CN105349547A - 一种提高家蚕蛹体重量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高家蚕蛹体重量的方法。从五龄家蚕丝腺中提取总RNA，逆转录获得第1链cDNA，并以其为模板Rt-PCR扩增，克隆获得BmCrzR？cDNA，并以其为模板PCR扩增，酶切后将DNA片段连接载体获得pFLAG-BmCrzR，再以其为模板PCR扩增获得反应模板，将反应模板与T7反应缓冲液、ATP液、CTP液、GTP液、UTP溶液和T7酶混合反应并进一步处理得到BmCrzR？dsRNA；最终将BmCrzR？dsRNA注射入五龄家蚕幼虫腹部，桑叶饲养至成熟结茧，家蚕蛹体体重增加。本发明提高家蚕蛹体重量的方法，是不增加蚕食桑量通过调控家蚕代谢来实现的，这对于研究家蚕的物质与能量代谢机制、进一步提高家蚕生理机能等，具有积极作用。

Description

一种提高家蚕蛹体重量的方法

技术领域

本发明涉及了一种提高蚕重量的方法，尤其是涉及了一种提高家蚕蛹体重量的方法。

背景技术

家蚕(Bombyxmori)是当今地球上室内饲养量最大的经济资源昆虫，它从桑叶(饲料)中摄取各种营养物质，并通过代谢生理过程供给蚕体内各个组织器官而进行生长、发育、繁殖等。家蚕大规模饲养分为蚕茧生产和蚕种生产二种类型，蚕种生产的主要目的是获取优质、高产的蚕卵，它与家蚕蛹体生长与代谢生理过程调控密切相关。

神经肽在昆虫的物质能量代谢等重要生理过程调控中发挥重要作用。在家蚕中存在有近40种神经肽，Corazonin是其中之一，其生理功能由Ventra于1989首次鉴定，并由Hua等于2000年首次在家蚕中分离到。家蚕Corazonin的作用是通过家蚕Corazonin受体(BmCrzR)来介导的，但有关BmCrzR介导Corazonin作用，来调控家蚕蛹生长与物质能量代谢等，均缺乏研究。

发明内容

为了解决背景技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种提高家蚕蛹体重量的方法，是采用Rt-PCR克隆，PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳回收，与哺乳动物表达载体pFlag-CMV-3'连接，与T7反应缓冲液、ATP液、CTP液、GTP液、UTP溶液、T7酶混合反应，再给家蚕幼虫腹部注射的方法，通过调控家蚕物质能量代谢，提高家蚕蛹体重量。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：

1)解剖并收集五龄第3-4天的家蚕丝腺，从中提取总RNA，然后逆转录获得第1链cDNA；

2)然后以第1链cDNA为模板通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增，克隆获得家蚕Corazonin受体(BmCrzR)cDNA；

3)再以BmCrzRcDNA为模板，通过PCR扩增得到BmCrzRDNA片段，琼脂糖凝胶电泳回收目的DNA片段，经HindIII/BamHI酶切后，与哺乳动物表达载体pFlag-CMV-3'连接，获得pFLAG-BmCrzR；

4)以pFLAG-BmCrzR为模板，通过PCR扩增得到pFLAG-BmCrzRDNA片段，琼脂糖凝胶电泳回收得到纯化的大小为893bp的目的DNA片段，作为反应模板；

5)将反应模板与10×T7反应缓冲液、ATP液、CTP液、GTP液、UTP溶液、T7酶混合进行反应，然后再进行多次处理得到BmCrzRdsRNA；

6)给五龄第2-3天家蚕幼虫腹部注射10-20μgBmCrzRdsRNA，用桑叶饲养至成熟结茧，获得重量增加的家蚕蛹体。

所述步骤1)具体为：解剖并收集五龄第3-4天的家蚕丝腺，使用Trizol试剂盒提取总RNA，再用逆转录第1链cDNA合成试剂对总RNA进行逆转录；其逆转录条件是：65℃变性5min，42℃反应60min，70℃灭活15min，获得第1链cDNA。

所述步骤2)具体为：以第1链cDNA为模板，分别用正向引物5’-AAGCTTGCCACCATGGACAACGAAGGCAACAGTAC-3’(如SEQIDNO.1的引物1)和反向引物5’-GGATCCCGTAACAAACTAATGTTCTGTCCATTCG-3’(如SEQIDNO.2的引物2)，进行逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增，克隆获得家蚕Corazonin受体(BmCrzR)cDNA。

所述的逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增条件是：94℃预变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，进行30个循环。

所述步骤3)得到BmCrzRDNA片段具体采用以下方式为：以BmCrzRcDNA为模板，分别用正向引物5’-AAGCTTATGGACAACGAAGGCAACAGTAC-3’(如SEQIDNO.3的引物3)和反向引物5’-GGATCCTTATAACAAACTAATGTTCTGTCCAT-3’(如SEQIDNO.4的引物4)，进行PCR扩增，其PCR扩增条件是：94℃预变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环，加rTaq酶继续延伸15min，得到DNA片段。

所述步骤4)得到pFLAG-BmCrzRDNA片段具体采用以下方式为：以pFLAG-BmCrzR为模板，设计使用2个特异性引物5′-AAGCTTATGAACTCAGAAACAATAAACGACAC-3′(如SEQIDNO.5的引物5)和5′-GGATCCTTAACAGTTCGTGTTGAAGTATGTTTC-3′(如SEQIDNO.6的引物6)，进行PCR扩增，其PCR扩增条件是：94℃预变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，得到DNA片段。

所述步骤5)具体为：

5.1)在一试管内依次加入1-2μg反应模板、2μL10×T7反应缓冲液、2μLATP液、2μLCTP液、2μLGTP液、2μLUTP溶液和2μLT7酶混合物；

5.2)补充无核酸酶的双蒸馏水至20μL，充分混合，放置于37℃反应16h，冷却至常温；

5.3)在上述混合液中加入1μLTURBODNA酶，混匀后，37℃下孵育15min，以消化多余的反应模板；

5.4)再加入30μL无核酸酶的双蒸馏水、30μL7.5M氯化锂和50mMEDTA，终止反应；

5.5)于4℃下15000rpm离心15min，除去上清液，加入1mL70％乙醇洗涤；

5.6)于4℃下15000rpm离心15min，除去70％乙醇上清液，将沉淀用无核酸酶的双蒸馏水溶解，得到BmCrzRdsRNA。

通过大量实验证实在不增加蚕食桑量的情况下，采用本发明的化蛹第2-5天蚕蛹体重较对照区未采用本发明的蚕蛹体重增加约18％。

本发明具有的有益效果是：

本发明提高家蚕蛹体重量的方法，是不增加蚕食桑量，通过调控家蚕代谢来实现的，这对于研究家蚕的物质与能量代谢机制、进一步提高家蚕生理机能等，具有积极作用。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：

从五龄第4天的家蚕丝腺中提取总RNA，然后逆转录获得第1链cDNA：解剖并收集五龄第4天的家蚕丝腺，使用Trizol试剂盒提取总RNA，再用逆转录第1链cDNA合成试剂对总RNA进行逆转录；其逆转录条件是：65℃变性5min，42℃反应60min，70℃灭活15min，获得第1链cDNA。

以第1链cDNA为模板，分别用正向引物5’-AAGCTTGCCACCATGGACAACGAAGGCAACAGTAC-3’和反向引物5’-GGATCCCGTAACAAACTAATGTTCTGTCCATTCG-3’，进行逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增，克隆获得家蚕Corazonin受体(BmCrzR)cDNA。RT-PCR扩增条件是：94℃预变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，进行30个循环。

以BmCrzRcDNA为模板，分别用正向引物5’-AAGCTTATGGACAACGAAGGCAACAGTAC-3’和反向引物5’-GGATCCTTATAACAAACTAATGTTCTGTCCAT-3’，进行PCR扩增，其PCR扩增条件是：94℃预变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环，加rTaq酶继续延伸15min，得到DNA片段。琼脂糖凝胶电泳回收目的DNA片段，经HindIII/BamHI酶切后，与哺乳动物表达载体pFlag-CMV-3'连接，获得pFLAG-BmCrzR。

以pFLAG-BmCrzR为模板，使用两个特异性引物5′-AAGCTTATGAACTCAGAAACAATAAACGACAC-3′(引物1)和5′-GGATCCTTAACAGTTCGTGTTGAAGTATGTTTC-3′(引物2)进行PCR扩增，其PCR扩增条件是：94℃预变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，得到DNA片段。琼脂糖凝胶电泳回收得到纯化的大小为893bp的目的DNA片段，作为反应模板。

在一试管内依次加入2μg反应模板、2μL10×T7反应缓冲液、2μLATP液、2μLCTP液、2μLGTP液、2μLUTP溶液和2μLT7酶混合物(上述原料来源于TaKaRa公司)；接着补充无核酸酶的双蒸馏水至20μL，充分混合，放置于37℃反应16h，冷却至常温；接着在上述混合液中加入1μLTURBODNA酶(上述原料来源于TaKaRa公司)，混匀后，37℃下孵育15min；接着再加入30μL无核酸酶的双蒸馏水、30μL7.5M氯化锂和50mMEDTA，终止反应；接着于4℃下15000rpm离心15min，除去上清液，加入1mL70％乙醇洗涤；接着于4℃下15000rpm离心15min，除去70％乙醇上清液，将沉淀用无核酸酶的双蒸馏水溶解，得到BmCrzRdsRNA。

将得到的10μgBmCrzRdsRNA注射入五龄第2天家蚕幼虫腹部，桑叶饲养至成熟结茧，化蛹第2天蚕蛹体重较对照区蚕蛹体重增加17.3％。

实施例2：

从五龄第3天的家蚕丝腺中提取总RNA，然后逆转录获得第1链cDNA：解剖并收集五龄第3天的家蚕丝腺，使用Trizol试剂盒提取总RNA，再用逆转录第1链cDNA合成试剂对总RNA进行逆转录；其逆转录条件是：65℃变性5min，42℃反应60min，70℃灭活15min，获得第1链cDNA。

以第1链cDNA为模板，分别用正向引物5’-AAGCTTGCCACCATGGACAACGAAGGCAACAGTAC-3’和反向引物5’-GGATCCCGTAACAAACTAATGTTCTGTCCATTCG-3’，进行逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增，克隆获得家蚕Corazonin受体(BmCrzR)cDNA。RT-PCR扩增条件是：94℃预变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，进行30个循环。

以BmCrzRcDNA为模板，分别用正向引物5’-AAGCTTATGGACAACGAAGGCAACAGTAC-3’和反向引物5’-GGATCCTTATAACAAACTAATGTTCTGTCCAT-3’，进行PCR扩增，其PCR扩增条件是：94℃预变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环，加rTaq酶继续延伸15min，得到DNA片段。琼脂糖凝胶电泳回收目的DNA片段，经HindIII/BamHI酶切后，与哺乳动物表达载体pFlag-CMV-3'连接，获得pFLAG-BmCrzR。

以pFLAG-BmCrzR为模板，使用两个特异性引物5′-AAGCTTATGAACTCAGAAACAATAAACGACAC-3′(引物1)和5′-GGATCCTTAACAGTTCGTGTTGAAGTATGTTTC-3′(引物2)进行PCR扩增，其PCR扩增条件是：94℃预变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，得到DNA片段。琼脂糖凝胶电泳回收得到纯化的大小为893bp的目的DNA片段，作为反应模板。

在一试管内依次加入1μg反应模板、2μL10×T7反应缓冲液、2μLATP液、2μLCTP液、2μLGTP液、2μLUTP溶液和2μLT7酶混合物(上述原料来源于TaKaRa公司)；接着补充无核酸酶的双蒸馏水至20μL，充分混合，放置于37℃反应16h，冷却至常温；接着在上述混合液中加入1μLTURBODNA酶(上述原料来源于TaKaRa公司)，混匀后，37℃下孵育15min；接着再加入30μL无核酸酶的双蒸馏水、30μL7.5M氯化锂和50mMEDTA，终止反应；接着于4℃下15000rpm离心15min，除去上清液，加入1mL70％乙醇洗涤；接着于4℃下15000rpm离心15min，除去70％乙醇上清液，将沉淀用无核酸酶的双蒸馏水溶解，得到BmCrzRdsRNA。

将得到的15μgBmCrzRdsRNA注射入五龄第3天家蚕幼虫腹部，桑叶饲养至成熟结茧，化蛹第4天蚕蛹体重较对照区蚕蛹体重增加18.2％。

实施例3：

从五龄第4天的家蚕丝腺中提取总RNA，然后逆转录获得第1链cDNA：解剖并收集五龄第4天的家蚕丝腺，使用Trizol试剂盒提取总RNA，再用逆转录第1链cDNA合成试剂对总RNA进行逆转录；其逆转录条件是：65℃变性5min，42℃反应60min，70℃灭活15min，获得第1链cDNA。

以第1链cDNA为模板，分别用正向引物5’-AAGCTTGCCACCATGGACAACGAAGGCAACAGTAC-3’和反向引物5’-GGATCCCGTAACAAACTAATGTTCTGTCCATTCG-3’，进行逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增，克隆获得家蚕Corazonin受体(BmCrzR)cDNA。RT-PCR扩增条件是：94℃预变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，进行30个循环。

以BmCrzRcDNA为模板，分别用正向引物5’-AAGCTTATGGACAACGAAGGCAACAGTAC-3’和反向引物5’-GGATCCTTATAACAAACTAATGTTCTGTCCAT-3’，进行PCR扩增，其PCR扩增条件是：94℃预变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环，加rTaq酶继续延伸15min，得到DNA片段。琼脂糖凝胶电泳回收目的DNA片段，经HindIII/BamHI酶切后，与哺乳动物表达载体pFlag-CMV-3'连接，获得pFLAG-BmCrzR。

以pFLAG-BmCrzR为模板，使用两个特异性引物5′-AAGCTTATGAACTCAGAAACAATAAACGACAC-3′(引物1)和5′-GGATCCTTAACAGTTCGTGTTGAAGTATGTTTC-3′(引物2)进行PCR扩增，其PCR扩增条件是：94℃预变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，得到DNA片段。琼脂糖凝胶电泳回收得到纯化的大小为893bp的目的DNA片段，作为反应模板。

在一试管内依次加入1μg反应模板、2μL10×T7反应缓冲液、2μLATP液、2μLCTP液、2μLGTP液、2μLUTP溶液和2μLT7酶混合物(上述原料来源于TaKaRa公司)；接着补充无核酸酶的双蒸馏水至20μL，充分混合，放置于37℃反应16h，冷却至常温；接着在上述混合液中加入1μLTURBODNA酶(上述原料来源于TaKaRa公司)，混匀后，37℃下孵育15min；接着再加入30μL无核酸酶的双蒸馏水、30μL7.5M氯化锂和50mMEDTA，终止反应；接着于4℃下15000rpm离心15min，除去上清液，加入1mL70％乙醇洗涤；接着于4℃下15000rpm离心15min，除去70％乙醇上清液，将沉淀用无核酸酶的双蒸馏水溶解，得到BmCrzRdsRNA。

将得到的20μgBmCrzRdsRNA注射入五龄第2天家蚕幼虫腹部，桑叶饲养至成熟结茧，化蛹第5天蚕蛹体重较对照区蚕蛹体重增加18.6％。

由上述实施例可见，本发明通过调控家蚕代谢方式提高了家蚕蛹体重量，技术效果显著，这对于研究家蚕的物质与能量代谢机制、进一步提高家蚕生理机能等，具有积极作用。

本申请涉及到的序列表：

SEQIDNO.1：引物1

来源：人工合成

5’-AAGCTTGCCACCATGGACAACGAAGGCAACAGTAC-3’

SEQIDNO.2：引物2

来源：人工合成

5’-GGATCCCGTAACAAACTAATGTTCTGTCCATTCG-3’

SEQIDNO.3：引物3

来源：人工合成

5’-AAGCTTATGGACAACGAAGGCAACAGTAC-3’

SEQIDNO.4：引物4

来源：人工合成

5’-GGATCCTTATAACAAACTAATGTTCTGTCCAT-3’

SEQIDNO.5：引物5

来源：人工合成

5′-AAGCTTATGAACTCAGAAACAATAAACGACAC-3’

SEQIDNO.6：引物6

来源：人工合成

5′-GGATCCTTAACAGTTCGTGTTGAAGTATGTTTC-3’

Claims (7)

1.一种提高家蚕蛹体重量的方法，其特征在于：

1)解剖并收集五龄第3-4天的家蚕丝腺，从中提取总RNA，然后逆转录获得第1链cDNA；

2)以第1链cDNA为模板，通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增，克隆获得家蚕Corazonin受体(BmCrzR)cDNA；

3)再以BmCrzRcDNA为模板，通过PCR扩增得到BmCrzRDNA片段，琼脂糖凝胶电泳回收目的DNA片段，经HindIII/BamHI酶切后，与哺乳动物表达载体pFlag-CMV-3'连接，获得pFLAG-BmCrzR；

4)以pFLAG-BmCrzR为模板，通过PCR扩增得到pFLAG-BmCrzRDNA片段，琼脂糖凝胶电泳回收得到纯化的大小为893bp的目的DNA片段，作为反应模板；

5)将反应模板与10×T7反应缓冲液、ATP液、CTP液、GTP液、UTP溶液、T7酶混合进行反应，然后再进行多次处理得到BmCrzRdsRNA；

6)给五龄第2-3天家蚕幼虫腹部注射10-20μgBmCrzRdsRNA，用桑叶饲养至成熟结茧，获得重量增加的家蚕蛹体。

2.根据权利要求1所述的一种提高家蚕蛹体重量的方法，其特征在于：

所述步骤1)具体为：解剖并收集五龄第3-4天的家蚕丝腺，使用Trizol试剂盒提取总RNA，再用逆转录第1链cDNA合成试剂对总RNA进行逆转录；其逆转录条件是：65℃变性5min，42℃反应60min，70℃灭活15min，获得第1链cDNA。

3.根据权利要求1所述的一种提高家蚕蛹体重量的方法，其特征在于：

所述步骤2)具体为：以第1链cDNA为模板，分别用正向引物5’-AAGCTTGCCACCATGGACAACGAAGGCAACAGTAC-3’和反向引物5’-GGATCCCGTAACAAACTAATGTTCTGTCCATTCG-3’进行逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增，克隆获得家蚕Corazonin受体(BmCrzR)cDNA。

4.根据权利要求3所述的一种提高家蚕蛹体重量的方法，其特征在于：

所述的逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增条件是：94℃预变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，进行30个循环。

5.根据权利要求1所述的一种提高家蚕蛹体重量的方法，其特征在于：

所述步骤3)得到BmCrzRDNA片段具体采用以下方式为：以BmCrzRcDNA为模板，分别用正向引物5’-AAGCTTATGGACAACGAAGGCAACAGTAC-3’和反向引物5’-GGATCCTTATAACAAACTAATGTTCTGTCCAT-3’进行PCR扩增，其PCR扩增条件是：94℃预变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环，加rTaq酶继续延伸15min，得到DNA片段。

6.根据权利要求1所述的一种提高家蚕蛹体重量的方法，其特征在于：所述步骤4)得到pFLAG-BmCrzRDNA片段具体采用以下方式为：以pFLAG-BmCrzR为模板，分别用两个特异性引物5′-AAGCTTATGAACTCAGAAACAATAAACGACAC-3′和5′-GGATCCTTAACAGTTCGTGTTGAAGTATGTTTC-3′进行PCR扩增，其PCR扩增条件是：94℃预变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，得到DNA片段。

7.根据权利要求1所述的一种提高家蚕蛹体重量的方法，其特征在于：所述步骤5)具体为：

5.1)在一试管内依次加入1-2μg反应模板、2μL10×T7反应缓冲液、2μLATP液、2μLCTP液、2μLGTP液、2μLUTP溶液和2μLT7酶混合物；

5.2)补充无核酸酶的双蒸馏水至20μL，充分混合，放置于37℃反应16h，冷却至常温；

5.3)在上述混合液中加入1μLTURBODNA酶，混匀后，37℃下孵育15min；

5.4)再加入30μL无核酸酶的双蒸馏水、30μL7.5M氯化锂和50mMEDTA，终止反应；

5.5)于4℃下15000rpm离心15min，除去上清液，加入1mL70％乙醇洗涤；

5.6)于4℃下15000rpm离心15min，除去70％乙醇上清液，将沉淀用无核酸酶的双蒸馏水溶解，得到BmCrzRdsRNA。