ES2601182T3 - Variantes de clorotoxina, conjugados y métodos para su utilización - Google Patents
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Abstract
Conjugado de clorotoxina que comprende: (i) un péptido de clorotoxina que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, en la que Lys15 y Lys23 están sustituidos por un aminoácido distinto de lisina para proporcionar una clorotoxina modificada que tiene un único residuo de lisina, Lys27; y (ii) un marcador fluorescente seleccionado de DyLight-680, DyLight-750, VivoTag-750, DyLight-800, VivoTag-680, y verde de indocianina; en el que el péptido de clorotoxina está acoplado covalentemente al marcador fluorescente a través del residuo de lisina, y dicho péptido de clorotoxina se une a sitios de unión a clorotoxina expresados por células cancerosas.
Description
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DESCRIPCION
Variantes de clorotoxina, conjugados y metodos para su utilizacion
Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud estadounidense n.° 61/333,556, presentada el 11 de mayo de 2010.
CAMPO DE LA DIVULGACION
La presente divulgacion se refiere de manera general a clorotoxina, y mas particularmente a variantes de clorotoxina, a conjugados de variantes de clorotoxina, a composiciones que incluyen las variantes o conjugados de clorotoxina, y a metodos para utilizar las variantes, conjugados y composiciones de clorotoxina.
ANTECEDENTES DE LA DIVULGACION
Los neurocirujanos han buscado desde hace mucho tiempo metodos para iluminar las celulas cancerosas cerebrales para identificar focos de cancer y distinguir el cancer del tejido normal en tiempo real durante operaciones de reseccion de tumores. Un bioconjugado compuesto por clorotoxina (CTX), un peptido descubierto a partir del escorpion Leiurus quinquestriatus, y moleculas fluorescentes en el infrarrojo cercano (NIRF), tales como Cy5.5, ("pintura tumoral") identifica claramente focos de tumor con alta sensibilidad (M. Veiseh, et al., "Tumor Paint: A Chlorotoxin:Cy5.5 Bioconjugate for Intra-Operative Visualization of Cancer Foci", Cancer Research 67(14):6882-88, 2007). CTX se selecciono originalmente para estos estudios porque se une de manera preferencial a celulas de glioma en comparacion con tejido cerebral normal (L. Soroceanu, et al., "Use of Chlorotoxin for Targeting of Primary Brain Tumors", Cancer Research 58:4871-4879, 1998). Dado que la diana de CTX parece estar compartida por otros multiples tipos de cancer, CTX:Cy5.5 ilumino eficazmente tumores de prostata, colon, sarcoma, meduloblastoma y otros tipos de tumores solidos (M. Veiseh 2007).
CTX es un peptido de 36 aminoacidos con cuatro puentes disulfuro que confiere un alto grado de estructura tridimensional al polipeptido. CTX tiene tres residuos de lisina en las posiciones 15, 23 y 27 que se han utilizado para la conjugacion a Cy5.5 modificado con ester de NHS y otras moleculas fluorescentes. El bioconjugado resultante es una mezcla de normalmente el 75-85% de peptido monomarcado en la posicion 27 y cantidades menores de peptido di y trimarcado conjugado con Lys 15 y Lys 23. Aunque es posible que la Food and Drug Administration (FDA) y agencias normativas similares en otras partes aprueben mezclas, la comercializacion se ve posiblemente impedida ya que en el futuro resulta caro y diflcil que coincida la razon de lotes mono, di y trimarcados.
Existe la necesidad de un polipeptido que tenga las propiedades ventajosas de clorotoxina y que tenga un unico residuo de lisina para su conjugacion con agentes de diagnostico o terapeuticos para proporcionar una unica nueva entidad molecular homogenea. La presente divulgacion busca cubrir esta necesidad y proporciona ventajas relacionadas adicionales.
El documento WO2006/115633 describe un conjugado de cianina-clorotoxina y un metodo para la visualizacion fluorescente intraoperatoria de cancer. Veiseh et al. (Cancer Res. (2007) 67(14): 6882-6888) describe un bioconjugado de clorotoxina:Cy5.5 para la visualizacion intraoperatoria de focos de cancer. Veiseh et al. (Nano Letters (2005) 5(6): 1003-1008) describe una nanosonda multifuncional optica y de IRM para seleccionar gliomas como diana. Veiseh et al. Cancer Res. (2009) 69(15): 6200-6207) describe la seleccion como diana especlfica de tumores cerebrales con una nanosonda optica/de IRM a traves de la barrera hematoencefalica. El documento US2009/004105 describe la obtencion de imagenes moleculares de la expresion de metaloproteinasa de la matriz utilizando clorotoxina marcada.
SUMARIO DE LA DIVULGACION
La invencion se define por las reivindicaciones. Los aspectos/casos de la presente divulgacion que constituyen la invention se definen por las reivindicaciones.
La presente divulgacion proporciona variantes de clorotoxina, conjugados preparados a partir de las variantes de clorotoxina, composiciones que incluyen las variantes o conjugados de clorotoxina, y metodos para utilizar las variantes, conjugados y composiciones de clorotoxina.
En un aspecto, la divulgacion proporciona un peptido de clorotoxina modificado que tiene un unico residuo de lisina (Lys 27). En un caso, el peptido de clorotoxina modificado tiene Lys 15 y Lys 23 de clorotoxina nativa sustituidos por un
- aminoacido distintc
- de lisina. En un caso, el peptido de clorotoxina modificado tiene la secuencia de aminoacidos
- expuesta
- en SEQ ID NO: 2. En un caso, el peptido de clorotoxina modificado tiene la secuencia de aminoacidos
- expuesta
- en SEQ ID NO: 3. En un caso, el peptido de clorotoxina modificado tiene la secuencia de aminoacidos
- expuesta
- en SEQ ID NO: 4. En un caso, el peptido de clorotoxina modificado tiene la secuencia de aminoacidos
- expuesta
- en SEQ ID NO: 5. En un caso, el peptido de clorotoxina modificado tiene la secuencia de aminoacidos
expuesta en SEQ ID NO: 6.
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Tambien se proporcionan composiciones que comprenden un peptido de clorotoxina modificado de la divulgacion. En un caso, la composicion comprende un portador farmaceuticamente aceptable.
En otro aspecto, la divulgacion proporciona un metodo para tratar una enfermedad o un estado que puede tratarse mediante la administracion de clorotoxina, que comprende administrar una cantidad eficaz de un peptido de clorotoxina modificado de la divulgacion a un sujeto que lo necesita.
En un aspecto adicional de la divulgacion, se proporciona un conjugado de clorotoxina que comprende un peptido de clorotoxina modificado de la divulgacion. En un caso, el conjugado de clorotoxina comprende un peptido de clorotoxina modificado acoplado covalentemente a uno o mas de un agente terapeutico, de diagnostico, de obtencion de imagenes o de direccionamiento, o un resto que aumenta la semivida en circulacion del peptido de clorotoxina modificado. En un caso, el agente terapeutico, de diagnostico, de obtencion de imagenes o de direccionamiento, o un resto que aumenta la semivida en circulacion del peptido de clorotoxina modificado esta acoplado covalentemente al peptido de clorotoxina modificado a traves del residuo de lisina. Los agentes de diagnostico o de obtencion de imagenes adecuados incluyen marcadores fluorescentes (p. ej., punto cuantico o punto polimerico), radiomarcadores y marcadores de obtencion de imagenes por resonancia magnetica (p. ej., una nanopartlcula de boro, una nanopartlcula de boro y carbono, una nanopartlcula de carburo de boro, pollmero que contiene boro, un pollmero que contiene boro y carbono, pollmero que contiene carburo de boro, y cualquiera de estas nanopartlculas o pollmeros que comprenden ademas gadolinio). Los agentes de direccionamiento adecuados incluyen anticuerpos, polipeptidos, polisacaridos y acidos nucleicos. Los agentes terapeuticos adecuados incluyen agentes quimioterapicos (p. ej., metotrexato, docetaxel, cisplatino y etoposido) y agentes terapeuticos biologicos (p. ej., ADNc, ARNip, ARNhp e iARN). Los restos adecuados que aumentan la semivida en circulacion del peptido de clorotoxina modificado incluyen restos de PEG, restos de glicosilo y restos de glicosil-PEG.
En otros aspectos, se proporcionan metodos para utilizar los conjugados de clorotoxina.
En un caso, la divulgacion proporciona un metodo para obtener imagenes de un tejido del que pueden obtenerse imagenes mediante clorotoxina, que comprende poner en contacto un tejido del que pueden obtenerse imagenes mediante clorotoxina con un conjugado de clorotoxina de la divulgacion para obtener imagenes de un tejido del que pueden obtenerse imagenes mediante clorotoxina.
En un caso, la divulgacion proporciona un metodo para detectar cancer que puede detectarse mediante clorotoxina, que comprende poner en contacto un tejido del que pueden obtenerse imagenes mediante clorotoxina modificada con un conjugado de clorotoxina modificada de la divulgacion para detectar cancer que puede detectarse mediante clorotoxina.
En un caso, la divulgacion proporciona un metodo para detectar y eliminar cancer que puede detectarse mediante clorotoxina, que comprende poner en contacto un tejido con un conjugado de clorotoxina modificada de la divulgacion para detectar tejido canceroso y eliminar el tejido canceroso detectado mediante el conjugado de clorotoxina modificada.
En un caso, la divulgacion proporciona un metodo para tratar cancer seleccionado como diana por un conjugado de clorotoxina modificada, que comprende poner en contacto un tejido que se une a clorotoxina modificada con un conjugado de clorotoxina modificada de la divulgacion para tratar el cancer.
DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
Los aspectos anteriores y muchas de las ventajas relacionadas de esta divulgacion se apreciaran mas facilmente al entenderse mejor mediante referencia a la siguiente descripcion detallada, tomada junto con los dibujos adjuntos.
La figura 1 compara las secuencias de clorotoxina nativa (CTX lineal) con peptidos de clorotoxina modificados representativos de la divulgacion (K15A_K23A CTX; K15R_K23R CTX). Las secuencias de CTX nativa y sustituida con cuatro enlaces disulfuro mostrados como llneas amarillas.
La figura 2 es una comparacion de los desplazamientos qulmicos de aH secundarios de peptidos de clorotoxina modificados representativos de la divulgacion y clorotoxina nativa. Los desplazamientos de aH secundarios se calcularon restando los desplazamientos de enrollamientos al azar de los desplazamientos de aH experimentales (D.S. Wishart, et al., 1H, 13C y 15N Chemical Shift Referencing in Biomolecular NMR", Journal of Biomolecular NMR 6, 135140, 1995). Un grafico de barras de CTX nativa (azul oscuro), CTX lineal (azul), K15A_K23A CTX (rojo) y K15R_K23R CTX (naranja). Se muestran dos cadenas p como flecha azul, la helice a se muestra en rojo. Los residuos sustituidos y el residuo D18 se muestran con un asterisco verde.
Las figuras 3A y 3B ilustran la obtencion de imagenes funcional con bioconjugados de CTX modificada representativa:Cy5.5 de la divulgacion (figura 3A, K15A_K23A CTX:Cy5.5; y figura 3B, K15R_K23R CTX:Cy5.5). A ratones que portaban tumor WT o ND2:SmoA1 se les inyectaron 50 pl de bioconjugado modificado 40 pM a traves de la vena de la cola. Se tomaron imagenes biofotonicas tres dlas tras la inyeccion utilizando el sistema Xenogen Spectrum. Se congelaron los cerebros en OCT, se cortaron en secciones de 12 pm y se tineron con H&E para determinar la carga tumoral.
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DESCRIPCION DETALLADA DE LA DIVULGACION
La presente divulgacion proporciona variantes de clorotoxina, conjugados preparados a partir de las variantes de clorotoxina, composiciones que incluyen las variantes o conjugados de clorotoxina, y metodos para utilizar las variantes, conjugados y composiciones de clorotoxina.
En un aspecto, la divulgacion proporciona variantes de clorotoxina. Tal como se utiliza en la presente, el termino "variante de clorotoxina " se utiliza de manera intercambiable con el termino "peptido de clorotoxina modificado" y se refiere a un polipeptido no nativo que presenta al menos algunas de las actividades utiles de clorotoxina nativa. La clorotoxina es un polipeptido que se produce de manera natural que comprende 36 aminoacidos y que tiene la secuencia de aminoacidos expuesta en SEQ ID NO: 1.
El termino "peptido de clorotoxina modificado" se refiere a un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos en la que uno o mas de los residuos de aminoacido de clorotoxina nativa estan sustituidos (es decir, remplazados) por un residuo de aminoacido distinto del de la clorotoxina nativa en esa posicion. Por ejemplo, los residuos 15 y 23 de clorotoxina nativa son residuos de lisina; en determinados casos de la divulgacion, se proporcionan peptidos de clorotoxina modificados que tienen residuos de alanina o arginina en las posiciones 15 y 23.
En un caso, la divulgacion proporciona un peptido de clorotoxina modificado que tiene un unico residuo de lisina (Lys 27). En este caso, el peptido de clorotoxina modificado tiene Lys 15 y Lys 23 de clorotoxina nativa sustituidos por un aminoacido distinto de lisina para proporcionar una clorotoxina modificada que tiene un unico residuo de lisina (Lys 27). En este caso, el peptido de clorotoxina modificado tiene la secuencia de aminoacidos expuesta en SEQ ID NO: 2, en la que Lys 15 y Lys 23 estan sustituidos por un aminoacido seleccionado independientemente del grupo que consiste en aminoacidos que se producen de manera natural y no naturales, analogos de aminoacidos y mimeticos de aminoacidos.
Los aminoacidos que se producen de manera natural son los veinte L-aminoacidos comunmente encontrados en protelnas que se producen de manera natural (Ala o A, Cys o C, Asp o D, Glu o E, Phe o F, Gly o G, His o H, Ile o I, Lys o K, Leu o L, Met o M, Asn o N, Pro o P, Gln o Q, Arg o R, Ser o S, Thr o T, Val o V, Trp o W, Tyr o Y). Los aminoacidos no naturales incluyen los D-aminoacidos. Los analogos de aminoacidos y mimeticos de aminoacidos funcionan de una manera similar a los aminoacidos que se producen de manera natural. Los analogos de aminoacidos se refieren a compuestos que tienen la misma estructura qulmica basica que un aminoacido que se produce de manera natural, unicamente a modo de ejemplo, un carbono a que esta unido a un hidrogeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R. Tales analogos pueden tener grupos R modificados (a modo de ejemplo, norleucina) o pueden tener estructuras principales peptldicas modificadas, al tiempo que todavla conservan la misma estructura qulmica basica que un aminoacido que se produce de manera natural. Los ejemplos no limitativos de analogos de aminoacidos incluyen homoserina, norleucina, sulfoxido de metionina, metilsulfonio de metionina.
En un caso, Lys 15 y/o Lys 23 se remplazan independientemente por un aminoacido basico (es decir, His, Arg), aminoacido no natural, analogo de aminoacido o mimetico de aminoacido.
En un caso, Lys 15 y/o Lys 23 se remplazan independientemente por un aminoacido no polar (hidrofobo) (es decir, Ala, Phe, Ile, Leu, Met, Pro, Val, Trp), aminoacido no natural relacionado, analogo de aminoacido o mimetico de aminoacido.
En un caso, Lys 15 y/o Lys 23 se remplazan independientemente por un aminoacido polar (no cargado) (es decir, Cys, Gly, Asn, Gln, Ser, Thr, Tyr), aminoacido no natural, analogo de aminoacido o mimetico de aminoacido.
En un caso, Lys 15 y/o Lys 23 se remplazan independientemente por un aminoacido acido (es decir, Glu, Asp), aminoacido no natural, analogo de aminoacido o mimetico de aminoacido.
En un caso, el peptido de clorotoxina modificado tiene Lys 15 y Lys 23 sustituidos por alanina (K15A_K23A CTX). En este caso, el peptido de clorotoxina modificado tiene la secuencia de aminoacidos expuesta en SEQ ID NO: 3.
En un caso, el peptido de clorotoxina modificado tiene Lys 15 y Lys 23 sustituidos por arginina (K15R_K23R CTX). En este caso, el peptido de clorotoxina modificado tiene la secuencia de aminoacidos expuesta en SEQ ID NO: 4.
En un caso, el peptido de clorotoxina modificado tiene Lys 15 sustituido por alanina y Lys 23 sustituido por arginina (K15A_K23R cTx). En este caso, el peptido de clorotoxina modificado tiene la secuencia de aminoacidos expuesta en SEQ ID NO: 5.
En otro caso, el peptido de clorotoxina modificado tiene Lys 15 sustituido por arginina y Lys 23 sustituido por alanina (K15R_K23A CTX). En este caso, el peptido de clorotoxina modificado tiene la secuencia de aminoacidos expuesta en SEQ ID NO: 6.
En otro aspecto de la divulgacion, se proporcionan composiciones que incluyen los peptidos de clorotoxina modificados. La composicion puede incluir un portador o diluyente farmaceuticamente aceptable para la administracion del peptido de
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clorotoxina modificado. Los portadores o diluyentes farmaceuticamente aceptables adecuados incluyen solucion salina o dextrosa para inyeccion.
Metodos de tratamiento. En un aspecto adicional, la divulgacion proporciona un metodo para tratar una enfermedad o un estado que puede tratarse mediante la administration de clorotoxina. En un caso, el metodo incluye administrar una cantidad eficaz de un peptido de clorotoxina modificado de la divulgacion a un sujeto que lo necesita.
El termino "cantidad eficaz", tal como se utiliza en la presente, se refiere a una cantidad suficiente de un agente o un compuesto que se administra que aliviara en cierto grado uno o mas de los slntomas de la enfermedad o el estado que esta tratandose. El resultado puede ser la reduction y/o el alivio de los signos, slntomas o causas de una enfermedad, o cualquier otra alteration deseada de un sistema biologico. Pueden administrarse composiciones que contienen tales agentes o compuestos para tratamientos profilacticos, de potenciacion y/o terapeuticos. Una cantidad "eficaz" apropiada en cualquier caso individual puede determinarse utilizando tecnicas, tales como un estudio de aumento a escala de la dosis.
En un caso, la divulgacion proporciona un metodo para tratar un cancer que expresa sitios de union a clorotoxina en un paciente, que comprende administrar a un paciente que lo necesita una cantidad eficaz de una variante de clorotoxina de la divulgacion.
En un caso, la divulgacion proporciona un metodo para tratar un cancer que expresa sitios de union a clorotoxina, que comprende administrar a un paciente que lo necesita una cantidad eficaz de una composition farmaceutica que comprende una variante de clorotoxina de la divulgacion y un portador farmaceuticamente aceptable.
En un caso, la divulgacion proporciona un metodo para tratar un tumor que expresa sitios de union a clorotoxina, que comprende administrar a un paciente que lo necesita una cantidad eficaz de una variante de clorotoxina de la divulgacion.
En un caso, la divulgacion proporciona un metodo para inhibir la actividad invasiva de celulas que expresan sitios de union a clorotoxina, que comprende administrar una cantidad eficaz de una variante de clorotoxina a celulas que expresan sitios de union a clorotoxina.
Los metodos de tratamiento de la divulgacion son aplicables a sujetos humanos y animales que necesitan tal tratamiento.
Practicamente cualquier tipo de cancer maligno que expresa sitios de union a clorotoxina puede tratarse mediante las variantes y los conjugados de clorotoxina de la divulgacion. Estos canceres malignos incluyen gliomas, astrocitomas, meduloblastomas, carcinomas de plexos coroideos, ependimomas, meningioma, glioblastoma, ganglioma, feocromocitoma y tumores cerebrales metastasicos, otros tumores cerebrales, neuroblastoma, cancer de cabeza y cuello, cancer de pulmon de celulas pequenas, cancer de mama, cancer intestinal, cancer pancreatico, cancer de colon, cancer de hlgado, cancer de rinon, cancer de piel, sarcomas (mas de 30 tipos), osteosarcoma, rabdomiosarcoma, sarcoma de Ewing, carcinomas, melanomas, cancer de ovarios, cancer de cuello uterino, linfoma, cancer de tiroides, cancer anal, cancer colorrectal, cancer endometrial, tumores de celulas germinales, cancer de laringe, mieloma multiple, cancer de prostata, retinoblastoma, cancer gastrico, cancer testicular y tumor de Wilm.
Conjugados de clorotoxina. En otro aspecto, la divulgacion proporciona conjugados de los peptidos de clorotoxina modificados de la divulgacion. En un caso, los conjugados comprenden un peptido de clorotoxina modificado de la divulgacion acoplado covalentemente a un resto que aumenta la semivida en circulation del peptido de clorotoxina modificado. En otro caso, los conjugados comprenden un peptido de clorotoxina modificado de la divulgacion acoplado covalentemente a un agente terapeutico, de diagnostico, de obtencion de imagenes o de direccionamiento. En determinados casos, el agente terapeutico, de diagnostico, de obtencion de imagenes o de direccionamiento, o resto que aumenta la semivida en circulacion del peptido de clorotoxina modificado se acopla covalentemente a traves del residuo de lisina del peptido.
Los restos adecuados que aumentan la semivida en circulacion del peptido de clorotoxina modificado incluyen los conocidos en la tecnica para aumentar la semivida en circulacion de polipeptidos (p. ej., pegilacion, glicosilacion, glicopegilacion). Los restos representativos para pegilacion incluyen poli(oxidos de alquileno) (poli(oxidos de etileno), poli(oxidos de propileno), y copollmeros de poli(oxidos de etileno) y poli(oxidos de propileno)). Los restos representativos para la glicosilacion incluyen oligosacaridos (p. ej., carbohidratos incluyendo acidos polisialicos). En un caso, el conjugado es una clorotoxina pegilada y comprende un peptido de clorotoxina modificado acoplado covalentemente a uno o mas poli(oxidos de alquileno) (p. ej., poli(oxido de etileno)). En un caso, el conjugado es una clorotoxina glicosilada y comprende un peptido de clorotoxina modificado acoplado covalentemente a uno o mas oligosacaridos. En un caso, el conjugado es una clorotoxina glicopegilada y comprende un peptido de clorotoxina modificado acoplado covalentemente a uno o mas glico-poli(oxidos de alquileno)(p. ej., glico-poli(oxido de etileno)).
Los agentes terapeuticos adecuados incluyen agentes citotoxicos. Los agentes terapeuticos representativos incluyen agentes quimioterapicos tales como metotrexato, docetaxel, cisplatino y etoposido, entre otros; agentes terapeuticos
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biologicos tales como moleculas de acido nucleico (p. ej., ADN tal como ADNc, y ARN tal como ARNip, ARNhp, iARN) incluyendo inhibidores de transcripcion y translocacion, y los moduladores de transduccion de senal.
Los agentes de diagnostico adecuados incluyen agentes que proporcionan la deteccion mediante metodos de fluorescencia as! como metodos distintos de la obtencion de imagenes por fluorescencia. Otros agentes de diagnostico adecuados incluyen radiomarcadores (p. ej., compuestos marcados con radioisotopos) tales como 125I, 14C y 31P, entre otros; y agentes de obtencion de imagenes por resonancia magnetica.
Los agentes de direccionamiento adecuados incluyen anticuerpos, polipeptidos, polisacaridos y acidos nucleicos.
En otro aspecto de la divulgacion, se proporcionan composiciones que incluyen los conjugados de peptido de clorotoxina modificado. La composicion puede incluir un portador o diluyente farmaceuticamente aceptable para la administracion del conjugado de peptido de clorotoxina modificado. Los portadores o diluyentes farmaceuticamente aceptables adecuados incluyen solucion salina o dextrosa para inyeccion.
Metodos de obtencion de imagenes. En un aspecto adicional de la divulgacion, se proporcionan metodos de utilizar los conjugados de peptido de clorotoxina modificado. En un caso, la divulgacion proporciona un metodo para obtener imagenes de un tejido del que pueden obtenerse imagenes mediante clorotoxina. En el metodo, se pone en contacto un tejido del que pueden obtenerse imagenes mediante clorotoxina con un conjugado de clorotoxina.
En un caso, el metodo de obtencion de imagenes es un metodo de de obtencion de imagenes por fluorescencia. Se describen metodos representativos para preparar y utilizar conjugados de clorotoxina fluorescentes en la publicacion de solicitud de patente estadounidense n.° 20080279780 A1, Fluorescent Chlorotoxin Conjugate and Method for IntraOperative Visualization of Cancer.
La presente divulgacion proporciona un conjugado de clorotoxina que puede detectarse mediante obtencion de imagenes por fluorescencia que permite la visualizacion intraoperatoria de tejidos cancerosos, composiciones que incluyen el conjugado de clorotoxina y metodos para utilizar el conjugado de clorotoxina.
En un aspecto, la presente divulgacion proporciona un conjugado de clorotoxina que puede detectarse mediante obtencion de imagenes por fluorescencia que permite la visualizacion intraoperatoria de tejidos cancerosos.
La clorotoxina es un agente de direccionamiento que dirige el conjugado a un tejido de interes. En un caso, el conjugado de clorotoxina de la divulgacion incluye uno o mas restos fluorescentes (p. ej., restos fluorescentes de emision en rojo o en el infrarrojo cercano) acoplados covalentemente a la clorotoxina.
Tal como se utiliza en la presente, el termino "resto fluorescente que emite en rojo o en el infrarrojo cercano" se refiere a un resto fluorescente que tiene un maximo de emision de fluorescencia superior a aproximadamente 600 nm. Los conjugados de clorotoxina fluorescentes que tienen restos fluorescentes que emiten a una longitud de onda mas corta (p. ej., de desde aproximadamente 500 hasta aproximadamente 600 nm) son utiles en la obtencion de imagenes histoqulmica. Estos conjugados pueden ser menos utiles para la obtencion de imagenes in vivo en seres humanos y animales en la que se prefieren restos fluorescentes que emiten a una longitud de onda mas larga (p. ej., superior a aproximadamente 600 nm).
En determinados casos del conjugado de clorotoxina, los restos fluorescentes se derivan de compuestos fluorescentes caracterizados por maximos de longitud de onda de emision superiores a aproximadamente 600 nm para evitar autofluorescencia, emision que se desplaza a traves de millmetros a un centlmetro de tejido/sangre/llquidos, emision que no se absorbe por hemoglobina, otros componentes sangulneos, o protelnas en tejido humano o animal.
El resto fluorescente esta acoplado covalentemente a la clorotoxina para permitir la visualizacion del conjugado mediante obtencion de imagenes por fluorescencia. El resto fluorescente se deriva de un compuesto fluorescente. Compuestos fluorescentes adecuados son aquellos que pueden acoplarse covalentemente a una clorotoxina sin afectar de manera sustancialmente adversa a la funcion de direccionamiento y union del conjugado de clorotoxina. De manera similar, los compuestos fluorescentes adecuados conservan sus propiedades fluorescentes tras la conjugation con la clorotoxina.
En un caso, el resto fluorescente es un resto de cianina. Los compuestos de cianina se caracterizan por sus coeficientes de extincion relativamente altos y rendimientos cuanticos de fluorescencia favorables. El maximo de longitud de onda de emision de fluorescencia para un compuesto de cianina varla como funcion de la estructura de cianina. Dependiendo del compuesto de cianina particular, los maximos de longitud de onda de emision de fluorescencia pueden variar desde el verde (aproximadamente 490 nm) hasta el infrarrojo cercano (aproximadamente 740 nm). En la practica de los metodos de la divulgacion, se prefieren compuestos de cianina que tienen maximos de emision de fluorescencia del rojo lejano (aproximadamente 650 nm) al infrarrojo cercano (aproximadamente 750 nm). A estas longitudes de onda de emision, la fluorescencia de fondo del entorno local es minima y los tejidos de interes son relativamente transparentes. Debido a la transparencia relativa de los tejidos de interes a estas longitudes de onda, la visualizacion por excitation y emision de fluorescencia se maximiza y pueden observarse cantidades relativamente mayores de tejido seleccionado como diana
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por el conjugado de la divulgacion en comparacion con otros conjugados que utilizan compuestos fluorescentes que tienen emision a longitudes de onda mas cortas (menos de 600 nm).
Las cianinas adecuadas incluyen los fluoros CYDYE comercialmente disponibles de GE Healthcare con la denominacion Cy2 (506 nm); Cy2 (506 nm); Cy3 (570 nm); Cy3B (572 nm); Cy3.5 (596 nm); Cy5 (670 nm); Cy5.5 (675 nm); y Cy7 (694 nm) (maximos de emision entre parentesis). En un caso, el compuesto de cianina es Cy5.5.
En un caso, el resto fluorescente es un resto de xanteno sulfonado. Se describen compuestos de xanteno sulfonados adecuados para su utilizacion en la practica de la divulgacion en la patente estadounidense n.° 6,130,101 y estan comercialmente disponibles con la denominacion ALEXA FLUOR de Molecular Probes, Inc., Eugene, OR. ALEXA FLUOR es la denominacion para una familia de fluoroforos que se caracterizan por sus coeficientes de extincion relativamente altos y rendimientos cuanticos de fluorescencia favorables. El maximo de longitud de onda de emision de fluorescencia para un compuesto de xanteno sulfonado varla como funcion de la estructura del compuesto. Dependiendo del compuesto de xanteno sulfonado particular, los maximos de longitud de onda de emision de fluorescencia pueden variar desde el verde (aproximadamente 450 nm) hasta el infrarrojo cercano (aproximadamente 780 nm). En la practica de los metodos de la divulgacion, se prefieren compuestos de ALEXA FLUOR que tienen maximos de emision de fluorescencia del rojo lejano (aproximadamente 650 nm) al infrarrojo cercano (aproximadamente 750 nm).
Los compuestos de xanteno sulfonado adecuados incluyen ALEXA FLUORS, tales como ALEXA FLUOR 350 (442 nm), ALEXA FLUOR 405 (421 nm), ALEXA FLUOR 488 (539 nm), ALEXA FLUOR 500 (525 nm), ALEXA FLUOR 514 (540 nm), ALEXA FLUOR 532 (554 nm), ALEXA FLUOR 546 (575 nm), ALEXA FLUOR 555 (565 nm), ALEXA FLUOR 568 (603 nm), ALEXA FLUOR 594 (617 nm), ALEXA FLUOR 610 (628 nm), ALEXA FLUOR 633 (647 nm), ALEXA FLUOR 635 (645 nm), ALEXA FLUOR 647 (668 nm), ALEXA FLUOR 660 (690 nm), ALEXA FLUOR 680 (702 nm), ALEXA FLUOR 700 (719 nm), y ALEXA FLUOR 750 (779 nm) (maximos de emision entre parentesis). En un caso, el xanteno sulfonado es ALEXA FLUOR 680. Pueden prepararse conjugados de xanteno sulfonado-clorotoxina de una manera analoga a la descrita en The Handbook - A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, Richard P. Haugland (Molecular Probes, Inc., una filial de Invitrogen Corp.).
Otros fluoroforos de NIR adecuados utiles en la divulgacion incluyen DyLight-680, DyLight-750, VivoTag-750, DyLight- 800, IRDye-800, VivoTag-680, y verde de indocianina.
Los peptidos de clorotoxina modificados de la divulgacion tambien pueden acoplarse a puntos cuanticos y puntos polimericos.
Los compuestos fluorescentes adecuados incluyen un grupo funcional que hace que el compuesto sea qulmicamente reactivo frente a la clorotoxina. Los grupos funcionales adecuados incluyen el grupo N-hidroxisuccinimida (NHS) para el acoplamiento covalente a grupos amina, el grupo maleimida para el acoplamiento covalente a grupos tiol, y el grupo hidrazida para el acoplamiento covalente a grupos aldehldo. Preferiblemente, el compuesto fluorescente util en la preparacion del conjugado de la divulgacion incluye un unico grupo funcional reactivo (p. ej., mono-ester de NHS). Se apreciara que otras qulmicas de conjugacion son adecuadas para preparar el conjugado de clorotoxina de la presente divulgacion.
Los conjugados adecuados de la divulgacion incluyen desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 3 restos fluorescentes/clorotoxina. En un caso, el conjugado incluye aproximadamente 1 resto fluorescente.
En otro aspecto de la divulgacion, se proporcionan composiciones que incluyen el conjugado de clorotoxina. La composition es adecuada para su administration a un ser humano y sujetos animales e incluye un portador farmaceuticamente aceptable. La composicion incluye una cantidad farmacologicamente eficaz de un conjugado de clorotoxina modificada. Una cantidad eficaz puede determinarse de manera rutinaria mediante procedimientos establecidos. Una cantidad eficaz es una cantidad suficiente para ocupar sitios de union a clorotoxina en celulas cancerosas, pero lo bastante baja como para minimizar la union no especlfica a tejidos no neoplasicos. Una cantidad eficaz optimiza la relation senal-ruido para la obtencion de imagenes intraoperatoria.
La divulgacion proporciona metodos para detectar un tejido utilizando los conjugados de clorotoxina. Los conjugados de clorotoxina de la divulgacion seleccionan como diana, y se unen a, sitios de union a clorotoxina. Se apreciara que los sitios de union a clorotoxina pueden adoptar dos formas: sitios que se unen a clorotoxina y sitios que se unen a los conjugados de clorotoxina de la divulgacion. Se apreciara que los sitios de union a clorotoxina pueden ser distintos de los sitios de union a conjugado de clorotoxina.
En un caso, se proporciona un metodo para diferenciar focos de canceres que expresan sitios de union a clorotoxina de tejido no neoplasico. El metodo incluye las etapas de:
(a) poner en contacto un tejido de interes con un conjugado de clorotoxina que tiene afinidad y especificidad por celulas que expresan sitios de union a clorotoxina, en el que el conjugado de clorotoxina comprende
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uno o mas restos fluorescentes que emiten en rojo o en el infrarrojo cercano acoplados covalentemente a una clorotoxina; y
(b) medir el nivel de union del conjugado de clorotoxina, en el que un nivel de union elevado, con respecto a tejido normal, es indicativo de que el tejido es neoplasico.
En un caso, se proporciona un metodo para detectar canceres que expresan sitios de union a clorotoxina. El metodo incluye las etapas de:
(a) poner en contacto un tejido de interes con un conjugado de clorotoxina que tiene afinidad y especificidad por celulas que expresan sitios de union a clorotoxina, en el que el conjugado de clorotoxina comprende uno o mas restos fluorescentes que emiten en rojo o en el infrarrojo cercano acoplados covalentemente a una clorotoxina; y
(b) medir el nivel de union del conjugado de clorotoxina, en el que un nivel de union elevado, con respecto a tejido normal, es indicativo de que el tejido es neoplasico.
En un caso, se proporciona un metodo para determinar la ubicacion de celulas cancerosas que expresan sitios de union a clorotoxina en un paciente de manera intraoperatoria. El metodo incluye las etapas de:
(a) administrar una composicion farmaceutica a un paciente, en el que la composition farmaceutica comprende un portador farmaceuticamente aceptable y una cantidad de un conjugado de clorotoxina suficiente para obtener imagenes de celulas cancerosas que expresan sitios de union a clorotoxina in vivo, en el que el conjugado de clorotoxina comprende uno o mas restos fluorescentes que emiten en rojo o en el infrarrojo cercano acoplados covalentemente a una clorotoxina;
(b) medir el nivel de union del conjugado de clorotoxina mediante obtencion de imagenes por fluorescencia para determinar la ubicacion de celulas cancerosas que expresan sitios de union a clorotoxina, en el que un nivel de union elevado, con respecto a tejido normal, es indicativo de la presencia de celulas cancerosas que expresan sitios de union a clorotoxina; y
(c) eliminar quirurgicamente del paciente al menos algunas celulas que expresan sitios de union a clorotoxina localizadas mediante obtencion de imagenes por fluorescencia.
Los metodos de obtencion de imagenes de la divulgation para la detection de focos de cancer son aplicables a modelos de raton y de otros animales de cancer as! como a la practica veterinaria.
El conjugado de clorotoxina fluorescente de la divulgacion puede incluir otros agentes utiles. Otros agentes utiles incluyen agentes de diagnostico y agentes terapeuticos.
En otro caso, el metodo de obtencion de imagenes es un metodo de obtencion de imagenes por resonancia magnetica. Se describen metodos representativos para preparar y utilizar conjugados de clorotoxina en obtencion de imagenes por resonancia magnetica en la publication de solicitud de patente estadounidense n.° 200701254965 A1, Chlorotoxin- Labeled Nanoparticle Compositions and Methods for Targeting Primary Brain Tumors.
La presente divulgacion proporciona nanopartlculas marcadas con clorotoxina que pueden seleccionar tumores cerebrales primarios como diana, composiciones que incluyen las nanopartlculas, metodos de obtencion de imagenes de tejidos utilizando las nanopartlculas y metodos para tratar celulas que expresan sitios de union a clorotoxina utilizando las nanopartlculas.
En un aspecto, la divulgacion proporciona una partlcula marcada con clorotoxina que comprende:
(a) un nucleo que tiene una superficie, comprendiendo el nucleo un material que tiene actividad de obtencion de imagenes por resonancia magnetica;
(b) un peptido de clorotoxina modificado; y
(c) un grupo de union que acopla covalentemente el peptido de clorotoxina modificado a la superficie.
El nucleo incluye un material que tiene actividad de obtencion de imagenes por resonancia magnetica. Los materiales adecuados que tienen actividad de obtencion de imagenes por resonancia magnetica incluyen oxidos de metal, tales como oxido ferroso, oxido ferrico, oxido de silicio, oxido de silicio policristalino, oxido de aluminio, oxido de germanio, seleniuro de zinc, dioxido de estano, dioxido de titanio, oxido de indio y estano, y oxido de gadolinio. Pueden utilizarse mezclas de uno o mas oxidos de metales.
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Ademas de materiales magneticos, el nucleo puede incluir materiales no magneticos, tales como nitruro de silicio, acero inoxidable, titanio, boro, carburo de boro, mezclas de boro y carbono, y nlquel-titanio. Tambien pueden utilizarse mezclas de uno o mas materiales no magneticos.
Las partlculas de la divulgacion incluyen desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 100 clorotoxinas modificadas/partlcula. En un caso, las partlculas incluyen desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 50 clorotoxinas modificadas/partlcula. En un caso, las partlculas incluyen aproximadamente 10 clorotoxinas modificadas/partlcula. En un caso, las partlculas incluyen de aproximadamente 50 hasta aproximadamente 100 clorotoxinas modificadas/partlcula.
Tal como se indico anteriormente, la nanopartlcula magnetica de la divulgacion incluye una clorotoxina que sirve como resto de direccionamiento que es eficaz para dirigir la nanopartlcula a celulas que expresan sitios de union a clorotoxina en los que se une la nanopartlcula. Las celulas de tumor cerebral primario (p. ej., celulas de tumor neuroectodermico y celulas de glioma) incluyen sitios de union a clorotoxina.
Las nanopartlculas marcadas con clorotoxina pueden incluir ademas otros agentes utiles. Otros agentes utiles incluyen agentes de diagnostico.
Los agentes de diagnostico adecuados incluyen agentes que proporcionan la detection de la nanopartlcula mediante metodos distintos de la obtencion de imagenes por resonancia magnetica. Los agentes de diagnostico adecuados incluyen compuestos emisores de luz (p. ej., fluoroforos, fosforos y luminoforos). Los fluoroforos adecuados incluyen los indicados anteriormente.
En un caso, la partlcula marcada con clorotoxina comprende ademas un resto fluorescente. Las partlculas de la divulgacion incluyen desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 10 restos fluorescentes/partlcula. En un caso, las partlculas incluyen desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 2 restos fluorescentes/partlcula.
En un caso, el resto fluorescente se selecciona de restos fluorescentes que emiten en rojo y en el infrarrojo cercano (es decir, restos fluorescentes que tienen maximos de emision superiores a aproximadamente 600 nm). En un caso, el resto fluorescente es un resto de cianina. En un caso, el resto fluorescente es un resto de Cy5.5.
Otros agentes de diaanostico adecuados incluyen radiomarcadores (p. ej., compuestos marcados con radioisotopos) tales como 125I, 14C y 31P, entre otros.
En otro aspecto de la divulgacion, se proporcionan composiciones que incluyen las partlculas de la divulgacion. En un caso, la composition incluye una nanopartlcula adecuada para su administration a un ser humano o un sujeto animal. La composicion puede incluir un portador aceptable. En un caso, la composicion es una composicion farmaceuticamente aceptable e incluye un portador farmaceuticamente aceptable. Tal como se utiliza en la presente el termino "portador" se refiere a un diluyente (p. ej., solution salina) para facilitar la administracion de las partlculas.
En otros aspectos, la divulgacion proporciona metodos para utilizar nanopartlculas.
En un caso, la divulgacion proporciona un metodo para diferenciar celulas de tumor neuroectodermico de tejido cerebral no neoplasico. En el metodo, las celulas de tumor neuroectodermico se diferencian de tejido cerebral no neoplasico mediante:
(a) poner en contacto un tejido de interes con una nanopartlcula marcada con clorotoxina que tiene afinidad y especificidad por celulas de tumor neuroectodermico; y
(b) medir el nivel de union de la nanopartlcula marcada con clorotoxina, en el que un nivel de union elevado, con respecto a tejido normal, es indicativo de que el tejido es neoplasico.
En un caso, la divulgacion proporciona un metodo para detectar celulas de tumor neuroectodermico. En el metodo, se detectan celulas de tumor neuroectodermico mediante:
(a) poner en contacto un tejido de interes con una nanopartlcula marcada con clorotoxina que tiene afinidad y especificidad por celulas de tumor neuroectodermico; y
(b) medir el nivel de union de la nanopartlcula marcada con clorotoxina, en el que un nivel de union elevado, con respecto a tejido normal, es indicativo de que el tejido es neoplasico.
Los metodos anteriores son utiles en la diferenciacion y deteccion de celulas de glioma.
En los metodos anteriores, medir el nivel de union de la nanopartlcula marcada con clorotoxina comprende obtener imagenes por resonancia magnetica.
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En determinados casos de los metodos anteriores, la nanopartlcuia marcada con clorotoxina comprende ademas un resto fluorescente. En estos casos, medir el nivel de union de la nanopartlcuia marcada con clorotoxina puede incluir obtener imagenes por fluorescencia.
En un caso, la divulgacion proporciona un metodo para determinar la ubicacion de celulas de glioma en un paciente de manera preoperatoria, intraoperatoria y posoperatoria. El metodo incluye las etapas de:
(a) administrar una composicion farmaceutica a un paciente, en el que la composicion farmaceutica comprende un portador farmaceuticamente aceptable y una cantidad de una nanopartlcula marcada con fluoroforo/clorotoxina suficiente para obtener imagenes de celulas de glioma in vivo;
(b) medir el nivel de union de la nanopartlcula marcada con fluoroforo/clorotoxina mediante obtencion de imagenes por resonancia magnetica de manera preoperatoria para determinar la ubicacion de celulas de glioma, en el que un nivel de union elevado, con respecto a tejido normal, es indicativo de la presencia de celulas de glioma;
(c) eliminar quirurgicamente del paciente al menos algunas celulas de glioma localizadas mediante obtencion de imagenes por resonancia magnetica;
(d) medir el nivel de union de la nanopartlcula marcada con fluoroforo/clorotoxina mediante obtencion de imagenes por fluorescencia de manera intraoperatoria para determinar la ubicacion de celulas de glioma residuales, en el que un nivel de union elevado, con respecto a tejido normal, es indicativo de la presencia de celulas de glioma residuales;
(e) eliminar quirurgicamente del paciente al menos algunas celulas de glioma residuales localizadas mediante obtencion de imagenes por fluorescencia; y
(f) medir el nivel de union de la nanopartlcula marcada con fluoroforo/clorotoxina mediante obtencion de imagenes por resonancia magnetica de manera posoperatoria para determinar la ubicacion de celulas de glioma, en el que un nivel de union elevado, con respecto a tejido normal, es indicativo de la presencia de celulas de glioma.
En el metodo, una cantidad de una nanopartlcula marcada con fluoroforo/clorotoxina suficiente para obtener imagenes de celulas de glioma in vivo es una cantidad de desde aproximadamente 1-20 mg de Fe/kg de peso corporal ("Fe" se refiere a hierro presente en el nucleo de la partlcula).
En el metodo anterior, las etapas (d) y (e) pueden repetirse.
El metodo anterior incluye obtencion de imagenes de manera preoperatoria, intraoperatoria, y posoperatoria. Se apreciara que las variaciones del metodo anterior estan dentro del alcance de la divulgacion. Otras variaciones del metodo incluyen, por ejemplo, (1) obtener imagenes unicamente de manera preoperatoria; (2) obtener imagenes unicamente de manera intraoperatoria; (3) obtener imagenes unicamente de manera posoperatoria; (4) obtener imagenes unicamente de manera preoperatoria e intraoperatoria; (5) obtener imagenes unicamente de manera preoperatoria y posoperatoria; y (6) obtener imagenes unicamente de manera intraoperatoria y posoperatoria.
La divulgacion proporciona metodos para tratar un tejido utilizando las nanopartlculas.
En un caso, la divulgacion proporciona un metodo para tratar un glioma en un paciente, que comprende administrar a un paciente que lo necesita una cantidad eficaz de una composicion farmaceutica que comprende una nanopartlcula marcada con clorotoxina y un portador farmaceuticamente aceptable.
En un caso, la divulgacion proporciona un metodo para tratar un tumor neuroectodermico, que comprende administrar a un paciente que lo necesita una cantidad eficaz de una composicion farmaceutica que comprende una nanopartlcula marcada con clorotoxina y un portador farmaceuticamente aceptable.
En un caso, la divulgacion proporciona un metodo para inhibir la actividad invasiva de celulas neoplasicas, que comprende administrar a celulas neoplasicas una cantidad eficaz de una composicion farmaceutica que comprende una nanopartlcula marcada con clorotoxina y un portador farmaceuticamente aceptable.
A continuacion se describen tres peptidos de clorotoxina modificados representativos de la divulgacion y sus propiedades, conjugados de los peptidos y sus propiedades, y utilizacion de los conjugados en la obtencion de imagenes.
Preparacion de peptidos de clorotoxina modificados. En la figura 1 se muestran secuencias de dos peptidos de clorotoxina modificados (CTX) representativos de la divulgacion (clorotoxina sustituida con alanina, K15A_k23A-CTX; clorotoxina sustituida con arginina, K15R_K23R-CTX). Se sintetizaron los peptidos utilizando qulmica de neutralization in situ con Boc (terc-butoxicarbonil)/HBTU [hexafluorofosfato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio]. Se utilizo una solution de tampon de Tris-HCl 0.1 M, NaCl 0.2 M, glutation reducido 5 mM / glutation oxidado 0.5 mM con
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un pH de 7.8 tanto para oxidar los peptidos sustituidos como para ciclizar y oxidar CTX a temperatura ambiente durante la noche. Se utilizo RP-HPLC para purificar los peptidos, y se confirmaron la pureza y las masas moleculares de los dos analogos de CTX, K15A_K23A-CTX y K15R_K23R-CTX, mediante RP-HPLC analltica y ES-EM.
Asignacion de RMN. Se disolvieron los peptidos en el 90% de H2O y el 10% de D2O, y se registraron espectros unidimensionales y bidimensionales de TOCSY y NOESY a 600 MHz a 298 °K. Se asignaron los espectros de RMN utilizando tecnicas bien establecidas (K. Wuthrich, "NMR of Proteins and Nucleic Acids", Wiley-Interscience, Nueva York, 1986). Los desplazamientos qulmicos en la region de la amida estan bien dispersados, lo que confirma que los peptidos estan correctamente plegados, y la region de huella en el espectro de NOESY de cada peptido muestra un ciclo completo de conectividades secuenciales aH-NH con la excepcion de los dos residuos de prolina (Pro4 y Pro31). Sin embargo, tal como se esperaba, se observaron NOE a partir de los protones 5 de los residuos de prolina y sus residuos anteriores. En la figura 2 se muestra una comparacion de desplazamientos qulmicos de aH secundarios de CTX nativa y los analogos sintetizados.
Caracterizacion de bioconjugados de CTX sustituida. Se conjugaron los peptidos nativos y modificados con Cy5.5 y se purificaron tal como se describe a continuation en los ejemplos. Se analizaron los bioconjugados resultantes mediante HPLC y espectrometrla de masas. Tal como se predice, las sustituciones de Ala y Arg solo dieron como resultado bioconjugados de CTX monomarcada:Cy5.5.
Evaluation funcional de CTX sustituida:Cy5.5. Los posibles beneficios de la sustitucion dependen de si la actividad de direccionamiento funcional de los peptidos es comparable con los bioconjugados de CTX nativa. Se sometio a ensayo la capacidad de cada peptido para dirigir la senal de Cy5.5 de manera preferible a celulas de meduloblastoma, con respecto a cerebro normal, mediante obtencion de imagenes biofotonicas. En cada caso, se inyectaron 50 pL de bioconjugado 40 pM en la vena de la cola de ratones que mostraron signos cllnicos congruentes con tumores cerebrales avanzados. Tras tres dlas se sacrificaron los ratones y se obtuvieron imagenes de sus cerebros utilizando el sistema de obtencion de imagenes biofotonico Caliper/Xenogen Spectrum. Todos los conjugados de peptidos modificados iluminaron de manera preferible tejido de cancer de meduloblastoma en comparacion con cerebro normal (figuras 3A y 3B). En todos los casos, se comparo la senal en el tumor con la senal en el cerebelo de animales de control que recibieron inyeccion que no tenlan meduloblastoma. La senal en el tumor en comparacion con la normal fue de 1.96 +/- 0.47 para cTx nativa:Cy5.5 (n =10); 3.3 +/- 1.8 para la sustitucion con Ala (n = 8) y 2.6 +/- 0.85 para la sustitucion con Arg (n = 5). Estadlsticamente, ninguno de los bioconjugados de peptidos modificados podia distinguirse de CTX nativa:Cy5.5 lo que indica que las sustituciones de lisina no interferlan con la union de CTX a su diana.
Ventajas de la divulgation. Cuando se hace avanzar un nuevo producto terapeutico hacia ensayos cllnicos con seres humanos, se tiene en cuenta no solo la eficacia, farmacocinetica, farmacodinamia y toxicidad, sino tambien cuestiones practicas que pueden poner en peligro la aprobacion normativa o aumentar los costes de fabrication. La pintura tumoral, un bioconjugado que ilumino de manera segura y eficaz tumores solidos en modelos de raton, planteo un desafio de fabricacion relacionado con el hecho de que el bioconjugado era en realidad una mezcla de CTX mono, di y trimarcada. La presente divulgacion proporciona tres nuevas entidades quimicas representativas que son funcionalmente equivalentes a CTX para dirigir moleculas de NIRF a cancer pero se conjugan solo con una unica molecula de NIRF.
Se mapearon los sitios de conjugation de CTX en CTX:Cy5.5 utilizando escision de arginasa acoplada con analisis proteomicos y mostraron que normalmente >80% del producto estaba monomarcado en Lys 27 y cantidades menores tambien estaban conjugadas en Lys 15 o Lys 23. En un analisis de CTX conjugada a otros cuatro tintes de NIRF, se observaron patrones similares de peptido predominantemente monomarcado con cantidades menores de peptido di y trimarcado, con la excepcion de Dylight 750, un tinte de NIRF que solo crea la especie monomarcada. El hecho de que Dylight 750 se une de manera monomerica a CTX sin modificar sugiere que el acceso a las otras dos lisinas esta limitado.
Ninguno de los residuos de lisina en CTX parece estar implicado en la union activa de CTX a su diana en celulas cancerosas. Esta conclusion se basa en las observaciones de que la union a la diana se conserva a pesar de la sustitucion de Lys 15 o Lys 23 por Ala o Arg y de que la adicion de Cy5.5 voluminoso u otros tintes de NIRF a Lys 27 no impide la union al sitio activo.
Procedimientos experimentales
Sintesis peptidica en fase solida. Se utilizo sintesis peptidica en fase solida (SPPS) manual para sintetizar los peptidos con grupos de protection convencionales (p. ej. Asn(Xan), Asp(OcHex), Arg(TOS), Cys(MeBzl), Lys(ClZ), Ser(Bzl), Thr(Bzl) y Tyr(BrZ)). Se ensamblaron las CTX lineales sustituidas con Ala y Arg sobre resina de PAM-Arg sin un grupo de union tioester. Se logro la escision de los peptidos de la resina utilizando fluoruro de hidrogeno (HF) con p-cresol y p- tiocresol como eliminadores (9:0.8:0.2 (vol/vol) de HF:p-cresol:p-tiocresol) a de -5 a 0 °C durante 1.5 h. Se utilizo cromatografia de liquidos de alta resolution de fase inversa (RP-HPLC) con una columna C18 para purificar los peptidos utilizando un gradiente del 0-80% de solution B (solution A: H2O/acido trifluoroacetico al 0.05%; solution B: el 90% de CH3CN/el 10% de H2O/acido trifluoroacetico al 0.045%) monitorizando la absorbancia a 215 nm. La espectroscopia de masas por electropulverizacion (ES-EM) confirmo la pureza y la masa molecular de los peptidos sintetizados.
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Plegamiento. Se oxidaron los analogos sustituidos con Ala y Arg en una solucion de tampon acuoso que consistla en Tris-HCl 0.1 M, NaCl 0.2 M, glutation reducido 5 mM / glutation oxidado 0.5 mM con un pH de 7.8 a temperatura ambiente durante la noche. Se utilizo RP-HPLC para purificar los peptidos y se confirmaron la pureza y los pesos moleculares mediante RP-HPLC analltica y ES-EM.
Espectroscopia de RMN. Se utilizo espectroscopla de 1H-RMN a 600 MHz para monitorizar las estructuras tridimensionale de los analogos peptldicos. Se disolvieron las muestras de peptido en el 90% de H2O y el 10% de D2O (v/v). Se obtuvo D2O (al 99.99%) de Cambridge Isotope Laboratories, Woburn, MA. Los experimentos de RMN bidimensional incluyeron espectros espectroscopla de correlacion total (TOCSY) y espectroscopla de efecto nuclear Overhauser (NOESY) que se registraron a 298 °K.
Ensayo de estabilidad en suero. Se llevo a cabo un ensayo de estabilidad en suero en suero humano masculino al 100% (Sigma) utilizando una concentracion de peptido final de 20 pM. Se centrifugo el suero a 14000 g durante10 min para eliminar el componente lipldico y se incubo el sobrenadante a 37 °C durante 15 min antes del ensayo. Se incubo cada peptido en suero a 37 °C y se tomaron allcuotas de 40 pL por triplicado a las 0, 1, 3, 6, 10, 16 y 24 h. Se extinguio cada allcuota de suero con 40 pL de urea 6 M y se incubaron durante 10 min a 4 °C. Despues, se extinguio cada allcuota de suero con 40 pL de acido tricloroacetico al 20% y se incubaron durante otros 10 min a 4 °C para precipitar las protelnas sericas. Se centrifugaron las muestras a 14000 g durante 10 min, y se analizaron 100 pL del sobrenadante con RP-HPLC utilizando un gradiente lineal de disolvente B (velocidad de flujo de 0.3 mL/min). Las muestras de control contenlan una cantidad equivalente de peptidos en solucion salina tamponada con fosfato sometidas al mismo procedimiento de tratamiento. Se detecto la recuperacion de peptidos en porcentaje mediante integracion a 215 nm.
Modelos de animales. Todos los animales se manipularon siguiendo estrictamente la Gula para el cuidado y uso de los animales de laboratorio de los Institutos Nacionales de la Salud. Todos los estudios con animales se realizaron segun protocolos aprobados por el Fred Hutchinson Cancer Research Center's Institute of Animal Care and Use Committee. Se utilizo un modelo de raton autoctono de meduloblastoma, ND2:SmoA1 (A.R. Hallahan, et al., "The SmoA1 Mouse Model Reveals That Notch Signaling is Critical for the Growth and Survival of Sonic Hedgehog-Induced Medulloblastomas", Cancer Research 64:7794-7800, 2004. B.A. Hatton, et al. "The Smo/Smo Model: Hedgehog-Induced Medulloblastoma With 90% Incidence and Leptomeningeal Spread," Cancer Research 68:1768-1776, 2008), con un contexto C57b1/6 para evaluar la especificidad de CTX ciclizada:Cy5.5, K15A_K23A CTX:Cy5.5, y K15r_K23R CTX:Cy5.5. Se seleccionaron ratones hemicigoticos u homocigoticos (denominados ND2:SmoA1) con meduloblastoma sintomatico para su inclusion en estos estudios. Se detectaron slntomas utilizando una evaluacion en jaula en campo abierto. Los slntomas incluyen inclinacion de cabeza, postura encorvada, ataxia, craneo prominente, y perdida de peso.
Obtencion de imagenes ex vivo. A animales ND2:SmoA1 que mostraban slntomas de meduloblastoma se les inyectaron 50 pL de K15A_K23A CTX:Cy5.5 o K15R_K23R CTX:Cy5.5 40 pM a traves de la vena de la cola. Se sacrificaron los ratones utilizando inhalacion de CO2 tres dlas tras la inyeccion y se obtuvieron imagenes biofotonicas ex vivo de su cerebro utilizando el sistema de obtencion de imagenes Xenogen Spectrum (Caliper). Despues se congelaron los cerebros en compuesto de temperatura de corte optima (OCT) Tissue-Tek (Sakura), se cortaron en secciones de 12 pm y se tineron con hemotoxilina y eosina (H&E) segun procedimientos convencionales.
Claims (9)
- 510152025303540455055REIVINDICACIONES1. Conjugado de clorotoxina que comprende:(i) un peptido de clorotoxina que tiene la secuencia de aminoacidos expuesta en SEQ ID NO: 2, en la que Lys15 y Lys23 estan sustituidos por un aminoacido distinto de lisina para proporcionar una clorotoxina modificada que tiene un unico residuo de lisina, Lys27; y(ii) un marcador fluorescente seleccionado de DyLight-680, DyLight-750, VivoTag-750, DyLight-800, VivoTag-680, y verde de indocianina;en el que el peptido de clorotoxina esta acoplado covalentemente al marcador fluorescente a traves del residuo de lisina, y dicho peptido de clorotoxina se une a sitios de union a clorotoxina expresados por celulas cancerosas.
- 2. Conjugado de clorotoxina segun la reivindicacion 1, en el que el polipeptido variante de clorotoxina comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2 en la que:(i) el residuo de lisina K15 y/o el residuo de lisina K23 estan sustituidos independientemente por un aminoacidobasico, no polar, polar o acido, o un aminoacido no natural, analogo de aminoacido o mimetico de aminoacido delmismo;(ii) los residuos de lisina K15 y K23 estan sustituidos por alanina o arginina;(iii) el residuo de lisina K15 esta sustituido por alanina y K23 esta sustituido por arginina; o(iv) el residuo de lisina K15 esta sustituido por arginina y K23 esta sustituido por alanina.
- 3. Conjugado de clorotoxina segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, para su utilization en:(a) detectar celulas cancerosas in vivo;(b) detectar y eliminar celulas cancerosas in vivo;(c) detectar un tejido canceroso o tumoral en un individuo, en el que el conjugado de clorotoxina es para suadministration al individuo de tal manera que el conjugado de clorotoxina se une al tejido canceroso o tumoral; o(d) obtener imagenes de tejido canceroso o tumoral en un individuo, en el que el conjugado de clorotoxina es para su administracion al individuo de tal manera que el conjugado de clorotoxina se une al tejido canceroso o tumoral.
- 4. Utilizacion del conjugado de clorotoxina segun la reivindicacion 1 o 2 para la fabrication de un medicamento para:(a) detectar u obtener imagenes de celulas cancerosas in vivo; o(b) detectar y eliminar, u obtener imagenes y eliminar celulas cancerosas in vivo.
- 5. Conjugado de clorotoxina para su utilizacion segun la reivindicacion 3, o utilizacion del conjugado de clorotoxina segun la reivindicacion 4, en el que la union del conjugado de clorotoxina al tejido canceroso o tumoral en el cuerpo del individuo:(a) se detecta midiendo un nivel de union del conjugado de clorotoxina, en el que un nivel de union elevado con respecto a tejido normal es indicativo de que el tejido es tejido canceroso o tumoral; o(b) se obtienen imagenes de la misma midiendo un nivel de union del conjugado de clorotoxina, en el que un nivel de union elevado con respecto a tejido normal es indicativo de que el tejido es tejido canceroso o tumoral.
- 6. Metodo in vitro o ex vivo para detectar u obtener imagenes de tejido canceroso con un conjugado de clorotoxina o una composition del mismo, en el que el conjugado de clorotoxina comprende el conjugado de clorotoxina segun la reivindicacion 1 o 2, comprendiendo dicho metodo:(a) poner en contacto un tejido con el conjugado de clorotoxina o la composicion del mismo; y(b) analizar el tejido para detectar la union del conjugado de clorotoxina a celulas cancerosas dentro del tejido.
- 7. Metodo segun la reivindicacion 6, en el que el analisis comprende medir un nivel de union del conjugado declorotoxina, en el que un nivel de union elevado con respecto a tejido normal es indicativo de que el tejido es neoplasico.
- 8. Metodo segun las reivindicaciones 6 o 7, en el que el conjugado de clorotoxina se une a celulas cancerosas dentro del tejido.
- 9. Conjugado de clorotoxina segun la reivindicacion 1 o 2, metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, clorotoxina para su utilizacion segun la reivindicacion 3 o 5 o utilizacion de una clorotoxina segun la reivindicacion 4 o 5, en el que el conjugado de clorotoxina comprende un polipeptido variante de clorotoxina que se ha conjugado con verde de indocianina.
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