CN105440124A - 神经肽sNPF和其受体基因及在桔小实蝇特异性控制剂中的应用 - Google Patents

神经肽sNPF和其受体基因及在桔小实蝇特异性控制剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种神经肽sNPF和其受体基因及在桔小实蝇特异性控制剂中的应用，提供了桔小实蝇神经肽sNPF基因如SEQIDNO:9所示，其编码的蛋白质如SEQIDNO:10所示；还提供了桔小实蝇神经肽sNPF成熟肽的核苷酸序列如SEQIDNO:11～14所示，其编码的蛋白质如SEQIDNO:15～18所示；还提供了桔小实蝇神经肽sNPF受体基因如SEQIDNO:19所示，其编码的蛋白质如SEQIDNO:20所示；还提供了上述核苷酸和氨基酸序列的应用，以及桔小实蝇神经肽sNPF基因和其受体基因的巢式PCR扩增方法。在制备实蝇杀虫剂方面有良好的应用前景。

Description

神经肽sNPF和其受体基因及在桔小实蝇特异性控制剂中的应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种神经肽sNPF和其受体基因及在桔小实蝇特异性控制剂中的应用。
背景技术
柑桔是重要的经济作物，随着我国农业产业结构调整，柑桔产业规模不断扩大，已经逐渐成为多地区的支柱产业。桔小实蝇(Bactroceradorsalis)由于其极强的环境适应能力和入侵扩散能力，严重危害多种重要经济果蔬，尤其是柑桔。目前，桔小实蝇已成为柑桔产业健康发展的巨大威胁。目前，桔小实蝇已对市面上的有机磷杀虫剂、拟除虫菊酯和阿维菌素等农药产生了严重的抗药性；农药残留严重污染环境，对食品安全造成了隐患；农药的特异性较低，威胁到有害生物天敌，有加剧农业有害生物爆发的风险。
短神经肽F(shortneuropeptideF,sNPF)序列在不同种昆虫中具有较高保守性，其功能在昆虫中参与调控了进食、生长、应激反应、嗅觉、生殖、激素分泌、学习及记忆等多种生理活动。sNPF受体(sNPFR)属于G蛋白偶联受体(G-proteincoupledreceptor，GPCR)家族。目前，50％以上的临床用药以及正在研发中的药物以GPCR为作用靶标。据统计，全球20种最畅销药物中就有12个以GPCR为靶标，每年的销售总额达500多亿美元。因此，该类受体的整个信号传递系统在药物开发和设计中占有极其重要的地位。由于短神经肽在昆虫生理活动中的重要作用，以其受体(sNPFR)作为潜在靶标创制害虫特异的杀虫剂来达到控制桔小实蝇的方法受到越来越多的重视，也具有良好的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供神经肽sNPF和其受体基因及在桔小实蝇特异性控制剂中的应用。
在本发明的第一方面，提供一种桔小实蝇神经肽sNPF基因及其编码的蛋白质，所述桔小实蝇神经肽sNPF基因的核苷酸序列如SEQIDNO:9所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO:10所示。
在本发明的另一方面，提供一种桔小实蝇神经肽sNPF基因的扩增方法，包括如下步骤：提取桔小实蝇总RNA，反转录为cDNA，以cDNA为模板采用巢式PCR的扩增方法，第一轮扩增的引物为sNPF-1-F和sNPF-1-R，第二轮扩增的引物为sNPF-2-F和sNPF-2-R，所述引物的序列为：
sNPF-1-F：GGAAAACAAAGCTGTACCAAC，
sNPF-1-R：CTGCTTTTGCCAATTATATAG，
sNPF-2-F：CAGCGTTCAAAATGTTCATGTC，
sNPF-2-R：GCATTTAATTTTTAGCTTGTGC。
在本发明的另一方面，提供一种桔小实蝇神经肽sNPF成熟肽(也称sNPFR配体)基因及其编码的蛋白质，所述桔小实蝇神经肽sNPF配体的核苷酸序列如SEQIDNO:11～14所示，所述核苷酸序列编码的蛋白质的氨基酸序列分别如SEQIDNO:15～18所示。
在本发明的另一方面，提供一种桔小实蝇神经肽sNPF受体基因及其编码的蛋白质，所述桔小实蝇神经肽sNPF受体基因的核苷酸序列如SEQIDNO:19所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO:20所示。
在本发明的另一方面，提供一种桔小实蝇神经肽sNPF受体基因的扩增方法，包括如下步骤：提取桔小实蝇总RNA，反转录为cDNA，以cDNA为模板采用巢式PCR的扩增方法，第一轮扩增的引物为sNPFR-1-F和sNPFR-1-R，第二轮扩增的引物为sNPFR-2-F和sNPFR-2-R，所述引物的序列为：
sNPFR-1-F：GCAATCATAATGGATGCAGTAG，
sNPFR-1-R：CAAGTGGCTGACTAGTTTCAG，
sNPFR-2-F：GTGCAACAAAAGCACACATGAATG，
sNPFR-2-R：CAAGTGGCTGACTAGTTTCAG。
在本发明的另一方面，提供一种前述的桔小实蝇神经肽sNPF基因及其编码的蛋白质、桔小实蝇神经肽sNPF成熟肽基因及其编码的蛋白质、或者桔小实蝇神经肽sNPFR基因及其编码的蛋白质，在实蝇神经调节方面的应用，在实蝇防治上的应用，或者在制备实蝇杀虫剂方面的应用。
本发明的有益效果是：本发明提供的桔小实蝇神经肽sNPFR的配体多肽与SNPFR具有很好的结合能力，证明本发明提供的配体具有体外活性，提供的配体多肽和编码该配体多肽的DNA可以用于针对该GPCR开发药物，例如桔小实蝇神经调节剂。通过利用按照本发明的重组G蛋白-偶联受体蛋白的表达的受体结合测定系统，可以筛选对桔小实蝇sNPFR特异性的激动剂和拮抗剂(对模式配体有促进作用的为激动剂，反之，起拮抗作用的为拮抗剂)，所获得的激动剂或拮抗剂可以用于桔小实蝇的防治，在制备实蝇杀虫剂方面有良好的应用前景。
附图说明
图1为桔小实蝇神经肽sNPF成熟肽对sNPFR的活性测定结果图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
主要试剂及生产者：
2×PrimeSTARMaxPremix(Takara公司，日本)
RNA提取试剂盒、反转录试剂盒(天根公司，中国)
pGEM-TEasyVector(Promega公司，美国)
DNA连接试剂盒(Takara公司，日本)
Trans5α感受态细胞(Transgen公司，中国)
DNA回收试剂盒(Takara公司，日本)
pcDNA3.1(+)质粒(Invitrogen公司，美国)
酶NotI(NEB公司，美国)
质粒DNA提取试剂盒(QIAGEN，德国)
DMEM/F-12medium(Gibco公司，美国)
T4DNA连接酶(Takara公司，日本)
基因组DNA提取试剂盒(天根公司，中国)
水母素Aequorin质粒由美国堪萨斯州立大学提供
ViaFect转染试剂(Promega公司，美国)
腔肠素CoelanterazineH储存溶液(Life-technologies公司，美国)
本发明实施例中的各序列合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例一、桔小实蝇神经肽sNPF及其受体的开放阅读框序列的获得
1、桔小实蝇神经肽sNPF及其受体的开放阅读框序列引物设计及扩增
基于基因组及转录组数据，采用生物信息学方法，经过对果蝇sNPF(GenbankNo.AY626808)和其sNPFR(GenbankNo.NP524176)反复分析及比对，设计桔小实蝇神经肽sNPF及其受体(sNPFR)的巢氏PCR特异性引物，序列如下：
用RNA提取试剂盒提取桔小实蝇总RNA，用反转录试剂盒反转录为cDNA。
扩增桔小实蝇神经肽sNPF序列：50ul的反应体系包含24μL去离子水,20μL2×PrimeSTARMaxPremix,引物sNPF-1-F(如序列表中SEQIDNO:1所示)、sNPF-1-R(如序列表中SEQIDNO:2所示)各2μL(浓度均为10μM),2μL桔小实蝇cDNA模板。第一轮PCR扩增条件如下:预变性：98℃反应2min,随后，98℃变性10s,55℃退火15s,72℃延伸1.5min，循环35次，最后72℃延伸10min。取第一轮PCR扩增得到的扩增产物2μL作为第二轮PCR扩增的模板，扩增引物用sNPF-2-F(如序列表中SEQIDNO:3所示)和sNPF-2-R(如序列表中SEQIDNO:4所示)，50ul的反应体系的其余组分与第一轮扩增时相同，第二轮PCR扩增条件与第一轮相同。
扩增桔小实蝇神经肽sNPFR序列：50ul的反应体系，以及第一、二轮的PCR扩增条件与前述扩增sNPF序列时相同，只需将第一轮的引物换为sNPFR-1-F(如序列表中SEQIDNO:5所示)、sNPFR-1-R(如序列表中SEQIDNO:6所示)，第二轮的引物换为sNPFR-2-F(如序列表中SEQIDNO:7所示)、sNPFR-2-R(如序列表中SEQIDNO:8所示)即可。
2、扩增产物构建到T载体上
将前述扩增的桔小实蝇神经肽sNPF和sNPFR产物分别构建到T载体上，操作步骤如下：
1)连接：将桔小实蝇神经肽sNPF扩增产物或者sNPFR扩增产物连接到pGEM-TEasyVector上，具体操作见DNA连接试剂盒。
2)转化：在超净工作台将2.5μL步骤1)得到的连接产物加入到50μL的Trans5α感受态细胞中，混匀，置冰上冰浴30min。42℃水浴热击65sec，再放入冰浴中5min。加入无氨苄抗性的200ulLB液体培养基，37℃，250rpm振荡培养1hr。在已加入氨苄的LB固体培养基上，将活化好的菌液80μL均匀涂布在上述LB平板上，37℃培养过夜，挑取白色正圆型的菌斑菌落37℃摇菌培养3-5h，用通用引物M13(上游：GCCAGGGTTTTCCCAGTCACGA，下游：GAGCGGATAACAATTTCACACAGG)进行PCR快速鉴定，电泳检测出约1000bp左右的条带，说明连接产物成功构建到T载体上，将检测出目的条带的菌液送去测序，测序确定序列无误后，用质粒DNA提取试剂盒抽提质粒DNA，保存于-20℃。
通过测序，得到桔小实蝇神经肽sNPF及其受体(sNPFR)的开放阅读框序列。
桔小实蝇神经肽sNPF的开放阅读框序列如下(如序列表中SEQIDNO:9所示)，
ATGTTCATGTCAAATCGTTTAGTGAGCTCATTCCTGTTTGTCTGCATCAGTGTTATGCTGTGGCAGCAAAGCTCCGCCGATGTGCCGGATAACAACGCACTCGCCAACTTATACAACAGTTTGCTGCAACGCGAATATGCCGGTCCTATTGTTTTCCCCAACCACCAGGTCGAACGCAAAGCTCAACGTTCGCCTTCGTTGCGACTACGTTTCGGTCGTCGCAGCGATCCGGATATGTACTTGCCCGCCGAGAAACGTTGGTTTGGTGATGTAAATCAGAAGCCAATACGTTCGCCAT CATTACGTTTACGTTTCGGTCGTCGCAGCGATCCCAGCATGCCACTGCATAGCGAATTCGATGCTGTCATGAACGATTTGGCTGGTGTGAGCAACAATGGCGGCATAACTGATGTCGAAGAAGCGGCTGCCTTTTACGGTGACGAGTACCCTGAAGATATGTATGACGCTGGTTTTGAGCGTATGGTACGTAAGCCTCAGCGTTTGCGTTTCGGCCGCAGCTTGCCAAGAATCCAGAATAATATCGATGATGAATTAGAGCATGAACAACTTCAACAGACCGATGATTTCTTCAACTCCCTCTTAACTTCAGAAAAATTGCACAATATGTTGCTCTCACTCCGTCAATACGATTCTGACAATGACGAATTCCAACGTGAAGTACGCAAACCATCGCCTCTCCGTCTGAGATTTGGCCGCAGCGCCGCCGGTGATACTAATGAACAGAAGAAGGTCACTGCACAAAATGCCATTAATGGTGAAAAATCTGCGCCAGCAACACAACAACAACCACAGCAAGCACAAGCTAAAAATTAA
神经肽sNPF编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO:10所示。通过对神经肽序列结构特征(成熟肽的切割位点通常为“Arg”，“Lys”组合；“Gly”为酰胺化位点)的分析得出，下划线部分为桔小实蝇神经肽sNPF4个配体的核苷酸序列(如序列表中SEQIDNO:11～14所示)，以下为4个配体翻译的多肽序列：
注：“a”表示酰胺化
测得桔小实蝇神经肽sNPFR的开放阅读框序列如序列表中SEQIDNO:19所示，神经肽sNPFR的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO:20所示。
实施例二、基于细胞内钙离子流动检测的方法测定桔小实蝇神经肽sNPF与其受体的结合能力
1、构建桔小实蝇sNPFR的CHO(中国仓鼠卵巢细胞)细胞表达质粒
将实施例一中回收得到的连接在T载体上的桔小实蝇神经肽sNPFR质粒和pcDNA3.1(+)质粒，分别经NotI单酶切酶切后连接(T4DNA连接酶)，连接后参照实施例一中的转化方法进行转化，菌液阳性鉴定无误后(用通用引物T7/BGH进行PCR检测，T7：TAATACGACTCACTATAGGG，BGH：TAGAAGGCACAGTCGAGG)，用质粒提取试剂盒抽提质粒，即得到构建有sNPFGPCR片段的pcDNA3.1(+)质粒。
共转染：
1)准备1.5mL无血清培养基DMEM/F-12medium于EP管。
2)在EP管中加入构建有sNPFR片段的pcDNA3.1(+)质粒和水母素Aequorin质粒各7.5μg。
3)在EP管中加入45uLViaFect转染试剂，使用移液器来回轻柔地混合均匀。
4)室温静置15min。
5)将上述转染的混合液体均匀点滴加入事先准备好的CHO细胞，过夜培养至少24h。
2、检测细胞内钙离子：
1)收集细胞：前述共转染过夜培养结束后，倒去本来的细胞培养基，加入2-3mL胰蛋白酶，3min后，用一次性的洗耳球管吹打细胞，收集到50ML的离心管中。
2)将离心管在室温，1000g(2500rpm)条件下离心3min。
3)将上清液转移至避光小瓶中，并加入3ml的无血清培养基并重悬细胞。
4)在避光小瓶中添加30uL腔肠素CoelanterazineH储存溶液(500uM)(最终浓度应为5uM)。
5)在避光小瓶中进行磁力搅拌3h。
6)在避光小瓶中加入27mL无血清培养基，使其最终体积为30mL，并不断磁力搅拌30min。
7)利用多功能酶标仪对合成的配体多肽与受体的结合能力进行测定。
测得合成的配体多肽BdsNPF2、BdsNPF4对sNPFR的结合能力如图1所示，结果显示配体BdsNPF2、BdsNPF4的EC50值(最大发光值中浓度)分别为1.89nM、48.5nM，以此确定BdsNPF2为模式配体。

Claims (6)

1.一种桔小实蝇神经肽sNPF基因及其编码的蛋白质，其特征在于，所述桔小实蝇神经肽sNPF基因的核苷酸序列如SEQIDNO:9所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO:10所示。
2.一种权利要求1所述的桔小实蝇神经肽sNPF基因的扩增方法，其特征在于，包括如下步骤：提取桔小实蝇总RNA，反转录为cDNA，以cDNA为模板采用巢式PCR的扩增方法，第一轮扩增的引物为sNPF-1-F和sNPF-1-R，第二轮扩增的引物为sNPF-2-F和sNPF-2-R，所述引物的序列为：
sNPF-1-F：GGAAAACAAAGCTGTACCAAC，
sNPF-1-R：CTGCTTTTGCCAATTATATAG，
sNPF-2-F：CAGCGTTCAAAATGTTCATGTC，
sNPF-2-R：GCATTTAATTTTTAGCTTGTGC。
3.一种桔小实蝇神经肽sNPF成熟肽基因及其编码的蛋白质，其特征在于，所述桔小实蝇神经肽sNPF成熟肽的核苷酸序列如SEQIDNO:11～14所示，所述核苷酸序列编码的蛋白质的氨基酸序列分别如SEQIDNO:15～18所示。
4.一种桔小实蝇神经肽sNPF受体基因及其编码的蛋白质，其特征在于，所述桔小实蝇神经肽sNPF受体基因的核苷酸序列如SEQIDNO:19所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO:20所示。
5.一种权利要求4所述的桔小实蝇神经肽sNPF受体基因的扩增方法，其特征在于，包括如下步骤：提取桔小实蝇总RNA，反转录为cDNA，以cDNA为模板采用巢式PCR的扩增方法，第一轮扩增的引物为sNPFR-1-F和sNPFR-1-R，第二轮扩增的引物为sNPFR-2-F和sNPFR-2-R，所述引物的序列为：
sNPFR-1-F：GCAATCATAATGGATGCAGTAG，
sNPFR-1-R：CAAGTGGCTGACTAGTTTCAG，
sNPFR-2-F：GTGCAACAAAAGCACACATGAATG，
sNPFR-2-R：CAAGTGGCTGACTAGTTTCAG。
6.一种权利要求1所述的桔小实蝇神经肽sNPF基因及其编码的蛋白质、权利要求3所述的桔小实蝇神经肽sNPF成熟肽基因及其编码的蛋白质、或者权利要求4所述的桔小实蝇神经肽sNPF受体基因及其编码的蛋白质，在实蝇神经调节方面的应用，在实蝇防治上的应用，或者在制备实蝇杀虫剂方面的应用。
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