KR101972173B1 - 클로로톡신 변이체, 접합체, 및 이의 사용 방법 - Google Patents

클로로톡신 변이체, 접합체, 및 이의 사용 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 클로로톡신 변이체, 클로로톡신 변이체 접합체, 클로로톡신 변이체 또는 접합체를 포함하는 조성물, 및 클로로톡신 변이체, 접합체, 및 조성물의 이용 방법에 관한 것이다.

Description

클로로톡신 변이체, 접합체, 및 이의 사용 방법{CHLOROTOXIN VARIANTS, CONJUGATES, AND METHODS FOR THEIR USE}
관련 출원에 대한 교차-참조
본원은 본원에 그 개시가 참조로서 포함되어 있는 미국 출원 제 61/333,556 호 (2010 년 5 월 11 일 출원) 를 우선권 주장한다.
기술 분야
본 발명은 일반적으로 클로로톡신, 보다 특히 클로로톡신 변이체, 클로로톡신 변이체 접합체, 클로로톡신 변이체 또는 접합체를 포함하는 조성물, 및 클로로톡신 변이체, 접합체, 및 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다.
신경외과 의사는 뇌암 세포를 조명하여 암의 자리를 확인하고 종양 절제술 동안 정상 조직과 암을 즉시 구분하기 위한 방법을 계속 찾고 있다. 클로로톡신 (CTX), 레우루스 퀸퀘스트리아투스 (Leiurus quinquestriatus) 전갈로부터 발견된 펩티드, 및 근적외선 형광 (NIRF) 분자, 예컨대 Cy5.5, ("종양 페인트") 로 이루어진 생접합체는 고감도로 종양 자리를 명백히 확인한다 (M. Veiseh, et al., "Tumor Paint: A Chlorotoxin:Cy5.5 Bioconjugate for Intra-Operative Visualization of Cancer Foci," Cancer Research 67(14):6882-88, 2007). CTX 는 본래부터 이러한 연구에서 선택되었는데 왜냐하면 이는 정상 뇌 조직에 비해 신경교종 세포에 우선적으로 결합하기 때문이다 (L. Soroceanu, et al., "Use of Chlorotoxin for Targeting of Primary Brain Tumors," Cancer Research 58:4871-4879, 1998). CTX 표적이 다중의 기타 암 유형에 의해 공유되는 것으로 보이기 때문에, CTX:Cy5.5 는 전립선, 결장, 육종, 수아 종 및 고체 종양의 기타 유형을 효과적으로 조명한다 (M. Veiseh 2007).
CTX 는 폴리펩티드에 대한 3차원 구조를 높은 정도로 부여하는 4 개의 디술피드 브릿지를 갖는 36 개의 아미노산 펩티드이다. CTX 는 NHS-에스터 변형된 Cy5.5 및 기타 형광 분자에 대한 접합을 위해 이용되는 위치 15, 23, 및 27 에서 3 개의 라이신 잔기를 갖는다. 전형적으로, 생성되는 생접합체는 27 위치에서 75-85% 모노-라벨링된 펩티드 및 Lys 15 및 Lys 23 에 접합된 더 적은 양의 디- 및 트리-라벨링된 펩티트의 혼합물이다. 식품의약국 (Food and Drug Administration; FDA) 및 유사 규제국에 의해 승인된 혼합물을 사용하는 것이 가능하나, 시판화하는 것은 이의 비용 및 앞으로의 모노-, 디- 및 트리-라벨링된 배치의 비를 매칭하는데 어려움이 있기 때문에 잠재적으로 방해받고 있다.
단일, 균질 신규 분자 전체를 제공하기 위해 진단제 또는 치료제와 접합되기 위한 단일 라이신 잔기를 갖고 클로로톡신의 이점을 갖는 폴리펩티드가 요구되고 있다. 본 발명은 이러한 필요성을 충족시키고 관련 이점을 추가로 제공하고자 한다.
발명의 개요
본 발명은 클로로톡신 변이체, 클로로톡신 변이체로부터 제조된 접합체, 클로로톡신 변이체 또는 접합체를 포함하는 조성물, 및 클로로톡신 변이체, 접합체, 및 조성물을 사용하는 방법을 제공한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 단일 라이신 잔기 (Lys 27) 를 갖는 변형 클로로톡신 펩티드를 제공한다. 하나의 구현예에서, 변형 클로로톡신 펩티드는 천연 클로로톡신의 Lys 15 및 Lys 23 이 라이신 이외의 아미노산으로 치환된 것이다. 하나의 구현예에서, 변형 클로로톡신 펩티드는 SEQ ID NO: 2 에 제시되는 아미노산 서열을 갖는다. 하나의 구현예에서, 변형 클로로톡신 펩티드는 SEQ ID NO: 3 에서 제시된 아미노산 서열을 갖는다. 하나의 구현예에서, 변형 클로로톡신 펩티드는 SEQ ID NO: 4 에서 제시된 아미노산 서열을 갖는다. 하나의 구현예에서, 변형 클로로톡신 펩티드는 SEQ ID NO: 5 에서 제시된 아미노산 서열을 갖는다. 하나의 구현예에서, 변형 클로로톡신 펩티드는 SEQ ID NO: 6 에서 제시된 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 변형 클로로톡신 펩티드를 포함하는 조성물이 또한 제공된다. 하나의 구현예에서, 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.
또다른 양태에서 본 발명은, 본 발명의 변형 클로로톡신 펩티드의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 클로로톡신을 투여함으로써 치료가능한 질환 또는 병태의 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 추가의 양태에서, 본 발명의 변형 클로로톡신 펩티드를 포함하는 클로로톡신 접합체가 제공된다. 하나의 구현예에서, 클로로톡신 접합체는 하나 이상의 치료제, 진단제, 이미지화제 또는 표적화제, 또는 변형 클로로톡신 펩티드의 순환 반감기를 증가시키는 부분에 공유적으로 커플링된 변형 클로로톡신 펩티드를 포함한다. 하나의 구현예에서, 치료제, 진단제, 이미지화제 또는 표적화제, 또는 변형 클로로톡신 펩티드의 순환 반감기를 증가시키는 부분은 라이신 잔기를 통해 변형 클로로톡신 펩티드로 공유적으로 커플링된다. 적합한 진단제 또는 이미지화제는 형광 라벨 (예를 들어, 양자점 또는 중합점), 방사성라벨, 및 자기 공명 이미지화 라벨 (예를 들어, 붕소 나노입자, 붕소 및 탄소 나노입자, 탄화 붕소 나노입자, 붕소-함유 중합체, 붕소 및 탄소 함유 중합체, 탄화 붕소 중합체, 및 가돌리늄을 추가로 포함하는 이들 나노입자 또는 중합체) 을 포함한다. 적합한 표적화제는 항체, 폴리펩티드, 폴리사카라이드, 및 핵산을 포함한다. 적합한 치료제는 화학치료제 (예를 들어, 메토트렉세이트, 도세탁셀, 시스플라틴 및 에토포시드) 및 생물학적 치료제 (예를 들어, cDNA, siRNA, shRNA, 및 RNAi) 를 포함한다. 변형 클로로톡신 펩티드의 순환 반감기를 증가시키는 적합한 부분은 페그 부분, 글리코실 부분, 및 글리코실페그 부분을 포함한다.
다른 양태에서, 클로로톡신 접합체를 사용하는 방법이 제공된다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 클로로톡신에 의해 이미지화 가능한 조직을 본 발명의 클로로톡신 접합체와 접촉시켜, 클로로톡신에 의해 이미지화 가능한 조직을 이미지화하는 것을 포함하는, 클로로톡신에 의해 이미지화 가능한 조직을 이미지화하는 방법을 제공한다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 변형 클로로톡신에 의해 이미지화 가능한 조직을 본 발명의 변형 클로로톡신 접합체와 접촉시켜 클로로톡신에 의해 검출가능한 암을 검출하는 것을 포함하는, 클로로톡신에 의해 검출가능한 암을 검출하는 방법을 제공한다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 조직을 본 발명의 변형 클로로톡신 접합체와 접촉시켜 암 조직을 검출하고, 변형 클로로톡신 접합체에 의해 검출되는 암 조직을 제거하는 것을 포함하는, 클로로톡신에 의해 검출가능한 암을 검출하고 제거하는 방법을 제공한다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 변형 클로로톡신에 결합하는 조직을 본 발명의 변형 클로로톡신 접합체와 접촉시켜 암을 치료하는 것을 포함하는, 변형 클로로톡신 접합체에 의해 표적화되는 암을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 양태 및 이점은 수반되는 도면과 함께 하기 상세한 설명을 참조로 하여 보다 용이하게 이해될 것이다.
도 1 은 천연 클로로톡신의 서열 (선형 CTX) 과 본 발명의 예시적인 변형 클로로톡신 펩티드 (K15A_K23A CTX; K15R_K23R CTX) 를 비교한 것이다. 4 개의 디술피드 결합을 갖는 치환된 CTX 및 천연 서열을 황색 선으로 나타낸다.
도 2 는 본 발명의 예시적인 변형 클로로톡신 펩티드 및 천연 클로로톡신의 2차 αH 화학적 시프트를 비교한 것이다. 2차 αH 시프트는 실험적 αH 시프트 로부터 무작위 코일 시프트를 차감함으로써 계산된다 (D.S. Wishart, et al.,"1H, 13C and 15N Chemical Shift Referencing in Biomolecular NMR," Journal of Biomolecular NMR 6, 135-140, 1995). 천연 CTX (진청색), 선형 CTX (청색), K15A_K23A CTX (적색), 및 K15R_K23R CTX (오렌지색) 에 대한 바 그래프를 나타낸다. 2 개의 β-가닥은 청색 화살표로 나타내고, α-나선은 적색으로 나타낸다. 치환된 잔기 및 잔기 D18 은 녹색 별표로 나타낸다.
도 3A 및 3B 는 본 발명의 예시적인 변형 CTX:Cy5.5 생접합체의 기능적 이미지를 나타낸다 (도 3A, K15A_K23A CTX:Cy5.5; 및 도 3B, K15R_K23R CTX:Cy5.5). 꼬리 정맥을 통해 40 μM 의 변형 생접합체 50 ㎕ 를 WT 또는 ND2:SmoA1 종양-포함 마우스에 주입하였다. 주입 3 일 후 Xenogen 스펙트럼을 이용하여 바이오포토닉 이미지를 수득하였다. 이후, 뇌를 OCT 에서 냉동시키고, 12 ㎛ 구획으로 절단하고, H&E 로 염색하여 종양 부위를 결정하였다.
본 발명은, 클로로톡신 변이체, 클로로톡신 변이체, 클로로톡신 변이체로부터 제조되는 접합체, 클로로톡신 변이체 또는 접합체를 포함하는 조성물, 및 클로로톡신 변이체, 접합체, 및 조성물을 사용하는 방법을 제공한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 클로로톡신 변이체를 제공한다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "클로로톡신 변이체" 는 용어 "변형 클로로톡신 펩티드" 와 호환가능하게 사용되고 천연 클로로톡신의 어느 정도 이상의 유용한 활성을 갖는 비-천연 폴리펩티드를 지칭한다. 클로로톡신은 SEQ ID NO: 1 에서 제시된 아미노산 서열을 갖고 36 개의 아미노산을 포함하는 자연 발생 폴리펩티드이다.
용어 "변형 클로로톡신 펩티드" 는 천연 클로로톡신의 하나 이상의 아미노산 잔기가 그 위치에서 천연 클로로톡신의 아미노산 잔기 이외의 아미노산 잔기로 치환된 (즉, 대체된) 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. 예를 들어, 천연 클로로톡신의 잔기 15 및 23 는 라이신 잔기이고; 본 발명의 특정 구현예에서, 변형 클로로톡신 펩티드는 위치 15 및 23 에서 알라닌 또는 아르기닌 잔기를 갖고 제공된다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 단일 라이신 잔기 (Lys 27) 를 갖는 변형 클로로톡신 펩티드를 제공한다. 이러한 구현예에서, 변형 클로로톡신 펩티드는, 천연 클로로톡신의 Lys 15 및 Lys 23 이 라이신 이외의 아미노산에 의해 치환되어, 단일 라이신 잔기 (Lys 27) 를 갖는 변형 클로로톡신이 제공된다. 이러한 구현예에서, 변형 클로로톡신 펩티드는 SEQ ID NO: 2 에서 제시된 아미노산 서열을 갖는데, Lys 15 및 Lys 23 은 자연 발생 및 비-천연 아미노산, 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 아미노산에 의해 치환된다.
자연 발생 아미노산은 자연 발생 단백질 (Ala 또는 A, Cys 또는 C, Asp 또는 D, Glu 또는 E, Phe 또는 F, Gly 또는 G, His 또는 H, Ile 또는 I, Lys 또는 K, Leu 또는 L, Met 또는 M, Asn 또는 N, Pro 또는 P, Gln 또는 Q, Arg 또는 R, Ser 또는 S, Thr 또는 T, Val 또는 V, Trp 또는 W, Tyr 또는 Y) 에서 통상적으로 발견되는 20 개의 L-아미노산이다. 비-천연 아미노산은 D-아미노산을 포함한다. 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체는 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능한다. 아미노산 유사체는 자연 발생 아미노산으로서 동일한 기본 화학 구조를 갖는 화합물을 지칭하며, 예로는, 수소, 카르복실 기, 아미노 기, 및 R 기에 결합하는 α-탄소가 있다. 그러한 유사체는 변형된 R 기를 가질 수 있거나 (예를 들어 노르루신), 또는 변형된 펩티드 골격을 가질 수 있는 반면, 여전히 자연 발생 아미노산으로서 동일한 기본 화학 구조를 보유한다. 아미노산 유사체의 비제한적 예로는 호모세린, 노르루신, 메티오닌 술폭시드, 메티오닌 메틸 술포늄이 포함된다.
하나의 구현예에서, Lys 15 및/또는 Lys 23 는 염기성 아미노산 (즉, His, Arg), 비-천연 아미노산, 아미노산 유사체, 또는 아미노산 모방체로 독립적으로 대체된다.
하나의 구현예에서, Lys 15 및/또는 Lys 23 은 비극성 (소수성) 아미노산 (즉, Ala, Phe, Ile, Leu, Met, Pro, Val, Trp), 관련 비-천연 아미노산, 아미노산 유사체, 또는 아미노산 모방체로 독립적으로 대체된다.
하나의 구현예에서, Lys 15 및/또는 Lys 23 은 극성 (하전되지 않은) 아미노산 (즉, Cys, Gly, Asn, Gln, Ser, Thr, Tyr), 비-천연 아미노산, 아미노산 유사체, 또는 아미노산 모방체로 독립적으로 대체된다.
하나의 구현예에서, Lys 15 및/또는 Lys 23 은 산성 아미노산 (즉, Glu, Asp), 비-천연 아미노산, 아미노산 유사체, 또는 아미노산 모방체로 독립적으로 대체된다.
하나의 구현예에서, 변형 클로로톡신 펩티드는 Lys 15 및 Lys 23 이 알라닌에 의해 치환된다 (K15A_K23A CTX). 이러한 구현예에서, 변형 클로로톡신 펩티드는 SEQ ID NO: 3 에서 제시된 아미노산 서열을 갖는다.
하나의 구현예에서, 변형 클로로톡신 펩티드는 Lys 15 및 Lys 23 이 아르기닌에 의해 치환된다 (K15R_K23R CTX). 이러한 구현예에서, 변형 클로로톡신 펩티드는 SEQ ID NO: 4 에서 제시된 아미노산 서열을 갖는다.
하나의 구현예에서, 변형 클로로톡신 펩티드는 Lys 15 이 알라닌에 의해 치환되고 Lys 23 이 아르기닌에 의해 치환된다 (K15A_K23R CTX). 이러한 구현예에서, 변형 클로로톡신 펩티드는 SEQ ID NO: 5 에서 제시된 아미노산 서열을 갖는다.
또다른 구현예에서, 변형 클로로톡신 펩티드는 Lys 15 이 아르기닌에 의해 치환되고 Lys 23 이 알라닌에 의해 치환된다 (K15R_K23A CTX). 이러한 구현예에서, 변형 클로로톡신 펩티드는 SEQ ID NO: 6 에서 제시된 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 또다른 양태에서, 변형 클로로톡신 펩티드를 포함하는 조성물이 제공된다. 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체 또는 변형 클로로톡신 펩티드의 전달을 위한 희석제를 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제는 염분 또는 주입을 위한 덱스트로오스를 포함한다.
치료 방법.
추가의 양태에서, 본 발명은 클로로톡신을 투여함으로써 치료가능한 질환 또는 병태를 치료하는 방법을 제공한다. 하나의 구현예에서, 상기 방법은 본 발명의 변형 클로로톡신 펩티드의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "유효량" 은 치료될 질환 또는 병태의 하나 이상의 징후를 어느 정도 경감시킬 것인, 투여제 또는 투여 화합물의 충분한 양을 지칭한다. 결과는 징조, 징후, 또는 질병의 원인의 감소 및/또는 완화일 수 있거나, 또는 생물학적 시스템의 임의의 다른 원하는 변경일 수 있다. 그러한 작용제 또는 화합물을 함유하는 조성물은 예방, 증강 및/또는 치료학적 치료를 위해 투여될 수 있다. 임의의 개별적인 경우에서 적절한 "유효량" 은 예컨대 용량 강화 연구와 같은 기술을 사용하여 측정될 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 클로로톡신 변이체의 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 클로로톡신 결합 부위를 발현하는 암을 치료하는 방법을 제공한다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 클로로톡신 변이체를 포함하는 약학 조성물의 유효량 및 약학적으로 허용가능한 담체를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 클로로톡신 결합 부위를 발현하는 암을 치료하는 방법을 제공한다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 클로로톡신 변이체의 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 클로로톡신 결합 부위를 발현하는 종양을 치료하는 방법을 제공한다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 클로로톡신 변이체의 유효량을 클로로톡신 결합 부위를 발현하는 세포에 투여하는 것을 포함하는, 클로로톡신 결합 부위를 발현하는 세포의 침습성 활성을 저해하는 방법을 제공한다.
본 발명의 치료 방법은 그러한 치료가 필요한 인간 및 동물 대상체에 적용가능하다.
사실상, 클로로톡신 결합 부위를 발현하는 악성 암의 모든 유형이 본 발명의 클로로톡신 변이체 및 접합체에 의해 치료될 수 있다. 이들 악성 암은 신경교종, 성상세포종 수아종, 맥락막망 암종, 뇌질피복 세포증, 수막종, 교모세포종, 신경절종, 갈색세포종, 및 전이성 뇌 종양, 기타 뇌 종양, 신경아종, 두경부암, 소세포폐암, 유방암, 장암, 췌장암, 결장암, 간암, 신장암, 피부암, 육종 (30 유형), 골육종, 횡문근육종, 유잉 (Ewing) 육종, 암종, 흑색종, 난소암, 자궁경부암, 림프종, 갑상선암, 항문암, 결장-직장암, 자궁내막암, 생식세포 종양, 후두암, 다발성 골수종, 전립선암, 망막아세포종, 위암, 고환암, 및 빌름 (Wilm) 종양을 포함한다.
클로로톡신 접합체.
또다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 변형 클로로톡신 펩티드의 접합체를 제공한다. 하나의 구현예에서, 접합체는 변형 클로로톡신 펩티드의 순환 반감기를 증가시키는 부분에 공유적으로 커플링된 본 발명의 변형 클로로톡신 펩티드를 포함한다. 또다른 구현예에서, 접합체는 치료제, 진단제, 이미지화제 또는 표적화제에 공유적으로 커플링된 본 발명의 변형 클로로톡신 펩티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 치료제, 진단제, 이미지화제 또는 표적화제, 또는 변형 클로로톡신 펩티드의 순환 반감기를 증가시키는 부분은 펩티드의 라이신 잔기를 통해 공유적으로 커플링된다.
변형 클로로톡신 펩티드의 순환 반감기를 증가시키는데 적합한 부분은 폴리펩티드의 순환 반감기를 증가시키기 위한 당업계에 공지되어 있는 것을 포함한다 (예를 들어, 페길화, 글리코실화, 글리코페길화). 페길화를 위한 예시적 부분은 폴리알킬렌 옥시드 (폴리에틸렌 옥시드, 폴리프로필렌 옥시드, 및 폴리에틸렌 옥시드 및 폴리프로필렌 옥시드의 공중합체) 를 포함한다. 글리코실화를 위한 예시적 부분은 올리고사카라이드 (예를 들어, 폴리시알산을 포함하는 카르보히드레이트) 를 포함한다. 하나의 구현예에서, 접합체는 페길화된 클로로톡신이고 및 하나 이상의 폴리알킬렌 옥시드 (예를 들어, 폴리에틸렌 옥시드) 에 공유적으로 커플링되는 변형 클로로톡신 펩티드를 포함한다. 하나의 구현예에서, 접합체는 글리코실화된 클로로톡신이고 하나 이상의 올리고사카라이드에 공유적으로 커플링되는 변형 클로로톡신 펩티드를 포함한다. 하나의 구현예에서, 접합체는 글리코페길화된 클로로톡신이고 하나 이상의 글리코폴리알킬렌 옥시드 (예를 들어, 글리코폴리에틸렌 옥시드) 에 공유적으로 커플링되는 변형 클로로톡신 펩티드를 포함한다.
적합한 치료제는 세포독성 약제를 포함한다. 치료제의 예로는, 다른 것 중에서도 메토트렉세이트, 도세탁셀, 시스플라틴 및 에토포시드와 같은 화학치료제; 전사 및 번역 저해제, 및 신호 전달 조절제를 포함하는 핵산 분자 (예를 들어, DNA, 예컨대 cDNA, 및 RNA, 예컨대 siRNA, shRNA, RNAi) 와 같은 생물학적 치료제가 포함된다.
적합한 진단제는 형광 방법 및 형광 이미지화 이외의 방법에 의해 검출되기 위해 제공되는 작용제를 포함한다. 다른 적합한 진단제는 다른 것 중에서도 방사성라벨 (예를 들어, 방사성 동위원소 라벨링된 화합물) 예컨대 125I, 14C, 및 31P; 및 자기 공명 영상 제제를 포함한다.
적합한 표적화제는 항체, 폴리펩티드, 폴리사카라이드, 및 핵산을 포함한다.
본 발명의 또다른 양태에서, 변형 클로로톡신 펩티드 접합체를 포함하는 조성물이 제공된다. 조성물은 변형 클로로톡신 펩티드 접합체의 전달을 위한 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제는 주입을 위한 염분 또는 덱스트로오스를 포함한다.
이미지화 방법.
본 발명의 추가의 양태에서, 변형 클로로톡신 펩티드 접합체를 사용하는 방법이 제공된다. 하나의 구현예에서, 본 발명은 클로로톡신에 의해 이미지화 가능한 조직을 이미지화하는 방법을 제공한다. 방법에서, 클로로톡신에 의해 이미지화 가능한 조직은 클로로톡신 접합체와 접촉된다.
하나의 구현예에서, 이미지화 방법은 형광 이미지화 방법이다. 형광 클로로톡신 접합체를 제조하는 방법 및 사용하는 방법의 예는 본원에 그 전체가 참조로서 포함되어 있는 미국 특허 출원 공보 제 20080279780 A1 호 (Fluorescent Chlorotoxin Conjugate and Method for Intra-Operative Visualization of Cancer) 에 기술되어 있다.
본 발명은 암 조직이 수술 중에 가시화되게 하는 형광 이미지화에 의해 검출가능한 클로로톡신 접합체, 클로로톡신 접합체를 포함하는 조성물, 및 클로로톡신 접합체를 사용하는 방법을 제공한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 암 조직이 수술 중에 가시화되게 하는 형광 이미지화에 의해 검출가능한 클로로톡신 접합체를 제공한다.
클로로톡신은 관심 조직에 대한 접합체를 표적으로하는 표적화제이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 클로로톡신 접합체는 클로로톡신에 공유적으로 커플링되는 하나 이상의 형광 부분 (예를 들어, 적외선 또는 근적외선 방출 형광 부분) 을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "적외선 또는 근적외선 방출 형광 부분" 은 약 600 nm 초과의 형광 방사 최대를 갖는 형광 부분을 지칭한다. 형광 부분을 방출하는 더 짧은 파장 (예를 들어, 약 500 내지 약 600 nm) 을 갖는 형광 클로로톡신 접합체는 조직화학 이미지화에 유용하다. 이들 접합체는 인간 및 동물에서 생체내 이미지화에 보다 덜 유용하며, 형광 부분을 방출하는 보다 더 긴 파장 (예를 들어, 약 600 nm 초과) 이 바람직하다.
클로로톡신 접합체의 특정 구현예에서, 형광 부분은 약 600 nm 초과의 방사 파장 최대를 특징으로 하는 형광 화합물로부터 유래하여 자발형광을 피하고, 방사는 조직/혈액/체액의 수 mm 내지 1 cm 로 이동하고, 방사는 다른 혈액 성분, 헤모글로빈에 의해 흡수되지 않거나, 인간 또는 동물 조직에서 단백질에 의해 흡수되지 않는다.
형광 부분은 형광 이미지화에 의해 접합체의 가시화를 허용하는 클로로톡신에 공유적으로 커플링된다. 형광 부분은 형광 이미지화에 의한 접합체의 가시화를 허용한다. 형광 부분은 형광 화합물로부터 유래한다. 적합한 형광 화합물은, 클로로톡신 접합체의 표적화 및 결합 작용에 상당히 반대로 영향 미치지 않으면서 클로로톡신에 대해 공유적으로 커플링될 수 있는 것이다. 유사하게, 적합한 형광 화합물은 클로로톡신에 접합 후 이들의 형광 특성을 보유한다.
하나의 구현예에서, 형광 부분은 시아닌 부분이다. 시아닌 화합물은 상대적으로 높은 소멸 계수 및 유리한 형광 양자 수율을 특징으로 한다. 시아닌 화합물에 대한 형광 방사 최대 파장은 시아닌 구조의 작용으로 다양하다. 특정 시아닌 화합물에 따라, 형광 방사 최대 파장은 녹색 (약 490 nm) 내지 근적외선 (약 740 nm) 으로 다양할 수 있다. 본 발의 방법의 실시에서, 원적외선 (약 650 nm) 내지 근적외선 (약 750 nm) 의 형광 방사 최대를 갖는 시아닌 화합물이 바람직하다. 이들 방사 파장에서, 지역 환경으로부터 배경 형광은 최소이고 관심 조직이 상대적으로 투명하다. 이들 파장에서 관심 조직의 상대적으로 투명도로 인해, 여기 및 형광 방사 가시화는 최대화되고 본 발명의 접합체에 의해 표적화되는 조직의 상대적으로 많은 양이 더 짧은 파장에서 방사를 갖는 형광 화합물을 이용하는 다른 접합체와 비교되어 관찰될 수 있다 (600 nm 미만).
적합한 시아닌은 하기로 지정되는 GE Healthcare 로부터 상업적으로 입수되는 CYDYE 형광을 포함한다: Cy2 (506 nm); Cy2 (506 nm); Cy3 (570 nm); Cy3B (572 nm); Cy3.5 (596 nm); Cy5 (670 nm); Cy5.5 (675 nm); 및 Cy7 (694 nm) (괄호 안에 방사 최대를 나타냄). 하나의 구현예에서, 시아닌 화합물은 Cy5.5 이다.
하나의 구현예에서, 형광 부분은 술폰화된 잔텐 부분이다. 본 발명의 실시에 사용되는데 적합한 술폰화된 잔텐 화합물은 본원에 그 전체가 참조로서 포함되어 있는 미국 특허 제 6,130,101 호에서 기술되어 있고, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR 로부터 ALEXA FLUOR 명칭으로 상업적으로 입수가능하다. ALEXA FLUOR 는 상대적으로 높은 소멸 계수 및 유리한 형광 양자 수율을 특징으로 하는 형광물질의 패밀리이다. 술폰화된 잔텐 화합물에 대한 형광 방사 최대 파장은 화합물 구조의 관능기에 따라 다양하다. 특정 술폰화된 잔텐 화합물에 따라, 형광 방사 최대 파장은 녹색 (약 450 nm) 내지 근적외선 (약 780 nm) 으로 다양할 수 있다. 본 발명의 방법의 실시에서, 원적외선 (약 650 nm) 내지 근적외선 (약 750 nm) 에서 형광 방사 최대를 갖는 ALEXA FLUOR 화합물이 바람직하다.
적합한 술폰화된 잔텐 화합물은 하기를 포함한다: ALEXA FLUORS, 예컨대 ALEXA FLUOR 350 (442 nm), ALEXA FLUOR 405 (421 nm), ALEXA FLUOR 488 (539 nm), ALEXA FLUOR 500 (525 nm), ALEXA FLUOR 514 (540 nm), ALEXA FLUOR 532 (554 nm), ALEXA FLUOR 546 (575 nm), ALEXA FLUOR 555 (565 nm), ALEXA FLUOR 568 (603 nm), ALEXA FLUOR 594 (617 nm), ALEXA FLUOR 610 (628 nm), ALEXA FLUOR 633 (647 nm), ALEXA FLUOR 635 (645 nm), ALEXA FLUOR 647 (668 nm), ALEXA FLUOR 660 (690 nm), ALEXA FLUOR 680 (702 nm), ALEXA FLUOR 700 (719 nm), 및 ALEXA FLUOR 750 (779 nm) (괄호 안의 수치는 방사 최대를 나타냄). 하나의 구현예에서, 술폰화된 잔텐은 ALEXA FLUOR 680 이다. 예시적인 술폰화된 잔텐-클로로톡신 접합체는 문헌 [The Handbook - A Guide to Fluorescent Probes and labeling Technologies, Richard P. Haugland (Molecular Probes, Inc., a subsidiary of Invitrogen Corp.)] 에서 기술되는 바와 유사한 방식으로 제조될 수 있다.
본 발명에서 유용한 기타 적합한 NIR 형광물질은 DyLight-680, DyLight-750, VivoTag-750, DyLight-800, IRDye-800, VivoTag-680, 및 인도시아닌 그린을 포함한다.
또한, 본 발명의 변형 클로로톡신 펩티드는 양자점 및 중합점에 커플링될 수 있다.
적합한 형광 화합물은 화합물이 클로로톡신을 향해 화학적으로 반응성이 되게 하는 관능기를 포함한다. 적합한 관능기는 아민 기에 공유 커플링되기 위한 N-히드록시숙신이미드 (NHS) 기, 티올 기에 공유 커플링되기 위한 말레이미드기, 및 알데히드 기에 공유 결합되기 위한 히드라지드 기를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 접합체를 제조하는데 유용한 형광 화합물은 단일 반응성 관능기 (예를 들어, 모노-NHS 에스터) 를 포함한다. 본 발명의 접합체를 제조하는데 유용한 형광 화합물은 단일 반응성 관능기 (예를 들어, 모노-NHS 에스터) 를 포함한다. 본 발명의 클로로톡신 접합체를 제조하는데 적합한 다른 접합 화학이 숙지되어 있다.
본 발명의 적합한 접합체는 약 1 내지 약 3 개의 형광 부분/클로로톡신을 포함한다. 하나의 구현예에서, 접합체는 약 1 개의 형광 부분을 포함한다.
본 발명의 또다른 양태에서, 클로로톡신 접합체를 포함하는 조성물이 제공된다. 조성물은 인간 및 동물 대상체에 투여되기에 적합하고 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 조성물은 변형 클로로톡신 접합체의 약리학적 유효량을 포함한다. 유효량은 수립된 절차에 의해 통상적으로 측정될 수 있다. 유효량은 암세포에서 클로로톡신 결합 부위를 점유하기에 충분한 양이나, 비-신생 조직에 비-특이적으로 결합하는 것을 최소화하기 충분히 낮아야 한다. 유효량은 수술 중에 이미지화를 위한 신호-대-노이즈 비를 최적화한다.
본 발명은 클로로톡신 접합체를 사용하는 조직을 검출하기 위한 방법을 제공한다. 표적이 되는 본 발명의 클로로톡신 접합체는 클로로톡신 결합 부위에 의해 결합된다. 클로로톡신 결합 부위는 하기의 2 개의 형태를 취할 수 있는 것으로 숙지되어 있다: 클로로톡신에 결합하는 부위 및 본 발명의 클로로톡신 접합체를 결합하는 부위. 클로로톡신 결합 부위가 클로로톡신 접합체 결합 부위로부터 구분될 수 있는 것이 숙지되어 있다.
하나의 구현예에서, 비-신생 조직으로부터 클로로톡신 결합 부위를 발현하는 암의 자리를 구분하기 위한 방법이 제공된다. 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 관심 조직을 클로로톡신 결합 부위를 발현하는 세포에 대한 특이성 및 친화도를 갖는 클로로톡신 접합체와 접촉시키는 단계 (이때, 클로로톡신 접합체는 클로로톡신에 공유적으로 커플링되는 적외선 또는 근적외선 방출 형광 부분을 포함함); 및
(b) 클로로톡신 접합체의 결합 수준을 측정하는 단계 (이때, 정상 조직에 대한 상승된 결합 수준은 조직이 신생인지에 대한 지표임).
하나의 구현예에서, 클로로톡신 결합 부위를 발현하는 암을 검출하는 방법이 제공된다. 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 관심 조직을 클로로톡신 결합 부위를 발현하는 세포에 대한 친화도 및 특이성을 갖는 클로로톡신 접합체와 접촉시키는 단계 (이때, 클로로톡신 접합체는 클로로톡신에 공유적으로 커플링되는 하나 이상의 적외선 또는 근적외선 방출 형광 부분을 포함함); 및
(b) 클로로톡신 접합체의 결합 수준을 측정하는 단계 (이때, 정상 조직에 대한 상승된 결합 수준은 조직이 신생물인지에 대한 지표임).
하나의 구현예에서, 환자의 수술 중에 클로로톡신 결합 부위를 발현하는 암 세포의 위치를 결정하는 방법이 제공된다. 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 약학 조성물을 환자에게 투여하는 단계 (이때, 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체 및 생체 내에서 클로로톡신 결합 부위를 발현하는 암 세포를 이미지화하는데 충분한 클로로톡신 접합체의 양을 포함하고, 클로로톡신 접합체가 클로로톡신에 공유적으로 커플링되는 하나 이상의 적외선 또는 근적외선 방출 형광 부분을 포함함);
(b) 클로로톡신 결합 부위를 발현하는 암 세포의 위치를 결정하기 위해 형광 이미지화에 의해 클로로톡신 접합체의 결합 수준을 측정하는 단계 (이때, 정상 조직에 대한 상승된 결합 수준은 클로로톡신 결합 부위를 발현하는 암 세포의 존재의 지표임); 및
(c) 형광 이미지화에 의해 위치하는 클로로톡신 결합 부위를 발현하는 어느 정도 이상의 세포를 환자로부터 외과적으로 제거하는 단계.
암 자리의 검출을 위한 본 발명의 이미지화 방법은 마우스에 적용가능하고, 다른 암 동물 모델 및 수의학 실시에 적용가능하다.
본 발명의 형광 클로로톡신 접합체는 다른 유용한 제제를 포함할 수 있다. 다른 유용한 제제는 진단제 및 치료제를 포함한다.
또다른 구현예에서, 이미지화 방법은 자기 공명 영상 방법이다. 자기 공명 영상에서 클로로톡신 접합체를 제조하는 방법 및 사용하는 대표적인 방법은 본원에 그 전체가 참조로 포함되어 있는 미국 특허 출원 공보 제 200701254965 A1 호 (Chlorotoxin-Labeled Nanoparticle Compositions and Methods for Targeting Primary Brain Tumor) 에 기술되어 있다.
본 발명은 1차 뇌 종양을 표적화할 수 있는 클로로톡신-라벨링된 나노입자, 나노입자를 포함하는 조성물, 나노입자를 이용하는 조직을 이미지화하는 방법, 및 나노입자를 사용하여 클로로톡신 결합 부위를 발현하는 세포를 치료하는 방법을 제공한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 클로로톡신-라벨링된 입자를 제공한다:
(a) 표면을 갖는 코어 (코어는 자기 공명 영상 활성을 갖는 물질을 포함함);
(b) 변형 클로로톡신 펩티드; 및
(c) 변형 클로로톡신 펩티드를 표면에 공유적으로 커플링하는 링커.
코어는 자기 공명 영상 활성을 갖는 물질을 포함한다. 자기 공명 영상 활성을 갖는 적합한 물질은 금속 옥시드, 예컨대 산화제1철, 산화제2철, 산화 규소, 다결정형 산화 규소, 산화 알루미늄, 산화 게르마늄, 아연 셀레니드, 이산화 주석, 이산화티탄, 인듐 주석 옥시드, 및 산화 가돌리늄을 포함한다. 하나 이상의 옥시드의 혼합물이 사용될 수 있다.
자기 물질 외에도, 코어는 비-자기 물질, 예컨대 질산 규소, 스테인레스 스틸, 티탄, 붕소, 탄화 붕소, 붕소 및 탄소 혼합물, 및 니켈 티탄을 포함한다. 또한, 하나 이상의 비-자기 물질의 혼합물이 사용될 수 있다.
본 발명의 입자는 약 1 내지 약 100 개의 변형 클로로톡신/입자를 포함한다. 하나의 구현예에서, 입자는 약 10 내지 약 50 개의 변형 클로로톡신/입자를 포함한다. 하나의 구현예에서, 입자는 약 10 개의 변형 클로로톡신/입자를 포함한다. 하나의 구현예에서, 입자는 약 50 내지 약 100 개의 변형 클로로톡신/입자를 포함한다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 자기 나노입자는, 나노입자를 나노입자가 결합되는 클로로톡신 결합 부위를 발현하는 세포를 향하게 하기에 효과적인 표적화 부분으로서 제공되는 클로로톡신을 포함한다. 1차 뇌 종양 세포 (예를 들어, 신경외배엽-유래 종양 세포 및 신경교종 세포) 는 클로로톡신 결합 부위를 포함한다.
클로로톡신-라벨링된 나노입자는 기타 유용한 제제를 추가로 포함할 수 있다. 기타 유용한 제제는 진단제를 포함한다.
적합한 진단제는 자기 공명 영상 이외의 방법에 의해 나노입자의 검출을 위해 제공되는 제제를 포함한다. 적합한 진단제는 발광 화합물 (예를 들어, 형광물질, 인광물질 및 발광물질) 을 포함한다. 적합한 형광물질은 상기 기술된 것을 포함한다.
하나의 구현예에서, 클로로톡신-라벨링된 입자는 형광 부분을 추가로 포함한다. 본 발명의 입자는 약 1 내지 약 10 개의 형광 부분/입자를 포함한다. 하나의 구현예에서, 입자는 약 1 내지 약 2 개의 형광 부분/입자를 포함한다.
하나의 구현예에서, 형광 부분은 적외선 및 근적외선 방출 형광 부분 (즉, 약 600 nm 초과의 방사 최대를 갖는 형광 부분) 으로부터 선택된다. 하나의 구현예에서, 형광 부분은 시아닌 부분이다. 하나의 구현예에서, 형광 부분은 Cy5.5 부분이다.
다른 적합한 진단제는 다른 것 중에서 125I, 14C, 및 31P 와 같은 방사성라벨 (예를 들어, 방사성 동위원소 라벨링된 화합물) 을 포함한다.
본 발명의 또다른 양태에서, 본 발명의 입자를 포함하는 조성물이 제공된다. 하나의 구현예에서, 인간 또는 동물 대상체에 투여되기에 적합한 나노입자를 포함한다. 조성물은 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 조성물은 약학적으로 허용가능한 조성물이고 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 본원에 사용되는 바와 같이 용어 "담체" 는 입자의 전달을 촉진하기 위한 희석제 (예를 들어, 염분) 를 지칭한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 나노입자를 사용하는 방법을 제공한다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 비-신생 뇌 조직으로부터 신경외배엽-유래되는 종양 세포를 분화시키기 위한 방법을 제공한다. 방법에서, 신경외배엽-유래되는 종양 세포는 하기에 의해 비-신생 뇌 조직으로부터 분화된다:
(a) 관심 조직을 신경외배엽-유래되는 종양 세포에 대한 친화도 및 특이성을 갖는 클로로톡신-라벨링된 나노입자와 접촉시키는 단계; 및
(b) 클로로톡신-라벨링된 나노입자의 결합 수준을 측정하는 단계 (이때, 정상 조직에 대해 결합의 상승된 수준은 조직이 신생물인지에 대한 지표임).
하나의 구현예에서, 본 발명은 신경외배엽-유래되는 종양 세포를 검출하는 방법을 제공한다. 방법에서, 신경외배엽-유래되는 종양 세포는 하기에 의해 검출된다:
(a) 관심 조직을 신경외배엽-유래되는 종양 세포에 대한 친화도 및 특이성을 갖는 클로로톡신-라벨링된 나노입자와 접촉시키는 단계; 및
(b) 클로로톡신-라벨링된 나노입자의 결합 수준을 측정하는 단계 (이때, 정상 조직에 대해 결합의 상승된 수준은 조직이 신생물인지를 나타내는 지표임).
상기 방법은 신경교종 세포를 분화하고 검출하는데 유용하다.
상기 방법에서, 클로로톡신-라벨링된 나노입자의 결합 수준을 측정하는 것은 자기 공명 영상을 포함한다.
상기 방법의 특정 구현예에서, 클로로톡신-라벨링된 나노입자는 형광 부분을 추가로 포함한다. 이들 구현예에서, 클로로톡신-라벨링된 나노입자의 결합 수준을 측정하는 것은 형광 이미지화를 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 수술전, 수술중 및 수술후 신경교종 세포의 위치를 측정하기 위한 방법을 제공한다. 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 약학 조성물을 환자에게 투여하는 단계 (이때, 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체 및 형광물질/클로로톡신-라벨링된 나노입자의 생체 내 신경교종 세포를 이미지화하기에 충분한 양을 포함함);
(b) 수술전 자기 공명 영상에 의해 형광물질/클로로톡신-라벨링된 나노입자의 결합 수준을 측정하여 신경교종 세포의 위치를 확인하는 단계 (이때, 정상 조직에 대해 결합의 상승된 수준은 신경교종 세포의 존재의 지표임);
(c) 자기 공명 영상에 의해 위치가 확인된 신경교종 세포의 일부 이상을 환자로부터 수술적으로 제거하는 단계;
(d) 잔류 신경교종 세포의 위치를 결정하기 위해, 형광 이미지화에 의한 형광물질/클로로톡신-라벨링된 나노입자의 결합 수준을 측정하는 단계 (이때, 정상 조직에 대해 결합의 상승된 수준은 잔류 신경교종 세포의 존재의 지표임);
(e) 형광 이미지화에 의해 위치를 확인한 잔류 신경교종 세포의 일부 이상을 환자로부터 외과적으로 제거하는 단계; 및
(f) 신경교종 세포의 위치를 결정하기 위해 수술후 자기 공명 영상에 의해 형광물질/클로로톡신-라벨링된 나노입자의 결합 수준을 측정하는 단계 (이때, 정상 조직에 대해 결합의 상승된 수준은 신경교종 세포의 존재의 지표임).
방법에서, 생체 내에서 신경교종 세포를 이미지화하기에 충분한 형광물질/클로로톡신-라벨링된 나노입자의 양은 약 1-20 mg Fe/kg 체중 ("Fe" 는 입자 코어에 존재하는 철을 지칭함) 의 양이다.
상기 방법에서, 단계 (d) 및 (e) 는 반복될 수 있다.
상기 방법은 수술전, 수술중, 및 수술후 이미지화를 포함한다. 상기 방법의 변형도 본 발명의 범주 이내임이 숙지될 것이다. 본 방법의 다른 변형은 예를 들어 하기를 포함한다: (1) 오직 수술전에만 이미지화하는 것; (2) 오직 수술중에만 이미지화하는 것; (3) 오직 수술후에만 이미지화하는 것; (4) 오직 수술전 및 수술중에만 이미지화하는 것; (5) 오직 수술전 및 수술후에만 이지화하는 것; 및 (6) 오직 수술중 및 수술후에만 이지화하는 것.
본 발명은 나노입자를 사용하는 조직을 처리하는 방법을 제공한다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 클로로톡신-라벨링된 나노입자 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 신경교종을 치료하는 방법을 제공한다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 클로로톡신-라벨링된 나노입자 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 신경외배엽 종양을 치료하는 방법을 제공한다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 클로로톡신-라벨링된 나노입자 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물의 유효량을 신생물 세포에게 투여하는 것을 포함하는, 신생물 세포의 침습성 활성을 저해하는 방법을 제공한다.
하기는 본 발명의 3 개의 각각의 변형 클로로톡신 펩티드 및 이들의 특성, 펩티드의 접합체 및 이의 특성, 및 이미화하는데 접합체의 용도를 기술하고 있다.
변형 클로로톡신 펩티드의 제조.
본 발명의 2 개의 예시적인 변형 클로로톡신 (CTX) 펩티드 (알라닌 치환된 클로로톡신, K15A_K23A-CTX; 아르기닌 치환된 클로로톡신, K15R_K23R-CTX) 서열을 도 1 에 나타낸다. Boc (tert-부톡시카르보닐)/HBTU [2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트] 를 사용하여 제자리 중성화 화학으로 펩티드를 합성하였다. 0.1 M Tris-HCl, 0.2 M NaCl, 5 mM 환원 글루타티온 / 0.5 mM 산화 글루타티온의 완충제 용액 (pH 7.8) 을 둘 모두 사용하여 치환된 펩티드를 산화시키고 순환시키고 실온에서 밤새 CTX 를 산화시켰다. RP-HPLC 를 사용하여 펩티드를 정제하고, 2 개의 CTX 유사체 K15A_K23A-CTX 및 K15R_K23R-CTX 의 분자 질량을 분석적 RP-HPLC 및 ES-MS 로 확인하였다.
NMR 배정.
펩티드를 90% H2O 및 10% D2O 에 용해시키고, 1차원 및 2차원 TOCSY 및 NOESY 스펙트럼을 298°K 에서 600 MHz 에서 기록하였다. 이미 수립되어 있는 기술을 이용하여 NMR 스펙트럼을 할당하였다 (K. Wuthrich, "NMR of Protein and Nuclic Acids", Wiley-Interscience, New York, 1986). 아미드 영역에서 화학적 시프트는 잘 사라지며, 이는 펩티드가 올바르게 접히는지를 확인하고, 각각의 펩티드의 NOESY 스펙트럼에서 지문 영역은 2 개의 프롤린 잔기 (Pro4 및 Pro31) 를 예외로 αH-NH 순차적 연결의 완료된 주기를 나타낸다. 그러나, 예상되는 바와 같이, NOE 는 프롤린 잔기의 δ프로톤 및 이들의 선행 잔기로부터 관찰되었다. 천연 CTX 의 2차 αH 화학적 시프트의 비교를 도 2 에 나타냈다.
치환된 CTX 생접합체의 특성화.
천연 및 변형된 펩티드를 Cy5.5 에 접합시키고 하기 실시예에 기술된 바와 같이 정제하였다. 생성되는 생접합체를 HPLC 및 질량 분광분석으로 분석하였다. 예상되는 바와 같이, Ala 및 Arg 치환은 단독으로 모노-라벨링된 CTX:Cy5.5 생접합체를 생성한다.
치환된 CTX : Cy5 . 5 의 기능 평가.
치환의 잠재적 이점은, 펩티드의 기능적 표적화 활성이 천연 CTX 생접합체에 비교가능한지에 의존적이다. 각각의 펩티드의 수용력은 우선적으로 수아종 세포에 대한 Cy5.5 신호를 표적으로 하고, 정상 뇌를 바이오광 이미지화에 의해 평가하였다. 각 경우에서, 50 μL 의 40 μM 생접합체를 증가된 뇌 종양에 일치하는 임상적 신호를 나타내는 마우스의 꼬리 정맥으로 주입하였다. 3 일 후, 마우스를 살생하고 이의 뇌를 Caliper/Xenogen 스펙트럼 바이오 광 이미지화 시스템을 이용하여 이미지화하였다. 변형된 펩티드 접합체 모두는 우선적으로 정상 뇌와 비교하여 수아종 암 조직을 조명하였다 (도 3A 및 3B). 모든 경우에서, 종양에서의 신호를, 수아종을 갖지 않는 소뇌 주입의 대조군 동물에서의 신호와 비교하였다. 정상에 비해 종양에서의 신호는 천연 CTX:Cy5.5 (n =10) 에 대해 1.96 ± 0.47 였고; Ala 치환된 것 (n = 8) 에 대해 3.3 ± 1.8 였고 Arg 치환된 것 (n = 5) 에 대해 2.6 ± 0.85 였다. 통계학적으로, 변형된 펩티드 생접합체 모두를 천연 CTX:Cy5.5 로부터 구분할 수 없었으며, 이는 라이신 치환이 이의 표적에 대한 CTX 결합으로 간섭되지 않음을 나타낸다.
본 발명의 이점 .
인간 임상 시험에 대한 신규 치료제를 개발할 때, 효능, 약물동태학, 약물학 및 독성뿐만 아니라, 규제국의 승인 또는 제조 비용 증가를 포함하는 실제적인 문제도 고려해야 한다. 마우스 모델에서 고체 종양을 안전하고 효과적으로 조명하는 생접합체는, 생접합체가 모노-, 디- 및 트리-라벨링된 CTX 의 실제 혼합물이라는 사실에 대한 제조관점에서의 도전이다. 본 발명은, 암에 대한 NIRF 분자, 오직 단일 NIRF 분자에 대한 접합체를 표적으로 하기 위한 CTX 와 기능적으로 동일한 신규 예시적 화학적 전체를 제공한다.
CTX:Cy5.5 에서 CTX 접합 부위를 단백질체학 분석으로 커플링되는 아르기나아제 분해를 사용하여 맵핑하였고, 전형적으로 >80% 의 생성물이 Lys 27 에서 모노-라벨링되고 더 적은 양이 또한 Lys 15 또는 Lys 23 에서 접합되는 것으로 나타났다. 4 개의 다른 NIRF 염료에 대해 접합된 CTX 의 분석에서, 디- 및 트리-라벨링된 펩티드의 더 적은 양을 갖는 우세하게 모노-라벨링된 펩티드의 유사한 패턴이 관찰되었으며, Dylight 750 을 예외로 하고, NIRF 염료는 오직 모노-라벨링된 종을 생성하였다. Dylight 750 이 비변형된 CTX 에 단량체 방식으로 결합한다는 사실은, 다른 2 개의 라이신에 접근하는 것이 제한된다는 것을 나타낸다.
CTX 에서 라이신 잔기 중 어느 것도, 암 세포에 대해 이의 표적으로의 CTX 의 활성 결합에 연관되지 않은 것으로 보인다. 이러한 결론은, Lys 15 또는 Lys 23 를 Ala 또는 Arg 으로 치환함에도 불구하고 표적 결합이 보존되고 벌키 Cy5.5 의 첨가 또는 Lys 27 에 대한 다른 NIRF 염료가 활성 부위에 대한 결합을 방해하지 않는다는 관찰에 기초한 것이다.
실험 절차
고체 상 펩티드 합성.
표준 보호기 (예를 들어, Asn(Xan), Asp(OcHex), Arg(TOS), Cys(MeBzl), Lys(ClZ), Ser(Bzl), Thr(Bzl) 및 Tyr(BrZ)) 로 펩티드를 합성하기 위해 수동 고체상 펩티드 합성 (SPPS) 을 사용하였다. Ala 및 Arg 치환된 선형 CTX 를 티오에스테르 링커 없이 PAM-Arg 수지 상에 조립하였다. 1.5 h 동안 -5 내지 0℃ 에서 스캐빈져로서 p-크레졸 및 p-티오크레졸을 갖는 수소 플루오라이드 (HF) (9:0.8:0.2 (vol/vol) HF:p-크레졸:p-티오크레졸) 를 이용하여 수지로부터 펩티드의 분해를 달성하였다. C18 컬럼을 갖는 역 상-고성능 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC) 를 이용하여 215 nm 에서 흡광도를 모니터링함으로써 0-80% 용액 B 구배 (용액 A: H2O/0.05% 트리플루오로아세트산; 용액 B: 90% CH3CN/10%H2O/0.045% 트리플루오로아세트산) 를 이용하여 펩티드를 정제하였다. 전기분사 질량 분광분석 (ES-MS) 으로, 합성된 펩티드의 순도 및 분자 질량을 확인하였다.
접힘.
Ala 및 Arg 치환된 유사체는 밤새 실온에서 0.1 M Tris-HCl, 0.2 M NaCl, 5 mM 환원된 글루타티온/ 0.5 mM 산화된 글루타티온 (pH 7.8) 으로 이루어진 완충 수용액에서 산화시켰다. RP-HPLC 를 사용하여 펩티드를 정제하고 순도 및 분자량을 분석적 RP-HPLC 및 ES-MS 로 확인하였다.
NMR 분광분석.
600 MHz 1H NMR 분광분석을 사용하여 펩티드 유사체의 3차원 구조를 모니터링하였다. 펩티드 샘플을 90% H2O 및 10% D2O (v/v) 에 용해시켰다. D2O (99.99%) 을 "Cambridge Isotope Laboratories" (Woburn, MA) 로부터 수득하였다. 2차원 NMR 실험에 "Total Correlation Spectroscopy (TOCSY)" 및 "Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy (NOESY)" 을 포함시켰고, 스펙트럼을 298°K 에서 기록하였다.
혈청 안정도 검정.
20 μM 최종 펩티드 농도를 사용하여 100% 인간 남자 혈청 (Sigma) 에서 혈청 안정도 검정을 수행하였다. 혈청을 10 분 동안 14000 g 에서 원심분리하여 지질 성분을 제거하고 상청액을 검정 전에 15 분 동안 37℃ 에서 인큐베이션하였다. 각각의 펩티드를 37℃ 에서 혈청에서 인큐베이션하고 40 μL 의 3중 분취액을 0, 1, 3, 6, 10, 16 및 24 h 에서 채취하였다. 각각의 혈청 분취액을 6 M 우레아 40 μL 로 켄칭하였고 4℃ 에서 10 분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 각각의 혈청 분취액을 40 μL 의 20% 트리클로로아세트산으로 켄칭하고 4℃ 에서 10 분 동안 인큐베이션하여 혈청 단백질을 침전시켰다. 샘플을 10 분 동안 14000 g 에서 원심분리하고, 100 μL 의 상청액을 용매 B (0.3 mL/분 유속) 의 선형 구배를 사용하여 RP-HPLC 에 대해 분석하였다. 포스페이트-완충된 염분에서 펩티드의 등가량이 함유된 대조군 샘플을 동일한 처리 절차로 처리하였다. 215 nm 에서 통합함으로써 펩티드의 회수 백분율을 검출하였다.
동물 모델.
모든 동물을 "National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals" 에 따라 엄격하게 취급하였다. "Fred Hutchinson Cancer Research Center's Institute of Animal Care" 및 사용 위원회의 승인된 프로토콜에 따라 모든 동물 연구를 수행하였다. C57b1/6 백그라운드에 대해 수아종의 자생 마우스 모델, ND2:SmoA1 (A.R. Hallahan, et al., "The SmoA1 Mouse Model Reveals That Notch Signaling is Critical for the Growth and Survival of Sonic Hedgehog-Induced Medulloblastomas," Cancer Research 64:7794-7800, 2004. B.A. Hatton, et al. "The Smo/Smo Model: Hedgehog-Induced Medulloblastomas With 90% Incidence and Leptomeningeal Spread," Cancer Research 68:1768-1776, 2008) 을 사용하여 순환되는 CTX:Cy5.5, K15A_K23A CTX:Cy5.5, 및 K15R_K23R CTX:Cy5.5 의 특이성을 평가하는데 사용하였다. 이 연구에서 기록을 위해, 수아종 징후를 나타내는 반접합 또는 동형접합 (ND2:SmoA1 으로서 지칭됨) 마우스를 선별하였다. 오픈 필드 케이지 평가를 사용하여 징후를 검출하였다. 징후는 머리를 기울이고, 등을 구부린 자세를 취하고, 운동 실조를 나타내고, 두개골이 돌출되고, 체중이 손실되는 것을 포함한다.
생체 외 이미지화.
수아종 징후를 나타내는 ND2:SmoA1 동물을 꼬리 정맥을 통해 50 μL 의 40 μM K15A_K23A CTX:Cy5.5 또는 K15R_K23R CTX:Cy5.5 을 주입하였다. 주입 3일 후 CO2 흡입을 사용하여 안락사시키고 "Xenogen Spectrum Imaging System" (Caliper) 을 사용하여 이들의 뇌의 생체외 바이오광 이미지를 수득하였다. 이후, "Tissue-Tek Optimal Cutting Temperature (OCT)" 화합물 (Sakura) 에서 뇌를 냉동시키고, 12 μm 구획으로 슬라이스하고 표준 절차에 따라 "Hemotoxylin and Eosin (H&E)" 염색하였다.
본 발명의 바람직한 구현예가 기술되었으나, 본 발명의 취지 및 범주에서 벗어나지 않는 다양한 변경이 가능함이 숙지될 것이다.
배타적 특성 또는 특권이 청구되는 본 발명의 구현예는 하기와 같이 정의된다:
SEQUENCE LISTING <110> Fred Hutchinson Cancer Research Center Olson, James M. <120> CHLOROTOXIN VARIANTS, CONJUGATES, AND METHODS FOR THEIR USE <130> FHCR136231 <150> US 61/333,556 <151> 2010-05-11 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 36 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Cys Met Pro Cys Phe Thr Thr Asp His Gln Met Ala Arg Lys Cys 1 5 10 15 Asp Asp Cys Cys Gly Gly Lys Gly Arg Gly Lys Cys Tyr Gly Pro Gln 20 25 30 Cys Leu Cys Arg 35 <210> 2 <211> 36 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Xaa can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(23) <223> Xaa can be any amino acid <400> 2 Met Cys Met Pro Cys Phe Thr Thr Asp His Gln Met Ala Arg Xaa Cys 1 5 10 15 Asp Asp Cys Cys Gly Gly Xaa Gly Arg Gly Lys Cys Tyr Gly Pro Gln 20 25 30 Cys Leu Cys Arg 35 <210> 3 <211> 36 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Cys Met Pro Cys Phe Thr Thr Asp His Gln Met Ala Arg Ala Cys 1 5 10 15 Asp Asp Cys Cys Gly Gly Ala Gly Arg Gly Lys Cys Tyr Gly Pro Gln 20 25 30 Cys Leu Cys Arg 35 <210> 4 <211> 36 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Cys Met Pro Cys Phe Thr Thr Asp His Gln Met Ala Arg Arg Cys 1 5 10 15 Asp Asp Cys Cys Gly Gly Arg Gly Arg Gly Lys Cys Tyr Gly Pro Gln 20 25 30 Cys Leu Cys Arg 35 <210> 5 <211> 36 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Cys Met Pro Cys Phe Thr Thr Asp His Gln Met Ala Arg Ala Cys 1 5 10 15 Asp Asp Cys Cys Gly Gly Arg Gly Arg Gly Lys Cys Tyr Gly Pro Gln 20 25 30 Cys Leu Cys Arg 35 <210> 6 <211> 36 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Cys Met Pro Cys Phe Thr Thr Asp His Gln Met Ala Arg Arg Cys 1 5 10 15 Asp Asp Cys Cys Gly Gly Ala Gly Arg Gly Lys Cys Tyr Gly Pro Gln 20 25 30 Cys Leu Cys Arg 35

Claims (40)

  1. 하기를 포함하는 클로로톡신 접합체:
    Lys 15 잔기 및 Lys 23 잔기가 라이신 이외의 아미노산으로 치환되어 있는 천연 클로로톡신의 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 1) 에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 클로로톡신 변이체 폴리펩티드; 및
    DyLight-680, DyLight-750, VivoTag-750, DyLight-800, VivoTag-680, 및 인도시아닌 그린으로부터 선택되는 형광 라벨,
    여기에서 클로로톡신 변이체 폴리펩티드는 형광 라벨에 공유적으로 커플링되어 있고, 클로로톡신 변이체 폴리펩티드는 암 세포에 의해 발현된 클로로톡신 결합 부위에 결합함.
  2. 제 1 항에 있어서, Lys 15 잔기, Lys 23 잔기, 또는 Lys 15 잔기 및 Lys 23 잔기가 염기성 아미노산, 비-천연 아미노산, 아미노산 유사체, 또는 아미노산 모방체로 독립적으로 치환되어 있는 클로로톡신 접합체.
  3. 제 1 항에 있어서, Lys 15 잔기, Lys 23 잔기, 또는 Lys 15 잔기 및 Lys 23 잔기가 산성 아미노산, 비-천연 아미노산, 아미노산 유사체, 또는 아미노산 모방체로 독립적으로 치환되어 있는 클로로톡신 접합체.
  4. 제 1 항에 있어서, Lys 15 잔기, Lys 23 잔기, 또는 Lys 15 잔기 및 Lys 23 잔기가 비극성 아미노산, 관련 비-천연 아미노산, 아미노산 유사체, 또는 아미노산 모방체로 독립적으로 치환되어 있는 클로로톡신 접합체.
  5. 제 1 항에 있어서, Lys 15 잔기, Lys 23 잔기, 또는 Lys 15 잔기 및 Lys 23 잔기가 극성 아미노산, 비-천연 아미노산, 아미노산 유사체, 또는 아미노산 모방체로 독립적으로 치환되어 있는 클로로톡신 접합체.
  6. 제 1 항에 있어서, Lys 15 잔기 및 Lys 23 잔기가 천연 및 비천연 아미노산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산으로 독립적으로 치환되어 있는 클로로톡신 접합체.
  7. 제 1 항에 있어서, Lys 15 잔기, Lys 23 잔기, 또는 Lys 15 잔기 및 Lys 23 잔기가 알라닌으로 독립적으로 치환되어 있는 클로로톡신 접합체.
  8. 제 1 항에 있어서, Lys 15 잔기, Lys 23 잔기, 또는 Lys 15 잔기 및 Lys 23 잔기가 아르기닌으로 독립적으로 치환되어 있는 클로로톡신 접합체.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 제 1 항에 있어서, Lys 15 잔기 및 Lys 23 잔기가 알라닌 또는 아르기닌으로 치환되어 있는 클로로톡신 접합체.
  13. 제 1 항에 있어서, Lys 15 잔기가 알라닌으로 치환되어 있고, Lys 23 잔기가 아르기닌으로 치환되어 있는 클로로톡신 접합체.
  14. 제 1 항에 있어서, Lys 15 잔기가 아르기닌으로 치환되어 있고, Lys 23 잔기가 알라닌으로 치환되어 있는 클로로톡신 접합체.
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 제 1 항에 있어서, 클로로톡신 변이체 폴리펩티드가 위치 27 에서 라이신 잔기를 포함하는 클로로톡신 접합체.
  18. 제 1 항에 있어서, 클로로톡신 변이체 폴리펩티드가 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어지는 클로로톡신 접합체:
    SEQ ID NO: 3 에 제시된 아미노산 서열;
    SEQ ID NO: 4 에 제시된 아미노산 서열;
    SEQ ID NO: 5 에 제시된 아미노산 서열; 및
    SEQ ID NO: 6 에 제시된 아미노산 서열.
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 제 17 항에 있어서, 인도시아닌 그린이 위치 27 에서 라이신 잔기에 접합되어 있는 클로로톡신 접합체.
  25. 제 6 항에 있어서, 비-천연 아미노산이 D-아미노산을 포함하는 클로로톡신 접합체.
  26. 제 1 항에 있어서, 형광 라벨이 650 nm 내지 750 nm 의 형광 방사 파장을 갖는 클로로톡신 접합체.
  27. 제 1 항 내지 제 8 항, 제 12 항 내지 제 14 항, 제 17 항, 제 18 항 및 제 24 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 따른 클로로톡신 접합체를 포함하는, 암 치료 또는 검출용 조성물.
  28. 제 27 항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 조성물.
  29. 제 1 항 내지 제 8 항, 제 12 항 내지 제 14 항, 제 17 항, 제 18 항 및 제 24 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 클로로톡신을 투여함으로써 치료가능한 질환 또는 병태의 치료를 위한 약제의 제조에서 사용되는 클로로톡신 접합체.
  30. 제 1 항 내지 제 8 항, 제 12 항 내지 제 14 항, 제 17 항, 제 18 항 및 제 24 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 클로로톡신에 의해 이미지화 가능한 조직의 이미지화를 위한 시약의 제조에서 사용되는 클로로톡신 접합체.
  31. 제 1 항 내지 제 8 항, 제 12 항 내지 제 14 항, 제 17 항, 제 18 항 및 제 24 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 클로로톡신에 의해 검출가능한 또는 이미지화 가능한 조직을 클로로톡신 접합체와 접촉시키는 것을 포함하는, 클로로톡신에 의해 검출가능한 또는 이미지화 가능한 암 세포 또는 암 또는 종양 조직의 검출 또는 이미지화를 위한 시약의 제조에서 사용되는 클로로톡신 접합체.
  32. 제 1 항 내지 제 8 항, 제 12 항 내지 제 14 항, 제 17 항, 제 18 항 및 제 24 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 클로로톡신 접합체에 의해 표적화되는 암의 치료를 위한 약제의 제조에서 사용되는 클로로톡신 접합체.
  33. 제 1 항 내지 제 8 항, 제 12 항 내지 제 14 항, 제 17 항, 제 18 항 및 제 24 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 암 세포 또는 조직을 접합체와 접촉시키고, 암 세포 또는 암 또는 종양 조직을 가시화하기 위해 수술 절차 동안 제거된 암 세포 또는 암 또는 종양 조직에 대한 클로로톡신 접합체의 결합을 검출 또는 이미지화하는 것을 포함하는, 생체 외에서의 암 세포 또는 암 또는 종양 조직의 가시화를 위한 시약의 제조에서 사용되는 클로로톡신 접합체.
  34. 제 33 항에 있어서, 이미지화가 형광 이미지화를 포함하는 클로로톡신 접합체.
  35. 제 34 항에 있어서, 형광 이미지화가 650 nm 내지 750 nm 의 클로로톡신 접합체로부터의 형광 방사 파장을 검출하는 것을 포함하는 클로로톡신 접합체.
  36. 제 1 항 내지 제 8 항, 제 12 항 내지 제 14 항, 제 17 항, 제 18 항 및 제 24 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 생체 외에서의 비-신생 조직으로부터 클로로톡신 결합 부위를 발현하는 암의 자리의 구분을 위한 시약의 제조에서 사용되는 클로로톡신 접합체로서,
    수술 절차 동안 제거된 조직을 접합체와 접촉시키고, 클로로톡신 접합체의 결합 수준을 측정하는 것을 포함하며, 여기서 정상 조직에 비해 상승된 결합 수준은 조직이 암이라는 것을 나타내는, 클로로톡신 접합체.
  37. 대상체로부터 제거된 조직 또는 세포로서, 제 1 항의 클로로톡신 접합체에 결합된 암 조직 또는 암 세포를 포함하는 조직 또는 세포.
  38. 하기를 포함하는 암 치료 또는 검출용 약학적 조성물:
    약학적으로 허용가능한 담체; 및
    인도시아닌 그린을 포함하는 형광 부분에 공유적으로 접합된 변형 클로로톡신 폴리펩티드를 포함하는 클로로톡신 접합체,
    여기에서 변형 클로로톡신 폴리펩티드는 라이신 잔기 K15 및 라이신 잔기 K23 이 라이신 이외의 아미노산으로 치환되어 있는 천연 클로로톡신의 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 1) 에 상응하는 아미노산 서열을 포함하고, 변형 클로로톡신 폴리펩티드는 암 세포에 의해 발현된 클로로톡신 결합 부위에 결합함.
  39. 제 38 항에 있어서, 변형 클로로톡신 폴리펩티드가 위치 27 에서 단일 라이신 잔기를 포함하는 약학적 조성물.
  40. 제 38 항에 있어서, 클로로톡신 접합체가 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어지는 변형 클로로톡신 폴리펩티드를 포함하는 약학적 조성물:
    SEQ ID NO: 3 에 제시된 아미노산 서열;
    SEQ ID NO: 4 에 제시된 아미노산 서열;
    SEQ ID NO: 5 에 제시된 아미노산 서열; 및
    SEQ ID NO: 6 에 제시된 아미노산 서열.
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