KR20170105504A - 딱정벌레류 해충을 방제하기 위한 hunchback 유전자의 모 RNAi 억제 - Google Patents

딱정벌레류 해충을 방제하기 위한 hunchback 유전자의 모 RNAi 억제 Download PDF

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Abstract

본 개시내용은 딱정벌레류 해충에서의 표적 코딩 서열 및 전사된 비-코딩 서열의 RNA 간섭-매개 억제를 통해 딱정벌레류 해충을 방제하기 위한 핵산 분자 및 그의 사용 방법에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 딱정벌레류 해충의 방제에 유용한 핵산 분자를 발현하는 트랜스제닉 식물의 제조 방법, 및 그에 의해 수득된 식물 세포 및 식물에 관한 것이다.

Description

딱정벌레류 해충을 방제하기 위한 hunchback 유전자의 모 RNAi 억제 {PARENTAL RNAI SUPPRESSION OF HUNCHBACK GENE TO CONTROL COLEOPTERAN PESTS}
우선권 주장
본 출원은 "딱정벌레류 해충을 방제하기 위한 hunchback 유전자의 모 RNAi 억제 {PARENTAL RNAI SUPPRESSION OF HUNCHBACK GENE TO CONTROL COLEOPTERAN PESTS}"에 대한, 2014년 12월 16일에 출원된 미국 특허 가출원 일련 번호 62/092,772, 및 "노린재류 해충을 방제하기 위한 hunchback 유전자의 모 RNAi 억제 {PARENTAL RNAI SUPPRESSION OF HUNCHBACK GENE TO CONTROL HEMIPTERAN PESTS}"에 대한, 2015년 6월 2일에 출원된 미국 특허 가출원 일련 번호 62/170,079의 출원일의 이익을 주장하며, 상기 가출원 둘 다는 그 전문이 본원에 포함된다.
기술 분야
본 발명은 일반적으로 딱정벌레류 해충에 의해 야기되는 식물 손상의 유전적 방제에 관한 것이다. 특정한 실시양태에서, 본 개시내용은 표적 코딩 및 비-코딩 폴리뉴클레오티드의 확인, 및 딱정벌레류 해충의 세포에서의 표적 코딩 및 비-코딩 폴리뉴클레오티드의 발현을 전사후 저해 또는 억제하여 식물 보호 효과를 제공하기 위한 재조합 DNA 기술의 사용에 관한 것이다.
서부 옥수수 뿌리벌레 (WCR)인 디아브로티카 비르기페라 비르기페라 르콩트(Diabrotica virgifera virgifera LeConte)는 북미에서 가장 파괴적인 옥수수 뿌리벌레 종 중 하나이며, 미국 중서부의 옥수수-재배 지역에서 특히 우려시되고 있다. 북부 옥수수 뿌리벌레 (NCR)인 디아브로티카 바르베리 스미스 및 로렌스(Diabrotica barberi Smith and Lawrence)는 WCR과 거의 동일한 범위에서 공동-서식하는 밀접하게 관련된 종이다. 북미에서 유의한 해충인 디아브로티카의 여러 다른 관련된 아종이 존재한다: 멕시코 옥수수 뿌리벌레 (MCR), 디. 비르기페라 제아에 크리산 및 스미스(D. virgifera zeae Krysan and Smith); 남부 옥수수 뿌리벌레 (SCR), 디. 운데심푼크타타 호와르디 바버(D. undecimpunctata howardi Barber); 디. 발테아타 르콩트(D. balteata LeConte); 디. 운데심푼크타타 테넬라(D. undecimpunctata tenella); 및 디. 유. 운데심푼크타타 만네르헤임(D. u. undecimpunctata Mannerheim). 미국 농무부는 옥수수 뿌리벌레로 인해 8억 달러의 수확량 손실 및 2억 달러의 처리 비용을 포함하여 매년 10억 달러의 수익 손실을 입고 있다고 추정하고 있다.
WCR 및 NCR 둘 다는 여름 동안에 알로서 토양에 침착되어 있다. 곤충은 겨울 내내 알 단계로 유지된다. 알은 장방형이고, 백색이며, 길이는 0.1 mm 미만이다. 유충은 5월말 또는 6월초에 부화되고, 정확한 알 부화 시기는 온도차 및 위치에 기인하여 해마다 달라진다. 새로 부화된 유충은 길이가 3.18 mm 미만인 백색 벌레이다. 일단 부화되고 나면, 유충은 옥수수 뿌리를 섭식하기 시작한다. 옥수수 뿌리벌레는 3회의 유충령을 거친다. 수주 동안 섭식한 후, 유충은 번데기 단계로 탈피한다. 이들은 토양에서 용화된 다음, 7월 및 8월에 토양으로부터 성충으로서 출현한다. 성충 뿌리벌레는 길이가 약 6.35 mm이다.
옥수수 뿌리벌레 유충은 옥수수 및 여러 다른 종의 초목에서 발생을 완료한다. 금강아지풀에서 자란 유충은 더 늦게 출현하고, 성충으로서 머리통의 크기는 옥수수에서 자란 유충과 비교하여 더 작다. 문헌 [Ellsbury et al. (2005) Environ. Entomol. 34:627-34]. WCR 성충은 옥수수 수염, 화분, 및 노출된 이삭 끝 상의 커넬을 섭식한다. 성충은 선호하는 수염 및 화분을 이용할 수 있게 되면 이들로 빠르게 이동할 것이다. NCR 성충은 또한 옥수수 식물의 생식 조직을 섭식한다. WCR 암컷은 전형적으로 1회 교미한다. 문헌 [Branson et al. (1977) Ann. Entom. Soc. America 70(4):506-8].
옥수수에서 뿌리벌레 손상의 대부분은 유충 섭식에 의해 야기된다. 새로 부화된 뿌리벌레는 초기에는 옥수수의 실뿌리털을 섭식하고, 근단으로 파고 들어간다. 유충의 크기가 점점 커짐에 따라, 이들은 주근을 섭식하고, 그 안으로 파고 들어간다. 옥수수 뿌리벌레가 풍부하게 존재할 때, 유충 섭식을 통해 종종 뿌리 전정이 옥수수 자루의 기저부까지 이루어진다. 심각한 뿌리 손상은 뿌리가 물 및 영양소를 식물 내로 수송할 수 있는 능력을 방해하고, 식물 성장을 감소시키며, 곡실 생산을 감소시켜, 종종 전체 수확량을 대폭 감소시킨다. 심각한 뿌리 손상은 또한 종종 옥수수 식물을 도복시키며, 이로 인해 수확은 더 어려워지고, 수확량은 더 감소하게 된다. 추가로, 성충이 옥수수 생식 조직을 섭식하게 되면, 이삭 끝의 수염의 전정이 일어날 수 있다. 이러한 "수염 클리핑"이 화분 방출 동안에 충분히 심각하다면, 수분은 파괴될 수 있다.
옥수수 뿌리벌레의 방제는 윤작, 화학 살곤충제, 생물살충제 (예를 들어, 포자-형성 그람-양성 박테리아인 바실루스 투린기엔시스(Bacillus thuringiensis), Bt 독소를 발현하는 트랜스제닉 식물, 또는 그의 조합에 의해 시도될 수 있다. 윤작시에는 농지 사용에 대해 제한이 따른다는 단점으로 어려움을 겪게 된다. 더욱이, 일부 뿌리벌레 종의 산란이 옥수수 이외의 다른 작물 재배지에서 발생할 수 있거나 또는 연장된 휴면기가 수년에 걸쳐 알 부화를 유발하며, 이에 의해 옥수수 및 다른 작물로 실시되는 윤작의 효과는 경감될 수 있다.
화학 살곤충제는 옥수수 뿌리벌레 방제를 달성하는 전략에 가장 크게 의존한다. 화학 살곤충제 사용이 비록 불완전한 옥수수 뿌리벌레 방제 전략이기는 하지만; 화학 살곤충제 비용을 살곤충제 사용에도 불구하고 발생할 수 있는 뿌리벌레 손상으로부터의 수확량 손실 비용에 더하였을 때, 매년 미국에서는 옥수수 뿌리벌레에 기인하여 10억 달러 초과의 비용이 손실될 수 있다. 고밀도 유충 집단, 폭우, 및 살곤충제(들)의 부적절한 적용은 모두 부적절한 옥수수 뿌리벌레 방제를 유발할 수 있다. 추가로, 살곤충제를 계속해서 사용하게 되면 살곤충제-저항성 뿌리벌레 균주가 선택될 수 있을 뿐만 아니라, 비-표적 종에 대한 그의 독성에 기인하여 환경에 대한 유의한 우려가 제기될 수 있다.
RNA 간섭 (RNAi)은 내인성 세포 경로를 이용하는 과정이며, 이에 의해 표적 유전자의 모두 또는 그의 적절한 크기의 임의의 부분에 특이적인 간섭 RNA (iRNA) 분자 (예를 들어, 이중-가닥 RNA (dsRNA) 분자)는 그에 의해 코딩되는 mRNA의 분해를 유발한다. 최근 수년간, RNAi는 수많은 종 및 실험 시스템; 예를 들어 카에노랍디티스 엘레간스(Caenorhabditis elegans), 식물, 곤충 배아, 및 조직 배양에서의 세포에서 유전자 "녹다운"을 수행하는데 사용되었다. 예를 들어 문헌 [Fire et al. (1998) Nature 391:806-11; Martinez et al. (2002) Cell 110:563-74; McManus and Sharp (2002) Nature Rev. Genetics 3:737-47]을 참조한다.
RNAi는 DICER 단백질 복합체를 포함한 내인성 경로를 통해 mRNA의 분해를 달성한다. DICER는 긴 dsRNA 분자를, 소형 간섭 RNA (siRNA)로 칭해지는 대략 20개의 뉴클레오티드의 짧은 단편으로 절단한다. siRNA는 2개의 단일-가닥 RNA: 패신저 가닥 및 가이드 가닥으로 풀린다. 패신저 가닥은 분해되고, 가이드 가닥은 RNA-유도된 침묵 복합체 (RISC) 내로 혼입된다. 마이크로 리보핵산 (miRNA)은 혼성화된 패신저 및 가이드 가닥을 연결하는 폴리뉴클레오티드 "루프"를 함유하는 전구체 분자로부터 절단된 구조적으로 매우 유사한 분자이고, 이들은 RISC 내로 유사하게 혼입될 수 있다. 가이드 가닥이 상보적 mRNA 분자에 특이적으로 결합하고, RISC 복합체의 촉매 성분인 아르고노트(Argonaute)에 의한 절단을 유도하는 경우에, 전사후 유전자 침묵이 발생한다. 이 과정은, 예컨대 식물, 선충류, 및 일부 곤충에서는 초기에 siRNA 및/또는 miRNA의 농도가 제한됨에도 불구하고, 일부 진핵 유기체 전반에 걸쳐 침투적으로 확산되는 것으로 공지되어 있다.
단지 siRNA 및/또는 miRNA에 상보적인 전사체만이 절단 및 분해되므로, mRNA 발현의 녹다운은 서열-특이적이다. 식물에는, 여러 기능군의 DICER 유전자가 존재한다. RNAi의 유전자 침묵 효과는 수일 동안 지속되고, 실험 조건 하에서 90% 이상의 표적화된 전사체의 존재비가 감소하게 될 수 있으며, 그 결과 상응하는 단백질의 수준도 감소할 수 있다. 곤충에는, 적어도 2종의 DICER 유전자가 존재하며, 여기서 DICER1은 아르고노트1에 의한 miRNA-지정 분해를 용이하게 한다. 문헌 [Lee et al. (2004) Cell 117 (1):69-81]. DICER2는 아르고노트2에 의한 siRNA-지정 분해를 용이하게 한다.
미국 특허 7,612,194 및 미국 특허 공개 번호 2007/0050860, 2010/0192265, 및 2011/0154545는 디. 브이. 비르기페라 르콩트 번데기로부터 단리된 9112종의 발현된 서열 태그 (EST) 서열의 라이브러리를 개시한다. 미국 특허 7,612,194 및 미국 특허 공개 번호 2007/0050860에는 식물 세포에서의 안티센스 RNA의 발현을 위해 상기 문헌에 개시된 디. 브이. 비르기페라 공포-유형 H+-ATPase (V-ATPase)의 여러 특정한 부분적 서열 중 1종에 상보적인 핵산 분자를 프로모터에 작동가능하게 연결하는 것이 시사되어 있다. 미국 특허 공개 번호 2010/0192265는 식물 세포에서의 안티센스 RNA의 발현을 위해 미지 및 비개시된 기능의 디. 브이. 비르기페라 유전자의 특정한 부분적 서열 (부분적 서열은 씨. 엘레간스(C. elegans)에서의 C56C10.3 유전자 산물에 대해 58% 동일한 것으로 언급됨)에 상보적인 핵산 분자를 프로모터에 작동가능하게 연결하는 것을 시사한다. 미국 특허 공개 번호 2011/0154545는 식물 세포에서의 안티센스 RNA의 발현을 위해 디. 브이. 비르기페라 코토머 베타 서브유닛 유전자의 2종의 특정한 부분적 서열에 상보적인 핵산 분자를 프로모터에 작동가능하게 연결하는 것을 시사한다. 추가로, 미국 특허 7,943,819는 디. 브이. 비르기페라 르콩트 유충, 번데기, 및 해부된 중장으로부터 단리된 906종의 발현된 서열 태그 (EST) 서열의 라이브러리를 개시하고, 식물 세포에서의 이중-가닥 RNA의 발현을 위해 디. 브이. 비르기페라 적재된 다소포체 단백질 4b 유전자의 특정한 부분적 서열에 상보적인 핵산 분자를 프로모터에 작동가능하게 연결하는 것을 시사한다.
미국 특허 7,612,194 및 미국 특허 공개 번호 2007/0050860, 2010/0192265, 및 2011/0154545에는 V-ATPase의 여러 특정한 부분적 서열 및 미지 기능의 유전자의 특정한 부분적 서열 이외에, RNA 간섭을 위해 상기 문헌에 열거된 9천종 초과의 서열 중 임의의 특정한 서열을 사용하는 것에 대한 어떠한 추가의 시사도 제공되어 있지 않다. 추가로, 미국 특허 7,612,194, 및 미국 특허 공개 번호 2007/0050860 및 2010/0192265, 및 2011/0154545 중 어떠한 것도 9천종 초과의 서열 중 다른 것이 dsRNA 또는 siRNA로서 사용되는 경우에 옥수수 뿌리벌레의 종에서 치사성이거나 또는 심지어 달리 유용할 것이라는 임의의 안내도 제공하지 않는다. 미국 특허 7,943,819는 적재된 다소포체 단백질 4b 유전자의 특정한 부분적 서열 이외에, RNA 간섭을 위해 상기 문헌에 열거된 9백종 초과의 서열 중 임의의 특정한 서열을 사용하는 것에 대한 어떠한 시사도 제공하지 않는다. 추가로, 미국 특허 7,943,819는 제공된 9백종 초과의 서열 중 다른 것이 dsRNA 또는 siRNA로서 사용되는 경우에 옥수수 뿌리벌레의 종에서 치사성이거나 또는 심지어 달리 유용할 것이라는 어떠한 안내도 제공하지 않는다. 미국 특허 출원 공개 번호 미국 2013/040173 및 PCT 출원 공개 번호 WO 2013/169923은 메이즈에서 RNA 간섭을 위한 디아브로티카 비르기페라 Snf7 유전자로부터 유래된 서열의 사용을 기재한다. (또한 문헌 [Bolognesi et al. (2012) PLoS ONE 7(10): e47534. doi:10.1371/journal.pone.0047534]에 개시됨).
옥수수 뿌리벌레 DNA에 상보적인 서열 중 압도적인 다수 (예컨대 상기)는 dsRNA 또는 siRNA로서 사용되는 경우에 옥수수 뿌리벌레 종으로부터의 식물 보호 효과를 제공하지 않는다. 예를 들어, 문헌 [Baum et al. (2007) Nature Biotechnology 25:1322-1326]은 RNAi에 의해 여러 WCR 유전자 표적을 억제하는 효과를 기재한다. 이들 저자는, 이들이 시험한 26종의 표적 유전자 중 8종이 520 ng/cm2 초과의 매우 높은 iRNA (예를 들어, dsRNA) 농도에서 실험상 유의한 딱정벌레류 해충 사멸률을 제공할 수 없다는 것을 보고하였다.
미국 특허 7,612,194 및 미국 특허 공개 번호 2007/0050860의 저자는 서부 옥수수 뿌리벌레를 표적화하는 옥수수 식물에서의 식물내 RNAi를 최초 보고하였다. 문헌 [Baum et al. (2007) Nat. Biotechnol. 25(11):1322-6]. 이들 저자는 트랜스제닉 RNAi 메이즈를 개발하기 위한 잠재적 표적 유전자를 스크리닝하는 고처리량 생체내 먹이 RNAi 시스템을 기재한다. 290종 표적의 초기 유전자 풀 중에서, 단지 14종만이 유충 방제 잠재력을 나타냈다. 가장 유효한 이중-가닥 RNA (dsRNA) 중 1종이 공포 ATPase 서브유닛 A (V-ATPase)를 코딩하는 유전자를 표적화하여, 상응하는 내인성 mRNA의 신속한 억제를 유발하고 낮은 농도의 dsRNA로 특이적 RNAi 반응을 일으켰다. 따라서, 이들 저자는 가능한 해충 관리 도구로서의 식물내 RNAi에 대한 잠재력을 최초로 기록하였으며, 동시에 유효 표적이 비교적 작은 세트의 후보 유전자로부터도 선험적으로 정확하게 확인될 수 없었다는 것을 입증하였다.
곤충 방제를 위한 RNAi의 또 다른 잠재적 적용은 모 RNAi (pRNAi)를 수반한다. 카에노랍디티스 엘레간스에서 최초 기재된 것으로, pRNAi는 자손 배아에서의 유전자 불활성을 야기하는, 체강 내로의 dsRNA의 주사 (또는 섭취를 통한 dsRNA의 적용)에 의해 확인되었다. 문헌 [Fire et al. (1998), supra; Timmons and Fire (1998) Nature 395(6705):854]. 유사한 과정이 딱정벌레류인 트리볼리움 카스타네움(Tribolium castaneum) 모델에서 기재되었으며, 여기서 배아 발생 동안 절편화를 제어하는 3종의 고유한 유전자에 상응하는 dsRNA가 주사된 암컷 번데기는 자손 배아에서 접합 유전자의 녹다운을 유발하였다. 문헌 [Bucher et　al. (2002) Curr. Biol. 12(3):R85-6]. 이 연구에서 거의 모든 자손 유충은 주사 1주 후에 유전자-특이적 표현형을 나타냈다. 기능적 유전체학 연구를 위한 dsRNA의 주사가 다양한 곤충에서 성공적이었지만, RNAi가 해충 관리 도구로서 유효하기 위해서는 dsRNA에의 경구 노출을 통한 장 환경으로부터의 dsRNA의 흡수 및 후속적인 필수 유전자의 하향-조절이 요구된다. 문헌 [Auer and Frederick (2009) Trends Biotechnol. 27(11):644-51].
모 RNAi는 톡토기인 오르케셀라 신크타(Orchesella cincta) (Konopova and Akam (2014) Evodevo 5(1):2); 갈색 식물 호퍼인 닐라파르바타 루겐스(Nilaparvata lugens); 잎벌인 아탈리아 로사에(Athalia rosae) (Yoshiyama et al. (2013) J. Insect Physiol. 59(4):400-7); 독일 바퀴벌레인 블라텔라 게르마니카(Blattella germanica) (Piulachs et al. (2010) Insect Biochem. Mol. Biol. 40:468-75); 및 완두 진딧물인 아시르토시폰 피숨(Acyrthosiphon pisum) (Mao et al. (2013) Arch Insect Biochem Physiol 84(4):209-21)을 포함한 수많은 곤충 종에서 배아 유전자의 기능을 기재하는데 사용되었다. 모든 이들 경우에서의 pRNAi 반응은 모 암컷의 혈체강 내로의 dsRNA의 주사에 의해 달성되었다.
예를 들어 디. 브이. 비르기페라 르콩트 (서부 옥수수 뿌리벌레, "WCR"); 디. 바르베리 스미스 및 로렌스 (북부 옥수수 뿌리벌레, "NCR"); 디. 유. 호와르디 바버 (남부 옥수수 뿌리벌레, "SCR"); 디. 브이. 제아에 크리산 및 스미스 (멕시코 옥수수 뿌리벌레, "MCR"); 디. 발테아타 르콩트; 디. 유. 테넬라; 디. 스페시오사 게르마르(D. speciosa Germar); 및 디. 유. 운데심푼크타타 만네르헤임을 포함한 딱정벌레류 해충의 방제를 위한 핵산 분자 (예를 들어, 표적 유전자, DNA, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, 및 hpRNA), 및 그의 사용 방법이 본원에 개시된다. 특정한 예에서, 딱정벌레류 해충에서의 1종 이상의 천연 핵산의 적어도 일부분에 상동일 수 있는 예시적인 핵산 분자가 개시된다. 일부 실시양태에서, 딱정벌레류 해충은 해충의 후속 세대를 생산하는 기존 세대의 능력을 감소시킴으로써 방제된다. 특정 예에서, 딱정벌레류 해충에게의 핵산 분자의 전달은 해충에 대한 유의한 사멸률을 유발하지는 않지만, 그로부터 생산된 생존 자손의 수를 감소시킨다.
이들 및 추가의 예에서, 천연 핵산은 표적 유전자일 수 있으며, 이의 산물은 예를 들어 및 비제한적으로: 대사 과정에 수반되고/거나; 생식 과정에 수반되고/거나; 배아 및/또는 유충 발생에 수반될 수 있다. 일부 예에서, 표적 유전자의 발현을, 그에 상동인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자에 의해 전사후 억제하는 것은, 딱정벌레류 해충의 감소된 생존율, 성장, 및/또는 생식을 유발할 수 있다. 구체적 예에서, hunchback 유전자는 전사후 침묵을 위한 표적 유전자로서 선택된다. 특정한 예에서, 전사후 억제에 유용한 표적 유전자는 본원에서 디아브로티카 hunchback으로 지칭되는 신규 유전자 (서열식별번호(SEQ ID NO): 1)이다. 따라서, 서열식별번호: 1; 및/또는 상기 중 어느 것의 단편 (예를 들어, 서열식별번호: 3 및 67)의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 핵산 분자가 본원에 개시된다.
또한, 표적 유전자 산물 (예를 들어, hunchback 유전자의 산물) 내의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 85% 동일한 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자가 개시된다. 예를 들어, 핵산 분자는 서열식별번호: 2 (디아브로티카 HUNCHBACK); 및/또는 디아브로티카 hunchback의 산물 내의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일한 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 추가로, 표적 유전자 산물 내의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일한 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 역 상보체인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자가 개시된다.
추가적으로, 딱정벌레류 해충 표적 유전자, 예를 들어 hunchback 유전자의 모두 또는 일부에 상보적인 iRNA (예를 들어, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, 및 hpRNA) 분자의 생산에 사용될 수 있는 cDNA 폴리뉴클레오티드가 개시된다. 특정한 실시양태에서, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, 및/또는 hpRNA는 유전자 변형된 유기체, 예컨대 식물 또는 박테리아에 의해 시험관내 또는 생체내에서 생산될 수 있다. 특정한 예에서, 디아브로티카 hunchback (서열식별번호: 1)으로부터 전사된 mRNA의 모두 또는 일부에 상보적인 iRNA 분자를 생산하는데 사용될 수 있는 cDNA 분자가 개시된다.
추가로, 딱정벌레류 해충에서의 필수 유전자의 발현을 억제하기 위한 수단, 및 딱정벌레류 해충으로부터 식물을 보호하기 위한 수단이 개시된다. 딱정벌레류 해충에서의 필수 유전자의 발현을 억제하기 위한 수단은 서열식별번호: 70, 서열식별번호: 71, 서열식별번호: 72; 및 그의 상보체로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드로 이루어진 단일- 또는 이중-가닥 RNA 분자이다. 딱정벌레류 해충에서의 필수 유전자의 발현을 억제하기 위한 수단의 기능적 등가물은 서열식별번호: 1을 포함하는 WCR 유전자로부터 전사된 mRNA의 모두 또는 일부에 실질적으로 상동인 단일- 또는 이중-가닥 RNA 분자를 포함한다. 딱정벌레류 해충으로부터 식물을 보호하기 위한 수단은 프로모터에 작동가능하게 연결된, 딱정벌레류 해충에서의 필수 유전자의 발현을 억제하기 위한 수단을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 DNA 분자이며, 여기서 DNA 분자는 메이즈 식물의 게놈 내로 통합될 수 있다.
딱정벌레류 해충에게, 해충에 의해 흡수되었을 때 해충 내의 생물학적 기능을 억제하도록 기능하는 iRNA (예를 들어, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, 및 hpRNA) 분자를 제공하는 것을 포함하며, 여기서 iRNA 분자는 서열식별번호: 1; 서열식별번호: 1의 상보체; 서열식별번호: 3; 서열식별번호: 3의 상보체; 서열식별번호: 67; 서열식별번호: 67의 상보체; 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 3, 및/또는 서열식별번호: 67의 모두 또는 일부를 포함하는 디아브로티카 유기체 (예를 들어, WCR)의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드; 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 3, 및/또는 서열식별번호: 67의 모두 또는 일부를 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드의 상보체; 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 3, 및/또는 서열식별번호: 67의 모두 또는 일부를 포함하는 천연 RNA 분자로 전사되는 디아브로티카 유기체의 천연 비-코딩 폴리뉴클레오티드; 및 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 3, 및/또는 서열식별번호: 67의 모두 또는 일부를 포함하는 천연 RNA 분자로 전사되는 디아브로티카 유기체의 천연 비-코딩 폴리뉴클레오티드의 상보체로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드의 모두 또는 일부 (예를 들어, 그의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드)를 포함하는 것인, 딱정벌레류 해충의 집단을 방제하는 방법이 개시된다.
특정한 예에서, 딱정벌레류 해충에게, 해충에 의해 흡수되었을 때 해충 내의 생물학적 기능을 억제하도록 기능하는 iRNA (예를 들어, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, 및 hpRNA) 분자를 제공하는 것을 포함하며, 여기서 iRNA 분자는 서열식별번호: 70의 모두 또는 일부; 서열식별번호: 70의 모두 또는 일부의 상보체; 서열식별번호: 71; 서열식별번호: 71의 상보체; 서열식별번호: 73; 및 서열식별번호: 73의 상보체; 서열식별번호: 1, 3, 및/또는 67 중 어느 것의 모두 또는 일부를 포함하는 디아브로티카 유기체 (예를 들어, WCR)의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드에 혼성화되는 폴리뉴클레오티드; 및 서열식별번호: 1, 3, 및/또는 67 중 어느 것의 모두 또는 일부를 포함하는 디아브로티카 유기체 (예를 들어, WCR)의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드에 혼성화되는 폴리뉴클레오티드의 상보체로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인, 딱정벌레류 해충의 집단을 방제하는 방법이 개시된다.
또한, 먹이-기반 검정에서 또는 dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, 및/또는 hpRNA를 발현하는 유전자-변형된 식물 세포에서 dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, 및/또는 hpRNA가 딱정벌레류 해충에게 제공될 수 있는 방법이 본원에 개시된다. 이들 및 추가의 예에서, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, 및/또는 hpRNA는 딱정벌레류 해충에 의해 섭취될 수 있다. 이어서, 본 발명의 dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, 및/또는 hpRNA의 섭취는 해충에서 RNAi를 유발할 수 있으며, 이는 차례로 대사 과정; 생식 과정; 및/또는 유충 발생에 필수적인 유전자의 침묵을 유발할 수 있다. 따라서, 딱정벌레류 해충의 모 방제에 유용한 예시적인 폴리뉴클레오티드(들)를 포함하는 핵산 분자가 딱정벌레류 해충에게 제공되는 방법이 개시된다. 특정한 예에서, 본 발명의 핵산 분자의 사용에 의해 방제되는 딱정벌레류 해충은 WCR, NCR, 또는 SCR일 수 있다. 일부 예에서, 딱정벌레류 해충에게의 핵산 분자의 전달은 해충에 대한 유의한 사멸률을 유발하지는 않지만, 그로부터 생산된 생존 자손의 수를 감소시킨다. 일부 예에서, 딱정벌레류 해충에게의 핵산 분자의 전달은 해충에 대한 유의한 사멸률을 유발하고, 또한 그로부터 생산된 생존 자손의 수를 감소시킨다.
상기 특색 및 다른 특색이 여러 실시양태에 대한 하기 상세한 설명으로부터 보다 분명해질 것이며, 이는 첨부 도면을 참조로 진행된다.
도 1은 단일 쌍의 프라이머를 갖는 단일 전사 주형으로부터 (도 1A), 및 2종의 전사 주형으로부터 (도 1B) dsRNA를 생성하는데 사용된 전략의 도시를 포함한다.
도 2는 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster), 트리볼리움 카스타네움(Tribolium castaneum), 및 디아브로티카 비르기페라 비르기페라(Diabrotica virgifera virgifera) HUNCHBACK 단백질 서열의 도메인 조직화의 도시를 포함한다. 디. 멜라노가스터, 티. 카스타네움, 및 디. 브이. 비르기페라 HUNCHBACK 단백질은 SMART 데이터베이스를 사용하여 주석달린 6종의 C2H2-유형 아연 핑거를 함유한다.
도 3은 WCR 알 생산 및 생존율에 대한 특정한 dsRNA의 효과를 제시하는 데이터의 요약을 포함한다. 성충 WCR 암컷당 산란된 알의 수 (도 3A), 및 부화된 알의 퍼센트 (도 3B)가 도시된다. 데이터는 평균 플러스/마이너스 SEM이다. 동일한 문자를 갖는 막대는 유의하게 상이하지 않다 (P > 0.05, N = 6).
도 4는 상이한 실험 조건 하에서 배아 발생을 검사하기 위해 해부된 WCR 알의 대표적인 사진을 포함한다. GFP dsRNA로 처리된 암컷이 낳은 알 (도 4A)은 정상 발생을 제시한다. hunchback dsRNA로 처리된 암컷이 낳은 알 (도 4A-4B)은 불완전한 배아 발생 및 기형 유충을 제시한다.
도 5는 GFP 및 물 대조군에 비해, 처리된 인공 먹이에서의 dsRNA에 노출된 WCR 암컷으로부터 수집된 알에서 hunchback의 상대 발현을 제시하는 데이터의 요약을 포함한다 (도 5A). 또한, GFP 및 물 대조군에 비해, 처리된 인공 먹이에서의 dsRNA에 노출된 성충 암컷 (도 5B), GFP 및 물 대조군에 비해, 처리된 인공 먹이에서의 dsRNA에 노출된 유충 (도 5C), 및 GFP 및 물 대조군에 비해, 처리된 인공 먹이에서의 dsRNA에 노출된 성충 수컷 (도 5D)에서 hunchback의 상대 발현이 제시된다. 동일한 문자가 이어진 막대는 유의하게 상이하지 않다 (P > 0.05; N = 10개의 알 또는 유충의 3회 생물학적 반복/2회 기술적 반복/샘플을 갖는 반복).
도 6은 비-은신처 식물이 살곤충 단백질 및 모 활성 iRNA를 발현하는 경우에 살곤충 단백질 (R) 및 RNAi (Y)에 대한 저항성에 관한 대립유전자 빈도의 증가율에 대한, "은신처 패치"로부터 출현한 (즉, 트랜스제닉 작물에서 살곤충 iRNA 또는 재조합 단백질을 발현하지 않은) 암컷 WCR 성충에 대한 pRNAi 효과의 상대 크기의 효과를 제시하는 모델링 데이터의 요약을 포함한다.
도 7은 비-은신처 식물이 살곤충 단백질, 및 유충 활성 및 모 활성 iRNA 분자 둘 다를 발현하는 경우에 살곤충 단백질 (R) 및 RNAi (Y)에 대한 저항성에 관한 대립유전자 빈도의 증가율에 대한, "은신처 패치"로부터 출현한 (즉, 트랜스제닉 작물에서 옥수수 뿌리벌레 유충-활성 간섭 dsRNA를 옥수수 뿌리벌레-활성 살곤충 단백질과 조합하여 포함하는 식물의 트랜스제닉 작물에서 살곤충 iRNA 또는 재조합 단백질을 발현하지 않은) 암컷 WCR 성충에 대한 pRNAi 효과의 상대 크기의 효과를 제시하는 모델링 데이터의 요약을 포함한다.
도 8A는 암컷당 회수된 알의 수를 제시하는 데이터의 요약을 예시하고, 도 8B는 교미 전 6회, 교미 직후 6회, 및 교미 6일 후에 6회, 0.67 μg/μl의 hunchback 또는 GFP에의 노출 후, 각각 부화된 퍼센트 총 유충의 결과를 예시한다. 던넷 검정을 사용하여 비교를 수행하였으며, *는 p < 0.1에서의 유의도를 나타내고, **는 p < 0.05에서의 유의도를 나타내고, ***는 p < 0.001에서의 유의도를 나타낸다.
도 9는 교미 전 6회, 교미 직후 6회, 및 교미 6일 후에 6회, 0.67 μg/μl의 hunchback 또는 GFP에의 노출 후 측정된 상대 hunchback 발현을 제시하는 데이터의 요약을 예시한다. 던넷 검정을 사용하여 비교를 수행하였으며, **는 p < 0.05에서의 유의도를 나타내고, ***는 p < 0.001에서의 유의도를 나타낸다.
도 10. 디. 브이. 비르기페라에서의 hunchback dsRNA를 사용한 pRNAi 반응에 대한 노출 효과의 지속기간. 암컷에게 dsRNA로 처리된 먹이를 섭식시켰으며; T는 암컷이 12일 동안 격일로 제공된 먹이인 dsRNA (0.67 μg/μl)를 받은 횟수를 나타낸다. 10A. 알 낳기: dsRNA-섭식 암컷으로부터 수집된 알, 알은 마지막 섭식 노출 후에 수집하였다. 10B. 퍼센트 부화: 10A로부터 산란된 수를 기준으로 하는 알 부화. 10C. 노출의 지속기간 동안 상대 hunchback 전사체 발현. 던넷 검정을 사용하여 비교를 수행하였으며, *는 p < 0.05에서의 유의도를 나타낸다. **는 p < 0.001에서의 유의도를 나타낸다.
도 11은 농도 반응에 대한 디. 브이. 비르기페라 암컷에서의 상대 hunchback 전사체를 제시한다. 던넷 검정을 사용하여 비교를 수행하였으며, **는 p < 0.05에서의 유의도를 나타내고, ***는 p < 0.001에서의 유의도를 나타낸다.
[서열 목록]
첨부 서열 목록에서 확인된 핵산 서열은 37 C.F.R. § 1.822에 정의된 바와 같이 뉴클레오티드 염기에 대한 표준 문자 약어를 사용하여 제시된다. 열거된 핵산 및 아미노산 서열은 기재된 방식으로 배열된 뉴클레오티드 및 아미노산 단량체를 갖는 분자 (즉, 각각 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드)를 정의한다. 열거된 핵산 및 아미노산 서열은 또한 각각 기재된 방식으로 배열된 뉴클레오티드 및 아미노산 단량체를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 부류를 정의한다. 유전자 코드의 중복을 고려하여, 코딩 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열은 또한 참조 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드와 동일한 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 부류를 기재하는 것으로 이해될 것이다. 아미노산 서열이 그 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 ORF의 부류를 기재하는 것으로 추가로 이해될 것이다.
각각의 핵산 서열의 단지 1개의 가닥만이 제시되어 있지만, 나타낸 가닥에 대한 임의의 참조를 통해 상보적 가닥도 포함되는 것으로 이해된다. 1차 핵산 서열의 상보체 및 역 상보체가 필연적으로 1차 서열에 의해 개시되는 것처럼, 핵산 서열의 상보적 서열 및 역 상보적 서열은 달리 명백하게 언급되지 않는 한 (또는 서열이 출현하는 문맥으로부터 달리 명확하지 않는 한) 핵산 서열에 대한 임의의 참조에 포함된다. 추가로, RNA 가닥의 뉴클레오티드 서열은 그가 전사된 DNA의 서열에 의해 결정되는 것으로 관련 기술분야에서 이해되고 있으므 (티민 (T)에 대한 우라실 (U) 핵염기의 치환 제외), RNA 서열은 이를 코딩하는 DNA 서열에 대한 임의의 참조에 포함된다. 첨부 서열 목록에서:
서열식별번호: 1은 예시적인 디아브로티카 hunchback DNA를 포함하는 콘티그를 제시한다:
Figure pct00001

서열식별번호: 2는 예시적인 디아브로티카 hunchback DNA에 의해 코딩된 디아브로티카 HUNCHBACK 폴리펩티드의 아미노산 서열을 제시한다:
Figure pct00002

서열식별번호: 3은 일부 예에서 dsRNA의 생산을 위해 사용된, 본원에서 일부 경우에 hunchback Reg1로 지칭되는 예시적인 디아브로티카 hunchback DNA를 제시한다:
Figure pct00003

서열식별번호: 4는 T7 파지 프로모터의 뉴클레오티드 서열을 제시한다.
서열식별번호: 5-8은 디아브로티카 hunchback 유전자 또는 GFP 유전자의 유전자 영역을 증폭시키는데 사용된 프라이머 (모든 프라이머에 대해 T7 프로모터 TAATACGACTCACTATAGGG를 포함함)를 제시한다.
서열식별번호: 9는 GFP 유전자를 제시한다.
서열식별번호: 10은 예시적인 YFP 유전자를 제시한다.
서열식별번호: 11은 아넥신 영역 1의 DNA 서열을 제시한다.
서열식별번호: 12는 아넥신 영역 2의 DNA 서열을 제시한다.
서열식별번호: 13은 베타 스펙트린 2 영역 1의 DNA 서열을 제시한다.
서열식별번호: 14는 베타 스펙트린 2 영역 2의 DNA 서열을 제시한다.
서열식별번호: 15는 mtRP-L4 영역 1의 DNA 서열을 제시한다.
서열식별번호: 16은 mtRP-L4 영역 2의 DNA 서열을 제시한다.
서열식별번호: 17-44는 dsRNA 합성을 위한 아넥신, 베타 스펙트린 2, mtRP-L4, 및 YFP의 유전자 영역을 증폭시키는데 사용된 프라이머를 제시한다.
서열식별번호: 45는 ST-LS1 인트론을 포함하는 예시적인 DNA를 제시한다.
서열식별번호: 46은 센스 폴리뉴클레오티드, 인트론을 포함하는 루프 폴리뉴클레오티드 (밑줄표시), 및 안티센스 폴리뉴클레오티드 (볼드체)를 함유하는; 디아브로티카 hunchback v1 헤어핀-형성 RNA를 코딩하는 예시적인 DNA를 제시한다:
Figure pct00004

서열식별번호: 47은 T20VN 프라이머 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 제시한다.
서열식별번호: 48-52는 dsRNA 전사체 발현 분석에 사용된 프라이머 및 프로브를 제시한다.
서열식별번호: 53은 이원 벡터 백본 검출에 사용된 SpecR 코딩 영역의 일부분의 뉴클레오티드 서열을 제시한다.
서열식별번호: 54는 게놈 카피수 분석에 사용된 AAD1 코딩 영역의 뉴클레오티드 서열을 제시한다.
서열식별번호: 55-66은 유전자 카피수 결정 및 이원 벡터 백본 검출에 사용된 DNA 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 제시한다.
서열식별번호: 67은 일부 예에서 dsRNA의 생산을 위해 사용된, 예시적인 디아브로티카 hunchback (v1) DNA를 제시한다:
Figure pct00005

서열식별번호: 68 및 69는 일부 예에서 dsRNA 생산을 위해 사용된, hunchback v1 서열의 PCR 증폭에 사용된 프라이머를 제시한다.
서열식별번호: 70-73은 예시적인 hunchback 폴리뉴클레오티드 및 그의 단편을 포함하는 핵산으로부터 전사된 예시적인 RNA를 제시한다.
I. 여러 실시양태의 개관
본 발명자들은 가장 가능하게는 dsRNA를 발현하는 트랜스제닉 식물에 대한 표적 해충 종 중 1종; 서부 옥수수 뿌리벌레를 사용하여, 곤충 해충 관리를 위한 도구로서 RNA 간섭 (RNAi)을 개발하였다. 지금까지, 뿌리벌레 유충에서 RNAi에 대한 표적으로서 제안된 대부분의 유전자는 그의 목적을 달성하지 않고, 확인된 그러한 유용한 표적은 유충 단계에서 치사성을 야기하는 것을 수반한다. 여기서, 본 발명자들은 서부 옥수수 뿌리벌레에서 hunchback (hb)의 RNAi-매개 녹다운을 기재하며, 이는 예를 들어 iRNA 분자가 성충 암컷에게 섭식시킨 hunchback dsRNA를 통해 전달되는 경우에 배아 발생을 파괴하는 것으로 제시된다. hunchback dsRNA에 대한 성충 암컷 곤충의 노출은 경구로 투여되었을 때 성충 장수명에 영향을 미치지 않않다. 그러나, hunchback dsRNA에 노출된 암컷으로부터 수집된 알에서 부화는 거의 완전히 부재하였다. 본원의 실시양태에서, 성충 곤충에게 섭식시킴으로써 hunchback dsRNA를 전달하는 능력은 곤충 (예를 들어, 딱정벌레류) 해충 관리에 매우 유용한 pRNAi 효과를 부여한다. 추가로, 유충 및 성충 뿌리벌레 둘 다에서 다중 표적 서열에 영향을 미치는 잠재력은 RNAi 기술을 수반하는 곤충 해충 관리에 대한 지속가능한 접근법을 개발하는 기회를 증가시킬 수 있다.
딱정벌레류 해충 침입의 유전적 방제를 위한 방법 및 조성물이 본원에 개시된다. 딱정벌레류 해충 집단의 RNAi-매개 방제를 위한 표적 유전자로서 사용하기 위한 딱정벌레류 해충의 생활주기에 필수적인 1종 이상의 유전자(들) (예를 들어, 정상 생식 능력 및/또는 배아 및/또는 유충 발생에 필수적인 유전자(들))를 확인하는 방법이 또한 제공된다. RNA 분자를 코딩하는 DNA 플라스미드 벡터는 성장, 생존, 발생, 및/또는 생식에 필수적인 1종 이상의 표적 유전자(들)를 억제하도록 설계될 수 있다. 일부 실시양태에서, RNA 분자는 dsRNA 분자 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 딱정벌레류 해충에서의 표적 유전자의 코딩 또는 비-코딩 서열에 상보적인 핵산 분자를 통해 표적 유전자의 발현을 전사후 저해하거나 또는 표적 유전자를 억제하는 방법이 제공된다. 이들 및 추가 실시양태에서, 딱정벌레류 해충은 표적 유전자의 코딩 또는 비-코딩 서열에 상보적인 핵산 분자의 모두 또는 일부분으로부터 전사된 1종 이상의 dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, 및/또는 hpRNA 분자를 섭취할 수 있고, 이에 의해 식물-보호 효과를 제공할 수 있다.
일부 실시양태는 표적 유전자(들)의 코딩 및/또는 비-코딩 서열에 상보적인 dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA 및/또는 hpRNA를 사용하여 표적 유전자 산물의 발현을 서열 특이적으로 억제함으로써 딱정벌레류 해충의 적어도 부분적 방제를 달성하는 것을 수반한다. 예를 들어, 서열식별번호: 1에 제시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드; 및 그의 단편을 포함하는 단리 및 정제된 핵산 분자의 세트가 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, 안정화된 dsRNA 분자는 표적 유전자의 전사후 침묵 또는 억제를 위해 이들 폴리뉴클레오티드, 그의 단편, 또는 이들 폴리뉴클레오티드 중 1종을 포함하는 유전자로부터 발현될 수 있다. 특정 실시양태에서, 단리 및 정제된 핵산 분자는 서열식별번호: 1; 3; 및 67 중 어느 것의 모두 또는 일부를 포함한다.
다른 실시양태는 적어도 1종의 iRNA (예를 들어, dsRNA) 분자(들)를 코딩하는 적어도 1종의 재조합 DNA를 게놈 내에 갖는 재조합 숙주 세포 (예를 들어, 식물 세포)를 수반한다. 특정한 실시양태에서, dsRNA 분자(들)는 딱정벌레류 해충에 의해 섭취되었을 때 생산되어 해충 또는 해충의 자손에서의 표적 유전자를 전사후 침묵시키거나 또는 그의 발현을 억제할 수 있다. 재조합 DNA는, 예를 들어 서열식별번호: 1; 3; 및 67 중 어느 것, 서열식별번호: 1; 3; 및 67 중 어느 것의 단편, 및 서열식별번호: 1; 3; 및 67 중 1종을 포함하는 유전자의 부분적 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 및/또는 그의 상보체를 포함할 수 있다.
일부 실시양태는 서열식별번호: 70의 모두 또는 일부 (예를 들어, 서열식별번호: 70-73으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드)를 포함하는 적어도 1종의 iRNA (예를 들어, dsRNA) 분자(들)를 코딩하는 재조합 DNA를 게놈 내에 갖는 재조합 숙주 세포를 수반한다. 딱정벌레류 해충에 의해 섭취되었을 때, iRNA 분자(들)는 해충 또는 해충의 자손에서의 표적 hunchback 유전자 (예를 들어, 서열식별번호: 1; 3; 및 67로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드의 모두 또는 일부를 포함하는 DNA)의 발현을 침묵 또는 억제할 수 있고, 이에 의해 해충에서의 생식, 및/또는 해충의 자손에서의 성장, 발생, 및/또는 섭식의 중지를 유발할 수 있다.
다른 실시양태에서, dsRNA 분자를 형성할 수 있는 적어도 1종의 RNA 분자를 코딩하는 적어도 1종의 재조합 DNA를 게놈 내에 갖는 재조합 숙주 세포는 형질전환된 식물 세포일 수 있다. 일부 실시양태는 이러한 형질전환된 식물 세포를 포함하는 트랜스제닉 식물을 수반한다. 이러한 트랜스제닉 식물에 추가로, 각각의 것이 재조합 DNA(들)를 포함하는 임의의 트랜스제닉 식물 세대의 자손 식물, 트랜스제닉 종자, 및 트랜스제닉 식물 산물이 모두 제공된다. 특정한 실시양태에서, dsRNA 분자를 형성할 수 있는 RNA 분자는 트랜스제닉 식물 세포에서 발현될 수 있다. 따라서, 이들 및 다른 실시양태에서, dsRNA 분자는 트랜스제닉 식물 세포로부터 단리될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 트랜스제닉 식물은 옥수수 (제아 메이스(Zea mays)), 대두 (글리신 맥스(Glycine max)), 목화, 및 포아세아에(Poaceae) 과의 식물을 포함하는 군으로부터 선택된 식물이다.
일부 실시양태는 딱정벌레류 해충 세포에서 표적 유전자의 발현을 조정하는 방법을 수반한다. 이들 및 다른 실시양태에서, dsRNA 분자를 형성할 수 있는 RNA 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자가 제공될 수 있다. 특정한 실시양태에서, dsRNA 분자를 형성할 수 있는 RNA 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있고, 또한 전사 종결 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 딱정벌레류 해충 세포에서 표적 유전자의 발현을 조정하는 방법은 (a) dsRNA 분자를 형성할 수 있는 RNA 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 식물 세포를 형질전환시키는 것; (b) 복수종의 형질전환된 식물 세포를 포함하는 식물 세포 배양물의 발생이 가능하게 하는데 충분한 조건 하에서 형질전환된 식물 세포를 배양하는 것; (c) 벡터가 게놈 내로 통합된 형질전환된 식물 세포를 선택하는 것; 및 (d) 선택된 형질전환된 식물 세포가 벡터의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 dsRNA 분자를 형성할 수 있는 RNA 분자를 포함하는지 여부를 결정하는 것을 포함할 수 있다. 식물은, 게놈 내에 벡터가 통합되어 있으며 벡터의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 dsRNA 분자를 포함하는 식물 세포로부터 재생될 수 있다.
게놈 내로 통합되어 있는, dsRNA 분자를 형성할 수 있는 RNA 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 갖는 벡터를 포함하는 트랜스제닉 식물이며, 여기서 벡터의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 dsRNA 분자를 포함하는 트랜스제닉 식물이 또한 개시된다. 특정한 실시양태에서, 식물에서 dsRNA 분자를 형성할 수 있는 RNA 분자의 발현은 (예를 들어 형질전환된 식물, 식물의 일부 (예를 들어, 뿌리) 또는 식물 세포를 섭식함으로써) 형질전환된 식물 또는 식물 세포와 접촉하는 딱정벌레류 해충의 세포에서 또는 (예를 들어, 모 전달에 의해) 형질전환된 식물 또는 식물 세포와 접촉하는 딱정벌레류 해충의 자손의 세포에서 표적 유전자의 발현을 조정하여, 해충의 생식이 억제되도록 하는데 충분하다. 본원에 개시된 트랜스제닉 식물은 딱정벌레류 해충 침입으로부터의 내성 및/또는 보호를 나타낼 수 있다. 특정한 트랜스제닉 식물은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 딱정벌레류 해충(들)로부터의 보호 및/또는 증진된 보호를 나타낼 수 있다: WCR; NCR; SCR; MCR; 디. 발테아타 르콩트; 디. 유. 테넬라; 디. 스페시오사 게르마르; 및 디. 유. 운데심푼크타타 만네르헤임.
추가로 방제제, 예컨대 iRNA 분자를 딱정벌레류 해충에게 전달하는 방법이 본원에 개시된다. 이러한 방제제는 직접적으로 또는 간접적으로, 섭식, 성장할 수 있는 딱정벌레류 해충 집단의 능력에 장애를 야기할 수 있거나, 또는 다르게는 숙주에 손상을 야기할 수 있다. 일부 실시양태에서, 안정화된 dsRNA 분자를 딱정벌레류 해충에게 전달하여 해충 또는 그의 자손에서의 적어도 1종의 표적 유전자를 억제함으로써, 해충 숙주에서 모 RNAi를 야기하고 식물 손상을 감소 또는 제거하는 것을 포함하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 딱정벌레류 해충에서의 표적 유전자의 발현을 억제하는 방법은 해충에서의 생식, 및/또는 해충의 자손에서의 성장, 발생, 및/또는 섭식의 중지를 유발할 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 iRNA 분자와 접촉하는 해충(들)에서의 사멸을 직접적으로 유발하지 않으면서, 침입시에 후속 해충 세대의 크기를 유의하게 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 또한 iRNA 분자와 접촉하는 해충(들)에서의 사멸을 유발하면서, 침입시에 후속 해충 세대의 크기를 유의하게 감소시킬 수도 있다.
일부 실시양태에서, 딱정벌레류 해충 침입의 제거 또는 감소를 달성하기 위해 식물, 동물, 및/또는 식물 또는 동물의 환경에서 사용하기 위한 iRNA (예를 들어, dsRNA) 분자를 포함하는 조성물 (예를 들어, 국소 조성물)이 제공된다. 일부 실시양태에서, iRNA 분자를 코딩하는 DNA를 포함하는 원핵생물을 포함하는 조성물; 예를 들어, 형질전환된 박테리아 세포가 제공된다. 특정한 예에서, 이러한 형질전환된 박테리아 세포는 통상적인 살충제 제제로서 이용될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 조성물은 딱정벌레류 해충에게 섭식시킬 영양 조성물 또는 공급원, 또는 먹이원일 수 있다. 일부 실시양태는 해충에게 이용가능한 영양 조성물 또는 먹이원을 제조하는 것을 포함한다. iRNA 분자를 포함하는 조성물의 섭취는 딱정벌레류 해충의 1개 이상의 세포에 의한 상기 분자의 흡수를 유발할 수 있으며, 이는 차례로 해충의 세포(들) 또는 그의 자손에서의 적어도 1종의 표적 유전자의 발현의 억제를 유발할 수 있다. 딱정벌레류 해충 침입에 의한 식물 또는 식물 세포의 섭취 또는 그에의 손상은, iRNA 분자를 포함하는 1종 이상의 조성물을 해충의 숙주에 제공함으로써 해충이 존재하는 임의의 숙주 조직 또는 환경 내 또는 그 상에서 제한 또는 제거될 수 있다.
본원에 개시된 조성물 및 방법은 딱정벌레류 해충에 의한 손상을 방제하기 위한 다른 방법 및 조성물과 조합되어 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 딱정벌레류 해충으로부터 식물을 보호하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 iRNA 분자는 딱정벌레류 해충에 대해 효과적인 1종 이상의 화학적 작용제, 딱정벌레류 해충에 대해 효과적인 생물살충제, 윤작, 또는 RNAi-매개 방법 및 RNAi 조성물의 특색과 상이한 특색을 나타내는 재조합 유전자 기술 (예를 들어, 딱정벌레류 해충에게 유해한 단백질 (예를 들어, Bt 독소)을 식물에서 재조합적으로 생산하는 것), 및/또는 비-모 iRNA 분자 (예를 들어, iRNA 분자를 섭취하는 딱정벌레류 해충에서의 성장, 발생, 및/또는 섭식의 중지를 유발하는 치사 iRNA 분자)의 재조합 발현의 추가의 사용을 포함하는 방법에서 사용될 수 있다.
II. 약어
dsRNA 이중-가닥 리보핵산
GI 성장 억제
GFP 녹색 형광 단백질
NCBI 국립 생물 정보 센터
gDNA 게놈 데옥시리보핵산
iRNA 억제 리보핵산
ORF 오픈 리딩 프레임
RNAi 리보핵산 간섭
miRNA 마이크로 리보핵산
siRNA 소형 억제 리보핵산
hpRNA 헤어핀 리보핵산
shRNA 짧은 헤어핀 리보핵산
pRNAi 모 RNA 간섭
UTR 비번역 영역
WCR 서부 옥수수 뿌리벌레 (디아브로티카 비르기페라 비르기페라 르콩트)
NCR 북부 옥수수 뿌리벌레 (디아브로티카 바르베리 스미스 및 로렌스)
MCR 멕시코 옥수수 뿌리벌레 (디아브로티카 비르기페라 제아에 크리산 및 스미스)
PCR 폴리머라제 연쇄 반응
qPCR 정량적 폴리머라제 연쇄 반응
RISC RNA-유도 침묵 복합체
RH 상대 습도
SCR 남부 옥수수 뿌리벌레 (디아브로티카 운데심푼크타타 호와르디 바버)
SEM 평균의 표준 오차
snRNA 소형 핵 리보핵산
YFP 황색 형광 단백질
III. 용어
하기하는 설명 및 표에서, 다수의 용어가 사용된다. 주어진 이러한 용어의 범주를 포함한, 본 명세서 및 청구범위의 명확하고 일관된 이해를 제공하기 위해, 하기 정의가 제공된다:
딱정벌레류 해충: 본원에 사용된 용어 "딱정벌레류 해충"은 옥수수 및 다른 볏과 식물을 포함한 농업 작물 및 작물 산물을 섭식하는 디아브로티카 속의 곤충 해충을 포함한 딱정벌레목의 곤충을 지칭한다. 특정한 예에서, 딱정벌레류 해충은 디. 브이. 비르기페라 르콩트 (WCR); 디. 바르베리 스미스 및 로렌스 (NCR); 디. 유. 호와르디 (SCR); 디. 브이. 제아에 (MCR); 디. 발테아타 르콩트; 디. 유. 테넬라; 디. 스페시오사 게르마르; 및 디. 유. 운데심푼크타타 만네르헤임을 포함하는 목록으로부터 선택된다.
접촉 (유기체와): 핵산 분자와 관련하여 본원에 사용된 용어 유기체 (예를 들어, 딱정벌레류 해충)"와 접촉하다" 또는 "에 의해 흡수되다"는 유기체 내로의 핵산 분자의 내재화, 예를 들어 및 비제한적으로: 유기체에 의한 분자의 섭취 (예를 들어, 섭식에 의해); 핵산 분자를 포함하는 조성물과 유기체를 접촉시키는 것; 및 핵산 분자를 포함하는 용액을 사용하여 유기체를 침지시키는 것.
콘티그: 본원에 사용된 용어 "콘티그"는 단일 유전자 공급원으로부터 유래된 중첩 DNA 절편의 세트로부터 재구축된 DNA 서열을 지칭한다.
옥수수 식물: 본원에 사용된 용어 "옥수수 식물"은 종 제아 메이스의 식물 (메이즈)을 지칭한다. 용어 "옥수수 식물" 및 "메이즈"는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.
발현: 본원에 사용된, 코딩 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 유전자 또는 트랜스진)의 "발현"은 핵산 전사 단위 (예를 들어, gDNA 또는 cDNA를 포함함)의 코딩된 정보가 세포의 작동적, 비-작동적, 또는 구조적 일부로 전환되는 과정 (종종 단백질의 합성을 포함함)을 지칭한다. 유전자 발현은 외부 신호; 예를 들어, 세포, 조직, 또는 유기체가 유전자 발현을 증가 또는 감소시키는 작용제에 노출되는 것에 의해 영향을 받을 수 있다. 유전자의 발현은 또한 DNA에서 RNA를 거쳐 단백질로의 경로 중 임의의 곳에서 조절될 수 있다. 유전자 발현의 조절은, 예를 들어, 전사, 번역, RNA 수송 및 프로세싱, 중간체 분자 예컨대 mRNA의 분해에 작용하는 제어를 통해, 또는 특정 단백질 분자가 만들어진 후 그의 활성화, 불활성화, 구획화, 또는 분해를 통해, 또는 그의 조합에 의해 발생한다. 유전자 발현은 노던 블롯, RT-PCR, 웨스턴 블롯, 또는 시험관내, 계내, 또는 생체내 단백질 활성 검정(들)을 비제한적으로 포함하는, 관련 기술 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 RNA 수준 또는 단백질 수준에서 측정될 수 있다.
유전 물질: 본원에 사용된 용어 "유전 물질"은 모든 유전자, 및 핵산 분자, 예컨대 DNA 및 RNA를 포함한다.
억제: 본원에 사용된 용어 "억제"는 코딩 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 유전자)에 대한 효과를 기재하는데 사용되는 경우에, 코딩 폴리뉴클레오티드로부터 전사된 mRNA, 및/또는 코딩 폴리뉴클레오티드의 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질 산물의 세포 수준에서의 측정가능한 감소를 지칭한다. 일부 예에서, 코딩 폴리뉴클레오티드의 발현은 발현이 거의 제거될 정도로 억제될 수 있다. "특이적 억제"는 특이적 억제가 달성되는 세포에서 결과적으로 다른 코딩 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 유전자)의 발현에는 영향을 미치지 않으면서 표적 코딩 폴리뉴클레오티드의 억제를 지칭한다.
단리된: "단리된" 생물학적 성분 (예컨대, 핵산 또는 단백질)은 성분이 자연적으로 발생하는 유기체의 세포 내의 다른 생물학적 성분 (즉, 다른 염색체 및 염색체외 DNA 및 RNA, 및 단백질)로부터, 성분에 화학적 또는 기능적 변화를 일으키면서 실질적으로 분리되거나, 그를 제외하고 생산되거나, 또는 그로부터 정제된 것이다 (예를 들어, 핵산은 염색체에 남아있는 DNA에 핵산을 연결하는 화학 결합을 파괴함으로써 염색체로부터 단리될 수 있다). "단리된" 핵산 분자 및 단백질은 표준 정제 방법에 의해 정제된 핵산 분자 및 단백질을 포함한다. 용어는 또한 숙주 세포에서의 재조합 발현에 의해 제조된 핵산 및 단백질, 뿐만 아니라 화학적으로 합성된 핵산 분자, 단백질, 및 펩티드를 포함한다.
핵산 분자: 본원에 사용된 용어 "핵산 분자"는 RNA, cDNA, gDNA, 및 상기의 합성 형태 및 혼합 중합체의 센스 및 안티-센스 가닥 둘 다를 포함할 수 있는, 뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭할 수 있다. 뉴클레오티드 또는 핵염기는 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 뉴클레오티드의 어느 유형의 변형된 형태를 지칭할 수 있다. 본원에 사용된 "핵산 분자"는 "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"와 동의어이다. 달리 명시되지 않는 한, 핵산 분자는 통상적으로 적어도 10개의 염기 길이이다. 관례상, 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열은 분자의 5'에서 3' 말단으로 판독된다. 핵산 분자의 "상보체"는 핵산 분자의 핵염기와 염기쌍을 형성할 수 있는 핵염기를 갖는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다 (즉, A-T/U, 및 G-C).
일부 실시양태는 mRNA 분자의 상보체인 RNA 분자로 전사되는 주형 DNA를 포함하는 핵산을 포함한다. 이들 실시양태에서, mRNA 분자로 전사되는 핵산의 상보체는 5'에서 3' 배향으로 존재하여, RNA 폴리머라제 (DNA를 5'에서 3' 방향으로 전사함)가 mRNA 분자에 혼성화될 수 있는 상보체로부터 핵산을 전사하도록 할 것이다. 따라서, 달리 명백하게 언급되지 않는 한, 또는 달리 문맥으로부터 명확하지 않는 한, 용어 "상보체"는 참조 핵산의 핵염기와 염기 쌍을 형성할 수 있는 5'에서 3'로의 핵염기를 갖는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 유사하게, 달리 명백하게 언급되지 않는 한 (또는 달리 문맥으로부터 명확하지 않는 한), 핵산의 "역 상보체"는 역 배향의 상보체를 지칭한다. 상기는 하기 예시에서 입증된다:
ATGATGATG 폴리뉴클레오티드
TACTACTAC 폴리뉴클레오티드의 "상보체"
CATCATCAT 폴리뉴클레오티드의 "역 상보체"
본 발명의 일부 실시양태는 헤어핀 RNA-형성 RNAi 분자를 포함할 수 있다. 이들 RNAi 분자에서, RNA 간섭에 의해 표적화될 핵산의 상보체 및 역 상보체 둘 다는 동일한 분자에서 발견될 수 있어, 단일-가닥 RNA 분자가 "서로 폴딩"되도록 할 수 있고 상보적 및 역 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 영역에 걸쳐 그 자체에 혼성화되도록 할 수 있다.
"핵산 분자"는 모든 폴리뉴클레오티드, 예를 들어: 단일- 및 이중-가닥 형태의 DNA; 단일-가닥 형태의 RNA; 및 이중-가닥 형태의 RNA (dsRNA)를 포함한다. 용어 "뉴클레오티드 서열" 또는 "핵산 서열"은 개별 단일 가닥으로서 또는 듀플렉스로 핵산의 센스 및 안티센스 가닥 둘 다를 지칭한다. 용어 "리보핵산" (RNA)은 iRNA (억제 RNA), dsRNA (이중 가닥 RNA), siRNA (소형 간섭 RNA), shRNA (소형 헤어핀 RNA), mRNA (메신저 RNA), miRNA (마이크로-RNA), hpRNA (헤어핀 RNA), tRNA (상응하는 아실화된 아미노산이 적재된 또는 적재되지 않은 전달 RNA), 및 cRNA (상보적 RNA)를 포함한다. 용어 "데옥시리보핵산" (DNA)은 cDNA, gDNA, 및 DNA-RNA 하이브리드를 포함한다. 용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산", 및 그의 "단편"은 gDNA, 리보솜 RNA, 전달 RNA, 메신저 RNA, 오페론, 및 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질을 코딩하거나 또는 그를 코딩하도록 적합화될 수 있는 보다 소형의 조작된 폴리뉴클레오티드 모두를 포함하는 용어로서 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해될 것이다.
올리고뉴클레오티드: 올리고뉴클레오티드는 짧은 핵산 중합체이다. 올리고뉴클레오티드는 보다 긴 핵산 절편의 절단에 의해, 또는 개별 뉴클레오티드 전구체를 중합시킴으로써 형성될 수 있다. 자동화 합성기는 최대 수백개의 염기 길이의 올리고뉴클레오티드의 합성을 가능하게 한다. 올리고뉴클레오티드는 상보적 핵산에 결합할 수 있기 때문에, 이들은 DNA 또는 RNA를 검출하기 위한 프로브로서 사용될 수 있다. DNA로 구성된 올리고뉴클레오티드 (올리고데옥시리보뉴클레오티드)는 DNA의 증폭을 위한 기술인 PCR에서 사용될 수 있다. PCR에서, 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 DNA 폴리머라제가 올리고뉴클레오티드를 연장시키고 상보적 가닥을 복제하게 하는 "프라이머"로 지칭된다.
핵산 분자는 자연 발생 및/또는 비-자연 발생 뉴클레오티드 연결에 의해 함께 연결된 자연 발생 및 변형된 뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 인지되는 바와 같이, 핵산 분자는 화학적으로 또는 생화학적으로 변형될 수 있거나, 또는 비-천연 또는 유도체화 뉴클레오티드 염기를 함유할 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어, 표지, 메틸화, 천연 발생 뉴클레오티드 중 1종 이상의 유사체로의 치환, 뉴클레오티드간 변형 (예를 들어, 비하전된 연결: 예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포르아미데이트, 카르바메이트 등; 하전된 연결: 예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등; 펜던트 모이어티: 예를 들어, 펩티드; 삽입제: 예를 들어, 아크리딘, 소랄렌 등; 킬레이트화제; 알킬화제; 및 변형된 연결: 예를 들어, 알파 아노머 핵산 등)을 포함한다. 용어 "핵산 분자"는 또한 단일-가닥, 이중-가닥, 부분적 듀플렉스, 트리플렉스, 헤어핀, 원형, 및 자물쇠형 입체형태를 포함한 임의의 위상 입체형태를 포함한다.
DNA와 관련하여 본원에 사용된 용어 "코딩 폴리뉴클레오티드", "구조적 폴리뉴클레오티드", 또는 "구조적 핵산 분자"는 적절한 조절 요소의 제어 하에 배치된 경우에 전사 및 mRNA를 통해 궁극적으로는 폴리펩티드로 번역되는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. RNA와 관련하여 용어 "코딩 폴리뉴클레오티드"는 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질로 번역되는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 코딩 폴리뉴클레오티드의 경계는 5'-말단에서의 번역 개시 코돈 및 3'-말단에서의 번역 정지 코돈에 의해 결정된다. 코딩 폴리뉴클레오티드는 gDNA; cDNA; EST; 및 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 "전사된 비-코딩 폴리뉴클레오티드"는 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질로 번역되지 않는 mRNA 분자의 절편, 예컨대 5'UTR, 3'UTR 및 인트론 절편을 지칭한다. 추가로, "전사된 비-코딩 폴리뉴클레오티드"는 세포에서 기능하는 RNA, 예를 들어, 구조적 RNA (예를 들어, 5S rRNA, 5.8S rRNA, 16S rRNA, 18S rRNA, 23S rRNA, 및 28S rRNA에 의해 예시되는 바와 같은 리보솜 RNA (rRNA) 등); 전달 RNA (tRNA); 및 snRNA 예컨대 U4, U5, U6 등으로 전사되는 핵산을 지칭한다. 전사된 비-코딩 폴리뉴클레오티드는 또한, 예를 들어 및 비제한적으로, 종종 소형 박테리아 비-코딩 RNA를 기재하는데 사용되는 용어인 소형 RNA (sRNA); 소형 핵소체 RNA (snoRNA); 마이크로RNA; 소형 간섭 RNA (siRNA); Piwi-상호작용 RNA (piRNA); 및 긴 비-코딩 RNA를 포함한다. 또한 추가로, "전사된 비-코딩 폴리뉴클레오티드"는 핵산에서 유전자내 "링커"로서 천연적으로 존재할 수 있고 RNA 분자로 전사되는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.
치사 RNA 간섭: 본원에 사용된 용어 "치사 RNA 간섭"은, 예를 들어 dsRNA, miRNA, siRNA, shRNA, 및/또는 hpRNA가 전달되는 대상 개체의 사멸 또는 생존율 감소를 유발하는 RNA 간섭을 지칭한다.
모 RNA 간섭: 본원에 사용된 용어 "모 RNA 간섭" (pRNAi)은, 예를 들어 dsRNA, miRNA, siRNA, shRNA, 및/또는 hpRNA가 전달되는 대상체 (예를 들어, 딱정벌레류 해충)의 자손에서 관찰가능한 RNA 간섭 표현형을 지칭한다. 일부 실시양태에서, pRNAi는 딱정벌레류 해충에게의 dsRNA의 전달을 포함하며, 여기서 해충은 이에 의해 생존 자손을 보다 덜 생산할 수 있게 된다. pRNAi를 개시하는 핵산은 핵산이 전달되는 집단에서 사멸의 발생률을 증가시킬 수 있거나 또는 그렇지 않을 수 있다. 특정 예에서, pRNAi를 개시하는 핵산은 핵산이 전달되는 집단에서 사멸의 발생률을 증가시키지 않는다. 예를 들어, 딱정벌레류 해충의 집단은 pRNAi를 개시하는 1종 이상의 핵산을 섭식할 수 있으며, 여기서 해충은 생존하고 교미하지만, 핵산(들)을 섭식하지 않은 동일한 종의 해충에 의해 생산된 알보다 생존 자손을 덜 부화시킬 수 있는 알을 생산한다. pRNAi의 한 메카니즘에서, 암컷에게 전달된 모 RNAi는 암컷의 자손 배아에서 접합 유전자 발현을 녹다운시킬 수 있다. 문헌 [Bucher et al. (2002) Curr. Biol. 12(3):R85-6].
게놈: 본원에 사용된 용어 "게놈"은 세포의 핵 내에서 발견되는 염색체 DNA를 지칭하고, 또한 세포의 세포하 성분 내에서 발견되는 소기관 DNA를 지칭한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, DNA 분자는 DNA 분자가 식물 세포의 게놈 내로 통합되도록 식물 세포 내로 도입될 수 있다. 이들 및 추가 실시양태에서, DNA 분자는 식물 세포의 핵 DNA 내로 통합될 수 있거나, 또는 식물 세포의 엽록체 또는 미토콘드리아의 DNA 내로 통합될 수 있다. 용어 "게놈"이 박테리아에 적용되는 경우에, 이는 박테리아 세포 내의 염색체 및 플라스미드 둘 다를 지칭한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, DNA 분자는 DNA 분자가 박테리아의 게놈 내로 통합되도록 박테리아 내로 도입될 수 있다. 이들 및 추가 실시양태에서, DNA 분자는 안정한 플라스미드로서 또는 그러한 것으로 염색체-통합 또는 위치할 수 있다.
서열 동일성: 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 관련하여 본원에 사용된 용어 "서열 동일성" 또는 "동일성"은 2개의 분자의 서열에서의 잔기가 명시된 비교 윈도우에 걸쳐 최대 상응도로 정렬된 경우에 동일한 것을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "서열 동일성의 백분율"은 비교 윈도우에 걸쳐 분자의 2개의 최적으로 정렬된 서열 (예를 들어, 핵산 서열 또는 폴리펩티드 서열)을 비교함으로써 결정된 값을 지칭할 수 있으며, 여기서 비교 윈도우에서의 서열의 부분은 2개의 서열의 최적 정렬을 위한 (부가 또는 결실을 포함하지 않는) 참조 서열과 비교하여, 부가 또는 결실 (즉, 갭)을 포함할 수 있다. 서열 둘 다에서 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 발생하는 위치의 수를 결정하여 매칭되는 위치의 수를 산출하고, 매칭되는 위치의 수를 비교 윈도우 내의 위치의 총수로 나누고, 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로서 백분율이 계산된다. 참조 서열과의 비교시에 모든 위치에서 동일한 서열은 참조 서열에 대해 100% 동일하다고 하고, 그 반대의 경우도 그러하다.
비교를 위해 서열을 정렬하는 방법은 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있다. 다양한 프로그램 및 정렬 알고리즘이, 예를 들어 다음에 기재되어 있다: 문헌 [Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443; Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444; Higgins and Sharp (1988) Gene 73:237-44; Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-3; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang et al. (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155-65; Pearson et al. (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-31; Tatiana et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-50]. 서열 정렬 방법 및 상동성 계산에 대한 상세한 고찰은, 예를 들어 문헌 [Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10]에서 찾을 수 있다.
국립 생물 정보 센터 (NCBI)의 베이직 로컬 얼라인머트 서치 툴 (BLAST™; 문헌 [Altschul et al. (1990)])은 여러 서열 분석 프로그램과 함께 사용하기 위해 국립 생물 정보 센터 (메릴랜드주 베데스다) 및 인터넷을 포함하는 여러 출처로부터 이용가능하다. 이 프로그램을 사용하여 서열 동일성을 결정하는 방법의 설명은 인터넷 상에서 BLAST™에 대한 "도움" 섹션 하에 이용가능하다. 핵산 서열의 비교를 위해, 디폴트 파라미터로 설정된 디폴트 BLOSUM62 행렬을 사용하는 BLAST™ (Blastn) 프로그램의 "Blast 2 서열" 기능이 사용될 수 있다. 참조 폴리뉴클레오티드의 서열에 대해 보다 더 큰 서열 유사성을 갖는 핵산은 이 방법에 의해 평가되는 경우에 증가하는 백분율 동일성을 제시할 것이다.
특이적으로 혼성화가능한/특이적으로 상보적인: 본원에 사용된 용어 "특이적으로 혼성화가능한" 및 "특이적으로 상보적인"은 핵산 분자와 표적 핵산 분자 사이에 안정하고 특이적인 결합이 발생할 수 있도록 하는 충분한 정도의 상보성을 나타내는 용어이다. 2개의 핵산 분자 사이의 혼성화는 2개의 핵산 분자의 핵염기 사이의 역평행 정렬의 형성을 수반한다. 이어서, 2개의 분자는 대향 가닥 상의 상응하는 염기와 수소 결합을 형성하여, 충분히 안정한 경우에 관련 기술분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 검출가능한 듀플렉스 분자를 형성할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 특이적으로 혼성화가능한 그의 표적 핵산에 대해 100% 상보적이어야 할 필요는 없다. 그러나, 특이적인 혼성화를 위해 존재해야 하는 상보성의 양은 사용되는 혼성화 조건의 함수이다.
특정한 정도의 엄격도를 유발하는 혼성화 조건은 선택된 혼성화 방법의 성질 및 혼성화 핵산의 조성 및 길이에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 혼성화의 온도 및 혼성화 완충제의 이온 강도 (특히, Na+ 및/또는 Mg++ 농도)가 혼성화의 엄격도를 결정할 것이지만, 세척 시간 또한 엄격도에 영향을 미친다. 특정한 정도의 엄격도를 달성하는데 요구되는 혼성화 조건에 관한 계산은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Sambrook et al. (ed.) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, chapters 9 and 11; 및 Hames and Higgins (eds.) Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, 1985]에 논의되어 있다. 핵산의 혼성화와 관련한 추가의 상세한 지침 및 안내는, 예를 들어 문헌 [Tijssen, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays," in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology- Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2, Elsevier, NY, 1993; 및 Ausubel et al., Eds., Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Greene Publishing and Wiley-Interscience, NY, 1995]에서 찾을 수 있다.
본원에 사용된 "엄격한 조건"은 혼성화 분자의 서열과 표적 핵산 분자 내의 상동 폴리뉴클레오티드 사이에 20% 미만의 미스매치가 존재하는 경우에만 혼성화가 발생하게 하는 조건을 포괄한다. "엄격한 조건"은 추가의 특정한 수준의 엄격도를 포함한다. 따라서, 본원에 사용된 "중간 엄격도" 조건은 20% 초과의 서열 미스매치를 갖는 분자는 혼성화되지 못하게 하는 조건이고; "고 엄격도" 조건은 10% 초과의 미스매치를 갖는 서열은 혼성화되지 못하게 하는 조건이고; "초고도 엄격도" 조건은 5% 초과의 미스매치를 갖는 서열은 혼성화되지 못하게 하는 조건이다.
하기는 대표적인 비제한적 혼성화 조건이다.
고 엄격도 조건 (적어도 90% 서열 동일성을 공유하는 폴리뉴클레오티드를 검출함): 16시간 동안 65℃에서 5x SSC 완충제 중에서의 혼성화; 각각 15분 동안 실온에서 2x SSC 완충제 중에서의 2회 세척; 및 각각 20분 동안 65℃에서 0.5x SSC 완충제 중에서의 2회 세척.
중간 엄격도 조건 (적어도 80% 서열 동일성을 공유하는 폴리뉴클레오티드를 검출함): 16-20시간 동안 65-70℃에서 5x-6x SSC 완충제 중에서의 혼성화; 각각 5-20분 동안 실온에서 2x SSC 완충제 중에서의 2회 세척; 및 각각 30분 동안 55-70℃에서 1x SSC 완충제 중에서의 2회 세척.
비-엄격한 대조군 조건 (적어도 50% 서열 동일성을 공유하는 폴리뉴클레오티드가 혼성화될 것임): 16-20시간 동안 실온 내지 55℃에서 6x SSC 완충제 중에서의 혼성화; 각각 20-30분 동안 실온 내지 55℃에서 2x-3x SSC 완충제 중에서의 적어도 2회 세척.
핵산과 관련하여 본원에 사용된 용어 "실질적으로 상동인" 또는 "실질적 상동성"은 엄격한 조건 하에서 참조 핵산에 혼성화되는 인접 핵염기를 갖는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 예를 들어, 서열식별번호: 1, 3, 46, 및 67 중 어느 것의 참조 핵산에 대해 실질적으로 상동인 핵산은 엄격한 조건 (예를 들어, 상기 문헌에 제시된 중간 엄격도 조건) 하에서 서열식별번호: 1, 3, 46, 및 67 중 어느 것의 참조 핵산에 혼성화되는 그러한 핵산이다. 실질적으로 상동인 폴리뉴클레오티드는 적어도 80% 서열 동일성을 가질 수 있다. 예를 들어, 실질적으로 상동인 폴리뉴클레오티드는 약 80% 내지 100%, 예컨대 79%; 80%; 약 81%; 약 82%; 약 83%; 약 84%; 약 85%; 약 86%; 약 87%; 약 88%; 약 89%; 약 90%; 약 91%; 약 92%; 약 93%; 약 94% 약 95%; 약 96%; 약 97%; 약 98%; 약 98.5%; 약 99%; 약 99.5%; 및 약 100% 서열 동일성을 가질 수 있다. 실질적 상동성의 특성은 특이적 혼성화와 밀접하게 관련된다. 예를 들어, 핵산 분자는 특이적 결합이 요구되는 조건 하에서, 예를 들어 엄격한 혼성화 조건 하에서 핵산의 비-표적 폴리뉴클레오티드에 대한 비-특이적 결합을 피할 수 있는 충분한 정도의 상보성이 존재하는 경우에 특이적으로 혼성화가능하다.
본원에 사용된 용어 "오르토로그"는 공통 조상 핵산으로부터 진화하였고, 2종 이상의 종에서 동일한 기능을 보유할 수 있는 2종 이상의 종에서의 유전자를 지칭한다.
본원에 사용된 2개의 핵산 분자는 5'에서 3' 방향으로 판독된 폴리뉴클레오티드의 모든 뉴클레오티드가 3'에서 5' 방향으로 판독되었을 때의 다른 폴리뉴클레오티드의 모든 뉴클레오티드에 상보적인 경우에 "완전한 상보성"을 나타낸다고 한다. 참조 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드는 참조 폴리뉴클레오티드의 역 상보체와 동일한 서열을 나타낼 것이다. 이들 용어 및 설명은 관련 기술분야에 널리 정의되어 있고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 이해된다.
작동가능하게 연결된: 제1 폴리뉴클레오티드가 제2 폴리뉴클레오티드와 기능적 관계에 있는 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드는 제2 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결된다. 재조합적으로 생산된 경우에, 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드는 동일한 리딩 프레임 내에서 (예를 들어, 번역 융합된 ORF 내에서) 일반적으로 인접해 있고, 필요할 경우 2개의 단백질-코딩 영역을 연결한다. 그러나, 핵산은 작동가능하게 연결되기 위해 인접해 있을 필요는 없다.
조절 유전자 요소 및 코딩 폴리뉴클레오티드와 관련하여 사용되는 경우의 용어 "작동가능하게 연결된"은 조절 요소가 연결된 코딩 폴리뉴클레오티드의 발현에 영향을 미친다는 것을 의미한다. "조절 요소" 또는 "제어 요소"는 전사의 시기 및 수준/양, RNA 프로세싱 또는 안정성, 또는 연관된 코딩 폴리뉴클레오티드의 번역에 영향을 미치는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 조절 요소는 프로모터; 번역 리더; 인트론; 인핸서; 스템-루프 구조; 리프레서 결합 폴리뉴클레오티드; 종결 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드; 폴리아데닐화 인식 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 등을 포함할 수 있다. 특정한 조절 요소는 그에 작동가능하게 연결된 코딩 폴리뉴클레오티드의 상류 및/또는 하류에 위치할 수 있다. 또한, 코딩 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 특정한 조절 요소는 이중-가닥 핵산 분자의 연관된 상보적 가닥 상에 위치할 수 있다.
프로모터: 본원에 사용된 용어 "프로모터"는 전사 개시로부터 상류에 위치할 수 있고, RNA 폴리머라제 및 전사를 개시하는 다른 단백질의 인식 및 결합에 수반될 수 있는 DNA 영역을 지칭한다. 프로모터는 세포에서의 발현을 위한 코딩 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결될 수 있거나, 또는 프로모터는 세포에서의 발현을 위한 코딩 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결될 수 있는 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결될 수 있다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터일 수 있다. 발생적 제어 하에 있는 프로모터의 예는 특정 조직, 예컨대 잎, 뿌리, 종자, 섬유, 물관, 헛물관, 또는 후막조직에서 전사를 우선적으로 개시하는 프로모터를 포함한다. 이러한 프로모터는 "조직-선호"인 것으로 지칭된다. 단지 특정 조직에서만 전사를 개시하는 프로모터는 "조직-특이적"인 것으로 지칭된다. "세포 유형-특이적" 프로모터는 주로 1종 이상 기관에서의 특정 세포 유형, 예를 들어 뿌리 또는 잎에서의 도관 세포에서 발현을 구동한다. "유도성" 프로모터는 환경 제어 하에 있을 수 있는 프로모터일 수 있다. 유도성 프로모터에 의해 전사를 개시할 수 있는 환경 조건의 예는 혐기성 조건 및 광의 존재를 포함한다. 조직-특이적, 조직-선호, 세포 유형 특이적, 및 유도성 프로모터는 "비-구성적" 프로모터의 부류를 구성한다. "구성적" 프로모터는 대부분의 환경 조건 하에서 또는 대부분의 세포 또는 조직 유형에서 활성일 수 있는 프로모터이다.
본 발명의 일부 실시양태에서 임의의 유도성 프로모터가 사용될 수 있다. 문헌 [Ward et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22:361-366]을 참조한다. 유도성 프로모터 하에, 유도제에 대한 반응으로 전사율이 증가한다. 예시적인 유도성 프로모터는 다음을 포함하나 이에 제한되지 않는다: 구리에 반응하는 ACEI 시스템으로부터의 프로모터; 벤젠술폰아미드 제초제 완화제에 대해 반응하는, 메이즈로부터의 In2 유전자; Tn10으로부터의 Tet 리프레서; 및 글루코코르티코스테로이드 호르몬에 의해 전사 활성이 유도될 수 있는 스테로이드 호르몬 유전자로부터의 유도성 프로모터 (Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:0421).
예시적인 구성적 프로모터로는 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 식물 바이러스로부터의 프로모터, 예컨대 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV)로부터의 35S 프로모터; 벼 액틴 유전자로부터의 프로모터; 유비퀴틴 프로모터; pEMU; MAS; 메이즈 H3 히스톤 프로모터; 및 브라시카 나푸스(Brassica napus) ALS3 구조적 유전자에 대해 5'에 있는 Xba1/NcoI 단편인 ALS 프로모터 (또는 상기 Xba1/NcoI 단편에 유사한 폴리뉴클레오티드) (국제 PCT 공개 번호 WO96/30530).
추가적으로, 본 발명의 일부 실시양태에서 임의의 조직-특이적 또는 조직-선호 프로모터가 이용될 수 있다. 조직-특이적 프로모터에 작동가능하게 연결된 코딩 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자로 형질전환된 식물은 특이적 조직에서 배타적으로 또는 우선적으로 코딩 폴리뉴클레오티드의 산물을 생산할 수 있다. 예시적인 조직-특이적 또는 조직-선호 프로모터는 다음을 포함하나 이에 제한되지 않는다: 종자-선호 프로모터, 예컨대 파세올린 유전자로부터의 것; 잎-특이적 및 광-유도성 프로모터, 예컨대 cab 또는 rubisco로부터의 것; 또 다른-특이적 프로모터, 예컨대 LAT52로부터의 것; 화분-특이적 프로모터, 예컨대 Zm13으로부터의 것; 및 소포자-선호 프로모터, 예컨대 apg로부터의 것.
대두 식물: 본원에 사용된 용어 "대두 식물"은 글리신 종의 식물; 예를 들어 지. 맥스를 지칭한다.
형질전환: 본원에 사용된 용어 "형질전환" 또는 "형질도입"은 1종 이상의 핵산 분자(들)를 세포 내로 전달하는 것을 지칭한다. 세포 내로 형질도입된 핵산 분자가 핵산 분자의 세포 게놈 내로의 혼입에 의해 또는 에피솜 복제 의해 세포에 의해 안정하게 복제되는 경우에 세포는 상기 핵산 분자에 의해 "형질전환된다". 본원에 사용된 용어 "형질전환"은 핵산 분자를 이러한 세포 내로 도입시킬 수 있는 모든 기술을 포괄한다. 예는 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 바이러스 벡터를 사용한 형질감염; 플라스미드 벡터를 사용한 형질전환; 전기천공 (Fromm et al. (1986) Nature 319:791-3); 리포펙션 (Felgner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7); 미세주사 (Mueller et al. (1978) Cell 15:579-85); 아그로박테리움-매개 전달 (Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7); 직접적 DNA 흡수; 및 미세발사체 충격 (Klein et al. (1987) Nature 327:70).
트랜스진: 외인성 핵산. 일부 예에서, 트랜스진은 딱정벌레류 해충에서 발견되는 핵산 분자에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 dsRNA 분자를 형성할 수 있는 RNA의 한 가닥 또는 둘 다의 가닥(들)을 코딩하는 DNA일 수 있다. 추가의 예에서, 트랜스진은 안티센스 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 여기서 안티센스 폴리뉴클레오티드의 발현은 표적 핵산의 발현을 억제하고, 이에 의해 모 RNAi 표현형을 생성한다. 추가의 예에서, 트랜스진은 유전자 (예를 들어, 제초제-내성 유전자, 산업상 또는 제약상 유용한 화합물을 코딩하는 유전자, 또는 바람직한 농업 형질을 코딩하는 유전자)일 수 있다. 이들 및 다른 예에서, 트랜스진은 트랜스진의 코딩 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 조절 요소 (예를 들어, 프로모터)를 함유할 수 있다.
벡터: 예를 들어 형질전환된 세포를 생산하기 위해 세포 내로 도입되는 핵산 분자. 벡터는 숙주 세포에서 복제될 수 있도록 허용하는 유전자 요소, 예컨대 복제 기점을 포함할 수 있다. 벡터의 예는 다음을 포함하나 이에 제한되지 않는다: 외인성 DNA를 세포 내로 운반하는 플라스미드; 코스미드; 박테리오파지; 또는 바이러스. 벡터는 또한 안티센스 분자를 생성하는 것, 및/또는 선택 마커 유전자 및 관련 기술분야에 공지된 다른 유전 요소를 포함한 1종 이상의 유전자를 포함할 수 있다. 벡터는 세포에 형질도입되거나, 세포를 형질감염시키거나, 또는 세포를 감염시켜, 세포가 벡터에 의해 코딩된 핵산 분자 및/또는 단백질을 발현하도록 할 수 있다. 벡터는 임의로 핵산 분자의 세포 내 진입을 달성하는데 보조하는 물질 (예를 들어, 리포솜, 단백질 코팅 등)을 포함한다.
수확량: 동일한 시기에 동일한 조건 하에서 성장한 동일한 성장 위치에 있는 대비 품종의 수확량에 비해 약 100% 또는 그 초과의 안정화된 수확량. 특정한 실시양태에서, "개선된 수확량" 또는 "수확량 개선"은 품종이, 동일한 시기에 동일한 조건 하에서 성장한 작물에게 유해하며 본원의 조성물 및 방법에 의해 표적화되는 딱정벌레류 해충을 유의한 밀도로 함유하는 동일한 성장 위치에 있는 대비 품종의 수확량에 비해 105% 또는 그 초과의 안정화된 수확량을 갖는 것을 의미한다.
구체적으로 지시 또는 암시되지 않는 한, 용어 단수 형태는 본원에 사용된 "적어도 1개"를 의미한다.
달리 구체적으로 설명되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 분자 생물학에서의 통상의 용어에 관한 정의는, 예를 들어 문헌 [Lewin's Genes X, Jones & Bartlett Publishers, 2009 (ISBN 10 0763766321); Krebs et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); 및 Meyers R.A. (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)]에서 찾을 수 있다. 달리 언급되지 않는 한 모든 퍼센트는 중량 기준이고, 모든 용매 혼합물 비율은 부피 기준이다. 모든 온도는 섭씨 온도이다.
IV. 딱정벌레류 해충 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자
A. 개관
딱정벌레류 해충의 방제에 유용한 핵산 분자가 본원에 기재된다. 기재된 핵산 분자는 표적 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 천연 유전자, 및 비-코딩 폴리뉴클레오티드), dsRNA, siRNA, shRNA, hpRNA, 및 miRNA를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 딱정벌레류 해충에서의 1종 이상의 천연 핵산의 모두 또는 일부에 특이적으로 상보적일 수 있는 dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, 및/또는 hpRNA 분자가 기재된다. 이들 및 추가 실시양태에서, 천연 핵산(들)은 1종 이상의 표적 유전자(들)일 수 있고, 그의 산물은, 예를 들어 및 비제한적으로: 생식 과정에 수반될 수 있거나 또는 유충 발생에 수반될 수 있다. 본원에 기재된 핵산 분자는 핵산 분자가 특이적으로 상보적인 적어도 1종의 천연 핵산(들)을 포함하는 세포 내로 (예를 들어, 모 전달을 통해) 도입된 경우에, 세포에서 RNAi를 개시할 수 있고, 결과적으로 천연 핵산(들)의 발현을 감소 또는 제거할 수 있다. 일부 예에서, 특이적으로 상보적인 핵산 분자에 의한 표적 유전자의 발현의 감소 또는 제거는 딱정벌레류 해충에서의 생식, 및/또는 해충의 자손에서의 성장, 발생, 및/또는 섭식의 감소 또는 중지를 유발할 수 있다. 이들 방법은 iRNA 분자와 접촉하는 해충(들)에서의 사멸을 직접적으로 유발하지 않으면서, 침입시에 후속 해충 세대의 크기를 유의하게 감소시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 딱정벌레류 해충에서의 적어도 1종의 표적 유전자가 선택될 수 있으며, 여기서 표적 유전자는 hunchback 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정한 예에서, 딱정벌레류 해충에서의 표적 유전자가 선택되며, 여기서 표적 유전자는 서열식별번호: 1, 3, 및 67 중에서 선택된 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
서부 옥수수 뿌리벌레 hunchback은 1955 bp 및 573개의 아미노산 (HUNCHBACK 단백질)의 서열을 나타낸다. 이 서열 내에서, 6종의 C2H2 유형 아연 핑거 도메인은 아연 핑거 전사 인자로서의 그의 역할과 일치하게 위치 226-248, 255-277, 283-305, 311-335, 520-542, 및 548-572에서 예측되었다. 예를 들어, 문헌 [Tautz et al. (1987) Nature 327:383-9]을 참조한다. NCBI 데이터베이스에서 BLASTp 알고리즘을 사용하여 검색하였을 때, 가장 유사한 서열은 트리볼리움 카스타네움으로부터의 것이었고, 그것은 단지 53 퍼센트 서열 동일성만을 나타냈다.
일부 실시양태에서, 표적 유전자는 hunchback 폴리뉴클레오티드의 단백질 산물의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 85% 동일한 (예를 들어, 적어도 84%, 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 약 100%, 또는 100% 동일한) 인접 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로 인 실리코 역번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자일 수 있다. 표적 유전자는 딱정벌레류 해충에서의 임의의 핵산일 수 있으며, 그의 전사후 억제는 해충이 생존 자손을 생산하는 능력에 대해 유해 효과를 나타내어, 예를 들어 식물에게 해충에 대한 보호 이익을 제공한다. 특정한 예에서, 표적 유전자는 서열식별번호: 2의 인 실리코 번역 산물인 아미노산 서열에 대해 적어도 약 85% 동일한, 약 90% 동일한, 약 95% 동일한, 약 96% 동일한, 약 97% 동일한, 약 98% 동일한, 약 99% 동일한, 약 100% 동일한, 또는 100% 동일한 인접 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로 인 실리코 역번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자이다.
일부 실시양태에서, 딱정벌레류 해충에서의 코딩 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 천연 RNA 분자의 모두 또는 일부에 특이적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 RNA 분자를 발현을 통해 생성하는 DNA가 제공된다. 일부 실시양태에서, 발현된 RNA 분자가 딱정벌레류 해충에 의해 섭취된 후에, 해충의 세포에서 또는 해충의 자손의 세포에서 코딩 폴리뉴클레오티드의 하향-조절이 얻어질 수 있다. 특정한 실시양태에서, 딱정벌레류 해충의 세포에서의 코딩 폴리뉴클레오티드의 하향-조절은 해충에서의 생식 및/또는 증식, 및/또는 해충의 자손에서의 성장, 발생, 및/또는 섭식의 감소 또는 중지를 유발할 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 전사된 비-코딩 RNA, 예컨대 5'UTR; 3'UTR; 스플라이싱된 리더; 인트론; 아우트론 (예를 들어, 트랜스 스플라이싱으로 후속 변형되는 5'UTR RNA); 도나트론 (예를 들어, 트랜스 스플라이싱을 위한 공여자 서열을 제공하는데 요구되는 비-코딩 RNA); 및 표적 딱정벌레류 해충 유전자의 다른 비-코딩 전사된 RNA를 포함한다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 모노-시스트론 및 폴리-시스토론 유전자 둘 다로부터 유래될 수 있다.
따라서, 또한 본원에는 일부 실시양태와 관련하여 딱정벌레류 해충에서의 표적 핵산의 모두 또는 일부에 특이적으로 상보적인 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 iRNA 분자 (예를 들어, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, 및 hpRNA)가 기재된다. 일부 실시양태에서, iRNA 분자는 복수종의 표적 핵산; 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10종 또는 그 초과의 표적 핵산의 모두 또는 일부에 상보적인 폴리뉴클레오티드(들)를 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, iRNA 분자는 유전자 변형된 유기체, 예컨대 식물 또는 박테리아에 의해 시험관내 또는 생체내에서 생산될 수 있다. 또한, 딱정벌레류 해충에서의 표적 핵산의 모두 또는 일부에 특이적으로 상보적인 dsRNA 분자, siRNA 분자, miRNA 분자, shRNA 분자, 및/또는 hpRNA 분자의 생산에 사용될 수 있는 cDNA가 개시된다. 특정한 숙주 표적의 안정한 형질전환을 달성하는데 사용하기 위한 재조합 DNA 구축물이 추가로 기재된다. 형질전환된 숙주 표적은 재조합 DNA 구축물로부터 dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, 및/또는 hpRNA 분자를 유효 수준으로 발현할 수 있다. 따라서, 또한 식물 세포에서 기능적인 이종 프로모터에 작동가능하게 연결된 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물 형질전환 벡터이며, 여기서 폴리뉴클레오티드(들)의 발현은 딱정벌레류 해충에서의 표적 핵산의 모두 또는 일부에 특이적으로 상보적인 인접 핵염기의 스트링을 포함하는 RNA 분자를 생성하는 것인, 식물 형질전환 벡터가 기재된다.
특정한 예에서, 딱정벌레류 해충의 방제에 유용한 핵산 분자는 다음을 포함할 수 있다: hunchback 폴리뉴클레오티드를 포함하는 디아브로티카로부터 단리된 천연 핵산의 모두 또는 일부 (예를 들어, 서열식별번호: 1, 3, 및 67 중 어느 것); 발현된 경우에, hunchback에 의해 코딩되는 천연 RNA 분자의 모두 또는 일부에 특이적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 RNA 분자를 생성하는 DNA; hunchback에 의해 코딩되는 RNA 분자의 모두 또는 일부에 특이적으로 상보적인 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 iRNA 분자 (예를 들어, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, 및 hpRNA); hunchback에 의해 코딩되는 RNA 분자의 모두 또는 일부에 특이적으로 상보적인 dsRNA 분자, siRNA 분자, miRNA 분자, shRNA 분자, 및/또는 hpRNA 분자의 생산에 사용될 수 있는 cDNA; 및 특정한 숙주 표적의 안정한 형질전환을 달성하는데 사용하기 위한 재조합 DNA 구축물 (여기서 형질전환된 숙주 표적은 상기 핵산 분자 중 1종 이상을 포함함).
B. 핵산 분자
본 발명은 특히 딱정벌레류 해충의 세포, 조직, 또는 기관에서의 표적 유전자 발현을 억제하는 iRNA (예를 들어, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, 및 hpRNA) 분자; 및 세포 또는 미생물에서 딱정벌레류 해충의 세포, 조직, 또는 기관에서의 표적 유전자 발현을 억제하는 iRNA 분자로서 발현될 수 있는 DNA 분자를 제공한다.
본 발명의 일부 실시양태는 서열식별번호: 1; 서열식별번호: 1의 상보체; 서열식별번호: 1의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드 (예를 들어, 적어도 19개의 인접 뉴클레오티드)의 단편 (예를 들어, 서열식별번호: 3 및 서열식별번호: 67); 서열식별번호: 1의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체; 서열식별번호: 1을 포함하는 디아브로티카 유기체 (예를 들어, WCR)의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드; 서열식별번호: 1을 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드의 상보체; 서열식별번호: 1을 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 및 서열식별번호: 1을 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종 (예를 들어, 1, 2, 3종 또는 그 초과)의 폴리뉴클레오티드(들)를 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 특정한 실시양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드의 딱정벌레류 해충과의 접촉 또는 그에 의한 흡수는 해충의 성장, 발생, 생식 및/또는 섭식을 억제한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 단리된 핵산 분자는 서열식별번호: 70; 서열식별번호: 70의 상보체; 서열식별번호: 71; 서열식별번호: 71의 상보체; 서열식별번호: 72; 서열식별번호: 72의 상보체; 서열식별번호: 73; 서열식별번호: 73의 상보체; 서열식별번호: 70, 71, 및 73 중 어느 것의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 서열식별번호: 70, 71, 및 73 중 어느 것의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체; 서열식별번호: 1을 포함하는 유전자로부터 디아브로티카 유기체에서 전사된 천연 폴리리보뉴클레오티드; 서열식별번호: 1을 포함하는 유전자로부터 디아브로티카 유기체에서 전사된 천연 폴리리보뉴클레오티드의 상보체; 서열식별번호: 1을 포함하는 유전자로부터 디아브로티카 유기체에서 전사된 천연 폴리리보뉴클레오티드의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 및 서열식별번호: 1을 포함하는 유전자로부터 디아브로티카 유기체에서 전사된 천연 폴리리보뉴클레오티드의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종 (예를 들어, 1, 2, 3종 또는 그 초과)의 폴리뉴클레오티드(들)를 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드의 딱정벌레류 해충과의 접촉 또는 그에 의한 흡수는 해충의 성장, 발생, 생식 및/또는 섭식을 억제한다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 핵산 분자는 세포 또는 미생물에서 딱정벌레류 해충의 세포, 조직, 또는 기관에서의 표적 유전자 발현을 억제하는 iRNA 분자로서 발현될 수 있는 적어도 1종 (예를 들어, 1, 2, 3종 또는 그 초과)의 DNA(들)를 포함할 수 있다. 이러한 DNA(들)는 dsRNA 분자(들)를 형성할 수 있는 코딩된 RNA의 전사를 개시 또는 증진시키는 DNA 분자를 포함하는 세포에서 기능하는 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 한 실시양태에서, 적어도 1종 (예를 들어, 1, 2, 3종 또는 그 초과)의 DNA(들)는 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드로부터 유래될 수 있다. 서열식별번호: 1의 유도체는 서열식별번호: 1의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 단편은, 예를 들어 서열식별번호: 1의 적어도 약 15개의 인접 뉴클레오티드, 또는 그의 상보체를 포함할 수 있다. 따라서, 이러한 단편은, 예를 들어, 서열식별번호: 1의 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200개 또는 그 초과의 인접 뉴클레오티드, 또는 그의 상보체를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 이러한 단편은, 예를 들어 서열식별번호: 1의 적어도 19개의 인접 뉴클레오티드 (예를 들어, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개의 인접 뉴클레오티드), 또는 그의 상보체를 포함할 수 있다.
일부 실시양태는 부분적- 또는 완전-안정화된 dsRNA 분자를 딱정벌레류 해충 내로 도입하여 딱정벌레류 해충의 세포, 조직, 또는 기관에서의 표적 유전자 발현을 억제하는 것을 포함한다. iRNA 분자 (예를 들어, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, 및 hpRNA)로서 발현되고, 딱정벌레류 해충에 의해 흡수된 경우에, 서열식별번호: 1, 3, 및 67 중 어느 것의 1종 이상의 단편; 및 그의 상보체를 포함하는 폴리뉴클레오티드는 사멸, 발생 정지, 성장 억제, 성비의 변화, 한배새끼 크기의 감소, 감염의 중지, 및/또는 딱정벌레류 해충에 의한 섭식의 중지 중 1종 이상을 야기할 수 있다. 특정한 예에서, 서열식별번호: 1, 3, 및 67 중 어느 것의 1종 이상의 단편 (예를 들어, 약 15 내지 약 300개의 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드); 및 그의 상보체를 포함하는 폴리뉴클레오티드는 해충의 후속 세대를 생산하는 해충의 기존 세대의 능력의 감소를 야기한다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 의해 제공된 dsRNA 분자는 서열식별번호: 1, 3, 46, 및/또는 67을 포함하는 표적 유전자로부터의 전사체에 상보적인 폴리뉴클레오티드, 및/또는 서열식별번호: 1, 3, 46, 및/또는 67의 단편에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 딱정벌레류 해충에서의 상기 표적 유전자의 억제는 해충 또는 해충의 자손의 성장, 발생, 또는 다른 생물학적 기능에 필수적인 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 작용제의 감소 또는 제거를 유발한다. 선택된 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 1, 3, 46, 및/또는 67, 서열식별번호: 1, 3, 46, 및/또는 67의 인접 단편, 또는 상기 중 어느 것의 상보체에 대해 약 80% 내지 약 100% 서열 동일성을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 선택된 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 1, 3, 46, 및/또는 67, 서열식별번호: 1, 3, 46, 및/또는 67의 인접 단편, 또는 상기 중 어느 것의 상보체에 대해 79%; 80%; 약 81%; 약 82%; 약 83%; 약 84%; 약 85%; 약 86%; 약 87%; 약 88%; 약 89%; 약 90%; 약 91%; 약 92%; 약 93%; 약 94% 약 95%; 약 96%; 약 97%; 약 98%; 약 98.5%; 약 99%; 약 99.5%; 또는 약 100% 서열 동일성을 나타낼 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포 또는 미생물에서 표적 유전자 발현을 억제하는 iRNA 분자로서 발현될 수 있는 DNA 분자는 1종 이상의 표적 딱정벌레류 해충 종에서 발견되는 천연 폴리뉴클레오티드의 모두 또는 일부에 특이적으로 상보적인 단일 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있거나, 또는 DNA 분자는 복수종의 이러한 특이적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드로부터의 키메라로서 구축될 수 있다.
다른 실시양태에서, 핵산 분자는 "링커"에 의해 이격되어 있는 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 링커는, 목적하는 경우에, 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드 사이의 2차 구조 형성을 용이하게 하는 임의의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 영역일 수 있다. 한 실시양태에서, 링커는 mRNA에 대한 센스 또는 안티센스 코딩 폴리뉴클레오티드의 일부이다. 대안적으로, 링커는 핵산 분자에 공유적으로 연결될 수 있는 뉴클레오티드 또는 그의 상동체의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 링커는 인트론 (예를 들어, ST-LS1 인트론으로서)을 포함할 수 있다.
예를 들어, 일부 실시양태에서, DNA 분자는 1종 이상의 상이한 RNA 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 여기서 각각의 상이한 RNA 분자는 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드는 서로에 상보적이다. 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드는 RNA 분자 내에서 링커에 의해 연결될 수 있다. 링커는 제1 폴리뉴클레오티드 또는 제2 폴리뉴클레오티드의 일부를 구성할 수 있다. 제1 및 제2 뉴클레오티드 폴리뉴클레오티드를 포함하는 RNA 분자의 발현은 제1 및 제2 뉴클레오티드 폴리뉴클레오티드의 특이적 분자내 염기-쌍형성에 의해 본 발명의 dsRNA 분자의 형성으로 이어질 수 있다. 제1 폴리뉴클레오티드 또는 제2 폴리뉴클레오티드는 딱정벌레류 해충에 천연인 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 표적 유전자, 또는 전사된 비-코딩 폴리뉴클레오티드), 그의 유도체, 또는 그에 상보적인 폴리뉴클레오티드에 대해 실질적으로 동일할 수 있다.
dsRNA 핵산 분자는 중합된 리보뉴클레오티드의 이중 가닥을 포함하고, 포스페이트-당 백본 또는 뉴클레오시드에 대한 변형을 포함할 수 있다. RNA 구조에서의 변형은 특이적 억제가 가능하도록 맞추어질 수 있다. 한 실시양태에서, dsRNA 분자는 편재하는 효소적 방법을 통해 변형될 수 있어 siRNA 분자가 생성되도록 할 수 있다. 이 효소적 방법은 시험관내 또는 생체내에서 RNase III 효소, 예컨대 진핵생물에서는 DICER를 이용할 수 있다. 문헌 [Elbashir et al. (2001) Nature 411:494-8; 및 Hamilton and Baulcombe (1999) Science 286(5441):950-2]을 참조한다. DICER 또는 기능적 등가 RNase III 효소는 보다 큰 dsRNA 가닥 및/또는 hpRNA 분자를, 각각이 약 19-25개의 뉴클레오티드 길이인 보다 작은 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, siRNA)로 절단한다. 이들 효소에 의해 생산된 siRNA 분자는 2 내지 3개의 뉴클레오티드 3' 오버행, 및 5' 포스페이트 및 3' 히드록실 말단을 갖는다. RNase III 효소에 의해 생성된 siRNA 분자는 풀려있고, 세포에서 단일 가닥 RNA로 분리된다. 이어서, siRNA 분자는 표적 유전자로부터 전사된 RNA와 특이적으로 혼성화되고, 후속적으로 둘 다의 RNA 분자는 고유한 세포 RNA-분해 메카니즘에 의해 분해된다. 이 과정은 표적 유기체에서의 표적 유전자에 의해 코딩된 RNA의 효과적 분해 또는 제거를 유발할 수 있다. 결과는 표적화된 유전자의 전사후 침묵이다. 일부 실시양태에서, 내인성 RNase III 효소에 의해 이종 핵산 분자로부터 생산된 siRNA 분자는 딱정벌레류 해충에서의 표적 유전자의 하향-조절을 효율적으로 매개할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 핵산 분자는 분자간 혼성화를 통해 생체내에서 dsRNA 분자를 형성할 수 있는 단일 가닥 RNA 분자로 전사될 수 있는 적어도 1종의 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 이러한 dsRNA는 전형적으로 자기-조립될 수 있고, 표적 유전자의 전사후 억제를 달성하기 위해 딱정벌레류 해충의 영양 공급원으로 제공될 수 있다. 이들 및 추가 실시양태에서, 본 발명의 핵산 분자는, 각각 딱정벌레류 해충에서의 상이한 표적 유전자에 특이적으로 상보적인 상이한 2종의 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이러한 핵산 분자가 dsRNA 분자로서 딱정벌레류 해충에게 제공되는 경우에, dsRNA 분자는 해충에서의 적어도 2종의 상이한 표적 유전자의 발현을 억제한다.
C. 핵산 분자 수득
딱정벌레류 해충에서의 다양한 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 핵산 분자, 예컨대 iRNA 및 iRNA를 코딩하는 DNA 분자의 설계를 위한 표적으로서 사용될 수 있다. 그러나, 천연 폴리뉴클레오티드의 선택은 간단한 과정이 아니다. 딱정벌레류 해충에서의 단지 소수의 천연 폴리뉴클레오티드만이 효과적인 표적일 것이다. 예를 들어, 특정한 천연 폴리뉴클레오티드가 본 발명의 핵산 분자에 의해 효과적으로 하향-조절될 수 있는지 여부, 또는 특정한 천연 폴리뉴클레오티드의 하향-조절이 딱정벌레류 해충의 성장, 생존율, 증식, 및/또는 생식에 대해 유해 효과를 나타낼 수 있는지 여부는 확신을 가지고 예측할 수 없다. 대다수의 천연 딱정벌레류 해충 폴리뉴클레오티드, 예컨대 이들로부터 단리된 EST (예를 들어, 미국 특허 7,612,194에 열거된 딱정벌레류 해충 폴리뉴클레오티드)는 해충의 성장, 생존율, 증식, 및/또는 생식에 대해 유해 효과를 나타내지 않는다. 딱정벌레류 해충에 대해 유해 효과를 나타낼 수 있는 천연 폴리뉴클레오티드 중 어느 것이 숙주 식물에서 이러한 천연 폴리뉴클레오티드에 상보적인 핵산 분자를 발현하고 숙주 식물에는 해를 끼치지 않으면서 해충이 섭식하였을 때에 그에 대해 유해 효과를 제공하기 위한 재조합 기술에 사용될 수 있는지를 예측하는 것은 불가능하다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 핵산 분자 (예를 들어, 딱정벌레류 해충의 숙주 식물에 제공될 dsRNA 분자)는, 예컨대 대사 또는 이화 생화학적 경로, 세포 분열, 생식, 에너지 대사, 배아 발생, 유충 발생, 전사 조절 등에 수반되는 폴리펩티드와 같이, 딱정벌레류 해충 생식 및/또는 발생에 필수적인 단백질 또는 단백질의 일부를 코딩하는 cDNA를 표적화하는 것으로 선택된다. 본원에 기재된 바와 같이, 1종 이상의 dsRNA (이의 적어도 1개의 절편은 표적 해충 유기체의 세포에서 생산된 RNA의 적어도 실질적으로 동일한 절편에 특이적으로 상보적임)를 함유하는 조성물이 표적 유기체에 의해 섭취되면 교미하거나, 알을 낳거나, 또는 생존 자손을 생산하는 능력의 실패 또는 감소를 유발할 수 있다. 딱정벌레류 해충으로부터 유래된 DNA 또는 RNA인 폴리뉴클레오티드를 사용하여 해충에 의한 침입에 대해 저항성인 식물 세포를 구축할 수 있다. 예를 들어, 딱정벌레류 해충의 숙주 식물 (예를 들어, 지. 메이스)은 본원에 제공된 바와 같은 딱정벌레류 해충으로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 중 1종 이상을 함유하도록 형질전환될 수 있다. 숙주 내로 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 형질전환된 숙주 내의 세포에서 또는 생물학적 유체에서 dsRNA 구조로 형성되는 1종 이상의 RNA를 코딩할 수 있고, 이에 따라 해충이 트랜스제닉 숙주와 영양적 관계를 맺게 되면/그러한 때에 dsRNA는 이용가능하다. 이는 해충의 세포에서의 1종 이상의 유전자의 발현의 억제, 및 궁극적으로 생식 및/또는 발생의 억제를 유발할 수 있다.
대안적 실시양태에서, 본질적으로 딱정벌레류 해충의 성장, 발생 및 생식에 수반되는 유전자가 표적화된다. 본 발명에서 사용하기 위한 다른 표적 유전자는, 예를 들어 딱정벌레류 해충 생존율, 운동, 이동, 성장, 발생, 감염성, 및 섭식 장소 확립에서 중요한 역할을 하는 것을 포함할 수 있다. 따라서, 표적 유전자는 하우스키핑 유전자 또는 전사 인자일 수 있다. 추가적으로, 본 발명에서 사용하기 위한 천연 딱정벌레류 해충 폴리뉴클레오티드는 또한 식물, 바이러스, 박테리아 또는 곤충 유전자의 상동체 (예를 들어, 오르토로그)로부터 유래될 수 있으며, 그의 기능은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 그의 폴리뉴클레오티드는 표적 딱정벌레류 해충의 게놈 중 표적 유전자와 특이적으로 혼성화가능하다. 혼성화에 의해 공지된 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자의 상동체를 확인하는 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 iRNA (예를 들어, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, 및 hpRNA) 분자를 생산하기 위한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자를 수득하는 방법을 제공한다. 하나의 이러한 실시양태는 (a) 딱정벌레류 해충에서 dsRNA-매개 유전자 억제시에 1종 이상의 표적 유전자(들)를 그의 발현, 기능, 및 표현형에 대해 분석하는 단계; (b) dsRNA-매개 억제 분석에서 변경된 (예를 들어 감소된) 생식 또는 발생 표현형을 나타내는 표적화된 딱정벌레류 해충으로부터의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상동체의 모두 또는 일부분을 포함하는 프로브로 cDNA 또는 gDNA 라이브러리를 프로빙하는 단계; (c) 프로브와 특이적으로 혼성화되는 DNA 클론을 확인하는 단계; (d) 단계 (b)에서 확인된 DNA 클론을 단리하는 단계; (e) 단계 (d)에서 단리된 클론을 포함하는 cDNA 또는 gDNA 단편을 서열분석하며, 여기서 서열분석된 핵산 분자는 RNA 또는 그의 상동체의 모두 또는 상당 부분을 포함하는 것인 단계; 및 (f) 유전자, 또는 siRNA, miRNA, hpRNA, mRNA, shRNA, 또는 dsRNA의 모두 또는 상당 부분을 화학적으로 합성하는 단계를 포함한다.
추가 실시양태에서, iRNA (예를 들어, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, 및 hpRNA) 분자의 상당 부분을 생산하기 위한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 단편을 수득하는 방법은 (a) 표적화된 딱정벌레류 해충으로부터의 천연 폴리뉴클레오티드의 일부분에 특이적으로 상보적인 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드 프라이머를 합성하는 단계; 및 (b) 단계 (a)의 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 클로닝 벡터에 존재하는 cDNA 또는 gDNA 삽입물을 증폭시키며, 여기서 증폭된 핵산 분자는 siRNA, miRNA, hpRNA, mRNA, shRNA, 또는 dsRNA 분자의 상당 부분을 포함하는 것인 단계를 포함한다.
본 발명의 핵산은 수많은 접근법에 의해 단리, 증폭, 또는 생산될 수 있다. 예를 들어, iRNA (예를 들어, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, 및 hpRNA) 분자는 gDNA 또는 cDNA 라이브러리로부터 유래된 표적 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 표적 유전자 또는 표적 전사된 비-코딩 폴리뉴클레오티드) 또는 그의 부분의 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다. DNA 또는 RNA는 표적 유기체로부터 추출될 수 있고, 핵산 라이브러리는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법을 사용하여 그로부터 제조될 수 있다. 표적 유기체로부터 생성된 gDNA 또는 cDNA 라이브러리는 표적 유전자의 PCR 증폭 및 서열분석에 사용될 수 있다. 확인된 PCR 산물은 시험관내 전사를 위한 주형으로서 사용되어 최소 프로모터로 센스 및 안티센스 RNA가 생성될 수 있다. 대안적으로, 핵산 분자는 자동화 DNA 합성기 (예를 들어, 피.이. 바이오시스템즈, 인크.(P.E. Biosystems, Inc.) (캘리포니아주 포스터 시티) 모델 392 또는 394 DNA/RNA 합성기)를 사용하는 것, 표준 화학, 예컨대 포스포르아미다이트 화학을 사용하는 것을 포함한 임의의 수많은 기술에 의해 합성될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Ozaki et al. (1992) Nucleic Acids Research, 20: 5205-5214; 및 Agrawal et al. (1990) Nucleic Acids Research, 18: 5419-5423] 참조). 예를 들어, 문헌 [Beaucage et al. (1992) Tetrahedron, 48: 2223-2311]; 미국 특허 4,980,460, 4,725,677, 4,415,732, 4,458,066, 및 4,973,679를 참조한다. 비-천연 백본 기, 예컨대 포스포로티오에이트, 포스포르아미다이트 등을 생성하는 대안적 화학이 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 RNA, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, 또는 hpRNA 분자는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 수동 또는 자동 반응을 통해, 또는 생체내 RNA, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, 또는 hpRNA 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자를 포함하는 세포에서 화학적으로 또는 효소적으로 생산될 수 있다. RNA는 또한 부분적 또는 총 유기 합성에 의해 생산될 수 있고; 임의의 변형된 리보뉴클레오티드는 시험관내 효소적 또는 유기 합성에 의해 도입될 수 있다. RNA 분자는 세포 RNA 폴리머라제 또는 박테리오파지 RNA 폴리머라제 (예를 들어, T3 RNA 폴리머라제, T7 RNA 폴리머라제, 및 SP6 RNA 폴리머라제)에 의해 합성될 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 클로닝 및 발현에 유용한 발현 구축물은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 국제 PCT 공개 번호 WO97/32016; 및 미국 특허 5,593,874, 5,698,425, 5,712,135, 5,789,214, 및 5,804,693을 참조한다. 화학적으로 또는 시험관내 효소적 합성에 의해 합성되는 RNA 분자는 세포 내로 도입되기 전에 정제될 수 있다. 예를 들어, RNA 분자는 용매 또는 수지를 사용한 추출, 침전, 전기영동, 크로마토그래피, 또는 그의 조합에 의해 혼합물로부터 정제될 수 있다. 대안적으로, 화학적으로 또는 시험관내 효소적 합성에 의해 합성되는 RNA 분자는, 예를 들어 샘플 프로세싱에 기인한 손실을 피하기 위해 정제 없이 또는 최소의 정제로 사용될 수 있다. RNA 분자는 보관을 위해 건조될 수 있거나 또는 수용액 중에 용해될 수 있다. 용액은 dsRNA 분자 듀플렉스 가닥의 어닐링 및/또는 안정화를 촉진하기 위해 완충제 또는 염을 함유할 수 있다.
실시양태에서, dsRNA 분자는 단일 자기-상보적 RNA 가닥에 의해 또는 2개의 상보적 RNA 가닥으로부터 형성될 수 있다. dsRNA 분자는 생체내 또는 시험관내에서 합성될 수 있다. 세포의 내인성 RNA 폴리머라제는 생체내에서 1 또는 2개 RNA 가닥의 전사를 매개할 수 있거나, 또는 클로닝된 RNA 폴리머라제는 생체내 또는 시험관내에서 전사를 매개하는데 사용될 수 있다. 딱정벌레류 해충에서의 표적 유전자의 전사후 억제는 (예를 들어, 조직-특이적 프로모터의 사용에 의해) 숙주의 기관, 조직, 또는 세포 유형에서의 특이적 전사에 의해; (예를 들어, 감염, 스트레스, 온도, 및/또는 화학 유도제에 대해 반응성인 유도성 프로모터의 사용에 의해) 숙주에서의 환경 조건의 자극에 의해; 및/또는 (예를 들어, 발생 단계-특이적 프로모터의 사용에 의해) 숙주의 발생 단계 또는 연령에서의 전사 조작 의해 숙주-표적화될 수 있다. 시험관내 또는 생체내에서 전사되었든지 간에, dsRNA 분자를 형성하는 RNA 가닥은 폴리아데닐화될 수 있거나 또는 그럴 수 없고, 세포의 번역 기구에 의해 폴리펩티드로 번역될 수 있거나 또는 그럴 수 없다.
D. 재조합 벡터 및 숙주 세포 형질전환
일부 실시양태에서, 본 발명은 또한 세포 (예를 들어, 박테리아 세포, 효모 세포, 또는 식물 세포) 내로 도입시키기 위한 DNA 분자이며, RNA로 발현되어 딱정벌레류 해충에 의해 섭취되었을 때, 해충의 세포, 조직, 또는 기관에서의 표적 유전자의 억제를 달성하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 DNA 분자를 제공한다. 따라서, 일부 실시양태는 식물 세포에서 딱정벌레류 해충에서의 표적 유전자 발현을 억제하는 iRNA (예를 들어, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, 및 hpRNA) 분자로서 발현될 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 핵산 분자를 제공한다. 발현을 개시 또는 증진시키기 위해, 이러한 재조합 핵산 분자는 1종 이상의 조절 요소를 포함할 수 있으며, 이 조절 요소는 iRNA로서 발현될 수 있는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결될 수 있다. 식물에서 유전자 억제 분자를 발현하는 방법은 공지되어 있고, 이를 사용하여 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 발현할 수 있다. 예를 들어, 국제 PCT 공개 번호 WO06/073727; 및 미국 특허 공개 번호 2006/0200878 Al을 참조한다.
구체적 실시양태에서, 본 발명의 재조합 DNA 분자는 dsRNA 분자를 형성할 수 있는 RNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이러한 재조합 DNA 분자는 섭취시에 딱정벌레류 해충 세포에서의 내인성 표적 유전자(들)의 발현을 억제할 수 있는 dsRNA 분자를 형성할 수 있는 RNA를 코딩할 수 있다. 많은 실시양태에서, 전사된 RNA는 안정화된 형태로; 예를 들어 헤어핀 및 스템 및 루프 구조로 제공될 수 있는 dsRNA 분자를 형성할 수 있다.
일부 실시양태에서, dsRNA 분자의 한 가닥은 서열식별번호: 1, 3, 46, 및 67; 서열식별번호: 1, 3, 46, 및/또는 67의 상보체; 서열식별번호: 1, 3, 46, 및/또는 67의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 서열식별번호: 1, 3, 46, 및/또는 67의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체; 서열식별번호: 1, 3, 및/또는 67을 포함하는 디아브로티카 유기체 (예를 들어, WCR)의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드; 서열식별번호: 1, 3, 및/또는 67을 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드의 상보체; 서열식별번호: 1, 3, 및/또는 67을 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 및 서열식별번호: 1, 3, 및/또는 67을 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 RNA에 대해 실질적으로 상동인 폴리뉴클레오티드로부터의 전사에 의해 형성될 수 있다.
특정 실시양태에서, dsRNA 분자를 형성할 수 있는 RNA를 코딩하는 재조합 DNA 분자는, 적어도 2종의 폴리뉴클레오티드가 적어도 1종의 프로모터에 대해 한 폴리뉴클레오티드는 센스 배향이고 다른 폴리뉴클레오티드는 안티센스 배향이도록 배열되고, 센스 폴리뉴클레오티드 및 안티센스 폴리뉴클레오티드가, 예를 들어 약 5 (~5) 내지 약 1000 (~1000)개의 뉴클레오티드의 링커에 의해 연결 또는 결합되어 있는 코딩 영역을 포함할 수 있다. 링커는 센스 및 안티센스 폴리뉴클레오티드 사이에 루프를 형성할 수 있다. 센스 폴리뉴클레오티드 또는 안티센스 폴리뉴클레오티드는 표적 유전자 (예를 들어, 서열식별번호: 1을 포함하는 hunchback 유전자) 또는 그의 단편에 의해 코딩된 RNA에 대해 실질적으로 상동일 수 있다. 그러나, 일부 실시양태에서, 재조합 DNA 분자는 링커가 없는 dsRNA 분자를 형성할 수 있는 RNA를 코딩할 수 있다. 실시양태에서, 센스 코딩 폴리뉴클레오티드 및 안티센스 코딩 폴리뉴클레오티드는 상이한 길이일 수 있다.
딱정벌레류 해충에 대해 유해 효과를 나타내거나 또는 딱정벌레류 해충과 관련하여 식물-보호 효과를 나타내는 것으로 확인된 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 재조합 핵산 분자에서 적절한 발현 카세트의 생성을 통해 발현된 dsRNA 분자 내로 용이하게 혼입될 수 있다. 예를 들어, 이러한 폴리뉴클레오티드는 표적 유전자 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 서열식별번호: 1, 및 그의 단편을 포함하는 hunchback 유전자)에 의해 코딩된 RNA에 상응하는 제1 절편을 취하고; 이 폴리뉴클레오티드를, 제1 절편에 상동 또는 상보적이 아닌 제2 절편 링커 영역에 연결하고; 이것을 제3 절편에 연결하며, 여기서 제3 절편의 적어도 일부분은 제1 절편에 실질적으로 상보적인 것에 의해 스템 및 루프 구조를 갖는 헤어핀으로서 발현될 수 있다. 이러한 구축물은 제1 절편과 제3 절편과의 분자내 염기-쌍형성에 의해 스템 및 루프 구조를 형성하며, 여기서 제2 절편을 포함하는 루프 구조가 형성된다. 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2002/0048814 및 2003/0018993; 및 국제 PCT 공개 번호 WO94/01550 및 WO98/05770을 참조한다. dsRNA 분자는, 예를 들어 이중-가닥 구조의 형태로, 예컨대 스템-루프 구조 (예를 들어, 헤어핀)로 생성될 수 있고, 이에 의해 천연 딱정벌레류 해충 폴리뉴클레오티드에 대해 표적화된 siRNA의 생산은, 예를 들어 추가의 식물 발현가능한 카세트 상에서 표적화된 유전자의 단편의 공동-발현에 의해 증진되어, 증진된 siRNA 생산으로 이어지거나 또는 메틸화가 감소되어 dsRNA 헤어핀 프로모터의 전사 유전자 침묵이 방지된다.
본 발명의 실시양태는 본 발명의 재조합 핵산 분자를 식물 내로 도입 (즉, 형질전환)하여 1종 이상의 iRNA 분자의 딱정벌레류 해충-보호 수준의 발현을 달성하는 것을 포함한다. 재조합 DNA 분자는, 예를 들어 벡터, 예컨대 선형 또는 폐쇄 원형 플라스미드일 수 있다. 벡터 시스템은 단일 벡터 또는 플라스미드, 또는 숙주의 게놈 내로 도입될 총 DNA를 함께 함유하는 2종 이상의 벡터 또는 플라스미드일 수 있다. 추가로, 벡터는 발현 벡터일 수 있다. 본 발명의 핵산은, 예를 들어 적합하게는 1종 이상의 숙주에서 연결된 코딩 폴리뉴클레오티드 또는 다른 DNA 요소의 발현을 구동하도록 기능하는 적합한 프로모터의 제어 하의 벡터 내로 삽입될 수 있다. 이 목적을 위해 많은 벡터가 이용가능하고, 적절한 벡터의 선택은 벡터 내로 삽입될 핵산의 크기 및 벡터로 형질전환될 특정한 숙주 세포에 주로 좌우될 것이다. 각각의 벡터는 그의 기능 (예를 들어, DNA의 증폭 또는 DNA의 발현), 및 그와 상용성인 특정한 숙주 세포에 따라 다양한 성분을 함유한다.
트랜스제닉 식물에 딱정벌레류 해충으로부터의 보호를 부여하기 위해, 재조합 DNA는, 예를 들어 재조합 식물의 조직 또는 유체 내에서 iRNA 분자 (예를 들어, dsRNA 분자를 형성하는 RNA 분자)로 전사될 수 있다. iRNA 분자는 숙주 식물 종에게 손상을 야기할 수 있는 딱정벌레류 해충 내의 상응하는 전사된 폴리뉴클레오티드에 실질적으로 상동이고 그에 특이적으로 혼성화가능한 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 딱정벌레류 해충은, 예를 들어 iRNA 분자를 포함하는 트랜스제닉 숙주 식물의 세포 또는 유체를 섭취함으로써 트랜스제닉 숙주 식물의 세포에서 전사되는 iRNA 분자와 접촉할 수 있다. 따라서, 표적 유전자의 발현은 트랜스제닉 숙주 식물에 침입하는 딱정벌레류 해충 내에서의 iRNA 분자에 의해 억제된다. 일부 실시양태에서, 표적 딱정벌레류 해충에서의 표적 유전자의 발현의 억제는 식물이 해충에 의한 공격에 대해 저항성이 있도록 할 수 있다.
본 발명의 재조합 핵산 분자로 형질전환된 식물 세포와 영양적 관계를 맺고 있는 딱정벌레류 해충에게 iRNA 분자를 전달할 수 있도록 하기 위해서는, 식물 세포에서의 iRNA 분자의 발현 (즉, 전사)이 요구된다. 따라서, 재조합 핵산 분자는 숙주 세포, 예컨대 핵산 분자가 증폭되는 박테리아 세포 및 핵산 분자가 발현되는 식물 세포에서 기능하는 1종 이상의 조절 요소, 예컨대 이종 프로모터 요소에 작동가능하게 연결된 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 핵산 분자에서 사용하기에 적합한 프로모터로는 유도성, 바이러스성, 합성, 또는 구성적 프로모터를 포함하며, 이는 모두 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 이러한 프로모터를 기재하는 비제한적 예는 미국 특허 6,437,217 (메이즈 RS81 프로모터); 5,641,876 (벼 액틴 프로모터); 6,426,446 (메이즈 RS324 프로모터); 6,429,362 (메이즈 PR-1 프로모터); 6,232,526 (메이즈 A3 프로모터); 6,177,611 (구성적 메이즈 프로모터); 5,322,938, 5,352,605, 5,359,142, 및 5,530,196 (CaMV 35S 프로모터); 6,433,252 (메이즈 L3 올레오신 프로모터); 6,429,357 (벼 액틴 2 프로모터, 및 벼 액틴 2 인트론); 6,294,714 (광-유도성 프로모터); 6,140,078 (염-유도성 프로모터); 6,252,138 (병원체-유도성 프로모터); 6,175,060 (인 결핍-유도성 프로모터); 6,388,170 (양방향 프로모터); 6,635,806 (감마-코익신 프로모터); 및 미국 특허 공개 번호 2009/757,089 (메이즈 엽록체 알돌라제 프로모터)를 포함한다. 추가의 프로모터는 노팔린 신타제 (NOS) 프로모터 (Ebert et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(16):5745-9) 및 옥토핀 신타제 (OCS) 프로모터 (이는 아그로박테리움 투메파시엔스의 종양-유도 플라스미드 상에 운반됨); 콜리모바이러스 프로모터 예컨대 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 19S 프로모터 (Lawton et al. (1987) Plant Mol. Biol. 9:315-24); CaMV 35S 프로모터 (Odell et al. (1985) Nature 313:810-2); 피그워트 모자이크 바이러스 35S-프로모터 (Walker et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(19):6624-8); 수크로스 신타제 프로모터 (Yang and Russell (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4144-8); R 유전자 복합체 프로모터 (Chandler et al. (1989) Plant Cell 1:1175-83); 클로로필 a/b 결합 단백질 유전자 프로모터; CaMV 35S (미국 특허 5,322,938, 5,352,605, 5,359,142, 및 5,530,196); FMV 35S (미국 특허 6,051,753, 및 5,378,619); PC1SV 프로모터 (미국 특허 5,850,019); SCP1 프로모터 (미국 특허 6,677,503); 및 AGRtu.nos 프로모터 (진뱅크(GenBank)™ 수탁 번호 V00087; 문헌 [Depicker et al. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:561-73; Bevan et al. (1983) Nature 304:184-7])를 포함한다.
특정한 실시양태에서, 본 발명의 핵산 분자는 조직-특이적 프로모터, 예컨대 뿌리-특이적 프로모터를 포함한다. 뿌리-특이적 프로모터는 배타적으로 또는 우선적으로 뿌리 조직에서의 작동가능하게 연결된 코딩 폴리뉴클레오티드의 발현을 구동한다. 뿌리-특이 프로모터의 예는 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 5,110,732; 5,459,252 및 5,837,848; 및 문헌 [Opperman et al. (1994) Science 263:221-3; 및 Hirel et al. (1992) Plant Mol. Biol. 20:207-18]을 참조한다. 일부 실시양태에서, 상기 기재된 바와 같이, 본 발명에 따른 딱정벌레류 해충 방제를 위한 폴리뉴클레오티드 또는 단편은, 그 폴리뉴클레오티드 또는 단편에 대해 반대 전사 방향으로 배향되어 있으며 트랜스제닉 식물 세포에서 작동가능한 2종의 뿌리-특이적 프로모터 사이에 클로닝될 수 있고, 그 안에서 발현되어 트랜스제닉 식물 세포에서 RNA 분자를 생산할 수 있고, 이는 후속적으로 dsRNA 분자를 형성할 수 있다. 식물 조직에서 발현된 iRNA 분자는 딱정벌레류 해충에 의해 섭취되어 표적 유전자 발현의 억제가 달성되도록 할 수 있다.
임의로 관심 핵산 분자에 작동가능하게 연결될 수 있는 추가의 조절 요소는 프로모터 요소와 번역 리더 요소로서 기능하는 코딩 폴리뉴클레오티드 사이에 위치하는 5'UTR을 포함한다. 번역 리더 요소는 완전-프로세싱된 mRNA에 존재하며, 그것은 1차 전사체의 프로세싱, 및/또는 RNA 안정성에 영향을 미칠 수 있다. 번역 리더 요소의 예는 메이즈 및 페튜니아 열 쇼크 단백질 리더 (미국 특허 5,362,865), 식물 바이러스 코트 단백질 리더, 식물 루비스코 리더 등을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Turner and Foster (1995) Molecular Biotech. 3(3):225-36]을 참조한다. 5'UTR의 비제한적 예는 GmHsp (미국 특허 5,659,122); PhDnaK (미국 특허 5,362,865); AtAnt1; TEV (Carrington and Freed (1990) J. Virol. 64:1590-7); 및 AGRtunos (진뱅크™ 수탁 번호 V00087; 및 문헌 [Bevan et al. (1983) Nature 304:184-7])를 포함한다.
임의로 관심 핵산 분자에 작동가능하게 연결될 수 있는 추가의 조절 요소는 또한 3' 비-번역 요소, 3' 전사 종결 영역, 또는 폴리아데닐화 영역을 포함한다. 이들은 폴리뉴클레오티드의 하류에 위치한 유전 요소이며, 폴리아데닐화 신호, 및/또는 전사 또는 mRNA 프로세싱에 영향을 미칠 수 있는 다른 조절 신호를 제공하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 폴리아데닐화 신호는 식물에서 mRNA 전구체의 3' 말단에 대한 폴리아데닐레이트 뉴클레오티드의 부가를 야기하도록 기능한다. 폴리아데닐화 요소는 다양한 식물 유전자로부터, 또는 T-DNA 유전자로부터 유래될 수 있다. 3' 전사 종결 영역의 비제한적 예는 노팔린 신타제 3' 영역 (nos 3'; 문헌 [Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7])이다. 상이한 3' 비번역 영역의 사용 예는 문헌 [Ingelbrecht et al. (1989) Plant Cell 1:671-80]에 제공되어 있다. 폴리아데닐화 신호의 비제한적 예는 피숨 사티붐(Pisum sativum) RbcS2 유전자 (Ps.RbcS2-E9; 문헌 [Coruzzi et al. (1984) EMBO J. 3:1671-9]) 및 AGRtu.nos (진뱅크™ 수탁 번호 E01312)로부터의 것을 포함한다.
일부 실시양태는 본 발명의 1종 이상의 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 상기 기재된 조절 요소 중 적어도 1종을 포함하는 단리 및 정제된 DNA 분자를 포함하는 식물 형질전환 벡터를 포함할 수 있다. 발현된 경우에, 1종 이상의 폴리뉴클레오티드는 딱정벌레류 해충에서의 천연 RNA 분자의 모두 또는 일부에 특이적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 1종 이상의 RNA 분자(들)를 생성한다. 따라서, 폴리뉴클레오티드(들)는 표적화된 딱정벌레류 해충 RNA 전사체 내에 존재하는 폴리리보뉴클레오티드의 모두 또는 일부를 코딩하는 절편을 포함할 수 있고, 표적화된 해충 전사체의 모두 또는 일부의 역위 반복부를 포함할 수 있다. 식물 형질전환 벡터는 1종 초과의 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드를 함유할 수 있으며, 이에 따라 표적 딱정벌레류 해충의 1종 이상의 집단 또는 종의 세포에서의 2종 이상의 유전자의 발현을 억제하기 위한 1종 초과의 dsRNA가 생산될 수 있다. 상이한 유전자에 존재하는 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드의 절편은 트랜스제닉 식물에서의 발현을 위해 단일 조성 핵산 분자로 조합될 수 있다. 이러한 절편은 인접해 있을 수 있거나 또는 링커에 의해 이격되어 있을 수 있다.
다른 실시양태에서, 이미 본 발명의 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드(들)를 함유하는 본 발명의 플라스미드는 동일한 플라스미드에서 추가의 폴리뉴클레오티드(들)의 순차적 삽입에 의해 변형될 수 있으며, 여기서 추가의 폴리뉴클레오티드(들)는 원래의 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드(들)와 동일한 조절 요소에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 다중 표적 유전자의 억제를 위해 설계될 수 있다. 일부 실시양태에서, 억제될 다중 유전자는 동일한 딱정벌레류 해충 종으로부터 수득될 수 있으며, 이는 핵산 분자의 유효성을 증진시킬 수 있다. 다른 실시양태에서, 유전자는 상이한 곤충 (예를 들어, 딱정벌레류) 해충으로부터 유래될 수 있으며, 이는 작용제(들)가 유효한 해충의 범위를 확장할 수 있다. 억제를 위해 또는 발현 및 억제의 조합을 위해 다중 유전자가 표적화되는 경우에, 폴리시스트론 DNA 요소가 조작될 수 있다.
본 발명의 재조합 핵산 분자 또는 벡터는 식물 세포와 같은 형질전환된 세포 상에 선택가능한 표현형을 부여하는 선택 마커를 포함할 수 있다. 선택 마커는 본 발명의 재조합 핵산 분자를 포함하는 식물 또는 식물 세포를 선택하는데 또한 사용될 수 있다. 마커는 살생물제 저항성, 항생제 저항성 (예를 들어, 카나마이신, 제네티신 (G418), 블레오마이신, 히그로마이신 등), 또는 제초제 내성 (예를 들어, 글리포세이트 등)을 코딩할 수 있다. 선택 마커의 예는, 카라마이신 저항성을 코딩하며 카라마이신, G418 등을 사용하여 선택될 수 있는 neo 유전자; 비알라포스 저항성을 코딩하는 bar 유전자; 글리포세이트 저항성을 코딩하는 돌연변이 EPSP 신타제 유전자; 브로목시닐에 대한 저항성을 부여하는 니트릴라제 유전자; 이미다졸리논 또는 술포닐우레아 내성을 부여하는 돌연변이 아세토락테이트 신타제 유전자 (ALS); 및 메토트렉세이트 저항성 DHFR 유전자를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 암피실린, 블레오마이신, 클로람페니콜, 겐타마이신, 히그로마이신, 카나마이신, 린코마이신, 메토트렉세이트, 포스피노트리신, 퓨로마이신, 스펙티노마이신, 리팜피신, 스트렙토마이신 및 테트라시클린 등에 대한 저항성을 부여하는 다중 선택 마커가 이용가능하다. 이러한 선택 마커의 예는, 예를 들어 미국 특허 5,550,318; 5,633,435; 5,780,708; 및 6,118,047에 예시되어 있다.
본 발명의 재조합 핵산 분자 또는 벡터는 또한 스크리닝 마커를 포함할 수 있다. 스크리닝 마커는 발현을 모니터링하는데 사용될 수 있다. 예시적인 스크리닝 마커는 다양한 발색원성 기질이 공지되어 있는 효소를 코딩하는 β-글루쿠로니다제 또는 uidA 유전자 (GUS) (Jefferson et al. (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405); 식물 조직에서 안토시아닌 안료 (적색)의 생산을 조절하는 산물을 코딩하는 R-유전자좌 유전자 (Dellaporta et al. (1988) "Molecular cloning of the maize R-nj allele by transposon tagging with Ac." In 18th Stadler Genetics Symposium, P. Gustafson and R. Appels, eds. (New York: Plenum), pp. 263-82); β-락타마제 유전자 (Sutcliffe et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3737-41); 다양한 발색원성 기질이 공지되어 있는 효소를 코딩하는 유전자 (예를 들어, PADAC, 발색원성 세팔로스포린); 루시페라제 유전자 (Ow et al. (1986) Science 234:856-9); 발색원성 카테콜을 전환시킬 수 있는 카테콜 디옥시게나제를 코딩하는 xylE 유전자 (Zukowski et al. (1983) Gene 46(2-3):247-55); 아밀라제 유전자 (Ikatu et al. (1990) Bio/Technol. 8:241-2); 티로신을 DOPA 및 도파퀴논 (이는 차례로 멜라닌으로 축합됨)으로 산화시킬 수 있는 효소를 코딩하는 티로시나제 유전자 (Katz et al. (1983) J. Gen. Microbiol. 129:2703-14); 및 α-갈락토시다제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 기재된 바와 같은 재조합 핵산 분자는 딱정벌레류 해충에 대해 감소된 감수성을 나타내는 트랜스제닉 식물을 제조하기 위해 트랜스제닉 식물의 생성 및 식물에서의 이종 핵산의 발현 방법에 사용될 수 있다. 식물 형질전환 벡터는, 예를 들어 iRNA 분자를 코딩하는 핵산 분자를 식물 형질전환 벡터 내로 삽입하고, 이들을 식물 내로 도입함으로써 제조될 수 있다.
숙주 세포의 형질전환을 위한 적합한 방법은, 예컨대 원형질체의 형질전환에 의해 (예를 들어, 미국 특허 5,508,184 참조), 데시케이션/억제-매개 DNA 흡수에 의해 (예를 들어, 문헌 [Potrykus et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199:183-8] 참조), 전기천공에 의해 (예를 들어, 미국 특허 5,384,253 참조), 탄화규소 섬유와의 교반에 의해 (예를 들어, 미국 특허 5,302,523 및 5,464,765 참조), 아그로박테리움-매개 형질전환에 의해 (예를 들어, 미국 특허 5,563,055; 5,591,616; 5,693,512; 5,824,877; 5,981,840; 및 6,384,301 참조) 및 DNA-코팅된 입자의 가속화에 의해 (예를 들어, 미국 특허 5,015,580; 5,550,318; 5,538,880; 6,160,208; 6,399,861; 및 6,403,865 참조) 등 DNA를 세포 내로 도입할 수 있는 임의의 방법을 포함한다. 옥수수를 형질전환시키는데 특히 유용한 기술은, 예를 들어 미국 특허 7,060,876 및 5,591,616; 및 국제 PCT 공개 WO95/06722에 기재되어 있다. 이들과 같은 기술의 적용을 통해, 사실상 임의의 종의 세포는 안정하게 형질전환될 수 있다. 일부 실시양태에서, 형질전환 DNA는 숙주 세포의 게놈 내로 통합된다. 다세포 종의 경우에, 트랜스제닉 세포는 트랜스제닉 유기체로 재생될 수 있다. 임의의 이들 기술을 사용하여, 예를 들어 트랜스제닉 식물의 게놈 중 1종 이상의 iRNA 분자를 코딩하는 1종 이상의 핵산을 포함하는 트랜스제닉 식물을 생산할 수 있다.
발현 벡터를 식물 내로 도입하는데 가장 폭넓게 이용되는 방법은 아그로박테리움의 천연 형질전환 시스템을 기반으로 한다. 에이. 투메파시엔스(A. tumefaciens) 및 에이. 리조게네스(A. rhizogenes)는 식물 세포를 유전적으로 형질전환시키는 식물 병원성 토양 박테리아이다. 에이. 투메파시엔스 및 에이. 리조게네스의 Ti 및 Ri 플라스미드는 각각 식물의 유전적 형질전환을 담당하는 유전자를 운반한다. Ti (종양-유도)-플라스미드는 형질전환된 식물로 전달되는, T-DNA로서 공지된 큰 절편을 함유한다. Ti 플라스미드의 또 다른 절편인 Vir 영역은 T-DNA 전달을 담당한다. T-DNA 영역은 말단 반복부에 의해 접경되어 있다. 변형된 이원 벡터에서, 종양-유도 유전자는 결실되어 있고, Vir 영역의 기능은 T-DNA 경계 요소에 의해 접경된 외래 DNA를 전달하는데 이용된다. T-영역은 또한 트랜스제닉 세포 및 식물의 효율적인 회수를 위한 선택 마커, 및 dsRNA 코딩 핵산과 같은 전달용 폴리뉴클레오티드의 삽입을 위한 다중 클로닝 부위를 함유할 수 있다.
따라서, 일부 실시양태에서, 식물 형질전환 벡터는 에이. 투메파시엔스의 Ti 플라스미드 (예를 들어, 미국 특허 4,536,475, 4,693,977, 4,886,937, 및 5,501,967; 및 유럽 특허 번호 EP 0 122 791 참조) 또는 에이. 리조게네스의 Ri 플라스미드로부터 유래된다. 추가의 식물 형질전환 벡터는, 예를 들어 및 비제한적으로, 문헌 [Herrera-Estrella et al. (1983) Nature 303:209-13; Bevan et al. (1983) Nature 304:184-7; Klee et al. (1985) Bio/Technol. 3:637-42]; 및 유럽 특허 번호 EP 0 120 516에 기재된 것, 및 상기 중 어느 것으로부터 유래된 것을 포함한다. 식물과 상호작용하는 다른 박테리아 예컨대 시노리조비움(Sinorhizobium), 리조비움(Rhizobium), 및 메소리조비움(Mesorhizobium)은 천연으로 변형되어 수많은 다양한 식물에게의 유전자 전달을 매개할 수 있다. 이들 식물-연관 공생 박테리아는 무력화된 Ti 플라스미드 및 적합한 이원 벡터 둘 다의 획득에 의해 유전자 전달에 적격으로 만들어질 수 있다.
외인성 DNA를 수용자 세포에 제공한 후, 형질전환된 세포는 일반적으로 추가 배양 및 식물 재생을 위해 확인된다. 형질전환된 세포를 확인하는 능력을 개선시키기 위해, 형질전환체를 생성하는데 사용된 형질전환 벡터와 함께, 상기 제시된 바와 같은 선택 또는 스크리닝 마커 유전자를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 선택 마커가 사용되는 경우에, 형질전환된 세포를 선택적 작용제 또는 작용제들에 노출시킴으로써 잠재적으로 형질전환된 세포 집단 내에서 형질전환된 세포가 확인된다. 스크리닝 마커가 사용되는 경우에, 세포는 목적하는 마커 유전자 형질에 대해 스크리닝될 수 있다.
선택적 작용제에 대한 노출에서 생존하는 세포, 또는 스크리닝 검정에서 양성으로 점수화된 세포는 식물의 재생을 지지하는 배지에서 배양될 수 있다. 일부 실시양태에서, 추가 물질, 예컨대 성장 조절제를 포함하는 것에 의해 임의의 적합한 식물 조직 배양 배지 (예를 들어, MS 및 N6 배지)가 변형될 수 있다. 식물 재생 노력을 시작하도록 충분한 조직이 이용가능할 때까지, 또는 반복된 회차의 수동 선택 후에, 조직의 형태가 재생에 적합할 때까지 (예를 들어, 적어도 2주), 조직은 성장 조절제를 갖는 기본 배지 상에서 유지된 다음, 싹 형성에 도움이 되는 배지로 전달될 수 있다. 충분한 싹 형성이 발생할 때까지 배양물은 주기적으로 전달된다. 싹이 형성되면, 이들은 뿌리 형성에 도움이 되는 배지로 전달된다. 충분한 뿌리가 형성되면, 식물은 추가 성장 및 성숙을 위해 토양으로 전달될 수 있다.
재생 식물에 관심 핵산 분자 (예를 들어, 딱정벌레류 해충에서의 표적 유전자 발현을 억제하는 1종 이상의 iRNA 분자를 코딩하는 DNA 서열)의 존재를 확인하기 위해, 다양한 검정이 수행될 수 있다. 이러한 검정은, 예를 들어 분자 생물학적 검정, 예컨대 서던 및 노던 블롯팅, PCR, 및 핵산 서열분석; 생화학적 검정, 예컨대, 예를 들어 면역학적 수단 (ELISA 및/또는 웨스턴 블롯)에 의해 또는 효소적 기능에 의해 단백질 산물의 존재를 검출하는 것; 식물 일부 검정, 예컨대 잎 또는 뿌리 검정; 및 전체 재생 식물의 표현형의 분석을 포함한다.
통합 이벤트는, 예를 들어 관심 핵산 분자에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여, 예를 들어 PCR 증폭에 의해 분석될 수 있다. PCR 유전자형결정은 게놈 내로 통합된 관심 핵산 분자를 함유하는 것으로 예측되는 단리된 숙주 식물 식물 캘러스 조직으로부터 유래된 gDNA의 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 증폭, 이어서 PCR 증폭 산물의 표준 클로닝 및 서열 분석을 포함하나 이에 제한되지 않는 것으로 이해된다. PCR 유전자형결정 방법은 널리 기재되어 있고 (예를 들어, 문헌 [Rios, G. et al. (2002) Plant J. 32:243-53]), 세포 배양물을 포함한 임의의 식물 종 (예를 들어, 지. 메이스) 또는 조직 유형으로부터 유래된 gDNA에 적용될 수 있다.
아그로박테리움-의존성 형질전환 방법을 사용하여 형성된 트랜스제닉 식물은 전형적으로 1개 염색체 내로 삽입된 단일 재조합 DNA를 함유한다. 단일 재조합 DNA의 폴리뉴클레오티드는 "트랜스제닉 이벤트" 또는 "통합 이벤트"로 지칭된다. 이러한 트랜스제닉 식물은 삽입된 외인성 폴리뉴클레오티드에 대해 이형접합이다. 일부 실시양태에서, 트랜스진에 대해 동형접합인 트랜스제닉 식물은 단일 외인성 유전자를 함유하는 독립적 분리개체 트랜스제닉 식물을, 예를 들어 T0 식물과 유성생식으로 자가 교배 (자가수분)시켜 T1 종자를 생산함으로써 수득될 수 있다. 생산된 T1 종자의 4분의 1은 트랜스진에 대해 동형접합일 것이다. T1 종자의 발아는, 전형적으로 이형접합체와 동형접합체 사이의 구별을 가능하게 하는 SNP 검정 또는 열 증폭 검정 (즉, 접합성 검정)을 사용하여 이형접합성에 대해 시험될 수 있는 식물을 생성한다.
특정한 실시양태에서, 딱정벌레류 해충-보호 효과를 나타내는 식물 세포에서 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10종 또는 그 초과의 상이한 iRNA 분자가 생산된다. iRNA 분자 (예를 들어, dsRNA 분자)는 상이한 형질전환 이벤트로 도입된 다중 핵산으로부터, 또는 단일 형질전환 이벤트로 도입된 단일 핵산으로부터 발현될 수 있다. 일부 실시양태에서, 복수종의 iRNA 분자는 단일 프로모터의 제어 하에서 발현된다. 다른 실시양태에서, 복수종의 iRNA 분자는 다중 프로모터의 제어 하에서 발현된다. 1종 이상의 딱정벌레류 해충 내의 상이한 유전자좌 (예를 들어, 서열식별번호: 1, 3, 및 67에 의해 정의된 유전자좌)에 각각 상동인 다중 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단일 iRNA 분자는 동일한 종의 딱정벌레류 해충의 상이한 집단에서 또는 딱정벌레류 해충의 상이한 종에서 둘 다 발현될 수 있다.
재조합 핵산 분자를 사용한 식물의 직접적 형질전환에 추가로, 트랜스제닉 식물은 적어도 1종의 트랜스제닉 이벤트를 갖는 제1 식물을 이러한 이벤트가 결여된 제2 식물과 교배시킴으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, iRNA 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 핵산 분자는 형질전환이 용이한 제1 식물 계통 내로 도입되어 트랜스제닉 식물을 생산할 수 있고, 이 트랜스제닉 식물은 제2 식물 계통과 교배되어 iRNA 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제2 식물 계통 내로 유전자이입할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드 중 1종 이상을 함유하는 범용 제품을 포함한다. 특정한 실시양태는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 중 1종 이상을 함유하는 재조합 식물 또는 종자로부터 생산된 범용 제품을 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 중 1종 이상을 함유하는 범용 제품은 식물의 가루, 오일, 분쇄된 또는 전체의 곡실 또는 종자, 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 중 1종 이상을 함유하는 재조합 식물 또는 종자의 임의의 가루, 오일, 또는 분쇄된 또는 전체의 곡실을 포함하는 임의의 식제품을 포함하나 이에 제한되지는 않는 것으로 의도된다. 본원에서 고려되는 1종 이상의 범용품 또는 범용 제품에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드 중 1종 이상의 검출은, 범용품 또는 범용 제품이 dsRNA-매개 유전자 억제 방법을 사용하여 식물 해충을 방제하기 위한 목적으로 본 발명의 폴리뉴클레오티드 중 1종 이상을 발현하도록 설계된 트랜스제닉 식물로부터 생산된다는 사실상의 증거이다.
일부 측면에서, 본 발명의 핵산을 검출가능한 양으로 포함하는 종자 또는 범용 제품인, 형질전환된 식물 세포로부터 유래된 트랜스제닉 식물에 의해 생산된 종자 및 범용 제품이 포함된다. 일부 실시양태에서, 예를 들어, 트랜스제닉 식물을 수득하고, 이로부터 식품 또는 사료를 제조함으로써, 이러한 범용 제품이 생산될 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 중 1종 이상을 포함하는 범용 제품은, 예를 들어 및 비제한적으로: 식물의 가루, 오일, 분쇄된 또는 전체의 곡실 또는 종자, 및 본 발명의 핵산 중 1종 이상을 포함하는 재조합 식물 또는 종자의 임의의 가루, 오일, 또는 분쇄된 또는 전체의 곡실을 포함하는 임의의 식제품을 포함한다. 1종 이상의 범용품 또는 범용 제품에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드 중 1종 이상의 검출은, 범용품 또는 범용 제품이 딱정벌레류 해충을 방제하기 위한 목적으로 본 발명의 iRNA 분자 중 1종 이상을 발현하도록 설계된 트랜스제닉 식물로부터 생산된다는 사실상의 증거이다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 트랜스제닉 식물 또는 종자는 또한 비제한적으로: 딱정벌레류 해충에서 서열식별번호: 1, 3, 및 67에 의해 정의된 것 이외의 다른 유전자좌를 표적화하는 iRNA 분자의 전사가 이루어지는 트랜스제닉 이벤트; 딱정벌레류 해충 이외의 다른 유기체 (예를 들어, 식물-기생 선충류)에서의 유전자를 표적화하는 iRNA 분자의 전사가 이루어지는 트랜스제닉 이벤트; 살곤충 단백질 (예를 들어, 바실루스 투린기엔시스(Bacillus thuringiensis) 살곤충 단백질)을 코딩하는 유전자; 제초제 내성 유전자 (예를 들어, 글리포세이트에 대한 내성을 제공하는 유전자); 및 트랜스제닉 식물에서 바람직한 표현형, 예컨대, 증가된 수확량, 변경된 지방산 대사, 또는 세포질 웅성 불임의 복원에 기여하는 유전자를 포함한, 적어도 1종의 다른 트랜스제닉 이벤트를 그의 게놈 중에 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 본 발명의 iRNA 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 식물에서 다른 곤충 방제 및 질병 형질과 조합되어 식물 질병 및 곤충 손상의 증진된 방제를 위한 목적하는 형질을 달성할 수 있다. 특유의 작용 방식을 사용하는 곤충 방제 형질을 조합하는 것은, 예를 들어 재배지에서 형질(들)에 대한 저항성이 발생될 확률이 감소하기 때문에, 단일 방제 형질을 보유하는 식물에 비해 더 우수한 지속성을 갖는 보호된 트랜스제닉 식물을 제공할 수 있다.
V. 딱정벌레류 해충에서의 표적 유전자 억제
A. 개관
본 발명의 일부 실시양태에서, 딱정벌레류 해충의 방제에 유용한 적어도 1종의 핵산 분자가 해충에게 제공될 수 있으며, 여기서 핵산 분자는 해충(들)에서 RNAi-매개 유전자 침묵을 유도한다. 특정한 실시양태에서, iRNA 분자 (예를 들어, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, 및 hpRNA)가 딱정벌레류 해충에게 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 딱정벌레류 해충의 방제에 유용한 핵산 분자는 핵산 분자를 해충과 접촉시킴으로써 해충에게 제공될 수 있다. 이들 및 추가 실시양태에서, 딱정벌레류 해충의 방제에 유용한 핵산 분자는 해충의 섭식 기질로, 예를 들어 영양 조성물로 제공될 수 있다. 이들 및 추가 실시양태에서, 딱정벌레류 해충의 방제에 유용한 핵산 분자는 해충에 의해 섭취되는 핵산 분자를 포함하는 식물 물질의 섭취를 통해 제공될 수 있다. 특정 실시양태에서, 핵산 분자는, 예를 들어 식물 세포를 재조합 핵산을 포함하는 벡터로 형질전환하는 것에 의해 및 형질전환된 식물 세포로부터의 식물 물질 또는 전체 식물의 재생에 의해 식물 물질 내로 도입된 재조합 핵산의 발현을 통해 식물 물질에 존재한다.
B. RNAi-매개 표적 유전자 억제
특정한 실시양태에서, 본 발명은, 예를 들어 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 1개의 가닥을 포함하는 iRNA 분자를 설계함으로써, 딱정벌레류 (예를 들어, WCR 또는 NCR) 해충의 트랜스크립톰에서 필수 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 필수 유전자)를 표적화하도록 설계될 수 있는 iRNA 분자 (예를 들어, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, 및 hpRNA)를 제공한다. 이와 같이 설계된 iRNA 분자의 서열은 표적 폴리뉴클레오티드의 것과 동일할 수 있거나, 또는 iRNA 분자와 그의 표적 폴리뉴클레오티드 사이의 특이적 혼성화가 이루어지지 못하도록 하는 미스매치를 혼입시킬 수 있다.
본 발명의 iRNA 분자는 딱정벌레류 해충에서의 유전자 억제 방법에 사용될 수 있고, 이에 의해 식물 (예를 들어, iRNA 분자를 포함하는 보호된 형질전환된 식물) 상의 해충에 의해 야기되는 손상의 수준 또는 발생률이 감소될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "유전자 억제"는 발현의 전사후 억제 및 전사 억제를 포함하는 유전자 또는 코딩 폴리뉴클레오티드로부터의 단백질 발현의 감소를 포함한, mRNA로의 유전자 전사 및 후속하는 mRNA의 번역의 결과로서 생산된 단백질의 수준을 감소시키는 널리 공지된 임의의 방법을 지칭한다. 전사후 억제는 억제를 위해 표적화된 유전자로부터 전사된 mRNA의 모두 또는 일부와, 억제를 위해 사용된 상응하는 iRNA 분자 사이의 특이적 상동성에 의해 매개된다. 추가적으로, 전사후 억제는 세포에서 리보솜에 의한 결합에 이용가능한 mRNA 양의 실질적이고도 측정가능한 감소를 지칭한다.
iRNA 분자가 dsRNA 분자인 특정 실시양태에서, dsRNA 분자는 효소 DICER에 의해 짧은 siRNA 분자 (대략 20개의 뉴클레오티드 길이)로 절단될 수 있다. dsRNA 분자에 대한 DICER 활성에 의해 생성된 이중-가닥 siRNA 분자는 2개의 단일-가닥 siRNA: "패신저 가닥" 및 "가이드 가닥"으로 분리될 수 있다. 패신저 가닥은 분해될 수 있고, 가이드 가닥은 RISC 내로 혼입될 수 있다. 가이드 가닥과 mRNA 분자의 특이적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드와의 특이적인 혼성화, 및 후속하는 효소 아르고너트 (RISC 복합체의 촉매 성분)에 의한 절단에 의해 전사후 억제가 발생한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 임의의 형태의 iRNA 분자가 사용될 수 있다. dsRNA 분자는 전형적으로 제조 동안 및 iRNA 분자를 세포에 제공하는 단계 동안, 단일 가닥 RNA 분자보다 더 안정하고, 이는 전형적으로 또한 세포에서 더 안정하다는 것을 관련 기술분야의 통상의 기술자는 이해할 것이다. 따라서, 예를 들어 siRNA 및 miRNA 분자는 일부 실시양태에서 동일하게 유효할 수 있지만, dsRNA 분자는 그의 안정성에 기인하여 선택될 수 있다.
특정한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자가 제공되며, 이 폴리뉴클레오티드는 시험관내에서 발현되어 딱정벌레류 해충의 게놈 내의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 핵산 분자에 실질적으로 상동인 iRNA 분자가 생산될 수 있다. 특정 실시양태에서, 시험관내에서 전사된 iRNA 분자는 스템-루프 구조를 포함하는 안정화된 dsRNA 분자일 수 있다. 딱정벌레류 해충이 시험관내에서 전사된 iRNA 분자와 접촉한 후에, 해충에서의 표적 유전자 (예를 들어, 필수 유전자)의 전사후 억제가 발생할 수 있다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드 (예를 들어, 적어도 19개의 인접 뉴클레오티드)를 포함하는 핵산 분자로부터의 iRNA의 발현은 딱정벌레류 해충에서의 표적 유전자의 전사후 억제 방법에 사용되며, 여기서 폴리뉴클레오티드는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 서열식별번호: 1; 서열식별번호: 1의 상보체; 서열식별번호: 3; 서열식별번호: 3의 상보체; 서열식별번호: 67; 서열식별번호: 67의 상보체; 서열식별번호: 1의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 서열식별번호: 1의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체; 서열식별번호: 3의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 서열식별번호: 3의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체; 서열식별번호: 67의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 서열식별번호: 67의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체; 서열식별번호: 1을 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드; 서열식별번호: 1을 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드의 상보체; 서열식별번호: 3을 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드; 서열식별번호: 3을 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드의 상보체; 서열식별번호: 67을 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드; 서열식별번호: 67을 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드의 상보체; 서열식별번호: 1을 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 서열식별번호: 1을 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체; 서열식별번호: 3을 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 서열식별번호: 3을 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체; 서열식별번호: 67을 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 및 서열식별번호: 67을 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체. 특정 실시양태에서, 상기 중 어느 것과 적어도 약 80% (예를 들어, 79%, 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 약 100%, 및 100%) 동일한 핵산 분자의 발현이 사용될 수 있다. 이들 및 추가 실시양태에서, 딱정벌레류 해충의 적어도 1개의 세포에 존재하는 RNA 분자와 특이적으로 혼성화되는 핵산 분자가 발현될 수 있다.
RNAi 전사후 억제 시스템이 유전자 돌연변이, 균주 다형성, 또는 진화상 분기에 기인한 것으로 예상될 수 있는 표적 유전자 중의 서열 변이를 견딜 수 있다는 것이 본원의 일부 실시양태의 중요한 특색이다. 도입된 핵산 분자가 표적 유전자의 1차 전사 산물 또는 완전-프로세싱된 mRNA에 특이적으로 혼성화가능한 한, 도입된 핵산 분자는 표적 유전자의 1차 전사 산물 또는 완전-프로세싱된 mRNA에 절대적으로 상동일 필요는 없을 수 있다. 더욱이, 도입된 핵산 분자는 표적 유전자의 1차 전사 산물 또는 완전-프로세싱된 mRNA에 비해, 전장일 필요가 없을 수 있다.
본 발명의 iRNA 기술을 사용하는 표적 유전자의 억제는 서열-특이적이며; 즉, iRNA 분자(들)에 실질적으로 상동인 폴리뉴클레오티드가 유전적 억제를 위해 표적화된다. 일부 실시양태에서, 표적 유전자의 일부분의 경우와 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 RNA 분자가 억제에 사용될 수 있다. 이들 및 추가 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드에 비해 1개 이상의 삽입, 결실, 및/또는 점 돌연변이를 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 RNA 분자가 사용될 수 있다. 특정한 실시양태에서, iRNA 분자 및 표적 유전자의 일부분은, 예를 들어 적어도 약 80%부터, 적어도 약 81%부터, 적어도 약 82%부터, 적어도 약 83%부터, 적어도 약 84%부터, 적어도 약 85%부터, 적어도 약 86%부터, 적어도 약 87%부터, 적어도 약 88%부터, 적어도 약 89%부터, 적어도 약 90%부터, 적어도 약 91%부터, 적어도 약 92%부터, 적어도 약 93%부터, 적어도 약 94%부터, 적어도 약 95%부터, 적어도 약 96%부터, 적어도 약 97%부터, 적어도 약 98%부터, 적어도 약 99%부터, 적어도 약 100%부터의, 및 100% 서열 동일성을 공유할 수 있다. 대안적으로, dsRNA 분자의 듀플렉스 영역은 표적 유전자 전사체의 일부분과 특이적으로 혼성화가능할 수 있다. 특이적으로 혼성화가능한 분자에서, 전장의 폴리뉴클레오티드보다는 더 짧은, 더 큰 상동성을 나타내는 서열이, 더 긴, 더 작은 상동 폴리뉴클레오티드를 보완한다. 표적 유전자 전사체의 일부분과 동일한 dsRNA 분자의 듀플렉스 영역의 폴리뉴클레오티드의 길이는 적어도 약 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 또는 적어도 약 1000개 염기일 수 있다. 일부 실시양태에서, 20-100개의 뉴클레오티드 초과의 폴리뉴클레오티드가 사용될 수 있고; 예를 들어, 100-200 또는 300-500개의 뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드가 사용될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 약 200-300개의 뉴클레오티드 초과의 폴리뉴클레오티드가 사용될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 표적 유전자의 크기에 따라, 약 500-1000개의 뉴클레오티드 초과의 폴리뉴클레오티드가 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 딱정벌레류 해충에서의 표적 유전자의 발현은 해충의 세포 내에서 적어도 10%; 적어도 33%; 적어도 50%; 또는 적어도 80% 억제될 수 있어, 유의한 억제가 일어나도록 한다. 유의한 억제는 검출가능한 표현형 (예를 들어, 생식, 섭식, 발생의 중지 등)을 유발하거나, 또는 억제되는 표적 유전자에 상응하는 RNA 및/또는 유전자 산물의 검출가능한 감소를 유발하는 역치 초과의 억제를 지칭한다. 비록 본 발명의 특정 실시양태에서 억제는 해충의 실질적으로 모든 세포에서 발생하지만, 다른 실시양태에서는 억제가 단지 표적 유전자를 발현하는 세포의 하위세트에서만 발생한다.
일부 실시양태에서, 전사 억제는 프로모터 DNA 또는 그의 상보체에 대해 실질적 서열 동일성을 나타내는 dsRNA 분자의 세포 내 존재에 의해 매개되어, "프로모터 트랜스 억제"라고 지칭되는 효과가 발휘된다. 유전자 억제는, 예를 들어 dsRNA 분자를 함유하는 식물 물질을 섭취하거나 또는 그와 접촉함으로써 이러한 dsRNA 분자를 섭취하거나 또는 그와 접촉할 수 있는 딱정벌레류 해충에서의 표적 유전자에 대해 효과적일 수 있다. 프로모터 트랜스 억제에 사용하기 위한 dsRNA 분자는 딱정벌레류 해충의 세포에서의 1종 이상의 상동 또는 상보적 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제 또는 저해하도록 특이적으로 설계될 수 있다. 식물 세포에서 유전자 발현을 조절하는 안티센스 또는 센스 배향 RNA에 의한 전사후 유전자 억제는 미국 특허 5,107,065; 5,759,829; 5,283,184; 및 5,231,020에 개시되어 있다.
C. 딱정벌레류 해충에게 제공된 iRNA 분자의 발현
딱정벌레류 해충에서의 RNAi-매개 유전자 억제를 위한 iRNA 분자의 발현은 많은 시험관내 또는 생체내 포맷 중 어느 하나로 수행될 수 있다. 이어서, iRNA 분자는, 예를 들어 iRNA 분자를 해충과 접촉시킴으로써, 또는 해충이 iRNA 분자를 섭취하도록 하거나 또는 다르게는 내재화하도록 함으로써 딱정벌레류 해충에게 제공될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태는 딱정벌레류 해충의 형질전환된 숙주 식물, 형질전환된 식물 세포, 및 형질전환된 식물의 자손을 포함한다. 형질전환된 식물 세포 및 형질전환된 식물은, 예를 들어 이종 프로모터의 제어 하에 iRNA 분자 중 1종 이상을 발현하여 해충-보호 효과를 제공하도록 조작될 수 있다. 따라서, 트랜스제닉 식물 또는 식물 세포가 딱정벌레류 해충에 의해 섭식 동안 소모되는 경우에, 해충은 트랜스제닉 식물 또는 세포에서 발현된 iRNA 분자를 섭취할 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 또한 매우 다양한 원핵 및 진핵 미생물 숙주 내로 도입되어 iRNA 분자를 생산할 수 있다. 용어 "미생물"은 원핵 및 진핵 종, 예컨대 박테리아 및 진균을 포함한다.
유전자 발현의 조정은 이러한 발현의 부분적 또는 완전한 억제를 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 딱정벌레류 해충에서의 유전자 발현을 억제하는 방법은 해충의 숙주의 조직에, 본원에 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오티드의 전사 후에 형성된 적어도 1종의 dsRNA 분자 (이의 적어도 1개의 절편은 딱정벌레류 해충의 세포 내의 mRNA에 상보적임)를 유전자 억제량으로 제공하는 것을 포함한다. 본 발명에 따라 딱정벌레류 해충에 의해 섭취되는, siRNA, miRNA, shRNA, 또는 hpRNA 분자와 같은 변형된 형태를 포함한 dsRNA 분자는, 예를 들어 서열식별번호: 1, 3, 및 67로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 hunchback DNA 분자로부터 전사된 RNA 분자에 대해 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 약 100% 동일할 수 있다. 따라서, 딱정벌레류 해충 내로 도입되었을 때 그에서 내인성 코딩 폴리뉴클레오티드 또는 표적 코딩 폴리뉴클레오티드의 발현을 저해 또는 억제하는, 본 발명의 dsRNA 분자를 제공하기 위한 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드 및 재조합 DNA 구축물을 포함하나 이에 제한되지는 않는 단리된 및 실질적으로 정제된 핵산 분자가 제공된다.
특정한 실시양태는 딱정벌레류 식물 해충에서의 1종 이상의 표적 유전자(들)의 전사후 억제 및 식물 해충 집단의 방제를 위해 iRNA 분자를 전달하기 위한 전달 시스템을 제공한다. 일부 실시양태에서, 전달 시스템은 숙주 트랜스제닉 식물 세포, 또는 숙주 세포에서 전사된 RNA 분자를 포함하는 숙주 세포의 내용물의 섭취를 포함한다. 이들 및 추가 실시양태에서, 본 발명의 안정화된 dsRNA 분자를 제공하는 재조합 DNA 구축물을 함유하는 트랜스제닉 식물 세포 또는 트랜스제닉 식물이 생성된다. 특정한 iRNA 분자를 코딩하는 핵산을 포함하는 트랜스제닉 식물 세포 및 트랜스제닉 식물은 본 발명의 iRNA 분자 (예를 들어, 안정화된 dsRNA 분자)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물 형질전환 벡터를 구축하고; 식물 세포 또는 식물을 형질전환시키고; 전사된 iRNA 분자를 함유하는 트랜스제닉 식물 세포 또는 트랜스제닉 식물을 생성하는 재조합 DNA 기술 (이의 기본 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있음)을 사용함으로써 생산될 수 있다
트랜스제닉 식물에 딱정벌레류 해충으로부터의 보호를 부여하기 위해, 재조합 DNA 분자는, 예를 들어 iRNA 분자, 예컨대 dsRNA 분자, siRNA 분자, miRNA 분자, shRNA 분자, 또는 hpRNA 분자로 전사될 수 있다. 일부 실시양태에서, 재조합 DNA 분자로부터 전사된 RNA 분자는 재조합 식물의 조직 또는 유체 내에서 dsRNA 분자를 형성할 수 있다. 이러한 dsRNA 분자는 부분적으로는, 숙주 식물에 침입할 수 있는 유형의 딱정벌레류 해충 내 DNA로부터 전사된 상응하는 폴리뉴클레오티드와 동일한 폴리뉴클레오티드로 구성될 수 있다. 딱정벌레류 해충 내 표적 유전자의 발현은 dsRNA 분자에 의해 억제되고, 딱정벌레류 해충에서의 표적 유전자의 발현의 억제는 트랜스제닉 식물이 해충에 대해 저항성이 있도록 한다. dsRNA 분자의 조정 효과는, 예를 들어 하우스키핑 유전자를 포함한, 세포 분열, 염색체 재형성, 및 세포 대사 또는 세포 형질전환을 담당하는 내인성 유전자; 전사 인자; 탈피-관련 유전자; 및 세포 대사 또는 정상 성장 및 발생에 수반되는 폴리펩티드를 코딩하는 다른 유전자를 포함한, 해충에서 발현되는 다양한 유전자에 적용될 수 있는 것으로 제시된 바 있다.
생체내 트랜스진 또는 발현 구축물로부터의 전사를 위해, 일부 실시양태에서는 조절 영역 (예를 들어, 프로모터, 인핸서, 사일렌서, 및 폴리아데닐화 신호)이 RNA 가닥 (또는 가닥들)을 전사하는데 사용될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 상기 제시된 바와 같이, iRNA 분자를 생산하는데 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드는 식물 숙주 세포에서 기능적인 1종 이상의 프로모터 요소에 작동가능하게 연결될 수 있다. 프로모터는 보통 숙주 게놈 내에 상주하는 내인성 프로모터일 수 있다. 작동가능하게 연결된 프로모터 요소의 제어 하에 있는 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 추가로 그의 전사 및/또는 생성된 전사체의 안정성에 유리한 영향을 미치는 추가의 요소에 플랭킹될 수 있다. 이러한 요소는 작동가능하게 연결된 프로모터의 상류, 발현 구축물의 3' 말단의 하류에 위치할 수 있고, 프로모터의 상류 및 발현 구축물의 3' 말단의 하류 둘 다에서 발생할 수 있다.
실시양태에서, 표적 유전자 (예를 들어, hunchback 유전자)의 억제는 모 RNAi 표현형; iRNA 분자와 접촉한 대상체 (예를 들어, 딱정벌레류 해충)의 자손에서 관찰가능한 표현형을 유발한다. 일부 실시양태에서, pRNAi 표현형은 해충이 생존 자손을 보다 덜 생산하게 만드는 것을 포함한다. pRNAi의 특정한 예에서, pRNAi를 개시하는 핵산은 핵산이 전달되는 집단 (예를 들어, 유충을 포함하는 총 집단 중 성충 집단)에서의 사멸의 발생률을 증가시키지 않는다. pRNAi의 다른 예에서, pRNAi를 개시하는 핵산은 또한 핵산이 전달되는 집단에서의 사멸의 발생률을 증가시킨다.
일부 실시양태에서, 딱정벌레류 해충의 집단은 iRNA 분자와 접촉하고, 이에 의해 pRNAi를 유발하며, 여기서 해충은 생존하고 교미하지만, 핵산(들)을 제공받지 않은 동일한 종의 해충에 의해 생산된 알보다 생존 자손을 덜 부화시킬 수 있는 알을 생산한다. 일부 예에서, 이러한 해충은 알을 낳지 않거나 또는 iRNA 분자와 접촉하지 않은 동일한 종의 해충에서 관찰가능한 것보다 더 적은 알을 낳는다. 일부 예에서, 이러한 해충이 낳은 알은 부화하지 않거나 또는 iRNA 분자와 접촉하지 않은 동일한 종의 해충에서 관찰가능한 것보다 유의하게 더 적은 비율로 부화한다. 일부 예에서, 이러한 해충이 낳은 알로부터 부화한 유충은 생존하지 않거나 또는 iRNA 분자와 접촉하지 않은 동일한 종의 해충에서 관찰가능한 것보다 덜 생존한다.
곤충 섭식으로부터의 보호를 제공하는 물질을 생산하는 트랜스제닉 작물은 곤충 보호 물질(들)의 이익의 지속성을 감소시키는 표적 곤충 해충 집단에 의한 적응에 취약하다. 전통적으로, 트랜스제닉 작물에 대한 곤충 해충 적응에 있어서의 지연은 (1) "은신처" (살충 물질을 함유하지 않고, 따라서 살충 물질(들)에 감수성인 곤충의 생존을 가능하게 하는 작물)의 식재; 및/또는 (2) 표적 해충에 대한 다중 작용 방식을 갖는 살곤충 물질을 조합하여, 한 작용 방식에 대해 저항성이 있는 개체가 제2 작용 방식에 의해 사멸되도록 하는 것에 의해 달성된다.
일부 예에서, iRNA 분자 (예를 들어, 숙주 식물에서 트랜스진으로부터 발현된 것)는 곤충 저항성 관리 유전자 피라미드에서 바실루스 투린기엔시스 살곤충 단백질 기술 및/또는 치사 RNAi 기술과 조합하기 위한 새로운 작용 방식을 나타내어 이들 방제 기술에 대해 저항성인 곤충 집단의 발생을 완화시킨다.
모 RNAi는 일부 실시양태에서, 치사 RNAi에 의해 수득된 방제와는 상이하며 치사 RNAi와 조합되어 상승작용적 해충 방제를 유발할 수 있는 해충 방제의 유형을 유발할 수 있다. 따라서, 특정한 실시양태에서, 딱정벌레류 식물 해충에서의 1종 이상의 표적 유전자(들)의 전사후 억제를 위한 iRNA 분자는 다른 iRNA 분자와 조합되어 중복 RNAi 표적화 및 상승작용적 RNAi 효과를 제공할 수 있다.
알 사멸률 또는 알 생존율의 손실을 야기하는 모 RNAi (pRNAi)는 RNAi 및 곤충 보호를 위한 다른 메카니즘을 사용하는 트랜스제닉 작물에 추가의 지속성 이익을 가져다 주는 잠재력을 갖는다. pRNAi는 노출된 곤충이 자손을 생산하는 것을 방지하고, 따라서 살충 물질(들)에 대한 저항성을 부여하는, 이들이 운반하는 임의의 대립유전자를 차세대로 전달하는 것을 방지한다. pRNAi는 그것이 동일한 해충 집단으로부터의 보호를 제공하는 1종 이상의 추가의 살충 물질과 조합되는 경우에 곤충-보호된 트랜스제닉 작물의 지속성을 확장하는데 있어서 특히 유용하다. 이러한 추가의 살충 물질은 일부 실시양태에서, 예를 들어 dsRNA; 유충-활성 dsRNA; 살곤충 단백질 (예컨대 바실루스 투린기엔시스 또는 다른 유기체로부터 유래된 것); 및 다른 살곤충 물질을 포함할 수 있다. 이 이익은 살충 물질에 대해 저항성이 있는 곤충이 은신처 작물에서보다 트랜스제닉 작물에서 더 높은 비율의 집단으로서 발생하기 때문에 생긴다. 차세대로 전달된 감수성 대립유전자에 대한 저항성 대립유전자의 비가 pRNAi의 부재 하에서보다 pRNAi의 존재 하에서 더 낮다면, 저항성의 진화는 지연될 것이다.
예를 들어, pRNAi는 iRNA 분자를 발현하는 식물에 대해 손상을 가하는 제1 해충 세대에서의 개체의 수를 감소시키지 못할 수 있다. 그러나, 이러한 해충이 후속 세대를 통해 침입을 지속하는 능력은 감소될 수 있다. 반대로, 치사 RNAi는 이미 식물에 침입한 해충을 사멸시킬 수 있다. pRNAi가 치사 RNAi와 조합되는 경우에, 모 iRNA 분자와 접촉한 해충은 iRNA와 접촉하지 않은 시스템 외부로부터의 해충과 함께 번식할 수 있지만, 그러나 이러한 교미의 자손은 비-생존하거나 또는 덜 생존할 수 있고, 따라서 식물에 침입이 불가능할 수 있다. 동시에, 치사 iRNA 분자와 접촉한 해충은 직접적으로 영향을 받을 수 있다. 이들 2가지 효과의 조합은 상승작용적일 수 있고; 즉, 조합된 pRNAi 및 치사 RNAi 효과는 독립적으로 pRNAi 및 치사 RNAi 효과의 합계보다 더 클수도 있다. pRNAi는 치사 RNAi와, 예를 들어 치사 및 모 iRNA 분자 둘 다를 발현하는 식물을 제공함으로써; 치사 iRNA 분자를 발현하는 제1 식물 및 모 iRNA 분자를 발현하는 제2 식물을 동일한 위치에 제공함으로써; 및/또는 암컷 및/또는 수컷 해충을 pRNAi 분자와 접촉시키고 후속적으로 접촉한 해충을 식물 환경 내로 방출시켜 이들이 식물 해충과 비생산적으로 교미할 수 있도록 함으로써 조합될 수 있다.
일부 실시양태는 식물을 섭식하는 딱정벌레류 해충에 의해 야기된 숙주 식물 (예를 들어, 옥수수 식물)에 대한 손상을 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 방법은 본 발명의 적어도 1종의 핵산 분자를 발현하는 형질전환된 식물 세포를 숙주 식물에 제공하는 것을 포함하며, 여기서 핵산 분자(들)는 해충(들)에 의해 흡수되었을 때 해충(들) 내에서의 표적 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제하도록 기능하고, 이 발현의 억제는, 예를 들어 해충(들)의 사멸 및/또는 감소된 성장에 추가로 감소된 생식을 유발하고, 이에 의해 해충에 의해 야기된 숙주 식물에 대한 손상을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자(들)는 dsRNA 분자를 포함한다. 이들 및 추가 실시양태에서, 핵산 분자(들)는 딱정벌레류 해충 세포에서 발현된 핵산 분자에 특이적으로 혼성화가능한 1종 초과의 폴리뉴클레오티드를 각각 포함하는 dsRNA 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자(들)는 딱정벌레류 해충 세포에서 발현된 핵산 분자에 특이적으로 혼성화가능한 1종의 폴리뉴클레오티드로 이루어진다.
다른 실시양태에서, 옥수수 작물의 수확량을 증가시키는 방법이 제공되며, 여기서 방법은 옥수수 식물 내로 본 발명의 적어도 1종의 핵산 분자를 도입하는 것; 및 옥수수 식물을 재배하여 핵산 서열을 포함하는 iRNA 분자가 발현되도록 하는 것을 포함하며, 여기서 핵산을 포함하는 iRNA 분자의 발현은 딱정벌레류 해충 손상 및/또는 성장을 억제하고, 이에 의해 딱정벌레류 해충 침입에 기인한 수확량의 손실을 감소 또는 제거한다. 일부 실시양태에서, iRNA 분자는 dsRNA 분자이다. 이들 및 추가 실시양태에서, 핵산 분자(들)는 딱정벌레류 해충 세포에서 발현된 핵산 분자에 특이적으로 혼성화가능한 1종 초과의 폴리뉴클레오티드를 각각 포함하는 dsRNA 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자(들)는 딱정벌레류 해충 세포에서 발현된 핵산 분자에 특이적으로 혼성화가능한 1종의 폴리뉴클레오티드로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 식물 작물의 수확량을 증가시키는 방법이 제공되며, 여기서 방법은 암컷 딱정벌레류 해충 내로 (예를 들어, 주사에 의해, 섭취에 의해, 분무에 의해, 및 DNA로부터의 발현에 의해) 본 발명의 적어도 1종의 핵산 분자를 도입하는 것; 및 암컷 해충을 작물 내로 방출시키는 것을 포함하며, 여기서 암컷 해충을 포함한 교미 쌍은 생존 자손을 생산할 수 없거나 또는 덜 생산할 수 있고, 이에 의해 딱정벌레류 해충 침입에 기인한 수확량의 손실을 감소 또는 제거한다. 특정한 실시양태에서, 이러한 방법은 해충의 후속 세대의 방제를 제공한다. 유사한 실시양태에서, 방법은 본 발명의 핵산 분자를 수컷 딱정벌레류 해충 내로 도입하는 것, 및 수컷 해충을 작물 내로 방출시키는 것 (예를 들어, 여기서 pRNAi 수컷 해충은 비처리 대조군보다 더 적은 정자를 생산함)을 포함한다. 예를 들어, WCR 암컷이 전형적으로 단지 1회 교미하는 것을 고려할 때, 이들 pRNAi 암컷 및/또는 수컷은 교미를 위해 천연 WCR 곤충을 압도하기 위한 경쟁에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 발현되어 iRNA 분자를 생산하는 DNA 분자이다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 dsRNA 분자이다. 이들 및 추가 실시양태에서, 핵산 분자(들)는 딱정벌레류 해충 세포에서 발현된 핵산 분자에 특이적으로 혼성화가능한 1종 초과의 폴리뉴클레오티드를 각각 포함하는 dsRNA 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자(들)는 딱정벌레류 해충 세포에서 발현된 핵산 분자에 특이적으로 혼성화가능한 1종의 폴리뉴클레오티드로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 딱정벌레류 해충에서의 표적 유전자의 발현을 조정하는 방법이 제공되며, 여기서 방법은 본 발명의 적어도 1종의 iRNA 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 식물 세포를 형질전환시키는 것이며, 여기서 폴리뉴클레오티드는 프로모터 및 전사 종결 요소에 작동가능하게 연결된 것; 복수종의 형질전환된 식물 세포를 포함하는 식물 세포 배양물의 발생이 가능하게 하는데 충분한 조건 하에서 형질전환된 식물 세포를 배양하는 것; 폴리뉴클레오티드가 게놈 내로 통합된 형질전환된 식물 세포를 선택하는 것; 형질전환된 식물 세포를 통합된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 iRNA 분자의 발현에 대해 스크리닝하는 것; iRNA 분자를 발현하는 트랜스제닉 식물 세포를 선택하는 것; 및 선택된 트랜스제닉 식물 세포를 딱정벌레류 해충에게 섭식시키는 것을 포함한다. 식물은 또한 통합된 핵산 분자에 의해 코딩된 iRNA 분자를 발현하는 형질전환된 식물 세포로부터 재생될 수 있다. 일부 실시양태에서, iRNA 분자는 dsRNA 분자이다. 이들 및 추가 실시양태에서, 핵산 분자(들)는 딱정벌레류 해충 세포에서 발현된 핵산 분자에 특이적으로 혼성화가능한 1종 초과의 폴리뉴클레오티드를 각각 포함하는 dsRNA 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자(들)는 딱정벌레류 해충 세포에서 발현된 핵산 분자에 특이적으로 혼성화가능한 1종의 폴리뉴클레오티드로 이루어진다.
본 발명의 iRNA 분자는 식물 세포의 게놈 내로 혼입된 재조합 유전자로부터의 발현 산물로서, 또는 식재하기 전 종자에 적용되는 코팅제 또는 종자 처리제 내로 혼입됨에 따라, 식물 종 (예를 들어, 옥수수)의 종자 내에 혼입될 수 있다. 재조합 유전자를 포함하는 식물 세포는 트랜스제닉 이벤트인 것으로 간주된다. 딱정벌레류 해충에게의 iRNA 분자의 전달을 위한 전달 시스템이 또한 본 발명의 실시양태에 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 iRNA 분자는 해충(들)의 세포 내로 직접 도입될 수 있다. 도입 방법은 딱정벌레류 해충의 먹이 내로의 iRNA의 직접 혼합 (예를 들어, 해충의 숙주로부터의 식물 조직과의 혼합에 의함), 뿐만 아니라 본 발명의 iRNA 분자를 포함하는 조성물의 숙주 식물 조직에의 적용을 포함할 수 있다. 예를 들어, iRNA 분자는 식물 표면 상에 분무될 수 있다. 대안적으로, iRNA 분자는 미생물에 의해 발현될 수 있고, 미생물은 식물 표면 상에 적용될 수 있거나 또는 물리적 수단 예컨대 주사에 의해 뿌리 또는 줄기 내로 도입될 수 있다. 상기 논의된 바와 같이, 트랜스제닉 식물은 또한 식물에 침입하는 것으로 공지된 딱정벌레류 해충을 사멸시키는데 충분한 양으로 적어도 1종의 iRNA 분자를 발현하도록 유전자 조작될 수 있다. 화학적 또는 효소적 합성에 의해 생산된 iRNA 분자는 또한 농업상 관례와 일치하는 방식으로 제제화될 수 있고, 딱정벌레류 해충에 의한 식물 손상을 방제하기 위한 분무식 제품으로서 사용될 수 있다. 제제는 효율적인 잎 피복을 위해 요구되는 적절한 보조제 (예를 들어, 스티커 및 습윤제), 뿐만 아니라 UV 손상으로부터 iRNA 분자 (예를 들어, dsRNA 분자)를 보호하기 위한 UV 보호제를 포함할 수 있다. 이러한 첨가제는 생물살곤충제 산업에서 통상적으로 사용되고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 이러한 적용은 딱정벌레류 해충으로부터의 식물 보호를 증진시키기 위해 다른 분무식 살곤충제 적용 (생물학적 기반의 것 또는 다른 것)과 조합될 수 있다.
본원에 인용된 공개, 특허, 및 특허 출원을 포함한 모든 참고문헌은 이들이 본 개시내용의 명시적 세부사항과 일관되는 정도로 본원에 참조로 포함되고, 마치 각각의 참고문헌이 개별적이고도 구체적으로 참조로 포함되는 것으로 나타내어지고 그 전문이 본원에 제시된 것과 동일한 정도로 참조로 포함된다. 본원에 논의된 참고문헌은 본 출원의 출원일 전의 그의 개시내용에 대해서만 제공된다. 본원에서의 어떠한 것도 본 발명자들이 선행 발명에 의해 이러한 개시내용을 앞서는 자격을 갖지 않음을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
하기 실시예는 특정의 특정한 특색 및/또는 측면을 예시하기 위해 제공된다. 이들 실시예는 본 개시내용을 기재된 특정한 특색 또는 측면으로 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예
실시예 1: 물질 및 방법
디아브로티카 유충 섭식 검정을 위한 샘플 제조 및 생물검정.
수많은 dsRNA 분자 (hunchback에 상응하는 것)를 메가스크립트(MEGAscript)® RNAi 키트 (라이프 테크놀로지스(LIFE TECHNOLOGIES)) 또는 하이스크라이브(HiScribe)® T7 시험관내 전사 키트를 사용하여 합성 및 정제하였다. 정제된 dsRNA 분자를 TE 완충제 중에서 제조하였고, 모든 생물검정은 이 완충제로 이루어진 대조 처리군을 함유하였으며, 이는 WCR의 사멸 또는 성장 억제에 대한 배경 체크로서의 역할을 하였다. 생물검정 완충제 중 dsRNA 분자의 농도는 나노드롭(NANODROP)™ 8000 분광광도계 (써모 사이언티픽(THERMO SCIENTIFIC), 델라웨어주 윌밍톤)를 사용하여 측정하였다.
신생 곤충 유충을 사용하여 수행된 생물검정에서 인공 곤충 먹이에 대한 곤충 활성에 대해 샘플을 시험하였다. WCR 알을 크롭 캐릭터리스틱스, 인크.(CROP CHARACTERISTICS, INC.) (미네소타주 파밍톤)로부터 입수하였다.
생물검정은 곤충 생물검정을 위해 특이적으로 설계된 128-웰 플라스틱 트레이 (씨-디 인터내셔널(C-D INTERNATIONAL), 뉴저지주 피트만)에서 수행하였다. 각각의 웰은 딱정벌레류 곤충의 성장을 위해 설계된 먹이 대략 1.0 mL를 함유하였다. dsRNA 샘플의 60 μL 분취물을 각각의 웰의 1.5 cm2 먹이 표면 상에 피펫팅 (40 μL/cm2)함으로써 전달하였다. 웰 중 표면적 제곱 센티미터당 dsRNA의 양 (ng/cm2)으로서 dsRNA 샘플 농도를 계산하였다. 먹이 표면 상의 액체가 증발될 때까지 또는 먹이 내로 흡수될 때까지 처리된 트레이를 흄 후드에서 유지하였다.
부화 몇 시간 이내에, 개별 유충을 습윤된 낙타 헤어 브러시를 사용하여 채취하고, 처리된 먹이 상에 침착시켰다 (웰당 1 또는 2마리의 유충). 이어서, 128-웰 플라스틱 트레이 중 침입된 웰을 투명 플라스틱의 접착 시트로 밀봉하고 환기시켜 기체 교환이 이루어질 수 있도록 하였다. 생물검정 트레이를 9일 동안 제어된 환경 조건 (28℃, ~40% 상대 습도, 16:8 (명:암)) 하에 유지하고, 이 시간 후 각각의 샘플에 노출된 곤충의 총수, 사멸된 곤충의 수, 및 생존하는 곤충의 중량을 기록하였다. 각각의 처리군에 대해 퍼센트 사멸률, 평균 생중량, 및 성장 억제를 계산하였다. 발육부진은 평균 생중량 감소로서 정의하였다. 성장 억제 (GI)는 하기와 같이 계산하였다:
GI = [1 - (TWIT/TNIT)/(TWIBC/TNIBC)],
여기서 TWIT는 처리군에서 생존 곤충의 총 중량이고;
TNIT는 처리군에서의 곤충의 총수이고;
TWIBC는 배경 체크 (완충제 대조군)에서 생존 곤충의 총 중량이고;
TNIBC는 배경 체크 (완충제 대조군)에서의 곤충의 총수이다.
GI50은 GI 값이 50%가 되는 먹이 중 샘플의 농도인 것으로 결정된다. LC50 (50% 치사 농도)은 시험 곤충 중 50%가 사멸하게 되는 먹이 중 샘플의 농도로서 기록된다. 통계학적 분석은 JMP™ 소프트웨어 (SAS, 노스캐롤라이나주 케리)를 사용하여 수행하였다.
실시예 2: 디아브로티카로부터의 후보 표적 유전자의 확인
RNAi 트랜스제닉 식물 곤충 보호 기술에 의한 방제를 위한 후보 표적 유전자 서열을 제공하기 위해, 풀링된 트랜스크립톰 분석을 위해 다중 발생 단계의 WCR (디아브로티카 비르기페라 비르기페라 르콩트)로부터의 곤충을 선택하였다.
한 예시에서, 총 RNA를 약 0.9 gm 전체 제1령 WCR 유충 (부화 4 내지 5일 후; 16℃에서 유지)으로부터 단리하고, 하기 페놀/트리 리에이전트(TRI REAGENT)®-기반 방법 (몰레큘라 리서치 센터(MOLECULAR RESEARCH CENTER), 오하이오주 신시내티)을 사용하여 정제하였다.
균질 현탁액을 수득할 때까지, 실온에서 10 mL의 트리 리에이전트®를 사용하여 15 mL 균질화기 중에서 유충을 균질화하였다. 실온에서 5분 인큐베이션한 후, 균질물을 1.5 mL 미세원심분리기 튜브 내로 분배하고 (튜브당 1 mL), 200 μL의 클로로포름을 첨가하고, 혼합물을 15초 동안 강력하게 진탕하였다. 추출을 통해 실온에서 10분 동안 정치시킨 후에, 4℃에서 12,000 x g로 원심분리에 의해 상을 분리하였다. 상부 상 (약 0.6 mL 포함)을 또 다른 멸균 1.5 mL 튜브 내로 조심스럽게 옮기고, 동등 부피의 실온 이소프로판올을 첨가하였다. 실온에서 5 내지 10분 동안 인큐베이션한 후에, 혼합물을 12,000 x g (4℃ 또는 25℃)로 8분 원심분리하였다.
상청액을 조심스럽게 제거하여 폐기하고, 75% 에탄올을 사용하여 볼텍싱에 의해 RNA 펠릿을 2회 세척하고, 각각의 세척 후에는 7,500 x g (4℃ 또는 25℃)로 5분 동안 원심분리에 의해 회수하였다. 에탄올을 조심스럽게 제거하고, 펠릿을 3 내지 5분 동안 공기-건조시킨 다음, 뉴클레아제-무함유 멸균수 중에 용해시켰다. 260 nm 및 280 nm에서의 흡광도 (A)를 측정함으로써 RNA 농도를 결정하였다. 약 0.9 gm의 유충으로부터의 전형적인 추출을 통해 1 mg 초과의 총 RNA를 수득하였으며, 이때 A260/A280 비는 1.9였다. 이와 같이 추출된 RNA를 추가로 프로세싱할 때까지 -80℃에서 보관하였다.
분취물을 1% 아가로스 겔을 통해 전개시킴으로써 RNA 품질을 결정하였다. 오토클레이빙된 용기 내에서 오토클레이빙된 10X TAE 완충제 (트리스-아세테이트 EDTA; 1x 농도는 DEPC (디에틸 피로카르보네이트)-처리된 물로 희석된 0.04 M 트리스-아세테이트, 1 mM EDTA (에틸렌디아민 테트라-아세트산 나트륨 염), pH 8.0)를 사용하여 아가로스 겔 용액을 제조하였다. 1x TAE를 전개 완충제로서 사용하였다. 사용 전에, 전기영동 탱크 및 웰-형성 빗을 RNAse어웨이(RNAseAway)™ (인비트로젠 인크.(INVITROGEN INC.), 캘리포니아주 칼스배드)로 세정하였다. 2 μL의 RNA 샘플을 8 μL의 TE 완충제 (10 mM 트리스 HCl pH 7.0; 1 mM EDTA) 및 10 μL의 RNA 샘플 완충제 (노바젠(NOVAGEN)® 카탈로그 번호 70606; 이엠디4 바이오사이언스(EMD4 Bioscience), 뉴저지주 깁스타운)와 혼합하였다. 샘플을 70℃에서 3분 동안 가열하고, 실온으로 냉각시키고, 웰당 5 μL (1 μg 내지 2 μg RNA 함유)를 로딩하였다. 분자 크기 비교를 위해 상업적으로 입수가능한 RNA 분자량 마커를 별도의 웰에서 동시에 전개시켰다. 겔을 2시간 동안 60 볼트로 전개시켰다.
무작위 프라이밍을 사용하여 상업용 서비스 제공자 (유로핀스 엠더블유지 오페론(EUROFINS MWG Operon), 알라바마주 헌츠빌)에 의해 유충의 총 RNA로부터 정규화된 cDNA 라이브러리를 제조하였다. 유로핀스 엠더블유지 오페론에서 GS FLX 454 티타늄(Titanium)™ 시리즈 화학에 의해 1/2 플레이트 규모로 정규화된 유충 cDNA 라이브러리를 서열분석하여, 평균 판독물 길이가 348 bp인 600,000개 초과의 판독물을 얻었다. 350,000개의 판독물을 50,000개 초과의 콘티그로 조립하였다. 공중 이용가능한 프로그램인 FORMATDB (NCBI로부터 이용가능함)를 사용하여 조립되지 않은 판독물 및 콘티그 둘 다를 BLASTable 데이터베이스로 전환시켰다.
다른 WCR 발생 단계에서 수거된 물질로부터 총 RNA 및 정규화된 cDNA 라이브러리를 유사하게 제조하였다. 다양한 발생 단계를 나타내는 cDNA 라이브러리 구성원을 조합함으로써 표적 유전자 스크리닝을 위한 풀링된 트랜스크립톰 라이브러리를 구축하였다.
다른 곤충 예컨대 드로소필라 및 트리볼리움에서의 특정한 유전자의 치사 효과에 관한 정보를 사용하여 RNAi 표적화를 위한 후보 유전자를 선택하였다. 예를 들어, 초기 배아 발생 동안 전방-후방 극성의 확립을 위해 필요한 전사 인자인 갭 유전자 hunchback은 드로소필라 및 트리볼리움에서 hunchback 기능의 전체 보존을 기반으로 하여 선택되었다 (Brizuela et al. (1994) Genetics 137(3):803-13; Schroder (2003) Nature 422(6932):621-5; Marques-Souza et al. (2008) Development 135(5):881-8).
조립되지 않은 디아브로티카 서열 판독물 또는 조립된 콘티그를 함유하는 BLASTable 데이터베이스에 대해 후보 단백질 코딩 서열을 사용하는 TBLASTN 검색을 실행하였다. NCBI 비-중복 데이터베이스에 대해 BLASTX를 사용함으로써 (콘티그 상동성의 경우, e-20보다 우수한 것, 및 조립되지 않은 서열 판독물 상동성의 경우, e-10보다 우수한 것으로 정의되는) 디아브로티카 서열에 대한 유의한 히트를 확인하였다. 이 BLASTX 검색 결과를 통해, TBLASTN 검색에서 확인된 디아브로티카 상동체 후보 유전자 서열이 실제로 디아브로티카 유전자를 포함하거나, 또는 비-디아브로티카 후보 유전자 서열에 대해 디아브로티카 서열에서 이용가능한 최상의 히트라는 것을 확인하였다. 대부분의 경우에, 단백질을 코딩하는 것으로서 주석달린 트리볼리움 후보 유전자는 디아브로티카 트랜스크립톰 서열 중 한 서열 또는 서열들에 대해 명확한 서열 상동성을 제공하였다. 몇몇 경우에, 비-디아브로티카 후보 유전자에 대한 상동성에 의해 선택된 디아브로티카 콘티그 또는 조립되지 않은 서열 판독물 중 일부는 중첩되었고, 콘티그의 조립체는 이들 중첩부를 연결하지 못했다는 것이 명확하였다. 상기 경우에, 시퀀서(SEQUENCHER)™ v4.9 (진 코드 코포레이션(GENE CODES CORPORATION), 미시간주 앤 아버)를 사용하여 서열을 보다 긴 콘티그로 조립하였다.
디. 브이. 비르기페라의 추가의 트랜스크립톰 서열분석은 이전에 기재되었다. 문헌 [Eyun et al. (2014) PLoS One 9(4):e94052]. 또 다른 예시에서, 일루미나(Illumina)™ 쌍형성된-말단, 뿐만 아니라 454 티타늄 서열분석 기술을 사용하여, 알 (여과 후 15,162,017개의 일루미나™ 쌍형성된-말단 판독물), 신생충 (여과 후 721,697,288개의 일루미나™ 쌍형성된-말단 판독물), 및 제3령 유충의 중장 (둘 다 여과 후 44,852,488개의 일루미나™ 쌍형성된-말단 판독물 및415,742개의 로슈 454 판독물)으로부터 제조된 cDNA로부터 총 ~700개의 기가염기를 서열분석하였다. 각각의 3개의 샘플 뿐만 아니라 풀링된 데이터세트에 대해서 트리니티 (Grabherr et al. (2011) Nat. Biotechnol. 29(7):644-52)를 사용하여 신생 트랜스크립톰 조립을 수행하였다. 풀링된 조립은 914 bp의 평균 길이를 갖는 163,871개의 콘티그를 생성하였다. 10-5의 컷오프 E 값을 사용하여 tBLASTN에 의해 뿌리벌레 트랜스크립톰 및 게놈 데이터베이스 (비공개)를 검색하는데 드로소필라 또는 트리볼리움으로부터의 HUNCHBACK의 아미노산 서열을 질의 서열로서 사용하였다. 추정 아미노산 서열을 클러스탈X(ClustalX)™에 의해 정렬하고, 진독(GeneDoc)™ 소프트웨어에 의해 편집하였다.
딱정벌레류 해충 사멸 또는 WCR에서의 성장, 발생, 또는 생식 억제를 유도할 수 있는, 전사체 서열식별번호: 1, 이와 하위서열 서열식별번호: 3 및 서열식별번호: 67을 포함한 후보 표적 유전자가 확인되었다. 이들 서열은 유전자 상실이 체제에 갭을 생성하는 것인, 갭 유전자로서 또한 정의되는 C2H2-유형 아연-핑거 단백질 패밀리 전사 인자에 상응하는 HUNCHBACK 단백질 또는 그의 하위영역을 코딩한다. WCR hunchback 서열 내에서, 6종의 C2H2 유형 아연 핑거 도메인은 아연 핑거 전사 인자로서의 그의 역할과 일치하게 573개의 아미노산 단백질의 위치 226-248, 255-277, 283-305, 311-335, 520-542, 및 548-572에서 SMART 데이터베이스 (월드 와이드 웹 상에서 인터프로스캔에서 이용가능함)를 사용하여 예측되었다. 도 2.
서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드는 신규하다. 서열은 공중 데이터베이스에도 제공되어 있지 않고, WO/2011/025860; 미국 특허 출원 번호 20070124836; 미국 특허 출원 번호 20090306189; 미국 특허 출원 번호 US20070050860; 미국 특허 출원 번호 20100192265; 또는 미국 특허 7,612,194에도 개시되어 있지 않다. 진뱅크에서의 검색으로 발견된 어떠한 유의한 상동 뉴클레오티드 서열도 존재하지 않았다. 디아브로티카 HUNCHBACK 아미노산 서열 (서열식별번호: 2)의 가장 밀접한 상동체는 진뱅크 수탁 번호 NP_001038093.1을 갖는 트리볼리움 카스타네움 단백질이다 (상동성 영역에 걸쳐 66% 유사; 53% 동일).
디아브로티카 후보 hunchback 유전자의 서열의 전장 또는 부분적 클론을 사용하여 dsRNA 합성을 위한 PCR 앰플리콘을 생성하였다. dsRNA를 또한 황색 형광 단백질 (YFP)에 대한 코딩 영역을 포함하는 DNA 클론 (서열식별번호: 10; 문헌 [Shagin et al. (2004) Mol. Biol. Evol. 21:841-850])으로부터 증폭시켰다.
실시예 3: 디아브로티카로부터의 표적 유전자의 증폭
PCR에 의해 각각의 표적 유전자의 코딩 영역의 부분을 증폭시키도록 프라이머를 설계하였다. 표 1을 참조한다. 적절한 경우, T7 파지 프로모터 서열 (TAATACGACTCACTATAGGG (서열식별번호: 4))을 증폭된 센스 또는 안티센스 가닥의 5' 말단 내로 혼입시켰다. 표 1을 참조한다. 총 RNA를 WCR로부터 추출하고, 천연 표적 유전자 서열의 모두 또는 일부를 증폭시키도록 배치된 대향 프라이머를 사용하는 PCR 반응을 위한 주형으로서 제1 가닥 cDNA를 사용하였다.
표 1. 예시적인 hunchback 및 YFP 표적 유전자의 코딩 영역의 부분을 증폭시키는데 사용된 프라이머 및 프라이머 쌍.
Figure pct00006
실시예 4: RNAi 구축물
PCR에 의한 주형 제조 및 dsRNA 합성.
hunchback dsRNA 생산을 위한 특이적 주형을 제공하는데 사용된 전략이 도 1A 및 도 1B에 제시된다. hunchback Reg1 또는 hunchback v1 dsRNA 합성에 사용하기 위해 의도된 주형 DNA를 각각 프라이머 쌍 1 및 프라이머 쌍 2 (표 1) 및 (PCR 주형으로서) 총 RNA로부터 제조된 제1 가닥 cDNA를 사용하여 PCR에 의해 제조하였다. hunchback Reg1 및 hunchback v1 선택된 표적 유전자 영역에 대해, 2회의 별도의 PCR 증폭을 수행하였다. 도 1. 제1 PCR 증폭은 증폭된 센스 가닥의 5' 말단에 T7 프로모터 서열을 도입하였다. 제2 반응은 안티센스 가닥의 5' 말단에 T7 프로모터 서열을 혼입시켰다. 이어서, 표적 유전자의 각각의 영역에 대한 2개의 PCR 증폭된 단편을 대략 동일한 양으로 혼합하고, 혼합물을 dsRNA 생산을 위한 전사 주형으로서 사용하였다. 도 1. 특정한 프라이머로 증폭된 hunchback Reg1 dsRNA 주형의 서열은 서열식별번호: 3으로서 개시된다. 특정한 프라이머로 증폭된 hunchback v1 dsRNA 주형의 서열은 서열식별번호: 67로서 개시된다.
YFP 음성 대조군을 위해, 단일 PCR 증폭을 수행하였다. 도 1B. PCR 증폭은 증폭된 센스 및 안티센스 가닥의 5' 말단에 T7 프로모터 서열을 도입하였다. 이어서, 표적 유전자의 각각의 영역에 대한 2개의 PCR 증폭된 단편을 대략 동일한 양으로 혼합하고, 혼합물을 dsRNA 생산을 위한 전사 주형으로서 사용하였다. 도 1B. 음성 대조군 YFP 코딩 영역 (서열식별번호: 10)에 대한 dsRNA를 프라이머 쌍 3 (표 1) 및 주형으로서 YFP 코딩 영역의 DNA 클론을 사용하여 생산하였다. GFP 음성 대조군을 프라이머 쌍 4 (표 1)를 사용하여 pIZT/V5-His 발현 벡터 (인비트로젠)로부터 증폭시켰다. hunchback 및 GFP에 대해 증폭된 PCR 산물을 메가스크립트 고수율 전사 키트 (어플라이드 바이오시스템즈 인크.(Applied Biosystems Inc.), 캘리포니아주 포스터 시티)를 사용하여 dsRNA의 시험관내 합성을 위한 주형으로서 사용하였다. 합성된 dsRNA를 RN이지 미니 키트 (퀴아젠(Qiagen), 캘리포니아주 발렌시아) 또는 암비온(AMBION)® 메가스크립트® RNAi 키트를 사용하여 본질적으로 제조업체의 지침서에 의해 규정된 바와 같이 정제하였다. dsRNA 제제를 나노드롭™ 8000 분광광도계 (써모 사이언티픽, 델라웨어주 윌밍톤) 또는 동등한 수단을 사용하여 정량화하고, 겔 전기영동에 의해 분석하여 순도를 결정하였다.
실시예 5: 디아브로티카 유충에서의 후보 표적 유전자의 스크리닝
반복된 생물검정은 먹이-기반 검정에 있어서 WCR에게 투여되었을 때 실시예 2에서 확인된 hunchback Reg1 표적 유전자 서열로부터 유래된 합성 dsRNA 제제의 섭취가 서부 옥수수 뿌리벌레 유충의 사멸 및 성장 억제를 야기하였다는 것을 입증하였다. 표 2.
표 2. 단일 용량의 dsRNA에 대한 9-일 노출 후 WCR 유충의 먹이-기반 섭식 생물검정의 결과. ANOVA 분석은 평균 % 사멸률 (Mort.) 및 평균 % 성장 억제 (GI)에서의 일부 유의차를 발견하였다. 터키-크레이머 검정을 사용하여 평균을 분리하였다.
Figure pct00007
*SEM- 평균의 표준 오차. 괄호 안의 문자는 통계적 수준을 지정한다. 동일한 문자가 이어지지 않은 수준은 유의하게 상이하다 (p< 0.05).
**TE- 트리스 HCl (1 mM) 플러스 EDTA (1 mM) 완충제, pH7.2.
***YFP- 황색 형광 단백질
디아브로티카 종의 특정 유전자가 RNAi-매개 곤충 방제에 사용될 수 있다는 것은 이전에 시사되었다. 906개의 서열을 개시하는 미국 특허 공개 번호 2007/0124836, 및 9,112개의 서열을 개시하는 미국 특허 7,614,924를 참조한다. 그러나, RNAi-매개 곤충 방제에 대해 유용성을 갖는 것으로 시사된 많은 유전자는 디아브로티카를 방제하는데 있어서는 효과적이지 않은 것으로 결정되었다. 또한, hunchback Reg1은 RNAi-매개 곤충 방제에 대해 유용성을 갖는 것으로 시사된 다른 유전자와 비교하여, 디아브로티카의 놀랍고도 예상외의 방제를 제공한 것으로 결정되었다.
예를 들어, 아넥신, 베타 스펙트린 2, 및 mtRP-L4는 각각 미국 특허 7,614,924에서 RNAi-매개 곤충 방제에 효과적인 것으로 시사되었다. 서열식별번호: 11은 아넥신 영역 1의 DNA 서열이고, 서열식별번호: 12는 아넥신 영역 2의 DNA 서열이다. 서열식별번호: 13은 베타 스펙트린 2 영역 1의 DNA 서열이고, 서열식별번호: 14는 베타 스펙트린 2 영역 2의 DNA 서열이다. 서열식별번호: 15는 mtRP-L4 영역 1의 DNA 서열이고, 서열식별번호: 16은 mtRP-L4 영역 2의 DNA 서열이다.
각각의 상기 언급된 서열을 사용하여 실시예 4의 이중 프라이머 쌍 방법에 의해 dsRNA를 생산하고 (도 1), dsRNA를 각각 상기 기재된 먹이-기반 생물검정 방법에 의해 시험하였다. YFP 서열 (서열식별번호: 10)을 또한 사용하여 음성 대조군으로서 dsRNA를 생산하였다. 표 3은 아넥신, 베타 스펙트린 2, mtRP-L4, 및 YFP dsRNA 분자를 생산하는데 사용된 프라이머의 서열을 열거한다. 표 4는 이들 dsRNA 분자에 대한 9-일 노출 후 WCR 유충의 먹이-기반 섭식 생물검정의 결과를 제시한다. 반복된 생물검정은 이들 dsRNA의 섭취가 TE 완충제, YFP dsRNA, 또는 물의 대조군 샘플에서 관찰된 경우를 초과하는 어떠한 서부 옥수수 뿌리벌레 유충의 사멸 또는 성장 억제도 유발하지 않았다는 것을 입증하였다.
표 3. 유전자의 코딩 영역의 부분을 증폭시키는데 사용된 프라이머 및 프라이머 쌍.
Figure pct00008
Figure pct00009
표 4. 서부 옥수수 뿌리벌레 유충에 의해 수득된 먹이 섭식 검정의 결과.
Figure pct00010
실시예 6: 디아브로티카 성충 섭식 검정을 위한 샘플 제조 및 생물검정
서부 옥수수 뿌리벌레에서의 모 RNA 간섭 (RNAi)은 hunchback 표적 유전자 서열의 절편에 상응하는 dsRNA를 임신 성충 암컷에게 섭식시킴으로써 수행하였다. 성충 뿌리벌레 (출아 <48시간 후)는 크롭 캐릭터리스틱스, 인크. (미네소타주 파밍톤)로부터 입수하였다. 성충은 모든 생물검정을 위해 23±1℃, >75%의 상대 습도, 및 8시간:16시간의 명:암 주기에서 사육하였다. 곤충 사육 먹이를 문헌 [Branson and Jackson (1988), J. Kansas Entomol. Soc. 61:353-55]으로부터 적합화시켰다. 2.9% 한천 및 5.6 mL의 글리세롤과 함께 이중 증류수를 포함하는 용액에 건조 성분을 첨가하였다 (48 gm/100 mL). 추가로, 미생물 성장을 억제하기 위해 100 mL의 먹이당 47% 프로피온산 및 6% 인산 용액을 포함하는 혼합물 0.5 mL를 첨가하였다. 한천을 비등수 중에 용해시키고, 건조 성분, 글리세롤, 및 프로피온산/인산 용액을 첨가하고, 철저히 혼합하고, 대략 2 mm의 깊이까지 부었다. 응고된 먹이 플러그 (직경 약 4 mm x 높이 2 mm; 25.12 mm3)를 1번 코르크 천공기를 사용하여 먹이로부터 절단하였다. 6마리의 성충 수컷 및 암컷 (24 내지 48시간령)을 비처리 인공 먹이 상에서 유지하고, 환기 뚜껑이 있는 16 웰 트레이 (5.1 cm 길이 x 3.8 cm 폭 x 2.9 높이)에서 4일 동안 교미하도록 하였다.
제5일에, 수컷을 용기로부터 제거하고, 암컷을 3μL hunchback Reg1 (서열식별번호: 3) 유전자-특이적 dsRNA (2 μg/먹이 플러그; 약 79.6 ng/mm3)로 처리된 인공 먹이 표면 플러그 상에서 섭식시켰다. 대조 처리군은 동일한 농도의 GFP dsRNA (서열식별번호: 9) 또는 동일한 부피의 물로 처리한 먹이에 노출된 임신 암컷으로 이루어졌다. GFP dsRNA는 5' 말단에 T7 프로모터 서열을 갖는 대향 프라이머 (서열식별번호: 7 및 8)를 사용하여 상기 기재된 바와 같이 생산하였다. dsRNA로 처리된 신선한 인공 먹이를 실험 내내 격일로 제공하였다. 제11일에, 암컷을 60-메쉬 체를 통해 이동되는 오토클레이빙된 미사질 식양토를 함유하는 산란 케이지 (7.5 cm x 5.5 cm x 5.5 cm) (쇼우맨 박스, 알토르 프로덕츠(Althor Products), 코네티컷주 윌톤)로 옮겼다 (Jackson (1986) Rearing and handling of Diabrotica virgifera and Diabrotica undecimpunctata howardi. Pages 25 to 47 in J. L. Krysan and T.A. Miller, eds. Methods for the study of pest Diabrotica. Springer-Verlag, New York). 암컷이 4일 동안 알을 낳도록 하고, 알을 27℃에서 10일 동안 산란 상자 내 토양에서 인큐베이션한 다음, 60-메쉬 체를 통해 산란 토양을 세척함으로써 토양으로부터 제거하였다. 알은 진균 성장을 방지하기 위해 포름알데히드 (5 mL 이중 증류수 중 500 μL 포름알데히드) 및 메틸-(부틸카르바모일)-2-벤즈이미다졸 카르바메이트 (50 mL 이중 증류수 중 0.025 g)의 용액으로 처리하였다. 암컷을 산란 상자로부터 제거하고, 각각의 처리로부터의 알의 하위샘플은 정량적 RT-PCR에 의한 후속 발현 분석을 위해 액체 질소에서 급속 동결시켰다 (실시예 7 참조). 접시를 디노-라이트 프로 디지털 현미경 (캘리포니아주 토런스)으로 사진찍고, 이미지 J 소프트웨어의 세포 계수기 기능을 사용하여 총 알을 계수하였다 (Schneider et al. (2012) Nat. Methods 9:671-5). 수거된 알을 28℃에서 페트리 디쉬 내 습윤 여과지 상에서 유지하고, 15일 동안 모니터링하여 알 생존율을 결정하였다. 각각 3 내지 6마리의 암컷을 포함하는 6회의 반복을 별도의 날에 실행하였다. 각각의 처리로부터 부화하는 유충의 수를 추가의 부화가 관찰되지 않을 때까지 매일 기록하였다.
성충 WCR 암컷에 의한 hunchback Reg1 dsRNA 분자의 섭취는 알 생존율에 대한 놀랍고도 극적이며 재현가능한 효과를 나타내는 것으로 입증되었다. hunchback dsRNA에 노출된 교미된 암컷은 비처리 먹이 또는 GFP dsRNA로 처리된 먹이에 노출된 암컷과 대략 동일한 수의 알을 생산하였다 (도 3A; 표 5). 그러나, hunchback dsRNA에 노출된 암컷으로부터 수집된 알은 생존하지 않았다 (도 3B; 표 5). hunchback dsRNA에 노출된 성충 암컷은 <3%의 알 부화를 나타냈다.
도 3A 및 3B는 dsRNA 처리가 알 생산 및 알 생존율에 대해 나타내는 효과에 관한 표 5의 데이터를 그래프로 요약한다.
표 5. 처리된 인공 먹이의 섭취 11일 후에 WCR 알 생산 및 알 생존율에 대한 hunchback dsRNA의 효과. 쌍별 비교를 사용하여 평균을 분리하였다.
Figure pct00011
*SEM- 평균의 표준 오차. 괄호 안의 문자는 통계적 수준을 지정한다. 동일한 문자가 이어지지 않은 수준은 유의하게 상이하다 (P<0.05).
각각의 처리로부터 부화되지 않은 알을 해부하여 배아 발생을 검사하고 모 RNAi (pRNAi)의 표현형 반응을 추정하였다. GFP dsRNA로 처리된 WCR 암컷에 의해 놓여진 알은 정상 발생을 나타냈다. 도 4A. 대조적으로, hunchback Reg-1 dsRNA로 처리된 암컷에 의해 놓여진 알은 알 안에서 일부 배아 발생을 나타냈으며, 그러나 해부되었을 때, 반응이 개별 유충 사이에서 가변적이긴 하였지만, 시각적으로 단축되어 있었고 수많은 복부 및 가슴 절편이 누락된 것처럼 보였다. 도 4B. 따라서, hunchback dsRNA의 섭취가 유충에 대한 치사 또는 성장 억제 효과를 나타낸다는 것은 본 발명의 예상외의 놀라운 발견이다. 추가로, 임신 성충 WCR 암컷에 의한 hunchback dsRNA 섭취는 알 생산 및 알 생존율에 대해 극적인 영향을 미치지만, 성충 암컷 자체에 대해서는 어떠한 식별가능한 극적인 효과도 나타내지 않는다는 것은 놀랍고도 예상외이다.
상기 결과는 서부 옥수수 뿌리벌레 유충 및 성충에서의 RNAi의 침투성 성질, 및 배아 발생과 연관된 유전자가 dsRNA에 노출된 암컷의 알에서 녹다운되는 모 효과를 달성하기 위한 잠재력을 명확히 기록한다. 중요하게는, 이것은 서부 옥수수 뿌리벌레에서 섭취된 dsRNA에 대한 pRNAi 반응의 최초 보고이다. 침투성 반응은 dsRNA의 노출 및 흡수가 발생하는 소화관 이외의 다른 조직에서의 녹다운의 관찰을 기반으로 나타내어진다. 일반적으로 곤충, 및 특히 뿌리벌레는 식물 및 선충류에서 침투성 반응과 연관된 RNA-의존성 RNA 폴리머라제가 결여되어 있기 때문에, 본 발명자들의 결과는 dsRNA가 장 조직에 의해 흡수되고 다른 조직 (예를 들어, 발생하는 난소소관)으로 전위될 수 있다는 것을 확인시켜 준다.
알이 부화하지 않도록 배아 발생에 수반된 유전자의 발현을 녹다운시키는 능력은 서부 옥수수 뿌리벌레의 방제를 달성하고 개선시키기 위한 고유한 기회를 제공한다. 성충이 지상 생식 조직 (예컨대 수염 및 웅수)을 용이하게 섭식하기 때문에, 성충 뿌리벌레는 dsRNA의 트랜스제닉 발현에 의해 iRNA 방제제에 노출되어 알이 부화하는 것을 방지함으로써 후속 세대에서의 뿌리 보호를 달성할 수 있다. 옥수수 식물에서 dsRNA의 트랜스제닉 발현을 통한 또는 표면-적용된 iRNA와의 접촉에 의한 dsRNA의 전달은 유충을 직접적으로 표적화하고 해충 관리 전략의 전체 지속성을 증진시키는 다른 트랜스제닉 접근법에 대한 중요한 스택킹 파트너를 제공한다.
실시예 7: 실시간 PCR 분석
총 RNA를 성충 암컷, 수컷, 처리된 암컷으로부터 부화된 유충, 및 알의 전체 몸체로부터 RN이지 미니 키트 (퀴아젠, 캘리포니아주 발렌시아)를 사용하여 제조업체의 권장에 따라 단리하였다. 전사 반응의 개시 전에, 퀀티테크 역전사 키트 (퀴아젠, 캘리포니아주 발렌시아)를 사용하여 임의의 gDNA를 제거하기 위해 DNase로 총 RNA를 처리하였다. 총 RNA (500 ng)를 사용하여 실시간 정량적 PCR (qPCR)을 위한 주형으로서 제1 가닥 cDNA를 합성하였다. RNA를 260 nm에서 분광광도계로 정량화하고, 아가로스 겔 전기영동에 의해 순도를 평가하였다. qPCR 분석에 사용된 프라이머는 비콘 디자이너 소프트웨어 (프리미어 바이오소프트 인터내셔널(Premier Biosoft International), 캘리포니아주 팔로 알토)를 사용하여 설계하였다. 프라이머 쌍의 효율은 5배 연속 희석물 (1: 1/5: 1/25:1/125: 1/625)을 삼중으로 사용하여 평가하였다. 증폭 효율은 이 연구에 사용된 모든 qPCR 프라이머 쌍에 대해 96.1%보다 높았다. 이 연구에 사용된 모든 프라이머 조합은 cDNA 주형의 양과 PCR 산물의 양 사이에 선형 상관을 나타냈다. 모든 상관 계수는 0.99보다 컸다. 7500 패스트 시스템 SDS v2.0.6 소프트웨어 (어플라이드 바이오시스템즈)를 사용하여 기울기, 상관 계수, 및 효율을 결정하였다. 각각 2회의 기술적 반복을 갖는 3회의 생물학적 반복을 qPCR 분석에 사용하였다. qPCR은 SYBR 그린 키트 (어플라이드 바이오시스템즈 인크., 캘리포니아주 포스터 시티) 및 7500 패스트 시스템 실시간 PCR 검출 시스템 (어플라이드 바이오시스템즈 인크., 캘리포니아주 포스터 시티)을 사용하여 수행하였다. qPCR 사이클링 파라미터는 제조업체의 프로토콜 (어플라이드 바이오시스템즈 인크., 캘리포니아주 포스터 시티)에 기재된 바와 같이, 각각 3초 동안 95℃, 30초 동안 58℃로 이루어진 40 사이클을 포함하였다. 각각의 PCR 반응의 종료시에, 용융 곡선을 생성하여 단일 피크를 확인하고 프라이머-이량체 및 비-특이적 산물 형성의 가능성을 배제하였다. 전사체의 상대 정량화를 비교 2-ΔΔCT 방법을 사용하여 계산하고, β-액틴에 대해 정규화하였다.
도 5(A-D)는 물 대조군과 비교하여 알, 성충 암컷, 유충, 및 성충 수컷에서 hunchback 및 GFP의 상대 전사체 수준을 제시하는 표 6의 데이터를 그래프로 요약한다. 성충 (수컷 및 암컷) 및 알에서 전사체 수준의 놀라운 감소가 존재한다. 처리된 암컷으로부터 부화된 유충에서 전사체의 감소는 존재하지 않는다.
표 6. GFP 및 물 대조군에 비해 처리된 인공 먹이에서의 dsRNA에 노출된 알, 성충 암컷, 성충 수컷, 및 유충에서 hunchback의 상대 발현. 쌍별 비교를 사용하여 평균을 분리하였다.
Figure pct00012
*SEM - 평균의 표준 오차. 괄호 안의 문자는 통계적 수준을 지정한다. 동일한 문자가 이어지지 않은 수준은 유의하게 상이하다 (p< 0.05; N = 10개의 알 또는 유충/반복의 3회 생물학적 반복 또는 2회 기술적 반복/샘플을 갖는 개별 성충).
실시예 8: 식물 형질전환 벡터의 구축
hunchback (서열식별번호: 1), hunchback Reg1 (서열식별번호: 3), 및/또는 hunchback v1 (서열식별번호: 67)의 절편을 포함하는 dsRNA 헤어핀 형성을 위한 표적 유전자 구축물을 보유하는 진입 벡터를 화학적으로 합성된 단편 (DNA2.0, 캘리포니아주 멘로 파크) 및 표준 분자 클로닝 방법의 조합을 사용하여 조립한다. (단일 전사 단위 내에서) 표적 유전자 절편의 2개 카피를 서로 반대 배향으로 배열함으로써 (상기 2개 절편은 링커 서열 (예를 들어 ST-LS1 인트론, 서열식별번호: 45; 문헌 [Vancanneyt et al. (1990) Mol. Gen. Genet. 220:245-250])에 의해 이격되어 있음) RNA 1차 전사체에 의한 분자내 헤어핀 형성을 용이하게 한다. 따라서, 1차 mRNA 전사체는 링커 서열에 의해 이격된, 서로의 큰 역위 반복부로서 2개의 hunchback 유전자 절편 서열을 함유한다. 프로모터의 카피 (예를 들어, 메이즈 유비퀴틴 1, 미국 특허 5,510,474; 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV)로부터의 35S; 벼 액틴 유전자로부터의 프로모터; 유비퀴틴 프로모터; pEMU; MAS; 메이즈 H3 히스톤 프로모터; ALS 프로모터; 파세올린 유전자 프로모터; cab; rubisco; LAT52; Zm13; 및/또는 apg)를 사용하여 1차 mRNA 헤어핀 전사체의 생산을 구동하고, 3' 비번역 영역, 예를 들어 및 비제한적으로, 메이즈 퍼옥시다제 5 유전자 (ZmPer5 3'UTR v2; 미국 특허 6,699,984), AtUbi10, AtEf1, 또는 StPinII를 포함하는 단편을 사용하여 헤어핀-RNA-발현 유전자의 전사를 종결시킨다.
진입 벡터는 hunchback (서열식별번호: 1), hunchback Reg1 (서열식별번호: 3), 및 hunchback v1 (서열식별번호: 67)의 절편을 포함하는 hunchback v1 헤어핀-RNA 구축물 (서열식별번호: 46)을 포함한다.
상기 기재된 바와 같은 진입 벡터를 전형적인 이원 목표 벡터와의 표준 게이트웨이(GATEWAY)® 재조합 반응에 사용하여 아그로박테리움-매개 메이즈 배아 형질전환을 위한 hunchback 헤어핀 RNA 발현 형질전환 벡터를 생산한다.
YFP 헤어핀 dsRNA를 발현하는 유전자를 포함하는 음성 대조군 이원 벡터는 전형적인 이원 목표 벡터 및 진입 벡터와의 표준 게이트웨이® 재조합 반응에 의해 구축한다. 진입 벡터는 메이즈 유비퀴틴 1 프로모터 (상기와 같음)의 발현 제어 하의 YFP 헤어핀 서열 및 메이즈 퍼옥시다제 5 유전자로부터의 3' 비번역 영역 (상기와 같음)을 포함하는 단편을 포함한다.
이원 목표 벡터는 식물 작동가능한 프로모터 (예를 들어, 사탕수수 간균형 바드나바이러스 (ScBV) 프로모터 (Schenk et al. (1999) Plant Mol. Biol. 39:1221-30) 또는 ZmUbi1 (미국 특허 5,510,474))의 조절 하의 제초제 내성 유전자 (아릴옥시알카노에이트 디옥시게나제; AAD-1 v3) (미국 특허 7,838,733, 및 문헌 [Wright et al. (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107:20240-5])를 포함한다. 5' UTR 및 이들 프로모터로부터의 인트론은 프로모터 절편의 3' 말단과 AAD-1 코딩 영역의 개시 코돈 사이에 위치되어 있다. 메이즈 리파제 유전자로부터의 3' 비번역 영역 (ZmLip 3'UTR; 미국 특허 7,179,902)을 포함하는 단편을 사용하여 AAD-1 mRNA의 전사를 종결시킨다.
YFP 단백질을 발현하는 유전자를 포함하는 추가의 음성 대조군 이원 벡터를 전형적인 이원 목표 벡터 및 진입 벡터와의 표준 게이트웨이® 재조합 반응에 의해 구축한다. 이원 목표 벡터는 메이즈 유비퀴틴 1 프로모터 (상기와 같음)의 발현 조절 하의 제초제 내성 유전자 (아릴옥시알카노에이트 디옥시게나제; AAD-1 v3) (상기와 같음) 및 메이즈 리파제 유전자로부터의 3' 비번역 영역 (ZmLip 3'UTR; 상기와 같음)을 포함하는 단편을 포함한다. 진입 벡터는 메이즈 유비퀴틴 1 프로모터 (상기와 같음)의 발현 제어 하의 YFP 코딩 영역 및 메이즈 퍼옥시다제 5 유전자로부터의 3' 비번역 영역 (상기와 같음)을 포함하는 단편을 포함한다.
서열식별번호: 46은 hunchback v1 헤어핀-형성 서열을 제공한다.
실시예 9: 살곤충 dsRNA를 포함하는 트랜스제닉 메이즈 조직
아그로박테리움-매개 형질전환. 1종 이상의 살곤충 dsRNA 분자 (예를 들어, hunchback (서열식별번호: 1), hunchback Reg1 (서열식별번호: 3), 및 hunchback v1 (서열식별번호: 67)의 절편을 포함하는 유전자를 표적화하는 dsRNA 분자를 포함한 적어도 1종의 dsRNA 분자)를 식물 게놈 내로 안정하게 통합된 키메라 유전자의 발현을 통해 생산하는 트랜스제닉 메이즈 세포, 조직, 및 식물을 아그로박테리움-매개 형질전환 후에 생산한다. 초이원 또는 이원 형질전환 벡터를 사용하는 메이즈 형질전환 방법은, 예를 들어 미국 특허 8,304,604 (이는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 형질전환된 조직을 할록시포프-함유 배지에서 성장하는 그의 능력에 의해 선택하고, 적절한 경우에 dsRNA 생산에 대해 스크리닝한다. 이러한 형질전환된 조직 배양물의 부분은, 본질적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 생물검정을 위한 신생 옥수수 뿌리벌레 유충에게 제공될 수 있다.
아그로박테리움 배양 개시. 상기 기재된 바와 같은 이원 형질전환 벡터 pDAB109819 또는 pDAB114245 (실시예 7)를 보유하는 아그로박테리움 균주 DAt13192 세포 (WO 2012/016222A2)의 글리세롤 스톡을 적절한 항생제를 함유하는 AB 최소 배지 플레이트 (Watson et al. (1975) J. Bacteriol. 123:255-264) 상에 스트리킹하고, 20℃에서 3일 동안 성장시킨다. 이어서, 배양물을 동일한 항생제를 함유하는 YEP 플레이트 (gm/L: 효모 추출물, 10; 펩톤, 10; NaCl 5) 상에 스트리킹하고, 20℃에서 1일 동안 인큐베이션하였다.
아그로박테리움 배양. 실험 날에, 접종 배지 및 아세토시린곤의 원액을 실험에서의 구축물 수에 적절한 부피로 제조하고, 멸균 일회용 250 mL 플라스크 내로 피펫팅한다. 접종 배지 (Frame et al. (2011) Genetic Transformation Using Maize Immature Zygotic Embryos. IN Plant Embryo Culture Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. T. A. Thorpe and E. C. Yeung, (Eds), Springer Science and Business Media, LLC. pp 327-341)는 2.2 gm/L MS 염; 1X ISU 변형된 MS 비타민 (Frame et al. (2011)) 68.4 gm/L 수크로스; 36 gm/L 글루코스; 115 mg/L L-프롤린; 및 100 mg/L 미오이노시톨 (pH 5.4)을 함유하였다. 아세토시린곤을 접종 배지를 함유하는 플라스크에 100% 디메틸 술폭시드 중 1 M 원액으로부터 200 μM의 최종 농도로 첨가하고, 용액을 철저히 혼합한다.
각각의 구축물에 대해, YEP 플레이트로부터의 아그로박테리움의 1 또는 2개의 접종 루프-풀을 멸균 일회용 50 mL 원심분리 튜브 내 15 mL의 접종 배지/아세토시린곤 원액 중에 현탁시키고, 550 nm에서의 용액의 광학 밀도 (OD550)를 분광광도계에서 측정한다. 이어서, 현탁액을 추가의 접종 배지/아세토시린곤 혼합물을 사용하여 0.3 내지 0.4의 OD550으로 희석한다. 이어서, 아그로박테리움 현탁액의 튜브를 실온에서 약 75 rpm으로 설정된 플랫폼 진탕기 상에 수평으로 두고, 배아 해부를 수행하면서 1 내지 4시간 동안 진탕시킨다.
이삭 멸균 및 배아 단리. 메이즈 미성숙 배아를 온실에서 성장시켜 이삭을 생산하도록 자기- 또는 형매-수분된 제아 메이스 근교계 B104의 식물 (Hallauer et al. (1997) Crop Science 37:1405-1406)로부터 수득한다. 수분 대략 10 내지 12일 후에 이삭을 수거한다. 실험 날에, 도정된 이삭을 상업용 표백제의 20% 용액 (울트라 클로록스(ULTRA CLOROX)® 살균 표백제, 6.15% 차아염소산나트륨; 트윈 20 2 방울 포함) 중에 침지시키고, 20 내지 30분 동안 진탕시키고, 이어서 층류 후드 내의 멸균 탈이온수 중에서 3회 헹구어 표면-멸균한다. 미성숙 접합 배아 (1.8 내지 2.2 mm 길이)를 각각의 이삭으로부터 무균 해부하고, 2 μL의 10% 브레이크-스루(BREAK-THRU)® S233 계면활성제 (에보닉 인더스트리즈(EVONIK INDUSTRIES); 독일 에센)가 첨가된, 200 μM 아세토시린곤이 있는 액체 접종 배지에 적절한 아그로박테리움 세포의 현탁액 2.0 mL를 함유하는 마이크로원심분리 튜브 내로 무작위로 분배하였다. 주어진 실험 설정을 위해, 풀링된 이삭으로부터의 배아를 각각의 형질전환에 사용한다.
아그로박테리움 공동-배양. 단리 후에, 배아를 5분 동안 로커 플랫폼 상에 둔다. 이어서, 튜브의 내용물을 4.33 gm/L MS 염; 1X ISU 변형된 MS 비타민; 30 gm/L 수크로스; 700 mg/L L-프롤린; KOH 중 3.3 mg/L 디캄바 (3,6-디클로로-o-아니스산 또는 3,6-디클로로-2-메톡시벤조산); 100 mg/L 미오-이노시톨; 100 mg/L 카세인 효소 가수분해물; 15 mg/L AgNO3; DMSO 중 200 μM 아세토시린곤; 및 3 gm/L 겔잔(GELZAN)™ (pH 5.8)을 함유하는 공동-배양 배지의 플레이트 상에 붓는다. 액체 아그로박테리움 현탁액을 멸균 일회용 전달 피펫으로 제거한다. 이어서, 배아를 현미경의 보조 하에 멸균 겸자를 사용하여 배반이 상부를 향하도록 배향한다. 플레이트를 폐쇄하고, 3M™ 마이크로포어(MICROPORE)™ 의료 테이프로 밀봉하고, 광합성 유효 방사선 (PAR)의 대략 60 μmol m-2s-1에서의 연속광 하에 25℃의 인큐베이터에 둔다.
트랜스제닉 이벤트의 캘러스 선택 및 재생. 공동-배양 기간 후에, 배아를 4.33 gm/L MS 염; 1X ISU 변형된 MS 비타민; 30 gm/L 수크로스; 700 mg/L L-프롤린; KOH 중 3.3 mg/L 디캄바; 100 mg/L 미오-이노시톨; 100 mg/L 카세인 효소 가수분해물; 15 mg/L AgNO3; 0.5 gm/L MES (2-(N-모르폴리노)에탄술폰산 1수화물; 피토테크놀로지스 래보러토리즈(PHYTOTECHNOLOGIES LABR.; 캔자스주 레넥사); 250 mg/L 카르베니실린; 및 2.3 gm/L 겔잔™ (pH 5.8)으로 구성된 휴지 배지로 옮긴다. 36개 이하의 배아를 각각의 플레이트로 이동시킨다. 플레이트를 투명 플라스틱 상자에 두고, 7 내지 10일 동안 대략 50 μmol m-2s-1 PAR에서의 연속광 하에 27℃에서 인큐베이션한다. 이어서, 캘러스화 배아를 100 nM R-할록시포프산 (0.0362 mg/L; AAD-1 유전자를 보유하는 캘러스의 선택을 위함)이 있는 휴지 배지 (상기)로 구성된 선택 배지 I 상으로 옮긴다 (<18개/플레이트). 플레이트를 투명한 상자로 복귀시키고, 7일 동안 대략 50 μmol m-2s-1 PAR에서의 연속광 하에 27℃에서 인큐베이션한다. 이어서, 캘러스화 배아를 500 nM R-할록시포프산 (0.181 mg/L)이 있는 휴지 배지 (상기)로 구성된 선택 배지 II로 옮긴다 (<12개/플레이트). 플레이트를 투명한 상자로 복귀시키고, 14일 동안 대략 50 μmol m-2s-1 PAR에서의 연속광 하에 27℃에서 인큐베이션한다. 이 선택 단계는 트랜스제닉 캘러스가 추가로 증식하고 분화되도록 한다.
증식. 배아발생 캘러스를 사전-재생 배지로 옮긴다 (<9개/플레이트). 사전-재생 배지는 4.33 gm/L MS 염; 1X ISU 변형된 MS 비타민; 45 gm/L 수크로스; 350 mg/L L-프롤린; 100 mg/L 미오-이노시톨; 50 mg/L 카세인 효소 가수분해물; 1.0 mg/L AgNO3; 0.25 gm/L MES; NaOH 중 0.5 mg/L 나프탈렌아세트산; 에탄올 중 2.5 mg/L 아브시스산; 1 mg/L 6-벤질아미노퓨린; 250 mg/L 카르베니실린; 2.5 gm/L 겔잔™; 및 0.181 mg/L 할록시포프산 (pH 5.8)을 함유한다. 플레이트를 투명한 상자에 보관하고, 7일 동안 대략 50 μmol m-2s-1 PAR에서의 연속광 하에 27℃에서 인큐베이션한다. 이어서, 재생하는 캘러스를 피타트레이스(PHYTATRAYS)™ (시그마-알드리치(SIGMA-ALDRICH)) 내 재생 배지로 옮기고 (<6개/플레이트), 14일 동안 또는 싹 및 뿌리가 발생할 때까지 (대략 160 μmol m-2s-1 PAR에서) 일당 16시간 명기/8시간 암기 하에 28℃에서 인큐베이션한다. 재생 배지는 4.33 gm/L MS 염; 1X ISU 변형된 MS 비타민; 60 gm/L 수크로스; 100 mg/L 미오-이노시톨; 125 mg/L 카르베니실린; 3 gm/L 겔란(GELLAN)™ 검; 및 0.181 mg/L R-할록시포프산 (pH 5.8)을 함유한다. 이어서, 1차 뿌리를 갖는 작은 싹을 단리하고, 선택 없이 신장 배지로 옮긴다. 신장 배지는 4.33 gm/L MS 염; 1X ISU 변형된 MS 비타민; 30 gm/L 수크로스; 및 3.5 gm/L 겔라이트(GELRITE)™ (pH 5.8)를 함유한다.
할록시포프를 함유하는 배지 상에서 성장하는 능력에 의해 선택된 형질전환된 식물 싹을 피타트레이스™로부터 성장 배지 (프로믹스 비엑스; 프리미어 테크 홀티컬쳐(PREMIER TECH HORTICULTURE))로 채워진 작은 용기로 이식하고, 컵 또는 휴이-돔스 (아르코 플라스틱스(ARCO PLASTICS))로 덮은 다음, 콘비론(CONVIRON)™ 성장 챔버 (27℃ 낮/24℃ 밤, 16-시간 광주기, 50-70% RH, 200 μmol m-2s-1 PAR)에서 튼튼하게 한다. 일부 경우에, 추정 트랜스제닉 소식물체를 메이즈 게놈 내로 통합된 AAD1 제초제 내성 유전자를 검출하도록 설계된 프라이머를 사용하는 정량적 실시간 PCR 검정에 의해 트랜스진 상대 카피수에 대해 분석한다. 추가로, RNA qPCR 검정을 사용하여 추정 형질전환체의 발현된 dsRNA에서의 링커 서열의 존재를 검출한다. 선택된 형질전환된 소식물체를 추가의 성장 및 시험을 위해 온실 내로 이동시킨다.
생물검정 및 종자 생산을 위한 온실에서의 T0 식물의 전달 및 확립. 식물이 V3-V4 단계에 도달할 때, 이들을 아이이 커스텀 블렌드 (프로파일/메트로 믹스 160) 토양 혼합물 내로 이식하고, 온실 (광 노출 유형: 광 또는 동화; 높은 광 한계: 1200 PAR; 16-시간 낮 길이; 27℃ 낮/24℃ 밤)에서 성장시켜 개화시킨다.
곤충 생물검정에 사용될 식물을 작은 용기로부터 티누스(TINUS)™ 350-4 루트레이너스(ROOTRAINERS)® (스펜서-르메르 인더스트리즈(SPENCER-LEMAIRE INDUSTRIES); 캐나다 앨버타주 애치슨)로 이식한다 (루트레이너®당 이벤트당 1개의 식물). 루트레이너스®로 이식한지 대략 4일 후에, 식물을 생물검정에 사용한다.
T1 세대의 식물은 비-트랜스제닉 우량 근교계 B104의 식물로부터 수집된 화분 또는 다른 적절한 화분 공여자를 사용하여 T0 트랜스제닉 식물의 수염을 수분시키고 생성된 종자를 식재함으로써 수득한다. 가능할 때 상반 교배를 수행한다.
실시예 10: 성충 디아브로티카 식물 섭식 생물검정
모 RNAi 표적 및 GFP 대조군에 대한 dsRNA를 발현하는 트랜스제닉 옥수수 잎 (V3-4)을 동결건조시키고, 막자 사발을 사용하여 미세 분말로 분쇄하고, 600 μM 스크린을 통해 체질하여 인공 먹이 내로의 혼입 전에 균일한 입자 크기를 달성한다. 인공 먹이는 물의 양이 배가된다는 것을 제외하고는 모 RNAi 실험에 대해 이전에 기재된 동일한 먹이이다 (20 mL ddH2O, 0.40 g 한천, 6.0 g 먹이 혼합물, 700 μL 글리세롤, 27.5 μL 곰팡이 억제제). 응고 전에, 동결건조된 옥수수 잎 조직을 40 mg/ml 먹이의 비율로 먹이 내로 혼입시키고, 철저히 혼합한다. 이어서, 먹이를 플라스틱 페트리 디쉬의 표면 상에 대략 4 mm의 깊이로 붓고, 응고되도록 한다. 먹이 플러그를 먹이로부터 절단하고, 모 RNAi 실험에 대해 이전에 기재된 동일한 방법을 사용하여 서부 옥수수 뿌리벌레 성충에 노출시키는데 사용한다.
pRNAi T0 또는 T1 이벤트를 식물이 속대, 웅수 및 수염을 생산할 때까지 온실에서 성장시킨다. 총 25마리의 새롭게 출현한 뿌리벌레 성충을 각각의 식물 상에 방출시키고, 전체 식물을 덮어 성충이 도망가는 것을 방지한다. 방출 2주 후에, 암컷 성충을 각각의 식물로부터 회수하고, 알 수집을 위해 실험실에서 유지한다. 모 RNAi 표적 및 예상된 표현형에 따라, 파라미터, 예컨대 암컷당 알의 수, 퍼센트 알 부화 및 유충 사멸률를 기록하고, 대조군 식물과 비교한다.
실시예 11: 트랜스제닉 메이즈의 디아브로티카 유충 뿌리-섭식 생물검정
곤충 생물검정. 식물 세포에서 생산된 본 발명의 dsRNA의 생물활성을 생물검정 방법에 의해 입증한다. 예를 들어, 살곤충 dsRNA를 생산하는 식물로부터 유래된 다양한 식물 조직 또는 조직 조각을 방제형 섭식 환경에서 표적 곤충에게 섭식시킴으로써, 효능을 입증할 수 있다. 대안적으로, 살곤충 dsRNA를 생산하는 식물로부터 유래된 다양한 식물 조직으로부터 추출물을 제조하고, 본원에서 이전에 기재된 바와 같은 생물검정을 위한 인공 먹이의 상부에 추출된 핵산을 분배한다. 이러한 섭식 검정의 결과를, 살곤충 dsRNA를 생산하지 않는 숙주 식물로부터의 적절한 방제 조직을 사용하는 유사하게 수행된 생물검정, 또는 다른 대조군 샘플과 비교한다.
트랜스제닉 메이즈 이벤트를 사용한 곤충 생물검정. 세척된 알로부터 부화된 2마리의 서부 옥수수 뿌리벌레 유충 (1 내지 3일령)을 선택하고, 생물검정 트레이의 각각의 웰 내에 둔다. 이어서, 웰을 "풀 엔' 필(PULL N' PEEL)" 탭 덮개 (바이오-CV-16, 바이오-서브(BIO-SERV))로 덮고, 18시간/6시간 명/암 주기 하에 28℃ 인큐베이터에 둔다. 초기 침입 9일 후에, 유충을 사멸률에 대해 평가하며, 이는 각각의 처리에서 곤충의 총수 중 사멸 곤충의 백분율로서 계산한다. 곤충 샘플을 2일 동안 -20℃에서 동결시킨 다음, 각각의 처리로부터의 곤충 유충을 풀링하고 칭량한다. 성장 억제의 퍼센트는 실험 처리군의 평균 중량을 2개의 대조 웰 처리군의 평균 중량으로 나눔으로써 계산한다. 데이터는 (음성 대조군의) 퍼센트 성장 억제로서 표현한다. 대조군 평균 중량을 초과하는 평균 중량은 0으로 정규화한다.
온실에서의 곤충 생물검정. 토양에 있는 서부 옥수수 뿌리벌레 (WCR, 디아브로티카 비르기페라 비르기페라 르콩트) 알을 크롭 캐릭터리스틱스 (미네소타주 파밍톤)로부터 입수한다. WCR 알을 10 내지 11일 동안 28℃에서 인큐베이션한다. 토양으로부터의 알을 세척하고, 0.15% 한천 용액 내에 두고, 0.25 mL 분취물당 대략 75 내지 100개 알이 있도록 농도를 조정한다. 부화율을 모니터링하기 위해 알 현탁액의 분취물이 있는 페트리 디쉬에서 부화 플레이트를 설정한다.
루트레이너스®에서 성장하는 메이즈 식물 주위의 토양에 150 내지 200개의 WCR 알을 침입시킨다. 2주 동안 곤충이 섭식하도록 하며, 이 시간 후에 각각의 식물에 대해 "뿌리 등급화"가 주어진다. 마디-손상 깍지벌레를 본질적으로 문헌 [Oleson et al. (2005) J. Econ. Entomol. 98:1-8]에 따라 등급화에 이용한다. 이 생물검정을 통과한 식물을 종자 생산을 위해 18.9 리터 용기로 이식한다. 온실에서 추가의 뿌리벌레 손상 및 곤충 방출을 방지하기 위해 이식물을 살곤충제로 처리한다. 식물을 종자 생산을 위해 수동 수분시킨다. 이들 식물에 의해 생산된 종자를 식물의 T1 및 후속 세대에서 평가하기 위해 저장한다.
온실 생물검정은 두 종류의 음성 대조군 식물을 포함한다. 트랜스제닉 음성 대조군 식물은 황색 형광 단백질 (YFP) 또는 YFP 헤어핀 dsRNA를 생산하도록 설계된 유전자를 보유하는 벡터에 의한 형질전환에 의해 생성한다 (실시예 4 참조). 비-형질전환 음성 대조군 식물은 계통 B104의 종자로부터 성장시킨다. 생물검정을 별도의 2일에 수행하며, 이때 음성 대조군을 각각의 식물 물질 세트에 포함시킨다.
실시예 12: 트랜스제닉 메이즈 조직의 분자 분석
뿌리 섭식 손상을 평가한 날과 동일한 날에 온실에서 성장한 식물로부터 수집된 잎 및 뿌리로부터의 샘플에 대해 메이즈 조직의 분자 분석 (예를 들어 RNA qPCR)을 수행한다.
Per5 3'UTR에 대한 RNA qPCR 검정의 결과를 사용하여 헤어핀 트랜스진의 발현을 검증한다. (통상적으로 메이즈 조직에서 내인성 Per5 유전자의 발현이 존재하므로, 비-형질전환 메이즈 식물에서 낮은 수준의 Per5 3'UTR 검출이 예상된다.) 발현된 RNA에서의 반복 서열 사이의 개재 서열 (이는 dsRNA 헤어핀 분자의 형성에 필수적임)에 대한 RNA qPCR 검정의 결과를 사용하여 헤어핀 전사체의 존재를 검증한다. 트랜스진 RNA 발현 수준을 내인성 메이즈 유전자의 RNA 수준에 비해 측정한다.
gDNA에서 AAD1 코딩 영역의 부분을 검출하기 위한 DNA qPCR 분석을 사용하여 트랜스진 삽입 카피수를 추정한다. 이들 분석을 위한 샘플을 환경 챔버에서 성장한 식물로부터 수집한다. 결과를 단일-카피 천연 유전자의 부분을 검출하도록 설계된 검정의 DNA qPCR 결과와 비교하고, 단순 이벤트 (1 또는 2개 카피의 트랜스진을 가짐)를 온실에서 추가의 연구를 위해 진전시킨다.
추가적으로, 스펙티노마이신-저항성 유전자 (SpecR; T-DNA 밖의 이원 벡터 플라스미드 상에 보유됨)의 부분을 검출하도록 설계된 qPCR 검정을 사용하여 트랜스제닉 식물이 이질 통합된 플라스미드 백본 서열을 함유하는지 여부를 결정한다.
헤어핀 RNA 전사체 발현 수준: Per 5 3'UTR qPCR. 캘러스 세포 이벤트 또는 트랜스제닉 식물을 Per 5 3'UTR 서열의 실시간 정량적 PCR (qPCR)에 의해 분석하여, TIP41-유사 단백질 (즉, 진뱅크 수탁 번호 AT4G34270의 메이즈 상동체; 74% 동일성의 tBLASTX 점수를 가짐)을 코딩하는 내부 메이즈 유전자 (예를 들어, 진뱅크 수탁 번호 BT069734)의 전사체 수준과 비교하여 전장 헤어핀 전사체의 상대 발현 수준을 결정한다. RNA이지(RNAEASY)™ 96 키트 (퀴아젠, 캘리포니아주 발렌시아)를 사용하여 RNA를 단리한다. 용리 후에, 총 RNA를 키트의 시사된 프로토콜에 따라 DNaseI 처리에 적용한다. 이어서, RNA를 나노드롭 8000 분광광도계 (써모 사이언티픽) 상에서 정량화하고, 농도를 25 ng/μL로 정규화한다. 제1 가닥 cDNA는 고용량 cDNA 합성 키트 (인비트로젠)를 사용하여 실질적으로 제조업체의 권장된 프로토콜에 따라, 5 μL의 변성된 RNA를 사용하여 10 μL 반응 부피로 제조한다. 조합된 무작위 프라이머 및 올리고 dT의 작업 스톡을 제조하기 위해, 무작위 프라이머 스톡 혼합물의 1 mL 튜브 내로 100 μM T20VN 올리고뉴클레오티드 (IDT) (TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN, 여기서 V는 A, C, 또는 G이고, N은 A, C, G, 또는 T임; 서열식별번호: 47) 10 μL의 첨가를 포함하도록 프로토콜을 약간 변형한다.
cDNA 합성 후, 뉴클레아제-무함유 물을 사용하여 샘플을 1:3으로 희석하고, 검정할 때까지 -20℃에서 보관한다.
Per5 3' UTR 및 TIP41-유사 전사체에 대한 별도의 실시간 PCR 검정은 라이트사이클러(LIGHTCYCLER)™ 480 (로슈 다이아그노스틱스(ROCHE DIAGNOSTICS), 인디애나주 인디애나폴리스) 상에서 10 μL 반응 부피로 수행한다. Per5 3'UTR 검정을 위해, 프라이머 P5U76S (F) (서열식별번호: 48) 및 P5U76A (R) (서열식별번호: 49), 및 로슈 유니버셜 프로브(ROCHE UNIVERSAL PROBE)™ (UPL76; 카탈로그 번호 4889960001; FAM으로 표지됨)를 사용하여 반응을 실행한다. TIP41-유사 참조 유전자 검정을 위해, 프라이머 TIPmxF (서열식별번호: 50) 및 TIPmxR (서열식별번호: 51), 및 HEX (헥사클로로플루오레신)로 표지된 프로브 HXTIP (서열식별번호: 52)를 사용한다.
모든 검정은 주형을 함유하지 않는 (단지 혼합물만 있는) 음성 대조군을 포함한다. 표준 곡선을 위해, 블랭크 (공급원 웰 중 물)를 샘플 교차-오염에 대해 체크하기 위해 공급원 플레이트에 포함시킨다. 프라이머 및 프로브 서열은 표 7에 제시된다. 다양한 전사체의 검출을 위한 반응 성분 레시피는 표 8에 개시되고, PCR 반응 조건은 표 9에 요약된다. FAM (6-카르복시 플루오레세인 아미다이트) 형광 모이어티를 465 nm에서 여기시키고, 형광을 510 nm에서 측정하며; HEX (헥사클로로플루오레세인) 형광 모이어티에 대한 상응하는 값은 533 nm 및 580 nm이다.
표 7. 트랜스제닉 메이즈에서 전사체 수준의 분자 분석에 사용된 올리고뉴클레오티드 서열.
Figure pct00013
*TIP41-유사 단백질.
**NAv 공급업체로부터 이용가능하지 않은 서열.
표 8. 전사체 검출을 위한 PCR 반응 레시피.
Figure pct00014
표 9. RNA qPCR을 위한 써모사이클러 조건.
Figure pct00015
라이트사이클러™ 소프트웨어 v1.5를 사용하여, 공급업체의 권장에 따라 Cq 값 계산을 위한 2차 도함수 최대 알고리즘을 사용하여 상대 정량화에 의해 데이터를 분석한다. 발현 분석을 위해, ΔΔCt 방법 (즉, 2-(Cq 표적 - Cq 참조))을 사용하여 발현 값을 계산하며, 이는 2개의 표적 사이의 Cq 값 차이의 비교에 의존하고, 이때 최적화된 PCR 반응의 경우, 산물은 사이클마다 배가된다는 가정 하에서 기준 값을 2로 선택한다.
헤어핀 전사체 크기 및 완전성: 노던 블롯 검정. 일부 경우에, hunchback 헤어핀 dsRNA를 발현하는 트랜스제닉 식물에서 hunchback 헤어핀 RNA의 분자 크기를 결정하기 위해 노던 블롯 (RNA 블롯) 분석을 사용하여 트랜스제닉 식물의 추가의 분자 특징화를 수득한다.
모든 물질 및 장비를 사용 전에 RNaseZAP (암비온/인비트로젠)로 처리한다. 조직 샘플 (100 mg 내지 500 mg)을 2 mL 세이프록 에펜도르프 튜브에 수집하고, 5분 동안 1 mL 트리졸 (인비트로젠) 중 3개의 텅스텐 비드를 갖는 클렉코(KLECKO)™ 조직 미분쇄기 (가르시아 매뉴팩처링(GARCIA MANUFACTURING), 캘리포니아주 비살리아)로 분쇄한 다음, 10분 동안 실온 (RT)에서 인큐베이션한다. 임의로, 샘플을 4℃에서 10분 동안 11,000 rpm으로 원심분리하고, 상청액을 신선한 2 mL 세이프록 에펜도르프 튜브 내로 옮긴다. 200 μL 클로로포름을 균질물에 첨가한 후에, 튜브를 2 내지 5분 동안 역전시켜 혼합하고, RT에서 10분 동안 인큐베이션하고, 4℃에서 15분 동안 12,000 x g로 원심분리한다. 상부 상을 멸균 1.5 mL 에펜도르프 튜브 내로 옮기고, 100% 이소프로판올 600 μL를 첨가하고, 이어서 RT에서 10분 내지 2시간 동안 인큐베이션한 다음, 4℃ 내지 25℃에서 10분 동안 12,000 x g로 원심분리한다. 상청액을 폐기하고, RNA 펠릿을 1 mL 70% 에탄올로 2회 세척하고, 세척 사이에 4℃ 내지 25℃에서 10분 동안 7,500 x g로 원심분리한다. 에탄올을 폐기하고, 펠릿을 3 내지 5분 동안 간단히 공기 건조시킨 후에, 뉴클레아제-무함유 물 50 μL 중에 재현탁시킨다.
총 RNA를 나노드롭8000® (써모-피셔(THERMO-FISHER))을 사용하여 정량화하고, 샘플을 5 μg/10 μL로 정규화한다. 이어서, 10 μL의 글리옥살 (암비온/인비트로젠)을 각각의 샘플에 첨가한다. DIG RNA 표준 마커 혼합물 (로슈 어플라이드 사이언스(ROCHE APPLIED SCIENCE), 인디애나주 인디애나폴리스) 5 내지 14 ng을 분배하고, 동등 부피의 글리옥살에 첨가한다. 샘플 및 마커 RNA를 50℃에서 45분 동안 변성시키고, 노던맥스 10 X 글리옥살 전개 완충제 (암비온/인비트로젠) 중 1.25% 시켐 골드 아가로스 (론자(LONZA), 뉴저지주 앨런데일) 겔 상에 로딩할 때까지 얼음 상에 보관한다. RNA를 2시간 15분 동안 65 볼트/30 mA로 전기영동에 의해 분리한다.
전기영동 후, 겔을 5분 동안 2X SSC 중에서 헹구고, 겔 독 스테이션 (바이오라드(BIORAD), 캘리포니아주 허큘레스) 상에서 영상화한 다음, RNA를 전달 완충제로서 10X SSC를 사용하여 (20X SSC는 3 M 염화나트륨 및 300 mM 시트르산삼나트륨으로 이루어짐, pH 7.0), RT에서 밤새 나일론 막 (밀리포어(MILLIPORE))으로 수동으로 전달한다. 전달 후, 막을 5분 동안 2X SSC 중에서 헹구고, RNA를 막 (애질런트(AGILENT)/스트라타진(STRATAGENE))에 UV-가교시키고, 막을 최대 2일 동안 실온에서 건조되도록 한다.
막을 1 내지 2시간 동안 울트라하이브 완충제 (암비온/인비트로젠) 중에서 예비혼성화시킨다. 프로브는 로슈 어플라이드 사이언스 DIG 절차에 의해 디곡시게닌으로 표지된 관심 서열 (예를 들어, 적절한 경우 서열식별번호: 46의 안티센스 서열 부분)을 함유하는 PCR 증폭된 산물로 이루어진다. 권장된 완충제 중에서의 혼성화는 혼성화 튜브 내 60℃의 온도에서 밤새 이루어진다. 혼성화 후, 블롯을 모두 DIG 키트의 공급업체에 의해 권장된 방법에 의해 DIG 세척에 적용하고, 랩핑하고, 1 내지 30분 동안 필름에 노출시킨 다음, 필름을 현상한다.
트랜스진 카피수 결정. 2개의 잎 펀치와 대략 동등한 메이즈 잎 단편을 96-웰 수집 플레이트 (퀴아젠)에 수집하였다. 1개의 스테인레스 스틸 비드를 갖는 바이오스프린트96 AP1 용해 완충제 (바이오스프린트96 플랜트 키트로 공급됨; 퀴아젠) 중에서 클렉코™ 조직 분쇄기 (가르시아 매뉴팩처링, 캘리포니아주 비살리아)를 사용하여 조직 파괴를 수행한다. 조직 온침 후, gDNA를 바이오스프린트96 플랜트 키트 및 바이오스프린트96 추출 로봇을 사용하여 고처리량 포맷으로 단리한다. qPCR 반응을 설정하기 전에 gDNA를 2:3 DNA:물로 희석한다.
qPCR 분석. 가수분해 프로브 검정에 의한 트랜스진 검출은 라이트사이클러®480 시스템을 사용하여 실시간 PCR에 의해 수행한다. 링커 서열 (예를 들어, ST-LS1; 서열식별번호: 45)을 검출하기 위한, 또는 SpecR 유전자 (즉, 이원 벡터 플라스미드 상에 보유된 스펙티노마이신 저항성 유전자; 서열식별번호: 53; 표 10에서의 SPC1 올리고뉴클레오티드)의 일부분을 검출하기 위한 가수분해 프로브 검정에 사용할 올리고뉴클레오티드는, 라이트사이클러® 프로브 설계 소프트웨어 2.0을 사용하여 설계한다. 추가로, AAD-1 제초제 내성 유전자 (서열식별번호: 54; 표 10에서의 GAAD1 올리고뉴클레오티드)의 절편을 검출하기 위한 가수분해 프로브 검정에 사용할 올리고뉴클레오티드는, 프라이머 익스프레스 소프트웨어 (어플라이드 바이오시스템즈)를 사용하여 설계한다. 표 10은 프라이머 및 프로브의 서열을 제시한다. gDNA가 각각의 검정에 존재하였다는 것을 보장하기 위해 내부 참조 서열로서의 역할을 하는 내인성 메이즈 염색체 유전자에 대한 시약 (인버타제; 진뱅크 수탁 번호 U16123; 본원에서 IVR1로 지칭됨)을 사용하여 검정을 멀티플렉스화한다. 증폭을 위해, 라이트사이클러®480 프로브스 마스터 믹스 (로슈 어플라이드 사이언스)를 0.4 μM의 각각의 프라이머 및 0.2 μM의 각각의 프로브를 함유하는 10 μL 부피 멀티플렉스 반응물 중 1x 최종 농도로 제조한다 (표 11). 2-단계 증폭 반응을 표 12에 요약된 바와 같이 수행한다. FAM- 및 HEX-표지된 프로브에 대한 형광단 활성화 및 방출은 상기 기재된 바와 같으며; CY5 접합체는 650 nm에서 최대로 여기하고, 670 nm에서 최대로 형광을 낸다.
피트 포인트 알고리즘 (라이트사이클러® 소프트웨어 출시 1.5) 및 렐러티브 퀀트 모듈 (ΔΔCt 방법을 기반으로 함)을 사용하여 실시간 PCR 데이터 분석으로부터 Cp 점수 (형광 신호가 배경 역치와 교차하는 지점)를 결정한다. 데이터를 이전에 기재된 바와 같이 다룬다 (상기; RNA qPCR).
표 10. 유전자 카피수 결정 및 이원 벡터 플라스미드 백본 검출에 사용된 프라이머 및 프로브 (형광 접합체 포함)의 서열.
Figure pct00016
CY5 = 시아닌-5
표 11. 유전자 카피수 분석 및 플라스미드 백본 검출을 위한 반응 성분.
Figure pct00017
*NA = 적용가능하지 않음
**ND = 결정되지 않음
표 12. DNA qPCR을 위한 써모사이클러 조건.
Figure pct00018
실시예 13: 딱정벌레류 해충 서열을 포함하는 트랜스제닉 제아 메이스
10 내지 20종의 트랜스제닉 T0 제아 메이스 식물을 실시예 8에 기재된 바와 같이 생성한다. RNAi 구축물을 위한 헤어핀 dsRNA를 발현하는 추가의 10-20종의 T1 제아 메이스 독립적 계통을 옥수수 뿌리벌레 챌린지를 위해 수득한다. 헤어핀 dsRNA는 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 3, 및 서열식별번호: 67에 제시된 바와 같은 서열로부터 유래될 수 있다. 추가의 헤어핀 dsRNA는, 예를 들어, 딱정벌레류 해충 서열 예컨대, 예를 들어, Caf1-180 (미국 특허 출원 공개 번호 2012/0174258), VatpaseC (미국 특허 출원 공개 번호 2012/0174259), Rho1 (미국 특허 출원 공개 번호 2012/0174260), VatpaseH (미국 특허 출원 공개 번호 2012/0198586), PPI-87B (미국 특허 출원 공개 번호 2013/0091600), RPA70 (미국 특허 출원 공개 번호 2013/0091601), RPS6 (미국 특허 출원 공개 번호 2013/0097730), Brahma (USSN), 및 Kruppel (USSN)로부터 유래될 수 있다. 이들을 RT-PCR 또는 다른 분자 분석 방법을 통해 확인한다. 각각의 RNAi 구축물 중 헤어핀 발현 카세트의 링커에서 결합하도록 설계된 프라이머를 사용하는 qPCR을 위해, 선택된 독립적 T1 계통으로부터의 총 RNA 제제를 임의로 사용한다. 추가로, RNAi 구축물 중 각각의 표적 유전자에 대해 특이적인 프라이머를 임의로 사용하여 식물내 siRNA 생산에 요구되는 예비-프로세싱된 mRNA를 증폭시키고 그의 생산을 확인한다. 각각의 표적 유전자에 대한 목적하는 밴드의 증폭은 각각의 트랜스제닉 제아 메이스 식물에서의 헤어핀 RNA의 발현을 확인시켜 준다. 후속적으로, 표적 유전자의 dsRNA 헤어핀의 siRNA로의 프로세싱을 RNA 블롯 혼성화를 사용하여 독립적 트랜스제닉 계통에서 임의로 확인한다.
더욱이, 표적 유전자에 대해 80% 초과의 서열 동일성을 갖는 미스매치 서열을 갖는 RNAi 분자는 표적 유전자에 대해 100% 서열 동일성을 갖는 RNAi 분자에 의해 관찰되는 것과 유사한 방식으로 옥수수 뿌리벌레에게 영향을 미친다. 동일한 RNAi 구축물에서 헤어핀 dsRNA를 형성하기 위한 미스매치 서열과 천연 서열과의 쌍형성은 섭식 딱정벌레류 해충의 성장, 발생, 생식, 및 생존율에 영향을 미칠 수 있는 식물-프로세싱된 siRNA를 전달한다.
표적 유전자에 상응하는 dsRNA, siRNA 또는 miRNA의 식물내 전달 및 딱정벌레류 해충에 의한 섭식을 통한 후속 흡수는 딱정벌레류 해충에서 RNA-매개 유전자 침묵을 통한 표적 유전자의 하향-조절을 유발한다. 표적 유전자의 기능이 1개 이상의 발생 단계에서 중요한 경우에, 딱정벌레류 해충의 성장, 발생, 및 생식은 영향을 받으며, WCR, NCR, SCR, MCR, 디. 발테아타 르콩트, 디. 유. 테넬라, 디. 스페시오사 게르마르, 및 디. 유. 운데심푼크타타 만네르헤임 중 적어도 1종의 경우에서, 성공적 침입, 섭식, 발생, 및/또는 생식의 실패로 이어지거나, 또는 딱정벌레류 해충의 사멸로 이어진다. 이어서, 표적 유전자의 선택 및 RNAi의 성공적인 적용을 사용하여 딱정벌레류 해충을 방제한다.
트랜스제닉 RNAi 계통 및 비-형질전환 제아 메이스의 표현형 비교. 헤어핀 dsRNA를 생성하기 위해 선택된 표적 딱정벌레류 해충 유전자 또는 서열은 어떠한 공지되어 있는 식물 유전자 서열에 대해서도 유사성을 갖지 않는다. 따라서, 이들 딱정벌레류 해충 유전자 또는 서열을 표적화하는 구축물에 의한 (침투성) RNAi의 생산 또는 활성화가 트랜스제닉 식물에 대해 임의의 유해 효과를 나타낼 것으로 예상되지 않는다. 그러나, 트랜스제닉 계통의 발생 및 형태학적 특징을 비-형질전환 식물, 뿐만 아니라 헤어핀-발현 유전자를 갖지 않는 "공" 벡터로 형질전환된 트랜스제닉 계통의 경우와 비교한다. 식물 뿌리, 싹, 잎 및 생식 특징을 비교한다. 트랜스제닉 및 비-형질전환 식물의 뿌리 길이 및 성장 패턴에 있어서는 어떠한 관찰가능한 차이도 없다. 식물 싹 특징 예컨대 높이, 잎의 수 및 크기, 개화의 시기, 꽃의 크기 및 외관은 유사하다. 일반적으로, 시험관내 및 온실 내 토양에서 배양할 때, 트랜스제닉 계통과 표적 iRNA 분자가 발현되지 않은 것 사이에는 어떠한 관찰가능한 형태학적 차이도 없다.
실시예 14: 딱정벌레류 해충 서열 및 추가의 RNAi 구축물을 포함하는 트랜스제닉 제아 메이스
딱정벌레류 해충 이외의 다른 유기체를 표적화하는 iRNA 분자로 전사되는 이종 코딩 서열을 게놈 내에 포함하는 트랜스제닉 제아 메이스 식물을 아그로박테리움 또는 휘스커스(WHISKERS)™ 방법론을 통해 2차로 형질전환시켜 (문헌 [Petolino and Arnold (2009) Methods Mol. Biol. 526:59-67] 참조) 1종 이상의 살곤충 dsRNA 분자 (예를 들어, 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 3, 또는 서열식별번호: 67을 포함하는 유전자를 표적화하는 dsRNA 분자를 포함한 적어도 1종의 dsRNA 분자)를 생산한다. 본질적으로 실시예 7에 기재된 바와 같이 제조된 식물 형질전환 플라스미드 벡터를 아그로박테리움 또는 휘스커스™-매개 형질전환 방법을 통해, 딱정벌레류 해충 이외의 다른 유기체를 표적화하는 iRNA 분자로 전사되는 이종 코딩 서열을 게놈 내에 포함하는 트랜스제닉 Hi II 또는 B104 제아 메이스 식물로부터 수득된 메이즈 현탁 세포 또는 미성숙 메이즈 배아 내로 전달한다.
실시예 15: RNAi 구축물 및 추가의 딱정벌레류 해충 방제 서열을 포함하는 트랜스제닉 제아 메이스
딱정벌레류 해충 유기체를 표적화하는 iRNA 분자로 전사되는 이종 코딩 서열 (예를 들어, 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 3, 또는 서열식별번호: 67을 포함하는 유전자를 표적화하는 dsRNA 분자를 포함한 적어도 1종의 dsRNA 분자)을 게놈 내에 포함하는 트랜스제닉 제아 메이스 식물을 아그로박테리움 또는 휘스커스™ 방법론을 통해 2차로 형질전환시켜 (문헌 [Petolino and Arnold (2009) Methods Mol. Biol. 526:59-67] 참조) 1종 이상의 살곤충 단백질 분자, 예를 들어, Cry1B, Cry1I, Cry2A, Cry3, Cry7A, Cry8, Cry9D, Cry14, Cry18, Cry22, Cry23, Cry34, Cry35, Cry36, Cry37, Cry43, Cry55, Cyt1A, 및 Cyt2C 살곤충 단백질을 생산한다. 본질적으로 실시예 7에 기재된 바와 같이 제조된 식물 형질전환 플라스미드 벡터를 아그로박테리움 또는 휘스커스™-매개 형질전환 방법을 통해, 딱정벌레류 해충 유기체를 표적화하는 iRNA 분자로 전사되는 이종 코딩 서열을 게놈 내에 포함하는 트랜스제닉 B104 제아 메이스 식물로부터 수득된 메이즈 현탁 세포 또는 미성숙 메이즈 배아 내로 전달한다. 딱정벌레류 해충의 방제를 위해 iRNA 분자 및 살곤충 단백질을 생산하는 이중으로-형질전환된 식물을 수득한다.
실시예 16: pRNAi-매개 곤충 보호
알 사멸률 또는 알 생존율의 손실을 야기하는 모 RNAi는 곤충 보호를 위해 RNAi 및 다른 메카니즘을 사용하는 트랜스제닉 작물에 추가의 지속성 이익을 가져다 준다. 기본적인 2-패치 모델을 사용하여 이 유용성을 입증하였다.
한 패치는 살곤충 성분을 발현하는 트랜스제닉 작물을 함유하였고, 제2 패치는 살곤충 성분을 발현하지 않는 은신처 작물을 함유하였다. 알을 2종의 모델링된 패치에서 그의 상대 비율에 따라 "낳았다". 본 실시예에서, 트랜스제닉 패치는 95%의 랜드스케이프를 나타냈고, 은신처 패치는 5%를 나타냈다. 트랜스제닉 작물은 옥수수 뿌리벌레 유충에 대해 활성인 살곤충 단백질을 발현하였다.
살곤충 단백질에 대한 옥수수 뿌리벌레 저항성을, 하나 (S)는 감수성을 부여하고 다른 것 (R)은 저항성을 부여하는 2종의 가능한 대립유전자를 갖는 단일유전자로서 모델링하였다. 살곤충 단백질은 그것을 섭식하는 동형접합 감수성 (SS) 옥수수 뿌리벌레 유충의 97% 사멸률을 야기하는 것으로 모델링되었다. 저항성 대립유전자에 대해 동형접합 (RR)인 옥수수 뿌리벌레 유충의 사멸률은 존재하지 않는 것으로 가정되었다. 살곤충 단백질에 대한 저항성은 불완전 열성인 것으로 가정되었고, 이에 의해 기능적 우성도는 0.3이다 (트랜스제닉 작물을 섭식하는, 단백질에의 저항성에 대해 이형접합 (RS)인 유충의 67.9% 사멸률이 존재한다).
트랜스제닉 작물은 또한 RNA-간섭 (pRNAi)을 통해 트랜스제닉 작물에 노출된 성충 암컷 옥수수 뿌리벌레의 알이 비-생존하도록 하는 모 활성 dsRNA를 발현하였다. pRNAi에 대한 옥수수 뿌리벌레 저항성은 또한 하나 (X)는 RNAi에 대한 성충 암컷의 감수성을 부여하고 다른 것 (Y)은 RNAi에 대한 성충 암컷의 저항성을 부여하는 2종의 가능한 대립유전자를 갖는 단일유전자인 것으로 간주되었다. dsRNA에 대한 노출의 높은 수준을 가정한다면, pRNAi는 동형접합 감수성 (XX) 암컷에 의해 생산된 알의 99.9%가 비-생존하도록 하는 것으로 모델링되었다. 모델은 pRNAi가 동형접합 저항성 (YY) 암컷에 의해 생산된 알의 생존율에 대해서는 어떠한 효과도 나타내지 않는 것으로 가정하였다. dsRNA에 대한 저항성은 열성인 것으로 가정되었고, 이에 의해 기능적 우성도는 0.01이다 (dsRNA에의 저항성에 대해 이형접합 (XY)인 암컷에 의해 생산된 알의 98.9%는 비-생존한다).
모델에서, 2종의 패치에 걸쳐 그의 상대 비율에 따라 생존하는 성충 사이의 무작위 교미 및 무작위 산란이 존재하였다. 생존 자손의 유전자형의 빈도는 2-유전자좌 유전자 시스템에 대한 멘델 유전학을 따랐다.
pRNAi의 효과는 성충 암컷이 모 활성 dsRNA를 발현하는 식물 조직을 섭식하는 것을 요구하였다. 알 발생에 의한 간섭은 트랜스제닉 작물보다 은신처 작물로부터 출현한 성충 암컷의 경우에 더 낮을 수 있고; 옥수수 뿌리벌레 성충은 유충 발생 후 이들이 출현한 패치에서 보다 광범위하게 섭식하는 것으로 예상된다. 따라서, 은신처 패치로부터 출현한 암컷 옥수수 뿌리벌레 성충에 대한 pRNAi 효과의 상대 크기는 달라졌으며, 이때 pRNAi 효과의 비율은 0 (은신처 패치로부터 출현한 충 암컷 성충에 대한 pRNAi의 효과 부재) 내지 1 (트랜스제닉 패치로부터 출현한 성충 암컷과 동일한, 은신처 패치로부터 출현한 성충 암컷에 대한 pRNAi의 효과)이다.
이 모델은 pRNAi의 효과가, 성충 수컷이 모 활성 dsRNA를 발현하는 식물 조직을 섭식하는 경우에도 또한 또는 대안적으로 달성되는 경우의 상황을 입증하기 위해 용이하게 조정될 수 있다.
2종의 저항성 대립유전자의 빈도를 세대에 걸쳐 계산하였다. 저항성 대립유전자 (R 및 Y) 둘 다의 초기 빈도는 0.005인 것으로 가정되었다. 결과는 0.05에 이르는 각각의 저항성 대립유전자의 빈도에 대한 곤충 세대의 수로서 제시되었다. pRNAi에 의해 야기된 저항성 지연을 검사하기 위해, pRNAi를 포함한 시뮬레이션을 pRNAi를 포함하지 않았지만 다른 모든 방식에 있어서는 동일한 시뮬레이션과 비교하였다. 도 6.
또한 트랜스제닉 작물에 옥수수 뿌리벌레 유충-활성 간섭 dsRNA를 옥수수 뿌리벌레-활성 살곤충 단백질과 조합하여 포함하도록 모델을 변형시켰다. 여기서, 유충 RNAi는 동형접합 RNAi-감수성 옥수수 뿌리벌레 유충 (유전자형 XX)에 대해 97% 유충 사멸률의 효과가 할당되었고, 동형접합 RNAi-저항성 (YY)이 있는 옥수수 뿌리벌레 유충에 대해서는 어떠한 효과도 할당되지 않았다. RNAi-저항성에 대해 이형접합 (XY)인 옥수수 뿌리벌레 유충의 67.9% 사멸률이 존재하였다. 동일한 메카니즘의 저항성이 옥수수 뿌리벌레에서의 유충 활성 RNAi 및 pRNAi 둘 다에 적용된 것으로 가정되었다. 이전과 같이, 트랜스제닉 패치로부터 출현한 성충 암컷에 대한 효과에 비해 은신처 패치로부터 출현한 성충 암컷에 대한 pRNAi 효과는 0 내지 1로 달라졌다. 이전과 같이, pRNAi에 의해 야기된 저항성 지연을 검사하기 위해, pRNAi를 포함한 시뮬레이션을 pRNAi를 포함하지 않았지만 다른 모든 방식에 있어서는 동일한 (유충 RNAi를 포함함) 시뮬레이션과 비교하였다. 도 7.
pRNAi의 명확한 저항성 관리 이익은 은신처 패치로부터 출현한 암컷 옥수수 뿌리벌레 성충의 경우 알 생존율에 대한 pRNAi 효과의 크기가 트랜스제닉 패치로부터 출현한 성충의 경우 효과의 크기와 비교하여 감소되었을 때 관찰되었다. 살곤충 단백질에 추가로 모 활성 dsRNA를 생산한 트랜스제닉 작물은 단지 살곤충 단백질만을 생산한 트랜스제닉 작물과 비교하여 훨씬 더 지속적이었다. 유사하게, 살곤충 단백질 및 유충 활성 dsRNA 둘 다에 추가로 모 활성 dsRNA를 생산한 트랜스제닉 작물은 단지 살곤충 단백질 및 유충 활성 dsRNA만을 생산한 트랜스제닉 작물과 비교하여 훨씬 더 지속적이었다. 후자의 경우에, 지속성 이익은 살곤충 단백질 및 살곤충 간섭 dsRNA 둘 다에 적용되었다.
실시예 17: WCR 수컷에 대한 모 RNAi 효과
새롭게 출현한 숫 WCR 수컷 (크롭 캐릭터리스틱스; 미네소타주 파밍톤)을 연속적인 dsRNA 섭식으로 7일 동안 pRNAi를 위한 dsRNA (hunchback)로 처리된 인공 먹이에 노출시켰다. 이어서, 생존하는 수컷을 숫 암컷과 쌍형성시켜 4일 동안 교미하도록 하였다. 암컷을 산란 챔버 내로 단리하고, 비처리 먹이 상에 유지하여 알 생존율을 기반으로 교미가 성공적이었는지 여부를 결정하였다. 추가로, 암컷을 해부하여 산란 10일 후에 정포의 존재를 결정하였다. GFP dsRNA 및 물의 대조군을 포함시켰다.
반복당 처리당 10마리의 수컷 및 10마리의 암컷의 3회 반복을 수행하였다. 상이한 3일에 새롭게 출현한 성충으로 반복을 완료하였다. 반복당 각각의 처리는 반복당 처리당 10마리의 수컷을 함유하였고, 이를 트레이의 1개 웰에 두었다. 각각의 웰은 물 또는 dsRNA (GFP (서열식별번호: 9) 또는 hunchback (서열식별번호: 3))로 처리된 12개의 먹이 플러그를 포함하였다. 각각의 먹이 플러그를 3 μL 물 중 2 μg dsRNA로 처리하였다. 트레이를 23±1℃의 온도, 상대 습도 >80%, 및 L:D 16:8을 갖는 성장 챔버로 옮겼다. 수컷을 제3일, 제5일, 및 제7일에 각각의 웰 내 12개의 처리된 먹이 플러그가 있는 새로운 트레이로 옮겼다. 제7일에, 처리당 반복당 3마리의 수컷을 실시예 7에 기재된 바와 같이 qPCR 분석을 위해 급속 동결시켰다. 제8일에, 10마리의 암컷 및 10마리의 처리된 수컷을 용기 내에 함께 두어 교미하도록 하였다. 각각의 용기는 22개의 비처리 먹이 플러그를 포함하였다. 곤충을 제10일에 22개의 비처리 먹이 플러그가 있는 새로운 트레이로 옮기고, 수컷을 제12일에 제거하고, 형광 염색 기술을 사용하여 정자 생존율을 측정하는데 사용하였다. 암컷을 제22일까지 격일로 12개의 비처리 먹이 플러그가 있는 새로운 트레이로 옮겼다. 제16일에, 암컷을 산란을 위해 오토클레이빙된 토양을 함유하는 알 케이지로 옮겼다. 제22일에, 모든 암컷을 토양 케이지로부터 제거하고, 정포의 존재에 대해 체크하기 위해 동결시켰다. 토양 케이지를 27±1℃의 온도, 상대 습도 >80%, 및 24시간 암기를 갖는 새로운 성장 챔버로 옮겼다. 제28일에, 토양을 체 #60을 사용하여 세척하여 각각의 케이지로부터 알을 수집하였다. 알을 진균 오염을 방지하기 위해 포름알데히드 (5 mL 이중 증류수 중 500 μL 포름알데히드) 및 메틸-(부틸카르바모일)-2-벤즈이미다졸 카르바메이트 (50 mL 이중 증류수 중 0.025 g)의 용액으로 처리하고, 여과지를 함유하는 작은 페트리 디쉬에 두었다. 이미지J 소프트웨어의 세포 계수기 기능을 사용하는 알 계수를 위해 각각의 페트리 디쉬를 사진찍었다 (Schneider et al. (2012) Nat. Methods 9:671-5). 알이 있는 페트리 디쉬를 27±1℃의 온도, 상대 습도 >80%, 및 24시간 암기를 갖는 작은 성장 챔버로 옮겼다. 제29일-제42일에 유충 부화를 매일 모니터링하였다.
정자 생존율. 숫 서부 옥수수 뿌리벌레 수컷을 모 RNAi 유전자 hunchback으로 7일 동안 dsRNA로 처리된 인공 먹이에 노출시켰다. 처리된 먹이를 격일로 제공하였다. 문헌 [Collins and Donoghue (1999)]에 기재된 바와 같이 생존 정자와 사멸 정자를 구별하기 위한 형광 기술을 사용하여 정자 생존율을 시험하는데 반복당 처리당 4마리의 수컷을 사용하였다. 생사 정자 생존율 키트(Live Dead Sperm Viability Kit)™ (라이프 테크놀로지스(Life Technologies), 캘리포니아주 칼스배드)는 막-투과 핵산 염색약인 SYBR 14 및 사멸 세포를 염색하는 프로피듐 아이오딘을 함유한다.
WCR 수컷을 얼음 상에서 마취시키고, 고환 및 정낭을 해부하고, 10 μL 완충제 (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, BSA 10%, pH 7.4) 중에 넣고, 오토클레이빙된 이쑤시개로 분쇄하였다. 정자 생존율을 생사 정자 생존율 키트™를 사용하여 즉시 평가하였다. 1 μL의 SYBR 14 (DMSO 중 0.1 mM)를 첨가하고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션하고, 이어서 1 μL 프로피듐 아이오딘 (2.4 mM)을 첨가하고, 다시 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 10 μL의 정자 염색된 용액을 유리 마이크로슬라이드로 옮기고, 슬립커버로 덮었다. 샘플을 니콘(Nikon)™ A1 공초점 및 NIS-엘레먼츠 소프트웨어를 갖는 니콘® 이클립스 90i 현미경을 사용하여 평가하였다. 샘플을 10X에서 488 여기, 동시에 생존 정자의 경우 500-550 nm 대역 통과 (SYBR 14) 및 사멸 정자의 경우 663-738 nm 대역 통과 (프로피듐 아이오딘)로 가시화하였다. 디지털 영상을 샘플당 5개의 영상 영역에 대해 기록하였다. 생존 정자 (녹색) 및 사멸 정자 (적색)의 수를 이미지J 소프트웨어의 세포 계수기 기능을 사용하여 평가하였다. 문헌 [Schneider et al. (2012) Nat. Methods 9:671-5].
7일 동안 hunchback dsRNA를 섭식한 수컷은 GFP dsRNA 또는 물을 단독으로 섭취한 수컷보다 더 적은 총 정자 및 더 적은 사멸 정자를 생산하였다. 표 20. 생존 정자의 평균 수는 처리 사이에 유의하게 상이하지 않았다. dsRNA 처리물을 섭취한 수컷과 교미한 암컷으로부터의 암컷당 알 수 또는 퍼센트 알 부화에 있어서는 어떠한 통계적 차이도 없었다. 표 21. hunchback dsRNA에 4 회 노출된 수컷에 대한 전사체 발현에 있어서는 어떠한 통계적 차이도 없었다.
표 20. 처리된 인공 먹이의 섭취 7일 후에 WCR 성충 수컷 정자 생산 및 생존율에 대한 hunchback dsRNA의 효과. 던넷 검정을 사용하여 평균을 분리하였다.
Figure pct00019
† SEM- 평균의 표준 오차.
*는 p-값 ≤ 0.1에서의 유의도를 나타낸다.
**는 p-값 ≤ 0.05에서의 유의도를 나타낸다.
표 21. 단지 수컷에 의한 dsRNA 처리된 인공 먹이의 섭취 7일 후에 WCR 알 생산 및 알 생존율에 대한 hunchback dsRNA의 효과.
Figure pct00020
† SEM- 평균의 표준 오차.
dsRNA에 대한 노출을 총 6회로 증가시킨 것을 제외하고는 상기 기재된 바와 같이 숫 수컷을 처리하였다. 수컷을 제3일, 제5일, 제7일, 제9일, 및 제11일에 각각의 웰 내 12개의 처리된 먹이 플러그가 있는 새로운 트레이로 옮겼다. 이어서, 생존하는 수컷을 숫 암컷과 쌍형성시켜 4일 동안 교미하도록 하였다. 암컷을 산란 챔버 내로 단리하고, 비처리 먹이 상에 유지하여 알 생존율을 기반으로 교미가 성공적이었는지 여부를 결정하였다.
표 22. 단지 수컷에 의한 dsRNA 처리된 인공 먹이의 섭취 7일 후에 WCR 알 생산 및 알 생존율에 대한 hunchback dsRNA의 효과. 던넷 검정을 사용하여 평균을 분리하였다.
Figure pct00021
† SEM- 평균의 표준 오차.
수컷에서 상대 발현을 실시예 7에 기재된 바와 같이 결정하였다.
표 23. GFP 및 물 대조군에 비해 처리된 인공 먹이에서의 hunchback dsRNA에 6회 노출된 성충 수컷에서 hunchback의 상대 발현. 수컷 성충에서 전사체 수준의 감소가 존재한다. 던넷 검정을 사용하여 평균을 분리하였다.
Figure pct00022
† SEM - 평균의 표준 오차.
*는 p < 0.05에서의 유의도를 나타낸다.
실시예 18: 유효 농도
교미된 암컷을 hunchback dsRNA의 4개의 노출 조건에 노출시켜 유효 농도를 결정하였다. 새롭게 출현한 (<48시간) 성충 수컷 및 암컷을 크롭 캐릭터리스틱스 (미네소타주 파밍톤)로부터 입수하였다. 처리는 먹이 플러그당 2, 0.2, 0.02, 및 0.002 μg hunchback (서열식별번호: 3) dsRNA를 포함하였다. 2 μg의 GFP 및 물은 대조군으로서의 역할을 하였다. 10마리의 수컷 및 10마리의 암컷을 비처리 인공 먹이의 20 펠릿을 함유하는 1개의 웰에 함께 두었다. 트레이를 성장 챔버로 옮기고, 23±1℃, 상대 습도 >80%, 및 16:8 L:D 광주기에서 유지하였다. 수컷을 제5일에 실험으로부터 제거하였다. 새로이 처리된 먹이를 제13일까지 격일로 제공하였다. 제14일에 암컷을 오토클레이빙된 토양을 함유하는 알 케이지로 옮기고, 새로운 처리된 인공 먹이를 제공하였다 (케이지당 11개 플러그). 알 케이지를 다시 성장 챔버 내에 두었다.
제16일에 새로운 처리된 먹이를 상기 기재된 바와 같이 제공하였다. 모든 암컷을 제18일에 토양 케이지로부터 제거하고, qPCR을 위해 급속 동결시켰다. 토양 케이지를 27±1℃의 온도, 상대 습도 >80% 및 24시간 암기를 갖는 새로운 성장 챔버로 옮겼다. 제24일에 토양을 #60 체를 사용하여 세척하여 각각의 케이지로부터 알을 수집하였다. 알을 진균 오염을 방지하기 위해 포름알데히드 (5 mL 이중 증류수 중 500 μL 포름알데히드) 및 메틸-(부틸카르바모일)-2-벤즈이미다졸 카르바메이트 (50 mL 이중 증류수 중 0.025 g)의 용액으로 처리하고, 여과지를 함유하는 작은 페트리 디쉬에 두었다. 이미지J 소프트웨어의 세포 계수기 기능을 사용하는 알 계수를 위해 각각의 페트리 디쉬를 사진찍었다 (Schneider et al. (2012) Nat. Methods 9:671-5). 알이 있는 페트리 디쉬를 27±1℃의 온도, 상대 습도 >80%, 및 24시간 암기를 갖는 작은 성장 챔버로 옮겼다. 유충 부화를 15일 내내 매일 모니터링하였다. 유충을 매일 계수하고 페트리 디쉬로부터 제거하였다.
2 및 0.2 μg/ 먹이 플러그 처리에서 유의하게 감소된 알 부화가 존재하였지만 (표 24), 임의의 시험된 용량과 대조군 사이에서 암컷당 낳은 알의 수에는 어떠한 차이도 없었다.
표 24. 처리된 인공 먹이의 섭취 후에 WCR 알 생산 및 알 생존율에 대한 hunchback dsRNA 농도의 효과. 던넷 검정을 사용하여 평균을 분리하였다.
Figure pct00023
† SEM- 평균의 표준 오차. 괄호 안의 문자는 통계적 수준을 지정한다. 동일한 문자가 이어지지 않은 수준은 유의하게 상이하다 (p< 0.05).
2, 0.2, 및 0.02의 농도로 처리된 디. 브이. 비르기페라 암컷으로부터의 상대 hunchback 발현은 대조군 (물 및 GFP)보다 유의하게 더 낮았다 (도 11). 던넷 검정을 사용하여 비교를 수행하였다.
실시예 19: 노출의 시기
암컷을 3회의 상이한 시간에 시작하여 2 μg의 hunchback dsRNA에 6회 노출시켜 모 RNAi 효과를 생성하는데 필요한 노출의 시기를 결정하였다. 암컷을 교미 전 6회, 교미 직후 6회, 및 교미 6일 후에 dsRNA에 노출시켰다. 각각의 노출 시간 동안 반복당 10마리의 암컷 및 10마리의 수컷의 3회 반복을 완료하였다. 성충 WCR을 크롭 캐릭터리스틱스 (미네소타주 파밍톤)로부터 입수하였다.
교미 전 dsRNA 섭식. 10마리의 암컷을 처리된 인공 먹이의 11개 펠릿 (펠릿당 2 μg dsRNA)이 있는 1개의 웰에 두었다. 트레이를 23±1℃의 온도, 상대 습도 >80%, 및 16:8 L:D 광주기를 갖는 성장 챔버로 옮겼다. 암컷을 10일 동안 격일로 신선한 처리된 먹이를 함유하는 트레이로 옮겼다. 제12일에 암컷을 10마리의 수컷과 쌍형성시키고, 비처리 먹이의 22개 플러그를 제공하였다. 수컷을 4일 후에 제거하였다. 신선한 비처리 먹이를 8일 동안 격일로 제공하였다. 제22일에 암컷을 비처리 인공 먹이의 11개 플러그가 있는 오토클레이빙된 토양을 함유하는 알 케이지로 옮겼다. 알 케이지를 성장 챔버 내에 다시 두고, 먹이를 제24일에 대체하였다. 제26일에 암컷을 토양 케이지로부터 제거하고, qPCR을 위해 급속 동결시켰다.
토양 케이지를 온도 27±1℃, 상대 습도 >80% 및 24시간 암기를 갖는 성장 챔버로 옮겼다. 4일 후에 토양을 #60 체를 사용하여 세척하여 각각의 케이지로부터 알을 수집하였다. 알을 진균 오염을 방지하기 위해 포름알데히드 (5 mL 이중 증류수 중 500 μL 포름알데히드) 및 메틸-(부틸카르바모일)-2-벤즈이미다졸 카르바메이트 (50 mL 이중 증류수 중 0.025 g)의 용액으로 처리하고, 여과지를 함유하는 작은 페트리 디쉬에 두었다. 이미지J 소프트웨어의 세포 계수기 기능을 사용하는 알 계수를 위해 각각의 페트리 디쉬를 사진찍었다. 알이 있는 페트리 디쉬를 27±1℃의 온도, 상대 습도 >80%, 및 24시간 암기를 갖는 작은 성장 챔버로 옮겼다. 유충 부화를 15일 동안 매일 모니터링하였다. 유충을 매일 계수하고 페트리 디쉬로부터 제거하였다. 도 8A는 암컷당 회수된 알의 수를 제시하는 데이터의 개요를 예시하고, 도 8B는 교미 전 6회, 교미 직후 6회, 및 교미 6일 후에 6회, 0.67 μg/μl의 hunchback 또는 GFP에의 노출 후, 각각 부화된 퍼센트 총 유충의 결과를 예시한다. 던넷 검정을 사용하여 비교를 수행하였으며, *는 p < 0.1에서의 유의도를 나타내고, **는 p < 0.05에서의 유의도를 나타내고, ***는 p < 0.001에서의 유의도를 나타낸다. 도 9는 교미 전 6회, 교미 직후 6회, 및 교미 6일 후에 6회, 0.67 μg/μl의 hunchback 또는 GFP에의 노출 후 측정된 상대 hunchback 발현을 제시하는 데이터의 요약을 예시한다. 던넷 검정을 사용하여 비교를 수행하였으며, **는 p < 0.05에서의 유의도를 나타내고, ***는 p < 0.001에서의 유의도를 나타낸다.
교미 직후 dsRNA 섭식. 연구의 시작시에 10마리의 수컷 및 10마리의 암컷을 비처리 인공 먹이의 22개 펠릿이 있는 1개의 웰에 함께 두었다는 것을 제외하고는, 상기 기재된 것과 유사한 방법을 사용하였다. 트레이를 상기 기재된 바와 같이 성장 챔버로 옮겼다. 신선한 비처리 먹이를 제3일에 제공하고, 수컷을 제5일에 제거하였다. 이어서, 암컷을 처리된 인공 먹이로 옮기고, 성장 챔버에서 유지하였다. 신선한 처리된 먹이를 6일 동안 격일로 제공하였다. 제12일에 암컷을 처리된 인공 먹이의 11개 플러그가 있는 오토클레이빙된 토양을 함유하는 알 케이지로 옮겼다. 알 케이지를 성장 챔버 내에 다시 두고, 신선한 처리된 먹이를 제14일에 제공하였다. 제16일에 모든 암컷을 토양 케이지로부터 제거하고, qPCR을 위해 급속 동결시켰다. 토양 케이지 및 알 세척을 상기 기재된 바와 같이 6일 후에 수행하였다. 알 계수를 위해 각각의 페트리 디쉬를 사진찍었다. 유충 부화를 15일 동안 매일 모니터링하였다. 암컷당 알의 결과는 도 8A에 제시되고, 부화된 퍼센트 총 유충의 결과는 도 8B에 제시된다. 암컷의 상대 hunchback 발현은 dsRNA를 6회 받은 후에 측정하였으며, 이는 도 9에 제시된다.
교미 후 dsRNA 섭식. 곤충이 처리된 먹이로 암컷을 옮기기 전 제11일까지 격일로 비처리 인공 먹이를 받았다는 것을 제외하고는 교미 직후 dsRNA 섭식에 대해 상기 기재된 것과 유사한 방법을 따랐다. 제12일에 암컷을 처리된 인공 먹이의 11개 플러그가 있는 오토클레이빙된 토양을 함유하는 알 케이지로 옮겼다. 알 케이지를 성장 챔버 내에 다시 두었다. 신선한 처리된 먹이를 제12일-제20일에 격일로 제공하였다. 제22일에, 모든 암컷을 토양 케이지로부터 제거하고, qPCR을 위해 급속 동결시켰다. 토양 케이지 및 알 세척을 상기 기재된 바와 같이 6일 후에 수행하였다. 알 계수를 위해 각각의 페트리 디쉬를 사진찍었다. 유충 부화를 15일 동안 매일 모니터링하였다. 유충을 매일 계수하고 페트리 디쉬로부터 제거하였다. 암컷당 알의 결과는 도 8A에 제시되고, 부화된 퍼센트 총 유충의 결과는 도 8B에 제시된다. 상대 hunchback 발현을 측정하였으며, 이는 도 9에 제시된다.
암컷 사멸률을 연구 내내 모든 처리에 대해 격일로 기록하였다.
실시예 20: 노출의 지속기간
숫 수컷 및 암컷을 비처리 먹이 하에 4일의 기간 동안 쌍형성시키며, 이 후에 교미된 암컷을 2 μg hunchback dsRNA에 노출시켰다. 노출의 지속기간의 효과를 평가하기 위해 곤충을 hunchback 또는 GFP dsRNA에 1, 2, 4 또는 6회 노출시켰다 (도 10 및 도 10B에서 T1, T2, T4 또는 T6으로 제시됨). 처리당 10마리의 암컷 및 10마리의 수컷의 4회 반복을 완료하였다. 성충 수컷 및 암컷은 크롭 캐릭터리스틱스 (미네소타주 파밍톤)로부터 입수하였다. 10마리의 수컷 및 10마리의 암컷을 비처리 인공 먹이의 20개 펠릿이 있는 1개의 웰에 함께 두었다. 트레이를 23±1℃의 온도, 상대 습도 >80%, 및 16:8 L:D 광주기를 갖는 성장 챔버에서 유지하였다. 새로운 비처리 인공 먹이를 제3일에 제공하였다. 수컷을 제5일에 제거하고, 암컷을 각각의 처리에서 웰당 11개 먹이 플러그를 함유하는 새로운 트레이로 옮겼다. 제7일에, 암컷을 새로운 처리된 인공 먹이가 있는 트레이로 옮기고, 사멸률을 기록하였다. 1회 (T1)의 노출로부터의 암컷을 비처리 먹이로 옮겼다. 제10일 및 제12일에 암컷을 새로운 처리된 인공 먹이가 있는 새로운 트레이로 옮기고, 사멸률을 기록하였다. T1 및 T2로부터의 암컷을 비처리 먹이로 옮겼다. 제14일에 암컷을 오토클레이빙된 토양을 함유하는 알 케이지로 옮기고, 새로운 처리된 인공 먹이를 제공하였다. T1, T2 및 T4로부터의 암컷에게 비처리 먹이를 제공하였다. 제16일에, 오래된 먹이를 제거하고, 새로운 처리된 먹이를 첨가하였다. T1, T2, 및 T4로부터의 암컷에게 비처리 먹이를 제공하였다. 18일 후에 모든 암컷을 토양 케이지로부터 제거하고, qPCR을 위해 급속 동결시켰다. 토양 케이지를 27±1℃의 온도, 상대 습도 >80% 및 24시간의 암기를 갖는 성장 챔버로 옮겼다. 알을 세척하고, 노출의 시기에 대해 나타낸 바와 같이 각각의 페트리 디쉬를 사진찍었다. 부화된 유충을 15일 동안 매일 계수하고 각각의 페트리 디쉬로부터 제거하였다. 암컷당 산란된 퍼센트 알의 결과는 도 10A에 제시된다. 부화된 총 유충의 퍼센트의 결과는 도 10B에 제시된다. 암컷의 상대 hunchback 발현을 측정하였으며, 이는 도 10C에 제시된다.
실시예 21: 난소 발생
노출의 시기에 대해 상기 기재된 바와 같이 교미 전 및 교미 직후에 hunchback dsRNA로 처리된 인공 먹이에 노출된 암컷에서 디. 브이. 비르기페라 난소 발생을 평가하였다. 암컷을 2 μg hunchback 또는 GFP dsRNA, 또는 물에 6회 노출시켰다. 처리당 5마리의 암컷을 마지막 dsRNA 노출 1일 후에 수집하고, 후속 난소 해부를 위해 70% 에탄올 중에 보관하였다. 모든 생존하는 암컷에 대한 난소 해부를 입체현미경 하에서 수행하였다. 올림푸스 SZX16 현미경, 올림푸스 SDF PLAPO 2X PFC 렌즈 및 올림푸스 셀센스 디멘션즈 소프트웨어 (일본 도쿄)로 영상을 획득하였다.
디. 브이. 비르기페라 해부는 물, GFP 또는 hunchback dsRNA로 처리된 암컷 사이에 난소 발생에 있어서 어떠한 분명한 차이도 나타내지 않았으며; 이는 교미되지 않은 암컷 뿐만 아니라 교미 직후 해부된 암컷 둘 다에 대해서 그러하였다.
SEQUENCE LISTING <110> Dow AgroSciences LLC and The Board of Regents of the University of Nebraska Siegfried, Blair Narva, Kenneth Arora, Kanika Worden, Sarah Khajuria, Chitvan Fishilevich, Elane Storer, Nicholas P. Frey, Meghan Hamm, Ronda Velez, Ana <120> PARENTAL RNAI SUPPRESSION OF HUNCHBACK GENE TO CONFER RESISTANCE TO COLEOPTERAN PESTS <130> 2971-P12202.4US (74840-US-NP) <150> 62/092,772 <151> 2014-12-16 <160> 73 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1955 <212> DNA <213> Diabrotica virgifera <400> 1 gttagatagt ggtggtcaca tgacattgtt atcagtgatt ttaatacgtg tttttgagga 60 atgaaaataa tagttggatt atttctaata cagactttga ttcttaccgt gaaatgagag 120 gaggtgtttc tgacgatatg acttcaactt gcgttcaagg aggaattaga ccaattggac 180 gatatcaacc aaacatgctt atggaaccat cgtctcctca atctgcctgg cagtttcacc 240 cagccatgcc gaaacgagaa cccgtcgatc atgatggcag aaatgactcc ggcttagcat 300 ctggaggtga atttatttca tcttcaccag gaagtgacaa tagtgaacac ttcagcgctt 360 cctattcatc tccaaccagt tgccatacag taatttctac taatacttat tatcccacca 420 atctaagaag accttcacag gcgcagacga gtattccaac gcacatgatg tacaccggcg 480 atcacaaccc cttaactccc ccgaattcgg aacctatgat ttcgcccaaa agcgtgttat 540 caagaaacaa cgaaggtgaa catcaaacta ctctgacgcc ttgtgcgtct cctgaggatg 600 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Asn Ser Glu His Phe 65 70 75 80 Ser Ala Ser Tyr Ser Ser Pro Thr Ser Cys His Thr Val Ile Ser Thr 85 90 95 Asn Thr Tyr Tyr Pro Thr Asn Leu Arg Arg Pro Ser Gln Ala Gln Thr 100 105 110 Ser Ile Pro Thr His Met Met Tyr Thr Gly Asp His Asn Pro Leu Thr 115 120 125 Pro Pro Asn Ser Glu Pro Met Ile Ser Pro Lys Ser Val Leu Ser Arg 130 135 140 Asn Asn Glu Gly Glu His Gln Thr Thr Leu Thr Pro Cys Ala Ser Pro 145 150 155 160 Glu Asp Ala Ser Val Asp Ala Thr Asp Ser Val Asn Cys Asp Gly Ala 165 170 175 Leu Lys Lys Leu Gln Ala Thr Phe Glu Lys Asn Ala Phe Ser Glu Gly 180 185 190 Ser Gly Asp Asp Asp Thr Lys Ser Asp Gly Glu Ala Glu Glu Tyr Asp 195 200 205 Glu Gln Gly Leu Arg Val Pro Lys Val Asn Ser His Gly Lys Ile Lys 210 215 220 Thr Phe Lys Cys Lys Gln Cys Asp Phe Val Ala Ile Thr Lys Leu Val 225 230 235 240 Phe Trp Glu His Thr Lys Leu His Ile Lys Ala Asp Lys Leu Leu Lys 245 250 255 Cys Pro Lys Cys Pro Phe Val Thr Glu Tyr Lys His His Leu Glu Tyr 260 265 270 His Leu Arg Asn His Tyr Gly Ser Lys Pro Phe Lys Cys 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oligonucleotide HXTIP (HEX-Probe) <400> 52 tttttggctt agagttgatg gtgtactgat ga 32 <210> 53 <211> 151 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SpecR coding region <400> 53 gaccgtaagg cttgatgaaa caacgcggcg agctttgatc aacgaccttt tggaaacttc 60 ggcttcccct ggagagagcg agattctccg cgctgtagaa gtcaccattg ttgtgcacga 120 cgacatcatt ccgtggcgtt atccagctaa g 151 <210> 54 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAD1 coding region <400> 54 tgttcggttc cctctaccaa gcacagaacc gtcgcttcag caacacctca gtcaaggtga 60 tggatgttg 69 <210> 55 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer oligonucleotide ST-LS1- F <400> 55 gtatgtttct gcttctacct ttgat 25 <210> 56 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer oligonucleotide ST-LS1- R <400> 56 ccatgttttg gtcatatatt agaaaagtt 29 <210> 57 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe oligonucleotide ST-LS1-P (FAM) <400> 57 agtaatatag tatttcaagt atttttttca aaat 34 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer oligonucleotide GAAD1-F <400> 58 tgttcggttc cctctaccaa 20 <210> 59 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer oligonucleotide GAAD1-R <400> 59 caacatccat caccttgact ga 22 <210> 60 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe oligonucleotide GAAD1-P (FAM) <400> 60 cacagaaccg tcgcttcagc aaca 24 <210> 61 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer oligonucleotide IVR1-F <400> 61 tggcggacga cgacttgt 18 <210> 62 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer oligonucleotide IVR1-R <400> 62 aaagtttgga ggctgccgt 19 <210> 63 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe oligonucleotide IVR1-P (HEX) <400> 63 cgagcagacc gccgtgtact tctacc 26 <210> 64 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer oligonucleotide SPC1A <400> 64 cttagctgga taacgccac 19 <210> 65 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer oligonucleotide SPC1S <400> 65 gaccgtaagg cttgatgaa 19 <210> 66 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe oligonucleotide TQSPEC (CY5) <400> 66 cgagattctc cgcgctgtag a 21 <210> 67 <211> 156 <212> DNA <213> Diabrotica virgifera <400> 67 caataccgct gttctgactg cagttatgcc acaaaatatt gtcattcgct gaaattgcat 60 cttagaaaat actcgcacaa acctgctatg gtactaaacc cagatggaac accaaatccg 120 ttgcccataa tcgatgttta tggtacaagg agagga 156 <210> 68 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hunchback v1 _F Forward primer <400> 68 ttaatacgac tcactatagg gagacaatac cgctgttctg actgc 45 <210> 69 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hunchback v1_R Reverse primer <400> 69 ttaatacgac tcactatagg gagatcctct ccttgtacca taaacatc 48 <210> 70 <211> 1955 <212> RNA <213> Diabrotica virgifera <400> 70 guuagauagu gguggucaca ugacauuguu aucagugauu uuaauacgug uuuuugagga 60 augaaaauaa uaguuggauu auuucuaaua cagacuuuga uucuuaccgu gaaaugagag 120 gagguguuuc ugacgauaug acuucaacuu gcguucaagg aggaauuaga ccaauuggac 180 gauaucaacc aaacaugcuu auggaaccau cgucuccuca aucugccugg caguuucacc 240 cagccaugcc gaaacgagaa cccgucgauc augauggcag aaaugacucc ggcuuagcau 300 cuggagguga auuuauuuca ucuucaccag gaagugacaa uagugaacac uucagcgcuu 360 ccuauucauc uccaaccagu ugccauacag uaauuucuac uaauacuuau uaucccacca 420 aucuaagaag accuucacag gcgcagacga guauuccaac gcacaugaug uacaccggcg 480 aucacaaccc cuuaacuccc ccgaauucgg aaccuaugau uucgcccaaa agcguguuau 540 caagaaacaa cgaaggugaa caucaaacua cucugacgcc uugugcgucu ccugaggaug 600 cuucuguuga ugcuacagac agcguuaauu gcgacggugc uuuaaaaaaa uuacaagcga 660 cuuuugaaaa aaaugcuuuu agugaagguu cuggggauga cgauaccaaa ucugauggag 720 aggcagaaga auacgacgaa caaggacuaa gaguuccaaa aguuaacucu cauggaaaaa 780 uuaaaacuuu caaguguaag caaugugauu uuguggccau uacuaaacua gucuucuggg 840 aacauaccaa guuacauauu aaagcugaca aacuccuuaa augccccaag uguccuuuug 900 ucaccgaaua uaagcaccau uuagaauauc accuuagaaa ucauuauggu ucaaaaccau 960 uuaaauguaa ccaguguagu uacucuugug uaaacaaauc aaugcuuaau ucacauuuaa 1020 aaucucacuc uaauauuuac caauaccgcu guucugacug caguuaugcc acaaaauauu 1080 gucauucgcu gaaauugcau cuuagaaaau acucgcacaa accugcuaug guacuaaacc 1140 cagauggaac accaaauccg uugcccauaa ucgauguuua ugguacaagg agaggaccaa 1200 agaugaaguc agaacaaaaa ucaucugagg aaaugucucc gaaacccgaa caaguucuac 1260 cauucccauu uaaccaguuu cuaccccaaa ugcaguuacc auucccagga uuuccauuau 1320 uuggagguuu uccagguggc auuccaaauc cuuuguuauu gcaaaacuug gaaaaacuag 1380 cccgagaaag gcgugaaucc augaacucuu cagaacguuu uucucccgca caaucagaac 1440 aaauggauac cgaugcaggc guucuugauc ucaguaaacc agaugacucu ucccagacaa 1500 accgacgaaa agauucagcu uacaaacuuu caacugguga uaauucuuca gaugaagaag 1560 acgaugaggc aacuacaaca auguucggua auguugaagu uguugaaaau aaagaacuag 1620 aagauacuuc aucggggaaa cagacaccaa cuagugcuaa aaaggaugac uacucgugcc 1680 aauacuguca gauaaauuuc ggggaccccg uuuuguauac uaugcauaug gguuaccacg 1740 gauacaagaa uccauuuauu ugcaacaugu gcggugagga auguaaugau aaagugucuu 1800 ucuucuugca cauugcacga aauccucauu cuuaaaaaua ucaauaagac ugaauucaag 1860 guuagcauuu uuauauauua uauucacacu gaaacuuuuu uaauauucaa uauuugguug 1920 cguaacauuu acgcauaucu auacuuuauu ucacg 1955 <210> 71 <211> 404 <212> RNA <213> Diabrotica virgifera <400> 71 aaguguaagc aaugugauuu uguggccauu acuaaacuag ucuucuggga acauaccaag 60 uuacauauua aagcugacaa acuccuuaaa ugccccaagu guccuuuugu caccgaauau 120 aagcaccauu uagaauauca ccuuagaaau cauuaugguu caaaaccauu uaaauguaac 180 caguguaguu acucuugugu aaacaaauca augcuuaauu cacauuuaaa aucucacucu 240 aauauuuacc aauaccgcug uucugacugc aguuaugcca caaaauauug ucauucgcug 300 aaauugcauc uuagaaaaua cucgcacaaa ccugcuaugg uacuaaaccc agauggaaca 360 ccaaauccgu ugcccauaau cgauguuuau gguacaagga gagg 404 <210> 72 <211> 537 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Diabrotica hunchback v1 hairpin-forming RNA <400> 72 caauaccgcu guucugacug caguuaugcc acaaaauauu gucauucgcu gaaauugcau 60 cuuagaaaau acucgcacaa accugcuaug guacuaaacc cagauggaac accaaauccg 120 uugcccauaa ucgauguuua ugguacaagg agaggagacu aguaccgguu gggaaaggua 180 uguuucugcu ucuaccuuug auauauauau aauaauuauc acuaauuagu aguaauauag 240 uauuucaagu auuuuuuuca aaauaaaaga auguaguaua uagcuauugc uuuucuguag 300 uuuauaagug uguauauuuu aauuuauaac uuuucuaaua uaugaccaaa acauggugau 360 gugcagguug auccgcgguu auccucuccu uguaccauaa acaucgauua ugggcaacgg 420 auuugguguu ccaucugggu uuaguaccau agcagguuug ugcgaguauu uucuaagaug 480 caauuucagc gaaugacaau auuuuguggc auaacugcag ucagaacagc gguauug 537 <210> 73 <211> 156 <212> RNA <213> Diabrotica virgifera <400> 73 caauaccgcu guucugacug caguuaugcc acaaaauauu gucauucgcu gaaauugcau 60 cuuagaaaau acucgcacaa accugcuaug guacuaaacc cagauggaac accaaauccg 120 uugcccauaa ucgauguuua ugguacaagg agagga 156

Claims (56)

  1. 서열식별번호: 1; 서열식별번호: 1의 상보체; 서열식별번호: 1의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 서열식별번호: 1의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체; 서열식별번호: 1을 포함하는 디아브로티카(Diabrotica) 유기체의 천연 코딩 서열; 서열식별번호: 1을 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 서열의 상보체; 서열식별번호: 1을 포함하는 천연 RNA 분자로 전사되는 디아브로티카 유기체의 천연 비-코딩 서열; 서열식별번호: 1을 포함하는 천연 RNA 분자로 전사되는 디아브로티카 유기체의 천연 비-코딩 서열의 상보체; 서열식별번호: 1을 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 서열의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 서열식별번호: 1을 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 서열의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체; 서열식별번호: 1을 포함하는 천연 RNA 분자로 전사되는 디아브로티카 유기체의 천연 비-코딩 서열의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 및 서열식별번호: 1을 포함하는 천연 RNA 분자로 전사되는 디아브로티카 유기체의 천연 비-코딩 서열의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체
    로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 핵산이며,
    여기서 폴리뉴클레오티드는 이종 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인
    단리된 핵산.
  2. 제1항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 46, 및 서열식별번호: 67로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 폴리뉴클레오티드.
  3. 제1항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물 형질전환 벡터.
  4. 제1항에 있어서, 유기체가 디. 브이. 비르기페라 르콩트(D. v. virgifera LeConte); 디. 바르베리 스미스 및 로렌스(D. barberi Smith and Lawrence); 디. 유. 호와르디(D. u. howardi); 디. 브이. 제아에(D. v. zeae); 디. 발테아타 르콩트(D. balteata LeConte); 디. 유. 테넬라(D. u. tenella); 디. 스페시오사 게르마르(D. speciosa Germar); 및 디. 유. 운데심푼크타타 만네르헤임(D. u. undecimpunctata Mannerheim)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 폴리뉴클레오티드.
  5. 제1항의 폴리뉴클레오티드로부터 전사된 리보핵산 (RNA) 분자.
  6. 제1항의 폴리뉴클레오티드의 발현으로부터 생산된 이중-가닥 리보핵산 분자.
  7. 제6항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 서열을 딱정벌레류 해충과 접촉시키는 것이 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 상보적인 내인성 뉴클레오티드 서열의 발현을 억제하는 것인 이중-가닥 리보핵산 분자.
  8. 제7항에 있어서, 상기 리보뉴클레오티드 분자를 딱정벌레류 해충과 접촉시키는 것이 해충을 사멸시키거나 또는 해충의 성장, 생식, 및/또는 섭식을 억제하는 것인 이중-가닥 리보핵산 분자.
  9. 제6항에 있어서, 제1, 제2 및 제3 RNA 절편을 포함하며, 여기서 제1 RNA 절편은 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 제3 RNA 절편은 제2 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 제1 RNA 절편에 연결되고, 여기서 제3 RNA 절편은 실질적으로 제1 RNA 절편의 역 상보체이며, 이에 따라 제1 및 제3 RNA 절편이 리보핵산으로 전사되는 경우에 혼성화되어 이중-가닥 RNA를 형성하는 것인 이중 가닥 RNA.
  10. 제5항에 있어서, 약 15 내지 약 30개의 뉴클레오티드 길이의 이중-가닥 리보핵산 분자 및 단일-가닥 리보핵산 분자로 이루어진 군으로부터 선택된 RNA.
  11. 제1항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물 형질전환 벡터이며, 여기서 이종 프로모터는 식물 세포에서 기능적인 것인 식물 형질전환 벡터.
  12. 제1항의 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 세포.
  13. 제12항에 있어서, 원핵 세포인 세포.
  14. 제12항에 있어서, 진핵 세포인 세포.
  15. 제14항에 있어서, 식물 세포인 세포.
  16. 제1항의 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 식물.
  17. 제16항의 식물의 종자이며, 폴리뉴클레오티드를 포함하는 종자.
  18. 제16항의 식물로부터 생산된 범용 제품이며, 검출가능한 양의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 범용 제품.
  19. 제16항에 있어서, 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드가 식물에서 이중-가닥 리보핵산 분자로서 발현되는 것인 식물.
  20. 제15항에 있어서, 제아 메이스(Zea mays) 세포인 세포.
  21. 제16항에 있어서, 제아 메이스인 식물.
  22. 제16항에 있어서, 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드가 식물에서 리보핵산 분자로서 발현되고, 리보핵산 분자는 딱정벌레류 해충이 식물의 일부를 섭취하는 경우에 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 상보적인 내인성 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제하는 것인 식물.
  23. 제1항에 있어서, 내인성 해충 유전자의 발현을 억제하는 RNA 분자를 코딩하는 적어도 1종의 추가의 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  24. 제23항에 있어서, 추가의 폴리뉴클레오티드가 모 RNAi 표현형을 유발하는 iRNA 분자를 코딩하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  25. 제24항에 있어서, 추가의 폴리뉴클레오티드가 brahma 또는 kruppel 유전자의 발현을 억제하는 iRNA 분자를 코딩하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  26. 제23항에 있어서, 추가의 폴리뉴클레오티드가 iRNA 분자와 접촉하는 딱정벌레류 해충에서의 감소된 성장 및/또는 발생 및/또는 사멸을 유발하는 iRNA 분자 (치사 RNAi)를 코딩하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  27. 제23항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물 형질전환 벡터이며, 여기서 추가의 폴리뉴클레오티드(들)는 각각 식물 세포에서 기능적인 이종 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인 식물 형질전환 벡터.
  28. 딱정벌레류 해충과의 접촉시에 딱정벌레류 해충 내의 생물학적 기능을 억제하도록 기능하는 리보핵산 (RNA) 분자를 포함하는 작용제를 제공하는 것을 포함하며, 여기서 RNA는 서열식별번호: 70-73 중 어느 것; 서열식별번호: 70-73 중 어느 것의 상보체; 서열식별번호: 70-73 중 어느 것의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 서열식별번호: 70-73 중 어느 것의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체; 서열식별번호: 1, 3, 및 67 중 어느 것의 전사체; 서열식별번호: 1, 3, 및 67 중 어느 것의 전사체의 상보체; 서열식별번호: 1, 3, 및 67 중 어느 것의 전사체의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 및 서열식별번호: 1, 3, 및 67 중 어느 것의 전사체의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화가능한 것인, 딱정벌레류 해충 집단을 방제하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 작용제가 이중-가닥 RNA 분자인 방법.
  30. 딱정벌레류 해충 내로, 딱정벌레류 해충과의 접촉시에 딱정벌레류 해충 내의 생물학적 기능을 억제하도록 기능하는 리보핵산 (RNA) 분자를 도입하는 것이며, 여기서 RNA는
    서열식별번호: 70-73 중 어느 것,
    서열식별번호: 70-73 중 어느 것의 상보체,
    서열식별번호: 70-73 중 어느 것의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편,
    서열식별번호: 70-73 중 어느 것의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체,
    서열식별번호: 1, 3, 및 67 중 어느 것의 전사체,
    서열식별번호: 1, 3, 및 67 중 어느 것의 전사체의 상보체,
    서열식별번호: 1, 3, 및 67 중 어느 것의 전사체의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편, 및
    서열식별번호: 1, 3, 및 67 중 어느 것의 전사체의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체
    로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화가능하고,
    이에 의해 pRNAi 표현형을 갖는 딱정벌레류 해충을 생산하는 것
    을 포함하는, 딱정벌레류 해충 집단을 방제하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, RNA가 수컷 딱정벌레류 해충 내로 도입되는 것인 방법.
  32. 제30항에 있어서, RNA가 암컷 딱정벌레류 해충 내로 도입되고, 방법이 해충 집단 내로 pRNAi 표현형을 갖는 암컷 딱정벌레류 해충을 방출시키는 것을 추가로 포함하며, 여기서 집단의 pRNAi 표현형을 갖는 암컷 딱정벌레류 해충과 수컷 해충 사이의 교미는 집단의 다른 암컷 해충과 수컷 해충 사이의 교미보다 더 적은 생존 자손을 생산하는 것인 방법.
  33. 딱정벌레류 해충과의 접촉시에 딱정벌레류 해충 내의 생물학적 기능을 억제하도록 기능하는 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 작용제를 제공하는 것을 포함하며, 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 70의 약 19 내지 약 30개의 인접 뉴클레오티드에 대해 약 90% 내지 약 100% 서열 동일성을 나타내는 영역을 포함하고, 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 서열은 제2 폴리뉴클레오티드 서열에 특이적으로 혼성화되는 것인, 딱정벌레류 해충 집단을 방제하는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 리보핵산 분자가 이중-가닥 리보핵산 분자인 방법.
  35. 제33항에 있어서, 딱정벌레류 해충 집단이 형질전환된 식물 세포가 결여된 동일한 숙주 식물 종의 숙주 식물에 침입한 동일한 해충 종의 집단에 비해 감소되는 것인 방법.
  36. 제1항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질전환된 식물 세포를 딱정벌레류 해충의 숙주 식물에 제공하는 것을 포함하며, 여기서 폴리뉴클레오티드는 발현되어, 딱정벌레류 해충 집단에 속하는 딱정벌레류 해충과의 접촉시에 딱정벌레류 해충 내의 표적 서열의 발현을 억제하도록 기능하는 리보핵산 분자를 생산하고, 폴리뉴클레오티드를 포함하지 않는 동일한 숙주 식물 종의 식물 상에서의 동일한 해충 종의 생식에 비해, 딱정벌레류 해충 또는 해충 집단의 감소된 생식을 유발하는 것인, 딱정벌레류 해충 집단을 방제하는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 리보핵산 분자가 이중-가닥 리보핵산 분자인 방법.
  38. 제36항에 있어서, 딱정벌레류 해충 집단이 형질전환된 식물 세포가 결여된 동일한 종의 숙주 식물에 침입한 딱정벌레류 해충 집단에 비해 감소되는 것인 방법.
  39. 서열식별번호: 70-73;
    서열식별번호: 70-73 중 어느 것의 상보체;
    서열식별번호: 70-73 중 어느 것의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편;
    서열식별번호: 70-73 중 어느 것의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체;
    서열식별번호: 1, 3, 및 67 중 어느 것의 전사체;
    서열식별번호: 1, 3, 및 67 중 어느 것의 전사체의 상보체;
    서열식별번호: 1, 3, 및 67 중 어느 것의 전사체의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 및
    서열식별번호: 1, 3, 및 67 중 어느 것의 전사체의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체
    로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화가능한 리보핵산 (RNA)을 딱정벌레류 해충의 먹이에 제공하는 것을 포함하는, 식물에서 딱정벌레류 해충 침입을 방제하는 방법.
  40. 제39항에 있어서, 먹이가 폴리뉴클레오티드를 발현하도록 형질전환된 식물 세포를 포함하는 것인 방법.
  41. 제39항에 있어서, 특이적으로 혼성화가능한 RNA가 이중-가닥 RNA 분자에 포함되는 것인 방법.
  42. 제1항의 핵산을 옥수수 식물 내로 도입하여 트랜스제닉 옥수수 식물을 생산하는 것; 및
    옥수수 식물을 배양하여 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드의 발현을 가능하게 하는 것을 포함하며; 여기서 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드의 발현은 딱정벌레류 해충 생식 또는 성장 및 딱정벌레류 해충 감염에 기인한 수확량의 손실을 억제하는 것인,
    옥수수 작물의 수확량을 개선시키는 방법.
  43. 제42항에 있어서, 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드의 발현이 옥수수 식물의 일부분과 접촉한 딱정벌레류 해충에서의 적어도 제1 표적 유전자를 억제하는 RNA 분자를 생산하는 것인 방법.
  44. 식물 세포를 제1항의 핵산을 포함하는 벡터로 형질전환시키는 것;
    복수종의 형질전환된 식물 세포를 포함하는 식물 세포 배양물의 발생이 가능하게 하는데 충분한 조건 하에서 형질전환된 식물 세포를 배양하는 것;
    적어도 1종의 폴리뉴클레오티드가 게놈 내로 통합된 형질전환된 식물 세포를 선택하는 것;
    형질전환된 식물 세포를 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 리보핵산 (RNA) 분자의 발현에 대해 스크리닝하는 것; 및
    RNA를 발현하는 식물 세포를 선택하는 것
    을 포함하는, 트랜스제닉 식물 세포를 생산하는 방법.
  45. 제44항에 있어서, RNA 분자가 이중-가닥 분자 RNA인 방법.
  46. 제44항의 방법에 의해 생산된 트랜스제닉 식물 세포를 제공하는 것; 및
    트랜스제닉 식물 세포로부터 트랜스제닉 식물을 재생시키는 것을 포함하며, 여기서 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 리보핵산 분자의 발현은 형질전환된 식물과 접촉하는 딱정벌레류 해충에서의 표적 유전자의 발현을 조정하는데 충분한 것인,
    트랜스제닉 식물에게 딱정벌레류 해충에 대한 보호를 제공하는 방법.
  47. 식물 세포를 딱정벌레류 해충으로부터 식물을 보호하기 위한 수단을 포함하는 벡터로 형질전환시키는 것;
    복수종의 형질전환된 식물 세포를 포함하는 식물 세포 배양물의 발생이 가능하게 하는데 충분한 조건 하에서 형질전환된 식물 세포를 배양하는 것;
    딱정벌레류 해충으로부터 식물을 보호하기 위한 수단이 게놈 내로 통합된 형질전환된 식물 세포를 선택하는 것;
    형질전환된 식물 세포를 딱정벌레류 해충에서의 필수 유전자의 발현을 억제하기 위한 수단의 발현에 대해 스크리닝하는 것; 및
    딱정벌레류 해충에서의 필수 유전자의 발현을 억제하기 위한 수단을 발현하는 식물 세포를 선택하는 것
    을 포함하는, 트랜스제닉 식물 세포를 생산하는 방법.
  48. 제47항의 방법에 의해 생산된 트랜스제닉 식물 세포를 제공하는 것; 및
    트랜스제닉 식물 세포로부터 트랜스제닉 식물을 재생시키는 것을 포함하며, 여기서 딱정벌레류 해충에서의 필수 유전자의 발현을 억제하기 위한 수단의 발현은 형질전환된 식물과 접촉하는 딱정벌레류 해충에서의 표적 유전자의 발현을 조정하는데 충분한 것인,
    딱정벌레류 해충-보호된 트랜스제닉 식물을 생산하는 방법.
  49. 제1항에 있어서, 바실루스 투린기엔시스(Bacillus thuringiensis)로부터의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 핵산.
  50. 제49항에 있어서, 비. 투린기엔시스로부터의 폴리펩티드가 Cry1B, Cry1I, Cry2A, Cry3, Cry7A, Cry8, Cry9D, Cry14, Cry18, Cry22, Cry23, Cry34, Cry35, Cry36, Cry37, Cry43, Cry55, Cyt1A, 및 Cyt2C를 포함하는 군으로부터 선택된 것인 핵산.
  51. 제15항에 있어서, 바실루스 투린기엔시스로부터의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포.
  52. 제51항에 있어서, 비. 투린기엔시스로부터의 폴리펩티드가 Cry1B, Cry1I, Cry2A, Cry3, Cry7A, Cry8, Cry9D, Cry14, Cry18, Cry22, Cry23, Cry34, Cry35, Cry36, Cry37, Cry43, Cry55, Cyt1A, 및 Cyt2C를 포함하는 군으로부터 선택된 것인 세포.
  53. 제16항에 있어서, 바실루스 투린기엔시스로부터의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물.
  54. 제53항에 있어서, 비. 투린기엔시스로부터의 폴리펩티드가 Cry1B, Cry1I, Cry2A, Cry3, Cry7A, Cry8, Cry9D, Cry14, Cry18, Cry22, Cry23, Cry34, Cry35, Cry36, Cry37, Cry43, Cry55, Cyt1A, 및 Cyt2C를 포함하는 군으로부터 선택된 것인 식물.
  55. 제42항에 있어서, 형질전환된 식물 세포가 바실루스 투린기엔시스로부터의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 방법.
  56. 제55항에 있어서, 비. 투린기엔시스로부터의 폴리펩티드가 Cry1B, Cry1I, Cry2A, Cry3, Cry7A, Cry8, Cry9D, Cry14, Cry18, Cry22, Cry23, Cry34, Cry35, Cry36, Cry37, Cry43, Cry55, Cyt1A, 및 Cyt2C를 포함하는 군으로부터 선택된 것인 방법.
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