KR20170107437A - 노린재류 해충을 방제하기 위한 hunchback 유전자의 모 RNAi 억제 - Google Patents

노린재류 해충을 방제하기 위한 hunchback 유전자의 모 RNAi 억제 Download PDF

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Abstract

본 개시내용은 노린재류 해충에서의 표적 코딩 서열 및 전사된 비-코딩 서열의 RNA 간섭-매개 억제를 통해 노린재류 해충을 방제하기 위한 핵산 분자 및 그의 사용 방법에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 노린재류 해충의 방제에 유용한 핵산 분자를 발현하는 트랜스제닉 식물의 제조 방법, 및 그에 의해 수득된 식물 세포 및 식물에 관한 것이다.

Description

노린재류 해충을 방제하기 위한 hunchback 유전자의 모 RNAi 억제 {PARENTAL RNAI SUPPRESSION OF HUNCHBACK GENE TO CONTROL HEMIPTERAN PESTS}
우선권 주장
본 출원은 "노린재류 해충을 방제하기 위한 hunchback 유전자의 모 RNAi 억제 {PARENTAL RNAI SUPPRESSION OF HUNCHBACK GENE TO CONTROL HEMIPTERAN PESTS}"에 대한, 2014년 12월 16일에 출원된 미국 특허 가출원 일련 번호 62/092,776의 출원일의 이익을 주장하며, 상기 가출원은 그 전문이 본원에 포함된다.
기술 분야
본 발명은 일반적으로 노린재류 해충에 의해 야기되는 식물 손상의 유전적 방제에 관한 것이다. 특정한 실시양태에서, 본 개시내용은 표적 코딩 및 비-코딩 폴리뉴클레오티드의 확인, 및 노린재류 해충의 세포에서의 표적 코딩 및 비-코딩 폴리뉴클레오티드의 발현을 전사후 저해 또는 억제하여 식물 보호 효과를 제공하기 위한 재조합 DNA 기술의 사용에 관한 것이다.
노린재 및 다른 노린재류 곤충 (노린재목)은 중요한 농업 해충 복합체이다. 전세계적으로 밀접하게 관련된 50종 초과의 노린재가 작물 손상을 야기하는 것으로 공지되어 있다. 문헌 [McPherson & McPherson (2000) Stink bugs of economic importance in America north of Mexico, CRC Press]. 노린재류 곤충은 메이즈, 대두, 과실, 채소, 및 곡물을 포함한 많은 수의 중요한 작물에 존재한다.
노린재는 성충 단계에 도달하기 전에 다중 약충 단계를 거친다. 이들 곤충은 약 30-40일 내에 알에서 성충으로 발생한다. 약충 및 성충 둘 다는 이들이 구강외 조직 소화 및 괴사를 야기하는 소화 효소를 또한 주사한 연부 조직으로부터의 수액을 섭식한다. 이어서, 소화된 식물 물질 및 영양소가 섭취된다. 식물 관다발계로부터의 물 및 영양소의 고갈은 식물 조직 손상을 유발한다. 발생하는 곡실 및 종자에 대한 손상은 수확량 및 발아가 유의하게 감소되므로 가장 유의하다. 온난 기후에서 다중 생성이 발생하여 유의한 곤충 압박이 유발된다. 노린재의 현재 관리는 개별 재배지 기준으로 살곤충제 처리에 의존한다. 따라서, 진행중인 작물 손실을 최소화하는 대안적인 관리 전략이 긴급히 필요하다.
RNA 간섭 (RNAi)은 내인성 세포 경로를 이용하는 과정이며, 이에 의해 표적 유전자의 모두 또는 그의 적절한 크기의 임의의 부분에 특이적인 간섭 RNA (iRNA) 분자 (예를 들어, 이중-가닥 RNA (dsRNA) 분자)는 그에 의해 코딩되는 mRNA의 분해를 유발한다. 최근 수년간, RNAi는 수많은 종 및 실험 시스템; 예를 들어 카에노랍디티스 엘레간스(Caenorhabditis elegans), 식물, 곤충 배아, 및 조직 배양에서의 세포에서 유전자 "녹다운"을 수행하는데 사용되었다. 예를 들어 문헌 [Fire et al. (1998) Nature 391:806-11; Martinez et al. (2002) Cell 110:563-74; McManus and Sharp (2002) Nature Rev. Genetics 3:737-47]을 참조한다.
RNAi는 DICER 단백질 복합체를 포함한 내인성 경로를 통해 mRNA의 분해를 달성한다. DICER는 긴 dsRNA 분자를, 소형 간섭 RNA (siRNA)로 칭해지는 대략 20개의 뉴클레오티드의 짧은 단편으로 절단한다. siRNA는 2개의 단일-가닥 RNA: 패신저 가닥 및 가이드 가닥으로 풀린다. 패신저 가닥은 분해되고, 가이드 가닥은 RNA-유도된 침묵 복합체 (RISC) 내로 혼입된다. 마이크로 억제 리보핵산 (miRNA)은 혼성화된 패신저 및 가이드 가닥을 연결하는 폴리뉴클레오티드 "루프"를 함유하는 전구체 분자로부터 절단된 구조적으로 매우 유사한 분자이고, 이들은 RISC 내로 유사하게 혼입될 수 있다. 가이드 가닥이 상보적 mRNA 분자에 특이적으로 결합하고, RISC 복합체의 촉매 성분인 아르고노트(Argonaute)에 의한 절단을 유도하는 경우에, 전사후 유전자 침묵이 발생한다. 이 과정은, 예컨대 식물, 선충류, 및 일부 곤충에서는 초기에 siRNA 및/또는 miRNA의 농도가 제한됨에도 불구하고, 일부 진핵 유기체 전반에 걸쳐 침투적으로 확산되는 것으로 공지되어 있다.
단지 siRNA 및/또는 miRNA에 상보적인 전사체만이 절단 및 분해되므로, mRNA 발현의 녹다운은 서열-특이적이다. 식물에는, 여러 기능군의 DICER 유전자가 존재한다. RNAi의 유전자 침묵 효과는 수일 동안 지속되고, 실험 조건 하에서 90% 이상의 표적화된 전사체의 존재비가 감소하게 될 수 있으며, 그 결과 상응하는 단백질의 수준도 감소할 수 있다. 곤충에는, 적어도 2종의 DICER 유전자가 존재하며, 여기서 DICER1은 아르고노트1에 의한 miRNA-지정 분해를 용이하게 한다. 문헌 [Lee et al. (2004) Cell 117 (1):69-81]. DICER2는 아르고노트2에 의한 siRNA-지정 분해를 용이하게 한다.
곤충 DNA에 상보적인 서열 중 압도적인 다수 (예컨대, 예를 들어, 미국 특허 7,612,194 및 미국 특허 공개 번호 2007/0050860, 2010/0192265, 및 2011/0154545에서 확인된 9,000+ 서열)는 dsRNA 또는 siRNA로서 사용되는 경우에 식물 보호 효과를 제공하지 않는다. 예를 들어, 문헌 [Baum et al. (2007) Nature Biotechnology 25:1322-1326]은 RNAi에 의해 여러 WCR 유전자 표적을 억제하는 효과를 기재한다. 이들 저자는, 이들이 시험한 26종의 표적 유전자 중 8종이 520 ng/cm2 초과의 매우 높은 iRNA (예를 들어, dsRNA) 농도에서 실험상 유의한 딱정벌레류 해충 사멸률을 제공할 수 없다는 것을 보고하였다.
미국 특허 7,612,194 및 미국 특허 공개 번호 2007/0050860의 저자는 서부 옥수수 뿌리벌레를 표적화하는 옥수수 식물에서의 식물내 RNAi를 최초 보고하였다. 문헌 [Baum et al. (2007) Nat. Biotechnol. 25(11):1322-6]. 이들 저자는 트랜스제닉 RNAi 메이즈를 개발하기 위한 잠재적 표적 유전자를 스크리닝하는 고처리량 생체내 먹이 RNAi 시스템을 기재한다. 290종 표적의 초기 유전자 풀 중에서, 단지 14종만이 유충 방제 잠재력을 나타냈다. 가장 유효한 이중-가닥 RNA (dsRNA) 중 1종이 공포 ATPase 서브유닛 A (V-ATPase)를 코딩하는 유전자를 표적화하여, 상응하는 내인성 mRNA의 신속한 억제를 유발하고 낮은 농도의 dsRNA로 특이적 RNAi 반응을 일으켰다. 따라서, 이들 저자는 가능한 해충 관리 도구로서의 식물내 RNAi에 대한 잠재력을 최초로 기록하였으며, 동시에 유효 표적이 비교적 작은 세트의 후보 유전자로부터도 선험적으로 정확하게 확인될 수 없었다는 것을 입증하였다.
곤충 방제를 위한 RNAi의 또 다른 잠재적 적용은 모 RNAi (pRNAi)를 수반한다. 카에노랍디티스 엘레간스에서 최초 기재된 것으로, pRNAi는 자손 배아에서의 유전자 불활성을 야기하는, 체강 내로의 dsRNA의 주사 (또는 섭취를 통한 dsRNA의 적용)에 의해 확인되었다. 문헌 [Fire et al. (1998), supra; Timmons and Fire (1998) Nature 395(6705):854]. 유사한 과정이 딱정벌레류인 트리볼리움 카스타네움(Tribolium castaneum) 모델에서 기재되었으며, 여기서 배아 발생 동안 절편화를 제어하는 3종의 고유한 유전자에 상응하는 dsRNA가 주사된 암컷 번데기는 자손 배아에서 접합 유전자의 녹다운을 유발하였다. 문헌 [Bucher et　al. (2002) Curr. Biol. 12(3):R85-6]. 이 연구에서 거의 모든 자손 유충은 주사 1주 후에 유전자-특이적 표현형을 나타냈다. 기능적 유전체학 연구를 위한 dsRNA의 주사가 다양한 곤충에서 성공적이었지만, RNAi가 해충 관리 도구로서 유효하기 위해서는 dsRNA에의 경구 노출을 통한 장 환경으로부터의 dsRNA의 흡수 및 후속적인 필수 유전자의 하향-조절이 요구된다. 문헌 [Auer and Frederick (2009) Trends Biotechnol. 27(11):644-51].
모 RNAi는 톡토기인 오르케셀라 신크타(Orchesella cincta) (Konopova and Akam (2014) Evodevo 5(1):2); 갈색 식물 호퍼인 닐라파르바타 루겐스(Nilaparvata lugens); 잎벌인 아탈리아 로사에(Athalia rosae) (Yoshiyama et al. (2013) J. Insect Physiol. 59(4):400-7); 독일 바퀴벌레인 블라텔라 게르마니카(Blattella germanica) (Piulachs et al. (2010) Insect Biochem. Mol. Biol. 40:468-75); 및 완두 진딧물인 아시르토시폰 피숨(Acyrthosiphon pisum) (Mao et al. (2013) Arch Insect Biochem Physiol 84(4):209-21)을 포함한 수많은 곤충 종에서 배아 유전자의 기능을 기재하는데 사용되었다. 모든 이들 경우에서의 pRNAi 반응은 모 암컷의 혈체강 내로의 dsRNA의 주사에 의해 달성되었다.
예를 들어 유쉬스투스 헤로스 (파브르.)(Euschistus heros (Fabr.)) (신열대 갈색 노린재, "BSB"); 이. 세르부스 (세이)(E. servus (Say)) (갈색 노린재); 네자라 비리둘라 (엘.)(Nezara viridula (L.)) (남부 녹색 노린재); 피에조도루스 구일디니이 (웨스트우드)(Piezodorus guildinii (Westwood)) (적색줄 노린재); 할리모르파 할리스 (스탈)(Halyomorpha halys (Stal)) (썩덩나무노린재); 키나비아 힐라레 (세이)(Chinavia hilare (Say)) (녹색 노린재); 씨. 마르기나툼 (팔리소 드 보부와)(C. marginatum (Palisot de Beauvois)); 디켈롭스 멜라칸투스 (달라스)(Dichelops melacanthus (Dallas)); 디. 푸르카투스 (에프.)(D. furcatus (F.)); 에데사 메디타분다 (에프.)(Edessa meditabunda (F.)); 티안타 페르디토르 (에프.)(Thyanta perditor (F.)) (신열대 적색 어깨 노린재); 호르시아스 노빌렐루스 (베르그)(Horcias nobilellus (Berg)) (목화 노린재); 타에디아 스티그모사 (베르그)(Taedia stigmosa (Berg)); 디스데르쿠스 페루비아누스 (게렝-메네빌)(Dysdercus peruvianus (Guerin-Meneville)); 네오메갈로토무스 파르부스 (웨스트우드)(Neomegalotomus parvus (Westwood)); 렙토글로수스 조나투스 (달라스)(Leptoglossus zonatus (Dallas)); 니에스트레아 시다에 (에프.)(Niesthrea sidae (F.)); 리구스 헤스페루스 (나이트)(Lygus hesperus (Knight)) (서부 변색 장님노린재); 및 엘. 리네올라리스 (팔리소 드 보부와)(L. lineolaris (Palisot de Beauvois))를 포함한 노린재류 해충의 방제를 위한 핵산 분자 (예를 들어, 표적 유전자, DNA, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, 및 hpRNA), 및 그의 사용 방법이 본원에 개시된다. 특정한 예에서, 노린재류 해충에서의 1종 이상의 천연 핵산의 적어도 일부분에 상동일 수 있는 예시적인 핵산 분자가 개시된다. 일부 실시양태에서, 노린재류 해충은 해충의 후속 세대를 생산하는 해충의 기존 세대의 능력을 감소시킴으로써 방제된다. 특정 예에서, 노린재류 해충에게의 핵산 분자의 전달은 해충에 대한 유의한 사멸률을 유발하지는 않지만, 그로부터 생산된 생존 자손의 수를 감소시킨다.
이들 및 추가의 예에서, 천연 핵산은 표적 유전자일 수 있으며, 이의 산물은 예를 들어 및 비제한적으로: 대사 과정에 수반되고/거나; 생식 과정에 수반되고/거나; 배아 및/또는 약충 발생에 수반될 수 있다. 일부 예에서, 표적 유전자의 발현을, 그에 상동인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자에 의해 전사후 억제하는 것은, 노린재류 해충의 감소된 성장 및/또는 생식을 유발할 수 있다. 구체적 예에서, hunchback 유전자는 전사후 침묵을 위한 표적 유전자로서 선택된다. 특정한 예에서, 전사후 억제에 유용한 표적 유전자는 본원에서 일부 경우에 BSB_hb로 지칭되는, 본원에서 BSB hunchback으로 지칭되는 신규 유전자 (서열식별번호(SEQ ID NO): 1)이다. 따라서, 서열식별번호: 1; 서열식별번호: 1의 상보체; 및/또는 상기 중 어느 것의 단편 (예를 들어, 서열식별번호: 2)의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 핵산 분자가 본원에 개시된다.
또한, 표적 유전자 산물 (예를 들어, hunchback 유전자의 산물) 내의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 85% 동일한 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자가 개시된다. 예를 들어, 핵산 분자는 서열식별번호: 3 (BSB HUNCHBACK); 및/또는 BSB_hb의 산물 내의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일한 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 추가로, 표적 유전자 산물 내의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일한 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 역 상보체인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자가 개시된다.
추가로, 노린재류 해충 표적 유전자, 예를 들어 hunchback 유전자의 모두 또는 일부에 상보적인 iRNA (예를 들어, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, 및 hpRNA) 분자의 생산에 사용될 수 있는 cDNA 폴리뉴클레오티드가 개시된다. 특정한 실시양태에서, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, 및/또는 hpRNA는 유전자 변형된 유기체, 예컨대 식물 또는 박테리아에 의해 시험관내 또는 생체내에서 생산될 수 있다. 특정한 예에서, BSB_hb (서열식별번호: 1)로부터 전사된 mRNA의 모두 또는 일부에 상보적인 iRNA 분자를 생산하는데 사용될 수 있는 cDNA 분자가 개시된다.
추가적으로, 노린재류 해충에서의 필수 유전자의 발현을 억제하기 위한 수단, 및 노린재류 해충으로부터 식물을 보호하기 위한 수단이 개시된다. 노린재류 해충에서의 필수 유전자의 발현을 억제하기 위한 수단은 서열식별번호: 12 및 서열식별번호: 13; 및 그의 상보체로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드로 이루어진 단일- 또는 이중-가닥 RNA 분자이다. 노린재류 해충에서의 필수 유전자의 발현을 억제하기 위한 수단의 기능적 등가물은 서열식별번호: 1을 포함하는 BSB 유전자로부터 전사된 mRNA의 모두 또는 일부에 실질적으로 상동인 단일- 또는 이중-가닥 RNA 분자를 포함한다. 노린재류 해충으로부터 식물을 보호하기 위한 수단은 프로모터에 작동가능하게 연결된, 노린재류 해충에서의 필수 유전자의 발현을 억제하기 위한 수단을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 DNA 분자이며, 여기서 DNA 분자는 메이즈 식물의 게놈 내로 통합될 수 있다.
노린재류 해충에게, 해충에 의해 흡수되었을 때 해충 내의 생물학적 기능을 억제하도록 기능하는 iRNA (예를 들어, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, 및 hpRNA) 분자를 제공하는 것을 포함하며, 여기서 iRNA 분자는 서열식별번호: 1; 서열식별번호: 1의 상보체; 서열식별번호: 2; 서열식별번호: 2의 상보체; 서열식별번호: 1 및/또는 서열식별번호: 2의 모두 또는 일부를 포함하는 노린재류 유기체 (예를 들어, BSB)의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드; 서열식별번호: 1 및/또는 서열식별번호: 2의 모두 또는 일부를 포함하는 노린재류 유기체의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드의 상보체; 서열식별번호: 1 및/또는 서열식별번호: 2의 모두 또는 일부를 포함하는 천연 RNA 분자로 전사되는 노린재류 유기체의 천연 비-코딩 폴리뉴클레오티드; 및 서열식별번호: 1 및/또는 서열식별번호: 2의 모두 또는 일부를 포함하는 천연 RNA 분자로 전사되는 노린재류 유기체의 천연 비-코딩 폴리뉴클레오티드의 상보체로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드의 모두 또는 일부 (예를 들어, 그의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드)를 포함하는 것인, 노린재류 해충의 집단을 방제하는 방법이 개시된다.
특정한 예에서, 노린재류 해충에게, 해충에 의해 흡수되었을 때 해충 내의 생물학적 기능을 억제하도록 기능하는 iRNA (예를 들어, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, 및 hpRNA) 분자를 제공하는 것을 포함하며, 여기서 iRNA 분자는 서열식별번호: 12; 서열식별번호: 12의 상보체; 서열식별번호: 13; 서열식별번호: 13의 상보체; 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2의 모두 또는 일부를 포함하는 노린재류 (예를 들어, BSB) 유기체의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드에 혼성화되는 폴리뉴클레오티드; 및 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2의 모두 또는 일부를 포함하는 노린재류 (예를 들어, BSB) 유기체의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드에 혼성화되는 폴리뉴클레오티드의 상보체 중 모두 또는 일부로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인, 노린재류 해충의 집단을 방제하는 방법이 개시된다.
또한, 먹이-기반 검정에서 또는 dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, 및/또는 hpRNA를 발현하는 유전자-변형된 식물 세포에서 dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, 및/또는 hpRNA가 노린재류 해충에게 제공될 수 있는 방법이 본원에 개시된다. 이들 및 추가의 예에서, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, 및/또는 hpRNA는 노린재류 해충에 의해 섭취될 수 있다. 이어서, 본 발명의 dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, 및/또는 hpRNA의 섭취는 해충에서 RNAi를 유발할 수 있으며, 이는 차례로 대사 과정; 생식 과정; 및/또는 약충 발생에 필수적인 유전자의 침묵을 유발할 수 있다. 따라서, 노린재류 해충의 모 방제에 유용한 예시적인 폴리뉴클레오티드(들)를 포함하는 핵산 분자가 노린재류 해충에게 제공되는 방법이 개시된다. 특정한 예에서, 본 발명의 핵산 분자의 사용에 의해 방제되는 노린재류 해충은 BSB일 수 있다. 일부 예에서, 노린재류 해충에게의 핵산 분자의 전달은 해충에 대한 유의한 사멸률을 유발하지는 않지만, 그로부터 생산된 생존 자손의 수를 감소시킨다. 일부 예에서, 노린재류 해충에게의 핵산 분자의 전달은 해충에 대한 유의한 사멸률을 유발하고, 또한 그로부터 생산된 생존 자손의 수를 감소시킨다.
상기 특색 및 다른 특색이 여러 실시양태에 대한 하기 상세한 설명으로부터 보다 분명해질 것이며, 이는 첨부 도면을 참조로 진행된다.
도 1은 단일 쌍의 프라이머를 갖는 단일 전사 주형으로부터 (도 1A), 및 2종의 전사 주형으로부터 (도 1B) dsRNA를 생성하는데 사용된 전략의 도시를 포함한다.
도 2는 비-은신처 식물이 살곤충 단백질 및 모 활성 iRNA를 발현하는 경우에 살곤충 단백질 (R) 및 RNAi (Y)에 대한 저항성에 관한 대립유전자 빈도의 증가율에 대한, "은신처 패치"로부터 출현한 (즉, 트랜스제닉 작물에서 살곤충 iRNA 또는 재조합 단백질을 발현하지 않은) 암컷 BSB 성충에 대한 pRNAi 효과의 상대 크기의 효과를 제시하는 모델링 데이터의 요약을 포함한다.
도 3은 비-은신처 식물이 살곤충 단백질, 및 유충 활성 및 모 활성 iRNA 분자 둘 다를 발현하는 경우에 살곤충 단백질 (R) 및 RNAi (Y)에 대한 저항성에 관한 대립유전자 빈도의 증가율에 대한, "은신처 패치"로부터 출현한 (즉, 트랜스제닉 작물에서 BSB 약충-활성 간섭 dsRNA를 BSB-활성 살곤충 단백질과 조합하여 포함하는 식물의 트랜스제닉 작물에서 살곤충 iRNA 또는 재조합 단백질을 발현하지 않은) 암컷 BSB 성충에 대한 pRNAi 효과의 상대 크기의 효과를 제시하는 모델링 데이터의 요약을 포함한다.
도 4. 이. 헤로스 암컷의 난소에서의 hunchback (hb)의 유전자에 대한 상대 전사체 수준. dsRNA가 주사되지 않은 곤충을 참조로서 사용하였고; YFP dsRNA-주사된 곤충을 음성 대조군으로서 사용하였다. 던넷 검정을 사용하여 대조군으로서 비-주사된 곤충을 사용하여 평균 비교를 수행하였다. **는 p < 0.001에서의 유의도를 나타낸다.
도 5. hunchback dsRNA-주사된 이. 헤로스 암컷으로부터의 알의 산란, 발생 및 부화율. 암컷에게 성충 탈피 0 내지 2일 후에 dsRNA를 주사하였다. 계수는 2-주 기간 내에 비-주사된 암컷에 의해 산란된 1342개 알, YFPv2 dsRNA-주사된 암컷에 의해 산란된 1202개 알, 및 hb dsRNA-주사된 암컷에 의해 산란된 922개 알을 기준으로 하였다. 알을 주사 7일 후에 시작하여 1일 기준으로 수집하였으며; 발생 및 부화율은 매주 간격이다. A. 매주 간격으로 평균낸, 암컷당 일당 산란된 알의 수. B. 가시적 머리 색소침착의 단계를 지나 발생한 알의 퍼센트. C. 알 수집 제1주 및 제2주 동안 산란된 알 중 부화된 알의 백분위수. 던넷 검정을 사용하여 대조군으로서 비-주사된 곤충을 사용하여 평균 비교를 수행하였으며, **는 p < 0.001에서의 유의도를 나타낸다.
도 6. 이. 헤로스에서의 모 hunchback dsRNA 표현형. 이. 헤로스 암컷에게 성충 탈피 0 내지 2일 후에 dsRNA를 주사하였다. A. hb dsRNA-주사된 암컷의 알로부터 해부된 4일령 배아. 배아는 단축된 사지 및 머리 구조를 포함하는 표현형을 나타낸다. B. 비-주사된 암컷으로부터의 4일령 배아는 발생하는 머리 구조 및 사지의 정상 배열을 제시한다. C. 비-주사된 암컷으로부터의 2일령 배아는 신장된 부속기를 갖는 보다 이른 발생 단계를 제시한다.
[서열 목록]
첨부 서열 목록에 열거된 핵산 서열은 37 C.F.R. § 1.822에 정의된 바와 같이 뉴클레오티드 염기에 대한 표준 문자 약어를 사용하여 제시된다. 열거된 핵산 및 아미노산 서열은 기재된 방식으로 배열된 뉴클레오티드 및 아미노산 단량체를 갖는 분자 (즉, 각각 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드)를 정의한다. 열거된 핵산 및 아미노산 서열은 또한 각각 기재된 방식으로 배열된 뉴클레오티드 및 아미노산 단량체를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 부류를 정의한다. 유전자 코드의 중복을 고려하여, 코딩 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열은 또한 참조 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드와 동일한 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 부류를 기재하는 것으로 이해될 것이다. 아미노산 서열이 그 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 ORF의 부류를 기재하는 것으로 추가로 이해될 것이다.
각각의 핵산 서열의 단지 1개의 가닥만이 제시되어 있지만, 나타낸 가닥에 대한 임의의 참조를 통해 상보적 가닥도 포함되는 것으로 이해된다. 1차 핵산 서열의 상보체 및 역 상보체가 필연적으로 1차 서열에 의해 개시되는 것처럼, 핵산 서열의 상보적 서열 및 역 상보적 서열은 달리 명백하게 언급되지 않는 한 (또는 서열이 출현하는 문맥으로부터 달리 명확하지 않는 한) 핵산 서열에 대한 임의의 참조에 포함된다. 추가로, RNA 가닥의 뉴클레오티드 서열은 그가 전사된 DNA의 서열에 의해 결정되는 것으로 관련 기술분야에서 이해되고 있으므 (티민 (T)에 대한 우라실 (U) 핵염기의 치환 제외), RNA 서열은 이를 코딩하는 DNA 서열에 대한 임의의 참조에 포함된다. 첨부 서열 목록에서:
서열식별번호: 1은 예시적인 BSB_hb DNA를 제시한다:
Figure pct00001

서열식별번호: 2는 그의 상보적 가닥이 전사되어 예시적인 BSB hunchback dsRNA (BSB_hb-1)의 센스 가닥이 되는 예시적인 이. 헤로스 hunchback DNA를 제시한다:
Figure pct00002

서열식별번호: 3은 예시적인 BSB_hb DNA에 의해 코딩된 BSB HUNCHBACK 폴리펩티드의 아미노산 서열을 제시한다:
Figure pct00003

서열식별번호: 4는 T7 파지 프로모터의 뉴클레오티드 서열을 제시한다.
서열식별번호: 5는 YFPv2 센스 폴리뉴클레오티드, ST-LS1 인트론을 포함하는 루프 폴리뉴클레오티드 (밑줄표시), 및 YFPv2 안티센스 폴리뉴클레오티드 (볼드체)를 함유하는; YFPv2 유전자 표적화 헤어핀-RNA-형성 RNA를 코딩하는 예시적인 DNA를 제시한다:
Figure pct00004

서열식별번호: 6은 ST-LS1 인트론을 포함하는 예시적인 DNA를 제시한다.
서열식별번호: 7 및 8은 BSB_hb 폴리뉴클레오티드의 PCR 증폭에 사용된 프라이머를 제시한다.
서열식별번호: 9는 예시적인 YFPv2 dsRNA의 센스 가닥을 위한 DNA 주형을 제시한다.
서열식별번호: 10 및 11은 YFP 유전자의 PCR 증폭에 사용된 프라이머를 제시한다.
서열식별번호: 12 및 13은 예시적인 hunchback 폴리뉴클레오티드 및 그의 단편을 포함하는 핵산으로부터 전사된 예시적인 RNA를 제시한다.
서열식별번호: 14는 액틴-ORF를 제시한다.
Figure pct00005
I. 여러 실시양태의 개관
본 발명자들은 dsRNA를 발현하는 트랜스제닉 식물에 대한 표적 해충 종; 신열대 갈색 노린재를 사용하여, 곤충 해충 관리를 위한 도구로서 RNA 간섭 (RNAi)을 개발하였다. 지금까지, 특정한 곤충에서 RNAi에 대한 표적으로서 제안된 대부분의 유전자는 그의 목적을 달성하지 않고, 확인된 그러한 유용한 표적은 전형적으로 약충 단계에서 치사성을 야기하는 것을 수반한다. 여기서, 본 발명자들은 신열대 갈색 노린재에서 hunchback (hb)의 RNAi-매개 녹다운을 기재하며, 이는 예를 들어 iRNA 분자가 성충 암컷에게 제공된 hunchback dsRNA를 통해 전달되는 경우에 배아 발생을 파괴하는 것으로 제시된다. hunchback dsRNA에 대한 성충 암컷 곤충의 노출은 경구로 투여되었을 때 성충 장수명에 영향을 미치지 않았다. 그러나, hunchback dsRNA에 노출된 암컷으로부터 수집된 알에서 부화는 거의 완전히 부재하였다. 본원의 실시양태에서, 성충 곤충에게 섭식시킴으로써 hunchback dsRNA를 전달하는 능력은 곤충 (예를 들어, 노린재류) 해충 관리에 매우 유용한 pRNAi 효과를 부여한다. 추가로, 약충 및 성충 노린재류 해충 둘 다에서 다중 표적 서열에 영향을 미치는 잠재력은 RNAi 기술을 수반하는 곤충 해충 관리에 대한 지속가능한 접근법을 개발하는 기회를 증가시킬 수 있다.
노린재류 해충 침입의 유전적 방제를 위한 방법 및 조성물이 본원에 개시된다. 노린재류 해충 집단의 RNAi-매개 방제를 위한 표적 유전자로서 사용하기 위한 노린재류 해충의 생활주기에 필수적인 1종 이상의 유전자(들) (예를 들어, 정상 생식 능력 및/또는 배아 및/또는 약충 발생에 필수적인 유전자(들))를 확인하는 방법이 또한 제공된다. RNA 분자를 코딩하는 DNA 플라스미드 벡터는 성장, 생존, 발생, 및/또는 생식에 필수적인 1종 이상의 표적 유전자(들)를 억제하도록 설계될 수 있다. 일부 실시양태에서, RNA 분자는 dsRNA 분자 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 노린재류 해충에서의 표적 유전자의 코딩 또는 비-코딩 서열에 상보적인 핵산 분자를 통해 표적 유전자의 발현을 전사후 저해하거나 또는 표적 유전자를 억제하는 방법이 제공된다. 이들 및 추가 실시양태에서, 노린재류 해충은 표적 유전자의 코딩 또는 비-코딩 서열에 상보적인 핵산 분자의 모두 또는 일부분으로부터 전사된 1종 이상의 dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, 및/또는 hpRNA 분자를 섭취할 수 있고, 이에 의해 식물-보호 효과를 제공할 수 있다.
일부 실시양태는 표적 유전자(들)의 코딩 및/또는 비-코딩 서열에 상보적인 dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA 및/또는 hpRNA를 사용하여 표적 유전자 산물의 발현을 서열 특이적으로 억제함으로써 노린재류 해충의 적어도 부분적 방제를 달성하는 것을 수반한다. 예를 들어, 서열식별번호: 1에 제시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드, 및 그의 단편을 포함하는 단리 및 정제된 핵산 분자의 세트가 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, 안정화된 dsRNA 분자는 표적 유전자의 전사후 침묵 또는 억제를 위해 이들 폴리뉴클레오티드, 그의 단편, 또는 이들 폴리뉴클레오티드 중 1종을 포함하는 유전자로부터 발현될 수 있다. 특정 실시양태에서, 단리 및 정제된 핵산 분자는 서열식별번호: 1 및 2 중 어느 것의 모두 또는 일부를 포함한다.
다른 실시양태는 적어도 1종의 iRNA (예를 들어, dsRNA) 분자(들)를 코딩하는 적어도 1종의 재조합 DNA를 게놈 내에 갖는 재조합 숙주 세포 (예를 들어, 식물 세포)를 수반한다. 특정한 실시양태에서, dsRNA 분자(들)는 노린재류 해충에 의해 섭취되었을 때 생산되어 해충 또는 해충의 자손에서의 표적 유전자를 전사후 침묵시키거나 또는 그의 발현을 억제할 수 있다. 재조합 DNA는, 예를 들어 서열식별번호: 1 및 2 중 어느 것, 서열식별번호: 1 및 2 중 어느 것의 단편, 및 서열식별번호: 1 및 2 중 어느 것을 포함하는 유전자의 부분적 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 및/또는 그의 상보체를 포함할 수 있다.
일부 실시양태는 서열식별번호: 12의 모두 또는 일부 (예를 들어, 서열식별번호: 12 및/또는 서열식별번호: 13)를 포함하는 적어도 1종의 iRNA (예를 들어, dsRNA) 분자(들)를 코딩하는 재조합 DNA를 게놈 내에 갖는 재조합 숙주 세포를 수반한다. 노린재류 해충에 의해 섭취되었을 때, iRNA 분자(들)는 해충 또는 해충의 자손에서의 표적 hunchback 유전자 (예를 들어, 서열식별번호: 1 및 2로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드의 모두 또는 일부를 포함하는 DNA)의 발현을 침묵 또는 억제할 수 있고, 이에 의해 해충에서의 생식, 및/또는 해충의 자손에서의 성장, 발생, 및/또는 섭식의 중지를 유발할 수 있다.
다른 실시양태에서, dsRNA 분자를 형성할 수 있는 적어도 1종의 RNA 분자를 코딩하는 적어도 1종의 재조합 DNA를 게놈 내에 갖는 재조합 숙주 세포는 형질전환된 식물 세포일 수 있다. 일부 실시양태는 이러한 형질전환된 식물 세포를 포함하는 트랜스제닉 식물을 수반한다. 이러한 트랜스제닉 식물에 추가로, 각각의 것이 재조합 DNA(들)를 포함하는 임의의 트랜스제닉 식물 세대의 자손 식물, 트랜스제닉 종자, 및 트랜스제닉 식물 산물이 모두 제공된다. 특정한 실시양태에서, dsRNA 분자를 형성할 수 있는 RNA 분자는 트랜스제닉 식물 세포에서 발현될 수 있다. 따라서, 이들 및 다른 실시양태에서, dsRNA 분자는 트랜스제닉 식물 세포로부터 단리될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 트랜스제닉 식물은 옥수수 (제아 메이스(Zea mays)), 대두 (글리신 맥스(Glycine max)), 목화, 및 포아세아에(Poaceae) 과의 식물을 포함하는 군으로부터 선택된 식물이다.
특정 실시양태는 노린재류 해충 세포에서 표적 유전자의 발현을 조정하는 방법을 수반한다. 이들 및 다른 실시양태에서, dsRNA 분자를 형성할 수 있는 RNA 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자가 제공될 수 있다. 특정한 실시양태에서, dsRNA 분자를 형성할 수 있는 RNA 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있고, 또한 전사 종결 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 노린재류 해충 세포에서 표적 유전자의 발현을 조정하는 방법은 (a) dsRNA 분자를 형성할 수 있는 RNA 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 식물 세포를 형질전환시키는 것; (b) 복수종의 형질전환된 식물 세포를 포함하는 식물 세포 배양물의 발생이 가능하게 하는데 충분한 조건 하에서 형질전환된 식물 세포를 배양하는 것; (c) 벡터가 게놈 내로 통합된 형질전환된 식물 세포를 선택하는 것; 및 (d) 선택된 형질전환된 식물 세포가 벡터의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 dsRNA 분자를 형성할 수 있는 RNA 분자를 포함하는지 여부를 결정하는 것을 포함할 수 있다. 식물은, 게놈 내에 벡터가 통합되어 있으며 벡터의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 dsRNA 분자를 포함하는 식물 세포로부터 재생될 수 있다.
게놈 내로 통합되어 있는, dsRNA 분자를 형성할 수 있는 RNA 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 갖는 벡터를 포함하는 트랜스제닉 식물이며, 여기서 벡터의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 dsRNA 분자를 포함하는 트랜스제닉 식물이 또한 개시된다. 특정한 실시양태에서, 식물에서 dsRNA 분자를 형성할 수 있는 RNA 분자의 발현은 (예를 들어 형질전환된 식물, 식물의 일부 (예를 들어, 잎) 또는 식물 세포를 섭식함으로써) 형질전환된 식물 또는 식물 세포와 접촉하는 노린재류 해충의 세포에서 또는 (예를 들어, 모 전달에 의해) 형질전환된 식물 또는 식물 세포와 접촉하는 노린재류 해충의 자손의 세포에서 표적 유전자의 발현을 조정하여, 해충의 생식이 억제되도록 하는데 충분하다. 본원에 개시된 트랜스제닉 식물은 노린재류 해충 침입으로부터의 내성 및/또는 보호를 나타낼 수 있다. 특정한 트랜스제닉 식물은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 해충(들)로부터의 보호 및/또는 증진된 보호를 나타낼 수 있다: 피에조도루스 구일디니이; 할리모르파 할리스; 네자라 비리둘라; 아크로스테르눔 힐라레; 유쉬스투스 헤로스; 유쉬스투스 세르부스; 키나비아 힐라레; 씨. 마르기나툼; 디켈롭스 멜라칸투스; 디. 푸르카투스; 에데사 메디타분다; 티안타 페르디토르; 호르시아스 노빌렐루스; 타에디아 스티그모사; 디스데르쿠스 페루비아누스; 네오메갈로토무스 파르부스; 렙토글로수스 조나투스; 니에스트레아 시다에; 리구스 헤스페루스; 및 엘. 리네올라리스.
추가로 방제제, 예컨대 iRNA 분자를 노린재류 해충에게 전달하는 방법이 본원에 개시된다. 이러한 방제제는 직접적으로 또는 간접적으로, 섭식, 성장할 수 있는 노린재류 해충 집단의 능력에 장애를 야기할 수 있거나, 또는 다르게는 숙주에 손상을 야기할 수 있다. 일부 실시양태에서, 안정화된 dsRNA 분자를 노린재류 해충에게 전달하여 해충 또는 그의 자손에서의 적어도 1종의 표적 유전자를 억제함으로써, 해충 숙주에서 모 RNAi를 야기하고 식물 손상을 감소 또는 제거하는 것을 포함하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 노린재류 해충에서의 표적 유전자의 발현을 억제하는 방법은 해충에서의 생식, 및/또는 해충의 자손에서의 성장, 발생, 및/또는 섭식의 중지를 유발할 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 iRNA 분자와 접촉하는 해충(들)에서의 사멸을 직접적으로 유발하지 않으면서, 침입시에 후속 해충 세대의 크기를 유의하게 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 또한 iRNA 분자와 접촉하는 해충(들)에서의 사멸을 유발하면서, 침입시에 후속 해충 세대의 크기를 유의하게 감소시킬 수도 있다.
일부 실시양태에서, 노린재류 해충 침입의 제거 또는 감소를 달성하기 위해 식물, 동물, 및/또는 식물 또는 동물의 환경에서 사용하기 위한 iRNA (예를 들어, dsRNA) 분자를 포함하는 조성물 (예를 들어, 국소 조성물)이 제공된다. 특정한 실시양태에서, 조성물은 노린재류 해충에게 섭식시킬 영양 조성물 또는 공급원, 또는 먹이원일 수 있다. 일부 실시양태는 해충에게 이용가능한 영양 조성물 또는 먹이원을 제조하는 것을 포함한다. iRNA 분자를 포함하는 조성물의 섭취는 노린재류 해충의 1개 이상의 세포에 의한 상기 분자의 흡수를 유발할 수 있으며, 이는 차례로 해충의 세포(들) 또는 그의 자손에서의 적어도 1종의 표적 유전자의 발현의 억제를 유발할 수 있다. 노린재류 해충 침입에 의한 식물 또는 식물 세포의 섭취 또는 그에의 손상은, iRNA 분자를 포함하는 1종 이상의 조성물을 해충의 숙주에 제공함으로써 해충이 존재하는 임의의 숙주 조직 또는 환경 내 또는 그 상에서 제한 또는 제거될 수 있다.
본원에 개시된 조성물 및 방법은 노린재류 해충에 의한 손상을 방제하기 위한 다른 방법 및 조성물과 조합되어 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 노린재류 해충으로부터 식물을 보호하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 iRNA 분자는 노린재류 해충에 대해 효과적인 1종 이상의 화학적 작용제, 노린재류 해충에 대해 효과적인 생물살충제, 윤작, 또는 RNAi-매개 방법 및 RNAi 조성물의 특색과 상이한 특색을 나타내는 재조합 유전자 기술 (예를 들어, 노린재류 해충에게 유해한 단백질 (예를 들어, Bt 독소)을 식물에서 재조합적으로 생산하는 것), 및/또는 비-모 iRNA 분자 (예를 들어, iRNA 분자를 섭취하는 노린재류 해충에서의 성장, 발생, 및/또는 섭식의 중지를 유발하는 치사 iRNA 분자)의 재조합 발현의 추가의 사용을 포함하는 방법에서 사용될 수 있다.
II. 약어
BSB 신열대 갈색 노린재 (유쉬스투스 헤로스)
dsRNA 이중-가닥 리보핵산
GI 성장 억제
NCBI 국립 생물 정보 센터
gDNA 게놈 데옥시리보핵산
iRNA 억제 리보핵산
ORF 오픈 리딩 프레임
RNAi 리보핵산 간섭
miRNA 마이크로 리보핵산
siRNA 소형 억제 리보핵산
hpRNA 헤어핀 리보핵산
shRNA 짧은 헤어핀 리보핵산
pRNAi 모 RNA 간섭
UTR 비번역 영역
PCR 폴리머라제 연쇄 반응
qPCR 정량적 폴리머라제 연쇄 반응
RISC RNA-유도 침묵 복합체
RH 상대 습도
SEM 평균의 표준 오차
YFP 황색 형광 단백질
III. 용어
하기하는 설명 및 표에서, 다수의 용어가 사용된다. 주어진 이러한 용어의 범주를 포함한, 본 명세서 및 청구범위의 명확하고 일관된 이해를 제공하기 위해, 하기 정의가 제공된다:
접촉 (유기체와): 핵산 분자와 관련하여 본원에 사용된 용어 유기체 (예를 들어, 노린재류 해충)"와 접촉하다" 또는 "에 의해 흡수되다"는 유기체 내로의 핵산 분자의 내재화, 예를 들어 및 비제한적으로: 유기체에 의한 분자의 섭취 (예를 들어, 섭식에 의해); 핵산 분자를 포함하는 조성물과 유기체를 접촉시키는 것; 및 핵산 분자를 포함하는 용액을 사용하여 유기체를 침지시키는 것.
콘티그: 본원에 사용된 용어 "콘티그"는 단일 유전자 공급원으로부터 유래된 중첩 DNA 절편의 세트로부터 재구축된 DNA 서열을 지칭한다.
옥수수 식물: 본원에 사용된 용어 "옥수수 식물"은 종 제아 메이스의 식물 (메이즈)을 지칭한다.
발현: 본원에 사용된, 코딩 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 유전자 또는 트랜스진)의 "발현"은 핵산 전사 단위 (예를 들어, gDNA 또는 cDNA를 포함함)의 코딩된 정보가 세포의 작동적, 비-작동적, 또는 구조적 일부로 전환되는 과정 (종종 단백질의 합성을 포함함)을 지칭한다. 유전자 발현은 외부 신호; 예를 들어, 세포, 조직, 또는 유기체가 유전자 발현을 증가 또는 감소시키는 작용제에 노출되는 것에 의해 영향을 받을 수 있다. 유전자의 발현은 또한 DNA에서 RNA를 거쳐 단백질로의 경로 중 임의의 곳에서 조절될 수 있다. 유전자 발현의 조절은, 예를 들어, 전사, 번역, RNA 수송 및 프로세싱, 중간체 분자 예컨대 mRNA의 분해에 작용하는 제어를 통해, 또는 특정 단백질 분자가 만들어진 후 그의 활성화, 불활성화, 구획화, 또는 분해를 통해, 또는 그의 조합에 의해 발생한다. 유전자 발현은 노던 블롯, RT-PCR, 웨스턴 블롯, 또는 시험관내, 계내, 또는 생체내 단백질 활성 검정(들)을 비제한적으로 포함하는, 관련 기술 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 RNA 수준 또는 단백질 수준에서 측정될 수 있다.
유전 물질: 본원에 사용된 용어 "유전 물질"은 모든 유전자, 및 핵산 분자, 예컨대 DNA 및 RNA를 포함한다.
노린재류 해충: 본원에 사용된 용어 "노린재류 해충"은 광범위한 숙주 식물을 섭식하고 천공 및 흡즙 구강 부분을 갖는, 예를 들어 및 비제한적으로, 노린재과, 장님노린재과, 별노린재과, 허리노린재과, 호리허리노린재과, 및 잡초노린재과의 곤충을 포함한, 노린재목의 해충 곤충을 지칭한다. 특정한 예에서, 노린재류 해충은 유쉬스투스 헤로스 (파브르.) (신열대 갈색 노린재), 네자라 비리둘라 (엘.) (남부 녹색 노린재), 피에조도루스 구일디니이 (웨스트우드) (적색줄 노린재), 할리오모르파 할리스 (스탈) (썩덩나무노린재), 키나비아 힐라레 (세이) (녹색 노린재), 유쉬스투스 세르부스 (세이) (갈색 노린재), 디켈롭스 멜라칸투스 (달라스), 디켈롭스 푸르카투스 (에프.), 에데사 메디타분다 (에프.), 티안타 페르디토르 (에프.) (신열대 적색 어깨 노린재), 키나비아 마르기나툼 (팔리소 드 보부와), 호르시아스 노빌렐루스 (베르그) (목화 노린재), 타에디아 스티그모사 (베르그), 디스데르쿠스 페루비아누스 (게렝-메네빌), 네오메갈로토무스 파르부스 (웨스트우드), 렙토글로수스 조나투스 (달라스), 니에스트레아 시다에 (에프.), 리구스 헤스페루스 (나이트) (서부 변색 장님노린재), 및 리구스 리네올라리스 (팔리소 드 보부와)를 포함하는 목록으로부터 선택된다.
억제: 본원에 사용된 용어 "억제"는 코딩 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 유전자)에 대한 효과를 기재하는데 사용되는 경우에, 코딩 폴리뉴클레오티드로부터 전사된 mRNA, 및/또는 코딩 폴리뉴클레오티드의 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질 산물의 세포 수준에서의 측정가능한 감소를 지칭한다. 일부 예에서, 코딩 폴리뉴클레오티드의 발현은 발현이 거의 제거될 정도로 억제될 수 있다. "특이적 억제"는 특이적 억제가 달성되는 세포에서 결과적으로 다른 코딩 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 유전자)의 발현에는 영향을 미치지 않으면서 표적 코딩 폴리뉴클레오티드의 억제를 지칭한다.
단리된: "단리된" 생물학적 성분 (예컨대, 핵산 또는 단백질)은 성분이 자연적으로 발생하는 유기체의 세포 내의 다른 생물학적 성분 (즉, 다른 염색체 및 염색체외 DNA 및 RNA, 및 단백질)로부터, 성분에 화학적 또는 기능적 변화를 일으키면서 실질적으로 분리되거나, 그를 제외하고 생산되거나, 또는 그로부터 정제된 것이다 (예를 들어, 핵산은 염색체에 남아있는 DNA에 핵산을 연결하는 화학 결합을 파괴함으로써 염색체로부터 단리될 수 있다). "단리된" 핵산 분자 및 단백질은 표준 정제 방법에 의해 정제된 핵산 분자 및 단백질을 포함한다. 용어는 또한 숙주 세포에서의 재조합 발현에 의해 제조된 핵산 및 단백질, 뿐만 아니라 화학적으로 합성된 핵산 분자, 단백질, 및 펩티드를 포함한다.
핵산 분자: 본원에 사용된 용어 "핵산 분자"는 RNA, cDNA, gDNA, 및 상기의 합성 형태 및 혼합 중합체의 센스 및 안티-센스 가닥 둘 다를 포함할 수 있는, 뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭할 수 있다. 뉴클레오티드 또는 핵염기는 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 뉴클레오티드의 어느 유형의 변형된 형태를 지칭할 수 있다. 본원에 사용된 "핵산 분자"는 "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"와 동의어이다. 달리 명시되지 않는 한, 핵산 분자는 통상적으로 적어도 10개의 염기 길이이다. 관례상, 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열은 분자의 5'에서 3' 말단으로 판독된다. 핵산 분자의 "상보체"는 핵산 분자의 핵염기와 염기쌍을 형성할 수 있는 핵염기를 갖는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다 (즉, A-T/U, 및 G-C).
일부 실시양태는 mRNA 분자의 상보체인 RNA 분자로 전사되는 주형 DNA를 포함하는 핵산을 포함한다. 이들 실시양태에서, mRNA 분자로 전사되는 핵산의 상보체는 5'에서 3' 배향으로 존재하여, RNA 폴리머라제 (DNA를 5'에서 3' 방향으로 전사함)가 mRNA 분자에 혼성화될 수 있는 상보체로부터 핵산을 전사하도록 할 것이다. 따라서, 달리 명백하게 언급되지 않는 한, 또는 달리 문맥으로부터 명확하지 않는 한, 용어 "상보체"는 참조 핵산의 핵염기와 염기 쌍을 형성할 수 있는 5'에서 3'로의 핵염기를 갖는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 유사하게, 달리 명백하게 언급되지 않는 한 (또는 달리 문맥으로부터 명확하지 않는 한), 핵산의 "역 상보체"는 역 배향의 상보체를 지칭한다. 상기는 하기 예시에서 입증된다:
ATGATGATG 폴리뉴클레오티드
TACTACTAC 폴리뉴클레오티드의 "상보체"
CATCATCAT 폴리뉴클레오티드의 "역 상보체"
본 발명의 일부 실시양태는 헤어핀 RNA-형성 RNAi 분자를 포함할 수 있다. 이들 RNAi 분자에서, RNA 간섭에 의해 표적화될 핵산의 상보체 및 역 상보체 둘 다는 동일한 분자에서 발견될 수 있어, 단일-가닥 RNA 분자가 "서로 폴딩"되도록 할 수 있고 상보적 및 역 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 영역에 걸쳐 그 자체에 혼성화되도록 할 수 있다.
"핵산 분자"는 모든 폴리뉴클레오티드, 예를 들어: 단일- 및 이중-가닥 형태의 DNA; 단일-가닥 형태의 RNA; 및 이중-가닥 형태의 RNA (dsRNA)를 포함한다. 용어 "뉴클레오티드 서열" 또는 "핵산 서열"은 개별 단일 가닥으로서 또는 듀플렉스로 핵산의 센스 및 안티센스 가닥 둘 다를 지칭한다. 용어 "리보핵산" (RNA)은 iRNA (억제 RNA), dsRNA (이중 가닥 RNA), siRNA (소형 간섭 RNA), shRNA (소형 헤어핀 RNA), mRNA (메신저 RNA), miRNA (마이크로-RNA), hpRNA (헤어핀 RNA), tRNA (상응하는 아실화된 아미노산이 적재된 또는 적재되지 않은 전달 RNA), 및 cRNA (상보적 RNA)를 포함한다. 용어 "데옥시리보핵산" (DNA)은 cDNA, gDNA, 및 DNA-RNA 하이브리드를 포함한다. 용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산", 및 그의 "단편"은 gDNA, 리보솜 RNA, 전달 RNA, 메신저 RNA, 오페론, 및 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질을 코딩하거나 또는 그를 코딩하도록 적합화될 수 있는 보다 소형의 조작된 폴리뉴클레오티드 모두를 포함하는 용어로서 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해될 것이다.
올리고뉴클레오티드: 올리고뉴클레오티드는 짧은 핵산 중합체이다. 올리고뉴클레오티드는 보다 긴 핵산 절편의 절단에 의해, 또는 개별 뉴클레오티드 전구체를 중합시킴으로써 형성될 수 있다. 자동화 합성기는 최대 수백개의 염기 길이의 올리고뉴클레오티드의 합성을 가능하게 한다. 올리고뉴클레오티드는 상보적 핵산에 결합할 수 있기 때문에, 이들은 DNA 또는 RNA를 검출하기 위한 프로브로서 사용될 수 있다. DNA로 구성된 올리고뉴클레오티드 (올리고데옥시리보뉴클레오티드)는 DNA의 증폭을 위한 기술인 PCR에서 사용될 수 있다. PCR에서, 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 DNA 폴리머라제가 올리고뉴클레오티드를 연장시키고 상보적 가닥을 복제하게 하는 "프라이머"로 지칭된다.
핵산 분자는 자연 발생 및/또는 비-자연 발생 뉴클레오티드 연결에 의해 함께 연결된 자연 발생 및 변형된 뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 인지되는 바와 같이, 핵산 분자는 화학적으로 또는 생화학적으로 변형될 수 있거나, 또는 비-천연 또는 유도체화 뉴클레오티드 염기를 함유할 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어, 표지, 메틸화, 천연 발생 뉴클레오티드 중 1종 이상의 유사체로의 치환, 뉴클레오티드간 변형 (예를 들어, 비하전된 연결: 예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포르아미데이트, 카르바메이트 등; 하전된 연결: 예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등; 펜던트 모이어티: 예를 들어, 펩티드; 삽입제: 예를 들어, 아크리딘, 소랄렌 등; 킬레이트화제; 알킬화제; 및 변형된 연결: 예를 들어, 알파 아노머 핵산 등)을 포함한다. 용어 "핵산 분자"는 또한 단일-가닥, 이중-가닥, 부분적 듀플렉스, 트리플렉스, 헤어핀, 원형, 및 자물쇠형 입체형태를 포함한 임의의 위상 입체형태를 포함한다.
DNA와 관련하여 본원에 사용된 용어 "코딩 폴리뉴클레오티드", "구조적 폴리뉴클레오티드", 또는 "구조적 핵산 분자"는 적절한 조절 요소의 제어 하에 배치된 경우에 전사 및 mRNA를 통해 궁극적으로는 폴리펩티드로 번역되는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. RNA와 관련하여 용어 "코딩 폴리뉴클레오티드"는 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질로 번역되는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 코딩 폴리뉴클레오티드의 경계는 5'-말단에서의 번역 개시 코돈 및 3'-말단에서의 번역 정지 코돈에 의해 결정된다. 코딩 폴리뉴클레오티드는 gDNA; cDNA; EST; 및 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 "전사된 비-코딩 폴리뉴클레오티드"는 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질로 번역되지 않는 mRNA 분자의 절편, 예컨대 5'UTR, 3'UTR 및 인트론 절편을 지칭한다. 추가로, "전사된 비-코딩 폴리뉴클레오티드"는 세포에서 기능하는 RNA, 예를 들어, 구조적 RNA (예를 들어, 5S rRNA, 5.8S rRNA, 16S rRNA, 18S rRNA, 23S rRNA, 및 28S rRNA에 의해 예시되는 바와 같은 리보솜 RNA (rRNA) 등); 전달 RNA (tRNA); 및 snRNA 예컨대 U4, U5, U6 등으로 전사되는 핵산을 지칭한다. 전사된 비-코딩 폴리뉴클레오티드는 또한, 예를 들어 및 비제한적으로, 종종 소형 박테리아 비-코딩 RNA를 기재하는데 사용되는 용어인 소형 RNA (sRNA); 소형 핵소체 RNA (snoRNA); 마이크로RNA; 소형 간섭 RNA (siRNA); Piwi-상호작용 RNA (piRNA); 및 긴 비-코딩 RNA를 포함한다. 또한 추가로, "전사된 비-코딩 폴리뉴클레오티드"는 핵산에서 유전자내 "스페이서"로서 천연적으로 존재할 수 있고 RNA 분자로 전사되는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.
치사 RNA 간섭: 본원에 사용된 용어 "치사 RNA 간섭"은, 예를 들어 dsRNA, miRNA, siRNA, shRNA, 및/또는 hpRNA가 전달되는 대상 개체의 사멸 또는 생존율 감소를 유발하는 RNA 간섭을 지칭한다.
모 RNA 간섭: 본원에 사용된 용어 "모 RNA 간섭" (pRNAi)은, 예를 들어 dsRNA, miRNA, siRNA, shRNA, 및/또는 hpRNA가 전달되는 대상체 (예를 들어, 노린재류 해충)의 자손에서 관찰가능한 RNA 간섭 표현형을 지칭한다. 일부 실시양태에서, pRNAi는 노린재류 해충에게의 dsRNA의 전달을 포함하며, 여기서 해충은 이에 의해 생존 자손을 보다 덜 생산할 수 있게 된다. pRNAi를 개시하는 핵산은 핵산이 전달되는 집단에서 사멸의 발생률을 증가시킬 수 있거나 또는 그렇지 않을 수 있다. 특정 예에서, pRNAi를 개시하는 핵산은 핵산이 전달되는 집단에서 사멸의 발생률을 증가시키지 않는다. 예를 들어, 노린재류 해충의 집단은 pRNAi를 개시하는 1종 이상의 핵산을 섭식할 수 있으며, 여기서 해충은 생존하고 교미하지만, 핵산(들)을 섭식하지 않은 동일한 종의 해충에 의해 생산된 알보다 생존 자손을 덜 부화시킬 수 있는 알을 생산한다. pRNAi의 한 메카니즘에서, 암컷에게 전달된 모 RNAi는 암컷의 자손 배아에서 접합 유전자 발현을 녹다운시킬 수 있다. 문헌 [Bucher et al. (2002) Curr. Biol. 12(3):R85-6].
게놈: 본원에 사용된 용어 "게놈"은 세포의 핵 내에서 발견되는 염색체 DNA를 지칭하고, 또한 세포의 세포하 성분 내에서 발견되는 소기관 DNA를 지칭한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, DNA 분자는 DNA 분자가 식물 세포의 게놈 내로 통합되도록 식물 세포 내로 도입될 수 있다. 이들 및 추가 실시양태에서, DNA 분자는 식물 세포의 핵 DNA 내로 통합될 수 있거나, 또는 식물 세포의 엽록체 또는 미토콘드리아의 DNA 내로 통합될 수 있다. 용어 "게놈"이 박테리아에 적용되는 경우에, 이는 박테리아 세포 내의 염색체 및 플라스미드 둘 다를 지칭한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, DNA 분자는 DNA 분자가 박테리아의 게놈 내로 통합되도록 박테리아 내로 도입될 수 있다. 이들 및 추가 실시양태에서, DNA 분자는 안정한 플라스미드로서 또는 그러한 것으로 염색체-통합 또는 위치할 수 있다.
서열 동일성: 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 관련하여 본원에 사용된 용어 "서열 동일성" 또는 "동일성"은 2개의 분자의 서열에서의 잔기가 명시된 비교 윈도우에 걸쳐 최대 상응도로 정렬된 경우에 동일한 것을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "서열 동일성의 백분율"은 비교 윈도우에 걸쳐 분자의 2개의 최적으로 정렬된 서열 (예를 들어, 핵산 서열 또는 폴리펩티드 서열)을 비교함으로써 결정된 값을 지칭할 수 있으며, 여기서 비교 윈도우에서의 서열의 부분은 2개의 서열의 최적 정렬을 위한 (부가 또는 결실을 포함하지 않는) 참조 서열과 비교하여, 부가 또는 결실 (즉, 갭)을 포함할 수 있다. 서열 둘 다에서 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 발생하는 위치의 수를 결정하여 매칭되는 위치의 수를 산출하고, 매칭되는 위치의 수를 비교 윈도우 내의 위치의 총수로 나누고, 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로서 백분율이 계산된다. 참조 서열과의 비교시에 모든 위치에서 동일한 서열은 참조 서열에 대해 100% 동일하다고 하고, 그 반대의 경우도 그러하다.
비교를 위해 서열을 정렬하는 방법은 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있다. 다양한 프로그램 및 정렬 알고리즘이, 예를 들어 다음에 기재되어 있다: 문헌 [Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443; Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444; Higgins and Sharp (1988) Gene 73:237-44; Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-3; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang et al. (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155-65; Pearson et al. (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-31; Tatiana et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-50]. 서열 정렬 방법 및 상동성 계산에 대한 상세한 고찰은, 예를 들어 문헌 [Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10]에서 찾을 수 있다.
국립 생물 정보 센터 (NCBI)의 베이직 로컬 얼라인머트 서치 툴 (BLAST™; 문헌 [Altschul et al. (1990)])은 여러 서열 분석 프로그램과 함께 사용하기 위해 국립 생물 정보 센터 (메릴랜드주 베데스다) 및 인터넷을 포함하는 여러 출처로부터 이용가능하다. 이 프로그램을 사용하여 서열 동일성을 결정하는 방법의 설명은 인터넷 상에서 BLAST™에 대한 "도움" 섹션 하에 이용가능하다. 핵산 서열의 비교를 위해, 디폴트 파라미터로 설정된 디폴트 BLOSUM62 행렬을 사용하는 BLAST™ (Blastn) 프로그램의 "Blast 2 서열" 기능이 사용될 수 있다. 참조 폴리뉴클레오티드의 서열에 대해 보다 더 큰 서열 유사성을 갖는 핵산은 이 방법에 의해 평가되는 경우에 증가하는 백분율 동일성을 제시할 것이다.
특이적으로 혼성화가능한/특이적으로 상보적인: 본원에 사용된 용어 "특이적으로 혼성화가능한" 및 "특이적으로 상보적인"은 핵산 분자와 표적 핵산 분자 사이에 안정하고 특이적인 결합이 발생할 수 있도록 하는 충분한 정도의 상보성을 나타내는 용어이다. 2개의 핵산 분자 사이의 혼성화는 2개의 핵산 분자의 핵염기 사이의 역평행 정렬의 형성을 수반한다. 이어서, 2개의 분자는 대향 가닥 상의 상응하는 염기와 수소 결합을 형성하여, 충분히 안정한 경우에 관련 기술분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 검출가능한 듀플렉스 분자를 형성할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 특이적으로 혼성화가능한 그의 표적 핵산에 대해 100% 상보적이어야 할 필요는 없다. 그러나, 특이적인 혼성화를 위해 존재해야 하는 상보성의 양은 사용되는 혼성화 조건의 함수이다.
특정한 정도의 엄격도를 유발하는 혼성화 조건은 선택된 혼성화 방법의 성질 및 혼성화 핵산의 조성 및 길이에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 혼성화의 온도 및 혼성화 완충제의 이온 강도 (특히, Na+ 및/또는 Mg++ 농도)가 혼성화의 엄격도를 결정할 것이지만, 세척 시간 또한 엄격도에 영향을 미친다. 특정한 정도의 엄격도를 달성하는데 요구되는 혼성화 조건에 관한 계산은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Sambrook et al. (ed.) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, chapters 9 and 11; 및 Hames and Higgins (eds.) Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, 1985]에 논의되어 있다. 핵산의 혼성화와 관련한 추가의 상세한 지침 및 안내는, 예를 들어 문헌 [Tijssen, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays," in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology- Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2, Elsevier, NY, 1993; 및 Ausubel et al., Eds., Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Greene Publishing and Wiley-Interscience, NY, 1995]에서 찾을 수 있다.
본원에 사용된 "엄격한 조건"은 혼성화 분자의 서열과 표적 핵산 분자 내의 상동 폴리뉴클레오티드 사이에 20% 미만의 미스매치가 존재하는 경우에만 혼성화가 발생하게 하는 조건을 포괄한다. "엄격한 조건"은 추가의 특정한 수준의 엄격도를 포함한다. 따라서, 본원에 사용된 "중간 엄격도" 조건은 20% 초과의 서열 미스매치를 갖는 분자는 혼성화되지 못하게 하는 조건이고; "고 엄격도" 조건은 10% 초과의 미스매치를 갖는 서열은 혼성화되지 못하게 하는 조건이고; "초고도 엄격도" 조건은 5% 초과의 미스매치를 갖는 서열은 혼성화되지 못하게 하는 조건이다.
하기는 대표적인 비제한적 혼성화 조건이다.
고 엄격도 조건 (적어도 90% 서열 동일성을 공유하는 폴리뉴클레오티드를 검출함): 16시간 동안 65℃에서 5x SSC 완충제 중에서의 혼성화; 각각 15분 동안 실온에서 2x SSC 완충제 중에서의 2회 세척; 및 각각 20분 동안 65℃에서 0.5x SSC 완충제 중에서의 2회 세척.
중간 엄격도 조건 (적어도 80% 서열 동일성을 공유하는 폴리뉴클레오티드를 검출함): 16-20시간 동안 65-70℃에서 5x-6x SSC 완충제 중에서의 혼성화; 각각 5-20분 동안 실온에서 2x SSC 완충제 중에서의 2회 세척; 및 각각 30분 동안 55-70℃에서 1x SSC 완충제 중에서의 2회 세척.
비-엄격한 대조군 조건 (적어도 50% 서열 동일성을 공유하는 폴리뉴클레오티드가 혼성화될 것임): 16-20시간 동안 실온 내지 55℃에서 6x SSC 완충제 중에서의 혼성화; 각각 20-30분 동안 실온 내지 55℃에서 2x-3x SSC 완충제 중에서의 적어도 2회 세척.
핵산과 관련하여 본원에 사용된 용어 "실질적으로 상동인" 또는 "실질적 상동성"은 엄격한 조건 하에서 참조 핵산에 혼성화되는 인접 핵염기를 갖는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 예를 들어, 서열식별번호: 1 및 2 중 어느 것의 참조 핵산에 대해 실질적으로 상동인 핵산은 엄격한 조건 (예를 들어, 상기 문헌에 제시된 중간 엄격도 조건) 하에서 서열식별번호: 1 및 2 중 어느 것의 참조 핵산에 혼성화되는 그러한 핵산이다. 실질적으로 상동인 폴리뉴클레오티드는 적어도 80% 서열 동일성을 가질 수 있다. 예를 들어, 실질적으로 상동인 폴리뉴클레오티드는 약 80% 내지 100%, 예컨대 79%; 80%; 약 81%; 약 82%; 약 83%; 약 84%; 약 85%; 약 86%; 약 87%; 약 88%; 약 89%; 약 90%; 약 91%; 약 92%; 약 93%; 약 94% 약 95%; 약 96%; 약 97%; 약 98%; 약 98.5%; 약 99%; 약 99.5%; 및 약 100% 서열 동일성을 가질 수 있다. 실질적 상동성의 특성은 특이적 혼성화와 밀접하게 관련된다. 예를 들어, 핵산 분자는 특이적 결합이 요구되는 조건 하에서, 예를 들어 엄격한 혼성화 조건 하에서 핵산의 비-표적 폴리뉴클레오티드에 대한 비-특이적 결합을 피할 수 있는 충분한 정도의 상보성이 존재하는 경우에 특이적으로 혼성화가능하다.
본원에 사용된 용어 "오르토로그"는 공통 조상 핵산으로부터 진화하였고, 2종 이상의 종에서 동일한 기능을 보유할 수 있는 2종 이상의 종에서의 유전자를 지칭한다.
본원에 사용된 2개의 핵산 분자는 5'에서 3' 방향으로 판독된 폴리뉴클레오티드의 모든 뉴클레오티드가 3'에서 5' 방향으로 판독되었을 때의 다른 폴리뉴클레오티드의 모든 뉴클레오티드에 상보적인 경우에 "완전한 상보성"을 나타낸다고 한다. 참조 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드는 참조 폴리뉴클레오티드의 역 상보체와 동일한 서열을 나타낼 것이다. 이들 용어 및 설명은 관련 기술분야에 널리 정의되어 있고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 이해된다.
작동가능하게 연결된: 제1 폴리뉴클레오티드가 제2 폴리뉴클레오티드와 기능적 관계에 있는 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드는 제2 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결된다. 재조합적으로 생산된 경우에, 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드는 동일한 리딩 프레임 내에서 (예를 들어, 번역 융합된 ORF 내에서) 일반적으로 인접해 있고, 필요할 경우 2개의 단백질-코딩 영역을 연결한다. 그러나, 핵산은 작동가능하게 연결되기 위해 인접해 있을 필요는 없다.
조절 유전자 요소 및 코딩 폴리뉴클레오티드와 관련하여 사용되는 경우의 용어 "작동가능하게 연결된"은 조절 요소가 연결된 코딩 폴리뉴클레오티드의 발현에 영향을 미친다는 것을 의미한다. "조절 요소" 또는 "제어 요소"는 전사의 시기 및 수준/양, RNA 프로세싱 또는 안정성, 또는 연관된 코딩 폴리뉴클레오티드의 번역에 영향을 미치는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 조절 요소는 프로모터; 번역 리더; 인트론; 인핸서; 스템-루프 구조; 리프레서 결합 폴리뉴클레오티드; 종결 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드; 폴리아데닐화 인식 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 등을 포함할 수 있다. 특정한 조절 요소는 그에 작동가능하게 연결된 코딩 폴리뉴클레오티드의 상류 및/또는 하류에 위치할 수 있다. 또한, 코딩 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 특정한 조절 요소는 이중-가닥 핵산 분자의 연관된 상보적 가닥 상에 위치할 수 있다.
프로모터: 본원에 사용된 용어 "프로모터"는 전사 개시로부터 상류에 위치할 수 있고, RNA 폴리머라제 및 전사를 개시하는 다른 단백질의 인식 및 결합에 수반될 수 있는 DNA 영역을 지칭한다. 프로모터는 세포에서의 발현을 위한 코딩 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결될 수 있거나, 또는 프로모터는 세포에서의 발현을 위한 코딩 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결될 수 있는 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결될 수 있다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터일 수 있다. 발생적 제어 하에 있는 프로모터의 예는 특정 조직, 예컨대 잎, 뿌리, 종자, 섬유, 물관, 헛물관, 또는 후막조직에서 전사를 우선적으로 개시하는 프로모터를 포함한다. 이러한 프로모터는 "조직-선호"인 것으로 지칭된다. 단지 특정 조직에서만 전사를 개시하는 프로모터는 "조직-특이적"인 것으로 지칭된다. "세포 유형-특이적" 프로모터는 주로 1종 이상 기관에서의 특정 세포 유형, 예를 들어 뿌리 또는 잎에서의 도관 세포에서 발현을 구동한다. "유도성" 프로모터는 환경 제어 하에 있을 수 있는 프로모터일 수 있다. 유도성 프로모터에 의해 전사를 개시할 수 있는 환경 조건의 예는 혐기성 조건 및 광의 존재를 포함한다. 조직-특이적, 조직-선호, 세포 유형 특이적, 및 유도성 프로모터는 "비-구성적" 프로모터의 부류를 구성한다. "구성적" 프로모터는 대부분의 환경 조건 하에서 또는 대부분의 세포 또는 조직 유형에서 활성일 수 있는 프로모터이다.
본 발명의 일부 실시양태에서 임의의 유도성 프로모터가 사용될 수 있다. 문헌 [Ward et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22:361-366]을 참조한다. 유도성 프로모터 하에, 유도제에 대한 반응으로 전사율이 증가한다. 예시적인 유도성 프로모터는 다음을 포함하나 이에 제한되지 않는다: 구리에 반응하는 ACEI 시스템으로부터의 프로모터; 벤젠술폰아미드 제초제 완화제에 대해 반응하는, 메이즈로부터의 In2 유전자; Tn10으로부터의 Tet 리프레서; 및 글루코코르티코스테로이드 호르몬에 의해 전사 활성이 유도될 수 있는 스테로이드 호르몬 유전자로부터의 유도성 프로모터 (Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:0421).
예시적인 구성적 프로모터로는 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 식물 바이러스로부터의 프로모터, 예컨대 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV)로부터의 35S 프로모터; 벼 액틴 유전자로부터의 프로모터; 유비퀴틴 프로모터; pEMU; MAS; 메이즈 H3 히스톤 프로모터; 및 브라시카 나푸스(Brassica napus) ALS3 구조적 유전자에 대해 5'에 있는 Xba1/NcoI 단편인 ALS 프로모터 (또는 상기 Xba1/NcoI 단편에 유사한 폴리뉴클레오티드) (국제 PCT 공개 번호 WO96/30530).
추가적으로, 본 발명의 일부 실시양태에서 임의의 조직-특이적 또는 조직-선호 프로모터가 이용될 수 있다. 조직-특이적 프로모터에 작동가능하게 연결된 코딩 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자로 형질전환된 식물은 특이적 조직에서 배타적으로 또는 우선적으로 코딩 폴리뉴클레오티드의 산물을 생산할 수 있다. 예시적인 조직-특이적 또는 조직-선호 프로모터는 다음을 포함하나 이에 제한되지 않는다: 종자-선호 프로모터, 예컨대 파세올린 유전자로부터의 것; 잎-특이적 및 광-유도성 프로모터, 예컨대 cab 또는 rubisco로부터의 것; 또 다른-특이적 프로모터, 예컨대 LAT52로부터의 것; 화분-특이적 프로모터, 예컨대 Zm13으로부터의 것; 및 소포자-선호 프로모터, 예컨대 apg로부터의 것.
대두 식물: 본원에 사용된 용어 "대두 식물"은 종 글리신 종의 식물; 예를 들어 지. 맥스를 지칭한다.
형질전환: 본원에 사용된 용어 "형질전환" 또는 "형질도입"은 1종 이상의 핵산 분자(들)를 세포 내로 전달하는 것을 지칭한다. 세포 내로 형질도입된 핵산 분자가 핵산 분자의 세포 게놈 내로의 혼입에 의해 또는 에피솜 복제 의해 세포에 의해 안정하게 복제되는 경우에 세포는 상기 핵산 분자에 의해 "형질전환된다". 본원에 사용된 용어 "형질전환"은 핵산 분자를 이러한 세포 내로 도입시킬 수 있는 모든 기술을 포괄한다. 예는 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 바이러스 벡터를 사용한 형질감염; 플라스미드 벡터를 사용한 형질전환; 전기천공 (Fromm et al. (1986) Nature 319:791-3); 리포펙션 (Felgner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7); 미세주사 (Mueller et al. (1978) Cell 15:579-85); 아그로박테리움-매개 전달 (Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7); 직접적 DNA 흡수; 및 미세발사체 충격 (Klein et al. (1987) Nature 327:70).
트랜스진: 외인성 핵산. 일부 예에서, 트랜스진은 노린재류 해충에서 발견되는 핵산 분자에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 dsRNA 분자를 형성할 수 있는 RNA의 한 가닥 또는 둘 다의 가닥(들)을 코딩하는 DNA일 수 있다. 추가의 예에서, 트랜스진은 안티센스 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 여기서 안티센스 폴리뉴클레오티드의 발현은 표적 핵산의 발현을 억제하고, 이에 의해 모 RNAi 표현형을 생성한다. 추가의 예에서, 트랜스진은 유전자 (예를 들어, 제초제-내성 유전자, 산업상 또는 제약상 유용한 화합물을 코딩하는 유전자, 또는 바람직한 농업 형질을 코딩하는 유전자)일 수 있다. 이들 및 다른 예에서, 트랜스진은 트랜스진의 코딩 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 조절 요소 (예를 들어, 프로모터)를 함유할 수 있다.
벡터: 예를 들어 형질전환된 세포를 생산하기 위해 세포 내로 도입되는 핵산 분자. 벡터는 숙주 세포에서 복제될 수 있도록 허용하는 유전자 요소, 예컨대 복제 기점을 포함할 수 있다. 벡터의 예는 다음을 포함하나 이에 제한되지 않는다: 외인성 DNA를 세포 내로 운반하는 플라스미드; 코스미드; 박테리오파지; 또는 바이러스. 벡터는 또한 안티센스 분자를 생성하는 것, 및/또는 선택 마커 유전자 및 관련 기술분야에 공지된 다른 유전 요소를 포함한 1종 이상의 유전자를 포함할 수 있다. 벡터는 세포에 형질도입되거나, 세포를 형질감염시키거나, 또는 세포를 감염시켜, 세포가 벡터에 의해 코딩된 핵산 분자 및/또는 단백질을 발현하도록 할 수 있다. 벡터는 임의로 핵산 분자의 세포 내 진입을 달성하는데 보조하는 물질 (예를 들어, 리포솜, 단백질 코팅 등)을 포함한다.
수확량: 동일한 시기에 동일한 조건 하에서 성장한 동일한 성장 위치에 있는 대비 품종의 수확량에 비해 약 100% 또는 그 초과의 안정화된 수확량. 특정한 실시양태에서, "개선된 수확량" 또는 "수확량 개선"은 품종이, 동일한 시기에 동일한 조건 하에서 성장한 작물에게 유해하며 본원의 조성물 및 방법에 의해 표적화되는 노린재류 해충을 유의한 밀도로 함유하는 동일한 성장 위치에 있는 대비 품종의 수확량에 비해 105% 또는 그 초과의 안정화된 수확량을 갖는 것을 의미한다.
구체적으로 지시 또는 암시되지 않는 한, 용어 단수 형태는 본원에 사용된 "적어도 1개"를 의미한다.
달리 구체적으로 설명되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 분자 생물학에서의 통상의 용어에 관한 정의는, 예를 들어 문헌 [Lewin's Genes X, Jones & Bartlett Publishers, 2009 (ISBN 10 0763766321); Krebs et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); 및 Meyers R.A. (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)]에서 찾을 수 있다. 달리 언급되지 않는 한 모든 퍼센트는 중량 기준이고, 모든 용매 혼합물 비율은 부피 기준이다. 모든 온도는 섭씨 온도이다.
IV. 노린재류 해충 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자
A. 개관
노린재류 해충의 방제에 유용한 핵산 분자가 본원에 기재된다. 기재된 핵산 분자는 표적 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 천연 유전자, 및 비-코딩 폴리뉴클레오티드), dsRNA, siRNA, shRNA, hpRNA, 및 miRNA를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 노린재류 해충에서의 1종 이상의 천연 핵산의 모두 또는 일부에 특이적으로 상보적일 수 있는 dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, 및/또는 hpRNA 분자가 기재된다. 이들 및 추가 실시양태에서, 천연 핵산(들)은 1종 이상의 표적 유전자(들)일 수 있고, 그의 산물은, 예를 들어 및 비제한적으로: 생식 과정에 수반될 수 있거나 또는 약충 발생에 수반될 수 있다. 본원에 기재된 핵산 분자는 핵산 분자가 특이적으로 상보적인 적어도 1종의 천연 핵산(들)을 포함하는 세포 내로 (예를 들어, 모 전달을 통해) 도입된 경우에, 세포에서 RNAi를 개시할 수 있고, 결과적으로 천연 핵산(들)의 발현을 감소 또는 제거할 수 있다. 일부 예에서, 특이적으로 상보적인 핵산 분자에 의한 표적 유전자의 발현의 감소 또는 제거는 노린재류 해충에서의 생식, 및/또는 해충의 자손에서의 성장, 발생, 및/또는 섭식의 감소 또는 중지를 유발할 수 있다. 이들 방법은 iRNA 분자와 접촉하는 해충(들)에서의 사멸을 직접적으로 유발하지 않으면서, 침입시에 후속 해충 세대의 크기를 유의하게 감소시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 노린재류 해충에서의 적어도 1종의 표적 유전자가 선택될 수 있으며, 여기서 표적 유전자는 hunchback 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정한 예에서, 노린재류 해충에서의 표적 유전자가 선택되며, 여기서 표적 유전자는 서열식별번호: 1 및 2 중 어느 것 중에서 선택된 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
다른 실시양태에서, 표적 유전자는 hunchback 폴리뉴클레오티드의 단백질 산물 (즉, HUNCHBACK 폴리펩티드, 예를 들어, 서열식별번호: 3)의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 85% 동일한 (예를 들어, 적어도 84%, 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 약 100%, 또는 100% 동일한) 인접 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로 인 실리코 역번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자일 수 있다. 표적 유전자는 노린재류 해충에서의 임의의 핵산일 수 있으며, 그의 전사후 억제는 해충이 생존 자손을 생산하는 능력에 대해 유해 효과를 나타내어, 예를 들어 식물에게 해충에 대한 보호 이익을 제공한다. 특정한 예에서, 표적 유전자는 서열식별번호: 1의 인 실리코 번역 산물인 아미노산 서열에 대해 적어도 약 85% 동일한, 약 90% 동일한, 약 95% 동일한, 약 96% 동일한, 약 97% 동일한, 약 98% 동일한, 약 99% 동일한, 약 100% 동일한, 또는 100% 동일한 인접 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로 인 실리코 역번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자이다.
일부 실시양태에서, 노린재류 해충에서의 코딩 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 천연 RNA 분자의 모두 또는 일부에 특이적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 RNA 분자를 발현을 통해 생성하는 DNA가 제공된다. 일부 실시양태에서, 발현된 RNA 분자가 노린재류 해충에 의해 섭취된 후에, 해충의 세포에서 또는 해충의 자손의 세포에서 코딩 폴리뉴클레오티드의 하향-조절이 얻어질 수 있다. 특정한 실시양태에서, 노린재류 해충의 세포에서의 코딩 폴리뉴클레오티드의 하향-조절은 해충에서의 생식 및/또는 증식, 및/또는 해충의 자손에서의 성장, 발생, 및/또는 섭식의 감소 또는 중지를 유발할 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 전사된 비-코딩 RNA, 예컨대 5'UTR; 3'UTR; 스플라이싱된 리더; 인트론; 아우트론 (예를 들어, 트랜스 스플라이싱으로 후속 변형되는 5'UTR RNA); 도나트론 (예를 들어, 트랜스 스플라이싱을 위한 공여자 서열을 제공하는데 요구되는 비-코딩 RNA); 및 표적 노린재류 해충 유전자의 다른 비-코딩 전사된 RNA를 포함한다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 모노-시스트론 및 폴리-시스토론 유전자 둘 다로부터 유래될 수 있다.
따라서, 또한 본원에는 일부 실시양태와 관련하여 노린재류 해충에서의 표적 핵산의 모두 또는 일부에 특이적으로 상보적인 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 iRNA 분자 (예를 들어, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, 및 hpRNA)가 기재된다. 일부 실시양태에서, iRNA 분자는 복수종의 표적 핵산; 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10종 또는 그 초과의 표적 핵산의 모두 또는 일부에 상보적인 폴리뉴클레오티드(들)를 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, iRNA 분자는 유전자 변형된 유기체, 예컨대 식물 또는 박테리아에 의해 시험관내 또는 생체내에서 생산될 수 있다. 또한, 노린재류 해충에서의 표적 핵산의 모두 또는 일부에 특이적으로 상보적인 dsRNA 분자, siRNA 분자, miRNA 분자, shRNA 분자, 및/또는 hpRNA 분자의 생산에 사용될 수 있는 cDNA가 개시된다. 특정한 숙주 표적의 안정한 형질전환을 달성하는데 사용하기 위한 재조합 DNA 구축물이 추가로 기재된다. 형질전환된 숙주 표적은 재조합 DNA 구축물로부터 dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, 및/또는 hpRNA 분자를 유효 수준으로 발현할 수 있다. 따라서, 또한 식물 세포에서 기능적인 이종 프로모터에 작동가능하게 연결된 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물 형질전환 벡터이며, 여기서 폴리뉴클레오티드(들)의 발현은 노린재류 해충에서의 표적 핵산의 모두 또는 일부에 특이적으로 상보적인 인접 핵염기의 스트링을 포함하는 RNA 분자를 생성하는 것인, 식물 형질전환 벡터가 기재된다.
특정한 실시양태에서, 노린재류 해충의 방제에 유용한 핵산 분자는 다음을 포함할 수 있다: hunchback 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유쉬스투스로부터 단리된 천연 핵산의 모두 또는 일부 (예를 들어, 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2); 발현된 경우에, hunchback에 의해 코딩되는 천연 RNA 분자의 모두 또는 일부에 특이적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 RNA 분자를 생성하는 DNA; hunchback에 의해 코딩되는 RNA 분자의 모두 또는 일부에 특이적으로 상보적인 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 iRNA 분자 (예를 들어, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, 및 hpRNA); hunchback에 의해 코딩되는 RNA 분자의 모두 또는 일부에 특이적으로 상보적인 dsRNA 분자, siRNA 분자, miRNA 분자, shRNA 분자, 및/또는 hpRNA 분자의 생산에 사용될 수 있는 cDNA; 및 특정한 숙주 표적의 안정한 형질전환을 달성하는데 사용하기 위한 재조합 DNA 구축물 (여기서 형질전환된 숙주 표적은 상기 핵산 분자 중 1종 이상을 포함함).
B. 핵산 분자
본 발명은 특히 노린재류 해충의 세포, 조직, 또는 기관에서의 표적 유전자 발현을 억제하는 iRNA (예를 들어, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, 및 hpRNA) 분자; 및 세포 또는 미생물에서 노린재류 해충의 세포, 조직, 또는 기관에서의 표적 유전자 발현을 억제하는 iRNA 분자로서 발현될 수 있는 DNA 분자를 제공한다.
본 발명의 일부 실시양태는 서열식별번호: 1; 서열식별번호: 1의 상보체; 서열식별번호: 1의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드 (예를 들어, 적어도 19개의 인접 뉴클레오티드)의 단편 (예를 들어, 서열식별번호: 2); 서열식별번호: 1의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체; 서열식별번호: 1을 포함하는 노린재류 유기체 (예를 들어, BSB)의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드; 서열식별번호: 1을 포함하는 노린재류 유기체의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드의 상보체; 서열식별번호: 1을 포함하는 노린재류 유기체의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 및 서열식별번호: 1을 포함하는 노린재류 유기체의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종 (예를 들어, 1, 2, 3종 또는 그 초과)의 폴리뉴클레오티드(들)를 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 특정한 실시양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드의 노린재류 해충과의 접촉 또는 그에 의한 흡수는 해충의 성장, 발생, 생식 및/또는 섭식을 억제한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 단리된 핵산 분자는 서열식별번호: 12; 서열식별번호: 12의 상보체; 서열식별번호: 13; 서열식별번호: 13의 상보체; 서열식별번호: 12 또는 서열식별번호: 13의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 서열식별번호: 12 또는 서열식별번호: 13의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체; 서열식별번호: 1을 포함하는 유전자로부터 노린재류 유기체에서 전사된 천연 폴리리보뉴클레오티드; 서열식별번호: 1을 포함하는 유전자로부터 노린재류 유기체에서 전사된 천연 폴리리보뉴클레오티드의 상보체; 서열식별번호: 1을 포함하는 유전자로부터 노린재류 유기체에서 전사된 천연 폴리리보뉴클레오티드의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 및 서열식별번호: 1을 포함하는 유전자로부터 노린재류 유기체에서 전사된 천연 폴리리보뉴클레오티드의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종 (예를 들어, 1, 2, 3종 또는 그 초과)의 폴리뉴클레오티드(들)를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드의 노린재류 해충과의 접촉 또는 그에 의한 흡수는 해충의 성장, 발생, 생식 및/또는 섭식을 억제한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 핵산 분자는 세포 또는 미생물에서 노린재류 해충의 세포, 조직, 또는 기관에서의 표적 유전자 발현을 억제하는 iRNA 분자로서 발현될 수 있는 적어도 1종 (예를 들어, 1, 2, 3종 또는 그 초과)의 DNA(들)를 포함할 수 있다. 이러한 DNA(들)는 dsRNA 분자(들)를 형성할 수 있는 코딩된 RNA의 전사를 개시 또는 증진시키는 DNA 분자를 포함하는 세포에서 기능하는 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 한 실시양태에서, 적어도 1종 (예를 들어, 1, 2, 3종 또는 그 초과)의 DNA(들)는 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드로부터 유래될 수 있다. 서열식별번호: 1의 유도체는 서열식별번호: 1의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 단편은, 예를 들어 서열식별번호: 1의 적어도 약 15개의 인접 뉴클레오티드 또는 그의 상보체를 포함할 수 있다. 따라서, 이러한 단편은, 예를 들어, 서열식별번호: 1의 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200개 또는 그 초과의 인접 뉴클레오티드 또는 그의 상보체를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 이러한 단편은, 예를 들어 서열식별번호: 1의 적어도 19개의 인접 뉴클레오티드 (예를 들어, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개의 인접 뉴클레오티드) 또는 그의 상보체를 포함할 수 있다.
일부 실시양태는 부분적- 또는 완전-안정화된 dsRNA 분자를 노린재류 해충 내로 도입하여 노린재류 해충의 세포, 조직, 또는 기관에서의 표적 유전자 발현을 억제하는 것을 포함한다. iRNA 분자 (예를 들어, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, 및 hpRNA)로서 발현되고, 노린재류 해충에 의해 흡수된 경우에, 서열식별번호: 1 및/또는 서열식별번호: 2의 1종 이상의 단편, 및 그의 상보체를 포함하는 폴리뉴클레오티드는 사멸, 발생 정지, 성장 억제, 성비의 변화, 한배새끼 크기의 감소, 감염의 중지, 및/또는 노린재류 해충에 의한 섭식의 중지 중 1종 이상을 야기할 수 있다. 특정한 예에서, 서열식별번호: 1 및/또는 서열식별번호: 2의 1종 이상의 단편 (예를 들어, 약 15 내지 약 300개의 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드); 및 그의 상보체를 포함하는 폴리뉴클레오티드는 해충의 후속 세대를 생산하는 해충의 기존 세대의 능력의 감소를 야기한다.
특정한 실시양태에서, 본 발명에 의해 제공된 dsRNA 분자는 서열식별번호: 1 및/또는 서열식별번호: 2를 포함하는 표적 유전자로부터의 전사체에 상보적인 폴리뉴클레오티드, 및/또는 서열식별번호: 1 및/또는 서열식별번호: 2의 단편에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 노린재류 해충에서의 상기 표적 유전자의 억제는 해충 또는 해충의 자손의 성장, 발생, 또는 다른 생물학적 기능에 필수적인 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 작용제의 감소 또는 제거를 유발한다. 선택된 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 1 및/또는 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 1 및/또는 서열식별번호: 2의 인접 단편, 또는 상기 중 어느 것의 상보체에 대해 약 80% 내지 약 100% 서열 동일성을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 선택된 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 1 및/또는 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 1 및/또는 서열식별번호: 2의 인접 단편, 또는 상기 중 어느 것의 상보체에 대해 79%; 80%; 약 81%; 약 82%; 약 83%; 약 84%; 약 85%; 약 86%; 약 87%; 약 88%; 약 89%; 약 90%; 약 91%; 약 92%; 약 93%; 약 94% 약 95%; 약 96%; 약 97%; 약 98%; 약 98.5%; 약 99%; 약 99.5%; 또는 약 100% 서열 동일성을 나타낼 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포 또는 미생물에서 표적 유전자 발현을 억제하는 iRNA 분자로서 발현될 수 있는 DNA 분자는 1종 이상의 표적 노린재류 해충 종에서 발견되는 천연 폴리뉴클레오티드의 모두 또는 일부에 특이적으로 상보적인 단일 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있거나, 또는 DNA 분자는 복수종의 이러한 특이적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드로부터의 키메라로서 구축될 수 있다.
다른 실시양태에서, 핵산 분자는 "링커"에 의해 이격되어 있는 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 링커는, 목적하는 경우에, 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드 사이의 2차 구조 형성을 용이하게 하는 임의의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 영역일 수 있다. 한 실시양태에서, 링커는 mRNA에 대한 센스 또는 안티센스 코딩 폴리뉴클레오티드의 일부이다. 대안적으로, 링커는 핵산 분자에 공유적으로 연결될 수 있는 뉴클레오티드 또는 그의 상동체의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 링커는 인트론 (예를 들어, ST-LS1 인트론으로서)을 포함할 수 있다.
예를 들어, 일부 실시양태에서, DNA 분자는 1종 이상의 상이한 RNA 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 여기서 각각의 상이한 RNA 분자는 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드는 서로에 상보적이다. 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드는 RNA 분자 내에서 스페이서에 의해 연결될 수 있다. 스페이서는 제1 폴리뉴클레오티드 또는 제2 폴리뉴클레오티드의 일부를 구성할 수 있다. 제1 및 제2 뉴클레오티드 폴리뉴클레오티드를 포함하는 RNA 분자의 발현은 제1 및 제2 뉴클레오티드 폴리뉴클레오티드의 특이적 분자내 염기-쌍형성에 의해 본 발명의 dsRNA 분자의 형성으로 이어질 수 있다. 제1 폴리뉴클레오티드 또는 제2 폴리뉴클레오티드는 노린재류 해충에 천연인 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 표적 유전자, 또는 전사된 비-코딩 폴리뉴클레오티드), 그의 유도체, 또는 그에 상보적인 폴리뉴클레오티드에 대해 실질적으로 동일할 수 있다.
dsRNA 핵산 분자는 중합된 리보뉴클레오티드의 이중 가닥을 포함하고, 포스페이트-당 백본 또는 뉴클레오시드에 대한 변형을 포함할 수 있다. RNA 구조에서의 변형은 특이적 억제가 가능하도록 맞추어질 수 있다. 한 실시양태에서, dsRNA 분자는 편재하는 효소적 방법을 통해 변형될 수 있어 siRNA 분자가 생성되도록 할 수 있다. 이 효소적 방법은 시험관내 또는 생체내에서 RNase III 효소, 예컨대 진핵생물에서는 DICER를 이용할 수 있다. 문헌 [Elbashir et al. (2001) Nature 411:494-8; 및 Hamilton and Baulcombe (1999) Science 286(5441):950-2]을 참조한다. DICER 또는 기능적 등가 RNase III 효소는 보다 큰 dsRNA 가닥 및/또는 hpRNA 분자를, 각각이 약 19-25개의 뉴클레오티드 길이인 보다 작은 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, siRNA)로 절단한다. 이들 효소에 의해 생산된 siRNA 분자는 2 내지 3개의 뉴클레오티드 3' 오버행, 및 5' 포스페이트 및 3' 히드록실 말단을 갖는다. RNase III 효소에 의해 생성된 siRNA 분자는 풀려있고, 세포에서 단일 가닥 RNA로 분리된다. 이어서, siRNA 분자는 표적 유전자로부터 전사된 RNA와 특이적으로 혼성화되고, 후속적으로 둘 다의 RNA 분자는 고유한 세포 RNA-분해 메카니즘에 의해 분해된다. 이 과정은 표적 유기체에서의 표적 유전자에 의해 코딩된 RNA의 효과적 분해 또는 제거를 유발할 수 있다. 결과는 표적화된 유전자의 전사후 침묵이다. 일부 실시양태에서, 내인성 RNase III 효소에 의해 이종 핵산 분자로부터 생산된 siRNA 분자는 노린재류 해충에서의 표적 유전자의 하향-조절을 효율적으로 매개할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 핵산 분자는 분자간 혼성화를 통해 생체내에서 dsRNA 분자를 형성할 수 있는 단일 가닥 RNA 분자로 전사될 수 있는 적어도 1종의 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 이러한 dsRNA는 전형적으로 자기-조립될 수 있고, 표적 유전자의 전사후 억제를 달성하기 위해 노린재류 해충의 영양 공급원으로 제공될 수 있다. 이들 및 추가 실시양태에서, 본 발명의 핵산 분자는, 각각 노린재류 해충에서의 상이한 표적 유전자에 특이적으로 상보적인 상이한 2종의 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이러한 핵산 분자가 dsRNA 분자로서 노린재류 해충에게 제공되는 경우에, dsRNA 분자는 해충에서의 적어도 2종의 상이한 표적 유전자의 발현을 억제한다.
C. 핵산 분자 수득
노린재류 해충에서의 다양한 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 핵산 분자, 예컨대 iRNA 및 iRNA를 코딩하는 DNA 분자의 설계를 위한 표적으로서 사용될 수 있다. 그러나, 천연 폴리뉴클레오티드의 선택은 간단한 과정이 아니다. 노린재류 해충에서의 단지 소수의 천연 폴리뉴클레오티드만이 효과적인 표적일 것이다. 예를 들어, 특정한 천연 폴리뉴클레오티드가 본 발명의 핵산 분자에 의해 효과적으로 하향-조절될 수 있는지 여부, 또는 특정한 천연 폴리뉴클레오티드의 하향-조절이 노린재류 해충의 성장, 생존율, 증식, 및/또는 생식에 대해 유해 효과를 나타낼 수 있는지 여부는 확신을 가지고 예측할 수 없다. 대다수의 천연 노린재류 해충 폴리뉴클레오티드, 예컨대 이들로부터 단리된 EST는 해충의 성장, 생존율, 증식, 및/또는 생식에 대해 유해 효과를 나타내지 않는다. 노린재류 해충에 대해 유해 효과를 나타낼 수 있는 천연 폴리뉴클레오티드 중 어느 것이 숙주 식물에서 이러한 천연 폴리뉴클레오티드에 상보적인 핵산 분자를 발현하고 숙주 식물에는 해를 끼치지 않으면서 해충이 섭식하였을 때에 그에 대해 유해 효과를 제공하기 위한 재조합 기술에 사용될 수 있는지를 예측하는 것은 불가능하다.
특정한 실시양태에서, 본 발명의 핵산 분자 (예를 들어, 노린재류 해충의 숙주 식물에 제공될 dsRNA 분자)는, 예컨대 대사 또는 이화 생화학적 경로, 세포 분열, 생식, 에너지 대사, 배아 발생, 약충 발생, 전사 조절 등에 수반되는 폴리펩티드와 같이, 노린재류 해충 생식 및/또는 발생에 필수적인 단백질 또는 단백질의 일부를 코딩하는 cDNA를 표적화하는 것으로 선택된다. 본원에 기재된 바와 같이, 1종 이상의 dsRNA (이의 적어도 1개의 절편은 표적 해충 유기체의 세포에서 생산된 RNA의 적어도 실질적으로 동일한 절편에 특이적으로 상보적임)를 함유하는 조성물이 표적 유기체와 접촉하면 (예를 들어, 주사 또는 국소 접촉에 의함) 교미하거나, 산란하거나, 또는 생존 자손을 생산하는 능력의 실패 또는 감소를 유발할 수 있다. 노린재류 해충으로부터 유래된 DNA 또는 RNA인 폴리뉴클레오티드를 사용하여 해충에 의한 침입에 대해 저항성인 식물 세포를 구축할 수 있다. 예를 들어, 노린재류 해충의 숙주 식물 (예를 들어, 지. 메이스, 지. 맥스, 및 목화)은 본원에 제공된 바와 같은 노린재류 해충으로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 중 1종 이상을 함유하도록 형질전환될 수 있다. 숙주 내로 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 형질전환된 숙주 내의 세포에서 또는 생물학적 유체에서 dsRNA 구조로 형성되는 1종 이상의 RNA를 코딩할 수 있고, 이에 따라 해충이 트랜스제닉 숙주와 영양적 관계를 맺게 되면/그러한 때에 dsRNA는 이용가능하다. 이는 해충의 세포에서의 1종 이상의 유전자의 발현의 억제, 및 궁극적으로 생식 및/또는 발생의 억제를 유발할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본질적으로 노린재류 해충의 성장, 발생 및 생식에 수반되는 유전자가 표적화된다. 본 발명에서 사용하기 위한 다른 표적 유전자는, 예를 들어 노린재류 해충 생존율, 운동, 이동, 성장, 발생, 감염성, 및 섭식 장소 확립에서 중요한 역할을 하는 것을 포함할 수 있다. 따라서, 표적 유전자는 하우스키핑 유전자 또는 전사 인자일 수 있다. 추가적으로, 본 발명에서 사용하기 위한 천연 노린재류 해충 폴리뉴클레오티드는 또한 식물, 바이러스, 박테리아 또는 곤충 유전자의 상동체 (예를 들어, 오르토로그)로부터 유래될 수 있으며, 그의 기능은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 그의 폴리뉴클레오티드는 표적 노린재류 해충의 게놈 중 표적 유전자와 특이적으로 혼성화가능하다. 혼성화에 의해 공지된 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자의 상동체를 확인하는 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 iRNA (예를 들어, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, 및 hpRNA) 분자를 생산하기 위한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자를 수득하는 방법을 제공한다. 하나의 이러한 실시양태는 (a) 노린재류 해충에서 dsRNA-매개 유전자 억제시에 1종 이상의 표적 유전자(들)를 그의 발현, 기능, 및 표현형에 대해 분석하는 단계; (b) dsRNA-매개 억제 분석에서 변경된 (예를 들어 감소된) 생식 또는 발생 표현형을 나타내는 표적화된 노린재류 해충으로부터의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상동체의 모두 또는 일부분을 포함하는 프로브로 cDNA 또는 gDNA 라이브러리를 프로빙하는 단계; (c) 프로브와 특이적으로 혼성화되는 DNA 클론을 확인하는 단계; (d) 단계 (b)에서 확인된 DNA 클론을 단리하는 단계; (e) 단계 (d)에서 단리된 클론을 포함하는 cDNA 또는 gDNA 단편을 서열분석하며, 여기서 서열분석된 핵산 분자는 RNA 또는 그의 상동체의 모두 또는 상당 부분을 포함하는 것인 단계; 및 (f) 유전자, 또는 siRNA, miRNA, hpRNA, mRNA, shRNA, 또는 dsRNA의 모두 또는 상당 부분을 화학적으로 합성하는 단계를 포함한다.
추가 실시양태에서, iRNA (예를 들어, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, 및 hpRNA) 분자의 상당 부분을 생산하기 위한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 단편을 수득하는 방법은 (a) 표적화된 노린재류 해충으로부터의 천연 폴리뉴클레오티드의 일부분에 특이적으로 상보적인 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드 프라이머를 합성하는 단계; 및 (b) 단계 (a)의 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 클로닝 벡터에 존재하는 cDNA 또는 gDNA 삽입물을 증폭시키며, 여기서 증폭된 핵산 분자는 siRNA, miRNA, hpRNA, mRNA, shRNA, 또는 dsRNA 분자의 상당 부분을 포함하는 것인 단계를 포함한다.
본 발명의 핵산은 수많은 접근법에 의해 단리, 증폭, 또는 생산될 수 있다. 예를 들어, iRNA (예를 들어, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, 및 hpRNA) 분자는 gDNA 또는 cDNA 라이브러리로부터 유래된 표적 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 표적 유전자 또는 표적 전사된 비-코딩 폴리뉴클레오티드) 또는 그의 부분의 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다. DNA 또는 RNA는 표적 유기체로부터 추출될 수 있고, 핵산 라이브러리는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법을 사용하여 그로부터 제조될 수 있다. 표적 유기체로부터 생성된 gDNA 또는 cDNA 라이브러리는 표적 유전자의 PCR 증폭 및 서열분석에 사용될 수 있다. 확인된 PCR 산물은 시험관내 전사를 위한 주형으로서 사용되어 최소 프로모터로 센스 및 안티센스 RNA가 생성될 수 있다. 대안적으로, 핵산 분자는 자동화 DNA 합성기 (예를 들어, 피.이. 바이오시스템즈, 인크.(P.E. Biosystems, Inc.) (캘리포니아주 포스터 시티) 모델 392 또는 394 DNA/RNA 합성기)를 사용하는 것, 표준 화학, 예컨대 포스포르아미다이트 화학을 사용하는 것을 포함한 임의의 수많은 기술에 의해 합성될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Ozaki et al. (1992) Nucleic Acids Research, 20: 5205-5214; 및 Agrawal et al. (1990) Nucleic Acids Research, 18: 5419-5423] 참조). 예를 들어, 문헌 [Beaucage et al. (1992) Tetrahedron, 48: 2223-2311]; 미국 특허 4,980,460, 4,725,677, 4,415,732, 4,458,066, 및 4,973,679를 참조한다. 비-천연 백본 기, 예컨대 포스포로티오에이트, 포스포르아미다이트 등을 생성하는 대안적 화학이 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 RNA, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, 또는 hpRNA 분자는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 수동 또는 자동 반응을 통해, 또는 생체내 RNA, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, 또는 hpRNA 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자를 포함하는 세포에서 화학적으로 또는 효소적으로 생산될 수 있다. RNA는 또한 부분적 또는 총 유기 합성에 의해 생산될 수 있고; 임의의 변형된 리보뉴클레오티드는 시험관내 효소적 또는 유기 합성에 의해 도입될 수 있다. RNA 분자는 세포 RNA 폴리머라제 또는 박테리오파지 RNA 폴리머라제 (예를 들어, T3 RNA 폴리머라제, T7 RNA 폴리머라제, 및 SP6 RNA 폴리머라제)에 의해 합성될 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 클로닝 및 발현에 유용한 발현 구축물은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 국제 PCT 공개 번호 WO97/32016; 및 미국 특허 5,593,874, 5,698,425, 5,712,135, 5,789,214, 및 5,804,693을 참조한다. 화학적으로 또는 시험관내 효소적 합성에 의해 합성되는 RNA 분자는 세포 내로 도입되기 전에 정제될 수 있다. 예를 들어, RNA 분자는 용매 또는 수지를 사용한 추출, 침전, 전기영동, 크로마토그래피, 또는 그의 조합에 의해 혼합물로부터 정제될 수 있다. 대안적으로, 화학적으로 또는 시험관내 효소적 합성에 의해 합성되는 RNA 분자는, 예를 들어 샘플 프로세싱에 기인한 손실을 피하기 위해 정제 없이 또는 최소의 정제로 사용될 수 있다. RNA 분자는 보관을 위해 건조될 수 있거나 또는 수용액 중에 용해될 수 있다. 용액은 dsRNA 분자 듀플렉스 가닥의 어닐링 및/또는 안정화를 촉진하기 위해 완충제 또는 염을 함유할 수 있다.
실시양태에서, dsRNA 분자는 단일 자기-상보적 RNA 가닥에 의해 또는 2개의 상보적 RNA 가닥으로부터 형성될 수 있다. dsRNA 분자는 생체내 또는 시험관내에서 합성될 수 있다. 세포의 내인성 RNA 폴리머라제는 생체내에서 1 또는 2개 RNA 가닥의 전사를 매개할 수 있거나, 또는 클로닝된 RNA 폴리머라제는 생체내 또는 시험관내에서 전사를 매개하는데 사용될 수 있다. 노린재류 해충에서의 표적 유전자의 전사후 억제는 (예를 들어, 조직-특이적 프로모터의 사용에 의해) 숙주의 기관, 조직, 또는 세포 유형에서의 특이적 전사에 의해; (예를 들어, 감염, 스트레스, 온도, 및/또는 화학 유도제에 대해 반응성인 유도성 프로모터의 사용에 의해) 숙주에서의 환경 조건의 자극에 의해; 및/또는 (예를 들어, 발생 단계-특이적 프로모터의 사용에 의해) 숙주의 발생 단계 또는 연령에서의 전사 조작 의해 숙주-표적화될 수 있다. 시험관내 또는 생체내에서 전사되었든지 간에, dsRNA 분자를 형성하는 RNA 가닥은 폴리아데닐화될 수 있거나 또는 그럴 수 없고, 세포의 번역 기구에 의해 폴리펩티드로 번역될 수 있거나 또는 그럴 수 없다.
D. 재조합 벡터 및 숙주 세포 형질전환
일부 실시양태에서, 본 발명은 또한 세포 (예를 들어, 박테리아 세포, 효모 세포, 또는 식물 세포) 내로 도입시키기 위한 DNA 분자이며, RNA로 발현되어 노린재류 해충에 의해 섭취되었을 때, 해충의 세포, 조직, 또는 기관에서의 표적 유전자의 억제를 달성하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 DNA 분자를 제공한다. 따라서, 일부 실시양태는 식물 세포에서 노린재류 해충에서의 표적 유전자 발현을 억제하는 iRNA (예를 들어, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, 및 hpRNA) 분자로서 발현될 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 핵산 분자를 제공한다. 발현을 개시 또는 증진시키기 위해, 이러한 재조합 핵산 분자는 1종 이상의 조절 요소를 포함할 수 있으며, 이 조절 요소는 iRNA로서 발현될 수 있는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결될 수 있다. 식물에서 유전자 억제 분자를 발현하는 방법은 공지되어 있고, 이를 사용하여 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 발현할 수 있다. 예를 들어, 국제 PCT 공개 번호 WO06/073727; 및 미국 특허 공개 번호 2006/0200878 Al을 참조한다.
구체적 실시양태에서, 본 발명의 재조합 DNA 분자는 dsRNA 분자를 형성할 수 있는 RNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이러한 재조합 DNA 분자는 섭취시에 노린재류 해충 세포에서의 내인성 표적 유전자(들)의 발현을 억제할 수 있는 dsRNA 분자를 형성할 수 있는 RNA를 코딩할 수 있다. 많은 실시양태에서, 전사된 RNA는 안정화된 형태로; 예를 들어 헤어핀 및 스템 및 루프 구조로 제공될 수 있는 dsRNA 분자를 형성할 수 있다.
다른 실시양태에서, dsRNA 분자의 한 가닥은 서열식별번호: 1; 서열식별번호: 2; 서열식별번호: 1의 상보체; 서열식별번호: 2의 상보체; 서열식별번호: 1 및/또는 2의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 서열식별번호: 1 및/또는 2의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체; 서열식별번호: 1 및/또는 2를 포함하는 노린재류 유기체 (예를 들어, BSB)의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드; 서열식별번호: 1 및/또는 2를 포함하는 노린재류 유기체의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드의 상보체; 서열식별번호: 1 및/또는 2를 포함하는 노린재류 유기체의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 및 서열식별번호: 1 및/또는 2를 포함하는 노린재류 유기체의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드에 대해 실질적으로 상동인 폴리뉴클레오티드로부터의 전사에 의해 형성될 수 있다.
특정한 실시양태에서, dsRNA 분자를 형성할 수 있는 RNA를 코딩하는 재조합 DNA 분자는, 적어도 2종의 폴리뉴클레오티드가 적어도 1종의 프로모터에 대해 한 폴리뉴클레오티드는 센스 배향이고 다른 폴리뉴클레오티드는 안티센스 배향이도록 배열되고, 센스 폴리뉴클레오티드 및 안티센스 폴리뉴클레오티드가, 예를 들어 약 5 (~5) 내지 약 1000 (~1000)개의 뉴클레오티드의 스페이서에 의해 연결 또는 결합되어 있는 코딩 영역을 포함할 수 있다. 스페이서는 센스 및 안티센스 폴리뉴클레오티드 사이에 루프를 형성할 수 있다. 센스 폴리뉴클레오티드 또는 안티센스 폴리뉴클레오티드는 표적 유전자 (예를 들어, 서열식별번호: 1을 포함하는 hunchback 유전자) 또는 그의 단편에 의해 코딩된 RNA에 대해 실질적으로 상동일 수 있다. 그러나, 일부 실시양태에서, 재조합 DNA 분자는 스페이서가 없는 dsRNA 분자를 형성할 수 있는 RNA를 코딩할 수 있다. 실시양태에서, 센스 코딩 폴리뉴클레오티드 및 안티센스 코딩 폴리뉴클레오티드는 상이한 길이일 수 있다.
노린재류 해충에 대해 유해 효과를 나타내거나 또는 노린재류 해충과 관련하여 식물-보호 효과를 나타내는 것으로 확인된 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 재조합 핵산 분자에서 적절한 발현 카세트의 생성을 통해 발현된 dsRNA 분자 내로 용이하게 혼입될 수 있다. 예를 들어, 이러한 폴리뉴클레오티드는 표적 유전자 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 서열식별번호: 1, 및 상기 중 어느 것의 단편을 포함하는 hunchback 유전자)에 의해 코딩된 RNA에 상응하는 제1 절편을 취하고; 이 폴리뉴클레오티드를, 제1 절편에 상동 또는 상보적이 아닌 제2 절편 스페이서 영역에 연결하고; 이것을 제3 절편에 연결하며, 여기서 제3 절편의 적어도 일부분은 제1 절편에 실질적으로 상보적인 것에 의해 스템 및 루프 구조를 갖는 헤어핀으로서 발현될 수 있다. 이러한 구축물은 제1 절편과 제3 절편과의 분자내 염기-쌍형성에 의해 스템 및 루프 구조를 형성하며, 여기서 제2 절편을 포함하는 루프 구조가 형성된다. 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2002/0048814 및 2003/0018993; 및 국제 PCT 공개 번호 WO94/01550 및 WO98/05770을 참조한다. dsRNA 분자는, 예를 들어 이중-가닥 구조의 형태로, 예컨대 스템-루프 구조 (예를 들어, 헤어핀)로 생성될 수 있고, 이에 의해 천연 노린재류 해충 폴리뉴클레오티드에 대해 표적화된 siRNA의 생산은, 예를 들어 추가의 식물 발현가능한 카세트 상에서 표적화된 유전자의 단편의 공동-발현에 의해 증진되어, 증진된 siRNA 생산으로 이어지거나 또는 메틸화가 감소되어 dsRNA 헤어핀 프로모터의 전사 유전자 침묵이 방지된다.
본 발명의 실시양태는 본 발명의 재조합 핵산 분자를 식물 내로 도입 (즉, 형질전환)하여 1종 이상의 iRNA 분자의 노린재류 해충-억제 수준의 발현을 달성하는 것을 포함한다. 재조합 DNA 분자는, 예를 들어 벡터, 예컨대 선형 또는 폐쇄 원형 플라스미드일 수 있다. 벡터 시스템은 단일 벡터 또는 플라스미드, 또는 숙주의 게놈 내로 도입될 총 DNA를 함께 함유하는 2종 이상의 벡터 또는 플라스미드일 수 있다. 추가로, 벡터는 발현 벡터일 수 있다. 본 발명의 핵산은, 예를 들어 적합하게는 1종 이상의 숙주에서 연결된 코딩 폴리뉴클레오티드 또는 다른 DNA 요소의 발현을 구동하도록 기능하는 적합한 프로모터의 제어 하의 벡터 내로 삽입될 수 있다. 이 목적을 위해 많은 벡터가 이용가능하고, 적절한 벡터의 선택은 벡터 내로 삽입될 핵산의 크기 및 벡터로 형질전환될 특정한 숙주 세포에 주로 좌우될 것이다. 각각의 벡터는 그의 기능 (예를 들어, DNA의 증폭 또는 DNA의 발현), 및 그와 상용성인 특정한 숙주 세포에 따라 다양한 성분을 함유한다.
트랜스제닉 식물에 노린재류 해충으로부터의 보호를 부여하기 위해, 재조합 DNA는, 예를 들어 재조합 식물의 조직 또는 유체 내에서 iRNA 분자 (예를 들어, dsRNA 분자를 형성하는 RNA 분자)로 전사될 수 있다. iRNA 분자는 숙주 식물 종에게 손상을 야기할 수 있는 노린재류 해충 내의 상응하는 전사된 폴리뉴클레오티드에 실질적으로 상동이고 그에 특이적으로 혼성화가능한 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 노린재류 해충은, 예를 들어 iRNA 분자를 포함하는 트랜스제닉 숙주 식물의 세포 또는 유체를 섭취함으로써 트랜스제닉 숙주 식물의 세포에서 전사되는 iRNA 분자와 접촉할 수 있다. 따라서, 표적 유전자의 발현은 트랜스제닉 숙주 식물에 침입하는 노린재류 해충 내에서의 iRNA 분자에 의해 억제된다. 일부 실시양태에서, 표적 노린재류 해충에서의 표적 유전자의 발현의 억제는 식물이 해충에 의한 공격에 대해 내성이 있도록 할 수 있다.
본 발명의 재조합 핵산 분자로 형질전환된 식물 세포와 영양적 관계를 맺고 있는 노린재류 해충에게 iRNA 분자를 전달할 수 있도록 하기 위해서는, 식물 세포에서의 iRNA 분자의 발현 (즉, 전사)이 요구된다. 따라서, 재조합 핵산 분자는 숙주 세포, 예컨대 핵산 분자가 증폭되는 박테리아 세포 및 핵산 분자가 발현되는 식물 세포에서 기능하는 1종 이상의 조절 요소, 예컨대 이종 프로모터 요소에 작동가능하게 연결된 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 핵산 분자에서 사용하기에 적합한 프로모터로는 유도성, 바이러스성, 합성, 또는 구성적 프로모터를 포함하며, 이는 모두 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 이러한 프로모터를 기재하는 비제한적 예는 미국 특허 6,437,217 (메이즈 RS81 프로모터); 5,641,876 (벼 액틴 프로모터); 6,426,446 (메이즈 RS324 프로모터); 6,429,362 (메이즈 PR-1 프로모터); 6,232,526 (메이즈 A3 프로모터); 6,177,611 (구성적 메이즈 프로모터); 5,322,938, 5,352,605, 5,359,142, 및 5,530,196 (CaMV 35S 프로모터); 6,433,252 (메이즈 L3 올레오신 프로모터); 6,429,357 (벼 액틴 2 프로모터, 및 벼 액틴 2 인트론); 6,294,714 (광-유도성 프로모터); 6,140,078 (염-유도성 프로모터); 6,252,138 (병원체-유도성 프로모터); 6,175,060 (인 결핍-유도성 프로모터); 6,388,170 (양방향 프로모터); 6,635,806 (감마-코익신 프로모터); 및 미국 특허 공개 번호 2009/757,089 (메이즈 엽록체 알돌라제 프로모터)를 포함한다. 추가의 프로모터는 노팔린 신타제 (NOS) 프로모터 (Ebert et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(16):5745-9) 및 옥토핀 신타제 (OCS) 프로모터 (이는 아그로박테리움 투메파시엔스의 종양-유도 플라스미드 상에 운반됨); 콜리모바이러스 프로모터 예컨대 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 19S 프로모터 (Lawton et al. (1987) Plant Mol. Biol. 9:315-24); CaMV 35S 프로모터 (Odell et al. (1985) Nature 313:810-2); 피그워트 모자이크 바이러스 35S-프로모터 (Walker et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(19):6624-8); 수크로스 신타제 프로모터 (Yang and Russell (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4144-8); R 유전자 복합체 프로모터 (Chandler et al. (1989) Plant Cell 1:1175-83); 클로로필 a/b 결합 단백질 유전자 프로모터; CaMV 35S (미국 특허 5,322,938, 5,352,605, 5,359,142, 및 5,530,196); FMV 35S (미국 특허 6,051,753, 및 5,378,619); PC1SV 프로모터 (미국 특허 5,850,019); SCP1 프로모터 (미국 특허 6,677,503); 및 AGRtu.nos 프로모터 (진뱅크(GenBank)™ 수탁 번호 V00087; 문헌 [Depicker et al. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:561-73; Bevan et al. (1983) Nature 304:184-7])를 포함한다.
특정한 실시양태에서, 본 발명의 핵산 분자는 조직-특이적 프로모터, 예컨대 잎-특이적 프로모터 또는 화분-특이적 프로모터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 기재된 바와 같이, 본 발명에 따른 노린재류 해충 방제를 위한 폴리뉴클레오티드 또는 단편은, 그 폴리뉴클레오티드 또는 단편에 대해 반대 전사 방향으로 배향되어 있으며 트랜스제닉 식물 세포에서 작동가능한 2종의 조직-특이적 프로모터 사이에 클로닝될 수 있고, 그 안에서 발현되어 트랜스제닉 식물 세포에서 RNA 분자를 생산할 수 있고, 이는 후속적으로 dsRNA 분자를 형성할 수 있다. 식물 조직에서 발현된 iRNA 분자는 노린재류 해충에 의해 섭취되어 표적 유전자 발현의 억제가 달성되도록 할 수 있다.
임의로 관심 핵산 분자에 작동가능하게 연결될 수 있는 추가의 조절 요소는 프로모터 요소와 번역 리더 요소로서 기능하는 코딩 폴리뉴클레오티드 사이에 위치하는 5'UTR을 포함한다. 번역 리더 요소는 완전-프로세싱된 mRNA에 존재하며, 그것은 1차 전사체의 프로세싱, 및/또는 RNA 안정성에 영향을 미칠 수 있다. 번역 리더 요소의 예는 메이즈 및 페튜니아 열 쇼크 단백질 리더 (미국 특허 5,362,865), 식물 바이러스 코트 단백질 리더, 식물 루비스코 리더 등을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Turner and Foster (1995) Molecular Biotech. 3(3):225-36]을 참조한다. 5'UTR의 비제한적 예는 GmHsp (미국 특허 5,659,122); PhDnaK (미국 특허 5,362,865); AtAnt1; TEV (Carrington and Freed (1990) J. Virol. 64:1590-7); 및 AGRtunos (진뱅크™ 수탁 번호 V00087; 및 문헌 [Bevan et al. (1983) Nature 304:184-7])를 포함한다.
임의로 관심 핵산 분자에 작동가능하게 연결될 수 있는 추가의 조절 요소는 또한 3' 비-번역 요소, 3' 전사 종결 영역, 또는 폴리아데닐화 영역을 포함한다. 이들은 폴리뉴클레오티드의 하류에 위치한 유전 요소이며, 폴리아데닐화 신호, 및/또는 전사 또는 mRNA 프로세싱에 영향을 미칠 수 있는 다른 조절 신호를 제공하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 폴리아데닐화 신호는 식물에서 mRNA 전구체의 3' 말단에 대한 폴리아데닐레이트 뉴클레오티드의 부가를 야기하도록 기능한다. 폴리아데닐화 요소는 다양한 식물 유전자로부터, 또는 T-DNA 유전자로부터 유래될 수 있다. 3' 전사 종결 영역의 비제한적 예는 노팔린 신타제 3' 영역 (nos 3'; 문헌 [Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7])이다. 상이한 3' 비번역 영역의 사용 예는 문헌 [Ingelbrecht et al. (1989) Plant Cell 1:671-80]에 제공되어 있다. 폴리아데닐화 신호의 비제한적 예는 피숨 사티붐(Pisum sativum) RbcS2 유전자 (Ps.RbcS2-E9; 문헌 [Coruzzi et al. (1984) EMBO J. 3:1671-9]) 및 AGRtu.nos (진뱅크™ 수탁 번호 E01312)로부터의 것을 포함한다.
일부 실시양태는 본 발명의 1종 이상의 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 상기 기재된 조절 요소 중 적어도 1종을 포함하는 단리 및 정제된 DNA 분자를 포함하는 식물 형질전환 벡터를 포함할 수 있다. 발현된 경우에, 1종 이상의 폴리뉴클레오티드는 노린재류 해충에서의 천연 RNA 분자의 모두 또는 일부에 특이적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 1종 이상의 RNA 분자(들)를 생성한다. 따라서, 폴리뉴클레오티드(들)는 표적화된 노린재류 해충 RNA 전사체 내에 존재하는 폴리리보뉴클레오티드의 모두 또는 일부를 코딩하는 절편을 포함할 수 있고, 표적화된 해충 전사체의 모두 또는 일부의 역위 반복부를 포함할 수 있다. 식물 형질전환 벡터는 1종 초과의 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드를 함유할 수 있으며, 이에 따라 표적 노린재류 해충의 1종 이상의 집단 또는 종의 세포에서의 2종 이상의 유전자의 발현을 억제하기 위한 1종 초과의 dsRNA가 생산될 수 있다. 상이한 유전자에 존재하는 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드의 절편은 트랜스제닉 식물에서의 발현을 위해 단일 조성 핵산 분자로 조합될 수 있다. 이러한 절편은 인접해 있을 수 있거나 또는 스페이서에 의해 이격되어 있을 수 있다.
다른 실시양태에서, 이미 본 발명의 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드(들)를 함유하는 본 발명의 플라스미드는 동일한 플라스미드에서 추가의 폴리뉴클레오티드(들)의 순차적 삽입에 의해 변형될 수 있으며, 여기서 추가의 폴리뉴클레오티드(들)는 원래의 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드(들)와 동일한 조절 요소에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 다중 표적 유전자의 억제를 위해 설계될 수 있다. 일부 실시양태에서, 억제될 다중 유전자는 동일한 노린재류 해충 종으로부터 수득될 수 있으며, 이는 핵산 분자의 유효성을 증진시킬 수 있다. 다른 실시양태에서, 유전자는 상이한 노린재류 해충으로부터 유래될 수 있으며, 이는 작용제(들)가 유효한 해충의 범위를 확장할 수 있다. 억제를 위해 또는 발현 및 억제의 조합을 위해 다중 유전자가 표적화되는 경우에, 폴리시스트론 DNA 요소가 조작될 수 있다.
본 발명의 재조합 핵산 분자 또는 벡터는 식물 세포와 같은 형질전환된 세포 상에 선택가능한 표현형을 부여하는 선택 마커를 포함할 수 있다. 선택 마커는 본 발명의 재조합 핵산 분자를 포함하는 식물 또는 식물 세포를 선택하는데 또한 사용될 수 있다. 마커는 살생물제 저항성, 항생제 저항성 (예를 들어, 카나마이신, 제네티신 (G418), 블레오마이신, 히그로마이신 등), 또는 제초제 내성 (예를 들어, 글리포세이트 등)을 코딩할 수 있다. 선택 마커의 예는, 카라마이신 저항성을 코딩하며 카라마이신, G418 등을 사용하여 선택될 수 있는 neo 유전자; 비알라포스 저항성을 코딩하는 bar 유전자; 글리포세이트 저항성을 코딩하는 돌연변이 EPSP 신타제 유전자; 브로목시닐에 대한 저항성을 부여하는 니트릴라제 유전자; 이미다졸리논 또는 술포닐우레아 저항성을 부여하는 돌연변이 아세토락테이트 신타제 유전자 (ALS); 및 메토트렉세이트 저항성 DHFR 유전자를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 암피실린, 블레오마이신, 클로람페니콜, 겐타마이신, 히그로마이신, 카나마이신, 린코마이신, 메토트렉세이트, 포스피노트리신, 퓨로마이신, 스펙티노마이신, 리팜피신, 스트렙토마이신 및 테트라시클린 등에 대한 저항성을 부여하는 다중 선택 마커가 이용가능하다. 이러한 선택 마커의 예는, 예를 들어 미국 특허 5,550,318; 5,633,435; 5,780,708; 및 6,118,047에 예시되어 있다.
본 발명의 재조합 핵산 분자 또는 벡터는 또한 스크리닝 마커를 포함할 수 있다. 스크리닝 마커는 발현을 모니터링하는데 사용될 수 있다. 예시적인 스크리닝 마커는 다양한 발색원성 기질이 공지되어 있는 효소를 코딩하는 β-글루쿠로니다제 또는 uidA 유전자 (GUS) (Jefferson et al. (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405); 식물 조직에서 안토시아닌 안료 (적색)의 생산을 조절하는 산물을 코딩하는 R-유전자좌 유전자 (Dellaporta et al. (1988) "Molecular cloning of the maize R-nj allele by transposon tagging with Ac." In 18th Stadler Genetics Symposium, P. Gustafson and R. Appels, eds. (New York: Plenum), pp. 263-82); β-락타마제 유전자 (Sutcliffe et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3737-41); 다양한 발색원성 기질이 공지되어 있는 효소를 코딩하는 유전자 (예를 들어, PADAC, 발색원성 세팔로스포린); 루시페라제 유전자 (Ow et al. (1986) Science 234:856-9); 발색원성 카테콜을 전환시킬 수 있는 카테콜 디옥시게나제를 코딩하는 xylE 유전자 (Zukowski et al. (1983) Gene 46(2-3):247-55); 아밀라제 유전자 (Ikatu et al. (1990) Bio/Technol. 8:241-2); 티로신을 DOPA 및 도파퀴논 (이는 차례로 멜라닌으로 축합됨)으로 산화시킬 수 있는 효소를 코딩하는 티로시나제 유전자 (Katz et al. (1983) J. Gen. Microbiol. 129:2703-14); 및 α-갈락토시다제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 기재된 바와 같은 재조합 핵산 분자는 노린재류 해충에 대해 감소된 감수성을 나타내는 트랜스제닉 식물을 제조하기 위해 트랜스제닉 식물의 생성 및 식물에서의 이종 핵산의 발현 방법에 사용될 수 있다. 식물 형질전환 벡터는, 예를 들어 iRNA 분자를 코딩하는 핵산 분자를 식물 형질전환 벡터 내로 삽입하고, 이들을 식물 내로 도입함으로써 제조될 수 있다.
숙주 세포의 형질전환을 위한 적합한 방법은, 예컨대 원형질체의 형질전환에 의해 (예를 들어, 미국 특허 5,508,184 참조), 데시케이션/억제-매개 DNA 흡수에 의해 (예를 들어, 문헌 [Potrykus et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199:183-8] 참조), 전기천공에 의해 (예를 들어, 미국 특허 5,384,253 참조), 탄화규소 섬유와의 교반에 의해 (예를 들어, 미국 특허 5,302,523 및 5,464,765 참조), 아그로박테리움-매개 형질전환에 의해 (예를 들어, 미국 특허 5,563,055; 5,591,616; 5,693,512; 5,824,877; 5,981,840; 및 6,384,301 참조) 및 DNA-코팅된 입자의 가속화에 의해 (예를 들어, 미국 특허 5,015,580; 5,550,318; 5,538,880; 6,160,208; 6,399,861; 및 6,403,865 참조) 등 DNA를 세포 내로 도입할 수 있는 임의의 방법을 포함한다. 옥수수를 형질전환시키는데 특히 유용한 기술은, 예를 들어 미국 특허 7,060,876 및 5,591,616; 및 국제 PCT 공개 WO95/06722에 기재되어 있다. 이들과 같은 기술의 적용을 통해, 사실상 임의의 종의 세포는 안정하게 형질전환될 수 있다. 일부 실시양태에서, 형질전환 DNA는 숙주 세포의 게놈 내로 통합된다. 다세포 종의 경우에, 트랜스제닉 세포는 트랜스제닉 유기체로 재생될 수 있다. 임의의 이들 기술을 사용하여, 예를 들어 트랜스제닉 식물의 게놈 중 1종 이상의 iRNA 분자를 코딩하는 1종 이상의 핵산을 포함하는 트랜스제닉 식물을 생산할 수 있다.
발현 벡터를 식물 내로 도입하는데 가장 폭넓게 이용되는 방법은 아그로박테리움의 천연 형질전환 시스템을 기반으로 한다. 에이. 투메파시엔스(A. tumefaciens) 및 에이. 리조게네스(A. rhizogenes)는 식물 세포를 유전적으로 형질전환시키는 식물 병원성 토양 박테리아이다. 에이. 투메파시엔스 및 에이. 리조게네스의 Ti 및 Ri 플라스미드는 각각 식물의 유전적 형질전환을 담당하는 유전자를 운반한다. Ti (종양-유도)-플라스미드는 형질전환된 식물로 전달되는, T-DNA로서 공지된 큰 절편을 함유한다. Ti 플라스미드의 또 다른 절편인 Vir 영역은 T-DNA 전달을 담당한다. T-DNA 영역은 말단 반복부에 의해 접경되어 있다. 변형된 이원 벡터에서, 종양-유도 유전자는 결실되어 있고, Vir 영역의 기능은 T-DNA 경계 요소에 의해 접경된 외래 DNA를 전달하는데 이용된다. T-영역은 또한 트랜스제닉 세포 및 식물의 효율적인 회수를 위한 선택 마커, 및 dsRNA 코딩 핵산과 같은 전달용 폴리뉴클레오티드의 삽입을 위한 다중 클로닝 부위를 함유할 수 있다.
일부 실시양태에서, 식물 형질전환 벡터는 에이. 투메파시엔스의 Ti 플라스미드 (예를 들어, 미국 특허 4,536,475, 4,693,977, 4,886,937, 및 5,501,967; 및 유럽 특허 번호 EP 0 122 791 참조) 또는 에이. 리조게네스의 Ri 플라스미드로부터 유래된다. 추가의 식물 형질전환 벡터는, 예를 들어 및 비제한적으로, 문헌 [Herrera-Estrella et al. (1983) Nature 303:209-13; Bevan et al. (1983) Nature 304:184-7; Klee et al. (1985) Bio/Technol. 3:637-42]; 및 유럽 특허 번호 EP 0 120 516에 기재된 것, 및 상기 중 어느 것으로부터 유래된 것을 포함한다. 식물과 상호작용하는 다른 박테리아 예컨대 시노리조비움(Sinorhizobium), 리조비움(Rhizobium), 및 메소리조비움(Mesorhizobium)은 천연으로 변형되어 수많은 다양한 식물에게의 유전자 전달을 매개할 수 있다. 이들 식물-연관 공생 박테리아는 무력화된 Ti 플라스미드 및 적합한 이원 벡터 둘 다의 획득에 의해 유전자 전달에 적격으로 만들어질 수 있다.
외인성 DNA를 수용자 세포에 제공한 후, 형질전환된 세포는 일반적으로 추가 배양 및 식물 재생을 위해 확인된다. 형질전환된 세포를 확인하는 능력을 개선시키기 위해, 형질전환체를 생성하는데 사용된 형질전환 벡터와 함께, 상기 제시된 바와 같은 선택 또는 스크리닝 마커 유전자를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 선택 마커가 사용되는 경우에, 형질전환된 세포를 선택적 작용제 또는 작용제들에 노출시킴으로써 잠재적으로 형질전환된 세포 집단 내에서 형질전환된 세포가 확인된다. 스크리닝 마커가 사용되는 경우에, 세포는 목적하는 마커 유전자 형질에 대해 스크리닝될 수 있다.
선택적 작용제에 대한 노출에서 생존하는 세포, 또는 스크리닝 검정에서 양성으로 점수화된 세포는 식물의 재생을 지지하는 배지에서 배양될 수 있다. 일부 실시양태에서, 추가 물질, 예컨대 성장 조절제를 포함하는 것에 의해 임의의 적합한 식물 조직 배양 배지 (예를 들어, MS 및 N6 배지)가 변형될 수 있다. 식물 재생 노력을 시작하도록 충분한 조직이 이용가능할 때까지, 또는 반복된 회차의 수동 선택 후에, 조직의 형태가 재생에 적합할 때까지 (예를 들어, 적어도 2주), 조직은 성장 조절제를 갖는 기본 배지 상에서 유지된 다음, 싹 형성에 도움이 되는 배지로 전달될 수 있다. 충분한 싹 형성이 발생할 때까지 배양물은 주기적으로 전달된다. 싹이 형성되면, 이들은 뿌리 형성에 도움이 되는 배지로 전달된다. 충분한 뿌리가 형성되면, 식물은 추가 성장 및 성숙을 위해 토양으로 전달될 수 있다.
재생 식물에 관심 핵산 분자 (예를 들어, 노린재류 해충에서의 표적 유전자 발현을 억제하는 1종 이상의 iRNA 분자를 코딩하는 DNA 서열)의 존재를 확인하기 위해, 다양한 검정이 수행될 수 있다. 이러한 검정은, 예를 들어 분자 생물학적 검정, 예컨대 서던 및 노던 블롯팅, PCR, 및 핵산 서열분석; 생화학적 검정, 예컨대, 예를 들어 면역학적 수단 (ELISA 및/또는 웨스턴 블롯)에 의해 또는 효소적 기능에 의해 단백질 산물의 존재를 검출하는 것; 식물 일부 검정, 예컨대 잎 또는 뿌리 검정; 및 전체 재생 식물의 표현형의 분석을 포함한다.
통합 이벤트는, 예를 들어 관심 핵산 분자에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여, 예를 들어 PCR 증폭에 의해 분석될 수 있다. PCR 유전자형결정은 게놈 내로 통합된 관심 핵산 분자를 함유하는 것으로 예측되는 단리된 숙주 식물 식물 캘러스 조직으로부터 유래된 gDNA의 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 증폭, 이어서 PCR 증폭 산물의 표준 클로닝 및 서열 분석을 포함하나 이에 제한되지 않는 것으로 이해된다. PCR 유전자형결정 방법은 널리 기재되어 있고 (예를 들어, 문헌 [Rios, G. et al. (2002) Plant J. 32:243-53]), 세포 배양물을 포함한 임의의 식물 종 (예를 들어, 지. 메이스, 지. 맥스, 및 목화) 또는 조직 유형으로부터 유래된 gDNA에 적용될 수 있다.
아그로박테리움-의존성 형질전환 방법을 사용하여 형성된 트랜스제닉 식물은 전형적으로 1개 염색체 내로 삽입된 단일 재조합 DNA를 함유한다. 단일 재조합 DNA의 폴리뉴클레오티드는 "트랜스제닉 이벤트" 또는 "통합 이벤트"로 지칭된다. 이러한 트랜스제닉 식물은 삽입된 외인성 폴리뉴클레오티드에 대해 이형접합이다. 일부 실시양태에서, 트랜스진에 대해 동형접합인 트랜스제닉 식물은 단일 외인성 유전자를 함유하는 독립적 분리개체 트랜스제닉 식물을, 예를 들어 T0 식물과 유성생식으로 자가 교배 (자가수분)시켜 T1 종자를 생산함으로써 수득될 수 있다. 생산된 T1 종자의 4분의 1은 트랜스진에 대해 동형접합일 것이다. T1 종자의 발아는, 전형적으로 이형접합체와 동형접합체 사이의 구별을 가능하게 하는 SNP 검정 또는 열 증폭 검정 (즉, 접합성 검정)을 사용하여 이형접합성에 대해 시험될 수 있는 식물을 생성한다.
특정한 실시양태에서, 노린재류 해충-억제 효과를 나타내는 식물 세포에서 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10종 또는 그 초과의 상이한 iRNA 분자가 생산된다. iRNA 분자 (예를 들어, dsRNA 분자)는 상이한 형질전환 이벤트로 도입된 다중 핵산으로부터, 또는 단일 형질전환 이벤트로 도입된 단일 핵산으로부터 발현될 수 있다. 일부 실시양태에서, 복수종의 iRNA 분자는 단일 프로모터의 제어 하에서 발현된다. 다른 실시양태에서, 복수종의 iRNA 분자는 다중 프로모터의 제어 하에서 발현된다. 1종 이상의 노린재류 해충 내의 상이한 유전자좌 (예를 들어, 서열식별번호: 1 및 2에 의해 정의된 유전자좌)에 각각 상동인 다중 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단일 iRNA 분자는 동일한 종의 노린재류 해충의 상이한 집단에서 또는 노린재류 해충의 상이한 종에서 둘 다 발현될 수 있다.
재조합 핵산 분자를 사용한 식물의 직접적 형질전환에 추가로, 트랜스제닉 식물은 적어도 1종의 트랜스제닉 이벤트를 갖는 제1 식물을 이러한 이벤트가 결여된 제2 식물과 교배시킴으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, iRNA 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 핵산 분자는 형질전환이 용이한 제1 식물 계통 내로 도입되어 트랜스제닉 식물을 생산할 수 있고, 이 트랜스제닉 식물은 제2 식물 계통과 교배되어 iRNA 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제2 식물 계통 내로 유전자이입할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드 중 1종 이상을 함유하는 범용 제품을 포함한다. 특정한 실시양태는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 중 1종 이상을 함유하는 재조합 식물 또는 종자로부터 생산된 범용 제품을 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 중 1종 이상을 함유하는 범용 제품은 식물의 가루, 오일, 분쇄된 또는 전체의 곡실 또는 종자, 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 중 1종 이상을 함유하는 재조합 식물 또는 종자의 임의의 가루, 오일, 또는 분쇄된 또는 전체의 곡실을 포함하는 임의의 식제품을 포함하나 이에 제한되지는 않는 것으로 의도된다. 본원에서 고려되는 1종 이상의 범용품 또는 범용 제품에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드 중 1종 이상의 검출은, 범용품 또는 범용 제품이 dsRNA-매개 유전자 억제 방법을 사용하여 식물 해충을 방제하기 위한 목적으로 본 발명의 폴리뉴클레오티드 중 1종 이상을 발현하도록 설계된 트랜스제닉 식물로부터 생산된다는 사실상의 증거이다.
일부 측면에서, 본 발명의 핵산을 검출가능한 양으로 포함하는 종자 또는 범용 제품인, 형질전환된 식물 세포로부터 유래된 트랜스제닉 식물에 의해 생산된 종자 및 범용 제품이 포함된다. 일부 실시양태에서, 예를 들어, 트랜스제닉 식물을 수득하고, 이로부터 식품 또는 사료를 제조함으로써, 이러한 범용 제품이 생산될 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 중 1종 이상을 포함하는 범용 제품은, 예를 들어 및 비제한적으로: 식물의 가루, 오일, 분쇄된 또는 전체의 곡실 또는 종자, 및 본 발명의 핵산 중 1종 이상을 포함하는 재조합 식물 또는 종자의 임의의 가루, 오일, 또는 분쇄된 또는 전체의 곡실을 포함하는 임의의 식제품을 포함한다. 1종 이상의 범용품 또는 범용 제품에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드 중 1종 이상의 검출은, 범용품 또는 범용 제품이 노린재류 해충을 방제하기 위한 목적으로 본 발명의 iRNA 분자 중 1종 이상을 발현하도록 설계된 트랜스제닉 식물로부터 생산된다는 사실상의 증거이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 트랜스제닉 식물 또는 종자는 또한 비제한적으로: 노린재류 해충에서 서열식별번호: 1 및 2에 의해 정의된 것 이외의 다른 유전자좌를 표적화하는 iRNA 분자의 전사가 이루어지는 트랜스제닉 이벤트; 노린재류 해충 이외의 다른 유기체 (예를 들어, 식물-기생 선충류)에서의 유전자를 표적화하는 iRNA 분자의 전사가 이루어지는 트랜스제닉 이벤트; 살곤충 단백질 (예를 들어, 바실루스 투린기엔시스(Bacillus thuringiensis), 알칼리게네스(Alcaligenes) 종, 또는 슈도모나스(Pseudomonas) 종 살곤충 단백질)을 코딩하는 유전자; 제초제 내성 유전자 (예를 들어, 글리포세이트에 대한 내성을 제공하는 유전자); 및 트랜스제닉 식물에서 바람직한 표현형, 예컨대, 증가된 수확량, 변경된 지방산 대사, 또는 세포질 웅성 불임의 복원에 기여하는 유전자를 포함한, 적어도 1종의 다른 트랜스제닉 이벤트를 그의 게놈 중에 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 본 발명의 iRNA 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 식물에서 다른 곤충 방제 및 질병 형질과 조합되어 식물 질병 및 곤충 손상의 증진된 방제를 위한 목적하는 형질을 달성할 수 있다. 특유의 작용 방식을 사용하는 곤충 방제 형질을 조합하는 것은, 예를 들어 재배지에서 형질(들)에 대한 저항성이 발생될 확률이 감소하기 때문에, 단일 방제 형질을 보유하는 식물에 비해 더 우수한 지속성을 갖는 보호된 트랜스제닉 식물을 제공할 수 있다.
V. 노린재류 해충에서의 표적 유전자 억제
A. 개관
본 발명의 일부 실시양태에서, 노린재류 해충의 방제에 유용한 적어도 1종의 핵산 분자가 노린재류 해충에게 제공될 수 있으며, 여기서 핵산 분자는 해충(들)에서 RNAi-매개 유전자 침묵을 유도한다. 특정한 실시양태에서, iRNA 분자 (예를 들어, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, 및 hpRNA)가 노린재류 숙주에게 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 노린재류 해충의 방제에 유용한 핵산 분자는 핵산 분자를 해충과 접촉시킴으로써 해충에게 제공될 수 있다. 이들 및 추가 실시양태에서, 노린재류 해충의 방제에 유용한 핵산 분자는 해충의 섭식 기질로, 예를 들어 영양 조성물로 제공될 수 있다. 이들 및 추가 실시양태에서, 노린재류 해충의 방제에 유용한 핵산 분자는 해충(들)에 의해 섭취되는 핵산 분자를 포함하는 식물 물질의 섭취를 통해 제공될 수 있다. 특정 실시양태에서, 핵산 분자는, 예를 들어 식물 세포를 재조합 핵산을 포함하는 벡터로 형질전환하는 것에 의해 및 형질전환된 식물 세포로부터의 식물 물질 또는 전체 식물의 재생에 의해 식물 물질 내로 도입된 재조합 핵산의 발현을 통해 식물 물질에 존재한다.
B. RNAi-매개 표적 유전자 억제
특정 실시양태에서, 본 발명은, 예를 들어 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 1개의 가닥을 포함하는 iRNA 분자를 설계함으로써, 노린재류 (예를 들어, BSB) 해충의 트랜스크립톰에서 필수 천연 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 필수 유전자)를 표적화하도록 설계될 수 있는 iRNA 분자 (예를 들어, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, 및 hpRNA)를 제공한다. 이와 같이 설계된 iRNA 분자의 서열은 표적 폴리뉴클레오티드의 것과 동일할 수 있거나, 또는 iRNA 분자와 그의 표적 폴리뉴클레오티드 사이의 특이적 혼성화가 이루어지지 못하도록 하는 미스매치를 혼입시킬 수 있다.
본 발명의 iRNA 분자는 노린재류 해충에서의 유전자 억제 방법에 사용될 수 있고, 이에 의해 식물 (예를 들어, iRNA 분자를 포함하는 보호된 형질전환된 식물) 상의 해충에 의해 야기되는 손상의 수준 또는 발생률이 감소될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "유전자 억제"는 발현의 전사후 억제 및 전사 억제를 포함하는 유전자 또는 코딩 폴리뉴클레오티드로부터의 단백질 발현의 감소를 포함한, mRNA로의 유전자 전사 및 후속하는 mRNA의 번역의 결과로서 생산된 단백질의 수준을 감소시키는 널리 공지된 임의의 방법을 지칭한다. 전사후 억제는 억제를 위해 표적화된 유전자로부터 전사된 mRNA의 모두 또는 일부와, 억제를 위해 사용된 상응하는 iRNA 분자 사이의 특이적 상동성에 의해 매개된다. 추가적으로, 전사후 억제는 세포에서 리보솜에 의한 결합에 이용가능한 mRNA 양의 실질적이고도 측정가능한 감소를 지칭한다.
iRNA 분자가 dsRNA 분자인 구체적 실시양태에서, dsRNA 분자는 효소 DICER에 의해 짧은 siRNA 분자 (대략 20개의 뉴클레오티드 길이)로 절단될 수 있다. dsRNA 분자에 대한 DICER 활성에 의해 생성된 이중-가닥 siRNA 분자는 2개의 단일-가닥 siRNA: "패신저 가닥" 및 "가이드 가닥"으로 분리될 수 있다. 패신저 가닥은 분해될 수 있고, 가이드 가닥은 RISC 내로 혼입될 수 있다. 가이드 가닥과 mRNA 분자의 특이적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드와의 특이적인 혼성화, 및 후속하는 효소 아르고너트 (RISC 복합체의 촉매 성분)에 의한 절단에 의해 전사후 억제가 발생한다.
본 발명의 특정한 실시양태에서, 임의의 형태의 iRNA 분자가 사용될 수 있다. dsRNA 분자는 전형적으로 제조 동안 및 iRNA 분자를 세포에 제공하는 단계 동안, 단일 가닥 RNA 분자보다 더 안정하고, 이는 전형적으로 또한 세포에서 더 안정하다는 것을 관련 기술분야의 통상의 기술자는 이해할 것이다. 따라서, 예를 들어 siRNA 및 miRNA 분자는 일부 실시양태에서 동일하게 유효할 수 있지만, dsRNA 분자는 그의 안정성에 기인하여 선택될 수 있다.
특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자가 제공되며, 이 폴리뉴클레오티드는 시험관내에서 발현되어 노린재류 해충의 게놈 내의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 핵산 분자에 실질적으로 상동인 iRNA 분자가 생산될 수 있다. 특정 실시양태에서, 시험관내에서 전사된 iRNA 분자는 스템-루프 구조를 포함하는 안정화된 dsRNA 분자일 수 있다. 노린재류 해충이 시험관내에서 전사된 iRNA 분자와 접촉한 후에, 해충에서의 표적 유전자 (예를 들어, 필수 유전자)의 전사후 억제가 발생할 수 있다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드 (예를 들어, 적어도 19개의 인접 뉴클레오티드)를 포함하는 핵산 분자로부터의 iRNA의 발현은 노린재류 해충에서의 표적 유전자의 전사후 억제 방법에 사용되며, 여기서 폴리뉴클레오티드는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 서열식별번호: 1; 서열식별번호: 1의 상보체; 서열식별번호: 2; 서열식별번호: 2의 상보체; 서열식별번호: 1의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 서열식별번호: 1의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체; 서열식별번호: 2의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 서열식별번호: 2의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체; 서열식별번호: 1을 포함하는 노린재류 유기체의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드; 서열식별번호: 1을 포함하는 노린재류 유기체의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드의 상보체; 서열식별번호: 2를 포함하는 노린재류 유기체의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드; 서열식별번호: 2를 포함하는 노린재류 유기체의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드의 상보체; 서열식별번호: 1을 포함하는 노린재류 유기체의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 서열식별번호: 1을 포함하는 노린재류 유기체의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체; 서열식별번호: 2를 포함하는 노린재류 유기체의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 및 서열식별번호: 2를 포함하는 노린재류 유기체의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체. 특정 실시양태에서, 상기 중 어느 것과 적어도 약 80% (예를 들어, 79%, 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 약 100%, 및 100%) 동일한 핵산 분자의 발현이 사용될 수 있다. 이들 및 추가 실시양태에서, 노린재류 해충의 적어도 1개의 세포에 존재하는 RNA 분자와 특이적으로 혼성화되는 핵산 분자가 발현될 수 있다.
RNAi 전사후 억제 시스템이 유전자 돌연변이, 균주 다형성, 또는 진화상 분기에 기인한 것으로 예상될 수 있는 표적 유전자 중의 서열 변이를 견딜 수 있다는 것이 본원의 일부 실시양태의 중요한 특색이다. 도입된 핵산 분자가 표적 유전자의 1차 전사 산물 또는 완전-프로세싱된 mRNA에 특이적으로 혼성화가능한 한, 도입된 핵산 분자는 표적 유전자의 1차 전사 산물 또는 완전-프로세싱된 mRNA에 절대적으로 상동일 필요는 없을 수 있다. 더욱이, 도입된 핵산 분자는 표적 유전자의 1차 전사 산물 또는 완전-프로세싱된 mRNA에 비해, 전장일 필요가 없을 수 있다.
본 발명의 iRNA 기술을 사용하는 표적 유전자의 억제는 서열-특이적이며; 즉, iRNA 분자(들)에 실질적으로 상동인 폴리뉴클레오티드가 유전적 억제를 위해 표적화된다. 일부 실시양태에서, 표적 유전자의 일부분의 경우와 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 RNA 분자가 억제에 사용될 수 있다. 이들 및 추가 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드에 비해 1개 이상의 삽입, 결실, 및/또는 점 돌연변이를 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 RNA 분자가 사용될 수 있다. 특정한 실시양태에서, iRNA 분자 및 표적 유전자의 일부분은, 예를 들어 적어도 약 80%부터, 적어도 약 81%부터, 적어도 약 82%부터, 적어도 약 83%부터, 적어도 약 84%부터, 적어도 약 85%부터, 적어도 약 86%부터, 적어도 약 87%부터, 적어도 약 88%부터, 적어도 약 89%부터, 적어도 약 90%부터, 적어도 약 91%부터, 적어도 약 92%부터, 적어도 약 93%부터, 적어도 약 94%부터, 적어도 약 95%부터, 적어도 약 96%부터, 적어도 약 97%부터, 적어도 약 98%부터, 적어도 약 99%부터, 적어도 약 100%부터의, 및 100% 서열 동일성을 공유할 수 있다. 대안적으로, dsRNA 분자의 듀플렉스 영역은 표적 유전자 전사체의 일부분과 특이적으로 혼성화가능할 수 있다. 특이적으로 혼성화가능한 분자에서, 전장의 폴리뉴클레오티드보다는 더 짧은, 더 큰 상동성을 나타내는 서열이, 더 긴, 더 작은 상동 폴리뉴클레오티드를 보완한다. 표적 유전자 전사체의 일부분과 동일한 dsRNA 분자의 듀플렉스 영역의 폴리뉴클레오티드의 길이는 적어도 약 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 또는 적어도 약 1000개 염기일 수 있다. 일부 실시양태에서, 20-100개의 뉴클레오티드 초과의 폴리뉴클레오티드가 사용될 수 있고; 예를 들어, 100-200 또는 300-500개의 뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드가 사용될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 약 200-300개의 뉴클레오티드 초과의 폴리뉴클레오티드가 사용될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 표적 유전자의 크기에 따라, 약 500-1000개의 뉴클레오티드 초과의 폴리뉴클레오티드가 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 노린재류 해충에서의 표적 유전자의 발현은 해충의 세포 내에서 적어도 10%; 적어도 33%; 적어도 50%; 또는 적어도 80% 억제될 수 있어, 유의한 억제가 일어나도록 한다. 유의한 억제는 검출가능한 표현형 (예를 들어, 생식, 섭식, 발생의 중지 등)을 유발하거나, 또는 억제되는 표적 유전자에 상응하는 RNA 및/또는 유전자 산물의 검출가능한 감소를 유발하는 역치 초과의 억제를 지칭한다. 비록 본 발명의 특정 실시양태에서 억제는 해충의 실질적으로 모든 세포에서 발생하지만, 다른 실시양태에서는 억제가 단지 표적 유전자를 발현하는 세포의 하위세트에서만 발생한다.
일부 실시양태에서, 전사 억제는 프로모터 DNA 또는 그의 상보체에 대해 실질적 서열 동일성을 나타내는 dsRNA 분자의 세포 내 존재에 의해 매개되어, "프로모터 트랜스 억제"라고 지칭되는 효과가 발휘된다. 유전자 억제는, 예를 들어 dsRNA 분자를 함유하는 식물 물질을 섭취하거나 또는 그와 접촉함으로써 이러한 dsRNA 분자를 섭취하거나 또는 그와 접촉할 수 있는 노린재류 해충에서의 표적 유전자에 대해 효과적일 수 있다. 프로모터 트랜스 억제에 사용하기 위한 dsRNA 분자는 노린재류 해충의 세포에서의 1종 이상의 상동 또는 상보적 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제 또는 저해하도록 특이적으로 설계될 수 있다. 식물 세포에서 유전자 발현을 조절하는 안티센스 또는 센스 배향 RNA에 의한 전사후 유전자 억제는 미국 특허 5,107,065; 5,759,829; 5,283,184; 및 5,231,020에 개시되어 있다.
C. 노린재류 해충에게 제공된 iRNA 분자의 발현
노린재류 해충에서의 RNAi-매개 유전자 억제를 위한 iRNA 분자의 발현은 많은 시험관내 또는 생체내 포맷 중 어느 하나로 수행될 수 있다. 이어서, iRNA 분자는, 예를 들어 iRNA 분자를 해충과 접촉시킴으로써, 또는 해충이 iRNA 분자를 섭취하도록 하거나 또는 다르게는 내재화하도록 함으로써 노린재류 해충에게 제공될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태는 노린재류 해충의 형질전환된 숙주 식물, 형질전환된 식물 세포, 및 형질전환된 식물의 자손을 포함한다. 형질전환된 식물 세포 및 형질전환된 식물은, 예를 들어 이종 프로모터의 제어 하에 iRNA 분자 중 1종 이상을 발현하여 해충-보호 효과를 제공하도록 조작될 수 있다. 따라서, 트랜스제닉 식물 또는 식물 세포가 노린재류 해충에 의해 섭식 동안 소모되는 경우에, 해충은 트랜스제닉 식물 또는 세포에서 발현된 iRNA 분자를 섭취할 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 또한 매우 다양한 원핵 및 진핵 미생물 숙주 내로 도입되어 iRNA 분자를 생산할 수 있다. 용어 "미생물"은 원핵 및 진핵 종, 예컨대 박테리아 및 진균을 포함한다.
유전자 발현의 조정은 이러한 발현의 부분적 또는 완전한 억제를 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 노린재류 해충에서의 유전자 발현을 억제하는 방법은 해충의 숙주의 조직에, 본원에 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오티드의 전사 후에 형성된 적어도 1종의 dsRNA 분자 (이의 적어도 1개의 절편은 노린재류 해충의 세포 내의 mRNA에 상보적임)를 유전자 억제량으로 제공하는 것을 포함한다. 본 발명에 따라 노린재류 해충에 의해 섭취되는, siRNA, miRNA, shRNA, 또는 hpRNA 분자와 같은 변형된 형태를 포함한 dsRNA 분자는, 예를 들어 서열식별번호: 1 및 2로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 hunchback DNA 분자로부터 전사된 RNA 분자에 대해 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 약 100% 동일할 수 있다. 따라서, 노린재류 해충 내로 도입되었을 때 그에서 내인성 코딩 폴리뉴클레오티드 또는 표적 코딩 폴리뉴클레오티드의 발현을 저해 또는 억제하는, 본 발명의 dsRNA 분자를 제공하기 위한 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드 및 재조합 DNA 구축물을 포함하나 이에 제한되지는 않는 단리된 및 실질적으로 정제된 핵산 분자가 제공된다.
특정한 실시양태는 노린재류 식물 해충에서의 1종 이상의 표적 유전자(들)의 전사후 억제 및 식물 해충 집단의 방제를 위해 iRNA 분자를 전달하기 위한 전달 시스템을 제공한다. 일부 실시양태에서, 전달 시스템은 숙주 트랜스제닉 식물 세포, 또는 숙주 세포에서 전사된 RNA 분자를 포함하는 숙주 세포의 내용물의 섭취를 포함한다. 이들 및 추가 실시양태에서, 본 발명의 안정화된 dsRNA 분자를 제공하는 재조합 DNA 구축물을 함유하는 트랜스제닉 식물 세포 또는 트랜스제닉 식물이 생성된다. 특정한 iRNA 분자를 코딩하는 핵산을 포함하는 트랜스제닉 식물 세포 및 트랜스제닉 식물은 본 발명의 iRNA 분자 (예를 들어, 안정화된 dsRNA 분자)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물 형질전환 벡터를 구축하고; 식물 세포 또는 식물을 형질전환시키고; 전사된 iRNA 분자를 함유하는 트랜스제닉 식물 세포 또는 트랜스제닉 식물을 생성하는 재조합 DNA 기술 (이의 기본 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있음)을 사용함으로써 생산될 수 있다
트랜스제닉 식물에 노린재류 해충으로부터의 보호를 부여하기 위해, 재조합 DNA 분자는, 예를 들어 iRNA 분자, 예컨대 dsRNA 분자, siRNA 분자, miRNA 분자, shRNA 분자, 또는 hpRNA 분자로 전사될 수 있다. 일부 실시양태에서, 재조합 DNA 분자로부터 전사된 RNA 분자는 재조합 식물의 조직 또는 유체 내에서 dsRNA 분자를 형성할 수 있다. 이러한 dsRNA 분자는 부분적으로는, 숙주 식물에 침입할 수 있는 유형의 노린재류 해충 내 DNA로부터 전사된 상응하는 폴리뉴클레오티드와 동일한 폴리뉴클레오티드로 구성될 수 있다. 노린재류 해충 내 표적 유전자의 발현은 dsRNA 분자에 의해 억제되고, 노린재류 해충에서의 표적 유전자의 발현의 억제는 트랜스제닉 식물이 해충에 대해 저항성이 있도록 한다. dsRNA 분자의 조정 효과는, 예를 들어 하우스키핑 유전자를 포함한, 세포 분열, 염색체 재형성, 및 세포 대사 또는 세포 형질전환을 담당하는 내인성 유전자; 전사 인자; 탈피-관련 유전자; 및 세포 대사 또는 정상 성장 및 발생에 수반되는 폴리펩티드를 코딩하는 다른 유전자를 포함한, 해충에서 발현되는 다양한 유전자에 적용될 수 있는 것으로 제시된 바 있다.
생체내 트랜스진 또는 발현 구축물로부터의 전사를 위해, 일부 실시양태에서는 조절 영역 (예를 들어, 프로모터, 인핸서, 사일렌서, 및 폴리아데닐화 신호)이 RNA 가닥 (또는 가닥들)을 전사하는데 사용될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 상기 제시된 바와 같이, iRNA 분자를 생산하는데 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드는 식물 숙주 세포에서 기능적인 1종 이상의 프로모터 요소에 작동가능하게 연결될 수 있다. 프로모터는 보통 숙주 게놈 내에 상주하는 내인성 프로모터일 수 있다. 작동가능하게 연결된 프로모터 요소의 제어 하에 있는 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 추가로 그의 전사 및/또는 생성된 전사체의 안정성에 유리한 영향을 미치는 추가의 요소에 플랭킹될 수 있다. 이러한 요소는 작동가능하게 연결된 프로모터의 상류, 발현 구축물의 3' 말단의 하류에 위치할 수 있고, 프로모터의 상류 및 발현 구축물의 3' 말단의 하류 둘 다에서 발생할 수 있다.
실시양태에서, 표적 유전자 (예를 들어, hunchback 유전자)의 억제는 모 RNAi 표현형; iRNA 분자와 접촉한 대상체 (예를 들어, 노린재류 해충)의 자손에서 관찰가능한 표현형을 유발한다. 일부 실시양태에서, pRNAi 표현형은 해충이 생존 자손을 보다 덜 생산하게 만드는 것을 포함한다. pRNAi의 특정한 예에서, pRNAi를 개시하는 핵산은 핵산이 전달되는 집단에서의 사멸의 발생률을 증가시키지 않는다. pRNAi의 다른 예에서, pRNAi를 개시하는 핵산은 또한 핵산이 전달되는 집단에서의 사멸의 발생률을 증가시킨다.
일부 실시양태에서, 노린재류 해충의 집단은 iRNA 분자와 접촉하고, 이에 의해 pRNAi를 유발하며, 여기서 해충은 생존하고 교미하지만, 핵산(들)을 제공받지 않은 동일한 종의 해충에 의해 생산된 알보다 생존 자손을 덜 부화시킬 수 있는 알을 생산한다. 일부 예에서, 이러한 해충은 산란하지 않거나 또는 iRNA 분자와 접촉하지 않은 동일한 종의 해충에서 관찰가능한 것보다 더 적은 알을 생산한다. 일부 예에서, 이러한 해충에 의해 산란된 알은 부화하지 않거나 또는 iRNA 분자와 접촉하지 않은 동일한 종의 해충에서 관찰가능한 것보다 유의하게 더 적은 비율로 부화한다. 일부 예에서, 이러한 해충에 의해 산란된 알로부터 부화한 약충은 생존하지 않거나 또는 iRNA 분자와 접촉하지 않은 동일한 종의 해충에서 관찰가능한 것보다 덜 생존한다.
곤충 섭식으로부터의 보호를 제공하는 물질을 생산하는 트랜스제닉 작물은 곤충 보호 물질(들)의 이익의 지속성을 감소시키는 표적 곤충 해충 집단에 의한 적응에 취약하다. 전통적으로, 트랜스제닉 작물에 대한 곤충 해충 적응에 있어서의 지연은 (1) "은신처" (살충 물질을 함유하지 않고, 따라서 살충 물질(들)에 감수성인 곤충의 생존을 가능하게 하는 작물)의 식재; 및/또는 (2) 표적 해충에 대한 다중 작용 방식을 갖는 살곤충 물질을 조합하여, 한 작용 방식에 대해 저항성이 있는 개체가 제2 작용 방식에 의해 사멸되도록 하는 것에 의해 달성된다.
특정한 예에서, iRNA 분자 (예를 들어, 숙주 식물에서 트랜스진으로부터 발현된 것)는 곤충 저항성 관리 유전자 피라미드에서 바실루스 투린기엔시스, 알칼리게네스 종, 또는 슈도모나스 종 살곤충 단백질 기술 및/또는 치사 RNAi 기술과 조합하기 위한 새로운 작용 방식을 나타내어 이들 방제 기술에 대해 저항성인 곤충 집단의 발생을 완화시킨다.
모 RNAi는 일부 실시양태에서, 치사 RNAi에 의해 수득된 방제와는 상이하며 치사 RNAi와 조합되어 상승작용적 해충 방제를 유발할 수 있는 해충 방제의 유형을 유발할 수 있다. 따라서, 특정한 실시양태에서, 노린재류 식물 해충에서의 1종 이상의 표적 유전자(들)의 전사후 억제를 위한 iRNA 분자는 다른 iRNA 분자와 조합되어 중복 RNAi 표적화 및 상승작용적 RNAi 효과를 제공할 수 있다.
알 사멸률 또는 알 생존율의 손실을 야기하는 모 RNAi (pRNAi)는 RNAi 및 곤충 보호를 위한 다른 메카니즘을 사용하는 트랜스제닉 작물에 추가의 지속성 이익을 가져다 주는 잠재력을 갖는다. pRNAi는 노출된 곤충이 자손을 생산하는 것을 방지하고, 따라서 살충 물질(들)에 대한 저항성을 부여하는, 이들이 운반하는 임의의 대립유전자를 차세대로 전달하는 것을 방지한다. pRNAi는 그것이 동일한 해충 집단으로부터의 보호를 제공하는 1종 이상의 추가의 살충 물질과 조합되는 경우에 곤충-보호된 트랜스제닉 작물의 지속성을 확장하는데 있어서 특히 유용하다. 이러한 추가의 살충 물질은 일부 실시양태에서, 예를 들어, dsRNA; 약충-활성 dsRNA; 살곤충 단백질 (예컨대 바실루스 투린기엔시스, 알칼리게네스 종, 슈도모나스 종 또는 다른 유기체로부터 유래된 것); 및 다른 살곤충 물질을 포함할 수 있다. 이 이익은 살충 물질에 대해 저항성이 있는 곤충이 은신처 작물에서보다 트랜스제닉 작물에서 더 높은 비율의 집단으로서 발생하기 때문에 생긴다. 차세대로 전달된 감수성 대립유전자에 대한 저항성 대립유전자의 비가 pRNAi의 부재 하에서보다 pRNAi의 존재 하에서 더 낮다면, 저항성의 진화는 지연될 것이다.
예를 들어, pRNAi는 iRNA 분자를 발현하는 식물에 대해 손상을 가하는 제1 해충 세대에서의 개체의 수를 감소시키지 못할 수 있다. 그러나, 이러한 해충이 후속 세대를 통해 침입을 지속하는 능력은 감소될 수 있다. 반대로, 치사 RNAi는 이미 식물에 침입한 해충을 사멸시킬 수 있다. pRNAi가 치사 RNAi와 조합되는 경우에, 모 iRNA 분자와 접촉한 해충은 iRNA와 접촉하지 않은 시스템 외부로부터의 해충과 함께 번식할 수 있지만, 그러나 이러한 교미의 자손은 비-생존하거나 또는 덜 생존할 수 있고, 따라서 식물에 침입이 불가능할 수 있다. 동시에, 치사 iRNA 분자와 접촉한 해충은 직접적으로 영향을 받을 수 있다. 이들 2가지 효과의 조합은 상승작용적일 수 있고; 즉, 조합된 pRNAi 및 치사 RNAi 효과는 독립적으로 pRNAi 및 치사 RNAi 효과의 합계보다 더 클수도 있다. pRNAi는 치사 RNAi와, 예를 들어 치사 및 모 iRNA 분자 둘 다를 발현하는 식물을 제공함으로써; 치사 iRNA 분자를 발현하는 제1 식물 및 모 iRNA 분자를 발현하는 제2 식물을 동일한 위치에 제공함으로써; 및/또는 암컷 해충을 pRNAi 분자와 접촉시키고 후속적으로 접촉한 해충을 식물 환경 내로 방출시켜 이들이 식물 해충과 비생산적으로 교미할 수 있도록 함으로써 조합될 수 있다.
일부 실시양태는 식물을 섭식하는 노린재류 해충에 의해 야기된 숙주 식물 (예를 들어, 대두 식물)에 대한 손상을 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 방법은 본 발명의 적어도 1종의 핵산 분자를 발현하는 형질전환된 식물 세포를 숙주 식물에 제공하는 것을 포함하며, 여기서 핵산 분자(들)는 해충(들)에 의해 흡수되었을 때 해충(들) 내에서의 표적 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제하도록 기능하고, 이 발현의 억제는, 예를 들어 해충(들)의 사멸 및/또는 감소된 성장에 추가로 감소된 생식을 유발하고, 이에 의해 해충(들)에 의해 야기된 숙주 식물에 대한 손상을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자(들)는 dsRNA 분자를 포함한다. 이들 및 추가 실시양태에서, 핵산 분자(들)는 노린재류 해충 세포에서 발현된 핵산 분자에 특이적으로 혼성화가능한 1종 초과의 폴리뉴클레오티드를 각각 포함하는 dsRNA 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자(들)는 노린재류 해충 세포에서 발현된 핵산 분자에 특이적으로 혼성화가능한 1종의 폴리뉴클레오티드로 이루어진다.
대안적 실시양태에서, 옥수수 작물의 수확량을 증가시키는 방법이 제공되며, 여기서 방법은 옥수수 식물 내로 본 발명의 적어도 1종의 핵산 분자를 도입하는 것; 및 옥수수 식물을 재배하여 핵산 서열을 포함하는 iRNA 분자가 발현되도록 하는 것을 포함하며, 여기서 핵산을 포함하는 iRNA 분자의 발현은 노린재류 해충 손상 및/또는 성장을 억제하고, 이에 의해 노린재류 해충 침입에 기인한 수확량의 손실을 감소 또는 제거한다. 일부 실시양태에서, iRNA 분자는 dsRNA 분자이다. 이들 및 추가 실시양태에서, 핵산 분자(들)는 노린재류 해충 세포에서 발현된 핵산 분자에 특이적으로 혼성화가능한 1종 초과의 폴리뉴클레오티드를 각각 포함하는 dsRNA 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자(들)는 노린재류 해충 세포에서 발현된 핵산 분자에 특이적으로 혼성화가능한 1종의 폴리뉴클레오티드로 이루어진다.
다른 실시양태에서, 식물 작물의 수확량을 증가시키는 방법이 제공되며, 여기서 방법은 암컷 노린재류 해충 내로 (예를 들어, 주사에 의해, 섭취에 의해, 분무에 의해, 및 DNA로부터의 발현에 의해) 본 발명의 적어도 1종의 핵산 분자를 도입하는 것; 및 암컷 해충을 작물 내로 방출시키는 것을 포함하며, 여기서 암컷 해충을 포함한 교미 쌍은 생존 자손을 생산할 수 없거나 또는 덜 생산할 수 있고, 이에 의해 노린재류 해충 침입에 기인한 수확량의 손실을 감소 또는 제거한다. 특정한 실시양태에서, 이러한 방법은 해충의 후속 세대의 방제를 제공한다. 유사한 실시양태에서, 방법은 본 발명의 핵산 분자를 수컷 노린재류 해충 내로 도입하는 것, 및 수컷 해충을 작물 내로 방출시키는 것 (예를 들어, 여기서 pRNAi 수컷 해충은 비처리 대조군보다 더 적은 정자를 생산함)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 발현되어 iRNA 분자를 생산하는 DNA 분자이다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 dsRNA 분자이다. 이들 및 추가 실시양태에서, 핵산 분자(들)는 노린재류 해충 세포에서 발현된 핵산 분자에 특이적으로 혼성화가능한 1종 초과의 폴리뉴클레오티드를 각각 포함하는 dsRNA 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자(들)는 노린재류 해충 세포에서 발현된 핵산 분자에 특이적으로 혼성화가능한 1종의 폴리뉴클레오티드로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 노린재류 해충에서의 표적 유전자의 발현을 조정하는 방법이 제공되며, 여기서 방법은 본 발명의 적어도 1종의 iRNA 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 식물 세포를 형질전환시키는 것이며, 여기서 폴리뉴클레오티드는 프로모터 및 전사 종결 요소에 작동가능하게 연결된 것; 복수종의 형질전환된 식물 세포를 포함하는 식물 세포 배양물의 발생이 가능하게 하는데 충분한 조건 하에서 형질전환된 식물 세포를 배양하는 것; 폴리뉴클레오티드가 게놈 내로 통합된 형질전환된 식물 세포를 선택하는 것; 형질전환된 식물 세포를 통합된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 iRNA 분자의 발현에 대해 스크리닝하는 것; iRNA 분자를 발현하는 트랜스제닉 식물 세포를 선택하는 것; 및 선택된 트랜스제닉 식물 세포를 노린재류 해충에게 섭식시키는 것을 포함한다. 식물은 또한 통합된 핵산 분자에 의해 코딩된 iRNA 분자를 발현하는 형질전환된 식물 세포로부터 재생될 수 있다. 일부 실시양태에서, iRNA 분자는 dsRNA 분자이다. 이들 및 추가 실시양태에서, 핵산 분자(들)는 노린재류 해충 세포에서 발현된 핵산 분자에 특이적으로 혼성화가능한 1종 초과의 폴리뉴클레오티드를 각각 포함하는 dsRNA 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자(들)는 노린재류 해충 세포에서 발현된 핵산 분자에 특이적으로 혼성화가능한 1종의 폴리뉴클레오티드로 이루어진다.
본 발명의 iRNA 분자는 식물 세포의 게놈 내로 혼입된 재조합 유전자로부터의 발현 산물로서, 또는 식재하기 전 종자에 적용되는 코팅제 또는 종자 처리제 내로 혼입됨에 따라, 식물 종 (예를 들어, 대두)의 종자 내에 혼입될 수 있다. 재조합 유전자를 포함하는 식물 세포는 트랜스제닉 이벤트인 것으로 간주된다. 노린재류 해충에게의 iRNA 분자의 전달을 위한 전달 시스템이 또한 본 발명의 실시양태에 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 iRNA 분자는 해충(들)의 세포 내로 직접 도입될 수 있다. 도입 방법은 노린재류 해충의 먹이 내로의 iRNA의 직접 혼합 (예를 들어, 해충의 숙주로부터의 식물 조직과의 혼합에 의함), 뿐만 아니라 본 발명의 iRNA 분자를 포함하는 조성물의 숙주 식물 조직에의 적용을 포함할 수 있다. 예를 들어, iRNA 분자는 식물 표면 상에 분무될 수 있다. 대안적으로, iRNA 분자는 미생물에 의해 발현될 수 있고, 미생물은 식물 표면 상에 적용될 수 있거나 또는 물리적 수단 예컨대 주사에 의해 뿌리 또는 줄기 내로 도입될 수 있다. 상기 논의된 바와 같이, 트랜스제닉 식물은 또한 식물에 침입하는 것으로 공지된 노린재류 해충을 사멸시키는데 충분한 양으로 적어도 1종의 iRNA 분자를 발현하도록 유전자 조작될 수 있다. 화학적 또는 효소적 합성에 의해 생산된 iRNA 분자는 또한 농업상 관례와 일치하는 방식으로 제제화될 수 있고, 노린재류 해충에 의한 식물 손상을 방제하기 위한 분무식 제품으로서 사용될 수 있다. 제제는 효율적인 잎 피복을 위해 요구되는 적절한 보조제 (예를 들어, 스티커 및 습윤제), 뿐만 아니라 UV 손상으로부터 iRNA 분자 (예를 들어, dsRNA 분자)를 보호하기 위한 UV 보호제를 포함할 수 있다. 이러한 첨가제는 생물살곤충제 산업에서 통상적으로 사용되고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 이러한 적용은 노린재류 해충으로부터의 식물 보호를 증진시키기 위해 다른 분무식 살곤충제 적용 (생물학적 기반의 것 또는 다른 것)과 조합될 수 있다.
본원에 인용된 공개, 특허, 및 특허 출원을 포함한 모든 참고문헌은 이들이 본 개시내용의 명시적 세부사항과 일관되는 정도로 본원에 참조로 포함되고, 마치 각각의 참고문헌이 개별적이고도 구체적으로 참조로 포함되는 것으로 나타내어지고 그 전문이 본원에 제시된 것과 동일한 정도로 참조로 포함된다. 본원에 논의된 참고문헌은 본 출원의 출원일 전의 그의 개시내용에 대해서만 제공된다. 본원에서의 어떠한 것도 본 발명자들이 선행 발명에 의해 이러한 개시내용을 앞서는 자격을 갖지 않음을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
하기 실시예는 특정의 특정한 특색 및/또는 측면을 예시하기 위해 제공된다. 이들 실시예는 본 개시내용을 기재된 특정한 특색 또는 측면으로 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예
실시예 1: RNAi 구축물
PCR에 의한 주형 제조 및 dsRNA 합성
hunchback dsRNA 생산을 위한 특이적 주형을 제공하는데 사용된 전략은 도 1A 및 도 1B에 제시된다. hunchback dsRNA 합성에 사용하기 위해 의도된 주형 DNA는 특이적 프라이머 및 총 RNA로부터 제조된 제1-가닥 cDNA를 사용하여 PCR에 의해 제조된다. hunchback 선택된 표적 유전자 영역에 대해 2회의 별도의 PCR 증폭을 수행한다. 도 1. 제1 PCR 증폭은 증폭된 센스 가닥의 5' 말단에 T7 프로모터 서열을 도입한다. 제2 반응은 안티센스 가닥의 5' 말단에 T7 프로모터 서열을 혼입시킨다. 이어서, 표적 유전자의 각각의 영역에 대한 2개의 PCR 증폭된 단편을 대략 동일한 양으로 혼합하고, 혼합물을 dsRNA 생산을 위한 전사 주형으로서 사용한다. 도 1.
YFP 음성 대조군을 위해, 단일 PCR 증폭을 수행한다. 도 1B. PCR 증폭은 증폭된 센스 가닥의 5' 말단에 T7 프로모터 서열을 도입하였다. 이어서, 표적 유전자의 각각의 영역에 대한 2개의 PCR 증폭된 단편을 대략 동일한 양으로 혼합하고, 혼합물을 dsRNA 생산을 위한 전사 주형으로서 사용하였다. 도 1B. 음성 대조군 YFP 코딩 영역에 대한 dsRNA를 특이적 프라이머 및 주형으로서 YFP 코딩 영역의 DNA 클론을 사용하여 생산하였다. hunchback 및 YFP에 대해 증폭된 PCR 산물을 메가스크립트(MEGAscript) 고수율 전사 키트 (어플라이드 바이오시스템즈 인크.(Applied Biosystems Inc.), 캘리포니아주 포스터 시티)를 사용하여 dsRNA의 시험관내 합성을 위한 주형으로서 사용하였다. 합성된 dsRNA를 RN이지(RNeasy) 미니 키트 (퀴아젠(Qiagen), 캘리포니아주 발렌시아) 또는 암비온(AMBION)? 메가스크립트? RNAi 키트를 사용하여 본질적으로 제조업체의 지침에 의해 규정된 바와 같이 정제하였다. dsRNA 제제를 나노드롭(NANODROP)™ 8000 분광광도계 (써모 사이언티픽(THERMO SCIENTIFIC), 델라웨어주 윌밍톤) 또는 동등한 수단을 사용하여 측량되고 순도를 결정하기 위한 겔 전기영동에 의해 분석되었다.
실시예 2: 실시간 PCR 분석
정량적 실시간 PCR: qRT-PCR을 위한 이. 헤로스 조직을 실시예 6에 기재된 바와 같이 dsRNA가 주사된 0 내지 3일령 암컷으로부터 수집하였다. 7일 후에, 암컷 난소를 뉴클레아제-무함유 1X PBS (pH 7.4) 중에서 입체 현미경 하에 해부하고, 수집 마이크로튜브 내 드라이 아이스 상에서 개별적으로 동결시켰다. RL 용해 완충제 및 클렉코(Klecko)™ 조직 미분쇄기 (가르시아 매뉴팩처링(Garcia Manufacturing), 캘리포니아주 비살리아)로 조직 파괴를 수행하였다. 조직 온침 후에, 총 RNA를 노르겐 총 RNA 정제 96-웰 키트 (노르겐 바이오텍 코포레이션(Norgen BioteK Corp), 캐나다 온타리오주)를 사용하여 고처리량 포맷으로 제조업체의 프로토콜에 따라, 용리액 상에서 37℃에서 1시간 동안 터보(Turbo)™ DNase (라이프 테크놀로지스(Life Technologies), 캘리포니아주 칼스배드)를 사용하여 단리하였다. cDNA 합성을 고용량 cDNA RT 키트 (라이프 테크놀로지스, 캘리포니아주 칼스배드)를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 하기 변형 하에 수행하였다. 총 RNA를 뉴클레아제-무함유 물을 사용하여 50 ng/μl로 조정한다. RNA 샘플을 10분 동안 70℃로 가열하고, 4℃로 냉각시켰다. 반쪽 반응을 5 μl의 2X 혼합물의 첨가에 의해 개시하였다. 무작위 프라이머로서 단독으로 공급된 프라이머 혼합물을 먼저, 3'UTR 기반 검정의 감수성을 개선시키기 위해 2 μM의 최종 농도로 맞춤 합성된 T20VN 올리고 (인티그레이티드 디엔에이 테크놀로지스(Integrated DNA Technologies), 아이오와주 코랄빌)와 섞었다. 제1 가닥 합성 후에, 샘플을 뉴클레아제 무함유 물을 사용하여 1:3으로 희석하였다.
이. 헤로스 qRT-PCR 프라이머 및 가수분해 프로브를 참조 유전자에 대해서는 라이트사이클러(LightCycler) 프로브 설계 소프트웨어 2.0 (로슈(Roche), 스위스 바젤)을 사용하여 설계하고, 표적 유전자에 대해서는 프라이머 익스프레스(Primer Express)?소프트웨어 버전 3.0 (어플라이드 바이오시스템즈, 뉴욕주 그랜드 아일랜드)을 사용하여 설계하였다 (보충 표 2). 비-주사된 곤충을 대조군으로서 사용하였다. 이. 헤로스 액틴을 참조 유전자로서 사용하였다. 프로브를 FAM (6-카르복시 플루오레세인 아미다이트)으로 표지하였다. 10 μl 반응 부피 중에서, 최종 프라이머 농도는 0.4 μM이고, 프로브 농도는 0.2 μM이었다. 상대 전사체 수준은 로슈 라이트사이클러480 (로슈, 스위스 바젤)을 사용하여 프로브 가수분해 qRT-PCR에 의해 분석하였다. 모든 검정은 주형을 함유하지 않는 (단지 혼합물만 있는) 음성 대조군을 포함하였다. 표준 곡선을 위해, 블랭크를 샘플 교차-오염에 대해 체크하기 위해 공급원 플레이트에 포함시켰다. PCR 사이클링 조건은 95℃에서의 10분 표적 활성화 인큐베이션, 이어서 10초 동안 95℃에서의 변성, 40초 동안 60℃에서의 어닐링/연장, 및 1초 동안 72℃에서의 FAM 획득의 40 사이클을 포함하였다. 반응에 이어서 40℃에서의 10초 냉각을 수행하였다. 데이터는 라이트사이클러™ 소프트웨어 v1.5를 사용하여 분석하고, 발현에서의 상대 변화는 2-ΔΔCt 방법을 사용하여 계산하였다 (Livak and Schmittgen (2001) Methods 25 (4):402-08).
비-주사된 곤충 및 YFP dsRNA-주사된 곤충을 대조군으로서 사용하였다. BSB 액틴 (서열식별번호: 14)을 참조 유전자로서 사용하였다 (Ponton et al. (2011) J Insect Physiol 57 (6):840-50). 관심 유전자 (GOI) 및 참조 유전자를 위한 프라이머 및 프로브는 표 1에 나타난다.
표 1. BSB 프로브 가수분해 qPCR 검정을 위한 올리고뉴클레오티드 및 프로브.
Figure pct00006
이. 헤로스 난소에서의 hb 전사체 수준은 hb dsRNA 주사 후에 유의하게 (80% 초과) 하락하였다 (도 4).
실시예 3: 식물 형질전환 벡터의 구축
hunchback (서열식별번호: 1)의 절편을 포함하는 dsRNA 헤어핀 형성을 위한 표적 유전자 구축물을 보유하는 진입 벡터를 화학적으로 합성된 단편 (DNA2.0, 캘리포니아주 멘로 파크) 및 표준 분자 클로닝 방법의 조합을 사용하여 조립한다. (단일 전사 단위 내에서) 표적 유전자 절편의 2개 카피를 서로 반대 배향으로 배열함으로써 (상기 2개 절편은 링커 서열 (예를 들어, ST-LS1 인트론, 서열식별번호: 6; 문헌 [Vancanneyt et al. (1990) Mol. Gen. Genet. 220:245-250])에 의해 이격되어 있음) RNA 1차 전사체에 의한 분자내 헤어핀 형성을 용이하게 한다. 따라서, 1차 mRNA 전사체는 링커 서열에 의해 이격된, 서로의 큰 역위 반복부로서 2개의 hunchback 유전자 절편 서열을 함유한다. 프로모터의 카피 (예를 들어, 메이즈 유비퀴틴 1, 미국 특허 5,510,474; 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV)로부터의 35S; 벼 액틴 유전자로부터의 프로모터; 유비퀴틴 프로모터; pEMU; MAS; 메이즈 H3 히스톤 프로모터; ALS 프로모터; 파세올린 유전자 프로모터; cab; rubisco; LAT52; Zm13; 및/또는 apg)를 사용하여 1차 mRNA 헤어핀 전사체의 생산을 구동하고, 3' 비번역 영역, 예를 들어 및 비제한적으로, 메이즈 퍼옥시다제 5 유전자 (ZmPer5 3'UTR v2; 미국 특허 6,699,984), AtUbi10, AtEf1, 또는 StPinII를 포함하는 단편을 사용하여 헤어핀-RNA-발현 유전자의 전사를 종결시킨다.
상기 기재된 진입 벡터를 전형적인 이원 목표 벡터와의 표준 게이트웨이(GATEWAY)? 재조합 반응에 사용하여 아그로박테리움-매개 식물 배아 형질전환을 위한 hunchback 헤어핀 RNA 발현 형질전환 벡터를 생산한다.
YFP 헤어핀 dsRNA를 발현하는 유전자를 포함하는 음성 대조군 이원 벡터는 전형적인 이원 목표 벡터 및 진입 벡터와의 표준 게이트웨이? 재조합 반응에 의해 구축한다. 진입 벡터는 메이즈 유비퀴틴 1 프로모터의 발현 제어 하의 YFP 헤어핀 서열 및 메이즈 퍼옥시다제 5 유전자로부터의 3' 비번역 영역을 포함하는 단편을 포함한다.
이원 목표 벡터는 식물 작동가능한 프로모터 (예를 들어, 사탕수수 간균형 바드나바이러스 (ScBV) 프로모터 (Schenk et al. (1999) Plant Mol. Biol. 39:1221-30) 또는 ZmUbi1 (미국 특허 5,510,474))의 조절 하의 제초제 내성 유전자 (아릴옥시알카노에이트 디옥시게나제; AAD-1 v3) (미국 특허 7,838,733, 및 문헌 [Wright et al. (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107:20240-5])를 포함한다. 5' UTR 및 이들 프로모터로부터의 인트론은 프로모터 절편의 3' 말단과 AAD-1 코딩 영역의 개시 코돈 사이에 위치되어 있다. 메이즈 리파제 유전자로부터의 3' 비번역 영역 (ZmLip 3'UTR; 미국 특허 7,179,902)을 포함하는 단편을 사용하여 AAD-1 mRNA의 전사를 종결시킨다.
YFP 단백질을 발현하는 유전자를 포함하는 추가의 음성 대조군 이원 벡터를 전형적인 이원 목표 벡터 및 진입 벡터와의 표준 게이트웨이? 재조합 반응에 의해 구축한다. 이원 목표 벡터는 메이즈 유비퀴틴 1 프로모터의 발현 조절 하의 제초제 내성 유전자 (아릴옥시알카노에이트 디옥시게나제; AAD-1 v3) (상기와 같음) 및 메이즈 리파제 유전자로부터의 3' 비번역 영역 (ZmLip 3'UTR)을 포함하는 단편을 포함한다. 진입 벡터는 메이즈 유비퀴틴 1 프로모터의 발현 제어 하의 YFP 코딩 영역 및 메이즈 퍼옥시다제 5 유전자로부터의 3' 비번역 영역을 포함하는 단편을 포함한다.
실시예 4: 곤충 사육 및 신열대 갈색 노린재 (유쉬스투스 헤로스)에서의 후보 유전자 선택
곤충 사육. 신열대 갈색 노린재 (BSB; 유쉬스투스 헤로스)를 27℃ 인큐베이터 내 65% 상대 습도에서 16:8시간 명:암 주기로 사육하였다. 2-3일에 걸쳐 수집된 1 그램의 알을 바닥에 여과지 디스크가 있는 5L 용기에 시딩하고; 용기를 환기를 위해 #18 메쉬로 덮었다. 각각의 사육 용기는 대략 300-400마리의 성충 BSB를 생성하였다. 모든 단계에서, 곤충에게 1주에 3회 신선한 녹색 콩을 섭식시키고, 해바라기 종자, 대두, 및 땅콩 (중량비 3:1:1)을 함유하는 종자 혼합물의 사쉐를 1주 1회 대체하였다. 심지로서 코튼 플러그가 있는 바이알에 물을 보충하였다. 초기 2주 후에, 곤충을 1주 1회 새로운 용기로 옮겼다.
RNAi 표적 선택. BSB 발생의 6 단계를 mRNA 라이브러리 제조를 위해 선택하였다. 총 RNA를 -70℃에서 동결된 곤충으로부터 추출하고, 패스트프렙(FastPrep)?-24 기기 (엠피 바이오메디칼스(MP BIOMEDICALS)) 상에서 용해 매트릭스 A 2 mL 튜브 (엠피 바이오메디칼스, 캘리포니아주 산타 아나) 내 10 부피의 용해/결합 완충제 중에서 균질화하였다. 총 mRNA를 미르바나(mirVana)™ miRNA 단리 키트 (암비온; 인비트로젠(INVITROGEN))를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 추출하였다. 일루미나(illumina)? HiSeq™ 시스템 (캘리포니아주 샌디에고)을 사용하는 RNA 서열분석은 RNAi 곤충 방제 기술에서 사용하기 위한 후보 표적 유전자 서열을 제공하였다. HiSeq™는 6개의 샘플에 대해 총 약 378백만개의 판독물을 생성하였다. 판독물을 트리니티 어셈블러 소프트웨어를 사용하여 각각의 샘플에 대해 개별적으로 조립하였다 (Grabherr et al. (2011) Nature Biotech. 29:644-652). 조립된 전사체를 합하여 풀링된 트랜스크립톰을 생성하였다. 이 BSB 풀링된 트랜스크립톰은 378,457개의 서열을 함유한다.
BSB hunchback 오르토로그 확인. BSB 풀링된 트랜스크립톰의 tBLASTn 검색을 드로소필라 hunchback (hb-PA, 진뱅크 수탁 번호 NP_731267) 단백질의 서열을 사용하여 수행하였다. BSB hunchback (서열식별번호: 1)을 노린재류 해충 사멸, 또는 성장, 발생, 또는 생식의 억제를 유발할 수 있는 유쉬스투스 헤로스 후보 표적 유전자로서 확인하였다. 이 유전자는 유전자 상실이 체제에 갭을 생성하는 것인, 갭 유전자로서 또한 정의되는 C2H2-유형 아연-핑거 단백질 패밀리 전사 인자에 상응하는 HUNCHBACK 단백질을 코딩한다.
서열식별번호: 1의 서열은 신규하다. 진뱅크에서의 검색으로 발견된 어떠한 유의한 상동 뉴클레오티드 서열도 존재하지 않았다. BSB HUNCHBACK 아미노산 서열 (서열식별번호: 3)의 가장 밀접한 상동체는 진뱅크 수탁 번호 AAR23151.1을 갖는 온코펠투스 파시아투스(Oncopeltus fasciatus) 단백질이다 (상동성 영역에 걸쳐 80% 유사; 73% 동일).
주형 제조 및 dsRNA 합성. cDNA를 트리졸(TRIzol)? 시약 (라이프 테크놀로지스(LIFE TECHNOLOGIES), 뉴욕주 그랜드 아일랜드)을 사용하여 단일 어린 성충 곤충으로부터 추출된 총 BSB RNA (약 90 mg)로부터 제조하였다. 곤충을 펠릿 페슬 (피셔브랜드(FISHERBRAND), 뉴욕주 그랜드 아일랜드) 및 페슬 모터 혼합기 (콜-파머(COLE-PARMER), 일리노이주 베르논 힐스)를 사용하여 실온에서 200 μL의 트리졸?이 있는 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브 내에서 균질화하였다. 균질화 후에, 추가의 800 μL의 트리졸?을 첨가하고, 균질물을 볼텍싱한 다음, 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 세포 파편을 원심분리에 의해 제거하고, 상청액을 새로운 튜브로 옮겼다. 1 mL의 트리졸?에 대한 제조업체-권장된 트리졸? 추출 프로토콜에 따라, RNA 펠릿을 실온에서 건조시키고, 용리 완충제 유형 4 (즉, 10 mM 트리스-HCl, pH 8.0)를 사용하는 GFX PCR DNA 및 겔 추출 키트 (일러스트라(Illustra)™; 지이 헬스케어 라이프 사이언시스(GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES), 펜실베니아주 피츠버그)로부터의 200 μL 트리스 완충제 중에 재현탁시켰다. RNA 농도를 나노드롭™ 8000 분광광도계 (써모 사이언티픽, 델라웨어주 윌밍톤)를 사용하여 결정하였다.
cDNA를 5 μg의 BSB 총 RNA 주형 및 올리고 dT 프라이머로부터 RT-PCR을 위한 슈퍼스크립트 III 패스트-스트랜드 신테시스 시스템(SUPERSCRIPT III FIRST-STRAND SYNTHESIS SYSTEM)™ (인비트로젠)을 사용하여 공급업체의 권장된 프로토콜에 따라 역전사시켰다. 전사 반응물의 최종 부피를 뉴클레아제-무함유 물을 사용하여 100 μL가 되게 하였다.
BSB_hb-1 dsRNA BSB_hb-1-F (서열식별번호: 7) 및 BSB_hb-1-R (서열식별번호: 8)에 대한 프라이머를 사용하여 dsRNA 전사를 위한 DNA 주형을 증폭시켰다. DNA 주형은 주형으로서 1 μL cDNA (상기)를 사용하는 "터치-다운" PCR (1℃/사이클 감소로 60℃에서 50℃로 낮아지는 어닐링 온도)을 사용하여 증폭시켰다. hunchback의 469 bp 절편 (즉 BSB_hb-1; 서열식별번호: 2)을 포함하는 단편을 PCR의 35 사이클 동안 합성하였다. 상기 절차를 사용하여, 프라이머 YFPv2_F (서열식별번호: 10) 및 YFPv2_R (서열식별번호: 11)을 사용하여 301 bp 음성 대조군 주형 YFPv2 (서열식별번호: 9)를 증폭시켰다. BSB-특이적 및 YFPv2 프라이머는 그의 5' 말단에 T7 파지 프로모터 서열 (서열식별번호: 4)을 함유하였으며, 이는 dsRNA 전사를 위한 상기 언급된 BSB DNA 단편의 사용을 가능하게 하였다.
dsRNA는 주형으로서 2 μL의 PCR 산물 (상기)을 사용하여 메가스크립트™ RNAi 키트 (암비온) 또는 하이스크라이브(HiScribe)? T7 시험관내 전사 키트를 사용하여 제조업체의 지침서에 따라 합성하였다. 도 1을 참조한다. dsRNA를 나노드롭™ 8000 분광광도계 상에서 정량화하고, 뉴클레아제-무함유 0.1X TE 완충제 (1 mM 트리스 HCL, 0.1 mM EDTA, pH 7.4) 중 1 μg/μL로 희석하였다.
실시예 5: 제2령 신열대 갈색 노린재 (유쉬스투스 헤로스) 약충 내로의 dsRNA 주사
BSB 인공 먹이. BSB 인공 먹이를 하기와 같이 제조하고, 제조 2주 이내에 사용하였다. 동결건조된 녹색 콩을 매직 불렛(MAGIC BULLET)? 블렌더에서 미세 분말로 블렌딩하고, 이때 미가공 (유기) 땅콩을 별도의 매직 불렛? 블렌더에서 블렌딩하였다. 블렌딩된 건조 성분을 대형 매직 불렛? 블렌더에서 합하고 (중량 백분율: 녹색 콩, 35%; 땅콩, 35%; 수크로스, 5%; 비타민 복합체 (예를 들어, 곤충용 반더잔트 비타민 복합체, 시그마-알드리치(SIGMA-ALDRICH), 0.9%); 이를 캡핑하고, 성분이 혼합되도록 잘 진탕하였다. 이어서, 혼합된 건조 성분을 혼합 볼에 첨가하였다. 별도의 용기에서, 물 및 베노밀 항진균제 (50 ppm; 25 μL 20,000 ppm 용액/50 mL 먹이 용액)를 잘 혼합한 다음, 건조 성분 혼합물에 첨가하였다. 용액이 완전히 블렌딩될 때까지 모든 성분을 수동으로 혼합하였다. 먹이를 목적하는 크기로 성형하고, 알루미늄 호일로 느슨하게 랩핑하고, 60℃에서 4시간 동안 가열한 다음, 4℃에서 냉각시키고 보관하였다.
BSB 혈체강 내로의 dsRNA의 주사. BSB를 27℃ 인큐베이터 내 65% 상대 습도 및 16:8시간 명:암 광주기에서 상기 기재된 콜로니로서 녹색 콩 및 종자 먹이 상에서 사육하였다. 제2령 약충 (각각 1 내지 1.5 mg으로 칭량됨)을 손상 방지를 위해 작은 브러시로 부드럽게 다루고, 얼음 상의 페트리 디쉬에 두어 곤충을 냉각시키고 고정화시켰다. 각각의 곤충에게 500 ng/μL dsRNA 용액 55.2 nL (즉, 27.6 ng dsRNA; 투여량 18.4 내지 27.6 μg/g 체중)를 주사하였다. 드루몬드 8.9 cm #3-000-203-G/X 유리 모세관으로부터 당겨지는 주사 바늘이 장착된 나노젝트(NANOJECT)™ II 주사기 (드루몬드 사이언티픽(DRUMMOND SCIENTIFIC), 펜실베니아주 브룸홀)를 사용하여 주사를 수행하였다. 바늘 팁을 파괴하고, 모세관을 경질 미네랄 오일로 다시 채운 다음, 2 내지 3 μL의 dsRNA로 채웠다. dsRNA를 약충의 복부 내로 주사하고 (시험당 dsRNA당 10마리의 곤충에게 주사함), 시험을 상이한 3일에 반복하였다. 주사된 곤충 (웰당 5마리)을 인공 BSB 먹이의 펠릿을 함유하는 32-웰 트레이 (바이오-RT-32 레어링 트레이; 바이오-서브(BIO-SERV), 뉴저지주 프렌치타운) 내로 옮기고, 풀-N-필(Pull-N-Peel)™ 탭 (바이오-CV-4; 바이오-서브)으로 덮었다. 코튼 심지가 있는 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브 내 1.25 mL의 물에 의해 수분을 공급하였다. 트레이를 26.5℃, 60% 습도 및 16:8시간 명:암 광주기에서 인큐베이션하였다. 생존율 계수 및 중량을 주사 후 제7일에 취하였다.
BSB 제2령 약충에 hunchback mRNA를 표적화하는 dsRNA의 주사. YFP 코딩 영역에 상동인 dsRNA인 YFPv2를 BSB 주사 실험에서 음성 대조군으로서 사용하였다. 표 2에 요약된 바와 같이, 제2령 BSB의 혈체강 내로 주사된 27.6 ng BSB_hb-1 dsRNA는 7일 이내에 증가된 사멸률을 유발하지 않았다.
표 2. 제2령 갈색 노린재 약충의 혈체강 내로의 BSB hunchback dsRNA 주사의 주사 7일 후 결과. 표는 평균 퍼센트 사멸률, 시험의 N 수, 평균의 표준 오차 (SEM) 및 양측 스튜던트 t-검정의 p-값을 제시한다.
Figure pct00007
실시예 6: 유쉬스투스 헤로스에서의 dsRNA 주사 후 알 부화
BSB 혈체강 내로의 dsRNA의 주사. BSB를 콜로니를 위해 상기 기재된 바와 같이 사육하였다. 하기 예시에서, 어린 성충 (성충 탈피 최대 1주후)을 수집하고, 얼음 상의 2차 용기에서 냉각시켰다. 암컷 및 수컷을 생식기의 구조적 이형성을 기반으로 분리하였다. 암컷 BSB를 페더급 곤충학 겸자로 다루고, 드루몬드 8.9 cm) #3-000-203-G/X 유리 모세관으로부터 당겨지는 주사 바늘이 장착된 나노젝트™ II 주사기 (드루몬드 사이언티픽, 펜실베니아주 브룸홀)를 사용하여 dsRNA를 주사하였다. 바늘 팁을 파괴하고, 모세관을 경질 미네랄 오일로 다시 채운 다음, 3 μL dsRNA로 채웠다. 처리당 10마리의 암컷 (각각 대략 90 mg)에게 dsRNA를 주사하였다. 각각의 암컷에게 총 138 nL (138 ng)를 위해 1 μg/μL dsRNA 69 nL를 2회 연속적으로 복부 내로 주사하였다. 10마리 암컷의 각각의 배치를 뚜껑에의 개구부 및 통풍을 위한 #18 메쉬가 있는 1 쿼트 (~950 mL) 통으로 이동시켰다. 2마리 성충 수컷을 10마리 암컷의 각각의 통에 첨가하였다. 곤충에게 사육 절차에 기재된 바와 같이 한 바이알의 물, 녹색 콩, 및 종자를 공급하였다. 곤충을 26.5℃, 60% 습도 및 16:8 명:암 광주기에서 유지하였다.
생존하는 암컷 계수, 산란된 알 및 알 부화 수를 주사 7 내지 9일 후에 시작하여 매일 기준으로 수집하고 최대 24일 동안 계속하였다. 알을 매일 제거하고, 페트리 디쉬 또는 다중-웰 플레이트에서 물 중 1% 아가로스의 층 상에 유지하였다. 성충 곤충을 매주 담수 및 음식물이 있는 통 내로 옮겼다.
BSB 암컷에 hunchback을 표적화하는 dsRNA의 주사는 알 산란을 감소시킨다. 한 예시에서, YFP 코딩 영역의 301 nt 서열을 표적화하는 dsRNA (서열식별번호: 9)가 주사된 암컷을 음성 대조군으로서 사용하고, 비-주사된 암컷 및 BSB_hb-1 dsRNA (서열식별번호: 2)가 주사된 암컷과 비교하였다. 표 3 및 표 5에 요약된 바와 같이 hunchback dsRNA-주사된 암컷은 YFPv2 dsRNA 주사 및 비 주사된 대조군보다 더 적은 수의 알을 산란하였다. 표 7은 YFP dsRNA가 주사된 암컷과 비교하였을 때 hunchback dsRNA가 주사된 암컷에 의해 산란된 알의 수에 있어서의 통계적 차이를 제시한다. 상기 알로부터의 부화율은 모든 시험에서 극적으로 감소하였다 (표 4, 표 6, 및 표 8). 도 5에 제시된 바와 같이, 시험 1에서 산란의 최초 2주로부터의 결과가 또한 주별로 비닝되었다. 산란이 영향을 받지는 않았지만, 발생 및 알 부화 둘 다는 감소하였다. 발생을 나타낸 알은 비발생 사지 및 머리 구조를 갖는 표현형을 가졌다 (도 6).
표 3. 시험 1에서 일당 암컷당 산란된 알의 수. 10마리의 암컷에게 BSB hunchback 또는 음성 대조군 YFPv2에 대해 표적화된 dsRNA를 주사하였다. 알의 계수를 주사 후 제7일에 시작하여 수집하고, 주사 후 연속 21일 동안 계속하였다. 엑셀로 양측 T-검정을 수행하였다.
Figure pct00008
표 4. 시험 1에서 일당 암컷당 부화된 알의 수. 10마리의 암컷에게 BSB hunchback 또는 음성 대조군 YFPv2에 대해 표적화된 dsRNA를 주사하였다. 부화된 알의 계수를 주사 후 제7일에 시작하여 수집하고, 주사 후 연속 21일 동안 계속하였다. 부화된 평균 #/ 일/ 암컷에 대해 엑셀로 양측 t-검정을 수행하였다.
Figure pct00009
*는 유의차 (p-값 ≤0.05)를 나타낸다
표 5. 시험 2에서 일당 암컷당 산란된 알의 수. 10마리의 암컷에게 BSB hunchback 또는 음성 대조군 YFPv2에 대해 표적화된 dsRNA를 주사하였다. 알의 계수를 주사 후 제9일에 시작하여 수집하고, 주사 후 연속 24일 동안 계속하였다. 엑셀로 양측 T-검정을 수행하였다.
Figure pct00010
표 6. 시험 2에서 일당 암컷당 부화된 알의 수. 10마리의 암컷에게 BSB hunchback 또는 음성 대조군 YFPv2에 대해 표적화된 dsRNA를 주사하였다. 부화된 알의 계수를 주사 후 제9일에 시작하여 수집하고, 주사 후 연속 24일 동안 계속하였다. 부화된 평균 #/ 일/ 암컷에 대해 엑셀로 양측 t-검정을 수행하였다.
Figure pct00011
*는 유의차 (p-값 ≤0.05)를 나타낸다
표 7. 시험 3에서 일당 암컷당 산란된 알의 수. 10마리의 암컷에게 BSB hunchback 또는 음성 대조군 YFPv2에 대해 표적화된 dsRNA를 주사하였다. 알의 계수를 주사 후 제9일에 시작하여 수집하고, 주사 후 연속 23일 동안 계속하였다. 엑셀로 양측 T-검정을 수행하였다.
Figure pct00012
*는 유의차 (p-값 ≤0.05)를 나타낸다
표 8. 시험 3에서 일당 암컷당 부화된 알의 수. 10마리의 암컷에게 BSB hunchback 또는 음성 대조군 YFPv2에 대해 표적화된 dsRNA를 주사하였다. 부화된 알의 계수를 주사 후 제9일에 시작하여 수집하고, 주사 후 연속 23일 동안 계속하였다. 부화된 평균 #/ 일/ 암컷에 대해 엑셀로 양측 t-검정을 수행하였다.
Figure pct00013
*는 유의차 (p-값 ≤0.05)를 나타낸다
실시예 7: 노린재류 해충 서열을 포함하는 트랜스제닉 제아 메이스
서열식별번호: 1 및/또는 서열식별번호: 2를 포함하는 핵산을 위한 발현 벡터를 보유하는 10 내지 20종의 트랜스제닉 T0 제아 메이스 식물을 실시예 3에 기재된 바와 같이 생성한다. RNAi 구축물을 위한 헤어핀 dsRNA를 발현하는 추가의 10-20종의 T1 제아 메이스 독립적 계통을 BSB 챌린지를 위해 수득한다. 서열식별번호: 1의 절편을 포함하는 헤어핀 dsRNA가 유래될 수 있다. 이들을 RT-PCR 또는 다른 분자 분석 방법을 통해 확인한다. 각각의 RNAi 구축물 중 헤어핀 발현 카세트의 링커에서 결합하도록 설계된 프라이머를 사용하는 RT-PCR을 위해, 선택된 독립적 T1 계통으로부터의 총 RNA 제제를 임의로 사용한다. 추가로, RNAi 구축물 중 각각의 표적 유전자에 대해 특이적인 프라이머를 임의로 사용하여 식물내 siRNA 생산에 요구되는 예비-프로세싱된 mRNA를 증폭시키고 그의 생산을 확인한다. 각각의 표적 유전자에 대한 목적하는 밴드의 증폭은 각각의 트랜스제닉 제아 메이스 식물에서의 헤어핀 RNA의 발현을 확인시켜 준다. 후속적으로, 표적 유전자의 dsRNA 헤어핀의 siRNA로의 프로세싱을 RNA 블롯 혼성화를 사용하여 독립적 트랜스제닉 계통에서 임의로 확인한다.
더욱이, 표적 유전자에 대해 80% 초과의 서열 동일성을 갖는 미스매치 서열을 갖는 RNAi 분자는 표적 유전자에 대해 100% 서열 동일성을 갖는 RNAi 분자에 의해 관찰되는 것과 유사한 방식으로 노린재류에게 영향을 미친다. 동일한 RNAi 구축물에서 헤어핀 dsRNA를 형성하기 위한 미스매치 서열과 천연 서열과의 쌍형성은 섭식 노린재류 해충의 성장, 발생, 생식, 및 생존율에 영향을 미칠 수 있는 식물-프로세싱된 siRNA를 전달한다.
표적 유전자에 상응하는 dsRNA, siRNA, shRNA, hpRNA, 또는 miRNA의 식물내 전달 및 노린재류 해충에 의한 섭식을 통한 후속 흡수는 노린재류 해충에서 RNA-매개 유전자 침묵을 통한 표적 유전자의 하향-조절을 유발한다. 표적 유전자의 기능이 1개 이상의 발생 단계에서 중요한 경우에, 노린재류 해충의 성장, 발생, 및/또는 생식은 영향을 받으며, 유쉬스투스 헤로스, 피에조도루스 구일디니이, 할리오모르파 할리스, 네자라 비리둘라, 아크로스테르눔 힐라레, 및 유쉬스투스 세르부스 중 적어도 1종의 경우에서, 성공적 침입, 섭식, 발생, 및/또는 생식의 실패로 이어지거나, 또는 노린재류 해충의 사멸로 이어진다. 이어서, 표적 유전자의 선택 및 RNAi의 성공적인 적용을 사용하여 노린재류 해충을 방제한다.
트랜스제닉 RNAi 계통 및 비-형질전환 제아 메이스의 표현형 비교. 헤어핀 dsRNA를 생성하기 위해 선택된 표적 노린재류 해충 유전자 또는 서열은 어떠한 공지되어 있는 식물 유전자 서열에 대해서도 유사성을 갖지 않는다. 따라서, 이들 노린재류 해충 유전자 또는 서열을 표적화하는 구축물에 의한 (침투성) RNAi의 생산 또는 활성화가 트랜스제닉 식물에 대해 임의의 유해 효과를 나타낼 것으로 예상되지 않는다. 그러나, 트랜스제닉 계통의 발생 및 형태학적 특징을 비-형질전환 식물, 뿐만 아니라 헤어핀-발현 유전자를 갖지 않는 "공" 벡터로 형질전환된 트랜스제닉 계통의 경우와 비교한다. 식물 뿌리, 싹, 잎 및 생식 특징을 비교한다. 트랜스제닉 및 비-형질전환 식물의 뿌리 길이 및 성장 패턴에 있어서는 어떠한 관찰가능한 차이도 없다. 식물 싹 특징 예컨대 높이, 잎의 수 및 크기, 개화의 시기, 꽃의 크기 및 외관은 유사하다. 일반적으로, 시험관내 및 온실 내 토양에서 배양할 때, 트랜스제닉 계통과 표적 iRNA 분자가 발현되지 않은 것 사이에는 어떠한 관찰가능한 형태학적 차이도 없다.
실시예 8: 노린재류 해충 서열을 포함하는 트랜스제닉 글리신 맥스
서열식별번호: 2 또는 서열식별번호: 1의 절편을 포함하는 핵산을 위한 발현 벡터를 보유하는 10 내지 20종의 트랜스제닉 T0 글리신 맥스 식물을, 예를 들어 하기와 같이 아그로박테리움-매개 형질전환에 의한 것을 포함하여 관련 기술분야에 공지된 바와 같이 생성한다. 성숙 대두 (글리신 맥스) 종자를 16시간 동안 염소 기체로 밤새 멸균시킨다. 염소 기체로 멸균시킨 후, 종자를 라미나르(LAMINAR)™ 유동 후드 내의 개방 용기에 두어 염소 기체를 없앤다. 그 다음, 멸균시킨 종자를 24℃에서 흑색 상자를 사용하여 암흑 하에 16시간 동안 멸균 H2O를 흡수하게 한다.
분할-종자 대두의 제조. 배축 프로토콜의 일부분을 포함하는 분할 대두 종자는, 종피를 분리 및 제거하고 종자를 2개의 자엽 절편으로 분할하기 위해 스칼펠에 고정된 #10 블레이드를 사용하여 종자의 꼭지를 따라 종축으로 절단되는 대두 종자 물질의 제조를 요구한다. 배축을 부분적으로 제거하는데 세심한 주의가 필요하며, 여기서 배축의 약 1/2 - 1/3은 자엽의 마디 끝에 부착된 채로 남아있다.
접종. 배축의 일부 부분을 포함하는 분할 대두 종자를, 서열식별번호: 1 및/또는 서열식별번호: 2를 포함하는 이원 플라스미드를 함유하는 아그로박테리움 투메파시엔스 (예를 들어, 균주 EHA 101 또는 EHA 105)의 용액 중에 약 30분 동안 침지시킨다. 배축을 포함하는 자엽을 침지시키기 전에 아그로박테리움 투메파시엔스 용액을 λ=0.6 OD650의 최종 농도로 희석한다.
공동-배양. 접종 후, 분할 대두 종자를 한 장의 여과지로 덮인 페트리 디쉬 내의 공동-배양 배지 상에서 아그로박테리움 투메파시엔스 균주와 5일 동안 공동-배양되게 한다 (Agrobacterium Protocols, vol. 2, 2nd Ed., Wang, K. (Ed.) Humana Press, New Jersey, 2006).
싹 유도. 공동-배양 5일 후에, 분할 대두 종자를 B5 염, B5 비타민, 28 mg/L 제1철, 38 mg/L Na2EDTA, 30 g/L 수크로스, 0.6 g/L MES, 1.11 mg/L BAP, 100 mg/L 티멘틴(TIMENTIN)™, 200 mg/L 세포탁심, 및 50 mg/L 반코마이신 (pH 5.7)으로 이루어진 액체 싹 유도 (SI) 배지에서 세척한다. 이어서, 분할 대두 종자를 B5 염, B5 비타민, 7 g/L 노블 한천, 28 mg/L 제1철, 38 mg/L Na2EDTA, 30 g/L 수크로스, 0.6 g/L MES, 1.11 mg/L BAP, 50 mg/L 티멘틴™, 200 mg/L 세포탁심, 50 mg/L 반코마이신 (pH 5.7)으로 이루어진 싹 유도 I (SI I) 배지 상에서 배양하며, 이때 자엽의 편평한 면은 위를 향하고 자엽의 마디 끝은 배지 내로 박혀있다. 배양 2주 후에, 형질전환된 분할 대두 종자로부터의 외식편을, 6 mg/L 글루포시네이트 (리버티(LIBERTY)?)가 보충된 SI I 배지를 함유하는 싹 유도 II (SI II) 배지로 옮긴다.
싹 신장. SI II 배지 상에서의 배양 2주 후에, 외식편으로부터 자엽을 제거하고, 자엽의 기저부에서 절단을 수행함으로써, 배축을 함유하는 플러시 싹 패드를 절제한다. 자엽으로부터 단리된 싹 패드를 싹 신장 (SE) 배지로 옮긴다. SE 배지는 MS 염, 28 mg/L 제1철, 38 mg/L Na2EDTA, 30 g/L 수크로스 및 0.6 g/L MES, 50 mg/L 아스파라긴, 100 mg/L L-피로글루탐산, 0.1 mg/L IAA, 0.5 mg/L GA3, 1 mg/L 제아틴 리보시드, 50 mg/L 티멘틴™, 200 mg/L 세포탁심, 50 mg/L 반코마이신, 6 mg/L 글루포시네이트, 7 g/L 노블 한천 (pH 5.7)으로 이루어진다. 배양물을 2주마다 신선한 SE 배지로 옮긴다. 배양물을 80-90 μmol/m2sec의 광 강도에서 18시간 광주기를 사용하여 24℃에서 콘비론(CONVIRON)™ 성장 챔버 내에서 성장시킨다.
발근. 자엽 싹 패드로부터 발생된 신장된 싹은 자엽 싹 패드의 기저부에서 신장된 싹을 절단하여 단리하고, 신장된 싹을 1-3분 동안 1 mg/L IBA (인돌 3-부티르산) 중에 침지시켜 발근을 촉진시킨다. 그 다음, 신장된 싹을 피타 트레이 내 발근 배지 (MS 염, B5 비타민, 28 mg/L 제1철, 38 mg/L Na2EDTA, 20 g/L 수크로스 및 0.59 g/L MES, 50 mg/L 아스파라긴, 100 mg/L L-피로글루탐산, 7 g/L 노블 한천, pH 5.6)로 옮긴다.
배양. 1-2주 동안 24℃, 18시간 광주기에서 콘비론™ 성장 챔버 내에서 배양한 후, 뿌리가 발생된 싹을, 덮은 선데이 컵 내의 토양 혼합물로 옮기고, 소식물체의 적응을 위해 일정한 온도 (22℃) 및 습도 (40-50%) 하에 120-150 μmol/m2sec의 광 강도에서 긴 낮 조건 (16시간 명기/8시간 암기) 하에 콘비론™ 성장 챔버 (모델 CMP4030 및 CMP3244, 컨트롤드 인바이런먼츠 리미티드(Controlled Environments Limited), 캐나다 마니토바주 윈니펙) 내에 둔다. 발근된 소식물체를 선데이 컵에서 수 주 동안 적응시킨 후에, 강건한 트랜스제닉 대두 식물의 향후 적응 및 정착을 위해 온실로 옮긴다.
RNAi 구축물을 위해 헤어핀 dsRNA를 발현하는 추가의 10-20종의 T1 글리신 맥스 독립적 계통을 BSB 챌린지를 위해 수득한다. 서열식별번호: 2에 제시된 바와 같은, 또는 달리 서열식별번호: 1을 추가로 포함하는 헤어핀 dsRNA가 유래될 수 있다. 이들을 RT-PCR 또는 관련 기술분야에 공지된 바와 같은 다른 분자 분석 방법을 통해 확인한다. 각각의 RNAi 구축물 중 헤어핀 발현 카세트의 링커에서 결합하도록 설계된 프라이머를 사용하는 RT-PCR을 위해, 선택된 독립적 T1 계통으로부터의 총 RNA 제제를 임의로 사용한다. 추가로, RNAi 구축물 중 각각의 표적 유전자에 대해 특이적인 프라이머를 임의로 사용하여 식물내 siRNA 생산에 요구되는 예비-프로세싱된 mRNA를 증폭시키고 그의 생산을 확인한다. 각각의 표적 유전자에 대한 목적하는 밴드의 증폭은 각각의 트랜스제닉 글리신 맥스 식물에서의 헤어핀 RNA의 발현을 확인시켜 준다. 후속적으로, 표적 유전자의 dsRNA 헤어핀의 siRNA로의 프로세싱을 RNA 블롯 혼성화를 사용하여 독립적 트랜스제닉 계통에서 임의로 확인한다.
표적 유전자에 대해 80% 초과의 서열 동일성을 갖는 미스매치 서열을 갖는 RNAi 분자는 표적 유전자에 대해 100% 서열 동일성을 갖는 RNAi 분자에 의해 관찰되는 것과 유사한 방식으로 BSB에게 영향을 미친다. 동일한 RNAi 구축물에서 헤어핀 dsRNA를 형성하기 위한 미스매치 서열과 천연 서열과의 쌍형성은 섭식 노린재류 해충의 성장, 발생, 생식, 및 생존율에 영향을 미칠 수 있는 식물-프로세싱된 siRNA를 전달한다.
표적 유전자에 상응하는 dsRNA, siRNA, 또는 miRNA의 식물내 전달 및 노린재류 해충에 의한 섭식을 통한 후속 흡수는 노린재류 해충에서 RNA-매개 유전자 침묵을 통한 표적 유전자의 하향-조절을 유발한다. 표적 유전자의 기능이 1개 이상의 발생 단계에서 중요한 경우에, 노린재류 해충의 성장, 발생, 및/또는 생식은 영향을 받으며, 유쉬스투스 헤로스, 피에조도루스 구일디니이, 할리오모르파 할리스, 네자라 비리둘라, 아크로스테르눔 힐라레, 및 유쉬스투스 세르부스 중 적어도 1종의 경우에서, 성공적 침입, 섭식, 발생, 및/또는 생식의 실패로 이어지거나, 또는 노린재류 해충의 사멸로 이어진다. 이어서, 표적 유전자의 선택 및 RNAi의 성공적인 적용을 사용하여 노린재류 해충을 방제한다.
트랜스제닉 RNAi 계통 및 비-형질전환 글리신 맥스의 표현형 비교. 헤어핀 dsRNA를 생성하기 위해 선택된 표적 노린재류 해충 유전자 또는 서열은 어떠한 공지되어 있는 식물 유전자 서열에 대해서도 유사성을 갖지 않는다. 따라서, 이들 노린재류 해충 유전자 또는 서열을 표적화하는 구축물에 의한 (침투성) RNAi의 생산 또는 활성화가 트랜스제닉 식물에 대해 임의의 유해 효과를 나타낼 것으로 예상되지 않는다. 그러나, 트랜스제닉 계통의 발생 및 형태학적 특징을 비-형질전환 식물, 뿐만 아니라 헤어핀-발현 유전자를 갖지 않는 "공" 벡터로 형질전환된 트랜스제닉 계통의 경우와 비교한다. 식물 뿌리, 싹, 잎 및 생식 특징을 비교한다. 트랜스제닉 및 비-형질전환 식물의 뿌리 길이 및 성장 패턴에 있어서는 어떠한 관찰가능한 차이도 없다. 식물 싹 특징 예컨대 높이, 잎의 수 및 크기, 개화의 시기, 꽃의 크기 및 외관은 유사하다. 일반적으로, 시험관내 및 온실 내 토양에서 배양할 때, 트랜스제닉 계통과 표적 iRNA 분자가 발현되지 않은 것 사이에는 어떠한 관찰가능한 형태학적 차이도 없다.
실시예 9: 인공 먹이에 대한 이. 헤로스 생물검정
인공 먹이에 대한 dsRNA 섭식 검정에서, 주사 실험에서와 같이 32-웰 트레이에 ~18 mg 펠릿의 인공 먹이 및 물을 설치한다. 200 ng/μL의 농도의 dsRNA를 먹이 펠릿 및 물 샘플에 100 μL로 각각의 2개 웰에 첨가한다. 5마리의 제2령 이. 헤로스 약충을 각각의 웰 내로 도입한다. 물 샘플 및 YFP 전사체를 표적화하는 dsRNA를 음성 대조군으로서 사용한다. 실험을 상이한 3일에 반복한다. 생존하는 곤충을 칭량하고, 사멸률을 처리 7일 후에 결정한다.
성충 암컷 이. 헤로스에 대한 섭식 생물검정을 상기 기재된 바와 같이 32-웰 트레이로서 수행한다. 어린 (1주 미만의 성충) 교미된 암컷을 인공 먹이가 있는 생물검정 트레이 내로 트레이당 한마리씨 도입한다. dsRNA에 대한 노출 7일 후에 최대 10마리의 성충 암컷을 녹색 콩, 물, 종자, 및 2마리의 수컷이 있는 용기로 이동시킨다. 암컷 생존율, 뿐만 아니라 산란된 알 및 부화된 알의 수를 2주 후에 기록한다. 데이터는 산란 및/또는 부화된 알의 수가 유의하게 감소된다는 것을 제시한다.
실시예 10: 노린재류 해충 서열을 포함하는 트랜스제닉 아라비돕시스 탈리아나
hunchback (서열식별번호: 1)의 절편을 포함하는 헤어핀 형성을 위한 표적 유전자 구축물을 함유하는 아라비돕시스 형질전환 벡터를 실시예 4와 유사한 표준 분자 방법을 사용하여 생성한다. 아라비돕시스 형질전환을 표준 아그로박테리움-기반 절차를 사용하여 수행한다. T1 종자를 글루포시네이트 내성 선택 마커로 선택한다. 트랜스제닉 T1 아라비돕시스 식물을 생성하고, 동형접합 단순-카피 T2 트랜스제닉 식물을 곤충 연구를 위해 생성한다. 생물검정을 개화가 있는 성장하는 아라비돕시스 식물에 대해 수행한다. 5 내지 10마리의 곤충을 각각의 식물 상에 배치하고, 14일 내에 생존에 대해 모니터링한다.
아라비돕시스 형질전환 벡터의 구축. hunchback (서열식별번호: 1)의 절편을 포함하는 헤어핀 형성을 위한 표적 유전자 구축물을 보유하는 진입 벡터를 기반으로 하는 진입 클론을 화학적으로 합성된 단편 (DNA2.0, 캘리포니아주 멘로 파크) 및 표준 분자 클로닝 방법의 조합을 사용하여 조립한다. (단일 전사 단위 내에서) 표적 유전자 절편의 2개 카피를 반대 배향으로 배열함으로써 (상기 2개 절편은 링커 서열 (예를 들어, ST-LS1 인트론; 서열식별번호: 6) (Vancanneyt et al. (1990) Mol. Gen. Genet. 220(2):245-50)에 의해 이격되어 있음) RNA 1차 전사체에 의한 분자내 헤어핀 형성을 용이하게 한다. 따라서, 1차 mRNA 전사체는 링커 서열에 의해 이격된, 서로의 큰 역위 반복부로서 2개의 hunchback 유전자 절편을 함유한다. 프로모터의 카피 (예를 들어, 아라비돕시스 탈리아나 유비퀴틴 10 프로모터 (Callis et al. (1990) J. Biological Chem. 265:12486-12493))를 사용하여 1차 mRNA 헤어핀 전사체의 생산을 구동하고, 아그로박테리움 투메파시엔스의 오픈 리딩 프레임 23으로부터의 3' 비번역 영역 (AtuORF23 3' UTR v1; 미국 특허 5,428,147)을 포함하는 단편을 사용하여 헤어핀-RNA-발현 유전자의 전사를 종결시킨다.
상기 기재된 진입 벡터 내의 헤어핀 클론을 전형적인 이원 목표 벡터와의 표준 게이트웨이? 재조합 반응에 사용하여 아그로박테리움-매개 아라비돕시스 형질전환을 위한 헤어핀 RNA 발현 형질전환 벡터를 생산한다.
이원 목표 벡터는 카사바 베인 모자이크 바이러스 프로모터 (CsVMV 프로모터 v2, 미국 특허 US 7601885; 문헌 [Verdaguer et al. (1996) Plant Mol. Biol. 31:1129-39])의 조절 하의 제초제 내성 유전자인 DSM-2v2 (미국 특허 출원 번호 2011/0107455)를 포함한다. 아그로박테리움 투메파시엔스의 오픈 리딩 프레임 1로부터의 3' 비번역 영역 (AtuORF1 3' UTR v6; 문헌 [Huang et al. (1990) J. Bacteriol. 172:1814-22])을 포함하는 단편을 사용하여 DSM2v2 mRNA의 전사를 종결시킨다.
YFP 헤어핀 RNA를 발현하는 유전자를 포함하는 음성 대조군 이원 구출물은 전형적인 이원 목표 벡터 및 진입 벡터와의 표준 게이트웨이? 재조합 반응에 의해 구축한다. 진입 구축물은 아라비돕시스 유비퀴틴 10 프로모터의 발현 제어 하의 YFP 헤어핀 서열 (hpYFP v2, 서열식별번호: 5) (상기와 같음) 및 아그로박테리움 투메파시엔스로부터의 ORF23 3' 비번역 영역 (상기와 같음)을 포함하는 단편을 포함한다.
살곤충 헤어핀 RNA를 포함하는 트랜스제닉 아라비돕시스의 생산: 아그로박테리움-매개 형질전환. 헤어핀 서열을 함유하는 이원 플라스미드를 아그로박테리움 균주 GV3101 (pMP90RK) 내로 전기천공한다. 재조합 아그로박테리움 클론을 재조합 아그로박테리움 콜로니의 플라스미드 제제의 제한 분석에 의해 확인한다. 퀴아젠 플라스미드 맥스 키트 (퀴아젠, Cat# 12162)를 사용하여 제조업체 권장된 프로토콜에 따라 아그로박테리움 배양물로부터 플라스미드를 추출한다.
아라비돕시스 형질전환 및 T1 선택. 12 내지 15개의 아라비돕시스 식물 (재배품종 콜럼비아(c.v. Columbia))을 250 μmol/m2의 광 강도, 25℃, 및 18:6시간의 명:암 조건을 갖는 온실에서 4" 용기 내에서 성장시킨다. 1차 꽃 줄기를 형질전환 1주 전에 트리밍한다. 10 μL 재조합 아그로박테리움 글리세롤 스톡을 28℃에서 100 mL LB 브로쓰 (시그마 L3022) + 100 mg/L 스펙티노마이신 + 50 mg/L 카나마이신 중에서 인큐베이션하고, 72시간 동안 225 rpm에서 진탕시킴으로써 아그로박테리움 접종물을 제조한다. 아그로박테리움 세포를 수거하고, 5% 수크로스 + 0.04% 실웨트-L77 (렐레 시드즈(Lehle Seeds) Cat # VIS-02) + 10 μg/L 벤즈아미노 퓨린 (BA) 용액 중에 현탁시켜 OD600 0.8~1.0이 되도록 한 후에 꽃을 침지시킨다. 식물의 지상 부분을 아그로박테리움 용액 중에 5-10분 동안 서서히 교반하면서 침지시킨다. 이어서 식물을 종자가 정착할 때까지 규칙적으로 급수 및 시비하면서 정상 성장을 위해 온실로 옮긴다.
실시예 11: 트랜스제닉 아라비돕시스의 성장 및 생물검정
헤어핀 RNAi 구축물로 형질전환시킨 T1 아라비돕시스의 선택. 각각의 형질전환으로부터의 T1 종자 최대 200 mg을 0.1% 아가로스 용액 중에서 계층화시킨다. 종자를 #5 선샤인 배지가 있는 발아 트레이 (10.5" x 21" x 1"; 티.오. 플라스틱스 인크.(T.O. Plastics Inc.), 미네소타주 클리어워터)에 식재한다. 형질전환체를 식재 6 및 9일 후 280 g/ha의 이그나이트(Ignite)? (글루포시네이트)에 내성이 있는 것으로 선택한다. 선택된 이벤트를 4" 직경 용기 내로 이식한다. 로슈 라이트사이클러480™을 사용하여 가수분해 정량적 실시간 PCR (qPCR)을 통해 식재 1주 이내에 삽입 카피 분석을 수행한다. PCR 프라이머 및 가수분해 프로브는 라이트사이클러™ 프로브 설계 소프트웨어 2.0 (로슈)을 사용하여 DSM2v2 선택 마커에 대해 설계한다. 식물을 100-150 mE/m2s 강도의 형광 및 백열광 하에 16:8시간 명:암 광주기로 24℃에서 유지한다.
이. 헤로스 약충 식물 섭식 생물검정. 적어도 4개의 낮은 카피 (1-2개 삽입), 4개의 중간 카피 (2-3개 삽입), 및 4개의 높은 카피 (≥4개 삽입) 이벤트를 각각의 구축물에 대해 선택한다. 식물을 생식 단계 (꽃 및 장각과를 함유하는 식물)까지 성장시킨다. 토양의 표면은 용이한 곤충 확인을 위해 ~ 50 mL 부피의 백색 모래로 덮는다. 5 내지 10마리의 제2령 이. 헤로스 약충을 각각의 식물 상에 도입한다. 식물을 3" 직경, 16" 높이, 및 0.03" 벽 두께를 갖는 플라스틱 튜브 (물품 번호 484485, 비시팩 펜톤(Visipack Fenton), 미주리주)로 덮고; 튜브를 곤충 단리를 위해 나일론 메쉬로 덮는다. 식물을 콘비론에서 정상 온도, 광, 및 급수 조건 하에서 유지한다. 14일 내에, 곤충을 수집하고, 칭량하고; 퍼센트 사멸률, 뿐만 아니라 성장 억제 (1 - 처리군 중량/대조군 중량)를 계산한다. YFP 헤어핀-발현 식물을 대조군으로서 사용한다.
pRNAi 아라비돕시스 T1 식물을 상기 기재된 바와 같이 선택하고 온실에서 성장시킨다. 1 내지 5마리의 새롭게 출현한 BSB 성충을 각각의 식물 상에 방출시키고, 전체 식물을 상기 기재된 바와 같이 덮어 성충이 도망가는 것을 방지한다. 방출 1주 후에, 암컷 성충을 각각의 식물로부터 회수하고, 알 수집을 위해 실험실에서 유지한다. 모 RNAi 표적 및 예상된 표현형에 따라, 파라미터, 예컨대 암컷당 알의 수, 퍼센트 알 부화 및 약충 사멸률을 기록하고, 대조군 식물과 비교한다.
T2 아라비돕시스 종자 생성 및 T2 생물검정. T2 종자를 각각의 구축물에 대해 선택된 낮은 카피 (1-2개 삽입) 이벤트로부터 생산한다. 식물 (동형접합 및/또는 이형접합)을 상기 기재된 바와 같이 이. 헤로스 약충 및 성충 섭식 생물검정에 적용한다. T3 종자를 동형접합체로부터 수거하고, 향후 분석을 위해 보관한다.
실시예 12: 추가의 작물 종의 형질전환
목화를 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법, 예를 들어 미국 특허 7,838,733의 실시예 14, 또는 PCT 국제 특허 공개 번호 WO 2007/053482의 실시예 12에 이전에 기재된 바와 실질적으로 동일한 기술을 이용하여 노린재의 방제를 제공하기 위해 (엽록체 통과 펩티드의 존재 또는 부재 하에) hunchback으로 형질전환시킨다.
실시예 13: pRNAi-매개 곤충 보호
알 사멸률 또는 알 생존율의 손실을 야기하는 모 RNAi는 곤충 보호를 위해 RNAi 및 다른 메카니즘을 사용하는 트랜스제닉 작물에 추가의 지속성 이익을 가져다 준다. 기본적인 2-패치 모델을 사용하여 이 유용성을 입증하였다.
한 패치는 살곤충 성분을 발현하는 트랜스제닉 작물을 함유하였고, 제2 패치는 살곤충 성분을 발현하지 않는 은신처 작물을 함유하였다. 알을 2종의 모델링된 패치에서 그의 상대 비율에 따라 산란시켰다. 본 실시예에서, 트랜스제닉 패치는 95%의 랜드스케이프를 나타냈고, 은신처 패치는 5%를 나타냈다. 트랜스제닉 작물은 곤충에 대해 활성인 살곤충 단백질을 발현하였다.
살곤충 단백질에 대한 해충을, 하나 (S)는 감수성을 부여하고 다른 것 (R)은 저항성을 부여하는 2종의 가능한 대립유전자를 갖는 단일유전자로서 모델링하였다. 살곤충 단백질은 그것을 섭식하는 동형접합 감수성 (SS) 약충의 97% 사멸률을 야기하는 것으로 모델링되었다. 저항성 대립유전자에 대해 동형접합 (RR)인 약충의 사멸률은 존재하지 않는 것으로 가정되었다. 살곤충 단백질에 대한 저항성은 불완전 열성인 것으로 가정되었고, 이에 의해 기능적 우성도는 0.3이다 (트랜스제닉 작물을 섭식하는, 단백질에의 저항성에 대해 이형접합 (RS)인 약충의 67.9% 사멸률이 존재한다).
트랜스제닉 작물은 또한 RNA-간섭 (pRNAi)을 통해 트랜스제닉 작물에 노출된 성충 암컷 곤충의 알이 비-생존하도록 하는 모 활성 dsRNA를 발현하였다. pRNAi에 대한 곤충 저항성은 또한 하나 (X)는 RNAi에 대한 성충 암컷의 감수성을 부여하고 다른 것 (Y)은 RNAi에 대한 성충 암컷의 저항성을 부여하는 2종의 가능한 대립유전자를 갖는 단일유전자인 것으로 간주되었다. dsRNA에 대한 노출의 높은 수준을 가정한다면, pRNAi는 동형접합 감수성 (XX) 암컷에 의해 생산된 알의 99.9%가 비-생존하도록 하는 것으로 모델링되었다. 모델은 pRNAi가 동형접합 저항성 (YY) 암컷에 의해 생산된 알의 생존율에 대해서는 어떠한 효과도 나타내지 않는 것으로 가정하였다. dsRNA에 대한 저항성은 열성인 것으로 가정되었고, 이에 의해 기능적 우성도는 0.01이다 (dsRNA에의 저항성에 대해 이형접합 (XY)인 암컷에 의해 생산된 알의 98.9%는 비-생존한다).
모델에서, 2종의 패치에 걸쳐 그의 상대 비율에 따라 생존하는 성충 사이의 무작위 교미 및 무작위 산란이 존재하였다. 생존 자손의 유전자형의 빈도는 2-유전자좌 유전자 시스템에 대한 멘델 유전학을 따랐다.
pRNAi의 효과는 성충 암컷이 모 활성 dsRNA를 발현하는 식물 조직을 섭식하는 것을 요구하였다. 알 발생에 의한 간섭은 트랜스제닉 작물보다 은신처 작물로부터 출현한 성충 암컷의 경우에 더 낮을 수 있고; 성충은 약충 발생 후 이들이 출현한 패치에서 보다 광범위하게 섭식할 수 있다. 따라서, 은신처 패치로부터 출현한 암컷 성충에 대한 pRNAi 효과의 상대 크기는 달라졌으며, 이때 pRNAi 효과의 비율은 0 (은신처 패치로부터 출현한 충 암컷 성충에 대한 pRNAi의 효과 부재) 내지 1 (트랜스제닉 패치로부터 출현한 성충 암컷과 동일한, 은신처 패치로부터 출현한 성충 암컷에 대한 pRNAi의 효과)이다.
이 모델은 pRNAi의 효과가, 성충 수컷이 모 활성 dsRNA를 발현하는 식물 조직을 섭식하는 경우에도 또한 또는 대안적으로 달성되는 경우의 상황을 입증하기 위해 용이하게 조정될 수 있다.
2종의 저항성 대립유전자의 빈도를 세대에 걸쳐 계산하였다. 저항성 대립유전자 (R 및 Y) 둘 다의 초기 빈도는 0.005인 것으로 가정되었다. 결과는 0.05에 이르는 각각의 저항성 대립유전자의 빈도에 대한 곤충 세대의 수로서 제시되었다. pRNAi에 의해 야기된 저항성 지연을 검사하기 위해, pRNAi를 포함한 시뮬레이션을 pRNAi를 포함하지 않았지만 다른 모든 방식에 있어서는 동일한 시뮬레이션과 비교하였다. 도 2.
또한 트랜스제닉 작물에 약충-활성 간섭 dsRNA를 살곤충 단백질과 조합하여 포함하도록 모델을 변형시켰다. 여기서, 약충 RNAi는 동형접합 RNAi-감수성 약충 (유전자형 XX)에 대해 97% 약충 사멸률의 효과가 할당되었고, 동형접합 RNAi-저항성 (YY)이 있는 약충에 대해서는 어떠한 효과도 할당되지 않았다. RNAi-저항성에 대해 이형접합 (XY)인 약충의 67.9% 사멸률이 존재하였다. 동일한 메카니즘의 저항성이 약충 활성 RNAi 및 pRNAi 둘 다에 적용된 것으로 가정되었다. 이전과 같이, 트랜스제닉 패치로부터 출현한 성충 암컷에 대한 효과에 비해 은신처 패치로부터 출현한 성충 암컷에 대한 pRNAi 효과는 0 내지 1로 달라졌다. 이전과 같이, pRNAi에 의해 야기된 저항성 지연을 검사하기 위해, pRNAi를 포함한 시뮬레이션을 pRNAi를 포함하지 않았지만 다른 모든 방식에 있어서는 동일한 (약충 RNAi를 포함함) 시뮬레이션과 비교하였다. 도 3.
pRNAi의 명확한 저항성 관리 이익은 은신처 패치로부터 출현한 암컷 성충의 경우 알 생존율에 대한 pRNAi 효과의 크기가 트랜스제닉 패치로부터 출현한 성충의 경우 효과의 크기와 비교하여 감소되었을 때 관찰되었다. 살곤충 단백질에 추가로 모 활성 dsRNA를 생산한 트랜스제닉 작물은 단지 살곤충 단백질만을 생산한 트랜스제닉 작물과 비교하여 훨씬 더 지속적이었다. 유사하게, 살곤충 단백질 및 약충 활성 dsRNA 둘 다에 추가로 모 활성 dsRNA를 생산한 트랜스제닉 작물은 단지 살곤충 단백질 및 약충 활성 dsRNA만을 생산한 트랜스제닉 작물과 비교하여 훨씬 더 지속적이었다. 후자의 경우에, 지속성 이익은 살곤충 단백질 및 살곤충 간섭 dsRNA 둘 다에 적용되었다.
실시예 14: 노린재류 해충 서열 및 추가의 RNAi 구축물을 포함하는 트랜스제닉 식물
노린재류 해충 이외의 다른 유기체를 표적화하는 iRNA 분자로 전사되는 이종 코딩 서열을 게놈 내에 포함하는 트랜스제닉 식물을 아그로박테리움 또는 휘스커스(WHISKERS)™ 방법론을 통해 2차로 형질전환시켜 (문헌 [Petolino and Arnold (2009) Methods Mol. Biol. 526:59-67] 참조) 1종 이상의 살곤충 dsRNA 분자 (예를 들어, 서열식별번호: 1을 포함하는 유전자를 표적화하는 dsRNA 분자를 포함한 적어도 1종의 dsRNA 분자)를 생산한다. 본질적으로 실시예 3에 기재된 바와 같이 제조된 식물 형질전환 플라스미드 벡터를 아그로박테리움 또는 휘스커스™-매개 형질전환 방법을 통해, 노린재류 해충 이외의 다른 유기체를 표적화하는 iRNA 분자로 전사되는 이종 코딩 서열을 게놈 내에 포함하는 트랜스제닉 식물로부터 수득된 현탁 세포 또는 미성숙 배아 내로 전달한다.
실시예 15: RNAi 구축물 및 추가의 노린재류 해충 방제 서열을 포함하는 트랜스제닉 식물
노린재류 해충 유기체를 표적화하는 iRNA 분자로 전사되는 이종 코딩 서열 (예를 들어, 서열식별번호: 1을 포함하는 유전자를 표적화하는 dsRNA 분자를 포함한 적어도 1종의 dsRNA 분자)을 게놈 내에 포함하는 트랜스제닉 식물을 아그로박테리움 또는 휘스커스™ 방법론을 통해 2차로 형질전환시켜 (문헌 [Petolino and Arnold (2009) Methods Mol. Biol. 526:59-67] 참조) 1종 이상의 살곤충 단백질 분자, 예를 들어, Cry1A, Cry2A, Cry3A, Cry11A, 또는 Cry51 살곤충 단백질을 생산한다. 본질적으로 실시예 3에 기재된 바와 같이 제조된 식물 형질전환 플라스미드 벡터를 아그로박테리움 또는 휘스커스™-매개 형질전환 방법을 통해, 노린재류 해충 유기체를 표적화하는 iRNA 분자로 전사되는 이종 코딩 서열을 게놈 내에 포함하는 트랜스제닉 식물로부터 수득된 현탁 세포 또는 미성숙 배아 내로 전달한다. 노린재류 해충의 방제를 위해 iRNA 분자 및 살곤충 단백질을 생산하는 이중으로-형질전환된 식물을 수득한다.
SEQUENCE LISTING <110> Dow AgroSciences LLC and The Board of Regents of the University of Nebraska Siegfried, Blair Narva, Kenneth Arora, Kanika Worden, Sarah Khajuria, Chitvan Fishilevich, Elane Storer, Nicholas P. Frey, Meghan Hamm, Ronda Velez, Ana <120> PARENTAL RNAI SUPPRESSION OF HUNCHBACK GENE TO CONFER RESISTANCE TO HEMIPTERAN PESTS <130> 2971-P12202.3US (74940-US-NP) <150> 62/092,776 <151> 2014-12-16 <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2237 <212> DNA <213> Euchistus heros <400> 1 gccctttggg tttagttctc tacgagctgc tctaccatcc actaggacta gctctatctt 60 ctctcttata ttagttctgg atatatatct ctctctctct atctatatct acagctggga 120 acaccgtagt cgtcttttgt tttatatata ttgcctgcat gttggaatga gatgattata 180 actcctgata tatactttaa caatccgagg atgaacatcg gtgtgcaata cgacccaagg 240 cattccgtct tcccgaattt ggagcaccat ccatggatgg cttccccgac tccggcacaa 300 gtcgttaaag aggagccgcg agatgacgcg gagtacggtc agaacagcca ggagagccag 360 ctgccgctga cgccgccccc cttccagggc taccccccgg ggaacaccta ccgcgaggcc 420 acgcccccta aggatacgcc ccccgcctcc accccctcgc ctcaggagaa gcaggaaggc 480 agctccaact ccgagggaga gtactacgag agcggagagt ccctaaagag gctgcagatg 540 gccctccata ggaccgggat gataacggag gagaagctgc aatgtcctgt atgcgagttc 600 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cagcaaccac aacaaccgcc gcaggucccg 1260 acuauuuuca acccauauuc cuuacuucca acacagaugc cauauuacaa cauccuuaau 1320 ggauuuggag gauuuccuuu cccacaagau guuaacaugg aagagaaaaa caacaauguu 1380 gaaaaagaag agaucagaga agauaaagcu ccucuugacu ugagcugccc ugaaccgaug 1440 guagaagaca gcaaucaaga agccccagug aaaaaccgua gaaaagggaa agccuucaaa 1500 cuugacagaa ucgcccuucg ccuacagcag caagucgaag uggaagagca gccagaaccg 1560 ccaaaaccga ucccaccacc ugugguuucc gagccggcaa aaucaccuga aauuaagucc 1620 ugcgaagcug acagcgagca gcagaaggug gagaaaacag aacaggagaa uguguauagu 1680 ugcacuuuuu gugauauuuu auuuaaggac auuguuaugu auacaaugca uauggguuac 1740 cauggcuacg aagaccccuu caagugcaac augugcgggc agcaaacaac cgacaagguu 1800 ucuuucuucc uccacauugc aagaacauca cacucauaag gauuacaauu cuauuauuaa 1860 ucaaauagau uuuuuucugg uuuuaaaaga gaauccaacu uguuacccag uucagucauu 1920 aacugucucu cguggcaguu uauguaaaua uuuauuauau caucauuuag auuauuaaua 1980 uauuauuuuc cagauauauu uagcguuggu gucuagucau guguauaaca acauaaugug 2040 uaaaaaaaaa auguggaauu aggaaauagu guccuaacau augaaauaug uaaacaagag 2100 aaaggaauaa caaaaauguu aaaaguaauu aacauuauua agaauauuug aaaaacaaua 2160 uuauguuccc uucuaauguu aaugagcgag uaaaaaaagu uaaaacgauu gcauaguuuu 2220 aagguauuuu auagccg 2237 <210> 13 <211> 469 <212> RNA <213> Euchistus heros <400> 13 guccacgacu gcgaugauga cagcagcugg ggagaagaag agcucaacac ucccaaaguc 60 aauucucagg gaaaggucaa aacguuucgc ugcaagcagu gugaguuuuc agcugugacg 120 aaacuagaau uuugggauca cucucgcacc cacaucaaac aggagcgauu gcucacuugc 180 ccaaagugcc cauucgucac ugaauacaaa caccaucucg aauaccauuu gaggaaucau 240 uuuggaucga aaccguucaa gugugacaag uguuccuacu cuugcgugaa caaauccaug 300 cucaauucuc acuugaaaag ucacagcaac auuuaccagu ucagaugugc ugauugcacc 360 uacgcuacua aguauuguca cagcuugaag cugcaucuga gaaaauaugc ucacaaccca 420 gccaugguuc uuaacccuga cgguucuccu aauccucuac caaucguag 469 <210> 14 <211> 1134 <212> DNA <213> Euchistus heros <400> 14 tacaaaatgt gtgacgaaga agttgctgct ttagttgtag acaatggatc tggtatgtgc 60 aaagccggtt tcgctggaga tgatgcaccc cgagctgtat tcccatcaat tgttggcagg 120 cctagacacc agggtgtcat ggttggaatg ggacaaaagg acagttatgt tggagacgaa 180 gcccaaagca agagaggtat cctcaccctg aaatacccca ttgaacacgg tatcatcacc 240 aactgggacg acatggaaaa gatctggcat cacaccttct acaacgagct gcgagtcgct 300 ccagaggaac accccatcct cctgactgag gctcccctca accccaaagc caacagggag 360 aagatgaccc agatcatgtt tgagaccttc aacaccccag ccatgtatgt cgccatccag 420 gctgtactct ccctctatgc ctccggtcgt actaccggta ttgtacttga ctcaggagat 480 ggtgtctccc acaccgtacc catctatgaa ggttatgccc ttccccacgc catcctccgt 540 ctggatcttg ctggacgtga cttgactgac tatcttatga agatcctcac cgagcgtggt 600 tacagcttca ccaccaccgc tgaaagggaa atcgtcaggg acatcaagga aaaactgtgc 660 tatgtcgccc tggactttga gcaggaaatg gccaccgccg ctgcctccac ctccctggag 720 aagtcctatg aacttcccga cggtcaggtc atcaccatcg gtaacgagag gttccgttgc 780 ccagaggctc tcttccagcc ttccttcttg ggtatggaat cttgcggtat ccatgagact 840 gtctacaact ccatcatgaa gtgcgacgtt gacatcagga aggacttgta cgccaacacc 900 gtcctctccg gaggtaccac catgtaccca ggtattgctg acaggatgca gaaggaaatc 960 accgccctcg ctccttcaac catcaagatc aagatcattg ctcccccaga aaggaagtac 1020 tccgtatgga tcggtggttc catcttggct tccctgtcca ccttccagca gatgtggatc 1080 tccaagcagg aatacgacga atccggccca ggcatcgtcc accgcaaatg cttc 1134

Claims (57)

  1. 서열식별번호: 1; 서열식별번호: 1의 상보체; 서열식별번호: 1의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 서열식별번호: 1의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체; 서열식별번호: 1을 포함하는 노린재류 유기체의 천연 코딩 서열; 서열식별번호: 1을 포함하는 노린재류 유기체의 천연 코딩 서열의 상보체; 서열식별번호: 1을 포함하는 천연 RNA 분자로 전사되는 노린재류 유기체의 천연 비-코딩 서열; 서열식별번호: 1을 포함하는 천연 RNA 분자로 전사되는 노린재류 유기체의 천연 비-코딩 서열의 상보체; 서열식별번호: 1을 포함하는 노린재류 유기체의 천연 코딩 서열의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 서열식별번호: 1을 포함하는 노린재류 유기체의 천연 코딩 서열의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체; 서열식별번호: 1을 포함하는 천연 RNA 분자로 전사되는 노린재류 유기체의 천연 비-코딩 서열의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 및 서열식별번호: 1을 포함하는 천연 RNA 분자로 전사되는 노린재류 유기체의 천연 비-코딩 서열의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체
    로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 핵산.
  2. 제1항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 2로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 폴리뉴클레오티드.
  3. 제1항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물 형질전환 벡터.
  4. 제1항에 있어서, 유기체가 유쉬스투스 헤로스 (파브르.)(Euschistus heros (Fabr.)) (신열대 갈색 노린재), 네자라 비리둘라 (엘.)(Nezara viridula (L.)) (남부 녹색 노린재), 피에조도루스 구일디니이 (웨스트우드)(Piezodorus guildinii (Westwood)) (적색줄 노린재), 할리모르파 할리스 (스탈)(Halyomorpha halys (Stal)) (썩덩나무노린재), 키나비아 힐라레 (세이)(Chinavia hilare (Say)) (녹색 노린재), 유쉬스투스 세르부스 (세이)(Euschistus servus (Say)) (갈색 노린재), 디켈롭스 멜라칸투스 (달라스)(Dichelops melacanthus (Dallas)), 디켈롭스 푸르카투스 (에프.)(Dichelops furcatus (F.)), 에데사 메디타분다 (에프.)(Edessa meditabunda (F.)), 티안타 페르디토르 (에프.)(Thyanta perditor (F.)) (신열대 적색 어깨 노린재), 키나비아 마르기나툼 (팔리소 드 보부와)(Chinavia marginatum (Palisot de Beauvois)), 호르시아스 노빌렐루스 (베르그)(Horcias nobilellus (Berg)) (목화 노린재), 타에디아 스티그모사 (베르그)(Taedia stigmosa (Berg)), 디스데르쿠스 페루비아누스 (게렝-메네빌)(Dysdercus peruvianus (Guerin-Meneville)), 네오메갈로토무스 파르부스 (웨스트우드)(Neomegalotomus parvus (Westwood)), 렙토글로수스 조나투스 (달라스)(Leptoglossus zonatus (Dallas)), 니에스트레아 시다에 (에프.)(Niesthrea sidae (F.)), 리구스 헤스페루스 (나이트)(Lygus hesperus (Knight)) (서부 변색 장님노린재), 및 리구스 리네올라리스 (팔리소 드 보부와)(Lygus lineolaris (Palisot de Beauvois))로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 폴리뉴클레오티드.
  5. 제1항의 폴리뉴클레오티드로부터 전사된 리보핵산 (RNA) 분자.
  6. 제1항의 폴리뉴클레오티드의 발현으로부터 생산된 이중-가닥 리보핵산 분자.
  7. 제6항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 서열을 노린재류 해충과 접촉시키는 것이 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 상보적인 내인성 뉴클레오티드 서열의 발현을 억제하는 것인 이중-가닥 리보핵산 분자.
  8. 제7항에 있어서, 상기 리보뉴클레오티드 분자를 노린재류 해충과 접촉시키는 것이 해충을 사멸시키거나 또는 해충의 성장, 생식, 및/또는 섭식을 억제하는 것인 이중-가닥 리보핵산 분자.
  9. 제6항에 있어서, 제1, 제2 및 제3 RNA 절편을 포함하며, 여기서 제1 RNA 절편은 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 제3 RNA 절편은 제2 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 제1 RNA 절편에 연결되고, 여기서 제3 RNA 절편은 실질적으로 제1 RNA 절편의 역 상보체이며, 이에 따라 제1 및 제3 RNA 절편이 리보핵산으로 전사되는 경우에 혼성화되어 이중-가닥 RNA를 형성하는 것인 이중 가닥 RNA.
  10. 제5항에 있어서, 약 15 내지 약 30개의 뉴클레오티드 길이의 이중-가닥 리보핵산 분자 및 단일-가닥 리보핵산 분자로 이루어진 군으로부터 선택된 RNA.
  11. 제1항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물 형질전환 벡터이며, 여기서 이종 프로모터는 식물 세포에서 기능적인 것인 식물 형질전환 벡터.
  12. 제1항의 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 세포.
  13. 제12항에 있어서, 원핵 세포인 세포.
  14. 제12항에 있어서, 진핵 세포인 세포.
  15. 제14항에 있어서, 식물 세포인 세포.
  16. 제1항의 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 식물.
  17. 제16항의 식물의 종자이며, 폴리뉴클레오티드를 포함하는 종자.
  18. 제16항의 식물로부터 생산된 범용 제품이며, 검출가능한 양의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 범용 제품.
  19. 제16항에 있어서, 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드가 식물에서 이중-가닥 리보핵산 분자로서 발현되는 것인 식물.
  20. 제15항에 있어서, 제아 메이스(Zea mays) 세포, 글리신 맥스(Glycine max) 세포, 또는 고시피움(Gossypium) 종으로부터의 세포인 세포.
  21. 제16항에 있어서, 메이즈, 대두, 또는 목화인 식물.
  22. 제16항에 있어서, 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드가 식물에서 리보핵산 분자로서 발현되고, 리보핵산 분자는 노린재류 해충이 식물의 일부를 섭취하는 경우에 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 상보적인 내인성 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제하는 것인 식물.
  23. 제1항에 있어서, 내인성 해충 유전자의 발현을 억제하는 RNA 분자를 코딩하는 적어도 1종의 추가의 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  24. 제23항에 있어서, 추가의 폴리뉴클레오티드가 모 RNAi 표현형을 유발하는 iRNA 분자를 코딩하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  25. 제24항에 있어서, 추가의 폴리뉴클레오티드가 brahma 또는 kruppel 유전자의 발현을 억제하는 iRNA 분자를 코딩하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  26. 제23항에 있어서, 추가의 폴리뉴클레오티드가 iRNA 분자와 접촉하는 노린재류 해충에서의 감소된 성장 및/또는 발생 및/또는 사멸을 유발하는 iRNA 분자 (치사 RNAi)를 코딩하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  27. 제23항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물 형질전환 벡터이며, 여기서 추가의 폴리뉴클레오티드(들)는 각각 식물 세포에서 기능적인 이종 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인 식물 형질전환 벡터.
  28. 제1항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 이종 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인 폴리뉴클레오티드.
  29. 노린재류 해충과의 접촉시에 노린재류 해충 내의 생물학적 기능을 억제하도록 기능하는 리보핵산 (RNA) 분자를 포함하는 작용제를 제공하는 것을 포함하며, 여기서 RNA는 서열식별번호: 12 및 13; 서열식별번호: 12 및 13 중 어느 것의 상보체; 서열식별번호: 12 및 13 중 어느 것의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 서열식별번호: 12 및 13 중 어느 것의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체; 서열식별번호: 1 및 2 중 어느 것의 전사체; 서열식별번호: 1 및 2 중 어느 것의 전사체의 상보체; 서열식별번호: 1 및 2 중 어느 것의 전사체의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 및 서열식별번호: 1 및 2 중 어느 것의 전사체의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화가능한 것인, 노린재류 해충 집단을 방제하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 작용제가 이중-가닥 RNA 분자인 방법.
  31. 노린재류 해충 내로, 노린재류 해충과의 접촉시에 노린재류 해충 내의 생물학적 기능을 억제하도록 기능하는 리보핵산 (RNA) 분자를 도입하는 것이며, 여기서 RNA는
    서열식별번호: 12 및 13 중 어느 것,
    서열식별번호: 12 및 13 중 어느 것의 상보체,
    서열식별번호: 12 및 13 중 어느 것의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편,
    서열식별번호: 12 및 13 중 어느 것의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체,
    서열식별번호: 1 및 2 중 어느 것의 전사체,
    서열식별번호: 1 및 2 중 어느 것의 전사체의 상보체,
    서열식별번호: 1 및 2 중 어느 것의 전사체의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편, 및
    서열식별번호: 1 및 2 중 어느 것의 전사체의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체
    로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화가능하고,
    이에 의해 pRNAi 표현형을 갖는 노린재류 해충을 생산하는 것
    을 포함하는, 노린재류 해충 집단을 방제하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, RNA가 수컷 노린재류 해충 내로 도입되는 것인 방법.
  33. 제31항에 있어서, RNA가 암컷 노린재류 해충 내로 도입되고, 방법이 해충 집단 내로 pRNAi 표현형을 갖는 암컷 노린재류 해충을 방출시키는 것을 추가로 포함하며, 여기서 집단의 pRNAi 표현형을 갖는 암컷 노린재류 해충과 수컷 해충 사이의 교미는 집단의 다른 암컷 해충과 수컷 해충 사이의 교미보다 더 적은 생존 자손을 생산하는 것인 방법.
  34. 노린재류 해충과의 접촉시에 노린재류 해충 내의 생물학적 기능을 억제하도록 기능하는 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 작용제를 제공하는 것을 포함하며, 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 12의 약 19 내지 약 30개의 인접 뉴클레오티드에 대해 약 90% 내지 약 100% 서열 동일성을 나타내는 영역을 포함하고, 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 서열은 제2 폴리뉴클레오티드 서열에 특이적으로 혼성화되는 것인, 노린재류 해충 집단을 방제하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 리보핵산 분자가 이중-가닥 리보핵산 분자인 방법.
  36. 제34항에 있어서, 노린재류 해충 집단이 형질전환된 식물 세포가 결여된 동일한 숙주 식물 종의 숙주 식물에 침입한 동일한 해충 종의 집단에 비해 감소되는 것인 방법.
  37. 제1항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질전환된 식물 세포를 노린재류 해충의 숙주 식물에 제공하는 것을 포함하며, 여기서 폴리뉴클레오티드는 발현되어, 노린재류 해충 집단에 속하는 노린재류 해충과의 접촉시에 노린재류 해충 내의 표적 서열의 발현을 억제하도록 기능하는 리보핵산 분자를 생산하고, 폴리뉴클레오티드를 포함하지 않는 동일한 숙주 식물 종의 식물 상에서의 동일한 해충 종의 생식에 비해, 노린재류 해충 또는 해충 집단의 감소된 생식을 유발하는 것인, 노린재류 해충 집단을 방제하는 방법.
  38. 제37항에 있어서, 리보핵산 분자가 이중-가닥 리보핵산 분자인 방법.
  39. 제37항에 있어서, 노린재류 해충 집단이 형질전환된 식물 세포가 결여된 동일한 종의 숙주 식물에 침입한 노린재류 해충 집단에 비해 감소되는 것인 방법.
  40. 서열식별번호: 12 및 13;
    서열식별번호: 12 및 13 중 어느 것의 상보체;
    서열식별번호: 12 및 13 중 어느 것의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편;
    서열식별번호: 12 및 13 중 어느 것의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체;
    서열식별번호: 1 및 2 중 어느 것의 전사체;
    서열식별번호: 1 및 2 중 어느 것의 전사체의 상보체;
    서열식별번호: 1 및 2 중 어느 것의 전사체의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 및
    서열식별번호: 1 및 2 중 어느 것의 전사체의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체
    로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화가능한 리보핵산 (RNA)을 노린재류 해충의 먹이에 제공하는 것을 포함하는, 식물에서 노린재류 해충 침입을 방제하는 방법.
  41. 제40항에 있어서, 먹이가 폴리뉴클레오티드를 발현하도록 형질전환된 식물 세포를 포함하는 것인 방법.
  42. 제40항에 있어서, 특이적으로 혼성화가능한 RNA가 이중-가닥 RNA 분자에 포함되는 것인 방법.
  43. 제1항의 핵산을 옥수수 식물 내로 도입하여 트랜스제닉 옥수수 식물을 생산하는 것; 및
    옥수수 식물을 배양하여 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드의 발현을 가능하게 하는 것을 포함하며; 여기서 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드의 발현은 노린재류 해충 생식 또는 성장 및 노린재류 해충 감염에 기인한 수확량의 손실을 억제하는 것인,
    옥수수 작물의 수확량을 개선시키는 방법.
  44. 제43항에 있어서, 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드의 발현이 식물의 일부분과 접촉한 노린재류 해충에서의 적어도 제1 표적 유전자를 억제하는 RNA 분자를 생산하는 것인 방법.
  45. 식물 세포를 제1항의 핵산을 포함하는 벡터로 형질전환시키는 것;
    복수종의 형질전환된 식물 세포를 포함하는 식물 세포 배양물의 발생이 가능하게 하는데 충분한 조건 하에서 형질전환된 식물 세포를 배양하는 것;
    적어도 1종의 폴리뉴클레오티드가 게놈 내로 통합된 형질전환된 식물 세포를 선택하는 것;
    형질전환된 식물 세포를 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 리보핵산 (RNA) 분자의 발현에 대해 스크리닝하는 것; 및
    RNA를 발현하는 식물 세포를 선택하는 것
    을 포함하는, 트랜스제닉 식물 세포를 생산하는 방법.
  46. 제45항에 있어서, RNA 분자가 이중-가닥 분자 RNA인 방법.
  47. 제44항의 방법에 의해 생산된 트랜스제닉 식물 세포를 제공하는 것; 및
    트랜스제닉 식물 세포로부터 트랜스제닉 식물을 재생시키는 것을 포함하며, 여기서 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 리보핵산 분자의 발현은 형질전환된 식물과 접촉하는 노린재류 해충에서의 표적 유전자의 발현을 조정하는데 충분한 것인,
    노린재류 해충-저항성 트랜스제닉 식물을 생산하는 방법.
  48. 식물 세포를 노린재류 해충으로부터 식물을 보호하기 위한 수단을 포함하는 벡터로 형질전환시키는 것;
    복수종의 형질전환된 식물 세포를 포함하는 식물 세포 배양물의 발생이 가능하게 하는데 충분한 조건 하에서 형질전환된 식물 세포를 배양하는 것;
    노린재류 해충으로부터 식물을 보호하기 위한 수단이 게놈 내로 통합된 형질전환된 식물 세포를 선택하는 것;
    형질전환된 식물 세포를 노린재류 해충에서의 필수 유전자의 발현을 억제하기 위한 수단의 발현에 대해 스크리닝하는 것; 및
    노린재류 해충에서의 필수 유전자의 발현을 억제하기 위한 수단을 발현하는 식물 세포를 선택하는 것
    을 포함하는, 트랜스제닉 식물 세포를 생산하는 방법.
  49. 제47항의 방법에 의해 생산된 트랜스제닉 식물 세포를 제공하는 것; 및
    트랜스제닉 식물 세포로부터 트랜스제닉 식물을 재생시키는 것을 포함하며, 여기서 노린재류 해충에서의 필수 유전자의 발현을 억제하기 위한 수단의 발현은 형질전환된 식물과 접촉하는 노린재류 해충에서의 표적 유전자의 발현을 조정하는데 충분한 것인,
    노린재류 해충-저항성 트랜스제닉 식물을 생산하는 방법.
  50. 제1항에 있어서, 바실루스 투린기엔시스(Bacillus thuringiensis), 알칼리게네스(Alcaligenes) 종, 또는 슈도모나스(Pseudomonas) 종으로부터의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 핵산.
  51. 제50항에 있어서, 비. 투린기엔시스로부터의 폴리펩티드가 Cry1A, Cry2A, Cry3A, Cry11A, 및 Cry51A를 포함하는 군으로부터 선택된 것인 핵산.
  52. 제15항에 있어서, 바실루스 투린기엔시스, 알칼리게네스 종, 또는 슈도모나스 종으로부터의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포.
  53. 제52항에 있어서, 비. 투린기엔시스로부터의 폴리펩티드가 Cry1A, Cry2A, Cry3A, Cry11A, 및 Cry51A를 포함하는 군으로부터 선택된 것인 세포.
  54. 제16항에 있어서, 바실루스 투린기엔시스, 알칼리게네스 종, 또는 슈도모나스 종으로부터의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물.
  55. 제53항에 있어서, 비. 투린기엔시스로부터의 폴리펩티드가 Cry1A, Cry2A, Cry3A, Cry11A, 및 Cry51A를 포함하는 군으로부터 선택된 것인 식물.
  56. 제45항에 있어서, 형질전환된 식물 세포가 바실루스 투린기엔시스, 알칼리게네스 종, 또는 슈도모나스 종으로부터의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 방법.
  57. 제56항에 있어서, 비. 투린기엔시스로부터의 폴리펩티드가 Cry1A, Cry2A, Cry3A, Cry11A, 및 Cry51A를 포함하는 군으로부터 선택된 것인 방법.
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