/O複合体のペプチドから切断、プロセシング、または解離されるまでの間、不活性または低活性であってよい。ペプチドI/O複合体のペプチドから切断、プロセシング、及び/または解離された活性またはより高活性の薬物は、本明細書では「切断されたI/O」と称する場合がある。ペプチドI/O複合体からのI/Oの切断、プロセシング、及び/または解離は、腫瘍微小環境中または細胞内で生じ得る。さらなる態様では、ペプチドI/O複合体は、低pH、還元剤、グルタチオン、プロテアーゼ、酵素によって切断されるか、または加水分解に不安定である切断可能なリンカーによって接続されることにより、切断されたI/Oを生成する。いくつかの態様では、切断されたI/OのI/O部分は、ペプチドに結合されたI/Oと比較して化学的に修飾されている。他の態様において、切断されたI/OのI/O部分は、ペプチドに結合されたI/Oと比較して化学的に修飾されていない。いくつかの態様において、切断されたI/Oは、切断前のペプチドI/O複合体中のI/Oとは、切断後の効力または活性が異なる。同様に、ペプチドの活性は、腫瘍微小環境中または細胞内におけるI/Oとの切断、プロセシング、または解離の際に変化または低下し得る。例えば、ペプチドI/O複合体のペプチドは、エンドソーム、リソソーム内で、または、細胞質への送達後に、酵素によって、または化学的に、切断、除去、分解、プロセシング、または解離され得る。切断は、本開示のリンカー内またはペプチド内で、またはI/O剤内で、またはペプチドI/O複合体の任意の位置で生じ得る。ペプチドとI/Oとは、リポソームまたはナノ粒子の内部及び/またはその表面上などで配合により複合体化することもできる。
リンカー
腫瘍にホーミング、ターゲティング、移動し、腫瘍によって保持され、腫瘍に蓄積、透過、及び/または結合し、腫瘍によってプロセシングされ、または腫瘍に誘導されるか、または腫瘍細胞に透過もしくは進入する本開示によるペプチドは、小分子、第2のペプチド、タンパク質、サイトカイン、サイトカイン-受容体鎖複合体、抗体、抗体フラグメント、アプタマー、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、二本鎖(ds)DNAまたはRNA、一本鎖DNAまたはRNA、マイクロRNA、siRNA、パンハンドルRNA、ヘアピンRNA、環状ジヌクレオチド、フルオロフォア、放射性同位体、放射性核種キレート剤、ポリマー、バイオポリマー、脂肪酸、アシル付加物、化学リンカー、または糖、または本明細書に記載の他のI/Oまたは他の活性剤などの別の部分(例えば、本開示の任意のI/Oまたは任意の他の活性剤)と、とリンカーを介して、またはリンカーなしで直接、結合させることができる。
ペプチドは、共有結合によって別の分子と直接結合することができる。例えば、ペプチドは、より大きなポリペプチドまたはペプチド分子のアミノ酸配列の末端に結合するか、またはリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン酸、非天然アミノ酸残基、またはグルタミン酸残基の側鎖などの側鎖に結合することができる。ペプチドはまた、例えば、3’末端、5’末端において、またはアミンやスルフヒドリル基などの化学ハンドルを有する修飾ヌクレオチド塩基を含む、配列内の残基の1つにおいて、ポリヌクレオチドに結合させることもできる。ペプチドは、環状ジヌクレオチドの窒素、酸素、炭素、または硫黄原子などで環状ジヌクレオチドに結合することもできる。結合は、アミド結合、エステル結合、チオエステル結合、ホスホエステル結合、ホスホジエステル結合、ホスホジエステル結合のジチオ類似体、エーテル結合、カルバメート結合、カーボネート結合、炭素-窒素結合、トリアゾール、大環状分子、オキシム結合、ヒドラゾン結合、炭素-炭素の一重、二重もしくは三重結合、ジスルフィド結合、またはチオエーテル結合を介したものとすることができる。結合はまた、非共有結合複合体または可逆的共有結合、例えば、シス-ジオールとのフェニルボロン酸複合体を介して、またはイオン性もしくは疎水性相互作用を介したものでもよい。いくつかの実施形態では、開示されたペプチド(複数可)自体の類似の領域(例えば、アミノ酸配列の末端、リシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン酸の側鎖などのアミノ酸側鎖)、非天然アミノ酸残基、またはグルタミン酸残基、アミド結合、エステル結合、チオエステル結合、ホスホエステル結合、ホスホジエステル結合、ホスホジエステル結合のジチオ類似体、エーテル結合、カルバメート結合、炭酸結合、炭素-窒素結合、トリアゾール、大環状分子、オキシム結合、ヒドラゾン結合、炭素-炭素の一重、二重もしくは三重結合、ジスルフィド結合、チオエーテル結合、非共有結合もしくは可逆共有結合リンカー、または任意の本明細書に記載される他のリンカー)を使用して、他の分子を連結するか、または本明細書に記載される任意のI/Oに連結することができる。
リンカーを介した結合には、他の分子とペプチドとの間へのリンカー部分の組み込みが含まれ得る。ペプチドと他の分子とは両方ともリンカーに共有結合によって結合することができる。リンカーは、切断可能、安定的、自己犠牲、親水性、または疎水性のものであり得る。切断可能なリンカーは、秒単位、分単位、時間単位、日単位、または週単位にわたって切断され得る。安定的なリンカーは切断されないか、極めてゆっくりと切断されるか、または異化作用によって分解され得る。リンカーは、一方がペプチドに結合し、他方が他の分子に結合した少なくとも2個の官能基と、2個の官能基間の連結部分とを有することができる。
結合のための官能基の非限定的な例としては、アミド結合、エステル結合、チオエステル結合、ホスホエステル結合、ホスホジエステル結合、ホスホジエステル結合のジチオ類似体、エーテル結合、カーボネート結合、カルバメート結合、炭素-窒素結合、トリアゾール、大環状分子、オキシム結合、ヒドラゾン結合、炭素-炭素の一重、二重もしくは三重結合、ジスルフィド結合、またはチオエーテル結合を形成することが可能な官能基が挙げられる。そのような結合を形成することができる官能基の非限定的な例としては、アミノ基;カルボキシル基;ヒドロキシル基;アルデヒド基;アジド基;アルキン及びアルケン基;ケトン;ヒドラジド;酸フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物などの酸ハロゲン化物;対称、混合、及び環状無水物を含む酸無水物;炭酸塩;シアノ、スクシンイミジル、N-ヒドロキシスクシンイミジルなどの脱離基に結合されたカルボニル官能基;マレイミド;加水分解するように設計されたマレイミド基を含むリンカー;マレイミドカプロイル;MCC([N-マレイミドメチル]シクロヘキサン-1-カルボキシレート);N-エチルマレイミド;マレイミドアルカン;mc-vc-PABC;DUBA(デュオカルマイシンヒドロキシベンズアミド-アザインドールリンカー);SMCCスクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート;SPDP(N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート);SPDB N-スクシンイミジル-4-(2-ピリジルジチオ)ブタノエート;スルホ-SPDB N-スクシンイミジル-4-(2-ピリジルジチオ)-2-スルホブタノエート;SPP N-スクシンイミジル4-(2-ピリジルジチオ)ペンタノエート;ジチオピリジルマレイミド(DTM);ヒドロキシルアミン、ビニルハロ基;ハロアセトアミド基;ブロモアセトアミド;ヒドロキシル基;スルフヒドリル基;及び、例えば、ハライド、メシレート、トシレート、トリフレート、エポキシド、リン酸エステル、硫酸エステル、及びベシレートなどの、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリル、またはベンジル脱離基を有する分子が挙げられる。
連結部分の非限定的な例としては、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ポリエチレングリコール(PEG)などのポリエーテル、ヒドロキシカルボン酸、オリゴエチレングリコール、ポリエステル、ポリアミド、ポリアミノ酸、両性イオン性ポリペプチド、ポリペプチド、GGGS(配列番号1170)、GGGSGGGS(配列番号1171)、(GGGS)(配列番号1172)(ただしx=1~10)などのG及びSから構成されるポリペプチド、Pro、Ala、及びSer、切断可能なペプチド、バリン-シトルリン(Val-Cit)(配列番号1142)、Phe-Lys(配列番号1143)、Val-Lys(配列番号1140)、Val-Ala(配列番号1139)、Val-Lys(配列番号1140)、Val-Arg(配列番号1141)、Met-Lys(配列番号1144)、Asn-Lys(配列番号1145)、Ile-Pro(配列番号1146)、Gly-Ile(配列番号1147)、Gly-Leu(配列番号1148)、Gly-Tyr(配列番号1149)、Met-Ile(配列番号1151)、Ala-Ile(配列番号1152)、Pro-Ile(配列番号1153)、Glu-Glu、Glu-Gly、Gly-Phe-Leu-Gly(配列番号1497)、配列番号1139~配列番号1161、配列番号1360~配列番号1363及び配列番号1365のうちの任意のペプチドを含むポリペプチド、Doroninaetal.,2008に示されるような他のペプチドリンカー、β-グルクロニダーゼなどのグルクロニダーゼにより切断可能なリンカー、カテプシンにより、またはカテプシンB、D、E、H、L、S、C、K、O、F、V、X、もしくはWにより切断可能なリンカー、MMP-1、2、7、9、もしくは13などのマトリックスメタロプロテアーゼにより切断可能なリンカー、ヒアルロニダーゼにより切断可能なリンカー、Val-Cit-p-アミノベンジルオキシカルボニル、グルクロニド-MABC、アミノベンジルカルバメート、D-アミノ酸、及びポリアミンが挙げられ、これらのいずれも、非置換であるか、または、ハロゲン、ヒドロキシル基、スルフヒドリル基、アミノ基、ニトロ基、ニトロソ基、シアノ基、アジド基、スルホキシド基、スルホン基、スルホンアミド基、カルボキシル基、カルボキシアルデヒド基、イミン基、アルキル基、ハロアルキル基、アルケニル基、ハロアルケニル基、アルキニル基、ハロアルキニル基、アルコキシ基、アリール基、アリールオキシ基、アラルキル基、アリールアルコキシ基、ヘテロシクリル基、アシル基、アシルオキシ基、カルバメート基、アミド基、ウレタン基、エポキシド、荷電基、両性イオン性基、及びエステル基などの任意の数の置換基により置換される。分子同士を連結する反応の他の非限定的な例としては、クリックケミストリー、銅フリーのクリックケミストリー、HIPSライゲーション、シュタウディンガーライゲーション、及びヒドラジン-イソ-ピクテ-スペングラーが含まれる。
ペプチドとI/Oとは、式:A-B-Cで記述されるリンカーを介して結合することができる。Aは、ペプチド及びリンカー上のアミンまたはカルボン酸への安定的なアミド結合であり、テトラフルオロフェニル(TFP)エステル、NHSエステル、またはATT基(チアゾリジン-チオン)を介して得ることができる。Aは、ペプチド上のアミンを、CDIとリンカー上のヒドロキシルとの反応によって形成されたイミダゾールカルバメート活性中間体と反応させることによって形成されるものなどの安定的なカルバメートリンカーであってよい。Aは、リンカー上のアルデヒドまたはケトン基によるペプチド上のアミンの還元的アルキル化によって形成されるものなどの安定的な第2級アミン結合であってよい。Aは、リンカー中のマレイミドまたはブロモアセトアミドをペプチド中のチオールとともに用いて形成される安定的なチオエーテルリンカー、トリアゾールリンカー、安定的なオキシムリンカー、またはオキサカルボリンリンカーであってよい。Bは、(-CH2-)x-、分岐の有無にかかわらず、短いPEG(-CHCHO-)(xは1~20)、またはGGGSGGGS(配列番号1171)のような短いポリペプチド 、Val-Ala(配列番号1139)、Val-Cit(配列番号1142)、Val-Cit-PABC、Gly-Ile(配列番号1147)、Gly-Leu(配列番号1148)、他のスペーサーを含むことができるか、またはスペーサーを含まなくともよい。Cは、I/O上のチオール、アミン、ヒドロキシル、またはカルボン酸に対するジスルフィド結合、アミド結合、カルバメート、炭素-炭素一重、二重もしくは三重結合、またはエステル結合であってよい。Cは、リンカー上のマレイミドとI/O上のスルフヒドロイルとの間に形成されるチオエーテル、第2級または第3級アミン、カルバメート、または他の安定的な結合であってよい。いくつかの実施形態では、Cは、リンカーの「切断可能な」または「安定」な部分を指すことができる。他の実施形態では、A及び/またはBも、「切断可能な」または安定な部分であり得る。いくつかの実施形態において、Aは、アミド、カルバメート、マレイミドまたはブロモアセトアミドを介したチオエーテル、トリアゾール、オキシム、またはオキサカルボリンであり得る。“Current ADC Linker Chemistry,” Jain et al.,Pharm Res,2015 DOI 10.1007/s11095-015-1657-7またはGreg HermansonによるBioconjugate Techniques,3rd editionに記載されるいずれのリンカー化学も用いることができる。
いくつかの実施形態では、ペプチド結合体は、安定的なリンカーを有することができる。本開示のペプチドは、組換えによって発現させるかまたは化学合成することができる。ペプチドは、アミド結合またはカルバメート結合などの安定的なリンカーを介して、検出可能な薬剤、活性薬剤、またはI/Oに結合させることができる。ペプチドは、標準的な1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)またはジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)に基づく化学、または塩化チオニルもしくは塩化リンに基づくバイオコンジュゲーション化学を用いて、アミド結合などの安定的なリンカーを介して、検出可能な薬剤、活性薬剤、またはI/Oと結合することができる。
得られたペプチド結合体は、ヒトまたは動物に、皮下、静脈内、筋肉内、皮内、経口投与するか、または腫瘍もしくは腫瘍微小環境(腫瘍内)もしくは臓器内に直接注入もしくは適用することにより疾患を治療することができる。ペプチドは、標的とされる機構を介して、検出可能な薬剤、活性薬剤、またはI/Oから特異的に切断されてもよいし、されなくてもよい。ペプチドは、異化などの機構によって分解され、その「天然」または最初の形態から改変されるかまたは改変されていない薬物を放出することができる(Antibody-Drug Conjugates:Design,Formulation,and Physicochemical Stability,Singh, Luisi,and Pak.Pharm Res(2015)32:3541-3571)。ペプチド薬物結合体は、インタクトな状態で、または部分的もしくは完全に分解、代謝、もしくは異化された状態でその薬理活性を示す。ペプチド結合体は、I/Oが切断後にのみ活性となるかまたは切断後にさらに活性となるように設計することができるか、または、ペプチド結合体は、I/Oがペプチドに結合している間、I/Oが活性であるように設計することもできる。
切断可能な結合の周囲の切断速度は、炭素長(-CH2-)x、立体障害またはその欠如(メチル、エチル、環状基などの隣接する側基、ならびにG、A、またはSなどのアミノ酸を含むことができるペプチド性スペーサーなどの隣接するスペーサーを含む)、親水性(ヒドロキシル、カルボン酸、またはオリゴエチレングリコール基の付加など)、または疎水性(フッ素、炭化水素基、または脂肪尾部の付加など)、電子吸引基または電子供与基の付加を含む、結合の周囲の局所環境を変化させることによって変化させることができる。いくつかの実施形態では、切断速度は、局所的なpHによって影響され得る。
切断は、異なる機構によって、体内または細胞内の異なる場所で生じ得る。切断は、エンドソーム、リソソーム、または腫瘍などの病変組織中の低pHのような低pH環境ではより高い速度で生じ得る。より低いpHで切断可能な特定の結合としては、エステル、カルバメート、カーボネート、ヒドラゾン、オキシム、及びフェニルボロン酸とcis-ジオールの間の可逆的な共有結合複合体が挙げられる。切断は、還元的環境またはジスルフィド交換によって生じる場合もある。サイトゾル、エンドソーム、リソソーム、腫瘍微小環境、及び細胞表面はいずれも還元的であり得るか、またはジスルフィド交換のための物質(グルタチオン、アルブミン、またはシステイン残基など)を与えることができる。切断は、エステラーゼ、カテプシン、マトリックスメタロプロテイナーゼ、ペプシノーゲン、ゼラチナーゼ、エラスターゼ、トリプシン、プラスミノーゲン活性化因子、グルクロニダーゼ、またはヒアルロニダーゼなどによって酵素的に生じ得る。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、腫瘍微小環境、腫瘍細胞表面、細胞の細胞質、またはエンドソームもしくはリソソームなどの細胞内区画に送達されたときにのみ、または選択的に切断され得る。これらの酵素は、腫瘍微小環境、細胞表面、エンドソーム-リソソーム経路、またはサイトゾルに、より高い濃度で存在し得る。pABCなどの自己犠牲基を含めることにより、切断時に遊離の非修飾薬物を放出させることができる(Antibody-Drug Conjugates: Design, Formulation, and Physicochemical Stability,Singh,Luisi,and Pak.Pharm Res (2015) 32:3541-3571)。リンカーの切断速度は、腫瘍内の結合体またはペプチドI/O複合体の滞留時間に応じて調整することができる。例えば、ペプチドまたはペプチドI/O複合体が比較的速やかに腫瘍から除去される場合、リンカーが速やかに切断されるように調整することができる。対照的に、例えば、ペプチドまたはペプチドI/O複合体が腫瘍内でより長い滞留時間を有する場合、切断速度をより遅くすることで、I/Oの送達を延ばすことができる。これは、ペプチドまたはペプチドI/O複合体が薬剤またはI/Oを腫瘍に送達する目的で使用される場合に重要となり得る。
リンカーの非限定的な例としては、以下のものが挙げられる。すなわち、
Figure 0007386161000104

Figure 0007386161000105

(ただし、各nは独立して、0~約1,000、1~約1,000、0~約500、1~約500、0~約250、1~約250、0~約200、1~約200、0~約150、1~約150、0~約100、1~約100、0~約50、1~約50、0~約40、1~約40、0~約30、1~約30、0~約25、1~約25、0~約20、1~約20、0~約15、1~約15、0~約10、1~約10、0~約5、または1~約5である)。いくつかの実施形態では、各nは、独立して0、約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、約25、約26、約27、約28、約29、約30、約31、約32、約33、約34、約35、約36、約37、約38、約39、約40、約41、約42、約43、約44、約45、約46、約47、約48、約49、約50である)、またはJain, N., Pharm Res. 32(11): 3526-40 (2015) もしくはDucry, L., Antibody Drug Conjugates (2013)に開示されるような任意のリンカー。いくつかの実施形態では、mは、1~約1,000、1~約500、1~約250、1~約200、1~約150、1~約100、1~約50、1~約40、1~約30、1~約25、1~約20、1~約15、1~約10、または1~約5である。いくつかの実施形態では、mは、0、約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、約25、約26、約27、約28、約29、約30、約31、約32、約33、約34、約35、約36、約37、約38、約39、約40、約41、約42、約43、約44、約45、約46、約47、約48、約49、または約50である。
いくつかの実施形態では、リンカーは、I/Oを非修飾の形で放出することができる。他の実施形態では、I/Oは、化学修飾により放出され得る。さらに他の実施形態では、リンカー及び/またはペプチドの一部に依然として連結されているI/Oを異化によって放出させることができる。
切断可能なリンカーは、ペプチドからI/Oを放出することができる。例えば、ペプチドとの結合体の形のI/O(すなわちペプチドI/O複合体)は最初は活性ではない場合があるが、腫瘍にターゲティングされた後に結合体から放出されると、例えば、ペプチドをRNAの5’三リン酸領域または機能に不可欠なI/Oの他の部分に結合させることなどにより、I/Oは活性となることができる。これにより、体内の腫瘍以外の部位におけるI/Oによる副作用を減らすことができる。あるいは、安定的なリンカーは、細胞内での異化後の活性な切断産物の放出を依然可能とし得る。あるいは、I/Oは、ペプチドI/O複合体のペプチドにまだ結合している場合に活性であってもよく、またはペプチドは、腫瘍微小環境中、細胞表面上、またはサイトゾル中のI/Oの局所濃度を増加させるように機能することもできる。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、例えば、Greg T. Hermanson(2013)によるBioconjugate Techniquesに記載されているものなどの当該技術分野では周知の一般的な方法によって、I/Oに結合することができる。
リンカーの選択は、本開示のI/Oの標的に基づいて行うことができる。例えば、I/Oが、リンカーが還元され得るエンドソーム/リソソーム経路または細胞質にターゲティングされる場合、切断可能なジスルフィド結合を用いることができる。リンカーが低pHのために切断され得るエンドソーム/リソソーム経路または腫瘍微小環境一般にI/Oがターゲティングされている場合には、切断可能なヒドラゾンまたはエステル結合またはボロン酸ジオール複合体を用いることができる。I/Oが、エンドソーム/リソソーム経路、細胞外細胞表面、腫瘍微小環境一般、または細胞質にターゲティングされている場合には、リンカーは酵素切断可能(例えば、カテプシンまたはMMPにより)としてもよい。
さらに、ペプチドI/O複合体は異なる比で設計することができる。例えば、I/Oは複数のペプチドと複合体化される場合がある。例えば、複数のペプチドを、それらの間にスペーサー(複数可)を配置した鎖としてNまたはC末端でIL-15超アゴニストと融合するか、またはアゴニストの複数の位置に融合することができる。別の例では、複数のI/Oを、ペプチドのN末端及びLys残基などで1つのペプチドと複合体化することができる。I/Oとペプチドとのさまざまな比は、配合によっても得られる。例えば、いくつかの実施形態では、ペプチドI/O複合体中のI/Oとペプチドとの比は、0.05:1~20:1であり得る。
ペプチドの安定性
本開示のペプチドは、さまざまな生物学的条件において安定であり得る。例えば、配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のいずれのペプチドも、還元剤、プロテアーゼ、酸化条件、または酸性条件に対する耐性を示すことができる。
特定の場合では、生物学的分子(ペプチドやタンパク質など)が治療機能を与えることができるが、そのような治療機能は、インビボ環境によって引き起こされる不安定性によって低下または妨害される。(Moroz et al.Adv Drug Deliv Rev 101:108-21 (2016),Mitragotri et al.Nat Rev Drug Discov 13(9):655-72 (2014),Bruno et al.Ther Deliv (11):1443-67 (2013),Sinha et al.Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.24(1):63-92 (2007),Hamman et al.BioDrugs 19(3):165-77 (2005))。例えば、消化管は、低pH(例えば、pH約1)の領域、還元的環境、またはペプチド及びタンパク質を分解し得るプロテアーゼが豊富な環境を含み得る。口、目、肺、鼻腔内、関節、皮膚、膣道、粘膜、腫瘍組織、及び血清など、身体の他の領域のタンパク質分解活性も、機能的に活性なペプチド及びポリペプチドの送達を妨げ得る。さらに、血清中のペプチドの半減期は、プロテアーゼに一部起因して極めて短くなる場合があり、その結果、ペプチドは急速に分解されて、妥当な投与計画を投与した場合に持続的な治療効果を得ることができない。同様に、リソソーム、エンドソーム、またはゴルジ装置などの細胞区画におけるタンパク質分解活性、ならびにリソソーム、エンドソーム、またはゴルジ装置及びサイトゾルにおける還元活性は、ペプチド及びタンパク質を分解し、これらが細胞内の標的に治療機能を与えられなくなる可能性がある。したがって、還元剤、プロテアーゼ、及び低pHに耐性のあるペプチドは、向上した治療効果を与えるか、またはインビボで共配合または結合されたI/Oの治療効果を高める可能性がある。
さらに、薬物の経口送達は、この投与方法によって提示される機能的に活性なペプチド及びポリペプチドの送達に対する障害にもかかわらず、身体の特定の領域(例えば、結腸癌などの消化管の疾患)をターゲティングするうえで望ましい場合がある。薬物の経口送達は、非経口送達と比較して患者が服用するのにより便利な剤形を提供することにより、コンプライアンスを高めることができる。経口送達は、治療ウィンドウが大きい治療計画で有用であり得る。したがって、還元剤、プロテアーゼ、及び低pHに耐性のあるペプチドは、治療機能を無効にすることなくペプチドの経口送達を可能とする。例えば、特定の小分子I/O(例えば、STINGまたはRIG-Iアゴニストとして作用するSTINGリガンドまたはRIG-IリガンドI/O)は、本開示のいずれかのペプチドと(ペプチドI/O複合体を作製するために)結合させることによって改善することができ、これにより、経口送達用に最適化される。
還元剤に対するペプチドの耐性。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、還元に対する耐性を有することができる。本開示のペプチドは、ペプチドがフォールディングした状態を維持するうえで欠かせないジスルフィド架橋に関与し得る1個以上のシステインを含むことができる。ペプチドを還元物質を含む生物学的環境に曝すとペプチドがアンフォールドし、機能と生物活性が失われ得る。例えば、グルタチオン(GSH)は、身体の多くの領域及び細胞に存在し得る、かつジスルフィド結合を還元することができる還元物質である。別の例として、ペプチドは、経口投与後にペプチドが消化管上皮を通過して輸送される際に細胞に内在化されると還元され得る。ペプチドは、消化管のさまざまな部分への曝露時に還元され得る。消化管は還元的環境であり得るため、ジスルフィド結合の還元により、ジスルフィド結合を有する治療用分子が最適な治療効果を発揮する能力を阻害し得る。ペプチドはまた、エンドソームまたはリソソームによる内在化後などの細胞への進入時、またはサイトゾルまたは他の細胞区画への進入時にも還元され得る。ジスルフィド結合の還元及びペプチドのアンフォールディングは、機能の喪失につながるか、またはバイオアベイラビリティー、ピーク血漿濃度、生物活性、及び半減期などの重要な薬物動態パラメータに影響を及ぼし得る。ジスルフィド結合の還元によって、ペプチドはプロテアーゼによるその後の分解も受けやすくなり、投与後のインタクトなペプチドの急速な消失につながり得る。いくつかの実施形態では、還元に対する耐性を有するペプチドはインタクトな状態に維持され、より容易に還元されるペプチドと比較して、身体のさまざまな区画及び細胞内でより長期間にわたって機能的活性を与えることができる。。
特定の実施形態では、本開示のペプチドは、還元剤に対する耐性の特性について分析することで安定なペプチドを同定することができる。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、0.00001M~0.0001M、0.0001M~0.001M、0.001M~0.01M、0.01M~0.05M、0.05M~0.1M、といった異なるモル濃度の還元剤に15分以上曝された後もインタクトな状態に維持され得る。いくつかの実施形態では、ペプチドの安定性を決定するために使用される還元剤は、ジチオスレイトール(DTT)、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィンHCl(TCEP)、2-メルカプトエタノール、(還元型)グルタチオン(GSH)、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、ペプチドの少なくとも5%~10%、少なくとも10%~20%、少なくとも20%~30%、少なくとも30%~40%、少なくとも40%~50%、少なくとも50%~60%、少なくとも60%~70%、少なくとも70%~80%、少なくとも80%~90%、または少なくとも90%~100%は、還元剤への曝露後にインタクトな状態に維持される。
プロテアーゼに対するペプチド耐性。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、プロテアーゼ分解に対する耐性を有することができる。本開示のペプチドの安定性は、プロテアーゼによる分解に対する耐性によって測定することができる。プロテアーゼは、ペプチダーゼまたはプロテイナーゼとも呼ばれ、隣接するアミノ酸間の結合を切断することによってペプチド及びタンパク質を分解することができる酵素であり得る。特定のアミノ酸をターゲティングとする特異性を有するプロテアーゼのファミリーには、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、エステラーゼ、血清プロテアーゼ、及びアスパラギンプロテアーゼが含まれ得る。さらに、メタロプロテアーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ、エラスターゼ、カルボキシペプチダーゼ、チトクロームP450酵素、及びカテプシンもペプチド及びタンパク質を消化することができる。プロテアーゼは、血液、粘膜、肺、皮膚、消化管、口、鼻、目、及び細胞の区画内に高濃度で存在し得る。プロテアーゼの誤調節もまた、関節リウマチ及び他の免疫障害ならびにがんなどのさまざまな疾患に存在し得る。プロテアーゼによる分解は、治療用分子のバイオアベイラビリティー、生体内分布、半減期、及び生物活性を低下させ、治療用分子の治療機能を発揮できなくし得る。いくつかの実施形態では、プロテアーゼに対する耐性を有するペプチドは、インビボで合理的に許容される濃度で治療活性をより良好に与えることができる。
いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、いずれのクラスのプロテアーゼによる分解にも抵抗することができる。特定の実施形態では、本開示のペプチドは、ペプシン(胃に見出される)、トリプシン(十二指腸に見出される)、血清プロテアーゼ、またはそれらの任意の組み合わせによる分解に抵抗する。特定の実施形態では、本開示のペプチドは、肺プロテアーゼ(例えば、セリン、システイニル、及びアスパルチルプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、好中球エラスターゼ、α1アンチトリプシン、分泌性ロイコプロテアーゼ阻害剤、エラフィン)、またはそれらの任意の組み合わせによる分解に抵抗することができる。いくつかの実施形態では、ペプチド安定性を測定するために使用されるプロテアーゼは、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、ペプチドの少なくとも5%~10%、少なくとも10%~20%、少なくとも20%~30%、少なくとも30%~40%、少なくとも40%~50%、少なくとも50%~60%、少なくとも60%~70%、少なくとも70%~80%、少なくとも80%~90%、または少なくとも90%~100%は、プロテアーゼへの曝露後にインタクトな状態に維持される。
酸性条件におけるペプチドの安定性。本開示のペプチドは、酸性の生物学的環境で投与することができる。例えば、経口投与後、ペプチドは胃及び消化(GI)管の胃液中の酸性の環境条件に曝され得る。胃のpHは約1~4の範囲であり得るが、消化管のpHは酸性~通常の生理的pHの範囲であり、消化管上部から結腸に向かって低下している。さらに、膣、後期エンドソーム、リソソーム、及び腫瘍の微小環境も、pH7.4未満のように酸性pH値を有し得る。これらの酸性条件は、ペプチド及びタンパク質をアンフォールドした状態に変性させ得る。ペプチド及びタンパク質のアンフォールディングは、他の酵素によるその後の消化を受けやすくするばかりでなく、ペプチドの生物活性の喪失につながり得る。
特定の実施形態では、本開示のペプチドは、酸性条件、及び酸性条件を再現する緩衝液中での変性及び分解に抵抗することができる。特定の実施形態では、本開示のペプチドは、1未満のpH、2未満のpH、3未満のpH、4未満のpH、5未満のpH、6未満のpH、7未満のpH、または8未満のpHを有する緩衝液中での変性または分解に抵抗することができる。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、1~3のpHでインタクトな状態に維持される。特定の実施形態では、ペプチドの少なくとも5%~10%、少なくとも10%~20%、少なくとも20%~30%、少なくとも30%~40%、少なくとも40%~50%、少なくとも50%~60%、少なくとも60%~70%、少なくとも70%~80%、少なくとも80%~90%、または少なくとも90%~100%は、1未満のpH、2未満のpH、3未満のpH、4未満のpH、5未満のpH、6未満のpH、7未満のpH、または8未満のpHの緩衝液への曝露後にインタクトな状態に維持される。他の実施形態では、ペプチドの少なくとも5%~10%、少なくとも10%~20%、少なくとも20%~30%、少なくとも30%~40%、少なくとも40%~50%、少なくとも50%~60%、少なくとも60%~70%、少なくとも70%~80%、少なくとも80%~90%、または少なくとも90%~100%は、1~3のpHの緩衝液への曝露後にインタクトな状態に維持される。他の実施形態では、本開示のペプチドは、模擬胃液(pH1~2)中での変性または分解に抵抗し得る。いくつかの実施形態では、ペプチドの少なくとも5%~10%、少なくとも10%~20%、少なくとも20%~30%、少なくとも30%~40%、少なくとも40%~50%、少なくとも50%~60%、少なくとも60%~70%、少なくとも70%~80%、少なくとも80%~90%、または少なくとも90%~100%は、模擬胃液への曝露後にインタクトな状態に維持される。いくつかの実施形態では、模擬胃液またはクエン酸緩衝液などの低pH溶液を使用してペプチドの安定性を測定することができる。
高温でのペプチドの安定性。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、高温に対する耐性を有する。本開示のペプチドは、高温の生物学的環境で投与することができる。例えば、経口投与後、ペプチドは体内で高温に曝され得る。体温は36℃~40℃の範囲であり得る。高温は、ペプチド及びタンパク質をアンフォールドした状態に変性させ得る。ペプチド及びタンパク質のアンフォールディングは、他の酵素によるその後の消化を受けやすくするばかりでなく、ペプチドの生物活性の喪失につながり得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、25℃から100℃の温度でインタクトな状態に維持され得る。高温はペプチドの分解を早める可能性がある。高温での安定性は、熱帯環境または冷蔵へのアクセスが制限されている地域でのペプチドの保管を可能とする。特定の実施形態では、ペプチドの5%~100%は、25℃への6ヶ月~5年間の曝露後にインタクトな状態に維持され得る。ペプチドの5%~100%は、70℃への15分~1時間の曝露後にインタクトな状態に維持され得る。ペプチドの5%~100%は、100℃への15分~1時間の曝露後にインタクトな状態に維持され得る。他の実施形態では、ペプチドの少なくとも5%~10%、少なくとも10%~20%、少なくとも20%~30%、少なくとも30%~40%、少なくとも40%~50%、少なくとも50%~60%、少なくとも60%~70%、少なくとも70%~80%、少なくとも80%~90%、または少なくとも90%~100%は、25℃への6ヶ月~5年間の曝露後にインタクトな状態に維持される。他の実施形態では、ペプチドの少なくとも5%~10%、少なくとも10%~20%、少なくとも20%~30%、少なくとも30%~40%、少なくとも40%~50%、少なくとも50%~60%、少なくとも60%~70%、少なくとも70%~80%、少なくとも80%~90%、または少なくとも90%~100%は、70℃への15分~1時間の曝露後にインタクトな状態に維持される。他の実施形態では、ペプチドの少なくとも5%~10%、少なくとも10%~20%、少なくとも20%~30%、少なくとも30%~40%、少なくとも40%~50%、少なくとも50%~60%、少なくとも60%~70%、少なくとも70%~80%、少なくとも80%~90%、または少なくとも90%~100%は、100℃への15分~1時間の曝露後にインタクトな状態に維持される。
ペプチドの薬物動態
本開示の任意のペプチドの薬物動態を、異なる投与経路を介したペプチドの投与後に決定することができる。例えば、本開示のペプチドの薬物動態パラメータは、静脈内、皮下、筋肉内、直腸内、エアロゾル、非経口、眼内、肺内、経皮、膣内、視神経、鼻腔、経口、舌下、吸入、皮膚、くも膜下腔内、鼻腔内、腫瘍内、関節内、腹腔内、頬側、滑膜、臓器内、または局所投与後に定量することができる。本開示のペプチドは、放射性標識またはフルオロフォアなどの追跡剤を使用することによって分析することができる。例えば、本開示の放射性標識ペプチドは、さまざまな投与経路を介して投与することができる。血漿、尿、糞便、任意の臓器、皮膚、筋肉、及び他の他の組織などのさまざまな生体試料中のペプチド濃度または用量回復は、HPLC、蛍光検出技術(TECAN定量、フローサイトメトリー、iVIS)または液体シンチレーションカウンティングなどの広範な方法を使用して測定することができる。
本明細書に記載される方法及び組成物は、対象への任意の経路を介したペプチド投与の薬物動態学に関連し得る。薬物動態は、方法及びモデル、例えば、コンパートメントモデルまたは非コンパートメント法を使用して記述することができる。コンパートメントモデルとしては、これらに限定されるものではないが、1コンパートメントモデル、2コンパートメントモデル、マルチコンパートメントモデルなどが含まれる。モデルは異なるコンパートメントに分割でき、対応するスキームにより記述することができる。例えば、1つのスキームは吸収、分布、代謝及び排泄(ADME)スキームである。別の例として、別のスキームは、遊離、吸収、分布、代謝及び排泄(LADME)スキームである。いくつかの態様において、代謝及び排泄は、排泄コンパートメントと呼ばれる1つのコンパートメントに分類することができる。例えば、遊離は、組成物の活性部分の送達システムからの遊離を含むことができ、吸収は、対象による組成物の活性部分の吸収を含み、分布は、血漿を介した異なる組織への組成物の分布を含む。代謝は、組成物の代謝または不活化を含み、最後に、排泄は、組成物または組成物の代謝産物の排泄または排出を含む。対象に静脈内投与される組成物には、多相性薬物動態プロファイルが適用され、これには、組織分布及び代謝/排泄の側面が含まれるが、それらに限定されない。このように、組成物の血漿または血清濃度の低下は、しばしば例えばα相及びβ相を含む二相性であり、時折γ、δまたは他の相が観察される。
薬物動態学は、対象へのペプチドの投与に関連する少なくとも1つのパラメータを決定することを含む。いくつかの態様では、パラメータには、少なくとも用量(D)、投与間隔(τ)、曲線下面積(AUC)、最大濃度(Cmax)、次の用量が投与される前に到達した最小濃度(Cmin)、最小時間(Tmin)、Cmaxに到達するまでの最大時間(Tmax)、分布体積(V)、定常状態の分布体積(Vss)、時間0における逆外挿濃度(C)、定常状態濃度(Css)、排出速度定数(k)、注入速度(kin)、クリアランス(CL)、バイオアベイラビリティー(f)、変動(%PTF)、及び排出半減期(t1/2)が含まれる。
特定の実施形態では、配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のいずれのペプチドも、経口投与後に最適な薬物動態パラメータを示す。他の実施形態では、配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のいずれのペプチドも、経口投与、吸入、鼻腔内投与、局所投与、非経口投与、静脈内投与、皮下投与、腫瘍内、関節内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、経皮投与、皮膚投与、またはそれらの任意の組み合わせなどの任意の投与経路後に最適な薬物動態パラメータを示す。
いくつかの実施形態では、配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のいずれのペプチドにおいても、平均Tmaxは、0.5~12時間、または1~48時間であり(そこでCmaxに到達する)、経口経路で対象にペプチドを投与した後の対象の血清中平均バイオアベイラビリティーは、0.1%~10%であり、消化管への送達のための対象への経口投与後の血清中平均バイオアベイラビリティーは、0.1%未満であり、非経口投与後の血清中の平均バイオアベイラビリティーは、10~100%であり、対象へのペプチドの投与後の対象における平均t1/2は、0.1時間~168時間、または0.25時間~48時間であり、対象へのペプチドの投与後の平均クリアランス(CL)は、ペプチド0.5~100L/時、または0.5~50L/時であり、対象にペプチドを全身投与した後の、または場合により全身の取り込みがない場合の対象における平均分布体積(V)は、200~20,000mLであり、またはこれらの任意の組み合わせであった。
製造方法
さまざまな発現ベクター/宿主系を、本明細書に記載されるペプチド、ペプチドI/O複合体、またはI/Oの組換え発現の製造に利用することができる。そのような系の非限定的な例としては、本明細書に記載されるペプチドまたはペプチド融合タンパク質/キメラタンパク質またはタンパク質をコードする核酸配列を含む組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNAまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌などの微生物、上記の核酸配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母、上記の核酸配列を含む組換えウイルス発現ベクター(例えば、バキュロウイルス)を感染させた昆虫細胞系、上記の核酸配列を含む組換えウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)、タバコモザイクウイルス(TMV))を感染させるかもしくは組換えプラスミド発現ベクター(例えば、Tiプラスミド)で形質転換された植物細胞系、または、安定的に増幅された(例えば、CHO/dhfr、CHO/グルタミンシンセターゼ)もしくは二重微小染色体で不安定に増幅された(例えば、マウス細胞株)上記の核酸配列の複数のコピーを含むように操作された細胞株を含む、組換えウイルス発現ベクター(例えば、アデノウイルス、ワクシニアウイルス)に感染させた動物細胞系が挙げられる。ペプチドのジスルフィド結合の形成及びフォールディングは、発現中または発現後、あるいはその両方で生じ得る。
宿主細胞は、本明細書に記載される1つ以上のペプチドもしくはタンパク質、またはペプチドI/O複合体を発現するように適合することができる。宿主細胞は原核細胞または真核細胞であってよく、昆虫細胞を含む。場合により、宿主細胞は、所望の特定の様式で挿入された配列の発現を調節することができ、または遺伝子またはタンパク質産物を修飾及びプロセシングすることができる。例えば、特定のプロモーターからの発現を、特定のインデューサー(例えば、メタロチオニンプロモーターにおける亜鉛及びカドミウムイオン)の存在下で上昇させることができる。場合により、ペプチド産物の修飾(例えば、リン酸化及びグリコシル化)及びプロセシング(例えば切断)がペプチドの機能にとって重要な場合がある。宿主細胞は、ペプチドの翻訳後プロセシング及び修飾のための特性及び特定の機構を有することができる。場合により、ペプチドを発現させるために使用される宿主細胞は、分泌するタンパク質分解酵素の量が最小限である。
細胞に基づくまたはウイルスに基づく試料の場合、生物を精製前に処理して、標的ポリペプチドを保存及び/または放出することができる。いくつかの実施形態では、細胞は固定剤を用いて固定される。いくつかの実施形態では、細胞は溶解される。細胞材料は、大部分の細胞を破壊しないが、細胞材料の表面から、及び/または細胞間の隙間からタンパク質を除去するような形で処理することができる。例えば、細胞材料を液体バッファーに浸漬するか、または植物材料の場合では、真空にかけることで細胞間空間及び/または植物細胞壁中に存在するタンパク質を除去することができる。細胞材料が微生物である場合、タンパク質を微生物培養培地から抽出することができる。あるいは、ペプチドを封入体に充填することもできる。封入体は、培地中の細胞成分からさらに分離することができる。いくつかの実施形態では、細胞は破壊されない。細胞またはウイルスによって提示される細胞性またはウイルス性ペプチドを、インタクトの細胞またはウイルス粒子の付着及び/または精製に使用することができる。あるいは、ペプチドまたはタンパク質を細胞から培地中に分泌させてもよい。組換え系以外に、ペプチド及びポリペプチドは、タンパク質及びペプチド合成に使用されるさまざまな既知の技術を使用して無細胞系で合成することもできる。
場合により、宿主細胞は、薬物の結合点を有するペプチドを産生する。結合点は、リシン残基、N末端、システイン残基、システインジスルフィド結合、または非天然アミノ酸を含み得る。非天然アミノ酸を合成により、または組換え法により組み込むことができる。
ペプチドは、例えば固相ペプチド合成法または液相ペプチド合成法などによる合成によって生成することもできる。ペプチド合成は、例えばFmoc固相ペプチド合成法(“Fmoc solid phase peptide synthesis,a practical approach,” edited by W.C.Chan and P.D.White, Oxford University Press,2000)に従って、フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)化学によって、またはブチルオキシカルボニル(Boc)化学によって行うことができる。ペプチドは、合成中もしくは合成後またはその両方でフォールディング(ジスルフィド結合の形成など)することができ、例えば、切断及び保護基の除去及び精製の後、または樹脂上にある間に、還元型及び酸化型のシステインまたはグルタチオンなどの酸化還元対の存在下、弱塩基性pHでペプチドをインキュベートすることによって行うなど、当該技術分野では周知の方法で行うことができる。ペプチドフラグメントを、酵素的にまたは合成または組換えにより生成し、その後、合成により、組換えにより、または酵素によって互いに連結することができる。
他の態様では、本開示のペプチドは、従来の液相ペプチド合成によって調製することができる。
米国特許第9,279,149号に記載される方法を用いてRNAポリヌクレオチドを作製することもでき、参照により本明細書に援用する。いくつかの実施形態では、RNAポリヌクレオチドは、酵素/PCR法によって合成される。例えば、RNAポリヌクレオチドは、RNAヌクレオチドを3’末端に付加することができるヌクレオチジルトランスフェラーゼ(例えば、E.coliポリ(A)ポリメラーゼまたはE.coliポリ(U)ポリメラーゼ)などの酵素を使用して合成することができる。あるいは、E.coliポリ(U)ポリメラーゼを使用することもできる。3’末端がブロックされていない可逆的ターミネーターリボヌクレオチド三リン酸(rNTP)を、ポリヌクレオチド合成時に使用することができる。あるいは、3’ブロック、2’ブロック、または2’-3’ブロックされたrNTPを、上記のいずれかの酵素と共に使用することもできる。RNAポリヌクレオチドは、標準的な固相合成法及びホスホロアミダイトを用いた方法を使用して合成することもできる。本開示のRNAポリヌクレオチドは、従来の固相オリゴヌクレオチド合成によって調製することができる。例えば、これらに限定されるものではないが、いずれも本明細書に参照により援用するところの、https://www.atdbio.com/content/17/Solid-phase-oligonucleotide-synthesis、及びAlbericio(Solid-Phase Synthesis: A practical guide,CRC Press,2000)、Lambert et al.(Oligonucleotide Synthesis:Solid-Phase Synthesis,DNA,DNA Sequencing,RNA,Small Interfering RNA,Nucleoside,Nucleic Acid,Nucleotide,Phosphoramidite,Sense,Betascript Publishing,2010)、及びGuzaev,A.P.et al.(Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry.2013;53:3.1:3.1.1-3.1.60.)に示されるような記載された方法を含む任意の固相合成法を用いることができる。CPGまたはポリスチレンなどの固体支持体を使用することができる。ホスホロアミダイト化学反応は、以下のステップ、すなわち、支持体に結合させた3’ヌクレオシドの脱トリチル化、活性化及びカップリング、キャッピング、及び酸化のサイクルを繰り返して用いることができる。合成の最後に、保護されたヌクレオチドを支持体から切断し、その後脱保護することができる。RNAポリヌクレオチドの固相合成に用いられる保護基には、t-ブチルジメチルシリル(TBDMS)またはトリ-イソ-プロピルシリルオキシメチル(TOM)が含まれ得る。RNAポリヌクレオチドは、安定性を高めるために修飾された骨格を有してもよい。さらに、非天然塩基または修飾塩基を使用して、その後の化学的結合のための固有の機能的ハンドルとして機能させることができる。いくつかの実施形態では、RNAの5’及び/または3’末端の修飾を行って、所望の官能基、安定性、または活性を与えることができる。いくつかの実施形態では、機能的ハンドルは、RNAの1つ以上の修飾ウリジン、修飾グアニシン、修飾シチジン、または修飾アデノシン塩基を含む修飾塩基を含む。そのような修飾塩基の例として、延長アミンを有するウリジンがある。
本開示のI/Oは、合成により、組換えにより、または小分子合成技術により作製することができる。本開示のペプチドは、合成により、または組換えにより作製することができる。ペプチドとI/Oとは、有機合成法により、組換え発現時のポリペプチド融合により、酵素によるライゲーションにより、配合により、または他の手段によって組み合わせることができる。
ペプチド及びペプチドI/O複合体の医薬組成物
本開示の医薬組成物は、本明細書に記載される任意のペプチドもしくはペプチドI/O複合体、またはその塩と、担体、安定化剤、希釈剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤、酸化防止剤、可溶化剤、緩衝剤、浸透圧調節剤、塩、界面活性剤、アミノ酸、カプセル化剤、増量剤、凍結保護剤、及び/または賦形剤などの他の化学成分との組み合わせとすることができる。医薬組成物は、本明細書に記載されるペプチドまたはペプチドI/O複合体の生物への投与を容易とする。医薬組成物は、例えば、静脈内、皮下、筋肉内、直腸、エアロゾル、非経口、眼内、肺内、経皮、膣内、点眼、経鼻、経口、舌下、吸入、皮膚、くも膜下腔内、鼻腔内、腫瘍内、関節内、局所投与、臓器内、またはそれらの組み合わせを含むさまざまな形態及び経路により、医薬組成物としての治療有効量で投与することができる。医薬組成物は、局所的または全身的に、例えば、本明細書に記載されるペプチドを臓器に直接、場合によりデポ剤として注射することにより投与することができる。
ボーラス注射または点滴用の非経口注射剤を配合することができる。医薬組成物は、油性または水性ビヒクル中の滅菌懸濁液、溶液またはエマルションとして非経口注射に適した形態とすることができ、懸濁化剤、安定化剤、及び/または分散剤などの配合剤を含むことができる。非経口投与用の医薬製剤には、水溶性形態の本明細書に記載のペプチドの水溶液が含まれる。本明細書に記載されるペプチドの懸濁液は、油性注射懸濁液として調製することができる。適当な親油性溶媒またはビヒクルとしては、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルまたはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームが挙げられる。水性注射懸濁液は、カロボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどの懸濁液の粘性を高める物質を含むことができる。懸濁液は、適当な安定化剤、または本明細書に記載のかかるペプチドの可溶性を高め、及び/またはかかるペプチドの凝集を低減することで高度に濃縮された溶液の調製を可能とする剤を含んでもよい。あるいは、本明細書に記載されるペプチドは、凍結乾燥するか、または適当なビヒクル、例えば無菌パイロジェンフリー水で使用前に戻すための粉末形態とすることもできる。いくつかの実施形態では、精製されたペプチドが静脈内投与される。
本開示のペプチドまたはペプチドI/O複合体は、外科的処置中に、脳もしくは脳組織またはがん細胞などの臓器、または臓器組織もしくは細胞に直接適用することができる。本明細書に記載の組換えペプチドは局所投与することができ、溶液、懸濁液、ローション、ゲル、ペースト、薬用スティック、バーム、クリーム、及び軟膏などのさまざまな局所投与可能な組成物中に配合することができる。かかる医薬組成物は、可溶化剤、安定化剤、張度増強剤、緩衝剤及び防腐剤を含むことができる。
本明細書で提供される治療または使用の方法を実施する際に、本明細書に記載される治療有効量のペプチドを、免疫系に影響する状態を有する対象に医薬組成物中で投与することができる。いくつかの実施形態では、対象は哺乳動物、例えばヒトである。治療有効量は、疾患の重症度、対象の年齢及び相対的健康状態、使用される化合物の効力、及び他の因子に応じて幅広く異なり得る。
医薬組成物は、賦形剤及び助剤を含む1つ以上の生理学的に許容される担体を使用して配合することができ、これにより、活性化合物を薬学的に使用可能な製剤に加工することが容易となる。配合は、選択される投与経路に応じて変更することができる。本明細書に記載のペプチドを含む医薬組成物は、例えば、組換え系でペプチドを発現させ、ペプチドを精製し、ペプチドを凍結乾燥し、混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、粉末化、乳化、カプセル化、封入、または圧縮プロセスによって製造することができる。医薬組成物は、少なくとも1つの医薬的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と、遊離塩基または医薬的に許容される塩の形態としての本明細書に記載される化合物とを含むことができる。
本明細書に記載の化合物を含む、本明細書に記載のペプチドまたはペプチドI/O複合体、またはその塩の調製方法は、本明細書に記載のペプチドを、1つ以上の不活性な薬学的に許容される賦形剤または担体と配合して固体、半固体、または液体組成物を形成することを含む。固体組成物としては、例えば、散剤、錠剤、分散性粒剤、カプセル剤、カシェ剤、及び坐剤が挙げられる。これらの組成物は、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝剤、及び他の薬学的に許容される添加剤などの少量の非毒性の補助物質も含むことができる。
薬学的に許容される賦形剤の非限定的な例は、例えば、いずれも参照によりその全容を援用するところの、Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Nineteenth Ed(Easton,Pa.:Mack Publishing Company,1995);Hoover,John E.,Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pennsylvania 1975;Liberman,H.A.and Lachman,L.,Eds.,Pharmaceutical Dosage Forms,Marcel Decker,New York,N.Y.,1980;及びPharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Seventh Ed.(Lippincott Williams & Wilkins1999)に見ることができる。
リポソームは、Stealth及び他のリポソームを含む、当該技術分野では周知の任意の方法によって調製することができる。リポソームの調製は、有機溶媒からの脂質の乾燥、水性媒体への液体の分散、及び必要に応じて超音波処理または押し出しを含む精製またはサイジングを含むことができる。リポソームは、機械的分散、固体分散、洗剤除去、(Akbarzadeh et al.Nanoscale Research Letters 2013,8:102)に開示されるいずれかの方法、または当該技術分野では周知の他の任意の方法を含む、受動的または能動的封入技術によって封入することができる。
がんの治療
本明細書で使用するところの「有効量」なる用語は、腫瘍に対する免疫応答及びがん細胞の減少または殺滅をもたらす、投与される薬剤または化合物の充分な量を指すことができる。その結果は、他のより毒性の高い治療法の必要性の減少、無増悪生存期間の改善、長期全生存期間の改善、進行速度の低下、転移の予防、生活の質の改善、寛解、完全寛解、部分寛解、症状の軽減、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。かかる薬剤または化合物を含む組成物は、予防的、増強的、及び/または治療的治療を行うために投与することができる。任意の個々の症例における適当な「有効」量は、用量漸増試験などの手法を用いて決定することができる。
本開示の方法、組成物、及びキットは、単独で、または他の治療と併用される場合に、状態の症状を予防、治療、抑止、逆転、または改善する方法を含むことができる。現在のがん治療は、手術及び放射線に加えて複数の薬剤の使用を伴う場合がある。さまざまな治療法の併用は、個々の薬剤よりも効果的で、完全な治癒につながり得る。併用は、免疫腫瘍学の分野において特に重要であり、補完的及び/または相乗的な組み合わせが知られている。併用は、個々の薬剤が明らかな効果を示さない場合に有効であり得る。例えば、ヒトのがんの治療では放射線を化学療法と併用することができる。マウスでも同様の効果がみられる(Dewan et al.,Clin Cancer Res.2012 Dec 15;18(24):6668-78)。放射線は、本開示のいずれのペプチドI/O複合体とも併用することができる。チェックポイント阻害剤であるPD1及びCTLA4に対する抗体は、最近承認された薬剤であり、互いに併用されて、また、他の薬剤と併用されて向上した治療効果を得ることができる。これは、マウス腫瘍モデルでみられる(Fallon 2017,Fu 2015)。上記のチェックポイント阻害剤に対する抗体は、本開示のいずれのペプチドI/O複合体とも併用することができる。TIM3、LAG3、KIRなどの研究されている他のチェックポイント阻害剤も、本開示の任意のペプチドI/O複合体と併用することができる。
本開示のペプチドI/O複合体は、I/Oの効力を高めるか、または治療ウィンドウを広げるように設計されている。I/O単独の併用で有効な治療は、ペプチドI/O複合体の併用でも有効となり得る。かかる治療の例としては、前臨床または臨床活性を示した併用療法が含まれ、IL-15スーパーアゴニストなどのIL-15剤と、抗PD-L1、抗CTLA-4、抗CD40、またはシクロホスファミドとの併用(Robinson and Schluns,Immunol Lett 190:159-168(2017));4-1BBリガンドと、IL-12、抗CTLA-4、抗PD-1、放射線、シスプラチン、5-フルオロウラシル、シクロホスファミド、セツキシマブ、リツキシマブ、またはトラスツズマブとの併用(Bartkowiak and Curran,Front Oncol 5:117(2015))、STINGリガンドと、ワクチン、放射線、5-フルオロウラシル、GM-CSF、または抗PD-1との併用(Vargas et al.,Eur J Cancer 75:86-97(2017))が挙げられる。他の新たな免疫療法の標的は、有効性を高め、及び/または毒性を低減するために本開示のペプチドI/O複合体と併用することができる臨床治療薬を創成することができる。これらには、B7x、HHLA2、及びB7-H3を含むB7ファミリーのメンバー;VISTA;CD27;OX40/OX40L;GITR;Tim-3;LAG-3;BTLA;及びIDOシンターゼが含まれる(Assal et al,Immunotherapy 7:1169-1186(2015))。本開示のペプチドI/O複合体は、単独で投与されるか、または、例えば、I/O、化学物質、生物学的薬剤、抗体、放射線治療薬、造影剤、診断薬、光増感剤、放射線増感剤、栄養素、化学療法、毒素、タンパク質、ペプチド、または、化学療法として一般的に認識されている以下のクラスの小分子化学療法薬、すなわち、アルキル化剤、トポイソメラーゼ阻害剤、マイクロチューブリン阻害剤、細胞毒性抗生物質、及び代謝拮抗剤などの他の治療薬、診断薬または造影剤と組み合わせて投与することができ(ペプチドI/O複合体に連結されるか、またはペプチドI/O複合体と共にペプチドに連結される診断薬または造影剤として使用されるかによらず)、かかる薬剤は、(治癒、改善、または予防につながる)治療効果等を目的とするかまたは治療効果を有するものである。本開示のペプチドI/O複合体は、単独で、または例えば、化学物質、放射性標識剤、放射線増感剤、フルオロフォア、造影剤、診断薬、タンパク質、ペプチド、または小分子などのコンパニオン診断薬または造影剤と組み合わせて投与することができ(かかる診断薬または造影剤がペプチドI/O複合体に連結されるか、またはペプチドI/O複合体と併用するためのペプチドに連結された別個のコンパニオン診断薬または造影剤として使用されるかどうかによらず)、かかる薬剤は診断または造影効果を目的とするかまたは有するものである。コンパニオン診断薬及びコンパニオン造影剤に使用される薬剤は、本明細書に記載される診断及び造影剤を含むことができる。診断テストを使用して、本明細書に開示されるような治療用製品の使用を強化することができる。画像診断(インビボまたはインビトロの)を用いるテストなど、対応する診断テストを有する治療用製品の開発は、診断、治療に役立ち、治療する患者集団を特定し、対応する治療の治療効果を高めることができる。テストはまた、FDAが規制の決定を行うために使用するデータを取得するための治療製品開発も支援する。例えば、このようなテストは、治療を行うための適切な部分母集団を特定したり、深刻な副作用のリスクが高いために特定の治療を受けるべきではない集団を特定することができ、これにより、応答する可能性が最も高い患者、または特定の副作用のリスクの程度が異なる患者を特定することにより、医療を個別化またはパーソナライズすることを可能とする。したがって、本開示は、いくつかの実施形態では、治療製品としてのペプチドI/O複合体の安全で効果的な使用と併せて使用される治療製品及び診断装置の共同開発を含む(ペプチドI/O複合体自体を検出するために使用されるか、またはコンパニオン診断薬または造影剤を検出するために使用され、かかる診断薬または造影剤がペプチドI/O複合体に連結されているか、ペプチドI/O複合体と併用するためにペプチドに連結された別のコンパニオン診断薬または造影剤として使用されているかによらない)。コンパニオン装置の非限定的な例としては、生物学的診断またはイメージングに使用されるか、またはX線ラジオグラフィー、磁気共鳴イメージング(MRI)、医療用超音波検査または超音波、内視鏡、弾性イメージング法、触覚イメージング、サーモグラフィー、医療用撮影術及び陽電子放射断層撮影法(PET)及び単一光子放射断層撮影(SPECT)としての核医療機能的イメージング法のイメージング技術を含む放射線医学を採り入れた、手術用顕微鏡、共焦点顕微鏡、X線透視スコープ、外視鏡、内視鏡、または外科用ロボット及び装置などの外科用器具が挙げられる。コンパニオン診断及び装置は、対象へのコンパニオン診断薬の投与後に切除された組織または細胞からのシグナルの検出、または対象からの切除後の組織または細胞にコンパニオン診断薬またはコンパニオン造影剤を直接適用した後、シグナルを検出することを含む、エクスビボで行われる試験を含み得る。エクスビボ検出に使用される装置の例としては、蛍光顕微鏡、フローサイトメーターなどが挙げられる。
本開示の方法、組成物、及びキットは、状態の症状を予防、治療、抑止、逆転、または改善する方法を含むことができる。治療は、対象(例えば、疾患または状態に罹患した個人または馴化動物、野生動物または実験動物)を本開示のペプチドで治療することを含み得る。疾患の治療において、ペプチドまたはペプチドI/O複合体は、対象の腫瘍に接触することができる。対象はヒトであってよい。対象は、ヒト;チンパンジーなどの非ヒト霊長類、または他の類人猿もしくはサルの種;ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタなどの家畜;ウサギ、イヌ、ネコなどの馴化動物;ラット、マウス、モルモットなどのげっ歯類を含む実験動物であってよい。対象は任意の年齢であってよい。対象は、例えば、高齢者、成人、青年期、青年期前、小児、幼児、乳児、または子宮内の胎児であってよい。
治療は、疾患の臨床的発症前に対象に与えることができる。治療は、疾患の臨床的発症後に対象に与えることもできる。治療は、疾患の臨床的発症の1日、1週間、6ヶ月、12ヶ月、または2年後、またはそれよりも後で対象に与えることができる。治療は、疾患の臨床的発症後、1日、1週間、1ヶ月、6ヶ月、12ヶ月、2年以上、またはそれよりも長い期間にわたって対象に与えることができる。治療は、疾患の臨床的発症後、1日、1週間、1ヶ月、6ヶ月、12ヶ月、または2年もしくは5年未満の期間で対象に与えることができる。治療には、臨床試験でのヒトの治療も含まれ得る。治療は、本開示の全体を通じて記載される医薬組成物の1つ以上のものなどの医薬組成物を対象に投与することを含み得る。治療は、1日1回の投与を含み得る。治療は、単回投与または2回投与を含み得る。治療は、週1回、隔週、または月1回の投与、または年に1~5回の投与を含み得る。治療は、非経口、静脈内、皮下、筋肉内、吸入、皮内、関節内注射、経口、くも膜下腔内、経皮、鼻腔内、腹腔経路のいずれかを介して、または例えば直接注入経路を介して腫瘍または腫瘍の微小環境に直接、ペプチドまたはペプチドI/O複合体を対象に投与することを含み得る。
いくつかの実施形態では、本開示は、がんまたは腫瘍を治療するための方法であって、治療を必要とする対象に有効量の本開示のペプチドまたはペプチドI/O複合体を投与することを含む方法を提供する。本開示のペプチドまたはペプチドI/O複合体で治療することができるがんまたは状態の一例として、固形腫瘍がある。本開示のペプチドまたはペプチドI/O複合体で治療することができるがんの別の例として、リンパ腫、白血病、及び血液悪性腫瘍などの液性腫瘍がある。本開示のペプチドまたはペプチドI/O複合体によって治療することが可能ながんまたは状態のさらなる例としては、トリプルネガティブ乳癌、乳癌、乳癌の転移、本明細書に記載される任意のがんの転移、結腸癌、結腸癌の転移、肉腫、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、カポジ肉腫などのAIDS関連癌、AIDS関連リンパ腫、中枢神経原発性リンパ腫、肛門癌、虫垂癌、小児型星状細胞腫、星状細胞腫、小児型非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍、中枢神経系非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍、非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍、基底細胞癌、皮膚癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、腫瘍のユーイング肉腫ファミリー、骨肉腫、軟骨腫、骨軟骨腫、原発性及び転移性骨癌、悪性線維性組織球腫、小児型脳幹神経膠腫、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、脳及び脊髄腫瘍、中枢神経系胚芽腫、小児型中枢神経系胚芽腫、中枢神経系胚細胞腫瘍、小児型中枢神経系胚細胞腫瘍、頭蓋咽頭腫、小児型頭蓋咽頭腫、上衣腫、小児型上衣腫、乳癌、気管支腫瘍、小児型気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、消化器癌、原発不明癌腫、心臓腫瘍、小児型心臓腫瘍、原発性リンパ腫、子宮頸癌、胆管癌、脊索腫、小児型脊索腫、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、結腸癌、結腸直腸癌、皮膚T細胞性リンパ腫、びまん性正中グリオーマ、非浸潤性乳管癌、胎児性腫瘍、子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、嗅神経芽細胞腫、小児型嗅神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、小児型頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、眼の癌、眼内メラノーマ、網膜芽細胞腫、卵管癌、骨の線維性組織球腫、胆嚢癌、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質細胞腫瘍、卵巣癌、睾丸癌、妊娠性絨毛性腫瘍、神経膠腫、多形性膠芽腫(GBM)、低悪性度グリオーマ、大脳神経膠腫症、毛様細胞性白血病、頭頸部癌、肝細胞癌、組織球症、ランゲルハンス細胞組織球症、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼内メラノーマ、黒色腫、黒色腫の転移、膵島細胞腫瘍、膵内分泌腫瘍、腎癌、腎細胞腫瘍、ウィルムス腫瘍、小児型腎腫瘍、口唇癌、肝臓癌、肺癌、髄芽腫、非ホジキンリンパ腫、マクログロブリン血症、原発性マクログロブリン血症、男性乳癌、メルケル細胞癌、原発不明の転移性頸部扁平上皮癌、NUT遺伝子が関与する正中線癌、口腔癌、多発性内分泌腺腫症、小児型多発性内分泌腺腫症、、多発性骨髄腫/形質細胞腫瘍、菌状息肉症、骨髄異形成症候群、骨髄異形成/骨髄増殖性腫瘍、多発性骨髄腫、骨髄増殖性腫瘍、慢性骨髄増殖性腫瘍、粘液乳頭状上衣腫、鼻腔及び副鼻腔癌、上咽頭癌、神経芽細胞腫、非小細胞肺癌、乏突起膠細胞腫瘍、混合星状細胞腫、中咽頭癌、卵巣癌、低悪性度腫瘍、膵癌、膵神経内分泌腫瘍、乳頭腫、小児型乳頭腫、傍神経節腫、副鼻腔及び鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、褐色細胞腫、咽頭癌、毛様細胞性星細胞腫、下垂体腫瘍、多形黄色星細胞腫(PXA)、胸膜肺芽腫、小児型胸膜肺芽腫、原発性腹膜癌、前立腺癌、直腸癌、妊娠関連癌、横紋筋肉腫、小児型横紋筋肉腫、唾液腺癌、セザリー症候群、小細胞肺癌、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、睾丸癌、咽頭癌、胸腺腫、胸腺癌、甲状腺癌、腎盂および尿管の移行細胞癌、子宮癌、尿道癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、膣癌、血管腫瘍、及び外陰癌が挙げられる。
特定の実施形態では、本開示のペプチドは、その機能の強さもしくは特異性を変化させるため、または機能を獲得もしくは欠失させるために、特定の組織(他の組織ではなく)にホーミング、分布、ターゲティング、移動、蓄積、または誘導されるように変異される。
いくつかの実施形態では、本開示は、がんを治療するための方法であって、治療を必要とする対象に有効量の本開示のペプチドまたはペプチドI/O複合体を投与することを含む方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、がんを治療するための方法であって、治療を必要とする患者に本開示のペプチドまたはペプチドI/O複合体と、薬学的に許容される担体とを含む有効量の医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、細胞の侵襲活性を阻害するための方法であって、有効量の本開示のペプチドまたはペプチドI/O複合体を対象に投与することを含む方法を提供する。
本明細書に記載される配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のいずれかの配列を含むペプチド、及び任意のペプチド誘導体またはペプチドI/O複合体を用いて、がん(例えば、脳腫瘍、乳癌、軟部組織肉腫、腎細胞癌、小細胞肺癌、結腸直腸癌、上部消化管癌、膵癌、前立腺癌、頭頸部扁平上皮癌、尿路上皮癌、卵巣癌、滑膜癌、膀胱癌、唾液腺癌、子宮癌、食道癌、胃癌、子宮頸癌、皮膚癌、骨肉腫、または他の任意の固形腫瘍)にターゲティングすることができる。本明細書に記載される配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のいずれかの配列を含むペプチド、及び任意のペプチド誘導体またはペプチドI/O複合体を用いて任意のがんにさらにターゲティングするか、または細胞内、必要に応じて細胞質、エンドソーム、または細胞内区画にI/Oの送達をターゲティングすることができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるペプチドは、対象のがん状態を治療する方法であって、配列番号1の配列を含む治療有効量のペプチドI/O複合体またはそのフラグメントを対象に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるペプチドは、対象のがん状態を治療する方法であって、配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のうちのいずれか1つのペプチドI/O複合体またはそのフラグメントを対象に投与することを含む方法を提供する。
本明細書に記載される毒または毒素由来のペプチド(複数可)、ペプチド、修飾ペプチド、標識ペプチド、ペプチドI/O複合体、及び医薬組成物は、治療的処置のために投与することができる。治療用途では、組成物は、既に疾患または状態を罹患している対象に、疾患または状態の症状を治療するかもしくは少なくとも部分的に抑止するうえで、または状態を治療、治癒、改善、もしくは緩和するうえで充分な量で投与することができる。本明細書に記載されるそのようなペプチドは、状態を、予防、すなわち発症、罹患、または増悪させる確率を(全体的または部分的に)低減するために投与することもできる。この使用に有効な量は、疾患または状態の重症度及び経過、以前の治療、対象の健康状態、体重、薬剤に対する反応、及び治療に当たる医師の判断に基づいて異なり得る。本明細書に記載される毒または毒素由来のペプチド(複数可)、ペプチド、修飾ペプチド、標識ペプチド、ペプチドI/O複合体、及び医薬組成物は、ペプチド、ペプチドI/O複合体、及び任意の結合体の局所送達のターゲティングされたホーミングを可能とする。例えば、IL-15剤、4-1BBリガンド、RIG-Iリガンド、及び/またはSTINGリガンドなどのI/Oと結合されるか、またはI/Oとの複合体(例えば、リポソーム製剤)として共配合されたペプチドは、I/Oの局所送達を可能とし、これは、従来のI/Oの全身的送達よりもはるかに効果的で毒性が低い。
一部のがんは、脳または中枢神経系(CNS)に発生し得る。I/Oなどのさまざまな治療薬は、血液脳関門(BBB)を通過することができず、または治療に適切な濃度でCNSに入ることができない。本開示のペプチドまたはその変異体はBBB透過性を有し得るものであり、CNS及び脳のがんにI/Oを送達することができる。あるいは、本開示のペプチドまたはその変異体は、I/Oへの曝露から脳を保護しつつ末梢腫瘍を治療するために非BBB透過性であってもよい。
キット
ペプチドまたはペプチドI/O複合体は、キットとしてパッケージングすることができる。いくつかの実施形態では、キットは、ペプチド、I/O、ペプチドI/O複合体、またはそれらの任意の組み合わせの使用または投与についての使用説明書を含む。
以下の実施例は、本開示のいくつかの実施形態をさらに説明するために含まれるものであり、本開示の範囲を限定するために使用されるべきではない。
実施例1
組換え発現によるペプチドの製造
本実施例では、組換え発現によるペプチドの製造について記載する。ペプチド配列を、標準的な分子生物学技術を使用してDNAに逆翻訳し、合成し、シデロカリンとインフレームでクローニングする。(M.R.Green,Joseph Sambrook.Molecular Cloning.2012 Cold Spring Harbor Press.)。得られたコンストラクトをレンチウイルスにパッケージングし、HEK293細胞にトランスフェクトし、増殖させ、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)で単離し、タバコエッチウイルスプロテアーゼで切断し、逆相クロマトグラフィーで均一になるまで精製する。精製後、各ペプチドを凍結乾燥し、冷凍保存する。
実施例2
ペプチドの合成による製造
本実施例では、ペプチドの合成による製造について記載する。ペプチド配列を、標準的なFmoc化学及び保護手法を用いた固相ペプチド合成法により合成した。合成後、ペプチドを樹脂から切断し、逆相クロマトグラフィーで精製する。酸化用の酸化還元対を使用して弱塩基性pHでインキュベーションすることによってペプチドをフォールディングさせ、ジスルフィド結合を形成した。次に、フォールディングしたペプチドを逆相クロマトグラフィーで精製し、バッファー交換し、凍結乾燥した。ペプチドを、RP-HPLC、質量分析、及び必要に応じて2D-NMRやLC-MSペプチドマッピングなどの他の方法によって特性評価した。
配列番号568、配列番号683、及び配列番号569のペプチドは、Fmoc化学により合成し、樹脂から切断し、フォールディングさせ、精製した。各ペプチドの質量をLC-MSで検証し、その純度をRP-HPLCで特性評価した。
本開示のペプチドのいずれも、同様の方法で製造することができる。
実施例3
ペプチドの放射性標識
本実施例では、還元的アルキル化などの標準的な方法によるペプチドの放射性標識について記載する。J Biol Chem.254(11):4359-65 (1979);Methods in Enzymology V91:1983 p.570、及びJournal of Biological Chemistry 254(11):1979 p.4359を参照されたい。14Cホルムアルデヒドを過剰量で使用して、完全なメチル化(すべての遊離アミンのジメチル化)を確実に行う。標識されたペプチドは、Strata-Xカラム(Phenomenex 8B-S100-AAK)による固相抽出によって単離し、5%メタノールを含む水で洗浄し、2%ギ酸を含むメタノール中に回収する。その後、穏やかな加熱と窒素ガス流を用いてブローダウンエバポレータで溶媒を除去する。
実施例4
ペプチドの同位体標識
本実施例では、ペプチドの同位体標識について記載する。固相ペプチド合成において、同位体標識したアミノ酸、1513Cアルギニンをペプチドに組み込んだ。同位体標識されたペプチドが生成された。このペプチドを用いて、生物学的試料中のペプチドまたはペプチドI/O複合体の濃度を測定した。
固相ペプチド合成を行って、同位体標識されたアルギニンが組み込まれた配列番号569のペプチドを生成した。Arg14、Arg15及びArg23に、均一に標識した13(98%)及び15(98%)を組み込み、適切にフォールディングされた配列番号569のペプチドを得た。同位体標識したペプチドを近赤外色素ICG-スルホをリシン27に結合させることによりさらに改変し、質量4795.5ダルトン、純度96%の同位体標識された結合体を得た。この結合体は、動物実験で血中のペプチド濃度を測定するために効果的に使用された。
本開示のペプチドのいずれも同様の方法で標識することができる。
実施例5
ペプチドと検出可能な薬剤との結合体
本実施例では、ペプチドの色素標識について記載する。配列番号2または配列番号569のペプチド(配列番号2の非GSバージョン)を組換えにより発現させ、または化学的に合成した後、このペプチドのN末端及び/または1つ以上のリシン残基の側鎖のアミンを、アミド結合を介して検出可能な薬剤に結合して、ペプチドと検出可能な薬剤との結合体を作製した。検出可能な薬剤はインドシアニングリーン色素(ICG)とした。
このペプチドと検出可能な薬剤との結合体を対象に投与した。対象は、がん細胞を移植し、腫瘍にまで増殖させた非ヒト動物とした。投与後、ペプチドと検出可能な薬剤との結合体は腫瘍にホーミングした。対象または対象から得た組織をイメージングして、ペプチドと検出可能薬剤との結合体の腫瘍への局在化を可視化した。投与後の腫瘍におけるペプチドと検出可能な薬剤との結合体の可視化は、がんの診断における造影剤または診断薬として用いることができる。対象の生検におけるがんの確認は、標準的な組織病理学によって確認した。配列番号568のペプチドを、ヒト神経膠腫U373またはU87細胞またはヒト肺癌A549細胞などの細胞に適用し、24時間インキュベートした。ペプチドは単独で適用し、免疫細胞化学によって検出するか、または適用に先立ってAlexa-488蛍光色素で標識した後、共焦点顕微鏡によりイメージングした。ペプチドは細胞に透過し、トランスゴルジ近傍及び核周囲領域などの細胞内の場所で検出された。Wiranowska et al.,Cancer Cell Intl 11:1-13(2011)。本明細書に開示されるペプチドの腫瘍蓄積を実証するための実験を行った。配列番号569のペプチドをICG色素に結合して、図27に示す分子を合成した。同種移植片を作製するため、マウス(雌性Balbc及びC57BL6/J系統、Envigo)にCT26、B16F10、またはA20細胞を容量100μlで接種した。腫瘍を移植後12~15日間増殖させた後、腫瘍を有するマウスにICG色素に結合した配列番号569のペプチドを10ナノモル(容量100μL)で静脈内注射した。腫瘍を投与24時間後に切除し、近赤外蛍光スキャナーを使用してイメージングした。図23は、ICG色素に結合した配列番号569のペプチドを注射しなかったマウスのCT26腫瘍における白色光イメージ及び蛍光シグナル、及びICG色素に結合させた配列番号569のペプチドを注射した2匹のマウスから得た腫瘍におけるシグナルを示す。図24は、ICG色素に結合した配列番号569のペプチドを注射しなかったマウスのB16F10腫瘍における白色光イメージ及び蛍光シグナル、及びICG色素に結合させた配列番号569のペプチドを注射した2匹のマウスから得た腫瘍におけるシグナルを示す。図25は、ICG色素に結合した配列番号569のペプチドを注射しなかったマウスのA20腫瘍及び筋肉(対側脇腹)における白色光イメージ及び蛍光シグナル、及びICG色素に結合させた配列番号569のペプチドを注射した2匹のマウスから得た腫瘍及び筋肉(対側脇腹)におけるシグナルを示す。ICG色素に結合させた配列番号569のペプチドで処理したA20マウスにおける腫瘍のシグナルは、これらの処理マウスの筋肉のシグナルよりも5~11倍高かった。腫瘍のシグナルは、各群の非処理マウスの腫瘍のシグナルよりもCT26腫瘍で2000~4000倍、B16F10腫瘍で1000~1500倍高かった。これらのデータは、ICG色素に結合した配列番号569のペプチドが、CT26結腸癌腫瘍、B16F10黒色腫腫瘍、及びA20リンパ腫腫瘍にインビボで蓄積することを示している。
本開示のペプチドのいずれも、ICG色素を用いた同様の方法で標識することができる。他の検出可能な色素を使用して、本明細書に記載される本開示のペプチドを標識することもできる。
実施例6
ペプチドの投与
本実施例では、ペプチドをマウスに投与するための投薬計画について記載する。異なる用量のペプチドを、体重20g~25gの雌性Harlan胸腺欠損ヌードマウスに尾静脈注射により投与する(ペプチド当たりn=2匹のマウス)。必要に応じて、腎臓を結紮してペプチドの腎濾過を防止する。必要に応じて、実際の結合剤がメチルまたはジメチルリシン(複数可)及びメチル化またはジメチル化されたアミノ末端を含むことができるように、リシン及びN末端をメチル化することによって各ペプチドを放射性標識するか、および/または各ペプチドをCy5.5-NHSエステルのような検出可能な薬剤で標識する。
必要に応じてペプチドとのモル比が1:1のフルオロフォアを含む、10~25uCiの14Cを保持する標的用量50~100nmolの各ペプチドを、雌性Harlan胸腺欠損ヌードマウスに投与する。各ペプチドを動物体内で自由に循環させた後、動物を安楽死させ、切片化する。
実施例7
ペプチドホーミング
本実施例では、マウスの腫瘍へのペプチドのホーミングについて説明する。実施例6の投与期間の終了時に、マウスをヘキサン/ドライアイス浴で凍結し、次いでカルボキシメチルセルロースのブロック中で凍結する。動物全体の矢状切片を調製し、イメージングに用いる薄い凍結切片を得る。脳、腫瘍、肝臓、腎臓、肺、心臓、脾臓、膵臓、筋肉、脂肪、胆嚢、上部消化管、下部消化管、骨、骨髄、生殖器系、目、軟骨、胃、皮膚、脊髄、膀胱、唾液腺、及びその他の種類の組織などの組織のイメージングを含む動物の薄い凍結切片をミクロトームを用いて得て、冷凍庫内で乾燥させ、ホスホイメージャープレートに約10日間曝露する。
放射性標識ペプチドの場合では、これらのプレートを現像し、各臓器からのシグナル(デンシトメトリー)を各動物の心臓の血液に見られるシグナルに対して正規化する。検出可能な薬剤とペプチドとの結合体については、組織を蛍光イメージャーまたは蛍光顕微鏡法でイメージングする。その組織に存在する血液から予想されるシグナルよりも強い組織中のシグナルは、領域、組織、構造、または細胞中のペプチドの蓄積を示す。あるいは、組織を採取して、ホモジナイズし、液体シンチレーションカウンティング(放射性標識)または吸光度測定(検出可能な薬剤の結合体)などにより、異なる組織中のペプチド含有量を分析する。
実施例8
安定的なリンカーを有するペプチド結合体
本実施例では、安定的なリンカーを有するペプチド結合体の調製について記載する。本開示のペプチドを組換えによって発現させるかまたは化学合成する。ペプチドを、検出可能な薬剤またはI/Oまたは他の任意の活性剤と、アミド結合またはカルバメート結合などの安定的なリンカーを介して結合する。ペプチドは、標準的な1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)またはジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)に基づいた化学、または塩化チオニルもしくは塩化リンに基づいたバイオコンジュゲーション化学、または本開示に記載されるような他の化学を用いて結合される。
リンカーを介して結合されたペプチドとI/Oとは、リンカーをA-B-Cとして式:ペプチド-A-B-C-I/Oで記述される。Aは、ペプチド上のアミンを、テトラフルオロフェニル(TFP)エステルまたはNHSエステルまたはATT(アシル-1,3-チアゾリジン-2-チオン)基を含むリンカーと反応させることにより形成されるものなどの安定的なアミド結合とすることができる。Aは、ペプチド上のアミンを、CDIとリンカー上のヒドロキシルとの反応によって形成されたイミダゾールカルバメート活性中間体と反応させることによって形成されるものなどの安定的なカルバメートリンカーであってもよい。Aは、リンカー上のアルデヒドまたはケトン基によるペプチド上のアミンの還元的アルキル化によって形成されるものなどの安定的な第2級アミン結合であってもよい。Aは、リンカー中のマレイミドまたはブロモアセトアミドをペプチド中のチオールとともに用いて形成される安定的なチオエーテルリンカー、トリアゾールリンカー、安定的なオキシムリンカー、またはオキサカルボリンリンカーであってもよい。Bは、(-CH2-)-、または短鎖PEG(-CHCHO-)(xは0~20)、または他のスペーサー、またはスペーサーなしである。Cは、I/O上のアミンまたはカルボン酸と形成されるアミド結合、リンカー上のマレイミドとI/O上のスルフヒドロイル間で形成されるチオエーテル、第2級もしくは第3級アミン、カルバメート、またはその他の安定的な結合であるか、またはAとして形成された結合を超えて存在しない。“Current ADC Linker Chemistry,” Jain et al.,Pharm Res,2015 DOI 10.1007/s11095-015-1657-7、または‘Bioconjugate Techniques” Greg Hermanson,3rd editionに記載される任意のリンカー化学を用いることができる。
得られたペプチド結合体を、ヒトまたは動物に、皮下、静脈内、経口投与するか、または腫瘍内に直接注入することにより疾患を治療する。ペプチドは、標的とする機構によって検出可能な薬剤、I/O、または活性剤から特異的に切断されない。ペプチドは、異化などの機構によって分解され、その「天然」または最初の形態から改変されるかまたは改変されていない薬物を放出することができる(Antibody-Drug Conjugates:Design,Formulation,and Physicochemical Stability,Singh, Luisi,and Pak.Pharm Res(2015)32:3541-3571)。ペプチド薬物結合体は、インタクトな状態で、または部分的もしくは完全に分解、代謝、もしくは異化された状態でその薬理活性を示す。
実施例9
切断可能なリンカーを有するペプチド結合体
本実施例では、切断可能なリンカーを有するペプチド結合体の調製について記載する。本開示のペプチドを、組換えによって発現させるかまたは化学合成する。ペプチドとI/Oとはリンカーを介して結合され、リンカーをA-B-Cとして式:ペプチド-A-B-C-I/Oで記述される。Aは、ペプチド上のアミンを、テトラフルオロフェニル(TFP)エステルまたはNHSエステルまたはATT基を含むリンカーと反応させることにより形成されるものなどの安定的なアミド結合である。Aは、ペプチド上のアミンを、CDIとリンカー上のヒドロキシルとの反応によって形成されたイミダゾールカルバメート活性中間体と反応させることによって形成されるものなどの安定的なカルバメートリンカーであってもよい。Aは、リンカー上のアルデヒドまたはケトン基によるペプチド上のアミンの還元的アルキル化によって形成されるものなどの安定的な第2級アミン結合であってもよい。Aは、リンカー中のマレイミドまたはブロモアセトアミドをペプチド中のチオールとともに用いて形成される安定的なチオエーテルリンカー、トリアゾールリンカー、安定的なオキシムリンカー、またはオキサカルボリンリンカーであってもよい。場合により、Aは、ペプチドがCに切断可能な結合を介して直接結合されるために存在しない。Bは、(-CH2-)-、または短鎖PEG(-CHCHO-)(xは0~20)、または他のスペーサー、またはスペーサーなしである。Cは、I/O上のヒドロキシルまたはカルボン酸とのエステル結合、または加水分解によって、及び/または酵素的に切断されるように設計されたカーボネート、ヒドラゾン、またはアシルヒドラゾンである。開裂速度は、炭素長(-CH2-)x、立体障害(メチル、エチル、環状基などの隣接する側基を含む)、親水性または疎水性など、エステル周囲の局所環境を変化させることによって変化する。加水分解速度は、エンドソーム及びリソソームまたは病変組織などの身体または細胞の特定の区画における低いpHなど、局所的なpHによって影響される。あるいは、Cは、ヒドラゾンまたはオキシム結合などのpH感受性基である。あるいは、Cは、グルタチオンによるものなど、還元によって放出されるように設計されたジスルフィド結合である。あるいは、C(またはA-B-C)は、酵素によって切断可能なペプチド結合の設計である。場合により、pABCなどの自己犠牲基を含めることにより、切断に際して遊離非修飾薬物を放出させる(Antibody-Drug Conjugates:Design,Formulation,and Physicochemical Stability,Singh,Luisi,and Pak.Pharm Res(2015)32:3541-3571)。リンカーは、エステラーゼ、マトリックスメタロプロテイナーゼ、カテプシンBなどのカテプシン、グルクロニダーゼ、プロテアーゼ、またはトロンビンなどの酵素によって切断される。あるいは、切断されるように設計された結合は、CではなくAとし、Cは安定的な結合または切断可能な結合とすることができる。別の設計は、AとCに安定的なリンカー(アミドまたはカルバメートなど)を有し、Bにジスルフィド結合などの切断可能なリンカーを有することである。還元速度は、メチル基またはエチル基による立体障害などの局所効果または、疎水性/親水性を調整することによって調節される。
得られたペプチド結合体を、ヒトまたは動物に、皮下、静脈内、経口投与するか、または腫瘍内に直接注入することにより疾患を治療する。
実施例10
RNAまたはDNAへのチオール基、アミン基、またはアルデヒド基の導入
本実施例では、RNAまたはDNAへのチオール基、アミン基、またはアルデヒド基の組み込みについて記載する。図1は、RNAまたはDNAへのこれらの基の組み込みまたは付加を示している。チオール基は、例えば、RIG-IリガンドまたはMDA5リガンド上で、EDC及びイミダゾールを使用して5’リン酸基をホスホリルイミダゾリドに活性化し、次いで、得られた生成物をシスタミンと反応させることにより、RNAまたはDNAに付加される。次いで、ジチオスレイトール(DTT)で還元して、遊離チオール基へのホスホロアミダイト結合を形成する。あるいは、チオール基は、図1に示されるように、固相ホスホロアミダイト法によるオリゴヌクレオチド合成中にチオールを有するホスホロアミダイトを組み込むことによって、オリゴヌクレオチドの5’末端または3’末端のいずれかにおいてRNAまたはDNAに付加される。合成中に使用されるホスホロアミダイトは、切断、精製、及びワークアップ時に除去される保護基を、合成中にチオールに有してもよい。図1Aは、https://www.atdbio.com/content/50/Thiol-modified-oligonucleotidesに示される、5’末端チオール(チオヘキシル、C6)修飾(左)、及び3’末端チオール(C3)修飾(右)を有するオリゴヌクレオチドの構造を示す。
アミン基は、後で脱保護される保護されたアミノ基を有するホスホロアミダイトを合成中に組み込むことにより、RNAまたはDNAに付加される。図1Bは、MMT-ヘキシルアミノリンカーホスホロアミダイトを示す。図1Cは、https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m01023hh?lang=en&region=USに示されるTFA-ペンチルアミノリンカーホスホロアミダイトを示す。
あるいは、チオールまたはアミン含有オリゴヌクレオチド残基は、Jin et al.(J Org Chem.2005 May 27;70(11):4284-99)に記載されるような、RNAまたはDNA中の任意の選択された位置において配列内に導入される。図1Dは、Jin et al.(J Org Chem.2005 May 27;70(11):4284-99)に示されるようなアミンまたはチオール残基を含むRNA残基を示す。また、ホスホジエステル骨格内にホスホロチオエート基(硫黄原子がオリゴヌクレオチドのリン酸骨格の非架橋酸素を置き換えている)を含むオリゴヌクレオチド残基は、チオール基への結合に同様に使用される反応基を与える。ホスホロチオエート含有残基の使用により、RNAのヌクレアーゼ分解に対する耐性を高めることもできる。
図1Eは、5’末端(左)及び3’末端(右)にアミノヘキシル修飾を有するオリゴヌクレオチドを示す。
過ヨウ素酸酸化を使用してジオールを2個のアルデヒド基に変換することにより、RNAの3’末端にアルデヒド官能基を組み込むことができる。
官能基を組み込むかまたは修飾する他の方法は、Greg Hermanson,3rd editionによるBioconjugate Techniquesに記載される方法を用いて行われる。
実施例11
環状ジヌクレオチドへのカルボキシレート基、チオール基、またはアミン基の組み込み
本実施例では、環状ジヌクレオチドへのカルボキシレート基、チオール基、またはアミン基の組み込みについて記載する。環状ジヌクレオチドは、配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のペプチドのいずれか1つに結合される本開示のI/OであるSTINGリガンドとして機能する。
環状ジヌクレオチドのヒドロキシル基をクロロ酢酸と反応させてカルボン酸塩を形成させる。このカルボン酸塩を、EDCを用い、エチレンジアミンなどのジアミンとのその後の反応によってアミン基に変換する。あるいは、カルボン酸塩を、EDCを用い、シスタミンとのその後の反応によってチオール基に変換する。これに続いて、例えば、ジチオスレイトール(DTT)による還元を行う。得られた環状ジヌクレオチドは、本開示の任意のペプチドと結合することができる状態であり、STINGをアゴナイズするために投与される。
あるいは、環状ホスホジエステルにビスホスホロチオエート結合を含むSTINGリガンドは、ペプチド-I/O複合体のI/Oとして使用することができる反応性チオールを与える。これらのチオールを、マレイミド、ブロモアセチル、ヨードアセチル、またはピリジルジチオール基と反応させる(図12A)。
あるいは、CDN内のプリン塩基の5員環のC8位をN-ブロモスクシンイミド(NBS)で臭素化して反応性臭素基を与えることもできる。次に、反応性臭素基を、チオールなどの官能基を有するアミン含有基、またはさらなる結合に利用することができる保護されたアミンと結合する(図12B)。
例えば、構造中に1個もしくは2個のホスホロチオレート結合を有するか、または1個もしくは2個のグアノシンを有することにより(アデノシンはNBSとの反応性がより低いため)、1個または2個の官能基が環状ジヌクレオチドに組み込まれる。
実施例12
RNA、DNA、または環状ジヌクレオチドとペプチドとの間の切断可能なリンカーの生成
本実施例では、RNA、DNA、または環状ジヌクレオチドと、配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のペプチドのいずれか1つとの間の切断可能なリンカーの生成について記載する。チオールを有するRNA/DNA/環状ジヌクレオチドと遊離チオール基を含むペプチドとを組み合わせることによりジスルフィドリンカーが生成される。チオールは、反応性アミンにTraut試薬、SATA、SPDP、またはその他の適切な試薬(N末端またはリシン残基を有するヘテロ二官能性SPDP及びNHSエステルリンカーなど)を用いるか、またはペプチドに遊離システイン残基を組み込むことによってペプチドに組み込まれる(図13)。ジスルフィドリンカーは、細胞質の還元的環境中、またはエンドソーム/リソソーム経路で切断される。
エステル結合は、遊離ヒドロキシル基(RNAもしくはDNAの3’末端、または環状ジヌクレオチド内のリボース単位上のものなど)と、ペプチドのカルボン酸基(C末端、アスパラギン酸、グルタミン酸残基からのもの、またはリンカーを介してリシン残基またはN末端に導入されたものなど)とを、例えばフィッシャーエステル化反応により、または塩化アシルの使用によって組み合わせることによって生成される。エステルリンカーは、エンドソーム及びリソソームのより低いpHによって加速される加水分解によって、または酵素的エステラーゼ切断によって切断される。
オキシムまたはヒドラゾン結合は、RNA/DNA/環状ジヌクレオチドのアルデヒド基と、アミノオキシ基(オキシム結合を形成する)またはヒドラジド基(ヒドラゾン結合を形成する)で官能化されたペプチドとを組み合わせることによって生成される。オキシムまたはヒドラゾン結合の安定性または不安定性は、隣接する基によって調整され(Kalia et al.,Angew Chem Int Ed Engl.2008;47(39):7523-6.)、エンドソーム/リソソームなどの酸性区画内で加水分解による切断が加速される。
ヒドラジド基は、アジピン酸ジヒドラジドまたはカルボヒドラジドをC末端またはアスパラギン酸またはグルタミン酸残基のカルボン酸基と反応させることによってペプチドに組み込まれる。アミノオキシ基は、N末端またはリシン残基を、一端にNHSエステルを、他端にフタルイミドキシ基を含むヘテロ二官能性分子と反応させた後、ヒドラジンで切断することによってペプチド上に組み込まれる。反応は、場合により、アニリンの添加によって触媒される。
いずれのリンカーの切断速度も、例えば、切断可能な結合の近くの電子密度を改変することによって、または切断部位へのアクセスに立体的に影響を及ぼすことによって(例えば、メチル基、エチル基、または環状基などのかさ高い基を付加することによって)調節される。
あるいは、切断可能なリンカーは、Greg Hermanson、3rd editionによるBioconjugate Techniquesに示されている方法を使用して生成される。
RNAまたはDNAへの機能的ハンドルとしてのチオール、アミン、またはアルデヒド基の導入は、実施例10で上記に述べたようにして行われる。環状ジヌクレオチドへの機能的ハンドルとしてのカルボキシレート、チオール、またはアミン基の導入は、実施例11で上記に述べたようにして行われる。
例示的なペプチド-RNA結合体を、図34~図35、及び図39~図44に示す。図34は、ジスルフィド切断可能リンカーによって互いに連結された、配列番号568のペプチドとdsRNA(配列番号1371)を含むI/Oとから構成されるペプチドI/O複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるdsRNA中の改変塩基に結合されている(例えば、図に示されるように、配列番号1371中のウリジンが、リンカーに結合される延長アミンを有するウリジンに改変されており、このリンカーがペプチドにも結合されている[図示のように])。このペプチドI/O複合体中の配列番号1371のdsRNAは、5’ppp(三リン酸)を有し、ヘアピン構造として形成されている点に留意されたい。図35は、図34のペプチドI/O複合体のペプチドの切断産物を示す。
図39は、ヒドラゾン/PEGリンカーによって互いに連結された、配列番号569のペプチドとdsRNA(配列番号1371)を含むI/Oとから構成されるペプチドI/O複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるdsRNA中の改変塩基に結合されている(例えば、図に示されるように、配列番号1371中のグアノシンが、リンカーに結合される改変グアノシンであり、このリンカーがペプチドにも結合されている[図示のように])。このペプチドI/O複合体中の配列番号1371のdsRNAは、5’ppp(三リン酸)を有し、ヘアピン構造として形成されている。図40は、ジスルフィド/PEGリンカーによって互いに連結された、配列番号569のペプチドとdsRNA(配列番号1371)を含むI/Oとから構成されるペプチドI/O複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるdsRNA中の改変塩基に結合されている(例えば、図に示されるように、配列番号1371中のグアノシンが、リンカーに結合される改変グアノシンであり、このリンカーがペプチドにも結合されている[図示のように])。このペプチドI/O複合体中の配列番号1371のdsRNAは、5’ppp(三リン酸)を有し、ヘアピン構造として形成されている。図41は、ジスルフィド/PEGリンカーによって互いに連結された、ICG色素に結合された配列番号569のペプチドとdsRNA(配列番号1371)を含むI/Oとから構成されるペプチドI/O複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるdsRNA中の改変塩基に結合されている(例えば、図に示されるように、配列番号1371中のグアノシンが、リンカーに結合される改変グアノシンであり、このリンカーがペプチドにも結合されている[図示のように])。このペプチドI/O複合体中の配列番号1371のdsRNAは、5’ppp(三リン酸)を有し、ヘアピン構造として形成されている。図42は、ヒドラゾンリンカーによって互いに連結された、配列番号569のペプチドとdsRNA(配列番号1371)を含むI/Oとから構成されるペプチドI/O複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるdsRNA中の改変塩基に結合されている(例えば、図に示されるように、配列番号1371中のグアノシンが、リンカーに結合される改変グアノシンであり、このリンカーがペプチドにも結合されている[図示のように])。このペプチドI/O複合体中の配列番号1371のdsRNAは、5’ppp(三リン酸)を有し、ヘアピン構造として形成されている。図43は、長いジスルフィドリンカーによって互いに連結された、配列番号569のペプチドとdsRNA(配列番号1371)を含むI/Oとから構成されるペプチドI/O複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるdsRNA中の改変塩基に結合されている(例えば、図に示されるように、配列番号1371中のグアノシンが、リンカーに結合される改変グアノシンであり、このリンカーがペプチドにも結合されている[図示のように])。このペプチドI/O複合体中の配列番号1371のdsRNAは、5’ppp(三リン酸)を有し、ヘアピン構造として形成されている。図44は、短いジスルフィドリンカーによって互いに連結された、配列番号569のペプチドとdsRNA(配列番号1371)を含むI/Oとから構成されるペプチドI/O複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるdsRNA中の改変塩基に結合されている(例えば、図に示されるように、配列番号1371中のグアノシンが、リンカーに結合される改変グアノシンであり、このリンカーがペプチドにも結合されている[図示のように])。このペプチドI/O複合体中の配列番号1371のdsRNAは、5’ppp(三リン酸)を有し、ヘアピン構造として形成されている。
図34のペプチドI/O複合体は、合成によって生成し、精製し、質量をMALDI-TOF MSで検証し、純度をRP-HPLCで測定した。
実施例13
RNA、DNA、または環状ジヌクレオチドとペプチドとの間の安定的なリンカーの生成
本実施例では、RIG-IリガンドまたはSTINGリガンドなどの、RNA、DNA、または環状ジヌクレオチドと、配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のペプチドのいずれか1つとの間の安定的なリンカーの生成について記載する。第2級アミンを介した安定的なリンカーは、アルデヒドを有するRNA、DNA、または環状ジヌクレオチドを、ペプチドのN末端またはリシン残基のアミンに結合させた後、シアノ水素化ホウ素ナトリウムで還元することで行われる、還元的アミノ化によって生成される。
安定的なアミド結合は、RNA、DNA、または環状ジヌクレオチドのアミン基を、ペプチドのC末端またはアスパラギン酸またはグルタミン酸残基のカルボキシレートと組み合わせることによって生成される。
安定的なカルバメート結合は、RNA、DNA、または環状ジヌクレオチドのヒドロキシル基を、カルボニルジイミダゾール(CDI)またはN、N’-ジスクシンイミジルカーボネート(DSC)で活性化し、続いてペプチドのN末端またはリシン残基と反応させることによって生成される。
マレイミドリンカーは、チオールを有するRNA、DNA、または環状ジヌクレオチドをマレイミドで官能化されたペプチドと組み合わせることによって生成される。ペプチドは、ペプチド中の反応性アミンに対してNHS-X-マレイミドヘテロ二官能性剤を使用して官能化される(Xは任意のリンカーである)。マレイミドリンカーは、安定的なリンカーとして、または緩慢に切断可能なリンカーとして使用され、後者は生物学的液体中の他のチオール含有分子との交換によって切断される。マレイミドリンカーは、Fontaine et al.,Bioconjugate Chem.,2015,26(1),pp 145-152に記載されるものを含むさまざまな置換基を用いてリンカーのスクシンイミド部分を加水分解することによっても安定化される。
例えば、ポリヌクレオチドに官能基を組み込む、付加する、または修飾する他の方法は、Greg Hermanson,3rd editionによるBioconjugate Techniquesに記載される方法を用いて行われる。
RNAまたはDNAへの機能的ハンドルとしてのチオール、アミン、またはアルデヒド基の導入は、実施例10で上記に述べたように行われる。環状ジヌクレオチドへの機能的ハンドルとしてのカルボキシレート、チオール、またはアミン基の導入は、実施例11で上記に述べたように行われる。
RNA I/Oを含む例示的な安定的なペプチドI/O複合体を図36~図38に示す。図36~図38に示されるペプチドI/O複合体は合成により生成し、精製した。それらの質量をMALDI-TOF MSによって検証され、純度をRP-HPLCによって測定した。
図36は、延長された安定的なリンカーによって互いに連結された、配列番号568のペプチドとdsRNA(配列番号1371)を含むI/Oとから構成されるペプチドI/O複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるdsRNA中の改変塩基に結合されている(例えば、図に示されるように、配列番号1371中のウリジンが、リンカーに結合される延長されたアミンを有するウリジンに改変されており、このリンカーがペプチドにも結合されている[図示のように])。このペプチドI/O複合体中の配列番号1371のdsRNAは、5’ppp(三リン酸)を有し、ヘアピン構造として形成されている。図37は、延長された安定的なリンカーによって互いに連結された、配列番号569のペプチドとdsRNA(配列番号1371)を含むI/Oとから構成されるペプチドI/O複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるdsRNA中の改変塩基に結合されている(例えば、図に示されるように、配列番号1371中のウリジンが、リンカーに結合される延長されたアミンを有するウリジンに改変されており、このリンカーがペプチドにも結合されている[図示のように])。このペプチドI/O複合体中の配列番号1371のdsRNAは、5’ppp(三リン酸)を有し、ヘアピン構造として形成されている。図38は、延長された安定的なリンカーによって互いに連結された、ICG色素に結合された配列番号569のペプチド(図27のペプチド複合体を参照)とdsRNA(配列番号1371)を含むI/Oとから構成されるペプチドI/O複合体を示し、リンカーは、結合または連結部位として用いられるdsRNA中の改変塩基に結合されている(例えば、図に示されるように、配列番号1371中のウリジンが、リンカーに結合される延長されたアミンを有するウリジンに改変されており、このリンカーがペプチドにも結合されている[図示のように])。このペプチドI/O複合体中の配列番号1371のdsRNAは、5’ppp(三リン酸)を有し、ヘアピン構造として形成されている。
実施例14
RNAとペプチドとの間のボロン酸エステル結合の生成
本実施例では、RIG-IリガンドまたはMDA5リガンドなどのRNAと、配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のペプチドのいずれか1つとの間のボロン酸エステル結合の生成について記載する。フェニルボロン酸(PBA)は、cisジオールと可逆的な共有結合による複合体を形成する。切断可能なリンカーは、RNAの3’末端のジオールとPBA含有ペプチドの間で共有結合による複合体を形成することによって形成される。PBAグループは、還元的アミノ化を介して4-ホルミル-PBAをペプチドのN末端またはペプチド中のリシンと反応させることによりペプチドに組み込まれる。PBAのpKaは、隣接基(例えば、アミン)によってpKaを約6にまで低下させるように調節され、中性pHで複合体化を、より低いpHで放出を可能とする(Aguirre-Chagala et al.,ACS Macro Lett.,2014,3 (12),pp 1249-1253;Winblade et al.,Biomacromolecules.2000 Winter;1(4):523-33;Roy et al.,ACS Macro Lett.,2012,1(5),pp 529-532,Gennari et al.,Bioconjugate Chem.,2017,28(5),pp 1391-1402)。ボロン酸エステル結合は、エンドソーム/リソソームの低pH環境によって切断される。切断後、RNAは未修飾の形態で放出されるため、RNAの送達はトレースできない。
実施例15
RNA、DNA、または環状ジヌクレオチドとペプチドとの間の酵素切断可能な結合の生成
本実施例では、RIG-IリガンドまたはSTINGリガンドなどの、RNA、DNA、または環状ジヌクレオチドと、配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のペプチドのいずれか1つとの間の酵素切断可能な結合の生成について記載する。酵素的に切断可能な結合が、RNA、DNA、または環状ジヌクレオチドとペプチドとの間に生成される。切断可能な結合を有する結合体はインビトロまたはインビボで投与され、細胞内または体内の酵素によって切断されて、RNA、DNA、または環状ジヌクレオチドを放出する。酵素は、エンドソーム/リソソーム、サイトゾル、細胞表面に存在するか、腫瘍の微小環境中で上方制御する。これらの酵素としては、これらに限定されるものではないが、カテプシンBなどのカテプシン(Kramer et al.,Trends Pharmacol Sci.2017 Oct;38(10):873-898に記載されるすべてのものなど)、β-グルクロニダーゼを含むグルコロニダーゼ、ヒアルロニダーゼ、及びMMP-1、2、7、9、13、または14などのマトリックスメタロプロテアーゼ(Kessenbrock et al.,Cell.2010 Apr 2;141(1):52-67)が挙げられる。カテプシンまたはMMPは、以下の表9に示される配列番号1139~配列番号1161、配列番号1360~配列番号1363、及び配列番号1365のいずれかのアミノ酸配列を切断する(Nagase,Hideaki. “Substrate specificity of MMPs.”Matrix Metalloproteinase Inhibitors in Cancer Therapy.Humana Press,2001.39-66;Dal Corso et al.,Bioconjugate Chem.,2017,28 (7),pp 1826-1833;Dal Corso et al.,Chemistry-A European Journal 21.18(2015):6921-6929;Doronina et al.,Bioconjug Chem.2008 Oct;19(10):1960-3.も参照)。グルクロニダーゼリンカーには、Jeffrey et al.,Bioconjugate Chem.,2006,17(3),pp831-840に記載されるリンカーのいずれか1つを含まれる。
Figure 0007386161000106
Figure 0007386161000107
Jain et al.,Pharm Res.2015 Nov;32(11):3526-40に記載されるような酵素的に切断可能なリンカー、Val-Cit-PABCは、RNA、DNA、または環状ジヌクレオチドのアミン基にPABC末端を結合させることにより作製される。バリン末端は、例えば、ペプチドのC末端とのアミド結合を生成することにより、ペプチドにさらに結合される。Val-Cit結合(配列番号1142)への酵素の立体的アクセスを促進するため、必要に応じて分子のいずれかの側にスペーサーを組み込む。あるいは、ペプチドへの結合は、ペプチドのN末端をSATAにより活性化し、チオール基を形成し、次いでこのチオール基をVal-Citのペア(配列番号1142)のN末端に結合されたマレイミドカプロイル基と反応させることによって生成される。カテプシンBによる切断時に自己犠牲PABC基は自然に脱離し、アミンを含むRNA、DNA、または環状ジヌクレオチドをさらなる化学修飾なしで放出する。他のアミノ酸ペアとしては、Glu-Glu、Glu-Gly、及びGly-Phe-Leu-Gly(配列番号1497)が挙げられる。
RNAまたはDNAへの機能的ハンドルとしてのチオール、アミン、またはアルデヒド基の導入は、実施例10で上記に述べたようにして行われる。環状ジヌクレオチドへの機能的ハンドルとしてのカルボキシレート、チオール、またはアミノ基の導入は、実施例11で上記に述べたようにして行われる。
実施例16
RIG-Iリガンドとペプチドの結合
本実施例では、本開示のペプチドへのRIG-1リガンドの結合について記載する。ペプチドは、配列番号2または配列番号569(N末端のGSのない配列番号2)である。図2に示されるRIG-Iリガンドを、骨格の安定性を高めるために2’-フルオロピリミジンを使用して合成する。配列番号569のLys27残基(配列番号2の29位)を、還元的アミノ化によって4-ホルミル-PBAに結合する。このPBA含有ペプチドは、RIG-1リガンドの3’ジオール基と複合体を形成して、ボロン酸エステルを形成する。
あるいは、2’-フルオロピリミジンを用いて調製したRIG-Iリガンドは、合成時に、5’pppの遠位に、例えば少なくとも10塩基対離れて位置するチオール含有またはホスホロチオレート含有ヌクレオチド残基を配列中に含む。配列番号569のLys27(または配列番号2のLys残基29)を、SATAで修飾し(その後、ヒドロキシルアミンを使用して脱保護し)、チオール基を形成する。
あるいは、配列番号569のLys27(または配列番号2のLys残基29)をSPDP-PEG-NHSエステルで修飾して、柔軟な親水性PEGスペーサーを有する保護チオール基を形成する。修飾されたRIG-Iリガンドと配列番号569の2個のチオール基が結合して、切断可能なジスルフィド結合を形成する。あるいは、配列番号569のLys27(または配列番号2のLys残基29)をブロモアセトアミド-PEG-TFPエステルで修飾してアミド結合を形成した後、2’-フルオロピリミジンを用いて調製したRIG-Iリガンド内のチオール基と反応させて安定的なチオエーテル結合を形成する。
あるいは、2’-フルオロピリミジンを用いて調製したRIG-Iリガンドは、合成時に、5’pppより遠位に位置するアミン含有ヌクレオチドを配列中に含む。配列番号569のLys27(配列番号2の29位)をSATAで修飾してチオール基を形成する。マレイミドカプロイル-Val-Cit-PABCリンカーを、RIG-Iリガンドのアミン、及び配列番号2または配列番号569のチオールと結合する。
あるいは、2’-フルオロピリミジンを用いて調製したRIG-Iリガンドを、3’ジオールを酸化した後に還元的アミノ化を行って配列番号569のLys27(配列番号2の29位)に結合させて第2級アミン結合体を形成する。
あるいは、2’-フルオロピリミジンを用いて調製したRIG-Iリガンドを、過ヨウ素酸酸化によって3’末端をアルデヒドに酸化する。次いで、このアルデヒドを配列番号2のペプチドと反応させ、N末端をアミノオキシ基で官能化して、切断可能なオキシム結合を形成する。
あるいは、配列番号1180(センス)及び配列番号1181(アンチセンス)のRIG-1リガンドを、骨格の安定性を高めるために2’-フルオロピリミジンを用いて使用する。センス鎖の3’末端を、図1に示されるようなチオール修飾を用いて合成する。配列番号569のLys27(または配列番号2のLys残基29)をブロモアセトアミド-PEG-TFPエステルで修飾してアミド結合を形成した後、RIG-Iリガンド内のチオール基と反応させて安定的なチオエーテル結合を形成する。あるいは、センス鎖またはアミノ末端ヌクレオチドの5’末端が修飾部位として機能する。
あるいは、ペプチドは、配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のうちのいずれか1つである。
RNAまたはDNAへの機能的ハンドルとしてのチオール、アミン、またはアルデヒド基の導入は、実施例10で上記に述べたようにして行われる。環状ジヌクレオチドへの機能的ハンドルとしてのカルボキシレート、チオール、またはアミノ基の導入は、実施例11で上記に述べたようにして行われる。
実施例17
環状ジヌクレオチドとペプチドの結合
本実施例では、本開示のペプチドへの環状ジヌクレオチドの結合について記載する。ペプチドは、配列番号2または配列番号569(N末端のGSのない配列番号2)である。2’3’cGAMPのヒドロキシル基を利用し、このヒドロキシル基をグルタル酸無水物と反応させ、次いで、修飾された2’3’cGAMPのNHSグルタル酸エステルを形成した後、配列番号569のLys27(配列番号2の29位)のアミンと反応させることにより、配列番号2または配列番号569とのエステル結合を形成する。
あるいは、マレイミドカプロイル-Val-Cit-PABCリンカーを、2’3’cGAMPのアミン及び配列番号2または配列番号569のチオール基(Lys27(配列番号569)またはLys29(配列番号2)をSATAと反応させてチオール基を形成する)と結合させる。
あるいは2’3’cGAMPのヒドロキシル基を利用し、このヒドロキシル基をDSCにより活性化した後、得られた化合物を配列番号569のLys27(配列番号2の29位)と反応させることにより、配列番号2または配列番号569とのカルバメート結合を形成する。
あるいは、ML-RR-S2-CDAなどのホスホロチオエートを含む表8の環状ジヌクレオチドも用いられる。配列番号569のLys27(または配列番号2のLys残基29)をSPDP-PEG-NHSエステルで修飾してアミド結合を形成した後、環状ジヌクレオチドのホスホロチオレート基と反応させて切断可能なジスルフィド結合を形成する。
あるいは、1個以上の安定的なスペーサーペプチド(配列番号1164~配列番号1172のうちのいずれか1つなど)、及び/または酵素的に切断可能なペプチド(配列番号1139~配列番号1161、配列番号1360~配列番号1363及び配列番号1365のうちのいずれか1つなど)、ならびに配列番号1170、配列番号1139、または配列番号2などの本開示のペプチドを含む融合産物を得る。この融合産物のN末端をブロモアセチル基で官能化し、このブロモ基を環状ジヌクレオチドのホスホロチオレート基と反応させて、酵素的に切断可能な結合を形成する。
あるいは、2’3’cGAMPのグアノシンのC8をNBSで臭素化し、シスタミンと反応させ、還元してチオールを生成する。配列番号569のLys27(または配列番号2のLys残基29)をSPDP-PEG-NHSエステルで修飾してアミド結合を形成し、チオール基と反応させて切断可能なジスルフィド結合を形成する。
あるいは、2’3’cGAMPのグアノシンのC8をNBSで臭素化する。これを、1個以上の安定的なスペーサーペプチド(配列番号1163~配列番号1172のうちのいずれか1つ、または配列番号1359、配列番号1364、配列番号1366のうちのいずれか1つなど)、及び/または酵素的に切断可能なペプチド(配列番号1139~配列番号1161、配列番号1360~配列番号1363及び配列番号1365のうちのいずれか1つなど)、ならびに配列番号1139、配列番号1170、及び配列番号2などの本開示のペプチドを含む融合産物のN末端と反応させる。
あるいは、ペプチドは、配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のうちのいずれか1つである。
RNAまたはDNAへの機能的ハンドルとしてのチオール、アミン、またはアルデヒド基の導入は、実施例10で上記に述べたようにして行われる。環状ジヌクレオチドへの機能的ハンドルとしてのカルボキシレート、チオール、またはアミン基の導入は、実施例11で上記に述べたようにして行われる。
実施例18
腫瘍ホーミング及び/または細胞透過性ペプチドに融合されたIL-15超アゴニストの発現
本実施例では、配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のいずれか1つなどの本開示のいずれかの腫瘍ホーミング及び/または細胞透過性ペプチドに融合されたIL-15超アゴニストを含むIL-15剤の発現及び精製について記載する。ペプチドは、IL-15超アゴニストのN末端またはC末端に融合される。IL-15超アゴニストは、IL-15Ra、リンカー、及びIL-15(N末端からC末端方向に例示的に「RLI」と呼ばれる;配列番号1135)で構成されるか、またはIL-15、リンカー、及びIL-15Raで構成される(例示的に「ILR」と呼ばれる)。IL-15超アゴニストの例を表3に示す。IL-15超アゴニストとペプチドとは、カテプシンまたはMMPによって切断されるリンカーなどの酵素的に切断可能なリンカーを介して連結される。酵素切断可能なリンカーは、配列番号1139~配列番号1161、配列番号1360~配列番号1363、及び配列番号1365のうちのいずれか1つである。あるいはまたはこれに加えて、IL-15超アゴニスト及びペプチドとは、下記表10に示されるような配列番号1163~配列番号1168のうちのいずれか1つのリンカーなどの安定的なリンカーまたは他の安定的なリンカーを介して連結される。FLAGなどの標識または精製に有用なタグを、必要に応じて融合体に付加する。前記タグは、「Xa」などの精製後に酵素的に切断されるリンカーと連結することができる。FLAG-Xa(DYKDDDDKIEGR)タグは、配列番号1162に示される。
ペプチドは、配列番号1、配列番号2、配列番号568、または配列番号569のペプチド、または上記のいずれかと80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれ以上同一である任意のペプチドであってよい。N末端からC末端にかけて、酵素的に切断可能なリンカーを有する融合ペプチドの例は、(1)配列番号1135または配列番号1136、(2)配列番号1170、(3)配列番号1139または配列番号1147、及び(4)配列番号1である。N末端からC末端にかけて、安定的なリンカーを有する融合ペプチドの例は、(1)配列番号1135または配列番号1136、(2)配列番号1170、及び(3)配列番号1である。
Figure 0007386161000108
Figure 0007386161000109
ペプチド-タンパク質融合は、M.R.Green,Joseph Sambrook.Molecular Cloning.2012 Cold Spring Harbor Press.に記載されるような標準的な分子生物学の手法を使用して、細胞内または無細胞系で組換えによって発現される。例えば、設計されたポリペプチド、ならびにリーダーペプチド及び発現に必要な他の要素をコードするDNAを合成する。コンストラクトを発現ベクターに挿入し、この発現ベクターを組み込んだウイルスを使用してCHO哺乳動物細胞またはSF9昆虫細胞などの細胞にトランスフェクトする。タンパク質を発現させ、精製する。あるいは、HermansonによるBioconjugate Techniquesに記載されるバイオコンジュゲート化学を用い、IL15超アゴニストを腫瘍ホーミング及び/または細胞透過性ペプチドに化学的に結合する。
0-X-L-Y-L(ただし、任意の組み合わせで、Lは、配列番号1169または配列番号1163であってよく、Xは、配列番号1176または配列番号1179であってよく、Yは、配列番号1177、配列番号1178であってよい)のようなIL-15剤を含むペプチド-IL-15剤複合体などの他のペプチドI/O複合体も同様に腫瘍ホーミング性を示し得る。さらに、ペプチド-IL-15剤複合体は、表4の複合体のいずれを含んでもよい。
実施例19
腫瘍ホーミング及び/または細胞透過性ペプチドに融合された4-1BBリガンドの発現
本実施例では、配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のいずれか1つなどの本開示のいずれかの腫瘍ホーミング及び/または細胞透過性ペプチドに融合された4-1BBリガンドの発現について記載する。ペプチドは、4-1BBリガンドのN末端またはC末端に融合される。4-1BBリガンドの例を表5に示す。4-1BBリガンド及びペプチドとは、カテプシンまたはMMPによって切断されるリンカーなどの酵素的に切断可能なリンカーを介して連結される。酵素切断可能なリンカーは、配列番号1139~配列番号1161、配列番号1360~配列番号1363、及び配列番号1365のうちのいずれか1つである。あるいは、4-1BBリガンド及びペプチドとは、上記表10に示されるような配列番号1163~配列番号1168のうちのいずれか1つのリンカーなどの安定的なリンカーまたは他の安定的なリンカーを介して連結される。FLAGなどの標識または精製に有用なタグを、必要に応じて融合体に付加する。前記タグは、「Xa」などの精製後に酵素的に切断されるリンカーと連結することができる。FLAG-Xaリンカー(DYKDDDDKIEGR)は、配列番号1162に示される。
ペプチドは、配列番号1、配列番号2、配列番号568、または配列番号569のペプチド、または上記のいずれかと80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれ以上同一である任意のペプチドであってよい。
ペプチド-タンパク質融合は、M.R.Green,Joseph Sambrook.Molecular Cloning.2012 Cold Spring Harbor Press.に記載されるような標準的な分子生物学の手法を使用して、細胞内または無細胞系で組換えによって発現される。例えば、設計されたポリペプチド、ならびにリーダーペプチド及び発現に必要な他の要素をコードするDNAを合成する。コンストラクトを発現ベクターに挿入し、この発現ベクターを組み込んだウイルスを使用してCHO哺乳動物細胞またはSF9昆虫細胞などの細胞にトランスフェクトする。タンパク質を発現させ、精製する。あるいは、HermansonによるBioconjugate Techniquesに記載されるバイオコンジュゲート化学を用い、4-1BBリガンドを腫瘍ホーミング及び/または細胞透過性ペプチドに化学的に結合する。
実施例20
中枢神経系(CNS)腫瘍のペプチド-RIG-Iリガンド結合体による治療
本実施例では、本明細書に開示されるI/Oに結合された本開示の任意のペプチド(配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のうちのいずれか1つ)による、脳腫瘍を含むCNS腫瘍の治療について記載する。I/OはRIG-Iリガンドである。ペプチドは、組換えによって発現させるかまたは化学合成され、実施例12、実施例13、実施例15、実施例16、または実施例17に記載されるようなRIG-Iリガンドに結合される。このペプチド-RIG-Iリガンド結合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であり、CNS腫瘍を有するものである。投与は、静脈内、皮下、鼻腔内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、または腫瘍内注射による。投与されると、ペプチド-RIG-Iリガンド結合体は、がん性組織及びその細胞にターゲティングされる。結合体は、がん細胞に内在化されて免疫原性細胞死をもたらし、これに続いて、実施例38に記載されるようにがんを低減または根絶し、また実施例45に記載されるようにインビボ応答を示す免疫応答が生じる。
実施例21
中枢神経系(CNS)腫瘍のペプチド-STINGリガンド結合体による治療
本実施例では、本明細書に開示されるI/Oに結合された本開示の任意のペプチド(配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のうちのいずれか1つ)による、脳腫瘍を含むCNS腫瘍の治療について記載する。I/OはSTINGリガンドである。ペプチドは、組換えによって発現させるかまたは化学合成され、実施例12、実施例13、実施例15、実施例16、または実施例17に記載されるようなSTINGリガンドに結合される。このペプチド-STINGリガンド結合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であり、CNS腫瘍を有するものである。投与は、静脈内、皮下、鼻腔内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、または腫瘍内注射による。投与されると、ペプチド-STINGリガンド結合体は、がん性組織及びその細胞にターゲティングされる。結合体は、がん細胞に内在化されて免疫原性細胞死をもたらし、これに続いて、実施例38に記載されるようにがんを低減または根絶し、また実施例45に記載されるようにインビボ応答を示す免疫応答が生じる。
実施例22
ペプチド-RIG-Iリガンド結合体による乳癌の治療
本実施例では、本明細書に開示されるI/Oに結合された本開示の任意のペプチド(配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のうちのいずれか1つ)による乳癌の治療について記載する。I/OはRIG-Iリガンドである。ペプチドは、組換えによって発現させるかまたは化学合成され、実施例12、実施例13、実施例15、実施例16、または実施例17に記載されるようなRIG-Iリガンドに結合される。このペプチド-RIG-Iリガンド結合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であり、乳癌を有するものである。投与は、静脈内、皮下、鼻腔内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、または腫瘍内注射による。投与されると、ペプチド-RIG-Iリガンド結合体は、がん性組織及びその細胞にターゲティングされる。結合体は、がん細胞に内在化されて免疫原性細胞死をもたらし、これに続いて、実施例38に記載されるようにがんを低減または根絶し、また実施例45に記載されるようにインビボ応答を示す免疫応答が生じる。
実施例23
ペプチド-STINGリガンド結合体による乳癌の治療
本実施例では、本明細書に開示されるI/Oに結合された本開示の任意のペプチド(配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のうちのいずれか1つ)による乳癌の治療について記載する。I/OはSTINGリガンドである。ペプチドは、組換えによって発現させるかまたは化学合成され、実施例12、実施例13、実施例15、実施例16、または実施例17に記載されるようなSTINGリガンドに結合される。このペプチド-STINGリガンド結合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であり、乳癌を有するものである。投与は、静脈内、皮下、鼻腔内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、または腫瘍内注射による。投与されると、ペプチド-STINGリガンド結合体は、がん性組織及びその細胞にターゲティングされる。結合体は、がん細胞に内在化されて免疫原性細胞死をもたらし、これに続いて、実施例38に記載されるようにがんを低減または根絶し、また実施例45に記載されるようにインビボ応答を示す免疫応答が生じる。
実施例24
ペプチド-RIG-Iリガンド結合体による肉腫の治療
本実施例では、本明細書に開示されるI/Oに結合された本開示の任意のペプチド(配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のうちのいずれか1つ)による肉腫の治療について記載する。I/OはRIG-Iリガンドである。ペプチドは、組換えによって発現させるかまたは化学合成され、実施例12、実施例13、実施例15、実施例16、または実施例17に記載されるようなRIG-Iリガンドに結合される。このペプチド-RIG-Iリガンド結合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であり、肉腫を有するものである。投与は、静脈内、皮下、鼻腔内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、または腫瘍内注射による。投与されると、ペプチド-RIG-Iリガンド結合体は、がん性組織及びその細胞にターゲティングされる。結合体は、がん細胞に内在化されて免疫原性細胞死をもたらし、これに続いて、実施例38に記載されるようにがんを低減または根絶し、また実施例45に記載されるようにインビボ応答を示す免疫応答が生じる。
実施例25
ペプチド-STINGリガンド結合体による肉腫の治療
本実施例では、本明細書に開示されるI/Oに結合された本開示の任意のペプチド(配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のうちのいずれか1つ)による肉腫の治療について記載する。I/OはSTINGリガンドである。ペプチドは、組換えによって発現させるかまたは化学合成され、実施例12、実施例13、実施例15、実施例16、または実施例17に記載されるようなSTINGリガンドに結合される。このペプチド-STINGリガンド結合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であり、肉腫を有するものである。投与は、静脈内、皮下、鼻腔内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、または腫瘍内注射による。投与されると、ペプチド-STINGリガンド結合体は、がん性組織及びその細胞にターゲティングされる。結合体は、がん細胞に内在化されて免疫原性細胞死をもたらし、これに続いて、実施例38に記載されるようにがんを低減または根絶し、また実施例45に記載されるようにインビボ応答を示す免疫応答が生じる。
実施例26
ペプチド-RIG-Iリガンド結合体による黒色腫の治療
本実施例では、本明細書に開示されるI/Oに結合された本開示の任意のペプチド(配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のうちのいずれか1つ)による黒色腫の治療について記載する。I/OはRIG-Iリガンドである。ペプチドは、組換えによって発現させるかまたは化学合成され、実施例12、実施例13、実施例15、実施例16、または実施例17に記載されるようなRIG-Iリガンドに結合される。このペプチド-RIG-Iリガンド結合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であり、黒色腫を有するものである。投与は、静脈内、皮下、鼻腔内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、または腫瘍内注射による。投与されると、ペプチド-RIG-Iリガンド結合体は、がん性組織及びその細胞にターゲティングされる。結合体は、がん細胞に内在化されて免疫原性細胞死をもたらし、これに続いて、実施例38に記載されるようにがんを低減または根絶し、また実施例45に記載されるようにインビボ応答を示す免疫応答が生じる。
実施例27
ペプチド-STINGリガンド結合体による黒色腫の治療
本実施例では、本明細書に開示されるI/Oに結合された本開示の任意のペプチド(配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のうちのいずれか1つ)による黒色腫の治療について記載する。I/OはSTINGリガンドである。ペプチドは、組換えによって発現させるかまたは化学合成され、実施例12、実施例13、実施例15、実施例16、または実施例17に記載されるようなSTINGリガンドに結合される。このペプチド-STINGリガンド結合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であり、黒色腫を有するものである。投与は、静脈内、皮下、鼻腔内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、または腫瘍内注射による。投与されると、ペプチド-STINGリガンド結合体は、がん性組織及びその細胞にターゲティングされる。結合体は、がん細胞に内在化されて免疫原性細胞死をもたらし、これに続いて、実施例38に記載されるようにがんを低減または根絶し、また実施例45に記載されるようにインビボ応答を示す免疫応答が生じる。
実施例28
ペプチド-IL-15剤複合体によるCNS腫瘍の治療
本実施例では、本明細書に開示されるI/Oとの融合体として発現される本開示の任意のペプチド(配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のうちのいずれか1つ)による、CNS及び/または脳のあらゆるがんを含むCNS腫瘍の治療について記載する。I/Oは、本明細書に開示される任意のIL-15剤である。ペプチドを、実施例18に記載されるように、IL-15との複合体として組換えによって発現させる。このペプチド-IL-15剤複合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であり、CNS及び/または脳のあらゆるがんを含む脳腫瘍を有するものである。投与は、静脈内、皮下、鼻腔内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、または腫瘍内注射による。投与されると、ペプチド-IL-15剤複合体は腫瘍微小環境に集中する。必要に応じて、IL-15剤は、腫瘍微小環境中または腫瘍細胞内でペプチドから切断される。必要に応じて、IL-15剤はプロセシングされ、腫瘍細胞の表面に提示される。IL-15剤は、免疫系の細胞に作用して、実施例38に記載されるようにがんを低減または根絶し、また実施例45に記載されるようにインビボ応答を示す免疫応答を開始、延長、及び/または増強する。
0-X-L-Y-L(ただし、任意の組み合わせで、Lは、配列番号1169または配列番号1163であってよく、Xは、配列番号1176または配列番号1179であってよく、Yは、配列番号1177、配列番号1178であってよい)のようなIL-15剤を含むペプチド-IL-15剤複合体などの他のペプチドI/O複合体も同様にCNS腫瘍の治療に使用することができる。さらに、ペプチド-IL-15複合体は、表4の複合体のいずれを含んでもよい。
実施例29
ペプチド-4-1BBリガンド融合体によるCNS腫瘍の治療
本実施例では、本明細書に開示されるI/Oとの複合体として発現される本開示の任意のペプチド(配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のうちのいずれか1つ)による、CNS及び/または脳のあらゆるがんを含む脳腫瘍の治療について記載する。I/Oは4-1BBリガンドである。ペプチドを、実施例19に記載されるように、4-1BBリガンドとの複合体として組換えによって発現させる。このペプチド-4-1BBリガンド複合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であり、CNS及び/または脳のあらゆるがんを含む脳腫瘍を有するものである。投与は、静脈内、皮下、鼻腔内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、または腫瘍内注射による。投与されると、ペプチド-4-1BBリガンド複合体は腫瘍微小環境に集中する。必要に応じて、4-1BBリガンドは、腫瘍微小環境中または腫瘍細胞内でペプチドから切断される。必要に応じて、4-1BBリガンドはプロセシングされ、腫瘍細胞の表面に提示される。4-1BBリガンドは、免疫系の細胞に作用して、実施例38に記載されるようにがんを低減または根絶し、また実施例45に記載されるようにインビボ応答を示す免疫応答を開始、延長、及び/または増強する。
実施例30
ペプチド-IL-15剤複合体による乳癌の治療
本実施例では、本明細書に開示されるI/Oとの融合体として発現された本開示の任意のペプチド(配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のうちのいずれか1つ)による乳癌の治療について記載する。I/Oは、本明細書に開示される任意のIL-15剤である。ペプチドを、実施例18に記載されるように、IL-15剤との融合タンパク質として組換えによって発現させる。このペプチド-IL-15剤複合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であり、乳癌を有するものである。投与は、静脈内、皮下、鼻腔内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、または腫瘍内注射による。投与されると、ペプチド-IL-15剤複合体は腫瘍微小環境に集中する。必要に応じて、IL-15剤は、腫瘍微小環境中または腫瘍細胞内でペプチドから切断される。必要に応じて、IL-15剤はプロセシングされ、腫瘍細胞の表面に提示される。IL-15剤は、免疫系の細胞に作用して、実施例38に記載されるようにがんを低減または根絶し、また実施例45に記載されるようにインビボ応答を示す免疫応答を開始、延長、及び/または増強する。
0-X-L-Y-L(ただし、任意の組み合わせで、Lは、配列番号1169または配列番号1163であってよく、Xは、配列番号1176または配列番号1179であってよく、Yは、配列番号1177、配列番号1178であってよい)のようなIL-15剤を含むペプチド-IL-15剤複合体などの他のペプチドI/O複合体も同様に乳癌の治療に使用することができる。さらに、ペプチド-IL-15複合体は、表4の複合体のいずれを含んでもよい。
実施例31
ペプチド-4-1BBリガンド融合体による乳癌の治療
本実施例では、本明細書に開示されるI/Oとの融合体として発現された本開示の任意のペプチド(配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のうちのいずれか1つ)による乳癌の治療について記載する。I/Oは4-1BBリガンドである。ペプチドを、実施例19に記載されるように、4-1BBリガンドとの融合タンパク質として組換えによって発現させる。このペプチド-4-1BBリガンド融合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であり、乳癌を有するものである。投与は、静脈内、皮下、鼻腔内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、または腫瘍内注射による。投与されると、ペプチド-4-1BBリガンド融合体は腫瘍微小環境に集中する。必要に応じて、4-1BBリガンドは、腫瘍微小環境中または腫瘍細胞内でペプチドから切断される。必要に応じて、4-1BBリガンドはプロセシングされ、腫瘍細胞の表面に提示される。4-1BBリガンドは、免疫系の細胞に作用して、実施例38に記載されるようにがんを低減または根絶し、また実施例45に記載されるようにインビボ応答を示す免疫応答を開始、延長、及び/または増強する。
実施例32
ペプチド-IL-15剤複合体による肉腫の治療
本実施例では、本明細書に開示されるI/Oとの融合体として発現された本開示の任意のペプチド(配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のうちのいずれか1つ)による肉腫の治療について記載する。I/Oは、本明細書に開示される任意のIL-15剤である。ペプチドを、実施例18に記載されるように、IL-15剤との複合体として組換えによって発現させる。このペプチド-IL-15剤複合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であり、肉腫を有するものである。投与は、静脈内、皮下、鼻腔内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、または腫瘍内注射による。投与されると、ペプチド-IL-15剤複合体は腫瘍微小環境に集中する。必要に応じて、IL-15剤は、腫瘍微小環境中または腫瘍細胞内でペプチドから切断される。必要に応じて、IL-15剤はプロセシングされ、腫瘍細胞の表面に提示される。IL-15剤は、免疫系の細胞に作用して、実施例38に記載されるようにがんを低減または根絶し、また実施例45に記載されるようにインビボ応答を示す免疫応答を開始、延長、及び/または増強する。
0-X-L-Y-L(ただし、任意の組み合わせで、Lは、配列番号1169または配列番号1163であってよく、Xは、配列番号1176または配列番号1179であってよく、Yは、配列番号1177、配列番号1178であってよい)のようなIL-15剤を含むペプチド-IL-15剤複合体などの他のペプチドI/O複合体も同様に肉腫の治療に使用することができる。さらに、ペプチド-IL-15剤複合体は、表4の複合体のいずれを含んでもよい。
実施例33
ペプチド-4-1BBリガンド融合体による肉腫の治療
本実施例では、本明細書に開示されるI/Oとの融合体として発現された本開示の任意のペプチド(配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のうちのいずれか1つ)による肉腫の治療について記載する。I/Oは4-1BBリガンドである。ペプチドを、実施例19に記載されるように、4-1BBリガンドとの融合タンパク質として組換えによって発現させる。このペプチド-4-1BBリガンド融合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であり、肉腫を有するものである。投与は、静脈内、皮下、鼻腔内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、または腫瘍内注射による。投与されると、ペプチド-4-1BBリガンド融合体は腫瘍微小環境に集中する。必要に応じて、4-1BBリガンドは、腫瘍微小環境中または腫瘍細胞内でペプチドから切断される。必要に応じて、4-1BBリガンドはプロセシングされ、腫瘍細胞の表面に提示される。4-1BBリガンドは、免疫系の細胞に作用して、実施例38に記載されるようにがんを低減または根絶し、また実施例45に記載されるようにインビボ応答を示す免疫応答を開始、延長、及び/または増強する。
実施例34
ペプチド-IL-15剤複合体による黒色腫の治療
本実施例では、本明細書に開示されるI/Oとの融合体として発現された本開示の任意のペプチド(配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のうちのいずれか1つ)による黒色腫の治療について記載する。I/Oは、本明細書に開示される任意のIL-15剤である。ペプチドを、実施例18に記載されるように、IL-15との複合体として組換えによって発現させる。このペプチド-IL-15剤複合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であり、黒色腫を有するものである。投与は、静脈内、皮下、鼻腔内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、または腫瘍内注射による。投与されると、ペプチド-IL-15剤複合体は腫瘍微小環境に集中する。必要に応じて、IL-15剤は、腫瘍微小環境中または腫瘍細胞内でペプチドから切断される。必要に応じて、IL-15剤はプロセシングされ、腫瘍細胞の表面に提示される。IL-15剤は、免疫系の細胞に作用して、実施例38に記載されるようにがんを低減または根絶し、また実施例45に記載されるようにインビボ応答を示す免疫応答を開始、延長、及び/または増強する。
0-X-L-Y-L(ただし、任意の組み合わせで、Lは、配列番号1169または配列番号1163であってよく、Xは、配列番号1176または配列番号1179であってよく、Yは、配列番号1177、配列番号1178であってよい)のようなIL-15剤を含むペプチド-IL-15剤複合体などの他のペプチドI/O複合体も同様に黒色腫の治療に使用することができる。さらに、ペプチド-IL-15複合体は、表4の複合体のいずれを含んでもよい。
実施例35
ペプチド-4-1BBリガンド融合体による黒色腫の治療
本実施例では、本明細書に開示されるI/Oとの融合体として発現された本開示の任意のペプチド(配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のうちのいずれか1つ)による黒色腫の治療について記載する。I/Oは4-1BBリガンドである。ペプチドを、実施例19に記載されるように、4-1BBリガンドとの融合タンパク質として組換えによって発現させる。このペプチド-4-1BBリガンド融合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であり、黒色腫を有するものである。投与は、静脈内、皮下、鼻腔内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、または腫瘍内注射による。投与されると、ペプチド-4-1BBリガンド融合体は腫瘍微小環境に集中する。必要に応じて、4-1BBリガンドは、腫瘍微小環境中または腫瘍細胞内でペプチドから切断される。必要に応じて、4-1BBリガンドはプロセシングされ、腫瘍細胞の表面に提示される。4-1BBリガンドは、免疫系の細胞に作用して、実施例38に記載されるようにがんを低減または根絶し、また実施例45に記載されるようにインビボ応答を示す免疫応答を開始、延長、及び/または増強する。
実施例36
ペプチド結合によるがん細胞の細胞質へのRIG-Iリガンドの送達
本実施例では、RIG-Iリガンドとのペプチド結合体のがん細胞の細胞質への送達について記載する。RIG-Iリガンドは、実施例12、実施例13、実施例15、実施例16、または実施例17に記載される本開示の任意のペプチド(例えば、配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316)に結合される。このペプチド-RIG-Iリガンド結合体を、ヒトまたは非ヒト動物などの対象に投与する。ペプチドの腫瘍ホーミング及び/または細胞透過性により、結合体はがん細胞の細胞質にアクセスする。
あるいは、任意のヒト腫瘍細胞株(例えば、MCF-7ヒト乳癌細胞株、HepG2細胞株、Huh7(.5)細胞株、HT29細胞株、HCT-15細胞、CaCO-2細胞株、MDA-MB-231細胞株、MDA-MB-453細胞株、MDA-MB-468細胞株、BT-549細胞株、HCC38細胞株、4T1細胞株、MDA-MB-436細胞株、HL-60細胞株、Capan-1細胞株、CFPAC-1細胞株、SK-OV3細胞株、PC3細胞株、Du145細胞株、LnCap細胞株、H1299細胞株、A549細胞株、H358細胞株、H460細胞株、LK2細胞株、DO4mel細胞株、またはMa-Mel-86c細胞株)、または任意のマウス腫瘍細胞株(例えば、Panc02細胞株、PANC-1細胞株、Mia PaCa-2細胞株、4T1細胞株、CT26細胞株、A20細胞株、HcMel12細胞株、B16F10細胞株、EG7(Ova)細胞株、C1498細胞株、LLC細胞株、GL261-luc細胞株、またはMC38細胞株)などのがん細胞株を培養中で増殖させる。細胞をペプチドI/O複合体に曝露する。曝露されると、結合体は細胞に内在化され、I/Oが放出される。標的(RIG-I)は細胞質中に存在し、I/Oによって刺激され、I型インターフェロン(例えば、IFNβ)が細胞培地中に放出される。細胞培地を回収し、ELISAアッセイを用いてI型インターフェロンの量を測定する。放出された量を、刺激されていない細胞及び遊離I/Oで処理した細胞を含むコントロールから放出されたI型インターフェロンの量と比較する。ペプチド結合がない場合、I/Oは細胞膜を透過せず、細胞質中の標的(RIG-I)をペプチドI/O複合体と同じレベルで刺激することはできない。コントロールと比較して、結合体で刺激した培養物からのI型インターフェロンの放出量の増加は、ペプチドによる細胞質へのI/Oの送達、及びI/OであるRIG-IリガンドによるRIG-Iの刺激を示す。
実施例37
ペプチド結合によるがん細胞の細胞質へのSTINGリガンドの送達
本実施例では、STINGリガンドとのペプチド結合体のがん細胞の細胞質への送達について記載する。STINGリガンドは、実施例12、実施例13、実施例15、実施例16、または実施例17に記載される本開示の任意のペプチド(例えば、配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316)に結合される。このペプチド-STINGリガンド結合体を、ヒトまたは非ヒト動物などの対象に投与する。ペプチドの腫瘍ホーミング及び/または細胞透過性により、結合体はがん細胞の細胞質にアクセスする。
あるいは、任意のヒト腫瘍細胞株(例えば、MCF-7ヒト乳癌細胞株、HepG2細胞株、Huh7(.5)細胞株、HT29細胞株、HCT-15細胞、CaCO-2細胞株、MDA-MB-231細胞株、MDA-MB-453細胞株、MDA-MB-468細胞株、BT-549細胞株、HCC38細胞株、4T1細胞株、MDA-MB-436細胞株、HL-60細胞株、Capan-1細胞株、CFPAC-1細胞株、SK-OV3細胞株、PC3細胞株、Du145細胞株、LnCap細胞株、H1299細胞株、A549細胞株、H358細胞株、H460細胞株、LK2細胞株、DO4mel細胞株、またはMa-Mel-86c細胞株)、または任意のマウス腫瘍細胞株(例えば、Panc02細胞株、PANC-1細胞株、Mia PaCa-2細胞株、4T1細胞株、CT26細胞株、A20細胞株、HcMel12細胞株、B16F10細胞株、EG7(Ova)細胞株、C1498細胞株、LLC細胞株、GL261-luc細胞株、またはMC38細胞株)などのがん細胞株を培養中で増殖させる。細胞をペプチドI/O複合体に曝露する。曝露されると、結合体は細胞に内在化され、I/Oが放出されるかまたは細胞質中に存在する。標的(STING)は細胞質中に存在し、I/Oによって刺激され、I型インターフェロン(例えば、IFNβ)が細胞培地中に放出される。細胞培地を回収し、ELISAアッセイを用いてI型インターフェロンの量を測定する。放出された量を、刺激されていない細胞及び遊離I/Oで処理した細胞を含むコントロールから放出されたI型インターフェロンの量と比較する。ペプチド結合がない場合、I/Oは細胞膜を透過せず、また、充分な量でエンドソームから放出もされず、細胞質中の標的(STING)をペプチドI/O複合体と同じレベルで刺激することはできない。コントロールと比較して、結合体で刺激した培養物からのI型インターフェロンの放出量の増加は、ペプチドによる細胞質へのI/Oの送達、及びI/OであるSTINGリガンドによるSTINGの刺激を示す。
実施例38
免疫原性細胞死(ICD)のインビトロでの実証
本実施例では、本開示のペプチドI/O複合体の曝露後の、がん細胞における免疫原性細胞死(ICD)のインビトロでの誘導について記載する。ペプチド(例えば、配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のうちのいずれか1つ)を組換えにより発現させるかまたは化学合成した後、実施例12、実施例13、実施例15、実施例16、または実施例17に記載されるようにしてRIG-IリガンドまたはSTINGリガンドに結合した。MCF-7ヒト乳癌細胞株などのがん細胞株を培養中で増殖させる。細胞をペプチドI/O複合体に曝露する。曝露されると、ペプチドI/O複合体は細胞に内在化され、I/Oが放出されるかまたは細胞質中に存在する。I/Oは、その標的(RIG-1、MDA5、またはSTING)を刺激し、実施例36に記載されるようなI型インターフェロンの放出、及びICDに起因する他の細胞事象をもたらす。これらには、ケモカインCXCL10とサイトカインIL-6の分泌、HMGB1及びHsp70の放出、細胞表面MHCクラスI(MHC I)及びFas発現の上方制御、及び細胞表面のカルレティキュリンの露出が挙げられる。培養中の細胞を、ペプチドI/O複合体に一晩、24時間、48時間、またはそれよりも長い時間にわたって曝露する。細胞培養培地を採取し、分泌されたCXCL10、IL-6、HMGB1、またはHsp70の量をELISAで測定する。MHC I及びFasの発現、ならびにカルレティキュリンの細胞表面露出は、フローサイトメトリーによって測定される。細胞死の誘導は、アネキシンVに対するモノクローナル抗体(mAb)に加えてヨウ化プロピジウム(PI)または4’、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)などの別の蛍光DNA染色で細胞を染色することによって示される。細胞でアポトーシスが進行するのにつれ、細胞は最初にアネキシンVを発現し、次いでPIに対する透過性を示すようになる。コントロール細胞培養と比較して、これらのパラメータの1つ以上の増加は、ICD経路がペプチドI/O複合体によって刺激されたことを示す。
実施例39
免疫原性細胞死を起こしたがん細胞による樹状細胞活性化のインビトロでの実証
本実施例では、実施例38に記載されるような本開示のいずれかのペプチドI/O複合体への曝露後に免疫原性細胞死(ICD)を起こしたがん細胞との共培養後の樹状細胞(DC)の活性化について記載する。CD11c樹状細胞をマウス脾臓から単離し、本開示のペプチドI/O複合体で処理した、例えば、任意のヒト腫瘍細胞株(例えば、MCF-7ヒト乳癌細胞株、HepG2細胞株、Huh7(.5)細胞株、HT29細胞株、HCT-15細胞株、CaCO-2細胞株、MDA-MB-231細胞株、MDA-MB-453細胞株、MDA-MB-468細胞株、BT-549細胞株、HCC38細胞株、4T1細胞株、MDA-MB-436細胞株、HL-60細胞株、Capan-1細胞株、CFPAC-1細胞株、SK-OV3細胞株、PC3細胞株、Du145細胞株、LnCap細胞株、H1299細胞株、A549細胞株、H358細胞株、H460細胞株、LK2細胞株、DO4mel細胞株、またはMa-Mel-86c細胞株)、または任意のマウス腫瘍細胞株(例えば、Panc02細胞株、PANC-1細胞株、Mia PaCa-2細胞株、4T1細胞株、CT26細胞株、A20細胞株、HcMel12細胞株、B16F10細胞株、EG7(Ova)細胞株、C1498細胞株、LLC細胞株、GL261-luc細胞株、またはMC38細胞株)と共に培養中で増殖させる。非処理のMCF-7細胞をネガティブコントロールとして用いる。細胞は、12時間、一晩、24時間、48時間、またはそれよりも長い時間にわたって共培養する。共培養後、DC上の細胞表面マーカーの発現及び共培養の培地中へのサイトカイン産生を測定する。DC上で発現が上方制御する細胞表面マーカーとしては、共刺激分子CD80及びCD86ならびに初期活性化マーカーCD69が挙げられる。サイトカインIL-1、IL-6、及び/またはCXCL10のレベルは、刺激された腫瘍細胞単独の培養よりも共培養からの培地で顕著に高く、これは主としてDCからの産生を示す。
実施例40
リポソーム送達
本実施例では、本開示の薬物またはペプチド薬物結合体をインビボでがん細胞に送達するためのリポソームの使用について記載する。本開示のペプチドを、実施例41に記載されるようにリポソーム粒子または他のナノ粒子の表面に付着させる。本開示のRIG-1またはSTINGリガンドをリポソームに封入する。リポソームを、静脈内または腫瘍内注射によって患者に送達する。ペプチドは、リポソームをターゲティングして腫瘍細胞により内在化させる。内在化後、リガンドは腫瘍細胞の細胞質に送達され、そこで標的を刺激して免疫原性細胞死(ICD)を誘導することができる。
実施例41
リポソームの製造
本実施例では、リポソームの製造について記載する。大豆ホスファチジルコリン、DC-chol、DSPE-PEG、及びマレイミド-PEG2000-DSPEをクロロホルムに溶解する。ロータリーエバポレーションまたはガス吹き付けにより溶媒を蒸発させる。脂質膜をクロロホルムに再溶解し、送達するI/O(例えば、RIG-Iリガンド、STINGリガンド、IL-15剤、4-1BBリガンド、またはMDA5リガンド)をバッファーに加える。混合物をボルテックスし、超音波処理する。溶液を37℃で蒸発させてクロロホルムを除去し、リポソームを水相溶液中に残す。ポリカーボネートフィルターを代えて(例えば、400nm、200nm、次いで100nm)溶液を押し出す。本開示のペプチドはチオール基を有するが、これを、アミン基をトラウト試薬と反応させることによってペプチドに導入する。チオール化されたペプチドを押し出されたリポソームとインキュベートすると、ペプチドのチオール基が脂質のマレイミド基と反応し、それにより、表面に本開示のペプチドを提示したリポソームが得られる。場合により、上記の代わりにまたは上記に加えて、送達する薬剤をチオール基で官能化してリポソームとインキュベートすることにより、表面に薬剤が結合したリポソームが得られる。室温で一晩インキュベートした後、リポソームをクロマトグラフィーにより精製する。
実施例42
ペプチド-IL-15剤複合体またはペプチド-IL-15超アゴニスト複合体のインビトロ生物活性
本実施例では、本開示のいずれかのペプチド(例えば、配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のうちのいずれか1つなど)との複合体として発現された任意のIL-15剤または具体的にはIL-15超アゴニスト(I/O)のインビトロ生物活性について記載する。本開示のペプチドを、実施例18に記載されるようにしてIL-15剤またはIL-15超アゴニスト(例えば、配列番号1135~配列番号1138のうちのいずれか1つ)との複合体として組換えにより発現させる。ヒト末梢血単核細胞(PBMC)は、健康な成人ドナーから分離され、密度勾配遠心分離により調製する。細胞を、サイトカインが添加されていない培地(ネガティブコントロール)、組換えヒトIL-15を含む培地(ポジティブコントロール)、または等モル量の本明細書に記載されるペプチドI/O複合体を含む培地中で培養する。最大7日間の培養後、細胞をさまざまな細胞系統に特異的な細胞表面タンパク質に対する抗体で染色し、フローサイトメトリーを使用して定量する。ネガティブコントロール培養物に対するCD56+T細胞及びNK細胞集団の増殖は、IL-15活性が存在することを示す。
T細胞の細胞毒性も、IL-15剤またはIL-15超アゴニストによって増加する。この活性を測定するため、CD3+T細胞を抗体でコーティングした磁気ビーズを使用してPBMCから単離し、単離した細胞を、サイトカインが添加されていない培地(ネガティブコントロール)、組換えヒトIL-15を含む培地(ポジティブコントロール)、または等モル量の本明細書に記載されるペプチドI/O融合体を含む培地中で培養する。最大7日間の培養後、細胞を、K562(ヒト白血病細胞株)などの標的細胞株に対する細胞毒性アッセイにおいてエフェクターとして使用する。標的細胞の殺傷を例えば、51Cr放出アッセイによって測定する。細胞毒性エフェクター機能の増加は、IL-15活性が存在することを示す。
IL-15活性は、CTLL、32D、及びTF1を含む因子依存性細胞株の増殖を刺激する能力によってインビトロで定量化される。活性化されたヒト末梢血T細胞の増殖も、IL-15活性の測定に用いることができる。例えば、因子依存性細胞株またはT細胞の培養物に、異なるIL-15融合体を異なる濃度で加える。培養の数日(1~4日)後、各培養中の細胞数を、生細胞を検出するための多くの定量的方法のいずれか1つによって測定することができる。最大増殖率の50%を与えるサイトカイン融合体の濃度を効力の尺度として用いる。
IL-15とIL-15Ra sushi+及び本開示の任意のペプチド(例えば、配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のうちのいずれか1つなど)との融合体、ならびに、L0-X-L-Y-L(ただし、任意の組み合わせで、Lは、配列番号1169または配列番号1163であってよく、Xは、配列番号1176または配列番号1179であってよく、Yは、配列番号1177、配列番号1178であってよい)のようなIL-15剤を含むペプチド-IL-15剤複合体であるペプチドI/O複合体などの他のペプチドI/O複合体も同様にそのようなIL-15活性を示し得る。さらに、ペプチド-IL-15複合体は、表4の複合体のいずれを含んでもよい。
実施例43
IL-15とIL-15Ra sushi+及びペプチドの融合
本実施例は、腫瘍に非常に強力なIL-15剤を送達するためのIL-15とIL-15Ra sushi+及び本開示の任意のペプチド(例えば、配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のうちのいずれか1つなど)との融合体であるペプチドI/O複合体について記載する。融合体は、IL-15とIL-15Raの部分とから構成され、これらは、IL-15-IL15Ra超アゴニスト融合体と本開示のペプチドとの間で場合により切断可能であることにより、IL-15超アゴニスト融合体を細胞内に放出させ、細胞表面に再びリサイクルかまたは分泌することを可能とするリンカーを含むリンカーを介して本開示のペプチドにさらに連結される。図3Aは、本開示の配列番号568のペプチドとのIL-15超アゴニスト融合体の図を示す((Mortier et al.(J Biol Chem.2006 Jan 20;281(3):1612-9)より改変))。ペプチドは一例であり、本開示の任意のペプチドで置換することができる。
図3Aは、sushi+部分、リンカー、IL-15、及び配列番号568を使用したIL-15Raの配列を示す(N末端からC末端方向に「RLIX」と呼ばれる)。前記融合体の配列は配列番号1173に記載される
(図3Bにも示される、MAPRRARGCRTLGLPALLLLLLLRPPATRGDYKDDDDKIEGRITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPGGSGGGGSGGGSGGGGSLQNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXMCMPCFTTDHQMARKCDDCCGGKGRGKCYGPQCLCR)。配列番号1173の一連のXはリンカーで置き換えられる。リンカーは、切断可能であり得るか(例えば、配列番号1139~配列番号1161、配列番号1360~配列番号1363及び配列番号1365のうちのいずれか1つ)、または安定的であり得る(例えば、配列番号1163~配列番号1172のうちのいずれか1つ)。Spリーダー(MAPRRARGCR TLGLPALLLL LLLRPPATRG)(配列番号1232)及びFLAG-Xaタグは、分泌の案内及び標識用のタグとしてどちらも任意選択的であり、これらは、他のリーダーまたはタグに置き換えるかあるいは省略することができる。図4Aは、IL-15、リンカー、IL-15Ra sushi+、及び配列番号568のペプチド(「ILRX」と呼ばれる)の説明図を示し、その配列は、配列番号1174
(図4Bにも示される、MAPRRARGCRTLGLPALLLLLLLRPPATRGDYKDDDDKIEGRNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXMCMPCFTTDHQMARKCDDCCGGKGRGKCYGPQCLCR)に記載されている。Spリーダー(配列番号1232)及びFlag-Xaタグは、分泌の案内及び標識用のタグとしてどちらも任意選択的であり、これらは、他のリーダーまたはタグに置き換えるかあるいは省略することができる。完全な配列には、成熟した分泌タンパク質及びIL-15Rα sushi+配列(エクソン2によってコードされるsushiドメインとエクソン3によってコードされるN末端の13個のアミノ酸とから構成さる)が含まれる。例えば、IL-15剤は、L-X-L-Y-L(ただし、XまたはYの一方は配列番号1177または配列番号1178のいずれか一方であってよく、XまたはYの一方は配列番号1176であってよい。さらに、L、L及びLは、配列番号1163~配列番号1172のうちのいずれか1つであるか、またはXnであってよい(ただし、各Xは独立して任意のアミノ酸であり、n=1~50であるか、または存在しなくてよい)。別の例として、IL-15剤は、L0-X-L-Y-Lであってよい(ただし、任意の組み合わせで、Lは、配列番号1169または配列番号1163であってよく、Xは、配列番号1176または配列番号1179であってよく、Yは、配列番号1177、配列番号1178であってよい)。さらに、ペプチド-IL-15複合体は、表4の複合体のいずれを含んでもよい。
FLAGエピトープ及び第Xa因子結合部位(FLAG-Xa)をコードする配列番号1162を、シグナルペプチド(その翻訳後分泌を案内する)とコード配列との間に場合により付加する。シグナルペプチドは、サブユニットに関連付けられた天然の配列、または人工配列である。19aaのペプチドNH2-GGSGGGGSGGGSGGGGSLQ-COOH(配列番号1163)(Bouchard et al.J Mol Biol.2008 Sep 26,382(1):1-12)または20aaのペプチドNH2-SGGSGGGGSGGGSGGGGSLQ-NH2(配列番号1169)(Mortier et al.J Biol Chem.2006 Jan 20;281(3):1612-9)などのリンカーペプチドが、RLIXのIL-15Rα-sushi+のC末端とIL-15のN末端との間に挿入される。26aaリンカーペプチド:NH2-SGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQ-COOH(配列番号1165)(Mortier 2006)が、ILRXのIL-15Rα-sushi+のN末端とIL-15のC末端の間に挿入される。この切断可能なリンカー(NH2切断可能リンカー)は、IL-15(RLIX)または15Rα-sushi+(ILRX)のC末端とクロロトキシンのN末端の間に挿入される。NH2切断可能リンカーは、配列番号1139~配列番号1161、配列番号1360~配列番号1363、及び配列番号1365のうちのいずれか1つのような任意の切断可能なリンカーである。
上記のIL-15配列以外に、以下のIL-15突然変異体のうちの1つ以上を置換することができる。すなわち、L45D(Bernard et al.J Biol Chem.2004 Jun 4;279(23):24313-22)、L45E(Bernard et al.J Biol Chem.2004 Jun 4,279(23):24313-22)、Q48K(Bernard et al.J Biol Chem.2004 Jun 4;279(23):24313-22)、V49D(Bernard et al.J Biol Chem.2004 Jun 4;279(23):24313-22)、S51D(Bernard et al.J Biol Chem.2004 Jun 4;279(23):24313-22)、L52D(Bernard et al.J Biol Chem.2004 Jun 4;,279(23):24313-22)、N72D(Zhu 2009及びUS008163879)、N72E(Zhu 2009)、N72A(Zhu 2009)、N72S(Zhu 2009)、N72Y(Zhu 2009)、N72R(US008163879)、またはD61A(US008163879)(ただし、最初の文字は、IL15配列中の数字で示される位置で変異されるアミノ酸を示し、2番目の文字はそれに置き換えられる新たなアミノ酸を示す)。例えば、L45Dは、IL15の45位のLがDに変異していることを意味する。内因性の30aaのIL-15Rαシグナルペプチドは、効率的なCHO分泌のために当該分野で使用されるシグナルペプチドのいずれかで置換することができる。
本明細書に開示されるペプチドをさまざまなIL-15剤に結合(例えば、組換えにより融合)することによってペプチド-IL-15剤複合体が得られた。本開示のペプチドを、リンカーを介して完全長の成熟ヒトIL-15(配列番号1177)及びヒトIL-15受容体のIL-15Rα sushiドメインの残基残基1~77(配列番号1176)と融合した。ペプチド-IL-15剤複合体には、剛直なリンカー及び柔軟なリンカーが含まれ(Chen 2013)、配列番号568及び配列番号569のペプチド、または上記のいずれかと80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上、同一である任意のペプチドで構成されていた。一部のペプチド-IL-15剤複合体は、カテプシン切断可能なVal-Ala部位(配列番号1139)(Kramer 2017,Jain 2015)またはMMP切断可能なPLGLAG配列(配列番号1499)(Aguilera 2009)などの設計された酵素による切断可能部位も含んでいる。10xHisタグ(配列番号1498)またはFLAGタグを、通常はペプチドを有していないペプチドI/O複合体の末端に付加することで精製及び標識を容易にすることが行われていた。ペプチド-IL-15剤複合体の配列を表4に示す。配列番号1317~配列番号1329の配列を有するペプチドI/O複合体の遺伝子を合成した。
分子生物学的手法を行った。各遺伝子配列は以下の設計:HindIII-Kozak-igkappa-10xHis(配列番号1498)-GOI-**-EcoRIを用いて生成した(ただし、IgKリーダーは、METDTLLLWVLLLWVPGST(配列番号1500)であり、GOIは目的の遺伝子を意味する)。遺伝子を合成し、発現ベクターpcDNA3.4に直接サブクローニングし、コーディング領域の配列を確認した。目的の合成遺伝子を含む5μgの精製プラスミドDNAを哺乳動物発現ベクターにクローニングし、供給した。遺伝子は支障なく合成され、プラスミドが作製された。
発現及びRLIの精製。配列番号1317~配列番号1321のペプチドI/O複合体を、Expi293(HEK293)細胞培養中、37℃、8%CO、回転速度125RPMで100mLスケールで発現させた。生存率が80%以下に低下し次第(トランスフェクションの6日後)、馴化上清を回収し、遠心分離により単離した。得られた馴化培地をドライアイスで凍結した。
Hisタグ付けされたRLIタンパク質(配列番号1342)としてのRLI(L0-X-L-Y-L(ただし、Lは、任意の組み合わせで、L1は、配列番号1169または配列番号1163であってよく、Xは、配列番号1176または配列番号1179であってよく、Yは、配列番号1177、配列番号1178であってよい)などのIL-15剤を含む)を、回転速度85RPMで300mLのスケールで同様に発現させ、HisTrap IMACカラムを使用して精製した。溶出は、PBS、500mM NaCl中、20~500mMのイミダゾールの直線勾配を用いて行った。D13~H13の画分をプールし、次いでPBSに対して16時間透析した。63mgの0.67mg/mLの生成物(A280及びE1%=9.3に基づく)を、47×2.0mLアリコートとして凍結し、発送した。分析では、クーマシー染色による還元的SDS-PAGE、及び、抗His抗体を使用した還元的ウエスタンブロットをレーンごとに12μLをロードして行った。
配列番号1317~配列番号1321の精製。HisPur NI-NTAニッケルカラムを使用して配列番号1317~配列番号1321の小規模精製を行った。各ペプチド-IL-15剤複合体について、2mLの馴化上清を2mLの平衡化バッファー(10mMイミダゾールを含む20mMリン酸ナトリウム、300mM塩化ナトリウム(PBS)、pH7.4)と混合した。各カラムを最初のローディングの前に2mLの平衡化バッファーで平衡化し、4mLの1:1希釈試料をカラムにロードしてフロースルーした。フロースルー(FT)画分を収集し、4℃で保存した。ロード後、カラムを2mLずつの洗浄バッファー(25mMイミダゾールを含むPBS、pH7.4)で3回洗浄し、各画分(W1~3)を別々に回収(3×2mL)して4℃で保存した。ペプチド-IL-15剤複合体を、1mLの溶出バッファー(250mMイミダゾールを含むPBS)を加えてさらに2回繰り返すことによって溶出し、合計で3mL(3×1mL)を回収した。溶出画分(E1~3)を4℃で保存した。すべての画分(上清、FT、W1~3、及びE1~3)を、還元的SDS-PAGE(レーンあたり20μLのロード)で分析し、クーマシーブルー(Simply Blue Coomassie Stain)で染色した。
融合タンパク質を含む溶出画分をプールし(合計2mL)、Zebaスピン脱塩カラム(床容量5mL)を使用してバッファーをPBSと交換した。15mLのコニカルコレクションチューブにカラムを入れ、1000×gで2分間遠心して保存バッファーを除去することによってカラムの準備処理を行った。PBS(2.5mL)をカラムに加え、1000×gで2分間遠心し、毎回コレクションチューブからバッファーを捨ててさらに3回繰り返した。カラムを新しいコレクションチューブに入れ、2mLの試料をレジン床の中央に加えた。カラムを1000×gで2分間遠心して試料を回収した。すべての試料を、還元SDS-PAGEによって分析し、クーマシーブルーで染色し、A280及びE1%(8.2~8.6の範囲)に基づいて定量した。試料をエッペンドルフチューブに分注し(各500μL)、-20℃で保存した。
20mLの各上清を20mLの平衡化バッファーと混合することにより、配列番号1317及び配列番号1321の各ペプチド-IL-15剤複合体に対して大規模な精製(10×)を行った。1:1希釈試料(40mL)をニッケルカラムにロードし、さらなる洗浄(5×2mL)工程及び溶出(5×1mL)工程を追加した以外は小規模精製について上記に述べたのと同じ条件を用いて洗浄及び溶出した。すべての画分を、還元的SDS-PAGEによって分析し、クーマシーブルーで染色した。プールされた溶出画分のPBSでのバッファー交換に続いて、最終試料を還元的SDS-PAGEと非還元的SDS-PAGEの両方で比較した。
Hisタグ付けされたRLIタンパク質(配列番号1342)精製としてのRLIタンパク質(例えば、L0-X-L-Y-L(ただし、Lは、任意の組み合わせで、Lは、配列番号1169または配列番号1163であってよく、Xは、配列番号1176または配列番号1179であってよく、Yは、配列番号1177、配列番号1178であってよい)などのIL-15剤を含む)の発現。精製300mLの配列番号1342の発現及び精製により、0.67mg/mL(28μM)の63mgの生成物、または細胞培養液1mL当たり0.2mgの生成物が得られた。図45は、Hisタグ付けされたRLIタンパク質(配列番号1342)としてのRLIタンパク質(例えば、配列番号1169、配列番号1176、及び配列番号1177を含む)のクーマシー染色したSDS-PAGE及び抗Hisウエスタン分析を示し、約25~26kDa及び30~34kDaに2本のバンドの強いシグナルを示している。2本のバンドは、Kermer et al.(Mol Cancer Ther.2012 June;11(6):1279-1288)にみられるような異なるグリコシル化パターンを表し得る。
図46は、Hisタグ付けされたRLIタンパク質(配列番号1342)としてのRLIタンパク質(例えば、配列番号1169、配列番号1176、及び配列番号1177を含む)のIMAC精製のクロマトグラム及びSDS-PAGE分析を示す。画分D13~H13をプールし、透析して最終物質を得た。図47は、配列番号1317~配列番号1321の発現からの馴化培地のクーマシー染色したSDS-PAGE及び抗Hisウェスタン分析を示す。配列番号1317、配列番号1319、及び配列番号1321は、両方の分析で約38~42kDaに強いバンドを示した。バンドの幅及び不明瞭さは、複数の重複するグリコシル化パターンを示し得る。N末端において、配列番号1317、配列番号1319、及び配列番号1321はいずれもHisタグを有し、その後にIL-15Rαタンパク質が続く。配列番号1318では、クーマシー染色による標的サイズの近くに大幅に薄いバンドがみられたが、このウエスタン分析では明らかなシグナルはみられなかった。配列番号1318もN末端のHisタグを有していたが、HisタグはIL-15に隣接している。このような構成のため、Hisタグがウェスタンブロットで可視化するための抗His抗体によって利用しにくくなる可能性がある。配列番号1320は、クーマシーにより標的サイズに視認される染色を(あったにしても)ほとんど示さなかったが、ウエスタン分析ではシグナル(約34kDa及び39kDaの2本のバンド、異なるグリコシル化パターンも表し得る)を示した。配列番号1320はN末端に配列番号568のペプチドを含み、C末端にHisタグを有する。より高い発現収量が、N末端にIL-15または配列番号568を有する場合よりも、N末端に15Rα-sushi+を有する場合に得られるようである。
配列番号1317及び配列番号1321の精製。図48は、配列番号1317及び配列番号1321のペプチド-IL-15剤複合体の小規模精製から得られた画分のクーマシー染色されたSDS-PAGEを示す。図49は、プールし、PBS中でバッファー交換した後の各ペプチド-IL-15剤複合体の精製画分E2~E3のクーマシー染色されたSDS-PAGEを示す。予想されたとおり、配列番号1317及び配列番号1321の両方がニッケルカラムに結合してカラムから溶出し、各融合体の精製された形態はSDS-PAGEにより約38kDのバンドを示し、上記に述べたウエスタンブロットのデータと一致することが分かった。
配列番号1318の精製。図50は、配列番号1318の小規模精製から得られた画分のクーマシー染色されたSDS-PAGEを示す。図51は、プールし、PBS中でバッファー交換した後の精製画分E2~E3のクーマシー染色されたSDS-PAGEを示す。配列番号1317及び配列番号1321と同様、配列番号1318はニッケルカラムに結合してカラムから溶出し、精製された形態はSDS-PAGEにより約38kDのバンドを示した。上記に述べたように抗His抗体を使用してウェスタンブロットで分析した場合に顕著なバンドは存在しなかったため、この結果は予想外のものであったが、Hisタグ配列は、ニッケルカラムに固定化されたニッケル荷電キレートにアクセスすることができた。
配列番号1319及び配列番号1320の精製。図52は、配列番号1319及び配列番号1320の小規模精製から得られた画分のクーマシー染色されたSDS-PAGEを示す。配列番号1317、配列番号1318、及び配列番号1321と同様、配列番号1319はニッケルカラムに結合して、カラムから溶出し、精製された形態はSDS-PAGEにより約38kDのバンドを示した。しかしながら、配列番号1320のクーマシー染色されたSDS-PAGEによる染色はほとんど認められなかった。これは、出発物質の同じ領域の極めて薄いバンド及びウェスタンブロット分析でみられた薄い染色の両方と一致している。
配列番号1317~配列番号1321の精製の概要を表11に示す。全体として、それぞれのHisタグ付けされたペプチド-IL-15剤複合体の精製は成功し、高発現の複合体ではクーマシー染色されたSDS-PAGEで顕著なバンドが認められ、1mLの出発物質からの最終収量は、80~130μgの範囲内であった。
Figure 0007386161000110
小規模精製に使用したものと同じサイズのカラム(1mL)で、20mLの出発物質(10×)を使用して配列番号1317及び配列番号1321の大規模精製を行った。図53は、配列番号1317及び配列番号1321の大規模精製から得られた画分のクーマシー染色されたSDS-PAGEを示す。両方のペプチド-IL-15剤複合体で、高濃度の精製タンパク質が画分E2~E4に溶出した。各精製ランのフロースルー(FT)画分に38kDにみられる顕著なバンドがないことは、カラムのロード量が過剰でなく、これらのタンパク質に対して高い結合能力を有することを示した。図54は、プールし、PBSでバッファー交換し、還元及び非還元条件下でさらに分析した、画分E2~E4のクーマシー染色されたSDS-PAGEを示す。非還元条件下で見られる約38kDの単一の顕著なバンドは、タンパク質が均質であり、分子間ジスルフィドを形成してジスルフィド結合された凝集体を生じ得るジスルフィド結合のスクランブルがないことを示唆している。
0-X-L-Y-L(ただし、任意の組み合わせで、Lは、配列番号1169または配列番号1163であってよく、Xは、配列番号1176または配列番号1179であってよく、Yは、配列番号1177、配列番号1178であってよい)のようなIL-15剤を含むペプチド-IL-15剤複合体などの他のペプチドRLIも同様に精製することができる。さらに、ペプチド-IL-15剤複合体は、表4の複合体のいずれを含んでもよい。
実施例44
ペプチド免疫抗がん剤(I/O)複合体のスクリーニング
本実施例では、がん治療のために本開示のペプチドとの複合体として投与されるI/Oのスクリーニングについて記載する。配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のいずれかのペプチドなどの本開示のペプチドは、組換えによって発現されるかまたは化学合成されて、I/Oと複合体化される。I/Oは、IL-15剤、4-1BBリガンド、RIG-Iリガンド、MDA5リガンド、もしくはSTINGリガンド、または、本出願の例示的なI/O、例えば、これらに限定されるものではないが、インターフェロン、インターロイキン(IL)-2、IL-15、IL-21、IL-12、IL-23、IL-27、IL-1、IL-18、IL-33を含むサイトカイン;これらに限定されるものではないが、CTLA-4、PD-1、TIM-3、LAG-3、VISTA、B7-H3、B7-H4、B7S1、ガレクチン9、CD244、BTLA、CD160、CIS、LIGHT、TIGITの阻害剤を含むチェックポイント阻害剤;これらに限定されるものではないが、TLR、NLR、ALR、CLR、RLR、RIG-I、及びSTINGを含むパターン認識受容体(PRR)のリガンド;これらに限定されるものではないが、がん細胞の細胞表面のCD47発現を下方制御させることができる、またはCD47-SIRPα相互作用を直接遮断することができるSIRPαを含むマクロファージチェックポイントCD47を阻害する分子;酵素インドールアミン-2,3-ジオキシゲナーゼ(IDO)の活性を阻害する分子;これらに限定されるものではないが、KIR2DL1-3、KIR3DL1、及びCD94/NKG2Aを含むナチュラルキラー(NK)細胞のチェックポイントを遮断する分子;ならびに、これらに限定されるものではないが、CD40、4-1BB、OX40、ICOS、CD27、TL-1A、TRAIL、FAS、及びGITRを含むTNFファミリーメンバーのリガンドまたは他のアゴニストのうちのいずれか1つである。複合体は、切断可能なまたは安定的なリンカーとの化学的結合、切断可能なまたは安定的なリンカーとの融合体としての組換え発現、リポソーム中の共配合、またはリポソーム中に配合された、I/Oをコードする発現ベクターとペプチドとの複合体によって形成される。
最初のインビトロスクリーニングは、遊離I/Oと比較して、ペプチドがI/Oを適切な区画(すなわち、IL-15剤及び4-1BBリガンドでは細胞外、RIG-Iリガンド及びSTINGリガンドでは細胞内)にどれだけ効率的に送達できるかを評価するために行われる。それに続くインビボスクリーニングは、リードI/Oを特定するために行われる。ペプチドI/O複合体をインビボでペプチド単独、空のリポソーム、及び遊離I/Oと比較する。インビトロ及びインビボの結果を分析して、遊離I/Oとは対照的に最大の腫瘍退縮を誘発するペプチドI/O複合体を特定する。
実施例45
インビボの腫瘍活性
本実施例では、本開示のペプチドI/O複合体がマウスにおいて確立された腫瘍を効果的に治療することを示すための実験計画について記載する。腫瘍細胞株を、皮下、静脈内(転移)、または同所性を含むさまざまな組織の1つに移植する。例えば数日間または数週間、腫瘍が確立するための時間を与える。マウスを、例えば、静脈内、皮下、腫瘍内、または腹腔内などのさまざまな投与経路の1つによって薬物で処理する。薬物は実験期間中、1回または数回投与する。未処理のマウスが腫瘍増殖したことで屠殺されるまで腫瘍のサイズを監視する。利用可能な場合、標的化遺伝子を欠失またはノックアウトしたマウスを用いて作用機序を検証する。あるいは、遺伝子ノックアウトした腫瘍も用いられる。薬力学的バイオマーカーを用いて、I/Oに関連した生物学的影響を測定し、さらにI/Oの作用機序を示す。ペプチドI/O複合体を投与したマウスを遊離I/Oと比較して、I/Oを本開示のペプチドと複合体化することによって得られる効力の増強を評価する。
例えば、治療モデル4T1は、マウスの侵襲性乳腺腫瘍である(Oh et al.,Oncotarget.2017 Jan 17;8(3):4730-4746,Chandra et al.,CancerImmunol Res.2014 Sep;2(9):901-10,Calderon et al.,Bioconjug Chem.2017 Feb 15;28(2):461-470,Kim et al.,Oncotarget.2016 Mar 29;7(13):16130-45)。腫瘍を乳腺脂肪体に同所的に移植すると、そこで腫瘍は増殖して転移する。腫瘍が触知可能なサイズ(50~100mm)に達するまで、通常は移植後約7日間、マウスを休ませる。マウスを処置群または非処置群に無作為に割り当てる。処置群には、3日、例えば、0、7、及び14日目のそれぞれにI/OまたはペプチドI/O複合体を投与する。特定の実験日まで、またはマウスが安楽死されるまで、治療をより頻繁に、例えば、2日ごと、週3回、週4回、または毎日投与することもできる。腫瘍の成長は、例えば毎日監視し、腫瘍が1000mmに達した時点でマウスを安楽死させる。実験終了前に、リンパ組織(脾臓及びリンパ節)を各群のマウスから採取し、放射線照射またはマイトマイシンCで処理した4T1細胞でこれらの細胞をインビトロで刺激することにより、腫瘍に対する免疫応答を分析する。培養細胞は、マルチプレックスアッセイを用いてケモカイン及びサイトカインなどの主要な調節因子の産生について18~24時間後にアッセイする。腫瘍及び流入領域リンパ節を、CD4及びCD8 T細胞、DC、NK、B細胞、Treg、メモリーT細胞、骨髄抑制細胞などの免疫細胞の存在についてさらに評価する。CD69、CD80、及びCD86などの活性化マーカーの発現を、免疫細胞で測定する。これらの細胞における分泌されたサイトカインの発現を、サイトカインに対する抗体を用いた細胞内染色によって測定する。抗腫瘍免疫応答は、腫瘍細胞または既知の抗原ペプチドに対するリンパ球の応答によるサイトカインの分泌によってインビトロで測定する。血清サイトカインの濃度を測定して全身の免疫活性化を評価する。循環している抗腫瘍抗体を測定する。腫瘍の免疫組織化学を用いて、浸潤性免疫細胞及び腫瘍内の関連タンパク質の発現を評価する。腫瘍組織を、I/OまたはペプチドI/O複合体の存在についても評価する。原発腫瘍の増殖に加えて、4T1は転移性腫瘍である。転移は、流入領域の肺、リンパ節、肝臓、及び脾臓においてカウントする。転移の数及び/またはサイズの減少は、ペプチドI/O複合体が腫瘍に対する全身性免疫を誘導したことを示す。特定のペプチドI/O複合体による処理は、腫瘍細胞に直接作用してアポトーシスを誘導する。アポトーシスの誘導は、Tunelアッセイなどの主要なアポトーシス調節因子の発現、またはカスパーゼ3、8、及び9の検出を評価することにより、免疫細胞化学によってインビトロで測定することができる。4T1モデルの1つの形態(Wu et al.,R Soc Open Sci.2017 Oct 25;4(10):170822)では、腫瘍細胞を、GFP及びルシフェラーゼを発現するように操作する。これにより、血液中を循環する腫瘍細胞の検出、及び全身のイメージングによる腫瘍の測定が可能となる。
上記の4T1乳腺腫瘍モデルについて記載したのと同じ方法が、他の腫瘍モデル、例えば、結腸腫瘍モデルCT26(Kim et al,Oncotarget.2016 Mar 29;7(13):16130-45)及びMC38(Fallon et al.Oncotarget.2017 Mar 28;8(13):20558-20571)、膵臓腫瘍モデルMIAPaCa-2、及びPANC-1(Duewell et al.,Oncoimmunology.2015 Apr 14;4(10):e1029698)及びPANC-02(Duewell et al.,Cell Death Differ.2014 Dec;21(12):1825-37)、黒色腫モデルB16F10(Kubo et al.,Cancer Immunol Res.2017 Sep;5(9):812-820,Demaria et al.,Proc Natl Acad Sci USA.2015 Dec 15;112(50):15408-13)、前立腺腫瘍モデルTRAMP-C2(Fu et al.,Sci Transl Med.2015 Apr 15;7(283):283ra52)、膀胱腫瘍モデルMB49(Fallon et al.Oncotarget.2017 Mar 28;8(13):20558-20571)、骨髄腫モデルMOPC-315及び5T33P(Xu et al.,Cancer Res.2013 May 15;73(10):3075-86)、AMLモデルC1498(Curran et al.,Cell Rep.2016 Jun 14;15(11):2357-66)、乳腺腫瘍モデルTSA、ならびにマウス肺癌モデルLLC及びTC-1(Yang 2016)についても用いられる。これらの皮下腫瘍モデルは、そのうちの1つだけに腫瘍内治療を投与する両側性腫瘍を使用してアブスコパル効果を研究するうえで有用である。対側性腫瘍に対する治療効果は、抗腫瘍免疫の誘導を反映する。抗腫瘍免疫の誘導は、腫瘍移植を生存したマウスにおいて、生存マウスに腫瘍で再チャレンジし、治療を行わない場合の生存率を示すことによって確認することもできる(Xu et al.,Cancer Res.2013 May 15;73(10):3075-86,Curran et al.,Cell Rep.2016 Jun 14;15(11):2357-66)。B16F10も転移モデルを提供し、その場合、腫瘍細胞を静脈内注射し、転移性病変を肺でカウントする(Demaria et al.,Proc Natl Acad Sci U S A.2015 Dec 15;112(50):15408-13)。転移の数及び/またはサイズの減少は、ペプチドI/O複合体が腫瘍に対する全身性免疫を誘導したことを示す。ヒトB細胞リンパ腫Daudi(Liu et al.,J Biol Chem.2016 Nov 11;291(46):23869-23881)及びヒト前立腺腫瘍PC3(Liu et al.,J Control Release.2016 Oct 10;239:223-30)などのヒト腫瘍の異種移植片をscidマウスで増殖させることができる。このモデルでは、NK細胞または他の自然免疫機構を刺激するI/Oも試験される。
場合によっては、ペプチドI/O複合体を、外科的切除が予定されている原発腫瘍を有する対象に投与することができる。対象は、ヒトまたは非ヒト動物とすることができる。免疫反応が生じるのに充分な期間を置いた後、原発腫瘍を切除する。対象を局所または遠隔再発について監視する。
実施例46
ペプチドI/O複合体による併用治療
本実施例では、ペプチドI/O複合体による併用治療について記載する。本開示のペプチドI/O複合体は、ペプチドI/O複合体または他の治療薬単独の投与と比較して向上した効力を得るために別の治療薬と組み合わせて対象に投与される。他の治療薬は、抗PD1、抗PDL1または抗CTLA4、抗CD40、IL-12などのチェックポイント阻害剤、セツキシマブ、リツキシマブ、またはトラスツズマブなどの治療用抗体、がんワクチン、GM-CSF、5-フルオロウラシルまたはシクロホスファミドなどの化学治療薬、放射線治療、または他のがん治療薬である。併用療法の向上した有効性は、実施例38及び実施例45に記載されるように、個々の治療をインビトロ及びインビボで併用治療と比較することによって示される。
実施例47
予防的腫瘍モデル
本実施例では、免疫原性細胞死(ICD)を誘導するI/Oを評価するための予防的腫瘍モデルについて記載する。このモデルは、必要に応じて、黒色腫モデルとしてB16F10細胞を使用して試験することができる。抗腫瘍免疫応答は、ICDを誘導するI/Oで処理した腫瘍細胞によるマウスの予防的治療によって調べる。腫瘍細胞のアポトーシスを誘導するI/Oは、ICDを起こすことが可能である。ICDでは、腫瘍細胞が活性酸素種(ROS)、カルレティキュリン、及びHMGB1などのシグナルを放出することができ、カスパーゼ活性、及び樹状突起を動員及び活性化する腫瘍抗原に依存する。成熟した樹状細胞はT細胞を刺激するようになり、それにより抗腫瘍免疫応答を促進する。
腫瘍細胞を本開示の任意のI/O(例えば、実施例38及び実施例39に記載されるように、それぞれアゴニストとして作用するRIG-IリガンドまたはSTINGリガンド)でインビトロで処理し、処理細胞を対象に投与する。対象はマウスである。投与数日または数週間後に生きた腫瘍細胞をマウスに投与する。あるいは、生きた腫瘍細胞を、処理細胞の投与と同時に投与する。処理した腫瘍細胞は、I/Oによって誘導されるICDを起こし始める。誘導されたICDは、マウスにおける強力な抗腫瘍免疫応答の増加を促進する。抗腫瘍免疫の存在及び特異性を、生存マウスを同じ腫瘍細胞または異なる腫瘍細胞でチャレンジすることによって評価する。CT26、Panc-02、及びTC-1及びEL4を含むいくつかの腫瘍を用いてICDが効果的に調べられた。
実施例48
ペプチドI/O複合体の腫瘍へのホーミング
本実施例では、がんを有するヒトまたは動物の腫瘍へのペプチドI/O複合体のホーミングについて説明する。本開示のペプチドI/O複合体は、組換えにより発現されるか化学的に合成され、直接、放射標識後、またはフルオロフォアへの結合後に使用される。ペプチドは、配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のペプチドのいずれか1つから選択される。ペプチドI/O複合体は、ヒトまたは動物に皮下、静脈内、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、皮内、または経口投与される。ペプチドI/O複合体は腫瘍にホーミングし、腫瘍に蓄積し、腫瘍に保持され、腫瘍もしくはその微小環境によってプロセシングされ、I/O単独の場合よりも高い濃度もしくは長い期間で腫瘍中に存在し、または他の形で腫瘍中に選択的に存在する。
実施例49
ペプチドI/O複合体の細胞内透過
本実施例では、がんを有するヒトまたは動物におけるペプチドI/O複合体の細胞内透過について説明する。本開示のペプチドI/O複合体は、組換えにより発現されるか化学的に合成され、直接、放射標識後、またはフルオロフォアへの結合後に使用される。ペプチドは、配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のペプチドのいずれか1つから選択される。ペプチドI/O複合体は、ヒトまたは動物に皮下、静脈内、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、皮内、または経口投与される。ペプチドI/O複合体は細胞膜を透過して、I/O単独の場合よりも高い濃度もしくは長い期間で細胞内区画にアクセスする。
実施例50
非ヒト動物の腫瘍へのペプチドI/O複合体のホーミング
本実施例では、非ヒト動物の腫瘍への本開示のペプチドI/O複合体のホーミングについて説明する。非ヒト動物としては、これらに限定されるものではないが、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ラット、マウス、ウシ、ブタ、非ヒト霊長類、及び他の非ヒト動物が挙げられる。本開示のペプチドI/O複合体は、組換えにより発現されるか化学的に合成され、直接、放射標識後、またはフルオロフォアへの結合後に使用される。ペプチドは、配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のペプチドのいずれか1つから選択される。得られたペプチド結合ペプチドI/O複合体を、非ヒト動物に、皮下、静脈内、もしくは経口投与するか、または腫瘍内に直接注入する。生体内分布を、LC/MS、オートラジオグラフィー、陽電子放射断層撮影(PET)、シンチレーションカウンティング、免疫組織化学、または蛍光イメージングによって評価する。ペプチドI/O複合体は腫瘍にホーミングされ、腫瘍に蓄積し、腫瘍に保持され、腫瘍もしくはその微小環境によってプロセシングされ、I/O単独の場合よりも高い濃度もしくは長い期間で腫瘍中に存在し、または他の形で非ヒト動物の腫瘍中に選択的に存在する。
実施例51
ペプチドI/O複合体の血液脳関門の通過及び脳へのホーミング
本実施例では、ペプチドI/O複合体の脳血液関門(BBB)及び/または血液脳脊髄液(CSF)関門の通過、及び一部の場合では、中枢神経系(CNS)内の腫瘍へのホーミングについて示す。本開示のペプチドI/O複合体は、組換えによって発現されるか化学合成され、直接、放射性標識後、またはフルオロフォアとの結合後に使用され、動物に投与される。投与期間の終了時に、マウスをヘキサン/ドライアイス浴で凍結し、次いでカルボキシメチルセルロースのブロック中で凍結する。脳、腫瘍、肝臓、腎臓、肺、心臓、脾臓、膵臓、筋肉、脂肪、胆嚢、上部消化管、下部消化管、骨、骨髄、生殖器系、目、軟骨、胃、皮膚、脊髄、膀胱、唾液腺、及びその他の種類の組織を含む動物全体の矢状切片の薄い凍結切片をミクロトームを用いて得て、冷凍庫内で乾燥させ、ホスホイメージャープレートに約10日間曝露する。
これらのプレートを現像し、各臓器からのシグナル(放射能または蛍光など)を各動物の心臓血または他の組織にみられるシグナルに対して正規化する。その組織の血液から予想されるシグナルよりも暗い組織のシグナルは、領域、組織、構造、または細胞中の蓄積を示す。
実施例52
ホーミングペプチドの全身オートラジオグラフィー
本実施例では、本開示のホーミングペプチドの全身オートラジオグラフィーについて説明する。実施例3に記載されるようにペプチドをN末端のリシンをメチル化することにより放射性標識する。このように、ペプチドはメチルまたはジメチルリシン及びメチル化またはジメチル化アミノ末端を含むことができる。100nmolの放射性標識ペプチドを、体重20~25gの雌Harlan胸腺欠損ヌードマウスに尾静脈注射で投与する。実験は少なくとも2連で行う(各群n=2匹の動物)。一部の動物で、腎臓を結紮して放射性標識ペプチドの腎濾過を防ぎ、血漿中半減期を延ばす。各放射性標識ペプチドを記載される時間にわたって動物体内で自由に循環させた後、動物を安楽死させ、切片化する。
全身オートラジオグラフィー(WBA)の矢状切片化は以下のようにして行う。投与期間の終了時に、マウスをヘキサン/ドライアイス浴で凍結し、次いでカルボキシメチルセルロースの凍結ブロック中に埋め込む。動物全体の矢状切片を調製し、イメージング用の薄い凍結切片を得る。薄い凍結切片はミクロトームを用いて得て、脳、腫瘍、肝臓、腎臓、肺、心臓、脾臓、膵臓、筋肉、脂肪、胆嚢、上部消化管、下部消化管、骨、骨髄、生殖器系、目、軟骨、胃、皮膚、脊髄、膀胱、唾液腺、及びその他の組織などの組織を可視化する。切片は、イメージングに先立って冷凍庫で乾燥させる。
オートラジオグラフィーイメージングでは、テープでマウントした薄い切片を凍結乾燥し、放射性試料をホスホイメージャープレートに7日間曝露した。これらのプレートを現像し、各臓器からのシグナル(デンシトメトリー)を各動物の心臓血にみられるシグナルに対して正規化した。その組織中の血液から予想されるシグナルよりも暗い組織中のシグナルは、領域、組織、構造、または細胞中の蓄積を示す。
実施例53
腫瘍中のペプチドI/O複合体の局在化
本実施例では、インタクトな腎臓を有する動物の腫瘍内の細胞への本開示のペプチドI/O複合体の結合について説明する。一実施形態では、実施例6及び実施例7に記載されるようにして動物に投与及び処理を行う。投与期間の終わりに、動物を安楽死させ、染色及びイメージング法で使用するために腫瘍を必要に応じて取り出す。動物全体の矢状切片を調製し、染色及びイメージングに用いる薄い凍結切片を得る。本開示のペプチドI/O複合体は、腫瘍微小環境に局在化し、腫瘍細胞によって細胞内に局在化されるかもしくは細胞外に結合するかまたはその両方であることが分かっている。局在化は顕微鏡で可視化して確認する。場合により、本開示のペプチドI/O複合体は、腫瘍に透過することが分かっている。
別の実施形態では、本開示のペプチドI/O複合体は、ヒトに投与され、腫瘍細胞の表面または腫瘍細胞内に局在化される。
実施例54
ペプチド-Fcタンパク質融合体
本実施例では、Fcタンパク質との融合体としてのペプチドI/O複合体の作製及び使用について説明する。配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のうちのいずれか1つのペプチドを、HEK293またはCHO細胞中でヒトIgG1 Fcタンパク質の配列のN末端またはC末端に融合することによって組換え発現させることで配列番号1230
(METDTLLLWVLLLWVPGSTGXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXGGSGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK、ただし、Xは、配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のうちのいずれか1つを含む本開示の任意のペプチドである)が得られる。
配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のうちのいずれか1つのペプチドを、HEK293またはCHO細胞中でヒトIgG1 Fcタンパク質の配列のN末端またはC末端に融合することによって組換え発現させることで
METDTLLLWVLLLWVPGSTGXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号1493)、ただし、Xは、配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のうちのいずれか1つを含む本開示の任意のペプチドである)が得られる。
HEK293またはCHO細胞中でヒトIgG1 Fcタンパク質の配列のN末端またはC末端に融合して組換え発現されるペプチドは、
METDTLLLWVLLLWVPGSTGGSGVPINVRCRGSRDCLDPCRRAGMRFGRCINSRCHCTPGGSGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号1494)の配列を生じることができる。
本開示の任意のペプチドの配列は、分泌シグナル配列をN末端に、Fc配列をC末端に付加することにより、マウスまたはヒトFcのいずれかとの融合タンパク質として発現される。これにより、分泌及び/または薬物動態特性が改善された二価の分子が作製される。このより大きなペプチド-Fc融合体は、異なる哺乳動物または昆虫の細胞株で発現させられ、研究用の試薬及び治療薬として有用である。
本開示のいずれのペプチドも、Fcタンパク質と共発現させることでより長い半減期及び改善された腫瘍へのホーミング性を有するFc融合ペプチドを生じる。配列番号1230では、分泌シグナル配列METTDLLLWVLLLWVPGSTG(配列番号1231)に続いて、配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のうちのいずれか1つのペプチドが配置され、これに続いてFcタンパク質の配列が配置される。切断は不正確であり得、配列番号1230の20位または21位で切断を生じる。次いで、ペプチド-Fc融合体は、本開示のI/Oに化学的に結合されるかもしくは配合されるか、またはペプチド-Fc融合体は本開示のI/Oと組換えによって発現される。
実施例55
ペプチド結合体の切断
本実施例では、調整可能な切断速度を有するペプチドI/O複合体の調製について記載する。化学構造を用いて切断に対する立体障害を与えるか、または切断点における変化した局所環境を与えるような改変(加水分解などの化学的切断及び酵素的切断の両方に対して)を行ってペプチドI/O複合体を合成または発現させる。1つの例示的な結合体では、ペプチドI/O複合体を、切断可能な結合に近接した1個以上のメチル基を有するように合成することで立体障害を生じさせ、これにより切断速度を低下させる。別の例示的な結合体では、隣接する炭素に1個のメチル基が存在する。別の例示的な結合体では、隣接する炭素に2個のメチル基が存在する。別の例示的な結合体では、隣接する炭素に1個のエチル基が存在する。別の例示的な結合体では、隣接する炭素に2個のエチル基が存在する。別の例示的な結合体では、切断部位の近くに環状基が存在する。別の例示的な結合体では、炭素リンカーの長さを大きくし、局所的な疎水性を増大させ、加水分解速度を低下させる。別の例示的な結合体では、隣接する炭素にヒドロキシル基を配置し、局所的な親水性を増大させ、切断速度を増大させる。このように、これらの例示的な結合体の切断速度を調整して、早すぎる切断を防止し、活性I/Oが放出される前に体内または細胞内の所望の部位により多くのペプチドI/O複合体を確実に蓄積させる一方でI/Oを腫瘍微小環境中でも適時放出させる。
得られたペプチドI/O複合体は、ヒトまたは動物に静脈内、皮下、鼻腔内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、または腫瘍内注入によって投与され、疾患を治療する。
実施例56
ペプチド及びペプチド結合体の腫瘍内投与
本実施例では、本開示のペプチドI/O複合体の腫瘍内投与について説明する。本開示のペプチドを、組換えによって発現させるかまたは化学合成する。場合により、この後、ペプチドをI/Oに結合するか、I/O剤と組換えにより発現させるか、またはI/Oと配合する。ペプチドまたはペプチド結合体を腫瘍内投与によって投与を必要とする対象に投与する。ペプチドI/O複合体のサイズが小さいことにより、また、ペプチドI/O複合体による腫瘍成分の結合により、ペプチドI/O複合体は腫瘍に透過する。ペプチドI/O複合体は腫瘍に結合し、この結合により腫瘍内の滞留時間が長くなる。必要に応じて、注入された物質は凝集するか、結晶化するか、または複合体を形成し、それによりデポ効果をさらに延長し、より長い滞留時間に寄与する。
ペプチドは、配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316から選択される配列を有する任意のペプチドであってよい。かかるペプチド薬物結合体は、本明細書に記載されるような切断可能なまたは安定的なリンカーのいずれかを使用して作製することができる(例えば、実施例8及び9)。
実施例57
ペプチドI/O複合体による脳腫瘍の治療
本実施例では、本開示のペプチドI/O複合体を用いた脳腫瘍の治療について説明する。本開示のペプチドを組換えによって発現させるかまたは化学合成し、I/Oに結合した後、直接使用する。ペプチドI/O複合体を脳腫瘍の治療薬として医薬組成物中で対象に投与する。本開示の1つ以上のペプチドI/O複合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であってよい。医薬組成物は皮下、静脈内、経口投与するか、または腫瘍に直接注射する。投与されたペプチドI/O複合体は、脳腫瘍に冒された組織及びその細胞をターゲティングする。
さらに、多くの化学療法剤は血液脳関門を通過しない。本開示のペプチドを、組換えにより発現させるかまたは化学合成した後、直接、または切断可能もしくは安定的なリンカーを介してI/Oに結合する。I/Oと、配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のペプチドのうちのいずれか1つとの結合は、I/Oを脳内、さらに腫瘍にターゲティングする。1つ以上のペプチドI/O複合体がヒトまたは動物に投与される。
ペプチドは、配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316から選択される配列を有する任意のペプチドである。かかるペプチド薬物結合体は、本明細書に記載されるような切断可能なまたは安定的なリンカーのいずれかを使用して作製することができる(例えば、実施例8及び9)。
実施例58
ペプチドI/O複合体による乳癌の治療
本実施例では、本開示のペプチドI/O複合体を用いた乳癌の治療について説明する。本開示のペプチドを、組換えにより発現させるかまたは化学合成し、I/Oに結合した後、直接使用する。ペプチドI/O複合体を乳癌の治療薬として医薬組成物中で対象に投与する。本開示の1つ以上のペプチドI/O複合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であってよい。医薬組成物は皮下、静脈内、経口投与するか、または腫瘍に直接注射する。投与されたペプチドI/O複合体は、乳癌に冒された組織及びその細胞をターゲティングする。
ペプチドは、配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316から選択される配列を有する任意のペプチドである。かかるペプチド薬物結合体は、本明細書に記載されるような切断可能なまたは安定的なリンカーのいずれかを使用して作製することができる(例えば、実施例8及び9)。
実施例59
ペプチドI/O複合体による黒色腫の治療
本実施例では、本開示のペプチドI/O複合体を用いた黒色腫の治療について説明する。本開示のペプチドを、組換えにより発現させるかまたは化学合成し、I/Oとの複合体として使用する。ペプチドI/O複合体を黒色腫の治療薬として医薬組成物中で対象に投与する。本開示の1つ以上のペプチドI/O複合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であってよい。医薬組成物は皮下、静脈内、経口投与するか、または腫瘍に直接注射する。投与されたペプチドI/O複合体は、黒色腫に冒された組織及びその細胞をターゲティングする。
ペプチドは、配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号番号1316のうちのいずれか1つである。かかるペプチドI/O複合体は、本明細書に記載されるような切断可能なまたは安定的なリンカーのいずれかを使用して作製することができる(例えば、実施例8及び9)。
実施例60
ペプチドI/O複合体による肉腫の治療
本実施例では、本開示のペプチドI/O複合体を用いた肉腫の治療について説明する。本開示のペプチドを、組換えにより発現させるかまたは化学合成し、I/Oに結合した後、直接使用する。ペプチドI/O複合体を肉腫の治療薬として医薬組成物中で対象に投与する。本開示の1つ以上のペプチドI/O複合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であってよい。医薬組成物は皮下、静脈内、経口投与するか、または腫瘍に直接注射する。投与されたペプチドI/O複合体は、肉腫に冒された組織及びその細胞をターゲティングする。
ペプチドは、配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316から選択される配列を有する任意のペプチドである。かかるペプチド薬物結合体は、本明細書に記載されるような切断可能なまたは安定的なリンカーのいずれかを使用して作製することができる(例えば、実施例8及び9)。
実施例61
ペプチドI/O複合体による脳腫瘍の治療
本実施例では、ペプチドI/O複合体による脳腫瘍の治療について記載する。多くの化学療法剤は血液脳関門を通過しない。本開示のペプチドを、組換えにより発現させるかまたは化学合成した後、直接、または切断可能もしくは安定的なリンカーを介してI/Oに結合する。I/Oと、配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のペプチドのうちのいずれか1つとの結合は、I/Oを脳内、さらに腫瘍にターゲティングする。1つ以上のペプチドI/O複合体がヒトまたは動物に投与される。
実施例62
ペプチドI/O複合体によるユーイング肉腫の治療
本実施例では、ユーイング肉腫を治療するための本明細書に記載されるペプチドI/O複合体の使用について記載する。本開示のペプチドを、組換えにより発現させるかまたは化学合成した後、直接、または切断可能もしくは安定的なリンカーを介してI/Oに結合する。I/Oと、配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のうちのいずれか1つのペプチドとの結合は、薬物をユーイング肉腫にターゲティングする。1つ以上のペプチドI/O複合体がヒトまたは動物に投与される。
実施例63
ペプチドI/O複合体による膠芽腫の治療
本実施例では、膠芽腫を治療するための本明細書に記載されるペプチドI/O複合体の使用について記載する。本開示のペプチドを、組換えにより発現させるかまたは化学合成した後、直接、または切断可能もしくは安定的なリンカーを介してI/Oに結合する。I/Oと、配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のうちのいずれか1つのペプチドとの結合は、薬物を膠芽腫にターゲティングする。1つ以上のペプチドI/O複合体がヒトまたは動物に投与される。
実施例64
ペプチドI/O複合体によるトリプルネガティブ乳癌の治療
本実施例では、トリプルネガティブ乳癌を治療するための本明細書に記載されるペプチドI/O複合体の使用について記載する。本開示のペプチドを、組換えにより発現させるかまたは化学合成した後、直接、または切断可能もしくは安定的なリンカーを介してI/O複合体に結合する。I/Oと、配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のうちのいずれか1つのペプチドとの結合は、薬物をトリプルネガティブ乳癌にターゲティングする。1つ以上のペプチドI/O複合体がヒトまたは動物に投与される。
実施例65
変異ペプチドによる非脳腫瘍の治療
本実施例では、非脳腫瘍の治療に用いられるペプチドI/O複合体について記載する。本開示のペプチドに変異を導入する。この変異は、変異ペプチドが血液脳関門を通過することを防ぐものである。変異ペプチドを、組換えにより発現させるかまたは化学合成した後、直接、または切断可能もしくは安定的なリンカーを介してI/O剤に結合する。I/Oと、配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のうちのいずれか1つの変異ペプチドとの結合は、薬物を非脳腫瘍にターゲティングする。例えば、変異ペプチドI/O複合体は、がんである非脳腫瘍にターゲティングする。1つ以上のペプチドI/O複合体がヒトまたは動物に投与される。
実施例66
ペプチド-RIG-Iリガンド複合体による頭頸部癌の治療
本実施例では、本明細書に開示されるI/Oに結合された本開示の任意のペプチド(配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のうちのいずれか1つ)による頭頸部癌の治療について記載する。I/OはRIG-Iリガンドである。ペプチドを組換えによって発現させるかまたは化学合成し、実施例12、実施例13、実施例15、実施例16、または実施例17に記載されるようなRIG-Iリガンドに結合させる。このペプチド-RIG-Iリガンド複合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であり、頭頸部癌を有するものである。投与は、静脈内、皮下、鼻腔内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、または腫瘍内注射による。投与されると、ペプチド-RIG-Iリガンド複合体は、がん性組織及びその細胞にターゲティングする。複合体は、癌細胞に内在化されて免疫原性細胞死をもたらし、これに続いて、実施例38に記載されるようにがんを低減または根絶し、また実施例45に記載されるようにインビボ応答を示す免疫応答が生じる。
実施例67
ペプチド-STINGリガンド複合体による頭頸部癌の治療
本実施例では、本明細書に開示されるI/Oに結合された本開示の任意のペプチド(配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のうちのいずれか1つ)による頭頸部癌の治療について記載する。I/OはSTINGリガンドである。ペプチドを組換えによって発現させるかまたは化学合成し、実施例12、実施例13、実施例15、実施例16、または実施例17に記載されるようなSTINGリガンドに結合させる。このペプチド-STINGリガンド複合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であり、頭頸部癌を有するものである。投与は、静脈内、皮下、鼻腔内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、または腫瘍内注射による。投与されると、ペプチド-STINGリガンド複合体は、がん性組織及びその細胞にターゲティングする。複合体は、がん細胞に内在化されて免疫原性細胞死をもたらし、これに続いて、実施例38に記載されるようにがんを低減または根絶し、また実施例45に記載されるようにインビボ応答を示す免疫応答が生じる。
実施例68
ペプチド-RIG-Iリガンド複合体による肺癌の治療
本実施例では、本明細書に開示されるI/Oに結合された本開示の任意のペプチド(配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のうちのいずれか1つ)による肺癌の治療について記載する。I/OはRIG-Iリガンドである。ペプチドを組換えによって発現させるかまたは化学合成し、実施例12、実施例13、実施例15、実施例16、または実施例17に記載されるようなRIG-Iリガンドに結合させる。このペプチド-RIG-Iリガンド複合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であり、肺癌を有するものである。投与は、静脈内、皮下、鼻腔内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、または腫瘍内注射による。投与されると、ペプチド-RIG-Iリガンド複合体は、がん性組織及びその細胞にターゲティングする。複合体は、がん細胞に内在化されて免疫原性細胞死をもたらし、これに続いて、実施例38に記載されるようにがんを低減または根絶し、また実施例45に記載されるようにインビボ応答を示す免疫応答が生じる。
実施例69
ペプチド-STINGリガンド複合体による肺癌の治療
本実施例では、本明細書に開示されるI/Oに結合された本開示の任意のペプチド(配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のうちのいずれか1つ)による肺癌の治療について記載する。I/OはSTINGリガンドである。ペプチドを組換えによって発現させるかまたは化学合成し、実施例12、実施例13、実施例15、実施例16、または実施例17に記載されるようなSTINGリガンドに結合させる。このペプチド-STINGリガンド複合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であり、肺癌を有するものである。投与は、静脈内、皮下、鼻腔内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、または腫瘍内注射による。投与されると、ペプチド-STINGリガンド複合体は、がん性組織及びその細胞にターゲティングする。複合体は、がん細胞に内在化されて免疫原性細胞死をもたらし、これに続いて、実施例38に記載されるようにがんを低減または根絶し、また実施例45に記載されるようにインビボ応答を示す免疫応答が生じる。
実施例70
ペプチド-RIG-Iリガンド複合体による腎細胞癌の治療
本実施例では、本明細書に開示されるI/Oに結合された本開示の任意のペプチド(配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のうちのいずれか1つ)による腎細胞癌の治療について記載する。I/OはRIG-Iリガンドである。ペプチドを組換えによって発現させるかまたは化学合成し、実施例12、実施例13、実施例15、実施例16、または実施例17に記載されるようなRIG-Iリガンドに結合させる。このペプチド-RIG-Iリガンド複合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であり腎細胞癌を有するものである。投与は、静脈内、皮下、鼻腔内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、または腫瘍内注射による。投与されると、ペプチド-RIG-Iリガンド複合体は、がん性組織及びその細胞にターゲティングされる。複合体は、がん細胞に内在化されて免疫原性細胞死をもたらし、これに続いて、実施例38に記載されるようにがんを低減または根絶し、また実施例45に記載されるようにインビボ応答を示す免疫応答が生じる。
実施例71
ペプチド-STINGリガンド複合体による腎細胞癌の治療
本実施例では、本明細書に開示されるI/Oに結合された本開示の任意のペプチド(配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のうちのいずれか1つ)による腎細胞癌の治療について記載する。I/OはSTINGリガンドである。ペプチドを組換えによって発現させるかまたは化学合成し、実施例12、実施例13、実施例15、実施例16、または実施例17に記載されるようなSTINGリガンドに結合させる。このペプチド-STINGリガンド複合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であり、腎細胞癌を有するものである。投与は、静脈内、皮下、鼻腔内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、または腫瘍内注射による。投与されると、ペプチド-STINGリガンド複合体は、がん性組織及びその細胞にターゲティングする。複合体は、がん細胞に内在化されて免疫原性細胞死をもたらし、これに続いて、実施例38に記載されるようにがんを低減または根絶し、また実施例45に記載されるようにインビボ応答を示す免疫応答が生じる。
実施例72
ペプチド-RIG-Iリガンド複合体によるリンパ腫の治療
本実施例では、本明細書に開示されるI/Oに結合された本開示の任意のペプチド(配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のうちのいずれか1つ)によるリンパ腫の治療について記載する。I/OはRIG-Iリガンドである。ペプチドを組換えによって発現させるかまたは化学合成し、実施例12、実施例13、実施例15、実施例16、または実施例17に記載されるようなRIG-Iリガンドに結合させる。このペプチド-RIG-Iリガンド複合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であり、リンパ腫を有するものである。投与は、静脈内、皮下、鼻腔内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、または腫瘍内注射による。投与されると、ペプチド-RIG-Iリガンド複合体は、がん性組織及びその細胞にターゲティングする。複合体は、がん細胞に内在化されて免疫原性細胞死をもたらし、これに続いて、実施例38に記載されるようにがんを低減または根絶し、また実施例45に記載されるようにインビボ応答を示す免疫応答が生じる。
実施例73
ペプチド-STINGリガンド複合体によるリンパ腫の治療
本実施例では、本明細書に開示されるI/Oに結合された本開示の任意のペプチド(配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のうちのいずれか1つ)によるリンパ腫の治療について記載する。I/OはSTINGリガンドである。ペプチドを組換えによって発現させるかまたは化学合成し、実施例12、実施例13、実施例15、実施例16、または実施例17に記載されるようなSTINGリガンドに結合させる。このペプチド-STINGリガンド複合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であり、リンパ腫を有するものである。投与は、静脈内、皮下、鼻腔内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、または腫瘍内注射による。投与されると、ペプチド-STINGリガンド複合体は、がん性組織及びその細胞にターゲティングする。複合体は、がん細胞に内在化されて免疫原性細胞死をもたらし、これに続いて、実施例38に記載されるようにがんを低減または根絶し、また実施例45に記載されるようにインビボ応答を示す免疫応答が生じる。
実施例74
ペプチド-IL-15剤複合体による頭頸部癌の治療
本実施例では、本明細書に開示されるI/Oとの複合体として発現された本開示の任意のペプチド(配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のうちのいずれか1つ)による頭頸部癌の治療について記載する。I/Oは、本明細書に開示される任意のIL-15剤である。ペプチドを、実施例18に記載されるように、IL-15剤との複合体として組換えによって発現させる。このペプチド-IL-15剤複合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であり、頭頸部癌を有するものである。投与は、静脈内、皮下、鼻腔内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、または腫瘍内注射による。投与されると、ペプチド-IL-15剤複合体は腫瘍微小環境に集中する。必要に応じて、IL-15剤は、腫瘍微小環境中または腫瘍細胞内でペプチドから切断される。必要に応じて、IL-15剤はプロセシングされ、腫瘍細胞の表面に提示される。IL-15剤は、免疫系の細胞に作用して、実施例38に記載されるようにがんを低減または根絶し、また実施例45に記載されるようにインビボ応答を示す免疫応答を開始、延長、及び/または増強する。
実施例75
ペプチド-4-1BBリガンド複合体による頭頸部癌の治療
本実施例では、本明細書に開示されるI/Oとの複合体として発現された本開示の任意のペプチド(配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のうちのいずれか1つ)による頭頸部癌の治療について記載する。I/Oは4-1BBリガンドである。ペプチドを、実施例19に記載されるように、4-1BBリガンドとの複合体または融合タンパク質として組換えによって発現させる。このペプチド-4-1BBリガンド複合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であり、頭頸部癌を有するものである。投与は、静脈内、皮下、鼻腔内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、または腫瘍内注射による。投与されると、ペプチド-4-1BBリガンド複合体は腫瘍微小環境に集中する。必要に応じて、4-1BBリガンドは、腫瘍微小環境中または腫瘍細胞内でペプチドから切断される。必要に応じて、4-1BBリガンドはプロセシングされ、腫瘍細胞の表面に提示される。4-1BBリガンドは、免疫系の細胞に作用して、実施例38に記載されるようにがんを低減または根絶し、また実施例45に記載されるようにインビボ応答を示す免疫応答を開始、延長、及び/または増強する。
実施例76
ペプチド-IL-15剤複合体による肺癌の治療
本実施例では、本明細書に開示されるI/Oとの複合体または融合体として発現された本開示の任意のペプチド(配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のうちのいずれか1つ)による肺癌の治療について記載する。I/Oは、本明細書に開示される任意のIL-15剤である。ペプチドを、実施例18に記載されるように、IL-15剤との複合体または融合タンパク質として組換えによって発現させる。このペプチド-IL-15剤複合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であり、肺癌を有するものである。投与は、静脈内、皮下、鼻腔内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、または腫瘍内注射による。投与されると、ペプチド-IL-15剤複合体は腫瘍微小環境に集中する。必要に応じて、IL-15剤は、腫瘍微小環境中または腫瘍細胞内でペプチドから切断される。必要に応じて、IL-15剤はプロセシングされ、腫瘍細胞の表面に提示される。IL-15剤は、免疫系の細胞に作用して、実施例38に記載されるようにがんを低減または根絶し、また実施例45に記載されるようにインビボ応答を示す免疫応答を開始、延長、及び/または増強する。
実施例77
ペプチド-4-1BBリガンド複合体による肺癌の治療
本実施例では、本明細書に開示されるI/Oとの融合体として発現された本開示の任意のペプチド(配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のうちのいずれか1つ)による肺癌の治療について記載する。I/Oは4-1BBリガンドである。ペプチドを、実施例19に記載されるように、4-1BBリガンドとの複合体または融合タンパク質として組換えによって発現させる。このペプチド-4-1BBリガンド複合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であり、肺癌を有するものである。投与は、静脈内、皮下、鼻腔内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、または腫瘍内注射による。投与されると、ペプチド-4-1BBリガンド複合体は腫瘍微小環境に集中する。必要に応じて、4-1BBリガンドは、腫瘍微小環境中または腫瘍細胞内でペプチドから切断される。必要に応じて、4-1BBリガンドはプロセシングされ、腫瘍細胞の表面に提示される。4-1BBリガンドは、免疫系の細胞に作用して、実施例38に記載されるようにがんを低減または根絶し、また実施例45に記載されるようにインビボ応答を示す免疫応答を開始、延長、及び/または増強する。
実施例78
ペプチド-IL-15剤複合体による腎細胞癌の治療
本実施例では、本明細書に開示されるI/Oとの融合体として発現された本開示の任意のペプチド(配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のうちのいずれか1つ)による腎細胞癌の治療について記載する。I/Oは、本明細書に開示される任意のIL-15剤である。ペプチドを、実施例18に記載されるように、IL-15剤との複合体または融合タンパク質として組換えによって発現させる。このペプチド-IL-15剤複合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であり、腎細胞癌を有するものである。投与は、静脈内、皮下、鼻腔内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、または腫瘍内注射による。投与されると、ペプチド-IL-15剤複合体は腫瘍微小環境に集中する。必要に応じて、IL-15剤は、腫瘍微小環境中または腫瘍細胞内でペプチドから切断される。必要に応じて、IL-15剤はプロセシングされ、腫瘍細胞の表面に提示される。IL-15剤は、免疫系の細胞に作用して、実施例38に記載されるようにがんを低減または根絶し、また実施例45に記載されるようにインビボ応答を示す免疫応答を開始、延長、及び/または増強する。
実施例79
ペプチド-4-1BBリガンド複合体による腎細胞癌の治療
本実施例では、本明細書に開示されるI/Oとの融合体として発現された本開示の任意のペプチド(配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のうちのいずれか1つ)による腎細胞癌の治療について記載する。I/Oは4-1BBリガンドである。ペプチドを、実施例19に記載されるように、4-1BBリガンドとの融合タンパク質として組換えによって発現させる。このペプチド-4-1BBリガンド複合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であり、腎細胞癌を有するものである。投与は、静脈内、皮下、鼻腔内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、または腫瘍内注射による。投与されると、ペプチド-4-1BBリガンド複合体は腫瘍微小環境に集中する。必要に応じて、4-1BBリガンドは、腫瘍微小環境中または腫瘍細胞内でペプチドから切断される。必要に応じて、4-1BBリガンドはプロセシングされ、腫瘍細胞の表面に提示される。4-1BBリガンドは、免疫系の細胞に作用して、実施例38に記載されるようにがんを低減または根絶し、また実施例45に記載されるようにインビボ応答を示す免疫応答を開始、延長、及び/または増強する。
実施例80
ペプチド-IL-15剤複合体によるリンパ腫の治療
本実施例では、本明細書に開示されるI/Oとの複合体または融合体として発現された本開示の任意のペプチド(配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のうちのいずれか1つ)によるリンパ腫の治療について記載する。I/Oは、本明細書に開示される任意のIL-15剤である。ペプチドを、実施例18に記載されるように、IL-15剤との複合体または融合タンパク質として組換えによって発現させる。このペプチド-IL-15剤複合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であり、リンパ腫を有するものである。投与は、静脈内、皮下、鼻腔内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、または腫瘍内注射による。投与されると、ペプチド-IL-15剤複合体は腫瘍微小環境に集中する。必要に応じて、IL-15剤は、腫瘍微小環境中または腫瘍細胞内でペプチドから切断される。必要に応じて、IL-15剤はプロセシングされ、腫瘍細胞の表面に提示される。IL-15剤は、免疫系の細胞に作用して、実施例38に記載されるようにがんを低減または根絶し、また実施例45に記載されるようにインビボ応答を示す免疫応答を開始、延長、及び/または増強する。
実施例81
ペプチド-4-1BBリガンド複合体によるリンパ腫の治療
本実施例では、本明細書に開示されるI/Oとの複合体または融合体として発現された本開示の任意のペプチド(配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のうちのいずれか1つ)によるリンパ腫の治療について記載する。I/Oは4-1BBリガンドである。ペプチドを、実施例19に記載されるように、4-1BBリガンドとの複合体または融合タンパク質として組換えによって発現させる。このペプチド-4-1BBリガンド複合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であり、リンパ腫を有するものである。投与は、静脈内、皮下、鼻腔内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、または腫瘍内注射による。投与されると、ペプチド-4-1BBリガンド複合体は腫瘍微小環境に集中する。必要に応じて、4-1BBリガンドは、腫瘍微小環境中または腫瘍細胞内でペプチドから切断される。必要に応じて、4-1BBリガンドはプロセシングされ、腫瘍細胞の表面に提示される。4-1BBリガンドは、免疫系の細胞に作用して、実施例38に記載されるようにがんを低減または根絶し、また実施例45に記載されるようにインビボ応答を示す免疫応答を開始、延長、及び/または増強する。
実施例82
ペプチド結合によるSEAPレポーター細胞株の細胞質へのRIG-Iリガンドの送達
本実施例では、ペプチド結合によるSEAPレポーター細胞株の細胞質へのRIG-Iリガンドの送達について記載する。JAK/STAT/ISGF3経路及び/またはIRF3経路の活性化を監視することにより、生物活性マウスI型IFNの検出を可能にするマウスB16-Blue IFN-α/β SEAPレポーター細胞株を使用した。これらの細胞をI型IFNインデューサー(RIG-Iリガンドなど)で刺激すると、IRF誘導性プロモーターの活性化による分泌型胚性アルカリホスファターゼ(SEAP)の産生が細胞内でトリガーされる。これらの細胞は、多量体ISREによって増強されたIFN-α/β誘導性ISG54プロモーターの制御下で、SEAPレポーター遺伝子で安定的にトランスフェクトされたC57BL/6由来のマウスB16黒色腫細胞株から誘導される。細胞を解凍し、熱不活性化10%ウシ胎仔血清、50U/mlペニシリン、50μg/mlストレプトマイシン、100μg/ml Normocin(商標)、2mM L-グルタミン、100μg/mL Zeocinを含むRPMI中で維持した。すべてのアッセイ読み取りにおいて、選択用抗生物質を完全な増殖培地から除外した。アッセイは以下のように行った。B16-Blueレポーター細胞を、100μL容量の透明な96ウェル組織培養プレートにウェル当たり20,000個または60,000個の細胞となるように播種し、一晩付着させた。翌日、適当な実験用処理培地を調製した。二本鎖RNA及びペプチドI/O複合体などのRNA含有試験物を水に溶解して、ストック溶液を調製した。トランスフェクションを用いるウェルについては、Lipofectamine300処理液を製造者のプロトコールに従って調製した。処理に際して適当なウェルを吸引した。次に、処理培地を、75または200μLの最終容量となるように適当な対応するウェルに再び加えた。各プレートを適当な時間(24時間、48時間、または72時間)インキュベートした。24時間、48時間、72時間の時点で、細胞プレート(複数可)をインキュベーターから取り出し、10μLを実験ウェル及びコントロールウェルからピペットで取り、50μLのSEAPアッセイ試薬が入った新しい白色壁96ウェルプレートに移した。このプレートを軽く振って混合し、プレートリーダーで読み取る前に15~20分間インキュベートした。
図19は、SEAPレポーター細胞内のIFN経路が活性化されることによる発光シグナルを示す。図19は、細胞を、12pmolまたは120pmolの図37のペプチドI/O複合体、配列番号1424(5’末端に三リン酸を有する)と配列番号1425(末端のリン酸なし)とが互いに複合体化されたものである5’ppp dsRNA(図37と同じ5’ppp RNAの配列。二本鎖だがペプチドリンカーのないもの)、または配列番号1424と配列番号1425(両方の鎖に末端リン酸なし)とが互いに複合体化されたものであるdsRNA(図37と同じRNAの配列。二本鎖だが、5’pppがなく、かつペプチドリンカーのないもの)により、細胞を処理した、24、48、または72時間後の相対発光量(RLU)を示す。この実験ではトランスフェクション試薬を使用しなかった。この経路を活性化するためには、5’pppの存在及び細胞質への薬剤の送達の両方が必要であると予想された。これは、5’pppがRig-Iの活性化に不可欠であり、Rig-Iが細胞質中に存在しているためである。また、5’ppp dsRNA単独では、トランスフェクション試薬を添加しなければ、細胞質に顕著なレベルで到達しないことも予想された。5’ppp dsRNAまたはdsRNAでは極めてわずかなシグナルしか観察されなかったが、図37のペプチドI/O複合体では12pmol及び120pmolの両方の用量で顕著かつ増加するシグナルが見られた。これは、図37のペプチドI/O複合体は、トランスフェクション試薬を添加することなく、細胞の細胞質にアクセスしてRIG-Iヘリカーゼを活性化することができたことを示した。図20は、12pmolまたは120pmolの一致させたモル用量で、5’ppp dsRNAではなく、図37のペプチドI/O複合体を投与したことによるシグナルの増加倍率を示す。図37のペプチドI/O複合体を添加したことによる増加倍率は、ペプチドのない5’ppp dsRNAのみの投与により得られたシグナルの約3~30倍の範囲であった。図21は、12pmolの図37のペプチドI/O複合体、図34のペプチドI/O複合体、図19で述べたポジティブコントロールの5’ppp dsRNA(「5’ppp dsRNA」として示す)、または図19で述べたネガティブコントロールのdsRNA(「dsRNA(5’pppなし)」として示す)(二本鎖だが、5’PPPがなく、ペプチドリンカーもない同じRNAの配列)で細胞を処理した24時間後の相対発光量(RLU)を示す。この実験ではトランスフェクション試薬を使用しなかった。これらの結果は、図34のペプチドI/O複合体及び図37のペプチドI/O複合体がトランスフェクション試薬の非存在下で、5’ppp dsRNAまたはdsRNAと比較してより高いレベルで細胞内のIFN経路を活性化したことを示した。図22は、トランスフェクション試薬の存在下で異なる薬剤を投与することによって得られたRLUシグナルを示す。5’ppp dsRNAをリポフェクタミントランスフェクション試薬とともに、またはdsRNAをリポフェクタミントランスフェクション試薬とともに投与した。リポフェクタミンなどのトランスフェクション試薬は、トランスフェクション試薬がなければ入らないものを含む分子をインビトロで細胞質に送達する方法を提供し、これにより、細胞質に送達された場合にそれが細胞質の標的を活性化するかどうかを示すものである。ただし、トランスフェクション試薬は毒性が高く、インビトロでの使用には制限がある。図22では、トランスフェクション試薬を、5’pppを有するRNAと共に使用した場合(例えばトランスフェクション試薬とともに細胞質に送達された場合の5’ppp dsRNAの活性を示す)、及び、トランスフェクション試薬を図34の、及び図37のペプチドI/O複合体と共に使用した場合(細胞質中でのこれらの複合体の活性を示す)に高いシグナルが生じたが、dsRNA(5’pppなし)では、RIG-I経路の活性化に5’pppが重要な役割を果たしていることから、生じたシグナルは大幅に低かった。さらに、図80は、トランスフェクション試薬であるリポフェクタミンを、16.2pmolの図34のペプチドI/O複合体、図36のペプチドI/O複合体、図35のI/O、5’pppを有する配列番号1371(5’ppp hpRNAと同じ配列だがペプチドリンカーのないもの)、または配列番号1424及び配列番号1425のdsRNA(二本鎖だが5’pppがなく、ペプチドリンカーもない同じ配列のRNA)のいずれかと共に用いて細胞を処理した24時間後のSEAPレポーター細胞内のIFN経路の活性化による相対発光量(RLU)を示す。
トランスフェクション試薬を、5’pppを有するRNA、図34のペプチドI/O複合体、図34のペプチドI/O複合体の切断産物(図35の構造)、または図36のペプチドI/O複合体のいずれかと共に用いた場合に高いシグナルがみられた。図22及び図80のデータは、5’ppp dsRNA、図34のペプチドI/O複合体、図37のペプチドI/O複合体、図36のペプチドI/O複合体、または図34のペプチドI/O複合体の切断産物(図35に示される構造である)が細胞質に送達される場合、これらはRIG-I経路を活性化できることを示している。
合わせたデータもまた、細胞質に入ってRIG-I経路及びI型インターフェロンの応答を活性化する、図37のペプチドI/O複合体及び図34のペプチドI/O複合体のようなペプチドI/O複合体の能力を示している。
実施例83
細胞死のインビトロでの実証
本実施例では、本開示のペプチドI/O複合体への曝露後の、インビトロのがん細胞におけるアポトーシスを含む細胞死のインビトロでの実証について記載する。ペプチド(例えば、配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316のうちのいずれか1つ)を組換えにより発現させるかまたは化学合成した後、実施例12、実施例13、実施例15、実施例16、または実施例17に記載されるようにして、または図34~44に示されるようにしてRIG-IリガンドまたはSTINGリガンドに結合した。MCF-7ヒト乳癌細胞株などのがん細胞株を培養中で増殖させる。細胞をペプチドI/O複合体に曝露する。曝露されると、ペプチドI/O複合体は細胞に内在化され、一部が細胞質に入る。I/Oがそのターゲット(RIG-I、MDA5、またはSTING)を刺激すると、アポトーシスを含む細胞死をもたらす細胞内シグナル伝達経路が刺激される。細胞死の誘導は、アネキシンVに対するモノクローナル抗体(mAb)に加えてヨウ化プロピジウム(PI)または4’、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)などの別の蛍光DNA染色で細胞を染色することによって示される。
実施例84
がん細胞に対する免疫応答のインビトロでの実証
本実施例では、本開示のペプチドI/O複合体で処理されたがん細胞と単離された免疫細胞とを共培養することによる、がん細胞に対する免疫応答のインビトロでの実証について記載する。免疫細胞を、免疫エフェクター細胞及び/またはメモリー細胞のサブセットの増殖及び活性化について特性評価を行う。ヒトがん細胞株または実施例36、37、39、45、47に記載されるような同系腫瘍モデルで使用されるマウスがん細胞株のいずれかなどのがん細胞を、実施例16~19、43、54、36、37、38に記載されるようにしてペプチドI/Oに曝露する。細胞は、ペプチドI/O複合体に対する応答を生じるのに充分な時間、例えば30分、1時間、4時間、一晩、24時間、または48時間にわたってインキュベートする。培地を除去し、細胞を洗浄して残存するペプチドI/O複合体をすべて除去する。コントロールの細胞培養はペプチドI/O複合体を含まない培地中に維持し、それ以外は同様に処理する。一方で、免疫細胞を単離する。がん細胞がヒト細胞株である場合には、ヒトPBMCを免疫細胞源として用いる。がん細胞がマウス細胞株である場合には、免疫細胞を同系マウス系統の脾臓から単離する。単離した免疫細胞をCellTrace(Invitrogen)のようなCFSE色素で染色した後、がん細胞と共培養中で増殖させる。例えば、30分、1時間、4時間、一晩、24時間、48時間、または最大1週間など、応答を生じるのに充分な時間にわたるインキュベーションの後、免疫細胞を共培養から取り出す。細胞を、CD3、CD4、CD8、CD11c、及びB220などの系統マーカーに対する抗体で染色し、マークされたサブセットの増殖をフローサイトメトリーによって分析する。免疫サブセットでのCD69、CD80、及びCD86などの活性化マーカーの発現を、評価する系統マーカー(複数可)及び活性化マーカー(複数可)に対して特異的な抗体で染色し、その後、フローサイトメトリー分析を行うことにより測定する。これらの共培養中に分泌されるサイトカインの発現を、サイトカインに対する抗体を用いた細胞内染色、及び/またはELISAなどのアッセイによって測定して培地中に分泌された各タンパク質の量を測定する。
コントロール細胞培養に対する応答とは異なる、ペプチドI/O複合体で処理されたがん細胞に対する免疫細胞応答は、がん細胞がペプチドI/O複合体への曝露により免疫原性を獲得または高めたことを示す。免疫細胞応答には、増殖、活性化マーカーの増加、及びサイトカインの発現が含まれる。
あるいは、CFSE標識した免疫細胞を、がん細胞培養から回収した馴化培地で培養する。系統特異的な増殖と活性化についてのアッセイを上記と同様に行う。応答は、ペプチドI/O複合体で処理されたがん細胞が、免疫応答を刺激する可溶性因子(複数可)を分泌することを示す。
実施例85
免疫細胞の走化性及び遊走のインビトロでの実証
本実施例では、本開示のペプチドI/O複合体で処理したがん細胞と単離した免疫細胞との共培養について記載し、免疫細胞を多孔性膜またはマトリックスによってがん細胞から分離し、がん細胞に応答してバリアに向かって、またはバリアを通過して遊走する能力について特性評価する。例えば、ヒトがん細胞株、または実施例36、37、及び45に記載される同系腫瘍モデルにおいて使用したマウスがん細胞株のいずれかのようながん細胞を、実施例36、37、及び38に記載されるペプチドI/O複合体に曝露する。細胞をペプチドI/O複合体に対する応答を生じるのに充分な時間、例えば、30分、1時間、4時間、一晩、24時間、または48時間にわたってインキュベートする。培地を除去し、細胞を洗浄して残存するペプチドI/O複合体をすべて除去する。コントロールの細胞培養はペプチドI/O複合体を含まない培地中に維持し、それ以外は同様に処理する。一方で、免疫細胞を単離する。がん細胞がヒト細胞株である場合には、ヒトPBMCを免疫細胞源として用いる。がん細胞がマウス細胞株である場合には、免疫細胞を同系マウス系統の脾臓から単離する。単離した免疫細胞をCellTrace(Invitrogen)のようなCFSE色素で染色した後、がん細胞に隣接した培養チャンバに加える。応答を生じるのに充分な時間、例えば30分、1時間、4時間、一晩、24時間、48時間、または最大1週間のインキュベーション後、チャンバを分離し、免疫細胞を元の区画内、バリア材料内、及びチャンバのがん細胞部分内で可視化する。コントロールの細胞培養との培養物におけるよりも多い、ペプチドI/O複合体で処理したがん細胞との培養におけるバリアまたはがん細胞チャンバ内の免疫細胞の存在は、ペプチドI/O複合体への暴露によって、がん細胞が免疫走化性を獲得または増大させたことを示す。
実施例86
ペプチドIL-15剤複合体で処理した細胞のインビトロ増殖
本実施例では、サイトカイン依存性CTLL2(マウス細胞傷害性Tリンパ球細胞株)、Mo7e(ヒト急性巨核芽球性白血病細胞株)、及びヒト初代CD8+T細胞を使用し、ペプチド-IL-15剤複合体で処理した細胞のインビトロ増殖について記載する。すべてのアッセイは、透明底の黒色壁組織培養プレートの96ウェルプレートフォーマットで行った。配列番号568を含むペプチドI/O複合体、IL-15剤を含むペプチドI/O複合体、及びHisタグ付けしたRLIコントロールタンパク質を含むペプチドI/O複合体(配列番号1342)を、補充サイトカインを含まない培地中に希釈した。2、5、及び10倍の段階希釈(濃度は実験及び細胞型によって変えた)を行い、各分子の分析を3連で行った。
CTLL2及びMo7e細胞は、IL-2(CTLL2)またはIL-3(Mo7e)のいずれかを含む培地中で細胞培養として維持した。生存率及び細胞濃度は、Viacellセルカウンターを使用して分析した。カウント後、必要な数の細胞を浮遊培養から取り出し、2~3回洗浄し、補充サイトカインを含まない培地に再懸濁し、培養フラスコに入れて37℃、5%COで4時間インキュベートすることによりサイトカイン飢餓状態とした。次いで、細胞を、10μLの各試験タンパク質が入ったウェルに加え(90μl中、20,000個のMo7e細胞または5,000個のCTLL2細胞)、2日間(CTLL2)または3日間(Mo7e)インキュベートした(最終容量を1ウェル当たり100μLとした)。細胞を含まない増殖培地を含むさらなるウェルを、アッセイのブランクとして含めた。
CD8+で選択した初代ヒトT細胞を凍結細胞として受け取り、使用するまでLN2気相中で保存した。細胞を37℃の水浴中で解凍した後、5mLの室温の50%FBS/50%RPMI培地にゆっくりと加えた。15mLの室温の10%FBS RPMI培地を細胞懸濁液に加えた後、細胞をペレット化し、10%FBS培地に再懸濁し、Viacellを使用してカウントした。次いで、細胞の半分を10%FBS RPMI培地を使用して適宜希釈し、40,000細胞/ウェル(90μL中)を、各試験タンパク質が入った96ウェルプレートに加えた。最終容量を100μLとした。細胞の残りの半分を5μg/mLのPHAを含む培地に再懸濁し、37℃で3日間インキュベートして芽球を形成させた。次いで、細胞を洗浄し、10単位/mLのIL-2を含む培地に再懸濁し、37℃で1日間インキュベートした後、上記で述べたようにしてプレーティングした。
インキュベーション期間の終了後、PrestoBlue生細胞アッセイ試薬(Invitrogen)を各ウェルに加えた(100μLウェル当たり10μL)。次いで、プレートをインキュベーターに4~6時間(CTLL2及びMo7e)または24時間(CD8+細胞)戻した。Envision(Perkin Elmer 2104)プレートリーダーを使用して蛍光を定量した。データをグラフ化し、Excel、GraphPad Prism 7、またはAAT Bioquest graphing and EC50 calculator(https://www.aatbio.com/tools/ec50-calculator)で分析した。
配列番号568を含むペプチドI/O複合体は、サイトカイン活性を保持し、CTLL2、Mo7e、及びCD8+初代ヒトT細胞の増殖を刺激した。図28は、CTLL2細胞の増殖曲線を示す。図28Aは、増加する濃度の配列番号1317、配列番号1318、配列番号1319、及び配列番号1321及びHisタグ付けしたRLIタンパク質(配列番号1342)に曝露した後のCTLL2細胞の増殖曲線を示す。図28Bは、配列番号1320、IL-15(配列番号1177)、及びHisタグ付けしたRLI(配列番号1342)についてのCTLL2増殖を示す。各データ点は、n=3の平均を表す。RFU-相対蛍光単位。
図29は、増加する濃度の配列番号1317、配列番号1318、配列番号1319、配列番号1320、及び配列番号1321及びHisタグ付けしたRLI(配列番号1342)に曝露した後のMo7e細胞の増殖曲線を示す。各曲線は各群n=3を示し、エラーバーは標準誤差(SEM)を表す。結果は、これらのIL-15剤がMo7e細胞を刺激することを示している。図30は、CD8+初代ヒトT細胞及び同じCD8+T細胞ドナーからのPHA誘導T細胞芽球の増殖曲線を示す。図30Aは、増加する濃度の配列番号1317、配列番号1318、配列番号1319、配列番号1320、及び配列番号1321及びHisタグ付けしたRLI(配列番号1342)に曝露した後のCD8+初代ヒトT細胞の増殖曲線を示す。曲線上の各点は、各群n=3の平均を示す。RFU-相対蛍光単位。図30Bは、増加する濃度の配列番号1317、配列番号1318、配列番号1319、配列番号1320、及び配列番号1321及びHisタグ付けしたRLI(配列番号1342)に曝露した後の図30Aと同じCD8+T細胞ドナーからのPHA誘導T細胞芽球の増殖曲線を示す。曲線上の各点は、各群n=3の平均を示す。RFU-相対蛍光単位。これらのデータは、これらのIL-15剤がヒトCD8+T細胞を刺激することを示している。
配列番号569-IL-15剤複合体で処理した細胞のインビトロ増殖。配列番号1328を含む発現プラスミドをトランスフェクトした(したがって、配列番号1328のタンパク質を上清に分泌すると予想される)HEK293細胞からの未精製の上清を、Mo7e増殖アッセイを使用してサイトカイン活性について試験した。Mo7e細胞は、サイトカイン依存性ヒト巨核芽球性白血病細胞株であり、IL-3を含む培地中で維持されるが、IL-15刺激にも応答して増殖する。生存率及び細胞濃度は、Viacellセルカウンターを使用して分析した。カウント後、必要な数の細胞を浮遊培養から取り出し、培地で3回洗浄して残留IL-3を除去し、補充サイトカインを含まない培地に再懸濁した。Mo7e細胞を、培養フラスコに入れて37℃、5%COで4時間インキュベートすることによりサイトカイン飢餓状態とした。次に、細胞を、未精製の配列番号1328を含む上清、発現ベクターをトランスフェクトしていないHEK293馴化培地(「モック」、配列番号1328の発現)、または培地のみ(「非処理」)が110倍の最終希釈倍率で含むウェルに加え、3日間インキュベートした。細胞を含まない培地を含むさらなるウェルを、アッセイのブランクとして含めた。
インキュベーション期間の終了後、PrestoBlue生細胞アッセイ試薬(Invitrogen)を各ウェルに製造者の指示に従って加えた。次いで各プレートをインキュベーターに4時間戻した。Envision(Perkin Elmer 2104)プレートリーダーを使用してPrestoBlueの蛍光を定量した。
配列番号1328を含むペプチドI/O複合体は、サイトカイン活性を示し、Mo7e細胞の増殖を刺激した。図83は、Mo7e細胞を、配列番号1328の発現ベクターをトランスフェクトしたHEK293細胞から得られた馴化培地(上清)、またはトランスフェクトしていない細胞(モックネガティブコントロール)から得られたHEK293馴化培地で処理した3日後にPrestBlue生細胞アッセイからの相対蛍光単位(RLU)で表した蛍光シグナルを示す。非処理のMo7e細胞もさらなるネガティブコントロールとして含めた。エラーバーは標準偏差を示す(各群n=3)。これは、配列番号1328を含むペプチドI/O複合体がMo7e細胞を刺激することを示している。
配列番号1、配列番号2、配列番号568、配列番号569または配列番号570の任意のペプチド、または上記のいずれかと80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれ以上同一である任意のペプチドを含む本開示のいずれのペプチドも、同様の結果を有するペプチド-IL-15複合体を構成することができる。
実施例87
ペプチドI/O複合体に対する腫瘍細胞の応答
本実施例では、ペプチドI/O複合体によるインターフェロン産生、インターフェロンで刺激した遺伝子を含む抗腫瘍遺伝子発現プロファイルの誘導、及びアポトーシスを含む腫瘍細胞応答について記載する。本開示のペプチドI/O複合体を、CT26結腸癌細胞及びA20リンパ腫細胞を使用して、アポトーシスを引き起こし、インビボで腫瘍にインターフェロン応答を誘導する能力について試験した。図37のペプチドI/O複合体を、雌性Balbcマウスで評価した。
側腹部腫瘍を形成するため、マウスに100μLの容量で20万個のCT26細胞を接種した。Klinghoffer,R.A. et al.A technology platform to assess multiple cancer agents simultaneously within a patient’s tumor.SciTranslMed 7,284ra258,doi:10.1126/scitranslmed.aaa7489(2015)、及びMoreno-Gonzalez,A.,Olson,J.M. & Klinghoffer,R.A.Predicting responses to chemotherapy in the context that matters-the patient.MolCell Oncol 3,e1057315,doi:10.1080/23723556.2015.1057315(2016)に記載されるようにして、独自のマイクロインジェクターデバイスを使用して腫瘍に直接試験物を注射することで、同じ腫瘍の異なる位置に4つの別々の試験群を局所的に別々に注射した。注射に先立って各試験物を蛍光追跡マーカー(FTM)と混合することで、腫瘍内の各注射の位置を特定できるようにした。移植した腫瘍が9mm(長さ)、8mm(幅)及び3mm(深さ)のおよその寸法に達した時点で、マウスをマイクロインジェクション実験に用いた。マイクロインジェクションデバイスは、4本の注射針を備え、各腫瘍注射ごとに針1本当たり1.2μLの総容量を送達する構成のものとした。空間的な位置確認のため、蛍光追跡マーカー(FTM)を注射内容に加えた。部位ごとに注射した薬剤の総量は以下のとおりであった。すなわち、a:1μg(60pmol)の図37のペプチドI/O複合体、b:50μMのクロロキン二リン酸塩、c:1ugの図37のペプチドI/O複合体+50μMのクロロキン、またはd:製造者の指示に従ってin vivo-jetPEI(Polyplus/VWR)に配合した0.6μg(48pmol)の5’ppp-dsRNA(Invivogen)(12.5μLの5’ppp dsRNAストック、4μLのin vivo-jetPEI試薬、25μLの10%グルコース、2.5μLのFTM、及び6μLの水を含み、最終グルコース濃度5%、N/P比=8とした)(ただし、5’ppp-dsRNAは、センス鎖に5’pppを有する、配列番号1424と配列番号1425との二本鎖RNAである)。マイクロインジェクションの4時間後及び24時間後に腫瘍を切除して分析を行った。切除した腫瘍を、Klinghoffer refに記載されているように固定、処理、染色、及びスキャンした。ウサギ抗CC3抗体(Cell Signaling #9661、希釈倍率1:150)を免疫組織化学(IHC)アッセイに使用した。免疫蛍光検出を行うため、AlexaFluor647(#111-605-144 Jackson Immuno research、希釈倍率1:600)に結合した二次抗体を製造元の指示に従って適用し、組織をDAPIで対比染色した。H&E染色を一般的な組織学的評価のために行った。
実験の結果を図16~図18及び図86に示す。Panoramic Viewerを使用して画像を撮影し、輝度及びコントラストをAdobe Photoshopソフトウェアを使用して調整した。画像パネル(高倍率の図で必要とされる)をAdobe Illustratorを使用して作成し、必要に応じて上記のように調整した。試験物治療群からのFTMと局在化した切断カスパーゼ3(CC3)染色の共局在は、試験物の注射によって引き起こされたアポトーシスを示し、これは、CT26がん細胞の細胞質中に存在するRIG-Iヘリカーゼにオリゴヌクレオチドが送達されることによるRIG-I経路の活性化を示し得る。図16は、図37のペプチドI/O複合体、図37のペプチドI/O複合体+クロロキン、クロロキン(CQ)、または5’ppp dsRNA+PEIをマイクロインジェクションし、処理の4時間後に採取して染色したCT26腫瘍試料を示す。上の画像は腫瘍試料全体を示し、下の各画像は標識された特定の治療領域を拡大したものである。破線の矢印は、注射の位置のいくつか(FTMでトレースしたもの)を示し、白い点状斑はCC3染色を示す。図37のペプチドI/O複合体+クロロキンを注射した部位では大きな領域がCC3染色を示したのに対して、図37のペプチドI/O複合体単独、クロロキン単独、または5’ppp dsRNA+PEIを注射した部位は、顕著なCC3染色の領域を有さなかった。下の各画像は、染色画面をさらに拡大して示している。図16では、CC3アポトーシスマーカーは、図37のペプチドI/O複合体+クロロキンの試験物と共局在化しており、図37のペプチドI/O複合体+クロロキンによって4時間でアポトーシスが誘導されたことを示している。CC3とこの試料中の他の試験物との顕著な共染色の明確な証拠は認められない。図17は、図37のペプチドI/O複合体、図37のペプチドI/O複合体+クロロキン、クロロキン、または5’ppp dsRNA+PEIをマイクロインジェクションし、処理の24時間後に採取して染色した、異なる動物由来のCT26腫瘍試料を示す。上の画像は腫瘍試料全体を示し、下の各画像は標識された特定の治療領域を拡大したものである。破線の矢印は、注射の位置のいくつかを示し、白い点状斑はCC3染色の一部を示す。図37のペプチドI/O複合体を注射した部位、及び図37のペプチドI/O複合体+クロロキンを注射した部位では大きな領域がCC3染色を示し、これらを下の画像に拡大して示した。一方、5’ppp dsRNA+PEIを注射した部位は、顕著なCC3染色の領域を有さなかった。図37のペプチドI/O複合体及び図37のペプチドI/O複合体+クロロキンは、いずれも強いCC3との共局在化染色を示し、図37のペプチドI/O複合体及び図37のペプチドI/O複合体+クロロキンの両方による24時間でのアポトーシスの誘導を示している。5’ppp dsRNA+PEIの注射では明らかなCC3との共染色は認められない(この腫瘍試料にはクロロキン部位は存在していない)。図18は、図37のペプチドI/O複合体、図37のペプチドI/O複合体+クロロキン、クロロキン、または5’ppp dsRNA+PEIをマイクロインジェクションし、処理の24時間後に採取して染色した、異なる動物由来のCT26腫瘍試料を示す。矢印または丸で囲った領域は、注射の位置のいくつかを示し、白い点状斑はCC3染色の一部を示す。図37のペプチドI/O複合体を注射した部位、及び5’ppp dsRNA+PEIを注射した部位では大きな領域がCC3染色を示した。CQ及び図37のペプチドI/O複合体+クロロキンの注射部位は、この試料における腫瘍壊死の大まかな領域との融合のために解釈不能である。図37のペプチドI/O複合体及び5’ppp dsRNA+PEIは、いずれも強いCC3との共局在化染色を示し、図37のペプチドI/O複合体及び5’ppp dsRNA+PEIの両方による24時間でのアポトーシスの誘導を示している。Tシグナルは、試験した動物によって異なった。1匹の動物が、クロロキン単独を注射した部位で24時間でCC3染色を示した。このデータは、腫瘍への注入時に(PEIまたはトランスフェクション試薬なしで)局所的なアポトーシスを誘発する図37のペプチドI/O複合体の能力を示している。図37のペプチドI/O複合体と同時注入されるクロロキンを加えることで、アポトーシス応答を加速すると考えられる。Rig-I経路を介してアポトーシス応答を誘導するには、図37のペプチドI/O複合体は、腫瘍の細胞のサイトゾル中に存在するRig-Iヘリカーゼに送達される必要がある。これは、図37のペプチドI/O複合体が、5’pppヘアピンRNAをサイトゾルに送達できる可能性を示している。5’ppp dsRNA+PEIもまた、図18に示されるように腫瘍にアポトーシス応答を示し、その場合、5’ppp dsRNAの細胞質送達が行われることでトランスフェクション試薬PEIにdsRNAの細胞質送達を引き起こさせると考えられる。
別の実験において、BalbCマウスに同様にA20リンパ腫細胞を接種して腫瘍を形成し、移植された腫瘍が14mm(長さ)、10mm(幅)、及び7mm(深さ)のおよその寸法に達した時点で用いた。マウスに、6箇所(ここでは、注射部位当たり1.2μL)に同時に注射できるデバイスを用いたマイクロインジェクションによって複数の試験物を投与し、4及び24時間で安楽死させ、腫瘍を同様にさまざまなマーカーで染色した。部位ごとに注射する薬剤の総量は、1または2μg(60または120pmol)の図37のペプチドI/O複合体、0.74μg(60pmol)の5’ppp-hpRNA(配列番号1371)、製造業者の説明書に従ってin vivo jet PEI中に配合した0.6μg(48pmol)の5’ppp dsRNA、1ug(3542pmol)のDMXAA(図26D)、またはPBSとした。in vivo jet PEI配合物中の5’ppp-dsRNAは、5μLの5’ppp dsRNAストック、4μLのin vivo-jetPEI試薬、25μLの10%グルコース、2.5μLのFTM、及び13.5μLの水を含み、最終グルコース濃度5%、N/P比=8)とした。5’ppp-dsRNAは、配列番号1425と複合体化された配列番号1424のセンス鎖に5’pppを有する二本鎖RNAである。
図81は、図37のペプチドI/O複合体、PBS、DMXAA、5’ppp dsRNA+in vivo jet PEI、及び5’ppp hpRNAをマイクロインジェクションしたA20リンパ腫試料を示す。白い点状斑は、CC3染色を示す。画像を投与24時間後に撮影した。図81Aは、1μg及び2μgの図37のペプチドI/O複合体、PBS、DMXAA、5’ppp dsRNA+in vivo jet PEI、及び5’ppp hpRNAをマイクロインジェクションしたA20リンパ腫試料の縮小画像を示し、各注射領域をテキストで示している。図81Bは、PBS領域、5’ppp hpRNA領域、2μg用量の図37のペプチドI/O複合体を注射した領域、及び1μg用量の図37のペプチドI/O複合体を注射した領域の拡大画像を示す。CC3染色は白い点状斑で示される。1μg及び2μg用量の図37のペプチドI/O複合体は、強いCC3との共局在化染色を示し、この試験物の注射によるアポトーシスの誘導を示した。この試料の他の注射部位は、同様に強いアポトーシスの誘導は示していない。
薬物反応の定量分析は、これまでに記載されているようにして行った(Klinghoffer,R.A. et al. Sci Transl Med(2015);Dey,J.et al PLoS One(2016))。注射部位はFTMの補助により自動的に特定され、次に注射部位を中心とする円形の対象領域内で細胞が自動的に特定され、それらの染色パターンに基づいて異なるクラスに割り当てられる。各クラスに属する細胞(例えば、CC3陽性)の割合は、径方向距離の関数としてマッピングされる。2つの薬剤によって誘導される応答を比較するため、各剤単独及びビヒクルコントロールの径方向の効果曲線を線形の混合効果モデルと組み合わせて使用して、一方の薬剤からの応答が他方の薬剤よりも顕著に大きいかどうかを推定する。
図82は、4時間及び24時間の時点で、各試験物について合計7~8個の腫瘍で、注射部位からの距離が増加するにつれて細胞のどれだけの割合がCC3染色について陽性であるかを示す放射状プロット分析である(0.3の割合は、細胞の30%が陽性であることを示す)。24時間の時点では、1μg及び2μgの両方の用量の図37のペプチドI/O複合体で、試験物の注入部位に近いほどCC3陽性細胞の割合が増加しているのに対し、PBSまたは5’ppp hpRNAでは注射部位の近くでCC3陽性細胞の増加がほとんどみられないことを示している。トランスフェクション試薬PEIを5’ppp dsRNAと組み合わせて加えた場合にも、CC3陽性細胞にある程度の増加がみられる。試験物の注射部位の近くにおけるCC3陽性細胞の割合の増加は、60pmol(1μg)の図37のペプチドI/O複合体を注射した場合に、等モル量の5’ppp hpRNを注射した部位の近くよりも有意に高くなっている(グラフので示されるP<0.05)。図37のペプチドI/O複合体は同じ5’ppp hpRNA配列を含むが、本開示のペプチドも付加されているため、これは、本開示のペプチドとRig-I I/O剤である5’ppp hpRNAとの組み合わせが、細胞にアポトーシスを引き起こす複合体の能力を高めることを示しており、これは、Rig-Iヘリカーゼへの5’ppp hpRNAのサイトゾル送達によるものと考えられる。
さらに、両方の実験からの腫瘍試料をIFNb応答の誘導についても染色した。インターフェロンβ(IFNb)応答は、RNAscopeマルチプレックス蛍光試薬キットv2(Advanced Cell Diagnostics)を製造元の指示に従って使用したインサイチューハイブリダイゼーションを用いて検出した。RNAscope ISHアッセイは、マウスIFNb1プローブを用い、TSA Plus Cyanine 5検出により完了する。スライドをDAPIで対比染色し、画像化した。
図86は、図37のペプチドI/O複合体、図37のペプチドI/O複合体+クロロキン、クロロキン(CQ)、または5’ppp dsRNA+PEIをマイクロインジェクションし、処理の4時間後に採取して染色したCT26腫瘍試料を示す。上の画像は腫瘍試料全体を示し、下の各画像は標識された特定の治療領域を拡大したものである。破線の矢印は、注射の位置のいくつか(FTMでトレースしたもの)を示し、白い点状斑はIFNb mRNA染色を示す。クロロキン注射部位はこの試料では存在していない。上の画像及び下の画像に拡大して示されるように、図37のペプチドI/O複合体を注射した領域及び5’ppp dsRNA+PEIを注射した領域では、IFNb mRNAの顕著な染色が認められる。これは、トランスフェクション試薬を使用することなくIFNb応答を生成することができる図37のペプチドI/O複合体の能力を示しており、これは、サイトゾルへのI/O RNAの送達とRig-I経路の関与を示すと考えられる。
図84及び図85は、図37のペプチドI/O複合体、PBS、DMXAA、5’ppp dsRNA+in vivo jet PEI、及び5’ppp hpRNAをマイクロインジェクションした上記の実験からのA20リンパ腫試料を示す。白い点状斑は、IFNb mRNAの染色を示す。画像を投与4時間後に撮影した。図84は、1μg及び2μgの図37のペプチドI/O複合体、PBS、DMXAA、5’ppp dsRNA+in vivo jet PEI、及び5’ppp hpRNAをマイクロインジェクションしたA20リンパ腫試料の縮小画像を示し、各注射領域をテキストで示している。図85は、PBS領域、5’ppp hpRNA領域、2μg用量の図37のペプチドI/O複合体を注射した領域、及び1μg用量の図37のペプチドI/O複合体を注射した領域の拡大画像を示す。IFNb mRNAの染色は白い点状斑で示される。1ugまたは2ugの図37のペプチドI/O複合体を注射した領域は、顕著なIFNb mRNA染色を示している。5’ppp hpRNAを注射した領域もIFNb mRNA染色も示しているが、PBSを注射した領域では染色はみられない。これは、トランスフェクション試薬を使用することなくIFNb応答を生成する図37のペプチドI/O複合体の能力を示しており、これは、サイトゾルへのI/O RNAの送達とRig-I経路の関与を示すと考えられる。
以上をまとめると、これらの実験の結果は、トランスフェクション試薬を使用せずにA20及びCT26腫瘍にインビボで送達される場合にIFNb mRNAを誘導し、アポトーシスを誘導する図37のペプチドI/O複合体の能力を示すものである。これは、RNA I/Oを細胞のサイトゾルに送達し、Rig-I経路を誘導する図37のペプチドI/O複合体の能力を示していると考えられる。
実施例88
ペプチドI/O複合体による頭頸部癌の治療
本実施例では、本開示のペプチドI/O複合体を用いた頭頸部癌の治療について説明する。本開示のペプチドを、組換えにより発現させるかまたは化学合成し、I/Oに結合した後、直接使用する。ペプチドI/O複合体を頭頸部癌の治療薬として医薬組成物中で対象に投与する。本開示の1つ以上のペプチドI/O複合体を対象に投与する。対象はヒトまたは動物であってよい。医薬組成物は皮下、静脈内、経口投与するか、または腫瘍に直接注射する。投与されたペプチドI/O複合体は、頭頸部癌に冒された組織及びその細胞をターゲティングする。
ペプチドは、配列番号1~配列番号1134、配列番号1243~配列番号1262、または配列番号1263~配列番号1316から選択される配列を有する任意のペプチドである。かかるペプチド薬物結合体は、本明細書に記載されるような切断可能なまたは安定的なリンカーのいずれかを使用して作製することができる(例えば、実施例8及び9)。
実施例89
ペプチドIL-15剤複合体の酵素によるプロセシング
本実施例では、本開示のペプチド-IL-15剤複合体の酵素によるプロセシングについて記載する。腫瘍細胞または腫瘍微小環境に曝されたペプチド-IL-15剤複合体は、腫瘍環境中、またはエンドソームへのエンドサイトーシスなどによって複合体が送達される細胞内区画内に高濃度で存在する酵素によってプロセシングされる。本実施例では、酵素カテプシンBに曝露された後のペプチド-IL-15剤複合体中のIL-15剤の効力の変化について記載する。カテプシンBは、pH5でエキソペプチダーゼ活性を、pH7でエンドペプチダーゼ活性を示す。配列番号1317、配列番号1318、配列番号1319、配列番号1320及び配列番号1321、ならびにHisタグ付きRLI(配列番号1342)を、それらのIL-15サイトカイン活性について、pH7及びpH5でカテプシンBへの曝露を行うかまたは行わずに試験した。pH条件は、エンドペプチダーゼ活性を決定する初期エンドソームの中性pH、及び後期エンドソーム及びリソソームのより酸性のpH5依存性エキソペプチダーゼ活性を再現するように選択した。
カテプシンB切断をpH7及びpH5で行った。pH7の条件の反応バッファーはPBS+8mMシステインとし、pH5の条件の反応バッファーは50mM酢酸ナトリウム+8mMシステインとした。融合タンパク質を微量遠心管中、反応バッファーで2μMに希釈した。カテプシンB(0.44μg)を各反応液に加え、37℃、5%COに設定した組織培養インキュベーターに2時間入れた。コントロール条件は、カテプシンB酵素を含まない点以外は同じとした。反応時間の後、1M HEPES(反応容量の1%)をpH5条件に加えて酸性バッファーを中和した。反応バッファーを使用して各反応の段階希釈を行い(pH5条件の希釈液に1%HEPESを添加)、96ウェルプレートの各ウェルに3連で添加した(ウェル当たり10μL)。
すべてのアッセイは、透明底の黒色壁組織培養プレートで96ウェルプレートフォーマットで行った。CTLL2細胞(マウス細胞傷害性Tリンパ球細胞株)を、IL-2を添加した培地中で細胞培養として維持した。Mo7e(ヒト急性巨核芽球性白血病細胞株)を、IL-3を添加した培地中で維持した。生存率及び細胞濃度は、Viacellセルカウンターを使用して分析した。カウント後、必要な数の細胞を浮遊培養から取り出し、補充サイトカインを含まない培地に再懸濁した。pH5条件の培地はHEPESを含むものとした。CTLL2細胞とMo7e細胞を37℃の組織培養インキュベーター中で4時間、サイトカイン飢餓状態にした後、ペプチド-IL-15剤複合体を含むウェルに最終容量100μLとなるように加えた(90μL中、5,000個のCTLL2または20,000個のMo7e細胞)。各プレートをインキュベーターに2日間(CTLL2)または3日間(Mo7e)戻した。細胞を含まない増殖培地を含むさらなるウェルを、アッセイのブランクとして含めた。インキュベーション期間の終了後、PrestoBlue生細胞アッセイ試薬(Invitrogen)を各ウェルに加えた(100μLウェル当たり10μL)。次いで各プレートをインキュベーターに4~24時間戻した。Envision(Perkin Elmer 2104)プレートリーダーを使用して蛍光を定量した。
サイトカイン活性は、pH7またはpH5でのカテプシンBへの曝露後に、試験した融合タンパク質の一部で増加した。図31は、Mo7e細胞中のHisタグ付きRLI(配列番号1342)及び配列番号1318のペプチド-IL-15剤複合体について、示された異なる濃度(nM)のペプチド-IL-15剤複合体またはRLIでpH5におけるカテプシンB処理をした場合(+)としない場合(-)のサイトカイン活性を示す。曲線上の各点は、各群n=3の平均を示す。曲線上の各点は、各群n=3の平均を示す。図31は、Mo7e細胞でpH5でのカテプシンBによる切断を行った場合と行わなかった場合の配列番号1318の増殖曲線を示す。カテプシンBによる切断を行わない場合、配列番号1318の効力はHisタグ付きRLI(配列番号1342)よりも顕著に低くなっている。カテプシンBによる切断後、効力はRLIと同様のレベルに増加し、このペプチド-IL-15複合体でRLI様活性が回復している。図32は、CTLL2増殖アッセイにおけるカテプシンB切断を示す。
図32Aは、CTLL2細胞中の配列番号1319の、pH7でのカテプシンB処理後のサイトカイン活性を示す。曲線上の各点は、各群n=3の平均を示す。図32Bは、CTLL2細胞中の配列番号1321の、pH7でのカテプシンB処理後のサイトカイン活性を示す。曲線上の各点は、各群n=3の平均を示す。図32は、配列番号1319では、CTLL2細胞中、pH7でのカテプシンB切断後にサイトカイン活性が増大することを示している。図32は、CTLL2細胞中の配列番号1317の、pH5でのカテプシンB処理後のサイトカイン活性を示す。曲線上の各点は、各群n=3の平均を示す。図33は、配列番号1317では、CTLL2細胞中、pH5でのカテプシンB切断(エキソペプチダーゼ条件)後にサイトカン活性が増大することを示している。配列番号1、配列番号2、配列番号568、配列番号569または配列番号570の任意のペプチド、または上記のいずれかと80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれ以上同一である任意のペプチドを含む本開示のいずれのペプチドも、同様の結果を有するペプチド-IL-15剤複合体を構成することができる。
実施例90
ペプチドI/O複合体に対する腫瘍細胞応答のインビトロ特性評価
本実施例では、本開示のペプチドI/O複合体に対する腫瘍細胞応答のインビトロ特性評価について記載する。例えば、ヒトがん細胞株、または実施例36、37、45に記載される同系腫瘍モデルにおいて使用したマウスがん細胞株のいずれかのようながん細胞を、実施例36、37、38に記載されるペプチドI/O複合体に曝露する。細胞はペプチドI/O複合体に対する応答を生じるのに充分な時間、例えば、30分、1時間、4時間、一晩、24時間、または48時間にわたってインキュベートする。各種の応答を測定する。培養皿の所定の領域から細胞をこすり取り、除去された領域の幅の経時的な変化を測定することによって細胞が遊走する能力を測定する。サイトカインや成長因子などの分泌タンパク質は、ELISAなどの標準的な方法で測定される。発現パターンの変化は、タンパク質レベル(プロテオミクス分析)またはマイクロアレイまたはRNAシーケンシングによりRNAレベルで測定される。
実施例91
間質及び内皮との腫瘍細胞の相互作用のインビトロ特性評価
本実施例では、間質及び内皮との腫瘍細胞の相互作用のインビトロ特性評価について記載する。詳細には、本実施例は、本開示のペプチドI/O複合体で処理されたがん細胞と間質細胞及び/または血管内皮細胞とを共培養し、腫瘍細胞は炎症を誘発するかもしくは他の形で腫瘍促進環境を増強する、間質に侵入する、及び/または血管内皮を通じて血管外に遊出する細胞の能力について特性評価を行うことについて記載する。例えば、ヒトがん細胞株、または実施例36、37、45に記載される同系腫瘍モデルにおいて使用したマウスがん細胞株のいずれかのようながん細胞を、実施例36、37、38に記載されるペプチドI/O複合体に曝露する。細胞をペプチドI/O複合体に対する応答を生じるのに充分な時間、例えば、30分、1時間、4時間、一晩、24時間、または48時間にわたってインキュベートする。培地を除去し、細胞を洗浄して残存するペプチドI/O複合体をすべて除去する。コントロールの細胞培養はペプチドI/O複合体を含まない培地中に維持し、それ以外は同様に処理する。一部の実験では、ペプチドI/O複合体を共培養物に直接添加する。一部の実験では、がん細胞をCFSEまたは他の蛍光マーカーで標識することができる。線維芽細胞などの間質細胞は、直接播種するか、マトリゲルなどのゲルに懸濁する。血管内皮細胞は、直接播種するか、2つの培養物が多孔質膜で分離されているトランスウェルプレートなどのプレートで増殖する。がん細胞は、間質細胞または血管内皮細胞と共に直接培養するか、トランスウェル型プレートで同じチャンバ内または間質細胞または血管内皮細胞の反対側のチャンバ内で培養する。例えば、30分、1時間、4時間、一晩、24時間、48時間、または最大1週間など、応答を生じるのに充分な時間にわたるインキュベーションの後、培養物を分析する。分泌された成長因子及びサイトカインをELISAなどの標準的な方法で測定する。がん細胞の数及び位置を、マトリゲルに浸潤した、または血管内皮細胞層に、または細胞層を通過して遊走した蛍光標識細胞をカウントすることによって決定する。コントロール細胞培養と比較して、ペプチドI/O複合体で処理されたがん細胞との培養における、間質またはマトリックスへの浸潤の減少、血管内皮へのもしくは血管内皮を通過する遊走の減少、及び/または腫瘍細胞の増殖を促進し、及び/またはアポトーシスを阻害する成長因子及びサイトカインの減少は、ペプチドI/O複合体に曝露されることでがん細胞の浸潤または転移特性が低下したことを示す。
実施例92
インビトロでのRIG-I、MDA5、TLR3、またはSTING経路の活性化
本実施例では、インビトロでのRIG-I、MDA5、TLR3、またはSTING経路の活性化について記載する。本開示のペプチドを、RIG-1、MDA5、TLR3、またはSTING経路を活性化することができる薬剤と複合体を形成させる。複合体化は、実施例16または17の方法を使用するなどして、ペプチドを薬剤に結合させることによって行うことができる。図13、34、37の薬剤などのペプチドI/O複合体も必要に応じて用いる。本開示のペプチドを、実施例82に記載されるように、IRF3シグナル伝達を介してSEAPレポーターもトリガーする細胞内の関連する複数の標的を刺激するリガンドに結合する。詳細には、本開示のペプチドを、5’二リン酸を有し、少なくとも10塩基対で平滑な5’末端を有するRIG-Iリガンド、ポリ(I:C)または50bpよりも長いポリ(I:C)などの、MDA5をトリガーする12塩基対より長いdsRNA(5’リン酸なし)、TLR3をトリガーするdsRNA、STINGの環状ジヌクレオチドリガンド、またはTLR9のCPGと結合する。
ペプチドI/O複合体を、実施例82に記載されるようなIRF3を介してSEAPレポートをトリガーすることが示されている細胞に適用する。
実施例93
免疫細胞集団に対するペプチド-IL-15剤複合体の作用
本実施例では、免疫細胞集団に対するペプチド-IL-15剤複合体の作用について記載する。I/OとしてIL-15剤を含むペプチドI/O剤複合体は、ペプチドI/O剤複合体にIL-15Rα鎖の一部を含むなどの因子に応じてさまざまな形で免疫細胞を活性化することができる。IL-15R、特にIL-15Rα鎖の発現及び組成の差異が、免疫細胞間で生じる。ナイーブT細胞がほとんどまたはまったくIL-15Rαを発現しないのに対してメモリー及びエフェクターT細胞は高レベルで発現する。IL-15はCD4 T細胞の増殖を促進するが、NK細胞及びCD8 T細胞、特にCD8エフェクターメモリー細胞の増殖よりは大幅に低くなる(Conlon 2015,Romee 2018)。IL-2Rβγ 鎖とIL-15Rαとの発現は、IL-15に対する極めて高い感受性を細胞に与える(Dubois 2002)。IL-15Raの差次的発現のため、裸のIL-15は、ナイーブ細胞(IL-15Rα)よりも成熟T細胞(IL-15Rα)をより効果的に刺激するが、IL-15及びIL-15Rα(sushi+など)を含む融合IL-15剤は、両方を等しく刺激すると予想される。これは、抗腫瘍免疫を増強できる超アゴニストの有用な特性である。Tregの増殖がないことも、有用な基準である。
実施例18に記載されるようなIL-15及びペプチド-IL-15-IL-15Ra(IL-15融合体)複合体のヒト白血球サブセットに対する効力を、正常なヒトPBMCでインビトロで試験する。細胞を、Kermer et al. (Mol Cancer Ther. 2012 June;11(6):1279-1288)に記載されるようなCFSEを用い、異なる濃度のIL-15またはペプチド-IL-15-IL-15Ra複合体と培養する。5日後、細胞を採取し、CFSE含有量とT細胞及びNK細胞表面マーカーの発現についてフローサイトメトリーで分析する。マーカーとしては、CD3、CD4、CD8、CD56、CD16、Ki67、CD45(RA及びRO)、NKG2D、CD127、CCR7、CC27、CD95、NKp30、TIM-3、及びCD107aが含まれ得る。ペプチド-IL-15-IL-15Ra(IL-15融合)複合体は、これらの細胞の特定のサブセット、特にCD4、CD8、γδT、Treg、及びNK細胞を、裸のIL-15よりも低い濃度で刺激する。CD4 T細胞は、公開されている臨床試験結果(Conlon 2015,Romee 2018)に基づけば、CD8またはNK細胞よりも増殖が少ないと予想される。
実施例94
ペプチドI/O複合体が細胞に入る輸送及び区画の決定
本実施例では、本明細書に開示されるペプチドI/O複合体が細胞に入る輸送及び区画の決定について記載する。ペプチド-RIG-Iリガンド複合体であるペプチドI/O複合体が細胞質に入る区画を、エンドソームの成熟及び酸性化の薬理学的阻害剤を用いて調べる。エンドソームの成熟と酸性化の薬理学的阻害剤には、エンドソームの酸性化の阻害剤であるバフィロマイシン(この薬剤によるSEAPレポーターの遮断は、エンドソームの酸性化が重要であることを示す)、EEの後期エンドソームへの成熟を妨げるワートマンニン、EEのゴルジ体及び小胞体への輸送の阻害剤であるブレフェルディンA、または、初期エンドソームから後期エンドソームへの輸送を阻害するが、細胞膜から初期エンドソームへの輸送は阻害しない微小管重合の阻害剤であるノコダゾールが挙げられる(Gao 2016)。
上記の薬剤の存在下でIRF3を活性化するペプチド-RIG-IリガンドI/O複合体の能力を、実施例36の方法により試験する。これらの阻害剤の存在下でのSEAPレポーター活性化のパターンによって、細胞質への透過が生じる正確な区画の知見が得られる。
実施例95
細胞透過性を高めるためのペプチド変異体
本実施例では、細胞透過性を高めるためのペプチド変異体について記載する。より高いレベルの細胞透過性、エンドソーム放出、または細胞質送達を示す本開示のペプチドの変異体を作製する。Kim et al(2016)は、サイトゾル透過活性を有するmAb(TMab4)を同定している。TMab4にみられるpH依存性の移動が生じるには、エンドソーム膜との疎水性相互作用が可能となるような酸性のGlu(E)またはAsp(D)残基のプロトン化が必要である。配列番号569などのペプチドは、αヘリックス中に存在すると考えられる3つの酸性D残基を有し、細胞質透過のpH依存性にはこれらの残基が関与していると考えられる。これらのD残基のE残基への置換、またはさらなるE残基の付加が細胞質送達に与える影響について試験する。試験は、そのようなペプチドをRIG-Iリガンドと複合体化し、実施例36に記載されるSEAPアッセイを行うことによって行う。配列番号568は、3個のArg(R)及び3個のLys(K)残基を有している。このような塩基性残基は、細胞透過特性を有するカチオン性両親媒性のαヘリックス(TAT、R8(配列番号1385)、メリチン)に共通してみられる。これらの残基はpHに反応し、酸性のエンドソーム区画内で正電荷を失う。配列番号568の細胞質送達におけるこれらの残基の役割は、K及びR残基を置換、除去するかまたはさらなるRまたはK残基を付加し、RIG-Iと複合体化し、さらに実施例36の方法によりIRF3活性化について試験することによって評価される。配列番号569の二次構造を調べることでβシート及びαヘリックス要素が明らかとなる。これらの構造は、細胞透過またはリガンド結合などの機能ドメインを決定する。上記に述べたものなどのこれらのドメインの主要な残基の変更が、エンドソーム内のアネキシンA2からのペプチドの解離(輸送)に対して、また、細胞質透過(SEAPレポーターの活性化)に対して及ぼす影響を試験することができる。これらの方法により、ペプチドI/O複合体で使用するためのさらに高いレベルの送達性を有するペプチドが同定される。
配列番号1、配列番号2、配列番号568、配列番号569または配列番号570の任意のペプチド、または上記のいずれかと80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれ以上同一である任意のペプチドを含む本開示のいずれのペプチドも、同様の細胞透過性の結果を有するペプチドI/O複合体を構成することができる。
実施例96
ペプチド-IL-15複合体の輸送
本開示のペプチドをIL-15 I/Oに結合することにより、IL-15 I/Oの細胞内の輸送が変化する。ペプチドはIL-15 I/Oのエンドソームへの取り込みを増加させ、またそれを細胞表面にリサイクルして分泌させることができるのに対して、ペプチドのないIL-15 I/Oは、低レベルで細胞に取り込まれ、リソソームで分解されるために輸送されると考えられる。
CT26またはU87細胞を、実施例18のものなどのペプチド-IL-15剤複合体に曝露した後、免疫細胞化学によって画像化する。ポリリシンでコーティングされた顕微鏡スライドを使用してチャンバを構築する。1ウェル当たり20,000個のCT26細胞を播種し、一晩付着させる。培地を吸引し、細胞を10uMの配列番号1317~配列番号1321、RLI、または薬剤なしで1、2、3、4、8、または24時間インキュベートする。その後、細胞をPBSで洗浄し、10%中性緩衝ホルマリンで15分間固定し、PBSで洗浄する。次いで、ウェルを0.1%TBSTで洗浄し、0.1%TBST+10%ヤギ血清で45分間インキュベートした後、溶液を除去する。一次抗体ミックスを室温で60分間ウェルに加え、その後除去し、ウェルを0.1%TBSTで洗浄する。次いで、溶液を除去し、0.01%TBST、1%ヤギ血清、DAPI染色、及びファロイジン染色を含む蛍光二次抗体溶液と、Alexafluor二次抗体の適当な希釈液を室温で45分間加える。ウェルを0.01%TBSTで洗浄し、自然乾燥させてから、カバーグラスをかけ、暗所で乾燥させる。その後、ウェルを、例えば20×の全スライドスキャナー、60×の油浸顕微鏡、共焦点顕微鏡(zスタックの設定をスライス間で0.45ミクロンとする)、またはzスタックの設定を0.2ミクロンとしたDeltavision顕微鏡により画像化し、適宜アルゴリズムを用いてデコンボリューションする。
染色は、Rab5(初期エンドソーム)、Rab7(後期エンドソーム)、Rab11(リサイクルエンドソーム)、及びlysotracker555(リソソーム)、ならびにHisタグを含むペプチド-IL-15-I/O複合体を同定するための抗Hisについて行う。ペプチド-IL-15複合体は、取り込みのレベルが低く、またリソソームへ輸送される可能性のある、Hisタグ付きRLIタンパク質(配列番号1342)としてのRLIタンパク質(配列番号1169、配列番号1176、及び配列番号1177を含む)と比較してより高い細胞取り込み、Rab5及び/またはRab11エンドソームでより高いレベルの取り込みを示すことが示された。L0-X-L-Y-L(ただし、任意の組み合わせで、Lは、配列番号1169または配列番号1163であってよく、Xは、配列番号1176または配列番号1179であってよく、Yは、配列番号1177、配列番号1178であってよい)のようなIL-15剤を含むペプチド-IL-15剤複合体などの他のペプチドI/O複合体も同様の取り込みを示し得る。さらに、ペプチド-IL-15剤複合体は、表4の複合体のいずれを含んでもよい。
同じ実験をU87神経膠腫細胞で行ったところ、IL-15剤類似体と比較してより高い細胞取り込み、Rab5またはRab11エンドソームでより高いレベルの取り込みを伴うペプチド-IL-15複合体の同様の輸送が観察された。
フローサイトメトリーを用いて、ペプチド-IL-15I/O複合体としての送達による、細胞表面でのIL-15I/Oの提示も実証する。U87、CT26、またはB16F10などのがん細胞を、0.05、0.5、1、2、4、または24時間にわたってペプチド-IL-15I/O複合体に曝露する。この後、細胞をIL-15またはIL-15Rαに対する抗体で標識し、フローサイトメトリーで分析する。分析は、IL-15ががん細胞の表面に提示されることを示している。
配列番号1、配列番号2、配列番号568、配列番号569または配列番号570の任意のペプチド、または上記のいずれかと80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれ以上同一である任意のペプチドを含む本開示のいずれのペプチドも、同様の輸送の結果を有するペプチド-IL-15複合体を構成することができる。
実施例97
腫瘍内のペプチド-IL-15剤複合体の蓄積
本実施例では、腫瘍内のペプチド-IL-15剤複合体の蓄積について記載する。実施例18におけるこのようなペプチドIL-15剤複合体を発現させ、精製した。マウスに20万個のCT26細胞を投与し、5日間増殖させ、その時点で腫瘍は触知可能であった。マウスに、100μl中、1~12ugの配列番号1317、配列番号1321、RLI、または薬剤を含まないものを週4日、腹腔内投与した。各処置はよく忍容された。7回の投与後、動物を屠殺し、腫瘍組織を採取して固定した。
切片を、Hisタグ、IL-15、またはIL-15 sushi+に対する抗体を用いた免疫組織化学によって染色する。RLIで処理されたマウスに対して、配列番号1317、配列番号1321で処理したマウスの腫瘍でより高いシグナルがみられ、本開示のペプチドの結合が腫瘍内のI/O複合体の蓄積を増加させたことを裏付ける。
配列番号1、配列番号2、配列番号568、配列番号569または配列番号570の任意のペプチド、または上記のいずれかと80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれ以上同一である任意のペプチドを含む本開示のいずれのペプチドも、同様の腫瘍蓄積を有するペプチド-IL-15剤複合体を構成することができる。
0-X-L-Y-L(ただし、任意の組み合わせで、Lは、配列番号1169または配列番号1163であってよく、Xは、配列番号1176または配列番号1179であってよく、Yは、配列番号1177、配列番号1178であってよい)のようなIL-15剤を含むペプチド-IL-15剤複合体などの他のペプチドI/O複合体も同様に取り込みを示し得る。さらに、ペプチド-IL-15剤複合体は、表4の複合体のいずれを含んでもよい。
実施例98
特にRig-I、MDA5、STINGの場合でのペプチドI/O複合体の細胞透過性の増大
本実施例では、特にRig-I、MDA5、STINGの場合でのペプチドI/O複合体の細胞透過性の増大について記載する。本開示のI/Oの細胞透過性のレベルを、本開示のペプチドI/O複合体にさらなる細胞透過性部分を付加することによって増加させる。必要に応じて、表2のペプチドのような1つ以上のペプチドを、ペプチドI/O複合体と複合体化する。必要に応じて、表2のペプチドを表1のペプチドと融合または結合する。必要に応じて、表2のペプチドは、表1のペプチドとI/Oとの間のリンカー内に配置する。必要に応じて、脂質、脂肪酸、コレステロール、リトコール酸、ラウリン酸、ドコサヘキサエン酸、ドコサン酸、(CH2)x(x=1~40)などの1つ以上の疎水性ドメインをペプチドI/Oと複合体化する。必要に応じて、疎水性ドメインは、表1のペプチドまたはI/Oと複合体化させて配置する。必要に応じて、疎水性ドメインは表1のペプチドとI/Oとの間のリンカー内に配置される。必要に応じて、表1のペプチドとI/Oの間のリンカーは三官能性であり、1つの端部は表1のペプチドに連結され、1つの端部はI/Oにリンクされ、1つの端部は表2のペプチドまたは疎水性ドメインのような、複合体の細胞透過を増加させる部分に連結される。
プロセシングもしくは切断されたI/O複合体としての、またはペプチドI/O複合体自体としてのI/Oにより、細胞質、エンドソーム、または他の細胞内区画を含む細胞の任意の部分への送達が増加し、及び/または場合により、細胞取り込みまたはエンドソーム脱出が増加した。
配列番号1、配列番号2、配列番号568、配列番号569または配列番号570の任意のペプチド、または上記のいずれかと80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれ以上同一である任意のペプチドを含む本開示のいずれのペプチドも、同様の細胞透過性の結果を有するペプチドI/O複合体を構成することができる。
実施例99
Rig-I経路の活性化の確認
特定のペプチドI/O複合体によるRig-IまたはMDA5経路のターゲティングは、所望により一方または他方の経路のターゲティングを試験することできるようにRig-IまたはMDA5をコードする遺伝子を欠失またはノックアウトした1つ以上のレポーター細胞株の使用により確認することができる。Rig-IまたはMDA5の必要性を直接確認するために使用することができる細胞株としては、A549-Dual細胞、ならびにRig-IまたはMDA5をノックアウトした対応する細胞であるA549-Dual KO-Rig-I及びA549-Dual KO-MDA5が挙げられる。ペプチドI/O複合体に対する応答における関連RLRへの依存は、A549-Dual KO-MAVS細胞株を使用してさらに確立することができる。例えば、両方の受容体が関与する場合など、予期しない形でRig-IまたはMDA5と関与するペプチドI/O複合体が存在し得る。あるいは、特定の下流のシグナル伝達経路に関与するが、別の経路には関与しない偏ったリガンドが存在し得る。Rig-Iは、ISREを用いるI型IFN経路を介して、また異なる重複遺伝子群の発現を調節するNFκBプロモーターを介して転写を刺激する。MAVSもこれらの遺伝子の転写に寄与し、さらに、カスパーゼ1を活性化するインフラマソームに作用し、IL-1β及びIL-18などのさらなる炎症性分子の活性化と分泌を引き起こすことができる。これらの細胞株を用いて、特定のペプチドI/O複合体が標的とする経路を評価することができる。
本開示のRig-IリガンドがRig-Iを介した応答を誘導できることを確認するため、ペプチド-Rig-Iリガンド複合体を初代ヒト細胞で試験することもできる。末梢血単球及び樹状細胞は、インフラマソーム活性化に依存するIL-1bを産生するため、特に興味深いものである。このRig-I経路は、A549-Dual細胞株で分析されるIRF3及びNFkB経路とは独立しており、A549-Dual細胞株の結果をさらに裏付けるために用いることができる。異なる由来の腫瘍細胞も試験し、それらのRig-I及びMDA5の発現をRig-IペプチドI/O複合体に対するそれらの応答とともに試験する。
本実施例ではさらに、RIG-I経路の活性化の確認について記載する。ペプチド-RIG-Iリガンド複合体が、MDA5などの関連する受容体ではなく、RIG-Iを特異的に活性化することを確認するため、RIG-Iを発現しない細胞を複合体で処理し、その応答を、RIG-Iを発現する同様の細胞と比較することができる。ヒト肺癌細胞株A549の変異体をこの実験に使用する。A549-Dual(商標)KO-RIG-I細胞(InvivoGen)が、RIG-I遺伝子の安定したノックアウトにより親細胞株(A549-Dual(商標))から作製されていた。この細胞は、RIG-Iタンパク質を発現しないが、他の経路成分はインタクトである。この細胞株は、RIG-I経路及び関連するNF-kB経路を介した刺激の直接的な測定を可能にするレポーターコンストラクトを有している。
A549-Dual KO-RIG-I及びA549-Dual細胞を、ペプチド-RIG-Iリガンド複合体で処理する。培地を異なる時点で回収し、レポーターコンストラクトによって誘導される分泌ルシフェラーゼのレベルを、QUANTI-Luc(InvivoGen)などの試薬を使用して測定し、ルミノメーターで読み取る。相対発光量(RLU)は、ペプチド-RIG-I複合体に応答して分泌されるルシフェラーゼの量に比例する。A549-Dual細胞と比較して、A549-Dual KO-RIG-Iにおけるルシフェラーゼ分泌の減少または欠如は、RIG-Iが活性に必要であることを示す。これは、ペプチド-RIG-I複合体が直接RIG-Iを活性化することを示すものである。
配列番号1、配列番号2、配列番号568、配列番号569または配列番号570の任意のペプチド、または上記のいずれかと80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれ以上同一である任意のペプチドを含む本開示のいずれのペプチドも、同様のRigI経路の活性化を示すペプチド-RigIリンカー複合体を構成することができる。
実施例100
腫瘍細胞によるペプチド-IL-15剤複合体のインビトロ活性化
本実施例では、腫瘍細胞によるペプチド-IL-15剤複合体のインビトロ活性化について記載する。
馴化培地。ヒトまたはマウスのがん細胞株などのがん細胞を、ペプチド-IL-15剤複合体に曝露する。がん細胞をペプチド-IL-15剤複合体に結合し、これを内在化させ、それに対する応答を生じるのに充分な時間、例えば、30分、1時間、2時間、4時間、8時間、一晩、24時間、または48時間にわたってインキュベートする。指定の時間後、ペプチド-IL-15剤複合体を含む培地を除去し、細胞を洗浄して残存する試験物質を除去する。細胞に増殖培地を加え、細胞がプロセシングされたペプチド-IL-15剤分子を培地中に分泌するなどの応答を生じるのに充分な時間、例えば1時間、2時間、4時間、8時間、一晩、24時間にわたって組織培養インキュベーター中に置く。この後、馴化培地を除去し、例えば、Mo7e(ヒト巨核芽球性白血病細胞株)、CTLL2(マウス細胞傷害性Tリンパ球細胞株)、初代ヒトCD8+T細胞、またはCD8+T細胞PHA誘導芽球などのサイトカイン依存性細胞株を使用した増殖アッセイでサイトカイン活性について試験する。馴化培地は、サイトカイン依存性細胞株において増殖応答を誘導する。
共培養。ヒトまたはマウスのがん細胞株などのがん細胞を、ペプチド-IL-15剤複合体に曝露する。がん細胞をペプチド-IL-15剤複合体に結合し、これを内在化させ、それに対する応答を生じるのに充分な時間、例えば、30分、1時間、2時間、4時間、8時間、一晩、24時間、または48時間にわたってインキュベートする。指定の時間後、ペプチド-IL-15剤複合体を含む培地を除去し、細胞を洗浄して残存する試験物質を除去する。半透膜を含む組織培養インサートを、付着したがん細胞が入ったウェルに加える。サイトカイン依存性細胞株、例えばMo7e(ヒト巨核芽球性白血病細胞株)またはCTLL2(マウス細胞傷害性Tリンパ球細胞株)を、膜の反対側に配置する。半透膜は、細胞同士を直接接触させることなく、培地及び細胞が分泌した産物の受動拡散を可能にする。サイトカインの唯一の供給源はがん細胞からの分泌であり、例えば、プロセシング及び/または分泌されたペプチドI/O複合体である。共培養を、サイトカイン依存性細胞が応答を生じるに充分な時間、例えば、2時間、4時間、8時間、一晩、24時間、48時間、または72時間にわたって組織培養インキュベーターに戻す。この後、サイトカイン依存性細胞をPrestoBlueなどの生細胞アッセイを用いて増殖についてアッセイする。サイトカイン依存性細胞は増殖を示す。
配列番号1、配列番号2、配列番号568、配列番号569または配列番号570の任意のペプチド、または上記のいずれかと80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれ以上同一である任意のペプチドを含む本開示のいずれのペプチドも、同様の腫瘍細胞の活性化を示すペプチド-IL-15剤複合体を構成することができる。
実施例101
Rig-I-またはMDA5-リガンドペプチドI/O複合体によるアブスコパル抗腫瘍免疫の誘導
T細胞媒介性抗腫瘍免疫の誘導は、全身作用が可能なT細胞の出現を生じる。かかるT細胞は、原発腫瘍の殺滅、さらにそれに加えて、遠隔部位における原発腫瘍のその後の転移の根絶において機能することが予想される。かかるT細胞は、原発腫瘍の消失後に再発腫瘍を根絶する機能を有するメモリーT細胞を生じさせることも予想される。
アブスコパル効果を示した最初のモデルは腫瘍ワクチン接種の使用であり、腫瘍細胞をインビトロで薬物で処理した後、マウスに接種するというものである(Fend 2017)。その後、マウスを生きた腫瘍でチャレンジする。マウスが抗腫瘍T細胞の誘導物質で前処理されていた場合、これらのマウスは腫瘍の進行に抵抗性を示す。このモデルでは、MCA205、CT26、4T1または他の腫瘍細胞などの腫瘍細胞をRig-IリガンドペプチドI/O複合体でインビトロ処理して、これらの細胞をできる限りアポトーシスに誘導する。次に、処理細胞を、マウスの側腹部の皮下に接種する。次いで、マウスを未処理の同じ腫瘍で最初の接種後の任意の時間、例えば4日後に、対側の側腹部にチャレンジする。その後、腫瘍の進行を同側と対側の両方の部位で監視する。腫瘍は同側の部位では成長せず、対側の部位では腫瘍の進行が顕著に遅れる。
抗腫瘍T細胞の役割を実証する別のモデルは、抗腫瘍治療を生き延びたマウスに腫瘍再チャレンジを用いることである(Jacobsen 2018)。腫瘍に対するメモリーT細胞応答を有する生存マウスは、腫瘍による2回目のチャレンジで生き残る。このようなT細胞の記憶は、特定の化学療法による腫瘍治療、放射線療法、またはRig-Iのリガンドなどの特定の生物学的製剤による治療の後に生じ得る。腫瘍を有するマウスを、Rig-IリガンドペプチドI/O複合体で処置する。腫瘍は退行し、マウスは生存する。次に、マウスを同じ腫瘍タイプからの細胞で再度チャレンジする。マウスは2番目のチャレンジを生き残る。
別のモデルは、薬物の腫瘍内投与によるマウスの腫瘍の処置後、同じ動物の対側の非処置の腫瘍の退行の評価を行うものである(Sagiv-Barfi 2015)。同じ種類の2つの腫瘍をマウスの右側腹部と左側腹部に1つずつのようにしてマウスに誘導する。右側腹部の腫瘍などの一方の腫瘍に、Rig-IリガンドペプチドI/O複合体を腫瘍内注射する。左側腹部の腫瘍などの他の腫瘍は退行する。
配列番号1、配列番号2、配列番号568、配列番号569または配列番号570の任意のペプチド、または上記のいずれかと80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれ以上同一である任意のペプチドを含む本開示のいずれのペプチドも、同様の腫瘍細胞の活性化を有するペプチド-RIG-Iリガンド複合体を構成することができる。
本開示の特定の実施形態を本明細書に例示または図示または記載したが、かかる実施形態はあくまで実例として与えられるものであることは当業者には明白であろう。本開示は、明細書内で提供される特定の例によって限定されることを意図しない。本開示を上記の明細書を参照して説明したが、本明細書の実施形態の説明及び図解は、限定的な意味で解釈されることを意味するものではない。この時点で、当業者には、本開示から逸脱することなく数多くの変形、変更及び置換が想到されるであろう。さらに、本開示のすべての実施形態は、さまざまな条件及び変数に依存する、本明細書に記載された特定の描写、構成または相対的比率に限定されない点を理解されたい。本明細書に記載される開示の実施形態のさまざまな代替物を本開示の実施において採用することが可能である点を理解されたい。したがって、本開示は、かかる代替物、改変物、変形物または均等物も包含することが企図されている。以下の特許請求の範囲が本開示の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲内の方法及び構造ならびにそれらの均等物が本開示によって包含されることが意図されている。

Claims (19)

  1. ペプチド免疫抗がん剤複合体を含む組成物であって、前記ペプチド免疫抗がん剤複合体が、免疫抗がん剤と複合体化したペプチドを含み、
    前記ペプチド免疫抗がん剤複合体の前記ペプチドは、配列番号568、配列番号569、配列番号570、配列番号571、配列番号572、または配列番号1~配列番号5のうちのいずれか1つと少なくとも90%の配列同一性を有する配列と、
    なくとも4個のシステイン残基及び前記システイン残基間に形成された複数のジスルフィド架橋
    を含み、
    前記ペプチドは、腫瘍ホーミング性であり、
    前記ペプチド免疫抗がん剤複合体の前記免疫抗がん剤は、
    配列番号1176の配列、配列番号1177の配列または両方を含むIL-15剤、または
    配列番号1371の配列を含むRIG-Iリガンド
    を含む、前記組成物。
  2. 前記ペプチドが、
    a)配列番号568、
    b)配列番号569、
    c)配列番号570、または
    d)配列番号571、配列番号572、もしくは配列番号1~配列番号5
    配列を含む、請求項に記載の組成物。
  3. 前記IL-15剤が、配列番号1135、配列番号1137、配列番号1177、配列番号1176、配列番号1432または配列番号1433を含む、請求項1または2に記載の組成物。
  4. 前記IL-15剤が、IL-15ドメインとIL-15Rα sushi+ドメインとの融合体を含む、請求項1~のいずれか1項に記載の組成物。
  5. 前記ペプチド免疫抗がん剤複合体が、
    a)配列番号1330、
    b)配列番号1340、または
    c)配列番号1317、もしくは配列番号1328
    含む、請求項1~のいずれか1項に記載の組成物。
  6. 前記RIG-Iリガンドが、二本鎖RNA(dsRNA)、1つ以上のホスホロチオエート結合、5’三リン酸、またはそれらの組み合わせを含む、請求項1~のいずれか1項に記載の組成物。
  7. 前記RIG-Iリガンドが、配列番号1371含む、請求項1~のいずれか1項に記載の組成物。
  8. 前記ペプチドが、細胞透過性、血液脳関門透過性またはそれらの組み合わせである、請求項1~のいずれか1項に記載の組成物。
  9. 前記細胞透過特性が、エンドソーム内への取り込み、細胞内区画内への取り込み、細胞内区画内の取り込み及びプロセシングならびに分泌、細胞質への取り込み及び送達、取り込み及びトランスサイトーシス、取り込み及び核局在化、取り込み及び細胞外提示、ピノサイトーシス、腫瘍微小環境への取り込み、切断、及び分泌、または細胞表面タンパク質への取り込み及び提示を含む、請求項に記載の組成物。
  10. 前記ペプチドと前記免疫抗がん剤とが化学的に結合されるか、または組換え融合により結合される、請求項1~のいずれか1項に記載の組成物。
  11. 前記ペプチドと前記免疫抗がん剤とが、切断可能なリンカーによって連結される、請求項1または2に記載の組成物。
  12. 前記切断可能なリンカーが、腫瘍微小環境に送達されたとき、前記腫瘍微小環境内の細胞の表面で、腫瘍細胞の前記表面で、細胞の細胞質内で、または細胞内区画でのみ、またはそこで選択的に切断される、請求項1に記載の組成物。
  13. 対象に投与されると、前記ペプチドは、前記対象のがんにホーミング、ターゲティング、移動、蓄積、結合し、前記対象のがんによって保持され、前記対象のがんによってプロセシングされ、または前記対象のがんに誘導される、請求項1~1のいずれか1項に記載の組成物。
  14. 前記対象に投与されると、前記ペプチド免疫抗がん剤複合体の前記免疫抗がん剤は、前記がんに対する宿主免疫応答を刺激する、請求項1に記載の組成物。
  15. 前記がんが、固形腫瘍、転移性がん病変、中枢神経系がん、神経膠腫、膠芽腫、脳癌、脳腫瘍、乳癌、卵巣癌、黒色腫、肉腫、基底細胞癌、扁平上皮癌、皮膚癌、肺癌、結腸癌、結腸直腸癌、膵臓癌、前立腺癌、膀胱癌、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項1または請求項1に記載の組成物。
  16. 治療を必要とする対象のがんを治療する方法における使用のための請求項1~1のいずれか1項に記載の組成物であって、前記方法が、
    前記組成物を前記対象に投与すること、及び
    前記免疫抗がん剤を前記がんに送達し、それにより前記がんを治療すること
    を含む、組成物。
  17. 前記免疫抗がん剤を前記がんに送達することが、前記ペプチド免疫抗がん剤複合体の前記ペプチドを前記がんにホーミングさせることをさらに含む、請求項16に記載の組成物。
  18. 前記がんが、固形腫瘍、転移性がん病変、中枢神経系がん、神経膠腫、膠芽腫、脳癌、脳腫瘍、乳癌、卵巣癌、黒色腫、肉腫、基底細胞癌、扁平上皮癌、皮膚癌、肺癌、結腸癌、結腸直腸癌、膵臓癌、前立腺癌、膀胱癌、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項16または請求項17に記載の組成物。
  19. 前記方法が、宿主免疫応答を刺激することをさらに含む、請求項1618のいずれか1項に記載の組成物。
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