CN103641903B

CN103641903B - 一种牛蛙抗菌肽crc及其改造体、编码核酸和应用

Info

Publication number: CN103641903B
Application number: CN201310616751.1A
Authority: CN
Inventors: 王义鹏; 于海宁; 凌桂英; 高久香; 卫林
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Xiamen Pinxing Interconnection Information Technology Co.,Ltd.; Yijifang Xiamen Biotechnology Co ltd
Priority date: 2013-11-27
Filing date: 2013-11-27
Publication date: 2016-03-02
Anticipated expiration: 2033-11-27
Also published as: CN103641903A

Abstract

本发明公开了一种牛蛙抗菌肽CRC，其特征在于：所述牛蛙抗菌肽CRC由28个氨基酸残基组成，分子量3282.2Da，等电点10.32，其氨基酸序列为：Lys¹Lys²Cys³Lys⁴Phe⁵Phe⁶Cys⁷Lys⁸Val⁹Lys¹⁰Lys¹¹Lys¹²Ile¹³Lys¹⁴Ser¹⁵Ile¹⁶Gly¹⁷Phe¹⁸Gln¹⁹Ile²⁰Pro²¹Ile²²Val²³Ser²⁴Ile²⁵Pro²⁶Phe²⁷Lys²⁸，其中Cys³和Cys⁷之间形成一对分子内二硫键。本发明中的牛蛙抗菌肽CRC及其改造体多肽具有分子量小、人工合成简单、抗菌作用广谱高效、真核细胞毒性和溶血活性低、盐耐受性、热耐受性和热稳定性好，具有广泛的应用前景。

Description

一种牛蛙抗菌肽CRC及其改造体、编码核酸和应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种牛蛙抗菌肽CRC及其改造体、编码核酸和应用。

背景技术

近年来，随着传统抗生素的大规模和不恰当使用，微生物对传统抗生素产生了越来越强的耐受性。医学界对微生物耐药性的应对手段是使用对耐药微生物尚未使用过的新的或者替代性的抗生素。这就需要持续开发新的抗微生物剂。抗菌肽是一种小分子多肽，对细菌、真菌、病毒和原虫等均具有杀灭作用。抗菌肽具有分子量小、结构简单、杀菌活性强、杀菌机制独特，不易引起耐药性等优点，因此具有很大的开发应用前景。目前已从不同的无尾目动物皮肤中分离到300多条不同的抗菌肽，并且其数目还在增加。本发明是提供一种从牛蛙体内发现的具有广谱高效的抗菌活性、极低的细胞毒性和溶血活性的新抗菌肽CRC，以及编码这条多肽的核酸序列，并提供一批具有抗菌活性的CRC改造体多肽，以及编码这些多肽的多核苷酸。

发明内容

本发明目的是：提供一种从牛蛙体内发现的具有广谱高效的抗菌活性、极低的细胞毒性和溶血活性的新抗菌肽CRC，以及编码这条多肽的核酸序列，并提供一批具有抗菌活性的CRC改造体多肽，以及编码这些多肽的多核苷酸。

本发明的技术方案是：一种牛蛙抗菌肽CRC，其特征在于：所述牛蛙抗菌肽CRC由28个氨基酸残基组成，分子量3282.2Da，等电点10.32，其氨基酸序列为：

Lys¹Lys²Cys³Lys⁴Phe⁵Phe⁶Cys⁷Lys⁸Val⁹Lys¹⁰Lys¹¹Lys¹²Ile¹³Lys¹⁴Ser¹⁵Ile¹⁶Gly¹⁷Phe¹⁸Gln¹⁹Ile²⁰Pro²¹Ile²²Val²³Ser²⁴Ile²⁵Pro²⁶Phe²⁷Lys²⁸，其中Cys³和Cys⁷之间形成一对分子内二硫键。

一种基于上述牛蛙抗菌肽CRC的具有抗微生物活性的改造体多肽，以牛蛙抗菌肽CRC的氨基酸序列为模板，通过设计改造获得的具有抗微生物活性的改造体多肽：包含以下氨基酸序列：X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-Ile¹⁶Gly¹⁷Phe¹⁸Gln¹⁹Ile²⁰Pro²¹Ile²²Val²³Ser²⁴Ile²⁵Pro²⁶Phe²⁷Lys²⁸，

其中，

X1=Lys或Arg；

X2=Lys,Phe,Ile,Trp,Ser,Ala,Thr,Val,Leu或Gly;

X3=Cys,Phe,Ile,Trp,Ser,Ala,Thr,Tyr,Val,Leu或Gly；

X4=Lys或Arg；

X5=Phe,Ala,Gly或Val;

X6=Phe,Ile,Trp,Val或Leu;

X7=Cys,Ser,Lys,Arg,Ala或Gly；

X8=Lys或Arg；

X9=Val,Phe,Trp,Leu或Ile;

X10=Val,Phe,Trp,Leu或Ile;

X11=Lys,Arg或Gly；

X12=Lys，Arg或Gly；

X13=Phe,Ile,Trp,Ser,Ala,Thr,Val，Leu或Ile；

X14=Gly,Lys,Arg,Ala或Ser；

X15=Ser,Lys,Arg,Gly或Ala。

优选的：优选所述X2=Phe,Ile,Trp,Leu或Gly；X3=Cys,Phe,Ile,Ala,Trp,Leu,Val或Gly；X7=Cys,Lys或Arg；X13=Phe,Trp,Leu或Ile；X15=Lys或Arg。其中所述氨基酸序列至少包含SEQIDNO:2的1到15位氨基酸，且片段长度不低于15个氨基酸残基。本发明的多肽的氨基酸可以是D或L-氨基酸。氨基酸可以是天然的或合成的。也包括已知的异构体（结构的、立体的、构象的和构型的）和上述氨基酸的结构类似物，和天然（翻译后修饰）或化学修饰的氨基酸，所述天然或化学修饰包括但不仅限于磷酸化、糖基化、羟基化和/或酰胺化。与牛蛙抗菌肽CRC相比，优选的改造体多肽具有分子量更小、合成成本更低、稳定性更高、毒性更低等优势。

一种牛蛙抗菌肽CRC的编码基因，该牛蛙抗菌肽CRC前体的编码基因由677个核苷酸组成，其5’端至3’端序列为SEQIDNO:1所示的核苷酸序列：

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编码牛蛙抗菌肽CRC为第370-453位核苷酸。

一种用于抗菌的组合物，其中该组合物包含一种或多种牛蛙抗菌肽CRC或改造体多肽。含有牛蛙抗菌肽CRC或改造体多肽的组合物可以用作药物、杀菌剂、抗微生物制剂、动物饲料、化妆品和防腐保鲜等领域。本发明的牛蛙抗菌肽CRC的编码基因，可以应用于多肽重组表达、转基因动物、植物、植物部分或植物细胞中。

本发明的优点是：

本发明中的牛蛙抗菌肽CRC及其改造体多肽具有分子量小、人工合成简单、抗菌作用广谱高效、真核细胞毒性和溶血活性低、盐耐受性、热耐受性和热稳定性好，具有广泛的应用前景。

具体实施方式

实施例1：

牛蛙抗菌肽CRC编码基因克隆：

1）牛蛙肺总RNA提取：

①取200mg牛蛙肺组织，放入研钵中加入液氮研磨成粉末，转移到EP管中，加入1ml总RNA提取缓冲液(Trizol，美国Life公司产品)，充分混匀，而后于4℃，12000rpm离心10min。

②离心取上清，加入0.2ml氯仿溶液，剧烈混匀，室温放置10分钟，而后以4℃，12000rpm离心10分钟，弃除沉淀。

③上清加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟，以4℃，12000rpm离心10分钟，收集沉淀用75%（V/V）乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即为牛蛙肺总RNA。

2）牛蛙肺cDNA二链合成：采用CLONTECH公司In-FusionSMARTerTMDirectionalcDNALibraryConstructionKit合成。

（1）cDNA第一链合成(mRNA反转录)：

①RNase-free的PCR管中加入1μl牛蛙肺总RNA、1μl3’端一链合成引物（3’In-FusionSMARTerCDSPrimer）和2.5μlRNase-free水使总体积达到4.5μl，混匀后短暂离心（2000rpm，30s），离心后于72℃保温3分钟；保温后再将离心管在42℃孵育2分钟。

②在上述离心管中加入以下试剂（均为CLONTECH公司In-FusionSMARTerTMDirectionalcDNALibraryConstructionKit建库试剂盒中配备），2.0μl5×第一链缓冲液、0.25μl100mMDTT、1.0μl10mMdNTPMix、1.0μlSMARTerVOligonucleotide、0.25μlRNaseInhibitor和1.0μlSMARTScribeReverseTranscriptase反转录酶，混合离心管中试剂并短暂离心（2000rpm，30s），在42℃保温90min，然后68℃保温10min。保温处理后将离心管置于冰上中止第一链的合成。从离心管取2μl所合成的cDNA第一链备用。

（2）采用长末端聚合酶链式反应(LD-PCR)方法扩增第二链（所用试剂均为CLONTECH公司In-FusionSMARTerTMDirectionalcDNALibraryConstructionKit建库试剂盒中配备）

①将2μlcDNA第一链（mRNA反转录）、80μl去离子水、10μl10×Advantage2PCR缓冲液、2μl50×dNTP混合物、2μl5’PCR引物、2μlCDSIII/3’PCR引物以及2μl50×Advantage2PolymeraseMix在95℃预热的PCR管中进行混合。

②在PCR仪中按以下程序扩增：

95℃，1min；18个循环：95℃，15sec，65℃，30sec，68℃，6min。循环结束后，将离心管中合成的cDNA双链－80℃保存。

（3）牛蛙抗菌肽CRC编码基因克隆：

人工设计合成正向引物5’-CRC:5’-GGATGAAGATCTGGCAGTGTGTG-3’，反向引物为CLONTECH公司In-FusionSMARTerTMDirectionalcDNALibraryConstructionKit中的3’-PCR引物，其序列为5’-CGGGGTACGATGAGACACCAT-3’。PCR反应在如下条件下进行：95℃4min，95℃30sec，58℃30sec和72℃1min，30个循环。扩增完成后用胶回收试剂盒（天根生物）进行目的片段回收。将回收的目的片段连接到pMD19-T载体(Takara,大连)，转化DH5α感受态细胞。涂板并进行氨苄青霉素筛选，挑取单菌落用M13引物PCR检测插入片段大小。挑取阳性菌落，摇菌提取质粒，使用AppliedBiosystemsDNAsequencer,modelABIPRISM377进行核苷酸测序。

测定结果：

编码牛蛙抗菌肽CRC前体的基因自5’端至3’端序列为：

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cagtctccggatcgggaaggatggatcagagaggccctggatctctacaaccagagagaa120

gatggagagttcctcttcaaactcctgtctgagctccccggccccctcctggaggaggag180

ggagactctccagcaatcggtttcttgataaaggagacggactgccccaaatctgaggag240

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牛蛙抗菌肽CRC前体的编码基因核苷酸序列表为：序列长度为677个碱基，序列类型：核酸，链数：单链，拓扑学：直链状，序列种类：cDNA，来源：牛蛙肺。

实施例2

牛蛙抗菌肽CRC的制备：

（1）、牛蛙抗菌肽CRC的化学合成方法：根据编码基因推导的氨基酸序列，用自动多肽合成仪(433A,AppliedBiosystems)合成其全序列，通过HPLC反相柱层析脱盐纯化。

（2）、分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）。

（3）、纯化的抗菌肽CRC用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF），等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。

牛蛙抗菌肽CRC是基因编码的一种小分子多肽，由28个氨基酸残基组成，分子量3282.2Da，等电点10.32。牛蛙抗菌肽CRC全序列为：

Lys1Lys2Cys3Lys4Phe5Phe6Cys7Lys8Val9Lys10Lys11Lys12Ile13Lys14Ser15Ile16Gly17Phe18Gln19Ile20Pro21Ile22Val23Ser24Ile25Pro26Phe27Lys28，其中Cys3和Cys7之间形成一对分子内二硫键。

实施例3

牛蛙抗菌肽CRC抗菌活性检测：

（1）分别挑取保存于斜面上的试验菌株均匀涂布于MH固体培养基（购自青岛海博生物技术有限公司）平板上，将经过灭菌的0.5cm直径的滤纸片置于培养基表面，滴加溶解于灭菌去离子水的2mg/ml的牛蛙抗菌肽CRC样品溶液10μl，于37℃倒置培养18－20小时，观察抑菌圈形成与否。若样品具有抗菌活性，则会在滤纸片周围形成清晰透明的抑菌圈，抑菌圈越大表明样品抗菌活性越强。

（2）牛蛙抗菌肽CRC最小抑菌浓度（MinimumInhibitoryConcentration）测定（2倍稀释法）：

选择上步实验中具有抑菌圈的菌株进行MIC测定实验。试验菌株接种到MH液体培养基（青岛海博生物技术有限公司）中，37℃振荡培养到对数生长期，而后用新鲜MH液体培养基将培养至对数生长期的培养液稀释到2×105cfu/ml待用。

在无菌96孔板各孔中预先加入100μlMH液体培养基，然后在第一孔中加入100μl用MH液体培养基稀释到一定浓度的经0.22μm孔滤膜过滤的的牛蛙抗菌肽CRC样品溶液，混匀后取100μl加入第2孔，依次倍比稀释（参见表1），自第9孔吸出100μl弃去，第10孔系对照管。

表.1稀释方法

将96孔板放置37℃缓慢振荡培养18小时，于600nm波长处测定光吸收。最小抑菌浓度为看不见细菌生长的最低样品浓度。结果如表2所示。

由表2可见，牛蛙抗菌肽CRC对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和真菌均表现出很强的抗菌活性，其中包括大量临床分离致病菌。MIC值处于4.69-75μg/ml的范围。

表2牛蛙抗菌肽CRC抗菌活性

实施例4

牛蛙抗菌肽CRC溶血活性测定：

将采集的新鲜人血与阿氏液混合抗凝，生理盐水洗涤2次并重悬成107-108cell/ml的悬浮液。上述稀释好的红细胞悬液与溶解于生理盐水的牛蛙抗菌肽CRC样品混合，37℃保温30min，再于1000rpm离心5min，上清液于540nm测吸收值。阴性对照使用生理盐水，阳性对照使用TritonX-100，溶血百分比按以下公式计算：溶血百分比H%=A样品-A阴性对照/A阳性对照×100%。结果表明CRC浓度为100和200μg/ml时，溶血百分比分别为0.22%和2.64%。说明抗菌肽CRC对人红细胞具有极低的溶血活性。

实施例5

牛蛙抗菌肽CRC细胞毒性测定：

用含有10%的胎牛血清以及双抗（青霉素和链霉素各100U/ml）的DMEM（Gibco公司，美国）培养基培养小鼠成纤维细胞L929，人肝癌细胞HepG2和人前列腺癌细胞PC3。待细胞长满后去除培养液，用HANKS缓冲液（Gibco公司，美国）洗涤三次，用0.25%的胰酶消化细胞，使细胞脱落下来，用DMEM培养基重悬细胞。96孔板中每孔加入100μl细胞悬液（大约2×104个细胞），待细胞贴壁后，加入溶解于DMEM培养基的不同浓度的样品，在37℃，5%二氧化碳条件下培养48个小时。培养结束后96孔板每孔加入20μl5mg/ml的MTT溶液（用HANKS缓冲液配制），继续培养4小时。吸出孔中液体，每孔加入150μl二甲基亚砜，充分混匀，用酶标仪检测490nm波长的光吸收。细胞死亡率按以下公式计算：细胞死亡率%=A阴性对照-A样品/A阴性对照×100%。结果表明在浓度为200μg/ml时，牛蛙抗菌肽CRC对HepG2、PC3和L929三种细胞的诱导死亡率分别为4.26%、2.53%和1.09%，说明抗菌肽CRC对真核细胞具有极低的毒性。

实施例6

牛蛙抗菌肽CRC血清稳定性、盐耐受性、热耐受性和热稳定性

取健康人的血清，与牛蛙抗菌肽CRC以1:3的体积比混合，将混合物放于37℃培养箱中孵育，于不同时间点取样品利用实施例3所述2倍稀释法检测其对大肠杆菌ATCC25922的最小抑菌浓度值，以此确定牛蛙抗菌肽CRC对人血清中蛋白酶降解的抵抗性。

大肠杆菌ATCC25922用MH液体培养基（青岛海博生物技术有限公司）于37℃培养12小时，然后分别用含0、50、100、150、200和400mM氯化钠的新鲜MH液体培养基稀释到106CFU/ml。用含相应氯化钠浓度的MH液体培养基制备不同浓度梯度的牛蛙抗菌肽CRC样品。利用实施例3所述的2倍稀释法测定牛蛙抗菌肽CRC的MIC值。

牛蛙抗菌肽CRC溶解于灭菌的去离子水中（2mg/ml），在4、20、37、50、70和90℃孵育1小时，然后利用实施例3所述的2倍稀释法测定样品对大肠杆菌ATCC25922的MIC值。

牛蛙抗菌肽CRC溶解于灭菌的去离子水中（2mg/ml，）在37℃孵育0-96小时。于0、6、12、24、48、72和96小时分别取样品检测对大肠杆菌ATCC25922的MIC值。

如表3所示，牛蛙抗菌肽CRC对人血清中蛋白酶的降解具有较强的抵抗性，在两者混合7小时后，CRC仍具有抗菌活性。

表3牛蛙抗菌肽CRC血清稳定性

如表4所示，牛蛙抗菌肽CRC具有很强的盐耐受性。在低于或等于人体生理盐浓度下（≤150mMNaCl），CRC的抗菌活性保持不变。在盐浓度高于人体生理盐浓度后，CRC的抗菌活性也只是随着盐浓度的升高而略有降低。

表4牛蛙抗菌肽CRC盐耐受性

如表5所示，牛蛙抗菌肽CRC具有很强的热耐受性。CRC溶液在90℃放置1小时之后，其抗菌活性几乎不会改变。

表5牛蛙抗菌肽CRC热耐受性

许多传统的抗生素，如头孢类抗生素的溶液极不稳定，几个小时内就会失去活性，这大大限制了它们的使用。与之不同，牛蛙抗菌肽CRC溶液具有很好的热稳定性。CRC溶液在37℃放置96小时后，其抗菌活性几乎不会改变（如表6）。

表6牛蛙抗菌肽CRC热稳定性

实施例7：具有抗微生物活性的改造体多肽

通过实施例2所述化学合成的方法得到具有抗微生物活性的改造体多肽1,2,3,4,5,6,7,8，并对其血清稳定性和溶血活性进行测定。

其中1为：

Lys1Lys2Cys3Lys4Phe5Phe6Cys7Lys8Val9Val10Lys11Lys12Phe13Gly14Ser15；

2为：

Lys1Phe2Phe3Arg4Ala5Ile6Ser7Arg8Phe9Phe10Arg11Lys12Phe13Lys14Lys15；

3为：Lys1Lys2Ile3Lys4Gly5Trp6Lys7Lys8Val9Val10Lys11Lys12Phe13Gly14Ser15；

4为Lys1Lys2Cys3Lys4Phe5Phe6Arg7Arg8Leu9Leu10Lys11Lys12Leu13Ala14Gly15；

5为Arg1Phe2Phe3Lys4Phe5Phe6Ala7Lys8Val9Leu10Lys11Lys12Phe13Gly14Ser15；

6为Arg1Phe2Phe3Arg4Ala5Ile6Ser7Arg8Phe9Phe10Gly11Lys12Phe13Lys14Lys15；

7为Arg1Lys2Ile3Lys4Gly5Trp6Lys7Lys8Val9Leu10Lys11Lys12Phe13Gly14Ser15；

8为Arg1Lys2Cys3Lys4Phe5Phe6Arg7Arg8Leu9Leu10Lys11Gly12Val13Ala14Gly15。

表7对比具有抗微生物活性的改造体多肽与牛蛙抗菌肽CRC的分子量、血清稳定性（在人血清中活性保持的时间）和溶血活性（200μg/ml时溶血百分比）

通过上述比对，可以看出与牛蛙抗菌肽CRC相比，优选的改造体多肽具有分子量更小、合成成本更低、稳定性更高和毒性更低等优势。

Claims

1.一种牛蛙抗菌肽CRC，其特征在于：所述牛蛙抗菌肽CRC由28个氨基酸残基组成，分子量3282.2Da，等电点10.32，其氨基酸序列为：

2.一种编码如权利要求1所述的牛蛙抗菌肽CRC的编码基因，其序列为SEQIDNO:1所示序列的第370-453位核苷酸。

3.一种用于抗菌的组合物，其中该组合物包含所述权利要求1涉及的肽。

4.通过施用包含权利要求1涉及的肽的组合物来防腐保鲜的方法。

5.权利要求1涉及的肽在制备抗菌、抑制细菌生长的药物、防腐剂、动物饲料以及化妆品中的应用。

6.权利要求2中牛蛙抗菌肽CRC的编码基因在转基因动物、植物、植物部分、动物细胞或植物细胞多肽重组表达中的用途。