CN108048464B - 一种让一化性品种家蚕产非滞育卵的siRNA、制备方法及应用 - Google Patents

一种让一化性品种家蚕产非滞育卵的siRNA、制备方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108048464B
CN108048464B CN201711374286.XA CN201711374286A CN108048464B CN 108048464 B CN108048464 B CN 108048464B CN 201711374286 A CN201711374286 A CN 201711374286A CN 108048464 B CN108048464 B CN 108048464B
Authority
CN
China
Prior art keywords
dhr
silkworm
sirna
diapause
template
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201711374286.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN108048464A (zh
Inventor
时连根
沈张飞
蒋学
费建明
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang University ZJU
Original Assignee
Zhejiang University ZJU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang University ZJU filed Critical Zhejiang University ZJU
Priority to CN201711374286.XA priority Critical patent/CN108048464B/zh
Publication of CN108048464A publication Critical patent/CN108048464A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108048464B publication Critical patent/CN108048464B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/033—Rearing or breeding invertebrates; New breeds of invertebrates
    • A01K67/0333—Genetically modified invertebrates, e.g. transgenic, polyploid
    • A01K67/0337—Genetically modified Arthropods
    • A01K67/0339—Genetically modified insects, e.g. Drosophila melanogaster, medfly
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/05—Animals modified by non-integrating nucleic acids, e.g. antisense, RNAi, morpholino, episomal vector, for non-therapeutic purpose
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/70—Invertebrates
    • A01K2227/706—Insects, e.g. Drosophila melanogaster, medfly
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/02—Animal zootechnically ameliorated
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/50—Biochemical production, i.e. in a transformed host cell

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种让一化性品种家蚕产非滞育卵的siRNA、制备方法及应用。从化蛹第3天的雌蚕蛹卵巢中提取总RNA，逆转录获得第1链cDNA，并RT‑PCR扩增克隆获得Bm.DHR cDNA；以Bm.DHR cDNA为模板PCR扩增，酶切后将DNA片段连接载体获得pFLAG‑Bm.DHR，再PCR扩增获得反应模板，将反应模板进一步处理得到Bm.DHR siRNA；将Bm.DHR siRNA液过滤膜除菌，注射入每代均产滞育卵的一化性品种家蚕化蛹后2‑3天的雌蚕蛹腹部，化蛾后正常交配，产下非滞育卵。本发明让一化性品种家蚕产非滞育卵，对于研究家蚕胚胎滞育机制、进一步利用家蚕胚胎滞育进行传统养蚕业的技术革新与经济效益提高等，具有积极作用。

Description

一种让一化性品种家蚕产非滞育卵的siRNA、制备方法及应用
技术领域
本发明涉及了一种让一化性品种家蚕产非滞育卵的siRNA、制备方法及应用。
背景技术
滞育(Diapause)是昆虫在个体发育的某个特定阶段主动停止发育的一种现象，它作为一种遗传特性，在昆虫的生存、进化、繁荣等中发挥着重要的作用。家蚕(Bombyx mori)为卵滞育型，一化性(univoltine)品种蚕每代都产滞育卵。滞育卵需要经过长时间低温处理等才能解除其滞育，这给一年多次养蚕带来不便。所以对家蚕滞育现象的研究，一直为人们所关注。
蚕卵是否发生滞育，主要取决于蛹期由咽下神经节(Subpharyngeal ganglion，SG)合成和分泌的滞育激素(Diapause hormone，DH)作用。当合成和分泌的DH作用于卵巢和发育中蚕卵，引起多种基因表达上调，从而改变蚕卵内的物质代谢，成为滞育卵。家蚕DH的作用是通过家蚕滞育激素受体(Bm.DHR)来介导的，但有关Bm.DHR介导DH作用，来调控家蚕卵滞育等，均缺乏研究。
发明内容
为了解决背景技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种让一化性品种家蚕产非滞育卵的siRNA、制备方法及应用，是采用RT-PCR克隆，PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳回收，与哺乳动物表达载体pFlag-CMV-3连接，与T7反应缓冲液、ATP液、CTP液、GTP液、UTP溶液、T7酶混合反应，再给雌蚕蛹腹部注射的方法，通过调控家蚕滞育激素作用，让一化性品种家蚕产非滞育卵。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明保护一种让一化性品种家蚕产非滞育卵的siRNA，所述siRNA采用以下方法制备而成：
1)解剖并收集化蛹第3天的雌蚕蛹卵巢，从中提取总RNA，然后逆转录获得第1链cDNA；
2)以第1链cDNA为模板，通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增，克隆获得Bm.DHR cDNA(家蚕滞育激素受体cDNA)；
3)以Bm.DHR cDNA为模板，通过PCR扩增得到Bm.DHR DNA片段并用琼脂糖凝胶电泳回收，将Bm.DHR DNA片段用HindIII/BamHI酶切，然后将酶切片段与哺乳动物表达载体pFlag-CMV-3连接获得pFLAG-Bm.DHR；
4)以pFLAG-Bm.DHR为模板，通过PCR扩增得到pFLAG-Bm.DHR DNA片段并用琼脂糖凝胶电泳回收，得到纯化的大小为1311bp的目的DNA片段，作为反应模板；
5)将反应模板与10×T7反应缓冲液、ATP液、CTP液、GTP液、UTP溶液、T7酶混合进行反应，然后再进行后续处理得到Bm.DHR siRNA，作为所述siRNA。
所述步骤1)具体为：解剖并收集化蛹第3天的雌蚕蛹卵巢，使用Trizol试剂盒提取总RNA，再用逆转录第1链cDNA合成试剂对总RNA进行逆转录获得第1链cDNA，逆转录条件是：30℃变性10min，50℃反应60min，95℃灭活5min。
Trizol试剂盒来源于加拿大Bio Basic Inc公司；逆转录第1链cDNA合成试剂来源于美国Promega公司。
所述步骤2)具体为：以第1链cDNA为模板，分别用如SEQ ID NO.1的正向引物5’-ATGAACTCAGAAACAATAAACGACAC-3’和如SEQ ID NO.2的反向引物5’-TTAACAGTTCGTGTTGAAGTATGTTTC-3’进行逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增，克隆获得Bm.DHR cDNA(家蚕滞育激素受体cDNA)。
所述的逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增条件是：94℃预变性2min，94℃变性15s，50℃退火30s，68℃延伸80s，进行30个循环。
所述步骤3)中，Bm.DHR DNA片段具体采用以下方式获得：以Bm.DHR cDNA为模板，分别用如SEQ ID NO.3的正向引物5’-ATGAACTCAGAAACAATAAACGACAC-3’和如SEQ ID NO.4的反向引物5’-TTAACAGTTCGTGTTGAAGTATGTTTC-3’进行PCR扩增得到Bm.DHR DNA片段，PCR扩增条件是：94℃预变性2min，94℃变性15s，50℃退火30s，68℃延伸80s，进行30个循环，加rTaq酶继续延伸10min。
所述步骤4)中，反应模板具体采用以下方式获得：以pFLAG-Bm.DHR为模板，分别用如SEQ ID NO.5的特异性引物5′-CCCAAGCTTGATGAACTCAG AAACAATAAACGACAC-3′和如SEQID NO.6的特异性引物5′-CGCGGATCC GCTTAACAGTTCGTGTTGAAGTATGTTTC-3′进行PCR扩增得到反应模板，P CR扩增条件是：94℃预变性2min，94℃变性15s，50℃退火30s，68℃延伸80s，进行30个循环。
所述步骤5)具体为：
5.1)在试管内依次加入1-2μg反应模板、2μL 10×T7反应缓冲液、2μL ATP液、2μLCTP液、2μL GTP液、2μL UTP溶液和2μL T7酶混合物；
5.2)补充无核酸酶的双蒸馏水至20μL，充分混合，放置于37℃反应16h，冷却至常温；
5.3)在步骤5.2)获得的混合液中加入1μL TURBO DNA酶，混匀后，37℃下孵育15min；
5.4)再加入30μL无核酸酶的双蒸馏水、30μL的7.5M氯化锂和50mM EDTA(乙二胺四乙酸)，终止反应；
5.5)于4℃下15000rpm离心15min，除去上清液，加入1mL的70％质量百分比的乙醇溶液洗涤；
5.6)于4℃下15000rpm离心15min，除去乙醇上清液，将沉淀用无核酸酶的双蒸馏水溶解，得到Bm.DHR siRNA。
所述方法获得的siRNA用于注入一化性家蚕蛹体内使得家蚕产下非滞育卵。
9、根据权利要求8所述的一种让一化性品种家蚕产非滞育卵的siRNA的应给每代均产滞育卵的一化性品种家蚕化蛹后2-3天的雌蚕蛹腹部注射20-24μg的所述siRNA(Bm.DHR dsRNA)，置于24-25℃温度、70-80％湿度、昼明夜暗的环境中保护，待化蛾后正常交配，产下非滞育卵。
本发明通过大量实施证实，采用本发明所提到的一化性品种家蚕产下约85％的非滞育卵。
本发明具有的有益效果是：
本发明让一化性品种家蚕产非滞育卵的方法，是通过调控家蚕滞育激素作用来实现的，这对于研究家蚕胚胎滞育机制、进行传统养蚕业的技术革新与经济效益提高等，具有积极作用。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
本发明的实施例如下：
实施例1：
解剖并收集化蛹第3天的雌蚕蛹卵巢，使用Trizol试剂盒提取总RNA，再用逆转录第1链cDNA合成试剂对总RNA进行逆转录；其逆转录条件是：30℃变性10min，50℃反应60min，95℃灭活5min，获得第1链cDNA。
以第1链cDNA为模板，分别用正向引物5’-ATGAACTCAGAAACAATAAACGACAC-3’和反向引物5’-TTAACAGTTCGTGTTGAAGTATGTTTC-3’，进行逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增，克隆获得家蚕滞育激素受体(Bm.DHR)cDNA。RT-PCR扩增条件是：94℃预变性2min，94℃变性15s，50℃退火30s，68℃延伸80s，进行30个循环。
以Bm.DHR cDNA为模板，分别用正向引物5’-ATGAACTCAGAAACAATAAACGACAC-3’和反向引物5’-TTAACAGTTCGTGTTGAAGTATGTTTC-3’进行PCR扩增，其PCR扩增条件是：94℃预变性2min，94℃变性15s，50℃退火30s，68℃延伸80s，进行30个循环，加rTaq酶继续延伸10min，得到Bm.DHR DNA片段。琼脂糖凝胶电泳回收目的DNA片段，经HindIII/BamHI酶切后，与哺乳动物表达载体pFlag-CMV-3连接，获得pFLAG-Bm.DHR。
以pFLAG-Bm.DHR为模板，分别用两个特异性引物5′-CCCAAGCTTGATGAACTCAGAAACAATAAACGACAC-3′和5′-CGCGGATCCGCTTAACAGTTCGTGTTGAAGTATGTTTC-3′进行PCR扩增，其PCR扩增条件是：94℃预变性2min，94℃变性15s，50℃退火30s，68℃延伸80s，进行30个循环，得到pFLAG-Bm.DHR DNA片段。琼脂糖凝胶电泳回收得到纯化的大小为1311bp的目的DNA片段，作为反应模板。
在一试管内依次加入2μg反应模板、2μL 10×T7反应缓冲液、2μL ATP液、2μL CTP液、2μL GTP液、2μL UTP溶液和2μL T7酶混合物(上述原料来源于美国Promega公司)；接着补充无核酸酶的双蒸馏水至20μL，充分混合，放置于37℃反应16h，冷却至常温；接着在上述混合液中加入1μL TURBO DNA酶(上述原料来源于美国Promega公司)，混匀后，37℃下孵育15min；接着再加入30μL无核酸酶的双蒸馏水、30μL的7.5M氯化锂和50mM EDTA，终止反应；接着于4℃下15000rpm离心15min，除去上清液，加入1mL 70％乙醇洗涤；接着于4℃下15000rpm离心15min，除去乙醇上清液，将沉淀用无核酸酶的双蒸馏水溶解，得到Bm.DHRsiRNA。
将得到的20μg Bm.DHRsiRNA注射入一化性品种家蚕化蛹后2天的雌蚕蛹腹部，置于24-25℃温度、70-80％湿度、昼明夜暗的环境中保护，待化蛾后正常交配，产下84.5％非滞育卵。
实施例2：
解剖并收集化蛹第3天的雌蚕蛹卵巢，使用Trizol试剂盒提取总RNA，再用逆转录第1链cDNA合成试剂对总RNA进行逆转录；其逆转录条件是：30℃变性10min，50℃反应60min，95℃灭活5min，获得第1链cDNA。
以第1链cDNA为模板，分别用正向引物5’-ATGAACTCAGAAACAATAAACGACAC-3’和反向引物5’-TTAACAGTTCGTGTTGAAGTATGTTTC-3’，进行逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增，克隆获得家蚕滞育激素受体(Bm.DHR)cDNA。RT-PCR扩增条件是：94℃预变性2min，94℃变性15s，50℃退火30s，68℃延伸80s，进行30个循环。
以Bm.DHR cDNA为模板，分别用正向引物5’-ATGAACTCAGAAACAATAAACGACAC-3’和反向引物5’-TTAACAGTTCGTGTTGAAGTATGTTTC-3’进行PCR扩增，其PCR扩增条件是：94℃预变性2min，94℃变性15s，50℃退火30s，68℃延伸80s，进行30个循环，加rTaq酶继续延伸10min，得到Bm.DHR DNA片段。琼脂糖凝胶电泳回收目的DNA片段，经HindIII/BamHI酶切后，与哺乳动物表达载体pFlag-CMV-3连接，获得pFLAG-Bm.DHR。
以pFLAG-Bm.DHR为模板，分别用两个特异性引物5′-CCCAAGCTTGATGAACTCAGAAACAATAAACGACAC-3′和5′-CGCGGATCCGCTTAACAGTTCGTGTTGAAGTATGTTTC-3′进行PCR扩增，其PCR扩增条件是：94℃预变性2min，94℃变性15s，50℃退火30s，68℃延伸80s，进行30个循环，得到pFLAG-Bm.DHRDNA片段。琼脂糖凝胶电泳回收得到纯化的大小为1311bp的目的DNA片段，作为反应模板。
在一试管内依次加入1μg反应模板、2μL 10×T7反应缓冲液、2μL ATP液、2μL CTP液、2μL GTP液、2μL UTP溶液和2μL T7酶混合物(上述原料来源于美国Promega公司)；接着补充无核酸酶的双蒸馏水至20μL，充分混合，放置于37℃反应16h，冷却至常温；接着在上述混合液中加入1μL TURBO DNA酶(上述原料来源于美国Promega公司)，混匀后，37℃下孵育15min；接着再加入30μL无核酸酶的双蒸馏水、30μL的7.5M氯化锂和50mM EDTA，终止反应；接着于4℃下15000rpm离心15min，除去上清液，加入1mL 70％乙醇洗涤；接着于4℃下15000rpm离心15min，除去乙醇上清液，将沉淀用无核酸酶的双蒸馏水溶解，得到Bm.DHRsiRNA。
将得到的22μg Bm.DHRsiRNA注射入一化性品种家蚕化蛹后2天的雌蚕蛹腹部，置于24-25℃温度、70-80％湿度、昼明夜暗的环境中保护，待其化蛾后正常交配，产下85.2％非滞育卵。
实施例3：
解剖并收集化蛹第3天的雌蚕蛹卵巢，使用Trizol试剂盒提取总RNA，再用逆转录第1链cDNA合成试剂对总RNA进行逆转录；逆转录条件是：30℃变性10min，50℃反应60min，95℃灭活5min，获得第1链cDNA。
以第1链cDNA为模板，分别用正向引物5’-ATGAACTCAGAAACAATAAACGACAC-3’和反向引物5’-TTAACAGTTCGTGTTGAAGTATGTTTC-3’，进行逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增，克隆获得家蚕滞育激素受体(Bm.DHR)cDNA。RT-PCR扩增条件是：94℃预变性2min，94℃变性15s，50℃退火30s，68℃延伸80s，进行30个循环。
以Bm.DHR cDNA为模板，分别用正向引物5’-ATGAACTCAGAAACAATAAACGACAC-3’和反向引物5’-TTAACAGTTCGTGTTGAAGTATGTTTC-3’进行PCR扩增，其PCR扩增条件是：94℃预变性2min，94℃变性15s，50℃退火30s，68℃延伸80s，进行30个循环，加rTaq酶继续延伸10min，得到Bm.DHR DNA片段。琼脂糖凝胶电泳回收目的DNA片段，经HindIII/BamHI酶切后，与哺乳动物表达载体pFlag-CMV-3连接，获得pFLAG-Bm.DHR。
以pFLAG-Bm.DHR为模板，分别用两个特异性引物5′-CCCAAGCTTGATGAACTCAGAAACAATAAACGACAC-3′和5′-CGCGGATCCGCTTAACAGTTCGTGTTGAAGTATGTTTC-3′进行PCR扩增，其PCR扩增条件是：94℃预变性2min，94℃变性15s，50℃退火30s，68℃延伸80s，进行30个循环，得到pFLAG-Bm.DHRDNA片段。琼脂糖凝胶电泳回收得到纯化的大小为1311bp的目的DNA片段，作为反应模板。
在一试管内依次加入1μg反应模板、2μL 10×T7反应缓冲液、2μL ATP液、2μL CTP液、2μL GTP液、2μL UTP溶液和2μL T7酶混合物(上述原料来源于美国Promega公司)；接着补充无核酸酶的双蒸馏水至20μL，充分混合，放置于37℃反应16h，冷却至常温；接着在上述混合液中加入1μL TURBO DNA酶(上述原料来源于美国Promega公司)，混匀后，37℃下孵育15min；接着再加入30μL无核酸酶的双蒸馏水、30μL的7.5M氯化锂和50mM EDTA，终止反应；接着于4℃下15000rpm离心15min，除去上清液，加入1mL 70％乙醇洗涤；接着于4℃下15000rpm离心15min，除去乙醇上清液，将沉淀用无核酸酶的双蒸馏水溶解，得到Bm.DHRsiRNA。
将得到的24μg Bm.DHRsiRNA注射入一化性品种家蚕化蛹后3天的雌蚕蛹腹部，置于24-25℃温度、70-80％湿度、昼明夜暗的环境中保护，待其化蛾后正常交配，产下86.3％非滞育卵。
由上述实施例可见，本发明通过调控家蚕滞育激素信号转导的方式，让一化性品种家蚕产非滞育卵，技术效果显著，这对于研究家蚕胚胎滞育机制、进行传统养蚕业的技术革新与经济效益提高等，具有积极作用。
本发明涉及的序列如下：
SEQ ID NO.1：引物1
来源：人工序列(Artificial Sequence)
5’-ATGAACTCAGAAA CAATAAACGACAC-3’；
SEQ ID NO.2：引物2
来源：人工序列(Artificial Sequence)
5’-TTAACAGTTCGTGTTGAA GTATGTTTC-3’；
SEQ ID NO.3：引物3
来源：人工序列(Artificial Sequence)
5’-ATGAACTCAGAAA CAATAAACGACAC-3’；
SEQ ID NO.4：引物4
来源：人工序列(Artificial Sequence)
5’-TTAACAGTTCGTGTTGAA GTATGTTTC-3’；
SEQ ID NO.5：引物5
来源：人工序列(Artificial Sequence)
5′-CCCAAGCTTGATGAACTCAGAAACAATAAACGACAC-3′；
SEQ ID NO.6：引物6
来源：人工合成
5′-CGCGGA TCCGCTTAACAGTTCGTGTTGAAGTATGTTTC-3′。
序列表
<110> 浙江大学（Zhejiang University）
<120> 一种让一化性品种家蚕产非滞育卵的siRNA、制备方法及应用
<130> 超-171-246
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgaactcag aaacaataaa cgacac 26
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttaacagttc gtgttgaagt atgtttc 27
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgaactcag aaacaataaa cgacac 26
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttaacagttc gtgttgaagt atgtttc 27
<210> 5
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cccaagcttg atgaactcag aaacaataaa cgacac 36
<210> 6
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cgcggatccg cttaacagtt cgtgttgaag tatgtttc 38

Claims (9)

1.一种让一化性品种家蚕产非滞育卵的siRNA，其特征在于：所述siRNA采用以下方法制备而成：
1)解剖并收集化蛹第3天的雌蚕蛹卵巢，从中提取总RNA，然后逆转录获得第1链cDNA；
2)以第1链cDNA为模板，通过逆转录聚合酶链式反应扩增，克隆获得Bm.DHR cDNA；
3)以Bm.DHR cDNA为模板，通过PCR扩增得到Bm.DHR DNA片段并用琼脂糖凝胶电泳回收，将Bm.DHR DNA片段用HindIII/BamHI酶切，然后将酶切片段与哺乳动物表达载体pFlag-CMV-3连接获得pFLAG-Bm.DHR；
4)以pFLAG-Bm.DHR为模板，通过PCR扩增得到pFLAG-Bm.DHR DNA片段并用琼脂糖凝胶电泳回收，得到纯化的大小为1311bp的目的DNA片段，作为反应模板；
5)将反应模板与10×T7反应缓冲液、ATP液、CTP液、GTP液、UTP溶液、T7酶混合进行反应，然后再进行后续处理得到Bm.DHR siRNA，作为所述siRNA。
2.根据权利要求1所述的一种让一化性品种家蚕产非滞育卵的siRNA制备方法，其特征在于：所述步骤1)具体为：解剖并收集化蛹第3天的雌蚕蛹卵巢，使用Trizol试剂盒提取总RNA，再用逆转录第1链cDNA合成试剂对总RNA进行逆转录获得第1链cDNA，逆转录条件是：30℃变性10min，50℃反应60min，95℃灭活5min。
3.根据权利要求1所述的一种让一化性品种家蚕产非滞育卵的siRNA制备方法，其特征在于：所述步骤2)具体为：以第1链cDNA为模板，分别用如SEQ ID NO.1的正向引物5’-ATGAACTCAGAAACAATAAACGACAC-3’和如SEQ ID NO.2的反向引物5’-TTAACAGTTCGTGTTGAAGTATGTTTC-3’进行逆转录聚合酶链式反应扩增，克隆获得Bm.DHRcDNA。
4.根据权利要求3所述的一种让一化性品种家蚕产非滞育卵的siRNA制备方法，其特征在于：所述的逆转录聚合酶链式反应扩增条件是：94℃预变性2min，94℃变性15s，50℃退火30s，68℃延伸80s，进行30个循环。
5.根据权利要求1所述的一种让一化性品种家蚕产非滞育卵的siRNA制备方法，其特征在于：所述步骤3)中，Bm.DHR DNA片段具体采用以下方式获得：以Bm.DHR cDNA为模板，分别用如SEQ ID NO.3的正向引物5’-ATGAACTCAGAAACAATAAACGACAC-3’和如SEQ ID NO.4的反向引物5’-TTAACAGTTCGTGTTGAAGTATGTTTC-3’进行PCR扩增得到Bm.DHR DNA片段，PCR扩增条件是：94℃预变性2min，94℃变性15s，50℃退火30s，68℃延伸80s，进行30个循环，加rTaq酶继续延伸10min。
6.根据权利要求1所述的一种让一化性品种家蚕产非滞育卵的siRNA制备方法，其特征在于：所述步骤4)中，反应模板具体采用以下方式获得：
以pFLAG-Bm.DHR为模板，分别用如SEQ ID NO.5的特异性引物5′-CCCAAGCTTGATGAACTCAGAAACAATAAACGACAC-3′和如SEQ ID NO.6的特异性引物5′-CGCGGATCCGCTTAACAGTTCGTGTTGAAGTATGTTTC-3′进行PCR扩增得到反应模板，PCR扩增条件是：94℃预变性2min，94℃变性15s，50℃退火30s，68℃延伸80s，进行30个循环。
7.根据权利要求1所述的一种让一化性品种家蚕产非滞育卵的siRNA制备方法，其特征在于：所述步骤5)具体为：
5.1)在试管内依次加入1-2μg反应模板、2μL 10×T7反应缓冲液、2μL ATP液、2μL CTP液、2μL GTP液、2μL UTP溶液和2μL T7酶混合物；
5.2)补充无核酸酶的双蒸馏水至20μL，充分混合，放置于37℃反应16h，冷却至常温；
5.3)在步骤5.2)获得的混合液中加入1μL TURBO DNA酶，混匀后，37℃下孵育15min；
5.4)再加入30μL无核酸酶的双蒸馏水、30μL的7.5M氯化锂和50mM乙二胺四乙酸，终止反应；
5.5)于4℃下15000rpm离心15min，除去上清液，加入1mL的70％质量百分比的乙醇溶液洗涤；
5.6)于4℃下15000rpm离心15min，除去乙醇上清液，将沉淀用无核酸酶的双蒸馏水溶解，得到Bm.DHR siRNA。
8.一种让一化性品种家蚕产非滞育卵的siRNA的应用，其特征在于：
权利要求1所述方法获得的siRNA用于注入一化性家蚕蛹体内使得家蚕产下非滞育卵。
9.根据权利要求8所述的一种让一化性品种家蚕产非滞育卵的siRNA的应用，其特征在于：给每代均产滞育卵的一化性品种家蚕化蛹后2-3天的雌蚕蛹腹部注射20-24μg的所述siRNA，置于24-25℃温度、70-80％湿度、昼明夜暗的环境中保护，待化蛾后正常交配，产下非滞育卵。
CN201711374286.XA 2017-12-19 2017-12-19 一种让一化性品种家蚕产非滞育卵的siRNA、制备方法及应用 Active CN108048464B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711374286.XA CN108048464B (zh) 2017-12-19 2017-12-19 一种让一化性品种家蚕产非滞育卵的siRNA、制备方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711374286.XA CN108048464B (zh) 2017-12-19 2017-12-19 一种让一化性品种家蚕产非滞育卵的siRNA、制备方法及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108048464A CN108048464A (zh) 2018-05-18
CN108048464B true CN108048464B (zh) 2021-01-19

Family

ID=62129989

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711374286.XA Active CN108048464B (zh) 2017-12-19 2017-12-19 一种让一化性品种家蚕产非滞育卵的siRNA、制备方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108048464B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110272916B (zh) * 2019-06-25 2021-03-23 浙江大学 一种增加家蚕雌蛾产卵数量的技术方法
CN113481207B (zh) * 2021-07-15 2023-04-07 西南大学 家蚕卵滞育的必需基因Bmtret1及其应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103215266B (zh) * 2012-01-20 2016-05-25 中国科学院上海生命科学研究院 用于调控家蚕蛹发育的RNAi及其应用
CN106719467A (zh) * 2016-11-14 2017-05-31 江苏科技大学 一种无滞育多化性家蚕品种的冬季安全保存方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN108048464A (zh) 2018-05-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104531705A (zh) 利用CRISPR-Cas9系统敲除动物myostatin基因的方法
CN108048464B (zh) 一种让一化性品种家蚕产非滞育卵的siRNA、制备方法及应用
Song et al. Bucky ball induces primordial germ cell increase in medaka
Yang et al. Transcriptome analysis of male and female mature gonads of Japanese scallop Patinopecten yessonsis
Zhenhui et al. Molecular characterization, expression, and function of Vitellogenin genes in Phytoseiulus persimilis
CN113621619B (zh) 一个家蚕卵滞育的必需基因Bmpnd-2及其应用
Huang et al. Molecular characterization, sexually dimorphic expression, and functional analysis of 3′-untranslated region of vasa gene in half-smooth tongue sole (Cynoglossus semilaevis)
CN109652457A (zh) 一种基因敲除选育alpk2基因缺失型斑马鱼的方法
CN113678789A (zh) Mir-379/410基因簇敲除的小鼠模型及其构建方法
CN110551190A (zh) 一种利用家蚕生产蜘蛛丝的方法
Fu et al. Role of thyroid hormone receptor in amphibian development
CN105349547A (zh) 一种提高家蚕蛹体重量的方法
Wei et al. Molecular characterization and functional analysis of DMRT11E in black tiger shrimp (Penaeus monodon)
Shiguemoto et al. Primordial germ cell identification and traceability during the initial development of the Siluriformes fish Pseudopimelodus mangurus
CN106350529A (zh) 绿盲蝽V‑ATPaseE基因及其在RNAi介导的害虫防治方面的应用
CN110272916B (zh) 一种增加家蚕雌蛾产卵数量的技术方法
CN113373150B (zh) 一种靶向dat基因的sgRNA及其应用
CN106518996B (zh) 来源于禾谷孢囊线虫的Ha-18764蛋白及其编码基因和应用
CN107267511B (zh) RNAi干扰片段、干扰载体及其制备方法和应用
JP5240699B2 (ja) 効率的なトランスジェニックカイコの作出方法
CN105349548A (zh) 一种提高家蚕幼虫体重量的方法
Yang et al. Temporospatial expression of Dmrt1 in chicken urogenital system (Gallus gallus) using whole mount in situ hybridization
Lai et al. miRNA–mRNA Integrative Analysis Reveals the Roles of miRNAs in Hypoxia-Altered Embryonic Development-and Sex Determination-Related Genes of Medaka Fish
Sharma Identification and characterization of the male-determining gene of the housefly, Musca domestica
Chen et al. Sex Identification and Control in Half‐Smooth Tongue Sole

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant