KR20070039593A - 비천연적으로 코딩된 아미노산을 이용한 생합성 폴리펩티드 - Google Patents

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호 성 조
토마스 오 다니엘
안나-마리아 헤이스
트로이 이 윌슨
데이비드 씨 릿징어
로베르토 마리아니
브루스 이. 킴멜
윌리암 엠. 키프
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암브룩스, 인코포레이티드
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Abstract

변형된 생합성 폴리펩티드 분자, 그것의 제조 방법 및 그것의 용도가 제공된다.
비천연적으로 코딩된 아미노산, 생합성 폴리펩티드 분자

Description

비천연적으로 코딩된 아미노산을 이용한 생합성 폴리펩티드 {BIOSYNTHETIC POLYPEPTIDES UTILIZING NON-NATURALLY ENCODED AMINO ACIDS}
관련 출원에 대한 상호 참조
이 출원은 2004년 7월 21일에 출원된 U.S. 가특허출원 일련 No. 60/590,035, 및 2005년 3월 7일에 출원된 U.S. 가특허출원 일련 No. 60/659,709을 우선권으로 주장하고, 이의 명세서 내용은 본원에 전체적으로 참고로 인용된다.
본 발명은 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하거나 그것을 이용하여 제조되는 생합성 폴리펩티드 및 융합 단백질에 관한 것이다.
펩티드는 연구 및 의료 수행에서 널리 사용되고 있고, 펩티드 산물의 제조 및 성능에 대한 도전과제가 해결됨에 따라 그 중요성이 증가할 것으로 예상될 수 있다. 본원에 기재된 펩티드들과 같은 치료용 펩티드는 생합성 폴리펩티드(BSP)로 칭해진다. 많은 내인성 펩티드들이 생물학적 공정들의 핵심 성분으로 기재되었다. 이들 펩티드 중 일부는 각종 장애의 관리를 위한 핵심 치료제로서 확인되었다. 일반적으로, 내인성 펩티드는, 그것의 내인적 특성으로 인해 면역 반응을 일으키지 않기 때문에, 비본연의(non-native) 서열을 갖는 합성 펩티드보다 치료제로서 더 바람직하다. 또한, 내인성 펩티드는 그것에 표적 수용체에 대해 매우 특이적이고, 합성 및 제조가 쉽다. 그러나, 그러한 치료용 펩티드를 전달함에 있어 주요 문제는, 주로 급성 혈청 소거 및 펩티다제의 작용을 통한 단백질 분해로 인한 짧은 혈장내 반감기이다.
본연의(native) 펩티드 또는 그것의 유사체가 치료에 사용될 때, 그것은 높은 퇴화 및/또는 소거 속도를 가지는 것으로 일반적으로 나타난다. 높은 치료제 소거 속도는 장시간 동안 높은 혈중 속도를 유지하는 것이 요망되는 경우에는 반복 투여가 필요하게 되어 불편하다. 높은 퇴화 및/또는 소거 속도를 가지는 펩티드의 예에는, ACTH, 부신피질자극호르몬-방출 인자, 안지오텐신, 칼시토닌, 인슐린, 글루카곤, 글루카곤-유사 펩티드-1, 글루카곤-유사 펩티드-2, 인슐린-유사 성장 인자-1, 인슐린-유사 성장 인자-2, 소화관 억제 펩티드, 성장 호르몬-방출 인자, 뇌하수체 아데닐레이트 사이클라제 활성화 펩티드, 세크레틴, 엔테로개스트린, 소마토스타틴, 소마토트로핀, 소마토메딘, 파라티로이드 호르몬, 트롬보포이에틴, 에리트로포이에틴, 시상하부 방출 인자, 프로락틴, 티로이드 자극 호르몬, 엔도르핀, 엔세팔린, 바소프레신, 옥시토신, 오피오이드 및 이들의 유사체, 슈퍼옥시드 디스뮤타제, 인터페론, 아스파라기나제, 아르기나제, 아르기닌 데아미나제, 아데노신 데아미나제 및 리보뉴클레아제가 포함된다. 일부 경우들에서, 적당한 약제학적 조성물을 적용함으로써 펩티드의 방출 프로파일에 영향을 줄 수 있으나, 이 방법은 각종 결점들을 가지고, 일반적으로 적용불가능하다.
펩티다제는 결합을 교차하여 물 분자를 삽입함으로써 펩티드 내 펩티드 결합을 파괴한다. 일반적으로, 대부분의 펩티드는 수분 이내의 방식으로 체 내의 펩티 다제에 의해 파괴 분해된다. 또한, 일부 펩티다제는 특정 유형의 펩티드에 대해 특이적이고, 이는 그것이 더욱 급속히 분해되도록 한다. 따라서, 펩티드가 치료제로서 사용될 경우, 그것의 활성은 펩티다제의 작용으로 인해 체 내 펩티드가 급속히 분해함에 따라, 일반적으로 감소된다.
이 결점을 극복하기 위한 한 방식은, 큰 투약량의 관심의 치료용 펩티드를 환자에게 투여하여, 펩티드 중 일부가 분해될 경우에도, 충분히 치료 유효적인 상태로 남도록 하는 것이다. 그러나, 이 방법은 환자에 대해서는 매우 불편하다. 대부분의 치료용 펩티드가 경구 투여될 수 없기 때문에, 치료용 펩티드는 꾸준히 주입되거나(infused), 정맥내 주사에 의해 빈번하게 투여되거나, 피하 주사의 불편한 경로에 의해 빈번하게 투여되어야 한다. 빈번한 투여에 대한 필요는 또한 많은 가능한 펩티드 치료제에 대한 치료 경로 당 허용불가능하게 높은 예산을 초래한다. 다량의 분해 펩티드의 존재는 또한 바람직하지 못한 부작용을 발생시킬 수 있다.
선호적인 생활성 프로파일을 갖는 대부분의 치료용 펩티드가 약물 후보물질로서 발달하지 못하는 두가지 이유는 불편한 투여 및 고비용이다. 그 대신에, 이 치료용 펩티드는 치료용 펩티드를 위한 대체제로 펩티드모방 화합물을 개발하기 위한 주형으로 사용된다. 바이오기술 및 대형 제약회사는 허용불가능한 부작용 프로파일을 유발하지 않으면서, 치료용 펩티드에서 볼 수 있는 활성을 모방하는 비펩티드 유기 화합물을 개발하는 것을 시도하는, 장기적 고가 최적화 프로그램에 착수하는 일이 빈번하다. 예를 들어, 고가의 SAR(구조 활성 관계(Structure Activity Relationship)) 및 분자 모델링 연구에서 비롯되는 시클릭 펩티드, 펩티드 모방체 및 소분자는 매우 많은 양의 펩티드 모방체의 개발을 초래하였다. 그러나, 이들 펩티드 모방체는 치료용 펩티드의 자체 원래의 생물학적 성질을 어떠한 식으로도 반영하지 못하며 이에 따라 치료제로서 내인성 치료용 펩티드보다 좋지 않다.
펩티드 모방체를 창출하는 것에 대한 한 대안은, 치료용 펩티드의 퇴화를 예방하거나, 생물학적 활성을 유지하면서 그것의 퇴화 속도를 늦추는 식으로 치료용 펩티드를 변형시키는 펩티다제의 작용을 차단하는 것이다. 그러한 방법에는 덱스트란, 폴리비닐 피롤리돈, 글리코펩티드, 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리아미노산과 같은 중합체성 물질과의 접합, 아드로이틴 술페이트와의 접합, 및 다당류, 저분자량 화합물, 예컨대 아미노레티신, 지방산, 비타민 B12, 및 글리코시드와의 접합이 포함된다. 수가지 방법에는 담체 단백질과의 체외 접합이 포함된다. 중합체성 물질의 첨가에 따른 치료 활성의 감소 및/또는 랜덤화 접합체의 생성이 감소되도록 하는 치료용 펩티드의 향상이 필요하다. 변형된 펩티드의 치료적 이점을 여전히 보호하면서 낮은 독성을 유지하고, 한편 펩티다제 활성으로부터 보호되고, 생체내 작용 시간이 보다 긴 향상된 치료용 펩티드가 필요하다.
친수성 중합체 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG로 약칭됨)의 공유 결합은, 물 용해도, 생체유용성의 증가, 혈청 반감기의 증가, 치료 반감기의 증가, 면역원성의 조절, 생물학적 활성의 조절, 또는 단백질, 펩티드, 및 특히 소수성 분자를 포함한 많은 생물학적 활성 분자들의 순환 시간의 연장 방법이다. PEG는 약제에서, 인공 임플란트에서, 또한 생체적합성, 독성 결여, 및 면역원성의 결여가 중요한 다른 용도들에서 고가로 사용되어 왔다. PEG의 요망 성질을 최대화하기 위해, 생물학적 활 성 분자에 결합된 PEG 중합체 또는 중합체들의 총 분자량 및 수화 상태는, 모분자의 생활성에 부정적 영향을 미치지 않으면서 PEG 중합체 결합과 전형적으로 연관된 이로운 특성, 예컨대 증가된 물 용해도 및 순환 반감기를 부여하기에 충분히 높아야 한다.
PEG 유도체는 빈번하게 반응성 화학적 작용기들, 예컨대 리신, 시스테인 및 히스티딘 잔기, N-말단 및 탄수화물 부분을 통해 생물학적 활성 분자에 연결된다. 단백질 및 기타 분자는 종종 중합체 결합에 이용가능한 제한된 수의 반응성 부위를 가진다. 종종, 중합체 결합을 통한 변형에 가장 적당한 부위는 수용체 결합에 중요한 역할을 하고, 분자의 생물학적 활성의 보유에 필요하다. 그 결과로서, 중합체 사슬이 생물학적 활성 분자 상의 그러한 반응성 부위에 무분별하게 결합함은 종종 중합체-변형된 분자의 생물학적 활성을 상당히 감소시키거나, 심지어 전체를 손실하게 한다(R. Clark 등(1996), J. Biol . Chem ., 271: 21969-21977). 표적 분자에 원하는 이점을 부여하기에 충분한 중합체 분자량을 갖는 접합체를 형성하기 위해, 종래 기술의 방법은 전형적으로 수많은 중합체 팔을 분자에 무작위로 결합시킴으로써, 모분자의 생활성의 감소 또는 심지어는 총 손실의 위험을 증가시키는 것을 포함하였다.
PEG 유도체가 단백질에 결합하기 위한 위치를 형성하는 반응성 부위는 단백질의 구조에 의해 표시된다. 효소를 포함한 단백질은 일반적 구조 H2N--CHR-C-OOH을 갖는 알파-아미노산의 각종 서열들로 구성된다. 한 아미노산의 알파 아미노 부 분(H2N--)은 인접 아미노산의 카르복실 부분(--COOH)에 결합하여, --(NH--CHR--CO)n-(여기에서, 첨자 "n"는 수백 또는 수천일 수 있음)로 표시될 수 있는 아미드 연결기를 형성한다. R로 표시되는 단편은 단백질 생물학적 활성 및 PEG 유도체의 결합을 위한 반응성 부위를 함유할 수 있다.
예를 들어, 아미노산 리신의 경우, 알파 위치뿐만 아니라 엡실론 위치에서 --NH2 부분이 존재한다. 엡실론 --NH2은 염기성 pH의 조건 하에서 반응을 위해 유리성이다. PEG를 이용한 단백질 유도화의 기술 분야의 상당부는 단백질 내에 존재하는 리신 잔기의 엡실론 --NH2 부분에 결합하기 위한 PEG 유도체의 개발에 관한 것이었다["진보 PEG화를 위한 폴리에틸렌 글리콜 및 유도체", Nektar Molecular Engineering Catalog, 2003, pp. 1-17]. 이들 PEG 유도체는 모두 공통된 제한 요소를 가지나, 단백질의 표면 상에 존재하는 종종 수많은 리신 잔기들 중에 선택적으로 장착될 수 없다. 이는, 리신 잔기가 예를 들어 효소 활성 부위에 존재하는 단백질 활성에 대해 중요한 예들에서, 또는 리신 잔기가 수용체 결합 부위의 경우에서와 같이 다른 생물학적 분자와의 단백질의 상호 작용을 매개하는 역할을 하는 경우에 상당한 제한요소일 수 있다.
현존 단백질 PEG화 방법의 두 번째로서 역시 동등하게 중요한 문제는, PEG 유도체가 원하는 반응 이외의 바람직하지 못한 잔기와의 부반응을 겪을 수 있다는 것이다. 히스티딘은 --N(H)--로 구조적으로 표시되는 반응성 이미노 부분을 함유하 나, 엡실론 --NH2와 반응하는 많은 화학적 반응성 종은 또한 --N(H)--로 반응할 수 있다. 유사하게, 아미노산 시스테인의 측쇄는 구조적으로 -SH로 표시되는 유리 술프히드릴기를 가진다. 일부 경우들에서, 리신의 엡실론 --NH2 기에 지정된 PEG 유도체는 또한 시스테인, 히스티딘 또는 기타 잔기와 반응한다. 이는 PEG-유도체화 생활성 분자의 복잡한 이질 혼합물을 형성할 수 있고, 표적화된 생활성 분자의 활성을 파괴할 위험이 있다. 잘 정의되어 있으면서도 예측가능한 단백질 표면 상의 특정 부위에 있는 생활성 분자에 하나 이상의 PEG 중합체를 선택적으로 결합시킬 수 있게 하는 단백질 내의 단일 부위에 화학적 작용기가 도입되도록 하는 PEG 유도체를 개발하는 것이 바람직할 것이다.
리신 잔기에 부가하여, 당업계의 상당한 노력은 시스테인, 히스티딘 및 N-말단을 포함하는 다른 아미노산 측쇄를 표적으로 하는 활성화 PEG 시약의 개발에 관한 것이었다. 예컨대, 본원에 참고로 인용되는 U.S. 특허 No. 6,610,281, 및 ["진보된 PEG화를 위한 폴리에틸렌 글리콜 및 유도체", Nektar Molecular Engineering Catalog, 2003, pp. 1-17]을 참고한다. 시스테인 잔기는 변이유발 및 당업계에 공지된 기타 기법을 이용하여 단백질의 구조에 부위-선택적으로 도입될 수 있고, 수득된 유리 술프히드릴 부분은 티올-반응성 작용기를 갖는 PEG 유도체와 반응할 수 있다. 그러나, 이 접근법은 유리 술프히드릴기의 도입이 수득된 단백질의 발현, 접힘 및 안정성을 복잡하게 할 수 있다는 점에서 복잡하다. 따라서, 술프히드릴, 및 전형적으로 단백질 내에 발견되는 기타 화학적 작용기와 상용적이도록(즉, 그 작용 기와 바람직하지 못한 부반응과 관련되지 않도록) 함과 동시에, 하나 이상의 PEG 중합체를 단백질에 선택적으로 결합할 수 있는 생활성 분자에 화학적 작용기를 도입하기 위한 수단을 가지는 것이 바람직할 것이다.
당 기술에서의 샘플링으로부터 확인될 수 있는 바와 같이, 단백질의 측쇄, 특히, 리신 아미노산 측쇄 상의 --NH2 부분, 및 시스테인 측쇄 상의 -SH 부분에 결합하도록 개발된 상기 유도체들 중 많은 것들이 그 합성 및 사용에 있어 문제가 있음이 입증되었다. 일부는 단백질과 불안정한 연결기를 형성하여 가수분해되고, 이에 따라 수성 환경, 예컨대 혈류 중에서 분해, 퇴화 등이 일어난다. 일부는 더욱 안정한 연결기를 형성하나, 연결기가 형성되기 전에 가수분해되고, 이는 PEG 유도체 상의 반응성 기는 단백질이 결합될 수 있기 전에 불활성화될 수 있다. 일부는 다소 독성이고, 이에 따라 생체내 사용하기에 덜 적당하다. 일부는 너무 느려서, 실제로 유용하게 반응할 수 없다. 일부는 단백질의 활성의 원인이 되는 부위에 결합함으로써 단백질 활성이 손실되도록 한다. 일부는 그것이 결합하게 되는 부위에 특이적이지 않고, 이는 또한 바람직한 활성의 손실, 및 결과의 재현성 결여를 초래할 수 있다. 폴리(에틸렌 글리콜) 부분을 이용하여 단백질을 변형시키는 것과 관련된 도전과제를 극복하기 위해, 더욱 안정하거나(예컨대, 본원에 참고로 인용되는 U.S. 특허 6,602,498), 분자 및 표면 상의 티올 부분과 선택적으로 반응하는(예컨대, 본원에 참고로 인용되는 U.S. 특허 6,610,281) PEG 유도체들이 개발되었다. 선택적으로 반응하여 안정한 화학적 결합을 형성하도록 요구될 때까지 생리학적 환경 에서 화학적으로 불활성인 PEG 유도체가 명백히 당업계에 필요하다.
최근, 단백질의 부위-특이적 변형과 연관된 많은 제한점들을 극복하도록 기약된 단백질 과학에 있어 전반적으로 새로운 기술이 보고되었다. 구체적으로, 신규 성분이 원핵생물 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli)(E. 콜라이)의 단백질 생합성 기작에 부가되었고(예컨대, L. Wang 등(2001), Science 292: 498-500), 진핵생물 사카로마이세스 세리비지아에( Sacchromyces cerevisiae )(S. 세레비지아에 )의 단백질 생합성 기작에 부가되었으며(예컨대, J. Chin 등, Science 301: 964-7(2003)), 이는 생체내 단백질로의 비유전적으로 코딩된 아미노산의 혼입을 가능하게 하였다. 광친화도 표지 및 광이성화가능한 아미노산, 케토 아미노산 및 글리코실화 아미노산을 포함한, 신규 화학적, 물리적 또는 생물학적 성질을 갖는 수많은 새로운 아미노산들이 효율적으로 또한 고신뢰도로, 앰버 코돈, TAG에의 반응에서 E. 콜라이 및 효모 내의 단백질로 이 방법을 이용하여 혼입되었다. 예컨대, [J. W. Chin 등(2002), Journal of the American Chemical Society 124: 9026-9027; J. W. Chin, & P. G. Schultz(2002), ChemBioChem 3(11): 1135-1137; J. W. Chin 등(2002), PNAS United States of America 99: 11020-11024; 및 L. Wang, & P. G. Schultz(2002), Chem . Comm ., 1: 1-11]을 참고한다. 이 연구들은, 20개의 통상의 유전적으로 코딩된 아미노산에서 발견되는 작용기 모두에 대해 화학적으로 불활성이고, 안정한 공유 연결기를 형성하기 위해 효율적으로 또한 선택적으로 반응하기 위해 사용될 수 있는, 단백질 내에 발견되지 않는 화학적 작용기, 예컨대 케톤기, 알킨(alkyne)기 및 아지드 부분을 선택적으로 또한 통상적으로 도입할 수 있음을 입증하였다.
단백질에 비유전적으로 코딩된 아미노산을 혼입하는 능력은 리신의 엡실론 -NH2, 시스테인의 술프히드릴 -SH, 히스티딘의 이미노기 등과 같은 천연 발생 작용기에 대한 중요한 대안을 제공할 수 있는 화학적 작용기를 도입할 수 있도록 한다. 특정 화학적 작용기들은 20개의 통상의 유전적으로 코딩된 아미노산에서 발견되는 작용기에 대해 불활성이나, 완전히 및 효율적으로 반응하여 안정한 연결기를 형성하는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 아지드 및 아세틸렌기는 촉매량의 구리의 존재 하에 수성 조건에서 휘스겐(Huisgen) [3+2] 시클로부가 반응을 겪는 것으로 당업계에 공지되어 있다. 예컨대, [Tornoe 등(2002) J. Org . Chem . 67: 3057-3064; 및 Rostovtsev 등(2002) Angew . Chem . Int . Ed . 41: 2596-2599]를 참고한다. 예를 들어 아지드 부분을 단백질 구조에 도입함으로써, 단백질에서 발견되는 아민, 술프히드릴, 카르복실산, 히드록실기에 대해 화학적으로 불활성이나, 아세틸렌 부분과 매끄럽고 효율적으로 반응하여 시클로부가 생성물을 형성하는 작용기를 도입할 수 있다. 중요하게, 아세틸렌 부분의 부재 하에, 아지드는 화학적으로 불활성인 상태로 남고, 기타 단백질 측쇄의 존재 하에 또한 생리학적 조건 하에서 비반응성인 상태로 남는다.
본 발명은 무엇보다도 생합성 폴리펩티드(BSP)의 활성 및 제조와 관련된 문제를 해결하고, 또한 향상된 생물학적 또한 약리학적 성질, 예컨대 향상된 치료 반감기를 갖는 BSP의 제조를 해결한다.
발명의 개요
본 발명은 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는, 글루카곤 유전자-유래 폴리펩티드, 예컨대 GLP-1, T-20 폴리펩티드, 막 융합 억제 펩티드, 및 펩티드 YY 펩티드를 비제한적 예로 포함하는 생합성 펩티드(BSP)를 제공한다. 치료 활성을 갖는 임의의 BSP, 그것의 단편, 유사체 또는 변종체가 본 발명에서 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 BSP의 수많은 예들이 제공되었다. 그러나, 제공된 목록은 완전히 모든 것을 반영하는 것이 아니며, 본 발명에서 사용될 수 있는 BSP의 수 또는 유형을 어떠한 식으로도 제한하지 않는다. 따라서, 신규 BSP를 포함한, 임의의 BSP, 및/또는 임의의 BSP로부터 생성된 단편, 유사체 및 변종체는 본 발명에 따라 변형되어 치료적으로 사용될 수 있다.
일부 실시양태들에서, BSP는 하나 이상의 전사후 변형을 포함한다. 일부 실시양태들에서, BSP는 링커, 중합체 또는 생물학적 활성 분자에 연결된다. 일부 실시양태들에서, BSP는 이관능성 중합체, 이관능성 링커, 또는 하나 이상의 부가적 BSP에 연결된다.
일부 실시양태들에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 수용성 중합체에 연결된다. 일부 실시양태들에서, 수용성 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜) 부분을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분자는 이관능성 중합체이다. 일부 실시양태들에서, 이관능성 중합체는 제2 폴리펩티드에 연결된다. 일부 실시양태들에서, 제2 폴리펩티드는 BSP이다.
일부 실시양태들에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 수용성 중합체에 연 결된다. 일부 실시양태들에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 링커를 이용하여 수용성 중합체에 연결된다. 일부 실시양태들에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 생분해성 링커를 이용하여 수용성 중합체에 연결된다. 일부 실시양태들에서, 생분해성 링커가 사용되어, BSP를 포함하는 전구약물을 형성할 수 있다. 이 전구약물 접근법의 한 예에서, 수용성 중합체는 GLP-1 활성을 차단하고, 링커의 퇴화는 활성 GLP-1를 방출한다. 일부 실시양태들에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 아실 부분 또는 아실 사슬에 연결된다. 일부 실시양태들에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 링커에 의해 아실 부분 또는 아실 사슬에 연결된다. 일부 실시양태들에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 폴리(에틸렌 글리콜) 링커 또는 전구약물에 의해 아실 부분 또는 아실 사슬에 연결된다. 일부 실시양태들에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 혈청 알부민에 연결된다. 일부 실시양태들에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 링커에 의해 혈청 알부민에 연결된다. 일부 실시양태들에서, 링커는 폴리(에틸렌 글리콜) 또는 전구약물이다. 일부 실시양태들에서, 링커는 전구약물의 이중 분해 전구약물이며, 여기에서 단계 1은 알부민과 같은 분자의 제어 방출이고, 단계 2는 링커 또는 그것의 일부를 방출하는 제2 분해이다.
일부 실시양태들에서, BSP는 BSP 내에 존재하는 2개의 아미노산 간에 분자간 가교를 포함한다. 일부 실시양태들에서, BSP는 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함한다. 2개의 가교 연결된 잔기 중 하나는 비천연적으로 코딩된 아미노산 또는 천연적으로 코딩된 아미노산일 수 있다. 비천연 아미노산은 링커, 중합체 또는 생물학적 활성 분자에 의해 결합될 수 있다.
일부 실시양태들에서, BSP는 폴리(에틸렌 글리콜) 부분을 포함하는 수용성 중합체에 연결된 2개 이상의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 하나 이상의 아미노산은 비천연적으로 코딩된 아미노산이다.
일부 실시양태들에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은, BSP, 예컨대 GLP-1 내의 임의의 위치에서, (아미노 말단의) 첫 번째 아미노산 앞, 카르복시 말단의 부가, 또는 이들의 임의의 조합에서 혼입된다. 일부 실시양태들에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 위치 7(즉, N 말단)의 첫 번째 아미노산 앞, 7H, 8A, 9E, V16, 17S, 18S, 19Y, 20L, 21E, 22G, 23Q, 24A, 25A, 26K, 27E, 28F, 29I, 30A, 31W, 32L, 33V, 34K, 35G, 36R, 37G, 위치 38(즉, 카르복실 말단)의 부가, 또는 이들의 임의의 조합의 잔기들을 비제한적 예로 포함하는, GLP-1 내의 임의의 위치에서 혼입된다.
일부 실시양태들에서, 이 위치들 중 하나 이상에 있는 이 비천연 발생 아미노산들은, 위치 7(즉, N 말단)의 첫 번째 아미노산 앞, 7H, 8A, 9E, V16, 17S, 18S, 19Y, 20L, 21E, 22G, 23Q, 24A, 25A, 26K, 27B, 28F, 29I, 30A, 31W, 32L, 33V, 34K, 35G, 36R, 37G, 위치 38(즉, 카르복실 말단)에서의 부가 또는 이들의 임의의 조합과 같은 GLP-1 위치를 비제한적 예로 포함하는 수용성 중합체에 연결된다.
일부 실시양태들에서, 본 발명의 GLP-1 폴리펩티드는 길항자를 제공하는 위치들, 즉 7, 8, 9, 22, 18, 29, 25, 32, 21, 28, 17, 24, 31, 20, 또는 이들의 임의의 조합 중 하나 이상의 위치에 있는 하나 이상의 비천연 발생 아미노산을 포함 한다.
일부 실시양태들에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 T-20 폴리펩티드(TEX 포함) 내의 임의의 위치에서, (아미노 말단의) 첫 번째 아미노산 앞, 카르복시 말단의 부가, 또는 이들의 임의의 조합에서 혼입된다. 일부 실시양태들에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 W631, D632, I635, N636, N637, Y638, T639, S640, L641, L645, N651, 또는 이들의 임의의 조합에서의 잔기를 비제한적 예로 포함하는 T-20(TEX 포함) 내의 임의의 위치에서 혼입된다.
일부 실시양태들에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 (아미노 말단의) 첫 번째 아미노산 앞, 카르복시 말단의 부가, 또는 이들의 임의의 조합에서, 펩티드 YY 내의 임의의 위치에서 혼입된다.
일부 실시양태들에서, BSP는 단백질, 폴리펩티드, 소분자 또는 핵산을 비제한적 예로 포함하는 BSP 수용체 또는 결합 상대에 대한 BSP의 친화도를 조절하는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. 일부 실시양태들에서, BSP는 치환, 부가 또는 결실이 없는 상응하는 BSP의 안정성 대비, BSP의 안정성을 증가시키는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. 일부 실시양태들에서, BSP는 치환, 부가 또는 결실이 없는 상응하는 BSP의 면역원성 대비, BSP의 면역원성을 조절하는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. 일부 실시양태들에서, BSP는 치환, 부가 또는 결실이 없는 상응하는 BSP의 혈청 반감기 또는 순환기 대비, BSP의 혈청 반감기 또는 순환기를 조절하는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다.
일부 실시양태들에서, BSP는 치환, 부가 또는 결실이 없는 상응하는 BSP의 수용해도 대비, BSP의 수용해도를 증가시키는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. 일부 실시양태들에서, BSP는 치환, 부가 또는 결실이 없는 상응하는 BSP의 용해도 대비, 숙주 세포에서 생성된 BSP의 용해도를 증가시키는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. 일부 실시양태들에서, BSP는 치환, 부가 또는 결실이 없는 상응하는 BSP의 발현 또는 합성 대비, 숙주 세포에서의 BSP의 발현을 증가시키거나 생체외 합성을 증가시키는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. 일부 실시양태들에서, BSP는 치환, 부가 또는 결실이 없는 상응하는 BSP의 펩티다제 또는 프로테아제 감수성 대비, BSP의 펩티다제 또는 프로테아제 감수성을 감소시키는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. 일부 실시양태들에서, BSP는 치환, 부가 또는 결실이 없는 상응하는 BSP의 신호 전달 활성 대비, BSP 수용체 또는 결합 상대의 그러한 활성을 조절하는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. 일부 실시양태들에서, BSP는 치환, 부가 또는 결실이 없는 상응하는 BSP의 다른 분자로의 결합 대비, BSP의 그러한 결합을 조절하는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. 일부 실시양태들에서, BSP는 치환, 부가 또는 결실이 없는 상응하는 BSP의 결합 상대의 구조 또는 생물학적 활성 대비, 그것의 결합 상대의 구조 또는 하나 이상의 생물학적 활성을 조절하는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다.
일부 실시양태들에서, 하나 이상의 치환이 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 이루어지는 경우, BSP에서의 아미노산 치환은 천연 발생 또는 비천연 발생 아미노산으로 이루어질 수 있다.
일부 실시양태들에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 카르보닐기, 아미노 옥시기, 히드라진기, 히드라지드기, 세미카르바지드기, 아지드기, 또는 알킨기를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 카르보닐기를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 구조:
Figure 112007014691585-PCT00001
(식 중에서, n은 0 내지 10이고; R1은 알킬, 아릴, 치환 알킬, 또는 치환 아릴이며; R2는 H, 알킬, 아릴, 치환 알킬, 및 치환 아릴이고; R3은 H, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 아미노 말단 변형기이며; R4는 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 카르복시 말단 변형기임)를 가진다.
일부 실시양태들에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 아미노옥시기를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 히드라지드기를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 히드라진기를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산 잔기는 세미카르바지드기를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산 잔기는 아지드기를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 구조:
Figure 112007014691585-PCT00002
(식 중에서, n은 0 내지 10이고; R1은 알킬, 아릴, 치환 알킬, 치환 아릴이거나 존재하지 않으며; X은 O, N, S이거나 존재하지 않고; m은 0 내지 10이며; R2는 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 아미노 말단 변형기이고, R3은 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 카르복시 말단 변형기임)를 가진다.
일부 실시양태들에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 알킨기를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 구조:
Figure 112007014691585-PCT00003
(식 중에서, n은 0 내지 10이고; R1은 알킬, 아릴, 치환 알킬 또는 치환 아릴이며; X은 O, N, S이거나 존재하지 않고; m은 0 내지 10이며, R2는 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 아미노 말단 변형기이고, R3은 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 카르복시 말단 변형기임)를 가진다.
일부 실시양태들에서, 폴리펩티드는 BSP 작용자 (agonist), 부분 작용자, 길항자 (antagonist), 부분 길항자 또는 역 작용자이다. 일부 실시양태들에서, BSP 작용자, 부분 작용자, 길항자, 부분 길항자 또는 역 작용자는 수용성 중합체에 연결된 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 수용성 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜) 부분을 포함한다. 일부 실시양태들에서, BSP 작용자, 부분 작용자, 길항자, 부분 길항자 또는 역 작용자는 비천연적으로 코딩된 아미노산 및 하나 이상의 전사후 변형, 링커, 중합체 또는 생물학적 활성 분자를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 수용성 중합체에 연결된 비천연적으로 코딩된 아미노산은 BSP의 수용체 결합 영역 내에 존재하거나 BSP의 수용체 결합을 간섭한다. 일부 실시양태들에서, 수용성 중합체에 연결된 비천연적으로 코딩된 아미노산은 결합 상대에 결합하는 BSP의 영역 내에 존재하거나, BSP에 대한 결합 상대의 결합을 간섭한다.
본 발명은 또한 서열 번호 1, 2, 3, 21, 22, 23 또는 24의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 대해 수렴 조건 하에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 핵산으로서, 폴리뉴클레오티드가 하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함하는 것인 핵산을 제공한다. 일부 실시양태들에서, 셀렉터 코돈 앰버 코돈, 오커 코돈, 오팔 코돈, 특유의 코돈, 희소 코돈 및 4-염기 코돈으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명은 또한 수용성 중합체에 연결된 BSP의 제조 방법을 제공한다. 일부 실시양태들에서, 방법은 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 단리된 BSP를, 비천연적으로 코딩된 아미노산과 반응하는 부분을 포함하는 수용성 중합체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, BSP에 혼입된 비천연적으로 코딩된 아미노산은 20개의 통상의 아미노산들 중 임의의 것에 대해 다른 방식으로는 비반응성인 수용성 중합체에 대해 반응성이다. 일부 실시양태들에서, BSP에 혼입된 비천연적으로 코딩된 아미노산은 20개의 통상의 아미노산들 중 임의의 것에 대해 다른 방식으로는 비반응성인 링커, 중합체 또는 생물학적 활성 분자에 대해 반응성이다.
일부 실시양태들에서, 수용성 중합체에 연결된 BSP는, 카르보닐-함유 아미노산을 포함하는 BSP를, 아미노옥시, 히드라진, 히드라지드 또는 세미카르바지드기를 포함하는 폴리(에틸렌 글리콜) 분자와 반응시킴으로써 제조된다. 일부 실시양태들에서, 아미노옥시, 히드라진, 히드라지드 또는 세미카르바지드기는 아미드 연결기를 통해 폴리(에틸렌 글리콜) 분자에 연결된다.
일부 실시양태들에서, 수용성 중합체에 연결된 BSP는, 카르보닐기를 포함하는 폴리(에틸렌 글리콜) 분자를 아미노옥시, 히드라진, 히드라지드 또는 세미카르바지드기를 포함하는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 BSP와 반응시킴으로써 제조된다.
일부 실시양태들에서, 수용성 중합체에 연결된 BSP는, 알킨-함유 아미노산을 포함하는 BSP를, 아지드 부분을 포함하는 폴리(에틸렌 글리콜) 분자와 반응시킴으로써 제조된다. 일부 실시양태들에서, 아지드 또는 알킨기는 아미드 연결기를 통해 폴리(에틸렌 글리콜) 분자에 연결된다.
일부 실시양태들에서, 수용성 중합체에 연결된 BSP는, 아지드-함유 아미노산을 포함하는 BSP를, 알킨 부분을 포함하는 폴리(에틸렌 글리콜) 분자와 반응시킴으 로써 제조된다. 일부 실시양태들에서, 아지드 또는 알킨기는 아미드 연결기를 통해 폴리(에틸렌 글리콜) 분자에 연결된다.
일부 실시양태들에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분자는 약 0.1 kDa 내지 약 100 kDa의 분자량을 가진다. 일부 실시양태들에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분자는 0.1 kDa 내지 50 kDa의 분자량을 가진다.
일부 실시양태들에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분자는 분지형 중합체이다. 일부 실시양태들에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분지형 중합체의 각 분지는 1 kDa 내지 100 kDa, 또는 1 kDa 내지 50 kDa의 분자량을 가진다.
일부 실시양태들에서, BSP에 연결된 수용성 중합체는 폴리알킬렌 글리콜 부분을 포함한다. 일부 실시양태들에서, BSP에 혼입된 비천연적으로 코딩된 아미노산 잔기는 카르보닐기, 아미노옥시기, 히드라지드기, 히드라진, 세미카르바지드기, 아지드기 또는 알킨기를 포함한다. 일부 실시양태들에서, BSP에 혼입된 비천연적으로 코딩된 아미노산 잔기는 카르보닐 부분을 포함하고, 수용성 중합체는 아미노옥시, 히드라지드, 히드라진 또는 세미카르바지드 부분을 포함한다. 일부 실시양태들에서, BSP에 혼입된 비천연적으로 코딩된 아미노산 잔기는 알킨 부분을 포함하고, 수용성 중합체는 아지드 부분을 포함한다. 일부 실시양태들에서, BSP에 혼입된 비천연적으로 코딩된 아미노산 잔기는 아지드 부분을 포함하고, 수용성 중합체는 알킨 부분을 포함한다.
본 발명은 또한 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 BSP, 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태들에서, 비천 연적으로 코딩된 아미노산은 수용성 중합체에 연결된다.
본 발명은 또한 셀렉터 코돈을 포함하는 BSP를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 제공한다. 일부 실시양태들에서, 세포는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 BSP로 치환하기 위한 직교성 (orthogonal) RNA 합성효소 및/또는 직교성 tRNA를 포함한다.
본 발명은 또한 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 BSP의 제조 방법을 제공한다. 일부 실시양태들에서, 방법은 BSP를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드들, 직교성 RNA 합성효소 및/또는 직교성 tRNA를 포함하는 세포를 BSP의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양하고; 세포 및/또는 배지로부터 BSP를 정제하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 BSP의 치료 반감기, 혈청 반감기 또는 순환기를 증가시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 BSP의 면역원성을 조절하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태들에서, 방법은 천연 발생 BSP 내의 하나 이상의 아미노산 중 임의의 것을 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환하고/하거나, BSP를 링커, 중합체, 수용성 중합체 또는 생물학적 활성 분자로 연결하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 유효량의 본 발명의 BSP를 이용하여 당해 치료가 필요한 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태들에서, 방법은 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 BSP, 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 치료 유효량의 약제학적 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 수용성 중합체에 연결된다.
본 발명은 또한 하나 이상의 아미노산이 비천연적으로 코딩된 아미노산에 의해 치환되는 것을 제외하고는, 서열 번호 1, 2, 3, 21, 또는 임의의 기타 GLP-1 폴리펩티드 서열, 서열 번호 22, 24, 또는 임의의 기타 T-20 폴리펩티드 서열, 또는 서열 번호 23 또는 임의의 기타 펩티드 YY 서열에 나와 있는 서열을 포함하는 BSP를 제공한다. 일부 실시양태들에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 수용성 중합체에 연결된다. 일부 실시양태들에서, 수용성 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜) 부분을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 카르보닐기, 아미노옥시기, 히드라지드기, 히드라진기, 세미카르바지드기, 아지드기 또는 알킨기를 포함한다.
본 발명은 또한 약제학적으로 허용가능한 담체, 및 서열 번호 1, 2, 3, 21, 또는 임의의 기타 GLP-1 폴리펩티드 서열, 서열 번호 22, 24, 또는 임의의 기타 T-20 폴리펩티드 서열, 또는 서열 번호 23 또는 임의의 기타 펩티드 YY 서열에 나와 있는 서열을 포함하는 BSP를 포함하는 약제학적 조성물로서, 하나 이상의 아미노산이 비천연적으로 코딩된 아미노산에 의해 치환된 것인 조성물을 제공한다. 일부 실시양태들에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 당 부분을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 수용성 중합체는 당 부분을 통해 폴리펩티드에 연결된다. 일부 실시양태들에서, 링커, 중합체 또는 생물학적 활성 분자가 당 부분을 통해 BSP에 연결된다.
본 발명은 또한 단일 아미노산에서 BSP에 대한 공유 결합에 의해 연결된 수용성 중합체를 포함하는 BSP를 제공한다. 일부 실시양태들에서, 수용성 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜) 부분을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 수용성 중합체에 공 유 연결된 아미노산은 폴리펩티드 내에 존재하는 비천연적으로 코딩된 아미노산이다.
본 발명은 하나 이상의 링커, 중합체 또는 생물학적 활성 분자를 포함하는 BSP로서, 상기 링커, 중합체 또는 생물학적 활성 분자가 폴리펩티드에 리보좀내 혼입된 비천연적으로 코딩된 아미노산의 작용기를 통해 폴리펩티드에 부착된 것인 BSP를 제공한다. 일부 실시양태들에서, BSP는 모노PEG화된다. 본 발명은 또한 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산에 부착된 링커, 중합체 또는 생물학적 활성 분자를 포함하는 BSP로서, 상기 비천연적으로 코딩된 아미노산이 예비선택된 부위에서 폴리펩티드로 리포좀형으로 혼입된 것인 BSP를 제공한다.
다른 한 실시양태에서, 하나 이상의 비천연 발생 아미노산을 포함하는 BSP의 PEG를 비제한적 예로 포함하는 다른 한 분자로의 접합은, 비천연 아미노산으로의 접합을 위해 이용되는 특유의 화학적 반응으로 인해 실질적으로 정제된 BSP를 제공한다. 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 BSP의 다른 한 분자, 예컨대 PEG로의 접합은, 접합 단계 전 또는 후에 수행되는 다른 정제 기법과 함께 수행되어, 실질적으로 순수한 BSP를 제공할 수 있다.
본 발명은 또한 식 (LT)-P-T'(식 중에서, (LT)는 국지화 펩티드(L), 택 또는 링커(T), 국지화 펩티드(L)와 택 또는 링커(T)(임의의 순서), 메티오닌으로 이루어진 군으로부터 선택되거나 부재하고; P는 BSP 서열을 포함하며; T'는 택 또는 링커를 포함하거나 부재하며, 여기에서 L, T, P, 또는 T'는 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함함)을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명은 또한 식 F-(LT)-P-T'-F'(식 중에서, F는 폴리펩티드 서열을 포함하거나 부재하고; (LT)는 국지화 펩티드(L), 택 또는 링커(T), 국지화 펩티드(L)와 택 또는 링커(T)(임의의 순서), 메티오닌으로 이루어진 군으로부터 선택되거나 부재하고; P는 100개 이하의 아미노산을 가지는 원하는 폴리펩티드 서열을 포함하고, F 또는 F'와 상이하며; T'는 택 또는 링커를 포함하거나 부재하며, F'는 폴리펩티드 서열을 포함하거나 부재하며, 여기에서, F, L, T, P, T' 또는 F'는 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함함)을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. P는 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 BSP를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 폴리펩티드 코딩 서열에 작용적으로 연결된 프로모터 서열을 포함하는 핵산 분자로서, 상기 폴리펩티드 코딩 서열이 식 (WX)-Z(식 중에서, (WX)는 국지화 펩티드(W)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 택 또는 링커(X)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 국지화 펩티드(W)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 택 또는 링커(X)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(임의의 순서임)로 이루어진 군으로부터 선택되거나 부재하고; Z는 원하는 BSP를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기에서 W, X 또는 Z를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 셀렉터 코돈을 포함함)을 가지는 것인 핵산 분자를 제공한다. 핵산 분자는 Z에 작용적으로 연결된 -Y'(여기에서, Y'는 택을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기에서 상기 택을 코딩하는 상기 뉴클레오티드 서열은 임의적으로 셀렉터 코돈을 포함함)를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 a) 식 (LT)-P-T'(식 중에서, (LT)는 국지화 펩티드(L), 택 또는 링커(T), 국지화 펩티드(L)와 택 또는 링커(T)(임의의 순서), 메티오닌으로 이루어진 군으로부터 선택되거나 부재하고; P는 BSP 서열을 포함하며; T'는 택 또는 링커를 포함하거나 부재하며, 여기에서 L, T, P 또는 T'는 선택된 조건 하에서 하나 이상의 펩티드 결합을 절단하도록 결정된 작용기를 갖는 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함함)을 포함하는 폴리펩티드를 재조합 숙주 세포에서 생성시키고; b) 하나 이상의 펩티드 결합을 적어도 부분적으로 절단하기에 충분한 시간 동안 선택 조건 하에서 폴리펩티드를 반응시키며; c) 반응 생성물로부터 P를 포함하는 펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 치료 유효량의 GLP-1 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함하는, 당해 처리가 필요한 포유류에서의 혈중 포도당 수준을 정상화하는 방법을 포함한다. 본 발명은 또한 치료 유효량의 T-20 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함하는, 당해 처리가 필요한 포유류에서의 바이러스 수준을 조절하는 방법을 포함한다. 본 발명은 또한 치료 유효량의 PYY 폴리펩티드를 당해 처리가 필요한 포유류에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다.
도 1 - GLP-1-Fc 융합 단백질을 포함하는 GLP-1 이량체성 폴리펩티드를 개략적으로 나타내는 도면이다.
도 2 - GLP-1 및 엑센딘-4의 나선형 비교를 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 3 - GLP-1 및 엑센딘-4의 구조의 비교의 다이어그램이 나와 있다.
도 4 - 엑센딘 또는 GLP-1 유사체의 설계법을 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 5 - 특별한 구조적 특성을 갖는 GLP-1 유사체의 설계법을 개략적으로 나 타내는 도면이다.
도 6 - 분자내 가교를 갖는 GLP-1 폴리펩티드의 설계 전략법을 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 7 - GLP-1에서의 분자내 가교를 위한 가능한 화학 전략법을 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 8 - GLP-1 발현을 위한 구축물 (construct)을 나타내는 도면이다.
도 9 - T-20 및 TEX로의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 혼입하기 위한 구축물이 나와 있다(도 9, 패널 A). 도 9, 패널 B는 CNBr 절단 전 및 후의 T-20 폴리펩티드를 개략적으로 나타내는 도면이다.
도 10 - 야생형 T-20 및 TEX 서열의 비교가 도 10에 나와 있고, 앰버 코돈으로 치환된 코돈에 의해 코딩된 잔기가 별표로 표시되어 있다.
도 11 - T-20 및 TEX 항바이러스 활성을 시험하기 위한 생체외 융합 검정을 개략적으로 도시한 도면이다.
도 12 - T20 651 억제(도 12, 패널 A) 및 TEX 636 억제(도 12, 패널 B)의 쿠마시 염색 폴리아크릴아미드 겔 사진이다. 패널 A 및 B에 나와 있는 샘플의 웨스턴(항-His)이 도 12, 패널 C 및 D에 나와 있다. 도 12, 패널 E는 T-20(T-20-Mut651) 및 TEX(TEX-Mut636)에서 별표로 표시된 p-아세틸-페닐알라닌으로 치환된 잔기를 보여준다.
정의
본 발명은 본원에 기재된 특별한 방법, 프로토콜, 세포주, 구축물 및 시약들에 제한되지 않고, 자체 변형될 수 있음을 이해하도록 한다. 또한, 본원에 사용된 용어들은 특별한 실시양태들을 단지 설명하고자 하는 목적을 위한 것으로서, 첨부된 특허청구범위에 의해서만 제한되는 본 발명의 범주를 제한하고자 하는 의도는 없음을 이해하도록 한다.
본문 및 첨부된 특허청구범위에 기재된 단일 형태(영문 관사)의 "a", "an" 및 "the"는 문맥상 달리 명백히 달리 표시되는 것이 아닌 한, 복수 표현을 포함한다. 따라서, 예를 들어 표현 "BSP" 또는 "GLP-1", "T-20" 또는 "PYY"는 하나 이상의 그러한 폴리펩티드를 가리키고, 이에는 당업자에게 공지된 그것의 균등물이 포함된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 기재된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 통상 이해되어지는 바와 동일한 의미를 가진다. 본원에 기재된 것들과 유사하거나 균등한 임의의 방법, 장치 및 물질이 본 발명의 수행 또는 시험에 사용될 수 있으나, 바람직한 방법, 장치 및 물질이 이제 설명된다.
본원에 언급된 모든 공보 및 특허는 예를 들어, 본 발명에 사용될 수 있는, 공보들에 기재된 구축물 및 방법을 기재하고 개시하기 위한 목적으로 참고로 본원에 인용된다. 본원에 논의된 공보들은 단지의 본원 출원일 이전의 개시 내용에 대해서만 제공된 것이다. 본원의 그 어느 것도 이전 발명에 의해 또는 임의의 기타 이유로 인해 발명자가 그러한 개시 내용에 선행하도록 하는 권한이 있음을 인정하는 것으로 간주되어서는 안된다.
"생합성 폴리펩티드" 또는 "BSP"는 셀렉터 코돈과 함께 mRNA로부터 생성된 펩티드 결합에 의해 공유 연결된 약 100개 이하의 아미노산 잔기의 중합체를 가리킨다. BSP에는 "GLP-1", "T-20" 및 "PYY", 또한 "GLP-1 폴리펩티드", "T-20 폴리펩티드" 및 "PYY 폴리펩티드"가 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. BSP는 길이가 약 100개 아미노산 초과인 중합체의 단편일 수 있고, 비제한적 예로서 리더 서열 또는 분비 신호 서열과 같은 부가적 아미노산을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
"폴리펩티드"에 관한 기재는 동등하게 "펩티드"의 기재에 적용되고, 그 역도 그러하다. 용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 천연 발생 아미노산 중합체, 및 하나 이상의 아미노산 잔기가 비천연적으로 코딩된 아미노산인 아미노산 중합체에 적용된다. 당업자는 단백질에 대한 기법 및 변형이 폴리펩티드 및 펩티드에 적용가능하고, 이에 따라 BSP에 적용가능하다는 것을 이해할 것이다.
용어 "실질적으로 정제된"은 천연 발생 환경, 즉 본연의 세포, 또는 재조합으로 생성된 BSP의 경우에는 숙주 세포에서 발견되는 단백질을 정상적으로 동반하거나 그것과 반응하는 성분이 실질적으로 또는 본질적으로 없을 수 있는 BSP를 가리킨다. 세포성 물질이 실질적으로 없을 수 있는 BSP는 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만, 또는 약 1% 미만(건조 중량 기준)의 오염 단백질을 갖는 단백질의 제제를 포함한다. BSP 또는 그것의 변종체가 숙주 세포에 의해 재조합으로 생성될 때, 단백질은 세포의 건조 중량의 약 30%, 약 25%, 약 20%, 약 15%, 약 10%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2% 또는 약 1%, 또는 그 이하로 존재할 수 있다. BSP 또는 그것의 변종체가 숙주 세포에 의해 재조합으로 생성될 때, 단백질은 세포의 건조 중량의 약 5 g/L, 약 4 g/L, 약 3 g/L, 약 2 g/L, 약 1 g/L, 약 750 mg/L, 약 500 mg/L, 약 250 mg/L, 약 100 mg/L, 약 50 mg/L, 약 10 mg/L 또는 약 1 mg/L, 또는 그 이하로 배지 내에 존재할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 "실질적으로 정제된" BSP는 SDS/PAGE 분석, RP-HPLC, SEC 및 모세관 전기영동과 같은 적당한 방법에 의해 결정될 때, 약 30% 이상, 약 35% 이상, 약 40% 이상, 약 45% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상의 순도 수준, 구체적으로는 약 75%, 80%, 85% 이상의 순도 수준, 더욱 구체적으로는 약 90% 이상의 순도 수준, 약 95% 이상의 순도 수준, 약 99% 이상의 순도 수준, 또는 그 이상을 가질 수 있다.
"재조합 숙주 세포" 또는 "숙주 세포"는 삽입에 사용되는 방법, 예를 들어 직접적 흡수, 전달(transduction), f-메이팅(f-mating) 또는 재조합 숙주 세포를 생성시키기 위해 당업계에 공지된 기타 방법에 상관없이, 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 가리킨다. 외인성 폴리뉴클레오티드는 비일체화 벡터, 예를 들어 플라스미드로서 유지되거나, 대안적으로 숙주 게놈에 일체화될 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "매질(medium, media)"에는, 세균 숙주 세포, 효모 숙주 세포, 곤충 숙주 세포, 식물 숙주 세포, 진핵생물 숙주 세포, 포유동물의 숙주 세포, CHO 세포 또는 E. 콜라이 및 세포 내용물을 포함한, 임의의 숙주 세포를 지지하거나 함유할 수 있는 임의의 배지, 용액, 고체, 반고체 또는 경질 지지체가 포함된다. 따라서, 그 용어는 숙주 세포가 성장된 매질, 예컨대 증식 단계 전 또는 후의 매질을 포함한, BSP가 분비된 매질을 포함할 수 있다. 그 용어는 또한 예컨대 BSP가 세포내 생성되고, 숙주 세포가 분해되거나 붕괴되어 BSP를 방출하는 경우에서와 같이, 숙주 세포 분해물을 함유하는 완충액 또는 시약을 포함할 수 있다.
단백질 재접힘(refolding)에 대해 본원에 사용되는 "환원제"는 술프히드릴기를 환원 상태로 유지시키고, 세포내 또는 세포간 디술피드 결합을 환원시키는 임의의 화합물 또는 물질로 정의된다. 적당한 환원제에는 디티오트레이톨(DTT), 2-메르캅토에탄올, 디티오에리트리톨, 시스테인, 시스테아민(2-아미노에탄티올) 및 환원된 글루타티온이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 매우 다양한 환원제들이 본 발명의 방법 및 조성물에 사용하기에 적당하다는 것이 당업자에게 자명하다.
단백질 재접힘에 대해 본원에 사용되는 "산화제"는 화합물로부터 전자를 제거하여 산화시킬 수 있는 임의의 화합물 또는 물질로 정의된다. 적당한 산화제에는 산화된 글루타티온, 시스틴, 시스타민, 산화된 디티오트레이톨, 산화된 에리트리톨 및 산소가 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 매우 다양한 산화제들이 본 발명의 방법에 사용하기에 적당하다는 것이 당업자에게 자명하다.
"변성화제" 또는 "변성제"는 폴리펩티드의 가역적 펴짐을 일으키게 되는 임의의 화합물 또는 물질로 정의된다. 변성화제 또는 변성제의 강도는 특별한 변성화제 또는 변성제의 성질 또는 농도 모두에 의해 결정된다. 적당한 변성화제 또는 변성제는 무질서유발제, 세제, 유기 용매, 수혼화성 용매, 인지질, 또는 그러한 제제들의 2종 이상의 조합일 수 있다. 적당한 무질서유발제에는 우레아, 구아니딘 및 나트륨 티오시아네이트가 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 유용한 세제에는 강한 세제, 예컨대 나트륨 도데실 술페이트 또는 폴리옥시에틸렌 에테르(예컨대, 트윈(Tween) 또는 트리톤(Triton) 세제), 사르코실(Sarkosyl), 마일드한 비이온성 세제(예컨대, 디기토닌), 마일드한 양이온성 세제, 예컨대 N→2,3-(디올레일옥시)-프로필-N,N,N-트리메틸암모늄, 마일드한 이온성 세제(예컨대, 나트륨 콜레이트 또는 나트륨 데옥시콜레이트) 또는 쯔비터이온성 세제(술포베타인(쯔비터제), 3-(3-클로로아미도프로필)디메틸암모니오-1-프로판 술페이트(CHAPS) 및 3-(3-클로로아미도프로필)디메틸암모니오-2-히드록시-1-프로판 술포네이트(CHAPSO)를 비제한적 예로 포함함)가 포함될 수 있으나, 이들에 제한되지 않는다. 유기, 수혼화성 용매, 예컨대 아세토니트릴, 저급 알칸올(특히, C2-C4 알칸올, 예컨대 에탄올 또는 이소프로판올), 또는 저급 알칸디올(특히 C2-C4 알칸디올, 예컨대 에틸렌-글리콜)이 변성제로서 사용될 수 있다. 본 발명에 유용한 인지질은 천연 발생 인지질, 예컨대 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 및 포스파티딜이노시톨 또는 합성 인지질 유도체 또는 그것의 변종체, 예컨대 디헥사노일포스파티딜콜린 또는 디헵타노일포스파티딜콜린일 수 있다.
본원에 사용되는 "재접힘"은 디술피드 결합을 함유하는 폴리펩티드를, 디술피드 결합에 대해 부적절하게 접혀있거나 접히지 않은 상태에서 본연의 구조 또는 적절하게 접힌 구조로 변환시키는 임의의 공정, 반응 또는 방법을 나타낸다.
본원에 사용되는 "동시 접힘(cofolding)"은 상호 반응하여, 접히지 않거나 부적절하게 접힌 폴리펩티드를 본연의 적절하게 접힌 폴리펩티드의 변환시키는, 2개 이상의 폴리펩티드를 이용하는 재접힘 공정, 반응 또는 방법을 가리킨다.
본원에 사용되는 "글루카곤-유사 펩티드-1" 또는 "GLP-1"은 본원에 각기 참고로 인용되는, U.S. 특허 공보 No. 20040127412, EP 0699686-A2 및 EP 0733,644, U.S. 특허 No. 5,545,618; 5118,666; 5,512,549; WO 91/11457; WO 90/11296; WO 87/06941에 기재된 것들을 비제한적 예로 포함하는 인간 GLP-1, 및 GLP-1 유사체, GLP-1 아형태, GLP-1 모방체, GLP-1 단편, 혼성 GLP-1 단백질, 융합 단백질, 올리고머, 및 그것의 다량체, 동종체, 글리코실화 패턴 변종체 및 뮤테인의 하나 이상의 생물학적 활성을, 그것의 생물학적 활성에 상관없이, 또한 (cDNA, 게놈 DNA, 합성 DNA 또는 기타 형태의 핵산으로부터 생성되는)재조합, 합성, 유전자도입 및 유전자 활성화 방법을 비제한적 예로 포함하는, 그것의 합성 또는 제조 방법에 상관없이 가지는 폴리펩티드 및 단백질을 포함한다. 수많은 GLP-1 유사체 및 유도체가 공지되어 있고, 본원에 "GLP-1 화합물"로 칭해진다. 이들 GLP-1 유사체에는 GILA-몬스터의 독액에서 발견되는 펩티드인 엑센딘이 포함된다. GLP-1의 구체예에는 GLP-1(3-36), GLP-1(3-37), GLP-1(1-45) 및 엑센딘 1 내지 4가 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 또한, [Maniatis, T. 등, Molecular Biology: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y.(1982)]에 개시된 바와 같이, 재조합 DNA 기술을 이용하여 GLP-1을 수득하고, 당업자에게 개시된 방법에 의해 숙주 세포 내에 GLP-1를 생성시킬 수 있다.
용어 "인간 GLP-1(GLP-1)" 또는 "GLP-1 폴리펩티드"는 본원에 기재된 GLP-1, 및 천연 발생 GLP-1의 하나 이상의 생물학적 활성을 보유하는 폴리펩티드를 포함한다. GLP-1 폴리펩티드는 또한 천연 발생 인간 GLP-1의 약제학적으로 허용가능한 염 및 그것의 전구약물, 및 염, 다형태(polymorph), 수화물, 용매화물, 생물 활성 단편, 생물 활성 변종체 및 입체이성질체의 전구약물, 및 천연 발생 인간 GLP-1의 작용자, 모방체 및 길항자 변종체, 엑센딘 1 내지 4를 포함한 엑센딘 계열, 및 그것의 폴리펩티드 융합체를 포함한다. GLP-1 폴리펩티드의 예에는 본원에 참고로 인용되는 U.S. 특허 No. 5,118,666에 기재된 것들이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 아미노 말단, 카르복실 말단, 또는 양 부위 모두에 부가적 아미노산을 포함하는 융합체가 용어 "GLP-1 폴리펩티드"에 의해 포괄된다. 예시적 융합체에는 예컨대, 메티오닌이 GLP-1의 재조합 발현에서 초래된 GLP-1의 N-말단에 연결되어, 메티오닐 GLP-1, (폴리-히스티딘 또는 친화도 에피토프를 비제한적 예로 포함하는) 정제를 목적으로 하는 융합체; 혈청 알부민 결합 펩티드를 갖는 융합체; 혈청 단백질, 예컨대 혈청 알부민을 갖는 융합체; 면역글로불린 분자, 예컨대 Fc의 불변 영역을 갖는 융합체; 및 지방산을 갖는 융합체가 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 단일 아미노산 변종체 또는 스플라이스 변종체와 같은 변종체와 같이, 각종 형태들의 천연 발생 GLP-1 핵산 및 아미노산 서열이 공지되어 있다.
용어 "GLP-1 폴리펩티드"는 하나 이상의 아미노산 치환, 부가 또는 결실을 포함하는 GLP-1 폴리펩티드를 포괄한다. 작용자 활성의 증가, 폴리펩티드의 용해도 증가, 폴리펩티드의 길항자로의 전환, 펩티다제 또는 프로테아제 감수성 등의 감소와 같은(단, 이에 제한되지는 않음) GLP-1의 생물학적 활성들 중 하나 이상을 조절하는 치환을 비제한적 예로 포함하는, 천연 발생 GLP-1 내의 매우 다양한 아미노산 위치들에서의 예시적 치환이 기재되었고, 이는 용어 "GLP-1 폴리펩티드"에 의해 포괄된다.
인간 GLP-1 길항자에는 7, 8, 9, 22, 18, 29, 25, 32, 21, 28, 17, 24, 31, 및 20(서열 번호 1, 2, 3, 21, 또는 임의의 기타 GLP-1 서열)에서의 치환을 갖는 것들이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 일부 실시양태들에서, GLP-1 길항자는 GLP-1 분자의 수용체 결합 영역 내에 존재하는 수용성 중합체에 연결된 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 수용성 중합체는 아미노산 위치: 7, 8, 9, 22, 18, 29, 25, 32, 21, 28, 17, 24, 31 및 20(서열 번호 1, 2, 3, 21, 또는 임의의 기타 GLP-1 폴리펩티드) 중 하나 이상에 있는 GLP-1 폴리펩티드에 결합된다.
GLP-1 아미노산 서열, 및 엑센딘-4 및 엑센딘-3 아미노산 서열에 대해, 본원에서의 서열 번호 1(GLP-1(7-36)), 서열 번호 2(GLP-1(7-37)), 서열 번호 3(엑센딘-4), 및 서열 번호 21(엑센딘-3)을 각기 참조한다. 일부 실시양태들에서, 본 발명의 GLP-1 폴리펩티드는 GLP-1 폴리펩티드의 서열 번호 1, 또는 서열 번호 2, 또는 서열 번호 3, 또는 서열 번호 21, 또는 임의의 기타 서열과 실질적으로 일치한다. GLP-1 변이체 및 변이체 GLP-1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자가 공지되어 있다. GLP-1 변이체의 예에는 본원에 참고로 인용되는 U.S. 특허 공보 No. 2004 0127412 A1에 개시된 것들이 포함된다.
GLP-1 펩티드 유사체, 접합체, 융합 단백질, 및 약물 전달 또는 조합 치료를 포함한 수많은 GLP-1 산물들이 임상전(preclinical) 및 임상 개발 중이다. 개발 중인 산물들 중 일부는 엑세나티드(Exenatide)(AC2993, 아밀린(Amylin)/엘리 릴리(Eli Lilly)), AVE-0010(ZP10, 질란드 팜(Zealand Pharm)/아벤티스(Aventis)), BIM-5 1077(입센(Ipsen)/로쉐(Roche)), 리라글루티드(Liraglutide)(NN2211, 노ㅗ 노르디스크(Novo Nordisk)), CJC-1131(콘쥬켐(Conjuchem)), 알부곤(Albugon)(휴먼 게놈 사이언시스(Human Genome Sciences)/글락소 스미쓰 클라인(Glaxo Smith Kline)), GLP-1 트랜스페린(바이오렉시스(Biorexis)), AC2993 LAP(아밀린/알케르메스(Alkermes)), 비강용 GLP-1(선토리(Suntory)) 및 GLP-1-INT(트랜지션 써래퍼틱스(Transition Therapeutics))이다.
GLP-1의 생물학적 활성이 개시되었고 당업계에 공지되어 있으며, 이는 예를 들어 본원에 참고로 인용되는 U.S 특허 공보 No. 20040082507 A1 및 No. 20040232754 A1에서 찾아볼 수 있다.
GLP-1(7-37)의 변종체 및 그것의 유사체도 또한 개시되었다. 이들 변종체 및 유사체에는 예를 들어, Gln9-GLP-1(7-37), D-Gln9-GLP-1(7-37), 아세틸-Lys9-GLP-1(7-37), Thr16-Lys18-GLP-1(7-37), Lys18-GLP-1(7-37) 등, 및 예를 들어 산 부가 염, 카르복실레이트 염, 저급 알킬 에스테르, 및 아미드를 포함한 상기 것들의 유도체가 포함된다(예컨대, 본원에 참고로 인용되는, WO 91/11457; EP 0733,644(1996); 및 U.S. 특허 No. 5,512,549(1996) 참고). 일반적으로, 각종 개시된 형태들의 GLP-1가 인슐린 분비(인슐린-분비 작용) 및 cAMP 형성을 자극하는 것으로 알려져 있다(예컨대, [Mojsov, S., Int. J. Peptide Protein Research, 40: 333-343(1992)] 참고).
본원에 사용되는 "T-20" 또는 "DP-178"은 인간 DP-178, 및 DP-178 유사체, DP-178 아형태, DP-178 모방체, DP-178 단편, 혼성 DP-178 단백질, 융합 단백질, 올리고머, 및 그것의 다량체, 동종체, 글리코실화 패턴 변종체 및 뮤테인의 하나 이상의 생물학적 활성을, 그것의 생물학적 활성에 상관없이, 또한 (cDNA, 게놈 DNA, 합성 DNA 또는 기타 형태의 핵산으로부터 생성되는) 재조합, 합성, 유전자도입 및 유전자 활성화 방법을 비제한적 예로 포함하는, 그것의 합성 또는 제조 방법에 상관없이 가지는 폴리펩티드 및 단백질을 포함한다. 용어의 하이픈 연결 형태 및 하이픈 비연결 형태(T20, DP178)는 동등하다.
용어 "인간 DP-178" 또는 "DP-178 폴리펩티드"는 본원에 기재된 DP-178 또는 T-20, 및 천연 발생 DP-178의 하나 이상의 생물학적 활성을 보유하는 폴리펩티드를 가리킨다. "DP-178"에는 DP-178의 부분, 유사체 및 동종체가 포함되고, 이들 모두는 항바이러스 활성을 나타낸다. 항바이러스 활성에는 비감염 CD-4+ 세포로의 HIV 전달의 억제가 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명은 인간 및 비인간 모두에서의 레트로바이러스 감염, 특히 HIV의 비감염 세포로의 전달의 억제제로서의 DP-178 및 DP-178 단편 및/또는 유사체 또는 동종체의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 펩티드에 의해 전달이 억제될 수 있는 비레트로바이러스성 바이러스에는 외피가 있는 바이러스, 인간 호흡 합포체 바이러스, 개 디스템퍼 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 인간 파라인플루엔자 바이러스, 및 인플루엔자 바이러스가 포함되나, 이들에 제한되지 않는다.
DP-178 폴리펩티드에는 또한 천연 발생 인간 DP-178의 약제학적으로 허용가능한 염 및 전구약물, 및 염, 다형태, 수화물, 용매화물, 생물 활성 단편, 생물 활성 변종체 및 입체이성질체의 전구약물, 및 천연 발생 인간 DP-178의 작용자, 모방체, 길항자 변종체, 및 그것의 폴리펩티드 융합체가 포함된다. 아미노 말단, 카르복실 말단, 또는 양 부위 모두에 부가적 아미노산을 포함하는 융합체가 용어 "DP-178 폴리펩티드"에 의해 포괄된다. 예시적 융합체에는 예컨대, 메티오닌이 DP-178의 재조합 발현으로부터 초래된 DP-178의 N-말단에 연결된 메티오닐 DP-178, (폴리-히스티딘 또는 친화도 에피토프로의(단, 이에 제한되지 않음)) 정제를 목적으로 하는 융합체, N-말단에 연장된 T-20, 혈청 알부민 결합 펩티드를 갖는 융합체; 혈청 단백질, 예컨대 혈청 알부민을 갖는 융합체; 면역글로불린 분자, 예컨대 Fc의 불변 영역을 갖는 융합체; 및 지방산을 갖는 융합체가 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 단일 아미노산 변종체 또는 스플라이스 변종체와 같은 변종체와 같이, 각종 형태들의 천연 발생 DP-178 핵산 및 아미노산 서열이 공지되어 있다.
용어 "DP-178 폴리펩티드"는 하나 이상의 아미노산 치환, 부가 또는 결실을 포함하는 DP-178 폴리펩티드를 포괄한다. 작용자 활성의 증가, 폴리펩티드의 용해도 증가, 폴리펩티드의 길항자로의 전환, 펩티다제 또는 프로테아제 감수성의 감소 등과 같은(단, 이에 제한되지 않음), DP-178의 생물학적 활성들 중 하나 이상을 조절하는 치환을 비제한적 예로 포함하는, 천연 발생 DP-178 내의 매우 다양한 아미노산 위치들에서의 예시적 치환이 기재되었고, 이는 용어 "DP-178 폴리펩티드"에 의해 포괄된다.
DP-178 아미노산 서열에 대해서는, 본원의 서열 번호 22를 각기 참조한다. 일부 실시양태들에서, 본 발명의 DP-178 폴리펩티드는 서열 번호 22, 24, 또는 DP-178 폴리펩티드의 임의의 기타 서열과 실질적으로 일치한다. DP-178 변이체 및 변이체 DP-178 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자가 공지되어 있다.
시중 입수가능한 형태의 DP-178은 푸제온(Fuzeon)
Figure 112007014691585-PCT00004
(엔푸비르타이드(enfuvirtide), 로쉐 라보라토리즈 인코포레이티드(Roche Laboratories Inc.) 및 트리메리스 인코포레이티드(Trimeris, Inc.))이다. 푸제온
Figure 112007014691585-PCT00005
은 아세틸화 N 말단 및 C-말단으로서의 카르복사미드를 가진다. 그것은, 진행 중인 항레트로바이러스 치료법에도 불구하고 HIV-1 복제를 나타내는 HIV-1 환자에 대해 다른 항바이러스와 조합되어 사용된다.
본원에 사용되는 "PYY" 및 "펩티드 YY"는 인간 PYY, 및 PYY 유사체, PYY 아형태, PYY 모방체, PYY 단편, 혼성 PYY 단백질, 융합 단백질, 올리고머, 및 그것의 다량체, 동종체, 글리코실화 패턴 변종체 및 뮤테인의 하나 이상의 생물학적 활성을, 그것의 생물학적 활성에 상관없이, 또한 (cDNA, 게놈 DNA, 합성 DNA 또는 기타 형태의 핵산으로부터 생성되는) 재조합, 합성, 유전자도입 및 유전자 활성화 방법을 비제한적 예로 포함하는 그것의 합성 또는 제조 방법에 상관없이 가지는 폴리펩티드 및 단백질을 포함한다.
용어 "PYY" 또는 "PYY 폴리펩티드"는 본원에 기재된 PYY, 및 천연 발생 PYY의 하나 이상의 생물학적 활성을 보유하는 폴리펩티드를 가리킨다. "PYY"에는 PYY(3-36), 전장 PYY, PYY(22-36) 및 PYY의 DPPIV 내성 변종체를 비제한적 예로 포함하는, PYY의 부분, 유사체 및 동종체가 포함된다. 용어 "PYY"에는 국제 공보 No. WO 02/47712(본원에 참고로 인용되는 U.S. 특허 공보 No. 2002/0141985에 대응하는 PCT 대응 출원)의 서열 번호 2, 및 본원에 참고로 인용되는 [Tatemoto, Proc Natl Acad Sci U.S.A. 79: 2514-8, 1982]에 나와 있는 인간 전장 36개 아미노산 펩티드가 모두 포함된다.
PYY 작용자는 또한 용어 "PYY"에 포함된다. PYY 작용자에는 영양소 유용성을 감소시키는 PYY의 효과를 나타내는 임의의 화합물, 예를 들어 (1) WO 02/47712 및 U.S. 특허 공보 No. 2002/0141985의 실시예 1, 2, 5 또는 6에 기재된, 음식 섭취, 위 배출, 췌장액 분비, 또는 체중 감량 검정에서의 활성을 가지고, (2) Y 수용체 검정에서(WO 02/47712 및 U.S. 특허 공보 No. 2002/0141985의 실시예 10), 또는 예컨대, 하측두 영역(WO 02/47712 및 U.S. 특허 공보 No. 2002/0141985의 실시예 9)를 포함한, Y 수용체가 많은 특정 조직으로부터의 표지된 PYY 또는 PYY [3-36]을 이용하는 경쟁적 결합 검정에서, 특이적으로 결합하는 화합물이 포함되고, 여기에서, PYY 작용자는 췌장 폴리펩티드가 아니다. 바람직하게, PYY 작용자는 약 1 μM 초과의 친화도, 더욱 바람직하게는 약 1 초과 내지 약 5 nM의 친화도로 상기와 같은 검정에서 결합할 것이다.
그러한 작용자는 관능적 PYY 도메인의 폴리펩티드, PYY의 활성 단편, 또는 화학적 또는 작은 분자를 포함할 수 있다. PYY 작용자는 펩티드 또는 비펩티드 화합물일 수 있고, 이에는 전형적으로 PYY 수용체 또는 기타 수용체, 또는 PYY 자체가 상호작용함으로써 생물학적 반응을 나타낼 수 있는 수용체에 결합하거나 기타 방식으로 직접 또는 간접적으로 상호작용함에 의해 PYY 활성을 가지는, PYY와 구조적으로 유사한 임의의 화합물을 가리키는 "PYY 작용자 유사체"가 포함된다. 그러한 화합물에는 PYY의 유도체, PYY의 단편, 36개 초과의 아미노산을 갖는 연장된 PYY 분자, 36개 미만의 아미노산을 갖는 절단 PYY 분자, 및 하나 이상의 상이한 아미노산을 갖는 치환 PYY 분자, 또는 상기 것들의 임의의 조합이 포함된다. 그러한 화합물은 또한 PEG화, 아미드화, 글리코실화, 아실화, 황화, 인산화, 아세틸화 및 고리화와 같은 공정에 의해서도 변형될 수 있다.
한 가지 그러한 PYY 작용자 유사체는, WO 02/47712 및 U.S. 특허 공보 No. 2002/0141985의 서열 번호 3으로 확인되고; [Eberlein, Eysselein 등, Peptides 10: 797-803(1989); 및 Grandy, Schimiczek 등, Regul Pept 51: 151-9(1994)]에 기재된 PYY [3-36]이다. 부가적 PYY 단편, 유사체 및 유도체가 U.S. 특허 공보 20050002927에 기재되어 있다. 상기 참조 특허 공보 모두는 본원에 참고로 인용된다.
PYY 폴리펩티드에는 또한 천연 발생 인간 PYY의 약제학적으로 허용가능한 염 및 전구약물, 및 염, 다형태, 수화물, 용매화물, 생물 활성 단편, 생물 활성 변종체 및 입체이성질체의 전구약물, 및 천연 발생 인간 PYY의 작용자, 모방체 및 길항자 변종체, 및 그것의 폴리펩티드 융합체가 포함된다. 아미노 말단, 카르복실 말단, 또는 양 부위 모두에 부가적 아미노산을 포함하는 융합체가 용어 "PYY 폴리펩티드"에 의해 포괄된다. 예시적 융합체에는 예컨대, 메티오닌이 PYY의 N-말단에 연결된 분비 신호 펩티드 또는 그것의 부분이 결여된 PYY의 재조합 발현으로부터 비롯된 메티오닐 PYY, (폴리-히스티딘 또는 친화도 에피토프로의(단, 이에 제한되지 않음)) 정제를 목적으로 하는 융합체; 혈청 알부민 결합 펩티드를 갖는 융합체; 혈청 단백질, 예컨대 혈청 알부민을 갖는 융합체; 면역글로불린 분자, 예컨대 Fc의 불변 영역을 갖는 융합체; 및 지방산을 갖는 융합체가 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 단일 아미노산 변종체 또는 스플라이스 변종체와 같은 변종체와 같이, 천연 발생 PYY 핵산 및 아미노산 서열이 공지되어 있다.
용어 "PYY 폴리펩티드"는 하나 이상의 아미노산 치환, 부가 또는 결실을 포함하는 PYY 폴리펩티드를 포괄한다. 작용자 활성의 증가, 폴리펩티드의 용해도 증가, 폴리펩티드의 길항자로의 전환, 펩티다제 또는 프로테아제 감수성의 감소 등과 같은(단, 이에 제한되지 않음), PYY의 생물학적 활성들 중 하나 이상을 조절하는 치환을 비제한적 예로 포함하는, 천연 발생 PYY 내의 매우 다양한 아미노산 위치들에서의 예시적 치환이 기재되었고, 이는 용어 "PYY 폴리펩티드"에 의해 포괄된다.
PYY(3-36) 아미노산 서열에 대해서는, 본원의 서열 번호 23을 각기 참조한다. 일부 실시양태들에서, 본 발명의 PYY 폴리펩티드는 서열 번호 23 또는 PYY 폴리펩티드의 임의의 기타 서열과 실질적으로 일치한다. PYY 변이체 및 변이 PYY 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자가 공지되어 있다.
각종 참조문헌은 중합체 접합 또는 글리코실화에 의한 폴리펩티드의 변형을 개시하고 있다. 용어 BSP에는 PEG와 같은 중합체에 접합된 폴리펩티드가 포함되고, 이는 시스테인, 리신, 또는 기타 잔기 중 하나 이상의 부가적 유도체화로 이루어질 수 있다. 또한, BSP는 링커 또는 중합체를 포함할 수 있고, 여기에서 링커 또는 중합체가 접합되는 아미노산은 본 발명에 따라 비천연 아미노산일 수 있거나, 리신 또는 시스테인으로의 결합과 같은 당업계에 공지된 기법을 이용하는 천연 코딩 아미노산에 접합될 수 있다.
폴리펩티드의 중합체 변형이 보고되었다. U.S. 특허 No. 4,904,584는 하나 이상의 리신 잔기가 결실되거나 임의의 기타 아미노산 잔기로 치환된 PEG화 리신 결실 폴리펩티드를 개시하고 있다. WO 99/67291은 단백질 상의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실되고, 단백질에 대한 접합을 달성하기에 충분한 조건 하에서 단백질이 PEG와 접촉되는, 단백질의 PEG와의 접합 방법을 개시하고 있다. WO 99/03887은 시스테인 잔기가 폴리펩티드의 특정 영역에 위치한 비필수 아미노산 잔기로 치환된, 성장 호르몬 상과(superfamily)에 속하는 폴리펩티드의 PEG화 변종체를 개시하고 있다. WO 00/26354는 상응하는 모 폴리펩티드에 비해 하나 이상의 부가적 글리코실화 부위를 포함하는, 알레르기성이 감소된 글리코실화 폴리펩티드 변종체의 생산 방법을 개시하고 있다. U.S. 특허 No. 5,218,092는 본연의 폴리펩티드 대비, 하나 이상의 부가적 탄수화물 사슬을 도입하기 위한 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF) 및 기타 폴리펩티드의 변형을 개시하고 있다. PEG화 펩티드의 예에는 GW395058, PEG화 펩티드 트롬보포이에틴 수용체(TPOr) 작용자[de Serres M. 등, Stem Cells. 1999. 17(4): 203-9), 및 성장 호르몬 방출 인자의 PEG화 유사체(PEG-GRP; D'Antonio M 등, Growth Horm IGF Res. 2004 Jun; 14(3): 226-34]가 포함된다.
용어 BSP에는 또한 임의의 아미노산 위치에서 글리코실화된 BSP, N-연결 또는 0-연결 글리코실화 형태의 폴리펩티드를 비제한적 예로 포함하는 글리코실화 BSP들이 포함된다. 단일 뉴클레오티드 변화를 갖는 변종체는 또한 BSP의 생물 활성 변종체로 간주된다. 또한, 스플라이스 변종체도 포함된다. 용어 BSP에는 또한 화학적 수단에 의해 연결되거나, 융합 단백질로서, 또한 예를 들어, 생물학적 활성을 아직 유지하면서도 특정 결실 또는 기타 변형을 가지는 폴리펩티드 유사체로서 발현되는 임의의 유형의 하나 이상의 BSP 또는 임의의 기타 폴리펩티드, 단백질, 탄수화물, 중합체, 소분자, 링커, 리간드, 또는 기타 생물학적 활성 분자의 BSP 이종이량체, 동종이량체, 이종다량체 또는 동종다량체가 포함된다.
각종 참조문헌은 본원에 참고로 인용되는 [J. of Med. Chem. (2000) 43: 1664-1669]에 기재된 GLP-1 모 유사체 및 아실화 부위를 비제한적 예로 포함한, GLP-1의 부가적 변종체, 및 GLP-1의 아실화를 개시하고 있다.
본원에 기재된 GLP-1 내의 아미노산 위치에 대한 모든 표시는 달리 명시되지 않는 한, 서열 번호 1, 2, 3, 또는 21에서의 위치를 기준으로 한다. 당업자는 서열 번호 1, 2, 3, 21, 또는 임의의 기타 GLP-1 서열 내의 위치에 상응하는 아미노산 위치는 GLP-1 융합체, 변종체, 단편 등과 같은 임의의 기타 GLP-1 분자 내에서 용이하게 동정될 수 있고, 예를 들어 시각적 수단, 또는 BLAST와 같은 컴퓨터 프로그램에 의한 서열 정렬을 사용하여, 서열 번호 1, 2, 3, 21 또는 기타 GLP-1 서열 내의 위치에 상응하는 단백질 내의 특별한 위치를 정렬하고 동정할 수 있다. 서열 번호 22, 24 및 임의의 기타 DP-178 서열 또는 서열 번호 23 (PYY(3-36)) 및 임의의 기타 PYY 서열에 대해 유사한 분석들을 수행할 수 있다. 서열 번호 1, 2, 3, 21 또는 기타 GLP-1 서열, 서열 번호 22, 24, 또는 기타 DP-178 서열, 또는 서열 번호 23, 및 임의의 기타 PYY 서열과 관련하여 본원에 기재된 아미노산의 치환, 결실 또는 부가는 본원에 기재되거나 당업계에 공지된 GLP-1, DP-178, 또는 PYY 융합체, 변종체, 단편 등 내의 상응하는 위치에서의 치환, 결실 또는 부가를 또한 가리키고, 이는 본 발명에 의해 포괄된다.
용어 BSP는 하나 이상의 아미노산 치환, 부가 또는 결실을 포함하는 BSP 폴리펩티드를 포괄한다. 본 발명의 BSP는 하나 이상의 비천연 아미노산 변형과 함께 하나 이상의 천연 아미노산의 변형으로 이루어질 수 있다. 비제한적으로, 작용자 활성의 증가, 폴리펩티드의 용해도 증가, 폴리펩티드의 길항자로의 전환, 펩티다제 또는 프로테아제 감수성 등의 감소와 같은, BSP의 생물학적 활성들 중 하나 이상을 조절하는 치환을 비제한적 예로 포함하는, 천연 발생 BSP 내의 매우 다양한 아미노산 위치들에서의 예시적 치환이 기재되었고, 이는 용어 BSP에 의해 포괄된다.
인간 GLP-1 길항자에는, (서열 번호 1, 2, 3, 21, 또는 임의의 기타 GLP-1 서열의) 19, 23, 26, 27, 28, 29, 30 및 33에서의 치환을 갖는 것들이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 일부 실시양태들에서, GLP-1 길항자는 GLP-1 분자의 수용체 결합 영역 내에 존재하는 수용성 중합체에 연결된 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 수용성 중합체는 아미노산 위치: 19, 23, 26, 27, 28, 29, 30 및 33(서열 번호 1, 2, 3, 21, 또는 임의의 기타 GLP-1 폴리펩티드) 중 하나 이상에 있는 GLP-1 폴리펩티드에 결합된다.
일부 실시양태들에서, BSP는 BSP의 생물학적 활성을 조절하는 부가, 치환 또는 결실을 추가로 포함한다. 예를 들어, 부가, 치환 또는 결실은 BSP의 하나 이상의 성질 또는 활성을 조절할 수 있다. 예를 들어, 부가, 치환 또는 결실은 BSP 수용체 또는 결합 상대의 친화도를 조절하거나, 수용체 이량체화를 조절(증가 또는 감소를 비제한적 예로 포함함), 수용체 이량체를 안정화하거나, 결합 상대의 구조 또는 하나 이상의 생물학적 활성을 조절하거나, 순환 반감기를 조절하거나, 치료 반감기를 조절하거나, 폴리펩티드의 안정성을 조절하거나, 펩티다제 또는 프로테아제에 의한 절단을 조절하거나, 투약량을 조절하거나, 방출 또는 생체유용성을 조절하거나, 정제를 촉진하거나, 특별한 투여 경로를 향상 또는 변경시킬 수 있다. 유사하게, BSP는 프로테아제 절단 서열, 반응성 기, 항체-결합 도메인(FLAG 또는 폴리-His를 비제한적 예로 포함함) 또는 기타 친화도 기재 서열(FLAG, 폴리-His, GST 등을 비제한적 예로 포함함) 또는 폴리펩티드의 검출(GFP를 비제한적 예로 포함함), 정제 또는 기타 작업을 향상시키는 연결 분자(비오틴을 비제한적 예로 포함함)를 포함할 수 있다.
용어 BSP는 또한 비천연적으로 코딩된 아미노산 측쇄를 통해 동일하거나 상이한 비천연적으로 코딩된 아미노산 측쇄 또는 천연적으로 코딩된 아미노산 측쇄에 직접적으로, 또는 링커를 간접적으로 연결된 것들을 비제한적 예로 포함하는, 연결된 동종이량체, 이종이량체, 동종다량체 및 이종다량체를 포괄한다. 예시적 링커는 작은 유기 화합물, 폴리(에틸렌 글리콜) 또는 폴리덱스트란과 같은 각종 길이의 수용성 중합체, 또는 각종 길이의 폴리펩티드를 포함한, 이에 제한되지 않는다.
"비천연적으로 코딩된 아미노산"은 20개의 통상의 아미노산 또는 파이로리신 또는 셀레노시스테인 중 어느 것도 아닌 아미노산을 가리킨다. 용어 "비천연적으로 코딩된 아미노산"과 동의적으로 사용될 수 있는 다른 용어는 "비천연 아미노산", "비천연 아미노산", "비천연 발생 아미노산" 및 상기 용어들의 다양하게 하이픈 연결 및 하이픈 비연결된 형태이다. 용어 "비천연적으로 코딩된 아미노산"에는 또한 천연적으로 코딩된 아미노산(20개의 통상의 아미노산 또는 파이로리신 및 셀레노시스테인을 비제한적 예로 포함함)의 변형(예컨대, 전사후 변형)에 의해 일어나나, 그 자체로는 번역 복합체에 의해 성장 폴리펩티드 사슬에 천연 혼입되지 않는 아미노산이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 그러한 비천연 발생 아미노산의 예에는 N-아세틸글루코사미닐-L-세린, N-아세틸글루코사미닐-L-트레오닌 및 0-포스포티로신이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다.
"아미노 말단 변형기"는 폴리펩티드의 아미노 말단에 결합될 수 있는 임의의 분자를 가리킨다. 유사하게, "카르복시 말단 변형기"는 폴리펩티드의 카르복시 말단에 결합될 수 있는 임의의 분자를 가리킨다. 말단 변형기에는 각종 수용성 중합체, 펩티드 또는 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 면역글로불린 불변 영역 부분, 예컨대 Fc, 또는 펩티드의 혈청 반감기를 증가시키는 기타 부분이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다.
용어 "작용기", "활성 부분", "활성화 기", "이탈기", "반응성 부위", "화학적으로 반응성인 기" 및 "화학적으로 반응성인 부분"이 분자의 구분된, 정의가능한 부분 또는 단위를 가리키기 위해 당업계 및 본원에서 사용된다. 그 용어들은 화학적 기술분야에서 다소 동의적이고, 일부 기능 또는 활성을 수행하고, 다른 분자와 반응성인 분자의 부분을 가리키기 위해 본원에서 사용된다.
용어 "연결기" 또는 "링커"는 본원에서 화학적 반응의 결과로서 정상적으로 형성되는 기 또는 결합을 가리키기 위해 본원에서 사용되고, 전형적으로는 공유 연결기이다. 가수분해 안정성 연결기는, 연장된 시간 동안, 아마도 심지어는 무한의 시간 동안의 생리학적 조건 하에서(단, 이에 제한되지 않음), 유용한 pH 값에서 물 내에서 실질적으로 안정하고, 물과 반응하지 않는 연결기를 의미한다. 가수분해 불안정성 또는 분해성 연결기는 물, 또는 예를 들어, 혈액을 포함한 수용액 중에서 분해가능한 연결기를 의미한다. 효소 불안정성 또는 분해성 연결기는 하나 이상의 효소에 의해 분해될 수 있는 연결기를 의미한다. 당업계에서 이해되어지는 바와 같이, PEG 및 관련 중합체는 중합체 골격, 또는 중합체 골격과 중합체 분자의 말단 작용기 간의 링커기에서의 분해성 연결기를 포함할 수 있다. 예를 들어, PEG 카르복실산 또는 활성화된 PEG 카르복실산의 생물 활성제 상의 알코올기와의 반응에 의해 형성된 에스테르 연결기는 일반적으로 생리학적 조건 하에서 가수분해하여, 그 활성제를 방출한다. 다른 가수분해 분해성 연결기에는 카르보네이트 연결기; 아민과 알데히드의 반응으로부터 수득되는 아민 연결기; 알코올의 포스페이트기와의 반응에 의해 형성되는 포스페이트 에스테르 연결기; 히드라지드와 알데히드의 반응 생성물인 히드라존 연결기; 알데히드와 알코올의 반응 생성물인 아세탈 연결기; 포르메이트와 알코올의 반응 생성물인오르토에스테르 연결기; PEG와 같은 중합체 말단에 있는(단, 이에 제한되지 않음) 아민기와, 펩티드의 카르복실기에 의해 형성되는 펩티드 연결기; 및 중합체 말단에 있는(단, 이에 제한되지 않음) 포스포르아미다이트 기와 올리고뉴클레오티드의 5' 히드록실기에 의해 형성되는 올리고뉴클레오티드 연결기가 포함되나, 이들에 제한되지 않는다.
본원에 사용되는 용어 "생물학적 활성 분자", "생물 활성 부분" 또는 "생물 활성제"는 바이러스, 세균, 박테리오파지, 트랜스포존, 프리온, 곤충, 진균류, 식물, 동물 및 인간을 비제한적 예로 포함하는 유기체와 관련된, 생물학적 시스템, 경로, 분자, 또는 상호작용의 임의의 물리적 또는 생화학적 성질에 영향을 줄 수 있는 임의의 물질을 의미한다. 특히, 본원에 사용되는 생물학적 활성 분자에는, 인간 또는 기타 동물에서의 질병의 진단, 치유, 경감, 치료 또는 예방을 위해 의도되거나, 그와 다른 방식으로 인간 또는 동물의 신체적 또는 정신적 안녕을 증진시키는 임의의 물질이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 생물학적 활성 분자의 예에는 펩티드, 단백질, 효소, 소분자 약물, 경질 약물, 연질 약물, 탄수화물, 무기 원자 또는 분자, 염료, 지질, 뉴클레오시드, 방사성핵종, 올리고뉴클레오티드, 독소, 세포, 바이러스, 리포좀, 마이크로입자 및 미셀이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 본 발명에 사용하기에 적당한 생물 활성제의 부류에는 약물, 전구약물, 방사성핵종, 영상제, 중합체, 항생제, 살진균제, 항바이러스제, 항염증제, 항종양제, 심혈관제, 항불안제, 호르몬, 성장 인자, 스테로이드제, 미생물 유래 등이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다.
"이관능성 중합체"는 다른 부분(아미노산 측기를 비제한적 예로 포함함)과 특이적으로 반응하여, 공유 또는 비공유 연결기를 형성할 수 있는 2개의 구별되는 작용기를 포함하는 중합체를 가리킨다. 특별한 생물 활성 성분 상의 기와 반응성인 한 작용기와, 두 번째 생물학적 성분 상의 기와 반응성은 다른 한 기를 가지는 이관능성 링커를 사용하여, 첫 번째 생물 활성 성분, 이관능성 링커, 및 두 번째 생물 활성 성분을 포함하는 접합체를 형성할 수 있다. 각종 화합물들을 펩티드에 부착하기 위한 많은 절차 및 링커 분자가 공지되어 있다. 예컨대, 본원에 참고로 인용되는, 유럽 특허 출원 No. 188,256; U.S. 특허 No. 4,671,958, No. 4,659,839, No. 4,414,148, No. 4,699,784; No. 4,680,338; No. 4,569,789; 및 No. 4,589,071을 참고한다. "다관능적 중합체"는 다른 부분(아미노산 측기를 비제한적 예로 포함함)과 특이적으로 반응하여, 공유 또는 비공유 연결기를 형성할 수 있는 2개 이상의 구별되는 작용기를 포함하는 중합체를 가리킨다. 고관능적 중합체 또는 다관능적 중합체는 임의의 원하는 분자 길이 또는 분자량을 가질 수 있고, BSP에 연결된 하나 이상의 분자와 그것의 결합 상대 또는 BSP 사이에 특별한 원하는 간격 또는 구조를 제공하도록 선택될 수 있다.
치환기가 좌측에서 우측으로 쓰여지는 통상적 화학식에 의해 표현되는 경우, 그것은 우측에서 좌측으로 쓰여지는 구조에서 비롯되는 화학적으로 동일한 치환기를 마찬가지로 포괄하며, 예를 들어 구조 -CH2O-는 구조 -OCH2-와 동등하다.
용어 "치환기"에는 "비간섭 치환기"가 포함되나, 이에 제한되지 않는다. "비간섭 치환기"는 안정한 화합물을 수득하도록 하는 기이다. 적당한 비간섭 치환기 또는 라디칼에는 할로, C1-C10 알킬, C2-C10 알케닐, C2-C10 알키닐, C1-C10 알콕시, C1-C12 아랄킬, C1-C12 알카릴, C3-C12 시클로알킬, C3-C12 시클로알케닐, 페닐, 치환 페닐, 톨루오일, 자일레닐, 비페닐, C2-C12 알콕시알킬, C2-C12 알콕시아릴, C7-C12 아릴옥시알킬, C7-C12 옥시아릴, C1-C6 알킬술피닐, C1-C10 알킬술포닐, --(CH2)m--O--(C1-C10 알킬)(식 중에서, m은 1 내지 8임), 아릴, 치환 아릴, 치환 알콕시, 플루오로알킬, 헤테로시클릭 라디칼, 치환 헤테로시클릭 라디칼, 니트로알킬, --NO2, --CN, --NRC(O)--(C1-C10 알킬), --C(O)--(C1-C10 알킬), C2-C10 알킬 티오알킬, --C(O)O--(C1-C10 알킬), --OH, --SO2, =S, --COOH, --NR2, 카르보닐, --C(O)--(C1-C10 알킬)-CF3, --C(O)-CF3, --C(O)NR2, --(C1-C10 아릴)-S--(C6-C10 아릴), --C(O)--(C1-C10 아릴), --(CH2)m--0--(--(CH2)m--0(C1-C10 알킬)(식 중에서, 각 m은 1 내지 8임), --C(O)NR2, --C(S)NR2, --SO2NR2, --NRC(O)NR2, --NRC(S)NR2, 이들의 염 등이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 여기에 사용되는 각 R은 H, 알킬 또는 치환 알킬, 아릴 또는 치환 아릴, 아랄킬 또는 알카릴이다.
용어 "할로겐"에는 불소, 염소, 옥소 및 브롬이 포함된다.
용어 "알킬"은 단독으로 또는 다른 한 치환기의 일부로서 달리 명시되지 않는 한, 직쇄형 또는 분지형 사슬, 또는 시클릭 탄화수소 라디칼, 또는 이들의 조합이 포함되고, 이는 완전 포화, 단일- 또는 다중불포화일 수 있고, 표시된 탄소수를 갖는(즉, C1-C10은 탄소수가 1 내지 10임을 의미함) 이가 및 다가 라디칼일 수 있다. 포화 탄화수소 라디칼의 예에는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, t-부틸, 이소부틸, sec-부틸, 시클로헥실, (시클로헥실)메틸, 시클로프로필메틸, 이들의 동종체 및 이성질체, 예를 들어 n-펜틸, n-헥실, n-헵틸, n-옥틸 등과 같은 기가 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 불포화 알킬기는 하나 이상의 이중 결합 또는 삼중 결합을 갖는 알킬기이다. 불포화 알킬기의 예에는 비닐, 2-프로페닐, 크로틸, 2-이소펜테닐, 2-(부타디에닐), 2,4-펜타디에닐, 3-(1,4-펜타디에닐), 에티닐, 1- 및 3-프로피닐, 3-부티닐, 및 고급 동종체 및 이성질체가 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 또한, 용어 "알킬"은 달리 명시되지 않는 한, 이하 더욱 상세하게 기재되는 알킬의 유도체, 예컨대 "헤테로알킬"을 포함하는 의미이다. 탄화수소기로 제한되는 알킬기는 "동종알킬"로 칭해진다.
용어 "알킬렌"은 단독으로 또는 다른 한 치환기의 일부로서 구조 -CH2CH2- 및 -CH2CH2CH2CH2-로 비제한적으로 예시되는 알칸으로부터 유래된 이가 라디칼을 의미하고, 그 예에는 이하 "헤테로알킬렌"으로 기재되는 기가 포함된다. 전형적으로, 알킬 (또는 알킬렌) 기는 탄소수 1 내지 24이고, 본 발명에서 이 기의 탄소수는 10 이하인 것이 바람직하다. "저급 알킬" 또는 "저급 알킬렌"은 일반적으로 탄소수가 8 이하인, 보다 짧은 사슬의 알킬 또는 알킬렌기이다.
용어 "알콕시", "알킬아미노" 및 "알킬티오" (또는 티오알콕시)는 그것들의 통상적 의미로 사용되고, 각기 산소 원자, 아미노기 또는 황 원자를 통해 분자의 나머지에 부착된 알킬기를 가리킨다.
용어 "헤테로알킬"은 단독으로 또는 다른 한 용어와 조합되어, 달리 명시되지 않는 한, 안정한 직쇄형 또는 분지형 사슬 또는 시클릭 탄화수소 라디칼, 또는 이들의 조합을 의미하고, 이들은 표시된 수의 탄소 원자, 및 0, N, Si 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 이종원자로 구성되고, 여기에서 질소 및 황 원자는 임의적으로 산화될 수 있고, 질소 이종원자는 임의적으로 4급화될 수 있다. 이종원자(들) 0, N 및 S, 및 Si는 헤테로알킬기의 임의의 내부 위치, 또는 알킬기가 분자의 나머지에 부착되는 위치에 있을 수 있다. 그 예에는 -CH2-CH2-O-CH3, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N(CH3)-CH3, -CH2-S-CH2-CH3, -CH2-CH2, -S(0)-CH3, -CH2-CH2-S(0)2-CH3, -CH=CH-0-CH3, -Si(CH3)3, -CH2-CH=N-OCH3, 및 -CH=CH-N(CH3)-CH3이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 예를 들어, -CH2-NH-OCH3 및 -CH2-0-Si(CH3)3과 같이 2개 이하의 이종원자가 연속적일 수 있다. 유사하게, 용어 "헤테로알킬렌"은 단독으로 또는 다른 한 치환기의 일부로서 -CH2-CH2-S-CH2-CH2- 및 -CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-에 의해 비제한적으로 예시되는 헤테로알킬로부터 유래되는 이가 라디칼을 의미한다. 헤테로알킬기에 대해, 동일하거나 상이한 이종원자는 또한 사슬 말단(알킬렌옥시, 알킬렌디옥시, 알킬렌아미노, 알킬렌디아미노, 아미노옥시알킬렌 등이 비제한적 예로 포함됨) 중 어느 하나 또는 양자 모두를 차지할 수 있다. 또한, 알킬렌 및 헤테로알킬렌 연결기에 대해서는, 연결기의 배향이 연결기의 화학식이 쓰여진 방향에 의해 나타내어지지 않는다. 예를 들어, 화학식 -C(O)2R'-는 -C(O)2R'- 및 -R'C(O)2-를 모두 나타낸다.
용어 "시클로알킬" 및 "헤테로시클로알킬"은 단독으로 또는 다른 한 용어와 조합되어, 달리 명시되지 않는 한, 각기 "알킬" 및 "헤테로알킬"의 시클릭 양태를 나타낸다. 따라서, 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬에는 포화 및 불포화 환 연결기가 포함된다. 부가적으로, 헤테로시클로알킬에 대해, 이종원자는 헤테로사이클이 분자의 나머지에 부착되는 위치를 차지할 수 있다. 시클로알킬의 예에는 시클로펜틸, 시클로헥실, 1-시클로헥세닐, 3-시클로헥세닐, 시클로헵틸 등이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 헤테로시클로알킬의 예에는 1-(1,2,5,6-테트라히드로피리딜), 1-피페리디닐, 2-피페리디닐, 3-피페리디닐, 4-모르폴리닐, 3-모르폴리닐, 테트라히드로푸란-2-일, 테트라히드로푸란-3-일, 테트라히드로티엔-2-일, 테트라히드로티엔-3-일, 1-피레라지닐, 2-피레라지닐 등이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 부가적으로, 그 용어는 이환 및 삼환 구조를 포괄한다. 유사하게, 용어 "헤테로시클로알킬렌"은 단독으로 또는 다른 한 치환기의 일부로서 헤테로시클로알킬로부터 유래된 이가 라디칼을 의미하고, 용어 "시클로알킬렌"은 단독으로 또는 다른 한 치환기의 일부로서 시클로알킬로부터 유래된 이가 라디칼을 의미한다.
본원에 사용되는 용어 "수용성 중합체"는 수성 용매 중 가용성인 임의의 중합체를 가리킨다. BSP로의 수용성 중합체의 연결기는, 비변형된 형태 대비의 혈청 반감기의 증가 또는 조절, 또는 치료 반감기의 증가 또는 조절, 조절된 면역원성, 조절된 물리적 연합 특성, 예컨대 응집 및 다량체 형성, 변경된 수용체 결합, 하나 이상의 결합 상대에 대한 변경된 결합, 및 변경된 수용체 이량체화 또는 다량체화를 비제한적 예로 포함하는 변화를 초래할 수 있다. 수용성 중합체는 그것의 자체의 생물학적 활성을 가지거나 가지지 않을 수 있고, BSP를 하나 이상의 BSP 또는 하나 이상의 생물학적 활성 분자를 비제한적 예로 포함하는 다른 물질에 부착하기 위한 링커로서 이용될 수 있다. 적당한 중합체에는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드, 모노 C1-C10 알콕시 또는 그것의 아릴옥시 유도체(본원에 참고로 인용되는 U.S. 특허 No. 5,252,714에 기재됨), 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리비닐 알코올, 폴리아미노산, 디비닐에테르 말레산 무수물, N-(2-히드록시프로필)-메타크릴아미드, 덱스트란, 덱스트란 술페이트를 포함한 덱스트란 유도체, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올, 헤파린, 헤파린 단편, 다당류, 이당류, 글리칸, 셀룰로스, 및 메틸셀룰로스 및 카르복시메틸 셀룰로스를 비제한적 예로 포함하는 셀룰로스 유도체, 전분 및 전분 유도체, 폴리펩티드, 폴리알킬렌 글리콜 및 그것의 유도체, 폴리알킬렌 글리콜의 공중합체 및 그것의 유도체, 폴리비닐 에틸 에테르, 및 알파-베타-폴리(2-히드록시에틸)-DL-아스파르타미드 등, 또는 이들의 혼합물이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 그러한 수용성 중합체의 예에는 폴리에틸렌 글리콜 및 혈청 알부민이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다.
본원에 사용되는 용어 "폴리알킬렌 글리콜" 또는 "폴리(알켄 글리콜)"은 폴리에틸렌 글리콜(폴리(에틸렌 글리콜)), 폴리프로필렌 글리콜, 폴리부틸렌 글리콜, 및 그것의 유도체를 가리킨다. 용어 "폴리알킬렌 글리콜"은 선형 및 분지형 중합체을 모두 포괄하고, 평균 분자량이 0.1 kDa 내지 100 kDa이다. 다른 예시적 실시양태들이, 열거되어 있다. 예를 들어, 상업적 공급업체 카달로그, 예컨대 쉬어워터 코포레이션(Shearwater Corporation)의 카달로그, [Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Applications" (2001)]에 폴리에틸렌 글리콜 및 유도체가 열거되어 있다.
용어 "아릴"은 달리 명시되지 않는 한, 함께 융합되거나 공유 연결된 단환 또는 다환(바람직하게는 1 내지 3개 환)일 수 있는 폴리불포화, 방향족, 탄화수소 치환기를 의미한다. 용어 "헤테로아릴"은 N, 0 및 S로부터 선택되는 1 내지 4개 이종원자를 함유하는 아릴기(또는 환)을 가리키고, 여기에서 질소 및 황 원자는 임의적으로 산화되고, 질소 원자(들)는 임의적으로 4급화된다. 헤테로아릴기는 헤테로 원자를 통해 분자의 나머지에 부착될 수 있다. 아릴 및 헤테로아릴기의 비제한적 예에는 페닐, 1-나프틸, 2-나프틸, 4-비페닐, 1-피롤릴, 2-피롤릴, 3-피롤릴, 3-피라졸릴, 2-이미다졸릴, 4-이미다졸릴, 피라지닐, 2-옥사졸릴, 4-옥사졸릴, 2-페닐-4-옥사졸릴, 5-옥사졸릴, 3-이속사졸릴, 4-이속사졸릴, 5-이속사졸릴, 2-티아졸릴, 4-티아졸릴, 5-티아졸릴, 2-푸릴, 3-푸릴, 2-티에닐, 3-티에닐, 2-피리딜, 3-피리딜, 4-피리딜, 2-피리미딜, 4-피리미딜, 5-벤조티아졸릴, 푸리닐, 2-벤즈이미다졸릴, 5-인돌릴, 1-이소퀴놀릴, 5-이소퀴놀릴, 2-퀴녹살리닐, 5-퀴녹살리닐, 3-퀴놀릴 및 6-퀴놀릴이 포함된다. 상기 나타낸 아릴 및 헤테로아릴 환계 각각에 대한 치환기는 하기 허용가능한 치환기들로 구성된 군으로부터 선택된다.
간략히 말해, 다른 용어와 조합되어 사용되는 용어 "아릴"(아릴옥시, 아릴티옥시, 아릴알킬을 비제한적 예로 포함함)은 상기 정의된 아릴 및 헤테로아릴 환을 모두 포함한다. 따라서, 용어 "아릴알킬"은 탄소 원자(메틸렌기의 것을 비제한적 예로 포함함)가 예를 들어 산소 원자(페녹시메틸, 2-피리딜옥시메틸, 3-(1-나프틸옥시)프로필 등의 것을 비제한적 예로 포함함)로 치환된 알킬기를 포함한 알킬기(벤질, 페네틸, 피리딜메틸 등을 비제한적 예로 포함함)에 아릴기가 부착된 라디칼을 포함하는 의미이다.
상기 용어들의 각각("알킬", "헤테로알킬", "아릴" 및 "헤테로아릴"을 비제한적 예로 포함함)은 표시된 라디칼의 치환 및 비치환 형태 모두를 포함하는 의미이다. 각 유형의 라디칼에 대한 예시적 치환기들이 이하에 나와 있다.
알킬 및 헤테로알킬 라디칼(알킬렌, 알케닐, 헤테로알킬렌, 헤테로알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 시클로알케닐 및 헤테로시클로알케닐로 종종 칭해지는 것들을 포함함)에 대한 치환기는, -OR', =0, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -할로겐, -SiR'R"R'", -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"R'", -NR"C(O)2R', -NR-C(NR'R"R"')=NR"", -NR-C(NR'R")=NIR"', -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R", -NRSO2R', -CN 및 -NO2(수는 0 내지 (2m'+1)의 범위임)(여기에서, m'은 그러한 라디칼 내의 총 탄소수임) 로부터 선택되는 각종 기들 중 하나 이상이다. R', R", R"' 및 R""은 각기 독립적으로 수소, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 1-3 할로겐으로 치환된 아릴을 비제한적 예로 포함하는 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 알킬, 알콕시 또는 티오알콕시기, 또는 아릴알킬기이다. 본 발명의 화합물이 1개 초과의 R 기를 포함할 때, 예를 들어 각각의 R 기는, 각각의 R', R", R'" 및 R"" 기가 1개 초과가 존재할 때의 그것들과 같이 독립적으로 선택된다. R' 및 R"가 동일한 질소 원자에 부착될 때, 그것들은 질소 원자와 조합되어, 5-, 6- 또는 7-원 환을 형성할 수 있다. 예를 들어, -NR'R"은 1-피롤리디닐 및 4-모르폴리닐을 비제한적 예로 포함하는 의미이다. 치환기의 상기 논의로부터, 당업자는 용어 "알킬"은 수소기 외의 기들에 결합된 탄소 원자를 포함하는 기, 예컨대 할로알킬(-CF3 및 -CH2CF3을 비제한적 예로 포함함) 및 아실(-C(O)CH3, -C(O)CF3, -C(O)CH2OCH3 등을 비제한적 예로 포함함)를 포함하는 의미임을 이해할 것이다.
알킬 라디칼에 대해 기재된 치환기와 유사하게, 아릴 및 헤테로아릴기에 대한 치환기가 다양하고, 할로겐, -OR', =0, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -할로겐, -SiR'R"R", -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"R"', -NIR"C(O)2R', -NR-C(NIR'R"R")=NR", -NR-C(NR'R")=NR'", -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R", -NRSO2R', -CN 및 -NO2, -R', -N3, -CH(Ph)2, 플루오로(C1-C4)알콕시, 및 플루오로(C1-C4)알킬(수는 0 내지 방향족 환계 상의 개방 원자가의 총수임)로부터 선택되나, 이에 제한되지 않고; 여기에서 R', R", R"' 및 R""은 수소, 알킬, 헤테로알킬, 아릴 및 헤테로아릴로부터 독립적으로 선택된다. 본 발명의 화합물이 1개 초과의 R 기를 포함할 때 예를 들어, 각각의 R 기는 상기 기들 중 1개 초과가 존재할 때의 각각의 R', R", R"' 및 R"" 기와 같이 독립적으로 선택된다.
본원에 사용되는 용어 "조절된 혈청 반감기"는 그것의 비변형된 형태에 대한 변형된 BSP의 순환 반감기의 양성 또는 음성 변화를 의미한다. 혈청 반감기는 BSP의 투여 후 각종 시점들에서 혈액 샘플을 채취하여, 각 샘플 내의 그 분자의 농도를 구함으로써 측정된다. 시간에 대한 혈청 농도의 상관관계에 의해 혈청 반감기가 계산된다. 증가된 혈청 반감기는 바람직하게 약 2배 이상을 가지나, 보다 작은 증가가 예를 들어, 만족스러운 투약 요법을 가능하게 하거나 독성 효과를 피하게 하므로, 유용할 수 있다. 일부 실시양태들에서, 증가는 약 3배 이상, 약 5배 이상 또는 약 10배 이상이다.
본원에 사용되는 용어 "조절된 치료 반감기"는 그것의 비변형된 형태에 대한 치료 유효량의 BSP의 반감기의 양성 또는 음성 변화를 의미한다. 치료 반감기는 투여 후 각종 시점에서의 분자의 약물동태학 및/또는 약력학 성질 및/또는 치료적 효과를 측정함으로써 측정된다. 증가된 치료 반감기는 바람직하게 특별한 유익한 투약 요법, 특별한 유익한 총 투약량을 가능하게 하거나, 바람직하지 못한 효과를 피하게 한다. 일부 실시양태들에서, 증가된 치료 반감기는 증가된 역가, 변형된 분자의 그것의 표적으로의 증가 또는 감소된 결합, 펩티다제 또는 프로테아제와 같은 효소에 의한 분자의 증가 또는 감소된 파괴, 또는 비변형된 분자의 작용 기작 또는 다른 파라미터의 증가 또는 감소로부터 비롯된다.
핵산 또는 단백질에 적용되는 용어 "단리된"은 핵산 또는 단백질이 그것에 천연 상태에서 연합되어 있는 다른 세포성 성분이 실질적으로 없음을 나타낸다. 그것은 균질한 상태로 있을 수 있다. 단리된 물질은 건조 또는 반건조 상태로 있을 수 있고, 수용액을 비제한적 예로 포함하는 용액으로 있을 수 있다. 순도 및 균질도는 전형적으로 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피와 같은 분석적 화학 기법을 이용하여 구해진다. 제제 내에 존재하는 주된 종인 단백질은 실질적으로 정제된다. 특히, 단리된 유전자는 유전자에 플랭킹하는 개방 해독 프레임으로부터 분리되어, 관심 유전자 이외의 단백질을 코딩한다. 용어 "정제된"은, 핵산 또는 단백질이 전기영동 겔에서 실질적으로 하나의 밴드를 일으킴을 의미한다. 특히, 그것은 핵산 또는 단백질이 순도 85% 이상, 순도 90% 이상, 순도 95% 이상, 순도 99% 이상, 또는 그 이상임을 의미한다.
용어 "핵산"은 단일- 또는 이중-나선 형태의, 데옥시리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오시드, 리보뉴클레오시드, 또는 리보뉴클레오티드 및 그것의 중합체를 가리킨다. 특별히 제한되지 않는 한, 그 용어는 기준 핵산과 유사한 결합 성질을 가지고, 천연 발생 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사 작용하는, 천연 뉴클레오티드의 공지 유사체를 함유하는 핵산을 포괄한다. 달리 특별히 제한되지 않는 한, 그 용어는 또한 PNA(펩티도핵산)의 올리고뉴클레오티드 유사체, 안티센스 기술에 사용되는 DNA의 유사체(포스포로티오에이트, 포스포로아미데이트 등)를 가리킨다. 달리 표시되지 않는 한, 특별한 핵산 서열은 또한 그것의 보존적으로 (conservatively) 변형된 변종체(퇴화 코돈 치환을 비제한적 예로 포함함) 및 상보적 서열, 및 명시된 서열을 함축적으로 포괄한다. 구체적으로, 퇴화 코돈 치환은 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 3번째 위치가 혼합-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 발생시킴으로써 달성될 수 있다(Batzer 등, Nucleic Acid Res. 19: 5081(1991); Ohtsuka 등, J. Biol . Chem . 260: 2605-2608(1985); 및 Cassol 등(1992); Rossolini 등, Mol. Cell. Probes 8: 91-98(1994)).
용어 "아미노산"은 천연 발생 및 비천연 발생 아미노산, 및 천연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는, 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 가리킨다. 천연적으로 코딩된 아미노산은 20개의 통상의 아미노산(알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소루이신, 루이신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린), 및 파이로리신 및 셀레노시스테인이다. 아미노산 유사체는 천연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 가지는 화합물, 즉 수소에 결합된 α-탄소, 카르복실기, 아미노기, 및 R 기, 예컨대 호모세린, 노르루이신, 메티오닌 술폭시드, 메티오닌 메틸 술포늄을 가리킨다. 그러한 유사체는 변형된 R 기(예컨대, 노르루이신) 또는 변형된 펩티드 골격을 가지나, 천연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 가진다.
아미노산은 통상 공지된 3개의 문자 기호에 의해, 또는 [IUPAC-IUB 생화학 명명법 위원회(Biochemical Nomenclature Commission)]가 권장하는 1개 문자 기호로 본원에서 칭해질 수 있다. 마찬가지로, 뉴클레오티드는 통상 수용되는 단일 문자 코드에 의해 칭해질 수 있다.
"보존적으로 (conservatively) 변형된 변종체"는 아미노산 및 핵산 서열 모두에 대해 적용된다. 특별한 핵산 서열에 대해, "보수적으로 변형된 변종체"는 일치하거나 본질적으로 일치하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산, 또는 핵산이 아미노산 서열을 코딩하지 않는 경우에는 본질적으로 일치하는 서열을 가리킨다. 유전 코드의 퇴행으로 인해, 수많은 기능적으로 일치하는 핵산이 임의의 주어진 단백질을 코딩한다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 코딩한다. 따라서, 알라닌이 코딘에 의해 특정화되는 모든 위치에서, 코돈은 코딩된 폴리펩티드을 변경하지 않으면서 기재된 상응하는 코돈 중 임의의 것으로 변경될 수 있다. 그러한 핵산 변이는 보존적으로 변형된 변이들 중 한 종인 "침묵 변이 (silent variations)"이다. 폴리펩티드를 코딩하는 본원의 모든 핵산 서열은 또한 핵산의 모든 가능한 침묵 변이를 기술한다. 당업자는 핵산 내의 각 코돈(메티오닌에 대한 통상 유일한 코돈인 AUG, 및 트립토판에 대한 통상 유일한 코돈인 TGG 제외)은 변형되어 기능적으로 일치하는 분자를 생성시킬 수 있음을 인지할 것이다. 따라서, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 각 침묵 변이는 각 기재된 서열에 내포된다.
아미노산 서열에 대해, 당업자는 코딩된 서열 내의 단일 아미노산 또는 낮은백분율의 아미노산을 변경, 부가 또는 결실시키는, 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 서열에 대한 개별적 치환, 결실 또는 부가가 "보존적으로 변형된 변종체"임(여기에서, 변경은 아미노산을 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환시키게 됨)을 인지할 것이다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표가 공지되어 있다. 그러한 보존적으로 변형된 변종체는 본 발명의 다형성 변종체, 종간 동종체 및 대립유전자에 부가되는 것으로, 그것을 제외시키지 않는다.
하기 8개 기는 상호 보존적 치환기인 아미노산을 각기 함유한다:
1) 알라닌(A), 글리신(G);
2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E);
3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q);
4) 아르기닌(R), 리신(K);
5) 이소루이신(I), 루이신(L), 메티오닌(M), 발린(V);
6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W);
7) 세린(S), 트레오닌(T); 및
8) 시스테인(C), 메티오닌(M)
(예컨대, [Creighton(1984) Proteins : Structure and Molecular Properties Freeman & Co.; 제2판(Dec. 1993)] 참고).
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열과 관련하여 용어 "일치하는" 또는 "일치도"(%)는 동일한 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 가리킨다. 서열은, 하기 서열 비교 알고리즘들 중 하나를 이용하거나, 수동 배열 및 가시적 조사에 의해 측정 시에 비교 창 또는 표시된 영역에서 최대 상응하도록 비교하고 정렬할 때, 동일한(즉, 특정 영역에서 약 60% 일치도, 임의적으로 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90% 또는 약 95%의 일치도)의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 일정 백분율을 가지는 경우, "실질적으로 일치하는" 것이다. 이 정의는 또한 시험 서열의 상보체도 가리킨다. 일치도는 길이가 적어도 약 50개 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드인 영역, 길이야 75 내지 100 아미노산 또는 뉴클레오티드인 영역, 또는 구체화되지 않은 경우에는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 전체 서열 또는 길이가 50개 미만의 아미노산 또는 뉴클레오티드 영역에 걸쳐 존재할 수 있다.
서열 비교를 위해, 전형적으로 하나의 서열이 기준 서열로 작용하고, 그에 대해 시험 서열이 비교된다. 서열 비교 알고리즘을 이용할 때, 시험 및 기준 서열을 컴퓨터에 입력하여, 필요한 경우 하위서열 좌표가 표시되고, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터가 표시된다. 바람직하게, 디폴트 프로그램 파라미터가 사용될 수 있거나, 대안적 파라미터가 표시될 수 있다. 이어서, 서열 비교 알고리즘은 프로그램 파라미터에 기초하여, 기준 서열에 대한 시험 서열에 대한 서열 일치도(%)를 계산한다.
본원에 사용되는 "비교 창"은 통상적으로 약 20 내지 600, 주로 약 50 내지 200, 더욱 주로 약 100 내지 150으로 구성되는 군으로부터 선택되는 임의의 수의 인접 위치의 세그먼트를 지칭하는 것을 포함하고, 여기에서 서열은 2개 서열이 최적으로 배열된 후, 동일한 수의 인접 위치들의 기준 서열과 비교될 수 있다. 비교를 위한 서열의 배열 방법이 당업계에 공지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적 배열은, 예컨대 [Smith 및 Waterman(1981) Adv . Appl . Math . 2: 482c]의 국소 상동성 알고리즘, [Needleman 및 Wunsch(1970) J. Mol . Biol . 48: 443]의 상동성 배열 알고리즘, [Pearson 및 Lipman(1988) Proc . Nat'1 . Acad . Sci . USA 85: 2444]의 유사도 방법 검색, 이 알고리즘의 컴퓨터처리 이행([위스콘신 제네틱스 소프트웨어 팩키지(Wisconsin Genetics Software Package), 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group), 575 Science Dr., 미국 위스콘신주 매디슨]에서의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA), 또는 수동적 배열 및 가시적 검사(예컨대, [Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology(1995년 부록) 참고)에 의해(단, 이에 제한되지 않음) 수행될 수 있다.
서열 일치도(%) 및 서열 유사성을 결정하는데 적당한 알고리즘의 한 바람직한 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이고, 이는 [Altschul 등(1977) Nuc . Acids Res . 25: 3389-3402] 및 [Altschul 등(1990) J. Mol . Biol . 215: 403-410]에 각기 기재되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어가 [National Center for Biotechnology Information]을 통해 공개 입수가능하다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T 및 X는 배열의 민감도 및 속도를 결정한다. (뉴클레오티드 서열을 위한) BLASTN 프로그램은 디폴트로서 11의 단어 길이(W), 10의 기대치(E), M=5, N=-4 및 양 나선의 비교를 사용한다. BLASTP 프로그램은 아미노산 서열에 대해, 디폴트로서 3의 단어 길이, 및 10의 기대치(E), 및 50의 BLOSUM62 스코어링 행렬[Henikoff 및 Henikoff(1992) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 89: 10915 참고) 배열(B), 10의 기대치(E), M=5, N=-4, 및 양 나선의 비교를 사용한다. BLAST 알고리즘은 전형적으로 "저 착화" 필터를 끄고 수행된다.
BLAST 알고리즘은 또한 두 서열 간의 유사성의 통계학적 분석을 수행한다(예컨대, [Karlin 및 Altschul(1993) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90: 5873-5787] 참고). BLAST 알고리즘에 의해 제공된 유사성의 한 척도는 최소 총 확률(P(N))이며, 이는 2개 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 간의 매치가 우연히 일어날 수 있는 확률을 가리킨다. 예를 들어, 핵산은 기준 핵산에 대한 시험 핵산의 비교에서 최소의 합 확률이 약 0.2 미만, 더욱 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만일 경우, 기준 서열과 유사한 것으로 간주된다.
표현 "...에 선택적으로(또는 특이적으로) 하이브리드화하다"는, 서열이 착혼합물(예컨대, 총 세포 내 또는 라이브러리 DNA 또는 RNA) 내에 존재할 때, 엄격한 하이브리드화 조건 하에서 한 특별한 뉴클레오티드 서열에 대해서만 분자에 결합하거나 이중화하거나 하이브리드화함을 가리킨다.
표현 "엄격한(stringent) 하이브리드화 조건"은 당업계에 공지된 바와 같은 저이온성 강도 및 고온의 조건을 가리킨다. 전형적으로, 엄격한 (stringent) 조건 하에 프로브는 핵산(총 세포성 또는 라이브러리 DNA 또는 RNA를 비제한적 예로 포함함)의 착 혼합물 내의 그것의 표적 하위서열에 하이브리드화하나, 착 혼합물 내의 다른 서열에는 하이브리드화하지 않는다. 엄격한 조건은 서열-의존적이고, 상이한 환경에서 상이할 것이다. 서열이 길수록, 특이적으로 하이브리드화하는 온도가 더 높다. 핵산의 하이브리드화에 대한 광대한 지침이, [Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays"(1993)]에 나와 있다. 일반적으로, 엄격한 조건은 한정된 이온 강도 pH에서 특이적 서열에 대한 열 융점(Tm)보다 약 5 내지 10℃가 더 낮도록 선택된다. Tm은 표적에 대해 상보적인 프로브의 50%가 평형 하에 표적 서열에 하이브리드화하는 (한정된 이온 강도, pH 및 핵산 농도 하에서의) 온도이다(Tm에서 표적 서열이 과량으로 존재할 때, 프로브의 50%가 평형 하에 놓이게 된다). 엄격한 조건은, 염 농도가 pH 7.0 내지 8.3에서 약 1.0 M 미만의 나트륨 이온, 통상적으로는 약 0.01-1.0 M 나트륨 이온 농도(또는 기타 염)이고, 온도가 짧은 프로브(예컨대, 약 10-50 뉴클레오티드)에서 약 30℃ 이상이고, 긴 프로브(예컨대, 약 50 초과의 뉴클레오티드)에서 약 60℃ 이상인 조건이다. 엄격한 조건은 또한 포름아미드와 같은 탈안정화제의 첨가로 달성될 수 있다. 선택적 또는 특이적 하이브리드화를 위해, 양성 신호는 통상적으로 2배 이상의 백그라운드, 바람직하게는 10배 이상의 백그라운드 하이브리드화일 수 있다. 예시적 엄격한 하이브리드화 조건은 하기와 같을 수 있다: 50% 포름아미드, 5×SSC, 및 1% SDS, 42℃에서의 인큐베이션, 또는 5×SSC, 1% SDS, 0.2×SSC에서의 세척과 함께 65℃에서의 인큐베이션, 및 65℃의 0.1% SDS. 상기 세정은 5, 15, 30, 60, 120분 또는 그 이상 동안 수행될 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "진핵생물"은 계통 도메인 진핵생물에 속하는 유기체, 예컨대 동물류(포유류, 곤충류, 양서류, 조류 등을 비제한적 예로 포함함), 섬모충, 식물류(단자엽식물, 쌍자엽식물, 조류 등을 비제한적 예로 포함함), 진균류, 효모, 편모충, 마포자충류, 원생생물 등을 가리킨다.
본원에 사용되는 용어 "비진핵생물"은 비진핵생물 유기체를 가리킨다. 예를 들어, 비진핵생물 유기체는 진정세균(에스케리치아 콜라이( Esherichia coli ), 써무스 써모필러스( Thermus thermophilus ), 바실러스 스테아로써모필러스( Bacillus stearothermophilus), 슈모모나스 플루오레슨스 ( Pseudomonas fluorescens ), 슈도모나스 아에루기노사( Pseudomonas aeruginosa ), 슈도모나스 푸티다( Pseudomonas putida) 등을 비제한적 예로 포함함) 계통 도메인, 또는 고세균(메타노코커스 자나쉬이( Methanococcus jannaschii ), 메타노박테리움 써모아우토트로피쿰( Methanobacterium thermoautotrophicum ), 호염성 세균( Halobacterium ), 예컨대 할로페락스 볼카니 ( Haloferax volcanii ) 및 호염성 세균 종 NRC-1, 아르카에오글로부스 풀기두스( Archaeoglobus fulgidus ), 파이로코코스 푸리오서스( Pyrococcus furiosus), 파이로코커스 호리코쉬이 ( Pyrococcus horikoshii ), 아에우로피룸 페르닉스( Aeuropyrum pernix ) 등을 비제한적 예로 포함함) 계통 도메인에 속할 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "대상은" 처리(치료), 관찰 또는 실험의 대상이 되는 동물, 바람직하게는 포유류, 가장 바람직하게는 인간을 가리킨다.
본원에 사용되는 용어 "유효량"은 처리하는 질병, 상태 또는 장애의 증상들 중 하나 이상을 어느 정도 경감시키기 위해 투여되는 (변형된) 비천연 아미노산 폴리펩티드의 총양을 가리킨다. 본원에 기재된 (변형된) 비천연 아미노산 폴리펩티드를 함유하는 조성물은 예방, 증진 및/또는 치료적 처리를 위해 투여될 수 있다.
용어 "증진하다" 또는 "증진시키는"은 원하는 효과를 그 강도 또는 기간에 있어 증가 또는 연장시키는 것을 의미한다. 따라서, 치료제의 효과를 증진시키는 것에 대한 용어 "증진시키는"은 시스템에 대한 다른 치료제의 효과를 그 강도 또는 기간에 있어 증가 또는 연장시키는 능력을 가리킨다. 본원에 사용되는 "증진 유효량"은 원하는 시스템에서 다른 한 치료제의 효과를 증진시키기에 적당한 양을 가리킨다. 환자에게 사용할 때, 이 용도에 효과적인 양은 질병, 장애 또는 상태의 중도 및 과정, 과거 치료, 환자의 건강 상태 및 약물에 대한 반응, 및 치료 의사의 판단에 의존할 것이다.
본원에 사용되는 용어 "변형된"은 주어진 폴리펩티드에 대해 가해지는 임의의 변화, 예컨대 폴리펩티드의 길이, 폴리펩티드의 아미노산 서열, 아미노산 조성, 화학적 구조, 동시 번역 변형, 또는 전사후 변형에 대한 변화를 가리킨다. 형태 "(변형된)"이란 용어는 논의되는 폴리펩티드가 임의적으로 변형되는 것, 즉 논의되는 폴리펩티드가 변형 또는 비변형될 수 있음을 의미한다.
용어 "전사후 변형된"은 폴리펩티드 사슬에 혼입된 후 천연 또는 비천연 아미노산에 일어나는 그 아미노산의 임의의 변형을 가리킨다. 그 용어는 단지 예시적으로, 동시 번역 생체내 변형, 동시 번역 생체외 변형(예컨대, 세포 불포함 번역 시스템 내), 전사후 생체내 변형, 및 전사후 생체외 변형을 포괄한다.
예방적 용도들에서, (변형된) 비천연 아미노산 폴리펩티드를 함유하는 조성물은 특별한 질병, 장애 또는 상태에 처해지기 쉽거나 그와 다른 방식으로 그럴 위험이 있는 환자에게 투여된다. 그러한 양은, "예방 유효량"인 것으로 정의된다. 이 사용에서, 정확한 양은 또한 환자의 건강 상태, 체중 등에 의존한다. 통상의 실험(예컨대, 투약량 순차증강(escalation) 임상 실험)에 의해 그러한 예방 유효량을 결정하는 것은 당업계의 기술 내에 족히 속하는 것으로 간주된다.
용어 "보호된"은 특정 반응 조건 하에서 화학적으로 반응성인 작용기의 반응을 방지하는 "보호기" 또는 부분의 존재를 가리킨다. 보호기는 보호되는 화학적으로 반응성인 기의 유형에 따라 다양할 것이다. 예를 들어, 화학적으로 반응성인 기가 아민 또는 히드라지드인 경우, 보호기는 tert-부틸옥시카르보닐(t-Boc) 및 9-플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 화학적으로 반응성인 기가 티올인 경우, 보호기는 오르토피리딜디술피드이다. 화학적으로 반응성인 기가 카르복실산, 예컨대 부탄산 또는 프로피온산, 또는 히드록실기인 경우, 보호기는 벤질 또는 알킬기, 예컨대 메틸, 에틸 또는 tert-부틸일 수 있다. 당업계에 공지된 다른 보호기도 또한 본원에 기재된 방법 및 조성물에서 또는 그와 함께 사용될 수 있다.
단지 예시적으로, 차단/보호기는 하기 것들로부터 선택될 수 있다:
Figure 112007014691585-PCT00006
다른 보호기들이, 전체적으로 본원에 참고로 인용되는 [Greene 및 Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 제3판, John Wiley & Sons, New York, NY, 1999]에 기재되어 있다.
치료 용도들에서, (변형된) 비천연 아미노산 폴리펩티드를 함유하는 조성물은 질병, 장애 또는 상태의 증상을 치료하거나 적어도 부분적으로 저항하기에 충분한 양으로, 질병, 상태 또는 장애를 이미 앓는 환자에게 투여된다. 그러한 양은 "치료 유효량"으로 정의되고, 이는 질병, 장애 또는 상태의 중도 및 과정, 과거 치료법, 환자의 건강 상태 및 약물에 대한 반응, 및 치료 의사의 판단에 의존할 것이다. 통상의 실험(예컨대, 용량 순차증강 임상 실험)에 의해 그러한 치료 유효량을 결정하는 것은 당업계의 기술 내에 족히 속하는 것으로 간주된다.
용어 "치료"는 예방적 및/또는 치료적 처리를 가리키기 위해 사용된다.
달리 표시되지 않는 한, 당업계의 기술 내에 속하는 질량분광법, NMR, HPLC, 단백질 화학, 생화학, 재조합 DNA 기법 및 약리학의 통상적 방법들이 이용된다.
발명의 상세한 설명
I. 도입부
본 발명에 유용할 수 있는 BSP 또는 그것의 단편의 비제한적 예에는 하기 것들이 포함된다. 특별한 BSP 또는 임의의 단백질의 활성의 일부 또는 전부를 보유하는 다른 변종체, 유사체, 단편 및/또는 유사체 단편도 또한 본 발명의 실시양태들에서 유용할 수 있음을 이해한다.
본 발명에 유용한 폴리펩티드의 대표적인 비제한적 부류에는 하기 치료적 범주에 속하는 것들이 포함된다: 부신피질자극 호르몬 펩티드, 아드레노메둘린 펩티드, 알라토스타틴 펩티드, 아밀린 펩티드, 아밀로이드 베타-단백질 단편 펩티드, 안지오텐신 펩티드, 항생제 펩티드, 항원형 폴리펩티드, 항미생물 펩티드, 세포괴사 관련 펩티드, 심방 나트륨이뇨 펩티드, 낭세포 펩티드, 봄베신 펩티드, 골 GLA 펩티드, 브래디키닌 펩티드, 뇌 나트륨이뇨 펩티드, C-펩티드, C-형 나트륨이뇨 펩티드, 칼시토닌 펩티드, 칼시토닌 유전자 관련 펩티드, CART 펩티드, 카소모르핀 펩티드, 화학주성 펩티드, 콜레시스토키닌 펩티드, 콜로니-자극 인자 펩티드, 코르티코르트로핀 방출 인자 펩티드, 코르티스타틴 펩티드, 사이토킨 펩티드, 데르모르핀 펩티드, 다이노르핀 펩티드, 엔도르핀 펩티드, 엔도텔린 펩티드, ETa 수용체 길항자 펩티드, ETb 수용체 길항자 펩티드, 엔케팔린 펩티드, 피브로넥틴 펩티드, 갈라닌 펩티드, 가스트린 펩티드, 글루카곤 펩티드, Gn-RH 연합 펩티드, 성장 인자 펩티드, 성장 호르몬 펩티드, GTP-결합 단백질 단편 펩티드, 구아닐린 펩티드, 인히빈 펩티드, 인슐린 펩티드, 인터류킨 펩티드, 라미닌 펩티드, 렙틴 펩티드, 류코키닌 펩티드, 항체형성 호르몬-방출 호르몬 펩티드, 마스토파란 펩티드, 비만 세포 탈과립화 펩티드, 멜라닌세포 자극 호르몬 펩티드, 모르피셉틴 펩티드, 모르틸린 펩티드, 뉴로-펩티드, 뉴로펩티드 Y 펩티드, 신경친화도 인자 펩티드, 오렉신 펩티드, 오피오이드 펩티드, 옥시토신 펩티드, PACAP 펩티드, 판크레아스타틴 펩티드, 췌장 폴리펩티드, 파라티로이드 호르몬 펩티드, 파라티로이드 호르몬 관련 펩티드, 펩티드 T 펩티드, 프로락틴 방출 펩티드, 펩티드 YY 펩티드, 레닌 기질 펩티드, 세크레틴 펩티드, 소마토스타틴 펩티드, 물질 P 펩티드, 타키키닌 펩티드, 타이로트로핀 방출 호르몬 펩티드, 독소 펩티드, 혈관 활동성 장관 펩티드, 바소프레신 펩티드, 및 바이러스 관련 펩티드. (U.S. 특허 No. 6,858,580 참고).
폴리펩티드의 예에는 뇌하수체 호르몬, 예컨대 바소프레신, 옥시토신, 멜라닌세포 자극 호르몬, 부신피질자극 호르몬, 성장 호르몬; 시상하부 호르몬, 예컨대 성장 호르몬 방출 인자, 부신피질자극호르몬 방출 인자, 프로락틴 방출 펩티드, 고나도트로핀 방출 호르몬 및 그것의 연합 펩티드, 항체형성 호르몬 방출 호르몬, 타이로트로핀 방출 호르몬, 오렉신 및 소마토스타틴; 티로이드 호르몬, 예컨대 칼시토닌, 칼시토닌 전구체 및 칼시토닌 유전자 관련 펩티드; 파라티로이드 호르몬 및 그것의 관련 단백질; 췌장 호르몬, 예컨대 인슐린 및 인슐린-유사 펩티드, 글루카곤, 소마토스타틴, 췌장 폴리펩티드, 아밀린, 펩티드 YY, 및 뉴로펩티드 Y; 소화성 호르몬, 예컨대 가스트린, 가스트린 방출 펩티드, 가스트린 억제성 펩티드, 콜레시스토키닌, 세크레틴, 모르틸린 및 혈관 활동성 장관 펩티드; 나트륨이뇨 펩티드, 예컨대 심방 나트륨이뇨 펩티드, 뇌 나트륨이뇨 펩티드, 및 C-형 나트륨이뇨 펩티드; 뉴로키닌, 예컨대 뉴로키닌 A, 뉴로키닌 B, 및 물질 P; 레닌 관련 펩티드, 예컨대 레닌 기질 및 억제제 및 안지오텐신; 엔도텔린, 예컨대 대형 엔도텔린, 엔도텔린 A 수용체 길항자, 및 사라포톡신 펩티드; 및 기타 펩티드, 예컨대 아드레노메둘린 펩티드, 알라토스타틴 펩티드, 아밀로이드 베타 단백질 단편, 항생제 및 항미생물 펩티드, 세포괴사 관련 펩티드, 낭세포 펩티드, 봄베신, 골 Gla 단백질 펩티드, CART 펩티드, 화학주성 펩티드, 코르티스타틴 펩티드, 피브로넥틴 단편 및 피브린 관련 펩티드, FMRF 및 유사체 펩티드, 갈라닌 및 관련 펩티드, 성장 인자s 및 관련 펩티드, G 치료용 펩티드-결합 단백질 단편, 구아닐린 및 유로구아닐린, 인히빈 펩티드, 인터류킨 및 인터류킨 수용체 단백질, 라미닌 단편, 렙틴 단편 펩티드, 류코키닌s, 비만 세포 탈과립화 펩티드, 뇌하수체 아데닐레이트 사이클라제 활성화 폴리펩티드, 판크레아스타틴, 펩티드 T, 폴리펩티드, 바이러스 관련 펩티드, 신호 전달 시약, 독소 및 기타 펩티드, 예컨대 보조 펩티드 유사체, 알파 메이팅 인자, 하부정맥제 펩티드, 부동화(antifreeze) 폴리펩티드, 식욕억제성 펩티드, 소 송과 항재생산 펩티드, 부르신, C3 펩티드 P16, 종양 괴사 인자, 카드헤린 펩티드, 크로모그라닌 A 단편, 피임성 테트라펩티드, 코난토킨 G, 코난토킨 T, 갑각류 심장작용성 펩티드, C-텔로펩티드, 사이토크롬 b588 펩티드, 데코르신, 양미(delicious) 펩티드, 델타-수면-유발 펩티드, 디아젬팜-결합 억제제 단편, 산화질소 합성효소 차단 펩티드, OVA 펩티드, 혈소판 칼파인 억제제(P1), 플라스미노겐 활성화제 억제제 1, 리그닌, 정신분열병 관련 펩티드, 혈청 흉선 인자, 나트륨 칼륨 A 치료적 펩티다제 억제제-1, 스퍼엑트(speract), 정자 활성화 펩티드, 시스테민, 트롬빈 수용체 작용자, 흉선 체액성 감마 2 인자, 티모펜틴, 티모신 알파 1, 흉선 인자, 투피신, 지방동원 호르몬, 요독성 펜타펩티드, 포도당 의존성 인슐린친화 폴리펩티드(GIP), 글루카곤-유사 펩티드-1(GLP-1), 글루카곤-유사 펩티드-2(GLP-1), 엑센딘-3, 엑센딘-4, 및 기타 치료용 펩티드 또는 그것의 단편이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 펩티드의 부가적 예에는 그렐린, 오피오이드 펩티드(카소모르핀 펩티드, 데모르핀, 엔도르핀, 엔케팔린, 델토르핀, 다이노르핀, 및 이들의 유사체 및 유도체), 흉성 펩티드(타이모포이에틴, 타이물린, 티모펜틴, 타이모신, 흉선 체액성 인자(THF)), 세포 결착 펩티드, 상보 억제제, 트롬빈 억제제, 트립신 억제제, 알파-1 항트립신, 섬게 정자 활성화 펩티드, SHU-9119 MC3-R & MC4-R 길항자, 글라스피모드(세균 감염, 진균류 감염, 면역 결핍 면역 장애, 백혈구감소증에 대해 유용한 면역자극제), HP-228(화학치료 유도 구토, 독성, 통증, 당뇨병, 염증, 류마티스상 관절염, 비반에 유용한 멜라노코르틴), 알파 2-플라스민 억제제(플라스민 억제제), APC 종양 억제자(신생물에 대해 유용한 종양 억제자), 조기 임신 인자(면역억제자), 엔도제핀 디아제팜 결합 억제제(수용체 펩티드), 감마 인터페론(백혈병에 대해 유용함), 선 칼리크레인-1(면역자극제), 태반 리보뉴클레아제 억제제, 사르코레신 결합 단백질, 계면활성 단백질 D, 윌름 종양 억제자, GABAB lb 수용체 펩티드, 프리온 관련 펩티드(iPrP13), 콜린 결합 단백질 단편(세균 관련 펩티드), 텔로머라제 억제제, 카르디오스타틴 펩티드, 엔도스타틴 유래 펩티드(혈관신생 억제제), 프리온 억제 펩티드, N-메틸 D-아스파르테이트 수용체 길항자, C-펩티드 유사체(당뇨 합병증에 대해 유용함), 란테스(RANTES), NTY 수용체, NPY2-R(뉴로펩티드 Y형 2-수용체) 리간드, NC4R 펩티드 또는 그것의 단편이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 본원에 참고로 인용되는 U.S. 특허 6,849,714를 참고한다.
호르몬 조절 인슐린 분비는 인슐린의 조기 및 강화 방출을 촉진하는, 위장 내 영양소의 존재 및 흡수에 대한 반응으로 위장관 점막으로부터 방출되는 호르몬의 군을 나타내는, 소위 내분비인슐린 축에 속한다. 인슐린 분비에 대한 증진 효과, 소위 인크레틴(incretin) 효과는 정상적 포도당 내인성에 대해 가능히 필수적이다. 가스트린 및 세크레틴(콜레시스토키닌은 사람에게 있어 인슐린자극성이 아님)을 포함한 많은 위장관 호르몬은 인슐린자극성이나, 인크레틴 효과의 원인이 되는, 단지 생리학적으로 중요한 물질이며, 포도당 의존성 인슐린친화 폴리펩티드, GIP 및 글루카곤-유사 펩티드-1(GLP-1)이다.
GIP는 153개 아미노산 전구체로부터 가공된 42개 아미노산으로 이루어져 있다(Takeda 등, PNAS USA(1987) 84: 7005-7008). GIP는 탄수화물 및 지질 함유 식사에 대한 반응으로 십이지장 및 소장 점막에 존재하는 K 세포에 의해 분비된다(Mortensen 등, Ann. NY Acad. Sci.(2000) 921: 469-472). GIP 수용체의 발현은 췌장섬, 부신피질, 위장, 심장, 지방 조직, 뇌의 수개 영역들, 및 뇌하수체선에 나타났다(Usdin 등(1993) Endocrinology 133: 2861-2870).
1973년에 단리된 GIP(Pederson RA. Gastric Inhibitory Polypeptide. In Walsh JH, Dockray GJ(편저) Gut peptides: Biochemistry and Physiology. Raven Press, New York 1994, pp. 217-259)은 그것의 인슐린친화 효과로 인해, 즉시 당뇨학자들 간의 상당한 흥미를 끌었다. 그러나, 그 후 수년간 행해진 많은 연구들은 GIP의 결손 분비가 인슐린 의존성 당뇨병(IDDM) 또는 인슐린 비의존성 당뇨병(NIDDM)의 병인과 관련되지 않음을 명백히 드러냈다(Krarup T., Endocr Rev 1988; 9: 122-134). 또한, 인슐린친화 호르몬으로서, GIP는 NIDDM에서 거의 비효과적인 것으로 나타났다(Krarup T., Endocr Rev 1988; 9: 122-134). 다른 인크레틴 호르몬인 GLP-1은 알려진 가장 강한 인슐린친화 물질이다(O'rskov C., Diabetologia 1992; 35: 701-711). GIP와 달리, 그것은 NI1DDM 환자에게 있어 인슐린 분비를 자극하는데 놀랍게도 효과적이다. 또한, 다른 인슐린친화 호르몬(아마도 세크레틴 제외)에 대해 부가적으로 또는 그와 대조적으로, 그것은 또한 글루카곤 분비를 강하게 억제한다. 이 작용으로 인해, 그것은 특히 NIDDM 환자에게 있어, 현저한 혈중 포도당 저하 효과를 가진다.
프로글루카곤 유전자의 생성물인 GLP-1(Bell GI 등, Nature 1983; 304: 368-371)은 세크레틴-VIP 계열의 펩티드들 중 한 구성원이며, 포도당 대사 및 위장관 분비 및 대사에서 조절 기능을 갖는 중요한 위장 호르몬으로서 확립되어 있다(Holst JJ., 1994; Gastroenterology. 1994 Dec; 107(6): 1848-55). 글루카곤 유전자는 췌장 및 장에서 다르게 가공된다. 췌장(Holst JJ 등, J Biol Chem, 1994; 269: 18827-18833)에서, 가공은 1) 프로글루카곤(PG)의 위치 33-61를 차지하는 글루카곤 자체; 2) 30개 아미노산(PG(1-30))(종종 글리센틴 관련 췌장 펩티드로 일컬어짐)의 N-말단 펩티드, GRPP(Moody AJ 등, Nature 1981; 289: 514-516; Thim L 등, Biochim Biophys Acta 1982; 703: 134-141); 3) PG(64-69)에 상응하는 헥사펩티드; 4) 마지막으로, 소위 주요 프로글루카곤 단편(PG(72-158))(여기에서, 2개의 글루카곤-유사 서열이 매립되어 있음)(Holst JJ 등, J Biol Chem, 1994; 269: 18827-18833)의 형성 및 평행 분비를 초래한다. 글루카곤은 유일 생물 활성 생성물인 것으로 보인다. 대조적으로, 장 점막에서, 보다 큰 분자 내에 매립된 것은 글루카곤이고, 한편 2개의 글루카곤-유사 펩티드는 따로 형성된다(O'rskov C 등, Endocrinology 1986; 119: 1467-1475). 하기 산물이 형성되고, 평행 분비된다: 1) 글루카곤 서열이 잔기 No. 33-61를 차지하는, PG(1-69)에 상응하는 글리센틴(Thim L 등, Regul Pept 1981; 2: 139-151); 2) GLP-1(7-36)아미드(PG(78-107))아미드(O'rskov C 등, J. Biol. Chem. 1989; 264: 12826-12829)(불활성인, 본래 믿어졌던 PG(72-107)아미드 또는 108가 아님). 소량의, C-말단에 있는 글리신-연장되어 있으나, 동등하게 생활성인 GLP-1(7-37), (PG(78-108))이 또한 형성됨(O'rskov C 등, Diabetes 1991; 43: 535-539); 3) 개재 펩티드-2(PG(111-122)아미드)(Buhl T 등, J. Biol. Chem. 1988; 263: 8621-8624); 및 4) GLP-2(PG(126-158))(Buhl T 등, J. Biol. Chem. 1988; 263: 8621-8624; O'rskov C 등, FEBS letters, 1989; 247: 193-106). 글리센틴의 한 분획이 GRPP(PG(1-30)) 및 옥신토모둘린(PG(33-69))으로 추가로 절단된다(Holst JJ. Biochem J. 1980; 187: 337-343; Bataille D 등, FEBS Lett 1982; 146: 79-86). 이 펩티드들 중, GLP-1이 가장 두드러진 생물학적 활성을 가진다.
글리센틴/엔테로글루카곤과 평행 분비되어, 그 결과, 어느 정도의 엔테로글루카곤 분비의 많은 연구들(Holst JJ., Gastroenterology 1983; 84: 1602-1613; Holst JJ 등, Glucagon and other proglucagon-derived peptides. In Walsh JH, Dockray GJ, 편저 Gut peptides: Biochemistry and Physiology. Raven Press, New York, pp. 305-340, 1993)은 GLP-1 분비에도 적용되나, GLP-1은 2분의 인간의 혈장내 반감기로 더욱 급속히 대사된게 된다(O'rskov C 등, Diabetes 1993; 42: 658-661). 추정컨대 아직 흡수되지 않은 영양소의 위장 점막의 개방형 L-세포의 미세돌기와의 직접적 상호작용의 결과로서, 탄수화물 또는 지방 풍부 식품은 분비를 자극한다(Elliott RM 등, J Endocrinol 1993; 138: 159-166). GLP-1 분비를 촉진하는 내분비 또는 신경 메커니즘이 존재할 수 있으나, 인간에게는 아직 입증되지 않았다.
GLP-1(29-31)의 인크레틴 기능은 래트에서의 경구 포도당에 의해 도출되는 인크레틴 효과를 현저하게 감소시키는 GLP-1 수용체 길항자, 엑센딘 9-39를 이용한 실험에서 명확히 설명되었다(Kolligs F 등, Diabetes 1995 44: 16-19; Wang Z 등, J. Clin. Invest. 1995 95: 417-421). 호르몬은 G-단백질-결합 7-막횡단 스패닝 수용체의 글루카곤/VIP/칼시토닌 계열에 속하는 GLP-1 수용체를 통해 β 세포와 직접 상호작용한다(본원에 참고로 인용되는, Thorens B., Proc Natl Acad Sci 1992; 89: 8641-4645, U.S. 특허 No. 5,670,360 및 No. 6,051,689). 인슐린 분비를 조절함에 있어 GLP-1 수용체의 중요성이 GLP-1 수용체 유전자의 표적화 파열이 마우스에서 수행된 최근 실험들에서 설명되었다. 파열에 대한 파열의 동물 동형은 포도당 내인성 및 공복 과혈당을 상당히 열화시켰고, 심지어 이종형 동물은 포도당 비내인성이었다(Scrocchi L 등, Diabetes 1996; 45: 21A). 신호 전달 메카니즘(Fehmann HC 등, Endocrine Reviews, 1995; 16: 390-410)은 아데닐레이트 사이클라제의 활성화와 주로 관련되나, 세포내 Ca2 +의 상승작용도 또한 필수적이다(Fehmann HC 등, Endocrine Reviews, 1995; 16: 390-410; Gromada J 등, Diabetes 1995; 44: 767-774). GLP-1 수용체-리간드 상호작용의 모델이 [Lopez de Maturana, R. 등, (2003) J. Biol. Chem. 278, 10195-10200]에 나와 있다. Lopez de Maturana 등은, 수용체의 N-말단 도메인이 엑센딘-4, GLP-1 및 엑센딘(9-39)의 중앙 나선의 보존된 면에 결합함을 나타낸다. 엑센딘-4 및 GLP-1의 N-말단 영역은 GLP-1R의 세포외 루프 및/또는 막횡단 영역과 상호작용한다. 또한, 수용체의 N-말단 도메인은 엑센딘-4 및 엑센딘(9-39)의 Trp-케이지 부분과 상호작용한다. [Neidigh 등, Nature Structural Biology (2002) 9(6): 425-430]은 엑센딘-4 및 그것의 변이체의 Trp-케이지 구조를 기술한다.
호르몬의 작용은 포도당 자극 인슐린 방출의 강화로 최적으로 기술되어 있으나(Fehmann HC 등, Endoctrine Reviews, 1995; 16: 390-410), 포도당 및 GLP-1 자극과 결부된 메커니즘은 알려져 있지 않다. 그것은 칼슘-유도 칼슘 방출과 관련될 수 있다(Gromada J 등, Diabetes 1995; 44: 767-774; Holz GG 등, J Biol Chem, 1996; 270: 17749-17759). 이미 언급된 바와 같이, GLP-1의 인슐린친화 작용은 당뇨 P-세포에서 보존된다. 후자와, "포도당 경쟁력"을 포도당 또는 GLP-1 단독에는 잘 반응하지 못하나 그 두가지의 조합에 대해서는 잘 반응하는, 단리된 인슐린-분비 세포에 전달하는 그것의 능력의 관계(Gromada J 등, Diabetes 1995, 44: 767-774; Holz GG 등, Nature 1993, 361: 362-365)도 또한 알려져 있지 않다. 그러나 마찬가지로 중요하게도, 호르몬은 또한 글루카곤 분비를 강하게 억제한다(O'rskov C 등, Endocrinology 1988; 123: 2009-2013). 메커니즘은 알려져 있지 않으나, 이웃하는 인슐린 또는 소마토스타틴 세포를 통한 측분비일 것으로 보인다(Fehmann HC 등, Endoctrine Reviews, 1995; 16: 390-410). 또한 정글루카곤(glucagonostatic) 작용은 포도당 의존성이므로, 혈중 포도당이 감소함에 따라 억제 효과가 감소한다. 이 이중 효과로 인해, 혈장 GLP-1 농도가 증가된 분비 또는 외인성 주입에 의해 증가할 경우, 간문 순환을 통해 간에 도달하는 혈중 인슐린 대 글루카곤의 몰비는 크게 증가되며, 이로써 간 포도당 생산이 감소한다(Hvidberg A 등, Metabolism 1994; 43: 104-108). 그 결과, 혈중 포도당 농도가 감소한다. 인슐린친화 및 정글루카곤 작용의 포도당 의존성으로 인해, 포도당 저하 효과가 자기 제한적이고, 그러므로 호르몬은 투약량에 무관하게 저혈당을 유발하지 않는다(Qualmann C 등, Acta Diabetologica, 1995; 32: 13-16). 효과가 약간 생리학적 투약량을 초과하는 양의 GLP-1의 주입이, 불량한 대사 조절 및 술포닐 우레아로의 2차적 실패(Nauck MA 등, Diabetologia 1993; 36: 741-744)에도 불구하고, 혈중 포도당 값을 완전히 정상화할 수 있는 당뇨병 환자에게 보존된다(Nauck MA 등, J Clin Invest 1993; 91: 301-307). 정글루카곤 효과의 중요성은, GLP-1가 또한 잔류 P-세포 분비 용량이 없는 I형 당뇨 환자에게 있어 혈중 포도당을 저하시킨다(Creutzfeldt W, 등, Diabetes Care 1996; 19: 580-586)는 발견에 의해서도 설명된다.
GLP-1은 베타-세포 질량을 증가시키는 것, 또한 베타-세포 분화, 베타-세포 증식 및 베타-세포 생존을 조절하는 것과 관련되고(Stoffers DA, Horm Metab Res. 2004 Nov-Dec; 36(11-12) : 811-21), 프로인슐린 유전자 전사 및 생합성의 증가에 일익을 한다.
GLP-1은 췌장섬에 대한 영향에 부가하여, 위장관에 강력한 작용을 가진다. 생리학적 양으로 주입될 때, GLP-1은 펜타가스트린-유도, 및 식품-유도 위산 분비를 강하게 억제한다(Schjoldager BTG 등, Dig. Dis. Sci. 1989; 35: 703-708; Wettergren A 등, Dig Dis Sci 1993; 38: 665-673). 그것은 또한 위 배출 속도 및 췌장 효소 분비를 억제한다(Wettergren A 등, Dig Dis Sci 1993; 38: 665-673). 위액 및 췌장액 분비 및 운동성에 대한 유사한 억제성 효과는 탄수화물- 또는 지질-함유 용액과 함께 회장에 주입할 때 인간에게서 나타날 수 있다(Layer P 등, Dig Dis Sci 1995; 40: 1074-1082; Layer P 등, Digestion 1993; 54: 385-386). 그에 수반하여, GLP-1 분비는 매우 자극되고, GLP-1은 적어도 부분적으로 이 소위 "회장-브레이크(ileal-brake) 효과"의 원인일 수 있는 것으로 고찰되었다(Layer P 등, Digestion 1993; 54: 385-386). 실제로, 최근 연구들은 생리학적으로, GLP-1의 회장-브레이크 효과는 췌장섬의 그 효과보다 더 중요할 수 있음을 제시한다. 따라서, 투약량 반응 연구에서, GLP-1은 섬(islet) 분비에 영향을 주기 위해 필요한 정도의 낮은 주입 속도에서 위 배출 속도에 영향을 준다 (Nauck M 등, Gut 1995; 37 (부록 2): A124).
GLP-1은 음식 섭취에 영향을 주는 것으로 보인다. GLP-1의 심실내 투여는 래트에서 음식 섭취를 상당히 억제한다(Schick RR, vorm Walde T, Zimmermann JP, Schusdziarra V, Classen M. Glucagon-like peptide 1--a novel brain peptide involved in feeding regulation. in Ditschuneit H, Gries FA, Hauner H, Schusdziarra V, Wechsler JG(편저) Obesity in Europe. John Libbey & Company Ltd., 1994; pp. 363-367; 42). 이 효과는 매우 특이적인 것으로 보인다. 따라서, N-말단에 연장된 GLP-1(PG 72-107)아미드는 불활성이고, 적당 투약량의 GLP-1 길항자, 엑센딘 9-39는 GLP-1의 효과를 파괴한다. GLP-1의 급성 말단 투여는 래트에서 급성으로 음식 섭취를 억제하지 않는다(Turton MD 등, Nature 1996; 379: 69-72). 그러나, 장 L-세포로부터 분비된 GLP-1은 포만 신호로서 작용할 수 있음이 여전히 가능하다.
인슐린친화 효과뿐만 아니라, 위장관에 대한 GLP-1의 영향이 당뇨 환자에서 보존되고(Wilims B 등, Diabetologia 1994; 37, 부록 1: A118), 식품-유도 포도당 편위운동을 줄이는 것을 도울 수 있으나, 더욱 중요하게는 음식 섭취에 영향을 줄 수도 있다. 4 ng/kg/min로 GLP-1를 정맥내, 1주일 동안 연속적으로 투여하면, 상당한 부작용없이 NIDDM 환자의 혈당 억제를 현저하게 향상시키는 것으로 입증되었다(Larsen J 등, Diabetes 1996; 45, 부록 2: 233A). 펩티드는 피하 투여 후에 완전히 활성이나(Ritzel R 등, Diabetologia 1995; 38: 720-725), 주로 디펩티딜 펩티다제 TV-유사 효소에 의한 퇴화로 인해 급속히 분해된다(Deacon CF 등, J Clin Endocrinol Metab 1995; 80: 952-957; Deacon CF 등, Diabetes 44: 1126-1131).
GLP-1의 아미노산 서열이 Schmidt 등[Diabetologia 28 704-707(1985)]에 개시되어 있다. 인간 GLP-1은 합성되는 프리프로글루카곤으로부터, 특히 원거리 회장, 췌장 및 뇌 내의 L-세포에서 비롯되는 30-31 아미노산 잔기 펩티드이다. 프리프로글루카곤의 GLP-1(7-36)아미드, GLP-1(7-37) 및 GLP-2로의 가공은 주로 L-세포에서 일어난다. GLP-1(7-3 7) 및 이들의 유사체의 유익한 약리학적 성질이 최근 많은 주목을 받았으나, 이들 분자의 구조에 대해서는 매우 조금만 알려져 있다. 미셀 내 GLP-1의 2차 구조가 Thorton 등(Biochemistry 33: 3532-3539(1994))에 기재되었으나, 정상적 용액 중, GLP-1은 매우 가요성 분자인 것으로 간주된다. 이 비교적 작고 매우 가요성인 분자의 유도체화는 혈장 프로파일이 매우 연장되고 여전히 활성을 보유한 화합물을 초래하였다.
GLP-1, 및 GLP-1 및 그것의 단편의 유사체는 특히 1형 및 2형 당뇨 및 비만의 치료에 유용하다.
WO 87/06941은 GLP-1(7-37)을 포함한 GLP-1 단편, 및 그것의 기능적 유도체, 및 인슐린친화제로서의 그것의 용도를 개시한다. GLP-1(7-37), 그것의 특정 유도체 및 그것의 포유동물의 당뇨병 치료를 위한 용도가 본원에 참고로 인용되는 U.S. 특허 No. 5,120,712에 개시되어 있다.
WO 90/11296은 GLP-1(1-36) 또는 GLP-1(1-37)의 인슐린친화 활성을 초과하는 인슐린친화 활성을 가지는 GLP-1(7-36) 및 그것의 기능적 유도체를 포함한 GLP-1 단편, 및 그것의 인슐린친화제로서의 용도를 개시하고 있다.
GLP-1(7-36) 및 GLP-1(7-37)의 아미노산 서열은 (서열 번호 1 및 서열 번호 2)이다: His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-X(여기에서, X는 GLP-1(7-36)에 대해서는 NH2이고, X는 GLP-1(7-37)에 대해서는 Gly임)이다.
WO 91/11457은 GLP-1 부분으로도 유용할 수 있는 활성 GLP-1 펩티드 7-34, 7-35, 7-36, 및 7-37의 유사체를 개시하고 있다.
EP 0708179-A2(엘리 릴리 앤 컴퍼니(Eli Lilly & Co.))는 N-말단 이미다졸기, 및 위치 34에 있는 리신 잔기에 부착된 임의적으로는 비분지형 C6C10 아실기를 포함하는 GLP-1 유사체 및 유도체를 개시하고 있다.
EP 0699686-A2(엘리 릴리 앤 컴퍼니)는 생물 활성인 것으로 보고되는 GLP-1의 특정 N-말단 절단 단편을 개시하고 있다.
펩티드의 다른 한 예는 gp41의 세포외 부분의 카르복실-말단 나선형 분절인 HIV-1LAI 막횡단 단백질(TM) gp41의 아미노산 638 내지 673에 상응하는 펩티드인 T-20(DP-178)이다. gp41의 세포외 부분은 제시된 지퍼 도메인의 아미노-말단인 DP-107의 다른 한 α-나선형 영역을 가진다. DP-107은 바이러스 융합을 억제함으로써 강한 항바이러스 활성을 나타낸다. 그것은 HIV-1LAI 막횡단 gp41 단백질의 잔기 558 내지 595에 상응하는 38개 아미노산 펩티드이다. DP-107 관련 연구는 그 양자 모두 생체외 연구 및 동물에서 비독성인 것으로 증명되었다. 본원에 참고로 인용되는 U.S. 특허 No. 5,656,480은 DP-107 및 그것의 항바이러스 활성을 기재하고 있다.
T-20은 바이러스 융합 억제제로서 작용함으로써 세포로의 HIV의 도입을 억제한다. HIV의 융합 공정이 잘 특징화되어 있다. HIV는 gp120을 통해 CD4 수용체에 결합하고, gp120은 그것의 수용체에 결합할 때, 그것의 조수용체, CCR5 또는 CXCR4에 결합하도록 하는 일련의 구조 변화를 겪게 된다. 수용체 및 조수용체에 결합한 후, gp120은 gp41을 노출시켜, 융합 공정을 개시한다. gp41은 헵타드 반복 1 및 2(HR1 및 2)로 칭해지는 2개 영역을 가진다. HR1로 확인되는 세포외 도메인은 제시된 지퍼 도메인의 아미노-말단인 α-나선형 영역이다. HR1은 gp41의 HR2와 함께, 헤어핀을 형성한다. 형성되는 구조는, 2개 막 사이의 융합을 일으키는 세포막의 부근에 HIV 엔벨로프를 두는 6-나선 번들이다. T-20은 gp41 막횡단 당단백질의 제1 헵타드-반복(HR1)을 결합함으로써 바이러스 융합에 대해 필요한 구조 변화를 방지한다. 따라서, 6-나선 번들의 형성은 gp41의 HR1 영역에 대한 T-20의 결합에 의해 차단된다. HIV gp41 단백질의 DP107 및 DP178 도메인(즉, HR1 및 HR2 도메인)은 상호 착화되고, 바이러스의 정상적 감염성을 위해 그것의 상호작용이 필요하다. DP107과 DP178 간, 및/또는 DP107-유사 펩티드와 DP178-유사 펩티드 간의 상호작용을 방해하는 화합물은 항바이러스를 포함한 항용해물질(antifusogenic)이다.
DP-178은 HIV-1 매개 CD-4+ 세포-세포 융합(즉, 합포체 형성) 및 세포비함유 바이러스에 의한 CD-4+ 세포의 감염의 강한 억제제로서 작용한다. 그러한 항-레트로바이러스 활성에는 비감염 CD-4+ 세포로의 HIV 투과의 억제가 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. DP-178는 저농도에서 작용하고, 생체외 연구 및 동물에서 비독성인 것으로 증명되었다. HIV-1 및 HIV-2의 DP-178-상응 영역 내의 아미노산 보존이 기재되었다.
HIV 투과와 연관된 융합 이벤트의 억제에 사용하기 위한, DP-178 펩티드에 대한 가능한 용도가, 각기 본원에 참고로 인용되는, U.S. 특허 No. 5,464,933 및 No. 6,133,418, 및 U.S. 특허 No. 6,750,008 및 No. 6,824, 783에 기재되어 있다.
항바이러스 활성, 및/또는 항-막 융합 능력을 나타내거나, HIV-1 및 비레트로바이러스성 바이러스 이외의 레트로바이러스 내의 코일형-코일 펩티드 구조와 관련된 세포내 공정을 조절하는 능력을 나타내는 DP178 및 DP-107의 부분, 동종체, 및 유사체, 및 DP178/DP107, DP178-유사/DP107-유사 또는 HR1/HR2 상호작용의 조절자가 연구되었다. 그러한 연구에서의 바이러스에는 원숭이 면역결핍 바이러스(U.S. 특허 No. 6,017,536), 호흡 다핵체 바이러스(U.S. 특허 No. 6,228,983; 6,440,656; 6,479,055; 6,623,741), 엡스타인-바르 바이러스(U.S. 특허 No. 6,093,794; 6,518,013), 파라인플루엔자 바이러스(U.S. 특허 No. 6,333,395), 인플루엔자 바이러스(U.S. 특허 No. 6,068, 973; 6,060,065), 및 홍역 바이러스(U.S. 특허 6,013, 263)가 포함되고, 상기 모든 공보는 본원에 참고로 인용된다.
시중 입수가능한 형태의 DP-178는 푸제온
Figure 112007014691585-PCT00007
(에푸바르타이드(enfuvirtide), 로쉐 라보라토리즈 인코포레이티드(Roche Laboratories Inc.) 및 트리메리스 인코포레이티드(Trimeris, Inc.))이다. 푸제온
Figure 112007014691585-PCT00008
은 아세틸화 N 말단, 및 C-말단으로서의 카르복사미드를 포함하며, 하기 1차 아미노산 서열로 기술된다: CH3CO-YTSLNSLIEESQNQQBKNEQBLLELDKWASLWNWF-NH2. 그것은 현재 진행 중인 항레트로바이러스 치료법에도 불구하고 HIV-1 복제를 나타내는 HIV-1 환자 내의 다른 항바이러스와 조합되어 사용된다.
본원에 참고로 인용되는, U.S. 특허 No. 5,464,933 및 No. 6,824,783은 아미노 및 카르복시 말단 절단, 치환, 삽입, 결실, 부가 또는 거대분자 담체기를 갖는 분자, 및 아미노 및/또는 카르복시 말단에 존재하는 소수성기와 같은 화학적 기를 갖는 DP-178 분자를 비제한적 예로 포함하는, DP-178, DP-178 단편, 유사체 및 동종체를 기재하고 있다. 부가적 변종체에는 U.S. 특허 No. 6,830,893에 기재된 것들, 및 U.S. 특허 No. 6,861,059에 개시된 DP-178의 유도체가 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 한 세트의 T-20 하이브리드 폴리펩티드가 U.S. 특허 No. 6,656,906, No. 6,562,787, No. 6,348,568 및 No. 6,258,782에 기재되어 있고, DP-178-독소 융합체가 U.S. 특허 No. 6,627, 197에 기재되어 있다.
HAART(고활성 항-레트로바이러스 치료법)는 바이러스 부하를 감소시키기 위한 수가지 부류의 항레트로바이러스제로부터의 약물을 조합하는 HIV용 치료의 표준이다. 본원에 참고로 인용되는 U.S. 특허 No. 6,861,059는 HIV-1 감염을 치료하거나, 역전사효소 억제제(예컨대, AZT, ddl, ddC, ddA, d4T, 3TC, 또는 기타 디데옥시뉴클레오티드 또는 디데옥시플루오로뉴클레오시드), 또는 HIV-1 프로테아제의 억제제(예컨대, 인디나비르; 리토나비르)와 같은 하나 이상의 기타 항바이러스 치료제와 조합하여 DP-178 또는 DP-107, 또는 이들의 유도체를 이용하는 HIV-1 복제를 억제하거나 HIV-1 감염을 치료하는 방법을 개시한다. 기타 항바이러스에는 사이토킨(예컨대, rIFNα, rIFNβ, rIFNγ), 바이러스 mRNA 캡핑 억제제(예컨대, 리바비린), HIV 프로테아제의 억제제(예컨대, ABT-538 및 MK-639), 항-HIV 활성을 갖는 지질-결합 분자로서의 암포테리신 B, 및 당단백질 가공의 억제제로서의 카스타노스퍼민이 포함된다. 역전사 효소 억제제, 인테그라제 억제제, 프로테아제 억제제, 사이토킨 길항자 및 T-20를 갖는 케모킨 수용체 조절자를 비제한적 예로 포함하는 기타 항-바이러스제의 가능한 조합 치료법이 하기 공보들을 포함한 수많은 참고문헌에 기재되어 있다: U.S. 특허 No. 6,855,724; No. 6,844,340; No. 6,841,558; No. 6,833,457; No. 6,825,210; No. 6, 811,780; No. 6,809,109; No. 6,806,265; No. 6,768,007; No. 6,750,230; No. 6,706,706; No. 6,696,494; No. 6,673,821; No. 6,673,791; No. 6,667,314; No. 6,642,237; No. 6,599,911; No. 6,596,729; No. 6,593, 346; No. 6,589,962; No. 6,586,430; No. 6,541,515; No. 6,538,002; No. 6,531,484; No. 6,511,994; No. 6, 506,777; No. 6,500,844; No. 6,498,161; No. 6,472,410; No. 6,432,981; No. 6,410,726; No. 6,399,619; No. 6,395,743; No. 6,358,979; No. 6,265,434; No. 6,248,755; No. 6,245,806; 및 No. 6,172,110.
DP-178에 대한 가능한 전달 시스템에는 U.S. 특허 No. 6,844,324 및 No. 6,706, 892에 기재된 것들이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 또한, 봉입체 (inclusion bodies) 내의 T-20의 생산방법이 U.S. 특허 No. 6,858,410에 기재되었다.
T20/DP178, T21/DP107 및 그것의 단편이 또한 N-포르밀 펩티드 수용체(FPR 구성원)과 상호작용하는 것으로 나타났다. T-20은 인간 거식세포 내에 존재하는 N-포르밀 펩티드 수용체를 활성화하고(Su 등(1999) Blood 93(11): 3885-3892), 단핵구 및 호중구의 활성화제 및 화학유인제이다(U.S. 특허 No. 6,830,893 참고). FPR 부류 수용체는 화학유인제 fMLP(N-포르밀-메티오닐-루실-페닐알라닌)에 결합하고 단핵구 화학주성 및 병원체에 대한 숙주의 면역 반응의 유도에 관련되는 0-단백질-결합의 STM 수용체이다. 원형 FPR 부류 수용체인 FPR은 고친화도 fMLP에 결합하고, 저농도의 fMLP에 의해 활성화된다. fMLP에 의한 FPR의 결합은 G 단백질-매개 신호전달 이벤트의 캐스케이드를 유도하고, 이에 대식 세포 결착, 화학주성, 산소 중간생성물의 방출, 증진된 식세포 작용 및 세균 사멸, 및 MAP 키나제 활성화 및 유전자 전사가 초래된다(Krump 등, J Biol Chem 272: 937(1997); Prossnitz 등, Pharmacol Ther 74: 73(1997); Murphy, Annu. Rev. Inimuno. 12: 593(1994); 및 Murphy, The N-formyl peptide chemotactic receptors, Chemoattractant ligands and their receptors. CRC Press, Boca Raton, p. 269(1996)). 다른 한 FPR 부류의 수용체는 (FPRH2 및 LXA4R로도 칭해지는) FPRL1라고 칭해지는 FPR의 고동종형 변종체이다. FPRL1은 광 수용체로서 본래 클로닝되었으나(Murphy 등, J. Biol. Chem., 267: 7637-7643(1992); Ye 등, Biochem. Biophys. Res. Commun., 184: 582-589(1992); Bao 등, Genomics, 13: 437-440(1992); Gao, J. L. 및 P. M. Murphy, J. Biol. Chem., 268: 25395-25401(1993); 및 Nornura 등, Int. Immunol., 5: 1239-1249(1993)), 후속하여 고농도의 fMLP에 대한 반응으로 Ca2 + 동원을 매개하는 것으로 나타났다(Ye 등, Biochem. Biophys. Res. Commun., 184: 582-589(1992); 및 Gao, J. L. 및 P. M. Murphy, J. Biol. Chem., 268: 25395-25401(1993)).
케모킨 수용체 CCR5는 다른 한 G-단백질-결합의 STM 수용체이고, 인간 면역결핍 바이러스 1형(HIV-1)의 대부분의 일차적 단리물에 의해 이용되는 주요 융합-보조인자이다(Al Khatib 등, Science 1996, 272: 1955; Doranz 등, Cell 1996, 85: 1149; Deng 등, Nature 1996, 381: 661; Dragic 등, Nature 1996; 381: 667; Horuk, Inmumol Today, 20: 89(1999); Dimitrov 및 Broder, "HIV and Membrane Receptors", HIV and Membrane fusion: Medical Intelligence Unit, Landes Bioscience, Austin, Tex., 1997: 99; 및 Berger, AIDS 11, Suppl A: S3(1997)). HIV-1 융합 및 도입에 있어 주요 역할로 인해, 연구원들은 HIV-1 엔벨로프와 CCR5 사이의 상호작용을 방해하는 분자를 개발하기 위한 심의 연구에 집중하였다. 예를 들어, 케모킨 리간드 및 CCR5에 대해 특이적인 항체가 HIV-1 도입 및 복제를 억제하는 것으로 나타났다(Cocchi 등, Science, 270: 1811(1995); Wu 등, J Exp Med, 186: 373(1997); Proudfoot 등, J Biol Chem, 271: 2599(1996); Arenzana-Seisdedos 등, Nature, 383: 400(1996); Gong 등, J Biol Chern, 273: 4289(1998)). U.S. 특허 No. 6,808,877은 DP-178, 및 N-포르밀 펩티드 수용체에 대한 리간드로서 작용함에 의한 HIV 감염의 억제 및/또는 그것의 CCR5의 예방 및 하향 제어에서의 역할을 논의하고 있다.
펩티드 YY(PYY)는 돼지 장 조직에서 먼저 단리되어 주로 장 내분비 세포에서 국지화된 36개 아미노산 길이의 펩티드이다. PYY는 원위 위장관의 내분비 세포에 의해 식후 분비되어, 시상하부 신호전달 포만에 작용한다. 본원에 참고로 인용되는 [Batterham, R. L. 등, Nature 418: 650-654(2002)]을 참고한다. 그것은 소화성 시스템 내의 일정 범위의 활성 및 장 전해 및 체액 분비의 강한 억제를 포함한 많은 생물학적 활성을 가진다. 그것의 관련물질인 뉴로펩티드 Y(NPY) 및 췌장 폴리펩티드(PP)과 마찬가지로, 펩티드 YY(PYY)는 수용체에 함께 결합하기 위한 분자의 자유 말단을 가교함에 있어 중요한 헤어핀 구조가 되도록 휘어진다.
최근 연구는 공복 및 식후 PYY 수준이 비만 대상자에게는 낮음을 보여주었고, 이는 그들의 높은 식욕 및 식품 소비를 설명할 수 있다. 그것은 정맥내 투여될 때, 저체중 및 비만 대상자 모두에게 있어 식욕 및 음식 섭취를 억제한다[Batterham, R. L. 등, N Engl J Med 349: 941-948(2003)]. 펩티드 YY 단편(예컨대, PYY [3-36], 및 PYY 작용자(PP 계열에 속하지 않은 것들을 포함함)와 같이, 췌장 펩티드(PP) 계열로부터의 기타 펩티드도 또한 식욕을 억제한다. 그러나, 그것의 구강 활성은 위장관에서의 낮은 흡수 및 급속한 퇴화로 인해 경미하다. PYY [3-36]은, 본원에 각기 참고로 인용되는, WO 02/47712 및 U.S. 특허 공보 No. 2002/0141985의 서열 번호 3로서; 또한 [Eberlein, Eysselein 등, Peptides 10: 797-803(1989); 및 Grandy, Schimiczek 등, Regul Pept 51: 151-9(1994)]에서 확인된다.
PYY [3-36]은 아미노산 3 내지 36에서 PYY와 일치하는 서열을 가진다 PYY [3-36]은 인간 및 개 장 추출물에서의 총 펩티드 YY-유사 면역반응성의 대략 40%, 및 식후 50% 약간 넘게 공복인 상태에서 총 혈장 펩티드 YY 면역반응성의 약 36%를 보유한다. 그것은 명백히 펩티드 YY의 디펩티딜 펩티다제-IV (DPP4) 절단 생성물이다. 펩티드 YY [3-36]은 Y2 및 Y5 수용체에서 선택적 리간드인 것으로 보고되며, 이는 N-말단 절단 뉴로펩티드 Y 유사체(즉, C 말단 단편)fmf 선호함에 있어 약리학적으로 특유한 것으로 보인다. PYY 작용자는 보다 높거나 보다 낮은 친화도로 PYY 수용체에 결합할 수 있고, 보다 길거나 보다 짧은 생체내 또는 생체외 반감기를 나타낼 수 있거나, 본연의 PYY보다 다소 효과적일 수 있다.
현 항비만 약물들은 제한된 효능 및 수많은 부작용들을 가진다[Crowley, V. E., Yeo, G. S. & O'Rahilly, S., Nat. Rev. Drug Discov 1, 276-86(2002)]. 비만이 전세계적으로 유행성 비율에 도달하고 있어, 이 부문에 있어 적당한 치료제의 개발에 대한 필요가 가중되고 있다. 근년, 식욕, 체내 에너지 소비 및 PYY와 같은 지방 질량 축적과 관련된 호르몬 및 뉴로펩티드가 가능한 항비만 약물로서 도래되었다. 본원에 참고로 인용되는 [McMinn, J. B., Baskin, D. G. & Schwartz, M. W., Obes Rev 1: 37-46(2000), Drazen, D. L. & Woods, S. C., Curr Opin Clin Nutr Metab Care 6: 621-629(2003)]을 참고한다.
본원에 참고로 인용되는 [Batterham 등, Nature 418: 650-654(2002)]에 따라, 펩티드 YY [3-36] 시스템은 비만의 치료를 위한 치료적 표적을 제공할 수 있다. 국제 공보 No. WO 02/47712 및 U.S. 특허 출원 공보 No. 2002/0141985는 펩티드 YY 및 펩티드 YY 작용자, 예컨대 펩티드 YY [3-36]를 이용한 비만 및 당뇨병을 치료하는 방법을 개시하고 있다. U.S. 특허 출원 공보 No. 20050002927은 비만과 같은 포유류 대상의 각종 질병 및 상태를 치료하기 위한 하나 이상의 Y2 수용체-결합 펩티드, 예컨대 펩티드 YY, 뉴로펩티드 Y(NPY) 또는 췌장 펩티드(PP)의 용도를 기재하고 있다.
비강내 PYY(3-36)(머크(Merck), 나스테크(Nastech))는 비만의 치료제로서 임상적 개발 중에 있다. 개발 중인 기타 PYY(3-36) 화합물에는 경구용 PYY(3-36)(에미스피어(Emisphere)) 및 AC 162352(아밀린)이 포함된다.
또한, DPP-IV 억제제를 이용한 치료는 궤양, 과민성 대장 질환 및 염증성 대장 질환과 같은 위장관 상태와 관련된 펩티드 YY의 퇴화를 예방한다. 펩티드 YY 및 그것의 유사체 또는 작용자는 세포 증식, 영양소 운송 및 장내 물 및 전해질 분비의 내분비 제어를 조절하기 위해 사용되었다(본원에 참고로 인용되는, U.S. 특허 No. 5,604,203; WO 9820885A1; EP 692971A1; U.S. 특허 No. 5,912,227). 장 운동성, 분비 및 혈류의 제어에 있어 펩티드 YY에 대한 역할, 및 비정상흡수 장애의 치료에서의 그것의 용도도 또한 제시되었다. 췌장 종양의 치료에 있어 천연 펩티드의 지속기간, 효과, 생물학적 활성 및 선택도를 모방하고 증진시키는 PYY의 유사체가 보고되었다(본원에 참고로 인용되는 U.S. 일련 No. 5,574,010 참고).
기타 적당한 PYY 작용자에는 본원에 참고로 인용되는 국제 공보 No. WO 98/20885에 기재된 것들이 포함된다.
한 측면에서, 본 발명은 치료 유효량의 PYY, PYY 작용자, 또는 그것의 혼합물을 하나 이상의 전달제 화합물과 함께 투여함에 의한 비만 또는 과체중 동물의 비만을 치료하는 방법을 제공한다. "비만"은 일반적으로 30 초과의 체중 지수로 정이되며, 본 개시 내용의 목적 상, 체중을 감소시킬 필요가 있거나 감소시키길 원하는, 30 미만의 체중 지수를 갖는 자들을 포함하는 임의의 대상자도 "비만"의 범주 내에 포함된다. 인슐린 내성이거나, 포도당 비내성이거나, 임의의 형태의 당뇨병(예컨대, 1형, 2형 또는 임신성 당뇨)를 갖는 대상자가 이 방법으로부터 이익을 얻을 수 있다.
다른 측면들에서, 본 발명은 대상자에게 치료 유효량의 PYY, PYY 작용자 또는 그것의 혼합물을 하나 이상의 전달제 화합물과 함께 투여하는 것을 포함하는, 음식 섭취 감소, 당뇨병 치료, 및 지질 프로파일의 향상(LDL 콜레스테롤 및 트리글리세리드 수준 감소 및/또는 HDL 콜레스테롤 수준의 감소 포함) 방법을 특징으로 한다. 한 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 대상자에게 치료 유효량의 PYY, PYY 작용자 또는 그것의 혼합물을 하나 이상의 전달제 화합물과 함께 투여하는 것을 포함하는, 처리 필요 대상자의 영양소 이용가능성을 감소시킴으로써 경감될 수 있는 상태 또는 장애를 치료하는데 사용된다. 그러한 상태 및 장애에는 고혈압, 지질대사이상, 심혈관 질병, 섭식 장애, 인슐린-내성, 비만, 및 임의의 종류의 당뇨병이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다.
바람직한 PYY 작용자는 WO 02/47712 및 U.S. 특허 공보 No. 2002/0141985에 기재된 검정들(바람직하게 음식 섭취, 위 배출, 췌장액 분비 또는 체중 감량 검정) 중 하나에 있어 효력을 가질 수 있고, 이는 동일 검정에서 NPY의 효력보다 큰 효력을 가진다. 전달제 화합물과 함께 PYY' 및 PYY 작용자는 아밀린 또는 아밀린 작용자, 콜레시스토키닌(CCK) 또는 CCK 작용자, 렙틴(OB 단백질) 또는 렙틴 작용자, 엑센딘 또는 엑센딘 작용자, 또는 U.S. 특허 공보 20050009748에 기재된 GLP-1 또는 GLP-1 작용자를 포함하는 다른 화합물 및 조성물을 비제한적 예로 포함하는, 영양소 이용가능성을 감소시키는 장기 또는 단기 작용을 나타내는 하나 이상의 다른 화합물 및 조성물과 함께 또는 별도로 투여될 수 있다. 적당한 아밀린 작용자에는 예를 들어, 본원에 참고로 인용되는 U.S. 특허 No. 5,739,106에 기재된 것들을 포함한, [25,28,29프로-]-인간 아밀린("프람린티드(pramlintide)"로도 알려져 있고, U.S. 특허 No. 5,686,511 및 No. 5,998,367에 기재되어 있음), 칼시토닌(예컨대, 연어 칼시토닌)이 포함된다. 사용된 CCK는 바람직하게 CCK 옥토펩티드(CCK-8)이다. 렙틴은 예를 들어, [Pelleymounter, C. 등, Science 269: 540-543(1995), Halaas, G. 등, Science 269: 543-6(1995) 및 Campfield, S. 등, Science 269: 546-549(1995)]에 논의되어 있다.
적당한 CCK 작용자에는 본원에 참고로 인용되는 U.S. 특허 No. 5,739,106에 기재된 것들이 포함된다. 적당한 엑센딘에는 엑센딘-3 및 엑센딘-4이 포함되고, 엑센딘 작용자 화합물에는 예를 들어, 각기 본원에 참고로 인용되는, PCT 공보 WO 99/07404, WO 99/25727 및 WO 99/25728에 기재된 것들이 포함된다. 한 실시양태에 따라, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 전달제 화합물, PYY, PYY 작용자 또는 그것의 혼합물, 하나 이상의 아밀린 작용자, 및 CCK 작용자를 포함한다. 아밀린 작용자 및 CCK 작용자의 적당한 조합에는 본원에 참고로 인용되는 U.S. 특허 No. 5,739,106에 기재된 것들이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다.
ACTH(인간); ACTH 1-10; ACTH 1-13(인간); ACTH 1-16(인간); ACTH 1-17; ACTH 1-24(인간); ACTH 4-10; ACTH 4-11; ACTH 6-24; ACTH 7-38(인간); ACTH 18-39(인간); ACTH(래트); ACTH 12-39(래트); 베타-세포 트로핀(ACTH 22-39); 비오티닐-ACTH 1-24(인간); 비오티닐-ACTH 7-38(인간); 코르티코스타틴(인간); 코르티코스타틴(토끼); [Met(02)4, DLys8, Phe9] ACTH 4-9(인간); [Met(0)4, DLys8, Phe9] ACTH 4-9(인간); N-아세틸, ACTH 1-17(인간); 및 에비라티드를 비제한적 예로 포함하는 부신피질자극 호르몬(ACTH) 펩티드.
아드레노메둘린, 아드레노메둘린 1-52(인간); 아드레노메둘린 1-12(인간); 아드레노메둘린 13-52(인간); 아드레노메둘린 22-52(인간); 프로-아드레노메둘린 45-92(인간); 프로-아드레노메둘린 153-185(인간); 아드레노르네둘린 1-52(돼지); 프로-아드레노메둘린(N-20)(돼지); 아드레노메둘린 1-50(래트); 아드레노메둘린 11-50(래트); 및 프로AM-N20(프로아드레노메둘린 N-말단 20 펩티드)(래트)를 비제한적 예로 포함하는 아드레노메둘린 펩티드.
알라토스타틴 I; 알라토스타틴 II; 알라토스타틴 III; 및 알라토스타틴 IV를 비제한적 예로 포함하는 알라토스타틴 펩티드.
아세틸-아밀린 8-37(인간); 아세틸화 아밀린 8-37(래트); AC187 아밀린 길항자; AC253 아밀린 길항자; AC625 아밀린 길항자; 아밀린 8-37(인간); 아밀린(IAPP)(고양이); 아밀린(인슐린종 또는 섬 아밀로이드 폴리펩티드(IAPP)); 아밀린 아미드(인간); 아밀린 1-13(당뇨-관련 펩티드 1-13)(인간); 아밀린 20-29(IAPP 20-29)(인간); AC625 아밀린 길항자; 아밀린 8-37(인간); 아밀린(IAPP)(고양이); 아밀린(래트); 아밀린 8-37(래트); 비오티닐-아밀린(래트); 및 비오티닐-아밀린 아미드(인간)를 비제한적 예로 포함하는 아밀린 펩티드.
알츠하이머씨병 베타-단백질 12-28(SP17); 아밀로이드 베타-단백질 25-35; 아밀로이드 베타/A4-단백질 전구체 328-332; 아밀로이드 베타/A4 단백질 전구체(APP) 319-335; 아밀로이드 베타-단백질 1-43; 아밀로이드 베타-단백질 1-42; 아밀로이드 베타-단백질 1-40; 아밀로이드 베타-단백질 10-20; 아밀로이드 베타-단백질 22-35; 알츠하이머씨병 베타-단백질(SP28); 베타-아밀로이드 펩티드 1-42(래트); 베타-아밀로이드 펩티드 1-40(래트); 베타-아밀로이드 1-11; 베타-아밀로이드 3 1-35; 베타-아밀로이드 32-35; 베타-아밀로이드 35-25; 베타-아밀로이드/A4 단백질 전구체 96-110; 베타-아밀로이드 전구체 단백질 657-676; 베타-아밀로이드 1-38; [Gln11] 알츠하이머씨병 베타-단백질; [Gln11]-베타-아밀로이드 1-40; [Gln22]-베타-아밀로이드 6-40; 알츠하이머씨병 아밀로이드(NAC)의 비-A 베타 성분; P3, (A 베타 17-40) 알츠하이머씨병 아밀로이드 β-펩티드; 및 SAP(혈청 아밀로이드 P 성분) 194-204를 비제한적 예로 포함하는 아밀로이드 베타-단백질 단편 펩티드.
A-779; Ala-Pro-Gly-안지오텐신 II; [Ile3, Val5]-안지오텐신 II; 안지오텐신 III 항펩티드; 안지오제닌 단편 108-122; 안지오제닌 단편 108-123; 안지오텐신 I 전환 효소 억제제; 안지오텐신 I(인간); 안지오텐신 I 전환 효소 기질; 안지오텐신 I 1-7(인간); 안지오펩틴; 안지오텐신 II(인간); 안지오텐신 II 항펩티드; 안지오텐신 III-4(인간); 안지오텐신 II 3-8(인간); 안지오텐신 II 4-8(인간); 안지오텐신 II 5-8(인간); 안지오텐신 III([Des-Asp1]-안지오텐신 II)(인간); 안지오텐신 III 억제제([Ile7]-안지오텐신 III); 안지오텐신-전환 효소 억제제(네오툰너스 마크로프테루스(Neothunnus macropterus)); [Asn1, Val5]-안지오텐신 I(구스피쉬); [Asn1, Val5, Asn9]-안지오텐신 I(연어); [Asn1, Val5, Gly9]-안지오텐신 I(뱀장어); [Asn1, Val5]-안지오텐신 I 1-7(뱀장어, 구스피쉬, 연어); [Asn1, Val5]-안지오텐신 II; 비오티닐-안지오텐신 I(인간); 비오티닐-안지오텐신 II(인간); 비오티닐-Ala-Ala-Ala-안지오텐신 II; [Des-Asp1]-안지오텐신 I(인간); [p-아미노페닐알라닌6]-안지오텐신 II; 레닌 기질(안지오텐시노젠 1-13)(인간); 프리안지오텐시노젠 1-14(레닌 기질 테트라데카펩티드)(인간); 레닌 기질 테트라데카펩티드(안지오텐시노젠 1-14)(돼지); [Sar1]-안지오텐신 II; [Sar1]-안지오텐신 II 1-7 아미드; [Sar1, A1a8]-안지오텐신 II; [Sar1, Ile8]-안지오텐신 II; [Sar1, Thr8]-안지오텐신 II; [Sar1, Tyr(Me)4]-안지오텐신 II(사르메신(Sarmesin)); [Sar1, Val5, Ala8]-안지오텐신 II; [Sar1, Ile7]-안지오텐신 III; 합성 테트라데카펩티드 레닌 기질(No. 2); [Val4]-안지오텐신 III; [Val5]-안지오텐신 II; [Val5]-안지오텐신 I(인간); [Val5]-안지오텐신 I; [Val5, Asn9]-안지오텐신 I(황소개구리); 및 [Val5, Ser9]-안지오텐신 I(가금)을 비제한적 예로 포함하는 안지오텐신 펩티드.
Ac-SQNY; 박테네신(소); CAP 37(20-44); 카르보르메톡시카르보닐-DPro-DPhe-OBzl; CD36 펩티드 P 139-155; CD36 펩티드 P 93-110; 세크로핀 A-멜리틴 하이브리드 펩티드[CA(1-7)M(2-9)NH2]; 세크로핀 B, 유리 산; CYS(Bzl)84 CD 단편 81-92; 데펜신(인간) HNP-2; 데르마셉틴; 면역자극 펩티드(인간); 락토페리신, 소(BLFC); 및 메가이닌 스페이서를 비제한적 예로 포함하는 항생제 펩티드.
증진된 면역 반응을 나타내거나, 면역 반응을 증진시키고/시키거나, 질병 및/또는 질병유발제, 예컨대 비제한적으로 아데노바이러스; 탄저병; 보르데텔라 페르투서스(Bordetella pertussus); 보툴리즘(botulism); 소 비기관염; 부런허맬러 커터럴라수(Branhamella catarrhalis) 개 간염; 개 디스템퍼; 클라미디아에lhlamydiae); 콜레라; 콕시디오이데스진균증; 우두; 사이토메갈로바이러스; 뎅그 열; 뎅그 톡소플라스마병; 디프테리아; 뇌염; 독소생산 B. 콜라이; 엡스타인 바르 바이러스; 말 뇌염; 말 감염 빈혈; 말 인플루엔자; 말 폐렴; 말 라이노바이러스; 에스케리치아 콜라이; 고양이 백혈병; 플라비바이러스; 글로불린; 해모필러스 인플루엔자 b형; 해모필러스 인플루엔자; 해모필러스 페르투시스; 헬리고박터 파일로리( Helicobacter pylori ); 헤모필러스; 간염; A형 간염; B형 간염; C형 간염; 헤르페스 바이러스; HIV; HIV-1 바이러스; HIV-2 바이러스; HTLV; 인플루엔자; 일본 뇌염; 클레브시엘라(Klebsiellae) 종; 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila); 레리슈만편모충증; 나병; 라임병; 말라리아 면역원; 홍역; 수막염; 수막구균; 수막구균 다당류 A군; 수막구균 다당류 C군; 볼거리; 볼거리 바이러스; 마이코박테리아; 마이코박테리움 튜베르쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis); 나이세리아 ; 나이세리아 고노르히아 ( Neisseria gonorrhea); 나이세리아 메닌기티디스 ( Neisseria meningitides ); 양 블루텅; 양 뇌염; 유두종; 파라인플루엔자; 파라마익소바이러스; 페르투시스; 역병; 뉴모코커 스( pneumococcus ); 뉴모사이티스 카리니 ( Pneumocystis carinii ); 폐렴; 폴리오바이 러스; 프로테우스(proteus) 종; 슈도모나스 아에루기노사( Pseudomonas aeruginosa); 공수병; 호흡 합포체 바이러스; 로타바이러스; 풍진; 살모넬라; 요로 주혈흡충증; 쉬겔라에(shigellae); 원숭이 면역결핍 바이러스; 천연두; 스타필로코 커스 아우레우스 ( Staphylococcus aureus ); 스타필러코커스 종; 스트렙토코터스 뉴 모니아; 스트렙토코커스 파이 오게네스 ( Streptococcus pyogenes ); 스트렙토코커스 종; 돼지 인플루엔자; 파상풍; 트레포네마 팔리둠( Treponema pallidum ); 장티푸스; 종두증; 바리셀라-조스터(varicella-zoster) 바이러스; 및 비브리오 콜레라에 대한 면역 유효 반응을 유발할 수 있는 항원형 폴리펩티드.
부포린(buforin) I; 부포린 II; 세크로핀 A; 세크로핀 B; 세크로핀 P1(돼지); 개구린(gaegurin) 2(라나로구사(Rana rugosa)); 개구린 5(라나 루고사); 인돌리시딘(indolicidin); 프로테그린(protegrin)-(PG)-I; 마가이닌 1; 및 마가이닌 2; 및 T-22 [Tyr5 ,12, Lys7]-폴리-페뮤신(phemusin) II 펩티드를 비제한적 예로 포함하는 항미생물 펩티드.
알츠하이머씨병 베타-단백질(SP28); 칼파인 억제제 펩티드; 캅사제-1 억제제 V; 캅사제-3, 기질 TV; 카스파제-1 억제제 I(세포투과성); 카스파제-1 억제제 VI; 카스파제-3 기질 III(형광발생); 카스파제-1 기질 V(형광발생); 카스파제-3 억제제 I(세포투과성); 카스파제-6 ICE 억제제 III; [Des-Ac, 비오틴]-ICE 억제제 III; IL-1B 전환 효소(ICE) 억제제 II; IL-1B 전환 효소(ICE) 기질 IV; MDL 28170; 및 MG-132를 비제한적 예로 포함하는 세포괴사 관련 펩티드.
알파-ANP(알파-ChANP)(닭); 아나틴; ANP 1-11(래트); ANP 8-30(개구리); ANP 11-30(개구리); ANP-21(fANP-21)(개구리); ANP-24(fANP-24)(개구리); ANP-30(개구리); ANP 단편 5-28(인간, 개); ANP-7-23(인간); ANP 단편 7-28(인간, 개); 알파-심방 나트륨이뇨 폴리펩티드 1-28(인간, 개); A7 1915(래트); 심방 나트륨이뇨 인자 8-33(래트); 심방 나트륨이뇨 폴리펩티드 3-28(인간); 심방 나트륨이뇨 폴리펩티드 4-28(인간, 개); 심방 나트륨이뇨 폴리펩티드 5-27(인간); 심방 나트륨이뇨 아엡티드(ANP)(뱀장어); 아트리오펩틴 I(래트, 토끼, 마우스); 아트리오펩틴 II(래트, 토끼, 마우스); 아트리오펩틴 III(래트, 토끼, 마우스); 심방 나트륨이뇨 인자(rANF)(래트), 아우리쿨린 A(래트 ANF 126-149); 아우리쿨린 B(래트 ANF 126-150); 베타-ANP(1-28, 이량체, 항-평형); 베타-rANF 17-48; 비오티닐-알파-ANIP 1-28(인간, 개); 비오티닐-심방 나트륨이뇨 인자(비오티닐-rANF)(래트); 카르디오딜라틴 1-16(인간); C-ANF 4-23(래트); Des-[Cys105, Cys121]-심방 나트륨이뇨 인자 104-126(래트); [Met(O)12] ANP 1-28(인간); [Mpr7, DA1a9]ANP 7-28, 아미드(래트); 프레프로-ANF 104-116(인간); 프레프로-ANF 26-55(프로ANF 1-30)(인간); 프레프로-ANF 56-92(프로ANF 31-67)(인간); 프레프로-ANF 104-123(인간); [Tyr0]-아트리오펩틴 I(래트, 토끼, 마우스); [Tyr0]-아트리오펩틴 II(래트, 토끼, 마우스); [Tyr0]-프레프로 ANF 104-123(인간); 유로딜라틴(CDD/ANP 95-126); 심실 나트륨이뇨 펩티드(VNP)(뱀장어); 및 심실 나트륨이뇨 펩티드(VNP)(무지개 송어)를 비제한적 예로 포함하는 심방 나트륨이뇨 펩티드.
알파 낭세포 펩티드; 알파-낭세포 펩티드 1-9; 알파-낭세포 펩티드 1-8; 알파-낭세포 펩티드 1-7; 베타-낭세포 인자 및 감마-낭세포 인자를 비제한적 예로 포함하는 낭세포 펩티드.
알파-s1 카세인 101-123(우유); 비오티닐-봄베신; 봄베신 8-14; 봄베신; [Leu13-psi(CH2NH)Leu14]-봄베신; [D-Phe6, Des-Met14]-봄베신 6-14 에틸아미드; [DPhe12] 봄베신; [DPhe12, Leu14]-봄베신; [Tyr4]-봄베신; 및 [Tyr4, DPhe12]-봄베신을 비제한적 예로 포함하는 봄베신 펩티드.
골 GLA 단백질; 골 GLA 단백질 45-49; [Glu17, G1a21 ,24]-오스테오칼신 1-49(인간); 미클로티드-2(MP-2); 오스테오칼신 1-49(인간); 오스테오칼신 37-49(인간); 및 [Tyr38, Phe42 ,46] 골 GLA 단백질 38-49(인간)을 비제한적 예로 포함하는 골 GLA 펩티드(BGP).
[Ala2 ,6, des-Pro3]-브래디키닌; 브래디키닌; 브래디키닌(Bowfin. Gar); 브래디키닌 강화 펩티드; 브래디키닌 1-3; 브래디키닌 1-5; 브래디키닌 1-6; 브래디키닌 1-7; 브래디키닌 2-7; 브래디키닌 2-9; [DPhe7] 브래디키닌; [Des-Arg9]-브래디키닌; [Des-Arg10]-Lys-브래디키닌([Des-Arg10]-칼리딘); [D-N-Me-Phe7]-브래디키닌; [Des-Arg9, Leu8]-브래디키닌; Lys-브래디키닌(칼리딘); Lys-(Des-Arg9, Leu8)-브래디키닌([Des-Arg10, Leu]9-칼리딘); [Lys0-Hyp3]-브래디키닌; 오보키닌; [Lys0-Ala3]-브래디키닌; Met-Lys-브래디키닌; 펩티드 K12 브래디키닌 강화 펩티드; [(pCl)Phe5,8]-브래디키닌; T-키닌(Ile-Ser-브래디키닌); [Thi5 ,8, D-Phe7]-브래디키닌; [Tyr0]-브래디키닌; [Tyr5]-브래디키닌; [Tyr8]-브래디키닌; 및 칼리크레인을 비제한적 예로 포함하는 브래디키닌 펩티드.
BNP 32(개); BNP-유사 펩티드(뱀장어); BNP-32(인간); BNP-45(마우스); BNP-26(돼지); BNP-32(돼지); 비오티닐-BNP-32(돼지); BNP-32(래트); 비오티닐-BNP-32(래트); BNP45(BNP 51-95, 5K 심장 나트륨이뇨 펩티드)(래트); 및 [Tyr0]-BNP 1-32(인간)을 비제한적 예로 포함하는 뇌 나트륨이뇨 펩티드(BNP).
C-펩티드; 및 [Tyr0]-C-펩티드(인간)를 비제한적 예로 포함하는 C-펩티드.
C-형 나트륨이뇨 펩티드(닭); C-형 나트륨이뇨 펩티드-22(CNP-22)(돼지, 래트, 인간); C-형 나트륨이뇨 펩티드-53(CNP-53)(인간); C-형 나트륨이뇨 펩티드-53(CNP-53)(돼지, 래트); C-형 나트륨이뇨 펩티드-53(돼지, 래트) 1-29(CNP-53 1-29); 프레프로-CNP 1-27(래트); 프레프로-CNP 30-50(돼지, 래트); 바소나트린 펩티드(VNP); 및 [Tyr0]-C-형 나트륨이뇨 펩티드-22([Tyr0]-CNP-22)를 비제한적 예로 포함하는 C-형 나트륨이뇨 펩티드(CNP).
비오티닐-칼시토닌(인간); 비오티닐-칼시토닌(래트); 비오티닐-칼시토닌(연어); 칼시토닌(닭); 칼시토닌(뱀장어); 칼시토닌(인간); 칼시토닌(돼지); 칼시토닌(래트); 칼시토닌(연어); 칼시토닌 1-7(인간); 칼시토닌 8-32(연어); 카타칼신(PDN-21)(C-프로칼시토닌); 및 N-proCT(아미노-말단 프로칼시토닌 절단 펩티드)(인간)을 비제한적 예로 포함하는 칼시토닌 펩티드.
아세틸-알파-CGRP 19-37(인간); 알파-CGRP 19-37(인간); 알파-CGRP 23-37(인간); 비오티닐-CGRP(인간); 비오티닐-CGRP II(인간); 비오티닐-CGRP(래트); 베타-CGRP(래트); 비오티닐-베타-CGRP(래트); CGRP(래트); CGRP(인간); 칼시토닌 C-말단 인접 펩티드; CGRP 1-19(인간); CGRP 20-37(인간); CGRP 8-37(인간); CGRP II(인간); CGRP(래트); CGRP 8-37(래트); CGRP 29-37(래트); CGRP 30-37(래트); CGRP 3 1-37(래트); CGRP 32-37(래트); CGRP 33-37(래트); CGRP 31-37(래트); [(Cys(Acm)2,7]-CGRP; 엘카토닌(elcatonin); [Tyr0]-CGRP(인간); [Tyr0]-CGRP II(인간); [Tyr0]-CGRP 28-37(래트); [Tyr0]-CGRP(래트); 및 [Tyr22]-CGRP 22-37(래트)를 비제한적 예로 포함하는 칼시토닌 유전자 관련 펩티드(CGRP).
CART(인간); CART 55-102(인간); CART(래트); 및 CART 55-102(래트)를 비제한적 예로 포함하는 CART 펩티드.
베타-카소모르핀(인간); 베타-카소모르핀 1-3; 베타-카소모르핀 1-3, 아미드; 베타-카소모르핀(소); 베타-카소모르핀 1-4(소); 베타-카소모르핀 1-5(소); 베타-카소모르핀 1-5, 아미드(소); 베타-카소모르핀 1-6(소); [DAla2]-베타-카소모르핀 1-3, 아미드(소); [DA1a2, Hyp4, Tyr5]-베타-카소모르핀 1-5 아미드; [DA1a2, DPro4, Tyr5]-베타-카소모르핀 1-5, 아미드; [DA1a2, Tyr5]-베타-카소모르핀 1-5, 아미드(소); [DA1a2 ,4,Tyr5]-베타-카소모르핀 1-5, 아미드(소); [DA1a2, (pCl)Phe3]-베타-카소모르핀, 아미드(소); [DA1a2]-베타-카소모르핀 1-4, 아미드(소); [DA1a2]-베타-카소모르핀 1-5(소); [DA1a2]-베타-카소모르핀 1-5, 아미드(소); [DA1a2, Met5]-베타-카소모르핀 1-5(소); [DPro2]-베타-카소모르핀 1-5, 아미드(소); [DA1a2]-베타-카소모르핀 1-6(소); [DPro2]-베타-카소모르핀 1-4, 아미드; [Des-Tyr1]-베타-카소모르핀(소); [DA1a2 ,4, Tyr5]-베타-카소모르핀 1-5, 아미드(소); [DA1a2, (pCl)Phe3]-베타-카소모르핀, 아미드(소); [DA1a2]-베타-카소모르핀 1-4, 아미드(소); [DA1a2]-베타-카소모르핀 1-5(소); [DA1a2]-베타-카소모르핀 1-5, 아미드(소); [DA1a2,Met5]-베타-카소모르핀 1-5(소); [DPro2]-베타-카소모르핀 1-5, 아미드(소); [DA1a2]-베타-카소모르핀 1-6(소); [DPro2]-베타-카소모르핀 1-4, 아미드; [Des-Tyr1]-베타-카소모르핀(소); 및 [Val3]-베타-카소모르핀 1-4, 아미드(소)를 비제한적 예로 포함하는 카소모르핀 펩티드.
데펜신 1(인간) HNP-1(인간 호중구 펩티드-1); 및 N-포르밀-Met-Leu-Phe를 비제한적 예로 포함하는 화학주성 펩티드.
카에룰레인; 콜레시스토키닌; 콜레시스토키닌-판크레오자이민; CCK-33(인간); 콜레시스토키닌 옥타펩티드 1-4(비술페이트화)(CCK 26-29, 비술페이트화); 콜레시스토키닌 옥타펩티드(CCK 26-33); 콜레시스토키닌 옥타펩티드(비술페이트화)(CCK 26-33, 비술페이트화); 콜레시스토키닌 헵타펩티드(CCK 27-33); 콜레시스토키닌 테트라펩티드(CCK 30-33); CCK-33(돼지); CR 1409, 콜레시스토키닌 길항자; CCK 플랭킹 펩티드(비술페이트화); N-아세틸 콜레시스토키닌, CCK 26-30(술페이트화); N-아세틸 콜레시스토키닌, CCK 26-31(술페이트화); N-아세틸 콜레시스토키닌, CCK 26-31(비술페이트화); 프레프로 CCK 단편 V-9-M; 및 프로글루미드를 비제한적 예로 포함하는 콜레시스토키닌(CCK) 펩티드.
콜로니-자극 인자(CSF); GMCSF; MCSF; 및 G-CSF를 비제한적 예로 포함하는 콜로니-자극 인자 펩티드.
아스트레신; 알파-나선형 CRF 12-41; 비오티닐-CRF(양); 비오티닐-CRF(인간, 래트); CRF(소); CRF(인간, 래트); CRF(양); CRF(돼지); [Cys21]-CRF(인간, 래트); CIRF 길항자(알파-나선형 CRF 9-41); CRF 6-33(인간, 래트); [DPro5]-CRF(인간, 래트); [D-Phe12, Nle21 ,38]-CRF 12-41(인간, 래트); 호산구주성 펩티드; [Met(0)21]-CRF(양); [Nle21, Tyr32]-CRF(양); 프레프로 CRF 125-151(인간); 사우바진(개구리); [Tyr0]-CRF(인간, 래트); [Tyr0]-CRF(양); [Tyr0]-CRF 34-41(양); [Tyr0]-유로코르틴; 유로코르틴 아미드(인간); 유로코르틴(래트); 유로텐신 I(카토스토무스 코메르소니(Catostomus commersoni)); 유로텐신 II; 및 유로텐신 II(라나 리비분다(Rana ridibunda))를 비제한적 예로 포함하는 코르티코르트로핀 방출 인자(CRF) 펩티드.
코르티스타틴 29; 코르티스타틴 29(1-13); [Tyr0]-코르티스타틴 29; 프로-코르티스타틴 28-47; 및 프로-코르티스타틴 51-81을 비제한적 예로 포함하는 코르티스타틴 펩티드.
종양 괴사 인자 (cytokine); 및 종양 괴사 인자-β(TNF-β)을 비제한적 예로 포함하는 사이토킨 펩티드.
데르모르핀 및 데르모르핀 유사체 1-4를 비제한적 예로 포함하는 데르모르핀 펩티드.
대형 다이노르핀(프로다이노르핀 209-240)(돼지); 비오티닐-다이노르핀 A(비오티닐-프로다이노르핀 209-225); [DAla2, DArg6]-다이노르핀 A 1-13(돼지); [D-A1a2]-다이노르핀 A(돼지); [D-A1a2]-다이노르핀 A 아미드(돼지); [D-A1a2]-다이노르핀 A 1-13, 아미드(돼지); [D-A1a2]-다이노르핀 A 1-9(돼지); [DArg6]-다이노르핀 A 1-13(돼지); [DArg8]-다이노르핀 A 1-13(돼지); [Des-Tyr1]-다이노르핀 A 1-8; [D-Pro10]-다이노르핀 A 1-11(돼지); 다이노르핀 A 아미드(돼지); 다이노르핀 A 1-6(돼지); 다이노르핀 A 1-7(돼지); 다이노르핀 A 1-8(돼지); 다이노르핀 A 1-9(돼지); 다이노르핀 A 1-10(돼지); 다이노르핀 A 1-10 아미드(돼지); 다이노르핀 A 1-11(돼지); 다이노르핀 A 1-12(돼지); 다이노르핀 A 1-13(돼지); 다이노르핀 A 1-13 아미드(돼지); DAKLI(다이노르핀 A-유사 카파 리간드); DAKLI-비오틴([Arg11 ,13]-다이노르핀 A(1-13)-Gly-NH(CH2)5NIH-비오틴); 다이노르핀 A 2-17(돼지); 다이노르핀 2-17, 아미드(돼지); 다이노르핀 A 2-12(돼지); 다이노르핀 A 3-17, 아미드(돼지); 다이노르핀 A 3-8(돼지); 다이노르핀 A 3-13(돼지); 다이노르핀 A 3-17(돼지); 다이노르핀 A 7-17(돼지); 다이노르핀 A 8-17(돼지); 다이노르핀 A 6-17(돼지); 다이노르핀 A 13-17(돼지); 다이노르핀 A(프로다이노르핀 209-225)(돼지); 다이노르핀 B 1-9; [MeTyr1, MeArg7, D-Leu8]-다이노르핀 1-8 에틸 아미드; [(nMe)Tyr1] 다이노르핀 A 1-13, 아미드(돼지); [Phe7]-다이노르핀 A 1-7(돼지); [Phe7]-다이노르핀 A 1-7, 아미드(돼지); 및 프로다이노르핀 228-256(다이노르핀 B 29)(류모르핀)(돼지)를 비제한적 예로 포함하는 다이노르핀 펩티드.
알파-네오-엔도르핀(돼지); 베타-네오엔도르핀; Ac-베타-엔도르핀(낙타, 소, 양); Ac-베타-엔도르핀 1-27(낙타, 소, 양); AC-베타-엔도르핀(인간); Ac-베타-엔도르핀 1-26(인간); Ac-베타-엔도르핀 1-27(인간); Ac-감마-엔도르핀(Ac-베타-리포트로핀 61-77); 아세틸-알파-엔도르핀; 알파-엔도르핀(베타-리포트로핀 61-76); 알파-네오-엔도르핀 유사체; 알파-네오-엔도르핀 1-7; [Arg8]-알파-네오엔도르핀 1-8; 베타-엔도르핀(베타-리포트로핀 61-91)(낙타, 소, 양); 베타-엔도르핀 1-27(낙타, 소, 양); 베타-엔도르핀, 말; 베타-엔도르핀(베타-리포트로핀 61-91)(인간); 베타-엔도르핀(1-5)+(16-31)(인간); 베타-엔도르핀 1-26(인간); 베타-엔도르핀 1-27(인간); 베타-엔도르핀 6-31(인간); 베타-엔도르핀 18-31(인간); 베타-엔도르핀(돼지); 베타-엔도르핀(래트); 베타-리포트로핀 1-10(돼지); 베타-리포트로핀 60-65; 베타-리포트로핀 61-64; 베타-리포트로핀 61-69; 베타-리포트로핀 88-91; 비오티닐-베타-엔도르핀(비오티닐-베타-리포트로핀 61-91); 비오사이틴-베타-엔도르핀(인간); 감마-엔도르핀(베타-리포트로핀 61-77); [DA1a2]-알파-네오-엔도르핀 1-2, 아미드; [DA1a2]-베타-리포트로핀 61-69; [DA1a2]-감마-엔도르핀; [Des-Tyr1]-베타-엔도르핀(인간); [Des-Tyr1]-감마-엔도르핀(베타-리포트로핀 62-77); [Leu5]-베타-엔도르핀(낙타, 소, 양); [Met5, Lys6]-알파-네오-엔도르핀 1-6; [Met5, Lys6 ,7]-알파-네오-엔도르핀 1-7; 및 [Met5, Lys6, Arg7]-알파-네오-엔도르핀 1-7을 비제한적 예로 포함하는 엔도르핀 펩티드.
엔도텔린-1(ET-1); 엔도텔린-1[비오틴-Lys9] 엔도텔린-1(1-15)(인간); 엔도텔린-1(1-15), 아미드(인간); Ac-엔도텔린-1(16-21)(인간); Ac-[DTrp16]-엔도텔린-1(16-21)(인간); [Ala3 ,11]-엔도텔린-1; [Dpr1, Asp15]-엔도텔린-1; [Ala2]-엔도텔린-3(인간); [Ala18]-엔도텔린-1(인간); [Asn18]-엔도텔린-1(인간); [Res-701-1]-엔도텔린 B 수용체 길항자; Suc-[Glu9, Ala11 ,15] 엔도텔린-1(8-21), IRL-1620; 엔도텔린-C-말단 헥사펩티드; [D-Val22]-대형 엔도텔린-1(16-38)(인간); 엔도텔린-2(ET-2)(인간, 개); 엔도텔린-3(ET-3)(인간, 래트, 돼지, 토끼); 비오티닐-엔도텔린-3(비오티닐-ET-3); 프레프로-엔도텔린-1(94-109)(돼지); BQ-518; BQ-610; BQ-788; 내피성-의존성 이완 길항자; FR139317; IRL-1038; JKC-301; JKC-302; PD-145065; PD-142893; 사라포톡신 S6a(아트락타스피스 에간덴시스(atractaspis engaddensis)); 사라포톡신 S6b(아트락타스피스 에간덴시스); 사라포톡신 S6c(아트락타스피스 에간덴시스); Lys4]-사라포톡신 S6c; 사라포톡신 S6d; 대형 엔도텔린-1(인간); 비오티닐-대형 엔도텔린-1(인간); 대형 엔도텔린-1(1-39)(돼지); 대형 엔도텔린-3(22-41), 아미드(인간); 대형 엔도텔린-1(22-39)(래트); 대형 엔도텔린-1(1-39)(소); 대형 엔도텔린-1(22-39)(소); 대형 엔도텔린-1(19-38)(인간); 대형 엔도텔린-1(22-38)(인간); 대형 엔도텔린-2(인간); 대형 엔도텔린-2(22-37)(인간); 대형 엔도텔린-3(인간); 대형 엔도텔린-1(돼지); 대형 엔도텔린-1(22-39) 레프로-엔도텔린-1(74-91)); 대형 엔도텔린-1(래트); 대형 엔도텔린-2(1-38)(인간); 대형 엔도텔린-2(22-38)(인간); 대형 엔도텔린-3(래트); 비오티닐-대형 엔도텔린-1(인간); 및 [Tyr123]-프레프로-엔도텔린(110-130), 아미드(인간)을 비제한적 예로 포함하는 엔도텔린 펩티드.
[BQ-123]; [BE18257B]; [BE-18257A]/[W-7338A]; [BQ-485]; FR139317; PD-151242; 및 TTA-386을 비제한적 예로 포함하는 ETa 수용체 길항자 펩티드.
[BQ-3020]; [RES-701-3] 및 [IRL-1720]을 비제한적 예로 포함하는 ETb 수용체 길항자 펩티드.
아드레노르핀, 유리산; 아미도르핀(프로엔케팔린 A(104-129)-NH2)(소); BAM-12P(소 부신 수질 도데카펩티드); BAM-22P(소 부신 수질 도코사펩티드); BAM-22P(소 부신 수질 도코사펩티드); 벤조일-Phe-Ala-Arg; 엔케팔린; [D-Ala2, D-Leu5]-엔케팔린; [D-A1a2, D-Met5]-엔케팔린; [DA1a2]-Leu-엔케팔린, 아미드; [DA1a2, Leu5, Arg6]-엔케팔린; [Des-Tyr1, DPen2 ,5]-엔케팔린; [Des-Tyr1, DPen2, Pen5]-엔케팔린; [Des-Tyr1]-Leu-엔케팔린; [D-Pen2 ,5]-엔케팔린; [DPen2, Pen5]-엔케팔린; 엔케팔리나제 기질; [D-Pen2, pCI-Phe4, D-Pen5]-엔케팔린; Leu-엔케팔린; Leu-엔케팔린, 아미드; 비오티닐-Leu-엔케팔린; [D-A1a2]-Leu-엔케팔린; [D-Ser2]-Leu-엔케팔린-Thr(델타-수용체 펩티드)(DSLET); [D-Thr2]-Leu-엔케팔린-Thr(DTLBT); [Lys6]-Leu-엔케팔린; [Met5, Arg6]-엔케팔린; [Met5, Arg6]-엔케팔린-Arg; [Met5, Arg6, Phe7]-엔케팔린, 아미드; Met-엔케팔린; 비오티닐-Met-엔케팔린; [D-A1a2]-Met-엔케팔린; [D-A1a2]-Met-엔케팔린, 아미드; Met-엔케팔린-Arg-Phe; Met-엔케팔린, 아미드; [A1a2]-Met-엔케팔린, 아미드; [DMet2, Pro5]-엔케팔린, 아미드; [DTrp2]-Met-엔케팔린, 아미드, 메토르핀아미드(아드레노르핀); 펩티드 B(소); 3200-달톤 부신 펩티드 E(소); 펩티드 F(소); 프리프로엔케팔린 B 186-204(인간); 스피노르핀(소); 및 티오르판(D,L,3-머캅토-2-벤질프로파노일-글리신)을 비제한적 예로 포함하는 엔케팔린 펩티드.
혈소판 인자-4(58-70)(인간); 에키스타틴(에키스 카리나투스(Echis carinatus)); E, P, L 셀렉틴 보존 영역; 피브로넥틴 유사체; 피브로넥틴-결합 단백질; 피브리노펩티드 A(인간); [Tyr0]-피브리노펩티드 A(인간); 피브리노펩티드 B(인간); [Glu1]-피브리노펩티드 B(인간); [Tyr15]-피브리노펩티드 B(인간); 24-42의 피브리노겐 베타-사슬 단편; 피브리노겐 결합 억제제 펩티드; 피브로넥틴 관련 펩티드(콜라겐 결합 단편); 피브린분해 억제 인자; FN-C/H-1(피브로넥틴 헤파린-결합 단편); FN-C/H-V(피브로넥틴 헤파린-결합 단편); 헤파린-결합 펩티드; 라미닌 펜타 펩티드, 아미드; Leu-Asp-Val-NH2(LDV-NH2)(인간), 소(래트)(닭); 네크로피브린(인간); 네크로피브린(래트); 및 혈소판 막 당단백질 IIB 펩티드 296-306을 비제한적 예로 포함하는 피브로넥틴 펩티드.
갈라닌(인간); 갈라닌 1-19(인간); 프레프로갈라닌 1-30(인간); 프레프로갈라닌 65-88(인간); 프레프로갈라닌 89-123(인간); 갈라닌(돼지); 갈라닌 1-16(돼지, 래트); 갈라닌(래트); 비오티닐-갈라닌(래트); 프레프로갈라닌 28-67(래트); 갈라닌 1-13-브래디키닌 2-9, 아미드; M40, 갈라닌 1-13-Pro-Pro-(Ala-Leu) 2-Ala-아미드; C7, 갈라닌 1-13-스판타이드-아미드; GMAP 1-41, 아미드; GMAP 16-41, 아미드; GMAP 25-41, 아미드; 갈란타이드; 및 엔테로-카시닌을 비제한적 예로 포함하는 갈라닌 펩티드.
가스트린(닭); 소화관 억제 펩티드(GIP)(인간); 가스트린 I(인간); 비오티닐-가스트린 I(인간); 대형 가스트린-1(인간); 가스트린 방출 펩티드(인간); 가스트린 방출 펩티드 1-16(인간); 소화관 억제 폴리펩티드(GIP)(돼지); 가스트린 방출 펩티드(돼지); 비오티닐-가스트린 방출 펩티드(돼지); 가스트린 방출 펩티드 14-27(돼지)(인간); 소량 가스트린(래트); 펜타가스트린; 소화관 억제 펩티드 1-30(돼지); 소화관 억제 펩티드 1-30, 아미드(돼지); [Tyr0]-소화관 억제 펩티드 23-42(인간); 및 소화관 억제 펩티드(래트)를 비제한적 예로 포함하는 가스트린 펩티드.
[Des-His1, Glu9]-글루카곤, 엑센딘-4, 글루카곤(인간); 비오티닐-글루카곤(인간); 글루카곤 19-29(인간); 글루카곤 22-29(인간); [Des-His1-Glu]9-글루카곤, 아미드; 글루카곤-유사 펩티드 1, 아미드; 글루카곤-유사 펩티드 1(인간); 글루카곤-유사 펩티드 1(7-36); 글루카곤-유사 펩티드 2(래트); 비오티닐-글루카곤-유사 펩티드-1(7-36)(비오티닐-프리프로글루카곤 78-107, 아미드); 글루카곤-유사 펩티드 2(인간); 개재 펩티드-2; 옥신토모둘린/글루카곤 37; 및 발로신(펩티드 VQY)(돼지)를 비제한적 예로 포함하는 글루카곤 펩티드.
Gn-RH 연관 펩티드 25-53(인간); Gn-RH 연관 펩티드 1-24(인간); Gn-RH 연관 펩티드 1-13(인간); Gn-RH 연관 펩티드 1-13(래트); 고나도트로핀 방출 펩티드(인간 여포); [Tyr0]-GAP([Tyr0]-Gn-RH 전구체 펩티드 14-69)(인간); 및 프로오피오멜라노코르틴(POMC) 전구체 27-52(돼지)를 비제한적 예로 포함하는 Gn-RH 연관 펩티드(GAP).
세포 성장 인자; 표피 성장 인자; 종양 성장 인자; 알파-TGF; 베타-TF; 알파-TGF 34-43(래트); EGF(인간); 산성 섬유아세포 성장 인자; 염기성 섬유아세포 성장 인자; 염기성 섬유아세포 성장 인자 13-18; 염기성 섬유아세포 성장 인자 120-125; 뇌 유래 산성 섬유아세포 성장 인자 1-11; 뇌 유래 염기성 섬유아세포 성장 인자 1-24; 뇌 유래 산성 섬유아세포 성장 인자 102-111; [Cys(Acm20 ,31)]-표피 성장 인자 20-31; 표피 성장 인자 수용체 펩티드 985-996; 인슐린-유사 성장 인자(IGF)-I(닭); IGF-I(래트); IGF-I(인간); Des(1-3) IGF-I(인간); R3 IGF-I(인간); R3 IGF-I(인간); 장형(long) R3 IGF-I(인간); 보조 펩티드 유사체; 식욕억제성 펩티드; Des(1-6) IGF-II(인간); R6 IGF-II(인간); IGF-I 유사체; IGF I(24-41); IGF I(57-70); IGF I(30-41); IGF II; IGF II(33-40); [Tyr0]-IGF II(33-40); 간세포 성장 인자; 미드카인; 미드카인 60-121(인간); N-아세틸, 알파-TGF 34-43, 메틸 에스테르(래트); 신경 성장 인자(NGF)(마우스); 혈소판-유래 성장 인자; 혈소판-유래 성장 인자 길항자; 형질전환 성장 인자-알파(인간); 및 형질전환 성장 인자-I(래트)를 비제한적 예로 포함하는 성장 인자 펩티드.
성장 호르몬(hGH)(인간); 성장 호르몬 1-43(인간); 성장 호르몬 6-13(인간); 성장 호르몬 방출 인자(인간); 성장 호르몬 방출 인자(소); 성장 호르몬 방출 인자(돼지); 성장 호르몬 방출 인자 1-29, 아미드(래트); 성장 호르몬 프로-방출 인자(인간); 비오티닐-성장 호르몬 방출 인자(인간); 성장 호르몬 방출 인자 1-29, 아미드(인간); [D-Ala2]-성장 호르몬 방출 인자 1-29, 아미드(인간); [N-Ac-Tyr1, D-Arg2]-GRF 1-29, 아미드; [His1, Nle27]-성장 호르몬 방출 인자 1-32, 아미드; 성장 호르몬 방출 인자 1-37(인간); 성장 호르몬 방출 인자 1-40(인간); 성장 호르몬 방출 인자 1-40, 아미드(인간); 성장 호르몬 방출 인자 30-44, 아미드(인간); 성장 호르몬 방출 인자(마우스); 성장 호르몬 방출 인자(양); 성장 호르몬 방출 인자(래트); 비오티닐-성장 호르몬 방출 인자(래트); GHRP-6([His1, Lys6]-GHRP); 헥사렐린(성장 호르몬 방출 헥사펩티드); 및 [D-Lys3]-GHRP-6을 비제한적 예로 포함하는 성장 호르몬 펩티드.
[Arg8]-GTP-결합 단백질 단편, Gs 알파; GTP-결합 단백질 단편, G 베타; GTP-결합 단백질 단편, G 알파; GTP-결합 단백질 단편, Go 알파; GTP-결합 단백질 단편, Gs 알파; 및 GTP-결합 단백질 단편, G 알파 i2를 비제한적 예로 포함하는 GTP-결합 단백질 단편 펩티드.
구아닐린(인간); 구아닐린(래트); 및 유로구아닐린을 비제한적 예로 포함하는 구아닐린 펩티드.
인히빈(소); 인히빈, 알파-서브유니트 1-32(인간); [Tyr0]-인히빈, 알파-서브유니트 1-32(인간); 정장 인히빈-유사 펩티드(인간); [Tyr0]-정장 인히빈-유사 펩티드(인간); 인히빈, 알파-서브유니트 1-32(돼지); 및 [Tyr0]-인히빈, 알파-서브유니트 1-32(돼지)를 비제한적 예로 포함하는 인히빈 펩티드.
인슐린(인간); 인슐린(돼지); IGF-I(인간); 인슐린-유사 성장 인자 II(69-84); 프로-인슐린-유사 성장 인자 II(68-102)(인간); 프로-인슐린-유사 성장 인자 II(105-128)(인간); [AspB28]인슐린(인간); [LysB28] 인슐린(인간); [LeuB28]인슐린(인간); [ValB28]인슐린(인간); [AlaB28]인슐린(인간); [AspB28, ProB29]-인슐린(인간); [LysB28, ProB29]-인슐린(인간); [LeuB28, ProB29]인슐린(인간); [ValB28, ProB29]-인슐린(인간); [A1aB28, ProB29]-인슐린(인간); [GlyA21]-인슐린(인간); [GlyA21 GlnB3]인슐린(인간); [A1aA21]인슐린(인간); [AlaA21 GlnB3] 인슐린(인간); [GlnB3] 인슐린(인간); [GlnB3O]인슐린(인간); [G1yA21 GluB30]인슐린(인간); G1yA21 GlnB33 GluB3O]-인슐린(인간); [GlnB3 GluB3O]-인슐린(인간); B22-B30 인슐린(인간); B23-B30 인슐린(인간); B25-B30 인슐린(인간); B26-B30 인슐린(인간); B27-B30 인슐린(인간); B29-B30 인슐린(인간); 인간 인슐린의 A 사슬, 및 인간 인슐린의 B 사슬을 비제한적 예로 포함하는 인슐린 펩티드.
인터류킨-1 베타 165-181(래트); 및 인터류킨-8(IL-8, CINC/gro)(래트)를 비제한적 예로 포함하는 인터류킨 펩티드.
라미닌; 알파(I)-CB3 435-438(래트); 및 라미닌 결합 억제제를 비제한적 예로 포함하는 라미닌 펩티드.
렙틴 93-105(인간); 렙틴 22-56(래트); Tyr-렙틴 26-39(인간); 및 렙틴 116-130, 아미드(마우스)를 비제한적 예로 포함하는 렙틴 펩티드.
류코마이오서프레신(LMS); 류코파이로키닌(LPK); 류코키닌 I; 류코키닌 II; 류코키닌 III; 류코키닌 IV; 류코키닌 VI; 류코키닌 VII; 및 류코키닌 VIII을 비제한적 예로 포함하는 류코키닌 펩티드.
안티드; Gn-RH II(닭); 항체형성 호르몬-방출 호르몬(LH-RH)(GnRH); 비오티닐-LH-RH; 세트로렐릭스(D-20761); [D-A1a6]-LH-RH; [Gln8]-LH-RH(닭 LH-RH); [DLeu6, Val7] LH-RH 1-9, 에틸 아미드; [D-Lys6]-LH-RH; [D-Phe2, Pro3, D-Phe6]-LH-RH; [DPhe2, DA1a6] LH-RH; [Des-G1y10]-LH-RH, 에틸 아미드; [D-Ala6, Des-Gly10]-LH-RH, 에틸 아미드; [DTrp6]-LH-RH, 에틸 아미드; [D-Trp6, Des-Gly10]-LH-RH, 에틸 아미드(데스롤레린(Deslorelin)); [DSer(But)6, Des-G1y10]-LH-RH, 에틸 아미드; 에틸 아미드; 류코프롤리드; LH-RH 4-10; LH-RH 7-10; LH-RH, 유리산; LH-RH, 란프레이, LH-RH(연어); [Lys8]-LH-RH; [Trp7, Leu8] LH-RH, 유리산; 및 [(t-Bu)DSer6, (Aza)G1y10]-LH-RH를 비제한적 예로 포함하는 항체형성 호르몬-방출 호르몬 펩티드.
마스토파란; 마스(mas)7; 마스8; 마스17; 및 마스토파란 X를 비제한적 예로 포함하는 마스토파란 펩티드.
비만 세포 탈과립화 펩티드 HR-1; 및 비만 세포 탈과립화 펩티드 HR-2를 비제한적 예로 포함하는 비만 세포 탈과립화 펩티드.
[Ac-Cys4, DPhe7, Cys10]알파-MSH 4-13, 아미드; 알파-멜라닌세포 자극 호르몬; 알파-MSH, 유리산; 베타-MSH(돼지); 비오티닐-알파-멜라닌세포 자극 호르몬; 비오티닐-[Nle4, D-Phe7] 알파-멜라닌세포 자극 호르몬; [Des-아세틸]-알파-MSH; [DPhe7]-알파-MSH, 아미드; 감마-1-MSH, 아미드; [Lys0]-감마-1-MSH, 아미드; MSH 방출 억제 인자, 아미드; [Nle4]-알파-MSH, 아미드; [Nle4, D-Phe7]-알파-MSH; N-아세틸, [Nle4, DPhe7] 알파-MSH 4-10, 아미드; 베타-MSH(인간); 및 감마-MSH를 비제한적 예로 포함하는 멜라닌세포 자극 호르몬(MSH) 펩티드.
모르피셉틴(베타-카소모르핀 1-4 아미드); [D-Pro4]-모르피셉틴; 및 [N-MePhe3, D-Pro4]-모르피셉틴을 비제한적 예로 포함하는 모르피셉틴 펩티드.
모르틸린(개); 모르틸린(돼지); 비오티닐-모르틸린(돼지); 및 [Leu13]-모르틸린(돼지)를 비제한적 예로 포함하는 모르틸린 펩티드.
AC-Asp-Glu; 달팽이 심장자극 펩티드-1(ACEP-1)(아프리카 왕달팽이(Achatina fulica)); 지방동원 호르몬(AKH)(메뚜기); 지방동원 호르몬(목화솜벌레 및 담배 박각시나방); 알리테신; 타바누스 아트라투스(Tabanus atratus) 지방동원 호르몬(Taa-AKT); 지방동원 호르몬 II(물무치); 지방동원 호르몬 II(사막 메뚜기); 지방동원 호르몬 III(AKH-3); 지방동원 호르몬 G(AKR-G)(귀뚜라미); 알라토트로핀(AT)(담배박각시나방); 알라토트로핀 6-13(담배박각시나방); APGW 아미드(달팽이류(Lymnaea stagnalis)); 부칼린; 세레벨린; [Des-Ser1]-세레벨린; 코라조닌(미국 바퀴(이질 바퀴); 갑각류 심장작용성 펩티드(CCAP); 갑각류 적색소 세포; DF2(미국산 붉은 가재); 디아제팜-결합 억제제 단편(인간); 디아제팜 결합 억제제 단편(ODN); 엘레도이신 관련 펩티드; FMRF 아미드(연체동물 심장자극 뉴로펩티드); Gly-Pro-Glu(GPE)(인간); 그라눌리베린 R; 두부 활성화제 뉴로펩티드; [His7]-코라조닌; 대벌레 과트레할로스성 인자 TI; 바누스 아트라투스 저트레할로스성 호르몬(Taa-HoTH); 이소구바신 히드로클로라이드; 비쿠쿨린 메티오디드; 피페리딘-4-술폰산; 프로오피오멜라노코르틴의 결합 펩티드(POMC)(소); 결합 펩티드(래트); KSAYMRF 아미드(P. 레디비부스(P. redivivus)); 카시닌; 키네텐신; 레비티드; 리토린; LUQ 81-91(검은반점돌기군소); LUQ 83-91(검은반점돌기군소); 마이오활성(myoactive) 펩티드 I(페리플라네틴 CC-1)(뉴로-호르몬 D); 마이오 활성 펩티드 II(페리플라네틴 CC-2); 마이오모듈린; 뉴런 특이적 펩티드; 뉴런 특이적 에놀라제 404-443(래트); 뉴로펩티드 FF; 뉴로펩티드 K(돼지); NEI(프레프로-MCH 131-143) 뉴로펩티드(래트); NGE(프레프로-MCH 110-128) 뉴로펩티드(래트); NFl(미국산 붉은 가재); PBAN-1(집누에); Hez-PBAN(목화솜벌레; SCPB(군소 기원의 심장작용성 펩티드); 크레토네우린(래트); 우페로레인; 우레키스타키키닌 I; 우레키스타키키닌 II; 제놉신 관련 펩티드 I; 제놉신 관련 펩티드 II; 페달 펩티드(Pep)(군소); 펩티드 Fl(바다가재, 필로메두신); 폴리스테스 마스토파란; 프록톨린; 라나텐신; Ro I(러버 메뚜기, 로말리아 미크로프테라); Ro II(러버 메뚜기, 로말리아 미크로프테라); SALMF 아미드 1(S1); SALMF 아미드 2(S2); 및 SCPA를 비제한적 예로 포함하는 뉴로-펩티드.
[Leu31, Pro34]-뉴로펩티드 Y(인간); 뉴로펩티드 F(확장조충); B1BP3226 NPY 길항자; 비스(31/31'){[Cys31, Trp32, Nva34] NPY 31-36}; 뉴로펩티드 Y(인간, 래트); 뉴로펩티드 Y 1-24 아미드(인간); 비오티닐-뉴로펩티드 Y; [D-Tyr27 ,36, D-Thr32]-NPY 27-36; Des 10-17(시클로 7-21) [Cys7 ,21, Pro34]-NPY; C2-NPY; [Leu31, Pro34] 뉴로펩티드 Y(인간) 뉴로펩티드 Y, 유리산(인간); 뉴로펩티드 Y, 유리산(돼지); 프레프로 NPY 68-97(인간); N-아세틸-[Leu28, Leu31] NPY 24-36; 뉴로펩티드 Y(돼지); [D-Trp32]-뉴로펩티드 Y(돼지); [D-Trp32] NPY 1-36(인간); [Leu17, DTrp32] 뉴로펩티드 Y(인간); [Leu31, Pro34]-NPY(돼지); NPY 2-36(돼지); NPY 3-36(인간); NPY 3-36(돼지); NPY 13-36(인간); NPY 13-36(돼지); NPY 16-36(돼지); NPY 18-36(돼지); NPY 20-36; NFY 22-36; NPY 26-36; [Pro34]-NPY 1-36(인간); [Pro34]-뉴로펩티드 Y(돼지); PYX-1; PYX-2; T4-[NPY(33-36)]4; 및 [Tyr(OMe)21]-뉴로펩티드 Y(인간)을 비제한적 예로 포함하는 뉴로펩티드 Y(NPY) 펩티드.
아교 유래 신경친화도 인자(GDNF); 뇌 유래 신경친화도 인자(BDNF); 및 섬모 신경친화도 인자(CNTF)을 비제한적 예로 포함하는 신경친화도 인자 펩티드.
오렉신 A; 오렉신 B(인간); 오렉신 B(래트, 마우스)를 비제한적 예로 포함하는 오렉신 펩티드.
알파-카세인 단편 90-95; BAM-18P; 카소모키닌 L; 카속신 D; 결정성; DALDA; 데르멘케팔린(델토르핀)(필로이네두사 사우바게이(Phyloinedusa sauvagei)); [D-A1a2]-델토르핀 I; [D-A1a2]-델토르핀 II; 엔도모르핀-1; 엔도모르핀-2; 카이오토르핀; [DArg2]-카이오토르핀; 모르핀 내인성 펩티드; 모르핀 조절 펩티드, C-말단 단편; 모르핀 조절 뉴로펩티드(A-18-F-NEI2); 노시셉틴 [오르파닌 FQ](ORL1 작용자); TIPP; Tyr-MIF-1; Tyr-W-MIF-1; 발로르핀; LW-헤모르핀-6(인간); Leu-발로르핀-Arg; 및 Z-Pro-D-Leu를 비제한적 예로 포함하는 오피오이드 펩티드.
[Asu6]-옥시토신; 옥시토신; 비오티닐-옥시토신; [Thr4, G1y7]-옥시토신; 및 토시노산([Ile3]-프레시노산)을 비제한적 예로 포함하는 옥시토신 펩티드.
PACAP 1-27(인간, 양, 래트); PACAP(1-27)-Gly-Lys-Arg-NH2(인간); [Des-Gln16]-PACAP 6-27(인간, 양, 래트); PACAP38(개구리); PACAP27-NR2(인간, 양, 래트); 비오티닐-PACAP27-NH2(인간, 양, 래트); PACAP 6-27(인간, 양, 래트); PACAP38(인간, 양, 래트); 비오티닐-PACAP38(인간, 양, 래트); PACAP 6-38(인간, 양, 래트); PACAP27-NH2(인간, 양, 래트); 비오티닐-PACAP27-NH2(인간, 양, 래트); PACAP 6-27(인간, 양, 래트); PACAP38(인간, 양, 래트); 비오티닐-PACAP38(인간, 양, 래트); PACAIP 6-38(인간, 양, 래트); PACAP38 16-38(인간, 양, 래트); PACAP38 31-38(인간, 양, 래트); PACAP 관련 펩티드(PRP)(인간); 및 PACAP-관련 펩티드(PRP)(래트)를 비제한적 예로 포함하는 PACAP(뇌하수체 아데닐화 사이클라제 활성화 펩티드) 펩티드.
크로모스타틴(소); 판크레아스타틴(hPST-52)(크로모그라닌 A 250-301, 아미드); 판크레아스타틴 24-52(hPST-29)(인간); 크로모그라닌 A 286-301, 아미드(인간); 판크레아스타틴(돼지); 비오티닐-판크레아스타틴(돼지); [Nle8]-판크레아스타틴(돼지); [Tyr0, Nle8]-판크레아스타틴(돼지); [Tyr0]-판크레아스타틴(돼지); 파라스타틴 1-19(크로모그라닌 A 347-365)(돼지); 판크레아스타틴(크로모그라닌 A 264-314-아미드(래트); 비오티닐-판크레아스타틴(비오티닐-크로모그라닌 A 264-314-아미드; [Tyr0]-판크레아스타틴(래트); 판크레아스타틴 26-51(래트); 및 판크레아스타틴 33-49(돼지)를 비제한적 예로 포함하는 판크레아스타틴 펩티드.
췌장 폴리펩티드(새); 췌장 폴리펩티드(인간); C-단편 췌장 폴리펩티드산(인간); C-단편 췌장 폴리펩티드 아미드(인간); 췌장 폴리펩티드(북방산 개구리); 췌장 폴리펩티드(래트); 및 췌장 폴리펩티드(연어)를 비제한적 예로 포함하는 췌장 폴리펩티드.
[Asp76]-파라티로이드 호르몬 39-84(인간); [Asp76]-파라티로이드 호르몬 53-84(인간); [Asn76]-파라티로이드 호르몬 1-84, 호르몬; [Asn76]-파라티로이드 호르몬 64-84(인간); [Asn8, Leu18]-파라티로이드 호르몬 1-34(인간); [Cys5 ,28]-파라티로이드 호르몬 1-34(인간); 악성종양으로 인한 고칼슘혈증 인자 1-40; [Leu18]-파라티로이드 호르몬 1-34(인간); [Lys(비오티닐)13, Nle8 ,18 Tyr34]-파라티로이드 호르몬 1-34 아미드; [Nle8 ,18, Tyr34]-파라티로이드 호르몬 1-34 아미드; [Nle8 ,18, Tyr34]-파라티로이드 호르몬 3-34 아미드(소); [Nle8 ,18, Tyr34]-파라티로이드 호르몬 1-34(인간); [Nle8 ,18, Tyr34]-파라티로이드 호르몬 1-34 아미드 인간; [Nle8 ,18, Tyr34]-파라티로이드 호르몬 3-34 아미드(인간); [Nle8 ,18, Tyr34]-파라티로이드 호르몬 7-34 아미드(소); [Nle8 ,21, Tyr34]-파라티로이드 호르몬 1-34 아미드(래트); 파라티로이드 호르몬 44-68(인간); 파라티로이드 호르몬 1-34(소); 파라티로이드 호르몬 3-34(소); 파라티로이드 호르몬 1-31 아미드(인간); 파라티로이드 호르몬 1-34(인간); 파라티로이드 호르몬 13-34(인간); 파라티로이드 호르몬 1-34(래트); 파라티로이드 호르몬 1-38(인간); 파라티로이드 호르몬 1-44(인간); 파라티로이드 호르몬 28-48(인간); 파라티로이드 호르몬 39-68(인간); 파라티로이드 호르몬 39-84(인간); 파라티로이드 호르몬 53-84(인간); 파라티로이드 호르몬 69-84(인간); 파라티로이드 호르몬 70-84(인간); [Pro34]-펩티드 YY(PYY)(인간); [Tyr0]-악성종양으로 인한 고칼슘혈증 인자 1-40; [Tyr0]-파라티로이드 호르몬 1-44(인간); [Tyr0]-파라티로이드 호르몬 1-34(인간); [Tyr1]-파라티로이드 호르몬 1-34(인간); [Tyr27]-파라티로이드 호르몬 27-48(인간); [Tyr34]-파라티로이드 호르몬 7-34 아미드(소); [Tyr43]-파라티로이드 호르몬 43-68(인간); [Tyr52, Asn76]-파라티로이드 호르몬 52-84(인간); 및 [Tyr63]-파라티로이드 호르몬 63-84(인간)을 비제한적 예로 포함하는 파라티로이드 호르몬 펩티드.
PTHrP([Tyr36]-PTHrP 1-36 아미드)(닭); hHCF-(1-34)-NH2(체액성 과칼슘혈증 인자)(인간); PTH-관련 단백질 1-34(인간); 비오티닐-PTH 관련 단백질 1-34(인간); [Tyr0]-PTH 관련 단백질 1-34(인간); [Tyr34]-PTH-관련 단백질 1-34 아미드(인간); PTH 관련 단백질 1-37(인간); PTH-관련 단백질 7-34 아미드(인간); PTH 관련 단백질 38-64 아미드(인간); PTH 관련 단백질 67-86 아미드(인간); PTH-관련 단백질 107-111(인간)(래트, 마우스); PTH 관련 단백질 107-111 유리산; PTH-관련 단백질 107-138(인간); 및 PTH-관련 단백질 109-111(인간)을 비제한적 예로 포함하는 파라티로이드 호르몬(PTH) 관련 펩티드.
펩티드 T; [D-Ala1]-펩티드 T; 및 [D-Ala1]-펩티드 T 아미드를 비제한적 예로 포함하는 펩티드 T 펩티드.
프로락틴-방출 펩티드 31(인간); 프로락틴-방출 펩티드 20(인간); 프로락틴-방출 펩티드 31(래트); 프로락틴 방출 펩티드 20(래트); 프로락틴-방출 펩티드 31(소); 및 프로락틴 방출 펩티드 20(소)를 비제한적 예로 포함하는 프로락틴-방출 펩티드.
PYY(인간); PYY 3-36(인간); 비오티닐-PYY(인간); PYY(돼지, 래트); 및 [Leu31, Pro34]-PYY(인간)을 비제한적 예로 포함하는 펩티드 YY(PYY) 펩티드.
아세틸, 안지오텐시노젠 1-14(인간); 안지오텐시노젠 1-14(돼지); 레닌 기질 테트라데카펩티드(래트); [Cys8]-레닌 기질 테트라데카펩티드(래트); [Leu8]-레닌 기질 테트라데카펩티드(래트); 및 [Val8]-레닌 기질 테트라데카펩티드(래트)를 비제한적 예로 포함하는 레닌 기질 펩티드.
세크레틴(개); 세크레틴(닭); 세크레틴(인간); 비오티닐-세크레틴(인간); 세크레틴(돼지); 및 세크레틴(래트)를 비제한적 예로 포함하는 세크레틴 펩티드.
BIM-23027; 비오티닐-소마토스타틴; 비오틴화 코르티스타틴 17(인간); 코르티스타틴 14(래트); 코르티스타틴 17(인간); [Tyr0]-코르티스타틴 17(인간); 코르티스타틴 29(래트); [D-Trp8]-소마토스타틴; [DTrp8, DCys14]-소마토스타틴; [DTrp8, Tyr11]-소마토스타틴; [D-Trp11]-소마토스타틴; NTB(날트리벤(Naltriben)); [Nle8]-소마토스타틴 1-28; 옥트레오티드(SMS 201-995); 프로소마토스타틴 1-32(돼지); [Tyr0]-소마토스타틴; [Tyr1]-소마토스타틴; [Tyr1]-소마토스타틴 28(1-14); [Tyr11]-소마토스타틴; [Tyr0, D-Trp8]-소마토스타틴; 소마토스타틴; 소마토스타틴 길항자; 소마토스타틴-25; 소마토스타틴-28; 소마토스타틴 28(1-12); 비오티닐-소마토스타틴-28; [Tyr0]-소마토스타틴-28; [Leu8, D-Trp22, Tyr25]-소마토스타틴-28; 비오티닐-[Leu8, D-Trp22, Tyr25]-소마토스타틴-28; 소마토스타틴-28(1-14); 및 소마토스타틴 유사체, RC-160을 비제한적 예로 포함하는 소마토스타틴(GIF) 펩티드.
G 단백질 길항자-2; Ac-[Arg6, Sar9, Met(02)11]-물질 P 6-11; [Arg3]-물질 P; Ac-Trp-3,5-비스(트리플루오로메틸)벤질 에스테르; Ac-[Arg6, Sar9, Met(02)11]-물질 P 6-11; [D-A1a4]-물질 P 4-11; [Tyr6, D-Phe7, D-His9]-물질 P 6-11(센디드); 비오티닐-물질 P; 비오티닐-NTE[Arg3]-물질 P; [Tyr8]-물질 P; [Sar9, Met(02)11]-물질 P; [D-Pro2, DTrp7 ,9]-물질 P; [D-Pro4, O-Trp7 ,9]-물질 P 4-11; 물질 P 4-11; [DTrp2,7,9]-물질 P; (데히드로)Pro2 ,4, Pro]-물질 P; [데히드로-Pro4]-물질 P 4-11; [G1p5, (Me)Phe8, Sar9]-물질 P 5-11; [G1p5, Sar9]-물질 P 5-11; [G1p5]-물질 P 5-11; 헵타-물질 P(물질 P 5-11); 헥사-물질 P(물질 P 6-11); [MePhe8, Sar9]-물질 P; [Nle11]-물질 P; 옥타-물질 P(물질 P 4-11); [pGlu1]-헥사-물질 P([PGlu6]-물질 P 6-11); [pGlu6, D-Pro9]-물질 P 6-11; [(pNO2)Phe7 Nle11]-물질 P; 펜타-물질 P(물질 P 7-11); [Pro9]-물질 P; GR73632, 물질 P 7-11; [Sar4]-물질 P 4-11; [Sar9]-물질 P; 셉티드([PGlu6, Pro9]-물질 P 6-11); 스판타이드 I; 스판타이드 II; 물질 P; 물질 P(대구); 물질 P(연어); 물질 P 길항자; 물질 P-Gly-Lys-Arg; 물질 P 1-4; 물질 P 1-6; 물질 P 1-7; 물질 P 1-9; 데카-물질 P(물질 P 2-11); 노나-물질 P(물질 P 3-11); 물질 P 테트라펩티드(물질 P 8-11); 물질 P 트리펩티드(물질 P 9-11); 물질 P, 유리산; 물질 P 메틸 에스테르, 및 [Tyr8, Nle11] 물질 P를 비제한적 예로 포함하는 물질 P 펩티드.
[Ala5, 베타-Ala8] 뉴로키닌 A 4-10; 엘레도이신; 로커스타타키키닌 I(Lom-TK-I)(풀무치); 로커스타타키키닌 II(Lom-TK-II)(풀무치); 뉴로키닌 A 4-10; 뉴로키닌 A(뉴로메딘 L, 물질 K); 뉴로키닌 A(대구 및 연어); 비오티닐-뉴로키닌 A 비오티닐-뉴로네딘 L, 비오티닐-물질 K); [Tyr0]-뉴로키닌 A; [Tyr6]-물질 K; FR64349; [Lys3,G1y8-(R)-감마-락탐-Leu]-뉴로키닌 A 3-10; GR83074; GR87389; GR94800; [베타-A1a8]-뉴로키닌 A 4-10; [Nle10]-뉴로키닌 A 4-10; [Trp7, 베타-A1a8]-뉴로키닌 A 4-10; 뉴로키닌 B(뉴로메딘 K); 비오티닐-뉴로키닌 B(비오티닐-뉴로메딘 K); [MePhe7]-뉴로키닌 B; [Pro7]-뉴로키닌 B; [Tyr0]-뉴로키닌 B; 뉴로메딘 B(돼지); 비오티닐-뉴로메딘 B(돼지); 뉴로메딘 B-30(돼지); 뉴로메딘 B-32(돼지); 뉴로메딘 B 수용체 길항자; 뉴로메딘 C(돼지); 뉴로메딘 N(돼지); 뉴로메딘(U-8)(돼지); 뉴로이네딘(U-25)(돼지); 뉴로메딘 U(래트); 뉴로펩티드-감마(감마-프레프로타키키닌 72-92); PG-KIT; 필로리토린; [Leu8]-필로이토린(필리오메두사 사우바게이); 피살라에민; 피살라에민 1-11; 실리오르히닌 II, 아미드(작은 상어); 센크티드, 선택적 뉴로키닌 B 수용체 펩티드; [Ser2]-뉴로메딘 C; 베타-프레프로타키키닌 69-91(인간); 베타-프레프로타키키닌 111-129(인간); 타키플레신 I; 제놉신; 및 제놉신 25(제닌(xenin) 25)(인간)를 비제한적 예로 포함하는 타키키닌 펩티드.
비오티닐-타이로트로핀-방출 호르몬; [Glu1]-TRH; His-Pro-디케토피페라진; [3-Me-His2]-TRH; pGlu-Gln-Pro-아미드; pGlu-His; [Phe2]-TRH; 프레프로 TRH 53-74; 프레프로 TRH 83-106; 프레프로-TRH 160-169(Ps4, TRH-강화 펩티드); 프레프로-TRH 178-199, 타이로트로핀 방출 호르몬(TRH); TRH, 유리산; TRH-SH 프로; 및 TRH 전구체 펩티드를 비제한적 예로 포함하는 타이로트로핀-방출 호르몬(TRH) 펩티드.
오메가-아가톡신 TK; 아겔레닌(거미, 애풀거미); 아파민(꿀벌, 서양꿀벌); 칼시쿠딘(CaC)(녹색 맘바, 데드로아스피스 안구스티셉스(Dedroaspis angusticeps)); 칼시셉틴(흑색 맘바(덴드로아스피스 폴리레피스 폴리레피스); 차리브도톡신(ChTX)(전갈, 데쓰 스토커 전갈 변종 헤브라에우스); 클로로톡신; 코노톡신 GI(바다 달팽이, 대보초 청자고동); 코노톡신 GS(바다 달팽이, 대보초 청자고동); 코노톡신 MI(바다 코너스 마구스(Marine Conus magus)); 알파-코노톡신 EI(코너스 에르미네우스(Conus ermineus); 알파-코노톡신 SIA; 알파-코노톡신 ImI; 알파-코노톡신 SI(청자 고둥, 코너스 스트리아투스(Conus striatus)); 마이크로-코노톡신 GIIIB(바다 달팽이, 대보초 청자고동); 오메가-코노톡신 GVIA(바다 달팽이, 대보초 청자고동); 오메가-코노톡신 MVIIA(코너스 마구스); 오메가-코노톡신 MVIIC(코너스 마구스); 오메가-코노톡신 SVIB,(청자 고둥, 코너스 스트리아투스); 내독소 억제제; 기오그래푸 독소 I(GTX-I)(μ-코노톡신 GIIIA); 이베리오톡신(IbTX)(전갈, 부투스 타물루스(Buthus tamulus)); 칼리오톡신 1-37; 칼리오톡신(전갈, 안드로토너스 마우레타니쿠스 마우레타니쿠스(Androctonus mauretanicus mauretanicus)); 비만 세포-탈과립화 펩티드(MCD-펩티드, 펩티드 401); 마르가톡신(MgTX)(전갈, 센트루리오데스 마르가리타투스(Centruriodes Margaritatus)); 뉴로톡신 NSTX-3(파푸아 기니언 거미, 네필리아 마쿨라타(Nephilia maculata)); PLTX-II(거미, 플렉트레우리스 트리스테스(Plectreurys tristes)); 실라톡신(레이우로톡신 I); 및 스티코닥틸라톡신(ShK)를 비제한적 예로 포함하는 독소 펩티드.
VIP(인간, 돼지, 래트, 양); VIP-Gly-Lys-Arg-NH2; 비오티닐-PHI(비오티닐-PHI-27)(돼지); [Glp16] VIP 16-28(돼지); PHI(PHI-27)(돼지); PHI(PHI-27)(래트); PHM-27(PHI)(인간); 프레프로 VIP 81-122(인간); 프레프로VIP/PHM 111-122; 프레프로 VIP/PHM 156-170; 비오티닐-PHM-27(비오티닐-PHI)(인간); 혈관 활동성 장관 수축근(엔도텔린-베타); 혈관 활동성 장관 옥타코사-펩티드(닭); 혈관 활동성 장관 펩티드(기니아 피그); 비오티닐-VIP(인간, 돼지, 래트); 혈관 활동성 장관 펩티드 1-12(인간, 돼지, 래트); 혈관 활동성 장관 펩티드 10-28(인간, 돼지, 래트); 혈관 활동성 장관 펩티드 11-28(인간, 돼지, 래트, 양); 혈관 활동성 장관 펩티드(대구, 가두스 모르후아(Gadus morhua)); 혈관 활동성 장관 펩티드 6-28; 혈관 활동성 장관 펩티드 길항자; 혈관 활동성 장관 펩티드 길항자([Ac-Tyr1, D-Phe2]-GHRF 1-29 아미드); 혈관 활동성 장관 펩티드 수용체 길항자([4-Cl-D-Phe6, Leu17]-VIP); 및 혈관 활동성 장관 펩티드 수용체 결합 억제제, L-8-K를 비제한적 예로 포함하는 혈관 활동성 장관 펩티드(VIP/PHI).
바소프레신; [Asu1 ,6, Arg8]-바소프레신; 바소토신; [Asu1 ,6, Arg8]-바소토신; [Lys8]-바소프레신; 프레시노산; [Arg8]-데사미노 바소프레신 데스글리신아미드; [Arg8]-바소프레신(AVP); [Arg8]-바소프레신 데스글리신아미드; 비오티닐-[Arg8]-바소프레신(비오티닐-AVP); [D-Arg8]-바소프레신; 데사미노-[Arg8]-바소프레신; 데사미노-[D-Arg8]-바소프레신(DDAVP); 데아미노-D-3-(3'-피리딜-Ala)]-[Arg8]-바소프레신; [1-(베타-머캅토-베타,베타-시클로펜타메틸렌 프로피온산), 2-(O-메틸)티로신]-[Arg8]-바소프레신; 바소프레신 대사물 뉴로펩티드 [pGlu4, Cys6]; 바소프레신 대사물 뉴로펩티드[pGlu4, Cys6]; [Lys8]-데아미노 바소프레신 데스글리신아미드; [Lys8]-바소프레신; [Mpr1, Val4, DArg8]-바소프레신; [Phe2, Ile3, 0rn8]-바소프레신([Phe2, 0rn8]-바소토신); [Arg8]-바소토신; 및 [d(CH2)5, Tyr(Me)2, Orn8]-바소토신을 비제한적 예로 포함하는 바소프레신(ADH) 펩티드.
바이러스 막 융합 단백질, 형광 인간 CMV 프로테아제 기질; HCV 코어 단백질 59-68; HCV NS4A 단백질 18-40(JT 균주); HCV NS4A 단백질 21-34(JT 균주); 간염 B 바이러스 수용체 결합 단편; 간염 B 바이러스 프리-S 영역 120-145; [Ala127]-간염 B 바이러스 프리-S 영역 120-131; 헤르페스 바이러스 억제제 2; HIV 엔벨로프 단백질 단편 254-274; HIV gag 단편 129-135; HIV 기질; P 18 펩티드; 펩티드 T; [3,5 디요오도-Tyr7] 펩티드 T; R15K HIV-1 억제성 펩티드; T20; T21; V3 데카펩티드 P 18-110; 및 바이러스 복제 억제 펩티드를 비제한적 예로 포함하는 바이러스 관련 펩티드.
인간 호르몬 글루카곤은 췌장의 A-세포에서 생성되는 29-아미노산 펩티드 호르몬이다. 그 호르몬은 세크레틴, 소화관 억제 펩티드, 혈관 활동성 장관 펩티드 및 글리센틴을 포함하는, 구조적으로 관련된 펩티드의 다중-유전자 계열에 속한다. 이들 펩티드는 탄수화물 대사, 위장관 이동 및 분비 가공을 다양하게 제어한다. 그러나, 췌장 글루카곤의 주요 인지 작용은 간 당분해 및 당원신생을 촉진하여, 혈중 당 수준을 상승시키는 것이다. 이에 따라, 글루카곤의 작용은 인슐린의 작용과 역행하며, 당뇨병을 수반하는 고혈당에 기여할 수 있다[(Lund, P. K. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 79: 345-349(1982)].
글루카곤은 인슐린 생성 세포의 표면에 있는 특이적 수용체에 결합할 수 있는 것으로 나타났다. 글루카곤은 이들 수용체에 결합될 때, 이들 세포에 의한 cAMP의 급속 합성을 자극하고, 이 cAMP는 다시 인슐린 발현을 자극하는 것으로 나타났다[Korman, L. Y. 등, Diabetes, 34: 717-722(1985)]. 인슐린은 글루카곤 합성을 억제하는 작용을 한다[Ganong, W. F., Review of Medical Physiology, Lange Publications, Los Altos, Calif., p. 273(1979)]. 따라서, 글루카곤의 발현은 인슐린에 의해 주의하여 제어되고, 궁극적으로 혈청 포도당 수준에 의해 제어된다.
글루카곤 유전자는 초기에 360개 염기쌍 전구체으로부터 번역되어, 폴리펩티드, 프리프로글루카곤을 형성한다[Lund 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79: 345-349(1982)]. 이 폴리펩티드는 후속하여 가공되어, 프로글루카곤을 형성한다. [Patzelt, C. 등, Nature, 282: 260-266(1979)]는 프로글루카곤이 후속하여 글루카곤 및 제2 폴리펩티드로 절단되었음을 입증하였다. [Lund, P. K. 등, supra, Lopez L. C. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 5485-5489(1983) 및 Bell, G. I. 등, Nature 302: 716-718(1983)]에 의한 후속 연구는, 프로글루카곤 분자가 리신-아르기닌 디펩티드 잔기 직후에 절단되었음을 입증하였다. 채널 메기(Ictalurus punctata)에 의해 생성된 프로글루카곤의 연구는 이 동물로부터의 글루카곤도 또한 인접 리신-아르기닌 디펩티드 잔기 후에 단백질 분해에 의해 절단되었음을 나타냈다[Andrews P. C. 등, J. Biol. Chem., 260: 3910-3914(1985), Lopez, L. C. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 5485-5489(1983)]. [Bell, G. I. 등, 이하 동일]은 포유동물의 프로글루카곤 리신-아르기닌 또는 아르기닌--아르기닌 디펩티드에서 절단됨을 발견하였고, 프로글루카곤 분자기 글루카곤, 글루카곤-유사 펩티드 1(GLP-1) 및 글루카곤-유사 펩티드 2(GLP-2)로 각기 칭해지는 3개의 구분된 매우 유사한 펩티드 분자를 함유함을 입증하였다. [Lopez 등]은 글루카곤-유사 펩티드 1이 37개 아미노산 잔기의 길이를 가지고, 글루카곤-유사 펩티드 2가 34개 아미노산 잔기 길이를 가진다는 결론을 내렸다. 래트 프리프로글루카곤의 구조에 대한 유사 연구는, 글루카곤, GLP-1 및 GLP-2이 형성되도록 하는, 인접 리신-아르기닌 또는 아르기닌--아르기닌 디펩티드 잔기 사이의 단백질분해 절단의 유사 패턴을 밝혀내었다[Heinrich, G. 등, Endocrinol., 115: 2176-2181(1984)].
글루카곤-유사 펩티드-2(GLP-2)는 다면적 글루카곤 유전자로부터의 조직-특이적 방식으로 발현되는 33개 아미노산 펩티드이다. GLP-2는 글루카곤 및 글루카곤-유사 펩티드-1(GLP-1)에 대한 아미노산 서열 측면에서의 현저한 상동성을 나타낸다. 또한, GLP-2의 상이한 포유동물 형태가 잘 보존된다. 인간 GLP-2의 서열은 하기와 같다: His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-lle-Thr-Asp. 또한, 수많은 작용자 GLP-2 펩티드가 PCT 출원 PCT/CA97/00252(1997년 4월 11일 출원)에 기재되어 있다. 유사체가 U.S. 특허 No. 6,051,557에 기재되어 있고, GLP-2 변종체의 예가 U.S. 특허 No. 5,990,077 및 No. 6,184,201에 나와 있다.
최근, GLP-2가 장영양 펩티드 호르몬임이 입증되었다(Drucker 등(1996) PNAS, 93: 7911-7916). 외인성으로 주어진 GLP-2는 시험 마우스의 작은 장 상피의 증식을 현저한 증가를 가져올 수 있고, 이는 명백히 바람직하지 못한 부작용이 없다. 이어서, 펩티드 서열에 대한 특정 변형이 있는 본연의 GLP-2의 펩티드 유사체는 증진된 장영양 활성을 가지는 것으로 나타났다(U.S. 특허 출원 일련 No. 08/669,791). 또한, GLP-2는 장 기저외측 막을 가로지르는 D-포도당 최대 수송 속도도 증가시키는 것으로 나타났다(Cheeseman 및 Tseng(1996) American Journal of Physiology 271:G477-G482).
GLP-2와 구조적으로 관련되지 않은 수많은 펩티드 호르몬(IGF-2, IGF-1, GH)은 다양한 정도의 장영양 활성을 가지는 것으로 입증되었다(U.S. 특허 No. 5,482,926, WO 91/12018, U.S. 특허 No. 5,288,703). 그러나, 상기 펩티드 호르몬은 모두 장 상피의 증식을 촉진함에 있어서의 GLP-2의 효능 또는 특이성을 가지지 않는다. GLP-2는 펩티드 호르몬 IGF-1 및/또는 GH와 상승효과적으로 작용하여 대장에서 세포의 증식을 촉진한다. 또한, 상기 조합 치료의 소장 및 대장에 대한 장영양 영향은 단독 치료에서 볼 수 있는 효과보다 크다. 소장 및/또는 대장 조직의 성장을 촉진하기 위한 GLP-2의 IGF-2와의 동시 투여가 U.S. 특허 No. 5,952,301에서 논의되어진다.
GLP-2 수용체를 코딩하는 핵산이 단리되었고, GLP-2 수용체 작용자의 동정 방법이 기재되어 있다(U.S. 특허 출원 일련 No. 08/767,224 및 U.S. 일련 No. 08/845,546). 상부 위장관의 기능장애를 발병할 위험이 있는 환자를 보조하고, 상부 위장관에서의 조직 성장을 증가시킴에 있어 식도 및 위 관련 질병에서의 GLP-2의 역할이 논의되었다(U.S. 특허 No. 6,051,557 참고). GLP-2 수용체 작용자는 대장의 기능을 증진시키는 작용을 한다(U.S. 특허 No. 6,297,214). GLP-2, 및 GLP-2의 펩티드계 작용자는 대장의 조직의 증식을 유발할 수 있다. GLP-2는 또한 염증성 대장 질환을 포함한, 대장의 염증 상태를 치료 또는 예방함에 있어 유용할 수 있다(U.S. 특허 No. 6,586,399).
GLP-1의 인간, 래트, 소 및 햄스터 서열이 일치하는 것으로 나타났다[Ghiglione, M. 등, Diabetologia, 27: 599-600(1984)]. GLP-1의 크기에 대한 Lopez 등에 의해 도달된 결론은, [Uttenthal, L. 0. 등, J. Clin. Endocrinol. Metabol., 61: 472-479(1985)]의 연구에 의해 확인되었다. Uttenthal 등은 인간 췌장 내에 존재하는 GLP-1의 분자 형태를 조사하였다. 그들의 연구는 GLP-1 및 GLP-2가 각기 37개 아미노산 및 34개 아미노산 펩티드로서 췌장 내에 존재함을 보여준다.
GLP-1 및 글루카곤 간의 유사성은 GLP-1이 생물학적 활성을 가질 수 있음을 초기 연구자들에게 제시하였다. 일부 연구자들은 GLP-1이 뇌 세포로 하여금 cAMP를 합성하는 것을 유도할 수 있음을 밝혀내었으나[Hoosein, N. M. 등, FEBS Lett. 178: 83-86(1984)], 다른 연구자들은 GLP-1의 어떠한 생리학적 역할도 확인하지 못했다(Lopez, L. C. 등). GLP-1에 대한 어떠한 생리학적 역할도 확인하지 못함은, 일부 연구자들로 하여금 GLP-1이 실제로 호르몬인지의 여부, 및 글루카곤과 GLP-1 간의 관련성이 인위적일 수 있는지의 여부에 의문을 갖도록 하였다.
GLP-1(7-37)의 변종체 및 그것의 유사체가 또한 개시되었다. 이들 변종체 및 유사체에는 예를 들어, Gln9-GLP-1(7-37), D-Gln9 -GLP-1(7-37), 아세틸-Lys9 -GLP-1(7-37), Thr16-Lys18-GLP-1(7-37), Lys18-GLP-1(7-37) 등, 및 그것의 유도체, 가령 예를 들어, 산 부가 염, 카르복실레이트 염, 저급 알킬 에스테르 및 아미드가 포함된다[예컨대, 본원에 참고로 인용되는, WO 91/11457; EP0733,644(1996); 및 U.S. 특허 No. 5,512,549(1996) 참고]. 일반적으로, 각종 개시된 형태들의 GLP-1이 인슐린 분비(인슐린친화 작용) 및 cAMP 형성을 자극하는 것으로 알려져 있다[예컨대, Mojsov, S., Int. J. Peptide Protein Research, 40: 333-343(1992) 참고].
더욱 중요하게는, 다수 저자들이 실험실 실험과 포유동물, 특히 인간의 GLP-1, 특히 GLP-1(7-36) NHI2 및 GLP-1(7-37)의 외인성 투여에 대한 인슐린친화 반응 간의 관계를 입증하였다[예컨대, Nauck, M. A. 등, Diabetologia, 36: 741-744(1993); Gutniak, M. 등, New England J. of Medicine, 326(20): 1316-1322(1992); Nauck, M. A. 등, J. Clin. Invest., 91: 301-307(1993); 및 Thorens, B. 등, Diabetes, 42: 1219-1225(1993) 참고].
보다 특히, 성숙기 발병 당뇨에서 고혈당을 유발하는 것으로 확인된 기초 결함은 내인성 인슐린의 손상된 분비, 및 근육 및 간에 의한 인슐린의 영향에 대한 내성이다[Galloway, J. S., Diabetes Care, 13: 1209-1239(1990)]. 후자의 결함은 간으로부터의 포도당의 과다 생산을 초래한다. 따라서, 정상적 개인은 대략 2 mg/kg/분의 속도로 포도당을 방출하는 반면, 성숙기 발병 당뇨의 환자의 경우, 이 양은 통상 2.5 mg/kg/분을 초과하여, 24시간 당, 순 과다량 70 그램 이상의 포도당을 초래한다. 간 포도당 생산, 공복 혈중 포도당, 및 글리코헤모글로빈 측정에 의해 나타나는 총 대사 조절군 간의 매우 높은 상관관계가 존재한다는 사실로부터[Galloway, J. A., 이하 동일; 및 Galloway, J. A. 등, Clin. Therap., 12: 460-472(1990)], 공복 혈중 포도당의 조절은 고혈당의 합병증을 예방하기에 충분한 대사의 총 정상화를 달성하기 위한 필수 조건임이 자명하다. 본 형태의 인슐린은 상당한 과다인슐린증 및 저혈당증을 생성하지 않고는 간 포도당 생성을 거의 정상화하지 못한다는 사실의 측면에서(Galloway, J. A., 및 Galloway, J. A. 등, 이하 동일), 대안적 접근법이 필요하다.
그러나, GLP-1, 특히 포유류에 투여하기 위한 약제학적 조성물의 성분으로서의 GLP-1의 장기 안정성이 문제가 있다. 실제로, 4℃의 저온에서 저장될 때, GLP-1(7-37)의 부산물이 샘플 제조 후 11개월 정도의 조기 시점에 나타났다(Mojsov, S., 이하 동일). 따라서, 당해 치료가 필요한 포유류에 안전하게 투여될 수 있는, 더욱 안정한 GLP-1 화합물에 대한 필요성이 존재한다.
또한, GLP-1 분자, 특히 디펩티딜-펩티다제 IV(DPP IV)의 활성에 의해 영향을 받는 상기 분자의 생물학적 반감기가 매우 짧다. 예를 들어, GLP-1(7-37)의 생물학적 반감기는 단지 3 내지 5분이고(U.S. 특허 No. 5,118,666), 포유동물에 비경구 투여한 후 그것의 급속 흡수에 의해 추가로 영향을 받는다. 따라서, 그러한 투여 후에 흡수를 지연시키는 GLP-1 화합물에 대한 필요성도 또한 존재한다.
글루카곤-유사 펩티드 1(GLP-1)는 식품 섭취에 대한 반응으로 장내 L-세포에 의해 분비되는 37개 아미노산 펩티드이다. 인슐린 분비를 자극함으로써(인슐린친화 작용), 세포에 의한 포도당 흡수 및 감소된 혈청 포도당 수준을 유발한다는 것이 밝혀졌다[예컨대, Mojsov, S.(1992) Int. J. Peptide Protein Research, 40: 333-343 참고]. 그러나, GLP-1은 활성이 약하다. 6번째와 7번째 위치 사이에서의 후속 내인성 절단은 더욱 강한 생물 활성 GLP-1(7-37)OH 펩티드를 생성시킨다. 수많은 GLP-1 유사체 및 유도체가 알려져 있고 이는 "GLP-1 화합물"로 칭해진다. 이들 GLP-1 유사체에는 GILA-몬스터의 독액에서 발견되는 펩티드인 엑센딘이 포함된다. 엑센딘은 본연의 GLP-1에 대한 서열 상동성을 가지고, GLP-1 수용체에 결합하여 GLP-1(7-37)OH에 의한 수많은 활성이 원인이 될 수 있는 신호 전달 캐스케이드를 개시할 수 있다
U.S. 특허 No. 6,569,832는 베타 세포 퇴화, 베타 세포 기능 손실, 베타 세포 기능장애, 및/또는 베타 세포 사멸, 예컨대 베타 세포의 괴사 또는 세포괴사를 조절, 억제 또는 감소 또는 예방하기 위한 GLP-1 작용자의 투여에 대해 논의하고 있다. 세포괴사는 정상적 발달 중에 일어나는 외인성 및 내인성 신호에 의해 제어되는 세포성 자기 파괴의 활성 공정이다. 세포괴사는 췌장 내분비 베타 세포의 제어에 핵심적 역할을 함이 문헌에 잘 공지되어 있다. 성장 포유류에서, 베타-세포체는 동적 변화를 하여, 정상혈당 특히 임신 및 비만과 같은 상태를 유지하기 위해 인슐린 생산을 적합화한다는 증거가 증가하고 있다(J. Dev. Physiol. 5: 373, 1983 및 Endocrinology 130: 1459, 1992). 베타 세포체의 조절은 세포 증식, 성장 및 세포 사멸(세포괴사) 간의 미묘한 균형에 의존한다. 이 균형의 파괴는 포도당 항상성의 손상을 초래할 수 있다. 예를 들어, 베타 세포 복제 속도가 감소될 때 노화에 따라 포도당 비내인성이 발달함은 주목할 만하고(Diabetes 32: 14, 1983), 인간 검시 연구는 비당뇨 대상자에 비해 비인슐린 의존성-당뇨병 환자에게 있어 베타 세포체의 40-60% 감소가 있음을 반복해서 나타냈다(Am. J. Med. 70: 105, 1981 및 Diabetes Res. 9: 151, 1988). 인슐린 내성은 항상 비만에 동반되는 것이나, 정상혈당치는, 베타 세포가 2형 당뇨가 개시되는 시점인, 인슐린에 대한 요구를 충족할 수 없을 때까지, 상보적 과다인슐린증에 의해 유지된다는 것에 일반적으로 합의되고 있다. GLP-1 및 섬 세포 증식 및 섬 세포 분화를 조사하기 위한 기타 연구가 수행되었다.
GLP-1 화합물은 각종 생리학적으로 상당한 활성을 가진다. 예를 들어, GLP-1은 인슐린 방출을 자극하고, 글루카곤 분비를 저하시키며, 위 배출을 억제하고, 포도당 이용을 증진시키는 것으로 나타났다[Nauck, M. A. 등(1993) Diabetologia 36: 741-744; Gutniak, M. 등(1992) New England J. of Med. 326: 1316-1322; Nauck, M. A. 등(1993) J. Clin. Invest. 91: 301-307].
GLP-1은 비인슐린 의존성 당뇨병(NIDDM)의 치료제로서 유망성을 나타낸다. NIDDM과 관련된 인슐린 내성을 치료하기 위해 시중에 수많은 경구용 약물들이 있다. 그러나, 질병이 진보함에 따라, 환자는 인슐린의 방출을 자극하는 치료, 및 궁극적으로 인슐린의 주사를 포함한 치료로 이동해야 한다. 그러나, 인슐린 방출을 자극하는 현 약물들은 또한 인슐린의 실제 투여에서와 같이 저혈당증을 유발할 수 있다. 그러나, GLP-1 활성은 혈중 포도당 수준에 의해 조절된다. 혈중 포도당 수준이 특정 역치 수준으로 급감할 때, GLP-1은 활성적이지 않다. 따라서, GLP-1 관련 치료와 연관된 저혈당증의 위험이 없다.
그러나, GLP-1 펩티드 관련 치료법의 유용성은 그것의 급속 소거 및 짧은 반감기에 의해 제한되었다. 예를 들어, GLP-1(7-37)은 혈청 반감기가 단지 3 내지 5분이다(U.S. 특허 No. 5,118,666). GLP-1(7-36) 아미드는 피하 투여될 때 약 50분의 작용 기간을 가진다. 내인성 프로테아제 절단에 내성이 있는 유사체 및 유도체조차도 24시간에 걸쳐 반복 투여를 피하기에 충분히 긴 반감기를 가지지 않는다. 치료제의 급속 소거는 연장되는 장기간에 걸쳐 제제의 높은 혈중 수준을 유지하는 것이 요망되는 경우에 불편하며, 그 이유는 반복 투여가 필요하게 되기 때문이다. 또한, 장기 작용 화합물은 특히 과거 치료 요법이 단지 경구 의약품을 섭취하는 것을 포함했던 당뇨 환자에게 중요하다. 이 환자들은 종종 의약품의 다중 주사를 포함하는 요법으로 전이하는데 극히 어려운 시간을 가진다.
본 발명은 짧은 혈장내 반감기를 가지는 GLP-1와 같은 BSP를 전달하는 것과 관련된 문제를 해결한다. 본 발명의 화합물은 면역글로불린 또는 알부민의 Fc 부분과 같은 장기 순환 반감기를 갖는 다른 한 단백질에 융합된 BSP를 포괄한다.
인간 면역결핍 바이러스(HIV)는 병원성 레트로바이러스이고, 후천성 면역 결핍 증후군(AIDS) 및 관련 장애의 원인 물질이다(Bane-Sinossi, F. 등, 1983, Science 220: 868-870; Gallo, R. 등, 1984, Science 224: 500-503). 2개 이상의 별개의 유형의 HIV가 기재되었다: HIV-1(Barre-Sinossi, F. 등, 1983, Science 220: 868-870; Gallo, R. 등, 1984, Science 224: 500-503) 및 HIV-2(Clavel, F. 등, 1986, Science 223: 343-346; Guyader, M. 등, 1987, Nature 326: 662-669). 또한, 다량의 유전 이질성이 각각의 상기 유형들의 집단 내에 존재한다. 인간 CD-4+ T-림프구의 HIV 바이러스 감염은 세포 유형의 고갈을 초래하고, 이는 궁극적으로 기회성 감염, 신경성 기능장애, 신생물 성장, 및 불시의 사망을 초래한다.
HIV는 레트로바이러스의 렌티바이러스 부류의 한 구성원이다(Teich, N. 등, 1984; RNA 종양 바이러스, Weiss, R. 등(편저), CSH-press, pp. 949-956). 레트로바이러스는 이배형, 단일-나선의 RNA 게놈을 함유하고, 바이러스 코딩된 역전사효소, RNA 의존성 DNA 중합효소에 의해 생성된 DNA 중간체를 통해 복제하는 작은 외피가 있는 바이러스이다(Varmus, H., 1988, Science 240: 1427-1439). 다른 레트로바이러스에는 예를 들어, 발암 바이러스, 예컨대 인간 T-세포 백혈병 바이러스(HTLV-1,-II,-III) 및 고양이 백혈병 바이러스가 포함된다. HIV 바이러스 입자는 p24 및 p18로 표시되는 단백질로 구성되는 바이러스 코어로 이루어진다. 바이러스 코어는 바이러스 RNA 게놈 및 복제 이벤트에 필요한 상기 효소를 함유한다. 미리스틸화 gag 단백질은 바이러스 코어 주변에 외부 바이러스 쉘을 형성하고, 이는 다시 감염된 세포 막으로부터 유래된 지질 막 엔벨로프에 의해 둘러싸인다. HIV 엔벨로프 표면 당단백질은, 바이러스가 2개의 당단백질, 즉 gp41 및 gp120로 출아하는 동안 세포성 프로테아제에 의해 절단되는 단일 160 kD 전구체 단백질로서 합성된다. gp41은 막횡단 단백질이고, gp120은 가능히 삼량체 또는 다량체 형태로, gp41과 비공유결합된 채로 남는 세포외 단백질이다(Hanimerwskjold, M. 및 Rekosh, D., 1989, Biochem. Biophys. Acta 989: 269-280).
HIV은 HIV-1 바이러스에 대한 세포성 수용체로서 작용하기 때문에 CD-4+ T 림프구를 표적으로 한다 (Dalgleish, A. 등, 1984, Nature 312: 767-768, Maddon 등, 1986, Cell 47: 333-348). 세포로의 바이러스 도입은 세포성 CD-4+ 수용체 분자에 결합하는 gp120 에 의존하고, 한편 gp41은 바이러스 막 내에 엔벨로프 당단백질 착체를 정박시키며(McDougal, J. S. 등, 1986, Science 231: 382-385; Maddon, P. J. 등, 1986, Cell 47: 333-348), 이에 CD-4+ 세포에 대한 HIV의 굴성을 설명한다.
바이러스 수명 사이클의 수가지 단계들은 치료적 개입에 대한 표적으로 간주되었다(Mitsuya, H. 등, 1991, FASEB J. 5: 2369-2381). 개입은 HIV의 세포 막에 대한 결합, HIV RNA 게놈의 DNA로의 역전사, 또는 숙주 세포로부터의 바이러스의 방출 및 새 세포성 표적의 감염을 가능히 억제할 수 있다.
HIV 감염의 최초 단계인 세포로의 바이러스 도입을 억제할 수 있는 약물을 개발하기 위한 시도가 이루어진다. 여기에서, 세포에 대한 세포 표면 수용체인 CD-4+에 초점이 맞춰졌다. 예를 들어, 재조합 가용성 CD-4는 세포막에 삽입된 CD-4 분자를 만나기 전에 바이러스 입자에 결합함으로써 HIV 감염성을 차단하는 것으로 나타났다(Smith, D. H. 등, 1987, Science 238: 1704-1707). 특정의 일차 HIV-1 단리물은 재조합 CD-4에 의한 억제에 비교적 덜 민감하다(Daar, E. 등, 1990, Ann. Int. Med. 112: 247-253). Tn 부가, 재조합 가용성 CD-4 임상 시도는 비결론적 결과를 산출하였다(Schooley, R. 등, 1990, Ann. Int. Med. 112: 247-253; Kahn, J. 0. 등, 1990, Ann. Int. Med. 112: 254-261; Yarchoan, R. 등, 1989, Proc. Vth Int. Conf. on AIDS, p564, MCP 137).
2',3'-디데옥시뉴클레오시드 유사체, 예컨대 AZT, ddI, ddC 및 d4T를 포함하는, 바이러스 코딩된 역전사효소를 표적으로 하는 약물은 또한 HIV에 대해 활성인 것으로 나타났다(Mitsuya, H. 등, 1991, Science 249: 1533-1544). 이들 뉴클레오시드 유사체는 유익하나, 치료적이지 않고, 이는 아마도 약물 내성 HIV 변이체의 급속 외향으로 인한 것으로 보인다(Lander, B. 등, 1989, Science 243: 1731-1734). 또한, 약물은 종종 골수 억제, 구토 및 간 기능 비정상대사와 같은 독성 부작용을 나타낸다.
특정 바이러스 단백질의 중요한 바이러스-특이적 2차 가공을 포함하는 HIV 복제의 후반 단계가 또한 가능한 항-HIV 약물 표적으로 제시되었다. 후반 단계 가공은 바이러스 프로테아제의 활성에 의존하고, 이 프로테아제를 억제하는 약물이 개발 중이다(Erikson, J., 1990, Science 249: 527-533).
HIV 감염의 치료를 위한 백신이 개발 중에 있다. HIV-1 엔벨로프 단백질(gpl6O, gp120, gp41)는 AIDS 환자 내에 존재하는 항-HIV 항체에 대한 주요 항원인 것으로 나타났다(Barin 등, 1985, Science 228: 1094-1096). 따라서, 이들 단백질은 항-HIV 개발을 위한 항원으로서 작용하는 가장 유망한 후보물질인 것으로 보인다. 수개 군이 숙주 면역계를 위한 면역원성 표적으로서 gp16O, gp120, 및/또는 gp41의 각종 부분을 사용하기 시작했다. 예를 들어, Ivanoff, L. 등, U.S. 특허 No. 5,141,867; Saith, G. 등, WO 92/22,654; Schafferman, A., WO 91/09,872; Formoso, C. 등, WO 90/07,119를 참고한다.
최근, 일반적 면역 반응을 도출하는 이중 나선의 RNA는 바이러스 감염을 치료하기 위해 항바이러스 인터페론, AZT 및 포스포노포르메이트와 같은 항바이러스와 조합되어 사용되었다. Carter, W., U.S. 특허 No. 4,950,652를 참고한다. 또한, 피리미딘 뉴클레오시드 유사체 및 유리딘 포스포릴라제 억제제를 조합하는 치료법이 HIV 치료를 위해 개발되었다(Sommadossi, J. P. 등, U.S. 특허 No. 5,077,280). 이 특정 치료법들은 유익한 것으로 입증되었으나, 일반적으로 조합 치료법은 아지도티미딘(AZT) 및 리바비린을 이용하여 생체외 입증된 바와 같이 길항작용을 할 가능성이 있다. U.S. 특허 No. 4,950,652를 참고한다. 또한, 조합 치료법은 대부분의 항-HIV 치료제의 고독성 및 낮은 수준의 효능이 있어, 문제가 있을 가능성이 있다.
T-20는 다른 항바이러스 치료제와 상이한 메커니즘으로 HIV를 표적으로 하여, CD4+ 세포에 대한 HIV-1 융합의 억제제로서 작용한다. U.S. 특허 No. 6,861,059는 DP-178 또는 DP-107, 또는 그것의 유도체를 하나 이상의 다른 항바이러스 치료제, 예컨대 역전사효소 억제제(예컨대, AZT, ddI, ddC, ddA, d4T, 3TC, 또는 기타 디데옥시뉴클레오티드 또는 디데옥시플루오로뉴클레오시드), 또는 HIV-1 프로테아제의 억제제(예컨대, 인디나비르; 리토나비르)와 조합하여 이용하는 HIV-1 감염의 치료, 또는 HIV-1 복제의 억제 방법을 개시한다. 다른 항바이러스에는 사이토킨(예컨대, rIFNα, rIFNβ, rIFNγ), 바이러스 mRNA 캡핑의 억제제(예컨대, 리바비린), HIV 프로테아제(예컨대, ABT-538 및 MK-639)의 억제제, 항-HIV 활성을 갖는 지질-결합 분자로서의 암포테리신 B, 및 당단백질 가공의 억제제로서의 카스타노스퍼민이 포함된다.
현 항비만 약물은 제한된 효능 및 수많은 부작용을 가진다(Crowley, V. E., Yeo, G. S. & O'Rahilly, S., Nat. Rev. Drug Discov 1, 276-86(2002)). 비만이 전세계적으로 유행성 분율에 도달하고 있어, 이 부문에 있어 적당한 치료제의 개발에 대한 필요성이 점차 강해지고 있다. 근년, PYY 및 PYY(3-36)과 같은, 식용 제어, 신체 에너지 소비, 및 지방 질량 축적과 관련된 호르몬 및 뉴로펩티드가 특히 가능한 항비만 약물로서 출현하였다[McMinn, J. E., Baskin, D. G. & Schwartz, M. W., Obes Rev 1: 37-46(2000), Drazen, D. L. & Woods, S. C., Curr Opin Clin Nutr Metab Care 6: 621-629(2003)].
일반적으로, 작은 치료용 펩티드는 그것의 구조의 약간의 변화라도 안정성 및/또는 생물학적 활성에 영향을 줄 수 있기 때문에, 조작하기 어렵다. 이는 일차적 알파 나선 구조에서 일차적 베타 시이트 구조로의 구조의 변화를 겪을 수 있는 GLP-1 화합물에서 특히 그러하였다. 이 베타 시이트 형태는 불활성인 것으로 사료되는 응집 물질을 초래한다. 그러나, 반감기가 증가된 생물 활성 GLP-1 융합 단백질이 개발되었다. 이는 특히 GLP-1(7-37)OH 단독 작업이 곤란하고, 결합된 작은 GLP-1 펩티드에 비한 융합 파트너의 크기가 큰 경우에, 특히 예상치 못했다. 유사하게, 혈청 반감기를 증가시키거나, 다른 원하는 성질을 갖는 분자를 생성시키기 위해, 다른 BSP 융합체를 제조할 수 있다.
본 발명의 화합물은, N-말단 및 C-말단을 갖는 제1 폴리펩티드가 N-말단 및 C-말단을 갖는 제2 폴리펩티드에 융합된 이종성 융합 단백질로서, 제1 폴리펩티드가 GLP-1 화합물과 같은 BSP이고, 제2 폴리펩티드가 a) 인간 알부민; b) 인간 알부민 유사체; 및 c) 인간 알부민의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 제1 폴리펩티드의 C-말단이 제2 폴리펩티드의 N-말단에 융합된 것인 이종성 융합 단백질을 포함한다.
본 발명의 화합물은 또한 N-말단 및 C-말단을 갖는 제1 폴리펩티드가 N-말단 및 C-말단을 갖는 제2 폴리펩티드에 융합된 이종성 융합 단백질로서, 제1 폴리펩티드가 GLP-1 화합물과 같은 BSP이고, 제2 폴리펩티드가 a) 인간 알부민; b) 인간 알부민 유사체; 및 c) 인간 알부민의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 제1 폴리펩티드의 C-말단이 펩티드 링커, 전구약물 링커, 또는 수용성 중합체를 통해 제2 폴리펩티드의 N-말단에 융합된 것인 이종성 융합 단백질을 포함한다. 펩티드 링커는 a) 글리신 풍부 펩티드; b) 서열 [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n(여기에서, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 그 이상임)을 갖는 펩티드; 및 c) 서열 [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]3을 갖는 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 부가적 화합물은 N-말단 및 C-말단을 갖는 제1 폴리펩티드가 N-말단 및 C-말단을 갖는 제2 폴리펩티드에 융합된 이종성 융합 단백질로서, 제1 폴리펩티드가 GLP-1 화합물과 같은 BSP이고, 제2 폴리펩티드가 a) 면역글로불린의 Fc 부분; b) 면역글로불린의 Fc 부분의 유사체; 및 c) 면역글로불린의 Fc 부분의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 제1 폴리펩티드의 C-말단이 제2 폴리펩티드의 N-말단에 융합된 것인 이종성 융합 단백질을 포함한다. GLP-1 화합물과 같은 BSP는 펩티드 링커, 전구약물 링커, 또는 수용성 중합체를 통해 제2 폴리펩티드에 융합될 수 있다. 펩티드 링커는 a) 글리신 풍부 펩티드; b) 서열 [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n(여기에서, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 그 이상임)을 갖는 펩티드; 및 c) 서열 [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]3을 갖는 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
이종성 융합 단백질의 부분인 GLP-1 화합물은 다중 아미노산 치환을 가질 수 있고, GLP-1(7-36), GLP-1(7-37), 엑센딘-4, 또는 엑센딘-3과 상이한 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 초과의 아미노산을 가질 수 있다. 바람직하게, 이종성 융합 단백질의 부분인 GLP-1 화합물은 위치 8에 글리신 또는 발린을 가진다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 이종성 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 및 본원에 기재된 벡터로 트랜스펙션 또는 형질전환된 숙주 세포를 포함한다. 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드를 이종성 융합 단백질이 검출가능 양으로 발현되는 조건 하에 전사 및 번역하는 단계를 포함하는 이종성 융합 단백질의 제조 방법도 또한 포함된다.
하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 BSP 분자가 본 발명에 제공된다. 본 발명의 특정 실시양태들에서, 하나 이상의 비천연 아미노산을 갖는 BSP는 하나 이상의 전사후 변형을 포함한다. 한 실시양태에서, 하나 이상의 전사후 변형은 표지, 염료, 중합체, 수용성 중합체, 폴리에틸렌 글리콜의 유도체, 광가교제, 방사성핵종, 세포독성 화합물, 약물, 친화도 표지, 광친화도 표지, 반응성 화합물, 수지, 제2 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체, 항체 또는 항체 단편, 금속 킬레이터, 보조인자, 지방산, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 수용성 덴드리머, 시클로덱스트린, 억제성 리보핵산, 바이오물질, 나노입자, 스핀 표지, 형광발색단, 금속-함유 부분, 방사능 부분, 신규 작용기, 다른 분자와 공유 또는 비공유 상호작용하는 기, 광바구니(photocaged) 부분, 광이성화가능한 부분, 비오틴, 비오틴의 유도체, 비오틴 유사체, 중원자 혼입 부분, 화학적으로 절단가능 기, 광절단가능 기, 연신 측쇄, 탄소-연결 당, 산화환원 활성제, 아미노 티오산, 독성 부분, 동위원소 표지된 부분, 생물리학적 프로브, 인광성 기, 화학발광성 기, 전자 조밀 기, 자기 기, 개재 기, 발색단, 에너지 전이제, 생물 활성제, 검출가능 표지, 소분자 또는 상기 것들의 임의의 조합물, 또는 특별한 반응성 기에 적당한 것으로 당업자에게 알려져 있는 화학 방법을 이용하는 제1 반응성 기를 포함하는 하나 이상의 비천연 아미노산에 대한 제2 반응성 기를 포함하는 임의의 기타 바람직한 화합물 또는 물질을 비제한적 예로 포함하는, 분자의 결합을 포함한다. 예를 들어, 제1 반응성 기는 알키닐 부분(비천연 아미노산 p-프로파르길옥시페닐알라닌(여기에서, 프로파르길기는 또한 경우에 따라 아세틸렌 부분으로 칭해짐) 내(단, 이에 제한되지 않음)이고, 제2 반응성 기는 아지도 부분이며, [3+2] 시클로부가 화학 방법이 이용된다. 다른 한 에에서, 제1 반응성 기는 아지도 부분(비천연 아미노산, p-아지도-L-페닐알라닌 내(단, 이에 제한되지 않음))이고, 제2 반응성 기는 알키닐 부분이다. 본 발명의 변형된 BSP의 특정 실시양태들에서, 하나 이상의 전사후 변형을 포함하는 하나 이상의 비천연 아미노산(케토 작용기를 함유하는 비천연 아미노산을 비제한적 예로 포함함)은, 하나 이상의 전사후 변형이 당 부분을 포함하는 경우에 이용된다. 특정 실시양태들에서, 전사후 변형은 진핵생물 세포 또는 비진핵생물 세포에서 생체내 이루어진다.
특정 실시양태들에서, 단백질은 전사후 변형이 정상적으로 다른 한 숙주 세포 유형에 의해 이루어지지 않는 경우, 한 숙주 세포에 의해 생체내 이루어지는 하나 이상의 전사후 변형을 포함한다. 특정 실시양태들에서, 단백질은 전사후 변형이 정상적으로 비진행생물 세포에 의해 이루어지지 않는 경우, 진핵생물 세포에 의해 생체내 이루어지는 하나 이상의 전사후 변형을 포함한다. 전사후 변형에는 아세틸화, 아실화, 지질-변형, 팔미토일화, 팔미테이트 부가, 포스포릴화, 당지질-연결기 변형 등이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 한 실시양태에서, 전사후 변형은 G1cNAc-아스파라긴 연결기에 의해 아스파라긴에 이당류를 결합시키는 것(이당류가 (G1cNAc-Man)2-Man-G1cNAc-G1cNAc 등을 포함하는 경우(단, 이에 제한되지 않음))을 포함한다. 다른 한 실시양태에서, 전사후 변형은 이당류(Gal-Ga1NAc, Gal-G1cNAc 등을 비제한적 예로 포함함)을 Ga1NAc-세린, Ga1NAc-트레오닌, GlcNAc-세린 또는 G1cNAc-트레오닌 연결기에 의해 세린 또는 트레오닌에 결합시키는 것을 포함한다. 특정 실시양태들에서, 본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드는 분비 또는 국지화 서열 또는 펩티드, 에피토프 택, FLAG 택, 폴리히스티딘 택, GST 융합, 및/또는 기타를 포함할 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 택 또는 링커의 예에는 폴리펩티드, 중합체, 친화도 택, 항원, 검출 택, 이미징 택, 다중-구성원 결합 착체의 구성원, 및 방사성 동위원소 택이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 친화도 택 및 검출 택의 예에는 폴리-His 택, 비오틴, 아비딘, 단백질 A, 단백질 G, 및 면역 글로불린 에피토프를 비제한적 예로 포함하는 항원이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 이미징 택의 예에는 금속, 방사성핵종, 및 자기 분자가 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 다중-구성원 결합 착체 택의 구성원의 예에는 스트렙타비딘, 아비딘, 비오틴, 단백질 A, 및 단백질 G가 포함되나, 이들에 제한되지 않는다.
용어 "국지화 펩티드"에는 분비 신호 서열의 예들이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 분비 신호 서열에는 원핵생물 분비 신호 서열, 진핵생물 분비 신호 서열, 세균 발현에 대한 5'-최적화 진핵생물 분비 신호 서열, 신규 분비 신호 서열, 펙테이트 분해효소 분비 신호 서열, Omp A 분비 신호 서열, 및 파지 분비 신호 서열. 분비 신호 서열의 예에는 STII(원핵생물), Fd GIII 및 M13(파지), Bgl2(효모), 및 트랜스포존 유래의 신호 서열 bla가 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 분비 신호 서열에는 세균 분비 신호 서열, 효모 분비 신호 서열, 곤충 신호 분비 신호, 포유동물의 분비 신호 서열, 및 특유의 분비 신호 서열이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. "국지화 서열"의 다른 한 예에는 TrpLE 서열이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다.
관심 단백질 또는 폴리펩티드는 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상의 비천연 아미노산을 함유할 수 있다. 비천연 아미노산은 동일하거나 상이할 수 있고, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상 개수의 상이한 비천연 아미노산을 포함하는 단백질에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상 개수의 상이한 부위들이 있을 수 있다. 특정 실시양태들에서, 천연 발생 양태의 단백질 내에 존재하는 특별한 아미노산의 하나 이상, 단 전부 미만이 비천연 아미노산으로 치환된다.
치료 활성을 갖는 임의의 BSP 또는 그것의 단편이 본 발명에 사용될 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 BSP의 수많은 예들이 제공되었다. 그러나, 제공된 목록들은 모두를 나타내는 것은 아니며, 본 발명에 사용될 수 있는 BSP의 수 또는 유형을 어떠한 식으로도 제한하지 않는다. 따라서, 신규 BSP를 비롯한, 임의의 BSP 및/또는 임의의 BSP로부터 제조된 단편이 본 발명에 따라 변형되어, 치료적으로 사용될 수 있다.
본 발명은 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 BSP 기재의 방법 및 조성물을 제공한다. 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산의 BSP로의 도입은, 통상 발생하는 20개 아미노산과 반응하지 않으면서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산과의(단, 이에 제한되지 않음) 특정 화학적 반응을 포함하는 접합 화학의 적용을 허용할 수 있다. 일부 실시양태들에서, BSP, 예컨대 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 GLP-1, T-20 또는 PYY는 비천연적으로 코딩된 아미노산의 측쇄를 통해, 수용성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 연결된다. 본 발명은 케톤, 아지드 또는 아세틸렌 부분을 비제한적 예로 포함하는 20개 천연 혼입 아미노산에서 발견되지 않는 작용기 또는 치환기를 함유하는 아미노산을 비제한적 예로 포함하는 비유전적으로 코딩된 아미노산을, 셀렉터 코돈에 대한 반응으로 단백질에 선택적으로 혼입시키고, 그 아미노산을 적당히 반응성인 PEG 유도체로 후속 변형시키는 것을 포함하는, PEG 유도체를 이용하여 단백질을 선택적으로 변형시키기 위한 매우 효율적인 방법을 제공한다. 아미노산 측쇄는 일단 혼입되면, 천연적으로 코딩된 아미노산 내에 존재하는 특별한 작용기 또는 치환기에 대해 적당한 것으로 당업자에게 알려진 화학 방법을 이용하여 변형될 수 있다. 수용성 중합체를 단백질에 혼입하기 위해, 매우 다양한 공지의 화학 방법들이 본 발명에 사용하기에 적당하다. 그러한 방법에는 아세틸렌 또는 아지드 유도체 등과의(단, 이에 제한되지 않음) 휘스겐(Huisgen) [3+2] 시클로부가 반응이 포함된다(예컨대, [Padwa, A. Comprehensive Organic Synthesis, 제4권, (1991) 편저 Trost, B. M., Pergamon, Oxford, p. 1069-1109; 및, Huisgen, R., 1,3-Dipolar Cycloaddition Chemistry, (1984) 편저 Padwa, A., Wiley, New York, p. 1-176)]를 참고한다).
휘스겐 [3+2] 시클로부가 방법은 친핵성 치환 반응이 아닌 시클로부가를 포함하기 때문에, 단백질은 극히 높은 선택도로 변형될 수 있다. 반응은 촉매량의 Cu(I) 염을 반응 혼합물에 첨가함으로써, 우수한 위치특이성(1,4 >1,5)으로 수성 조건 하에 실온에서 수행될 수 있다. 예컨대, [Tornoe 등(2002) J. Org . Chem . 67: 3057-3064; 및 Rostovtsev 등(2002) Angew . Chem . Int . Ed. 41: 2596-2599; 및 WO 03/10 1972]를 참고한다. [3+2] 시클로부가를 통해 본 발명의 단백질에 첨가될 수 있는 분자에는 아지도 또는 아세틸렌 유도체를 비제한적 예로 포함하는 적당한 작용기 또는 치환기를 갖는 실질적으로 임의의 분자가 포함된다. 이 분자들은 p-아지도-페닐알라닌을 비제한적 예로 포함하는 p-프로파르길옥시페닐알라닌, 또는 아지도기를 비제한적 예로 포함하는 아세틸렌기를 갖는 비천연 아미노산에 부가될 수 있다.
휘스겐 [3+2] 시클로부가로부터 수득되는 5-원 환은 일반적으로 환원 환경에서 가역적이지 않고, 수성 환경에서 연장된 시간 동안 가수분해에 대해 안정하다. 궁극적으로, 매우 다양한 물질의 물리적 및 화학적 특성이 본 발명의 활성 PEG 유도체와 함께 요구되는 수성 조건 하에서 변형될 수 있다. 더욱 더 중요하게도, 아지드 및 아세틸렌 부분이 서로 특이적이기 때문에(또한, 예를 들어 20개의 통상의 유전적으로-코딩된 아미노산 중 어느 것과도 반응하지 않기 때문에), 단백질은 극히 높은 선택도로 하나 이상의 특정 부위에서 변형될 수 있다.
본 발명은 또한 PEG 유도체, 및 하나 이상의 아세틸렌 또는 아지드 부분을 갖는 관련 친수성 중합체의 수용성 및 가수분해적으로 안정한 유도체를 제공한다. 아세틸렌 부분을 함유하는 PEG 중합체 유도체는 셀렉터 코돈을 수득하도록 하는 반응에서 단백질로 선택적으로 도입된 아지드 부분과의 결합에 대해 매우 선택적이다. 유사하게, 아지드 부분을 함유하는 PEG 중합체 유도체는 셀렉터 코돈을 수득하도록 하는 반응에서 단백질로 선택적으로 도입된 아세틸렌 부분과의 결합에 대해 매우 선택적이다.
보다 구체적으로, 아지드 부분은 알킬 아지드, 아릴 아지드, 및 이 아지드들의 유도체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 알킬 및 아릴 아지드의 유도체는 아세틸렌-특이적 반응성이 유지되는 한, 다른 치환기를 포함할 수 있다. 아세틸렌 부분은 알킬 및 아릴 아세틸렌, 및 이들의 유도체를 포함한다. 알킬 및 아릴 아세틸렌의 유도체는 아지드-특이적 반응성이 유지되는 한, 다른 치환기를 포함할 수 있다.
본 발명은 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교제; 방사성핵종; 세포독성 화합물; 약물; 친화도 표지; 광친화도 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이터; 보조인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 수용성 덴드리머; 시클로덱스트린; 억제성 리보핵산; 바이오물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광발색단, 금속-함유 부분; 방사능 부분; 신규 작용기; 다른 분자와 공유 또는 비공유 상호작용하는 기; 광바구니 부분; 광이성화가능한 부분; 비오틴; 비오틴의 유도체; 비오틴 유사체; 중원자가 혼입된 부분; 화학적으로 절단가능 기; 광절단가능 기; 연신 측쇄; 탄소-연결 당; 산화환원 활성제; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위원소 표지된 부분; 생물리학적 프로브; 인광성 기; 화학발광성 기; 전자 조밀 기; 자기 기; 개재 기; 발색단; 에너지 전이제; 생물 활성제; 검출가능 표지; 소분자; 또는 상기 것들의 임의의 조합, 또는 임의의 기타 바람직한 화합물 또는 물질)을 비제한적 예로 포함하는 다른 물질과의, 매우 다양한 작용기, 치환기 또는 부분을 갖는 물질의 접합체를 제공한다. 본 발명은 또한 아지드 또는 아세틸렌 부분을 갖는 물질의 상응하는 아세틸렌 또는 아지드 부분을 갖는 PEG 중합체 유도체와의 접합체를 포함한다. 예를 들어, 아지드 부분을 함유하는 PEG 중합체는 아세틸렌 관능성을 갖는 비유전적으로 코딩된 아미노산을 함유하는 단백질 내의 위치에 생물학적 활성 분자에 결합된다. PEG 및 생물학적 활성 분자를 결합할 때 이용되는 연결기에는 휘스겐 [3+2] 시클로부가 생성물이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
PEG가 바이오물질의 표면을 변형시키기 위해 사용될 수 있음이 잘 확립되어 있다(예컨대, 본원에 참고로 인용되는, [U.S. 특허 6,610, 281; Mehvar, R., J. Pharm Pharm Sci., 3(1): 125-136(2000)를 참고한다). 본 발명은 또한 하나 이상의 반응성 아지드 또는 아세틸렌 부위를 갖는 표면, 및 휘스겐 [3+2] 시클로부가 연결기를 통해 표면에 결합된 본 발명의 아지드- 또는 아세틸렌-함유 중합체 중 하나 이상을 포함하는 생물물질을 포함한다. 생물물질 및 기타 물질은 또한 아지드 또는 아세틸렌 연결기 이외의 연결기를 통해, 예컨대 카르복실산, 아민, 알코올 또는 티올 부분을 포함하는 연결기를 통해 아지드- 또는 아세틸렌-활성화된 중합체 유도체에 결합되어, 아지드 또는 아세틸렌 부분이 후속 반응에 이용될 수 있도록 할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 아지드- 및 아세틸렌-함유 중합체의 합성 방법을 포함한다. 아지드-함유 PEG 유도체의 경우, 아지드는 중합체의 탄소 원자에 직접 결합될 수 있다. 대안적으로, 아지드-함유 PEG 유도체는 통상적 활성화된 중합체의 한 말달에 아니드 부분을 갖는 연결제를 결합시켜, 수득된 중합체가 그 말단에 아지드 부분을 가지도록 함으로써 제조될 수 있다. 아세틸렌-함유 PEG 유도체의 경우, 아세틸렌은 중합체의 탄소 원자에 직접 결합될 수 있다. 대안적으로, 아세틸렌-함유 PEG 유도체는 통상적 활성화된 중합체의 한 말달에 아세틸렌 부분을 갖는 연결제를 결합시켜, 수득된 중합체가 그 말단에 아세틸렌 부분을 가지도록 함으로써 제조될 수 있다.
보다 구체적으로, 아지드-함유 PEG 유도체의 경우, 하나 이상의 활성 히드록실 부분을 갖는 수용성 중합체는 더욱 반응성인 부분, 예컨대 메실레이트, 트레실레이트, 토실레이트 또는 할로겐 이탈기를 그 위에 갖는 치환 중합체를 생성시키는 반응을 수행한다. 술포닐산 할로겐화물, 할로겐 원자 및 기타 이탈기를 함유하는 PEG 유도체의 제조 및 용도가 당업자에게 공지되어 있다. 이어서, 수득된 치환 중합체는 중합체 말단에서 아지드 부분을 더욱 반응성인 부분으로 치환하는 반응을 수행한다. 대안적으로, 하나 이상의 활성 친핵성 또는 친전자성 부분을 갖는 수용성 중합체는 한 말단에 아지드를 갖는 연결제와의 반응을 수행하여, PEG 중합체와 연결제 사이에 공유 결합이 형성되도록 하고, 아지드 부분은 중합체의 말단에 위치하게 된다. 아민, 티올, 히드라지드, 히드라진, 알코올, 카르복실레이트, 알데히드, 케톤, 티오에스테르 등을 포함한 친핵성 및 친전자성 부분이 당업자에게 공지되어 있다.
보다 구체적으로, 아세틸렌-함유 PEG 유도체의 경우, 하나 이상의 활성 히드록실 부분을 갖는 수용성 중합체는 아세틸렌 부분을 함유하는 전구체로부터 할로겐 또는 기타 활성화된 이탈기를 대체하는 반응을 수행한다. 대안적으로, 하나 이상의 활성 친핵성 또는 친전자성 부분을 갖는 수용성 중합체는 한 말단에 아세틸렌을 갖는 연결제와의 반응을 수행하여, PEG 중합체와 연결제 사이에 공유 결합이 형성되도록 하고, 아세틸렌 부분은 중합체의 말단에 위치하게 된다. 유기 합성 및 PEG 유도체의 제조 및 사용 부분에 있어 할로겐 부분, 활성화된 이탈기, 친핵성 및 친전자성 부분의 사용은 당 기술분야의 수행자들에게 잘 확립되어 있다.
본 발명은 또한 PEG, 및 아지드 또는 아세틸렌 부분을 함유하는 PEG 유도체와 같은 수용체 중합체를 비제한적 예로 포함하는 변형된 단백질에 다른 물질을 첨가하는 단백질의 선택적 변형 방법을 제공한다. 아지드- 및 아세틸렌-함유 PEG 유도체는, 생체적합성, 안정성, 용해도, 및 면역원성의 결여가 중요한 표면 및 분자의 성질을 변형하기 위해 사용될 수 있고, 또한 그와 동시에 당업계에 과거 공지된 단백질에 PEG 유도체를 결합시키는 더욱 선택적인 수단이 제공된다.
II. 펩티드 및 폴리펩티드
본 발명의 방법을 이용하는데 제조될 수 있는 BSP는 천연 발생 또는 비천연 코딩 여부에 무관하고, 또한 임의의 길이 또는 서열의 아미노산의 임의의 조합일 수 있다. 유일한 조건은, BSP 사슬 내의 아미노산 중 하나 이상이 비천연적으로 코딩된 아미노산인 것이다. 폴리펩티드가 생합성으로 이루어지는 경우, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함하는 mRNA로부터 번역되어 페티드 사슬에 혼입된다. 화학적 합성에 의해 제조될 수 있는 본 발명의 신규 BSP는 합성 공정 중에 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 혼입하고 있을 수 있다. 비천연적으로 코딩된 아미노산은 아미노산 사슬 내의 임의의 위치에 놓일 수 있고, 또한 Fc와 같은 생물 활성 펩티드, 링커 또는 융합 상대, 예컨대 알부민 내에서(단, 이에 제한되지 않음) 완료된 BSP의 임의의 부분에 위치할 수 있다.
본원에서 GLP-1 폴리펩티드라는 언급은 본 발명에 사용하기에 적당한 펩티드 또는 폴리펩티드의 예로서 GLP-1을 사용하기 위해 의도된다. 따라서, GLP-1과 관련하여 본원에 기재된 변형 및 화학기작은 본원에 구체적으로 열거된 것들을 비제한적 예로 포함하는, 임의의 기타 BSP에 동등하게 적용될 수 있음을 이해하도록 한다.
장의 L-세포로부터 방출된 GLP-1은, 음식에 대한 반응으로, 문맥 순환에 들어간다. 그것은 DPP IV(CD26)에 의해 급속히 절단되어, GLP-1(9-37) 또는 GLP-1(9-36) 아미드를 방출시키고, 이 양자 모두는 GLP-1R에서 덜 활성이다. 일부 보고서에 따르면, 그것들은 위장관 운동성에 대해 GLP-1R 및 GLP-1 효과의 길항자로서 작용할 수 있다. 순환 GLP-1의 반감기는 약 4분인 것으로 나타났다(Kreymann 등, 1987 Lancet. Dec 5; 2(8571): 1300-4). CD26로 표시되는 디펩티딜-펩티다제 IV(DPP IV, BC 3. 4.14.5, CD26)은 수가지 세포 유형들, 특히 CD4+ T-세포의 표면, 또한 신장, 태반, 혈장, 간 및 장 세포에서 발현되는 세포외 막 결합 효소이다. T-세포 상에서, DPP IV는 항원 CD26과 일치하는 것으로 나타났다. CD26은 저밀도로 휴지 T 세포의 한 분획에서 발현되나, T-세포 활성화 후에 강하게 상향 제어된다(Gorrell 등, 2001, Scand J Immunol. 2001 Sep; 54(3): 249-64). CD26은 T-세포 및 전체 면역 시스템 조절에 있어 중요한 기능적 역할을 가질 수 있는 다중기능 분자이다. CD26은 세포 표면 상에서 발견되는 면역학적 중요성을 갖는 다른 수용체, 예컨대 단백질 티로신 포스파타제 CD45 및 아데노신 데아미나제(ADA)와 관련된다. DPP IV는 GLP-1 및 GIP를 분해함에 의한 포도당 처분의 음성 제어를 발휘함으로써, 췌장의 베타 세포에 대한 인크레틴 효과를 저하시킨다.
DPP IV는 인간 GLP-1의 주요 순환 형태의 Ala-Glu 결합을 절단하여(인간 GLP-1(7-36) NH2: His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2)(서열 번호 1), N-말단 디펩티드를 방출한다. Ala의 Gly(Deacon 등, 1998, Diabetologia, 41: 271-278; Burcelin 등, 1999, Metabolism, 48(2): 252-258), Leu, D-Ala 및 기타 아미노산으로의 치환이 DPP IV 퇴화로부터 GLP-1을 보호하고, 그것의 생체외 및 생체내 인슐린친화 작용을 강화하는 것(Xiao 등, 2001, Biochemistry, 40: 2860-2869)으로 나타났다. His7의 NH2 기, 또는 아미노-말단 히스티딘의 결실은 수용체 친화도 및 유사체의 강도를 감소시켰다(Adelhorst 등, 1994, J. Biol. Chem., 269(9): 6275-6278; Xiao 등, 2001, 이하 동일; Siegel 등, 1999, Reg. Peptides, 79: 93-102). U.S. 특허 No. 5,545,618은 알릴 및 아실 변형을 이용한 N-말단 변형이 또한 DPP IV 내성 유사체를 생성시킴을 교시한다. 보다 구체적으로, N-알킬화 (C1-C6) 또는 N-아실화 (C1-C6) L-/D-아미노산에 의한 His7 치환은 DPP TV-내성을 갖는 유사체를 수득하도록 한다. 불포화 유기산, 예컨대 트랜스-3-헥센산의 공유 결합은 또한 마우스에서의 경구 포도당 내인성 시험에서 고혈당을 강하게 감소시키는 DPP IV-내성 GLP-1 유사체를 생성시킨다(Xiao 등, 2001, 이하 동일). 또한, His7은 α-치환 카르복실산에 의해 치환되어(여기에서, 치환기 중 하나는 5- 또는 6-원 환 구조(예컨대, 이미다졸)임), DPP IV 내성을 부여할 수 있다(본원에 참고로 인용되는 WO 99/43707 참고). His7 뒤에서의 6-아미노헥산산(AHA)의 삽입은 DPP IV 내성을 부여하면서, 생체내 수용체 친화도 및 인슐린친화 효능은 보유시키는 것으로 나타났다(Doyle 등, 2001, Endocrinol., 142(10) : 4462-4468).
인슐린친화 작용을 나타내는 수많은 GLP-1 유사체들이 당업계에 공지되어 있다. 이들 변종체 및 유사체에는 예를 들어, GLP-1(7-36), Gln9-GLP-1(7-37), D-Gln9-GLP-1(7-37), 아세틸-Lys9-GLP-1(7-37), Thr16-Lys18-GLP-1(7-37), 및 Lys18-GLP-1(7-37)이 포함된다. GLP-1의 유도체에는 예를 들어, 산 부가 염, 카르복실레이트 염, 저급 알킬 에스테르 및 아미드가 포함된다(WO 91/11457(1991); EP 0733,644(1996); 및 U.S. 특허 No. 5,512,549(1996) 참고). 또한, N-말단 히스티딘 잔기(His7)가 GLP-1의 인슐린친화 활성에 매우 중요하다는 것도 또한 입증되었다(Suzuki 등, 1988, Diabates Research and Clinical Practice XIII Congress of the International Diabetes Federation, 5(부록 1):S30 (초록 No. ORA-007-007)).
본 발명에 사용하기에 적당한 GLP-1 화합물의 군이 본원에 참고로 인용되는 WO 91/11457 (U.S. 특허 No. 5,545,618)에 개시되어 있고, 본질적으로 (a) 위치 26 및/또는 위치 34에서 리신의 글리신, 세린, 시스테인, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 티로신, 알라닌, 발린, 이소루이신, 루이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 아르기닌 또는 D-리신으로의 치환; 또는 위치 36에서의 아르기닌의 글리신, 세린, 시스테인, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 티로신, 알라닌, 발린, 이소루이신, 루이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 리신, 또는 D-아르기닌으로의 치환; (b) 위치 31에서의 트립토판의 산화-내성 아미노산으로의 치환; (c) 위치 16에서의 발린의 티로신의 치환; 위치 18에서의 세린의 리신으로의 치환; 위치 21에서의 글루탐산의 아스파르트산으로의 치환; 위치 22에서의 글리신의 세린으로의 치환; 위치 23에서의 글루타민의 아르기닌으로의 치환; 위치 24에서의 알라닌의 아르기닌으로의 치환; 및 위치 26에서의 리신의 글루타민의 치환 중 하나 이상으로의 치환; 및 (d) 위치 8에서의 알라닌의 글리신, 세린 또는 시스테인으로의 치환; 위치 9에서의 글루탐산의 아스파르트산, 글리신, 세린, 시스테인, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 티로신, 알라닌, 발린, 이소루이신, 루이신, 메티오닌 또는 페닐알라닌으로의 치환; 위치 10에서의 글리신의 세린, 시스테인, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 티로신, 알라닌, 발린, 이소루이신, 루이신, 메티오닌 또는 페닐알라닌으로의 치환; 및 위치 15에서의 아스파르트산의 글루탐산의 치환 중 하나 이상으로의 치환; 및 (e)위치 7에서의 히스티딘의 글리신, 세린, 시스테인, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 티로신, 알라닌, 발린, 이소루이신, 루이신, 메티오닌 또는 페닐알라닌 또는 D- 또는N-아실화 또는 알킬화 형태의 히스티딘으로의 치환(여기에서, 치환은 (a), (b), (d) 및 (e)이고, 치환 아미노산은 임의적으로 D-형태일 수 있고, 위치 7에서 치환된 아미노산은 임의적으로 N-아실화 또는 N-알킬화 형태일 수 있음)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변형을 갖는 GLP-1(7-34), GLP-1(7-35), GLP-1(7-36), 또는 GLP-1(7-37), 또는 그것의 아미드 형태, 및 약제학적으로-허용가능한 이들의 염으로 구성된다.
효소인 디펩티딜-펩티다제 IV(DPP IV)은 투여된 GLP-1의 급속 생체내 불활성화가 관찰되는 것에 대한 원인일 수 있기 때문에(예컨대 [Mentlein, R. 등, Eur. J. Biochem., 214: 829-835(1993)] 참고), 융합 단백질의 부문에서 DPP IV의 활성으로부터 보호된 GLP-1 유사체 및 유도체가 적당하고, GLP-1 화합물이 G1y8-GLP-1(7-37)OH, Val8-GLP-1(7-37)0H, α-메틸-A1a8-GLP-1(7-37)OH, 또는 G1y8-G1y21-GLP-1(7-37) OH인 융합 단백질도 또한 적당하다.
본 발명에 사용하기 위한 GLP-1 화합물의 다른 한 바람직한 군은 본원에 참고로 명백히 인용되는 U.S. 특허 No. 5,512,549에 개시된 화합물들로 구성된다.
본 발명의 GLP-1 화합물은 또한 엑센딘 화합물을 포괄한다. 엑센딘-3 및 엑센딘-4은 독도마뱀과의 도마뱀의 독액으로부터 먼저 단리된 생물 활성 펩티드이고, GLP-1 수용체에 결합하고, 포유동물의 외벽 세포에서의 cAMP 의존성 H+ 생산을 자극하는 것으로 나타났다. 엑센딘-3 및 엑센딘-4는 모두 GLP-1에 대해 대략 53% 유사성을 갖는 39개 아미노산 펩티드이다. 도 2는 GLP-1 및 엑센딘-4 구조의 나선형 비교이다. 보존 잔기가 별표로 표시되어 있다. 도 3은 엑센딘-4와 GLP-1 간의 보존 면이 성질상 우세하게 소수성인 반면, 비보존 면은 우세하게 친수성임을 도시한다.
그것들은 GLP-1 활성의 강한 작용자로서 작용한다. 주목할만하게, 엑센딘(9-39개 아미노산)으로도 알려져 있는 엑센딘의 N-말단 절단 유도체는 엑센딘-3, 엑센딘-4 및 GLP-1의 억제제이다(Goke 등(1993) J. Biol. Chem. 268(26)19650-19655).
엑센딘 화합물은 전형적으로 엑센딘-3, 엑센딘-4, 또는 그것의 유사체 또는 단편의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 엑센딘-3 및 엑센딘-4가 U.S. 특허 No. 5,424,286에 개시되어 있다. 엑센딘-3은 His-Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys.-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(서열 번호 21)의 아미노산 서열을 가진다. 엑센딘-4는 His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(서열 번호 3)의 아미노산 서열을 가진다.
GLP-1 화합물은 또한 엑센딘 또는 엑센딘 유사체의 N-말단 및/또는 C-말단으로부터의 하나 이상의 아미노산의 절단 후에 수득되는 폴리펩티드인 엑센딘 단편을 포함한다. 또한, GLP-1 화합물은 하나 이상의 아미노산이 엑센딘 또는 그것의 단편의 N-말단 및/또는 C-말단에 부가된 엑센딘 폴리펩티드를 포함한다. 이 유형의 엑센딘 화합물은 약 45개 이하의 아미노산을 가진다.
GLP-1 화합물은 또한 "엑센딘 유사체"를 포함한다. 엑센딘 유사체는 엑센딘-4, 엑센딘-3, 또는 그것의 단편에 대해, 유사체가 인슐린친화 활성을 가지도록 하기에 충분한 상동성을 가진다. 엑센딘 단편 및/또는 유사체의 활성은 본원에 각기 참고로 인용되는 EP 619,322 및 U.S. 특허 No. 5,120,712에 기재된 것과 같은 생체외 검정을 이용하여 평가될 수 있다. 본 발명에 유용한 부가적 엑센딘-유사체가 본원에 각기 참고로 인용되는, PCT 특허 공보 WO 99/25728(Beeley 등), WO 99/25727(Beeley 등), WO 98/05351(Young 등), WO 99/40788(Young 등), WO 99/07404(Beeley 등), 및 WO 99/43708(Knudsen 등)에 기재되어 있다. 본 발명 내에 포함되는 엑센딘, 및 그것의 유사체, 유도체 및 단편의 예가 WO 97/46584 및 U.S. 특허 No. 5,424,286에 개시되어 있다.
이종성 Fc 융합 단백질
상기 GLP-1 화합물과 같은 BSP는 직접적으로 또는 펩티드 링커를 통해 면역글로불린의 Fc 부분에 융합될 수 있다. 면역글로불린은 디술피드 결합에 의해 함께 고정된 폴리펩티드 사슬을 함유하고, 전형적으로는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 가지는 분자이다. 각 사슬에서, 하나의 도메인(V)은 분자의 항체 특이성에 따라 가변 아미노산 서열을 가진다. 다른 도메인(C)은 오히려 동일한 부류의 분자에 공통된 불변 서열을 가진다. GLP-1-Fc 융합 화합물의 한 예가 도 1에 나와 있다.
본원에 사용되는 면역글로불린의 Fc 부분은 면역학 분야에서 그 용어에 통상 주어지는 의미를 가진다. 구체적으로, 이 용어는 항체로부터의 2개 항원 결합 영역(Fab 단편)을 제거함으로써 수득되는 항체 단편을 가리킨다. Fab 단편을 제거하기 위한 한 방법은, 파파인 프로테아제로 면역글로불린을 소화하는 것이다. 따라서, Fc 부분은 비공유 상호작용 및 디술피드 결합을 통해 연합된 양 중쇄로부터의 불변 영역의 대략 동등한 크기의 단편으로부터 형성된다. Fc 부분은 힌지 영역을 포함할 수 있고, CH2 및 CH3 도메인을 통해 항체의 C-말단에 연장될 수 있다. 인간 및 마우스 면역글로불린에 대한 대표적인 힌지 영역은, 그 교시내용은 본원에 참고로 인용되는 [Antibody Engineering, A Practical Guide, Borrebaeck, C. A. K., ed., W. H. Freeman and Co., 1992]에서 찾아볼 수 있다. Fc 부분은 하나 이상의 글리코실화 부위를 추가로 포함할 수 있다. 힌지 영역, CH2 및 CH3 도메인, 및 하나의 N-글리코실화 부위를 함유하는 수많은 대표적인 Fc 단백질의 아미노산 서열이 당업계에 공지되어 있다.
상이한 효과자 기능, 및 약물동태학 성질을 갖는 5가지 유형의 인간 면역글로불린 Fc 영역, 즉 IgG, IgA, IgM, IgD 및 IgE이 있다. IgG는 혈청 내 가장 풍부한 면역글로불린이다. IgG는 또한 임의의 면역글로불린의 혈청 내 가장 긴 반감기를가진다(23일). 다른 면역글로불린과 달리, IgG는 Fc 수용체에 결합한 후 효율적으로 재순환된다. 4가지 IgG 하위부류, 즉 G1, G2, G3 및 G4가 있고, 이들 각각은 상이한 효과자 기능을 가진다. G1, G2 및 G3은 C1q을 결합시켜 상보체를 고정할 수 있으나, G4는 그러하지 못하다. G3은 G1보다 더 효율적으로 C1q에 결합할 수 있을지라도, G1은 상보체-지정 세포 분해를 매개함에 있어 더욱 효과적이다. G2는 상보체를 매우 비효율적으로 유지시킨다. IgG 내의 C1q 결합 부위는 CH2 도메인의 카르복시 말단 영역 내에 위치한다.
모든 IgG 하위부류가 Fc 수용체(CD 16, CD32, CD64)에 결합할 수 있고. G1 및 G3이 G2 및 G4보다 더 효과적이다. IgG의 Fc 수용체 결합 영역이 CH2 도메인의 힌지 및 카르복시 말단 영역 모두에 위치한 잔기에 의해 형성된다.
IgA는 J-사슬에 의해 함께 유지되는 단량체성 형태 및 이량체성 형태 모두로 존재할 수 있다. IgA는 혈청 내에 두 번째로 가장 풍부한 Ig이나, 그것은 단지 6일의 반감기를 가진다. IgA는 3가지 효과자 기능을 가진다. 그것은 식세포 작용 및 탈과립화를 각기 유도하는, 대식세포 및 호산백혈구에 대한 IgA 특이적 수용체에 결합한다. 그것은 또한 미지의 대안적 경로를 통해 상보체를 고정할 수 있다.
IgM은 J-사슬에 의해 함께 고정되는 오량체성 형태 및 육량체성 형태 중 어느 하나로 발현될 수 있다. IgM은 5일의 혈청 반감기를 가진다. 그것은 그것의 CH3 도메인에 위치한 결합 부위를 통해 C1q에 약하게 결합한다. IgD는 혈청 내에 3일의 반감기를 가진다. 어떠한 효과자 기능이 이 Ig의 원인이 되는지 명확하지 않다. IgE는 단량체성 Ig이고, 2.5일의 혈청 반감기를 가진다. IgE는 탈과립화를 유도하고 염증전 제제의 방출을 초래하는 2개의 Fc 수용체에 결합한다.
원하는 생체내 효과에 따라, 본 발명의 이종성 융합 단백질은 상기 아형들 중 임의의 것을 함유하거나 변이된 Fc 영역을 함유할 수 있고, 여기에서 상보 및/또는 Fc 수용체 결합 기능이 변형되었다. 본 발명의 이종성 융합 단백질은 GLP-1 화합물에 융합된 면역글로불린의 Fc 부분의 전체, 면역글로불린의 Fc 부분의 단편, 또는 그것의 유사체를 함유할 수 있다.
본 발명의 융합 단백질은 단일 사슬 단백질 또는 다중 사슬 폴리펩티드로 구성될 수 있다. 2개 이상의 Fc 융합 단백질은, Fc 영역들 간에 천연적으로 형성되는 디술피드 결합을 통해 상호작용하도록 생성될 수 있다. 이들 다량체는 GLP-1 화합물과 동종성일 수 있거나, 융합 단백질의 Fc 부분의 N-말단에 융합된 상이한 GLP-1 화합물을 함유할 수 있다.
융합 단백질의 최종 구조와 무관하게, Fc 또는 Fc-유사 영역은 N-말단에 융합된 GLP-1 화합물의 생체내 혈장내 반감기를 연장시키는 작용을 할 수 있다. 또한, 융합 단백질 화합물의 GLP-1 성분은 GLP-1의 하나 이상의 생물학적 활성을 보유해야 한다. 치료적 또는 순환 반감기의 증가는, 본원에 기재되거나 당업계에 공지된 방법을 구해질 수 있고, 여기에서 융합 단백질의 반감기는 GLP-1 화합물 단독의 반감기와 비교된다. 생물학적 활성은 당업계에 공지된 생체외 및 생체내 방법에 의해 구해질 수 있다.
단백질분해에 의해 생성된 IgG의 Fc 영역이 비변형 IgG 분자 및 Fab 단편이 급속히 분해됨에 따라, 동일한 생체내 반감기를 가지기 때문에, 반감기 연장을 위한 관련 서열이 CH2 및/또는 CH3 도메인에 있는 것으로 믿어진다. 또한, 고친화도 Fc 수용체 또는 칩에 결합하지 않는 IgG 변종체의 이화 속도가 모 야생형 항체의 소거 속도와 식별가능하지 않은 것으로 문헌에 나와 있고, 이는 이화 부위가 Fc 수용체 또는 C1q 결합과 연관된 부위와 구분됨을 가리킨다[Wawrzynczak 등(1992) Molecular Immunology 29: 221]. 쥐과 IgG1 Fc 영역을 이용한 부위-지정 변이유발 연구는 이화 속도를 조절하는 IgG1 Fc 영역의 부위가 CH2-CH3 도메인 계면에 위치함을 제시하였다. Fc 영역은 융합 단백질의 반감기를 최적화하기 위해 이화 부위에서 변형될 수 있다. 본 발명의 융합 단백질을 위해 사용되는 Fc 영역은 IgG1 또는 IgG4 Fc 영역으로부터 유래될 수 있고, 힌지 영역을 포함한 CH2 및 CH3 영역을 모두 함유할 수 있다.
이종성 알부민 융합 단백질
본원에 기재된 GLP-1 화합물과 같은 BSP는 직접적으로 또는 펩티드 링커, 수용성 중합체 또는 전구약물 링커를 통해, 알부민 또는 an 그것의 유사체, 단편 또는 유도체에 융합될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 융합 단백질의 부분인 알부민 단백질은 인간을 포함한 임의의 종으로부터 클로닝된 알부민으로부터 유래될 수 있다. 인간 혈청 알부민(HSA)은 식 분자량이 66,500인 585개 아미노산의 단일 비글리코실화 폴리펩티드 사슬로 구성된다. 인간 HAS의 아미노산 서열은 알려져 있다[본원에 각기 참고로 인용되는, [Meloun 등(1975) FEBS Letters 58: 136; Behrens 등(1975) Fed. Proc. 34: 591; Lawn 등(1981) Nucleic Acid Research 9: 6102-6114; Minghetti 등(1986) J. Biol. Chem. 261: 6747]을 참고]. 알부민의 각종 다형태 변종체, 및 유사체 및 단편이 기재되었다[Weitkamp 등(1973) Ann. Hum. Genet. 37: 21] 참고]. 예를 들어, EP 322,094에서, 각종 보다 짧은 유형의 HSA가 기재되어 있다. HSA(1-373), HSA(1-388), HSA(1-389), HSA(1-369), 및 HSA(1-419) 및 1-369 및 1-419 단편을 포함한, HSA의 상기 단편들 중 일부가 개시되어 있다. EP 399,666은 HSA(1-177) 및 HSA(1-200) 및 HSA(1-177) 및 HSA(l-200)의 단편을 포함한 알부민 단편을 개시한다.
본 발명의 이종성 융합 단백질은, 단편, 유사체 및 유도체를 포함한 임의의 알부민 단백질에 결합된 GLP-1 화합물을 포함하는 것으로 이해되어 지며, 여기에서 그러한 융합 단백질은 생물 활성적이고, GLP-1 화합물 단독보다 더 긴 혈장내 반감기를 가진다. 따라서, 융합 단백질의 알부민 부분은 반드시 본연의 인간 알부민과 동일한 혈장 반감기를 가질 필요는 없다. 본연의 인간 알부민 및 관심 GLP-1 화합물보다 더 길거나 그 중간의 반감기를 갖는, 단편, 유사체 및 유도체가 공지되어 있거나 생성될 수 있다.
본 발명의 이종성 융합 단백질은 GLP-1 화합물, 및/또는 융합 단백질의 Fc 또는 알부민 부분에 보수적 아미노산 치환을 갖는 단백질을 포괄한다. "보수적 치환"은 아미노산을 동일한 알짜 전하 및 대략 일치하는 크기 및 모양을 가지는 다른 한 아미노산으로 대체하는 것이다. 지방족 또는 치환 지방족 아미노산 측쇄를 갖는 아미노산은, 그 측쇄 내의 탄소 및 이종원자의 총수가 약 4 이하로 차이가 날 때 대략 일치하는 크기를 가진다. 그것들은 측쇄 내의 분지의 수가 1개 이하로 차이가 날 때 대략 동일한 모양을 가진다. 측쇄 내에 페닐 또는 치환 페닐기를 갖는 아미노산은 대략 동일한 크기 및 모양을 가지는 것으로 간주된다. 본원에 달리 구체적으로 제시되지 않는 한, 보수적 치환은 바람직하게 천연 발생 아미노산으로 이루어진다.
야생형 알부민 및 면역글로불린 단백질은 각종 출처(source)로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 이 단백질은 검출가능 수준으로 관심 mRNA를 발현하는 조직 또는 세포로부터 제조되는 cDNA 라이브러리로부터 수득될 수 있다. 관심 특별한 단백질의 공개 DNA 또는 단백질 서열을 이용하여 설계된 프로브를 이용하여 라이브러리를 스크리닝할 수 있다. 예를 들어, 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 불변 영역이 [Adams 등(1980) Biochemistry 19: 2711-2719; Goughet 등(1980) Biochemistry 19: 2702-2710; Dolby 등(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 6027-6031; Rice 등(1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 7862-7862; Falkner 등(1982) Nature 298: 286-288; 및 Morrison 등(1984) Ann. Rev. Immunol. 2: 239-256]에 기재되어 있다. 알부민 단백질 및 DNA 서열을 개시하고 있는 일부 참고문헌에는 [Meloun 등(1975) FEBS Letters 58: 136; Behrens 등(1975) Fed. Proc. 34: 591; Lawn 등(1981) Nucleic Acids Research 9: 6102-6114; 및 Minghetti 등(1986) J. Biol. Chem. 261: 6747]이 포함된다.
합성 비본연의 아미노산, 치환 아미노산 또는 하나 이상의 D-아미노산을 포함한 비천연 아미노산의 본 발명의 이종성 융합 단백질로의 혼입이 수많은 상이한 방식들로 유리할 수 있다. D-아미노산-함유 펩티드 등은 L-아미노산-함유 상대편에 비해, 생체외 또는 생체내 증가된 안정성을 나타낸다. 따라서, 보다 큰 세포내 안정성이 요망되거나 요구될 때, D-아미노산을 혼입하는, 펩티드 등의 구축이 특히 유용할 수 있다. 보다 구체적으로, D-펩티드 등은, 내인성 펩티다제 및 프로테아제에 대해 내성이 있으므로, 그러한 성질이 바람직한 경우, 분자의 향상된 생체유용성 및 연장된 수명을 제공한다. 부가적으로, D-펩티드 등은 T 헬퍼 세포에 대한 조직적합성 착체 부류 II-제한 제시를 위해 효율적으로 가공될 수 있고, 이에 따라 전체 유기체 내 체액성 면역 반응을 유도하기 더 용이하지 않다.
기타 펩티드는 T-20(DP-178), PYY(3-36), 및 란테스(RANTES)를 비제한적 예로서 포함하는 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 변형될 수 있다.
란테스로 공지된 폴리펩티드는 케모킨으로 공지된 사이토킨의 큰 부류의 한 원이고, β-케모킨으로 분류된다. 그것은 68개 아미노산 서열을 가진다. 란테스를 위한 수용체가 최근 클로닝되었고(Gao 등, J. Exp. Med. 177: 1421-7(1993); Neote 등, Cell 72: 415-25(1993)), 이는 대략 MIP-1α>란테스의 효력을 위해 케모킨에 결합하는 것으로 나타났다.
케모킨은 매우 다양한 염증전 세포 유형을 소집하고 활성화하는 능력을 가지고, 란테스는 생체내 염증 반응을 도출하는 것으로 나타났다. 란테스는 CCR5 케모킨 수용체를 위한 천연 리간드, MIP-1α, MIP-1β와 함께 인간 면역 결핍 바이러스 유형-1("HIV-1") 감염을 억제하는 것으로 나타났으며(Cocchi 등, Science 270: 1811-1815(1995)), 이는 HIV-1, HIV-2 및 SW-1의 일차적 단리물을 위한 주요 공수용체로서 CCR5을 확인시킨다(Deng 등, Nature 381: 661-666(1996); Doranz 등, Cell 85: 1149-1158(1996); Choe 등, Cell 85: 1135-1148(1996); Chen 등, J. Virol. 71: 2705-2714(1997); 및 Alkhatib 등, Science 272: 1955-1958(1996)). 그러나, 란테스가 말초 혈액 단핵 세포에서 HIV-1 복제를 일관되게 억제하나, 그것은 일차 대식세포 배양물의 감염을 차단하지 못하며, 이는 란테스가 비림프구 세포 유형에서 HIV 복제에 영향을 주지 않음을 제시한다.
란테스의 N-말단 변형은 칼슘 흐름의 신호 전달없이 HIV-1 감염을 차단할 수 있는 길항자를 초래한다(Mack 등, J. Exp. Med. 187: 1215-1224(1998) 및 Proudfoot 등, J. Biol. Chem. 271: 2599-2603(1996)). 이들 변형에는 N-말단 절단 란테스[9-68] (Arenzana-Seisdedos 등, Nature 383: 400(1996)), 및 란테스의 N-말단에서의 메티오닌의 부가("Met-란테스") 또는 아미노옥시펜탄 부가("AOP-란테스")(Mack 등, 이하 동일, 및 Simmons 등, Science 276: 276-279(1997))이 포함된다. Met-란테스 및 AOP-란테스 유도체가 란테스의 길항자인 것으로 보고되었다. 또한, 본연의 란테스보다 CCR5에 대한 친화도가 더 큰 N-말단 변형된 란테스는, 감염을 차단함에 있어 본연의 란테스보다 더욱 강하다(Simmons 등, 이하 동일).
강하고, 선택적이며, 전체 수용체 점위를 달성하는 케모킨 수용체 길항자는 감염된 개인의 HIV-1의 치료에 명백히 유용할 것이다. 놀랍게도, 이러한 범위의 활성을 가지는 화합물들이발견되었다. 이 유도체들은 대식세포 및 림프구를 포함한 많은 상이한 세포 유형의 감염을 억제하였다. 부가적으로, 란테스의 길항자는 그것의 염증 효과를 효과적으로 차단하며, 이에 따라 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 바이러스 질병, 죽종/동맥경화, 류마티스성 관절염 및 기관 이식 거부의 치료에 유용하다. 란테스의 특정 유도체가 [Wells 등, 국제 특허 출원 WO 96/17935]에 개시되어 있다. 본원에 참고로 인용되는 U.S. 특허 No. 6,168,784는 화학적 합성에 의해 제조된 N-말단 변형된 란테스 유도체를 기재하고 있다. 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 란테스 폴리펩티드는 유사하거나 향상된 치료적 활성을 제공할 수 있다.
III. 본 발명에 사용하기 위한 일반적 재조합 핵산 방법
본 발명의 수많은 실시양태들에서, 관심 BSP를 코딩하는 핵산은 단리되고 클로닝되고, 재조합 방법을 이용하여 종종 변경될 것이다. 그러한 실시양태들은 비제한적 예로서, 단백질 발현을 위해, 또는 BSP로부터 유래된 변종체, 유도체, 발현 카세트 또는 기타 서열을 발생시키는 동안에 이용될 수 있다. 일부 실시양태들에서, 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 서열은 이종성 프로모터에 작용적으로 연결된다. 숙주 세포에서의 GLP-1의 단리 및 GLP-1의 제조가 예컨대, 본원에 참고로 인용되는 U.S. 특허 No. 5,118,666에 기재되어 있다.
비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 BSP를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은, 서열 번호 1, 2, 3, 21(GLP-1), 서열 번호 22, 24 (T-20), 또는 서열 번호 23 (PYY(3-36))에 나와 있는 아미노산 서열 등을 비제한적 예로 포함하는 모 폴리펩티드의 아미노산 서열을 기초로 하여 합성될 수 있고, 이어서 도입을 위해 관련 아미노산 잔기(들)의 도입(즉, 혼입 또는 치환) 또는 제거(즉, 결실 또는 치환)을 행하기 위해 뉴클레오티드 서열을 변화시킬 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 통상적 방법에 따라 부위-지정 변이유발에 의해 편리하게 변형될 수 있다. 대안적으로, 뉴클레오티드 서열은, 올리고뉴클레오티드 합성장치를 이용하는 것 등을 비제한적 예로 포함하는 화학적 합성에 의해 제조될 수 있고, 여기에서 올리고뉴클레오티드는 원하는 폴리펩티드 아미노산 서열을 기초로 하여, 바람직하게 재조합 폴리펩티드가 생성되는 숙주 세포에서 바람직한 코돈을 선택함으로써, 설계된다. 예를 들어, 원하는 폴리펩티드의 부분을 코딩하는 수개의 작은 올리고뉴클레오티드는 PCR, 결찰 또는 결찰 사슬 반응에 의해 합성 및 어셈블리될 수 있다. 예컨대, 본원에 참고로 인용되는 [Barany 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 189-193(1991); U.S. 특허 6,521,427]을 참고한다.
본 발명은 재조합 유전공학의 분야의 통상의 기술을 이용한다. 본 발명에서 사용되는 일반적 방법을 개시한 기초 문헌에는 [Sambrook 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd ed. 2001); Kriegler, Gene Transfer and expression: A Laboratory Manual(1990); 및 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel 등(편저), 1994))]이 포함된다.
분자생물학적 기술을 기재한 일반 문헌에는 [Berger 및 Kinirnel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA(Berger); Sambrook 등, Molecular Cloning - A Laboratory Manual (제2판), 제1-3권, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989 ("Sambrook") 및 Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel 등(편저), Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. 및 John Wiley & Sons, Inc., (supplemented through 1999)("Ausubel"))]이 포함된다. 이 문헌들은 비천연 아미노산, 직교성 tRNA, 직교성 합성효소 및 이들의 쌍을 포함하는 단백질의 제조를 위한 셀릭터 코돈을 포함하는 유전자의 생성 등(단, 이에 제한되지 않음)과 관련된 변이유발, 벡터, 프로모터 및 많은 다른 관련 주제의 이용을 기재하고 있다. 프로모터에는 원핵생물 프로모터, 진핵생물 프로모터, 세균 프로모터, 효모 프로모터, 곤충 프로모터, 포유동물 프로모터, 특유의 프로모터, 및 유도성 프로모터가 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
각종 유형의 변이유발이 tRNA의 라이브러리의 제조, 합성효소의 라이브러리의 제조, 셀렉터 코돈의 제조, 관심 단백질 또는 폴리펩티드에서의 비천연 아미노산을 코딩하는 셀렉터 코돈의 삽입을 비제한적 예로 포함하는 각종 목적을 위해 본 발명에 이용된다. 그것들에는 부위-지정, 무작위 점 변이유발, 동종성 재조합, DNA 재혼합(shuffling) 또는 기타 재귀적 변이유발 방법, 키메라 구축, 우라실 함유 주형을 이용한 변이유발, 올리고뉴클레오티드-지정 변이유발, 포스포로티오에이트-변형된 DNA 변이유발, 갭 이중체 DNA 등을 이용한 변이유발, 또는 이들의 임의의 조합이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 부가적 적당한 방법에는 점 부정합 수복, 수복-결핍 숙주 균주를 이용한 변이유발, 제한-선택 및 제한-정제, 결실 변이유발, 총 유전자 합성에 의한 변이유발, 이중 나선 파괴 수복 등이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 키메라 구축물를 포함시키는 것을 비제한적 예로 포함하는 변이유발이 또한 본 발명에 포함된다. 한 실시양태에서, 변이유발은서열, 서열 비교, 물리적 성질, 결정 구조 등을 비제한적 예로 포함하는 천연 발생 분자, 또는 변경되거나 변이된 천연 발생 분자의 공지 정보에 의해 인도될 수 있다.
본원에 나와 있는 문헌 및 예들은 이 절차를 기재하고 있다. 부가적 정보가 하기 공보들 및 이하에 인용된 참고문헌들에 나와 있다: [Ling 등, DNA 변이유발에 대한 방법(Approaches to DNA mutagenesis): 개관, Anal Biochem . 254(2): 157-178(1997); Dale 등, 포스포로티오에이트 방법을 이용한 올리고뉴클레오티드-지정 무작위 변이유발(Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method), Method Mol . Biol . 57: 369-374(1996); Smith, 생체외 변이유발(In vitro mutagenesis), Ann. Rev. Genet. 19: 423-462(1985); Botstein & Shortle, 생체외 변이유발의 방법 및 적용(Strategies and applications of in vitro mutagenesis), Science 229: 1193-1201(1985); Carter, 부위-지정 변이유발(Site-directed mutagenesis), Biochem . J. 237: 1-7(1986); Kunkel, 올리고뉴클레오티드 지정 변이유발의 효율성(The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis), Nucleic Acids & Molecular Biology(Eckstein, F. 및 Lilley, D.M.J 편저, Springer Verlag, Berlin)(1987); Kunkel, 표현형 선택을 포함하지 않는 고속 및 효율적 부위-특이적 변이유발(Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection), Proc . Natl . Acad . Sci . USA 82: 488-492(1985); Kunkel 등, 표현형 선택을 포함하지 않는 고속 및 효율적 부위-특이적 변이유발(Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection), Methods in Enzymol . 154, 367-382(1987); Bass 등, 신규 DNA-결합 특이성을 갖는 변이체 Trp 억제자(Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities), Science 242: 240-245(1988); Zoller & Smith, M13-유래 벡터를 이용한 올리고뉴클레오티드-지정 변이유발(Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors): 임의의 DNA 단편에서의 점 변이의 생성을 위한 효율적이고 일반적인 절차(an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment), Nucleic Acids Res. 10: 6487-6500(1982); Zoller & Smith, M13 벡터에 클로닝된 DNA 단편의 올리고뉴클레오티드-지정 변이유발(Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors), Methods in Enzymol. 100: 468-500(1983); Zoller & Smith, 올리고뉴클레오티드-지정 변이유발(Oligonucleotide-directed mutagenesis): 2개의 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 단일-나선의 DNA 주형을 이용한 단순 방법(a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template), Methods in Enzymol . 154: 329-350(1987); Taylor 등, 절단형 DNA의 제조를 위한 제한 효소 반응에서의 포스포로티오에이트-변형 DNA의 사용(The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA), Nucl . Acids Res. 13: 8749-8764(1985); Taylor 등, 포스포로티오에이트-변형 DNA를 이용한 고빈도 올리고뉴클레오티드-지정 변이유발의 급속 발생(The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA), Nucl . Acids Res. 13: 8765-8785(1985); Nakamaye & Eckstein, 포스포로티오에이트기에 의한 제한 엔도뉴클레아제 Nd I의 억제, 및 그것의 올리고뉴클레오티드-지정 변이유발에의 적용(Inhibition of restriction endonuclease Nd I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis), Nucl . Acids Res. 14: 9679-9698(1986); Sayers 등, 포스포로티오에이트-기재 올리고뉴클레오티드-지정 변이유발에서의 5'-3' 엑소뉴클레아제(5'-3' Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis), Nucl . Acids Res. 16: 791-802(1988); Sayers 등, 브롬화에티듐의 존재 하에서 제한 엔도뉴클레아제를 이용한 반응에 의한 포스포로티오에이트-함유 DNA의 나선 특이적 절단(Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide), (1988) Nucl. Acids Res. 16: 803-814; Kramer 등, 올리고뉴클레오티드-지정 변이 구축을 위한 갭 이중체 DNA 방법(The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction), Nucl . Acids Res. 12: 9441-9456(1984); Kramer & Fritz 갭 이중체 DNA를 통한 변이의 올리고뉴클레오티드-지정 구축(Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA), Methods in Enzymol. 154: 350-367(1987); Kramer 등, 변이의 올리고뉴클레오티드-지정 구축을 위한 갭 이중체 DNA 방법에서의 향상된 효소에 의한 생체외 반응(Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations), Nucl . Acids Res. 16: 7207(1988); Fritz 등, 변이의 올리고뉴클레오티드-지정 구축(Oligonucleotide-directed construction of mutations): 생체외 효소에 의한 반응을 포함하지 않는 갭 이중체 DNA 절차(a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro), Nucl. Acids Res. 16: 6987-6999(1988); Kramer 등, E. 콜라이의 메틸-지정 DNA 부정함-수복 시스템에 의한 상이한 효율로 수정되는 상이한 염기/염기 부정합(Different base/base mismatches are corrected with different efficiencies by the methyl-directed DNA mismatch-repair system of E. coli), Cell 38: 879-887(1984); Carter 등, M13 벡터를 이용한 향상된 올리고뉴클레오티드 부위-지정 변이유발(Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors), Nucl . Acids Res. 13: 4431-4443(1985); Carter, M13 벡터를 이용한 향상된 올리고뉴클레오티드-지정 변이유발(Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors), Methods in Enzymol . 154: 382-403(1987); Eghtedarzadeh & Henikoff, 큰 결실을 발생시키기 위한 올리고뉴클레오티드의 용도(Use of oligonucleotides to generate large deletions), Nucl . Acids Res. 14: 5115(1986); Wells 등, 섭틸리신의 전이 상태를 안정화시킴에 있어 수소 결합 형성의 중요성(Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin), Phil. Trans. R. Soc . Loud. A 317: 415- 423(1986); Nambiar 등, 리보뉴클레아제 S 단백질을 코딩하는 유전자의 총괄적 합성 및 클로닝(Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein), Science 223: 1299-1301(1984); Sakmar 및 Khorana, 소 막대형 외부 분절 구아닌 뉴클레오티드-결합 단백질(트랜스듀신)의 알파-서브유닛을 위한 유전자의 총괄적 합성 및 발현(Total synthesis and expression of a gene for the alpha-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein(transducin), Nucl . Acids Res. 14: 6361-6372(1988); Wells 등, Cassette mutagenesis:an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites, Gene 34: 315-323(1985); Grundstr[delta]m 등, 마이크로크기의 '샷건' 유전자 합성에 의한 올리고뉴클레오티드-지정 변이유발(Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale 'shot-gun' gene synthesis), Nucl . Acids Res. 13: 3305-3316(1985); Mandecki, 에스케리치아 콜라이의 플라스미드에서의 올리고뉴클레오티드-지정 이중 나선 파괴 수복(Oligonucleotide-directed double- strand break repair in plasmids of Escherichia coli): 부위-특이적 변이유발을 위한 방법(a method for site-specific mutagenesis), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 7177-7181(1986); Arnold, 특유 환경을 위한 단백질 공학처리(Protein engineering for unusual environments), Current Opinion in Biotechnology 4: 450-455(1993); Sieber 등, Nature Biotechnology, 19: 456-460 (2001); W. P. C. Stemmer, Nature 370, 389-91(1994); 및 I. A. Lorimer, I. Pastan, Nucleic Acids Res. 23, 3067-8(1995)]. 상기 방법들 중 많은 방법들에 대한 부가적 상세 내용을 [Methods in Enzymology 제154권]에서 찾아볼 수 있고, 이 문헌은 또한 각종 변이유발 방법을 이용한 품질 관리 문제에 대한 유용한 조절을 또한 기재하고 있다.
본 발명은 또한 직교성 tRNA/RS 쌍을 통한 비천연 아미노산의 생체내 혼입을 위한 진핵생물 숙주 세포, 비진핵생물 숙주 세포 및 유기체에 관한 것이다. 숙주 세포는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 또는 예를 들어 클로닝 벡터 또는 발현 벡터일 수 있는 본 발명의 벡터를 비제한적 예로서 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 구축물을 이용하여 유전적으로 공학처리(형질변환, 전달 또는 트랜스펙션 등이 포함되나, 이에 제한되지 않음)된다. 벡터는 예를 들어, 플라스미드, 세균, 바이러스, 네이키드 네이키드 폴리뉴클레오티드 또는 접합 폴리뉴클레오티드의 형태일 수 있다. 벡터는 전기천공[Fromm 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 82, 5824(1985)], 바이러스 벡터에 의한 감염, 작은 비이드 또는 입자의 기질 내, 또는 표면 상에서의 핵산을 이용한 고속 충격 천공[Klein 등, Nature 327, 70-73(1987)]을 포함한 표준 방법에 의해 세포 및/또는 미생물에 도입된다.
공학처리된 숙주 세포는 예를 들어, 프로모터를 활성화하거나 형질전환체를 선택하는 스크리닝 단계와 같은 활성에 적당하도록 변형된 통상적 영양 배지에서 배양될 수 있다. 이 세포들은 임의적으로 유전자도입 유기체 내로 배양 도입될 수 있다. 세포 단리 및 배양(예컨대, 후속 핵산 단리) 등(다만 이에 제한되지 않음)에 관한 기타 유용한 참고문헌에는 [Freshney(1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, 제3판, Wiley-Liss, New York, 및 본 문헌 안에서 인용된 참고문헌들; Payne 등(1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, hie. New York, NY; Gamborg 및 Phillips(편저)(1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York) 및 Atlas 및 Parks(편저), The Handbook of Microbiological Media(1993) CRC Press, Boca Raton, FL]이 포함된다.
표적 핵산을 세포에 도입하기 위한 수가지 공지 방법이 이용가능하며, 이들 중 임의의 방법이 본 발명에 이용될 수 있다. 이 방법에는 수여자 세포의 DNA 포함 세균 원형질과의 융합, 전기천공, 발사 포격(projectile bombardment), 및 (이하에 다시 논의되는) 바이러스 벡터 등이 포함된다. 세균 세포는 본 발명의 DNA 구축물을 포함하는 플라스미드의 수를 증폭시키기 위해 사용될 수 있다. 세균은 로그 상태로까지 성장하고, 세균 내의 플라스미드는 당업계에 공지된 각종 방법들에 의해 단리될 수 있다(예를 들어, Sambrook 참고). 또한, 세균으로부터 플라스미드를 정제하기 위한 키트의 다혈증이 시중 입수가능하다(예컨대, 이지프레프(EasyPrep)TM, 플렉시프레프(FlexiPrep)TTM(양자 모두 파마시아 바이오테크(Pharmacia Biotech) 제품); 스트라타클린(StrataClean)TM(스트라타겐(Stratagene) 제조); 및, QIAprepTM(키아겐(Qiagen) 제조). 이어서, 단리되고 정제된 플라스미드를 다른 플라스미드를 생성하도록 더욱 조작하고, 세포를 트랜스펙션하기 위해 사용하거나 관련 벡터에 혼입되어 유기체를 감염시킬 수 있다. 전형적 벡터는 전사 및 번역 종결자, 전사 및 번역 개시 서열, 및 특별한 표적 핵산의 발현의 제어에 유용한 프로모터를 함유한다. 벡터는 임의적으로 하나 이상의 독립적 종결자 서열을 함유하는 포괄적 발현 카세트, (셔틀 벡터를 비제한적 예로 포함하는) 진핵생물, 또는 원핵생물, 또는 양자 모두 내의 카세트의 복제를 허용하는 서열, 및 원핵생물 및 진핵생물 시스템 모두를 위한 선택 마커를 포함한다. 벡터는 원핵생물, 진핵생물, 또는 바람직하게는 양자 모두에서의 복제 및 일체화에 적당하다. [Gillam & Smith, Gene 8: 81(1979); Roberts 등, Nature, 328: 731(1987); Schneider, E. 등, Protein Expr . Purif . 6(1)10-14(1995); Ausubel, Sambrook, Berger(모두 이하 동일)]를 참고한다. 클로닝에 유용한 세균 및 박테리오파지의 카달로그가 예컨대, ATCC에 의해 제공되며, 예를 들어 ATCC에 의해 발행되는 The ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophage(1992) Gherna 등(편저)이 있다, 예컨대 분자 생물학의 시퀀싱, 클로닝 및 기타 측면, 및 이론적 고려사항의 기초가 되는 부가적 기본 절차가 또한 [Watson 등(1992) Recombinant DNA 제2판 Scientific American Books, NY]에 나와 있다. 또한, 본질적으로 임의의 핵산 (및 표준 또는 비표준 불문의 실질적으로 임의의 표지된 핵산)은 더 미들렌드 서티파이드 리에이전트 컴퍼니(The Midland Certified Reagent Company(미국 텍사스주 미들랜드 소재, mcrc.com의 웹사이트 상에 이용가능함), 더 그레잇 아메리칸 젠 컴퍼니(The Great American Gene Company(미국 캘리포니아주 라모나 소재, genco.com의 웹사이트 상에 이용가능함), ExpressGen Inc.(미국 일리노이즈주 시카고 소재, expressgen.com의 웹사이트 상에 이용가능함), 오페론 테크놀로지즈 인코포레이티드(Operon Technologies Inc.)(미국 캘리포니아주 알라메다 소재), 및 기타 많은 회사들과 같은 각종 상업적 출처들 중 임의의 출처로부터 주문된 관례 또는 표준일 수 있다.
셀렉터 코돈
본 발명의 셀렉터 코돈은 단백질 생합성 기작의 유전 코돈 작업틀을 확장시킨다. 예를 들어, 셀렉터 코돈에는 특유의 3염기 코돈, 넌센스(nonsense) 코돈, 예컨대 앰버 코돈(UAG) 또는 오팔 코돈(UGA)을 비제한적 예로 포함하는 중지 코돈, 비천연 코돈, 4개 이상의 염기 코돈, 희소 코돈 등이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. BSP의 적어도 일부분을 코딩하는 단일 폴리뉴클레오티드에서, 1개 이상, 2개 이상, 3개 초과, 즉 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 이상 개수를 비제한적 예로 포함하는 수의, 원하는 유전자에 도입될 수 있는 셀렉터 코돈의 수가 매우 폭넓음이 당업자에게 자명하다.
한 실시양태에서, 방법은 진핵생물 세포 내의 생체내 비천연 아미노산의 혼입을 위한 중지 코돈인 셀렉터 코돈의 사용을 포함한다. 예를 들어, UAG를 비제한적 예로 포함하는 중지 코돈을 인식하는 O-tRNA가 생성되어 원하는 비천연 아미노산을 이용하여 O-RS에 의해 아미노아실화된다. 이 O-tRNA는 천연 발생 숙주의 아미노아실-tRNA 합성효소에 의해 인식되지 않는다. 통상적 부위-지정 변이유발을 사용하여, 관심 폴리펩티드의 부위에 있는 택을 비제한적 예로 포함하는 중지 코돈을 도입할 수 있다. 예컨대, [Sayers, J.R. 등(1988), 포스포로티오에이트 기재 올리고뉴클레오티드-지정 변이에서의 5'-3' 엑소뉴클레아제(5'-3' Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis). Nucleic Acids Res., 16: 791-802]을 참고한다. 관심 폴리펩티드를 코딩하는 O-RS, O-tRNA 및 핵산이 생체내 조합되고, 비천연 아미노산이 UAG 코돈에 대한 반응하여 혼입되어, 특정화된 위치에 비천연 아미노산을 함유하는 폴리펩티드를 생성시킨다.
생체내 비천연 아미노산의 혼입은 진핵생물 숙주 세포의 당한 섭동 없이 행해질 수 있다. 예를 들어, UAG 코돈에 대한 억제 효율성이 앰버 억제자 tRNA, 및 진핵생물 방출 인자(eRF를 비제한적 예로 포함함)(중지 코돈에 결합하여 리보좀으로부터 성장 펩티드의 방출을 개시함)를 비제한적 예로 포함하는 O-tRNA 사이의 경쟁에 의존하기 때문에, 억제 효율성은 O-tRNA, 및/또는 억제자 tRNA의 발현 수준을 증가시키는 것 등(단, 이에 제한되지 않음)에 의해 조절될 수 있다.
셀렉터 코돈은 또한 4개 이상의 염기 코돈, 예컨대 4개, 5개 또는 6개 이상의 염기 코돈을 비제한적 예로 포함하는 연장된 코돈을 포함한다. 4개 염기 코돈의 예는 AGGA, CUAG, UAGA, CCCU 등을 비제한적 예로서 포함한다. 5개 염기 코돈의 예에는 AGGAC, CCCCU, CCCUC, CUAGA, CUACU, UAGGC 등이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 본 발명의 한 특성은 격자이동 억제에 기초한 연장된 코돈을 이용하는 것을 포함한다. 4개 이상의 염기 코돈은 1개 또는 다수개의 비천연 아미노산을 동일한 단백질에 삽입할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 안티코돈 루프, 예를 들어 적어도 8-10 nt 안티코돈 루프와 함께, 특별한 격자이동 억제자 tRNA를 비제한적 예로 포함하는 변이된 O-tRNA의 존재 하에, 4개 이상의 염기 코돈은 단일 아미노산으로 읽혀진다. 다른 실시양태들에서, 적어도 4-염기 코돈, 적어도 5-염기 코돈, 또는 6-염기 코돈, 또는 그 이상을 비제한적 예로 포함하는 안티코돈 루프가 디코딩될 수 있다. 256가지 가능한 4-염기 코돈이 있으므로, 4개 이상의 염기 코돈을 이용하여 다중 비천연 아미노산을 동일한 세포에서 코딩할 수 있다. [Anderson 등(2002) 코돈 및 안티코돈 크기의 한도 탐색(Exploring the Limits of Codon and Anticodon Size), Chemistry and Biology, 9: 237-244; Magliery, (2001) 유전 코드 확장: 4-염기 코돈의 효율적 억제자의 선택, 및 에스케리치아 콜라이에서의 라이브러리를 이용한 "이동" 40염기 코돈의 학인( Expanding the Genetic Code: Selection of Efficient Suppressors of Four-base Codons and Identification of "Shifty" Four-base Codons with a Library Approach in Escherichia coli ), J. Mol . Biol . 307: 755-769]를 참고한다.
예를 들어, 4-염기 코돈이 생체외 생합성 방법을 이용하여 단백질에 비천연 아미노산을 혼입하기 위해 사용되었다. 예컨대, [Ma 등(1993) Biochemistry, 32: 7939; 및 Hohsaka 등(1999) J. Am. Chem . Soc ., 121: 34]를 참고한다. CGGG 및 AGGU는 2개의 화학적으로 아실화 격자이동 억제자 tRNA와 함께 스트렙타비딘에 2-나프틸알라닌 및 리신의 NBD 유도체를 동시에 생체외 혼입하기 위해 사용되었다. 예컨대, [Hohsaka 등(1999) J. Am. Chem . Soc ., 121: 12194]을 참고한다. 생체내 연구에서, Moore 등은 NCUA 안티코돈과 함께 UAGN 코돈을 억제하는 tRNALeu 유도체의 능력을 연구하였고(N은 U, A, G 또는 C일 수 있음), 4중체 UAGA가 0 또는 -1 격자에서의 적은 디코딩을 갖는 13 내지 26%의 효율로 UCUA 안티코돈을 이용하여 tRNALeu에 의해 디코딩될 수 있음을 밝혀내었다. [Moore 등(2000) J. Mol . Biol ., 298: 195]를 참고한다. 한 실시양태에서, 희소 코돈 또는 넌센스 코돈 기재의 연장된 코돈이 본 발명에 사용될 수 있고, 이는 다른 원하지 않는 부위에서 미스센스 과번역 및 격자이동 억제를 감소시킬 수 있다.
주어진 시스템의 경우, 셀렉터 코돈은 또한 천연 3개 염기 코돈 중 하나를 포함할 수 있고, 여기에서 내인성 시스템은 천연 염기 코돈을 전혀 (혹은 거의) 사용하지 않는다. 예를 들어, 이는 천연 3개 염기 코돈, 및/또는 시스템을 인식하는 tRNA가 결핍된 시스템을 포함하고, 여기에서 3개 염기 코돈은 희소 코돈이다.
셀렉터 코돈은 임의적으로 비천연 염기쌍을 포함한다. 이들 비천연 염기쌍은 존재하는 유전 알파벳을 더욱 확장시킨다. 한 추가 염기쌍은 삼중체(triplet) 코돈의 수를 64에서 125로 증가시킨다. 세 번째 염기쌍의 성질에는, 안정하고 선택적인 염기쌍짓기, 중합효소에 의한 고신뢰도의 DNA로의 효율적인 효소에 의한 혼입, 및 초기 비천연 염기쌍의 합성 후 효율적 연속 프라이머 연장이 포함된다. 방법 및 조성물을 위해 적용될 수 있는 비천연 염기쌍의 기재에는 예컨대, [Hirao 등(2002) 아미노산 유사체를 단백질에 혼입하기 위한 비천연 염기쌍(An unnatural base pair for incorporating amino acid analogues into protein) Nature Biotechnology, 20: 177-182]이 포함된다. 다른 관련 공보들이 이하 열거되어 있다.
생체내 용도에 대해, 비천연 뉴클레오시드는 막 투과가능하고, 인산화되어, 상응하는 삼인산염을 형성한다. 또한, 증가된 유전 정보는 안정하고, 세포성 효소에 의해 파괴되지 않는다. Benner 등에 의한 과거 노력은 정규(canonical) Watson-Crick 쌍에서의 패턴과 상이한 수소 결합 패턴을 이용하였고, 이의 가장 주목되는 예는 이소-C:이소-G 쌍이다. 예컨대, [Switzer 등(1989) J. Am. Chem . Soc ., 111: 8322; 및 Piccirilli 등(1990) Nature, 343: 33; Kool(2000) Curr . Opin . Chem . Biol., 4: 602]를 참고한다. 이 염기들은 일반적으로 천연 염기와 어느 정도 잘못 쌍을 이루고, 효소에 의해 복제될 수 없다. Kool 및 그의 동료 연구원들은, 염기들 간의 소수성 팩킹 상호작용은 수소 결합을 대체하여, 염기쌍의 형성을 주도할 수 있음을 입증하였다. [Kool,(2000) Curr . Opin . Chem . Biol ., 4: 602; 및 Guckian 및 Kool(1998) Angew . Chem . Int . Ed. Engl ., 36, 2825]를 참고한다. 상기 요건들을 모두 만족하는 비천연 염기쌍을 개발하기 위한 노력으로, Schultz, Romesberg 및 동료 연구원들은 일련의 비천연 소수성 염기들을 계통적으로 합성하고 연구하였다. PICS:PICS 자기-쌍은 천연 염기쌍보다 더 안정한 것으로 나타나고, 에스케리치아 콜라이 DNA 중합효소 I(KF)의 클레노우(Klenow) 단편에 의해 DNA로 효율적으로 혼입될 수 있다. 예컨대, [McMimi 등(1999) J. Am . Chem . Soc ., 121: 11585-6; 및 Ogawa 등(2000) J. Am. Chem . Soc ., 122: 3274]를 참고한다. 3MN: 3MN 자기-쌍은 생물학적 기능을 위해 충분한 효율 및 선택도로 KF에 의해 합성될 수 있다. 예컨대, [Ogawa 등(2000) J. Am. Chem . Soc ., 122: 8803]을 참고한다. 그러나, 양 염기 모두 추가 복제를 위한 사슬 종결자로서 작용한다. PICS 자기 쌍을 복제하기 위해 사용될 수 있는 변이체 DNA 중합효소가 최근 진척되었다. 또한, 7AI 자기 쌍이 복제될 수 있다. 예컨대, [Tae 등(2001) J. Am. Chem . Soc ., 123: 7439]를 참고한다. Cu(II)에 결합할 때 안정한 쌍을 형성하는 신규 금속염기쌍, Dipic:Py이 또한 개발되었다. [Meggers 등(2000) J. Am. Chem . Soc ., 122: 10714]를 참고한다. 연장된 코돈 및 비천연 코돈이 천연 코돈에 대해 본래 직교성이기 때문에, 본 발명의 방법은 그것들을 위한 직교성 tRNA를 생성시키는 상기 성질을 이용할 수 있다.
번역 바이패싱(bypassing) 시스템을 또한 사용하여, 요망되는 폴리펩티드에 비천연 아미노산을 혼입할 수 있다. 번역 바이패싱 시스템에서, 큰 서열이 유전자에 혼입되나, 단백질로 번역되지 않는다. 서열은 리보솜이 삽입의 하류에서 서열을 뛰어넘고 번역을 재개하도록 유도하는 신호로서 작용하는 구조를 포함한다.
특정 실시양태들에서, 본 발명의 방법 및/또는 조성물에서의 관심 단백질 또는 폴리펩티드(또는 그것의 부분)는 핵산에 의해 코딩된다. 전형적으로, 핵산은 1개 이상의 셀렉터 코돈, 2개 이상의 셀렉터 코돈, 3개 이상의 셀렉터 코돈, 4개 이상의 셀렉터 코돈, 5개 이상의 셀렉터 코돈, 6개 이상의 셀렉터 코돈, 7개 이상의 셀렉터 코돈, 8개 이상의 셀렉터 코돈, 9개 이상의 셀렉터 코돈, 10개 이상의 셀렉터 코돈을 포함한다.
관심 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 변이화될 수 있고, 비천연 아미노산의 혼입을 위한 1개 이상의 셀렉터 코돈을 포함하는 것으로 본원에 기재되어 있다. 예를 들어, 관심 단백질에 대한 핵산을, 1개 이상의 셀렉터 코돈을 포함하도록 변이화하여, 1개 이상의 비천연 아미노산의 혼입을 제공한다. 본 발명은 변이체, 예를 들어 1개 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 각 양태의 임의의 단백질 등을 비제한적 예로 포함하는 임의의 변종체를 포함한다. 유사하게, 본 발명은 또한 상응하는 핵산, 즉 1개 이상의 비천연 아미노산을 코딩하는 1개 이상의 셀렉터 코돈을 갖는 임의의 핵산을 포함한다.
BSP를 코딩하는 핵산 분자, 예컨대 GLP-1, T-20 또는 PYY(3-36)는 폴리펩티드의 임의의 요망되는 위치에 시스테인을 도입하기 위해 용이하게 변이될 수 있다. 시스테인은 반응성 분자, 수용성 중합체, 단백질, 또는 매우 다양한 다른 분자를 관심 단백질에 도입하기 위해 광범위하게 사용된다. U.S. 특허 No. 6,608,183에 기재된 방법과 같이, 폴리펩티드의 임의의 요망되는 위치에 시스테인을 도입하기 위해 적당한 방법이, 당업계에 공지되어 있고, 이에는 표준 변이유발 기법이 포함된다.
IV. 비천연적으로 코딩된 아미노산
매우 다양한 비천연적으로 코딩된 아미노산이 본 발명에 사용하기에 적당하다. 임의의 수의 비천연적으로 코딩된 아미노산이 BSP에 도입될 수 있다. 일반적으로, 도입된 비천연적으로 코딩된 아미노산은 20개의 통상의 유전적으로-코딩된 아미노산(즉, 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소루이신, 루이신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린)에 대해 실질적으로 화학적으로 불활성이다. 일부 실시양태들에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 (아지도, 케톤, 알데히드 및 아미노옥시기를 비제한적 예로 포함하는) 20개의 통상의 아미노산에서 발견되는 작용기와 효율적으로 또한 선택적으로 반응하여, 안정한 접합체를 형성하는 측쇄 작용기를 포함한다. 예를 들어, 아지도 작용기를 함유하는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 BSP는 폴리(에틸렌 글리콜)을 비제한적 예로 포함하는 중합체 또는 대안적으로 알킨 부분을 함유하는 두 번째 폴리펩티드와 반응하여, 안정한 접합체를 형성하며, 이는 아지드 및 알킨 작용기의 선택적 반응을 통해 휘스겐 [3+2] 시클로부가 생성물이 형성되도록 한다.
알파-아미노산의 포괄적 구조는 하기와 같이 도시된다(화학식 I):
Figure 112007014691585-PCT00009
비천연적으로 코딩된 아미노산은 전형적으로 상기 화학식(식 중에서, R 기는 20개 천연 아미노산에 사용되는 것과 다른 임의의 치환기임)을 갖는 구조이며, 본 발명에 사용하기에 적당할 수 있다. 본 발명의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 전형적으로 측쇄의 구조에서만 천연 아미노산과 상이하기 때문에, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 다른 아미노산과, 천연 발생 폴리펩티드에서 형성되는 방식과 동일한 방식으로, 천연 또는 비천연적으로 코딩된(단, 이에 제한되지 않음) 아미드 결합을 형성한다. 그러나, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 천연 아미노산과 그것을 구별되게 하는 측쇄기를 가진다. 예를 들어, R은 임의적으로 알킬-, 아릴-, 아실-, 케토-, 아지도-, 히드록실-, 히드라진, 시아노-, 할로-, 히드라지드, 알케닐, 알키닐, 에테르, 티올, 셀레노-, 술포닐-, 보레이트, 보로네이트, 포스포, 포스포노, 포스핀, 헤테로시클릭, 에논, 이민, 알데히드, 에스테르, 티오산, 히드록실아민, 아미노기 등 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 본 발명에 사용하기에 적당할 수 있는 다른 관심 비천연 발생 아미노산에는 광활성화가능한 가교제를 포함하는 아미노산, 스핀-표지된 아미노산, 형광성 아미노산, 금속 결합 아미노산, 금속-함유 아미노산, 방사능 아미노산, 신규 작용기를 갖는 아미노산, 다른 분자, 광바구니 및/또는 광이성화가능한 아미노산과 공유 또는 비공유 상호작용하는 아미노산, 비오틴 또는 비오틴 유사체를 포함하는 아미노산, 글리코실화 아미노산, 예컨대 당 치환 세닐, 다른 탄수화물 변형된 아미노산, 케토-함유 아미노산, 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에테르를 포함하는 아미노산, 중 원자 치환 아미노산, 화학적으로 절단가능한 및/또는 광절단가능한 아미노산, 약 5개 초과 또는 약 10개 초과의 탄소 길이를 갖는(단, 이에 제한되지 않음) 장쇄 탄화수소 또는 폴리에테르를 비제한적 예로 포함하는 천연 아미노산에 비해 연신 측쇄를 갖는 아미노산, 탄소-연결 당-함유 아미노산, 산화환원-활성 아미노산, 아미노 티오산 함유의 아미노산, 및 1개 이상의 독성 부분을 포함하는 아미노산이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다.
본 발명에 사용하기에 적당할 수 있고, 수용성 중합체와의 반응에 유용한 예시적 비천연적으로 코딩된 아미노산에는 카르보닐, 아미노옥시, 히드라진, 히드라지드, 세미카르바지드, 아지드 및 알킨 반응성 기를 갖는 것들이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 일부 실시양태들에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 당 부분을 포함한다. 그러한 아미노산의 예에는 N-아세틸-L-글루코사미닐-L-세린, N-아세틸-L-갈락토아미닐-L-세린, N-아세틸-L-글루코사미닐-L-트레오닌, N-아세틸-L-글루코사미닐-L-아스파라긴 및 O-만노스아미닐-L-세린이 포함된다. 그러한 아미노산의 예에는 아미노산과 당 사이의 천연 발생 N- 또는0-연결기가 알켄, 옥심, 티오에테르, 아미드 등을 비제한적 예로서 포함하는, 천연적으로는 통상 발견되지는 않는 공유 연결기에 의해 치환되는 것들이 포함된다. 그러한 아미노산의 예에는 또한 2-데옥시-포도당, 2-데옥시갈락토스 등과 같은 천연 발생 단백질에서 통상 발견되지 않는 당들이 포함된다.
본원에 제공되는 많은 비천연적으로 코딩된 아미노산들이 예컨대, 시그마-알드리히(Sigma-Aldrich)(미국 미조리주 세인트루이스 소재), 노바바이오켐(Novabiochem)(EMD 바이오사이언스사 지사, 독일 담슈타트 소재) 또는 펩테크(Peptech)(미국 메사츄세츠주 버링톤 소재)로부터 시중 입수가능하다. 시중 입수가능하지 않은 것들은 임의적으로 본원에 제공된 채로 합성되거나, 당업자에게 공지된 표준 방법을 이용하여 합성된다. 유기 합성 기법에 대해, 예컨대 [Organic Chemistry, Fessendon and Fessendon(1982)(제2판, Willard Grant Press, Boston Mass); Advanced Organic Chemistry, March(제3판, 1985, Wiley and Sons, New York); 및 Advanced Organic Chemistry, Carey 및 Sundberg(제3판, 파트 A 및 B, 1990, Plenum Press, New York)]을 참고한다. 또한 본원에 각기 참고로 인용되는 U.S. 특허 출원 공보 2003/0082575 및 2003/0108885를 참고한다. 신규 측쇄를 포함하는 비천연 아미노산에 부가하여, 본 발명에 사용하기에 적당할 수 있는 비천연 아미노산은 또한 임의적으로, 하기 화학식 II 및 III의 구조로 도시되는(단, 이에 제한되지 않음) 변형된 골격 구조를 포함한다:
Figure 112007014691585-PCT00010
(식 중에서, Z 전형적으로 OH, NH2, SH, NH-R' 또는 S-R'를 포함하고; X 및 Y는 동일하거나 상이할 수 있고, 전형적으로 S 또는 0를 포함하며; R 및 R'는 임의적으로 동일하거나 상이하고, 전형적으로 화학식 I을 갖는 비천연 아미노산에 대해 상기 기재된 R기에 대한 요소들의 동일한 목록, 및 수소로부터 선택된다). 예를 들어, 본 발명의 비천연 아미노산은 또한 임의적으로 화학식 II 및 III로 도시되는 아미노 또는 카르복실기에 치환을 포함한다. 이 유형의 비천연 아미노산에는 통상의 20개 천연 아미노산에 상응하는 측쇄 또는 비천연 측쇄를 갖는(단, 이에 제한되지 않음) α-히드록시 산, α-티오산, α-아미노티오카르복실레이트가 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 또한, α-탄소에서의 치환에는 임의적으로 L, D, 또는 α-α-이치환 아미노산, 예컨대 D-글루타메이트, D-알라닌, D-메틸-0-티로신, 아미노부티르산 등이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 다른 구조적 대체물에는 시클릭 아미노산, 예컨대 프롤린 유사체, 및 3, 4, 6, 7, 8 및 9원 환 프롤린 유사체, β 및 γ 아미노산, 예컨대 치환 β-알라닌 및 γ-아미노 부티르산이 포함된다.
많은 비천연 아미노산은 천연 아미노산, 예컨대 티로신, 글루타민, 페닐알라닌 등을 기재로 하고, 본 발명에 사용하기에 적당하다. 티로신 유사체에는 파라-치환 티로신, 오르토-치환 티로신, 및 메타 치환 티로신이 포함되나, 이들에 제한되지 않으며, 여기에서 치환 티로신은 케토기(아세틸기를 비제한적 예로 포함함), 벤조일기, 아미노기, 히드라진, 히드록시아민, 티올기, 카르복시기, 이소프로필기, 메틸기, C6-C20 직쇄 또는 분지형 탄화수소, 포화 또는 불포화 탄화수소, 0-메틸기, 폴리에테르 기, 니트로기, 알키닐기 등을 비제한적 예로 포함한다. 또한, 다중 치환 아릴 환도 또한 구상된다. 본 발명에 사용하기에 적당할 수 있는 글루타민 유사체에는 α-히드록시 유도체, γ-치환 유도체, 시클릭 유도체 및 아미드 치환 글루타민 유도체가 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 본 발명에 사용하기에 적당할 수 있는 페닐알라닌 유사체의 예에는 파라-치환 페닐알라닌, 오르토-치환 페닐알라닌, 및 메타-치환 페닐알라닌이 포함되나, 이들에 제한되지 않으며, 여기에서 치환기는 히드록시기, 메톡시기, 메틸기, 알릴기, 알데히드, 아지도, 요오도, 브로모, 케토기(아세틸기를 비제한적 예로 포함함), 벤조일, 알키닐기 등을 비제한적 예로 포함한다. 본 발명에 사용하기에 적당할 수 있는 비천연 아미노산의 구체예에는 p-아세틸-L-페닐알라닌, 0-메틸-L-티로신, L-3-(2-나프틸)알라닌, 3-메틸-페닐알라닌, 0-4-알릴-L-티로신, 4-프로필-L-티로신, 트리-O-아세틸-GlcNAcβ-세린, L-도파, 플루오르화 페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, p-아지도-L-페닐알라닌, p-아실-L-페닐알라닌, p-벤조일-L-페닐알라닌, L-포스포세린, 포스포노세린, 포스포노티로신, p-요오도-페닐알라닌, p-브로모페닐알라닌, p-아미노-L-페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, 및 p-프로파르길옥시-페닐알라닌 등이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 본 발명에 사용하기에 적당할 수 있는 각종 비천연 아미노산의 구조의 예가 예를 들어, WO 2002/085923, 발명의 명칭: "비천연 아미노산의 생체내 혼입(In vivo incorporation of unnatural amino acids)"에 제공되어 있다. 또한, 부가적 메티오닌 유사체에 대해 [Kiick 등(2002) 스타우딩거 결찰에 의한 화학선택적 변형을 위한 재조합 단백질로의 아지드의 혼입(Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation), PNAS 99: 19-24]를 참고한다.
한 실시양태에서, 비천연 아미노산(예컨대, p-(프로파르길옥시)-페닐알라닌)을 포함하는 BSP의 조성물이 제공된다. p-(프로파르길옥시)-페닐알라닌을 포함하고, 단백질 및/또는 세포를 비제한적 예로 포함하는 각종 조성물도 또한 제공된다. 한 측면에서, p-(프로파르길옥시)-페닐알라닌 비천연 아미노산을 포함하는 조성물은 직교성 tRNA를 추가로 포함한다. 비천연 아미노산은 아미노-아실 결합을 통해 직교성 tRNA에 공유 결합되거나 직교성 tRNA 등의 말단 리보스 당의 3'OH 또는 2'OH에 공유 결합된(단, 이에 제한되지 않음) 직교성 tRNA에(공유, 단 이에 제한되지 않음) 결합될 수 있다.
단백질에 혼입될 수 있는 비천연 아미노산을 통한 화학적 부분은 각종 이점들 및 단백질의 조작을 제공한다. 예를 들어, 케토 작용기의 특유의 반응성은 생체외 및 생체내 수많은 히드라진- 또는 히드록실아민-함유 시약을 이용한 단백질의 선택적 변형을 허용한다. 예를 들어, 중원자 비천연 아미노산은 X-선 구조 데이터를 단계화하는데 유용할 수 있다. 비천연 아미노산을 이용한 중원자의 부위-특이적 도입은 또한 중원자를 위한 위치를 선택함에 있어 선택성 및 가요성을 제공한다. 예를 들어, 광반응성 비천연 아미노산(벤조페논 및 아릴아지드(페닐 아지드를 비제한적 예로 포함함) 측쇄를 갖는 아미노산을 비제한적 예로 포함함)은 단백질의 효율적 생체내 및 생체외 광가교를 허용한다. 광반응성 비천연 아미노산의 예에는 p-아지도-페닐알라닌 및 p-벤조일-페닐알라닌이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 이어서, 광반응성 비천연 아미노산을 갖는 단백질이 광반응성 기-제공 임시 조절의 여기에 의해 임의로 가교될 수 있다. 한 예에서, 비천연 아미노의 메틸기는 국소 구조 및 동력학(핵자기 공명 및 진동 분광법의 사용을 비제한적 예로 포함함)의 프로브로서 메틸기로(단, 이에 제한되지 않음) 표지된 동위원소로 치환될 수 있다. 예를 들어, 알키닐 또는 아지도 작용기는 [3+2] 시클로부가 반응을 통해 분자를 이용한 단백질의 선택적 변형을 허용한다.
아미노 말단에서 폴리펩티드에 혼입된 비천연 아미노산은 20개 천연 아미노산에 사용되는 것과 다른 임의의 치환기인 R기, 및 α-아미노산 내에 정상적으로 존재하는 NH2 기와 상이한 2차 반응기로 구성될 수 있다(화학식 1 참고). 유사한 비천연 아미노산은 α-아미노산 내에 정상적으로 존재하는 COOH 기와 상이한 2차 반응기와 함께 카르복실 말단에 혼입될 수 있다(화학식 1 참고).
비천연 아미노산의 화학적 합성
본 발명에 사용하기에 적당한 많은 비천연 아미노산들이 예컨대, 시그마(미국) 또는 알드리히(미국 위스콘신주 밀워키 소재)로부터 시중 입수가능하다. 시중 입수가능하지 않은 것들은 임의적으로 본원에 제공된 채로 합성되거나, 당업자에게 공지된 표준 방법을 이용하여 합성된다. 유기 합성 기법에 대해, 예컨대 [Organic Chemistry, Fessendon and Fessendon(1982)(제2판, Willard Grant Press, Boston Mass); Advanced Organic Chemistry, March(제3판, 1985, Wiley and Sons, New York); 및 Advanced Organic Chemistry, Carey 및 Sundberg(제3판, 파트 A 및 B, 1990, Plenum Press, New York)]을 참고한다. 비천연 아미노산의 합성을 기재하고 있는 부가적 공보에는 WO 2002/085923, 발명의 명칭: "비천연 아미노산의 생체내 혼입(In vivo incorporation of unnatural amino acids)"; Matsoukas 등(1995) J. Med. Chem ., 38, 4660-4669; King, F.E. & Kidd, D.A.A.(1949) A New Synthesis ofGlutamine and of γ-Dipeptides of Glutamic Acid from Phthylated Intermediates. J. Chem . Soc ., 3315-3319; Friedman, O.M. & Chatterrji, R.(1959) Synthesis of Derivatives of Glutamine as Model Substrates for Anti-Tumor Agents. J. Am. Chem . Soc . 81, 3750-3752; Craig, J.C. 등(1988) Absolute Configuration of the Enantiomers of 7-Chloro-4 [[4-(diethylamino)-1-methylbutyl]amino] quinoline(Chloroquine). J. Chem . Soc . 53, 1167-1170; Azoulay, M., Vilmont, M. & Frappier, F.(1991) Glutamine analogues as Potential Antimalarials, Eur. J. Med . Chem . 26, 201-5; Koskinen, A.M.P. & Rapoport, H.(1989) Synthesis of 4-Substituted Prolines as Conformationally Constrained Amino Acid Analogues. J. Org . Chem . 54, 1859- 1866; Christie, B.D. & Rapoport, H.(1985) Synthesis of Optically Pure Pipecolates from L- Asparagine. Application to the Total Synthesis of (+)-Apovincamine through Amino Acid Decarbonylation and Iminium Ion Cyclization. J. Org . Chem . 50: 1239-1246; Barton 등(1987) Synthesis of Novel alpha-Amino-Acids and Derivatives Using Radical Chemistry: Synthesis of L- and D-alpha-Amino-Adipic Acids, L-alpha-aminopimelic Acid and Appropriate Unsaturated Derivatives. Tetrahedron 43: 4297-4308; 및 Subasinghe 등(1992) Quisqualic acid analogues: synthesis of beta-heterocyclic 2-aminopropanoic acid derivatives and their activity at a novel quisqualate-sensitized site. J. Med . Chem . 35: 4602-7]이 포함된다. 또한 발명의 명칭: "단백질 어레이(Protein Arrays)", 출원일: 2003년 12월 22일의 특허출원, 일련 번호 10/744,899 및 일련 번호 60/435,821(출원일: 2002년 12월 22일)]을 참고한다.
A. 카르보닐 반응성 기
카르보닐 반응성 기를 갖는 아미노산은 특히 친핵성 부가 또는 알돌 축합 반응을 통해 각종 반응이 분자(PEG 또는 기타 수용성 분자를 비제한적 예로 포함함)를 연결시키도록 한다.
예시적 카르보닐-함유 아미노산은 다음과 같이 나타내어질 수 있다:
Figure 112007014691585-PCT00011
(식 중에서, n은 0 내지 10이고; R1은 알킬, 아릴, 치환 알킬 또는 치환 아릴이며; R2는 H, 알킬, 아릴, 치환 알킬, 및 치환 아릴이고; R3은 H, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 아미노 말단 변형기이고; R4는 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 카르복시 말단 변형기임). 일부 실시양태들에서, n은 1이고, R1은 페닐이며, R2는 단순 알킬(즉, 메틸, 에틸 또는 프로필)이고, 케톤 부분은 알킬 측쇄에 대해 파라 위치에 위치한다. 일부 실시양태들에서, n은 1이고, R1은 페닐이며, R2는 단순 알킬(즉, 메틸, 에틸 또는 프로필)이고, 케톤 부분은 알킬 측쇄에 대해 메타 위치에 위치한다.
p-아세틸-(+/-)-페닐알라닌 및 m-아세틸-(+/-)-페닐알라닌의 합성이 본원에 참고로 인용되는 [Zhang, Z. 등, Biochemistry 42: 6735-6746(2003)]에 기재되어 있다. 다른 카르보닐-함유 아미노산은 유사하게 당업자에 의해 제조될 수 있다.
일부 실시양태들에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 반응성 카르보닐 작용기를 발생시키록 화학적으로 변형된다. 예를 들어, 접합 반응에 유용한 알데히드 작용기가 인접 아미노 및 히드록실기를 갖는 작용기로부터 발생될 수 있다. 생물학적 활성 분자가 예를 들어 폴리펩티드인 경우, N-말단 세린 또는 트레오닌(이는 화학적 또는 효소적 소화를 통해 정상적으로 존재하거나 노출될 수 있음)이 사용되어, 과요오드산염을 사용하여 마일드한 산화 절단 조건 하에서 알데히드 작용기를 발생시킬 수 있다. 예컨대 [Gaertner 등, Bioconjug . Chem . 3: 262-268(1992); Geoghegan, K. & Stroh, J., Bioconjug . Chem . 3: 138-146(1992); Gaertner 등, J. Biol. Chem. 269: 7224-7230(1994)]를 참고한다. 그러나, 당업계에 공지된 방법은 펩티드 또는 단백질의 N-말단에 있는 아미노산에 제한된다.
본 발명에서, 인접 히드록실 및 아미노기를 갖는 비천연적으로 코딩된 아미노산이 "마스킹된" 알데히드 작용기로서 폴리펩티드에 혼입될 수 있다. 예를 들어, 5-히드록시리신은 엡실론 아민에 인접한 히드록실기를 가진다. 알데히드를 발생시키기 위한 반응 조건은 전형적으로 마일드한 조건 하에서 몰 과량의 메타과요오드산나트륨을 폴리펩티드의 완충 용액에 첨가하여, 폴리펩티드 내의 다른 부위에서의 산화를 피하는 것을 포함한다. 산화 반응의 pH는 전형적으로 약 7.0이다. 전형적 반응은 약 1.5 몰 과량의 메타과요오드산나트륨을 폴리펩티드의 완충 용액에 첨가한 후, 암 상태에서 약 10분 동안 인큐베이션하는 것을 포함한다. 예컨대, 본원에 참고로 인용되는 U.S. 특허 No. 6,423,685를 참고한다.
카르보닐 작용기는 수용액 중 마일드한 조건 하에서 히드라진-, 히드라지드-, 히드록실아민-, 또는 세미카르바지드-함유 시약과 선택적으로 반응하여, 생리학적 조건 하에서 안정한 상응하는 히드라존, 옥심, 또는 세미카르바존 연결기를 각기 형성시킬 수 있다. 예컨대, [Jencks, W. P., J. Am. Chem . Soc . 81, 475-481(1959); Shao, J. 및 Tam, J. P., J. Am. Chem . Soc . 117: 3893-3899(1995)]를 참고한다. 또한, 카르보닐기의 특유의 반응성은 다른 아미노산 측쇄의 존재 하에서의 선택적 변형을 허용한다. 예컨대, [Cornish, V. W. 등, J. Am. Chem . Soc . 118: 8150-8151(1996); Geoghegan, K. F. & Stroh, J. G., Bioconjug . Chem . 3: 138-146(1992); Mahal, L. K. 등, Science 276: 1125-1128(1997)]를 참고한다.
B. 히드라진, 히드라지드 또는 세미카르바지드 반응성 기
친핵성 기, 예컨대 히드라진, 히드라지드 또는 세미카르바지드를 함유하는 비천연적으로 코딩된 아미노산은 각종 친핵성기와의 반응을 허용하여, 접합체(PEG 또는 기타 수용성 중합체를 갖는 것을 비제한적 예로 포함함)를 형성시킨다.
예시적 히드라진, 히드라지드 또는 세미카르바지드-함유 아미노산은 하기와 같이 표시될 수 있다:
Figure 112007014691585-PCT00012
(식 중에서, n은 0 내지 10이고; R1은 알킬, 아릴, 치환 알킬, 또는 치환 아릴이거나 존재하지 않으며; X는 0, N 또는 S이거나 존재하지 않고; R2는 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 아미노 말단 변형기이고, R3은 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 카르복시 말단 변형기임).
일부 실시양태들에서, n은 4이고, R1은 존재하지 않으며, X는 N이다. 일부 실시양태들에서, n은 2이고, R1은 존재하지 않으며, X는 존재하지 않는다. 일부 실시양태들에서, n은 1이고, R1은 페닐이며, X는 O이고, 산소 원자는 이릴 환 상의 지방족기에 대해 파라 위치에 위치한다.
히드라지드-, 히드라진- 및 세미카르바지드-함유 아미노산은 상업용 출처로부터 입수가능하다. 예를 들어, L-글루타메이트-γ-히드라지드는 시그마 케미칼(미국 미조리주 세인트루이스 소재)로부터 입수가능하다. 시중 입수가능하지 않은 다른 아미노산은 당업자에 의해 제조될 수 있다. 예컨대, 본원에 참고로 인용되는 U.S. 특허 No. 6,281,211을 참고한다.
히드라지드, 히드라진 또는 세미카르바지드 작용기를 갖는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 함유하는 폴리펩티드는 유사한 화학적 반응성을 갖는 알데히드 또는 기타 작용기를 함유하는 각종 분자와 효율적으로 또한 선택적으로 반응할 수 있다. 예컨대, [Shao, J. 및 Tam, J., J. Am. Chem . Soc . 117: 3893-3899(1995)]를 참고한다. 히드라지드, 히드라진 및 세미카르바지드 작용기의 특유의 반응성은 그것들을 20개의 통상의 아미노산에 존재하는 친핵성 기(세린 또는 트레오닌의 히드록실기, 또는 N-말단의 리신 및 아미노기를 비제한적 예로 포함함)에 비해, 알데히드, 케톤 및 기타 친전자성 기에 대해 상당히 더 반응성이도록 만든다.
C. 아미노옥시 -함유 아미노산
아미노옥시(이는 히드록실아민으로도 불림) 기를 함유하는 비천연적으로 코딩된 아미노산은 각종 친전자성 기와의 반응을 하용하여, 접합체(PEG 또는 기타 수용성 중합체를 갖는 것을 비제한적 예로 포함함)를 형성시킨다. 히드라진, 히드라지드 및 세미카르바지드와 같이, 아미노옥시기의 증진된 친핵성은 그것이 유사한 화학적 반응성을 갖는 알데히드 또는 기타 작용기를 함유하는 각종 분자와 효율적으로 또한 선택적으로 반응하도록 한다. 예컨대, [Shao, J. 및 Tam, J., J. Am. Chem. Soc . 117: 3893-3899(1995); H. Hang 및 C. Bertozzi, Acc . Chem . Res. 34: 727-736(2001)]를 참고한다. 히드라진기와의 반응 결과가 상응하는 히드라존인 반면, 옥심은 일반적으로 아미노옥시기와 카르보닐-함유 기, 예컨대 케톤과의 반응으로부터 비롯된다.
아미노옥시기를 함유하는 예시적 아미노산은 하기와 같이 표시될 수 있다:
Figure 112007014691585-PCT00013
(식 중에서, n은 0 내지 10이고; R1은 알킬, 아릴, 치환 알킬, 또는 치환 아릴이거나 존재하지 않으며; X은 O, N, S이거나 존재하지 않고; m은 0 내지 10이며; Y=C(O)이거나 존재하지 않고; R2는 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 아미노 말단 변형기이고, R3은 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 카르복시 말단 변형기임). 일부 실시양태들에서, n은 1이고, R1은 페닐이며, X는 O이고, m은 1이며, Y는 존재한다. 일부 실시양태들에서, n은 2이고, R1 및 X는 존재하지 않으며, m은 0이고, Y는 존재하지 않는다.
아미노옥시-함유 아미노산은 용이하게 입수가능한 아미노산 전구체(호모세린, 세린 및 트레오닌)로부터 제조될 수 있다. 예컨대, [M. Carrasco 및 R. Brown, J. Org . Chem . 68: 8853-8858(2003)]를 참고한다. 특정 아미노옥시-함유 아미노산, 예컨대 L-2-아미노-4-(아미노옥시) 부티르산)은 천연 출처로부터 단리되었다[Rosenthal, G., Life Sci. 60: 1635-1641(1997)]. 다른 아미노옥시-함유 아미노산이 당업자에 의해 제조될 수 있다.
D. 아지드 및 알킨 반응성 기
아지드 및 알킨 작용기의 특유의 반응성은 그것들을 폴리펩티드 및 기타 생물학적 분자의 선택적 변형에 특히 유용하도록 만든다. 유기 아지드, 특히 지방족 아지드 및 알킨은 일반적으로 통상의 반응성 화학적 조건에 대해 안정하다. 특히, 아지드 및 알킨 작용기은 모두 천연 발생 폴리펩티드에서 발견되는 20개의 통상의 아미노산의 측쇄(즉, R기)에 대해 불활성이다. 그러나 가까이 근접하면, 아지드 및 알킨기의 "스프링-부하(spring-loaded)" 성질이 나타나고, 그것들은 휘스겐 [3+2] 시클로부가 반응을 통해 선택적으로 또한 효율적으로 반응하여, 상응하는 트리아졸을 발생시킨다. 예컨대, [Chin J. 등, Science 301: 964-7(2003); Wang, Q. 등, J. Am. Chem . Soc . 125, 3192-3193(2003); Chin, J. W. 등, J. Am. Chem . Soc . 124: 9026-9027(2002)]을 참고한다.
휘스겐 시클로부가 반응이 친핵성 치환보다는 선택적 시클로부가 반응과 관련되기 때문에(예컨대, [Padwa, A., COMPREHENSIVE ORGANIC SYNTHESIS, 제4권, (편저 Trost, B. M., 1991), p. 1069-1109; Huisgen, R. 1,3-DIPOLAR CYCLOADDITION CHEMISTRY(편저 Padwa, A., 1984), p. 1-176)] 참고), 아지드 및 알킨-함유 측쇄를 갖는 비천연적으로 코딩된 아미노산의 혼입은 수득되는 폴리펩티드가 비천연적으로 코딩된 아미노산의 위치에서 선택적으로 변형되도록 한다. 아지드 또는 알킨-함유 BSP와 관련된 시클로부가 반응은, Cu(II)를 Cu(I)로 인시츄 환원시키기 위한 환원제의 존재 하에, (촉매량의 CuS04의 형태의 것을 비제한적 예로 포함하는) Cu(II)을 첨가함으로써 수성 조건 하에서 실온에서 수행될 수 있다. 예컨대, [Wang, Q. 등, J. Am. Chem . Soc . 125, 3192-3193(2003); Tornoe, C. W. 등, J. Org . Chem . 67: 3057-3064(2002); Rostovtsev 등, Angew . Chem . Int . Ed. 41: 2596-2599(2002)]를 참고한다. 예시적 환원제에는 아스코르베이트, 금속성 구리, 퀴닌, 히드로퀴논, 비타민 K, 글루타티온, 시스테인, Fe2 +, Co2 +, 및 인가 전기 포텐셜이 비제한적 예로 포함된다.
일부 경우들에서, 아지드와 알킨 사이의 휘스겐 [3+2] 시클로부가 반응이 요망되는 경우, BSP는 알킨 부분을 포함하는 비천연적으로 코딩된 아미노산, 및 아지드 부분을 포함하는 아미노산에 부착된 수용성 중합체를 포함한다. 대안적으로, 역반응(즉, 수용성 중합체 상에 존재하는 아미노산 및 알킨 부분 상의 아지드 부분과의 반응)도 또한 수행될 수 있다.
아지드 작용기는 또한 아릴 에스테르를 함유하는 수용성 중합체와 선택적으로 반응하고, 아릴 포스핀 부분으로 적절히 관능화되어, 아미드 연결기를 발생시킬 수 있다. 아릴 포스핀기는 인시츄 아지드를 환원시키고, 이어서 수득된 아민은 인접 에스테르 연결기와 효율적으로 반응하여, 상응하는 아미드를 발생시킨다. 예컨대, [E. Saxon 및 C. Bertozzi, Science 287, 2007-2010(2000)]를 참고한다. 아지드(p-아지드-함유 아미노산은 알킬 아지드(2-아미노-6-아지도-1-헥산산) 또는 아릴 아지드-아지도-페닐알라닌을 비제한적 예로 포함함)일 수 있다.
아릴 에스테르 및 포스핀 부분을 함유하는 예시적 수용성 중합체는 하기와 같이 표시될 수 있다:
Figure 112007014691585-PCT00014
(식 중에서, X는 O, N, S이거나 존재하지 않을 수 있고, Ph는 페닐이며, W는 수용성 중합체이고, R은 H, 알킬, 아릴, 치환 알킬 및 치환 아릴기일 수 있음). 예시적 R 기에는 -CH2, -C(CH3), -OR', -NR'R", -SR', -할로겐, -C(O)R', -CONR'R", -S(O)2R', -S(O)2NR'R", -CN 및 -NO2가 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. R', R", R"' 및 R""는 각기 독립적으로 수소, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 1 내지 3개 할로겐로 치환된 아릴을 비제한적 예로 포함하는 아릴 치환, 치환 또는 비치환 알킬, 알콕시 또는 티오알콕시기, 또는 아릴알킬기를 가리킬 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 화합물이 1개 초과의 R 기를 포함하는 경우, 각 R 기는 이 기들 중 1개 초과가 존재하는 경우의 R', R", R"' 및 R"" 기와 같이 독립적으로 선택된다. R' 및 R"기가 동일한 질소 원자에 결합하는 경우, 그것은 질소 원자와 조합되어, 5-, 6- 또는 7-원 환을 형성할 수 있다. 예를 들어, -NR'R"는 1-피롤리디닐 및 4-모르폴리닐을 비제한적 예로 포함하는 것을 의미한다. 치환기의 상기 논의로부터, 당업자는 용어 "알킬"은 수소가 아닌 기에 결합된 탄소 원자를 포함하는 기, 예컨대 할로알킬(-CF3 및 -CH2CF3을 비제한적 예로 포함함) 및 아실(-C(O)CH3, -C(O)CF3, -C(O)CH2OCH3 등을 비제한적 예로 포함함)를 포함하는 것을 의미함을 이해할 것이다.
아지드 작용기는 또한 티오 에스테르를 함유하는 수용성 중합체와 선택적으로 반응하여, 아릴 포스핀 부분으로 적절히 관능화되어, 아미드 연결기를 발생시킬 수 있다. 아릴 포스핀기는 인시츄 아지드를 환원시키고, 이어서 수득된 아민은 티오에스테르 연결기와 효율적으로 반응하여, 상응하는 아미드를 발생시킨다. 티오에스테르 및 포스핀 부분을 함유하는 예시적 수용성 중합체는 하기와 같이 표시될 수 있다:
Figure 112007014691585-PCT00015
(식 중에서, n은 1-10이고; X는 O, N, S이거나 존재하지 않을 수 있으며, Ph는 페닐이고, W는 수용성 중합체임).
예시적 알킨-함유 아미노산은 하기와 같이 표시될 수 있다:
Figure 112007014691585-PCT00016
(식 중에서, n은 0 내지 10이고; R1은 알킬, 아릴, 치환 알킬, 또는 치환 아릴이거나 존재하지 않으며; X은 O, N, S이거나 존재하지 않고; m은 0 내지 10이며, R2는 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 아미노 말단 변형기이고, R3은 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 카르복시 말단 변형기임). 일부 실시양태들에서, n은 1이고, R1은 페닐이며, X는 존재하지 않고, m은 0이며, 아세틸렌 부분은 알킬 측쇄에 대해 파라 위치에 위치한다. 일부 실시양태들에서, n은 1이고, R1은 페닐이며, X는 0이고, m은 1이고, 프로파르길옥시기는 알킬 측쇄에 대해 파라 위치에 위치한다(즉, 0-프로파르길-티로신). 일부 실시양태들에서, n은 1이고, R1 및 X는 존재하지 않으며, m은 0이다(즉, 프로파르길글리신).
알킨-함유 아미노산은 시중 입수가능하다. 예를 들어, 프로파르길글리신은 펩테크(Peptech)(미국 메사츄세츠주 버링톤 소재)로부터 시중 입수가능하다. 대안적으로, 알킨-함유 아미노산은 표준 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, p-프로파르길옥시페닐알라닌은 예를 들어 [Deiters, A., 등, J. Am. Chem . Soc . 125: 11782-11783(2003)]에 기재된 바대로 합성될 수 있고, 4-알키닐-L-페닐알라닌은 [Kayser, B. 등, Tetrahedron 53(7): 2475-2484(1997)]에 기재된 바대로 합성될 수 있다. 다른 알킨-함유 아미노산은 당업자에 의해 제조될 수 있다.
예시적 아지드-함유 아미노산 하기와 같이 표시될 수 있다:
Figure 112007014691585-PCT00017
(식 중에서, n은 0 내지 10이고; R1은 알킬, 아릴, 치환 알킬, 치환 아릴이거나 존재하지 않으며; X은 O, N, S이거나 존재하지 않고; m은 0 내지 10이며; R2는 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 아미노 말단 변형기이고, R3은 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 카르복시 말단 변형기임). 일부 실시양태들에서, n은 1이고, R1은 페닐이며, X는 존재하지 않고, m은 0이며, 아지드 부분은 알킬 측쇄에 대해 파라 위치에 위치한다. 일부 실시양태들에서, n은 0-4이고, R1 및 X는 존재하지 않으며, m=0이다. 일부 실시양태들에서, n은 1이고, R1은 페닐이며, X는 O이고, m은 2이며, β-아지도에톡시 부분은 알킬 측쇄에 대해 파라 위치에 위치한다.
아지드-함유 아미노산은 상업용 출처로부터 입수가능하다. 예를 들어, 4-아지도페닐알라닌은 켐-임펙스 인터내셔널(Chem-Impex International, Inc.)(미국 일리노이즈주 우드데일 소재)로부터 수득될 수 있다. 시중 입수가능하지 않은 아지드-함유 아미노산에 대해, 아지드기는 적당한 이탈기(할라이드, 메실레이트, 토실레이트를 비제한적 예로 포함함)의 치환, 또는 적당히 보호된 락톤의 개방(opening)을 통해(단, 이에 제한되지 않음), 당업자에게 공지된 표준 방법을 이용하여 비교적 용이하게 제조될 수 있다. 예컨대, [Advanced Organic Chemistry, March(제3판, 1985, Wiley and Sons, New York)]을 참고한다.
E. 아미노티올 반응성 기
베타-치환 아미노티올 작용기의 특유의 반응성은 티아졸리딘의 형성을 통해, 폴리펩티드, 및 알데히드기를 함유하는 기타 생물학적 분자의 선택적 변형에 매우 유용하도록 만든다. 예컨대, [J. Shao 및 J. Tam, J. Am. Chem . Soc . 1995, 117(14) 3893-3899]를 참고한다. 일부 실시양태들에서, 베타-치환 아미노티올 아미노산은 BSP에 혼입된 후, 알데히드 작용기를 함유하는 수용성 중합체와 반응할 수 있다. 일부 실시양태들에서, 수용성 중합체, 약물 접합체 또는 기타 탑재체(payload)를 티아졸리딘의 형성을 통해 베타-치환 아미노티올 아미노산을 포함하는 BSP에 결합될 수 있다.
비천연 아미노산의 세포성 흡수
진핵생물 세포에 의한 비천연 아미노산 흡수는 단백질로의 혼입을 위해(단, 이에 제한되지 않음) 비천연 아미노산을 설계하고 선택할 때 전형적으로 고려되는 관건이다. 예를 들어, α-아미노산의 고전하 밀도는 이 화합물이 세포 투과가 어려울 수 있음을 제시한다. 천연 아미노산은 단백질-기재 수송 시스템의 수집을 통해 진핵생물 세포로 흡수될 수 있다. 비천연 아미노산이 있는 경우, 어떠한 비천연 아미노산이 세포에 의해 흡수되는지를 평가하는 급속 스크린이 행해질 수 있다. 예를 들어, 독성 검정에 대해서는 예컨대 [발명의 명칭: "단백질 어레이(Protein Arrays)", 출원일: 2003년 12월 22일의 특허출원, 일련 번호 10/744,899 및 일련 번호 60/435,821(출원일: 2002년 12월 22일); 및 Liu, D.R. & Schultz, P.G.(1999) Progress toward the evolution of an organism with an expanded genetic code. PNAS United States 96: 4780-4785]을 참고한다. 흡수가 각종 검정을 이용하여 용이하게 분석되나, 세포성 흡수 경로에 수용적인 비천연 아미노산을 설계함에 있어 대안법은, 생체내 아미노산을 생성시키는 생합성 경로를 제공하는 것이다.
비천연 아미노산의 생합성
많은 생합성 경로가 아미노산 및 기타 화합물의 제조를 위해 세포 내에 이미 존재한다. 특별한 비천연 아미노산을 위한 생합성 방법이 진핵생물 세포 내를 비제한적 예로 포함하는 자연에 존재하지 않을 수 있으나, 본 발명은 그러한 방법을 제공한다. 예를 들어, 비천연 아미노산을 위한 생합성 경로는 임의적으로 새 효소를 첨가하거나, 현존 숙주 세포 경로를 변형시킴으로써 숙주 세포 내에 발생될 수 있다. 부가적 새 효소는 임의적으로 천연 발생 효소 또는 인공 진화된 효소이다. 예를 들어, p-아미노페닐알라닌의 생합성은(발명의 명칭이 "비천연 아미노산의 생체내 혼입(In vivo incorporation of unnatural amino acids)"인 WO 2002/085923에서 한 예로 제시됨) 다른 유기체로부터의 공지 효소들의 조합물을 첨가하는 것에 의존한다. 이 효소들을 위한 유전자는 유전자를 포함하는 플라스미드를 이용하여 세포를 형질변환시킴으로써 진핵생물 세포에 도입될 수 있다. 유전자는 세포 내에 발현될 때, 요망되는 화합물을 합성하기 위한 효소 경로를 제공한다. 임의적으로 첨가되는 효소의 유형의 예가 이하의 예들에서 제공된다. 부가적 효소 서열이 예를 들어, 유전자은행(Genbank)에 나와 있다. 인공 진화된 효소는 또한 동일한 방식으로 세포에 임의적으로 첨가된다. 이 방식으로, 세포 기작 및 세포의 리소스를 조작하여, 비천연 아미노산을 생성시킨다.
생합성 경로에 사용하기 위한, 또는 현존 경로를 진화하기 위한 신규 효소를 생성시키기 위해 각종 방법들이 이용가능하다. 예를 들어, 맥시겐 인코포레이티드(Maxygen, Inc.)(웹사이트 maxygen. com에서 이용가능함)에 의해 개발된(단, 이에 제한되지 않음) 재귀적 재조합을 임의적으로 이용하여, 신규 효소 및 경로를 개발한다. 예컨대, [Stemmer(1994), Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling, Nature 370(4): 389-391; 및 Stemmer(1994), DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution, Proc . Natl . Acad . Sci . USA., 91: 10747-10751]를 참고한다. 유사하게, 지넨코어(Genencor)(웹사이트 genencor.com에서 이용가능함)에 의해 개발된 디자인패쓰(DesignPath)TM를 임의적으로 이용하여, 세포 내 O-메틸-L-티로신을 생성시키기 위한 경로를 공학처리하기 위한(단, 이에 제한되지 않음) 대사 경로를 사용하여, 공학처리한다. 이 기술은 기능적 유전체학, 및 분자 진화 및 설계를 통해 확인된(단, 이에 제한되지 않음) 새 유전자들의 조합을 이용하는 숙주 유기체 내의 현존 경로를 재구축한다. 디벌사 코포레이션(Diversa Corporation)(웹사이트 diversa.com에서 이용가능함)은 또한 새 경로를 생성시키기 위한(단, 이에 제한되지 않음) 유전자의 라이브러리 및 유전자 경로를 급속히 스크리닝하는 기술을 제공한다.
전형적으로, 본 발명의 공학처리된 생합성 경로를 이용하여 생성된 비천연 아미노산은, 천연 세포내 양을 비제한적 예로 포함하는, 효율적인 단백질 생합성을 위해 충분한 농도로, 다만 다른 아미노산의 농도에 영향을 주거나, 세포 리소스를 소진하는 정도로는 아닌 농도로 생성된다. 이러한 식으로 생체내 생성된 전형적 농도는 약 10 mM 내지 약 0.05 mM이다. 일단 세포가 특정 경로 및 비천연 아미노산에 요망되는 효소를 생성시키기 위해 사용되는 유전자를 포함하는 플라스미드를 이용하여 형질전환되면, 생체내 선택을 임의적으로 사용하여, 리보솜내 단백질 합성 및 세포 성장 모두를 위한 비천연 아미노산의 생성을 더욱 최적화한다.
비천연 아미노산을 갖는 폴리펩티드
비천연 아미노산의 혼입은 단백질 구조 및/또는 기능 변화의 조정, 크기, 산도, 친핵도, 수소 결합, 소수도, 프로테아제 표적 부위의 접근성, (단백질 어레이를 위한(단, 이에 제한되지 않음)) 부분에 대한 표적화의 변화, 생물학적 활성 분자의 부가, 중합체 결합, 방사성핵종 결합, 혈청 반감기 조절, 조직 투과(예컨대, 종양) 조절, 활성 수성 조절, 조직, 세포 또는 기관 특이성 또는 분포 조절, 면역원성 조절, 프로테아제 내성 조절 등을 비제한적 예로 포함하는 각종 목적들을 위해 행해질 수 있다. 비천연 아미노산를 포함하는 단백질은 증진되거나 심지어 전적으로 새로운 촉매 또는 생물물리학적 성질을 가질 수 있다. 예를 들어, 비천연 아미노산을 단백질에 포함시킴으로써, 하기 성질들이 임의적으로 변형된다: 독성, 생체분포, 구조적 성질, 분광 성질, 화학적 및/또는 광화학적 성질, 촉매 능력, 반감기(혈청 반감기를 비제한적 예로 포함함), 공유 또는 비공유적으로(단, 이에 제한되지 않음) 다른 분자와 반응하는 능력 등, 1개 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 단백질이 포함된 조성물은, 신규 치료제, 진단제, 촉매 효소, 산업용 효소, 결합 단백질(항체를 비제한적 예로 포함함), 및 단백질 구조 및 기능의 연구를 위해(단, 이에 제한되지 않음) 유용하다. 예컨대, [Dougherty(2000) Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure and Function, Current Opinion in Chemical Biology, 4: 645-652]를 참고한다.
본 발명의 한 측면에서, 조성물은 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 이상, 또는 그 이상 개수를 비제한적 예로 포함하는 1개 이상의 비천연 아미노산을 갖는 1개 이상의 단백질을 포함한다. 비천연 아미노산은 동일하거나 상이할 수 있고, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개, 또는 그 이상 개수의 상이한 비천연 아미노산을 포함하는 단백질 내의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 또는 그 이상 개수의 상이한 부위일 수 있으나, 이를 비제한적 예로서 포함한다. 다른 한 측면에서, 조성물은 단백질 내에 존재하는 특별한 아미노산의 1개 이상, 단 전부보다는 적은 아미노산이 비천연 아미노산으로 치환된 단백질을 포함한다. 1개 초과의 비천연 아미노산을 갖는 소정의 단백질의 경우, 비천연 아미노산은 동일하거나 상이할 수 있다(단백질은 2개 이상의 상이한 유형의 비천연 아미노산을 포함하거나, 동일한 비천연 아미노산 2개를 포함할 수 있으나, 이를 비제한적 예로서 포함함). 2개 초과의 비천연 아미노산을 갖는 소정의 단백질의 경우, 비천연 아미노산은 동일하거나 상이하거나, 혹은 1개 이상의 상이한 비천연 아미노산을 갖는 동일 종류의 다수 비천연 아미노산의 조합물일 수 있다.
1개 이상의 비천연 아미노산을 갖는 관심 단백질 또는 폴리펩티드는 본 발명의 한 특징이다. 본 발명은 또한 본 발명의 조성물 및 방법을 이용하여 생성된 1개 이상의 비천연 아미노산을 갖는 폴리펩티드 또는 단백질을 포함한다. 부형제(약제학적으로 허용가능한 부형제를 비제한적 예로서 포함함)도 또한 단백질에 존재할 수 있다.
진핵생물 세포 내에 1개 이상의 비천연 아미노산을 갖는 관심 단백질 또는 폴리펩티드를 생성시킴으로써, 단백질 또는 폴리펩티드는 전형적으로 진핵생물 전사후 변형을 포함한다. 특정 실시양태들에서, 단백질은 진핵생물 세포에 의해 생체내 행해지는 1개 이상의 비천연 아미노산 및 1개 이상의 전사후 변형를 포함하고, 여기에서 전사후 변형은 원핵생물 세포에 의해 행해지지 않는다. 예를 들어, 번역후 변형에는 아세틸화, 아실화, 지질-변형, 팔미토일화, 팔미테이트 부가, 포스포릴화, 당지질-연결기 변형, 글리코실화 등이 비제한적 예로 포함된다. 한 측면에서, 전사후 변형에는 GlcNAC-아스파라긴 연결기에 의한 이당류((GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAC-GlcNAc)를 비제한적 예로서 포함함)의 아스파라긴에의 결합이 포함된다. 진핵생물 단백질의 N-연결 이당류의 몇가지 예를 열거하고 있는 표 1을 참고한다(부가적 잔기가 또한 존재할 수 있으나, 이는 나와 있지 않음). 다른 한 측면에서, 전사후 변형에는 a GalNAc-세린 또는 GalNAc-트레오닌 연결기 또는 GlcNAc-세린 또는 GlcNAC-트레오닌 연결기에 의한 이당류(Gal-GalNAc, Gal-GlcNAc 등을 비제한적 예로서 포함함)의 세린 또는 트레오닌에의 결합이 포함된다.
[ GlcNac - 연결기를 통한 올리고당의 예]
Figure 112007014691585-PCT00018
또 다른 한 측면에서, 번역후 변형에는 전구체(칼시토닌 전구체, 칼시토닌 유전자-관련 펩티드 전구체, 프레프로파라티로이드 호르몬, 프리프로인슐린, 프로인슐린, 프레프로-오피도멜라노코르틴, 프로-오피도멜라노코르틴 등을 비제한적 예로서 포함함)의 단백질분해 가공, 다중 서브유니트 단백질로의 어셈블리, 또는 거대분자 어셈블리, 세포내 다른 한 부위(세포소기관, 예컨대 소포체, 골지체, 핵, 리소좀, 퍼옥시좀, 미토콘드리아, 엽록체, 액포 등을 비제한적 예로서 포함함, 또는 분비 경로를 통해)로의 번역이 포함된다. 특정 실시양태들에서, 단백질은 분비 또는 국지화 서열, 에피토프 택, FLAG 택, 폴리히스티딘 택, GST 융합, 등을 포함한다.
비천연 아미노산의 한 이점은, 그것이 부가적 분자를 부가하는데 사용될 수 있는 부가적 화학적 부분을 제공한다는 것이다. 이 변형들은 진핵생물 또는 비진핵생물 세포에서 생체내, 또는 생체외 행해질 수 있다. 따라서, 특정 실시양태들에서, 전사후 변형은 비천연 아미노산을 통해 이루어진다. 예를 들어, 전사후 변형은 친핵성-친전자성 반응을 통해 이루어질 수 있다. 단백질의 선택적 변형을 위한 대부분의 반응들은α-할로케톤과 히스티딘 또는 시스테인 측쇄과의 반응을 비제한적 예로 포함하는, 친핵성 및 친전자성 반응 상대 사이의 공유 결합 형성을 포함한다. 이들 경우에서의 선택도는 단백질 내의 친핵성 잔기의 수 및 접근성에 의해 구해진다. 본 발명의 단백질에서, 생체외 및 생체내 비천연 케토-아미노산과 히드라지드 또는 아미노옥시 화합물의 반응과 같은 다른 더욱 선택적인 반응이 사용될 수 있다. 예컨대, [Comish 등(1996) J. Am. Chem . Soc ., 118: 8150-8151; Mahal 등(1997) Science, 276: 1125-1128; Wang 등(2001) Science 292: 498-500; Chin 등(2002) J. Am. Chem . Soc . 124: 9026-9027; Chin 등(2002) Proc . Natl . Acad . Sci ., 99: 11020-11024; Wang 등(2003) Proc . Natl . Acad . Sci ., 100: 56-61; Zhang 등(2003) Biochemistry, 42: 6735-6746; 및, Chin 등(2003) Science, 301: 964-7]를 참고한다. 이는 형광발색단, 가교제, 당 유도체 및 세포독성 분자를 포함한 시약의 숙주로 실질적으로 임의의 단백질을 선택적으로 표지할 수 있도록 한다. 또한 [본원에 각기 참고로 인용되는, U.S. 가특허 출원 일련 No. 60/419,265(2002년 10월 16일 출원), U.S. 가특허 출원 일련 No. 60/420,990(2002년 10월 23일 출원), 및 U.S. 가특허 출원 일련 No. 60/441,450(2003년 1월 16일 출원)을 기초로 한, U.S. 특허 출원 일련 No. 10/686,944(발명의 명칭: "당단백질 합성(Glycoprotein synthesis)", 2003년 10월 15일 출원)]을 참고한다. 아지도 아미노산을 통한(단, 이에 제한되지 않음) 전사후 변형은 또한 (트리아릴포스핀 시약을 이용하여(단, 이에 제한되지 않음)) 스타우딘거 결찰을 통해 행해질 수 있다. 예컨대, [Kiick 등(2002) Incorporation of azides into recombinant proteins for chemos elective modification by the Staudinger ligation, PNAS 99: 19-24]를 참고한다.
본 발명은 아지드 또는 알키닐 부분을 함유하는(단, 이에 제한되지 않음) 비천연 아미노산을 셀렉터 코돈에 대한 반응으로 단백질에 유전적으로 혼입하는 것을 포함하는, 단백질의 선택적 변형을 위한 다른 한 매우 효율적인 방법을 제공한다. 이어서, 이 아미노산 측쇄들을, 각기 알키닐 또는 아지드 유도체를 이용하여(단, 이에 제한되지 않음), 휘스겐 [3+2] 시클로부가 반응에 의해(단, 이에 제한되지 않음) 변형시킬 수 있다(예컨대, [Padwa, A. Comprehensive Organic Synthesis, 제4권(1991) 편저: Trost, B. M., Pergamon, Oxford, p. 1069-1109; 및 Huisgen, R. 1,3-Dipolar Cycloaddition Chemistry(1984) Ed. Padwa, A., Wiley, New York, p. 1-17)]를 참고한다). 이 방법은 친핵성 치환보다는 시클로부가를 포함하기 때문에, 단백질은 극히 높은 선택도로 변형될 수 있다. 이 반응은, 촉매량의 Cu(I) 염을 반응 혼합물에 첨가함으로써, 우수한 위치선택도(1,4>1,5)로 수성 조건 하에서 실온에서 수행될 수 있다. 예컨대, [Tornoe 등(2002) J. Org. Chem. 67: 3057-3064; 및 Rostovtsev 등(2002) Angew . Chem . Int . Ed. 41: 2596-2599]를 참고한다. 사용될 수 있는 다른 한 방법은 테트라시스테인 모티프를 갖는 비스-비소형 화합물에서의 리간드 교환이며, 이에 대해 예컨대, [Griffin 등(1998) Science 281: 269-272]를 참고한다.
[3+2] 시클로부가를 통해 본 발명의 단백질에 첨가될 수 있는 분자에는 아지드 또는 알키닐 유도체를 갖는 실질적으로 임의의 분자가 포함된다. 분자에는 염료, 형광발색단, 가교제, 당 유도체, 중합체(폴리에틸렌 글리콜의 유도체를 비제한적 예로서 포함함), 광가교제, 세포독성 화합물, 친화도 표지, 비오틴의 유도체, 수지, 비이드, 제2 단백질 또는 폴리펩티드(또는 그 이상), 폴리뉴클레오티드(들)(DNA, RNA 등을 비제한적 예로서 포함함), 금속 킬레이터, 보조인자, 지방산, 탄수화물 등이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 이 분자들은 p-프로파르길옥시페닐알라닌을 비제한적 예로 포함하는 알키닐기, 또는 p-아지도-페닐알라닌을 비제한적 예로 포함하는 아지도기를 갖는 비천연 아미노산에 각기 부가될 수 있다.
V. 비유전적으로-코딩된 아미노산을 포함하는 BSP 의 생체내 발생
본 발명의 BSP는 변형된 tRNA 및 tRNA 합성효소를 이용하여 생체내 발생되어, 천연 발생 시스템에서 코딩되지 않는 아미노산에 부가되거나 그 아미노산을 치환할 수 있다.
천연 발생 시스템에서 코딩되지 않는 아미노산을 사용하여 tRNA 및 tRNA 합성효소를 발생시키는 방법이 예컨대, [본원에 각기 참고로 인용되는, U.S. 특허 출원 공보 2003/0082575(일련 No. 10/126,927) 및 2003/0108885(일련 No. 10/126,931)]에 기재되어 있다. 이 방법들은 번역 시스템에 대해 내인성인 합성효소 및 tRNA와 무관하게 기능하는 번역 기작을 발생시키는 것을 포함한다(이에 따라, 이는 경우에 따라 "직교성"으로 칭해진다). 전형적으로, 번역 시스템은 직교성 tRNA(O-tRNA) 및 직교성 아미노아실 tRNA 합성효소(O-RS)를 포함한다. 전형적으로, O-RS는 우선적으로 O-tRNA를 번역 시스템 내 1개 이상의 비천연 발생 아미노산을 이용하여 아미노아실화하고, O-tRNA는 시스템 내 다른 tRNA에 의해 인식되지 않는 1개 이상의 셀렉터 코돈을 인식한다. 이에 따라, 번역 시스템은 코딩된 셀렉터 코돈에 대한 반응으로 시스템 내 생성된 단백질에 비천연적으로 코딩된 아미노산을 삽입함으로써, 아미노산을 코딩된 폴리펩티드 내의 위치로 "치환"시킨다.
특별한 합성 아미노산을 폴리펩티드에 삽입하기 위한 매우 다양한 직교성 tRNA 및 아미노아실 tRNA 합성효소가 당업계에 기재되었고, 이는 일반적으로 본 발명에 사용하기에 적당하다. 예를 들어, 케토-특이적 0-tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소가 [Wang, L. 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 100: 56-61(2003) 및 Zhang, Z. 등, Biochem. 42(22): 6735-6746(2003)]에 기재되어 있다. 예시적 O-RS, 또는 그것의 부분은 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되며, 이는 본원에 각기 참고로 인용되는, U.S. 특허 출원 공보 2003/0082575 및 2003/0108885에 개시된 아미노산 서열을 포함한다. O-RS와 함께 사용하기 위한 상응하는 O-tRNA 분자가 또한 본원에 각기 참고로 인용되는, U.S. 특허 출원 공보 2003/0082575(일련 No. 10/126,927) 및 2003/0108885(일련 No. 10/126,931)에 기재되어 있다.
아지드-특이적 O-tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소 시스템의 한 예가 [Chin, J. W. 등, J. Am. Chem . Soc . 124: 9026-9027(2002)]에 기재되어 있다. p-아지도-L-Phe을 위한 예시적 0-RS 서열에는, 본원에 참고로 인용되는 U.S. 특허 출원 공보 2003/0108885(일련 No. 10/126,931)에 개시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열 서열 번호 14-16 및 29-32, 및 아미노산 서열 서열 번호 46-48 및 61-64가 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 본 발명에 사용하기에 적당한 예시적 O-tRNA 서열에는 본원에 참고로 인용되는 U.S. 특허 출원 공보 2003/0108885(일련 No. 10/126,931)에 개시된 뉴클레오티드 서열 서열 번호 1-3가 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 특별한 비천연적으로 코딩된 아미노산에 특이적인 O-tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소 쌍의 다른 예가 본원에 참고로 인용되는 U.S. 특허 출원 공보 2003/0082575(일련 No. 10/126,927)에 기재되어 있다. S. 세레비지아에(S. cerevisiae) 내에 케토- 및 아지드-함유 아미노산이 모두 혼입된 0-RS 및 O-tRNA가 [Chin, J. W. 등, Science 301: 964-967(2003)]에 기재되어 있다.
O-tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소의 사용은 비천연적으로 코딩된 아미노산을 코딩하는 특정 코돈을 선택하는 것을 포함한다. 임의의 코돈이 사용될 수 있으나, 일반적으로 0-tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소가 발현되는 세포에 거의 사용되지 않거나 절대 사용되지 않는 코돈을 선택하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 예시적 코돈에는 넌센스 코돈, 예컨대 중지 코돈(앰버, 오커 및 오팔), 4개 이상의 염기 코돈, 및 거의 사용되지 않거나 절대 사용되지 않는 기타 천연 3-염기 코돈이 포함된다.
특정 셀렉터 코돈(들)은 당업계에 공지된 변이유발 방법(이를 비제한적 예로서 포함함 부위-특이적 변이유발, 카세트 변이유발, 제한 선택 변이유발 등)을 이용하여 GLP-1 폴리뉴클레오티드 코딩 서열 내의 적당한 위치에 도입될 수 있다.
비천연적으로 코딩된 아미노산을 혼입시키는데 사용될 수 있는, 단백질 생합성 기작의 성분, 예컨대 O-RSs, O-tRNA 및 직교성 O-tRNA/O-RS 쌍을 발생시키는 방법이 [Wang, L. 등, Science 292: 498-500(2001); Chin, J. W. 등, J. Am. Ghem . Soc. 124: 9026-9027(2002); Zhang, Z. 등, Biochemistry 42: 6735-6746(2003)]에 기재되어 있다. 비천연적으로 코딩된 아미노산의 생체내 혼입을 위한 방법 및 조성물이 본원에 참고로 인용되는 U.S. 특허 출원 공보 2003/0082575(일련 No. 10/126,927)에 기재되어 있다. 유기체의 생체내 번역 시스템에 사용하기 위한 직교성 tRNA-tRNA 합성효소 쌍을 선택하는 방법이 또한 본원에 참고로 인용되는 U.S. 특허 출원 공보 2003/0082575(일련 No. 10/126,927) 및 2003/0108885(일련 No. 10/126,93 1)에 기재되어 있다.
1개 이상의 재조합 직교성 아미노아실-tRNA 합성효소(O-RS)를 생성시키는 방법은 (a) 원핵생물 유기체, 예컨대 메타노코커스 자나쉬이 , 메타노박테리움 써모오 토트로피쿰, 할로박테리움 , 에스케리치아 콜라이 , A. 풀기더스 , P. 푸리오서스 , P. 호리코쉬이, A. 퍼닉스 , T. 써모필러스 등을 비제한적 예로 포함하는 원핵생물 유기체로부터의 1개 이상의 아미노아실-tRNA 합성효소(RS)에서 유래된 (임의적으로 변이체) RS의 라이브러리를 발생시키고(시키거나); (b) 비천연적으로 코딩된 아미노산 및 천연 아미노산의 존재 하에 직교성 tRNA(O-tRNA)를 아미노아실화하는 구성원에 대한 RS(임의적으로는 변이체 RS)의 라이브러리의 선택(및/또는 스크리닝)함으로써, 활성 (임의적으로 변이체) RS의 풀을 제공하고(하거나); (c) 비천연적으로 코딩된 아미노산의 부재 하에 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하는 활성 RS(변이체 RS를 비제한적 예로서 포함함)에 대한 풀을 선택(임의적으로는 음성 선택을 통해)함으로써, 1개 이상의 재조합 O-RS를 제공하는 것(여기에서, 1개 이상의 재조합 O-RS는 O-tRNA를 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 우선적으로 아미노아실화함)을 포함한다.
한 실시양태에서, RS는 불활성 RS이다. 불활성 RS는 활성 RS를 변이화함으로써 발생될 수 있다. 예를 들어, 불활성 RS는 약 1개 이상, 약 2개 이상, 약 3개 이상, 약 4개 이상, 약 5개 이상, 약 6개 이상 또는 약 10개 이상, 또는 그 이상 개수의 아미노산을 알라닌을 비제한적 예로 포함하는 다른 아미노산으로 변이화함으로써 발생될 수 있다.
변이체 RS의 라이브러리는 단백질 3차원 RS 구조에 기초한 합리적 설계, 또는 무작위 또는 합리적 기법에서의 RS 뉴클레오티드의 변이유발을 비제한적 예로 포함하는, 당업계에 공지된 각종 기법들을 이용하여 발생될 수 있다. 예를 들어, 변이체 RS는 부위-특이적 변이, 무작위 변이, 다양성 발생 재조합 변이, 키메라 구축물, 합리적 설계에 의해, 또한 본원에 기재되거나 당업계에 공지된 다른 방법에 의해 발생될 수 있다.
한 실시양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산 및 천연 아미노산의 존재 하에 직교성 tRNA(O-tRNA)를 아미노아실화하는(단, 이에 제한되지 않음) 활성 원에 대한 RS(임의적으로는 변이체 RS)의 라이브러리의 선택(및/또는 스크리닝)은 항생제 내성 유전자 등을 비제한적 예로 포함하는 양의 선택 또는 스크리닝 마커, 및 (임의적으로 변이체) RS의 라이브러리를 복수개의 세포에 도입하고(여기에서, 양의 선택 및/또는 스크리닝 마커는, 앰버, 오커 또는 오팔 코돈을 비제한적 예로 포함하는 1개 이상의 셀렉터 코돈을 포함함); 선택제의 존재 하에 복수개의 세포를 성장시키며; 양의 선택 또는 스크리닝 마커의 존재 하에 1개 이상의 셀렉터 코돈을 억제함으로써 선택 및/또는 스크리닝제의 존재 하에 생존하는(또는 특정 반응을 나타내는) 세포를 동정하고, 이로써 활성 (임의적으로 변이체) RS의 풀을 갖는 양의 선택 세포의 서브세트를 제공하는 것을 포함한다. 임의적으로, 선택 및/또는 스크리닝제 농도를 변화시킬 수 있다.
한 측면에서, 양의 선택 마커는 클로르암페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT) 유전자이고, 셀렉터 코돈은 CAT 유전자 내의 앰버 중지 코돈이다. 임의적으로, 양의 선택 마커는 β-락타마제 유전자이고, 셀렉터 코돈은 β-락타마제 유전자 내의 앰버 중지 코돈이다. 다른 한 측면에서, 양의 스크리닝 마커는 형광 또는 발광 스크리닝 마커, 또는 친화도 기재 스크리닝 마커(세포 표면 마커를 비제한적 예로서 포함함)이다.
한 실시양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산의 부재 하에 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하는 활성 RS(임의적으로 변이체)에 대한 풀을 음으로 선택 또는 스크리닝하는 것은, 양의 선택 또는 스크리닝으로부터의 활성 (임의적으로 변이체) RS의 풀을 갖는 음의 선택 또는 스크리닝 마커를 제2 유기체의 복수개의 세포에 도입하고(여기에서, 음의 선택 또는 스크리닝 마커는 1개 이상의 셀렉터 코돈(클로르암페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT) 유전자를 비제한적 예로 포함하는 항생제 내성 유전자를 비제한적 예로서 포함함)을 포함함); 비천연적으로 코딩된 아미노산 및 스크리닝 또는 선택제로 보충된 제1 배지에서의 특정 스크리닝 반응을 나타내거나 생존하나, 비천연적으로 코딩된 아미노산 및 선택 또는 스크리닝제로 보충되지 않은 제2 배지에서 특정 반응을 나타내거나 생존하지 못하는 세포를 동정함으로써, 1개 이상의 재조합 O-RS을 갖는 생존 세포 또는 스크리닝된 세포를 제공하는 것을 포함한다. 예를 들어, CAT 동정 프로토콜은 임의적으로 적절한 O-RS 재조합을 구함에 있어 양의 선택 및/또는 음의 스크리닝으로서 작용한다. 예를 들어, 클론의 풀은 임의적으로 1개 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산이 있거나 없는 (1개 이상의 셀렉터 코돈을 포함하는) CAT를 함유하는 성장판에서 복제된다. 이에 따라, 비천연적으로 코딩된 아미노산을 함유하는 판에서 독점적으로 성장하는 콜로니는 재조합 O-RS를 함유하는 것으로 간주된다. 한 측면에서, 선택 (및/또는 스크리닝) 제의 농도는 변화된다. 일부 측면들에서, 제1 및 제2 유기체는 상이하다. 따라서, 제1 및/또는 제2 유기체는 임의적으로 원핵생물, 진핵생물, 포유류, 에스케리치아 콜라이, 진균류, 효모, 고세균, 혐기세균, 식물, 곤충, 원생생물 등을 포함한다. 다른 실시양태들에서, 스크리닝 마커는 형광 또는 발광 스크리닝 마커, 또는 친화도 기재의 스크리닝 마커를 포함한다.
다른 한 실시양태에서, 활성 (임의적으로 변이체) RS를 위한 풀을 스크리닝 또는 선택하는 것(음으로 선택하는 것을 비제한적 예로서 포함함)은, 양의 선택 단계 (b)로부터 활성 변이체 RS의 풀을 단리하고; 음의 선택 또는 스크리닝 마커(여기에서, 음의 선택 또는 스크리닝 마커는 1개 이상의 셀렉터 코돈(1개 이상의 셀렉터 코돈을 포함하는 리보뉴클레아제 바나제 유전자를 비제한적 예로 포함하는 독성 마커 유전자를 비제한적 예로서 포함함)를 포함함), 및 활성 (임의적으로 변이체) RS의 풀을 제2 유기체의 복수개의 세포에 도입하고; 비천연적으로 코딩된 아미노산 및 스크리닝 또는 선택제로 보충된 제1 배지에서의 특정 스크리닝 반응을 나타내거나 생존하나, 비천연적으로 코딩된 아미노산 및 선택 또는 스크리닝제로 보충되지 않은 제2 배지에서 특정 반응을 나타내거나 생존하지 못하는 세포를 동정함으로써, 1개 이상의 재조합 O-RS(여기에서, 1개 이상의 재조합 O-RS는 비천연적으로 코딩된 아미노산에 대해 특이적임)을 갖는 생존 세포 또는 스크리닝된 세포를 제공하는 것을 포함한다. 한 측면에서, 1개 이상의 셀렉터 코돈은 약 2개 이상의 셀렉터 코돈을 포함한다. 그러한 실시양태들은 임의적으로 1개 이상의 셀렉터 코돈가 2개 이상의 셀렉터 코돈을 포함하는 경우, 및 제1 및 제2 유기체가 상이한 경우(각 유기체는 임의적으로 비제한적 예로서 원핵생물, 진핵생물, 포유류, 에스케리치아 콜라이, 진균류, 효모, 고세균, 진정세균, 식물, 곤충, 원생생물 등임을 비제한적 예로 포함함)를 포함할 수 있다. 또한, 일부 측면들은 음의 선택 마커가 (1개 이상의 셀렉터 코돈을 포함하는) 리보뉴클레아제 바나제 유전자를 포함하는 경우를 포함한다. 다른 측면들은 스크리닝 마커가 임의적으로 형광 또는 발광 스크리닝 마커 또는 친화도 기재의 스크리닝 마커를 포함하는 경우를 포함한다. 여기에서의 실시양태들에서, 스크리닝 및/또는 선택은 임의적으로 스크리닝 및/또는 선택 엄격성의 변화를 포함한다.
한 실시양태에서, 1개 이상의 재조합 직교성 아미노아실-tRNA 합성효소(O-RS)의 제조 방법은 추가로 (d) 1개 이상의 재조합 O-RS를 단리하고; (e) 1개 이상의 재조합 O-RS로부터 유래된 (임의적으로 변이된) O-RS의 제2 세트를 발생시키며; (f) 우선적으로 O-tRNA를 아미노아실화하는 능력을 가지는 변이된 O-RS가 수득될 때까지 단계 (b) 및 (c)를 반복하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 임의적으로, 약 2배 이상(단, 이에 제한되지 않음)으로 단계 (d) 내지 (f)를 반복한다. 한 측면에서, 1개 이상의 재조합 O-RS로부터 유래된 변이된 O-RS의 제2 세트를, 무작위 변이유발, 부위-특이적 변이유발, 재조합 또는 이들의 조합법을 비제한적 예로 포함하는 변이유발에 의해 발생시킬 수 있다.
상기 방법들에 있어 양의 선택/스크리닝 단계 (b), 음의 선택/스크리닝 단계 (c) 또는 양 및 음의 선택/스크리닝 단계 (b) 및 (c) 모두를 비제한적 예로 포함하는 선택/스크리닝 단계의 엄격성은 선택/스크리닝 엄격성을 변화시키는 것을 임의적으로 포함한다. 다른 한 실시양태에서, 양의 선택/스크리닝 단계 (b), 음의 선택/스크리닝 단계 (c), 또는 양 및 음의 선택/스크리닝 단계 (b) 및 (c) 모두는 리포터의 사용을 포함하고, 여기에서 리포터는 형광-활성화된 세포 분류(FACS)에 의해 검출되거나, 리포터는 발광에 의해 검출된다. 임의적으로, 리포터는 파지 디스플레이 등 상에서 세포 표면에 표시되고, 비천연적으로 코딩된 아미노산 또는 유사체를 포함하는 친화도 또는 촉매 활성에 기초하여 선택된다. 한 실시양태에서, 변이된 합성효소는 파지 디스플레이 등 상에서 세포 표면에 표시된다.
재조합 직교성 tRNA(O-tRNA)의 제조 방법은 (a) 제1 유기체로부터 억제자 tRNA를 비제한적 예로 포함하는 1개 이상의 tRNA로부터 유래된 변이체 tRNA의 라이브러리를 발생시키고; (b) 제1 유기체로부터의 PS의 부재 하에 제2 유기체로부터의 아미노아실-tRNA 합성효소(RS)에 의해 아미노아실화되는 (임의적으로 변이체) tRNA에 대한 라이브러리를 선택(음의 선택을 비제한적 예로 포함함) 또는 스크니링함으로써, (임의적으로 변이체) tRNA의 풀을 제공하며; (c) 도입된 직교성 RS(O-RS)에 의해 아미노아실화되는 구성원에 대한 (임의적으로 변이체) tRNA의 풀을 선택 또는 스크리닝함으로써, 1개 이상의 재조합 O-tRNA를 제공하는 것(식 중에서, 1개 이상의 재조합 O-tRNA는 셀렉터 코돈을 인식하고, 제2 유기체로부터의 RS에 의해 효율적으로 인식되지 않고, O-RS에 의해 우선적으로 아미노아실화됨)을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 1개 이상의 tRNA는 억제자 tRNA이고/이거나, 천연 및/또는 비천연 염기의 특유의 3개 염기 코돈을 포함하거나 넌센스 코돈, 희소 코돈, 비천연 코돈, 4개 이상의 염기를 포함하는 코돈, 앰버 코돈, 오커 코돈 또는 오팔 중지 코돈이다. 한 실시양태에서, 재조합 O-tRNA는 직교성의 향상을 가진다. 일부 실시양태들에서, O-tRNA가 임의적으로 변형의 필요 없이 제2 유기체에서 제1 유기체로 이송되어짐이 인지될 것이다. 각종 실시양태들에서, 제1 및 제2 유기체는 동일하거나 상이하고, 원핵생물(메타노코커스 자나쉬이 ( Methanococcus jannaschii ), 메타노박테 리움 써모오토트로피쿰 ( Methanobacterium thermoautotrophicum ), 에스케리치아 콜라이 , 할로박테리움 ( Halobacterium) 등을 비제한적 예로 포함함), 진핵생물, 포유류, 진균류, 효모, 고세균, 진정세균, 식물, 곤충, 원생생물으로부터(단, 이에 제한되지 않음) 임의적으로 선택된다. 부가적으로, 재조합 tRNA는 임의적으로 비천연적으로 코딩된 아미노산에 의해 아미노아실화되고, 여기에서 비천연적으로 코딩된 아미노산은 천연적으로 또는 유전 조작을 통해 생체내 생합성된다. 비천연적으로 코딩된 아미노산은 임의적으로 적어도 제1 또는 제2 유기체를 위한 성장 배지에 첨가된다.
한 측면에서, 아미노아실-tRNA 합성효소에 의해 아미노아실화되는 (임의적으로 변이체) tRNA에 대한 라이브러리를 선택(음의 선택을 비제한적 예로 포함함)하거나 스크리닝하는 것(단계 (b))은, 독성 마커 유전자(여기에서, 독성 마커 유전자는 셀렉터 코돈(또는 독성 또는 정적 제제의 생산을 초래하는 유전자 또는 유기체에 본질적인 유전자)(여기에서, 상기 마커 유전자는 1개 이상의 셀렉터 코돈을 포함함), 및 (임의적으로 변이체) tRNA의 라이브러리를 포함함)를 제2 유기체로부터의 복수개의 세포에 도입하고; 생존 세포를 선택하는 것(여기에서, 생존 세포는 1개 이상의 직교성 tRNA 또는 비기능적 tRNA를 포함하는 (임의적으로 변이체) tRNA의 풀을 함유함)을 포함한다. 예를 들어, 생존 세포는 비교 비율 세포 밀도 검정을 이용함으로써 선택될 수 있다.
다른 한 측면에서, 독성 마커 유전자는 2개 이상의 셀렉터 코돈을 포함할 수 있다. 방법의 다른 한 실시양태에서, 독성 마커 유전자는 리보뉴클레아제 바나제 유전자이고, 여기에서 리보뉴클레아제 바나제 유전자는 1개 이상의 앰버 코돈을 포함한다. 임의적으로, 리보뉴클레아제 바나제 유전자는 2개 이상의 앰버 코돈을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 도입된 직교성 RS(O-RS)에 의해 아미노아실화되는 구성원에 대한 (임의적으로 변이체) tRNA의 풀을 선택 또는 스크리닝하는 것은 양의 선택 또는 스크리닝 마커 유전자(여기에서, 양의 마커 유전자는 약물 내성 유전자(1개 이상의 셀렉터 코돈, 예컨대 1개 이상의 앰버 중지 코돈을 포함하는 β-락타마제 유전자를 비제한적 예로 포함함) 또는 유기체에 필수적인 유전자 또는 독성제의 탈독성화를 초래하는 유전자를, O-RS와 함께 포함함), 및 (임의적으로 변이체) tRNA의 풀을 제2 유기체로부터의 복수개의 세포에 도입하고; 항생제를 비제한적 예로 포함하는 선택 또는 스크리닝제의 존재 하에 성장하는 생존 또는 스크리닝된 세포를 동정함으로써, 1개 이상의 재조합 tRNA를 갖는 세포의 풀을 제공하는 것(여기에서, 1개 이상의 재조합 tRNA는 O-RS에 의해 아미노아실화되고, 아미노산을 1개 이상의 셀렉터 코돈에 대한 반응으로 양의 마커 유전자에 의해 코딩된 번역 생성물에 삽입함)을 포함할 수 있다. 다른 한 실시양태에서, 선택 및/또는 스크리닝제의 농도가 변화된다.
특정 O-tRNA/O-RS 쌍을 발생시키는 방법이 제공된다. 방법은 (a) 제1 유기체로부터 1개 이상의 tRNA로부터 유래된 변이체 tRNA의 라이브러리를 발생시키고; (b) 제1 유기체로부터의 PS의 부재 하에 제2 유기체로부터의 아미노아실-tRNA 합성효소(RS)에 의해 아미노아실화되는 (임의적으로 변이체) tRNA에 대한 라이브러리를 선택(음의 선택을 비제한적 예로 포함함) 또는 스크니링함으로써, (임의적으로 변이체) tRNA의 풀을 제공하며; (c) 도입된 직교성 RS(O-RS)에 의해 아미노아실화되는 구성원에 대한 (임의적으로 변이체) tRNA의 풀을 선택 또는 스크리닝함으로써, 1개 이상의 재조합 O-tRNA를 제공하는 것을 포함한다. 하나 이상의 재조합 O-tRNA는 셀렉터 코돈을 인식하고, 제2 유기체로부터의 RS에 의해 효율적으로 인식되지 않고, O-RS에 의해 우선적으로 아미노아실화된다. 방법은 또한 (d) 제3 유기체로부터 1개 이상의 아미노아실-tRNA 합성효소(RS) (임의적으로 변이체) tRNA의 라이브러리를 발생시키고; (e) 비천연적으로 코딩된 아미노산 및 천연 아미노산의 존재 하에 1개 이상의 재조합 O-tRNA을 우선적으로 아미노아실화하는 구성원에 대한 변이체 RS의 풀을 음의 선택 또는 스크리닝함으로써, 1개 이상의 특정 O-tRNA/O-RS 쌍을 제공하는 것(여기에서, 1개 이상의 특정 O-tRNA/O-RS 쌍은 비천연적으로 코딩된 아미노산에 대해 특이적인 1개 이상의 재조합 O-RS 및 1개 이상의 재조합 O-tRNA를 포함함)을 포함한다. 방법에 의해 생성되는 특정 O-tRNA/O-RS 쌍이 포함된다. 예를 들어, 특정 O-tRNA/O-RS 쌍에는 mutRNATyr-mutTyrRS 쌍, 예컨대 mutRNATyr-SS12TyrRS 쌍, mutRNALeu-mutLeuRS 쌍, mutRNAThr-mutThrRS 쌍, mutRNAGlu-mutGluRS 쌍 등이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 부가적으로, 상기 방법은 제1 유기체와 제3 유기체가 동일한(단, 메타노코커스 자나쉬이를 비제한적 예로 포함함) 경우를 포함한다.
제2 유기체의 생체내 번역 시스템에 사용하기 위한 직교성 tRNA-tRNA 합성효소 쌍을 선택하기 위한 방법이 본 발명에 포함된다. 방법은: 제1 유기체로부터 단리되거나 유도된 마커 유전자, tRNA 및 아미노아실-tRNA 합성효소(RS)를 제2 유기체로부터의 제1 세트의 세포에 도입하고; 제2 유기체로부터의 중복체 세포 세트에 도입하며; 중복체 세포 세트 내에 생존하지 못하는 제1 세트 내의 생존 세포에 대해 선택하거나, 중복체 세포 세트 내에서는 당해 반응을 나타내지 못하는, 특정 스크리닝 반응을 나타내는 세포에 대해 스크리닝하는 것(여기에서, 제1 세트 및 중복체 세포 세트는 선택 또는 스크리닝제의 존재 하에 성장하고, 생존 또는 스크리닝된 세포는 제2 유기체의 생체내 번역 시스템에서 사용하기 위한 직교성 tRNA-tRNA 합성효소 쌍을 포함함)을 포함한다. 한 실시양태에서, 비교, 및 선택 또는 스크리닝은 생체내 상보 검정을 포함한다. 선택 또는 스크리닝제의 농도는 변화할 수 있다.
본 발명의 유기체는 각종 유기체 및 각종 조합을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 방법의 제1 및 제2 유기체는 동일하거나 상이할 수 있다. 한 실시양태에서, 유기체는 임의적으로 메타노코커스 자나쉬이 , 메타노박테리움 써모오토트로피쿰 , 할로박테리움, 에스케리치아 콜라이 , A. 풀기더스 (A. fulgidus ), P. 푸리오서스(P. furiosus), P. 호리코쉬이 (P. horikoshii ), A. 퍼닉스 (A. pernix ), T. 써모필러 스(T. thermophilus ) 등을 비제한적 예로 포함하는 원핵생물 유기체이다. 대안적으로, 유기체는 임의적으로 식물 (고등 식물, 예컨대 단자엽 또는 쌍자엽 식물을 비제한적 예로 포함함), 조류, 원생생물, 진균류 (효모 등을 비제한적 예로 포함함), 동물(곤충, 절지동물 등을 비제한적 예로 포함함) 등을 비제한적 예로 포함하는 진핵생물 유기체를 포함한다. 다른 한 실시양태에서, 제2 유기체는 메타노코커스 자 나쉬이, 메타노박테리움 써모오토트로피쿰 , 할로박테리움 , 에스케리치아 콜라이 , A. 풀기더스, P. 푸리오서스 , P. 호리코쉬이 , A. 퍼닉스 , T. 써모필러스 등을 비제한적 예로 포함하는 원핵생물 유기체이다. 대안적으로, 제2 유기체는 효모, 동물 세포, 식물 세포, 진균류, 포유동물의 세포 등을 비제한적 예로 포함하는 진핵생물 유기체일 수 있다. 각종 실시양태들에서, 제1 및 제2 유기체는 상이하다.
VI. BSP 내의 비천연 발생 아미노산의 위치
본 발명은 1개 이상의 비천연 발생 아미노산의 BSP로의 혼입을 구상한다. 1개 이상의 비천연 발생 아미노산은 폴리펩티드의 활성을 저해하지 않는 특별한 위치에 혼입될 수 있다. 이는 소수성 아미노산의 소수성 아미노산으로의 치환, 벌크성 아미노산에 대한 벌크성 아미노산 치환, 친수성 아미노산에 대한 친수성 아미노산 치환을 비제한적 예로 포함하는"보수적" 치환 및/또는 활성을 위해 필요하지 않은 위치에의 비천연 발생 아미노산의 삽입을 행함으로써 달성될 수 있다.
각종 생화학적 및 구조적 방법을 이용하여, BSP 내의 비천연적으로 코딩된 아미노산으로의 치환을 위한 요망되는 부위를 선택할 수 있다. 폴리펩티드 사슬의 임의의 위치가 비천연적으로 코딩된 아미노산을 혼입하기 위한 선택에 적당하고, 그러한 선택은 합리적 설계에 기초하거나, 임의의 목적을 위한, 또는 평이한 요망 목적을 위한 무작위 선택에 의해 행해질 수 있음이 당업자에게 자명하다. 요망되는 부위의 선택은 작용자, 초(super)-작용자, 역 작용자, 길항자, 수용체 결합 조절자, 수용체 활성 조절자, 결합 상대에 대한 결합의 조절자, 결합 상대 활성 조절자, 결합 상대 구조 조절자, 이량체 또는 다량체 형성, 본연의 분자 대비의 활성 또는 성질에 대한 변화, 또는 용해도, 응집 또는 안정성과 같은 폴리펩티드의 임의의 물리적 또는 화학적 성질의 조작을 비제한적 예로 포함하는 임의의 요망되는 성질 또는 활성을 갖는 BSP 분자를 생성하기 위한 것일 수 있다. 예를 들어, BSP의 생물학적 활성을 위해 필요한 폴리펩티드 내의 위치는 당업계에 공지된 점 변이 분석, 알라닌 스캐닝 또는 동종체 스캐닝 방법을 이용하여 확인될 수 있다. GLP-1에 대해 [Adelhorst 등, J. of Biol. Chem. 1994 269(9): 6275-6278]를 참고한다. 알라닌 또는 동종체 스캐닝 변이유발에 의해 생물학적 활성에 결정적인 것으로 확인되는 잔기와 다른 잔기는 폴리펩티드를 위해 모색되는 요망 활성에 따라 비천연적으로 코딩된 아미노산으로의 치환을 위한 양호한 후보물질일 수 있다. 대안적으로, 생물학적 활성에 대해 결정적인 것으로 확인된 부위는 또한 이 역시 폴리펩티드를 위해 모색되는 요망 활성에 따라 비천연적으로 코딩된 아미노산으로의 치환을 위한 양호한 후보물질일 수 있다. 다른 한 대안은, 비천연적으로 코딩된 아미노산을 갖는 폴리펩티드 사슬 상의 각 위치에서 일련 치환을 단순히 행하고, 폴리펩티드의 활성에 대한 영향을 관찰하는 것이다. 임의의 폴리펩티드로의 비천연 아미노산을 갖는 치환을 위한 위치를 선택하는 임의의 수단, 기법 또는 방법이 본 발명에 사용하기에 적당하다는 것이 당업자에게 자명하다.
결실을 갖는 BSP의 천연 발생 변이체의 구조 및 활성도 또한 조사하여, 비천연적으로 코딩된 아미노산으로의 치환의 내인성이기 쉬운 단백질의 영역을 결정할 수 있다. 한 유사 방식으로, 프로테아제 소화 및 단클론성 항체는 BSP 수용체 또는 결합 상대에 결합하는데 원인될 수 있는 BSP의 영역을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 비천연적으로 코딩된 아미노산으로의 치환에 대해 내인성이지 않기 쉬운 잔기가 일단 제거되면, BSP 및 그것의 수용체 또는 결합 상대의 구조로부터, 나머지 각 위치에서 제안된 치환의 영향을 조사할 수 있다. 따라서, 당업자는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 이용하여 치환될 수 있는 아미노산 위치를 용이하게 확인할 수 있다.
일부 실시양태들에서, 본 발명의 BSP는 폴리펩티드의 나선 또는 베타 시이트 2차 구조를 저해하지 않는 단백질의 영역 내에 위치한 1개 이상의 비천연 발생 아미노산을 포함한다.
일부 실시양태들에서, 1개 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 GLP-1 내의 임의의 위치, (아미노 말단의) 첫 번째 아미노산 앞, 카르복시 말단의 부가, 또는 이들의 임의의 조합에서 혼입된다. 일부 실시양태들에서, 1개 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 하기와 같은 잔기들을 비제한적 예로 포함하는 GLP-1 내의 임의의 위치에서 혼입될 수 있다: 위치 7(즉, N 말단)의 첫 번째 아미노산 앞, 7H, 8A, 9E, V16, 17S, 18S, 19Y, 20L, 21E, 22G, 23Q, 24A, 25A, 26K, 27E, 28F, 29I, 30A, 31W, 32L, 33V, 34K, 35G, 36R, 37G, 위치 38(즉, 카르복실 말단)에서의 부가, 또는 이들의 임의의 조합.
일부 실시양태들에서, 이 위치 또는 기타 위치들에서의 비천연 발생 아미노산은 위치 7(즉, N 말단)의 첫 번째 아미노산 앞, 7H, 8A, 9E, V16, 17S, 18S, 19Y, 20L, 21E, 22G, 23Q, 24A, 25A, 26K, 27E, 28F, 29I, 30A, 31W, 32L, 33V, 34K, 35G, 36R, 37G, 위치 38(즉, 카르복실 말단)에서의 부가, 또는 이들의 임의의 조합을 비제한적 예로 포함하는 위치에서 수용성 분자에 연결된다. 일부 실시양태들에서, 본 발명의 GLP-1 폴리펩티드는 길항자를 제공하는 하기 위치들 중 하나 이상에 1개 이상의 비천연 발생 아미노산을 포함한다: 7, 8, 9, 22, 18, 29, 25, 32, 21, 28, 17, 24, 31, 20, 또는 이들의 임의의 조합.
일부 실시양태들에서, 1개 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 T-20(TEX 포함) 내의 임의의 위치, (아미노 말단의) 첫 번째 아미노산 앞, 카르복시 말단의 부가, 또는 이들의 임의의 조합에서 혼입된다. 일부 실시양태들에서, 1개 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 하기와 같은 잔기들을 비제한적 예로 포함하는 T-20(TEX 포함) 내의 임의의 위치에서 혼입된다: W631, D632, I635, N636, N637, Y638, T639, S640, L641, L645, N651, 또는 이들의 임의의 조합.
일부 실시양태들에서, 1개 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 펩티드 YY 내의 임의의 위치, (아미노 말단의) 첫 번째 아미노산 앞, 카르복시 말단의 부가, 또는 이들의 임의의 조합에서 혼입된다.
비천연적으로 코딩된 아미노산 혼입의 예시적 잔기는 가능한 수용체 결합 영역, 또는 결합 상대에 결합하기 위한 영역으로부터 배출되는 잔기들일 수 있거나; 전부 또는 부분적으로 용매에 노출될 수 있으나; 근접 잔기와의 수소 결합 상호작용이 최소이거나 없거나; 부근 반응성 잔기에 최소로 노출될 수 있거나, BSP의 노출면들 중 하나 이상에 있을 수 있거나; 매우 가요성이거나 그것의 수용체 또는 결합 상대에 결합 또는 비결합되거나 다른 한 BSP 또는 기타 생물학적 활성 분자에 결합 또는 비결합된 BSP의 3차원, 2차, 3차 또는 4차 구조에 의해 예측되는 바, 구조적으로 경성인 영역 내에 있을 수 있거나; 원하는 경우 완전한 구조의 가요성 또는 경성을 변화시킴으로써 BSP 자체, 또는 1개 이상의 BSP를 포함하는 이량체 또는 다량체의 구조를 조절할 수 있다.
일부 실시양태들에서, GLP-1 길항자는 GLP-1 분자의 수용체 결합 영역 내에 존재하는 수용성 중합체에 연결된 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 수용성 중합체는 아미노산 위치들 7, 8, 9, 22, 18, 29, 25, 32, 21, 28, 17, 24, 31 및 20 중 하나 이상에 있는 GLP-1 폴리펩티드(서열 번호 1, 2, 3, 21, 또는 임의의 기타 GLP-1 폴리펩티드)에 결합된다.
매우 다양한 비천연적으로 코딩된 아미노산은 BSP의 소정의 위치에 대해 치환되거나, 그 위치에 혼입될 수 있다. 일반적으로, 한 특별한 비천연적으로 코딩된 아미노산은, 그것의 수용체 또는 결합 상대를 가지거나 가지지 않는 BSP의 구조의 연구, 보수적 치환(즉, Phe, Tyr 또는 Trp에 대한 아릴계 비천연적으로 코딩된 아미노산, 예컨대 p-아세틸페닐알라닌 또는 O-프로파르길티로신 치환)에 대한 선호, 및 BSP로 도입하고자 하는 특정 접합 화학작용(예컨대, 알킨 부분을 갖는 수용성 중합체와의 휘스겐 [3+2] 시클로부가를 행하고자 하는 경우의 4-아지도페닐알라닌의 도입, 또는 아릴 에스테르를 가짐에 따라 포스핀 부분이 혼입되어 있는 수용성 중합체를 이용한 아미드 결합 형성)에 기초하여, 혼입을 위해 선택된다.
한 실시양태에서, 방법은 단백질에 비천연 아미노산을 혼입시키고(여기에서, 비천연 아미노산은 제1 반응성 기를 포함함); 단백질을, 제2 반응성 기를 포함하는 분자(이를 표지, 염료, 중합체, 수용성 중합체, 폴리에틸렌 글리콜의 유도체, 광가교제, 방사성핵종, 세포독성 화합물, 약물, 친화도 표지, 광친화도 표지, 반응성 화합물, 수지, 제2 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체, 항체 또는 항체 단편, 금속 킬레이터, 보조인자, 지방산, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 수용성 덴드리머, 시클로덱스트린, 억제성 리보핵산, 바이오물질, 나노입자, 스핀 표지, 형광발색단, 금속-함유 부분, 방사능 부분, 신규 작용기, 다른 분자와 공유 또는 비공유 상호작용하는 기, 광바구니 부분, 광이성화가능한 부분, 비오틴, 비오틴의 유도체, 비오틴 유사체, 중원자가 혼입된 부분, 화학적으로 절단가능 기, 광절단가능 기, 연신 측쇄, 탄소-연결 당, 산화환원 활성제, 아미노 티오산, 독성 부분, 동위원소 표지된 부분, 생물리학적 프로브, 인광성 기, 화학발광성 기, 전자 조밀 기, 자기 기, 개재 기, 발색단, 에너지 전이제, 생물 활성제, 검출가능 표지, 소분자 또는 상기 것들의 임의의 조합물, 또는 임의의 기타 바람직한 화합물 또는 물질을 비제한적 예로 포함함)와 접촉시키는 것을 추가로 포함한다. 제1 반응성 기는 제2 반응성 기와 반응하여, [3+2] 시클로부가를 통해 분자를 비천연 아미노산에 결합시킨다. 한 실시양태에서, 제1 반응성 기는 알키닐 또는 아지도 부분이고, 제2 반응성 기는 아지도 또는 알키닐 부분이다. 예를 들어, 제1 반응성 기는 알키닐 부분(비천연 아미노산 p-프로파르길옥시페닐알라닌 내(단, 이에 제한되지 않음)이고, 제2 반응성 기는 아지도 부분이다. 다른 한 예에서, 제1 반응성 기는 아지도 부분(비천연 아미노산 p-아지도-L-페닐알라닌(단, 이에 제한되지 않음))이고, 제2 반응성 기는 알키닐 부분이다.
일부 경우들에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산 치환(들)은 BSP 내의 다른 부가, 치환 또는 결실과 조합되어, BSP의 다른 생물학적 성질에 영향을 주게 된다. 일부 경우들에서, 다른 부가, 치환 또는 결실은 BSP의 안정성(단백질 분해에 대한 내성을 비제한적 예로 포함함)을 증가시키거나, 그것의 수용체 또는 결합 상대에 대한 BSP 친화성을 증가시킬 수 있다. 일부 경우들에서, 다른 부가, 치환 또는 결실은 BSP의 (E. 콜라이 또는 기타 숙주 세포 중의 값으로 표시될 때의(단, 이에 제한되지 않음)) 용해도를 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태들에서, 부가, 치환 또는 결실은 E. 콜라이 재조합 숙주 세포에서 발현된 후, 폴리펩티드 용해도를 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태들에서, E. 콜라이 재조합 숙주 세포에서 발현된 후, 폴리펩티드 용해도를 증가시키게 되는, 비천연 아미노산의 혼입을 위한 다른 한 부위에 부가하여, 천연적으로 코딩된 아미노산 또는 비천연 아미노산으로 치환하기 위한 부위가 선택된다. 일부 실시양태들에서, BSP는 BSP 수용체 또는 결합 상대에 대한 친화도를 조절하거나, 수용체 이량체화를 조절(증가 또는 감소를 비제한적 예로 포함함)하거나, 결합 상대의 구조 또는 하나 이상의 생물학적 활성을 조절하거나, 순환 반감기를 조절하거나, 방출 또는 생체유용성을 조절하거나, 정제를 용이하게 하거나, 특별한 투여 경로를 향상 또는 변경시키는 다른 한 부가, 치환 또는 결실을 포함한다. 마찬가지로, BSP는 프로테아제 절단 서열, 반응성 기, 항체-결합 도메인(FLAG 또는 폴리-His를 비제한적 예로 포함함) 또는 기타 친화도 기재의 서열(FLAG, 폴리-His, GST 등을 비제한적 예로 포함함), 또는 검출(GFP를 비제한적 예로 포함함), 정제, 조직 또는 세포막을 통한 수송, 전구약물 방출 또는 활성화, BSP 크기 감소, 또는 폴리펩티드의 기타 성질을 향상시키기 위한 연결 분자(비오틴을 비제한적 예로 포함함)를 포함할 수 있다.
일부 실시양태들에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산의 치환은 BSP 길항자를 발생시킨다. 비천연적으로 코딩된 아미노산의 혼입을 위한 예시적 부위의 서브세트에는 GLP-1의 7, 8, 9, 22, 18, 29, 25, 32, 21, 28, 17, 24, 31 및 20이 포함된다. 다른 실시양태들에서, 상기 열거된 치환은 GLP-1 폴리펩티드가 GLP-1 길항자이도록 유발하는 부가적 치환과 조합된다. 일부 실시양태들에서, GLP-1 길항자는 GLP-1 분자의 수용체 결합 영역 내에 존재하는 수용성 중합체에 연결된 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함한다.
일부 경우들에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상 개수의 아미노산은 1개 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환된다. 일부 경우들에서, BSP는 천연 발생 아미노산에 대한 1개 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상 개수의 치환을 추가로 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태들에서, GLP-1의 하기 영역에서의 2개 이상의 잔기는 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환된다: 위치 7(즉, N 말단)의 첫 번째 아미노산 앞, 7H, 8A, 9E, V16, 17S, 18S, 19Y, 20L, 21E, 22G, 23Q, 24A, 25A, 26K, 27E, 28F, 29I, 30A, 31W, 32L, 33V, 34K, 35G, 36R, 37G, 위치 38(즉, 카르복실 말단)의 부가 또는 이들의 임의의 조합. 일부 실시양태들에서, T-20 폴리펩티드의 2개 이상의 잔기는 W631, D632, I635, N636, N637, Y638, T639, S640, L641, L645, N651을 비제한적 예로 포함하는 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환된다. 일부 실시양태들에서, 1개 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 펩티드 YY내의 임의의 위치, (아미노 말단의) 첫 번째 아미노산 앞, 카르복시 말단의 부가, 또는 이들의 임의의 조합에서 혼입된다.
일부 경우들에서, 1개 이상의 비천연적으로 코딩된 잔기는 1개 이상의 저분자량 선형 또는 분지형 PEG(대략 ~5 내지 20 kDa 질량 이하)에 연결됨으로써, 단일 고분자량 PEG에 결합된 종에 대한 결합 친화도 및 필적하는 혈청 반감기를 증진시킨다.
VII. 비진핵생물 및 진핵생물에서의 발현
클로닝된 BSP의 높은 수준 발현을 수득하기 위해, 전형적으로 본 발명의 BSP을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 전사, 전사/번역 종결자을 지정하는 강한 프로모터를 함유하는 발현 벡터로 서브클로닝하고, 단백질을 코딩하는 핵산의 경우에는 변역 개시를 위한 리보솜을 서브클로닝한다. 적당한 세균 프로모터가 당업계에 공지되어 있고, 예컨대 [Sambrook 등 및 Ausubel 등]에 기재되어 있다.
본 발명의 BSP를 발현하기 위한 세균 발현 시스템은 E. 콜라이 , 바실러스( Bacillus ) sp . 및 살모넬라(단, 이에 제한되지 않음)에서 입수가능하다(Palva 등, Gene 22: 229-235(1983); Mosbach 등, Nature 302: 543-545(1983)). 그러한 발현 시스템을 위한 키트가 시중 입수가능하다. 포유동물의 세포, 효모, 및 곤충 세포를 위한 진핵생물 발현 시스템이 당업계에 공지되어 있고, 또한 시중 입수가능하다. (상기 기재된) 직교성 tRNA 및 아미노아실 tRNA 합성효소를 사용하여 본 발명의 BSP를 발현하는 경우, 발현을 위한 숙주 세포가 직교성 성분을 사용하는 그 능력을 기초로 하여 선택된다. 예시적 숙주 세포에는 그램-양성 세균(B. 브레비스(B. brevis ), B. 섭틸리스 (B. subtilis ) 또는 스트렙토마이세스(Streptomyces)를 비제한적 예로 포함함) 및 그램-음성 세균(E. 콜라이 , 슈도모나스 플루오레슨 스( Pseudomonas fluorescens ), 슈도모나사 아에루기노사 ( Pseudomonas aeruginosa ), 슈도모나스 푸티다 ( Pseudomonas putida ), 및 효모 및 기타 진핵생물 세포가 포함된다. 본원에 기재된 바와 같이, O-tRNA/O-RS 쌍을 포함하는 세포를 사용할 수 있다.
본 발명의 진핵생물 숙주 세포 또는 비진핵생물 숙주 세포는 큰 유용한 양으로 비천연 아미노산을 포함하는 단백질을 합성하는 능력을 제공한다. 한 측면에서, 조성물은 임의적으로 10 마이크로그램 이상, 50 마이크로그램 이상, 75 마이크로그램 이상, 100 마이크로그램 이상, 200 마이크로그램 이상, 250 마이크로그램 이상, 500 마이크로그램 이상, 1 밀리그램 이상, 10 밀리그램 이상, 100 밀리그램 이상, 1 그램 이상, 또는 그 이상(단, 이에 제한되지 않음)의, 비천연 아미노산 함유 단백질, 또는 생체내 단백질 생성 방법으로 달성될 수 있는 양(재조합 단백질 생성 및 정제에 대한 상세 내용이 본원에 제공됨)을 포함한다. 다른 한 측면에서, 단백질은 임의적으로 조성물 내에, (약 1 nl 내지 약 100 L의 임의 양의 체적(단, 이에 제한되지 않음)의 세포 분해물, 완충제, 약제학적 완충제, 또는 기타 액체 현탁액(단, 이에 제한되지 않음)에서 리터 당 10 마이크로그램 이상의 단백질, 리터당 50 마이크로그램 이상의 단백질, 리터 당 75 마이크로그램 이상의 단백질, 리터 당 100 마이크로그램 이상, 리터 당 200 마이크로그램 이상의 단백질, 리터 당 250 마이크로그램 이상의 단백질, 리터 당 500 마이크로그램 이상의 단백질, 리터 당 1 밀리그램 이상의 단백질, 또는 리터 당 10 밀리그램 이상의 단백질, 또는 그 이상(단, 이에 제한되지 않음)의 농도로 존재한다. 1개 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 진핵생물 세포 내의 다량(이는 생체외 번역을 비제한적 예로 포함하는 다른 방법으로 전형적으로 가능한 양 보다 큰 양을 비제한적 예로 포함함)의 단백질 생성은 본 발명의 한 특성이다.
본 발명의 진핵생물 숙주 세포 또는 비진핵생물 숙주 세포는 비천연 아미노산을 큰 유용한 양으로 포함하는 단백질을 생합성하는 능력을 제공한다. 예를 들어, 비천연 아미노산을 포함하는 단백질은 세포 추출물, 세포분해물, 배지, 완충제 등에서, 10 μg/리터 이상, 50 μg/리터 이상, 75 μg/리터 이상, 100 μg/리터 이상, 200 μg/리터 이상, 250 μg/리터 이상, 또는 500 μg/리터 이상, 1 mg/리터 이상, 2 mg/리터 이상, 3 mg/리터 이상, 4 mg/리터 이상, 5 mg/리터 이상, 6 mg/리터 이상, 7 mg/리터 이상, 8 mg/리터 이상, 9 mg/리터 이상, 10 mg/리터 이상, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 mg/리터, 1 g/리터, 5 g/리터, 10 g/리터 이상, 또는 그 이상의 단백질(이를 비제한적 예로 포함함)의 농도로 생성될 수 있다.
I. 발현 시스템, 배양 및 단리
BSP는 예를 들어, 효모, 곤충 세포, 포유동물 세포 및 세균을 비제한적 예로 포함하는, 임의의 수의 적당한 발현 시스템에서 발현될 수 있다. 예시적 발현 시스템의 기재가 이하 제시된다.
효모 본원에 사용되는 용어 "효모"는 BSP를 코딩하는 유전자를 발현할 수 있는 각종 효모들 중 임의의 것이 포함된다. 그러한 효모에는 유성포자 효모(덴도마이세탈레스( Endomycetales )), 담자포자 효모 및 불완전 진균류에 속하는 효모(블라스토마이세테스( Blastomycetes )) 군이 포함된다. 유성포자 효모는 두 가지 계, 즉 스퍼모프토라세아에( Spermophthoraceae ) 및 사카로마이세타세아에( Saccharomycetaceae )로 구분된다. 후자는 4가지 아계, 즉 시조사카로마이코데아 에( Schizosaccharomycoideae )(예컨대, 속 시조사카로마이세스( Schizosaccharomyces )), 나드소니오이데아에 ( Nadsonioideae ), 리포마이코이데아에( Lipomycoideae ) 및 사카로마이코이데아에( Saccharomycoideae )(예컨대, 속 피치아( Pichia ), 클루이베로마이세스 ( Kluyveromyces ) 및 사카로마이세스( Saccharomyces)로 구분된다. 담자포자 효모에는 속 류코스포리디움( Leucosporidium ), 로도스포리디움 ( Rhodosporidium ), 스포리디오볼루스( Sporidiobolus ), 필로바시디움 ( Filobasidium ) 및 필로바시디엘 라( Filobasidiella )가 포함된다. 불완전 진균류에 속하는 효모(블라스토마이세테스) 군에는 2가지 계, 즉 스포로볼로마이세타세아에 ( Sporobolomycetaceae )(예컨대, 속 소포로볼로마이세스 ( Sporobolomyces ) 및 불레라 ( Bullera )) 및 크립토코카세아에( Cryptococcaceae )(예컨대, 속 칸디다( Candida ))로 구분된다.
본 발명에 사용하기에 특이 유익한 것은, 속 피치아 , 클루이베로마이세스 , 사카로마이세스, 시조사카로마이세스 , 한세눌라 ( Hansenula ), 쿠롤로프시스( Torulopsis ) 및 칸디다(P. 파스토리스 (P. pastoris ), P. 구일러리몬디(P. guillerimondii), S. 세레비지아에 , S. 카알스베르겐시스 (S. carlsbergensis ), S. 디아스타티쿠스(S. diastaticus ), S. 도우글라시이 (S. douglasii ), S. 클루이베 리(S. kluyveri ), S. 노르벤시스 (S. norbensis ), S. 오비포르미스 (S. oviformis ), K. 락티스(K. lactis ), K. 프라길리스 (K. fragilis ), C. 알비칸스 (C. albicans ), C. 말토사 (C. maltosa ) 및 H. 폴리모르파(H. polymorpha)를 비제한적 예로 포함함) 내에 속하는 종들이다.
BSP의 발현을 위해 적당한 효모를 선택하는 것은 당업자의 기술 내에 속한다. 발현을 위한 효모 숙주를 선택할 때, 적당한 숙주는 예를 들어, 양호한 분비 성능, 낮은 단백질분해 활성, 양호한 가용성 단백질 생성, 및 전반적 강인도(robustness)를 가지는 것들이 포함될 수 있다. 효모는 일반적으로 효모 유전학 스톡 센터(Yeast Genetic Stock Center), 생물리학 및 의료물리학 부(Department of Biophysics and Medical Physics), 캘리포니아 대학(University of California)(미국 캘리포니아주 버클리 소재), 및 미국 미생물 보존 센터("ATCC")(미국 버지니아주 마나사스 소재)를 비제한적 예로 포함하는 각종 출처들로부터 입수가능하다.
용어 "효모 숙주" 또는 "효모 숙주 세포"에는 재조합 벡터 또는 기타 전달 DNA를 위한 수여자로 사용될 수 있거나, 사용되었거나 사용되는 효모가 포함된다. 용어에는 재조합 벡터 또는 기타 전달 DNA을 수여받은 원래의 효모 숙주 세포의 후대(progeny)가 포함된다. 단일 모 세포의 후대는 우발적 또는 고의적 변이로 인해, 원래의 모에 대해, 형태 또는 게놈 상으로 완전히 일치하거나, 총체적 DNA 상보체일 필요가 없는 것으로 이해된다. 관련 성질, 예컨대 BSP를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 존재를 특징으로 하는 모에 대해 충분히 유사한 모 세포의 후대가 이 정의에 의해 의도되는 후대에 포함된다.
염색체외 레플리콘을 포함하는 발현 및 형질전환 벡터, 또는 일체화 벡터가 많은 효모 숙주들로 형질전환되기 위해 개발되었다. 예를 들어, 하기 균들을 위한 발현 벡터가 개발되었다: S. 세레비지아에(Sikorski 등, GENETICS(1989) 122: 19; Ito 등, J. BACTERIOL(1983) 153: 163; Hiimen 등, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA(1978) 75: 1929); C. 알비칸스(Kurtz 등, M0L. CELL. BI0L.(1986) 6: 142); C. 말토사(Kunze 등, J. BASIC MICROBIOL.(1985) 25: 141); H. 폴리모르파(Gleeson 등, J. GEN. MICROBIOL.(1986) 132: 3459; Roggerikamp 등, MOL. GENETICS AND GENOMICS(1986) 202: 302); K. 프라길리스(Das 등, J. BACTERIOL.(1984) 158: 1165); K 락티스(De Louvencourt 등, J. BACTERIOL.(1983) 154: 737; Van den Berg 등, BIOTECHNOLOGY(NY)(1990) 8: 135); P. 길러리몬디이(Kunze 등, J. BASIC MICROBIOL.(1985) 25: 141); P. 파스토리스(U.S. 특허 No. 5,324,639; 4,929,555; 및 4,837,148; Cregg 등, MOL. CELL. BI0L.(1985) 5: 3376); 시조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)(Beach 등, NATURE(1982) 300: 706); 및 Y. 리폴리티카(Davidow 등, CURR. GENET.(1985) 10: 380(1985); Gaillardin 등, CuRR. GENET.(1986) 10: 49); A. 니둘란스(Ballance 등, BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN.(1983) 112: 284-89; Tilburn 등, GENE(1983) 26: 205-221; 및 Yelton 등, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA(1984) 81: 1470-74); A. 니거(A. niger)(Kelly 및 Hynes, EMBO J.(1985) 4: 475-479); T. 리이시아(T. reesia)(EP 0 244 234); 및 필라멘트 사상균류, 예컨대 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium)(WO 91/00357)(이들 문헌들은 각기 본원에 참고로 인용됨).
효모 벡터를 위한 조절 서열이 당업계의 숙련가에게 공지되어 있고, 이에는 알코올 탈수소효소 (ADH)(EP 0 284 044); 에놀라제; 글루코키나제; 포도당-6-포스페이트 이성체화효소; 글리세르알데히드-3-포스페이트-탈수소효소 (GAP 또는 GAPDH); 헥소키나제; 포스포프룩토키나제; 3-포스포글리세레이트 뮤스타제; 및 피루베이트 키나제(PyK)(EP 0 329 203)와 같은 유전자로부터의 프로모터 영역들이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 산 포스파타제를 코딩하는 효모 PHO5 유전자도 또한 유용한 프로모터 서열을 제공한다(Miyanohara 등, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA(1983) 80: 1). 효모 숙주와 사용하기 위한 다른 적당한 프로모터 서열에는 3-포스포글리세레이트 키나제를 위한 프로모터(Hitzeman 등, J. BIOL. CHEM.(1980) 255: 12073); 및 기타 당분해 효소, 예컨대 피루베이트 디카르복실라제, 트리오스 포스페이트 이성체화효소 및 포스포글루코스 이성체화효소(Holland 등, BIOCHEMISTRY(1978) 17: 4900; Hess 등, J. ADv. ENZYME REG.(1969) 7: 149)가 포함될 수 있다. 성장 조건에 의해 조절되는 전사의 부가적 이점을 갖는 유도성 효모 프로모터에는 알코올 탈수소효소 2; 이소사이토크롬 C; 산 포스파타제; 메탈로티오네인; 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소; 질소 대사와 연관된 분해성 효소; 및 말토스 및 갈락토스 이용의 원인이 되는 효소를 위한 프로모터 영역들이 포함된다. 효모 발현에 사용하기 위한 적당한 벡터 및 프로모터가 EP0073 657에 더욱 기재되어 있다.
효모 증진제는 또한 효모 프로모터와 함께 사용될 수 있다. 또한, 합성 프로모터는 또한 효모 프로모터로서 기능할 수 있다. 예를 들어, 효모 프로모터의 상류 활성화 서열(UAS)은 다른 한 효모 프로모터의 전사 활성화 영역과 결합하여, 합성 혼성체 프로모터를 발생시킬 수 있다. 그러한 혼성체 프로모터의 예에는 GAP 전사 활성화 영역에 연결된 ADH 제어 서열이 포함된다. 본원에 각기 참고로 인용되는, U.S. 특허 No. 4,880,734 및 4,876,197을 참고한다. 혼성체 프로모터의 다른 예에는, GAP 또는 PyK와 같은 당분해 효소 유전자의 전사 활성화 영역과 조합되는, ADH2, GAL4, GAL10 또는 PH05 유전자의 제어 서열로 구성된 프로모터가 포함된다. EP 0 164 556을 참고한다. 또한, 효모 프로모터에는 효모 RNA 중합효소에 결합하여 전사를 개시하는 능력을 갖는 비효모 기원의 천연 발생 프로모터가 포함될 수 있다.
효모 발현 벡터의 부분을 포함할 수 있는 다른 조절 요소에는, 종결자, 예를 들어 GAPDH로부터의 것, 또는 에놀라제 유전자가 포함된다(Holland 등, J. BI0L. CHEM.(1981) 256: 1385). 또한, 2μ 플라스미드 기원으로부터의 복제의 기원이 효모에 적당하다. 효모 내에 사용하기 위해 적당한 선택 유전자는 trp1 유전자이다. [Tschumper 등, GENE(1980) 10: 157; Kingsman 등, GENE(1979) 7: 141]를 참고한다. trp1 유전자는 트립토판에서 성장할 수 있는 능력이 결여된 효모의 변이체 균주를 위한 선택 마커를 제공한다. 유사하게, Leu2-결실 효모 균주(ATCC 20,622 또는 38,626)는 Leu2 유전자를 갖는 공지 플라스미드에 의해 상보된다.
외인성 DNA를 효모 숙주에 도입하는 방법이 당업계의 숙련가에게 공지되어 있고, 이에는 전형적으로 세포벽불완전제거균(spheroplast), 또는 알칼리 양이온으로 처리된 비변형 효모 숙주 세포의 형질전환이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 예를 들어, 효모의 형질전환은 [Hsiao 등, PROC. NATL. ACAD. Sci. USA(1979) 76: 3 829 및 Van Solingen 등, J. BAcT.(1977) 130: 946]에 기재된 방법에 따라 수행될 수 있다. 그러나, 핵 주입, 전기천공 또는 프로토플라스트 융합과 같은, DNA를 세포에 도입하는 다른 방법이 또한 일반적으로 [SAMBROOK 등, MOLECULAR CLONING: A LAB. MANUAL(2001)]에 기재된 대로 사용될 수 있다. 이어서, 효모 숙주 세포는 당업계의 숙련가에게 공지된 표준 기법을 이용하여 배양될 수 있다.
효모 숙주 세포 내에 이종성 단백질을 발현하기 위한 기타 방법이 당업계의 숙련가에게 공지되어 있다. 일반적으로 각기 본원에 참고로 인용되는, U.S. 특허 공보 No. 2002 0055169, U.S. 특허 No. 6,361,969; 6,312,923; 6,183,985; 6,083,723; 6,017,731; 5,674,706; 5,629,203; 5,602,034; 및 5,089,398; U.S. 재심사 특허 No. RE37,343 및 RE35,749; PCT 공개 특허 출원 WO 99/07862; WO 98/37208; 및 WO 98/26080; 유럽 특허 출원 EP 0 946 736; EP 0 732 403; EP 0 480 480; EP 0 460 071; EP 0 340 986; EP 0 329 203; BP 0 324 274; 및 EP 0 164 556를 참고한다. 또한 [Gellissen 등, ANTONIE VAN LEBUWENHOEK(1992) 62(1-2): 79-93; Romanos 등, YEAST(1992) 8(6): 423-488; Goeddel, METHODS IN ENZYMOLOGY(1990) 185: 3-7]을 참고한다.
이어서, 효모 숙주 균주는 당업계의 숙련가에게 공지된 표준 공급 배치 발효법을 이용하여 증폭 단계 동안에 발효기에서 성장될 수 있다. 발효 방법은 특별한 효모 숙주의 탄소 이용 경로, 또는 발현 조절 방식의 차이를 설명하도록 적용될 수 있다. 예를 들어, 사카로마이세스 효모 숙주의 발효는 단일 포도당 공급, 복합 질소원(예컨대, 카세인 가수분해물), 및 다중 비타민 보충물을 필요로 할 수 있다. 대조적으로, 메틸친화성 효모 P. 파스토리스는 글리세롤, 메탄올 및 미량 광물 공급을 필요로 할 수 있으나, 최적의 성장 및 발현을 위해서는 단지 단순 암모늄 (질소) 염을 필요로 할 수 있다. 예컨대, 본원에 각기 참고로 인용되는, [U.S. 특허 No. 5,324,639; Elliott 등, J. PROTEIN CHEM.(1990) 9: 95; 및 Fieschko 등, BIOTECH. BIOENG.(1987) 29: 1113]을 참고한다.
그러나, 그러한 발효 방법은 이용되는 효모 숙주 균주와 무관하게 특정의 통상적 특성을 가질 수 있다. 예를 들어, 성장 제한 영양소, 전형적으로 탄소를 증폭기 동안에 발효기에 첨가하여, 최대의 성장을 가져오도록 할 수 있다. 또한, 발효 방법은 일반적으로 적당량의 탄소, 질소, 기초 염, 인 및 기타 부 영양소(비타민, 미량 광물 및 염 등)을 함유하도록 설계된 발효 배지를 이용한다. 피치아와 함께 사용하기에 적당한 발효 배지의 예가 본원에 각기 참고로 인용되는, U.S. 특허 No. 5,324,639 및 5,231,178에 기재되어 있다.
바큘로바이러스 -감염 곤충 세포 용어 "곤충 숙주" 또는 "곤충 숙주 세포"는 재조합 벡터 또는 기타 전달 DNA를 위한 수용자로서 사용될 수 있거나, 사용되었거나, 사용되는 곤충을 가리킨다. 그 용어에는 트랙스펙션된 원래의 곤충 숙주 세포의 후대가 포함된다. 단일 모 세포의 후대는 반드시 우발적 또는 고의적 변이로 인해, 원래의 모에 대해, 형태, 또는 게놈 또는 총 DNA 상으로 완전히 일치하거나, 총 DNA 상보체에 있어 완전히 일치하지 않을 수 있는 것으로 이해된다. 관련 성질, 예컨대 BSP를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 존재를 특징으로 하는 모에 대해 충분히 유사한 모 세포의 후대가 이 정의에 의해 의도되는 후대에 포함된다.
BSP의 발현을 위한 적당한 곤충 세포의 선택은 당업계의 숙련가에게 공지되어 있다. 수개의 곤충 종이 당업계에 공지되어 있고, 아에데스 아에집티( Aedes aegypti), 봄비스 모리( Bombyx mori ), 드로소필라 멜라노가스터( Drosophila melanogaster), 스포도프테라 프루기페르다 ( Spodoptera frugiperda ) 및 트리초플루시아 니( Trichoplusia ni ) 등과 같이 시중 입수가능하다. 발현을 위한 곤충 숙주를 선택할 때, 적당한 숙주는 특히 양호한 분비 성능, 낮은 단백질분해 활성, 양호한 가용성 단백질 생성, 및 전반적 강인도를 가지는 것들이 포함될 수 있다. 곤충은 일반적으로 곤충 유전학 스톡 센터, 생물리학 및 의료물리학 부(Department of Biophysics and Medical Physics), 캘리포니아 대학(University of California)(미국 캘리포니아주 버클리 소재), 및 미국 미생물 보존 센터("ATCC")(미국 버지니아주 마나사스 소재)를 비제한적 예로 포함하는 각종 출처들로부터 입수가능하다.
일반적으로, 바큘로바이러스-감염 곤충 발현 시스템의 성분에는 전달 벡터, 통상 바큘로바이러스 게놈의 단편과 발현될 이종성 유전자의 삽입을 위한 편리한 제한 부위를 모두 가지는 세균 플라스미드; 전달 벡터에 있어 바큘로바이러스-특이적 단편에 대해 동종인 서열을 가지는 야생형 바큘로바이러스(이는 바큘로바이러스 게놈 내의 이종성 유전자의 동종성 재조합을 허용함); 및 적절한 곤충 숙주 세포 및 성장 배지가 포함된다. 벡터의 구축, 세포의 트랜프펙션, 플라크 집기, 배지 내의 세포 성장 등을 구축함에 있어 사용되는 물질, 방법 및 기법이 당업계에 공지되어 있고, 이 기법들을 설명하는 매뉴얼이 입수가능하다.
이종성 유전자를 전달 벡터에 삽입한 후, 벡터 및 야생형 바이러스 게놈은 곤충 숙주 세포에 트랜스펙션되고, 거기에서 벡터 및 바이러스 게놈이 재조합한다. 팩키징된 재조합 바이러스가 발현되고, 재조합 재조합 플라크가 동정되어 정제된다. 바큘로바이러스/곤충 세포 발현 시스템을 위한 물질 및 방법이 예를 들어, 인비트로겐 코포레이션(Invitrogen Corp.)(미국 캘리포니아주 카스배드 소재)로부터, 키트 형태로 시중 입수가능하다. 이 기법들은 일반적으로 당업계의 숙련가에게 공지되어 있고, 본원에 각기 참고로 인용되는, [SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN No. 1555(1987)]에 전적으로 기재되어 있다. 또한, [RICHARDSON, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY: BACULOVIRUS EXPRESSION PROTOCOLS(1995); AUSUBEL 등, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY 16.9-16.11(1994); KING AND POSSEE, THE BACULOVIRUS SYSTEM: A LABORATORY GUIDE(1992); 및 O'REILLY 등, BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS: A LABORATORY MANUAL(1992)]를 참고한다.
실제로, 바큘로바이러스/곤충 세포 발현 시스템을 이용한 각종 이종성 단백질의 생성이 당업계에 공지되어 있다. 예컨대 본원에 각기 참고로 인용되는, U.S. 특허 No. 6,368,825; 6,342,216; 6,338,846; 6,261,805; 6,245, 528, 6,225,060; 6,183,987; 6,168,932; 6,126,944; 6,096,304; 6,013, 433; 5, 965,393; 5,939,285; 5,891,676; 5,871,986; 5,861,279; 5,858,368; 5, 843,733; 5,762,939; 5,753,220; 5,605,827; 5,583,023; 5,571,709; 5,516,657; 5,290, 686; W002/06305; WO01/90390; WO01/27301; WO01/05956; W000/55345; W000/20032 WO 99/51721; WO 99/45130; WO 99/31257; WO 99/10515; WO 99/09193; WO 97/26332; WO 96/29400; WO 96/25496; WO 96/06161; WO 95/20672; WO 93/03 173; WO 92/16619; WO 92/03628; WO 92/01801; WO 90/14428; WO 90/10078; WO 90/02566; WO 90/02186; WO 90/01556; WO 89/01038; WO 89/01037; WO 88/07082를 참고한다.
바큘로바이러스/곤충 세포 발현 시스템에 유용한 벡터가 당업계에 공지되어 있고, 이에는 예를 들어, 헬퍼-독립적인 바이러스 발현 벡터인 바큘로바이러스 오토그래파캘리포르니카( Autographacalifornica ) 핵 다면체 바이러스(AcNPV)로부터 유래된 곤충 발현 및 전달 벡터가 포함된다. 이 시스템에서 유래된 바이러스 발현 벡터는 통상 강한 바이러스 다면체 유전자 프로모터를 이용하여, 이종성 유전자의 발현을 유도한다. 일반적으로, [O'Reilly 등, BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS: A LABORATORY MANUAL(1992)]를 참고한다.
외래 유전자를 바큘로바이러스 게놈에 삽입하기 전에, 프로모터, 리더(원하는 경우), 관심 코딩 서열, 및 전사 종결 서열을 포함하는 상기 성분들을 전형적으로 중간체 전도(transplacement) 구축물 (전달 벡터)로 어셈블리한다. 중간체 전도 구축물은 종종 레플리콘, 예컨대 숙주, 예컨대 세균에서 안정한 유지를 할 수 있는 염색체외 요소(예컨대, 플라스미드) 내에서 유지된다. 레플리콘은 복제 시스템을 가져, 클로닝 및 복제를 위해 적당한 숙주 내에서 유지되도록 한다. 보다 구체적으로, 플라스미드는 다면체 폴리아데닐화 신호(Miller, ANN. REV. MICROBIOL.(1988) 42: 177), 및 원핵생물 암피실린-내성(amp) 유전자 및 E. 콜라이에서의 선택 및 증폭을 위한 복제의 기원을 포함할 수 있다.
AcNPV로의 외래 유전자를 도입하기 위한 통상 사용되는 한 전달 벡터는 pAc373이다. 예를 들어, 다면체 개시 코돈을 ATG에서 ATT로 변경시키고, ATT의 하류에 있는 BamHI 클로닝 부위 32개 염기쌍을 도입하는 pVL985를 포함한, 당업자에게 공지된 많은 다른 벡터도 또한 설계되었다. [Luckow 및 Summers, VIROLOGY 170: 31(1989)]를 참고한다. 다른 시중 입수가능한 벡터에는 예를 들어, PBlueBac4.5/V5-His; pBlueBacHis2; pMelBac; pBlueBac4.5(인비트로겐 코포레이션(미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)가 포함된다.
이종성 유전자의 삽입 후, 전달 벡터 및 야생형 바큘로바이러스 게놈은 곤충 세포 숙주로 동시 트랜스펙션된다. 이종성 DNA를 바큘로바이러스성 바이러스 내의 요망되는 부위에 도입하는 방법이 당업계에 공지되어 있다. [SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN No. 1555(1987); Smith 등, M0L. CELL. BIOL.(1983)3: 2156; Luckow and Summers, VIROLOGY(1989) 170: 31]를 참고한다. 예를 들어, 삽입은 동종성 이중 크로스오버 재조합에 의해 다면체 유전자와 같은 유전자에 대해 이루어질 수 있고; 삽입은 요망되는 바큘로바이러스 유전자로 공학처리되어 들어간 제한 효소 부위에 대해 이루어질 수 있다. [Miller 등, BIOESSAYS(1989) 11(4): 91]을 참고한다.
트랜스펙션은 전기천공에 의해 달성될 수 있다. [TROTTER AND WOOD, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY(1995); Mann 및 King, J. GEN. VIROL.(1989) 70: 3501]를 참고한다. 대안적으로, 리포좀은 재조합 발현 벡터 및 바큘로바이러스로 곤충 세포를 트랜스펙션하는데 사용될 수 있다. 예컨대, [Liebman 등, BIOTECHNIQUES(1999) 26(1): 36; Graves 등, BIOCHEMISTRY(1998) 37: 6050; Nomura 등, J. BI0L. CHEM.(1998) 273(22): 13570; Schmidt 등, PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION(1998) 12: 323; Siffert 등, NATURE GENETICS(1998) 18: 45; TILKINS 등, CELL BIOLOGY: A LABORATORY HANDBOOK 145-154(1998); Cai 등, PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION(1997) 10: 263; Dolphin 등, NATURE GENETICS(1997) 17: 491; Kost 등, GENE(1997) 190: 139; Jakobsson 등, J. BIOL. CHEM.(1996) 271: 22203; Rowles 등, J. BI0L. CHEM.(1996) 271(37): 22376; Reverey 등, J. BIOL. CHEM.(1996) 271(39): 23607-10; Stanley 등, J. BI0L. CHEM.(1995) 270: 4121; Sisk 등, J. VIROL.(1994) 68(2): 766; 및 Peng 등, BIOTECHNIQUES(1993) 14(2): 274]를 참고한다. 시중 입수가능한 리포좀에는 예를 들어, 셀펙틴(Celifectin)
Figure 112007014691585-PCT00019
및 리포펙틴(Lipofectin)
Figure 112007014691585-PCT00020
(인비트로겐 코포레이션(미국 캘리포니아주 칼스배드 소재))이 포함된다. 또한, 칼슘 포스페이트 트랜스펙션이 사용될 수 있다. [TROTTER AND WOOD, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY(1995); Kitts, NAR(1990) 18(l9): 5667; 및 Mann 및 King, J. GEN. VIROL.(1989) 70: 3501]를 참고한다.
바큘로바이러스 발현 벡터는 통상 바큘로바이러스 프로모터를 함유한다. 바큘로바이러스 프로모터는 바큘로바이러스 RNA 중합효소에 결합하여, 코딩 서열(예컨대, 구조 유전자)의 mRNA로의 하류(3') 전사를 개시할 수 있는 임의의 DNA 서열이다. 프로모터는 통상 코딩 서열의 5' 말단에 인접하게 위치하는 전사 개시 영역을 가질 것이다. 이 전사 개시 영역은 전형적으로 RNA 중합효소 결합 부위 및 전사 개시 부위를 포함한다. 바큘로바이러스 프로모터는 또한 존재하는 경우, 통상 구조 유전자와 떨어져 위치하는, 증진제로 칭해지는 제2 도메인을 가질 수 있다. 또한, 발현은 제어 또는 구성적일 수 있다.
감염 사이클에서 후반기에 풍부하기 전사되는 구조 유전자는 특히 유용한 프로모터 서열을 제공한다. 예에는 바이러스 다면체 단백질를 코딩하는 유전자(FRIESEN 등, The Regulation of Baculovirus Gene Expression in THE MOLECULAR BIOLOGY OF BACULOVIRUSES(1986); EP 0 127 839 및 0 155 476) 및 p10 단백질을 코딩하는 유전자(Vlak 등, J. GEN. VIROL.(1988) 69: 765)로부터 유래된 서열이 포함된다.
새로 형성된 바큘로바이러스 발현 벡터는 감염성 재조합 바큘로바이러스에 팩키징될 수 있고, 후속하여 성장된 플라크는 당업계의 숙련가에 공지된 기법에 의해 정제될 수 있다. [Miller 등, BIOESSAYS(1989) 11(4): 91; SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN NO. 1555(1987)]를 참고한다.
재조합 바큘로바이러스 발현 벡터들이 수개의 곤충 세포로의 감염에 대해 개발되어 왔다. 예를 들어, 재조합 바큘로바이러스는, 특히 아에데스 아에집티(ATCC No. CCL-125), 봄비스 모리(ATCC No. CRL-8910), 드로소필라 멜라노가스터(ATCC No. 1963), 스포도프테라 프루기페르다 및 트리초플루시아 니에 대해 개발되어 왔다. [WO 89/046,699; Wright, NATURE(1986) 321: 718; Carbonell 등, J. VIROL.(1985) 56: 153; Smith 등, M0L. CELL. BIOL.(1983)3: 2156]을 참고한다. 일반적으로, [Fraser 등, IN VITRO CELL. DEv. BI0L.(1989) 25: 225]를 참고한다. 보다 구체적으로, 바큘로바이러스 발현 벡터 시스템을 위해 사용되는 세포주에는 통상 Sf9(스포 도프테라 프루기페르다)(ATCC No. CRL-171 1), Sf21(스포도프테라 프루기페르다)(인비트로겐 코포레이션 카달로그 No. 11497-013 (미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)), 트리-368(트리초플루시아 니), 및 하이-파이브(High-Five)TM BTI-TN-5B1-4(트 리초 플루시아 니)가 포함되나, 이들에 제한되지 않는다.
바큘로바이러스/발현에 있어 이종성 폴리펩티드의 직접적 및 융합 발현 모두를 위한 세포 및 배지가 시중 입수가능하고, 세포 배양 기술이 일반적으로 당업계의 숙련가에게 공지되어 있다.
E. 콜라이 , 슈도모나스 종, 및 기타 원핵생물 세균 발현 기법이 당업계에 공지되어 있다. 매우 다양한 벡터들이 세균 숙주에서 사용하기 위해 이용가능하다. 벡터는 단일 복사체, 또는 저 또는 고 다중복사체 벡터일 수 있다. 벡터는 클로닝 및/또는 발현을 위해 작용할 수 있다. 벡터, 많은 벡터들의 시중 입수가능성, 및 심지어는 벡터, 및 그것의 제한 맵 및 특성을 설명하는 매뉴얼에 관한 충분한 문헌이 있음을 볼 때, 심의 논의가 여기서 필요하지 않다. 공지되어 있는 바와 같이, 벡터는 정상적으로 선택을 허용하는 마커를 포함하고, 이 마커는 세포독성제 내성, 야생형 또는 면역을 위한 것이다. 빈번하게, 복수개의 마커가 존재하고, 이는 상이한 특성을 위한 것이다.
세균 프로모터는 세균 RNA 중합효소에 결합하여, 코딩 서열(예컨대, 구조 유전자)의 mRNA로의 하류(3') 전사를 개시할 수 있는 임의의 DNA 서열이다. 프로모터는 통상 코딩 서열의 5' 말단에 인접하게 위치하는 전사 개시 영역을 가질 것이다. 이 전사 개시 영역은 전형적으로 RNA 중합효소 결합 부위 및 전사 개시 부위를 포함한다. 세균 프로모터는 또한 RNA 합성이 시작되는 곳인 인접 RNA 중합효소 결합 부위와 중첩될 수 있는 작동자로 불리는 제2 도메인을 가질 것이다. 유전자 억제자 단백질이 작동자에 결함함으로써 특정 유전자의 전사를 억제함에 따라, 작동자는 음의 제어 (유도성) 전사를 허용한다. 지속적 발현이 음의 제어 요소, 예컨대 작동자의 부재 하에 일어날 수 있다. 또한, 양의 제어는 존재하는 경우, 통상 RNA 중합효소 결합 서열에 대해 (5')에 인접하는 유전자 활성화제 단백질 결합 서열에 의해 달성될 수 있다. 유전자 활성화제 단백질의 한 예는 이화 생성물 활성화제 단백질(CAP)이고, 이는 에스케리치아 콜라이(E. 콜라이)에서의 lac 오페론의 전사 개시를 돕는다[Raibaud 등, ANNU. REV. GENET.(1984) 18: 173]. 그러므로 제어된 발현은 양 또는 음의 것일 수 있어, 전사를 증진 또는 감소시킬 수 있다.
대사 경로 효소를 코딩하는 서열은 특히 유용한 프로모터 서열을 제공한다. 예에는 당 대사작용 효소, 예컨대 갈락토스, 락토스(lac)[Chang 등, NATURE(1977) 198: 1056], 및 말토스로부터 유래된 프로모터 서열이 포함된다. 부가적 예에는 생합성 효소, 예컨대 트립토판(trp)으로부터 유래된 프로모터 서열[본원에 각기 참고로 인용되는, Goeddel 등, NUCL. ACIDS RES.(1980) 8: 4057; Yelverton 등, NUCL. ACIDS REs.(1981) 9: 731; U.S. 특허 No. 4, 738,921; EP Pub. No. 036 776 및 121 775]. β-갈락토시다제(bla) 프로모터 시스템[Weissmann(1981) "The cloning of interferon and other mistakes" In Interferon 3 (편저 I. Gresser)], 박테리오파지 람다 PL[본원에 각기 참고로 인용되는, Shimatake 등, NATURE(1981) 292: 128] 및 T5 U.S. 특허 No. 4,689,406]이 포함된다. 프로모터 시스템은 또한 유용한 프로모터 서열을 제공한다. 본 발명의 바람직한 방법은 강한 프로모터, 예컨대 높은 수준으로 BSP를 유도하는 T7 프로모터를 이용한다. 그러한 벡터의 예가 당업계에 공지되어 있고, 이에는 노바겐(Novagen)의 pET29 계열, 및 본원에 참고로 인용되는 WO 99/05297에 기재된 pPOP 벡터가 포함된다. 그러한 발현 시스템은 숙주 세포 생존력 또는 성장 파라미터와 타협하지 않고 숙주 내의 높은 수준의 BSP를 생성시킨다.
또한, 천연 발생되지 않는 합성 프로모터가 또한 세균 프로모터로 기능한다. 예를 들어, 하나의 세균 또는 박테리오파지 프로모터의 전사 활성화 서열이 다른 한 세균 또는 박테리오파지 프로모터의 오페론 서열과 결합되어, 합성 혼성체 프로모터를 발생시킬 수 있다[본원에 참고로 인용되는 U.S. 특허 No. 4,551,433]. 예를 들어, tac 프로모터는 lac 억제자에 의해 제어되는 trp 프로모터, 및 lac 오페론 서열로 구성되는 혼성체 trp-lac 프로모터이다[Amann 등, GENE(1983) 25: 167; de Boer 등, PROC. NATL. ACAD. Sci.(1983) 80: 21]. 또한, 세균 프로모터에는 세균 RNA 중합효소에 결합하여 전사를 개시할 수 있는 비세균 기원의 천연 발생 프로모터가 포함될 수 있다. 비세균 기원의 천연 발생 프로모터는 또한 화합성(compatible) RNA 중합효소에 결합하여, 원핵생물 내 일부 유전자의 높은 수준의 발현을 생성시킬 수 있다. 박테리오파지 T7 RNA 중합효소/프로모터 시스템은 결합된 프로모터 시스템의 한 예이다[Studier 등, J. MOL. BI0L.(1986) 189: 113; Tabor 등, Proc Natl. Acad. Sci.(1985) 82: 1074]]. 또한, 혼성체 프로모터는 또한 박테리오파지 프로모터 및 E. 콜라이 작동자 영역으로 구성될 수 있다(EP 공개 No. 267 851).
기능성 프로모터 서열에 부가하여, 효율적 리보솜 결합 부위가 또한 원핵생물 내 외래 유전자의 발현에 유용하다. E. 콜라이에서, 리보솜 결합 부위는 샤인-달가르노(Shine-Dalgarno)(SD) 서열로 불리고, 이에는 개시 코돈의 상류에서 3-11 뉴클레오티드에 위치하는 길이상 서열 3-9 뉴클레오티드 및 개시 코돈(ATG)를 포함한다[Shine 등, NATURE(1975) 254: 34]. SD 서열은 E. 콜라이 16S rRNA의 3' 말단 과 SD 서열 사이의 염기 쌍짓기에 의해 리보솜으로의 mRNA의 결합을 촉진하는 것으로 사료된다[Steitz 등, "Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA", In Biological Regulation and Development: Gene Expression(편저 R. F. Goldberger, 1979)]. 약한 리보솜-결합 부위를 갖는 원핵생물 유전자 및 진핵생물 유전자를 발현함에 대해, [Sambrook 등 "Expression of cloned genes in Escherichia coli", Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 198]를 참고한다.
용어 "세균 숙주" 또는 "세균 숙주 세포"는 재조합 벡터 또는 기타 전달 DNA용 수여자로서 사용될 수 있거나 사용되었거나 사용되는 세균을 가리킨다. 그 용어에는 트랙스펙션된 원래의 세균 숙주 세포의 후대가 포함된다. 단일 모 세포의 후대는 반드시 우발적 또는 고의적 변이로 인해, 원래의 모에 대해, 형태 또는 게놈 상으로 완전히 일치하거나, 총체적 DNA 상보체일 필요가 없는 것으로 이해된다. 관련 성질, 예컨대 BSP를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 존재를 특징으로 하는 모에 대해 충분히 유사한 모 세포의 후대가 이 정의에 의해 의도되는 후대에 포함된다.
BSP의 발현을 위한 적당한 숙주 세균 세포의 선택은 당업계의 숙련가에게 공지되어 있다. 발현을 위한 세균 숙주를 선택할 때, 적당한 숙주는 특히 양호한 분비 성능, 낮은 단백질분해 활성, 양호한 가용성 단백질 생성, 및 전반적 강인도를 가지는 것들이 포함될 수 있다. 세균은 일반적으로 효모 유전학 스톡 센터, 생물리학 및 의료물리학 부, 캘리포니아 대학(미국 캘리포니아주 버클리 소재), 및 미국 미생물 보존 센터("ATCC")(미국 버지니아주 마나사스 소재)를 비제한적 예로 포함하는 각종 출처들로부터 입수가능하다. 산업적/약제학적 발효는 일반적으로 K 균주(예컨대, W3110)로부터 유래된 세균, 또는 B 균주(예컨대, BL21)로부터 유래된 세균을 이용한다. 이 균주들은 그 성장 파라미터가 매우 공지되어 있고 강건하기 때문에 특히 유용하다. 또한, 이 균주는 비병원성이고, 이는 안전 및 환경적 이유로 인해 상업적으로 중요하다. 본 발명의 방법의 한 실시양태에서, E. 콜라이 숙주는BL21의 균주이다. 본 발명의 방법의 다른 한 실시양태에서, E. 콜라이 숙주는 OMP- 및 LON-를 비제한적 예로 포함하는 프로테아제 마이너스 균주이다. 본 발명의 방법의 다른 한 실시양태에서, 숙주 세포 균주는 슈도모나스 플루오레슨스 , 슈도모나사 우에루기노사 및 슈도모나스 푸디다를 비제한적 예로 포함하는 슈도모나사의 종이다. 균주 MB101로 표시되는 슈도모나스 플루오레슨스 생물형 1은 재조합 생성에 유용한 것으로 알려져 있고, 이는 치료적 단백질 생성 공정을 위해 이용가능하다. 슈도모나스 발현 시스템의 예에는 더 다우 케미칼 컴퍼니(The Dow Chemical Company)(미국 미시간주 미들랜드 소재, 웹사이트 dow.com에서 이용가능함)에 의해 숙주 균주로서 입수가능한 시스템이 포함된다. 본원에 각기 참고로 인용되는, U.S. 특허 No. 4,755,465 및 4,859,600는 hGH 생성을 위한 숙주 세포로서의 슈도모나스 균주를 용도를 기재하고 있다.
일단 재조합 숙주 세포 균주가 구축되면(즉, 발현 구축물이 숙주 세포에 도입되고, 적절한 발현 구축물을 갖는 숙주 세포가 단리되면), 재조합 숙주 세포 균주가 BSP의 생성에 적절한 조건 하에서 배양된다. 당업자에게 자명한 바와 같이, 재조합 숙주 세포 균주의 배양 방법은 이용되는 발현 구축물의 성질, 및 숙주 세포의 실체에 의존할 것이다. 재조합 숙주 균주는 정상적으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 배양된다. 재조합 숙주 세포는 전형적으로 탄소, 질소 및 무기 염의 동화성 원을 함유하고, 임의적으로는 비타민, 아미노산, 성장 인자, 및 당업계에 공지된 기타 단백질성 보충물을 함유하는 액체 배지 내에서 배양된다. 숙주 세포의 배양을 위한 액체 배지는 임의적으로 바람직하지 않은 미생물의 성장을 방지하기 위한 항생제 또는 항진균제, 및/또는 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포를 위해 선택하는 항생제를 비제한적 예로 포함하는 화합물을 함유할 수 있다.
재조합 숙주 세포는, 세포를 수확하거나(BSP가 세포내 축적되는 경우), 또는 배치 또는 연속 형태로 배양 상등액을 수확하면서, 배치 또는 연속 형태로 배양될 수 있다. 원핵생물 숙주 세포 내에 생성시키기 위해, 배치 배양 및 세포 수확이 바람직하다.
본 발명의 BSP는 정상적으로 재조합 시스템에서 발현된 후 정제된다. BSP는 당업계에 공지된 각종 방법들에 의해 숙주 세포로부터 정제될 수 있다. 정상적으로, 세균 숙주 세포에서 생성된 BSP는 (봉입체의 형태로) 난용성 또는 불용성일 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 아미노산 치환은 본원에 개시된 방법 및 당업계에 공지되어 있는 방법을 이용하여 재조합으로 생성된 단백질의 용해도를 증가시키는 목적을 위해 선택되는 BSP에서 용이하게 행해질 수 있다. 불용성 단백질의 경우, 단백질은 원심부닐에 의해 숙주 세포의 분해물로부터 수집될 수 있고, 그 후 세포의 균질화가 이어질 수 있다. 난용성 단백질의 경우, 폴리에틸렌 이민(PEI)을 비제한적 예로 포함하는 화합물을 첨가하여, 부분적으로 가용성인 단백질의 제조를 유도할 수 있다. 석출된 단백질은 이어서 원심분리에 의해 수집될 수 있다. 재조합 숙주 세포를 파열 또는 균질화시켜, 당업계의 숙련가에게 공지된 각종 방법들을 이용하여 세포 내에서 봉입체를 방출시킬 수 있다. 숙주 세포 파열 또는 균질화는 효소에 의한 세포 파열, 음파처리, 다운스 균질화, 또는 고압 방출 파열을 비제한적 예로 포함하는 공지된 기법을 이용하여 수행될 수 있다. 본 발명의 방법의 한 실시양태에서, 고압 방출 기법을 사용하여, E. 콜라이 숙주 세포를 파열시켜, BSP의 봉입체를 방출시킬 수 있다. BSP의 봉입체를 취급할 때, 가용화, 기계적 전단 또는 단백질분해와 같은 인자들로 인한 손실없이 봉입체의 수율을 최대화하기 위해 반복 시의 균질화 시간을 최소화하는 것이 유리할 수 있다. 봉입체의 형성 경향은 특정 다른 단백질, 예컨대 TrpLE에 대한 표적 단백질의 융합에 의해[Georgiou, G.(1996) in Protein engineering: Principles and Practice (Cleland, J. L. 및 Craik, C. S., 편저), pp. 101-127, Wiley-Liss, New York, Ford, C. F., Suominen, I. 및 Glatz, C. B.(1991) Protein Expression Purif. 2, 95-107], 또한 7.0 외의 pH에서 또는 상승된 온도에서 재배함으로써 증진될 수 있다.
불용성이거나 석출된 BSP는 이어서 당업계에 공지되어 있는 수많은 적당한 가용화제를 이용하여 가용화될 수 있다. 바람직하게, BSP는 우레아 또는 구아니딘 히드로클로라이드를 이용하여 가용화된다. 가용화된 BSP의 부피는, 편리하게 조작할 수 있는 배치 크기를 이용하여 큰 배치가 생성될 수 있도록 최소화되어야 한다. 이 인자는 재조합 숙주가 부피가 수천 리터인 배치에서 성장할 수 있게 하는 대규모 상업용 세팅에서 중요할 수 있다. 또한, 대규모 상업용 세팅에서 BSP를 제조할 때, 특히 인간 약제학적 용도에 대해, 기작 및 용기에 손상을 줄 수 있는 거친 화학물질 또는 단백질 생성물 자체의 회피가 가능한 한, 피해져야 한다. 보다 거친 변성화제 구아니딘 히드로클로라이드르 대신에, 보다 마일드한 변성화제 우레아를 사용하여 BSP 봉입체를 가용화할 수 있음이 본 발명의 방법에서 나타났다. 우레아의 사용은, BSP 봉입체를 효율적으로 가용화하면서 BSP의 제조 및 정제 공정에서 이용되는 스테인레스 스틸 장비에 대한 손상 위험을 상당히 감소시킨다.
가용성 BSP의 경우, BSP는 원형질막 주위 공간 또는 배지로 분비될 수 있다. 또한, 가용성 BSP는 숙주 세포의 세포질 내에 존재할 수 있다. 정제 단계를 수행하기 전에, 농축 수용성 BSP를 농축하는 것이 요망될 수 있다. 당업계의 숙련가에게 공지된 표준 기법을 사용하여, 예를 들어 세포 분해물 또는 배지로부터 수용성 BSP를 농축할 수 있다. 또한, 당업계의 숙련가에게 공지된 표준 기법을 사용하여, 숙주 세포를 파열하고, 숙주 세포의 세포질 또는 원형질막 주위 공간으로부터 가용성 BSP을 방출시킬 수 있다.
BSP가 융합 단백질로서 생성될 때, 융합 서열이 바람직하게 제거된다. 융합 서열의 제거는, 효소적 절단 또는 화학적 절단을 비제한적 예로 포함하는 수많은 상이한 조건 하에서 달성될 수 있다. 융합 서열의 효소적 제거는 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 달성될 수 있다. 융합 서열의 제거를 위한 효소의 선택은 융합의 실체에 의해 구해질 것이고, 반응 조건은 당업자에게 명백한 바와 같이 효소의 선택에 의해 구체화될 것이다. 화학적 절단은 당업자에게 공지된 시약을 이용하여 달성될 수 있다. 그러한 한 시약은 메티오닌 잔기에서 절단되는 브롬화 시아노겐이다. 절단된 BSP는 바람직하게 공지된 방법에 의해 절단된 융합 서열로부터 정제된다. 그러한 방법은 당업자에게 명백한 바와 같이, 융합 서열 및 BSP의 실체 및 성질에 의해 구해질 것이다. 예를 들어, 융합 서열의 제거를 위한 펩티드 결합은 광자 에너지에의 노출, 증가된 온도, 감소된 온도, 증가된 pH, 감소된 pH, 아원자 입자의 노출, 촉매의 첨가, 효소와의 인큐베이션, 다른 한 화학적 작용기와의 접촉, 및/또는 다른 조건 하에서 절단될 수 있다. 상기 조건들 중 하나 이상의 조건 하에서 절단되는 펩티드 결합의 경우, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 광활성화된 작용기, pH 활성화된 작용기, 온도 활성화된 작용기, 촉매를 필요로 하는 작용기, 및 프로테아제, 효소, 또는 다른 한 화학적 작용기에 의해 인식되는 작용기를 비제한적 예로 포함하는, 1개 이상의 특성을 갖는 작용기를 가질 수 있다. 정제 방법에는 크기 배제 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 또는 투석 또는 이들의 임의의 조합이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다.
단백질 용액으로부터 DNA를 제거하기 위해, BSP를 정제하는 것이 또한 바람직하다. DNA는 당업계에 공지된 임의의 적당한 방법, 예컨대 석출 또는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 제거될 수 있으나, 바람직하게는 핵산 석출제, 예컨대 비제한적 예로서 프로타민 술페이트를 이용한 석출에 의해 제거된다. BSP는 원심분리 또는 여과를 비제한적 예로 포함하는 표준 공지 방법을 이용하여 석출된 DNA로부터 분리될 수 있다. 숙주 핵산 분자의 제거는 BSP가 인간을 치료하게 되는 세팅에 있어 중요한 인자이고, 본 발명의 방법은 숙주 세포 DNA를 약제학적으로 허용가능한 수준으로 감소시킨다.
또한, 발효기, 쉐이크 플라스크, 유동층 바이오리액터, 중공 섬유 바이오리액터, 롤러 병 배양 시스템, 및 교반 탱크 바이오리액터 시스템을 비제한적 예로 포함하는, 소규모 또는 대규모 발효를 위한 방법이 단백질 발현에 사용될 수 있다. 이 방법들은 각기 배치, 공급-배치, 또는 연속 방식의 공정으로 수행될 수 있다.
본 발명의 인간 BSP는 일반적으로 당업계에서의 표준 방법을 이용하여 회수될 수 있다. 예를 들어, 배지 또는 세포 분해물을 원심분리 또는 여과하여, 세포 잔사를 제거할 수 있다. 상등액을 원하는 부피로 농축 또는 희석하거나, 추가 정제를 위해 제제를 컨디셔닝하기 위해 적당한 완충액으로 투석여과할 수 있다. 본 발명의 BSP의 추가 정제는 탈아미드화 및 클립핑된 형태의 BSP 변종체를 비변형 형태로부터 분리시키는 것을 포함한다.
하기 예시적 절차들 중 임의의 절차를 본 발명의 BSP의 정제를 위해 이용할 수 있다: 친화도 크로마토그래피; 음이온- 또는 양이온 교환 크로마토그래피 (DEAE 세파로스(SEPHAROSE)의 이용, 단 이를 비제한적 예로 포함함); 실리카 상의 크로마토그래피; 역상 HPLC; 겔 여과(스파덱스(SEPHADEX) G-75 이용, 단 이를 비제한적 예로 포함함); 소수성 상호작용 크로마토그래피; 크기 배제 크로마토그래피, 금속-킬레이트 크로마토그래피; 초여과/투석여과; 에탄올 석출; 암모늄 술페이트 석출; 크로마토포커싱; 치환 크로마토그래피; 전기영동 절차(제조용 등전점 포커싱을 비제한적 예로 포함함), 시차 가용화(암모늄 술페이트 석출을 비제한적 예로 포함함), SDS-PAGE 또는 추출.
비천연 아미노산를 포함하는 단백질, 비천연 아미노산을 포함하는 펩티드, 비천연 아미노산을 포함하는 단백질에 대한 항체, 비천연 아미노산을 포함하는 단백질에 대한 결합 상대 등을 비제한적 예로 포함하는 본 발명의 단백질을 당업자에게 공지되어 있고 당업자가 사용하는 표준 절차에 따라, 부분적으로 또는 실질적으로 균질하게 정제될 수 있다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 암모늄 술페이트 또는 에탄올 석출, 산 또는 염기 추출, 칼럼 크로마토그래피, 친화도 칼럼 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 히드록실아파이트 크로마토그래피, 렉틴 크로마토그래피, 겔 전기영동 등을 비제한적 예로 포함하는, 당업계에 공지된 수많은 방법들에 의해 회수 및 정제될 수 있다. 바로 접힌 성숙 단백질을 제조할 때, 원하는 경우, 단백질 재접힘 단계가 사용될 수 있다. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 친화도 크로마토그래피 또는 기타 적당한 방법을, 고순도가 요망되는 최종 정제 단계에서 이용할 수 있다. 한 실시양태에서, 비천연 아미노산(또는 비천연 아미노산을 포함하는 단백질 또는 펩티드)에 대해 제조된 항체를, 1개 이상의 비천연 아미노산(들)을 포함하는 단백질 또는 펩티드의 친화도-기재 정제를 위한(단, 이에 제한되지 않음) 정제 시약으로 사용한다. 일단 정제되면, 원하는 대로 부분적으로 또는 균질하게, 폴리펩티드를 임의적으로 검정 성분, 치료제, 예방제, 진단제, 연구 시약, 및/또는 항체 생성을 위한 면역원을 비제한적 예로 포함하는 매우 다양한 용도들을 위해 사용한다.
본원에 언급된 다른 참고문헌에 부가하여, [R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y.(1982); Deutscher, Methods in Enzymology 제182권: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc. N.Y.(1990); Sandana(1997) Bioseparation of Protein, Academic Press, Inc.; Bollag 등(1996) Protein Methods, 제2판 Wiley-Liss, NY; Walker(1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ, Harris and Angal(1990) Protein Applications: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England; Harris and Angal, Protein Methods: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England; Scopes(1993) Protein Purification Methods: Principles and Practice 제3판 Springer Verlag, NY; Janson 및 Ryden(1998) Protein Purification: Principles, High Resolution Methods and Applications, 제2판 Wiley-VCH, NY; 및 Walker(1998), Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, NJ; 및 여기에 언급된 참고문헌들에 나와 있는 세트들을 비제한적 예로 포함하는 각종 정제/단백질 접힘 방법들이 당업계에 공지되어 있다.
진핵생물 숙주 세포 또는 비진핵생물 숙주 세포에서 비천연 아미노산을 이용하여 관심 단백질 또는 폴리펩티드를 생성시키는 한 이점은, 전형적으로 단백질 또는 폴리펩티드가 그 본연의 구조로 접혀지게 된다는 것이다. 그러나, 본 발명의 실시양태들에서, 당업자는 합성, 발현 및/또는 정제, 단백질 또는 펩티드가 관련 폴리펩티드의 요망되는 구조와 상이한 구조를 가질 수 있음을 인지할 것이다. 본 발명의 한 측면에서, 발현된 단백질 또는 폴리펩티드는 임의적으로 변성된 후, 재변성된다. 이는, 샤퍼로닌을 관심 단백질 또는 폴리펩티드에 첨가하는 것, 구아니딘 HCl과 같은 무질서 유발제 내에 단백질을 가용화하는 것, 단백질 디술피드 이성체화효소를 이용하는 것 등을 비제한적 예로 포함하는, 당업계에 공지된 방법을 이용하여 달성된다.
일반적으로, 발현된 폴리펩티드를 변성하고 환원한 후, 폴리펩티드를 바람직한 구조로 재접힘시키는 것이 경우에 따라 바람직하다. 예를 들어, 구아니딘, 우레아, DTT, DTE, 및/또는 샤퍼로닌은 관심 번역 생성물에 첨가될 수 있다. 단백질의 환원, 변성 및 재변성 방법이 당업자에게 공지되어 있다(상기 문헌들, 및 [Debinski 등(1993) J. Biol . Chem ., 268: 14065-14070; Kreitman and Pastan(1993) Bioconjug . Chem ., 4: 581-585; 및 Buchner 등(1992) Anal. Biochem., 205: 263-270]를 참고한다. 예를 들어, Debinski 등은 구아니딘-DTE에서의 봉입 체의 변성 및 환원을 기재하고 있다. 단백질은 산화된 글루타티온 및 L-아르기닌을 함유하는(단, 이에 제한되지 않음) 산화환원 완충액 내에서 재접힐 수 있다. 재접힘 시약은 1개 이상의 폴리펩티드 또는 다른 발현 생성물과 접촉하도록 유동하거나 기타 방식으로 이동할 수 있으며, 그 역도 성립한다.
BSP의 원핵생물 생성의 경우, 이에 생성된 BSP는 잘못 접힐 수 있고, 이에 따라 생물학적 활성이 부족하거나 감소되어 있다. 단백질의 생활성은 "재접힘"에 의해 회복될 수 있다. 일반적으로, 잘못 접힌 BSP는 예를 들어, 폴리펩티드 사슬을 가용화시키고(BSP가 또한 불용성인 경우), 풀고, 1개 이상의 무질서 유발제(예컨대, 우레아 및/또는 구아니딘) 및 디술피드 결합를 환원시킬 수 있는 환원제(예컨대, 디티오트레이톨, DTT 또는 2-메르캅토에탄올, 2-ME)를 이용하여 환원시킴으로써 재접힌다. 무질서제의 보통 정도의 농도에서, 이어서 산화제(예컨대, 산소, 시스틴 또는 시스타민)를 첨가하고, 이는 디술피드 결합이 재형성되도록 한다. BSP를 예컨대 본원에 각기 참고로 인용되는, U.S. 특허 No. 4,511,502, 4,511,503, 및 4,512,922에 기재된 바와 같은, 당업계에 공지된 표준 방법을 이용하여 재접힐 수 있다. BSP는 또한 다른 단백질과 함께 함께 접힘으로써, 이종이량체 또는 이종다량체를 형성할 수 있다. 재접힘 또는 동시 접힘 후에, BSP는 바람직하게 추가 정제된다.
일반적 정제 방법 각종 단리 단계들 중 임의의 단계를, BSP를 포함하는 세포 분해물에 대해, 또는 친화도 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피 ("HPLC"), 역상 HPLC ("RP-HPLC"), 발포층 흡수, 또는 이들의 임의의 순서로의 임의의 조합 및/또는 반복을 비제한적 예로 포함하는 임의의 단리 단계로부터 수득되는 임의의 BSP 혼합물 또는 BSP 함유 세포 분해물에 대해 수행할 수 있다.
본원에 기재된 기법을 수행하는데 사용되는 장비 및 기타 필요 물질이 시중 입수가능하다. 펌프, 분획 분취기(fraction collector), 모니터, 리코더, 및 전반 시스템은 예를 들어, [어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems(미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재), 바이오-래드 라보라토리즈(미국 캘리포니아주 헤르큘레스 소재), 및 아머샴 바이오사이언스 인코포레이티드(Amersham Biosciences, Inc.)(미국 뉴저지주 피스캐터웨이 소재))]로부터 입수가능하다. 교환 매트릭스 물질, 매질 및 완충제를 비제한적 예로 포함하는 크로마토그래피 물질도 또한 상기 회사들로부터 입수가능하다.
세척 및 용리와 같은, 본원에 기재된 칼럼 크로마토그래피 공정에서의 평형화, 및 기타 단계는 펌프와 같은 특수화 장비를 이용하여 더 급속히 달성될 수 있다. 시중 입수가능한 펌프에는 하이로드(HILOAD)
Figure 112007014691585-PCT00021
펌프 P-50, 튜브연동식 펌프 P-1, 펌프 P-90l 및 펌프 P-903(아머샴 바이오사이언시스(Amersham Biosciences))(미국 뉴저지주 피스캐터웨이 소재)이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다.
분획 분취기의 예에는 레디플락(RediFrac) 분획 분취기, FRAC-100 및 FRAC-200 분획 분취기, 및 수퍼프랙(SUPERFRAC)
Figure 112007014691585-PCT00022
분획 분취기(아머샴 바이오사이언시스)(미국 뉴저지주 피스캐터웨이 소재)가 포함된다. 믹서가 또한 pH 및 선형 농도 구배를 형성하기 위해 이용가능하다. 시중 입수가능한 믹서에는 구배 믹서 GM-1 및 인-라인 믹서스(In-Line Mixers)(아머샴 바이오사이언시스)(미국 뉴저지주 피스캐터웨이 소재)가 포함된다.
크로마토그래피법은 임의의 시중 입수가능한 모니터를 이용하여 모니터될 수 있다. 그러한 모니터를 사용하여 UV, pH 및 전도도와 같은 정보를 수집할 수 있다. 검출기의 예에는 모니터 UV-1, 우비코드(UVICORD)
Figure 112007014691585-PCT00023
S II, 모니터 UV-M II, 모니터 UV-900, 모니터 UPC-900, 모니터 pH/C-900, 및 전도도 모니터(아머샴 바이오사이언시스)(미국 뉴저지주 피스캐터웨이 소재)가 포함된다. 실제로, 아머샴 바이오사이언시스 (미국 뉴저지주 피스캐터웨이 소재)로부터의 각종 아크타(AKTA)
Figure 112007014691585-PCT00024
시스템을 포함한 전반 시스템이 시중 입수가능하다.
본 발명의 한 실시양태에서, 예를 들어 BSP는 먼저 우레아 내에서 수득되는 정제된 BSP를 변성시킨 후, 적당한 pH에서 환원제(예컨대, DTT)를 함유하는 트리스 완충제로 희석함으로써, 환원 및 변성될 수 있다. 다른 한 실시양태에서, BSP를 약 2 M 내지 약 9 M의 농도 범위에서 우레아 내에서 변성시킨 후, 약 5.0 내지 약 8.0 범위의 pH에서 트리스 완충액 내에 희석시킨다. 이어서, 이 실시양태의 재접힘 혼합물을 인큐베이션한다. 한 실시양태에서, 재접힘 혼합물을 4시간 내지 24시간 동안 실온에서 인큐베이션한다. 이어서, 환원 및 변성 BSP 혼합물을 단리 및 정제할 수 있다.
여기에 언급된 바와 같이, 첫 번째 혼합물을 pH를 임의의 후속 단리 단계를 수행하기 전에 조정할 수 있다. 또한, 첫 번째 혼합물 또는 그것의 임의의 후속 혼합물을 당업계에 공지된 기법을 이용하여 농축시킬 수 있다. 또한, 첫 번째 혼합물 또는 그것의 임의의 후속 혼합물을 포함하는 용리액을 당업계의 숙련가에게 공지된 기법을 이용하여 이어지는 단리 단계에 적당한 완충제로 교환될 수 있다.
이온 교환 크로마토그래피 한 실시양태에서, 또한 한 임의적 부가적 단계에서, 이온 교환 크로마토그래피를 첫 번째 혼합물에 대해 수행할 수 있다. 일반적으로 [ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY: PRINCIPLES AND METHODS(카달로그 No. 18-1114-21, 아머샴 바이오사이언시스(미국 뉴저지주 피스캐터웨이 소재))를 참고한다. 시중 입수가능한 이온 교환 칼럼에는 하이트랩(HITRAP)
Figure 112007014691585-PCT00025
, 하이프렙(HIPREP)
Figure 112007014691585-PCT00026
및 하이로드(HILOAD)
Figure 112007014691585-PCT00027
칼럼(아머샴 바이오사이언시스)(미국 뉴저지주 피스캐터웨이 소재)이 포함된다. 그러한 칼럼들은 Q 세파로스
Figure 112007014691585-PCT00028
패스트 플로우(Fast Flow), Q 세파로스
Figure 112007014691585-PCT00029
고성능, 및 Q 세파로스
Figure 112007014691585-PCT00030
XL와 같은 이온 교환기; SP 세파로스
Figure 112007014691585-PCT00031
고성능, SP 세파로스
Figure 112007014691585-PCT00032
패스트 플로우, 및 SP 세파로스
Figure 112007014691585-PCT00033
XL와 같은 강한 양이온 교환; DEAE 세파로스
Figure 112007014691585-PCT00034
패스트 플로우와 같은 약한 음이온 교환기; 및 CM 세파로스
Figure 112007014691585-PCT00035
패스트 플로우와 같은 약한 양이온 교환기(아머샴 바이오사이언시스)(미국 뉴저지주 피스캐터웨이 소재)를 이용한다. 음이온 또는 양이온 교환 칼럼 크로마토그래피를 위한 정제 공정의 임의의 단계에서 BSP에 대해 수행하여, 실질적으로 정제된 BSP를 단리할 수 있다. 양이온 교환 크로마토그래피 단계를 임의의 적당한 양이온 교환 매트릭스를 이용하여 수행할 수 있다. 유용한 양이온 교환 매트릭스에는 섬유성, 다공성, 비다공성, 미세과립성, 비이드형 또는 가교 양이온 교환 매트릭스 물질이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 그러한 양이온 교환 매트릭스 물질에는 셀룰로스, 아가로스, 덱스트란, 폴리아크릴레이트, 폴리비닐, 폴리스티렌, 실리카, 폴리에테르, 또는 임의의 상기 것들의 조합이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다.
양이온 교환 매트릭스는 강한 양이온 교환기 및 약한 양이온 교환기를 포함한, 임의의 적당한 양이온 교환기일 수 있다. 강한 양이온 교환기는 넓은 pH 범위에 걸쳐 이온화된 상태로 남을 수 있고, 따라서 넓은 pH 범위에 걸쳐 BSP에 결합할 수 있다. 그러나, 약한 양이온 교환기는 pH의 함수로서 이온화를 상실할 수 있다. 예를 들어, 약한 양이온 교환기는 약 pH 4 또는 pH 5 미만으로 pH가 떨어질 때 전하를 상실할 수 있다. 적당한 강한 양이온 교환기에는 술포프로필(SP), 메틸 술포네이트(S) 또는 술포에틸(SE)이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 양이온 교환 매트릭스는 바람직하게 BSP 결합 pH 범위가 약 2.5 내지 약 6.0인 강한 양이온 교환기일 수 있다. 대안적으로, 강한 양이온 교환기는 BSP 결합 pH 범위가 약 pH 2.5 내지 약 pH 5.5일 수 있다. 양이온 교환 매트릭스는 BSP 결합 pH가 약 3.0인 강한 양이온 교환기일 수 있다. 대안적으로, 양이온 교환 매트릭스는 바람직하게 BSP 결합 pH 범위가 약 6.0 내지 약 8.0인 강한 양이온 교환기일 수 있다. 양이온 교환 매트릭스는 바람직하게 BSP 결합 pH 범위가 약 8.0 내지 약 12.5인 강한 양이온 교환기일 수 있다. 대안적으로, 강한 양이온 교환기는 BSP 결합 pH 범위가 약 pH 8.0 내지 약 pH 12.0일 수 있다.
BSP 로딩 전에, 양이온 교환 매트릭스를 예를 들어, 수가지 칼럼 체절의 희석된 약한 산, 예컨대 4개 칼럼 부피의 20 mM 아세트산(pH 3)을 이용하여 평형화할 수 있다. 평형화 후, BSP를 첨가할 수 있고, 칼럼을 실질적으로 정제된 BSP를 용리하기 전에, 또한 약한 아세트산 또는 인산 용액과 같은 약한 산 용액을 이용하여 일회 내지 수회 세척할 수 있다. 예를 들어, 대략 2-4 칼럼 체적의 20 mM 아세트산(pH 3)을 사용하여 칼럼을 세척할 수 있다. 예컨대, 2-4 칼럼 체적의 0.05 M 아세트산나트륨(pH 5.5), 또는 0.1 M 염화나트륨(pH 5.5)과 혼합된 0.05 M 아세트산나트륨을 이용한 부가적 세척을 또한 이용할 수 있다. 대안적으로, 당업계에 공지된 방법을 이용하여, 양이온 교환 매트릭스를 수가지 칼럼 체적의 희석 약 염기를 이용하여 평형화할 수 있다.
대안적으로, 양이온 교환기 매트릭스를 충분히 낮은 pH 또는 이온 강도를 갖는 완충액과 접촉시켜, 매트릭스로부터 BSP를 옮김에 의해 실질적으로 정제된 BSP를 용리할 수 있다. 용리 완충액의 pH는 약 pH 2.5 내지 약 pH 6.0 범위 내일 수 있다. 보다 구체적으로, 용리 완충액의 pH는 약 pH 2.5 내지 약 pH 5.5, 약 pH 2.5 내지 약 pH 5.0 범위 내일 수 있다. 용리 완충액은 pH가 약 3.0일 수 있다. 또한, 용리 완충액의 양은 다양하게 변화할 수 있고, 일반적으로 약 2 내지 약 10 칼럼 체적 범위 내일 것이다.
양이온 교환기 매트릭스로의 BSP의 흡수 후, 매트릭스를 충분히 높은 pH 또는 이온 강도를 갖는 완충액와 접촉시켜, 매트릭스로부터 BSP를 옮김으로써 실질적으로 정제된 BSP를 용리할 수 있다. 실질적으로 정제된 BSP의 높은 pH 용리에서 사용하기에 적당한 완충액에는 시트레이트, 포스페이트, 포르메이트, 아세테이트, HEPES, 및 MES 완충액(농도 범위가 약 5 mM 이상 내지 약 100 mM 이상임)이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다.
역상 크로마토그래피 RP-HPLC를 수행하여, 당업계의 숙련가에게 공지된 적당한 프로토콜에 따라 단백질을 정제할 수 있다. 예컨대, [Pearson 등, ANAL BIOCHEM.(1982) 124: 217-230(1982); Rivier 등, J. CHROM.(1983) 268: 112-119; Kunitani 등, J. CHR0M.(1986) 359: 391-402]를 참고한다. RP-HPLC를 BSP에 대해 수행하여, 실질적으로 정제된 BSP를 단리할 수 있다. 이 점에 있어서, 약 C3 이상 내지 약 C30 이상, 약 C3 이상 내지 약 C20 이상, 또는 약 C3 이상 내지 약 C18 이상 수지를 비제한적 예로 포함하는 매우 다양한 길이를 갖는, 알킬 작용기를 갖는 실리카 유도체화 수지를 사용할 수 있다. 대안적으로, 중합체성 수지를 사용할 수 있다. 예를 들어, 스티렌 중합체 수지인 토소하스 앰버크롬(TosoHaas Amberchrome) CGl000sd 수지를 사용할 수 있다. 매우 다양한 알킬 사슬 길이를 갖는 시아노 또는 중합체성 수지를 또한 사용할 수 있다. 또한, RP-HPLC 칼럼을 에탄올과 같은 용매로 세척할 수 있다. 소스 RP 칼럼이 RP-HPLC 칼럼의 다른 한 예이다.
이온 쌍형성제 및 유기 개질제, 예컨대 메탄올, 이소프로판올, 테트라히드로푸란, 아세토니트릴 또는 에탄올을 함유하는 적당한 용리 완충액을 사용하여, RP-HPLC 칼럼으로부터 BSP를 용리할 수 있다. 가장 통상적으로 사용되는 이온 쌍형성제에는 아세트산, 포름산, 과염소산, 인산, 트리플루오로아세트산, 헵타플루오로부티르산, 트리에틸아민, 테트라메틸암모늄, 테트라부틸암모늄, 트리에틸암모늄 아세테이트가 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 분리 시간을 감소시키고 피크 폭을 감소시키기 위해 바람직한 구배 조건 하에서 1개 이상의 구배 또는 등용매 조건을 이용하여 용리를 수행할 수 있다. 다른 한 방법은 상이한 용매 농도 범위를 갖는 2개 구배의 사용을 포함한다. 여기에 사용하기에 적당한 용리 완충액의 예에는 암모늄 아세테이트 및 아세토니트릴 용액이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다.
소수성 상호작용 크로마토그래피 정제 기법 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC를 BSP에 대해 수행할 수 있다. 일반적으로, 본원에 참고로 인용되는 [HYDROPHOBIC INTERACTION CHROMATOGRAPHY HANDBOOK: PRINCIPLES AND METHODS(카달로그 No. 18-1020-90, 아머샴 바이오사이언시스(미국 뉴저지주 피스캐터웨이 소재))를 참고한다. 적당한 HIC 매트릭스에는 알킬- 또는 아릴-치환 매트릭스, 예컨대 부틸-, 헥실-, 옥틸- 또는 페닐-치환 매트릭스, 예를 들어 아가로스, 가교 아가로스, 세파로스, 셀룰로스, 실리카, 덱스트란, 폴리스티렌, 폴리(메타크릴레이트) 매트릭스, 및 폴리에틸렌아민 수지를 비제한적 예로 포함하는 혼합식 수지, 또는 부틸- 또는 페닐-치환 폴리(메타크릴레이트) 매트릭스가 포함되나, 이들에 제한되지 않을 수 있다. 소수성 상호작용 칼럼 크로마토그래피를 위한 시중 입수가능한 출처에는 하이트랩
Figure 112007014691585-PCT00036
, 하이프렙
Figure 112007014691585-PCT00037
및 하이로드
Figure 112007014691585-PCT00038
칼럼(아머샴 바이오사이언시스)(미국 뉴저지주 피스캐터웨이 소재)이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다.
간략히, 로딩 전에, HIC 칼럼을 당업계의 숙련가에 공지된 표준 완충액, 예컨대 아세트산/염화나트륨 용액, 또는 암모늄 술페이트 함유의 HEPES를 이용하여 평형화할 수 있다. BSP 로딩 후, 이어서 칼럼을 표준 완충액 및 조건을 이용하여 세척하여, 원하지 않는 물질은 제거하면서도, 다만 HIC 칼럼 상에는 BSP를 보유시킬 수 있다. 특히 약 3 내지 약 10 칼럼 체적의 표준 완충액, 예컨대 EDTA 및 평형화 완충액보다 낮은 저급 암모늄 술페이트 농도를 갖는 HEPES 완충액, 또는 아세트산/염화나트륨 완충액을 이용하여 BSP를 용리할 수 있다. 예를 들어, 칼륨 포스페이트의 구배를 이용한 감소하는 선형 염 구배를 또한 사용하여 BSP 분자를 용리할 수 있다. 이어서, 용리제를 예를 들어, 투석여과 또는 초여과와 같은 여과에 의해 농축할 수 있다. 투석여과를 이용하여, BSP를 용리하기 위해 사용되는 염을 제거할 수 있다.
기타 정제 기법 예를 들어, 겔 여과(본원에 참고로 인용되는, GEL FILTRATION: PRINCIPLES AND METHODS(카달로그 No. 18-1022-18, 아머샴 바이오사이언시스)(미국 뉴저지주 피스캐터웨이 소재), 히드록시아파이트 크로마토그래피(적당한 매트릭스에는 HA-울트로겔(HA-Ultrogel), 하이 레졸루션(High Resolution)(칼바이오켐(Calbiochem)), CHT 세라믹 히드록시아파이트(바이오래드(BioRad)), 바이오-겔(바이오-겔(Bio-Gel)), HTP 히드록시아파이트(바이오래드)가 포함되나, 이들에 제한되지 않음), HPLC, 발포층 흡수, 초여과, 투석여과, 동결건조 등을 이용하는 또 다른 한 단리 단계를 첫 번째 혼합물 또는 이의 임의의 후속 혼합물에 수행하여, 과량의 염을 제거하고, 완충액을 후속 단리 단계 또는 심지어 최종 약물 생성물의 제형을 위한 적당한 완충액으로 대체할 수 있다.
실질적으로 정제된 BSP를 포함한 BSP의 수율을 당업계의 숙련가에게 공지된 기법을 이용하여 본원에 기재된 각 단계에서 모니터할 수 있다. 그러한 기법들을 사용하여, 마지막 단리 단계 후에 실질적으로 정제된 BSP의 수율을 평가할 수 있다. 예를 들어, BSP의 수율을 시아노 RP-HPLC, C18RP-HPLC; 및 양이온 교환 HPLC 및 겔 여과 HPLC와 같은 각종 알킬 사슬 길이를 갖는 수개의 역상 고압 액체 크로마토그래피 칼럼들 중 임의의 것을 이용하여 모니터할 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태들에서, 각 정제 단계 후의 BSP의 수율은, 각 정제 단계를 위한 출발 물질에서의 BSP의 약 30% 이상, 약 35% 이상, 약 40% 이상, 약 45% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상, 약 99.9% 이상, 또는 약 99.99% 이상일 수 있다.
표준 기법, 예컨대 SDS-PAGE에 의해, 또는 웨스턴 블롯 및 ELISA 검정을 이용하여 BSP를 측정함으로써 순도를 구할 수 있다. 예를 들어, 음의 조절 효모 발효 및 양이온 교환 회수로부터 단리된 단백질에 대한 다클론성 항체를 발생시킬 수 있다. 항체를 또한 숙주 세포 단백질 오염의 존재를 탐침하기 위해 사용할 수 있다.
RP-HPLC 물질 Vydac C4(Vydac)는 C4-알킬 사슬을 표면에 가지고 있는 실리카 겔 입자로 구성된다. 단백질성 불순물로부터의 BSP의 분리는 소수성 상호작용의 강도의 차이에 기초한다. 희석된 트리플루오로아세트산에서 아세토니트릴 구배를 이용하여 용리를 수행한다. 스테인레스 스틸 칼럼(2.8 내지 3.2 리터의 Vydac C4 실리카 겔 충전)을 이용하여 제조용 HPLC를 수행한다. 히드록시아파이트 울트로겔 용리물을 트리플루오로아세트산 첨가에 의해 산성화하고, Vydac C4 칼럼 상에 로딩한다. 세척 및 용리를 위해, 희석된 트리플루오로아세트산에서의 아세토니트릴 구배를 사용한다. 분획물을 수집한 직후, 포스페이트 완충액으로 중성화하였다. IPC 한도 내의 BSP 분획물을 풀링한다.
DEAE 세파로스(파마시아(Pharmacia)) 물질은 세파로스 비이드의 표면에 공유 결합된 디에틸아미노에틸 (DEAE)-기들로 구성된다. DEAE 기에 대한 BSP의 결합은 이온성 상호작용에 의해 매개된다. 아세토니트릴 및 트리플루오로아세트산을 칼럼에 통과시켜, 칼럼 상에 보유시키지 않는다. 이 물질들을 세척 제거한 후, 낮은 pH에서 아세테이트 완충액으로 칼럼을 세척함으로써, 미량의 불순물을 제거한다. 이어서, 칼럼을 중성 포스페이트 완충액으로 세척하고, BSP는 증가된 이온 강도를 갖는 완충액으로 용리한다. 칼럼을 DEAE 세파로스 고속 유동으로 충전한다. 칼럼 체적을 3-10 mg BSP/ml 겔 범위의 BSP 부하량이 되도록 조정한다. 칼럼을 물 및 평형화 완충액(나트륨/칼륨 포스페이트)으로 세척한다. HPLC 용리물의 풀링된 분획물을 로딩하고, 칼럼을 평형화 완충액으로 세척한다. 이어서, 칼럼을 세척 완충액(아세트산나트륨 완충액)으로 세척한 후, 평형화 완충액으로 세척한다. 후속하여, BSP를 용리 완충액(염화나트륨, 나트륨/칼륨 포스페이트)을 이용하여 칼럼으로부터 용리하고, 마스터 용리 프로파일에 따라 단일 분획으로 수집한다. DEAE 세파로스 칼럼의 용리물을 특정 전도도로 조정한다. 수득된 약물 물질을 테플론(Teflon) 병에 무균 여과하고, -70℃에 저정한다.
이용될 수 있는 부가적 방법에는 내독소 제거 단계가 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 내독소는 예를 들어, 에스케리치아 콜라이와 같은 그램-음성 숙주 세포의 외부 막에 위치하는 리포폴리-당(LPS)이다. 내독소 수준을 감소시키는 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 이에는 정제 실리카 지지체, 유리 분말 또는 히드록시아파이트를 이용하는 기법, 역상, 친화도, 크기 배제, 음이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 이 방법들의 조합법 등이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 관심 폴리펩티드로부터 동시 이동 단백질과 같은 오염물질을 제거하기 위한 변형 또는 부가적 방법이 필요할 수 있다.
브래드포드(Bradford) 검정, SDS-PAGE, 은 염색 SDS-PAGE, 쿠마시 염색 SDS-PAGE, 질량 분광법(MALDI-TOF를 비제한적 예로 포함함), 및 당업자에게 공지된 기타 단백질의 특징화 방법을 비제한적 예로 포함하는 매우 다양한 방법 및 절차를 사용하여, 1개 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 BSP의 수율 및 순도를 평가할 수 있다.
본 발명의 이종성 융합 단백질의 특징화
본 발명의 융합 단백질을 특징화하기 위한 수많은 방법들이 존재한다. 이 방법들 중 일부에는 단백질 염색법과 결부된 SDS-PAGE, 또는 항-IgG 또는 항-HSA 항체를 이용한 면역블로팅(immunoblotting)이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 다른 방법에는 예를 들어, 기질 보조 레이저 탈착/이온화-질량 분광법(MALDI-MS), 액체 크로마토그래피/질량 분광법, 등전 포커싱, 분석 음이온 교환, 크로마토포커싱, 및 원형 이핵성이 포함된다.
VIII . 교대 시스템에서의 발현
비재조합 숙주 세포, 변이유발된 숙주 세포, 또는 세포-비함유 시스템에서 비천연 아미노산을 단백질에 도입하기 위한 수가지 전략법들이 이용되어왔다. 이 시스템들은 또한 본 발명의 BSP를 제조하는데 사용하기에 적당하다. Lys, Cys 및 Tyr과 같은 반응성 측쇄를 갖는 아미노산의 유도체화는 리신을 N2-아세틸-리신으로의 전환을 초래하였다. 화학적 합성은 또한 비천연 아미노산을 혼입하기 위한 직접적 방법을 제공한다. 펩티드 단편의 효소적 결찰 및 본연의 화학적 결찰의 최근 발달로 인해, 보다 큰 단백질을 제조할 수 있다. 예컨대, [P. E. Dawson 및 S. B. H. Kent, Annu . Rev . Biochem, 69: 923(2000)]를 참고한다. 요망되는 비천연 아미노산에 화학적으로 아실화된 억제자 tRNA가 단백질 생합성을 지지할 수 있는 생체외 추출물에 부가되는 일반적 생체외 생합성 방법을 사용하여, 실질적으로 임의의 크기의 각종 단백질에 100개 초과의 비천연 아미노산을 부위-특이적으로 혼입하였다. 예컨대, [V. W. Cornish, D. Mendel 및 P. G. Schultz, Angew . Chem . Int . Ed . Engl., 1995, 34: 621(1995); C.J. Noren, S.J. Anthony-Cahill, M. C. Griffith, P.G. Schultz, A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins, Science 244: 182-188(1989); 및 J.D. Bain, C.G. Glabe, T.A. Dix, A.R. Chamberlin, E.S. Diala, Biosynthetic site - specific incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide, J. Am. Chem . Soc. 111: 8013-8014(1989)]를 참고한다. 단백질 안정성, 단백질 접힘, 효소 메커니즘 및 신호 전달의 연구를 위해 광범위한 범위의 작용기가 단백질에 도입되었다.
야생형 합성효소의 난교(promiscuity)를 이용하기 이해, 선택적 압력 혼입으로도 칭해지는 생체내 방법이 개발되었다. 예컨대, [N. Budisa, C. Minks, S. Alefelder, W. Wenger, F. M. Dong, L. Moroder 및 R. Huber, FASEB J., 13: 41(1999)]를 참고한다. 세포에 특별한 천연 아미노산을 공급하는 관련 대사 경로가 차단되는 영양요구 균주를 제한된 농도의 천연 아미노산이 함유된 최소 배지에서 성장시키고, 한편 표적 유전자의 전사는 억제된다. 정지 성장 상태가 개시될 때, 천연 아미노산이 고갈되고, 비천연 아미노산 유사체로 치환된다. 재조합 단백질의 발현의 도입은 비천연 유사체를 함유하는 단백질의 축적을 초래한다. 예를 들어, 이 전략법을 이용하여, o, m 및 p-플루오로페닐알라닌이 단백질에 혼입되었고, 용이하게 확인 수 있는 UV 스펙트럼에서 2개의 특정 쇼율더를 나타내고, 이에 대해 예컨대, [C. Minks, R. Huber, L. Moroder 및 N. Budisa, Anal . Biochem ., 284: 29(2000)]을 참고하고; 박테리오파지 T4 라이소좀 내의 메티오닌을 치환하기 위해 트리플루오로메티오닌을 사용하여, 그것의 키토 이당류 리간드와의 상호작용을 19F NMR을 이용하여 연구하였으며, 이에 대해 예컨대, [H. Duewel, B. Daub, V. Robinson 및 J. F. Honek, Biochemistry, 36: 3404(1997)]을 참고하며; 트리플루오로루이신을 루이신 대신에 혼입하여, 루이신-지퍼 단백질의 증가된 열적 및 화학적 안정성을 초래하였다. 예컨대, [Y. Tang, G. Ghirlanda, W. A. Petka, T. Nakajima, W. F. DeGrado 및 D. A. Tirrell, Angew . Chem . Int . Ed . Engl ., 40: 1494(2001)]을 참고한다. 또한, 셀레노메티오닌 및 텔루로메티오닌을 각종 재조합 단백질에 혼입하여, 결정학 X-선에서의 상용해를 용이하게 한다. 예컨대, [W. A. Hendrickson, J. R. Horton 및 D. M. Lemaster, EMIBO J., 9: 1665(1990); J. 0. Boles, K. Lewinski, M. Kunkle, J. D. Odom, B. Dunlap, L. Lebioda 및 M. Hatada, Nat. Struct . Biol ., 1: 283(1994); N. Budisa, B. Steipe, P. Demange, C. Eckerskorn, J. Kellermann 및 R. Huber, Eur . J. Biochem ., 230: 788(1995); 및 N. Budisa, W. Karnbrock, S. Steinbacher, A. Humm, L. Prade, T. Neuefeind, L. Moroder 및 R. Huber, J. Mol . Biol ., 270: 616(1997)]을 참고한다. 알켄 또는 알킨 관능성을 갖는 메티오닌 유사체도 또한 효율적으로 혼입되어, 화학적 수단에 의해 단백질의 부가적 변형을 허용한다. 예컨대, [J. C. van Hest 및 D. A. Tirrell, FEBS Lett ., 428: 68(1998); J. C. van Hest, K. L. Kiick 및 D. A. Tirrell, J. Am. Chem . Soc ., 122: 1282(2000); 및, K. L. Kiick 및 D. A. Tirrell, Tetrahedron, 56: 9487(2000); 본원에 각기 참고로 인용되는, U.S. 특허 No. 6,586,207; U.S. 특허 공보 2002/0042097]를 참고한다.
이 방법의 성공은 일반적으로 단백질 번역의 신뢰도를 보증하기 위해 높은 선택도를 요구하는, 아미노아실-tRNA 합성효소에 의한 비천연 아미노산 유사체의 인식에 의존한다. 이 방법의 범주를 확장시키는 한 방법은, 제한된 수의 경우들에서 달성되었던, 아미노아실-tRNA 합성효소의 기질 특이성을 이완시키는 것이다. 예를 들어, 에스케리치아 콜라이 페닐알라닐-tRNA 합성효소(PheRS)에서의 Gly에 의한 Ala294의 치환은 기질 결합 포켓의 크기를 증가시키고, p-Cl-페닐알라닌(p-Cl-Phe)에 의한 tRNAPhe의 아실화를 초래한다. [M. Ibba, P. Kast 및 H. Hennecke, Biochemistry, 33: 7107(1994)]를 참고한다. 이 변이체 PheRS를 함유하는 에스케리치아 콜라이 균주는 페닐알라닌 대신에 p-Cl-페닐알라닌 또는 p-Br-페닐알라닌이 혼입되도록 한다. 예컨대, [M. Ibba 및 H. Hennecke, FEBS Lett ., 364: 272(1995); 및, N. Sharma, R. Furter, P. Kast 및 D. A. Tirrell, FEBS Lett ., 467: 37(2000)]를 참고한다. 유사하게, 에스케리치아 콜라이 티로실-tRNA 합성효소의 아미노산 결합 부위 부근의 점 변이 Phel3OSer는 아자티로신이 티로신보다 더 효율적으로 혼입되도록 하는 것으로 나타났다. [F. Hamano-Takaku, T. Iwama, S. Saito-Yano, K. Takaku, Y. Monden, M. Kitabatake, D. Soil 및 S. Nishimura, J. Biol . Chem ., 275: 40324(2000)]를 참고한다.
비천연 아미노산을 단백질로 생체내 혼입하는 다른 한 전략법은 교정(proofreading) 메커니즘을 갖는 합성효소를 변형시키는 것이다. 이 합성효소는 차별화할 수 없어, 동질 천연 아미노산과 구조적으로 유사한 아미노산을 활성화한다. 이 에러는 분리된 부위에서 수정되고, 이는 tRNA로부터 잘못 방출된 아미노산을 탈아실화하여, 단백질 번역의 신뢰도를 유지한다. 합성효소의 교정 활성이 불능으로 될 경우, 잘못 활성화된 구조적 유사체는 편집 기능에서 벗어나 혼입될 수 있다. 이 접근법은 발릴-tRNA 합성효소(ValRS)를 이용하여 최근 입증되었다. [V. Doring, H. D. Mootz, L. A. Nangle, T. L. Hendrickson, V. de Crecy-Lagard, P. Schimmel 및 P. Marliere, Science, 292: 501(2001)]를 참고한다. ValRS는 Cys, Thr, 또는 아미노부티레이트(Abu)를 이용하여 tRNAVal을 잘못 아미노아실화할 수 있고; 이 비동실 아미노산들은 후속하여 편집 도메인에 의해 가수분해된다. 에스케리치아 콜라이 염색체의 무작위 변이유발 후에, ValRS의 편집 부위에서의 변이를 갖는 변이체 에스케리치아 콜라이 균주가 선택되었다. 이 편집-결핍 ValRS는 tRNAVal을 Cys로 잘못 충전한다. Abu가 입체적으로 Cys와 유사하기 때문에(Cys의 -SH 기는 Abu에서 -CH3로 치환됨), 이 변이체 에스케리치아 콜라이 균주가 Abu의 존재 하에 성장될 때, 변이체 ValRS는 또한 Abu를 단백질에 혼입시킨다. 질량 분광 분석은 발린의 약 24%가 본연의 단백질 내의 각 발린 위치에서 Abu에 의해 치환됨을 나타낸다.
고체상 합성 및 반합성 방법은 신규 아미노산을 함유하는 수많은 단백질들의 합성을 허용한다. 예를 들어, 하기 공보, 및 이하와 같은 그 안에 인용된 참고문헌들을 참고한다: Crick, F.H.C., Barrett, L. Brenner, S. Watts-Tobin, R. General nature of the genetic code for proteins. Nature, 192: 1227- 1232(1961); Hofmann, K., Bohn, H. Studies on polypeptides. XXXVI . The effect of pyrazole - imidazole replacements on the S- protein activating potency of an S- peptide fragment, J. Am Chem, 88(24): 5914-5919(1966); Kaiser, E.T. Synthetic approaches to biologically active peptides and proteins including enyzmes, Acc Chem Res, 22: 47-54(1989); Nakatsuka, T., Sasaki, T., Kaiser, E.T. Peptide segment coupling catalyzed by the semisynthetic enzyme thiosubtilisin, J. Am . Chem . Soc . 109: 3808-3810(1987); Schnolzer, M., Kent, S B H. Constructing proteins by dovetailing unprotected synthetic peptides: backbone-engineered HIV protease, Science, 256(5054): 221-225(1992); Chaiken, LM. Semisynthetic peptides and proteins, CRC Crit Rev Biochem, 11(3): 255-301(1981); Offord, R.E. Protein engineering by chemical means ? Protein Eng ., 1(3): 151-157(1987); 및 Jackson, D.Y., Burnier, J., Quan, C, Stanley, M., Tom, J., Wells, J.A. A Designed Peptide Ligase for Total Synthesis of Ribonuclease A with Unnatural Catalytic Residues, Science. 266(5183): 243(1994).
화학적 변형을 사용하여, 보조인자, 스핀 표지 및 올리고뉴클레오티드를 포함한 각종 비천연 측쇄를 생체외 단백질로 도입하였다. 예컨대, [Corey, D.R., Schultz, P.G. Generation of a hybrid sequence - specific single - stranded deoxyribonuclease, Science, 238(4832): 1401-1403(1987); Kaiser, E.T., Lawrence D.S., Rokita, S.E. The chemical modification of enzymatic specificity, Annu Rev Biochem, 54: 565-595(1985); Kaiser, E.T., Lawrence, D. S. Chemical mutation of enyzme active sites, Science, 226(4674): 505-511(1984); Neet, K.E., Nanci A, Koshland, D.E. Properties of thiol - subtilisin, J. Biol. Chem., 243(24): 6392-6401(1968); Polgar, L. et MX. Bender. A new enzyme containing a synthetically formed active site. Thiol-subtilisin. J. Am. Chem . Soc ., 88: 3153-3154(1966); 및 Pollack, SJ., Nakayama, G. Schultz, P.G. Introduction ofnucleophiles and spectroscopic probes into antibody combining sites, Science, 242(4881): 1038-1040(1988)]을 참고한다.
대안적으로, 화학적으로 변형된 아미노아실-tRNA를 이용하는 생합성 방법을 사용하여, 생체외 합성된 단백질에 수개의 생물리학적 프로브를 혼입하였다., 하기 공보, 및 이하와 같은 그 안에 인용된 참고문헌들을 참고한다: Brunner, J. New Photolabeling and crosslinking methods, Annu . Rev Biochem, 62: 483-514(1993); 및 Krieg, U.C., Walter, P., Hohnson, A.E. Photocrosslinking of the signal sequence of nascent preprolactin of the 54- kilolodalton polypeptide of the signal recognition particle, Proc . Natl . Acad . Sci , 83 (22): 8604- 8608(1986).
과거, 요망되는 앰버 넌센스 변이를 갖는 유전자를 이용하여 프로그래밍된 단백질 합성 반응에 화학적으로 아미노아실화된 억제자 tRNA를 부가함으로써 생체외 단백질에 부위-특이적으로 혼입될 수 있는 것으로 나타났다. 이 접근법들을 이용함으로써, 특별한 아미노산에 대한 영양요구성인 균주를 이용하여, 수많은 통상의 20개 아미노산을 근접 구조적 동종체로 치환할 수 있는 바, 예컨대 플루오로페닐알라닌을 갖는 페닐알라닌으로 치환할 수 있다. 예컨대, [Noren, C.J., Anthony-Cahill, Griffith, M.C., Schultz, P.G. A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins, Science, 244: 182-188(1989); M.W. Nowak,등, Science 268: 439-42(1995); Bain, J.D., Glabe, C. G., Dix, T.A., Chamberlin, A.R., Diala, E.S. Biosynthetic site-specific Incorporation of a non - natural amino acid into a polypeptide , J. Am . Chem . Soc., 111: 8013-8014(1989); N. Budisa 등, FASEB J. 13: 41-51(1999); Ellman, J.A., Mendel, D., Anthony-Cahill, S., Noren, C.J., Schultz, P.G. Biosynthetic method for introducing unnatural amino acids site - specifically into proteins. Methods in Enz., vol. 202, 301-336(1992); 및 Mendel, D., Cornish, V.W. & Schultz, P.G. Site-Directed Mutagenesis with an Expanded Genetic Code, Annu Rev Biophys . Biomol Struct. 24, 435-62(1995)]를 참고한다.
예를 들어, 중지 코돈 UAG을 인식한 비천연 아미노산으로 화학적으로 아미노아실화된 억제자 tRNA를 제조하였다. 통상적 부위-지정 변이유발을 사용하여, 단백질 유전자 내 관심 부위에 중지 코돈 TAG을 도입하였다. 예컨대, [Sayers, J.R., Schmidt, W. Eckstein, F. 5'-3' Exonucleases in phosphorothioate - based olignoucleotide-directed mutagensis, Nucleic Acids Res, 16(3): 791-802(1988)]을 참고한다. 아실화 억제자 tRNA 및 변이체 유전자를 생체외 전사/번역 시스템에서 조합할 때, 비천연 아미노산을, 특정화 위치에서 상기 아미노산을 갖는 단백질을 제공하는 UAG 코돈에 대한 반응으로 혼입하였다. [3H]-Phe을 이용한 실험, 및 α-히드록시 산을 이용한 실험은, 요망되는 아미노산은 단지 UAG 코돈에 의해 특정화된 위치에서만 혼입되고, 이 아미노산이 단백질 내 임의의 기타 부위에서는 혼입되지 않음을 입증하였다. 예컨대, [Noren 등, 이하 동일; Kobayashi 등, (2003) Nature Structural Biology 10(6): 425-432; 및 Ellman, J.A., Mendel, D., Schultz, P.G. Site-specific incorporation of novel backbone structures into proteins, Science, 255(5041): 197-200(1992)]을 참고한다.
비천연 아미노산을 단백질에 혼입하기 위해, 마이크로주사 기법도 또한 사용되었다. 예컨대, [M. W. Nowak, P. C. Kearney, J. R. Sampson, M. B. Saks, C. G. Labarca, S. K. Silverman, W. G. Zhong, J. Thorson, J. N. Abelson, N. Davidson, P. G. Schultz, D. A. Dougherty 및 H. A. Lester, Science, 268: 439(1995); 및, D. A. Dougherty, Curr . Opin . Chem . Biol ., 4: 645(2000)]을 참고한다. 개구리 난자를 생체외 제조된 2종의 RNA, 즉 관심 아미노산 위치에서 UAG 중지 코돈으로 표적 단백질을 코딩하는 mRNA, 및 요망되는 비천연 아미노산으로 아미노아실화된 앰버 억제자 tRNA와 함께 주입하였다. 이어서, 난자의 번역 기작은 비천연 아미노산을 UAG에 의해 특정화된 위치에 삽입한다. 이 방법은 일반적으로 생체외 발현 시스템에 순응가능하지 않은 내재 막 단백질의 생체내 구조-기능 연구를 허용하였다. 그 예에는 타키키닌 뉴로키닌-2 수용체에 형광성 아미노산을 혼입하여, 형광 공명 에너지 전달에 의해 거리를 측정하는 것(예컨대, [G. Turcatti, K. Nemeth, M. D. Edgerton, U. Meseth, F. Talabot, M. Peitsch, J. Knowles, H. Vogel and A. Chollet, J. Biol . Chem ., 271: 19991(1996)]를 참고한다); 비오틴화 아미노산을 혼입하여, 이온 통로에서의 표면 노출된 잔기를 확인하는 것(예컨대, [J. P. Gallivan, H. A. Lester 및 D. A. Dougherty, Chem . Biol ., 4: 739(1997)]를 참고한다); 케이지 티로신 유사체를 사용하여 실시간 이온 통로에서의 구조 변화를 모니터하는 것(예컨대, [J. C. Miller, S. K. Silverman, P. M. England, D. A. Dougherty 및 H. A. Lester, Neuron, 20: 619(1998)]를 참고한다); 및 알파 히드록시 아미노산을 사용하여, 그것의 게이트 메커니즘을 참침하기 위한 이온 통로 골격을 변화시키는 것이 포함된다. 예컨대, [P. M. England, Y. Zhang, D. A. Dougherty 및 H. A. Lester, Cell, 96: 89(1999); 및, T. Lu, A. Y. Ting, J. Mainland, L. Y. Jan, P. G. Schultz 및 J. Yang, Nat . Neurosci., 4: 239(2001)]을 참고한다.
비천연 아미노산을 생체내 단백질에 직접적으로 혼입하는 능력은, 변이체 단백질의 고수율, 기술적 용이성, 세포, 또는 가능하게는 생물 유기체에서의 변이체 단백질의 연구 가능성, 및 치료적 처리에서의 상기 변이체 단백질의 사용의 이점들을 제공한다. 각종 크기, 산도, 친핵도, 소수도 및 기타 성질을 갖는 비천연 아미노산을 단백질에 포함시키는 능력은, 단백질 기능을 탐침함과 동시에 신규 성질을 갖는 새로운 단백질 또는 유기체를 창출하도록 하기 위한, 단백질의 구조를 합리적으로 또는 계통적으로 조작할 수 있는 능력을 크게 확장시킨다. 그러나, 그 공정은, 단백질 번역에서의 고도의 신뢰도를 달성하기 위해 tRNA-합성효소 상호작용의 복집한 성질이 필요하기 때문에 용이하기 않다.
파라-F-Phe를 부위-특이적으로 혼입하기 위한 한 시도로서, 효모 앰버 억제자 tRNAPheCUA /페닐알라닐-tRNA 합성효소 쌍을 p-F-Phe 내성의 Phe 영양요구 에스케리치아 콜라이 균주에서 사용하였다. 예컨대, [R. Furter, Protein Sci ., 7: 419(1998)]을 참고한다.
또한, 무세포(생체외) 번역 시스템을 이용하여 본 발명의 BSP의 발현을 수득하는 것도 가능할 수 있다. 주형으로서 mRNA를 포함하거나(생체외 번역), 주형으로서 DNA를 포함할 수 있는(생체외 전사 및 번역와 조합) 상기 시스템들에서, 생체외 합성은 리보좀에 의해 지정된다. 무세포 단백질 발현 시스템의 개발을 위해 상당한 노력이 가해졌다. 예컨대, [Kim, D.M. 및 J.R. Swartz, Biotechnology and Bioengineering, 74: 309-316(2001); Kim, D.M. 및 J.R. Swartz, Biotechnology Letters, 22, 1537-1542,(2000); Kim, D.M., 및 J.R. Swartz, Biotechnology Progress, 16, 385-390,(2000); Kim, D.M., 및 J.R. Swartz, Biotechnology and Bioengineering, 66, 180-188(1999); 및 Patnaik, R. 및 J.R. Swartz, Biotechnologies 24, 862-868(1998); 본원에 각기 참고로 인용되는, U.S. 특허 No. 6,337,191; U.S. 특허 공보 No. 2002/0081660; WO 00/55353; WO 90/05785]를 참고한다. 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 BSP의 발현에 적용될 수 있는 다른 한 접근법에는 mBNA-펩티드 융합 기법이 포함된다. 예컨대, [R. Roberts 및 J. Szostak, Proc . Natl Acad . Sci . (USA) 94: 12297-12302(1997); A. Frankel 등, Chemistry & Biology 10: 1043-1050(2003)]를 참고한다. 이 접근법에서, 푸로마이신에 연결된 mRNA 주형은 리보솜 상에서 펩티드로 번역된다. 1개 이상의 tRNA 분자가 변형된 경우, 비천연 아미노산도 또한 펩티드에 혼입될 수 있다. 마지막 mRNA 코돈이 해독된 후, 푸로마이신은 펩티드의 C-말단을 포획한다. 수득된 mRNA-펩티드 접합체가 생체외 검정에서 유익한 성질을 가지는 것으로 나타나는 경우, 그것의 실체는 mRNA 서열로부터 용이하게 발해질 수 있다. 이러한 식으로, 1개 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 BSP의 라이브러리를 스크리닝하여, 요망되는 성질을 갖는 폴리펩티드를 동정할 수 있다. 더욱 최근, 정제된 성분을 갖는 생체외 리보솜 번역이 펩티드 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환된 펩티드의 합성을 허용한다는 것이 보고되었다. 예컨대, [A. Forster 등, Proc . Natl . Acad . Sci . (USA) 100: 6353(2003)]을 참고한다.
IX. BSP 에 결합된 거대분자 중합체
본원에 기재된 비천연 아미노산 폴리펩티드에 대한 각종 변형들은, 본원에 기재된 조성물, 방법, 기법 및 전략법을 이용하여 행해질 수 있다. 이 변형들에는, 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교제; 방사성핵종; 세포독성 화합물; 약물; 친화도 표지; 광친화도 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이터; 보조인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 수용성 덴드리머; 시클로덱스트린; 억제성 리보핵산; 바이오물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광발색단, 금속-함유 부분; 방사능 부분; 신규 작용기; 다른 분자와 공유 또는 비공유 상호작용하는 기; 광바구니 부분; 광이성화가능한 부분; 비오틴; 비오틴의 유도체; 비오틴 유사체; 중원자가 혼입된 부분; 화학적으로 절단가능 기; 광절단가능 기; 연신 측쇄; 탄소-연결 당; 산화환원 활성제; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위원소 표지된 부분; 생물리학적 프로브; 인광성 기; 화학발광성 기; 전자 조밀 기; 자기 기; 개재 기; 발색단; 에너지 전이제; 생물 활성제; 검출가능 표지; 소분자; 또는 상기 것들의 임의의 조합, 또는 임의의 기타 바람직한 화합물 또는 물질을 비제한적 예로 포함하는, 폴리펩티드의 비천연 아미노산 성분에의 추가적 작용기의 혼입이 포함된다. 본원에 기재된 조성물, 방법, 기법 및 전략법의 비제한적 예를 예시함에 있어, 하기 설명은 여기에 기재된 조성물, 방법, 기법 및 전략법이 상기 열거된 작용기들을 비제한적 예로 포함하는 다른 작용기들을 부가하는 것에도 또한 적용가능하다는 것(필요한 경우, 당업자가 본 개시 내용에 대해 가할 수 있는 적절한 변형도 가능함)을 이해하면서, 비천연 아미노산 폴리펩티드에 거대분자 중합체를 부가하는 것에 초점을 두게 된다.
매우 다양한 거대분자 중합체 및 기타 분자가 본 발명의 BSP에 연결되어, BSP의 생물학적 성질을 조절하고/하거나, BSP 분자의 새로운 생물학적 성질을 제공할 수 있다. 이 거대분자 중합체는 천연적으로 코딩된 아미노산, 비천연적으로 코딩된 아미노산, 또는 천연 또는 비천연 아미노산의 임의의 관능성 치환기, 또는 천연 또는 비천연 아미노산에 부가된 임의의 치환기 또는 작용기를 통해 BSP에 연결될 수 있다. 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 100,000 Da, 또는 그 이상의 분자량을 비제한적 예로 포함하는 광범위한 범위 내일 수 있다.
본 발명은 중합체:단백질 접합체의 실질적으로 동질성인 제제를 제공한다. 본원에 사용되는 "실질적으로 동질성"은 중합체:단백질 접합체 분자가 총 단백질의 절반보다 더 많은 것으로 관찰됨을 의미한다. 중합체:단백질 접합체는 생물학적 활성을 가지고, 본원에 제공되는 당해 "실질적으로 동질성인" PEG화 BSP 제제는, 동질성 제제의 이점들, 예컨대 로트 대 로트 약물동태학의 예측가능성에 있어서 임상적 적용의 용이성을 나타내기에 충분히 동질성인 것들이다.
중합체:단백질 접합체 분자의 혼합물을 제조하는 것을 선택할 수 있고, 여기에서 제공되는 이점은, 혼합물 내 포함되는 모노-중합체:단백질 접합체의 분율을 선택할 수 있다는 것이다. 따라서, 요망되는 경우, 각종 수의 중합체 부분들(즉, 디-, 트리-, 테트라- 등)이 결합된 각종 단백질들의 혼합물을 제조하고, 상기 접합체를 본 발명의 방법을 이용하여 제조된 모노-중합체:단백질 접합체와 조합하며, 소정의 분율의 모노-중합체:단백질 접합체를 갖는 혼합물을 가질 수 있다.
선택되는 중합체는 그것이 결합된 단백질이 수성 환경, 예컨대 생리학적 환경에서 석출하지 않도록 하기 위해 수용성일 수 있다. 중합체는 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 바람직하게, 최종 생성물 제제의 치료 용도를 위해, 중합체는 약제학적으로 허용가능할 것이다.
단백질 분자에 대한 폴리에틸렌 글리콜 분자의 분율은, 반응 혼합물 내 그것의 농도에 따라 다양할 것이다. 일반적으로, (최소의 과잉 미반응 단백질 또는 중합체가 있도록 하는 반응 효율성 측면에서의) 최적 비는 선택된 폴리에틸렌 글리콜의 분자량 및 이용가능한 반응성 기의 수에 의해 결정될 수 있다. 분자량에 관한 경우, 전형적으로 중합체의 분자량이 클수록, 단백질에 결합될 수 있는 중합체 분자의 수가 더 적다. 유사하게, 중합체의 분지화는 이들 파라미터들을 최적화할 때 고려되어야 한다. 일반적으로, 분자량이 클수록(또는 분지도가 클수록), 중합체:단백질 비가 더 크다.
PEG:BSP 접합체를 구상할 때, 본원에 사용되는 용어 "치료 유효량"은 환자에게 요망되는 이익을 제공하는 양을 가리킨다. 예를 들어, 용어 "치료 유효량"은 BSP가 GLP-1인 경우, 환자에 이익을 제공하는 혈중 포도당의 감소를 가져오는 양을 가리킨다. 예를 들어, 용어 "치료 유효량"은 BSP가 T-20인 경우, 환자에게 이익을 제공하는 바이러스 수준을 조절하는 양을 가리킨다. 그 양은 개인별로 다양할 것이며, 환자의 전반적 신체적 상태 및 피처리 상태의 기저 원인(예컨대, BSP가 GLP-1인 경우에는 고혈당)을 포함한 수많은 인자들에 의존할 것이다. 치료법에 사용되는 BSP의 양은 허용가능한 변화 속도를 가져오고, 유익한 수준에서 요망되는 반응을 유지시킨다. 본 조성물의 치료 유효량은 공공연히 이용가능한 물질 및 절차를 이용하여 당업자에게 의해 용이하게 확인될 수 있다.
수용성 중합체는 선형, 포크형 또는 분지형을 비제한적 예로 포함하는 임의의 구조적 형태일 수 있다. 전형적으로, 수용성 중합체는 폴리(알킬렌 글리콜), 예컨대 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)이나, 다른 수용성 중합체도 또한 이용될 수 있다. 예로서, 본 발명의 특정 실시양태들을 설명하기 위해 PEG를 사용한다.
PEG는 시중 입수가능하거나 당업계에 공지된 방법에 따라 에틸렌 글리콜의 개환 중합에 의해 제조될 수 있는 공지된 수용성 중합체이다(Sandler 및 Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, New York, 제3권, p. 138-161). 용어 "PEG"는 크기 또는 PEG의 말단에서의 변형과 상관없이, 임의의 폴리에틸렌 글리콜 분자들을 포괄하기 위해 광범위하게 사용되고, 화학식:
XO-(CH2CH2O)-CH2CH2-Y
(식 중에서, n은 2 내지 10,000이고, X는 H 또는 C1 -4 알킬을 비제한적 예로 포함하는 말단 변형기임)에 의해 BSP에 연결되는 것으로 표시될 수 있다.
일부 경우들에서, 본 발명에 사용되는 PEG는 히드록시 또는 메톡시로 한 말단이 종결되고, 즉, X는 H 또는 CH3("메톡시 PEG")이다. 대안적으로, PEG는 반응성 기로 종결됨으로써 이관능성 중합체를 형성할 수 있다. 전형적 반응성 기에는, 20개의 통상의 아미노산에서 발견되는 작용기와 반응하기 위해 통상 사용되는 반응기들(말레이미드기, 활성화된 카르보네이트(p-니트로페닐 에스테르를 비제한적 예로 포함함), 활성화된 에스테르(N-히드록시숙신이미드, p-니트로페닐 에스테르를 비제한적 예로 포함함) 및 알데히드를 비제한적 예로 포함함), 및 20개의 통상의 아미노산에 대해 불활성이나 비천연적으로 코딩된 아미노산 내에 존재하는 상보적 작용기와 특이적으로 반응하는 작용기들(아지드기, 알킨기를 비제한적 예로 포함함)이 포함된다. 상기 화학식에서 Y로 표시되는, PEG의 다른 말단은 천연 발생 또는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 통해 BSP에 직접적으로 또는 간접적으로 결합할 것임을 주목한다. 예를 들어, Y는 폴리펩티드의 아민기에 대한 아미드, 카르바메이트 또는 우레아 연결기(리신의 엡실론 아민 또는 N-말단을 비제한적 예로 포함함)일 수 있다. 대안적으로, Y는 티올기에 대한 말레이미드 연결기(시스테인의 티올기를 비제한적 예로 포함함)일 수 있다. 대안적으로, 20개의 통상의 아미노산을 통해 통상 접근가능하지 않은 잔기에 대한 연결기일 수 있다. 예를 들어, PEG 상의 아지드기는 BSP 상의 알킨기와 반응하여, 휘스겐 [3+2] 시클로부가 생성물을 형성할 수 있다. 대안적으로, PEG 상의 알킨기는 비천연적으로 코딩된 아미노산 내에 존재하는 아지드기와 반응하여, 유사한 생성물을 형성할 수 있다. 일부 실시양태들에서, 강한 친핵체(히드라진, 히드라지드, 히드록실아민, 세미카르바지드를 비제한적 예로 포함함)는 비천연적으로 코딩된 아미노산 내에 존재하는 알데히드 또는 케톤기와 반응하여, 적용가능한 경우 히드라존, 옥심 또는 세미카르바존을 형성할 수 있고, 이는 일부 경우들에서 적절한 환원제를 이용한 처리에 의해 추가 환원될 수 있다. 대안적으로, 강한 친핵체는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 통해 BSP에 혼입되어, 수용성 중합체 내에 존재하는 케톤 또는 알데히드기와 우선적으로 반응하기 위해 사용될 수 있다.
PEG에 대한 임의의 분자 질량은 실질적으로 원하는 대로 사용될 수 있고, 이는 원하는 대로 약 100 달톤(Da) 내지 100,000 Da 이상(경우에 따라, 0.1-50 kDa 또는 10-40 kDa를 비제한적 예로 포함함)을 비제한적 예로 포함한다. MW가 1-100 kDa 범위 내(1-50 kDa 또는 5 내지 20 kDa)인 각 사슬을 갖는 PEG 분자를 비제한적 예로 포함하는 분지형 사슬 PEG도 또한 사용될 수 있다. 광범위한 PEG 분자들이 본원에 참고로 인용되는, [쉐어워터 폴리머스 인코포레이티드(Shearwater Polymers, Inc). 카달로그, 넥타르 써레포틱스(Nektar Therapeutics) 카달로그](단, 이에 제한되지 않음)에 기재되어 있다.
일반적으로, PEG 분자의 1개 이상의 말단은 비천연적으로 코딩된 아미노산과의 반응을 위해 이용가능하다. 예를 들어, 아미노산 측쇄와의 반응을 위한 알킨 및 아지드 부분을 갖는 PEG 유도체를 사용하여, PEG를 본원에 기재된 바와 같이 비천연적으로 코딩된 아미노산에 결합시킬 수 있다. 비천연적으로 코딩된 아미노산이 아지드를 포함하는 경우, PEG는 전형적으로 [3+2] 시클로부가 생성물을 형성하기 위한 알킬 부분, 또는 아미드 연결기를 형성하기 위한 포스핀기를 갖는 활성화된 PEG 종(즉, 에스테르, 카르보네이트)을 함유할 것이다. 대안적으로, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 알킨을 포함하는 경우, PEG는 전형적으로 [3+2] 휘스겐 시클로부가 생성물을 형성하기 위한 아지드 부분을 함유할 것이다. 비천연적으로 코딩된 아미노산이 카르보닐기를 포함하는 경우, PEG는 전형적으로 상응하는 히드라존, 옥심 및 세미카르바존 연결기를 각기 형성시키는 강한 친핵체(히드라지드, 히드라진, 히드록실아민 또는 세미카르바지드 관능성을 비제한적 예로 포함함)를 포함할 것이다. 다른 대안으로서, 상기 기재된 반응성 기의 배향의 역이 사용될 수 있는데, 즉 비천연적으로 코딩된 아미노산 내의 아지드 부분은 알킨 함유의 PEG 유도체와 반응할 수 있다.
일부 실시양태들에서, PEG 유도체를 갖는 BSP 변종체는 비천연적으로 코딩된 아미노산의 측쇄 상에 화학적 작용기와 반응성인 화학적 작용기를 함유한다.
본 발명은 일부 실시양태들에서 평균 분자량이 약 800 Da 내지 약 100,000 Da인 수용성 중합체 골격을 포함하는 아지드- 및 아세틸렌-함유 중합체 유도체를 제공한다. 수용성 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜)일 수 있다. 그러나, 폴리(에틸렌)글리콜 및 기타 관련 중합체(이는 폴리(덱스트란) 및 폴리프로필렌 글리콜을 포함함)를 비제한적 예로 포함하는 매우 다양한 수용성 중합체도 또한 본 발명의 수행에 사용하기에 적당하고, 용어 PEG 또는 폴리(에틸렌 글리콜)의 사용은 그러한 모든 분자들을 포괄하고 포함하도록 의도되어짐을 이해해야 한다. 용어 PEG에는 이관능성 PEG, 다수 팔을 가지는 PEG, 유도체화 PEG, 포크형 PEG, 분지형 PEG, 펜던트 PEG(즉, PEG 또는 중합체 골격에 걸려 있는 1개 이상의 작용기를 갖는 관련 중합체), 또는 분해가능한 연결기가 안에 있는 PEG를 포함한 임의의 형태의 폴리(에틸렌 글리콜)이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다.
PEG는 전형적으로 투명, 무색, 무취, 수용성, 열 안정성, 많은 약품에 대한 불활성의 성질들을 가지고, 가수분해 또는 열화되지 않으며, 일반적으로 비독성이다. 폴리(에틸렌 글리콜)은 생화합성인 것으로 간주되며, 이는 즉, PEG가 유해를 유발하지 않으면서 생 조직 또는 유기체와 공존할 수 있음을 가리킨다. 보다 구체적으로, PEG는 실질적으로 비면역원성이고, 즉, PEG는 생체 내에서 면역 반응을 발생시키지 않는 경향이 있다. PEG는 신체 내 일부 바람직한 기능을 갖는 분자, 예컨대 생물 활성제에 결합할 때, 그 제제를 마스킹하는 경향이 있고, 유기체가 제제의 존재를 견딜 수 있도록 임의의 면역 반응을 감소시키거나 제거할 수 있다. PEG 접합체는 실질적 면역 반응을 생성시키지 않거나, 응고 또는 기타 바람직하지 않은 효과를 일으키지 않는 경향이 있다. 화학식 --CH2CH2O--(CH2CH2O)n--CH2CH2--(식 중에서, n은 약 3 내지 약 4000, 전형적으로는 약 20 내지 약 2000임)을 갖는 PEG가 본 발명에 사용하기에 적당하다. 분자량이 약 800 Da 내지 약 100,000 Da인 PEG가 본 발명의 일부 실시양태들에서 중합체 골격으로서 특히 유용하다.
중합체 골격은 선형 또는 분지형일 수 있다. 분지형 중합체 골격은 일반적으로 당업계에 공지되어 있다. 전형적으로, 분지형 중합체는 중심 분지 코어 부분, 및 중심 분지 코어에 연결된 복수개의 선형 중합체 사슬을 가진다. PEG는 에틸렌 옥시드를 각종 폴리올, 예컨대 글리세롤, 글리세롤 올리고머, 펜타에리트리톨 및 소르비톨에 첨가함으로써 제조될 수 있는 분지형 형태로 통상 사용된다. 중심 분지 부분은 또한 수개의 아미노산, 예컨대 리신으로부터 유래될 수 있다. 분지형 폴리(에틸렌 글리콜)은 화학식 R-(PEG-OH)m(식 중에서, R은 코어 부분, 예컨대 글리세롤, 글리세롤 올리고머 또는 펜타에리트리톨로부터 유래되고, m은 팔의 수를 나타냄)의 일반 형태로 표시될 수 있다. 다수 팔을 갖는 PEG 분자, 예컨대 본원에 각기 참고로 전체적으로 인용되는, U.S. 특허 No. 5,932,462 5,643,575; 5,229,490; 4,289,872; U.S. 특허출원 2003/0143596; WO 96/21469; 및 WO 93/21259에 기재된 것들이 또한 중합체 골격으로 사용될 수 있다.
분지형 PEG는 또한 PEG(--YCHZ2)n(식 중에서, Y는 연결기이고, Z는 한정된 길이의 원자의 사슬에 의해 CH에 연결된 활성화된 말단기임)의 포크형 PEG의 형태일 수 있다.
또 다른 한 분지형 형태, 펜던트 PEG는 PEG 사슬의 말단에서가 아니라, PEG 골격을 따라 반응성 기, 예컨대 카르복실을 가진다.
이 형태들의 PEG에 부가하여, 중합체는 또한 골격 내의 약하거나 분해가능한 연결기로 제조될 수 있다. 예를 들어, PEG는 가수분해되는 중합체 골격 내의 에스테르 연결기를 이용하여 제조될 수 있다. 이하 나와 있는 바와 같이, 이 가수분해는 중합체가 보다 낮은 분자량의 단편들로 절단되도록 한다:
-PEG-C02-PEG-+H20 → PEG-CO2H+HO-PEG-
용어 폴리(에틸렌 글리콜) 또는 PEG는 본원에 개시된 것들을 비제한적 예로 포함하는, 당업계에 공지된 모든 것들을 나타내거나 포함한다는 것을 당업계의 숙련가에 의해 이해되어 진다.
많은 다른 중합체들도 또한 본 발명에 사용하기에 적당하다. 일부 실시양태들에서, 2 내지 약 300 말단을 갖는, 수용성인 중합체 골격이 본 발명에서 특히 유용하다. 적당한 중합체의 예에는 다른 폴리(알킬렌 글리콜), 예컨대 폴리(프로필렌 글리콜)("PPG"), 그것의 공중합체(에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜의 공중합체를 비제한적 예로 포함함), 그것의 삼원중합체, 그것의 혼합물 등이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 중합체 골격의 각 사슬의 분자량은 다양할 수 있으나, 전형적으로는 약 800 Da 내지 약 100,000 Da, 종종은 약 6,000 Da 내지 약 80,000 Da의 범위 내이다.
당업자는 실질적으로 수용성 골격에 대한 상기 목록이 결코 모든 예들을 반영하는 것이 아니라 단지 예시적이라는 것과, 상기 기재된 특질들을 갖는 모든 중합체성 물질이 본 발명에 사용하기에 적당한 것으로 구상됨을 인식할 것이다.
본 발명의 일부 실시양태들에서, 중합체 유도체는 "다관능적"이며, 이는 중합체 골격이 작용기로 관능화 또는 활성화된 2개 이상의 말단, 또한 가능하게는 약 300개 말단 정도로 많은 말단을 가짐을 의미한다. 다관능성 중합체 유도체에는 각 말단이 동일하거나 상이한 작용기에 결합된 2개의 말단을 갖는 선형 중합체가 포함되나, 이들에 제한되지 않는다.
한 실시양태에서, 중합체 유도체는 구조:
X-A-폴리-B-N=N=N
(식 중에서,
N=N=N는 아지드 부분이고;
B는 연결부이며, 이는 존재 또는 부재할 수 있고;
폴리는 수용성의 비항원형 중합체이며;
A는 연결부이고, 이는 존재 또는 부재할 수 있으며, B와 동일하거나 상이할 수 있고;
X는 제2 작용기임)를 가진다.
A 및 B에 대한 연결부의 예에는 탄소수 18 이하, 더욱 바람직하게는 1 내지 10인 다관능화 알킬기가 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 질소, 산소 또는 황과 같은 이종원자가 알킬 사슬에 포함될 수 있다. 알킬 사슬은 또한 이종 원자에서 분지화될 수 있다. A 및 B에 대한 연결부의 다른 예에는 탄소수 10 이하, 더욱 바람직하게는 5 내지 6인 다관능화 알킬기가 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 아릴기는 하나 이상의 탄소 원자, 질소, 산소 또는 황 원자로 치환될 수 있다. 적당한 연결기의 다른 예에는 본원에 각기 참고로 인용되는 U.S. 특허 No. 5,932,462; 5,643,575; 및 U.S. 특허출원 공보 2003/0143596에 기재된 연결기들이 포함된다. 당업자는 연결부에 대한 상기 목록이 결코 모든 예들을 반영하는 것이 아니라 단지 예시적이라는 것과, 상기 기재된 특질들을 갖는 모든 연결부들이 본 발명에 사용하기에 적당한 것으로 구상됨을 인식할 것이다.
X로서 사용하기에 적당한 작용기의 예에는 히드록실, 보호된 히드록실, 알콕실, 활성 에스테르, 예컨대 N-히드록시숙신이미딜 에스테르 및 1-벤조트리아졸릴 에스테르, 활성 카르보네이트, 예컨대 N-히드록시숙신이미딜 카르보네이트 및 1-벤조트리아졸릴 카르보네이트, 아세탈, 알데히드, 알데히드 수화물, 알케닐, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 활성 술폰, 아민, 아미노옥시, 보호된 아민, 히드라지드, 보호된 히드라지드, 보호된 티올, 카르복실산, 보호된 카르복실산, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 말레이미드, 비닐술폰, 디티오피리딘, 비닐피리딘, 요오도아세트아미드, 에폭시드, 글리옥살, 디온, 메실레이트, 토실레이트, 트레실레이트, 알켄, 케톤 및 아지드가 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 당업계의 숙련가에 의해 이해되어지는 바와 같이, 선택된 X 부분은 아지드와의 반응이 일어나지 않도록, 아지드기와 화합성이어야 한다. 아지드-함유 중합체 유도체는 호모이관능성(이는 제2 작용기(즉, X)가 또한 아지드 부분임을 의미함), 또는 이종이관능성(이는 제2 작용기가 상이한 작용기임을 의미함)일 수 있다.
용어 "보호된"은, 특정 반응 조건 하에서 화학적으로 반응성인 작용기의 반응을 예방하는 보호기 또는 보호 부분의 존재를 가리킨다. 보호기는 보호되는 화학적으로 반응성인 기의 유형에 따라 다양하다. 예를 들어, 화학적으로 반응성인 기가 아민 또는 히드라지드인 경우, 보호기가 tert-부틸옥시카르보닐(t-Boc) 및 9-플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc)의 군으로부터 선택될 수 있다. 화학적으로 반응성인 기가 티올인 경우, 보호기는 오르토피리딜디술피드일 수 있다. 화학적으로 반응성인 기가 카르복실산, 예컨대 부탄산 또는 프로피온산, 또는 히드록실기인 경우, 보호기는 벤질 또는 알킬기, 예컨대 메틸, 에틸 또는 tert-부틸일 수 있다. 당업계에 공지된 다른 보호기가 또한 본 발명에 사용될 수 있다.
문헌에서의 말단 작용기의 구체예에는 N-숙신이미딜 카르보네이트(예컨대, U.S. 특허 No. 5,281,698, No. 5,468,478 참고), 아민(예컨대, [Buckmann 등, Makromol. Chem. 182: 1379(1981), Zalipsky 등, Eur. Polym. J. 19: 1177(1983)] 참고), 히드라지드(예컨대, [Andresz 등, Makromol. Chem. 179: 301(1978)] 참고), 숙신이미딜 프로피오네이트 및 숙신이미딜 부타노에이트(예컨대, [Olson 등, Poly(ethylene glycol) Chemistry & Biological Applications, pp 170-181, Harris & Zalipsky 편저, ACS, Washington, D. C., 1997]; 및 U.S. 특허 No. 5,672,662 참고), 숙신이미딜 숙시네이트(예컨대, [Abuchowski 등, Cancer Biochem. Biophys. 7: 175(1984) 및 Joppich 등, Makrolol. Chem. 180: 1381(1979)] 참고), 숙신이미딜 에스테르(예컨대, U.S. 특허 No. 4,670,417), 벤조트리아졸 카르보네이트(예컨대, U.S. 특허 No. 5,650,234 참고), 글리시딜 에테르(예컨대, [Pitha 등, Eur. J Biochem. 94: 11(1979), Elling 등, Biotech. Appl. Biochem. 13: 354(1991)] 참고), 옥시카르보닐이미다졸(예컨대, [Beauchamp, 등, Anal. Biochem. 131: 25(1983), Tondelli 등, J. Controlled Release 1: 251(1985)] 참고), p-니트로페닐 카르보네이트(예컨대, [Veronese, 등, Appl. Biochem. Biotech., 11: 141(1985)]; 및 [Sartore 등, Appi. Biochem. Biotech., 27: 45(1991)] 참고), 알데히드(예컨대, [Harris 등, J. Polym. Sci. Chem. Ed. 22: 341(1984)], U.S. 특허 No. 5,824,784, U.S. 특허 No. 5,252,714 참고), 말레이미드(예컨대, [Goodson 등, Bioteclmology (NY) 8: 343(1990), Romani 등, Chemistry of Peptide and Proteins 2: 29(1984)), 및 Kogan, Synthetic Comm. 22: 2417(1992)] 참고), 오르토피리딜-디술피드(예컨대, [Woghiren, 등, Bioconj. Chem. 4: 314(1993)] 참고), 아크릴올(예컨대, [Sawhney 등, Macromolecules, 26: 581(1993)] 참고), 비닐술폰(예컨대, U.S. 특허 No. 5,900,461 참고)가 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 상기 참고문헌 및 특허 모두는 본원에 참고로 인용된다.
본 발명의 특정 실시양태들에서, 본 발명의 중합체 유도체는 구조:
X-CH2CH2O--(CH2CH2O)n--CH2CH2-N=N=N
(식 중에서,
X는 상기와 같은 작용기이고;
n은 약 20 내지 약 4000임)를 갖는 중합체 골격을 포함한다.
다른 한 실시양태에서, 본 발명의 중합체 유도체는 구조:
X-CH2CH2O--(CH2CH2O)nCH2CH2-0-(CH2)m-WN=N=N
(식 중에서,
W는 탄소수 1 내지 10의 지방족 또는 방향족 링커 부분이고;
n은 약 20 내지 약 4000이며;
X는 상기와 같은 작용기이고;
m은 1 내지 10임)를 갖는 중합체 골격을 포함한다.
본 발명의 아지드-함유 PEG 유도체는 당업계에 공지되고/되거나 본원에 개시된 각종 방법에 의해 제조될 수 있다. 하기 나와 있는 한 방법에서, 평균 분자량이 약 800 Da 내지 약 100,000 Da인 수용성 중합체 골격, 제1 말단이 제1 작용기에 결합되고 제2 말단이 적당한 이탈기에 결합된 중합체 골격은 아지드 음이온(이는 나트륨, 칼륨, tert-부틸암모늄 등을 포함한 수많은 적당한 짝이온들 중 임의의 것과 쌍을 이룰 수 있음)과 반응한다. 이탈기는 친핵성 치환을 겪고, 아지드 부분에 의해 치환되어, 요망되는 아지드-함유 PEG 중합체를 제공한다.
X-PEG-L+N3 - → X-PEG-N3
나와 있는 바와 같이, 본 발명에 사용하기에 적당한 중합체 골격은 화학식 X-PEG-L(식 중에서, PEG는 폴리(에틸렌 글리콜)이고, X는 아지드기와 반응하지 않는 작용기이며, L은 적당한 이탈기임)를 가진다. 적당한 작용기의 예에는 히드록실, 보호된 히드록실, 아세탈, 알케닐, 아민, 아미노옥시, 보호된 아민, 보호된 히드라지드, 보호된 티올, 카르복실산, 보호된 카르복실산, 말레이미드, 디티오피리딘, 및 비닐피리딘 및 케톤이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 적당한 이탈기의 예에는 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드, 메실레이트, 트레실레이트 및 토실레이트가 포함되나, 이들에 제한되지 않는다.
본 발명의 아지드-함유 중합체 유도체의 다른 한 제조 방법에서, 아지드 작용기를 갖는 연결제는 평균 분자량이 약 800 Da 내지 약 100,000 Da인 수용성 중합체 골격와 접촉되고, 여기에서 연결제는 PEG 중합체 상의 화학적 작용기와 선택적으로 반응하여, 아지드-함유 중합체 유도체 생성물을 형성하는 화학적 작용기를 가지고, 여기에서 아지드는 연결기에 의해 중합체 골격으로부터 분리된다.
한 예시적 반응식이 하기 나와 있다:
X-PEG-M + N-링커-N=N=N → PG-X-PEG-링커-N=N=N
(여기에서,
PEG는 폴리(에틸렌 글리콜)이고;
X는 캡핑기, 예컨대 알콕시 또는 상기 작용기이며;
M은 아지드 작용기와 반응성이지 않으나, N 작용기와는 효율적으로 또한 선택적으로 반응하는 작용기임).
적당한 작용기의 예에는, N이 아민인 경우, M가 카르복실산, 카르보네이트 또는 활성 에스테르가 포함되나, 이들에 제한되지 않고; N이 히드라지드 또는 아미노옥시 부분인 경우, M이 케톤이며; N이 친핵체인 경우, M은 이탈기이다.
조생성물의 정제는 생성물의 석출, 및 이어서 필요한 경우에 따라, 크로마토그래피를 비제한적 예로 포함하는 공지 방법을 이용하여 달성될 수 있다.
보다 구체적인 예가 하기 PEG 디아민의 경우에 나와 있고, 여기에서 아민들 중 하나는 tert-부틸-Boc와 같은 보호기 부분에 의해 보호되고, 수득된 모노-보호된 PEG 디아민은 아지드 작용기를 갖는 연결부와 반응한다:
BocHN-PEG-NH2+HO2C-(CH2)3-N=N=N
이 예에서, 아민기는 티오닐 클로라이드 또는 카르보디이미드 시약 및 N-히드록시숙신이미드 또는 N-히드록시벤조트리아졸과 같은 각종 활성화제를 이용하여 카르복실산기에 결합되어, 모노아민 PEG 유도체와 아지드-함유 링커 부분 사이에 아미드 결합을 발생시킬 수 있다. 아미드 결합을 연속적으로 형성한 후에, 수득된 N-tert-부틸-Boc-보호 아지드-함유 유도체를 직접적으로 사용하여 생활성 분자를 변형시킬 수 있거나, 다른 유용한 작용기를 장착시키는 것을 추가로 구상할 수 있다. 예를 들어, N-t-Boc기는 강산과의 처리에 의해 가수분해되어, 오메가-아미노-PEG-아지드를 발생시킬 수 있다. 수득된 아민은 합성 핸들로 사용되어, 중요한 이종이관능성 시약을 발생시키기 위한 말레이미드기, 활성화된 디술피드, 활성화된 에스테르 등과 같은 다른 유용한 관능성을 장착시킬 수 있다.
상이한 분자를 중합체의 각 말단에 결합시키는 것이 요망되는 경우, 이종이관능성 유도체가 특히 유용하다. 예를 들어, 오메가-N-아미노-N-아지도 PEG는, 활성화된 친전자성 기를 갖는 분자, 예컨대 알데히드, 케톤, 활성화된 에스테르, 활성화된 카르보네이트 등을 PEG의 한 말단, 및 PEG의 다른 말단에 아세틸렌기를 갖는 분자에 결합시키는 것을 허용할 것이다.
본 발명의 다른 한 실시양태에서, 중합체 유도체는 구조:
X-A-폴리-B-C≡C-R
(식 중에서,
R은 H 또는 알킬, 알켄, 알콕시, 또는 아릴 또는 치환 아릴기이고;
B는 연결부이며, 이는 존재 또는 부재할 수 있고;
폴리는 수용성의 비항원형 중합체이며;
A는 연결부이고, 이는 존재 또는 부재할 수 있고, B와 동일하거나 상이할 수 있으며;
X는 제2 작용기임)를 가진다.
A 및 B에 대한 연결부의 예에는 탄소수 18 이하, 더욱 바람직하게는 1 내지 10인 다관능화 알킬기가 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 질소, 산소 또는 황과 같은 이종원자가 알킬 사슬에 포함될 수 있다. 알킬 사슬은 또한 이종 원자에서 분지화될 수 있다. A 및 B에 대한 연결부의 다른 예에는 탄소수 10 이하, 더욱 바람직하게는 5 내지 6인 다관능화 알킬기가 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 아릴기는 하나 이상의 탄소 원자, 질소, 산소 또는 황 원자로 치환될 수 있다. 적당한 연결기의 다른 예에는 본원에 각기 참고로 인용되는 U.S. 특허 No. 5,932,462; 5,643,575; 및 U.S. 특허출원 공보 2003/0143596에 기재된 연결기들이 포함된다. 당업자는 연결부에 대한 상기 목록이 결코 모든 예들을 반영하는 것이 아니라 단지 예시적이라는 것과, 상기 기재된 특질들을 갖는 매우 다양한 연결부들이 본 발명에 유용한 것으로 구상됨을 인식할 것이다.
X로서 사용하기에 적당한 작용기의 예에는 히드록실, 보호된 히드록실, 알콕실, 활성 에스테르, 예컨대 N-히드록시숙신이미딜 에스테르 및 1-벤조트리아졸릴 에스테르, 활성 카르보네이트, 예컨대 N-히드록시숙신이미딜 카르보네이트 및 1-벤조트리아졸릴 카르보네이트, 아세탈, 알데히드, 알데히드 수화물, 알케닐, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 활성 술폰, 아민, 아미노옥시, 보호된 아민, 히드라지드, 보호된 히드라지드, 보호된 티올, 카르복실산, 보호된 카르복실산, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 말레이미드, 비닐술폰, 디티오피리딘, 비닐피리딘, 요오도아세트아미드, 에폭시드, 글리옥살, 디온, 메실레이트, 토실레이트, 및 트레실레이트, 알켄, 케톤, 및 아세틸렌이 포함된다. 이해되어지는 바와 같이, 선택된 X 부분은 아세틸렌기와의 반응이 일어나지 않도록, 아세틸렌기와 화합성이어야 한다. 아세틸렌-함유 중합체 유도체는 호모이관능성(이는 제2 작용기(즉, X)가 또한 아세틸렌 부분임을 의미함), 또는 이종이관능성(이는 제2 작용기가 상이한 작용기임을 의미함)일 수 있다.
본 발명의 다른 한 실시양태에서, 중합체 유도체는 구조:
X-CH2CH2O--(CH2CH2O)n--CH2CH2-O-(CH2)m-C≡CH
(식 중에서,
X는 상기와 같은 작용기이고;
n은 약 2O 내지 약 4000이며;
m은 1 내지 10임)를 갖는 중합체 골격을 포함한다.
각 이종이관능성 PEG 중합체의 구체예가 이하에 나와 있다.
본 발명의 아세틸렌-함유 PEG 유도체는 당업계에 공지되고/되거나 본원에 개시된 각종 방법에 의해 제조될 수 있다. 한 방법에서, 평균 분자량이 약 800 Da 내지 약 100,000 Da인 수용성 중합체 골격, 제1 말단이 제1 작용기에 결합되고 제2 말단이 적당한 친핵성 기에 결합된 중합체 골격은 아세틸렌 작용기 및 PEG 상의 친핵성 기와 반응하기에 적당한 이탈기를 모두 갖는 화합물과 반응한다. 친핵성 부분 및 이탈기 함유 이탈기를 갖는 PEG 중합체가 조합될 때, 이탈기는 친핵성 치환을 겪고, 친핵성 부분에 의해 치환되어, 요망되는 아세틸렌-함유 PEG 중합체를 제공한다.
X-PEG-Nu + L-A-C → X-PEG-Nu-A-C≡CR'
나와 있는 바와 같이, 반응에 사용하기에 바람직한 중합체 골격은 식 X-PEG-Nu(식 중에서, PEG는 폴리(에틸렌 글리콜)이고, Nu는 친핵성 부분이며, X는 Nu, L 또는 아세틸렌 작용기와 반응하지 않는 작용기임)를 가진다
Nu의 예에는 SN2-형 메커니즘을 통해 주로 반응하게 되는, 아민, 알콕시, 아릴옥시, 술프히드릴, 이미노, 카르복실레이트, 히드라지드, 아미노옥시기가 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. Nu 기의 부가적 예에는 친핵성 첨가 반응을 통해 주로 반응하게 되는 작용기들이 포함된다. L 기의 예에는 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드, 메실레이트, 트레실레이트, 및 토실레이트, 및 친핵성 치환을 겪는 것으로 예상되는 기타 기, 및 케톤, 알데히드, 티오에스테르, 올레핀, 알파-베타 불포화 카르보닐기, 카르보네이트, 및 친핵체에 의해 부가를 겪는 것으로 예상되는 기타 친전자성 기가 포함된다.
본 발명의 다른 한 실시양태에서, A는 탄소수 1 내지 10의 지방족 링커, 또는 탄소수 6 내지 14의 치환 아릴환이다. X는 아지드기와 반응하지 않는 작용기이고, L은 적당한 이탈기이다.
아세틸렌-함유 본 발명의 중합체 유도체의 제조를 위한 다른 한 방법에서, 평균 분자량이 약 800 Da 내지 약 100,000 Da이고, 보호된 작용기 또는 캡핑제를 한 말단에 가지고, 적당한 이탈기를 다른 말단에 가지는 PEG 중합체가 아세틸렌 음이온에 의해 접촉된다.
한 예시적 반응식이 하기 나와 있다:
X-PEG-L + -C≡CR' → X-PEG-C≡CR'
(식 중에서,
PEG는 폴리(에틸렌 글리콜)이고;
X는 캡핑기, 예컨대 알콕시 또는 상기와 같은 작용기이며;
R'은 H, 알킬, 알콕시, 아릴 또는 아릴옥시기, 또는 치환 알킬, 알콕실, 아릴 또는 아릴옥시기임).
상기 예에서, 이탈기 L은 충분한 농도의 아세틸렌 음이온과 접촉 시에 SN2-형 치환을 겪기 위해 충분히 반응성이어야 한다. 아세틸렌 음이온에 의한 이탈기의 SN2 치환을 달성하는데 필요한 반응 조건이 당업계에 공지되어 있다.
조생성물의 정제는 생성물의 석출, 및 그에 이어 필요한 경우, 크로마토그래피를 비제한적 예로 포함하는 당업계에 공지된 방법에 의해 달성될 수 있다.
수용성 중합체는 본 발명의 BSP에 연결될 수 있다. 수용성 중합체는 BSP 내에 혼입된 비천연적으로 코딩된 아미노산, 또는 비천연적으로 코딩되거나 천연적으로 코딩된 아미노산의 임의의 작용기 또는 치환기, 또는 비천연적으로 코딩되거나 천연적으로 코딩된 아미노산에 부가된 임의의 작용기 또는 치환기를 통해 연결될 수 있다. 대안적으로, 수용성 중합체는 천연 발생 아미노산(N-말단 잔기의 시스테인, 리신 또는 아민기를 비제한적 예로 포함함)을 통해 비천연적으로 코딩된 아미노산이 혼입된 BSP에 연결된다. 일부 경우들에서, 본 발명의 BSP는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 비천연 아미노산을 포함하고, 여기에서 1개 이상의 비천연-코딩된 아미노산(들)은 수용성 중합체(들)(PEG 및/또는 이당류를 비제한적 예로 포함함)에 연결된다. 일부 경우들에서, 본 발명의 BSP는 수용성 중합체에 연결된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상 개수의 천연적으로 코딩된 아미노산(들)을 추가로 포함한다. 일부 경우들에서, 본 발명의 BSP는 수용성 중합체에 연결된 1개 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산(들), 및 수용성 중합체에 연결된 1개 이상의 천연 발생 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 발명에 사용되는 수용성 중합체는 비접합 형태에 비해 BSP의 혈청 반감기를 증진시킨다.
　변경(증가 또는 감소를 비제한적 예로 포함함)된 약리학, 약물동태학 또는 약력학 특성들, 예컨대 생체내 반감기를 제공하기 위해, 본 발명의 BSP에 연결된 수용성 중합체의 수(즉, PEG화 또는 글리코실화 정도)가 조정될 수 있다. 일부 실시양태들에서, BSP의 반감기는 비변형된 폴리펩티드에 비해, 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90%, 2배, 5배, 10배, 50배, 또는 약 100배 이상 증가된다.
강친핵성 기(즉, 히드라지드 , 히드라진, 히드록실아민 또는 세미카르바지드 )를 갖는 PEG 유도체
　본 발명의 한 실시양태에서, 카르보닐-함유의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 BSP는 PEG 골격에 직접적으로 연결된 말단 히드라진, 히드록실아민, 히드라지드 또는 세미카르바지드 부분을 함유하는 PEG 유도체를 이용하여 변형된다.
일부 실시양태들에서, 히드록실아민-말단 PEG 유도체는 구조:
R0-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-O-NH2
(식 중에서, R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2 내지 10이며, n은 100 내지 1,000(즉, 평균 분자량은 5 내지 40 kDa임)임)를 가질 것이다.
일부 실시양태들에서, 히드라진- 또는 히드라지드-함유 PEG 유도체는 구조:
R0-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-X-NH-NH2
(식 중에서, R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2 내지 10이며, n은 100 내지 1,000이며, X는 임의적으로 존재 또는 부재할 수 있는 카르보닐기(C=O)임)를 가질 것이다.
일부 실시양태들에서, 세미카르바지드-함유 PEG 유도체는 구조:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2
(식 중에서, R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2 내지 10이며, n은 100 내지 1,000임)를 가질 것이다.
본 발명의 다른 한 실시양태에서, 카르보닐-함유 아미노산을 포함하는 BSP는 아미드 연결기에 의해 PEG 골격에 연결된 말단 히드록실아민, 히드라지드, 히드라진 또는 세미카르바지드 부분을 함유하는 PEG 유도체를 이용하여 변형된다.
일부 실시양태들에서, 히드록실아민-말단 PEG 유도체는 구조:
R0-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-O-NH2
(식 중에서, R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2 내지 10이며, n은 100 내지 1,000(즉, 평균 분자량은 5 내지 40 kDa임)임)를 가질 것이다.
일부 실시양태들에서, 히드라진- 또는 히드라지드-함유 PEG 유도체는 구조:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-X-NH-NH2
(식 중에서, R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2 내지 10이며, n은 100 내지 1,000이며, X는 임의적으로 존재 또는 부재할 수 있는 카르보닐기(C=O)임)를 가진다.
일부 실시양태들에서, 세미카르바지드-함유 PEG 유도체는 구조:
R0-(CH2CH2O)n-0-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2
(식 중에서, R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2 내지 10이며, n은 100 내지 1,000임)를 가진다.
본 발명의 다른 한 실시양태에서, 카르보닐-함유 아미노산을 포함하는 BSP는 말단 히드라진, 히드록실아민, 히드라지드 또는 세미카르바지드 부분을 함유하는 분지형 PEG 유도체(분지형 PEG의 각 사슬은 MW가 10 내지 40 kDa, 더욱 바람직하게는 5 내지 20 kDa의 범위 내임)를 이용하여 변형된다.
본 발명의 다른 한 실시양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 BSP는 분지형 구조를 갖는 PEG 유도체를 이용하여 변형된다. 예를 들어, 일부 실시양태들에서, 히드라진- 또는 히드라지드-말단 PEG 유도체는 하기 구조:
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH2)m-X-NH-NH2
(식 중에서, R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2 내지 10이며, n은 100 내지 1,000이며, X는 임의적으로 존재 또는 부재할 수 있는 카르보닐기(C=O)임)를 가질 것이다.
일부 실시양태들에서, 세미카르바지드기를 함유하는 PEG 유도체는 구조:
[R0-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-C(O)-NH-CH2-CH2]2CH-X-(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2
(식 중에서, R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, X는 임의적으로 NH, 0, S, C(O)이거나, 존재하지 않으며, m은 2 내지 10이며, n은 100 내지 1,000임)를 가질 것이다.
일부 실시양태들에서, 히드록실아민기를 함유하는 PEG 유도체는 구조:
[R0-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-C-(0)-NH-CH2-CH2]2CH-X-(CH2)m-O-NH2
(식 중에서, R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, X는 임의적으로 NH, 0, S, C(O)이거나, 존재하지 않으며, m은 2 내지 10이며, n은 100 내지 1,000임)를 가질 것이다.
수용성 중합체(들)이 BSP에 연결되는 정도 및 부위는 BSP 수용체 또는 결합 상대에 대한 BSP의 결합을 조절할 수 있다. 일부 실시양태들에서, 연결기는, 평형 결합 검정에 의해 측정 시, Kd가 약 400 nM 이하이고, Kd이 150 nM 이하이며, 일부 경우들에서는 Kd가 100 nM 이하인 상태에서 BSP가 BSP 수용체에 결합하도록 배치된다.
중합체의 활성화 및 펩티드의 접합을 위한 방법 및 화학작용이 문헌에 기재되어 있고, 당업계에 공지되어 있다. 중합체의 활성화를 위해 통상 이용되는 방법에는 시아노겐 브로마이드, 과요오드산염, 글루타르알데히드, 비에폭시드, 에피클로로히드린, 디비닐술폰, 카르보디이미드, 술포닐 할라이드, 트리클로로트리아진 등을 이용한 작용기의 활성화가 포함되나, 이들에 제한되지 않는다([R. F. Taylor(1991), PROTEIN IMMOBILISATION. FUNDAMENTAL AND APPLICATIONS, Marcel Dekker, N. Y.; S. S. Wong, (1992), CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSSLINKING, CRC Press, Boca Raton; G. T. Hermanson 등(1993), IMMOBILIZED AFFINITY LIGAND TECHNIQUES, Academic Press, N. Y.; Dunn, R.L. 등 편저, POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, ACS Symposium Series 제469권, American Chemical Society, Washington, D. C. 1991)] 참고).
PEG의 관능화 및 접합에 대한 몇가지 평론 및 특수 논문들이 입수가능하다. 예를 들어, [Harris, Macromol . Chem . Phys. C25: 325-373(1985); Scouten, Methods in Enzymology 135: 30-65(1987); Wong 등, Enzyme Microb . Technol. 14: 866-874(1992); Delgado 등, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249-304(1992); Zalipsky, Bioconjugate Chem . 6: 150-165(1995)]를 참고한다.
중합체의 활성화 방법도 또한 [WO 94/17039, U.S. 특허 No. 5,324,844, WO 94/18247, WO 94/04193, U.S. 특허 No. 5,219,564, U.S. 특허 No. 5,122,614, WO 90/13540, U.S. 특허 No. 5,281,698 및 WO 93/15189]에서, 또한 활성화 중합체와 효소로서의 응고 인자 VII 간의 접합 방법은 WO 94/15625에서, 활성화 중합체와 효소로서의 헤모글로빈 간의 접합 방법은 WO 94/09027에서, 활성화 중합체와 효소로서의 산소 담지 분자 간의 접합 방법은 U.S. 특허 No. 4,412,989에서, 활성화 중합체와 효소로서의 리보뉴클레아제 및 수퍼옥시드 디스뮤타제 간의 접합 방법은 [Veronese 등, App. Biochem. Biotech. 11: 141-52(1985)]에서 찾아볼 수 있다. 상기 언급된 모든 참고문헌 및 특허는 본원에 참고로 인용된다.
비천연적으로 코딩된 아미노산, 예컨대 p-아지도-L-페닐알라닌을 함유하는 BSP의 PEG화(즉, 임의의 수용성 중합체의 첨가)는 임의의 통상적 방법에 의해 수행된다. 예를 들어, BSP는 알킨-말단 mPEG 유도체에 의해 PEG화된다. 간략히 말해, 과량의 고체 mPEG(5000)-O-CH2-C≡CH가 실온에서 교반 하에 p-아지도-L-Phe-함유 BSP의 수용액에 첨가된다. 전형적으로, 수용액은 반응이 수행되는 pH(일반적으로 약 pH 4-10) 부근에 pKa를 가지는 완충액으로 완충된다. pH 7.5에서 PEG화를 위해 적당한 완충액의 예에는 예를 들어, HEPES, 포스페이트, 보레이트, TRTS-HCl, EPPS, 및 TES가 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. pH를 연속적으로 모니터하고, 필요한 경우에는 조정한다. 반응은 전형적으로 약 1 내지 48시간 동안 계속되도록 한다.
반응 생성물을 후속하여 소수성 상호작용 크로마토그래피에 적용하여, 유리 mPEG(5000)-O-CH2-C≡CH, 및 비블록 PEG가 분자의 양 말단에서 활성화됨으로써 BSP 변종체 분자를 가교할 때 형성될 수 있는 PEG화 BSP의 임의의 고분자량 착체로부터 PEG화 BSP 변종체를 분리한다. 소수성 상호작용 크로마토그래피 동안의 조건은, 유리 mPEG(50O0)-O-CH2-C≡CH가 칼럼을 통과해 흐르고, 한편 임의의 가교된 PEG화 BSP 변종체 착체가 1개 이상의 PEG 기에 접합된 1개의 BSP 변종체 분자를 함유하는 원하는 형태를 따라 용리되도록 하는 조건이다. 적당한 조건은 원하는 접합체 대비, 가교된 착체의 상대 크기에 따라 다양하고, 이는 당업계의 숙련가에 의해 용이하게 결정된다. 원하는 접합체를 함유하는 용리액은 초여과에 의해 농축되고, 투석여과에 의해 탈염된다.
필요한 경우, 소수성 크로마토그래피로부터 수득된 PEG화 BSP는, 친화도 크로마토그래피; 음이온- 또는 양이온 교환 크로마토그래피(DEAE 세파로스 이용(단, 이에 제한되지 않음)); 실리카 상의 크로마토그래피; 역상 HPLC; 겔 여과(세파덱스 G-75 이용(단, 이에 제한되지 않음)); 소수성 상호작용 크로마토그래피; 크기 배제 크로마토그래피, 금속-킬레이트 크로마토그래피; 초여과/투석여과; 에탄올 석출; 암모늄 술페이트 석출; 크로마토포커싱; 치환 크로마토그래피; 전기영동 절차(제조용 등전점 포커싱을 비제한적 예로 포함함), 시차 용해도(암모늄 술페이트 석출을 비제한적 예로 포함함), 또는 추출을 비제한적 예로 포함하는, 당업계의 숙련가에게 공지된 1개 이상의 절차에 의해 추가 정제될 수 있다. 겉보기 분자량을 구형 단백질 표준물질과 비교함으로써 GPC에 의해 평가될 수 있다(Preneta, AZ in PROTEIN PURIFICATION METHODS, A PRACTICAL APPROACH (Harris & Angal 편저) IRL Press 1989, 293-306). BSP-PEG 접합물의 순도는 단백질 분해(트립신 절단을 비제한적 예로 포함함), 및 그에 이은 질량 분광법 분석에 의해 평가될 수 있다[Pepinsky RB. 등, J. Pharmcol . & Exp . Ther . 297(3): 1059-66(2001)].
본 발명의 BSP의 아미노산에 연결된 수용성 중합체는 추가로 유도체화되거나 비제한적으로 치환될 수 있다.
아지드 -함유 PEG 유도체
본 발명의 다른 한 실시양태에서, BSP는 비천연적으로 코딩된 아미노산의 측쇄 상에 존재하는 알킨 부분과 반응하게 될 아지드 부분을 함유하는 PEG 유도체로 변형된다. 일반적으로, PEG 유도체는 평균 분자량이 1 내지 100 kDa 범위 내, 일부 실시양태들에서는 10 내지 40 kDa 범위 내일 것이다.
　일부 실시양태들에서, 아지드-말단 PEG 유도체는 구조:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-N3
(식 중에서, R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2 내지 10이며, n은 100 내지 1,000(즉, 평균 분자량은 5 내지 40 kDa임)임)를 가질 것이다.
다른 한 실시양태에서, 아지드-말단 PEG 유도체는 구조:
RO-(CH2CH2O)n-0-(CH2)m-NH-C(O)-(CH2)p-N3
(식 중에서, R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2 내지 10이며, p는 2 내지 10이고, n은 100 내지 1,000(즉, 평균 분자량은 5 내지 40 kDa임)임)를 가질 것이다.
본 발명의 다른 한 실시양태에서, 알킨-함유 아미노산을 포함하는 BSP는 말단 히드라진 부분을 함유하는 분지형 PEG 유도체(분지형 PEG의 각 사슬은 MW가 10 내지 40 kDa, 더욱 바람직하게는 5 내지 20 kDa의 범위 내임)를 이용하여 변형된다. 예를 들어, 일부 실시양태들에서, 아지드-말단 PEG 유도체는 하기 구조:
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH2)m-X-(CH2)pN3
(식 중에서, R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2 내지 10이며, p는 2 내지 10이고, n은 100 내지 1,000이며, X는 임의적으로 각 경우에 존재 또는 부재할 수 있는 O, N, S 또는 카르보닐기(C=O)임)를 가질 것이다.
알킨 -함유 PEG 유도체
본 발명의 다른 한 실시양태에서, BSP는 비천연적으로 코딩된 아미노산의 측쇄 상에 존재하는 아지드 부분과 반응하게 될 알킨 부분을 함유하는 PEG 유도체로 변형된다.
일부 실시양태들에서, 알킨-말단 PEG 유도체는 하기 구조:
R0-(CH2CH20)n-0-(CH2)m-C≡CH
(식 중에서, R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2 내지 10이며, n은 100 내지 1,000(즉, 평균 분자량은 5 내지 40 kDa임)임)를 가질 것이다.
본 발명의 다른 한 실시양태에서, 알킨-함유 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 BSP는 아미드 연결기에 의해 PEG 골격에 연결된 말단 아지드 또는 말단 알킨 부분을 함유하는 PEG 유도체를 이용하여 변형된다.
일부 실시양태들에서, 알킨-말단 PEG 유도체는 하기 구조:
R0-(CH2CH20)n-0(CH2)m-NH-C(0)-(CH2)p-C≡CH
(식 중에서, R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2 내지 10이며, p는 2 내지 10이고, n은 100 내지 1,000임)를 가질 것이다.
본 발명의 다른 한 실시양태에서, 아지드-함유 아미노산을 포함하는 BSP는 말단 알킨 부분을 함유하는 분지형 PEG 유도체(분지형 PEG의 각 사슬은 MW가 10 내지 40 kDa, 더욱 바람직하게는 5 내지 20 kDa의 범위 내임)를 이용하여 변형된다. 예를 들어, 일부 실시양태들에서, 알킨-말단 PEG 유도체는 하기 구조:
[R0-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH2)m-X-(CH2)pC≡CH
(식 중에서, R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2 내지 10이며, p는 2 내지 10이고, n은 100 내지 1,000이며, X는 임의적으로 O, N, S 또는 카르보닐기(C=O)이거나 부재할 수 있음)를 가질 것이다.
포스핀-함유 PEG 유도체
본 발명의 다른 한 실시양태에서, BSP는 비천연적으로 코딩된 아미노산의 측쇄 상에 존재하는 아지드 부분과 반응하게 될 아릴 포스핀을 추가로 포함하는, 활성화된 작용기(에스테르, 카르보네이트를 비제한적 예로 포함함)를 함유하는 PEG 유도체를 이용하여 변형된다. 일반적으로, PEG 유도체는 평균 분자량이 1 내지 100 kDa 범위 내, 일부 실시양태들에서는 10 내지 40 kDa 범위 내일 것이다.
일부 실시양태들에서, PEG 유도체는 구조:
Figure 112007014691585-PCT00039
(식 중에서, n은 1 내지 10이고; X는 O, N, S이거나 존재하지 않을 수 있으며; Ph는 페닐이고; W는 수용성 중합체임)를 가질 것이다.
일부 실시양태들에서, PEG 유도체는 구조:
Figure 112007014691585-PCT00040
(식 중에서, X는 O, N, S이거나 존재하지 않을 수 있으며; Ph는 페닐이고; W는 수용성 중합체이며; R은 H, 알킬, 아릴, 치환 알킬 및 치환 아릴기일 수 있음)를 가질 것이다. 예시적 R 기에는 -CH2, -C(CH3), -OR', -NR'R", -SR', -할로겐, -C(O)R', -CONR'R", -S(O)2R', -S(O)2NR'R", -CN 및 -NO2가 포함되나 이에 제한되지 않는다. R', R", R"' 및 R""는 각기 독립적으로 수소, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 아릴(1-3 할로겐으로의 아릴 치환을 비제한적 예로 포함함), 치환 또는 비치환 알킬, 알콕시 또는 티오알콕시기, 또는 아릴알킬기를 가리킨다. 본 발명의 화합물이 1개 초과의 R 기를 포함할 때, 예를 들어 각 R 기는, 각 R', R", R" 및 R" 기들이 1개로 초과될 때 그 각각의 기와 마찬가지로, 독립적으로 선택된다. R' 및 R"가 동일한 질소 원자에 결합할 때, 그것들은 질소 원자와 조합되어 5-, 6- 또는 7-원 환을 형성할 수 있다. 예를 들어, -NR'R"은 1-피롤리디닐 및 4-모르폴리닐을 비제한적 예로서 포함하는 의미이다. 치환기의 상기 논의로부터, 당업자는 용어 "알킬"은 수소기 외의 기에 결합된 탄소 원자를 포함하는 기, 예컨대 할로알킬(-CF3 및 -CH2CF3을 비제한적 예로 포함함), 및 아실(-C(O)CH3, -C(O)CF3, -C(O)CH2OCH3 등을 비제한적 예로 포함함)을 포함하는 의미임을 이해할 것이다.
기타 PEG 유도체 및 일반적 PEG화 기법
BSP에 연결될 수 있는 다른 예시적 PEG 분자, 및 PEG화 방법에는 예컨대, 본원에 각기 참고로 인용되는, U.S. 특허 공보 No. 2004/0001838; 2002/0052009; 2003/0162949; 2004/0013637; 2003/0228274; 2003/0220447; 2003/0158333; 2003/0143596; 2003/0114647; 2003/0105275; 2003/0105224; 2003/0023023; 2002/0156047; 2002/0099133; 2002/0086939; 2002/0082345; 2002/0072573; 2002/0052430; 2002/0040076; 2002/0037949; 2002/0002250; 2001/0056171; 2001/0044526; 2001/0027217; 2001/0021763; U.S. 특허 No. 6,646,110; 5,824,778; 5,476,653; 5,219,564; 5,629,384; 5,736,625; 4,902,502; 5,281,698; 5,122,614; 5,473,034; 5,516,673; 5,382,657; 6,552,167; 6,610,281; 6,515,100; 6,461,603; 6,436,386; 6,214,966; 5,990,237; 5,900,461; 5,739,208; 5,672,662; 5,446,090; 5,808,096; 5,612,460; 5,324,844; 5,252,714; 6,420,339; 6,201,072; 6,451,346; 6,306,821; 5,559,213; 5,747,646; 5,834,594; 5,849,860; 5,980,948; 6,004,573; 6,129,912; WO 97/32607, EP 229,108, EP 402,378, WO 92/16555, WO 94/04193, WO 94/14758, WO 94/17039, WO 94/18247, WO 94/28024, WO 95/00162, WO 95/11924, WO 95/13090, WO 95/33490, WO 96/00080, WO 97/18832, WO 98/41562, WO 98/48837, WO 99/32134, WO 99/32139, WO 99/32140, WO 96/40791, WO 98/32466, WO 95/06058, EP 439 508, WO 97/03106, WO 96/21469, WO 95/13312, EP 921 131, WO 98/05363, EP 809 996, WO 96/41813, WO 96/07670, EP 605 963, EP 510 356, EP 400 472, EP 183 503 및 EP 154 316에 기재된 것들이 포함된다. 본원에 기재된 임의의 PEG 분자는 단일 사슬, 분지형 사슬, 다수 팔 사슬, 단관능성, 이관능성, 다관능성 또는 이들의 임의의 조합을 비제한적 예로 포함하는 임의의 형태로 사용될 수 있다.
혈청 알부민에 대한 친화도 증진
각종 분자들을 또한 본 발명의 BSP에 융합시켜, 혈청 내 BSP의 반감기를 조절할 수 있다. 일부 실시양태들에서, 분자를 본 발명의 BSP에 연결 또는 융합시켜, 동물에서의 내인성 혈청 알부민에 대한 친화도를 증진시킨다.
예를 들어, 일부 경우들에서, BSP 및 알부민 결합 서열의 재조합 융합이 행해진다. 예시적 알부민 결합 서열에는 스트렙토코커스 단백질 G로부터의 알부민 결합 도메인(예컨대, [Makrides 등, J. Pharmacol . Exp . Ther . 277: 534-542(1996) 및 Sjolander 등, J. Immunol . Methods 201: 115-123(1997)), 또는 예컨대, [Dennis 등, J. Biol . Chem . 277: 35035-35043(2002)]에 기재된 것들과 같은 알부민-결합 펩티드가 포함되나, 이들에 제한되지 않는다.
다른 실시양태들에서, 본 발명의 BSP는 지방산을 이용하여 아실화된다. 일부 경우들에서, 지방산은 혈청 알부민에 대한 결합을 촉진한다. 예컨대, [Kurtzhals 등, Biochem. J. 312: 725-73 1(1995)]을 참고한다.
다른 실시양태들에서, 본 발명의 BSP는 혈청 알부민(인간 혈청 알부민을 비제한적 예로 포함함)에 직접적으로 융합된다. 당업자는 매우 다양한 다른 분자들이 또한 본 발명에서의 BSP에 연결되어, 혈청 알부민 또는 기타 혈청 성분에 대한 결합을 조절할 수 있음을 인지할 것이다.
X. BSP 의 글리코실화
본 발명은 당 잔기 함유의 1개 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산이 혼입된 BSP를 포함한다. 당 잔기는 천연(N-아세틸글루코사민을 비제한적 예로 포함함) 또는 비천연(3-플루오로갈락토스를 비제한적 예로 포함함)일 수 있다. 당은 N- 또는 0-연결 글리코시딕 연결기(N-아세틸갈락토스-L-세린을 비제한적 예로 포함함) 또는 비천연 연결기(옥심 또는 상응하는 C- 또는 S-연결 글리코시드를 비제한적 예로 포함함)을 통해 비천연적으로 코딩된 아미노산에 연결될 수 있다.
당(글리코실을 비제한적 예로 포함함) 부분은 생체내 또는 생체외 BSP에 첨가될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태들에서, 카르보닐-함유 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 BSP는 아미노옥시기로 유도체화된 당으로 변형되어, 옥심 연결기를 통해 연결된 상응하는 글리코실화 폴리펩티드를 발생시킨다. 당은 일단 비천연적으로 코딩된 아미노산에 결합되면, 당은 글리코실트랜스퍼라제 및 기타 효소를 이용한 처리로써 BSP에 결합된 이당류를 발생시키기 위해 구상될 수 있다. 예컨대, [H. Liu 등, J. Am . Chem . Soc . 125: 1702-1703(2003)]을 참고한다.
본 발명의 일부 실시양태들에서, 카르보닐-함유 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 BSP는 아미노옥시 유도체로서 제조된 한정된 구조를 갖는 글리칸을 이용하여 직접적으로 변형된다. 당업자는 아지드, 알킨, 히드라지드, 히드라진 및 세미카르바지드를 포함한 다른 작용기들을 사용하여 당을 비천연적으로 코딩된 아미노산에 연결할 수 있음을 인지할 것이다.
본 발명의 일부 실시양태들에서, 아지드 또는 알키닐-함유 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 BSP은 이어서, 알키닐 또는 아지드 유도체(단, 이에 제한되지 않음)와의 휘스겐 [3+2] 시클로부가 반응(단, 이에 제한되지 않음)에 의해 변형될 수 있다. 이 방법은 단백질이 극히 높은 선택도로 변형되도록 한다.
XI . 이량체 및 다량체를 함유하는 BSP
본 발명은 또한 BSP 조합물(GLP-1 및 GLP-1 유사체, T-20 및 T-20 유사체, PYY 및 PYY 유사체를 비제한적 예로 포함함), 예컨대 동종이량체, 이종이량체, 동종다량체 또는 이종다량체(즉, 삼량체, 사량체 등)을 제공하고, 여기에서 1개 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 함유하는 특별한 BSP는, 폴리펩티드 골격에 직접적으로 또는 링커를 통해, 비GLP-1(또는 비T- 또는 비PYY) 펩티드 또는 그것의 변종체인 다른 한 BSP, 그것의 유사체 또는 변종체 또는 임의의 기타 폴리펩티드에 결합된다. BSP(예컨대, GLP-1, T-20 또는 PYY) 이량체 또는 다량체 접합체는 단량체에 비해 증가된 분자량으로 인해, 단량체성 BSP에 비해 상이한 약리학적, 약물동태학, 약력학, 조절된 치료 반감기 또는 조절된 혈장내 반감기를 비제한적 예로 포함하는 새로운 성질 또는 바람직한 성질을 나타낼 수 있다. 일부 실시양태들에서, 본 발명의 접합체 또는 융합체는 BSP의 그것의 수용체 또는 결합 상대와의 상호작용을 조절할 것이다. 다른 실시양태들에서, 본 발명의 BSP 접합체, 융합체, 이량체 또는 다량체는 수용체 길항자, 작용자, 초작용자 또는 조절자로서 작용할 것이다.
일부 실시양태들에서, 이량체 또는 다량체를 함유하는 BSP 내에 존재하는 BSP 중 1 개 이상은 수용체 결합 영역 또는 결합 상대에 결합하기 위한 영역 내에 존재하는 수용성 중합체에 연결된 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태들에서, BSP는 직접적으로, 또는 Asn-Lys 아미드 연결기 또는 Cys-Cys 디술피드 연결기를 통해(단, 이에 제한되지 않음) 연결된다. 일부 실시양태들에서, 연결된 BSP는 접합, 융합, 이량체화, 또는 다량체화를 촉진하기 위해 상이한 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함할 것이며, 비제한적 예로서 제1 BSP의 비천연적으로 코딩된 아미노산 내의 알킨, 및 제2 BSP의 제2 비천연적으로 코딩된 아미노산 내의 아지드는 휘스겐 [3+2] 시클로부가를 통해 접합될 것이다. 대안적으로, 제1 BSP, 및/또는 케톤-함유 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 연결된 BSP는 히드록실아민-함유 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 제2 BSP에 접합될 수 있고, 폴리펩티드는 상응하는 옥심의 형성을 통해 반응한다.
대안적으로, 2개의 BSP가 링커를 통해 연결된다. 임의의 헤테로- 또는 호모-이관능성 링커를 사용하여, 동일하거나 상이한 일차 서열일 수 있는 2개의 BSP를 연결할 수 있다. 일부 경우들에서, BSP를 함께 테더링하는데 사용되는 링커는 이관능성 PEG 시약일 수 있다. 링커는 광범위한 범위의 분자량 또는 분자 길이를 가질 수 있다. 보다 크거나 보다 작은 분자량 링커를 사용하여, 존재하는 경우에 한 해 BSP와 연결된 객체 간, BSP와 그것의 결합 상대 간, 또는 연결된 객체와 그것의 결합 상대 간의 원하는 공간적 관계 또는 구조를 제공할 수 있다. 보다 길거나 보다 짧은 분자 길이를 갖는 링커를 또한 사용하여, 존재하는 경우에 한 해 BSP와 연결된 객체 간, BSP와 그것의 결합 상대 간, 또는 연결된 객체와 그것의 결합 상대 간의 원하는 공간 또는 가요성을 제공할 수 있다. 유사하게, 특별한 모양 또는 구조를 갖는 링커를 이용하여, BSP 또는 연결된 객체에, BSP가 그것의 표적에 도달하기 전 또는 후에 특별한 모양 또는 구조를 부여할 수 있다. BSP와 연결된 객체 및 결합 상대 간의 공간적 관계의 상기 최적화는 신규의 조절되거나 요망되는 성질을 분자에 제공할 수 있다.
일부 실시양태들에서, 본 발명은 a) 중합체 골격의 적어도 제1 말단 상의 아지드, 알킨, 히드라진, 히드라지드, 히드록실아민 또는 카르보닐-함유 부분; 및 b) 중합체 골격의 제2 말단 상의 적어도 제2 작용기를 포함하는 덤벨 구조를 가지는 수용성 이관능성 링커를 제공한다. 제2 작용기는 제1 작용기와 동일하거나 상이할 수 있다. 제2 작용기는, 일부 실시양태들에서 제1 작용기와 반응성이지 않다. 본 발명은 일부 실시양태들에서, 분지형 분자 구조의 1개 이상의 팔을 포함하는 수용성 화합물을 제공한다. 예를 들어, 분지형 분자 구조는 수지상(dendritic)일 수 있다.
일부 실시양태들에서, 본 발명은 구조:
R-(CH2CH2O)n-0-(CH2)m-X
(식 중에서, n은 약 5 내지 3,000이고, m은 2 내지 10이며, X는 아지드, 알킨, 히드라진, 히드라지드, 아미노옥시기, 히드록실아민, 아세틸 또는 카르보닐-함유 부분일 수 있고, R은 X와 동일하거나 상이할 수 있는 캡핑기, 작용기 또는 이탈기임)를 갖는 수용성 활성화된 중합체와의 반응에 의해 형성된 BSP와 같은 하나 이상의 GH 수퍼유전자 부류 구성원을 포함하는 다량체를 제공한다. R는, 예를 들어 히드록실, 보호된 히드록실, 알콕실, N-히드록시숙신이미딜 에스테르, 1-벤조트리아졸릴 에스테르, N-히드록시숙신이미딜 카르보네이트, 1-벤조트리아졸릴 카르보네이트, 아세탈, 알데히드, 알데히드 수화물, 알케닐, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 활성 술폰, 아민, 아미노옥시, 보호된 아민, 히드라지드, 보호된 히드라지드, 보호된 티올, 카르복실산, 보호된 카르복실산, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 말레이미드, 비닐술폰, 디티오피리딘, 비닐피리딘, 요오도아세트아미드, 에폭시드, 글리옥살, 디온, 메실레이트, 토실레이트 및 트레실레이트, 알켄, 및 케톤으로 이루어진 군으로부터 선택되는 작용기일 수 있다.
XII. BSP 활성, 및 BSP 의 BSP 수용체 또는 결합 상대에 대한 친화도의 측정
BSP 활성은 표준 생체외 또는 생체내 검정을 이용하여 구해질 수 있다.
수많은 검정들을 사용하여, 본 발명의 GLP-1 폴리펩티드의 활성을 모니터할 수 있다. GLP-1과 같은 펩티드 호르몬은 특정 G 단백질-결합 수용체를 활성화하고, 이에 따라 본 발명의 GLP-1 폴리펩티드는 GLP-1 수용체 디펜던트 cAMP 형성을 검출하는 검정에 의해 평가될 수 있다. 하류 세포내 cAMP 생성은, 비색, 발광, 시간 분해 형광 또는 FP 방법을 비제한적 예로 포함하는 각종 방법들에 의해 측정될 수 있다. 래트 인슐린종-유래 RIN-m5F 세포는 아데닐레이트 사이클라제에 결합된 내인성 GLP-1 수용체를 가지고(Fehmarm. 등, Mol Cell Endocrinol 85:C39-C44; Goke 등, Res Exp Med(Berl). 1989;189(4): 257-64), 수용체 활성화 후에 cAMP를 측정하기 위해 사용될 수 있다. 유사하게, 햄스터 HIT-T15 세포(ATCC, 미국 버지니아주 마나사스 소재) 또는 래트 BRIN-BD11 베타 세포(Green 등, J Mol Endocrinol. 2003 Dec; 31(3): 529-4)가 사용될 수 있다.
대안적으로, CHO를 비제한적 예로 포함하는 재조합 hGLP-1 수용체가 트랜스펙션된 세포(Kim 등, 2003 Diabetes 52: 751-59), BHK(어린 햄스터 신장; Knudsen 등, 2000 J. Med. Chem. 43: 1664-1669), 및 CHL(차이니즈 햄스터 폐) 세포) 또는 일차 세포, 예컨대 래트, 마우스 또는 햄스터로부터 단리된 췌장섬 세포에서 cAMP 생성을 측정될 수 있다. GLP-1 수용체를 본원에 각기 참고로 인용되는 [Thorens, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992, 89(18): 8641-5] 또는 U.S. 특허 No. 5,670,360 및 6,051,689에 기재된 바대로 제조할 수 있다. 포스콜린(Forskolin)(EMD 바이오사이언시스(EMD Biosciences), 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재), 아데닐레이트 사이클라제 활성화제, 및 아데닐레이트 사이클라제, PI3K, MAPK, 또는 p38의 억제제를 검정 대조군으로서 사용할 수 있다. 작용자 대조군에는 GLP-1(7-37) 및 엑센딘-4, 강한 GLP-1 수용체 작용자가 포함되고, 길항자 대조군에는 GLP-1 수용체 길항자 엑센딘(9-39)(바켐 아게(Bachem AG)로부터 입수가능함) 포함된다. [Goke 등, J Biol Chem. 1993 Sep 15;268(26): 19650-5]을 참고한다. 용량 반응 곡선을 시험한 각 화합물에 대해 폴로팅하고, EC50 값을 계산한다. 대안적으로, cAMP를 다른 검정에 의해 측정할 수 있다. 일반적으로, 이 검정들은 당업계에 공지되어 있다.
인슐린 분비는 또한 본 발명의 GLP-1 폴리펩티드의 생물학적 활성의 척도이다. 인슐린 분비의 생체외 연구는 인슐린 RIA 또는 ELISA를 통해 GLP-1 폴리펩티드(들) 및 포도당의 농도 범위를 이용하여 배양 후 세포에서 산출될 수 있다. [Green 등, 이하 동문]은 래트 BRIN-BD11 베타 세포 내의 GLP-1 폴리펩티드의 인슐린친화 효과를 평가하였다. 래트 췌장섬이 대안적으로 인슐린 분비 연구에 사용할 수 있다(Goke 등, J. Biol. Chem. 1993 268(26)19650-19655).
대안적으로, 베타 섬 세포 성장을 CRE 리포터 검정에 의해 XTT 또는 BrdU 또는 CREB(시클릭 AMP 반응 요소 결합 단백질) 전사 인자와 같은 시약을 이용하여 측정할 수 있다.
비천연 아미노산을 포함하는 GLP-1 폴리펩티드의 그것의 수용체에 대한 친화도를 비아코어(BIAcore)TM 바이오센서(파마시아)를 이용하여 측정할 수 있다. GLP-1(활성 GLP-1 수용체를 함유하는 세포, 예컨대 인간 세포, 또는 재조합 GLP-1 수용체 생성 세포를 비제한적 예로 포함함)의 성장을 조절하거나 그에 결합하는 세포 또는 세포주를 사용하여, GLP-1 수용체 결합을 모니터할 수 있다. 예를 들어, GLP-1(활성 GLP-1 수용체를 함유하는 세포, 예컨대 인간 세포, 또는 재조합 GLP-1 수용체 생성 세포를 비제한적 예로 포함함)의 성장을 조절하거나 그에 결합하는 세포 또는 세포주를 사용하여, GLP-1 수용체 결합을 모니터할 수 있다.
대안적으로, 재조합 hGLP-1 수용체가 트랜스펙션된 세포(CHO, BHK(어린 햄스터 신장), 및 CHL(차이니즈 햄스터 폐 섬유아세포) 세포를 비제한적 예로 포함함)를 이용하여 결합을 측정할 수 있다. 트랜스펙션된 CHO 세포에서의 결합 연구에 대해서는 [Kim 등, 이하 동문]을 참고하고, 트랜스펙션된 CHL 세포에서의 연구에 대해서는 [Green 등, J Mol Endocrinol. 2003 Dec; 31(3): 529-40]을 참고한다. GLP-1 수용체를 본원에 각기 참고로 인용되는, [Thorens, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992, 89(18): 8641-5] 또는 U.S. 특허 No. 5,670,360 및 6,051,689에 기재된 바대로 제조할 수 있다.
DPP IV 또는 인간 혈장에 의한 본 발명의 GLP-1 폴리펩티드의 퇴화(degradation)를 액체 크로마토그래피/질량 분광법(LC/MS), 또는 기타 방법들에 의해 모니터할 수 있다. 본 발명의 GLP-1 펩티드를 DPP IV 또는 풀링된 인간 혈장과 함께 0, 6 또는 12시간 동안 인큐베이션하고, TFA와 같은 시약을 분석 전에 첨가하여 임의의 효소에 의한 반응을 종료할 수 있다. 인용된 모든 참고문헌들은 본원에 참고로 인용된다.
GLP-1 활성을 시험하기 위한 생체내 동물 모델 및 인간 임상 시도에는 본원에 각기 참고로 인용되는, U.S. 특허 출원 공보 No. 20040082507 A1; 및 20030232754 A1에 기재된 것들이 포함된다.
수많은 검정들을 사용하여, 본 발명의 T-20(DP-178) 폴리펩티드의 활성을 모니터할 수 있다. 본원에 참고로 인용되는 U.S. 특허 No. 5,464,933에 기재된 바대로, DP-178 폴리펩티드의 합포체 형성 능력 또는 무세포 바이러스에 의한 감염 억제 능력을 시험하는 생체외 검정을 사용할 수 있다. 측정된 파라미터들에는 주어진 바이러스 균주에 대해 나타나는 상대적 항바이러스 활성 및/또는 펩티드의 균주 특이적 억제 활성이 포함된다. 세포 융합 검정을 이용하여, 생체외 HIV-유도 합포체 형성을 억제하는 펩티드 능력을 시험할 수 있다. 그러한 검정은 만성적 HIV-감염 세포 및 각종 농도들의 피검정 펩티드의 존재 하에 비감염 CD-4+ 세포(예컨대, 비제한적 예로서 Molt 또는 CEM 세포)를 배양하는 것을 포함할 수 있다. 적절한 시간 동안 인큐베이션한 후, 배양물을 세포 융합 및 합포체 형성을 나타내는 다핵 거대 세포의 존재에 대해 현미경으로 조사한다.
역전사효소(RT) 검정을 이용하여, 무세포 HIV에 의한 CD-4+ 세포의 감염을 억제하는 펩티드의 능력을 시험할 수 있다. 그러한 검정은 적절한 농도(즉, TCID50)의 바이러스 및 CD-4+ 세포를 시험하는 펩티드의 존재 하에 배양하는 것을 포함할 수 있다. 당업자에게 공지된 배양 조건을 사용한다. 펩티드가 첨가되지 않은 대조군 바양물에 부가하여, 일정 범위의 펩티드 농도를 사용할 수 있다. 적절한 시간(예컨대, 7일) 동안 배양한 후, 표준 절차를 이용하여 무세포 상등액을 제조하고, 성공적 감염의 척도로서 RT 활성의 존재에 대해 시험한다. RT 활성을, 예를 들어 [Goff 등(Goff, S. 등, 1981, J. Virol. 38: 239-248) 및/또는 Willey 등(Willey, R. 등, 1988, J. Virol. 62: 139-147)]에 기재된 기법과 같은 표준 기법을 이용하여 시험할 수 있다. 이 참고문헌들은 전체적으로 본원에 참고로 인용된다. 항바이러스 활성을 측정하는 다른 검정이 당업자에게 공지되어 있다. 다른 한 항바이러스제를 이용한 조합 치료법으로 시험하는 상기 검정에 대한 변형법도 또한 당업자에게 공지되어 있다.
당업자에게 공지된 표준 방법을 이용하여, 비레트로바이러스 활성을 검정할 수 있다. 예를 들어, 호흡 합포체 바이러스 및 파라인플루엔자 바이러스 활성 검정 기법의 논의에 대해, [Pringle 등(Pringle, C. R. 등, 1985, J. Medical Virology 17: 377-386)]을 참고한다. 또한, 상기 기법의 일반적 개요에 대해, 예를 들어 ["Zinsser Microbiology", 1988, Joklik, W. K. 등(편저), Appleton & Lange, Norwalk, Conn., 제19판]을 참고한다. 이 문헌들은 전체적으로 본원에 참고로 인용된다.
바람직한 PYY 작용자는 WO 02/47712 및 U.S. 특허 공보 No. 2002/0141985에 기재된 검정들(바람직하게 음식 섭취, 위 배출, 췌장액 분비, 또는 체중 감량 검정) 중 하나에서의 효력을 가질 수 있고, 이는 동일한 검정에서 NPY의 효력보다 크다.
BSP 유사체를 발생시키는데 사용되는 방법의 종과 무관하게, 유사체를 생물학적 활성에 대해 검정한다. 일반적으로, 생물학적 활성에 대한 시험은 원하는 결과, 예컨대 (비변경된 BSP 대비) 생물학적 활성의 증가 또는 감소, (비변경된 BSP 대비) 상이한 생물학적 활성, 수용체 또는 결합 상대 친화도 분석, (비변경된 BSP 대비) BSP 자체 또는 결합 상대의 구조적 또는 구조적 변화, 또는 혈청 반감기 분석에 대한 분석을 제공한다.
검정 방법에 대한 참고문헌들의 상기 목록은 모든 예들을 반영하는 것이 아니며, 당업자는 원하는 최종 결과에 대해 시험하는데 유용한 다른 검정들을 인지할 것이다.
XIII. 효력, 기능적 생체내 반감기, 및 약물동태학 파라미터의 측정
본 발명의 한 중요 측면은 폴리펩티드의 수용성 중합체 부분에 대한 접합의 존재 또는 부재 하에서의 BSP의 구축에 의해 수득되는 연장된 생물학적 반감기이다. BSP 혈청 농도의 급속 감소는 접합 및 비접합 BSP 및 그것의 변종체를 이용한 처리에 대한 생물학적 반응을 평가하는 것이 중요하도록 만들었다. 바람직하게, 본 발명의 접합 및 비접합 BSP 및 그것의 변종체는 또한 정맥내 투여 후 연장된 혈청 반감기를 가지고, 이는 예컨대 ELISA 방법 또는 일차 스크리닝 검정에 의한 측정을 가능하게 만든다. GLP-1 또는 그것의 변종체의 생체내 반감기를 측정하기 위한 검정의 다른 한 예가, 본원에 각기 참고로 인용되는 U.S. 특허 No. 5,118,666; U.S. 특허 출원 공보 No. 20040082507 A1; 및 20030232754 A1에 기재되어 있다. 생체내 생물학적 반감기의 측정은 본원에 기재된 바와 같이 수행된다.
비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 GLP-1 폴리펩티드의 효력 및 기능적 생체내 반감기는 U.S. 특허 No. 5,118,666; U.S. 특허 출원 공보 No. 20040082507 A1 및 20030232754 A1에 기재된 프로토콜에 따라 구해질 수 있다.
비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 GLP-1 폴리펩티드에 대한 약동학적 파라미터는 정상적 스프라그-도우리(Sprague-Dawley) 수컷 래트(처리군 당, N=5 동물)에서 평가될 수 있다. 동물은 25 ug/래트 iv 또는 50 ug/래트 Sc의 단일 투약을 받을 것이고, 대략 5 내지 7개 혈액 샘플을 소정의 시간 코스, 일반적으로는 수용성 중합체에 접합되지 않은 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 GLP-1 폴리펩티드의 경우에는 약 6시간, 또한 수용성 중합체에 접합된, 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 GLP-1 폴리펩티드에 대해서는 약 4시간으로 취해진다. GLP-1에 대한 약물동태학 데이터는 수개의 종에서 잘 연구되어 있고, 이는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 GLP-1로부터 수득된 데이터와 직접적으로 비교될 수 있다.
본 발명의 GLP-1 펩티드를 평가하는데 사용될 수 있는 동물 모델에는, 패티 저커(fatty Zucker)(fa/fa; ZDF) 래트, ob/ob 마우스, 및 db/db 마우스가 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 이 모델들은 단일 유전자의 열성 유전에 의해 발생된다(Bray, G. A. 1977. Fed Proc. 36: 148-153; Bray, G. A. 및 D. A. York. 1979. Physiol. Rev. 51: 598-646; Kasiske, B. L. 등, 1992. Hypertension 19 부록 1: 1110-1115; Bray, G. A. 1992. Am. J. Clin. Nutr. 55 부록 488S-494S). GLP-1 수용체 넛아웃(knockout)(GLP-1R-/-) 마우스는 또한 본 발명의 GLP-1 분자의 포도당 저하 효과가 기능적 GLP-1 수용체에 의존한다는 것을 보여주는 동물 연구에 사용될 수 있다(U.S. 특허 No. 5,846,937, Scrocchi 등, 1996 Nat Med. 1996 Nov; 2(11): 1254-8, Scrocchi 등, Diabetes 1996 45: 21A). db/db 마우스는 유전적으로 비만성이고 당뇨성인 마우스 품종이다. db/db 마우스는 비만의 발달함과 동시에 고혈당 및 과다인슐린증을 발달시키며, 이에 따라 그것은 비만인 2형 당뇨(NIDDM)의 모델로서 작용한다. db/db 마우스는 예를 들어 더 잭슨 라보라토리즈(The Jackson Laboratories)(미국 메인주 바하버 소재)로부터 구매될 수 있다. [Young 등, Diabetes 1999 48: 1026-1034]는 패티 저커(fa/fa) 래트, ob/ob 마우스, db/db 마우스 및 당뇨 레서스 원숭이에서의 엑센딘-4와 비변형된 GLP-1을 비교하는 연구를 기재하고 있다. 저커 당뇨 패티 fa/fa(ZDF) 래트는 인슐린-내성이나, 태어날 때부터 정상혈당성이며, 그것들은 약 7주령 내지 10주령에서 당뇨를 발달시킨다. 과도기 기간 동안, 동물은 손상된 포도당 내인성 상태를 겪는다. 동물은 당뇨 발병 전에 과다인슐린증 상태이나, 당뇨 초기 단계 동안, 그것은 후에 포도당-자극 인슐린 분비를 상실하고, 최종적으로는 거의 완전히 인슐린의존성이 된다.
db/db 또는 ob/ob 마우스에 비교자로서 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 GLP-1 펩티드 또는 엑센딘-4를 함께 투약한다. 화합물은 s.c. 투약 당, 0.1 μg으로 투여되고, 두 모집단 간에 혈장 포도당, 글루카곤 및 혈액 인슐린의 수준, 체중 감량, 및 식욕감퇴 효과가 비교될 것이다. 결과는 엑센딘-4에 비해 본 발명의 GLP-1 펩티드는 투약이 덜 빈번하고 반감기는 연장되며, 우수한 활성을 나타낼 것이다. [Baggio 등, Diabetes(2004) 53: 2492-2500]에 기재된 바대로 GLP-1 수용체 넛아웃 마우스에서의 연구를 수행할 수 있다.
GLP-1 활성, 및 GLP-1 융합체 및 유사체의 활성을 검출하기 위한 수많은 방법들이 존재한다. EP 619,322(Gelfand 등), 및 U.S. 특허 No. 5,120,712에 기재된 검정과 같은 검정들을 사용하여 생체외 GLP-1 활성을 시험할 수 있다. 본원에 참고로 인용되는 U.S. 특허 공보 US 20040053370 A1은 또한 GLP-1 유사체 및 융합 단백질, 및 그것의 펩티드의 생체내 반감기에 대한 영향을 기재하고 있다. 생체내 연구로부터의 혈청 GLP-1 농도는 ELISA(린코 리서치 컴퍼니(Linco Research Co.))에 의해 측정될 수 있다.
DP-178의 세포로의 HIV 도입 억제 능력은 생체외 평가되거나(예컨대, 합포체 검정 및 감염력 검정), 생체내 평가될 수 있다(예컨대, 적절한 동물 모델 또는 인간). HIV-감염 인간에게 정맥내 투여된 DP-178의 안정성, 약동력학 성질 및 항바이러스 활성이 Kilby 등의 [Nature Medicine(1998) 4(11): 1302-1307]에 기재되어 있다. 본 발명의 DP-178 분자를 이용하여 유사한 연구들을 수행할 수 있다.
혈청, 중추신경계(CNS) 조직 또는 체약, 뇌척수액(CSF), 또는 포유동물 대상의 기타 조직 또는 체액 내 펩티드 YY의 농도를 구하는 절차는, 펩티드 YY에 대한 면역학적 검정에 의해 구해질 수 있다. 예를 들어, 방사선면역검정(RIA), 효소 면역검정(EIA), 및 펩티드 YY에 대한 면역조직화학 또는 면역형광용 항체 시약(바켐 아게)(미국 펜실베니아주 킹오브프루시아 소재)을 사용할 수 있다. PYY 활성을 시험하기 위한 생체내 동물 모델 및 인간 임상적 시도에는 U.S. 특허 출원 공보 No. 20050002927에 기재된 것들이 포함된다.
본 발명에 따른 BSP의 특정 활성은 당업계에 공지된 각종 검정들에 의해 구해질 수 있다. 본 발명에 따라 수득되고 정제된 BSP 뮤테인, 또는 그것의 단편의 생물학적 활성은 본원에 기재되거나 당업자에게 공지된 방법에 의해 시험될 수 있다.
XIV . 투여 및 약제학적 조성물
본 발명의 폴리펩티드 또는 단백질(BSP, 합성효소, 1개 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 단백질 등을 비제한적 예로 포함함)은, 적당한 약제학적 담체와 조합하여(단, 이에 제한되지 않음), 치료 용도를 위해 임의적으로 이용된다. 그러한 조성물은, 예를 들어 치료 유효량의 화합물, 및 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함한다. 그러한 담체 또는 부형제에는 식염수, 완충 식염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올, 및/또는 이들의 조합이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 제형물은 투여 방식에 적합화된다. 일반적으로, 단백질 투여 방법은 당업계에 공지되어 있고, 이는 본 발명의 폴리펩티드의 투여에 적용될 수 있다.
본 발명의 1개 이상의 폴리펩티드를 포함하는 치료 조성물은 임의적으로 질병의 1개 이상의 적절한 생체외 및/또는 생체내 동물 모델에서 시험되어, 당업계에 공지된 방법에 따라, 효능, 조직 대사가 확인되고 투약량이 평가된다. 특히, 투약량은 천연 아미노산 동종체에 대한 비천연 아미노산의 활성, 안정성 또는 기타 적당한 척도(천연 아미노산 BSP 대비, 1개 이상의 비천연 아미노산을 포함하도록 변형된 BSP의 비교를 비제한적 예로 포함함)에 의해, 즉 관련 검정으로 초기에 구해질 수 있다.
투여는 혈액 또는 조직 세포와 궁극적으로 접촉되는 분자를 도입하는데 정상적으로 사용되는 경로들 중 임의의 경로에 의해 이루어진다. 본 발명의 비천연 아미노산 폴리펩티드는, 임의적으로 1개 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께, 임의의 적당한 방식으로 투여된다. 환자에게 본 발명의 영역 내에서의 상기 폴리펩티드의 적당한 투여 방법이 이용가능하고, 1개 초과의 경로를 사용하여 특별한 조성물을 투여할 수 있으나, 특별한 경로는 종종 다른 경로보다 더욱 즉각적이고 더욱 효과적인 작용 또는 반응을 제공할 수 있다.
약제학적으로 허용가능한 담체는 투여되는 부분적으로는, 투여되는 특별한 조성물에 의해, 또한 조성물을 투여하는데 사용되는 특별한 방법에 의해 구해진다. 따라서, 본 발명의 약제학적 조성물의 매우 다양한 적당한 제형이 있다.
폴리펩티드 조성물은 경구, 정맥내, 복강내, 근육내, 경피, 피하, 국소, 설하 또는 직장 수단을 비제한적 예로 포함하는 수많은 경로들에 의해 투여될 수 있다. 변형 또는 비변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 또한 리포좀을 통해 투여될 수 있다. 그러한 투여 경로 및 적절한 제형은 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다.
단독 또는 다른 적당한 성분과 조합되는 비천연 아미노산을 포함하는 BSP는 또한 에어로졸 제형물로 만들어져(즉, "분무될(nebulized)" 수 있음), 흡입을 통해 투여될 수 있다. 에어로졸 제형물은 가압된 허용가능한 추진제, 예컨대 디클로로디플루오로메탄, 프로판, 질소 등에 놓일 수 있다.
예를 들어 관절내(관절 내부), 정맥내, 근육내, 피내, 복강내, 및 피하 경로와 같은 비경구 투여에 적당한 제형물에는 산화방지제, 완충액, 제균제 및, 제형물이 의도된 수령자의 혈액과 등장성이 되도록 하는 용매화물을 함유할 수 있는 수성 및 비수성, 등장성 무균 주사 용액, 및 현탁화제, 가용화제, 증점제, 안정화제, 및 보존제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 무균 현탁액이 포함된다. BSP의 제형물은 단일 투약 또는 다중 투약 봉지 용기, 예컨대 앰퓰 및 바이얼 내에 제공될 수 있다.
비경구 투여 및 정맥내 투여가 바람직한 투여 방법이다. 특히, 현 사용 중인 제형물과 함께, 천연 아미노산 동종체 치료제를 위해 이미 사용되는 투여 경로(전형적으로 GLP-1, DP-178, PYY, EPO, GH, G-CSF, GM-CSF, IFN, 인터류킨, 항체, 및/또는 임의의 기타 약제학적으로 전달되는 폴리펩티드 또는 단백질을 위해 사용되는 것들을 비제한적 예로 포함함)는 본 발명의 폴리펩티드의 투여 및 제형을 위한 바람직한 경로를 제공한다.
본 발명의 영역 내에서 환자에게 투여되는 용량은, 경시적으로 환자에게 있어 유익한 치료 반응을 가지기에, 또는 병원체에 의한 감염을 억제하기 위해(단, 이에 제한되지 않음), 또는 용량에 따라 기타 적절한 활성을 가지도록 하기에 충분한 양이다. 용량은 특별한 벡터 또는 제형물의 효능, 및 이용되는 비천연 아미노산 폴리펩티드의 활성, 안정성 또는 혈청 반감기, 및 환자의 상태, 또한 피처리 환자의 체중 또는 표면적에 의해 구해진다. 용량의 크기도 또한 특별한 환자에게 있어서의 특별한 벡터, 제형물 등의 투여를 동반하는 임의의 부정적 부작용의 존재, 성질 및 정도에 의해 구해진다.
질병(암, 유전 질병, 당뇨, AIDS 등을 비제한적 예로 포함함)의 치료 또는 예방 시에 투여되는 벡터 또는 제형물의 유효량을 구할 때, 의사는 순환 혈장 수준, 제형물 독성, 질병의 진척도, 및/또는 적절한 경우, 항-비천연 아미노산 폴리펩티드 항체의 생산을 평가한다.
예를 들어 70 킬로그램 환자에게 투여되는 용량은 전형적으로 관련 조성물의 변경된 활성 또는 혈청 반감기를 위해 조정되는 현재 사용되는 치료적 단백질의 투약량과 동등한 범위 내이다. 본 발명의 벡터는 항체 투여, 백신 투여, 세포독성제, 천연 아미노산 폴리펩티드, 핵산, 뉴클레오티드 유사체, 생물학적 반응 개질제 등의 투여를 포함한, 임의의 공지된 통상적 치료법에 의해 치료 조건을 보충할 수 있다.
투여를 위해, 본 발명의 제형물은 관련 제형물의 LD-50 또는 ED-50, 및/또는 환자의 체중 및 전반적 건강에 대해 적용되는(단, 이에 제한되지 않음) 각종 농도에서의 비천연 아미노산의 임의의 부작용의 관찰에 의해 구해지는 속도로 투여된다. 투여는 단일 또는 분할 용량을 통해 달성될 수 있다.
제형물을 주입받는 환자가 고열, 오한 또는 근육통을 나타내는 경우, 환자는 적절한 용량의 아스피린, 이부프로펜, 아세트아미노펜 또는 기타 통증/고열 억제 약물을 섭위한다. 고열, 근육통 및 오한과 같은, 주입에 대한 반응을 겪는 환자는 이후에 아스피린, 아스테아미노펜, 또는 비제한적 예로서의 디페닐히드라민을 주입하기 30분 전에 예비 약제처리된다. 진통제 및 항히스타민제에 급속히 반응하지 않는 보다 심각한 오한 및 근육통에 대해 메페리딘을 사용한다. 세포 주입은 반응의 심각도 따라 속도 완화되거나 중단된다.
본 발명의 인간 BSP는 포유동물 대상에게 직접적으로 투여될 수 있다. 투여는 대상에게 BSP를 도입하는데 정상적으로 사용되는 경로들 중 임의의 것에 의해 이루어진다. 본 발명의 실시양태들에 따른 BSP 조성물에는 직장, 국소, 흡입(에어로졸을 통한 흡입을 비제한적 예로 포함함), 구강(설하를 비제한적 예로 포함함), 질내, 비경구(피하, 근육내, 피내, 관절내, 흉막내, 복강내, 뇌내, 동맥내 또는 정맥내를 비제한적 예로 포함함), 국소(즉, 기도 표면을 포함한, 피부 및 근육 표면을 모두 포함함), 및 경피 투여에 적당한 것들이 포함되나, 임의의 주어진 경우에서 가장 적당한 경로는 피처리 상태의 성질 및 심각도에 의존할 것이다. 투여는 국소 또는 계통적일 수 있다. 화합물의 제형물은 단일 투약 또는 다중 투약 용기, 예컨대 앰퓰 및 바이얼 내에 제공될 수 있다. 본 발명의 BSP는 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 단일 투약 주사가능한 형태(현탁액 또는 유화액을 비제한적 예로 포함함) 내 혼합물로서 제공될 수 있다. 본 발명의 BSP는 또한 연속적 주입(삼투압 펌프와 같은 미니펌프를 비제한적 예로 포함함), 단일 볼루스 또는 서방성 데포 제형물에 의해 투여될 수 있다.
투여에 적당한 제형물에는, 수성 및 비수용액, 산화방지제, 완충액, 제균제, 및 제형물을 등장성으로 만드는 용매화물을 함유할 수 있는 등장성 무균 용액, 및 현탁화제,가용화제, 증점제, 안정화제 및 보존제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 무균 현탁액을 함유할 수 있다. 용액 및 현탁액은 상기 기술된 종류의 무균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 담체는 부분적으로는 투여되는 특별한 조성물에 의해, 또한 조성물을 투여하는데 사용되는 특별한 방법에 의해 결정된다. 따라서, 본 발명의 약제학적 조성물(임의적 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제를 포함함)의 매우 다양한 적당한 제형이 있다(예컨대, [Remington' s Pharmaceutical Sciences, 제17판, 1985)] 참고).
적당한 담체에는 포스페이트, 보레이트, HEPES, 시트레이트, 및 기타 유기산을 함유하는 완충액; 아스코르브산을 포함하는 산화방지제; (약 10개 미만의 잔기의) 저분자량인 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류, 및 포도당, 만노스 또는 덱스트린을 포함한 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트화제; 아연, 코발트 또는 구리와 같은 이가 금속 이온; 만니톨 또는 소르비톨과 같은 당 알코올; 나트륨과 같은 염-형성 짝이온; 및/또는 트윈(Tween)TM, 플루로닉스(Pluronics)TM, 또는 PEG와 같은 비이온성 계면활성제를 함유하는 완충액이 포함된다.
PEG와 같은 수용성 중합체에 연결된 것들을 포함한 본 발명의 BSP는 또한 지연 방출성 시스템에 의해, 또는 그 시스템의 일부로서 투여될 수 있다. 지연 방출성 조성물에는 필름 또는 마이크로캡슐을 비제한적 예로 포함하는 성형품의 형태의 반투과성 중합체 매트릭스를 비제한적 예로서 포함한다. 지연 방출성 매트릭스에는 폴리(2-히드록시에틸 메타크릴레이트)(Langer 등, J. Biomed . Mater. Res., 15: 267-277(1981); Langer, Chem . Tech., 12: 98-105(1982), 에틸렌 비닐 아세테이트(Langer 등, 이하 동일) 또는 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산(EP 133,988), 폴리락티드(폴리락트산)(U.S. 특허 No. 3,773,919; EP 58,481), 폴리글리콜리드(글리콜산의 중합체), 폴리락티드 코-글리콜리드(락트산 및 글리콜산의 공중합체) 폴리무수물, L-글루탐산 및 감마-에틸-L-글루타메이트의 공중합체(Sidman 등, Biopolymers, 22, 547-556(1983), 폴리(오르토)에스테르, 폴리펩티드, 히알루론산, 콜라겐, 콘드로이틴 술페이트, 카르복실산, 지방산, 인지질, 다당류, 핵산, 폴리아미노산, 아미노산, 예컨대 페닐알라닌, 티로신, 이소루이신, 폴리뉴클레오티드, 폴리비닐 프로필렌, 폴리비닐피롤리돈 및 실리콘과 같은 생체적합성 물질로부터의 것들이 포함된다. 지연 방출성 조성물에는 리포좀내 포획된 화합물이 포함된다. 화합물을 포함하는 리포좀은 지금까지 공지된 방법, 예컨대 DE 3,218, 121; Eppstein 등, Proc. Natl. Acad. Sci. US.A., 82: 3688-3692(1985); Hwang 등, Proc. Natl. Acad. Sci. US.A., 77: 4030-4034(1980); EP 52, 322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; EP 142,641; 일본 특허 출원 83-118008; U.S. 특허 No. 4,485,045 및 4,544,545; 및 EP 102,324에 기재된 방법에 의해 제조된다. 상기 언급된 모든 참고문헌 및 특허는 본원에 참고로 인용된다.
리포좀내 포획된 BSP는 예컨대, [DE 3,218,121; Eppstein 등, Proc. Natl. Acad. Sci. US.A., 82: 3688-3692(1985); Hwang 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77: 4030-4034(1980); EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; EP 142,641; 일본 특허 출원 83-118008; U.S. 특허 No. 4,485,045 및 4,544,545; 및 EP 102,324]에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있다. 리포좀의 조성 및 크기는 당업자에게 공지되어 있거나, 당업자에 의해 실험적으로 용이하게 결정될 수 있다. 리포좀의 일부 예들에는 예컨대, [Park JW 등, Proc . Natl . Acad . Sci. USA 92: 1327-1331(1995); Lasic D 및 Papahadjopoulos D(편저): MEDICAL APPLICATIONS OF LIPOSOME1998); Drunimond DC 등, Liposomal drug delivery systems for cancer therapy, Teicher B(편저): CANCER DRUG DISCOVERY AND DEVELOPMENT(2002); Park JW 등, Glin . Cancer Res . 8: 1172-1181(2002); Nielsen UB 등, Biochim . Biophys. Acta 1591(1-3): 109-118(2002); Mamot C 등, Cancer Res. 63: 3154-3161(2003)]에 기재된 것들이 포함된다. 상기 언급된 모든 참고문헌 및 특허는 본원에 참고로 인용된다.
본 발명의 영역 내에서의 환자에게 투여되는 용량은 경시적으로 대상에게 유익한 반응을을 유발하기에 충분해야 한다. 일반적으로, 투약 당 비경구 투여된 본 발명의 BSP의 총 약제학적으로 유효량은 치료별로 다르나, 약 0.01 μg/환자 체중 kg/일 내지 약 100 μg/환자 체중 kg, 또는 약 0.05 mg/환자 체중 kg 내지 약 1 mg/환자 체중 kg이다. 또한, 투약 빈도도 또한 치료별에 따라 따르며, 인간에게 사용하도록 승인된 시중 입수가능한 BSP 산물보다 더 빈번하거나 덜 빈번할 수 있다. 일반적으로, PEG화 본 발명의 BSP는 상기 기재된 투여 경로들 중 임의의 것에 의해 투여될 수 있다.
XV . 본 발명의 BSP 의 치료 용도
본 발명의 BSP는 광범위한 장애들을 치료하는데 유용하다.
본 발명의 BSP 산물의 투여는 인간에 있어 다른 BSP 제제에 의해 나타나는 임의의 활성을 초래한다. BSP 산물을 함유하는 약제학적 조성물은, BSP 작용자 또는 길항자에 의해 영향을 받을 수 있는 단독의, 또는 한 상태 또는 질병의 부분으로서의 장애를 겪는 인간 환자에게 각종 수단에 의해 투여하는데 효과적인 강도로 제형될 수 있다. BSP 산물의 평균 양은 다양할 수 있고, 특히 자격있는 의사의 권고 및 처방에 기초해야 한다. BSPD의 정확한 양은 피처리 상태의 정확한 유형, 피처리 환자의 상태, 및 조성물 내 다른 성분들과 같은 인자들에 따라 선택되는 문제이다. 본 발명은 또한 치료 유효량의 다른 한 활성제의 투여를 제공한다. 주어지는 양은 BSP를 이용한 치료법에 기초하여 당업자에 의해 용이하게 구해질 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드 및 융합 단백질을 사용하여, 매우 다양한 질병 및 조건을 치료할 수 있다. 본 발명의 GLP-1 폴리펩티드 및 융합 단백질은 일차적으로 "GLP-1 수용체"로 칭해지는 수용체에서 작용함으로써 자체의 생물학적 효과를 발휘한다. 그러므로, GLP-1 수용체 자극 또는 GLP-1 화합물의 투여에 주로 반응하는 질병 및/또는 상태를 갖는 대상을 본 발명의 GLP-1 폴리펩티드 및 융합 단백질로 처리할 수 있다. 이 대상자는 GLP-1 화합물을 이용하여 처리할 필요가 있는" 또는 "GLP-1 수용체 자극의 필요가 있는" 것으로 일컬어진다. 비인슐린 의존성 당뇨, 인슐린 의존성 당뇨, 발작(WO 00/16797 참고), 심근경색(WO 98/08531 참고), 비만(WO 98/19698 참고), 수술 후 분해 변화(U.S. 특허 No. 6,006,753 참고), 기능성 소화불량 및 과민성 대장 증후군(WO 99/64060 참고)을 갖는 대상자들이 포함된다. 또한, GLP-1 화합물을 이용한 예방적 처리를 필요로 하는 대상, 예컨대 비인슐린 의존성 당뇨(WO 00/07617 참고)가 발병할 위험이 있는 대상도 포함된다. 손상된 포도당 내인성 또는 손상된 공복 포도당을 갖는 대상, 체중이 대상자의 키 및 체격에 비해 정상 체중보다 약 25% 초과하는 대상, 부분적 췌절제술을 갖는 대상, 1개 이상의 적어도 한 부모가 비인슐린 의존성 당뇨가 있는 대상, 임신성 대상, 및 급성 또는 만성 췌장염이 있었던 대상은 비인슐린 의존성 당뇨를 발병할 위험이 있다.
본 발명은 알부민 단백질, 알부민 단편, 알부민 유사체, Fc 단백질, Fe 단편, Fc 유사체, 수용성 중합체 또는 지방산에 융합됨으로써 향상된 생화학적 및 생물리적 성질을 갖는 GLP-1 화합물을 포함한다. 이 이종성 단백질은 숙주 세포내 성공적으로 발현될 수 있고, GLP-1 수용체의 활성화와 연관된 신호전달 활성을 보유하고, 연장된 반감기를 가진다.
DP-178의 치료 용도에는 HIV-1 감염의 치료 또는 HIV-1 복제의 억제가 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 본 발명의 DP-178 펩티드는 바람직하게 항바이러스 활성을 나타낸다. 이에 따라, 펩티드는 인간 및 비인간 바이러스 및 레트로바이러스, 특히 HIV의 비감염 세포로의 전달의 억제제로서 사용될 수 있다. 본 발명의 펩티드에 의해 전달이 억제될 수 있는 인간 레트로바이러스에는 HIV-1 및 HIV-2, 및 인간 T-림프구 바이러스(HTLV-I 및 II)의 모든 균주들이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 본 발명의 펩티드에 의해 전달이 억제될 수 있는 비인간 레트로바이러스에는 소 백혈병 바이러스, 고양이 육종 및 백혈병 바이러스, 원숭이 면역결핍, 육종 및 백혈병 바이러스, 및 양 진행성 폐렴 바이러스가 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 본 발명의 펩티드에 의해 전달이 억제될 수 있는 비레트로바이러스형 바이러스에는 인간 호흡 합포체 바이러스, 개 디스템퍼 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 인간 파라인플루엔자 바이러스, 및 인플루엔자 바이러스가 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 본 발명은 또한 항바이러스제를 비제한적 예로 포함하는, 1개 이상의 다른 치료제와의 조합 치료법으로 펩티드를 이용하는, 상기 레트로바이러스 및 비레트로바이러스성 바이러스의 치료를 포괄한다.
PYY의 치료 용도에는 비만, 당뇨, 위장관 상태, 예컨대 궤양, 과민성 대장 질환 및 염증성 대장 질환, 또는 세포 증식, 영양소 수송 및 장 물 및 전해질 분비의 내분비 제어와 관련된 임의의 상태가 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. PYY의 치료 용도에는 또한 대사 상태 또는 장애, 특히 열량 이용가능성을 감소시킴으로써 경감될 수 있는 상태 또는 장애, 예를 들어 섭식 장애, 인슐린-내성 증후군(증후군 X), 포도당 비내인성, 지질대사이상, 및 심혈관 장애의 치료가 포함된다.
하기 실시예들은 청구된 발명을 설명하기 위해 제공된 것으로, 본 발명을 제한하지 않는다.
실시예 1
이 실시예는 비천연적으로 코딩된 아미노산이 GLP-1에 혼입되는 바람직한 부위의 선택을 위한 많은 가능한 기준 세트 중 몇가지를 기술한다.
이 실시예는 어떻게 GLP-1 폴리펩티드 내의 바람직한 부위가 비천연적으로 코딩된 아미노산의 도입을 위해 선택되는지를 입증한다. 이 실시예에서 사용되는 서열 순번지정(numbering)은 서열 번호 2에 나와 있는 GLP-1(7-37)의 아미노산 서열에 따른다. 인용되는 위치 번호는 달리 표시되지 않는 한, 펩티드의 위치 7-37에 기초한다. 예를 들어, 위치 8은 서열 번호 2에서의 2번째 아미노산에 상응한다. 당 업자는 서열 번호 2 내의 위치에 상응하는 아미노산 위치는 서열 번호 1, 3, 21, 또는 임의의 기타 GLP-1 분자에서 용이하게 확인될 수 있음을 인식할 것이다.
GLP-1의 가능한 알파 나선형 구조의 모델링은, [Neidigh , J. W., Fesinmeyer, R. M., Prickett , K. S., Andersen , N. H.: Exendin-4 and Glucagon-Like-Peptide-1: NMR Structural Comparisons in the Solution and Micelle-Associated States. Biochemistry 40 pp. 13188(2001)]로부터 PDB ID 1JRJ에 기초하여 수행되었다. 하기 기준을 사용하여, 비천연적으로 코딩된 아미노산의 도입을 위한 GLP-1의 각 위치를 평가하였다: 잔기는 (a) 알라닌 스캐닝 변이유발에 의해 영향을 받아서는 않되고([Adelhorst 등, J. of Biol. Chem. 1994 269(9): 6275-6278] 참고), (b) 표면 노출되어, 모델링에 기초하여 주변 잔기와의 최소의 반데르발스 또는 수소 결합 상호작용을 나타내야 하며, (c) GLP-1 변종체에서의 활성에 영향을 주지 않으면서 가변적이거나 비필수적일 수 있고, (d) 비천연적으로 코딩된 아미노산을 이용한 치환 시, 보수적 치환을 초래하게 되며, (e) 매우 가요성 영역 또는 구조적으로 경질인 영역에서 발견될 수 있다. 또한, Cx 프로그램을 이용하여, 모델 구조에 기초하여 GLP-1 분자에 대해 추가적 계산을 수행하여(Pintar 등(2002) Bioinformatics, 18, pp 980), 펩티드의 각 단백질 원자의 돌출 정도를 평가한다. 일부 실시양태들에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은, (서열 번호 2, 및 다른 GLP-1 유사체에서의 상응하는 아미노산에서와 같이) GLP-1의 위치 7(즉, N-말단) 앞, 19, 23, 26, 27, 28, 29, 30, 또는 33의 위치들 중 하나 이상(단, 이에 제한되지 않음)에서 치환된다. 일부 실시양태들에서, 본 발명의 GLP-1 폴리펩티드는 22, 18, 29, 25, 32, 21, 28, 17, 24, 31 및 20의 위치들 중 하나 이상에서 1개 이상의 비천연 발생 아미노산을 포함하여, 길항자를 제공한다.
GLP-1 융합 단백질은 면역글로불린의 Fc 부분을 포함할 수 있다. 도 1은 GLP-1-Fc 융합 단백질을 포함하는 GLP-1 이량체성 폴리펩티드의 개략도이다. 2개의 GLP-1 폴리펩티드는 링커 서열을 통해 인간 IgG1 Fc에 결합된다. 각 GLP-1 폴리펩티드의 C-말단은 IgG1의 Fc 부분에 융합된 링커 서열(Ala-Ala-Ala-Glu-Pro-Lys-Ser-Ser)에 융합된다. GLP-1 폴리펩티드는 위치 1, 2 또는 3에 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하고, 여기에서 위치 1은 GLP-1의 첫 번째 아미노산이다(서열 번호 2). GLP-1에 대한 부가적 변형은 위치 8-12, 16에서의 Ala의 치환, 또는 Arg의 결실을 포함한다(여기에서, 위치 1은 GLP-1의 첫 번째 아미노산이다).
도 4는 엑센딘 또는 GLP-1 유사체의 설계에 대한 전략법의 다이어그램을 나타낸다. 한 전략법은, GLP-1의 나선형 핵화를 무질서하게 포획하기 위해 GLP-1에 혼입된 비천연적으로 코딩된 아미노산을 이용하는 것이다. 비천연 아미노산을 이용한 치환에는 나선형 기능을 최대화하기 위한 알파 나선의 비보존 영역에 따라 있는 잔기가 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 다른 한 전략법은, GLP-1 내에 존재하는 2개 이상의 비천연 아미노산을 연결하여 나선형 구조를 고착시킨다. 비천연 아미노산을 이용한 치환에는 알파 나선의 비보존 영역을 따라 있는 잔기이다. 가능한 면역원성을 조절하기 위해, 연결기 부위에서의 폴리(에틸렌 글리콜)의 부가를 수행할 수 있다. 도 5에는, 특별한 구조적 특성을 갖는 GLP-1 유사체의 설계에 대한 전략법의 한 다이어그램이 나와 있다. 생합성 경로: 이점 - 비용, 균질도, Cys 접합을 위한 형태의 가요성. 중요 관찰: 1) 엑센딘-4는 GLP-1와, A8G를 제외한 처음 10개의 아미노산을 공유하고; 2) A8G 치환은 엑센딘-4가 아닌 GLP-1에서 수용가능한 DPPIV이며; 3) 엑센딘-4는 GLP-1에서는 보이지 않는 위치 Y28, W33....에서의 방향족 적재에 기초한 나선형 구조를 가진다. 결론: 나선형 구조를 촉진하기 위한 비천연 아미노산 치환은, ... Y28 바람직한 부위에서 안정성을 보존함과 동시에 효력을 증진시킬 수 있다.
잔기를, 대사 안정성을 향상시키고, 나선형 구조를 안정화하며, 가능한 분자 응집을 감소시키고, 수용체 결합 친화도를 조절함에 대한 기여에 대해 평가하였다. GLP-1 수용체-리간드 상호작용의 모델은 [Lopez de Maturana, R. 등(2003) J. Biol. Chem. 278, 10195-10200]에 상세하게 나와 있다.
일부 실시양태들에서, 1개 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 GLP-1 내의 임의의 위치, (아미노 말단의) 첫 번째 아미노산 앞, 카르복시 말단의 부가, 또는 이들의 임의의 조합에서 혼입된다. 일부 실시양태들에서, 본 발명의 GLP-1 폴리펩티드는 위치 7(즉, N 말단)의 첫 번째 아미노산 앞, 7H, 8A, 9E, V16, 17S, 18S, 19Y, 20L, 21E, 22G, 23Q, 24A, 25A, 26K, 27E, 28F, 29I, 30A, 31W, 32L, 33V, 34K, 35G, 36R, 37G, 위치 38(즉, 카르복실 말단)의 부가 또는 이들의 임의의 조합의 위치들에서 1개 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 본 발명의 GLP-1 폴리펩티드는 위치 18S, 19Y, 20L, 22G, 23Q, 25A, 26K, 27E, 30A, 아미노산 W31 내지 G37 중 임의의 것, 38(즉, 카르복실 말단)에서의 부가, 또는 이들의 임의의 조합에서 1개 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산 을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태들에서, GLP-1 폴리펩티드는 위치 19Y, 23Q, 26K, 27E, 30A, 또는 38(즉, 카르복실 말단)에서 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 수용성 중합체에 연결된다. 일부 실시양태들에서, 수용성 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜)이다. 일부 실시양태들에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 링커에 연결된 수용성 중합체에 연결된다. 일부 실시양태들에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 생분해성인 링커에 연결된 수용성 중합체에 연결된다. 일부 실시양태들에서, 생분해성 링커가 사용되어, BSP를 포함하는 전구약물을 형성할 수 있다. 이 전구약물 접근법의 한 예에서, 수용성 중합체는 GLP-1 활성을 막고, 링커의 퇴화는 활성 GLP-1를 방출한다. 일부 실시양태들에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 아실 부분 또는 아실 사슬에 연결된다. 일부 실시양태들에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 링커에 의해 아실 부분 또는 아실 사슬에 연결된다. 일부 실시양태들에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 폴리(에틸렌 글리콜) 링커 또는 전구약물에 의해 아실 부분 또는 아실 사슬에 연결된다. 일부 실시양태들에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 혈청 알부민에 연결된다. 일부 실시양태들에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 링커에 의해 혈청 알부민에 연결된다. 일부 실시양태들에서, 링커는 폴리(에틸렌 글리콜) 또는 전구약물이다. 일부 실시양태들에서, 링커는 이원적(dual) 절단 전구약물이며, 여기에서 단계 1은 알부민과 같은 분자의 제어 방출이고, 단계 2는 링커 또는 그것의 일부분을 방출하는 제2 절단이다.
GLP-1 폴리펩티드를 위한 다른 한 전략법은 GLP-1 분자 내에 존재하는 2개의 비천연적으로 코딩된 아미노산 간에 세포내 가교를 형성하는 것을 포함한다. 분자의 알파-나선형 구조의 증진, 펩티다제 또는 프로테아제 소화의 감소, 용해도의 증가, 및/또는 폴리펩티드의 PKIPD 프로파일의 향상을 위해, 가교를 형성시킬 수 있다. GLP-1 분자는 1개 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함한다. 2개의 가교 연결된 잔기들 중 하나는 비천연적으로 코딩된 아미노산 또는 천연적으로 코딩된 아미노산일 수 있다. 2개의 비천연적으로 코딩된 아미노산, 또는 비천연적으로 코딩된 아미노산 및 천연적으로 코딩된 아미노산은 링커, 중합체 또는 생물학적 활성 분자에 의해 결합될 수 있다. 2개의 아미노산 간의 연결기는 2개의 아미노산 간에 공유결합을 통해 있을 수 있다. 가교와 관련된 링커 또는 중합체는 이관능성 링커 또는 이관능성 중합체일 수 있다. 일부 실시양태들에서, 비천연 아미노산은 친수성 가교(미니PEG)에 의해 결합된다. 도 6은 세포내 가교에 의해 결합될 수 있는 많은 가능한 잔기 세트들의 군을 나타낸다. 일부 실시양태들에서, 세포내 가교는 위치 16와 19 또는 20, 또는 16과 23; 19와 23, 또는 19와 26; 20과 27; 23과 26 또는 27, 또는 23과 30; 27과 30 또는 31, 또는 27과 33 또는 34; 30과 34 사이에 형성된다. 잔기 17-33은 알파-나선 구조를 형성한다. 내부 가교 결합을 위한 가능한 화학적 전략법이 도 7에 나와 있다. GLP-1 내의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 링커, 중합체 또는 생물학적 활성 분자에 의해 일치하는 폴리펩티드 내에 존재하는 천연적으로 코딩된 아미노산에 연결된다. 링커, 중합체 또는 생물학적 활성 분자에 결합된 천연적으로 코딩된 아미노산은 아미노산 치환의 결과일 수 있다.
상기 전략법들 중 임의의 것과 조합하여, GLP-1 폴리펩티드는 1개 이상의 천 연 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시양태들에서, GLP-1 폴리펩티드는 하기 치환들 중 1개 이상을 포함한다: 8A 내지 G; 16V 내지 F 또는 L; 22G 내지 B; 30A 내지 B; 34K 내지 R. 일부 실시양태들에서, GLP-1 폴리펩티드는 하기 치환들 중 1개 이상을 포함한다: 8A 내지 V, 또는 8A 내지 S. 일부 실시양태들에서, GLP-1 폴리펩티드는 시스테인과의 1개 이상의 치환을 포함한다. 일부 실시양태들에서, GLP-1 폴리펩티드는 위치 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 또는 이들의 임의의 조합에서 1개 이상의 시스테인 치환을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 화학적으로 반응성인 시스테인은 수용성 중합체 또는 아실 부분에 접합된다. 일부 실시양태들에서, GLP-1 폴리펩티드는 나선의 비보존적 면 내의 잔기에서 1개 이상의 친수성 아미노산 치환을 포함한다.
실시예 2
이 실시예는 E. 콜라이 내의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 BSP의 발현을 상세히 설명한다. 숙주 세에서의 GLP-1의 생성 및 GLP-1의 단리가 예컨대, 본원에 참고로 인용되는 U.S. 특허 No. 5,118,666에 기재되어 있다.
직교성 tRNA(O-tRNA) 및 직교성 아미노아실 tRNA 합성효소(O-RS)를 포함하는 도입된 번역 시스템을 사용하여, 비천연적으로 코딩된 아미노산을 함유하는 BSP을 발현한다. O-RS는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 이용하여 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화한다. 이에, 번역 시스템은 코딩된 셀렉터 코돈에 대한 반응으로, 비천연적으로 코딩된 아미노산을 BSP에 삽입한다.
O-RS 및 O-tRNA 서열
서열 번호 4 M. 자나쉬이 mtRNA Tyr CUA tRNA
서열 번호 5 HLADO3 ; 최적화 앰버 억제자 tRNA tRNA
서열 번호 6 HL325A ; 최적화 AGGA 프레임쉬프트( frameshift ) 억제자 tRNA tRNA
서열 번호 7 p- 아지도 -L-페닐알라닌의 혼입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 p- Az - PheRS ('6) RS
서열 번호 8 p- 벤조일 -L-페닐알라닌의 혼입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 p- BpaRS (1) RS
서열 번호 9 프로파르길 -페닐알라닌의 혼입을 위한 아 미노아실 tRNA 합성효소 프로파르길- PheRS RS
서열 번호 10 프로파르길 -페닐알라닌의 혼입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 프로파르길- PheRS RS
서열 번호 11 프로파르길 -페닐알라닌의 혼입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 프로파르길- PheRS RS
서열 번호 12 p- 아지도 -페닐알라닌의 혼입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 p- Az - PheRS (1) RS
서열 번호 13 p- 아지도 -페닐알라닌의 혼입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 p- Az - PheRS (3) RS
서열 번호 14 p- 아지도 -페닐알라닌의 혼입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 p- Az - PheRS (4) RS
서열 번호 15 p- 아지도 -페닐알라닌의 혼입을 위한 아미 노아실 tRNA 합성효소 p- Az - PheRS (2) RS
서열 번호 16 p-아세틸-페닐알라닌의 혼입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 ( LW1 ) RS
서열 번호 17 p-아세틸 -페닐알라닌의 혼입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 ( LW5 ) RS
서열 번호 18 p-아세틸-페닐알라닌의 혼입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 ( LW6 ) RS
서열 번호 19 p- 아지도 -페닐알라닌의 혼입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 ( AzPheRS -5) RS
서열 번호 20 p- 아지도 -페닐알라닌의 혼입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 ( AzPheRS -6) RS
변형된 BSP 유전자 및 직교성 아미노아실 tRNA 합성효소/tRNA 쌍(원하는 비천연적으로 코딩된 아미노산에 대해 특이적인 쌍)을 함유하는 플라스미드를 이용한 E. 콜라이의 형질전환은, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 BSP로 부위-특이적으로 혼입되도록 한다. 0.01 내지 100 mM의 특별한 비천연적으로 코딩된 아미노산을 함유하는 배지에서 37℃에서 성장한 형질전환된 E. 콜라이는 매우 신뢰도있게 또한 효율적으로 변형된 BSP를 발현한다. 비천연적으로 코딩된 아미노산을 함유하는 His-택이 있는 BSP는 봉입체 또는 응집체로서 E. 콜라이 숙주 세포에 의해 생성된다. 응집체는 가용화되고, 친화성 물질은 6 M 구아니딘 HCl 내 불활성화 조건 하에서 정제된다. 50 mM TRIS-HCl, pH 8.0, 40 μM CuSO4, 및 2%(w/v) 사르코실 중 4℃에서 하룻밤 동안 투석함으로써 재접힘을 수행한다. 이어서, 물질을 20 mM TRIS-HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl, 2 mM CaCl2에 대해 투석한 후, His-택을 제거한다. [Boissel 등(1993) J. Biol. Chem. 268: 15983-93]을 참고한다. BSP의 정제 방법이 당업계에 공지되어 있고, SDS-PAGE, 웨스턴 블롯 분석 또는 전기분무-이온화 포획 질량 분광법 등에 의해 확인된다.
도 8은 GLP-1 발현을 위한 구축물을 보여준다. 프라이머 쌍은 플랭킹 BamHI 및 HindIII 부위를 갖는 GLP-1 삽입부를 수득하기 위해 고안된다.. GLP-1 프라이머를 어닐링하고, BamHI-HindIII로 소화된 발현 벡터로 결찰시킨다. 발현 벡터는 T7 프로모터, N-말단 His 택, 및 GLP-1 삽입부의 상류에 있는 TrpLE 리더 폴리펩티드 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. TrpLE 리더 폴리펩티드 서열이 도 8에 또한 서열 번호 25로 나와 있다. 폴리뉴클레오티드 삽입부는 GLP-1 서열의 N-말단에 있는 아미노산 메티오닌을 코딩하거나 코딩하지 않을 수 있다. 구축물에는 위치 Y19, Q23, K26, E27 또는 A30에서의 비천연적으로 코딩된 아미노산 치환을 코딩하는 GLP-1 폴리뉴클레오티드 서열이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. GLP-1 폴리펩티드는 또한 1개 이상의 천연 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
실시예 3
이 실시예는 카르보닐-함유 아미노산의 도입, 및 아미노옥시-함유 PEG와의 후속 반응을 상세히 설명한다.
이 실시예는 후속하여 대략 5,000 MW의 아미노옥시-함유 PEG와 반응하게 되는 케톤-함유 비천연적으로 코딩된 아미노산이 혼입된 BSP의 발생 방법을 입증한다. 예를 들어, GLP-1에 대한 실시예 1의 기준, 또는 T-20에 대한 실시예 32의 기준에 따라 동정되는 각 잔기는 하기 구조를 갖는 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 따로 치환된다:
Figure 112007014691585-PCT00041
p-아세틸-페닐알라닌의 GLP-1로의 부위-특이적 혼입을 위해 이용되는 서열은 실시예 1에 기재된 서열들, 및 상기 실시예 2에 기재된 서열 번호 4(muttRNA, M. 자나쉬이 mtRNATyr CUA), 및 16, 17 또는 18(TyrRS LW1, 5 또는 6) 중 임의의 것이다. p-아세틸-페닐알라닌의 T-20으로의 부위-특이적 혼입을 위해 이용되는 서열은 실시예 32에 기재된 서열들, 및 상기 실시예 2에 기재된 서열 번호 4(muttRNA, M. 자나쉬이 mtRNATyr CUA), 및 16, 17 또는 18(TyrRS LW1, 5 또는 6) 중 임의의 것이다.
카르보닐-함유 아미노산을 포함하는 BSP 변종체는 일단 변형되면, 형태:
R-PEG(N)-O-(CH2)n-O-NH2
(식 중에서, R은 메틸이고, n은 3이며, N은 대략 5,000 MW임)의 아미노옥시-함유 PEG 유도체와 반응한다. 25 mM MES(시그마 케미칼, 미국 미조리주 세인트루이스 소재)(pH 6.0), 25 mM Hepes(시그마 케미칼, 미국 미조리주 세인트루이스 소재)(pH 7.0), 또는 10 mM 아세트산나트륨(시그마 케미칼, 미국 미조리주 세인트루이스 소재)(pH 4.5) 중, 10 mg/mL로 용해된 p-아세틸페닐알라닌을 함유하는 정제된 BSP를 10 내지 100배 과량의 아미노옥시-함유 PEG와 반응시킨 후, 실온에서 10 내지 16시간 동안 교반한다(Jencks, W. J. Am. Chem . Soc. 1959, 81, pp 475). 이어서, PEG-BSP를 적절한 완충액에 희석하여, 즉각적으로 정제 및 분석을 행한다.
실시예 4
아미드 연결기를 통해 PEG에 연결된 히드록실아민기로 구성된 PEG와의 접합
실시예 3에 기재된 절차를 이용하여 하기 구조를 갖는 PEG 시약을 케톤-함유 비천연적으로 코딩된 아미노산에 결합시킨다:
R-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)n-O-NH2
(식 중에서, R은 메틸이고, n은 4이며, N은 대략 20,000 MW임). 반응, 정제 및 분석 조건은 실시예 3에 기재된 바와 같다.
실시예 5
이 실시예는 2개의 별개의 비천연적으로 코딩된 아미노산의 BSP로의 도입을 상세히 설명한다.
이 실시예는 실시예 1에 따라 동정된 잔기들 중 2개 위치에 케톤 작용기를 포함하는 비천연적으로 코딩된 아미노산이 혼입된 GLP-1 폴리펩티드의 발생 방법을 입증한다(여기에서, X*는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 나타냄). 셀렉터 코돈을 핵산 내의 2개의 별개의 부위에서 도입함을 제외하고는, 실시예 1 및 2에 따라, GLP-1 폴리펩티드를 제조한다. 이 실시예는 실시예 32에 따라 동정된 잔기들 중 2개 위치에 케톤 작용기를 포함하는 비천연적으로 코딩된 아미노산이 혼입된 T-20 폴리펩티드의 발생 방법을 입증한다(여기에서, X*는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 나타냄). 셀렉터 코돈을 핵산 내의 2개의 별개의 부위에서 도입함을 제외하고는, 실시예 32 및 33에 따라 T-20 폴리펩티드를 제조한다.
실시예 6
이 실시예는 BSP의 히드라지드-함유 PEG로의 접합, 및 후속되는 인시츄 환원을 상세히 설명한다.
카르보닐-함유 아미노산이 혼입된 GLP-1 폴리펩티드를 실시예 2 및 3에 기재된 절차에 따라 제조하거나, 카르보닐-함유 아미노산이 혼입된 T-20 폴리펩티드를 실시예 32 및 33에 기재된 절차에 따라 제조한다. 하기 구조를 갖는 히드라지드-함유 PEG는 일단 변형되면, GLP-1 또는 T-20 폴리펩티드에 접합된다:
R-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)n-X-NH-NH2
(식 중에서, R은 메틸이고, n은 2이며, N은 10,000 MW이고, X는 카르보닐 (C=O)기임). p-아세틸페닐알라닌을 함유하는 정제된 GLP-1를, 25 mM MES(시그마 케미칼, 미국 미조리주 세인트루이스 소재)(pH 6.0), 25 mM Hepes(시그마 케미칼, 미국 미조리주 세인트루이스 소재)(pH 7.0), 또는 10 mM 아세트산나트륨(시그마 케미칼, 미국 미조리주 세인트루이스 소재)(pH 4.5) 중, 0.1 내지 10 mg/mL로 용해시키고, 10 내지 100배 과량의 히드라지드-함유 PEG와 반응시키며, 상응하는 히드라존은, H2O 중에 용해된 원액 1 M NaCNBH3(시그마 케미칼, 미국 미조리주 세인트루이스 소재)를 첨가함으로써 인시츄 환원시킨다. 반응을 암상태에서 4℃ 내지 실온에서 18 내지 24시간 동안 수행한다. 약 pH 7.6의 1 M 트리스(시그마 케미칼, 미국 미조리주 세인트루이스 소재)를 첨가함으로써 반응을 중단하여 최종 트리스 농도가 50 mM이 되도록 하거나, 적당한 완충액으로 희석하여, 즉각적으로 정제한다.
실시예 7
이 실시예는 알킨-함유 아미노산의 BSP로의 도입, 및 mPEG-아지드를 이용한 유도체화를 상세히 설명한다.
실시예 1(GLP-1) 또는 실시예 32(T-20)에 따라 확인되는 임의의 잔기는 각기 하기 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환된다:
Figure 112007014691585-PCT00042
p-프로파르길-티로신의 GLP-1로의 부위-특이적 혼입을 위해 사용되는 서열은 상기 실시예 2에 기재된 서열 번호 2(GLP-1), 서열 번호 4(muttRNA, M. 자나쉬이mtRNATyr CUA), 및 9, 10 또는 11. 프로파르길 티로신을 함유하는 GLP-1 폴리펩티드는 실시예 3에 기재된 조건을 이용하여 E. 콜라이에서 발현되어 정제된다. p-프로파르길-티로신의 T-20으로의 부위-특이적 혼입을 위해 사용되는 서열은 상기 실시예 2에 기재된 서열 번호 22 또는 24, 및 서열 번호 4(muttRNA, M 자나쉬이 mtRNATyr CUA), 및 9, 10 또는 11이다. 프로파르길 티로신을 함유하는 T-20 폴리펩티드는 실시예 3에 기재된 조건을 이용하여 E. 콜라이에서 발현되어 정제된다.
PB 완충액(100 mM 나트륨 포스페이트, 0.15 M NaCl, pH 8) 중 0.1-10 mg/mL로 용해된 프로파르길-티로신, 및 10 내지 1000배 과량의 아지드-함유 PEG를 함유하는 정제된 GLP-1 또는 T-20을 반응 혼합물에 첨가한다. 이어서, 촉매량의 CuSO4 및 Cu 와이어를 반응 혼합물에 첨가한다. 혼합물을 인큐베이션(실온 또는 37℃에서 약 4시간, 또는 4℃에서 하룻밤 동안의 인큐베이션을 비제한적 예로 포함함)한 후, H2O를 첨가하고, 혼합물을 투석 막을 통해 여과한다. 샘플을 실시예 3에 기재된 유사한 절차에 의해(단, 이에 제한되지 않음), 첨가를 위해 분석할 수 있다.
이 실시예에서, PEG는 하기 구조를 가질 것이다:
R-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)n-N3
(식 중에서, R은 메틸이고, n은 4이며, N은 10,000 MW임).
실시예 8
이 실시예는 BSP 내의 큰 소수성 아미노산의 프로파르길 티로신으로의 치환을 상세히 설명한다.
GLP-1 또는 T-20 내에 존재하는 Phe, Trp 또는 Tyr 잔기는 실시예 7에 기재된 바와 같은 하기 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환된다:
Figure 112007014691585-PCT00043
PEG는 일단 변형되면, 알킨-함유 아미노산을 포함하는 BSP 변종체에 결합된다. PEG는 하기 구조를 가질 것이고:
Me-PBG(N)-O-(CH2)2-N3
결합 절차는 실시예 7에서와 같을 것이다. 이는 천연 발생의 것과 대략 아형입체형이고 폴리펩티드 내의 별개의 부위에서 PEG 유도체를 이용하여 변형되는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 BSP 변종체를 발생시킬 것이다.
실시예 9
이 실시예는 1개 이상의 PEG 링커에 의해 분리되는 BSP 동종이량체, 이종이량체, 동종다량체 또는 이종다량체의 발생을 상세히 설명한다.
실시예 7에서 생성된 알킨-함유 BSP 변종체는 형태:
N3-(CH2)n-C(O)-NH-(CH2)2-O-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)-(CH2)n-N3
(식 중에서, n은 4이고, PEG는 평균 MW가 대략 5,000임)의 이관능성 PEG 유도체와 반응하여, 2개의 BSP 분자가 PEG에 의해 물리적으로 분리된 상응하는 BSP 동종이량체를 발생시킨다. 유사 방식으로, BSP가 1개 이상의 다른 폴리펩티드에 결합되어, 이종이량체, 동종다량체 또는 이종다량체를 형성할 수 있다. 실시예 7 및 3에서와 같이 결합, 정제 및 분석을 수행할 것이다.
실시예 10
이 실시예는 당 부분의 BSP로의 결합을 상세히 설명한다.
하기의 하나의 잔기는 실시예 3에 기재된 바와 같이 이하의 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환된다: 19, 23, 26, 27, 28, 29, 30 또는 33(서열 번호 1, 2, 3, 21, 또는 다른 GLP-1 폴리펩티드의 상응하는 아미노산에서와 같음). 대안적으로, T-20의 하나의 잔기는 실시예 3에 기재된 바와 같이 이하 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환된다.
Figure 112007014691585-PCT00044
카르보닐-함유 아미노산을 포함하는 BSP 변종체는 일단 변형되면 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)의 β-연결 아미노옥시 유사체와 반응한다. BSP 변종체(10 mg/mL) 및 아미노옥시 당(21 mM)는 수성 100 mM 아세트산나트륨 완충액(pH 5.5) 내에서 혼합되어, 7 내지 26시간 동안 37℃에서 인큐베이션한다. 두 번째 당은 주변 온도에서 48시간 동안 150 mM HEPES 완충액(pH 7.4) 내에서 UDP-갈락토스(16 mM) 및 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제(0.4 단위/mL)와 함께 당-접합 BSP (5 mg/mL)를 함께 인큐베이션함으로써 효소에 의해 첫 번째 당에 결합된다(Schanbacher 등, J. Biol. Chem. 1970, 245, 5057-5061).
실시예 11
이 실시예는 PEG화 BSP 길항자의 발생을 상세히 설명한다.
GLP-1의 잔기 19, 23, 26, 27, 28, 29, 30 또는 33는 실시예 3에 기재된 바와 같은 하기 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환된다.
Figure 112007014691585-PCT00045
카르보닐-함유 아미노산을 포함하는 BSP는 일단 변형되면, 형태:
R-PEG(N)-O-(CH2)n-O-NH2
(식 중에서, R은 메틸이고, n은 4이며, N은 20,000 MW임)의 아미노옥시-함유 PEG 유도체와 반응하여, 폴리펩티드 내의 단일 부위에서 PEG 유도체를 이용하여 변형되는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 BSP 길항자를 발생시킬 것이다. 결합, 정제 및 분석은 실시예 3에서와 같이 수행된다.
실시예 12
BSP 분자가 직접적으로 연결된, BSP 동종이량체, 이종이량체, 동종다량체 또는 이종다량체의 발생
알킨-함유 아미노산을 포함하는 GLP-1 변종체는 아지도-함유 아미노산을 포함하는 다른 한 GLP-1 변종체에 직접적으로 결합될 수 있고, 이들 각각은 실시예 1에 기재된(단, 이에 제한되지 않음) 부위에 비천연적으로 코딩된 아미노산 치환을 포함한다. 유사한 방식으로, GLP-1 폴리펩티드는 1개 이상의 다른 폴리펩티드에 결합되어, 이종이량체, 동종다량체 또는 이종다량체를 형성할 수 있다. 결합, 정제 및 분석은 실시예 3, 6 및 7에서와 같이 수행된다.
알킨-함유 아미노산을 포함하는 T-20 변종체는 아지도-함유 아미노산을 포함하는 다른 한 T-20 변종체에 결합될 수 있고, 이들 각각은 실시예 32에 기재된(단, 이에 제한되지 않음) 부위에 비천연적으로 코딩된 아미노산 치환을 포함한다. 유사한 방식으로, T-20 폴리펩티드는 1개 이상의 다른 폴리펩티드에 결합되어, 이종이량체, 동종다량체 또는 이종다량체를 형성할 수 있다. 결합, 정제 및 분석은 실시예 3, 6 및 7에서와 같이 수행된다.
실시예 13
PEG-OH + Br-(CH2)n-C≡CR' → PEG-O-(CH2)n-C≡CR'
A B
폴리알킬렌 글리콜(P-OH)은 알킬 할라이드(A)와 반응하여, 에테르(B)를 형성한다. 이 화합물들에서, n은 1 내지 9의 정수이고, R'은 직쇄형 또는 분지형-사슬, 포화 또는 불포화 C1-C20 알킬 또는 헤테로알킬기일 수 있다. R'은 또한 C3-C7 포화 또는 불포화 시클릭 알킬 또는 시클릭 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 아릴 또는 헤테로아릴기, 또는 치환 또는 비치환 알카릴(알킬은 C1-C20 포화 또는 불포화 알킬임) 또는 헤테로알카릴기일 수 있다. 전형적으로, PEG-OH는 분자량이 800 내지 40,000 달톤(Da)인 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 모노메톡시 폴리에틸렌 글리콜(mPEG)이다.
실시예 14
mPEG-OH + Br-CH2-C≡CH → mPEG-O-CH2-C≡CH
분자량이 20,000 Da인 mPEG-OH(mPEG-OH 20 kDa; 2.0 g, 0.1 mmol, 선바이오(Sunbio))를 THF(35 mL) 중 NaH(12 mg, 0.5 mmol)로 처리하였다. 이어서, 자일렌 중 80 중량% 용액(0.56 mL, 5 mmol, 50 당량, 알드리히(Aldrich)) 형태로 용해된 프로파르길 브로마이드의 용액, 및 촉매량의 KI를 용액에 첨가하였고, 수득된 혼합물을 2시간 동안 가열 환류시켰다. 이어서, 물(1 mL)을 첨가하였고, 용매를 진공 하에 제거하였다. 잔류물에 CH2Cl2(25 mL)을 첨가하였고, 유기층을 분리시켜, 무수 Na2SO4로 건조시켰으며, 체적을 대략 2 mL로 감소시켰다. 이 CH2Cl2 용액을 디에틸 에테르(150 mL)에 적가하였다. 수득된 석출물을 수집하여, 냉 디에틸 에테르로 수회 분량으로 세정하였으며, 건조시켜 프로파르길-O-PEG를 제공하였다.
실시예 15
mPEG-OH + Br-(CH2)3-C≡CH → mPEG-O-(CH2)3-C≡CH
분자량이 20,000 Da인 mPEG-OH(mPEG-OH 20 kDa; 2.0 g, 0.1 mmol, 선바이오)를 THF(35 mL) 중 NaH(12 mg, 0.5 mmol)로 처리하였다. 이어서, 50 당량의 5-브로모-1-펜틴(0.53 mL, 5 mmol, 알드리히) 및 촉매량의 KI를 혼합물에 첨가하였다. 수득된 혼합물을 16시간 동안 가열 환류시켰다. 이어서, 물(1 mL)을 첨가하였고, 용매를 진공 하에 제거하였다. 잔류물에 CH2Cl2(25 mL)을 첨가하였고, 유기층을 분리시켜, 무수 Na2SO4로 건조시켰으며, 체적을 대략 2 mL로 감소시켰다. 이 CH2Cl2 용액을 디에틸 에테르(150 mL)에 적가하였다. 수득된 석출물을 수집하여, 냉 디에틸 에테르로 수회 분량으로 세정하였으며, 건조시켜 상응하는 알킨을 제공하였다. 유사한 반응으로 5-클로로-1-펜틴을 사용할 수 있다.
실시예 16
(1) m-HOCH2C6H4OH + NaOH + Br-CH2-C≡CH → m-HOCH2C6H4O-CH2-C≡CH
(2) m-HOCH2C6H4O-CH2-C≡CH + MsCl + N(Et)3 → m-MsOCH2C6H4O-CH2-C≡CH
(3) m-MsOCH2C6H4O-CH2-C≡CH + LiBr → m-Br-CH2C6H4O-CH2-C≡CH
(4) mPEG-OH + m-Br-CH2C6H4O-CH2-C≡CH → mPEG-O-CH2-C6H4O-CH2-C≡CH
THF(50 mL) 및 물(2.5 mL) 중 3-히드록시벤질알코올(2.4 g, 20 mmol)의 용액에 먼저 분말형 나트륨 히드록시드(1.5 g, 37.5 mmol), 및 그에 이어 자일렌 (3.36 mL, 30 mmol) 중 80 중량% 용액으로서 용해된 프로파르길 브로마이드의 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 6시간 동안 가열 환류하였다. 혼합물에 10% 시트르산(2.5 mL)을 첨가하였고, 용매를 진공 제거하였다. 잔류물을 에틸 아세테이트로 추출하였고(3 x 15 mL), 조합된 유기층을 포화 NaCl 용액(10 mL)으로 세정하였으며, MgSO4로 건조시키고 농축시켜, 3-프로파르길옥시벤질 알코올을 수득하였다.
메탄술포닐 클로라이드(2.5 g, 15.7 mmol) 및 트리에틸아민(2.8 mL, 20 mmol)을 0℃에서 CH2Cl2 중 화합물 3(2.0 g, 11.0 mmol)의 용액에 첨가하였고, 반응물을 16시간 동안 냉장고에 두었다. 통상의 워크업으로, 담황색 오일로서의 메실레이트를 제공하였다. 이 오일(2.4 g, 9.2 mmol)을 THF(20 mL)에 용해시키고, LiBr(2.0 g, 23.0 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 1시간 동안 가열 환류시킨 후, 실온으로 냉각시켰다. 혼합물에 물(2.5 mL)을 첨가하였고, 용매를 진공 제거하였다. 잔류물을 에틸 아세테이트로 추출하였고(3 x 15 mL), 조합된 유기층을 포화 NaCl 용액(10 mL)으로 세정하였으며, 무수 Na2SO4로 건조시키고 농축시켜, 원하는 브로마이드를 수득하였다.
mPEG-OH 20 kDa(1.0 g, 0.05 mmol, 선바이오)를 THF(20 mL) 중에 용해시켰고, 용액을 빙조에서 냉각시켰다. NaH(6 mg, 0. 25 mmol)를 수분간 격렬한 교반 하에 첨가한 후, 상기로부터 수득된 브로마이드(2.55 g, 11.4 mmol) 및 촉매량의 KI를 첨가하였다. 냉각조를 제거하고, 수득된 혼합물을 12시간 동안 가열 환류시켰다. 물(1.0 mL)을 혼합물에 첨가하였고, 용매를 진공 제거하였다. 잔류물에 CH2Cl2(25 mL)을 첨가하였고, 유기층을 분리하였으며, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 체적을 대략 2 mL로 감소시켰다. 에테르 용액(150 mL)으로의 적가로써 백색 석출물을 수득하였고, 이를 수집하여 PEG 유도체가 생성되었다.
실시예 17
mPEG-NH2 + X-C(O)-(CH2)n-C≡CR' → mPEG-NH-C(O)-(CH2)n-C≡CR'
상기 나와 있는 바와 같이, 말단 작용기를 함유하는 폴리(에틸렌 글리콜) 중합체를 알킨 관능성을 함유하는 반응성 분자에 결합시킴으로써, 말단 알킨-함유 폴리(에틸렌 글리콜) 중합체가 또한 수득될 수 있다. n은 1 내지 10이고, R'은 H, 또는 C1-C4의 저급 알킬기일 수 있다.
실시예 18
(1) HO2C-(CH2)2-C≡CH + NES +DCC → NHSO-C(O)-(CH2)2-C≡CH
(2) mPEG-NH2 + NHSO-C(O)-(CH2)2-C≡CH → mPEG-NH-C(O)-(CH2)2-C≡CH
4-펜틴산(2.943 g, 3.0 mmol)을 CH2Cl2(25 mL) 중에 용해시켰다. N-히드록시숙신이미드(3. 80 g, 3.3 mmol) 및 DCC(4.66 g, 3.0 mmol)를 첨가하였고, 용액을 실온에서 하룻밤 동안 교반하였다. 수득된 조 NHS 에스테르 7를 추가 정제없이 하기 반응에 사용하였다.
분자량이 5,000 Da인 mPEG-NH2(mPEG-NH2, 1 g, 선바이오)를 THF(50 mL) 중 용해시켰고. 혼합물을 4℃로 냉각시켰다. NH2 에스테르 7(400 mg, 0.4 mmol)를 격렬한 교반 하에 적가하였다. 혼합물을 3시간 동안 교반하면서, 실온으로 가온시켰다. 이어서, 물(2 mL)을 첨가하였고, 용매를 진공 제거하였다. 잔류물에 CH2Cl2(50 mL)을 첨가하였고, 유기층을 분리하였으며, 무수 Na2SO4로 건조시켰고, 체적을 대략 2 mL로 감소시켰다. 이 CH2Cl2 용액을 에테르(150 mL)에 적가하였다. 수득된 석출물을 수집하고, 진공 건조시켰다.
실시예 19
이 실시예는 폴리(에틸렌 글리콜)의 메탄술포네이트 또는 메실레이트로도 칭해질 수 있는, 폴리(에틸렌 글리콜)의 메탄 술포닐 에스테르의 제조를 나타낸다. 유사한 절차에 의해 상응하는 토실레이트 및 할라이드가 제조될 수 있다.
mPEG-OH + CH3SO2Cl + N(Et)3 → mPEG-O-SO2CH3 → mPEG-N3
150 mL의 톨루엔 중 mPEG-OH(MW 3,400, 25 g, 10 mmol)을 질소 하에 공비 증류시켰고, 용액을 실온으로 냉각시켰다. 40 mL의 건조 CH2Cl2 및 2.1 mL의 건조 트리에틸아민(15 mmol)을 용액에 첨가하였다. 용액을 빙조에서 냉각시켰고, 1.2 mL의 증류 메탄술포닐 클로라이드(15 mmol)를 적가하였다. 용액을 질소 하에 실온에서 교반하였고, 2 mL의 무수 에탄올을 첨가함으로써 반응물을 급냉시켰고, 혼합물을 진공 하에 증발시켜, 용매, 주로 톨루엔을 제외한 용매를 제거하고, 여과하였으며, 다시 진공 하에 농축한 후, 100 mL의 디에틸 에테르로 석출시켰다. 여과물을 수회 분량의 냉 디에틸 에테르로 세정하고, 진공 하에 건조시켜, 메실레이트를 제공하였다.
메실레이트(20 g, 8 mmol)를 75 ml의 THF 중에 용해시키고, 용액을 4℃로 냉각시켰다. 냉각된 용액에 나트륨 아지드(1.56 g, 24 mmol)를 첨가하였다. 반응을 2시간 동안 질소 하에서 가열 환류시켰다. 이어서, 용매를 증발시키고, 잔류물을 CH2Cl2(50 mL)로 희석하였다. 유기 분획을 NaCl 용액으로 세정하고, 무수 MgSO4로 건조시켰다. 체적을 20 ml로 감소시키고, 150 ml의 냉 건조 에테르를 첨가함으로써 생성물을 석출시켰다.
실시예 20
(1) N3-C6H4-CO2H → N3-C6H4CH2OH
(2) N3-C6H4CH2OH - Br-CH2-C6H4-N3
(3) mPEG-OH + Br-CH2-C6H4-N3 - mPEG-O-CH2-C6H4-N3
본원에 참고로 인용되는 U.S. 특허 5,998,595에 기재된 방법을 이용하여 4-아지도벤질 알코올을 생성시킬 수 있다. 메탄술포닐 클로라이드(2.5 g, 15.7 mmol) 및 트리에틸아민(2.8 mL, 20 mmol)을 0℃에서 CH2Cl2 중 4-아지도벤질 알코올(1.75 g, 11.0 mmol)의 용액에 첨가하였고, 반응물을 16시간 동안 냉장고에 두었다. 통상의 워크업으로 메실레이트를 담황색 오일로서 제공하였다. 이 오일(9.2 mmol)을 THF(20 mL)에 용해시키고, LiBr(2.0 g, 23.0 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 1시간 동안 가열 환류시킨 후, 실온으로 냉각시켰다. 혼합물에 물(2.5 mL)을 첨가하였고, 용매를 진공 제거하였다. 잔류물을 에틸 아세테이트로 추출하였고(3 x 15 mL), 조합된 유기층을 포화 NaCl 용액(10 mL)으로 세정하였으며, 무수 Na2SO4로 건조시키고 농축시켜, 원하는 브로마이드를 수득하였다.
mPEG-OH 20 kDa(2.0 g, 0.1 mmol, 선바이오)를 THF(35 mL) 중 NaH(12 mg, 0.5 mmol)로 처리하였고, 그 브로마이드(3.32 g, 15 mmol)를 촉매량의 KI와 함께 혼합물에 첨가하였다. 수득된 혼합물을 12시간 동안 가열 환류시켰다. 물(1.0 mL)을 혼합물에 첨가하였고, 용매를 진공 제거하였다. 잔류물에 CH2Cl2(25 mL)을 첨가하였고, 유기층을 분리하였으며, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 체적을 대략 2 mL로 감소시켰다. 에테르 용액(150 mL)으로의 적가로써 백색 석출물을 수득하였고, 이를 수집하여 mPEG-O-CH2-C6H4-N3이 생성되었다.
실시예 21
NH2-PEG-O-CH2CH2CO2H + N3-CH2CH2CO2-NHS → N3-CH2CH2-C(O)NH-PEG-O-CH2CH2CO2H
NH2-PEG-O-CH2CH2CO2H(MW 3,400 Da, 2.0 g)을 NaHCO3(10 mL)의 포화 수용액에 용해시키고, 용액을 0℃로 냉각시켰다. 3-아지도-1-N-히드록시숙신이미도프로피오네이트(5 당량)를 격렬한 교반 하에 첨가하였다. 3시간 후에, 20 mL의 H20을 첨가하였고, 혼합물을 실온에서 부가적 45분 동안 교반하였다. 0.5 N H2S04를 첨가함으로써 pH를 3으로 조정하였고, NaCl을 첨가하여, 대략 15 wt%의 농도로 만들었다. 반응 혼합물을 CH2Cl2(100 mL x 3)로 추출하고, Na2SO4로 건조시켜 농축하였다. 냉 디에틸 에테르를 이용하여 석출한 후, 생성물을 여과에 의해 수집하고, 진공 하게 건조시켜, 오메가-카르복시-아지드 PEG 유도체를 생성시켰다.
실시예 22
mPEG-OMs + HC≡CLi → mPEG-O-CH2-CH2-C≡C-H
당업계에 공지된 바에 따라 제조되고 THF 중에서 -78℃로 냉각된 리튬 아세틸리드(4 당량)의 용액에, THF 중에 용해된 mPEG-OMs의 용액을 격렬한 교반 하에 적가하였다. 3시간 후, 반응물을 실온으로 가온시키고, 1 mL의 부탄올을 첨가함으로써 급냉시킨다. 이어서, 20 mL의 H20를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 부가적 45분 동안 교반하였다. 0.5 N H2S04를 첨가함으로써 pH를 3으로 조정하였고, NaCl을 첨가하여, 대략 15 wt%의 농도로 만들었다. 반응 혼합물을 CH2Cl2(100 mL x 3)로 추출하고, Na2SO4로 건조시켜 농축하였다. 냉 디에틸 에테르를 이용하여 석출한 후, 생성물을 여과에 의해 수집하고, 진공 하게 건조시켜, 1-(부트-3-이닐옥시)-메톡시폴리에틸렌 글리콜(mPEG)을 생성시켰다.
실시예 23
[L. Wang 등(2001), Science 292: 498-500, J.W. Chin 등, Science 301: 964-7(2003)), J. W. Chin 등(2002), Journal of the American Chemical Society 124: 9026-9027; J. W. Chin, & P. G. Schultz,(2002), Chem Bio Chem 3(1l): 1135-1137; J. W. Chin 등(2002), PNAS United States of America 99: 11020-11024: and, L. Wang, & P. G. Schultz,(2002), Chem . Comm ., 1: 1-11]에 기재된 방법을 이용하여 단백질에 아지드- 및 아세틸렌-함유 아미노산을 부위-선택적으로 혼입시켰다. 일단 아미노산이 혼입되면, 2 mM PEG 유도체, 1 mM CuSO4, 및 ~1 mg Cu-와이어의 존재 하에, 37℃에서 4시간 동안 포스페이트 완충액(PB)(pH 8) 중 0.01 mM 단백질을 이용하여 시클로부가 반응을 수행하였다.
실시예 24
이 실시예는 PEG화 GLP-1 및 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 GLP-1의 생체외 및 생체내 활성을 측정하기 위한 방법을 기재하고 있다.
수많은 검정들을 이용하여, 본 발명의 GLP-1 폴리펩티드의 활성을 모니터할 수 있다. GLP-1과 같은 펩티드 호르몬은 특정 G 단백질-결합 수용체를 활성화하고, 이에 따라 본 발명의 GLP-1 폴리펩티드를 GLP-1 수용체 의존성 cAMP 형성을 검출하는 분석에 의해 평가할 수 있다. 하류 세포내 cAMP 생성을 비제한적 예로 포함하는, 비색법, 발광법, 시간 분해 형광법 또는 FP법을 포함한 각종 방법들에 의해 측정할 수 있다. 래트 인슐린종-유래 RIN-m5F 세포는 아데닐레이트 사이클라제에 결합된 내인성 GLP-1 수용체를 가지고(Fehmann 등, Mol Cell Endocrinol 85:C39-C44; Goke 등, Res Exp Med(Berl). 1989;189(4): 257-64), 수용체 활성화 후, cAMP를 측정하는데 사용될 수 있다. 유사하게, 햄스터 HIT-T15 세포(ATCC, 미국 버지니아주 마나사스 소재) 또는 래트 BRIN-BD11 베타 세포(Green 등, J Mol Endocrinol. 2003 Dec; 31(3): 529-4)를 사용할 수 있다.
대안적으로, CH0를 비제한적 예로 포함하는 재조합 hGLP-1 수용체가 트랜스펙션된 세포(Kim 등, 2003 Diabetes 52: 751-59), BHK(어린 햄스터 신장; Knudsen 등, 2000 J. Med. Chem. 43: 1664-1669), 및 CHL(차이니즈 햄스터 폐) 세포, 또는 래트, 마우스 또는 햄스터로부터 단리된 일차 세포, 예컨대 췌장섬 세포에서 cAMP 생성을 측정할 수 있다. GLP-1 수용체를 본원에 각기 참고로 인용되는 [Thorens, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992, 89(18): 8641-5] 또는 U.S. 특허 No. 5,670,360 및 6,051,689에 기재된 바대로 제조할 수 있다. 포스콜린(Forskolin)(EMD 바이오사이언시스, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재), 아데닐레이트 사이클라제 활성화제, 및 아데닐레이트 사이클라제, PI3K, MAPK, 또는 p38의 억제제를 검정 대조군으로서 사용할 수 있다. 작용자 대조군에는 GLP-1(7-37) 및 엑센딘-4, 강한 GLP-1 수용체 작용자가 포함되고, 길항자 대조군에는 GLP-1 수용체 길항자 엑센딘(9-39)(바켐 아게)이 포함된다. 용량 반응 곡선을 시험한 각 화합물에 대해 폴로팅하고, EC50 값을 계산한다. 대안적으로, cAMP를 다른 검정에 의해 측정할 수 있다. 일반적으로, 이 검정들은 당업계에 공지되어 있다.
인슐린 분비는 또한 본 발명의 GLP-1 폴리펩티드의 생물학적 활성의 척도이다. 인슐린 분비의 생체외 연구는 인슐린 RIA 또는 ELISA를 통해 GLP-1 폴리펩티드(들) 및 포도당의 농도 범위를 이용하여 배양 후 세포에서 산출될 수 있다. [Green 등, 이하 동문]은 래트 BRIN-BD 11 베타 세포 내의 GLP-1 폴리펩티드의 인슐린친화 효과를 평가하였다. 래트 췌장섬이 대안적으로 인슐린 분비 연구에 사용될 수 있다(Goke 등, J. Biol. Chem. 1993 268(26)19650-19655).
대안적으로, 베타 섬 세포 성장을 XTT 또는 BrdU과 같은 시약을 이용하여 측정할 수 있다. CRE 리포터 검정과 함께 CREB(시클릭 AMP 반응 요소 결합 단백질) 전사 인자를 측정하는 생체외 검정을 또한 수행할 수 있다.
비천연 아미노산을 포함하는 GLP-1 폴리펩티드의 그것의 수용체에 대한 친화도를 비아코어TM 바이오센서(파마시아)를 이용하여 측정할 수 있다. GLP-1(활성 GLP-1 수용체를 함유하는 세포, 예컨대 인간 세포, 또는 재조합 GLP-1 수용체 생성 세포를 비제한적 예로 포함함)의 성장을 조절하거나 그에 결합하는 세포 또는 세포주를 사용하여, GLP-1 수용체 결합을 모니터할 수 있다. 예를 들어, GLP-1(활성 GLP-1 수용체를 함유하는 세포, 예컨대 인간 세포, 또는 재조합 GLP-1 수용체 생성 세포를 비제한적 예로 포함함)의 성장을 조절하거나 그에 결합하는 세포 또는 세포주를 사용하여, GLP-1 수용체 결합을 모니터할 수 있다
대안적으로, 재조합 hGLP-1 수용체가 트랜스펙션된 세포(CHO, BHK(어린 햄스터 신장), 및 CHL(차이니즈 햄스터 폐 섬유아세포) 세포를 비제한적 예로 포함함)를 이용하여 결합을 측정할 수 있다. 트랜스펙션된 CHO 세포에서의 결합 연구에 대해서는 [Kim 등, 이하 동문]을 참고하고, 트랜스펙션된 CHL 세포에서의 연구에 대해서는 [Green 등, J Mol Endocrinol. 2003 Dec; 31(3): 529-40]을 참고한다. GLP-1 수용체를 본원에 각기 참고로 인용되는, [Thorens, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992, 89(18): 8641-5] 또는 U.S. 특허 No. 5,670,360 및 6,051,689에 기재된 바대로 제조할 수 있다.
DPP IV 또는 인간 혈장에 의한 본 발명의 GLP-1 폴리펩티드의 퇴화를 액체 크로마토그래피/질량 분광법(LC/MS), 또는 기타 방법들에 의해 모니터할 수 있다. 본 발명의 GLP-1 펩티드를 DPP IV 또는 풀링된 인간 혈장과 함께 0, 6 또는 12시간 동안 인큐베이션하고, TFA와 같은 시약을 분석 전에 첨가하여 임의의 효소에 의한 반응을 종료할 수 있다. 인용된 모든 참고문헌들은 본원에 참고로 인용된다.
세포 결합 검정
각종 농도(체적: 10 μl)의 비표지 GLP-1, GLP-1 또는 GLP-1 유사체의 부재 또는 존재 하에, 또한 125I GLP-1(대략 100,000 cpm 또는 1 ng)의 존재 하에, 세포(3 x 106)을 PBS/1% BSA(100 μl) 중에 0℃에서 90분 동안 이벌로 인큐베이션한다(총 체적: 120 μl). 이어서, 세포를 350 μL 플라스틱 원심분리관 내에서 200 μl 빙냉 FCS 상에서 재현탁시키고 층상화하고, 원심분리하였다(1000 g; 1 분). 관의 말단을 절단함으로써 펠렛을 수집하고, 펠렛 및 상등액을 분리하여 감마계수기(팩커드(Packard))에서 계수한다.
특이적 결합(cpm)은, 컴패티터의 부재 하에서의 총 결합(이중체)에서 100배 과량의 비표지 GLP-1(비특이적 결합)의 존재 하에서의 결합(cpm)을 뺀 것으로 구해진다. 사용된 각 세포 유형에 대해 비특이적 결합을 측정한다. 125I-GLP-1의 동일한 제조를 이용하여 실험들을 분리하여 운용하였고, 내부 일관성을 나타내야 한다. 125I-GLP-1은 세포에 대한 결합을 나타낸다. 결합은 비표지 천연 GLP-1 또는 GLP-1에 의해 용량 의존적 방식으로 억제되나, 음의 대조군에 의해서는 그러하지 않다. 천연 GLP-1와 유사한, 천연 125I-GLP-1의 결합에 대해 경쟁하는 GLP-1의 능력은, 수용체가 양 형태 모두를 동등하게 잘 인식함을 제시한다.
PEG화 GLP-1의 생체내 연구
PEG-GLP-1, 비변형된 GLP-1 및 완충액 용액을 마우스 또는 래트에 투여한다. 결과는, 상당히 감소된 혈중 포도당에 의해 표시되는 비변형된 GLP-1에 비해, 본 발명의 PEG화 GLP-1의 높은 활성 및 연장된 반감기를 나타낼 것이다.
GLP-1 활성을 시험하기 위한 생체내 동물 모델에는 본원에 각기 참고로 인용되는, U.S. 특허 출원 공보 No. 20040082507 A1; 및 20030232754 A1에 기재된 것들이 포함된다.
접합 및 비접합 GLP-1 및 그것의 변종체의 생체내 반감기의 측정
수컷 스프라그 도우리 래트(약 7 주령)를 사용한다. 투여일에 동물의 각 체중을 측정한다. 체중 kg 당, 100 μg의 비접합 및 접합 GLP-1 샘플을 3마리 래트의 꼬리 정맥에 각기 정맥내 주사한다. 주사한지 1분, 30분, 1, 2, 4, 6 및 24시간 후, 500 μl의 혈액을 CO2-마취 하에 각 래트에서 취한다. 혈액 샘플을 1.5시간 이하 동안 실온에서 저장한 후, 원심분리(4℃, 1 8000xg, 5분간)에 의해 혈청을 단리한다. 분석일까지 혈청 샘플을 -80℃에서 저장한다. 얼음 위에 샘플을 해동한 후, 혈청 샘플 내 활성 GLP-1의 양을 GLP-1 생체외 활성 검정에 의해 정량화한다.
동물 모델
본 발명의 GLP-1 펩티드를 평가하는데 사용될 수 있는 동물 모델에는 패티 저커(fa/fa; ZDF) 래트, ob/ob 마우스, 및 db/db 마우스가 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 단일 유전자의 열성 유전에 의해 상기 모델이 발생된다(Bray, G. A. 1977. Fed Proc. 36: 148-153; Bray, G. A. 및 D. A. York. 1979. Physiol. Rev. 51: 598-646; Kasiske, B. L. 등, 1992. Hypertension 19 부록 1: 1110-1115; Bray, G. A. 1992. Am. J. Clin. Nutr. 55 부록 488S-494S). GLP-1 수용체 넉아웃(GLP-1R-/-) 마우스는 또한 본 발명의 GLP-1 분자의 포도당 저하 효과가 기능적 GLP-1 수용체에 의존한다는 것을 보여주는 동물 연구에 사용될 수 있다(U.S. 특허 No. 5,846,937, Scrocchi 등, 1996 Nat Med. 1996 Nov; 2(11): 1254-8, Scrocchi 등, Diabetes 1996 45: 21A), 야생형 마우스와 비교하여, 포도당 내인성을 결정하기 위해 사용된다. [Young 등, Diabetes 1999 48: 1026-1034]는 패티 저커(fa/fa) 래트, ob/ob 마우스, db/db 마우스 및 당뇨 레서스 원숭이에서의 엑센딘-4와 비변형된 GLP-1을 비교하는 연구를 기재하고 있다.
db/db 마우스는 유전적으로 비만성이고 당뇨성인 마우스 품종이다. db/db 마우스는 비만의 발달함과 동시에 고혈당 및 과다인슐린증을 발달시키며, 이에 따라 그것은 비만인 2형 당뇨(NIDDM)의 모델로서 작용한다. 이 마우스들의 핵심적 표현형 특성은, 그것들이 비만이고, 고지혈증, 과다인슐린증, 인슐린 내성 및 과다콜레스테롤성이라는 것이다. db/db 마우스는 예를 들어 더 잭슨 라보라토리즈(The Jackson Laboratories)(미국 메인주 바하버 소재)로부터 구매될 수 있다. [
저커 당뇨 패티 fa/fa(ZDF) 래트는 인슐린-내성이나, 태어날 때부터 정상혈당성이며, 그것들은 약 7주령 내지 10주령에서 당뇨를 발달시킨다. 과도기 기간 동안, 동물은 손상된 포도당 내인성 상태를 겪는다. 동물은 당뇨 발병 전에 과다인슐린증 상태이나, 당뇨 초기 단계 동안, 그것은 후에 포도당-자극 인슐린 분비를 상실하고, 최종적으로는 거의 완전히 인슐린의존성이 된다. 이 래트들의 핵심적 표현형 특성은, 그것들이 비만이고, 고지혈증, 과다인슐린증, 인슐린 내성 및 과다콜레스테롤성이라는 것이다.
db/db 또는 ob/ob 마우스에 대조군으로서 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 GLP-1 펩티드 또는 비변형 GLP-1, 또는 비교자로서 엑센딘-4를 함께 투약한다. 화합물은 s.c. 투약 당, 0.1 μg으로 투여되고, 두 모집단 간에 혈장 포도당, 글루카곤 및 혈액 인슐린의 수준, 체중 감량, 및 식욕감퇴 효과를 비교할 것이다. 결과는 엑센딘-4에 비해 본 발명의 GLP-1 펩티드는 우수한 활성 및 연장된 반감기를 나타낼 것이다.
대조군으로서 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 GLP-1 펩티드 또는 비변형 GLP-1, 또는 비교자로서 엑센딘-4를 급성 및 만성 연구에서 저커 패티 래트에 투약한다. 급성 연구에서, 포도당 및 인슐린 수준에 대한 시간의 영향을 측정한다. 만성 연구에서, 이 래트를 저하된 음식 섭취, 체중 및 HbA1c 수준에 대해 모니터한다. 결과는, 엑센딘-4에 비해 본 발명의 GLP-1 펩티드가 투약이 덜 빈번하고 반감기가 연장되며 활성이 우수함을 나타낸다.
실시예 31
비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 PEG화 GLP-1의 안정성 및/또는 효능의 인간 임상적 시험.
목적 엑센딘-4과 함께 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 피하 투여된 PEG화 재조합 인간 GLP-1의 안정성 및 약물동태학을 비교하기 위함.
환자 연령이 20 내지 40세 범위이고, 체중이 60 내지 90 kg인 18명의 건강한 자원자가 연구에 지원한다. 대상자는 혈액학 또는 혈청화학, 음의 소변 독성학 스크린, HIV 스크린 및 간염 B 표면 항원에 대한 임상적으로 유의한 비정상 실험 값을 가지지 않을 것이다. 그들은 이하를 나타내서는 안된다: 고혈압; 임의의 일차 혈액학적 질병의 병력; 유의적인 간, 신장, 심혈관, 위장관, 성기, 대사, 신경학적 질병의 병력; 빈혈 또는 경련 장애의 병력; 세균 또는 포유동물의-유래 산물, PEG, 또는 인간 혈청 알부민에 대한 공지 민감성; 카페인 함유 음료에 대한 습관적이고 중증인 소비자; 임의의 기타 임상적 시험에 참가하였거나, 연구 시작 30일 내에 혈액을 수혈받았거나 수혈해줌; 연구 시작 3개월 이내에 GLP-1에의 노출됨; 연구 시작 7일 이내에 병을 앓음; 및 연구 시작 14일 이내 연구전 신체검사 또는 임상적 실험실 평가에서 유의적 비정상 상태를 보임. 모든 대상자들은 안정성에 대해 평가가능해야 하고, 약물동태학 분석을 위한 혈액 수집물은 스케쥴대로 수집한다. 모든 연구들은 제도적 윤리위원회의 승인을 받고 환자의 동의를 얻어 수행된다.
연구 설계 이는 건강한 남성 지원자들에 있어 제I 상태, 단일 중심의 공개 표지, 무작위, 2-기 교차 연구이다. 18명의 대상자들을 2가지 처리군 중 한 군에 무작위로 배당한다(9명 대상자/군). 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 PEG화 GLP-1 및 엑센딘-4을 포함하는 동등한 용량을 이용하여, 대퇴에의 볼루스 s.c. 주사로서 2개의 분리된 투약 기간에 걸쳐 GLP-1을 투여한다. 엑센딘-4의 투여 용량 및 빈도는 팩키지 표지에 설명되어 있는 바와 같다. 부가적 대상자 군들을 포함시킴으로써, 시중 입수가능한 제품을 이용하여, 부가적 투약, 투약 빈도, 또는 원하는 경우 기타 파라미터를 연구에 부가할 수 있다. 각 투약 기간은 14-일의 세정 시간에 의해 구분된다. 대상자를 2개 투약 기간 중 각 기간 동안 투약 전 적어도 12시간 전 및 투약 후 72시간에 연구 센터에 감금하나, 투약 기간 중간에는 그러하지 않는다. 부가적 투약, 빈도 또는 PEG화 GLP-1에 대해 시험하고자 하는 기타 파라미터가 있는 경우, 부가적 대상군을 부가할 수 있다. 인간에 사용하도록 승인된 GLP-1의 다중 제형물을 이 연구에 사용할 수 있다. GLP-1의 실험적 제형물은 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 PEG화 GLP-1이다.
혈액 샘플링 일련의 혈액을 GLP-1의 투여 전 및 후에 직접적 정맥 주사를 통해 인취한다. 혈청 GLP-1 농도를 구하기 위한 정맥 혈액 샘플(5 mL)을 투약하기 약 30, 20 및 10분 전(3 기준선 샘플) 및 투약하기 대략 30분, 및 1, 2, 5, 8, 12, 15, 18, 24, 30, 36, 48, 60 및 72시간 후에 수득한다. 각 혈청 샘플을 2가지 분취량으로 나눈다. 모든 혈청 샘플들을 -20℃에서 저장한다. 혈청 샘플을 드라이아이스 상에 선적한다. 공복 임상 실험실 시험(혈액학, 혈청화학 및 소변검사)를 초기 1일째 투약 직전, 4일째 아침, 16일째 투약 직전, 및 19일째 아침에 수행한다.
생분석학 방법 혈청 GLP-1 농도를 구하기 위해, ELISA 키트 절차(린코 리서치 컴퍼니(Linco Research Co.))를 사용한다.
안정성 결정 각 투약(1일째 및 16일째) 직전, 및 각 투약의 6, 24, 48 및 72 후에 활력 징후를 기록한다. 안정성 결정은 좋지 않은 사건의 발생 및 유형, 기준선으로부터의 임상적 실험실 시험으로부터의 변화를 기초로 한다. 또한, 혈압을 포함한, 활력 징후 측정값에 있어서의 연구전 상태에서의 변화, 및 신체검사 결과를 평가한다.
데이터 분석 투약 후 혈청 농도 값을 각 투약후 값에서 투약 30, 20 및 10분 전에 수집된 3개의 샘플로부터의 GLP-1 수준들을 평균내어 구한 평균 기준선 GLP-1 농도를 뺌으로써, 투약전 기준선 GLP-1 농도를 보정한다. 투약전 혈청 GLP-1 농도가 검정의 정량화 수준 미만인 경우, 평균값 계산 시에 포함시키지 않는다. 기준선 GLP-1 농도에 대해 보정된 혈청 농도 데이터로부터 약물동태학 파라미터를 구한다. 최신 버전의 BIOAVL 소프트웨어를 이용하여 디지털 이큅먼트 코포레이션(Digital Equipment Corporation) VAX 8600 컴퓨터 시스템에서 모델 독립적 방법에 의해 약물동태학 파라미터를 계산한다. 하기 약물동태학 파라미터들을 구한다: 피크 혈청 농도(Cmax); 피크 혈청 농도가 되기 까지의 소요 시간(tmax); 선형 사다리꼴 원리를 이용하여 계산되는, 선형 시간 0에서 최후 혈액 샘플링 시간까지의 농도-시간 곡선(AUC) 아래의 면적(AUC0 -72); 및 제거 속도 상수로부터 연산된 말단 제거 반감기(t1 /2). 로그-선형 농도-시간 플롯의 말단 선형 영역에서의 연속적 데이터 점들의 선형 회귀법에 의해 제거 속도 상수를 구한다. 각 처리에 대해 약물동태학 파라미터의 평균, 표준편차(SD), 및 분산계수(CV)를 계산한다. 파라미터 평균의 비(보전 제형물/비보전 제형물)를 계산한다.
안정성 결과 좋지 않은 상황의 발생은 처리군 전반에 걸쳐 균등하게 분포된다. 기준선 또는 연구전 임상적 실험실 시험 또는 혈압에서 임상적으로 유의한 변화가 없고, 신체검사 결과 및 활력 징후 측정값에 있어서도 주목할만한 변화가 없다. 2개의 처리군에 대한 안정성 프로파일은 유사한 것으로 나타나야 한다.
약물동태학 결과 1개 이상의 입수가능한 GLP-1 중 한 개 이상을 단일 투여한 후의 모든 18명의 대상자들에 있어 평균 혈청 GLP-1 농도-시간 프로파일(기준선 GLP-1 수준에 대해 비보정)을 각 측정 시험에서의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 PEG화 GLP-1와 비교한다. 모든 대상자들은 정상적 생리학적 범위 내의 투약전 기준선 GLP-1 농도를 가져야 한다. 투약전 평균 기준선 GLP-1 농도에 대해 보정된 혈청 데이터로부터 약물동태학 파라미터를 구하고, Cmax 및 tmax를 구한다. GLP-1에 대한 평균 tmax는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 PEG화 GLP-1에 대한 tmax보다 상당히 더 짧다. 말단 반감기 값은 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 PEG화 GLP-1에 대한 말단 반감기보다 상당히 더 짧다.
본 연구는 건강한 남성 대상자들에게서 행하여지나, 유사한 흡수 특성 및 안정성 프로파일이 다른 환자 모집단, 에컨대 암 또는 만선 신부전을 갖는 남성 또는 여성 환자, 소아 심부전 환자, 자가 수술전예치식 프로그램을 받고 있는 환자, 또는 대기 수술 대기 환자에게 예기된다.
결론적으로, 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 PEG화 GLP-1의 피하 투여된 단일 용량은 안전할 것이며, 건강한 남성 대상자에 대한 내인성이 좋다. 좋지 않은 사건들의 비교 발생에 기초로 하여, 임상적 실험실 값, 활력 징후 및 신체 검사 결과, 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 GLP-1 및 PEG화 GLP-1의 안정성 프로파일이 동등할 것이다. 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 PEG화 GLP-1은 가능히 환자 및 건강 보호 제공자에게 큰 임상적 유용성을 제공한다.
실시예 32
이 실시예는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 T-20에 혼입하는 바람직한 부위의 선택을 위한 많은 가능한 기준 세트 중 몇가지를 기술한다.
이 실시예는 T-20 폴리펩티드 내의 바람직한 부위가 비천연적으로 코딩된 아미노산을 도입하기 위해 어떻게 선택되는지를 입증한다. 이 실시예에 사용되는 서열 순번지정은 T-20(서열 번호 22) 및 TEX(서열 번호 24)의 아미노산 서열에 따르다. TEX는 T-20의 N-말단 연장된 폴리펩티드이다. 인용되는 위치 번호는 달리 표시되지 않는 한, T-20 펩티드의 위치 638-673 및 TEX 펩티드의 위치 630-673를 기준으로 한다. 예를 들어, 위치 639는 서열 번호 22의 두 번째 아미노산에 상응한다. 당업자는 서열 번호 22의 위치에 상응하는 아미노산 위치는 서열 번호 24, 또는 임의의 기타 T-20 분자에서 용이하게 확인될 수 있음을 인식할 것이다.
T-20의 가능한 알파 나선형 구조의 모델링은 [W. Shu, J. Liu, H. Ji, L. Rading, S. Jiang, M. Lu, Helical Interactions in the HIV-1 gp41 Core Reveal Structural Basis for the Inhibitory Activity of gp41 Peptides(Biochemistry 39: 1634(2000))]의 PDB 1DLB에 기초하여 수행되었다. 하기 기준을 사용하여, 비천연적으로 코딩된 아미노산의 도입을 위한 T-20의 각 위치를 평가하였다: 잔기는 (a) 알라닌 스캐닝 변이유발에 의해 영향을 받아서는 안되고, (b) 표면 노출되어, 모델링에 기초한 주변 잔기와의 최소의 반데르발스 또는 수소 결합 상호작용을 나타내야 하며, (c) T-20 변종체에서 활성에 영향을 주지 않으면서 가변적이거나 비본질적이어도 되고, (d) 비천연적으로 코딩된 아미노산으로의 치환 시에 보수적 치환을 초래하게 되며, (e) 고 가요성 영역 또는 구조적 경질성 영역에서 발견될 수 있음. 또한, 펩티드로부터의 각 단백질 원자에 대한 돌출 정도를 평가하기 위해 Cx 프로그램[Pintar 등(2002) Bioinformatics, 18, pp 980)을 이용하여, T-20 분자에 대해 추가 계산들을 행하였다.
일부 실시양태들에서, 1개 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 T-20(TEX 포함) 내의 임의의 위치, 첫 번째 아미노산 앞, 카르복시 말단의 부가, 또는 이들의 임의의 조합에서 혼입된다. 일부 실시양태들에서, 1개 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 하기 잔기들을 비제한적 예로 포함하는, T-20(TEX 포함) 내의 임의의 위치에서 혼입된다: W631, D632, I635, N636, N637, Y638, T639, S640, L641, L645, N651, 또는 이들의 임의의 조합.
실시예 33
T-20 및 TEX을 생합성으로 생성시키기 위한 클로닝 전략법
도 9A는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 T-20 폴리펩티드 및 N 말단에 연결된 T-20의 폴리펩티드가 혼입되도록 고안된 구축물(TEX)의 개략도를 나타낸다. HIV 프로바이러스 DNA를 사용하여, 펩티드 산물의 N 말단의 메티오닌을 포함한 T-20 및 TEX를 코딩하는 서열을 증폭시켰다. HIV 프로바이러스 DNA로부터 T-20 서열을 증폭시키기 위해 사용되는 프라이머는 F-T20 5'AAG CTT TGG ATG TAC ACA AGT TTA ATA CAC TCC3'(서열 번호 26) 및 R-T20 5'GCG GAT CCC ATT AAA ACC AAT TCC ACA AAC TTG C3'(서열 번호 27)였다. HIV 프로바이러스 DNA로부터 TEX 서열을 증폭시키기 위해 사용되는 프라이머는 F-EXT20 5'CG AAG CTT TGG ATG GAG TGG GAT AGA GAA ATT AAC AAT TAC ACA AGT TTA ATA CAC TCC3'(서열 번호 28) 및 R-T20(서열 번호 27)였다. F-T20 및 F-EXT20은 HindIII 제한 부위를 포함하였고, R-T20은 클로닝을 위한 BamHI 부위를 포함하였다.
T-20 및 TEX 서열을 TrpLE 융합 상대(FP), 및 융합 상대의 N 말단의 9개 히스티딘 택을 포함하는 발현 벡터에 인-플레임 클로닝하였다.
도 10는 야생형 T-20 및 TEX 서열의 비교를 나타낸다. Gp41 헵타드 반복체 2(HR2)의 상응하는 DNA 영역을 증폭하기 위해 상기 표시된 프라이머를 이용하여 연장된 양태의 펩티드 T-20(TEX)를 생성시켰다. TEX는 N-말단에 T-20보다 8개 아미노산만큼 더 길어, 길이가 44개 아미노산인 폴리펩티드를 제공한다. TEX는 HIVNL4 -3 막횡단 단백질(TM)의 아미노산 630 내지 673에 상응한다. T-20는 HIVNL4 -3 막횡단 단백질(TM의 아미노산 638 내지 673에 상응한다.
생합성으로 생성된 T20 및 TEX 펩티드 유사체의 정제
수득된 융합 펩티드를 세균 내에 생합서응로 생성시켰다. 직교 tRNA 및 그것의 특이적 직교성 아미노아실 tRNA 합성효소를 발현시켜, T-20 또는 TEX 구축물의 억제를 수행하였다. 세균 세포질에서 단백질 퇴화를 피하기 위해, 융합 펩티드를 봉입체(IB) 내로 유도함으로써 발현이 일어났다. 융합 펩티드를 함유하는 IB를 100 μg/ml 라이소좀 및 10 μg/ml DNA아제를 함유하는 봉입체 재현탁액 완충액(IBRB; 50 mM 트리스, pH 7.5, 200 mM NaCl, 2 mM EDTA) 내에 재현탁시켰다. 재현탁액을 6회 음파처리한 후, 샘플을 원심분리하여, 펠렛을 가라앉혔다. IB 펠렛을 4회 세정하여, 1% 트리톤(Triton) X-100과 함께 봉입체 세정 완충액(50 mM 트리스, pH 7.5, 30 mM NaCl, 1 mM EDTA)으로 음파처리한 후, 그 사이에 원심분리함으로써 잔류 오염물질을 제거하였다. 이어서, 봉입체 세정 완충액(50 mM 트리스, pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA)으로 음파처리한 후, 그 사이에 원심분리함으로써, TB 펠렛을 세정하였다. 펠렛을 구아니디늄 결합 완충액, pH 7.8(6 M 구아니딘 HCl, 20 mM NaPO4, pH 7.8, 500 nM NaCl) 중에 가용화하고, 평형화된 프로본드(ProBond) 수지에 결합시켜, 융합 펩티드의 His-택 정제를 행하였다. 수지를 구아니디늄 결합 완충액(pH 7.8)으로 2회; 구아니디늄 세정 완충액(pH 6.0)(6M 구아니딘 HCl, 20 mM NaPO4, pH 6.0, 500 nM NaCl)으로 2회; 또한 구아니디늄 세정 완충액(pH 5.3)(6M 구아니딘 HCl, 20 mM NaPO4, pH 5.3, 500 nM NaCl)으로 2회 세정하였다. His-택이 결합된 융합 펩티드를 구아니디늄 용리 완충액(pH 4.0)(6M 구아니딘 HCl, 200 mM 아세트산, 20 mM NaPO4, pH 4, 500 nM NaCl)으로 용리하였다.
샘플 동결건조 전에, PD-10 탈염 칼럼을 이용하여 10% 포름산을 갖는 구아니디늄 용리 완충액으로의 완충액 교환을 수행하였다. 동결건조 후, 이어서 샘플을 하룻밤 동안 시아노겐 브로마이드(CNBr) 절단을 위해 70% 포름산 중에 재현탁시켰다. CNBr을 메티오닌에 대해 C-말단을 특이적으로 절단하고, CNBr을 이용한 절단은 T-20 또는 TEX가 그것의 융합 상대로부터 분리되어 추가 정제되도록 함으로써, 항-바이러스 활성 검정에서의 시험을 위한 순수한 펩티드를 수득한다. 도 9의 레인 4, 패널 B는 CNBr 처리의 절단 생성물을 보여준다. T-20 및 융합 상대(FP)는 화살표로 표시되어 있다. 다른 레인은 하기와 같이 로딩되었다: 유도 전: 레인 1-마커, 레인 2, 및 유도 후: 레인 3.
CNBr을 이용한 절단 후, 샘플을 동결건조시키고, 8 M 우레아 중에 재현탁시켰으며, 제조용 HPLC을 통해 분리하였다. 샘플을 C8 프레프 HPLC 칼럼 상에 운용시켜, 잔류 CNBr를 정제하여 제거하였다. 생성물을 동결건조한 후, 구아니디늄 결합 완충액(pH 7.8) 중에 재현탁시켰다. 가용화된 생성물을 평형화된 프로본드 수지에 결합시켰고, 통과 유동물을 수집하였다. 이어서, 샘플을 C8 프레프 HPLC 칼럼 상에 운용시켜, T-20 또는 TEX를 정제하고 동결건조시켰다. 이어서, 정제된 펩티드를 하기 완충액: 22.5 mg/ml 만니톨, 2.39 mg/ml 나트륨 카르보네이트(pH 9) 중에 재현탁시켰다.
T20 및 TEX의 변형을 위한 변이
셀렉터 코돈을, 보존 위치에 비천연적으로 코딩된 아미노산이 혼입되는 T-20 및 TEX 유사체 펩티드 모두를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 도입하였다. 각 셀렉터 코돈의 위치를 HIV 융합 중의 6-나선 번들 형성의 공개된 결정 구조에 기초하여 선택하였다. 셀렉터 코돈을 제조업체의 사용설명서(슈트라겐(Stratagene))에 따라 퀵체인지(QuickChange) 변이유발에 의해 도입하였고, 각 개별 변이체의 시퀀싱에 의해 확인하였다.
비천연적으로 코딩된 아미노산으로의 치환을 코딩하는 셀렉터 코돈으로 T-20의 5개의 상이한 구축물을 발생시켰다. 도 10은 앰버 코돈으로 치환된 코돈에 의해 코딩된 T-20의 5개 잔기의 맵을 나타낸다: T20 639로 표시되는 트레오인; T20 640으로 표시되는 세린; T20 641로 표시되는 루이신; T20 645로 표시되는 루이신; T20 651로 표시되는 아스파라긴.
비천연적으로 코딩된 아미노산으로의 치환을 코딩하는 셀렉터 코돈으로 TEX의 11개의 상이한 구축물을 발생시켰다. 도 10은 또한 앰버 코돈으로 치환된 코돈에 의해 코딩된 TEX의 11개 잔기의 맵을 나타낸다: TEX 631로 표시되는 트립토판; TEX 632로 표시되는 아스파르트산; TEX 635로 표시되는 이소루이신; TEX 636으로 표시되는 아스파라긴; TEX 637로 표시되는 아스파라긴; TEX 638로 표시되는 티로신; TEX 639로 표시되는 트레오닌; TEX 640으로 표시되는 세린; TEX 641로 표시되는 루이신; TEX 645로 표시되는 루이신; 및 TEX 651로 표시되는 아스파라긴. 도 12는 T20 651(패널 A) 및 TEX 636 (패널 B) 모두에서 억제가 일어남을 보여준다. sup.는 억제된(suppressed)의 약자이다. 도 12의 패널 C 및 D는 도 12의 패널 A 및 B에서 운용된 샘플의 웨스턴 블롯을 나타낸다. 패널 E는 T-20(T-20-Mut651) 및 TEX(TEX-Mut636)에서 별표로 표시되는 p-아세틸-페닐알라닌으로 치환된 잔기를 보여준다.
실시예 34
이 실시예는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 T-20의 생물학적 활성을 측정하는 방법을 기술한다.
T20 및 TEX 항바이러스 활성을 시험하기 위한 생체외 융합 검정
T20 또는 TEX 항바이러스 활성을 평가하기 위해, 단일-사이클 감염력에 기초하여 융합 검정을 사용한다. 검정의 개략적 도시가 도 11에 나와 있다. 간략히 말해, 293-T 세포는 2개의 플라스미드, 즉 HIV 엔벨로프 유전자(JRFL 또는 JC2 env)만을 발현하는 제1 플라스미드, 및 HIV Nef 유전자 대신에 루시페라제 유전자를 담지하는 변형된 HIV 프로바이러스 DNA를 발현하나, 그것의 내인성 엔벨로프 유전자(pHIV.Luc)를 발현하지 않는 제2 플라스미드가 함께 트랜스펙션된다. 그러한 가형(pseudotyped) env HW-Luc 바이러스는 단지 1회 감염에 의해 표적 세포를 감염시킬 수 있다. HIV는 트랜스팩션한지 48시간 후에 생성되어, 트랜스펙션된 세포의 상등액 중에 수집된다. ELISA에 의해 p24gag를 측정함으로써 바이러스를 정량화한다. 일단 HIV 농도가 구해지면, 인간 CD4 수용체, 및 2개의 인간 조수용체 CCR5 또는 CXCR4 중 어느 하나를 발현하는 인간 표적 세포는 T20, TEX 및 그것들의 상응하는 변이체의 존재 또는 부재 하에 상이한 MOI로 감염된다. 세포는 감염된지 3일 후에 분해되고, 기질이 로딩되어, 조도계에 의해 루시페라제 활성가 구해진다. 이 검정은 정량적이고, 상이한 펩티드의 HIV 융합의 억제 수준이 평가된다.
대안적으로, 당업자에게 공지된, 바이러스 도입 또는 바이러스 융합을 측정하는 검정을 비제한적 예로 포함하는 항바이러스 활성을 측정하는 다른 검정들을 비제한적 예로 포함하는 수많은 다른 검정들을 사용하여, 본 발명의 T-20 또는 TEX 폴리펩티드의 활성을 모니터할 수 있다. 다른 한 항바이러스제와의 조합 치료법을 시험하기 위한 상기 검정에 대한 변형법이 또한 당업자에게 공지되어 있다.
또한, 당업자에게 공지된 표준 방법을 이용하여, 비레트로바이러스 활성을 검정할 수 있다. 호흡 합포체 바이러스 및 파라인플루엔자 바이러스 활성 검정 기법의 논의에 대해 예를 들어, [Pringle 등(Pringle, C. R. 등, 1985, J. Medical Virology 17: 377386)]을 참고한다. 또한, 그러한 기법의 일반적 평론에 대해서는, 예를 들어 ["Zinsser Microbiology", 1988, Joklik, W. K. 등(편저), Appleton & Lange, Norwalk, Conn., 제19판]을 참고한다. 이 참고문들은 전체적으로 본원에 참고로 인용된다.
동물 연구는 본 발명의 T-20 폴리펩티드를 이용하여 수행될 수 있다. 그러한 연구에는 독성 연구가 포함되나, 이들에 제한되지 않는다.
본원에 기재된 실시예 및 실시양태는 단지 설명을 목적으로 하는 것이며, 이 측면에서 각종 변형 또는 변화가 당업자에게 제시될 것이며, 이 또한 본원의 사상 및 권한, 및 첨부된 특허청구범위의 범주 내에 포함됨을 이해하도록 한다. 본원에 인용된 모든 공보, 특허 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 전체적으로 본원에 참고로 인용된다.
서열번호 # 주
1 GLP-1(7-36)의 아미노산 서열
2 GLP-1(7-37)의 아미노산 서열
3 엑센딘 -4의 아미노산 서열
21 엑센딘 -3의 아미노산 서열
22 T-20(DP-178)의 아미노산 서열
23 펩티드 YY (3-36)의 아미노산 서열
24 TEX의 아미노산 서열
25 TrpLE 의 아미노산 서열
26 F- T20 의 프라이머 서열
27 R- T20 의 프라이머 서열
28 F- EXT20 의 프라이머 서열
본 발명의 부가적 및 대안적 실시양태
1. 식 (LT)-P-T'을 포함하는 폴리펩티드;
(식 중에서,
(LT)는 국지화 펩티드(L), 택 또는 링커(T), 국지화 펩티드(L)와 택 또는 링커(T)(임의의 순서), 메티오닌으로 이루어진 군으로부터 선택되거나 부재하고;
P는 BSP 서열을 포함하며;
T'는 택 또는 링커를 포함하거나 부재하며,
여기에서 L, T, P, 또는 T'는 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함함).
2. 제1항에 있어서, L이 TrpLE 서열, 원핵생물 분비 신호 서열, 진핵생물 분비 신호 서열, 세균 발현에 대한 5'-최적화 진핵생물 분비 신호 서열, 세균 분비 신호 서열, 효모 분비 신호 서열, 곤충 분비 신호 서열, 포유동물의 분비 신호 서열, 신규 분비 신호 서열, 특유의 분비 신호 서열, 펙테이트 분해효소 분비 신호 서열, Omp 분비 신호 서열 및 파지 분비 신호 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 폴리펩티드.
3. 제1항에 있어서, T 또는 T'이 폴리펩티드, 중합체, 친화도 택, 항원, 검출 택, 이미징 택, 다중-구성원 결합 착체의 구성원, 및 방사성 동위원소 택으로 이루어진 군으로부터 선택되는 택 또는 링커인 것인 폴리펩티드.
4. 제3항에 있어서, T 또는 T'는 폴리-His 택, 비오틴, 아비딘, 단백질 A, 단백질 G 및 항원으로 이루어진 군으로부터 선택되는 친화도 택인 것인 폴리펩티드.
5. 제3항에 있어서, T 또는 T'는 폴리-His 택, 비오틴, 아비딘, 단백질 A, 단백질 G 및 항원으로 이루어진 군으로부터 선택되는 검출 택인 것인 폴리펩티드.
6. 제3항에 있어서, T 또는 T'는 면역글로불린 에피토프로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원인 것인 폴리펩티드.
7. 제3항에 있어서, T 또는 T'는 금속, 방사성핵종 및 자기 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 이미징 택인 것인 폴리펩티드.
8. 제3항에 있어서, T 또는 T는 스트렙타비딘, 아비딘, 비오틴, 단백질 A 및 단백질 G로 이루어진 군으로부터 선택되는 다중-구성원 결합 착체 택의 구성원인 것인 폴리펩티드.
9. 제1항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 광활성화 작용기, pH 활성화 작용기, 온도 활성화 작용기, 촉매를 필요로 하는 작용기, 및 프로테아제, 효소 또는 다른 한 화학적 작용기에 의해 인식되는 작용기로 이루어진 군으로부터 선택되는 선택 조건 하에서 펩티드 결합을 절단하도록 결정된 작용기를 가지는 것인 폴리펩티드.
10. 제9항에 있어서, 선택 조건이 광자 에너지에의 노출, 증가된 온도, 감소된 온도, 증가된 pH, 감소된 pH, 아원자 입자의 노출, 촉매의 첨가, 효소와의 인큐베이션, 및 다른 한 화학적 작용기와의 접촉으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 폴리펩티드.
11. 제1항에 있어서, BSP가 GLP-1인 것인 폴리펩티드.
12. 제1항에 있어서, BSP가 T-20인 것인 폴리펩티드.
13. 식 F-(LT)-P-T'-F'을 포함하는 폴리펩티드;
(식 중에서,
F는 폴리펩티드 서열을 포함하거나 부재하고;
(LT)는 국지화 펩티드(L), 택 또는 링커(T), 국지화 펩티드(L)와 택 또는 링커(T)(임의의 순서), 메티오닌으로 이루어진 군으로부터 선택되거나 부재하고;
P는 100개 이하의 아미노산을 가지는 원하는 폴리펩티드 서열을 포함하고, F 또는 F'와 상이하며;
T'는 택 또는 링커를 포함하거나 부재하며;
F'는 폴리펩티드 서열을 포함하거나 부재하며,
여기에서, F, L, T, P, T' 또는 F'는 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함함).
14. 제13항에 있어서, T 또는 T'가 폴리펩티드, 중합체, 친화도 택, 항원, 검출 택, 이미징 택, 다중-구성원 결합 착체의 구성원, 및 방사성 동위원소 택으로 이루어진 군으로부터 선택되는 택 또는 링커인 것인 폴리펩티드.
15. 제14항에 있어서, T 또는 T'는 폴리-His 택, 비오틴, 아비딘, 단백질 A, 단백질 G 및 항원으로 이루어진 군으로부터 선택되는 친화도 택인 것인 폴리펩티드.
16. 제13항에 있어서, F 또는 F'가 P에 융합된 폴리펩티드인 것인 폴리펩티드.
17. 제16항에 있어서, F 또는 F'가 Fc, 알부민, 및 알부민 결합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 폴리펩티드.
18. 제13항에 있어서, F가 1개 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 것인 폴리펩티드.
19. 제13항에 있어서, F'가 1개 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 것인 폴리펩티드.
20. 제13항에 있어서, P가 1개 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 BSP를 추가로 포함하는 것인 폴리펩티드.
21. 제20항에 있어서, BSP 내의 비천연적으로 코딩된 아미노산이 광활성화 작용기, pH 활성화 작용기, 온도 활성화 작용기, 촉매를 필요로 하는 작용기, 및 프로테아제, 효소 또는 다른 한 화학적 작용기에 의해 인식되는 작용기로 이루어진 군으로부터 선택되는 선택 조건 하에서 펩티드 결합을 절단하도록 결정된 작용기를 가지는 것인 폴리펩티드.
22. 제21항에 있어서, 선택 조건이 광자 에너지에의 노출, 증가된 온도, 감소된 온도, 증가된 pH, 감소된 pH, 아원자 입자의 노출, 촉매의 첨가, 효소와의 인큐베이션, 및 다른 한 화학적 작용기와의 접촉으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 폴리펩티드.
22. 제20항에 있어서, BSP가 GLP-1인 것인 폴리펩티드.
23. 제20항에 있어서, BSP가 T-20인 것인 폴리펩티드.
24. 폴리펩티드 코딩 서열에 작용적으로 연결된 프로모터 서열을 포함하는 핵산 분자로서, 상기 폴리펩티드 코딩 서열이 식 (WX)-Z을 가지는 것인 핵산 분자; (식 중에서, (WX)는 국지화 펩티드(W)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 택 또는 링커(X)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 국지화 펩티드(W)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 택 또는 링커(X)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(임의의 순서임)로 이루어진 군으로부터 선택되거나 부재하고; Z는 원하는 BSP를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기에서 W, X 또는 Z를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 셀렉터 코돈을 포함함).
25. 제24항에 있어서, 프로모터가 원핵생물 프로모터, 진핵생물 프로모터, 세균 프로모터, 효모 프로모터, 곤충 프로모터, 포유동물 프로모터, 특유의 프로모터, 및 유도성 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 핵산 분자.
26. 제24항에 있어서, W가 TrpLE 서열, 원핵생물 분비 신호 서열, 진핵생물 분비 신호 서열, 세균 발현에 대한 5'-최적화 진핵생물 분비 신호 서열, 세균 분비 신호 서열, 효모 분비 신호 서열, 곤충 분비 신호 서열, 포유동물의 분비 신호 서열, 신규 분비 신호 서열, 특유의 분비 신호 서열, 펙테이트 분해효소 분비 신호 서열, Omp A분비 신호 서열 및 파지 분비 신호 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 핵산 분자.
27. 제24항에 있어서, X가 친화도 택, 항원, 검출 택, 이미징 택, 다중-구성원 결합 착체의 구성원, 및 방사성 동위원소 택으로 이루어진 군으로부터 선택되는 택을 코딩하는 것인 핵산 분자.
28. 제24항에 있어서, 상기 셀렉터 코돈이 앰버 코돈, 오팔 코돈, 오커 코돈, 4 염기 코돈 및 특유의 코돈으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 핵산 분자.
29. 제24항에 있어서, Z에 작용적으로 연결된 -Y'를 추가로 포함하고, 여기에서 Y'는 택을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 상기 택을 코딩하는 상기 뉴클레오티드 서열은 셀렉터 코돈을 임의적으로 포함하는 것인 핵산 분자.
30. 제29항에 있어서, Y'가 친화도 택, 항원, 검출 택, 이미징 택, 다중-구성원 결합 착체의 구성원, 및 방사성 동위원소 택으로 이루어진 군으로부터 선택되는 택을 코딩하는 것인 핵산 분자.
31. 제24항 또는 제29항의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
32. 제31항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
33. 제32항에 있어서, 원핵생물, 진핵생물, 곤충, 효모, 세균, 포유동물 또는 식물 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 숙주 세포.
34. a) 식 (LT)-P-T'을 포함하는 폴리펩티드를 재조합 숙주 세포에서 생성시키는 단계;
(식 중에서,
(LT)는 국지화 펩티드(L), 택 또는 링커(T), 국지화 펩티드(L)와 택 또는 링커(T)(임의의 순서), 메티오닌으로 이루어진 군으로부터 선택되거나 부재하고;
P는 BSP 서열을 포함하며;
T'는 택 또는 링커를 포함하거나 부재하며,
여기에서 L, T, P 또는 T'는 선택된 조건 하에서 하나 이상의 펩티드 결합을 절단하도록 결정된 작용기를 갖는 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함함);
b) 하나 이상의 펩티드 결합을 적어도 부분적으로 절단하기에 충분한 시간 동안 선택 조건 하에서 폴리펩티드를 반응시키는 단계;
c) 반응 생성물로부터 P를 포함하는 펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 방법.
35. 제34항에 있어서, 단계 c)의 P를 포함하는 회수된 펩티드가 N 말단 또는 C 말단에 원하는 작용기를 포함하는 것인 방법.
36. 제35항에 있어서, N 말단의 원하는 작용기가 광활성화 작용기, pH 활성화 작용기, 온도 활성화 작용기, 촉매를 필요로 하는 작용기, 및 프로테아제, 효소 또는 다른 한 화학적 작용기에 의해 인식되는 작용기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
37. 제35항에 있어서, C 말단의 원하는 작용기가 광활성화 작용기, pH 활성화 작용기, 온도 활성화 작용기, 촉매를 필요로 하는 작용기, 및 프로테아제, 효소 또는 다른 한 화학적 작용기에 의해 인식되는 작용기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
38. 제34항에 있어서, 상기 선택 조건이 광자 에너지에의 노출, 증가된 온도, 감소된 온도, 증가된 pH, 감소된 pH, 아원자 입자의 노출, 촉매의 첨가, 효소와의 인큐베이션, 및 다른 한 화학적 작용기와의 접촉으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
39. 1개 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 BSP.
40. 제39항에 있어서, BSP가 1개 이상 번역후 변형을 가지는 것인 BSP.
41. 제39항에 있어서, 폴리펩티드가 링커, 중합체 또는 생물학적으로 활성인 분자에 연결된 것인 BSP.
42. 제41항에 있어서, 폴리펩티드가 수용성 중합체에 연결된 것인 BSP.
43. 제39항에 있어서, 폴리펩티드가 이관능적 중합체, 이관능적 링커, 또는 하나 이상의 부가적 BSP에 연결된 것인 BSP.
44. 제43항에 있어서, 이관능적 링커 또는 중합체가 두 번째 폴리펩티드에 연결된 것인 BSP.
45. 제44항에 있어서, 두 번째 폴리펩티드가 BSP인 것인 BSP.
46. 제42항에 있어서, 수용성 중합체가 폴리(에틸렌 글리콜) 부분을 포함하는 것인 BSP.
47. 제42항에 있어서, 상기 수용성 중합체가 상기 BSP 내에 존재하는 비천연적으로 코딩된 아미노산에 연결된 것인 BSP.
48. 제39항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 서열 번호 2(GLP-1)의 위치 7(즉, N 말단)의 첫 번째 아미노산 앞, 7H, 8A, 9E, V16, 17S, 18S, 19Y, 20L, 21E, 22G, 23Q, 24A, 25A, 26K, 27E, 28F, 29I, 30A, 31W, 32L, 33V, 34K, 35G, 36R, 37G, 위치 38(즉, 카르복실 말단)의 부가, 및 이들의 임의의 조합에서의 잔기들로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에서 치환되는 것인 BSP.
49. 제39항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 서열 번호 22 또는 24(T-20)의 잔기 W631, D632, I635, N636, N637, Y638, T639, S640, L641, L645, N65l, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에서 치환되는 것인 BSP.
50. 제1항, 제20항, 제24항 및 제34항 중 어느 한 항에 있어서, BSP가 그것의 수용체 또는 결합 상대에 대한 BSP의 친화도를 조절하는 1개 이상 아미노산 치환, 첨가 또는 결실을 포함하는 것인 BSP.
51. 제1항, 제20항, 제24항 및 제34항 중 어느 한 항에 있어서, BSP가 BSP의 안정성 또는 용해도를 증가시키는 1개 이상 아미노산 치환, 첨가 또는 결실을 포함하는 것인 BSP.
52. 제1항, 제20항, 제24항 및 제34항 중 어느 한 항에 있어서, BSP가 재조합 숙주 세포 또는 생체외 합성된 BSP의 발현을 증가시키는 1개 이상 아미노산 치환, 첨가 또는 결실을 포함하는 BSP.
53. 제1항, 제20항, 제24항 및 제34항 중 어느 한 항에 있어서, BSP가 BSP의 프로테아제 내성을 증가시키는 1개 이상 아미노산 치환, 첨가 또는 결실을 포함하는 BSP.
54. 제1항, 제20항, 제24항 및 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이, 폴리펩티드 내의 20개의 통상의 아미노산 중 임의의 것에 대해 다른 방식으로는 비반응성인 링커, 중합체 또는 생물학적으로 활성인 분자에 대해 반응성인 것인 BSP.
55. 제1항, 제20항, 제24항 및 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 카르보닐기, 아미노옥시기, 히드라진기, 히드라지드기, 세미카르바지드기, 아지드기 또는 알킨기를 포함하는 것인 BSP.
56. 제55항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 카르보닐기를 포함하는 것인 BSP.
57. 제56항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 구조:
Figure 112007014691585-PCT00046
(식 중에서, n은 0 내지 10이고; R1은 알킬, 아릴, 치환 알킬, 또는 치환 아릴이며; R2는 H, 알킬, 아릴, 치환 알킬, 및 치환 아릴이고; R3은 H, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 아미노 말단 변형기이며; R4는 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 카르복시 말단 변형기임)를 가지는 것인 BSP.
58. 제55항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 아미노옥시기를 포함하는 것인 BSP.
59. 제55항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 히드라지드기를 포함하는 것인 BSP.
60. 제55항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 히드라진기를 포함하는 것인 BSP.
61. 제55항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산 잔기가 세미카르바지드기를 포함하는 것인 BSP.
62. 제55항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산 잔기가 아지드기를 포함하는 것인 BSP.
63. 제62항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 하기 구조를 가지는 것인 BSP;
Figure 112007014691585-PCT00047
(식 중에서, n은 0 내지 10이고; R1은 알킬, 아릴, 치환 알킬, 치환 아릴이거나 존재하지 않으며; X은 O, N, S이거나 존재하지 않고; m은 0 내지 10이며; R2는 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 아미노 말단 변형기이고, R3은 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 카르복시 말단 변형기임).
64. 제55항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 알킨기를 포함하는 것인 BSP.
65. 제64항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 하기의 구조를 가지는 것인 BSP;
Figure 112007014691585-PCT00048
(식 중에서, n은 0 내지 10이고; R1은 알킬, 아릴, 치환 알킬, 또는 치환 아릴이며; X은 O, N, S이거나 존재하지 않고; m은 0 내지 10이며; R2는 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 아미노 말단 변형기이고; R3은 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 카르복시 말단 변형기임).
66. 제42항에 있어서, 수용성 중합체가 약 0.1 kDa 내지 약 100 kDa의 분자량을 가지는 것인 BSP.
67. 제66항에 있어서, 수용성 중합체가 약 0.1 kDa 내지 약 50 kDa의 분자량을 가지는 것인 BSP.
68. 제42항에 있어서, 카르보닐-함유 아미노산을 포함하는 BSP을, 아미노옥시, 히드라진, 히드라지드 또는 세미카르바지드기를 포함하는 수용성 중합체와 반응시킴으로써 제조되는 BSP.
69. 제68항에 있어서, 아미노옥시, 히드라진, 히드라지드 또는 세미카르바지드기가 아미드 연결기를 통해 수용성 중합체에 연결된 것인 BSP.
70. 제42항에 있어서, 카르보닐기를 포함하는 수용성 중합체를, 아미노옥시, 히드라진, 히드라지드 또는 세미카르바지드기를 포함하는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 폴리펩티드와 반응시킴으로써 제조되는 BSP.
71. 제42항에 있어서, 알킨-함유 아미노산을 포함하는 BSP를 아지드 부분을 포함하는 수용성 중합체와 반응시킴으로써 제조되는 BSP.
72. 제42항에 있어서, 아지드-함유 아미노산을 포함하는 BSP를 알킨 부분을 포함하는 수용성 중합체와 반응시킴으로써 제조되는 BSP.
73. 제55항에 있어서, 아지드 또는 알킨기가 아미드 연결기를 통해 수용성 중합체에 연결된 것인 BSP.
74. 제42항에 있어서, 수용성 중합체가 분지형 또는 다수 팔을 가진 중합체인 것인 BSP.
75. 제74항에 있어서, 수용성 중합체의 각 분지가 약 1 kDa 내지 약 100 kDa의 분자량을 가지는 것인 BSP.
76. 제39항에 있어서, 폴리펩티드가 길항자인 것인 BSP.
77. 제76항에 있어서, 폴리펩티드가 1개 이상 번역후 변형, 링커, 중합체 또는 생물학적으로 활성인 분자를 포함하는 것인 BSP.
78. 제77항에 있어서, 중합체가 수용성 중합체 및 폴리(에틸렌 글리콜)로 이루어진 군으로부터 선택되는 부분을 포함하는 것인 BSP.
79. 제39항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 당 부분을 포함하는 것인 BSP.
80. 제41항에 있어서, 링커, 중합체 또는 생물학적으로 활성인 분자가 당 부분을 통해 폴리펩티드에 연결된 것인 BSP.
81. 서열 번호 1, 2, 3, 21, 22, 23 또는 24을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 엄격한 조건 하에 하이브리드화하고, 하나 이상의 셀렉터 코돈을 가지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 핵산.
82. 제81항에 있어서, 셀렉터 코돈이 앰버 코돈, 오커 코돈, 오팔 코돈, 특유의 코돈, 희소 코돈, 및 4-염기 코돈으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단리된 핵산.
83. 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 단리된 BSP를, 비천연적으로 코딩된 아미노산과 반응하는 부분을 포함하는 링커, 중합체 또는 생물학적으로 활성인 분자와 접촉시키는 단계를 포함하는, 제41항의 BSP의 제조 방법.
84. 제83항에 있어서, 중합체가 수용성 중합체 및 폴리(에틸렌 글리콜)로 이루어진 군으로부터 선택되는 부분을 포함하는 것인 방법.
85. 제83항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 카르보닐기, 아미노옥시기, 히드라진기, 히드라지드기, 세미카르바지드기, 아지드기 또는 알킨기를 포함하는 것인 방법.
86. 제83항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 카르보닐 부분을 포함하고, 링커, 중합체 또는 생물학적으로 활성인 분자가 아미노옥시, 히드라진, 히드라지드 또는 세미카르바지드 부분을 포함하는 것인 방법.
87. 제86항에 있어서, 아미노옥시, 히드라진, 히드라지드 또는 세미카르바지드 부분이 아미드 연결기를 통해 링커, 중합체 또는 생물학적으로 활성인 분자에 연결된 것인 방법.
88. 제83항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 알킨 부분을 포함하고, 링커, 중합체 또는 생물학적으로 활성인 분자가 알킨 부분을 포함하는 것인 방법.
89. 제83항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 아지드 부분을 포함하고, 링커, 중합체 또는 생물학적으로 활성인 분자가 알킨 부분을 포함하는 것인 방법.
90. 제85항에 있어서, 아지드 또는 알킨 부분이 아미드 연결기를 통해 링커, 중합체 또는 생물학적으로 활성인 분자에 연결된 것인 방법.
91. 제84항에 있어서, 폴리(에틸렌 글리콜) 부분이 약 0.1 kDa 내지 약 100 kDa의 평균 분자량을 가지는 것인 방법.
92. 제84항에 있어서, 폴리(에틸렌 글리콜) 부분이 분지형 또는 다수 팔을 가지는 중합체인 것인 방법.
93. 제39항의 BSP 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
94. 제93항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 수용성 중합체에 연결된 것인 조성물.
95. 치료 유효량의 제93항의 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, BSP에 의해 조절되는 장애를 갖는 환자의 치료 방법.
96. 제81항의 핵산을 포함하는 세포.
97. 제96항에 있어서, 직교성 tRNA 합성효소 또는 직교성 tRNA를 포함하는 세포.
98. 셀렉터 코돈을 포함하는 BSP를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드들, 직교성 RNA 합성효소 및 직교성 tRNA를 포함하는 세포를, 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 BSP의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양하는 단계; 및 BSP를 정제하는 단계들을 포함하는, 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 BSP의 제조 방법.
99. BSP에서 1개 이상 천연 발생 아미노산을 1개 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환하는 단계를 포함하는 BSP의 혈청 반감기 또는 순환기의 조절 방법.
100. 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 BSP로서, 상기 폴리뉴클레오티드가 셀렉터 코돈을 포함하고, 상기 폴리펩티드가 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 것인 BSP.
101. 제100항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 링커, 중합체 또는 생물학적으로 활성인 분자에 연결된 것인 BSP.
101. 제101항에 있어서, 수용성 중합체가 폴리(에틸렌 글리콜) 부분을 포함하는 것인 BSP.
102. 제100항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 카르보닐기, 아미노옥시기, 히드라진기, 히드라지드기, 세미카르바지드기, 아지드기 또는 알킨기를 포함하는 것인 BSP.
103. 제101항에 있어서, 폴리(에틸렌 글리콜) 부분이 약 0.1 kDa 내지 약 100 kDa의 분자량을 가지는 것인 BSP.
104. 제101항에 있어서, 폴리(에틸렌 글리콜) 부분이 분지형 또는 다수 팔을 가진 중합체인 것인 BSP.
105. 제104항에 있어서, 폴리(에틸렌 글리콜) 부분이 약 1 kDa 내지 약 100 kDa의 분자량을 가지는 것인 BSP.
106. 제100항의 BSP 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
107. 단일 아미노산에서 BSP에 공유 결합에 의해 연결된 수용성 중합체를 포함하는 BSP.
108. 제107항에 있어서, 수용성 중합체가 폴리(에틸렌 글리콜) 부분을 포함하는 것인 BSP.
109. 제107항에 있어서, 수용성 중합체에 공유 결합으로 연결된 아미노산이 비천연적으로 코딩된 아미노산인 것인 BSP.
110. 제48항에 있어서, 상기 비천연적으로 코딩된 아미노산이 폴리(에틸렌 글리콜) 분자에 연결된 것인 BSP.
111. 제49항에 있어서, 상기 비천연적으로 코딩된 아미노산이 폴리(에틸렌 글리콜) 분자에 연결된 것인 BSP.
112. 하나 이상의 링커, 중합체 또는 생물학적으로 활성인 분자를 포함하는 BSP로서, 링커, 중합체, 또는 생물학적으로 활성인 분자가 폴리펩티드에 리보솜형으로 혼입된 비천연적으로 코딩된 아미노산의 작용기를 통해 폴리펩티드에 부착된 것인 BSP.
113. 제112항에 있어서, 상기 BSP가 모노PEG화된 것인 BSP.
114. 1개 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산에 부착된 링커, 중합체, 또는 생물학적으로 활성인 분자를 포함하는 BSP로서, 상기 비천연적으로 코딩된 아미노산이 예비선택된 부위에 폴리펩티드로 리보솜형으로 혼입된 것인 BSP.
115. 제114항에 있어서, 하나의 상기 링커, 중합체, 또는 생물학적으로 활성인 분자를 포함하는 것인 BSP.
116. 제1항, 제20항, 제24항 및 제34항 중 어느 한 항에 있어서, BSP의 면역원성을 조절하는 1개 이상 아미노산 치환, 첨가 또는 결실을 포함하는 것인 BSP.
117. 제1항, 제20항, 제24항 및 제34항 중 어느 한 항에 있어서, BSP의 혈청 반감기 또는 순환기를 조절하는 1개 이상 아미노산 치환, 첨가 또는 결실을 포함하는 것인 BSP.
118. BSP 내의 1개 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 임의의 1개 이상의 천연 발생 아미노산을 치환하는 단계를 포함하는, BSP의 면역원성의 조절 방법.
119. 폴리펩티드가 서열 번호 1, 2, 3, 21, 22, 23, 24 및 그것의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 BSP.
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Keefe, William M. <120> Biosynthetic Polypeptides Utilizing Non-Naturally Encoded Amino Acids <130> AMBX-0041.00PCT <150> 60/590,035 <151> 2004-07-21 <150> 60/659,709 <151> 2005-03-07 <160> 28 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30 <210> 2 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 3 <211> 39 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 4 <211> 77 <212> DNA <213> Methanococcus jannaschii <400> 4 ccggcggtag ttcagcaggg cagaacggcg gactctaaat ccgcatggcg ctggttcaaa 60 tccggcccgc cggacca 77 <210> 5 <211> 88 <212> DNA <213> Halobacterium sp. NRC-1 <400> 5 cccagggtag ccaagctcgg ccaacggcga cggactctaa atccgttctc gtaggagttc 60 gagggttcga atcccttccc tgggacca 88 <210> 6 <211> 89 <212> DNA <213> Halobacterium sp. 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Asp Glu Lys Ser Ala Ala 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Glu Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Gly Gly His 145 150 155 160 Tyr Leu Gly Val Asp Val Ile Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 19 <211> 306 <212> PRT <213> Methanococcus jannaschii <400> 19 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Ala 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Arg Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Val Ile His 145 150 155 160 Tyr Asp Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 20 <211> 306 <212> PRT <213> Methanococcus jannaschii <400> 20 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Gly 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Thr Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Thr Tyr Tyr 145 150 155 160 Tyr Leu Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 21 <211> 39 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 22 <211> 36 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <400> 22 Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln 1 5 10 15 Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu 20 25 30 Trp Asn Trp Phe 35 <210> 23 <211> 34 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 24 <211> 44 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <400> 24 Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu 1 5 10 15 Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu 20 25 30 Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn Trp Phe 35 40 <210> 25 <211> 107 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 25 Lys Ala Ile Phe Val Leu Lys Gly Ser Leu Asp Arg Asp Leu Asp Ser 1 5 10 15 Arg Ile Glu Leu Glu Leu Arg Thr Asp His Lys Glu Leu Ser Glu His 20 25 30 Leu Leu Leu Val Asp Leu Ala Arg Asn Asp Leu Ala Arg Ile Ala Thr 35 40 45 Pro Gly Ser Arg Tyr Val Ala Asp Leu Thr Lys Val Asp Arg Tyr Ser 50 55 60 Tyr Val Leu His Leu Val Ser Arg Val Val Gly Glu Leu Arg His Asp 65 70 75 80 Leu Asp Ala Leu His Ala Tyr Arg Ala Ala Leu Asn Leu Gly Thr Leu 85 90 95 Ser Gly Ala Pro Lys Val Arg Ala Lys Leu Trp 100 105 <210> 26 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 26 aagctttgga tgtacacaag tttaatacac tcc 33 <210> 27 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 27 gcggatccca ttaaaaccaa ttccacaaac ttgc 34 <210> 28 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 28 cgaagctttg gatggagtgg gatagagaaa ttaacaatta cacaagttta atacactcc 59

Claims (26)

  1. 식 (LT)-P-T'을 포함하는 폴리펩타이드;
    (식 중에서,
    (LT)는 국지화 펩티드(L), 택 또는 링커(T), 국지화 펩티드(L)와 택 또는 링커(T)(임의의 순서), 메티오닌으로 이루어진 군으로부터 선택되거나 부재하고;
    P는 BSP 서열을 포함하며;
    T'는 택 또는 링커를 포함하거나, 부재하며,
    여기에서 L, T, P, 또는 T'는 1개 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함함).
  2. 식 F-(LT)-P-T'-F'을 포함하는 폴리펩티드;
    (식 중에서, F는 폴리펩티드 서열을 포함하거나 부재하고;
    (LT)는 국지화 펩티드(L), 택 또는 링커(T), 국지화 펩티드(L)와 택 또는 링커(T)(임의의 순서), 메티오닌으로 이루어진 군으로부터 선택되거나 부재하고;
    P는 100개 이하의 아미노산을 가지는 원하는 폴리펩티드 서열을 포함하고, F 또는 F'와 상이하며;
    T'는 택 또는 링커를 포함하거나 부재하며;
    F'는 폴리펩티드 서열을 포함하거나 부재하며,
    여기에서, F, L, T, P, T' 또는 F'는 1개 이상의 비천연적으로 코딩된 아미 노산을 포함함).
  3. 제2항에 있어서, P가 1개 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 BSP를 추가로 포함하는 것인 폴리펩티드.
  4. 폴리펩티드 코딩 서열에 작용적으로 연결된 프로모터 서열을 포함하는 핵산 분자로서,
    상기 폴리펩티드 코딩 서열이 식 (WX)-Z(식 중에서,
    (WX)는 국지화 펩티드(W)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 택 또는 링커(X)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 국지화 펩티드(W)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 택 또는 링커(X)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(임의의 순서임)으로 이루어진 군으로부터 선택되거나 부재하고;
    Z는 원하는 BSP를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며,
    여기에서 W, X 또는 Z를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 셀렉터 코돈을 포함함)을 가지는 것인 핵산 분자.
  5. 제4항에 있어서, Z에 작용적으로 연결된 -Y'(여기에서, Y'는 택을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기에서 상기 택을 코딩하는 상기 뉴클레오티드 서열은 임의적으로 셀렉터 코돈을 포함함)를 추가로 포함하는 핵산 분자.
  6. 제4항 또는 제5항의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
  7. 제6항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  8. a) 식 (LT)-P-T'을 포함하는 폴리펩티드를 재조합 숙주 세포에서 생성시키는 단계
    (식 중에서,
    (LT)는 국지화 펩티드(L), 택 또는 링커(T), 국지화 펩티드(L)와 택 또는 링커(T)(임의의 순서), 메티오닌으로 이루어진 군으로부터 선택되거나 부재하고;
    P는 BSP 서열을 포함하며;
    T'는 택 또는 링커를 포함하거나 부재하며,
    여기에서 L, T, P 또는 T'는 선택된 조건 하에서 1개 이상의 펩티드 결합을 절단하도록 결정된 작용기를 갖는 1개 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함함);
    b) 1개 이상의 펩티드 결합을 적어도 부분적으로 절단하기에 충분한 시간 동안 선택 조건 하에서 폴리펩티드를 반응시키는 단계;
    c) 반응 생성물로부터 P를 포함하는 펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 방법.
  9. 1개 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 BSP.
  10. 제9항에 있어서, 1개 이상의 전사후 변형을 포함하는 BSP.
  11. 제9항에 있어서, 폴리펩티드가 링커, 중합체 또는 생물학적 활성 분자에 연결된 것인 BSP.
  12. 제9항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 서열번호 2(GLP-1)로부터의 위치 7(즉, N 말단)의 첫 번째 아미노산 앞, 7H, 8A, 9E, V16, 17S, 18S, 19Y, 20L, 21E, 22G, 23Q, 24A, 25A, 26K, 27E, 28F, 29I, 30A, 31W, 32L, 33V, 34K, 35G, 36R, 37G, 위치 38(즉, 카르복실 말단)의 부가, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에서 치환된 것인 BSP.
  13. 제9항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 서열번호 22 또는 24(T-20)로부터의 잔기들 W631, D632, I635, N636, N637, Y638, T639, S640, L641, L645, N651, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에서 치환된 것인 BSP.
  14. 엄격한 (stringent) 조건 하에서 서열번호 1, 2, 3, 21, 22, 23 또는 24를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 핵산으로서, 폴리뉴클레오티드가 1개 이상의 셀렉터 코돈을 포함하는 것인 핵산.
  15. 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 단리된 BSP를, 비천연 코딩된 아미노산과 반응하는 부분을 포함하는 링커, 중합체 또는 생물학적 활성 분자와 접촉시키는 단계를 포함하는, 제11항의 BSP의 제조 방법.
  16. 제9항의 BSP 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
  17. 치료 유효량의 제16항의 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, BSP에 의해 조절되는 장애를 갖는 환자의 치료 방법.
  18. 제14항의 핵산을 포함하는 세포.
  19. 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 BSP의 발현을 허용하는 조건 하에서, 셀렉터 코돈을 포함하는 BSP를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드들, 직교성 (orthogonal) RNA 합성효소 및 직교성 tRNA를 포함하는 세포를 배양하는 단계; 및 BSP를 정제하는 단계를 포함하는, 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 BSP의 제조 방법.
  20. BSP에서 임의의 1개 이상의 천연 발생 아미노산을 1개 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환하는 단계를 포함하는, BSP의 혈청 반감기 또는 순환기를 조절하는 방법.
  21. 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 BSP로서, 상기 폴리뉴클레오티드가 셀렉터 코돈을 포함하고, 상기 폴리펩티드가 1개 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 것인 BSP.
  22. 제21항의 BSP 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
  23. 단일 아미노산에서 공유 결합에 의해 BSP에 연결된 수용성 중합체를 포함하는 BSP.
  24. 1개 이상의 링커, 중합체 또는 생물학적 활성 분자를 포함하는 BSP로서, 상기 링커, 중합체 또는 생물학적 활성 분자가 폴리펩티드에 리보솜형으로 혼입된 비천연적으로 코딩된 아미노산의 작용기를 통해 폴리펩티드에 부착된 것인 BSP.
  25. 1개 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산에 부착된 링커, 중합체 또는 생물학적 활성 분자를 포함하는 BSP로서, 상기 비천연적으로 코딩된 아미노산이 예비선택된 부위에서 폴리펩티드에 리보솜형으로 혼입된 것인 BSP.
  26. 폴리펩티드가 서열번호 1, 2, 3, 21, 22, 23, 24, 및 그것의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 BSP.
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