CN106518996B

CN106518996B - 来源于禾谷孢囊线虫的Ha-18764蛋白及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN106518996B
Application number: CN201710024319.1A
Authority: CN
Inventors: 简恒; 戴依然; 刘倩; 杨姗姗
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2017-01-13
Filing date: 2017-01-13
Publication date: 2019-05-28
Anticipated expiration: 2037-01-13
Also published as: CN106518996A

Abstract

本发明公开了一种来源于禾谷孢囊线虫的Ha‑18764蛋白及其编码基因和应用。本发明提供了一种蛋白质，获自禾谷孢囊线虫，命名为Ha‑18764蛋白，是如下(a1)或(a2)：(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(a2)将(a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与孢囊线虫的寄生和/或致病和/或发育相关的由(a1)衍生的蛋白质。编码Ha‑18764蛋白的基因也属于本发明的保护范围。编码Ha‑18764蛋白的基因命名为Ha‑18764基因。Ha‑18764基因在线虫寄生过程中发挥重要作用，可作为植物抗线虫工程的靶标基因。本发明对于禾谷孢囊线虫致病机理研究以及抗线虫植物制备具有重大价值。

Description

来源于禾谷孢囊线虫的Ha-18764蛋白及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种来源于禾谷孢囊线虫的Ha-18764蛋白及其编码基因和应用。

背景技术

禾谷孢囊线虫(Heteroderaavenae)是一类固着型内寄生植物线虫，主要侵入麦类植株根系，抑制根的正常生长，对小麦、大麦等作物产量造成很大损失。据研究表明，在我国禾谷孢囊线虫(H.avenae)危害小麦的面积达到400万hm²以上，并呈逐年上升趋势，引起小麦15.5％-55.0％的产量损失，已成为我国小麦生产上的重大问题。

由于对禾谷孢囊线虫致病机理研究不足，传统的防治方法存在特异性差、副作用大、防效有限等突出问题。RNA干扰作为一种新的防治策略及技术，为抗线虫基因工程带来新的突破。RNA干扰抗线虫的主要方案为：构建靶标为线虫寄生致病相关基因的RNA干扰载体，将RNA干扰载体导入植物中表达双链RNA(dsRNAs)或小干扰RNA(siRNAs)，经口针取食进入线虫体内，引发系统性RNA干扰反应，导致线虫寄生、发育、代谢、运动等相关功能出现障碍甚至死亡，从而使转基因植物实现对寄生线虫的抗性。因此，挖掘禾谷孢囊线虫的新基因，研究其对禾谷孢囊线虫寄生、致病、发育的作用机制，将其作为靶标培育抗线虫的植物，具有重大的前景和价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种来源于禾谷孢囊线虫的Ha-18764蛋白及其编码基因和应用。

本发明提供了一种蛋白质，获自禾谷孢囊线虫，命名为Ha-18764蛋白，是如下(a1)或(a2)：

(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(a2)将(a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与孢囊线虫的寄生和/或致病和/或发育相关的由(a1)衍生的蛋白质。

为了使(a2)中的蛋白质便于纯化和检测，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

上述(a2)中蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(a2)中蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码Ha-18764蛋白的基因也属于本发明的保护范围。编码Ha-18764蛋白的基因命名为Ha-18764基因。

Ha-18764基因为如下(b1)或(b2)或(b3)：

(b1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；

(b2)在严格条件下与以上(b1)所述DNA分子杂交且编码Ha-18764蛋白的DNA分子；

(b3)与以上(b1)所述DNA分子具有90％以上同源性且编码Ha-18764蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。

含有Ha-18764基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系、转基因植物组织或重组菌均属于本发明的保护范围。

可用现有的表达载体构建含有Ha-18764基因的重组表达载体。所述表达载体包括双元农杆菌载体和可用于微弹轰击的载体等。使用Ha-18764基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用Ha-18764基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于鉴定及筛选，可对所用表达载体进行加工，如加入表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。从转基因安全性考虑，可不加任何选择性标记基因。

本发明还保护Ha-18764蛋白的应用，为如下(c1)至(c3)中的至少一种：

(c1)调控孢囊线虫的寄生能力；

(c2)调控孢囊线虫的致病能力；

(c3)调控孢囊线虫的发育。

本发明还保护抑制Ha-18764基因表达的干扰载体。所述干扰载体具体可为重组质粒BSMV:Ha-18764。对重组质粒BSMV:Ha-18764进行结构描述如下：在载体pCa-γbLIC的ApaI酶切位点插入了序列表的序列2自5’末端第28-229位核苷酸所示的DNA分子。

本发明还保护抑制Ha-18764基因表达的RNA(干扰RNA)。干扰RNA如序列表的序列6和/或如序列表的序列7所示。

本发明还保护抑制Ha-18764基因表达的重组病毒。所述重组病毒具体可为重组BSMV病毒。

所述重组病毒的制备方法具体如下：将pCaBS-α、pCaBS-β和重组质粒BSMV:Ha-18764共同转染烟草植株，培养，得到重组病毒。pCaBS-α具体通过重组农杆菌甲转染烟草植株。pCaBS-β具体通过重组农杆菌乙转染烟草植株。重组质粒BSMV:Ha-18764具体通过重组农杆菌丙转染烟草植株。重组农杆菌甲是将pCaBS-α导入根癌农杆菌EHA105得到的重组农杆菌。重组农杆菌乙是将pCaBS-β导入根癌农杆菌EHA105得到的重组农杆菌。重组农杆菌丙是将重组质粒BSMV:Ha-18764导入根癌农杆菌EHA105得到的重组农杆菌。所述共同转染烟草植株具体可为共同转染生长至8-12叶期的本生烟植株的叶片。所述转染的方式，具体可为注射含有重组农杆菌甲、重组农杆菌乙和重组农杆菌丙的菌液至叶片背面。所述培养的时间具体可为3天。重组病毒具体存在于被接种的叶片和/或该叶片以上的第1片叶片和/或该叶片以上的第2片叶片中。

本发明还保护用于抑制Ha-18764基因表达的物质在制备产品中的应用。所述产品功能为抑制孢囊线虫对植物的寄生和/或抑制孢囊线虫对植物的致病和/或抑制孢囊线虫发育。用于抑制Ha-18764基因表达的物质具体可为以上任一所述的抑制Ha-18764基因表达的干扰载体、以上任一所述的抑制Ha-18764基因表达的RNA或以上任一所述的抑制Ha-18764基因表达的重组病毒。所述植物可为单子叶植物或双子叶植物，具体可为小麦，例如小麦矮抗58。

本发明还保护用于抑制Ha-18764蛋白活性的物质在制备产品中的应用。所述产品功能为抑制孢囊线虫对植物的寄生和/或抑制孢囊线虫对植物的致病和/或抑制孢囊线虫发育。所述植物可为单子叶植物或双子叶植物，具体可为小麦，例如小麦矮抗58。

以上任一所述孢囊线虫具体可为禾谷孢囊线虫。

食道腺在线虫与寄主互作致病过程中发挥重要作用。多数寄生致病相关基因均在线虫食道腺表达，编码产生分泌蛋白，再经由口针穿刺和注射进入植物细胞内，发挥寄生致病相关的复杂功能。

本发明提供的Ha-18764基因，从组织特异性来看在亚腹食道腺表达，从时间特异性来看在禾谷孢囊线虫的寄生后二龄时期、四龄幼虫时期及成年雌虫中表达量较高。利用大麦条纹花叶病毒(BSMV)介导的寄主诱导的基因沉默体系沉默Ha-18764基因后，禾谷孢囊线虫无法在小麦根部正常发育，小麦根部的线虫数量明显低于对照，表明该基因在禾谷孢囊线虫寄生过程中发挥重要作用，可作为植物抗线虫工程的靶标基因。

本发明对于孢囊线虫致病机理研究以及抗线虫植物制备具有重大价值。

附图说明

图1为实施例2的结果。

图2为实施例3的结果。

图3为实施例4中平均每株植株根内禾谷孢囊线虫的数量统计结果。

图4为实施例4中植株根内禾谷孢囊线虫的发育状态比较。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

提及“禾谷孢囊线虫”、“本生烟(Nicotianabenthamiana)”和“小麦矮抗58”的文献：Chen C,Liu S,Liu Q,et al.An ANNEXIN-Like Protein from the Cereal CystNematode Heteroderaavenae Suppresses Plant Defense.PLOS ONE,2015,10(4):e122256.。

提及“pCaBS-α”、“pCaBS-β”和“pCa-γbLIC”的文献：Chen C,Liu S,Liu Q,etal.An ANNEXIN-Like Protein from the Cereal Cyst Nematode HeteroderaavenaeSuppresses Plant Defense.PLOS ONE,2015,10(4):e122256.。

100×BSA即1g/100ml的BSA水溶液。

实施例1、Ha-18764蛋白以及Ha-18764基因的发现

1、挑取新鲜的单粒的禾谷孢囊线虫孢囊，液氮冷冻，组织研磨器破碎样品，用磁珠法(QIAGEN)提取总RNA，反转录得到cDNA。

2、以cDNA为模板，采用Ha-18764F和Ha-18764R组成的引物对进行PCR扩增。

Ha-18764F：5'-ATGGCTTCTTCAGCATCCTTTTC-3'；

Ha-18764R：5'-GAGTTTGTGTGATCCGCTTTTG-3'。

PCR扩增的反应体系(25.00μL)：5×Q5Buffer 5.00μL，Q5High-Fidelity DNAPolymerase 0.25μL，Ha-18764F 1.25μL，Ha-18764R 1.25μL，模板1.00μL，用ddH₂O补足。

PCR反应程序：98℃30s；98℃10s、55℃30s、72℃40s，35个循环；72℃10min；4℃保存。

3、将pGR107载体进行线性化(37℃水浴3-4h)，回收线性化质粒，与步骤2的PCR扩增产物连接，然后转化大肠杆菌DH5α，测序。

测序结果表明，扩增产物中具有序列表的序列2所示的开放阅读框，编码序列表的序列1所示的蛋白质。将序列表的序列1命名为Ha-18764蛋白，将其编码基因命名为Ha-18764基因。

实施例2、Ha-18764基因的组织定位

以DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II(Roche)对禾谷孢囊线虫二龄幼虫进行原位杂交实验。

1、以禾谷孢囊线虫的cDNA为模板，采用Ha-18764-situ-S和Ha-18764-situ-A组成的引物对扩增探针目的片段(282bp)，回收目的片段。

Ha-18764-situ-S：5’-AACACATTGTCTCGCTGAT-3’；

Ha-18764-situ-A：5’-AGTTGGTCCAGTCGTTGT-3’。

反应体系(25μL)：Phusion High-Fidelity DNA Polymerase 0.5μL,dNTPMixture(10mM each)1.0μL,Ha-18764-situ-S 2.5μL,Ha-18764-situ-A 2.5μL,模板2μL,5×Phusion HF Buffer 10μL,ddH₂O补足。

反应条件：94℃4min；94℃30s、52℃30s、72℃1min，35个循环；72℃10min；15℃5min。

2、采用不对称PCR制备正义探针或反义探针。

以Ha-18764-situ-A或Ha-18764-situ-S为引物，以步骤1回收的目的片段为模板进行PCR扩增扩增，得到反义探针/正义探针。

反应体系(25μL)：10×Taq Buffer 2.5μL,DIG/dNTP mix(1mM)2.5μL,引物(10μM)5.0μL，模板1.0μL，Taq DNA polymerase(5U/μL)0.5μL，DEPC-H₂O补足。

3、进行原位杂交。

结果见图1。结果显示，反义探针有杂交信号，杂交信号位于亚腹食道腺。结果表明，Ha-18764基因可能为亚腹食道腺细胞表达。

实施例3、Ha-18764基因的表达谱

采用实时荧光定量PCR分析Ha-18764基因在禾谷孢囊线虫的各个发育期(卵、寄生前二龄幼虫、寄生期二龄幼虫、三龄幼虫、四龄幼虫、成熟雌虫和成熟雄虫)的相对表达水平。以GAPDH-1基因为内参。采用Premix Ex Taq^TM试剂盒(Takara)，在ABI PRISM7000荧光定量PCR仪上进行Real time RT-PCR检测。用于检测Ha-18764基因的引物对由qHa-18764S和qHa-18764AS组成。用于检测GAPDH-1基因的引物对由GAPDH-1S和GAPDH-1AS组成。模板为各个发育期的禾谷孢囊线虫的总RNA反转录得到的cDNA。

qHa-18764S(上游引物)：5’-CCGCAGTGTCGGCTTTG-3’；

qHa-18764AS(下游引物)：5’-TTTGGCAGGGTCGTTGA-3’。

GAPDH-1S(上游引物)：5’-AGCGGCACAGAACATCATCC-3’；

GAPDH-1AS(下游引物)：5’-GGTCCTCCGTGTAGCCCAAA-3’。

反应体系(20μL)：Premix Ex TaqTM(2×)10μL，Rox Dye 0.4μL，上游引物(10μM)0.4μL，下游引物(10μM)0.4μL，模板1μL，ddH₂O补足。

反应程序：95℃30s；95℃5s、60℃31s，40个循环；95℃15s、60℃1min、95℃15s。

分别进行三次生物学重复实验，采用2-△△Ct法分析结果。

结果见图2。相对于卵时期的表达量，Ha-18764基因在寄生期二龄幼虫、四龄幼虫和成熟雌虫中表达量高。结果显示，Ha-18764基因主要在禾谷类孢囊线虫寄生后期起作用。

实施例4、通过沉默Ha-18764基因验证其作为靶标在抗线虫中的应用

pCass4-Rz-BSMV病毒载体共三个，分别是pCaBS-α，pCaBS-β和pCa-γbLIC。

一、构建干扰载体

1、以禾谷孢囊线虫的cDNA为模板，采用Ha-18764-LIC-pBS-S1和Ha-18764-LIC-pBS-AS1组成的引物对进行PCR扩增。

Ha-18764-LIC-pBS-S1：5’-AACCACCACCACCGTTCCTCTGCTCTTCTTTCCATG-3’；

Ha-18764-LIC-pBS-AS1：5’-AAGGAAGTTTAATCAATTGGTTTTCCAAGGCCGC-3’。

Ha-18764-LIC-pBS-S1和Ha-18764-LIC-pBS-AS1中，下划线标注接头序列。

经测序，PCR扩增产物如序列表的序列3所示。

将该PCR扩增产物命名为带有接头序列的Ha-18764区段。

2、以eGFP基因(eGFP基因如序列表的序列4所示)为模板，采用eGFPG1-LIC-pBS-S1和eGFPG1-LIC-pBS-AS1组成的引物对进行PCR扩增。

eGFPG1-LIC-pBS-S1：5’-AAGGAAGTTTAAACCCTCGTGACCACCCTGAC-3’；

eGFPG1-LIC-pBS-AS1：5’-AACCACCACCACCGTGTTCACCTTGATGCCGTTCT-3’。

eGFPG1-LIC-pBS-S1和eGFPG1-LIC-pBS-AS1中，下划线标注接头序列。

经测序，PCR扩增产物如序列表的序列5所示。

将该PCR扩增产物命名为带有接头序列的eGFP区段。

3、取载体pCa-γbLIC，用限制性内切酶ApaI酶切，得到线性化质粒。

4、制备反应体系甲(反应体系甲的组成见表2)，然后22-25℃孵育30min，然后75℃孵育15min，然后迅速冰浴冷却。将完成上述步骤的整个体系命名为产物甲。

表2

步骤3得到的线性化质粒	200ng
		100mM dTTP	0.5μL
100×BSA	0.1μL
		10×T4DNA polymerase Buffer	1μL
T4DNA polymerase(NEB)	0.2μL
		ddH<sub>2</sub>O	补足10μL

5、制备反应体系乙(反应体系乙的组成见表3)，然后22-25℃孵育30min，然后75℃孵育15min，然后迅速冰浴冷却。将完成上述步骤的整个体系命名为产物乙。

表3

带有接头的区段	40ng以上
		100mM dATP	0.5μL
100×BSA	0.1μL
		10×T4DNA polymerase Buffer	1μL
T4DNA polymerase(NEB)	0.2μL
		ddH<sub>2</sub>O	补10μL

表3中，带有接头的区段指的是步骤1制备的带有接头序列的Ha-18764区段或步骤2制备的带有接头序列的eGFP区段。带有接头的区段为带有接头序列的Ha-18764区段时，得到的产物为产物乙-Ⅰ。带有接头的区段为带有接头序列的eGFP区段时，得到的产物为产物乙-Ⅱ。

6、将2μL产物甲和10μL产物乙-Ⅰ混合，66℃孵育2min，然后室温冷却2min，得到的连接产物即为干扰载体BSMV:Ha-18764(重组质粒)。经测序，对干扰载体BSMV:Ha-18764进行结构描述如下：在载体pCa-γbLIC的ApaI酶切位点插入了序列表的序列2自5’末端第28-229位核苷酸所示的DNA分子。

7、将2μL产物甲和10μL产物乙-Ⅱ混合，66℃孵育2min，然后室温冷却2min，得到的连接产物即为干扰载体BSMV:eGFP(重组质粒)。经测序，对干扰载体BSMV:eGFP进行结构描述如下：在载体pCa-γbLIC的ApaI酶切位点插入了序列表的序列4自5’末端第178-495位核苷酸所示的DNA分子。

二、瞬时转染烟草

1、将pCaBS-α导入根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌，然后用悬浮缓冲液悬浮，得到OD_600nm＝0.7菌悬液。

2、将pCaBS-β导入根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌，然后用悬浮缓冲液悬浮，得到OD_600nm＝0.7菌悬液。

3、将pCa-γbLIC导入根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌，然后用悬浮缓冲液悬浮，得到OD_600nm＝0.7菌悬液。

4、将干扰载体BSMV:Ha-18764导入根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌，然后用悬浮缓冲液悬浮，得到OD_600nm＝0.7菌悬液。

5、将干扰载体BSMV:eGFP导入根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌，然后用悬浮缓冲液悬浮，得到OD_600nm＝0.7菌悬液。

6、将步骤1得到的菌悬液、步骤2得到的菌悬液和步骤3得到的菌悬液等体积混合，28℃静置3h，得到接种液γ。

7、将步骤1得到的菌悬液、步骤2得到的菌悬液和步骤4得到的菌悬液等体积混合，28℃静置3h，得到接种液Ha-18764。

8、将步骤1得到的菌悬液、步骤2得到的菌悬液和步骤5得到的菌悬液等体积混合，28℃静置3h，得到接种液eGFP。

9、分别将接种液γ、接种液Ha-18764和接种液eGFP作为菌液依次进行如下步骤(每种菌液对25株植株进行操作)：

(1)将菌液接种生长至8-12叶期的本生烟植株(接种方式：每隔3片叶子接种1片叶子进行注射接种，注射时手指按压在本生烟叶片正面，然后从与之对应的叶片背面位置进行注射，注射过程中尽量使菌液浸润整个叶片)，然后正常培养3天。

(2)取被接种的叶片和该叶片以上的第1片叶片和第2片叶片，按照1g鲜重叶片比3ml磷酸缓冲液的比例加入磷酸缓冲液(20mM，pH7.0)，进行研磨。

(3)取生长至二叶期的矮抗58小麦植株(每株植株种植于一个装有培养基质的容器，培养基质即1体积份营养土和1体积份蛭石混合得到的)，先在植株叶片上均匀喷洒硅藻土，然后一手握住小麦茎秆与叶片交界处以固定，另一只手蘸取步骤(2)得到的研磨物，自下而上的轻捋小麦叶片(接种力度以手指与小麦叶片能够摩擦发出声音为宜)，然后将植株置于22℃、16h光/8h黑暗的条件下正常培养9天。

(4)完成步骤(3)后，在每个容器中的培养基质中接种300头禾谷孢囊线虫，然后继续在22℃、16h光/8h黑暗的条件下正常培养7天。

完成步骤(4)后，统计平均每株植株根内禾谷孢囊线虫的数量并观察植株根内禾谷孢囊线虫的发育状态。

平均每株植株根内禾谷孢囊线虫的数量统计结果见图3。接种液Ha-18764进行上述步骤后平均每株植株根内禾谷孢囊线虫的数量显著低于接种液γ或接种液eGFP进行上述步骤后平均每株植株根内禾谷孢囊线虫的数量。结果表明，对禾谷孢囊线虫中的Ha-18764基因进行干扰抑制可以抑制禾谷孢囊线虫对小麦的侵染。

植株根内禾谷孢囊线虫的发育状态比较见图4。对禾谷孢囊线虫中的Ha-18764基因进行干扰抑制可以抑制禾谷孢囊线虫的发育。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业大学

<120> 来源于禾谷孢囊线虫的Ha-18764蛋白及其编码基因和应用

<130> GNCYX170183

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 188

<212> PRT

<213> 禾谷孢囊线虫（Heteroderaavenae）

<400> 1

Met Ala Ser Ser Ala Ser Phe Ser Ser Ser Ser Ala Leu Leu Ser Met

1 5 10 15

Ile Thr Ile Val Ala Leu Leu Cys Lys Cys Cys Ile Ser Ala Pro His

20 25 30

Pro Cys Cys Pro Gly Ser Gln His Ile Val Ser Leu Met His Asn Tyr

35 40 45

Ile Asp Thr Phe Pro Ala Ser Met Gln Lys Ser Ala Leu Cys Leu Arg

50 55 60

Ala Glu Arg Val Ala Ala Ala Leu Glu Asn Gln Leu Thr Leu Ile Gly

65 70 75 80

Cys Pro Asn Gly Gly Asp Gln Thr Leu Ile Lys Glu Ile Asn Ala Ile

85 90 95

Gln Ser Thr Asn Asp Glu Cys Ala Arg Ser Val Gly Phe Val Arg Ala

100 105 110

Met Phe Asp Ile Ala Ala Ser Thr Ala Ser His Ala Ser Gly Asn Asn

115 120 125

Asp Trp Thr Asn Leu Ala Ala Gln Phe Arg Gln Gln Val Val Met Met

130 135 140

Asp Asn Lys Cys Thr Glu Leu Gly Ile Gln Ile Gly Arg Met Ser Leu

145 150 155 160

Asp Ser Pro Lys Gly Ser His Ala Arg Val Pro Ala Thr Glu Cys Val

165 170 175

Ile Asn Asp Pro Ala Lys Ser Gly Ser His Lys Leu

180 185

<210> 2

<211> 567

<212> DNA

<213> 禾谷孢囊线虫（Heteroderaavenae）

<400> 2

atggcttctt cagcatcctt ttcctcatcc tctgctcttc tttccatgat cacaattgtc 60

gctttgctgt gcaaatgctg tatttcggca ccccacccgt gctgtcctgg tagccaacac 120

attgtctcgc tgatgcacaa ttacattgac actttccccg cttcaatgca aaagtcggca 180

ctttgtttgc gtgccgaaag agttgccgcg gccttggaaa accaattgac cttaattggt 240

tgccccaacg gcggtgatca aaccctcatc aaagagatca atgcaattca gtcaacaaac 300

gatgaatgtg cccgcagtgt cggctttgtc cgtgccatgt ttgacattgc cgcgtccacc 360

gcttcccatg ccagtggcaa caacgactgg accaacttgg ctgctcagtt ccgacaacaa 420

gttgtgatga tggacaacaa gtgcacggaa ttgggcattc aaattggaag aatgagtctg 480

gacagtccca agggaagtca cgcgcgagtg ccggccactg aatgtgtgat caacgaccct 540

gccaaaagcg gatcacacaa actctga 567

<210> 3

<211> 229

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aaccaccacc accgttcctc tgctcttctt tccatgatca caattgtcgc tttgctgtgc 60

aaatgctgta tttcggcacc ccacccgtgc tgtcctggta gccaacacat tgtctcgctg 120

atgcacaatt acattgacac tttccccgct tcaatgcaaa agtcggcact ttgtttgcgt 180

gccgaaagag ttgccgcggc cttggaaaac caattgatta aacttcctt 229

<210> 4

<211> 720

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720

<210> 5

<211> 345

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aaggaagttt aaaccctcgt gaccaccctg acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac 60

cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag 120

gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc 180

gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc 240

aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc 300

gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac acggtggtgg tggtt 345

<210> 6

<211> 202

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 6

uccucugcuc uucuuuccau gaucacaauu gucgcuuugc ugugcaaaug cuguauuucg 60

gcaccccacc cgugcugucc ugguagccaa cacauugucu cgcugaugca caauuacauu 120

gacacuuucc ccgcuucaau gcaaaagucg gcacuuuguu ugcgugccga aagaguugcc 180

gcggccuugg aaaaccaauu ga 202

<210> 7

<211> 202

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 7

ucaauugguu uuccaaggcc gcggcaacuc uuucggcacg caaacaaagu gccgacuuuu 60

gcauugaagc ggggaaagug ucaauguaau ugugcaucag cgagacaaug uguuggcuac 120

caggacagca cggguggggu gccgaaauac agcauuugca cagcaaagcg acaauuguga 180

ucauggaaag aagagcagag ga 202

Claims

1.一种蛋白质，是由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白质的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为编码区如序列表中序列2所示的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒或重组菌。

5.权利要求1所述蛋白质的应用，为如下(c1)至(c3)中的至少一种：

(c1)调控孢囊线虫的寄生能力；

(c2)调控孢囊线虫的致病能力；

(c3)调控孢囊线虫的发育。

6.抑制权利要求2或3所述基因表达的干扰载体。

7.抑制权利要求2或3所述基因表达的RNA。

8.抑制权利要求2或3所述基因表达的重组病毒。

9.用于抑制权利要求2或3所述基因表达的物质在制备产品中的应用；所述用于抑制权利要求2或3所述基因表达的物质为权利要求6所述干扰载体或权利要求7所述RNA或权利要求8所述重组病毒，所述产品的功能为抑制孢囊线虫对植物的寄生和/或抑制孢囊线虫对植物的致病和/或抑制孢囊线虫发育。