CN111334510B - 桔小实蝇RNAi干扰片段制备及其使用方法 - Google Patents

桔小实蝇RNAi干扰片段制备及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种用于干扰桔小实蝇Flightin基因的RNAi干扰片段制备及其使用方法，制备方法为，选取桔小实蝇Flightin基因部分序列，设计干扰引物，进行模板DNA的扩增，以扩增产物为模板合成dsRNA，纯化得到浓度和纯度俱佳的RNAi干扰产物，选用物质的量的浓度为1000ng/μl的RNAi干扰产物，分别在桔小实蝇蛹后期或刚羽化两个时期，通过显微注射完成摄入，本发明实施的技术方案干扰桔小实蝇Flightin基因的效果显著，为安全、高效的生物防治提供了新的防治方法。

Description

桔小实蝇RNAi干扰片段制备及其使用方法
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种用于干扰桔小实蝇Flightin基因的RNAi干扰片段制备及其使用方法。
背景技术
RNA干扰( RNA interference，RNAi )是一种广泛存在于真核生物中高度保守的、由dsRNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解，使相应基因不能表达，从而引发基因转录后水平基因沉默的现象，dsRNA 导入生物体内后，被细胞中称为Dicer 的RNase Ⅲ分解成21~23bp 的小干扰RNA ( siRNA) ，siRNA 在沉默复合体(RISC) 的作用下与目标mRNA 结合，序列特异性地降解靶mRNA，阻止相应蛋白产物的合成，造成靶标基因的功能丧失，桔小实蝇（Bactrocera dorsalis（Hendal）），又名东方果实蝇(oriental fruit fly)，属双翅目（Diptera）实蝇科(Trypetidea)、果实蝇属(Bactrocera)，是我国二类进境检疫性害虫，超强的飞行能力使得对桔小实蝇的防治变得困难。目前对该害虫的防治手段主要有人工防治、化学防治及性诱剂的生物防治等，这些手段具有一定的防治效果，但总体存在效率低、成本高、对生态环境不友好等问题，因此RNA 干扰这种靶标性强、环境友好型的技术在害虫防控领域展现较大的应用潜力。
发明内容
基于上述问题，本发明提供一种桔小实蝇RNAi干扰片段制备及其使用方法，主要目的是用于干扰桔小实蝇Flightin基因，并探寻最佳效用的浓度和使用时期，以达到对桔小实蝇的防治效果。
本发明的目的及解决其技术问题是通过以下技术方案来实现的。
本发明提供了一种桔小实蝇RNAi干扰片段的制备方法，步骤如下：
（1）选取桔小实蝇Flightin基因的部分序列SEQ ID NO.1；
（2）设计步骤（1）中所述序列的PCR扩增引物的5’端，分别加上T7启动子序列，得到上游引物序列为TAATACGACTCACTATAGGGACTCGTATAATGGCTGATG，下游引物序列为TAATACGACTCACTATAGGGATAGCGACAAGCTCCCAC；
（3）使用步骤（2）中的引物PCR扩增，获得DNA片段，利用体外转录试剂盒合成dsRNA；
（3）将步骤（3）中合成的产物进行纯化、干燥；
（4）将干燥的RNA产物，用50 μl无核酸酶水溶解RNA沉淀，室温静置5 min；获得最终使用的RNAi干扰片段产物，于-80℃保存待用。
进一步地为了更好的解决技术问题，本发明提供了一种桔小实蝇RNAi干扰片段的使用方法，用于干扰桔小实蝇Flightin基因，将最终制备得到 RNAi干扰片段产物，解冻后，调整浓度为1000 ng/μl，使用显微注射方式分别于桔小实蝇成长的各个时期注入其体内。
进一步地，注射时期为蛹后期或刚羽化两个时期。
进一步地，注射时期为蛹后期。
通过上述技术方案，本发明具有以下优点：
采取本发明选取的基因片段，以及所设计的引物，制备的dsRNA具有较高浓度；电泳表明，条带清晰, 检测其浓度和纯度俱佳，通过本发明提供的注射浓度和注射时期，对提纯的RNAi干扰片段进行使用，干扰桔小实蝇Flightin基因的效果显著，为安全、高效的生物防治提供了新的防治方法。
桔小实蝇具有超强的飞行能力，沉默特定Flightin基因进而控制该虫，为创新农业害虫防治新方法提供了理论依据和实验支持。本发明选择飞行蛋白flightin基因作为RNA 干扰靶标，破坏昆虫飞行肌表达通路，阻止昆虫肌肉伸展活化及肌丝的组装和收缩等生理过程，可达到害虫防治的目的，迄今国内外尚无针对桔小实蝇的同类研究报道，本发明为建全的害虫分子调控技术体系提供了很好的范例。从这一思路出发，在将来的研究中针对灾区害虫的实际情况，选择害虫的高度保守序列及与生命活动相关的关键基因，利用本发明的分子调控技术体系，实现控制害虫的目的。因此，本发明具有较为广阔的应用前景。
附图说明
图1、Flightin和EGFP含有T7启动子的PCR扩增检测；泳道M：DNA Marker(AL5000)；泳道A1-6: Flightin含T7启动子的PCR扩增；泳道B1-10: EGFP含T7启动子的PCR扩增。
图2、Flightin和EGFP含有T7启动子的PCR产物电泳回收结果；泳道M：DNA Marker(AL5000)；泳道A1-6: Flightin含T7启动子的PCR产物回收；泳道B1-10: EGFP含T7启动子的PCR产物回收。
图3、合成Flightin和EGFP dsRNA的检测结果；泳道M：DNA Marker(AL5000)；泳道A1-6: 合成Flightin dsRNA的检测结果；泳道B1-10: 合成EGFP dsRNA的检测结果。
图4、合成Flightin和EGFP dsRNA纯化回收检测结果；泳道M：DNA Marker(AL5000)；泳道A1-6:合成Flightin dsRNA纯化回收检测结果；泳道B1-10:合成EGFP dsRNA纯化回收检测结果。
图5、桔小实蝇不同虫态注射dsRNA后1日龄Flightin的表达水平。
图6、桔小实蝇蛹注射不同量dsRNA后Flightin表达水平。
图7、桔小实蝇蛹注射dsRNA干扰后飞行测试。
图8、蛹注射dsRNA后桔小实蝇胸部组织与整虫鲜重比。
图9、桔小实蝇刚羽化成虫注射dsRNA后Flightin在雌雄虫中的表达水平。
图10、桔小实蝇刚羽化成虫注射dsRNA干扰后飞行测试。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
RNAi干扰桔小实蝇Flightin基因dsRNA干扰片段制备
1、干扰引物设计
根据克隆得到的桔小实蝇Flightin基因片段序列（GenBank登录号：MN557386），使用Primer5.0和Oligo7进行干扰引物设计，然后把T7启动子序列加在干扰引物的5’端；同理，设计对照基因EGFP的干扰引物，详见表1.1。
2、 DNA模板制备及合成dsRNA
以构建正确的pTOPO-T-Flightin、pTOPO-T-EGFP重组载体为模板，使用表1.1中的引物PCR扩增，获得Flightin和EGFP的DNA片段，胶回收后作为合成dsRNA的DNA模板。
利用体外转录试剂盒（RiboTM RNAmax-T7），合成dsRNA。
（1）将试剂冰上解冻，瞬时离心，将所有试剂收集与于管底，置于冰上待用。
（2）T7体外转录反应体系如表1.2。
（3）加完反应试剂后轻轻混匀，瞬时离心，37℃，孵育4 h，反应结束后将反应体系置于冰上，尽快进行下一步纯化。
（4）向上一步加入1 μl DNase （1 U/μl），轻轻混匀，孵育20 min（37℃），消化DNA模板。
（5）T7转录RNA产物的纯化
转录RNA产物的纯化按表1.3体系进行处理。加完以下试剂后轻轻混均，加入300 μl预冷无水乙醇，轻轻混匀，2 h或过夜-20℃沉淀，或于-80℃沉淀1 h以上；之后，4℃、13000rpm 30 min，弃上清，用1ml预冷70%乙醇，洗涤RNA 2次；最后沉淀RNA 10 min，4℃、13000rpm，弃上清，干燥RNA。
（6）RNA产物的复溶和质检
晾干RNA，用50 μl无核酸酶水溶解RNA沉淀，室温静置5 min； 用NanoDrop 2000检测dsRNA浓度和纯度，于-80℃保存待用。
3、体外合成dsRNA的DNA模板制备结果
利用双端带T7启动子的引物PCR扩增得到Flightin和EGFP基因片段作为合成dsRNA的DNA模板。浓度在8μg/μl左右，具有较高浓度；电泳表明，扩增效果好，条带清晰，且目的片段大小与预期结果一致（图1）。经胶回收结果显示（图2），目的条带单一，检测其浓度和纯度较好，可用于后续dsRNA的合成实验。
4、合成dsRNA电泳检测结果
以纯化回收的目标基因片段为模板，利用T7体外转录试剂盒合成桔小实蝇Flightin基因和对照基因EGFP的dsRNA。电泳结果表明，合成dsRNA的效果理想，条带清晰，大小与预期一致（图3）。遵照试剂盒说明方法纯化回收dsRNA结果显示（图4），回收目的片段大小正确，条带清晰，检测其浓度和纯度较好，可用于下一步dsRNA的干扰实验。
实施例2
制备得到的RNAi片段产物显微注射桔小实蝇。
1、注射刚羽化成虫
利用显微注射器注射dsRNA，选取刚羽化后约3h的成虫，从前胸腹面前足基节的节间处为注射点，控制好扎针的深度，以免损伤体内其他组织。每头注射量为1000ng，每组注射100头雌虫和100头雄虫。同时，注射dsEGFP作为阴性对照，设置3个生物学重复。具体方法如下：
（1）冰上解冻dsRNA，调整浓度。
（2）在体式显微镜上垫一块泡沫板，将虫用乙醚轻微麻醉后放于泡沫板上，用镊子轻轻调整其姿态，再用事先制作好的带有适合成虫大小凹槽的小泡沫板，轻轻将虫压在凹槽里，使用昆虫针固定好小泡沫板，以便压住虫体的腹部露出注射位点。每组在泡沫板上以同样方式固定5头虫为一个操作组，然后依次注射。
（3）注射完后，将试虫放回养虫室继续饲养并做好观察记录。
2、注射9日龄蛹
利用显微注射器注射dsRNA，注射1 μl不同浓度(500 ng/μl、1000 ng/μl和2000ng/μl）的dsRNA以控制注射不同剂量，三个处理，每组注射300头。同样，注射dsEGFP作为阴性对照，设置3个生物学重复。具体操作方法如下：
（1）注射时将制备好的不同浓度的dsRNA置于冰上解冻；
（2）将筛选出用于注射的蛹快速用75%的酒精消毒后，固定在胶带上，然后在显微镜下逐一注射。
（3）注射完后，将处理蛹置于养虫室待其羽化及饲养，并做好观察记录。
3、注射dsRNA后RNAi效果检测RT-qPCR检测RNAi效果
桔小实蝇成虫，注射dsRNA后，分别于注射后1 d（24h）、2 d（48h）、3 d（72h）和5d（120h）雌雄分开取样，每6头为一个样，3个生物学重复，液氮冻存待用。
桔小实蝇9日龄蛹，注射dsRNA后，蛹30头为一个样，成虫18头（9雌9雄）为一个样；分别于注射后10日龄蛹，羽化后1日龄和5日龄成虫取样，3个生物学重复，液氮中保存待用。
不同处理均采用RT-qPCR检测分析RNAi对桔小实蝇Flightin基因的干扰效率。
4、飞行能力测试
注射刚羽化成虫后，分别于3和5日龄进行雌雄虫飞行测试。注射9日龄蛹，待其羽化后，选取5日龄的雌雄虫进行飞行测试。
、桔小实蝇不同虫态注射合成的dsRNA后Flightin干扰效率
将桔小实蝇9日龄蛹和刚羽化成虫分别注射1000ng的Flightin dsRNA进行RNA干扰。在桔小实蝇Flightin表达高峰1日龄时荧光定量检测结果显示（图5），上述两个时期注射dsRNA干扰后，均引发了1日龄时Flightin相对表达量的下调。其中，蛹后期注射导致43%左右的下调，与对照差异显著（P＜0.05）；刚羽化成虫进行注射导致30%的下调，但与对照相比无显著差异。结果表明蛹后期注射目的dsRNA后在1日龄时干扰效率比刚羽化成虫期注射高，Flightin相对表达量下调量较多。
、桔小实蝇蛹注射Flightin dsRNA后干扰效率
将桔小实蝇9日龄蛹分别注射不同剂量（500 ng、1000 ng和2000 ng）的FlightindsRNA进行RNA干扰，然后对注射后24h的10日龄蛹，羽化后1日龄和5日龄成虫检测靶标基因的表达水平。结果如图6所示，荧光定量PCR结果表明使用不同剂量Flightin dsRNA注射蛹后期导致桔小实蝇Flightin基因出现下调和上调现象。当注射500 ng时，在10日龄蛹、1日龄和5日龄成虫时期，干扰效率不高，相对表达量分别下调19%、12%和19%，与对照无明显差异；注射1000 ng时，出现了分别为52%、43%和63%的稳定下调，均与对照差异显著（P＜0.05）；然而，当注射2000 ng时，在10日龄蛹期和5日龄出现55%和9%的上调，但1日龄时有11%的下调，且与对照均无显著差异。结果表明蛹后期注射目的dsRNA的量为1000 ng时，能对桔小实蝇Flightin基因产生明显相对稳定的干扰效果，其次500 ng时干扰效果不明显，2000 ng时会导致目的基因转录出现上调现象。
同时，待其羽化后，选取5日龄成虫做飞行测试。不同剂量的dsRNA干扰后，桔小实蝇飞行能力减弱。由图7可知，随dsRNA注射量的不同，桔小实蝇飞行距离有不同程度减少，对其飞行能力产生了一定程度的影响。注射1000 ng dsRNA干扰效果相对较明显，桔小实蝇雌、雄虫飞行距离明显降低；当注射500 ng和2000 ng时干扰后飞行能力与对照差异不明显。
桔小实蝇蛹后期注射dsRNA羽化后至5日龄时，注射dsEGFP的桔小实蝇在测试的13h内雌、雄虫平均飞行距离分别为3.51 km和3.27 km。当注射500 ng dsFlightin时，雌、雄虫平均飞行距离分别为2.55 km和2.59 km，与对照比分别下降27.35%和20.80%，差异不明显；注射1000 ng时，雌、雄虫平均飞行距离分别为1.81 km和2.06 km，与对照比分别减少1.70 km和1.21 km，降低48.43%和37.00%，飞行时间明显延长，差异显著（P＜0.05）；注射2000 ng时，雌、雄虫平均飞行距离分别为2.44 km和2.84 km，与对照差异不显著。
其次，选取蛹注射1000ng dsRNA羽化后5日龄雌、雄虫称量其整虫鲜重与胸部组织（去除翅和足）鲜重，得到胸部组织与整虫的鲜重比（见图8）。结果显示，注射dsEGFP的雌、雄虫胸部组织占整虫鲜重的百分比分别为35.16%和36.13%，而注射dsFlightin后的分别下降为32.13%和32.48%，与对照差异显著（P＜0.05）。认为注射靶标dsFlightin进行干扰后对桔小实蝇胸部飞行肌肉等组织的发育产生了影响。
、桔小实蝇刚羽化成虫注射Flightin dsRNA后干扰效率
将桔小实蝇刚羽化的成虫注射1000ng的dsRNA进行RNA干扰，然后分别对注射后1、2、3和5日龄的成虫检测靶标基因的表达水平，如图9所示。荧光定量PCR结果表明，处理后雌、雄虫均出现Flightin基因下调现象。雌虫中在3和5日龄时分别引发了49%和77%的下调，与对照差异显著（P＜0.05）；而在注射后1和2日龄时分别引起目的基因20%和9%的下调，与对照相比没有明显差异。雄虫在注射后1、2、3和5日龄，分别导致25%、3%、13%和38%的下调，5日龄时与对照差异显著（P＜0.05）其余日龄与对照相比无明显差异。
同时，刚羽化的成虫注射1000 ng dsRNA后，选取注射后3和5日龄成虫做飞行测试。结果如图10所示，在注射后3和5日龄时对桔小实蝇飞行能力造成不同程度的影响，飞行距离有所减少。在雌、雄虫中，注射靶标dsRNA后干扰效果相似。雌虫中，注射dsEGFP的3和5日龄虫平均飞行距离分别为1.91 km和3.13 km，而注射了dsFlightin的平均飞行距离分别为1.67 km和2.03 km，3日龄时与对照组差异不显著，5日龄时平均飞行距离减少约35.14%，差异显著（P＜0.05）。雄虫注射dsEGFP后3和5日龄时平均飞行距离分别为1.83 km和3.36km，注射dsFlightin的分别为1.64 km和2.36 km，3日龄时与对照组差异不显著，5日龄时平均飞行距离减少约29.76%差异显著（P＜0.05）。
本研究通过生物合成目的dsRNA片段，以显微注射法将其导入桔小实蝇体内进行Flightin基因的RNAi研究。结果发现，蛹后期注射不同剂量的dsFlightin均能引发靶标基因的沉默，注射1000ng时沉默效率较高，干扰效果稳定明显，但高浓度的时候出现上调现象。刚羽化成虫注射1000 ng dsFlightin后，在雌、雄虫中均下调了靶标基因的表达。经飞行测试表明，从蛹期和刚羽化成虫期注射dsRNA，均有出现飞行能力明显减弱的现象，说明Flightin基因在桔小实蝇飞行机制调控中发挥重要作用。
序列表
<110> 云南林业与草原科学院
<120> 桔小实蝇RNAi干扰片段制备及其使用方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 678
<212> DNA
<213> 桔小实蝇(Bactrocera dorsalis flightin)
<400> 1
actcgtataa tggctgatga ggaggatcca tggggtttcg atgagggtga tagtgagcca 60
gccgctgccc ctgctcctgc cgctgccgct gccgcagatg caggtgctgc ccctgccgcg 120
ggtggtggtg agagcgcccc aacaggaggc gaaactgaag cagctgccgc cgaagaagaa 180
tcggcaccac caccaccgcc gccagaagac gatgggtacc gaaagcccgt gcaactatat 240
cgtcactggg tgagaccaca attcttgcag tataaataca tgtacaacta cagaacaaac 300
tactatgatg acgtaattga ttacttggat aagaagcaag ttggcgtttc aagggaaata 360
ccgcgcgcac aaacttgggc tgaacgcgtg ctcagaacaa gcaacgccag tggacgtgac 420
cttgactcat acacatgttc aagcaaaagg gataagcatc ttgttcaaac tctggctgcc 480
tcgattcgta ctcataatta tcacaccaaa gcttatatta accaaaaata tgcaaatgtt 540
ctataaataa atacaaaacc tatctataaa tatgaatacc aactaaaaag ttagttaaaa 600
ttgtagtaca atttaattat aaggagatga ttacctaatt acgttctaat aaacaataaa 660
gtgggagctt gtcgctat 678

Claims (1)

1.如SEQ ID NO.1所述的序列制备的RNAi 干扰片段在下调桔小实蝇Flightin基因中的应用，其特征在于，所述应用步骤如下：
（1）采用桔小实蝇Flightin基因的序列SEQ ID NO.1；
（2）设计步骤（1）中所述序列的PCR扩增引物的5’端，分别加上T7启动子序列，得到上游引物序列为TAATACGACTCACTATAGGGACTCGTATAATGGCTGATG，下游引物序列为TAATACGACTCACTATAGGGATAGCGACAAGCTCCCAC；
（3）使用步骤（2）中的引物PCR扩增，获得DNA片段，利用体外转录试剂盒合成dsRNA；
（4）将步骤（3）中合成的产物进行纯化、干燥；
（5）将干燥的RNA产物，用50 μl无核酸酶水溶解RNA沉淀，室温静置5 min；获得最终使用的RNAi干扰片段产物，于-80℃保存待用；
所述RNAi干扰片段产物，解冻后，调整浓度为1000 ng/μl，使用显微注射方式分别于桔小实蝇成长的蛹后期注入其体内。
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