CN104910266A - 一种武夷湍蛙抗菌肽及其编码基因和应用 - Google Patents

一种武夷湍蛙抗菌肽及其编码基因和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种武夷湍蛙抗菌肽及其编码基因和应用，武夷湍蛙抗菌肽分子量2708.5Da，等电点10.25，由24个氨基酸残基组成，氨基酸序列为：Lys1-Lys2-Cys3-Lys4-Phe5-Leu6-Cys7-Lys8-Val9-Lys10-Lys11-Lys12-Leu13-Lys14-Ser15-Val16-Gly17-Leu18-Gln19-Ile20-Ser21-Met22-Gly23-Ile24，其中Cys3和Cys7之间形成一对分子内二硫键，武夷湍蛙抗菌肽具有分子量小、人工合成简单、抗菌作用广谱高效、溶血活性低的优点，具有广泛的应用前景。

Description

一种武夷湍蛙抗菌肽及其编码基因和应用
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种武夷湍蛙抗菌肽及其编码基因和应用。
背景技术
近年来，随着传统抗生素的大规模和不恰当使用，微生物对传统抗生素产生了越来越强的耐药性。目前应对微生物耐药的唯一手段是使用新型或者替代性的抗生素药物，这就需要持续开发新型抗微生物剂。
抗菌肽是一种生物体内合成的天然小分子多肽，是多细胞生物天然免疫系统的重要功能分子，对细菌、真菌、病毒和原虫等均具有直接杀灭作用。抗菌肽具有分子量小、结构简单、杀菌活性强、杀菌机制独特，不易引起耐药性等优点，被认为是极具潜力的传统抗生素替代药物，具有很大的开发应用前景。
两栖类动物皮肤裸露，易于受到周围环境中病原菌的攻击，与此同时，两栖类动物获得性免疫系统不健全，更多的依赖先天免疫系统抵御病原菌侵袭。抗菌肽作为先天免疫系统的重要分子，在两栖类动物体内种类多样，且含量丰富。到目前为止已从各种两栖类动物体内发现数百种不同的抗菌肽分子，并且其数目还在不断增加。
本发明提供一种从武夷湍蛙(Amolops wuyiensis)中提取出的具有广谱高效的抗菌活性和极低的溶血活性的新型抗菌肽，以及编码这条多肽的核酸序列。
发明内容
本发明提供一种从武夷湍蛙体内提取所得的具有广谱高效的抗菌活性和极低的溶血活性的新型抗菌肽，以及编码这条多肽的核酸序列。
本发明所述武夷湍蛙抗菌肽由24个氨基酸残基组成，分子量2708.5Da，等电点10.25，其氨基酸序列为：
Lys1-Lys2-Cys3-Lys4-Phe5-Leu6-Cys7-Lys8-Val9-Lys10-Lys11-Lys12-Leu13-Lys14-Ser15-Val16-Gly17-Leu18-Gln19-Ile20-Ser21-Met22-Gly23-Ile24(SEQ ID：1)，其中Cys3和Cys7之间形成一对分子内二硫键。
武夷湍蛙抗菌肽编码基因通过从武夷湍蛙皮肤提取总RNA，反转录合成第一链cDNA，采用长末端聚合酶链式反应(LD-PCR)方法扩增第二链cDNA。
根据抗菌肽信号肽区的保守序列，人工设计合成正向引物5’-ATGGAGGTCTGGCAGTGTGTGTTAT-3’(SEQ ID：3)，反向引物5’-CGGGGTACGATGAGACACCAT-3’(SEQ ID：4)。PCR反应扩增，扩增完成后回收目的片段，将回收的目的片段连接到质粒载体上，转化感受态细胞，筛选挑取阳性菌落，进行核苷酸测序。
该武夷湍蛙抗菌肽前体的编码基因由699个核苷酸组成，其5’端至3’端序列为SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列：
编码武夷湍蛙抗菌肽的为第370-441位核苷酸。
武夷湍蛙抗菌肽和含有该武夷湍蛙抗菌肽的组合物可以用作抗菌和抑制细菌生长的药物、杀菌剂、抗微生物制剂、动物饲料、化妆品和防腐保鲜等领域，尤其应用在制备抵抗和抑制革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和真菌生长的药物中，特别针对大肠杆菌、铜绿假单胞菌、不动杆菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、痢疾杆菌、白色念珠菌、光滑念珠菌、嗜麦芽窄食单胞菌、表皮葡萄球菌和屎肠球菌的抗菌和抑菌效果良好。
本发明的武夷湍蛙抗菌肽的编码基因，可以应用于多肽重组表达、转基因动物、植物、植物部分、动物细胞或植物细胞中。
本发明中的武夷湍蛙抗菌肽具有分子量小、人工合成简单、抗菌作用广谱高效、溶血活性低的优点，具有广泛的应用前景。
具体实施方式
下面用实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1：
武夷湍蛙抗菌肽编码基因克隆：
1)武夷湍蛙皮肤总RNA提取：
①取200mg武夷湍蛙背部皮肤组织，放入研钵中加入液氮研磨成粉末，转移到EP管中，加入1ml总RNA提取缓冲液(Trizol，美国Life公司产品)，充分混匀，而后于4℃，12000rpm离心10min。
②离心取上清，加入0.2ml氯仿溶液，剧烈混匀，室温放置10分钟，而后以4℃，12000rpm离心10分钟，弃除沉淀。
③上清加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟，以4℃，12000rpm离心10分钟，收集沉淀用75％(V/V)乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即为武夷湍蛙皮肤总RNA。
2)武夷湍蛙皮肤cDNA二链合成：采用CLONTECH公司In-FusionSMARTerTM Directional cDNA Library Construction Kit合成。
(1)cDNA第一链合成(mRNA反转录)：
①RNase-free的PCR管中加入1μl武夷湍蛙皮肤总RNA、1μl 3’端一链合成引物(3’In-Fusion SMARTer CDS Primer)和2.5μl RNase-free水使总体积达到4.5μl，混匀后短暂离心(2000rpm，30s)，离心后于72℃保温3分钟；保温后再将离心管在42℃孵育2分钟。
②在上述离心管中加入以下试剂(均为CLONTECH公司In-FusionSMARTerTM Directional cDNA Library Construction Kit建库试剂盒中配备)，2.0μl5×第一链缓冲液、0.25μl 100mM DTT、1.0μl 10mM dNTP Mix、1.0μl SMARTerV Oligonucleotide、0.25μl RNase Inhibitor和1.0μl SMARTScribe ReverseTranscriptase反转录酶，混合离心管中试剂并短暂离心(2000rpm，30s)，在42℃保温90min，然后68℃保温10min。保温处理后将离心管置于冰上中止第一链的合成。从离心管取2μl所合成的cDNA第一链备用。
(2)采用长末端聚合酶链式反应(LD-PCR)方法扩增第二链(所用试剂均为CLONTECH公司In-Fusion SMARTerTM Directional cDNA Library ConstructionKit建库试剂盒中配备)
①将2μl cDNA第一链(mRNA反转录)、80μl去离子水、10μl10×Advantage 2PCR缓冲液、2μl 50×dNTP混合物、2μl 5’PCR引物、2μl CDSIII/3’PCR引物以及2μl 50×Advantage 2Polymerase Mix在95℃预热的PCR管中进行混合。
②在PCR仪中按以下程序扩增：
95℃，1min；18个循环：95℃，15sec，65℃，30sec，68℃，6min。循环结束后，将离心管中合成的cDNA双链－80℃保存。
(3)武夷湍蛙抗菌肽编码基因克隆：
根据蛙科cathelicidins家族抗菌肽信号肽区的保守序列，人工设计合成正向引物5’-:5’-ATGGAGGTCTGGCAGTGTGTGTTAT-3’，反向引物为CLONTECH公司In-Fusion SMARTerTM Directional cDNA Library Construction Kit中的3’-PCR引物，其序列为5’-CGGGGTACGATGAGACACCAT-3’。PCR反应在如下条件下进行：95℃4min，95℃30sec，57℃30sec和72℃1min，30个循环。扩增完成后用胶回收试剂盒(天根生物)进行目的片段回收。将回收的目的片段连接到pMD19-T载体(Takara,大连)，转化DH5α感受态细胞。涂板并进行氨苄青霉素筛选，挑取单菌落用M13引物PCR检测插入片段大小。挑取阳性菌落，摇菌提取质粒，使用Applied Biosystems DNA sequencer,model ABI PRISM 377进行核苷酸测序。
测定结果：
编码武夷湍蛙抗菌肽前体的基因自5’端至3’端序列为：
武夷湍蛙抗菌肽前体的编码基因核苷酸序列表为：序列长度为699个碱基，序列类型：核酸，链数：单链，拓扑学：直链状，序列种类：cDNA，来源：武夷湍蛙皮肤。
实施例2
武夷湍蛙抗菌肽的制备：
(1)武夷湍蛙抗菌肽的化学合成方法：根据编码基因推导的氨基酸序列，用自动多肽合成仪(433A,Applied Biosystems)合成其全序列，通过HPLC反相柱层析脱盐纯化。
(2)分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)。
(3)纯化的抗菌肽用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。
武夷湍蛙抗菌肽是基因编码的一种小分子多肽，由24个氨基酸残基组成，分子量2708.5Da，等电点10.25。武夷湍蛙抗菌肽全序列为：
Lys1-Lys2-Cys3-Lys4-Phe5-Leu6-Cys7-Lys8-Val9-Lys10-Lys11-Lys12-Leu13-Lys14-Ser15-Val16-Gly17-Leu18-Gln19-Ile20-Ser21-Met22-Gly23-Ile24，其中Cys3和Cys7之间形成一对分子内二硫键。
实施例3
武夷湍蛙抗菌肽抗菌活性检测：
微生物菌株接种到MH液体培养基(青岛海博生物技术有限公司)中，37℃振荡培养到对数生长期，用新鲜MH液体培养基将菌液稀释到2×105CFU/ml备用。在无菌96孔板(Thermo，美国)各孔中预先加入100μl MH液体培养基，然后在第一孔中加入100μl用MH液体培养基稀释的武夷湍蛙抗菌肽样品溶液，混匀后取100μl加入第2孔，依次倍比稀释(参见表1)，自第9孔吸出100μl弃去，第10孔做为对照管。
表.1稀释方法
将96孔板放置37℃培养箱中缓慢振荡培养18小时，于600nm波长处测定光吸收，计算样品对不同微生物的最小抑菌浓度(Minimum InhibitoryConcentration)值。结果如表2所示。
由表2可见，武夷湍蛙抗菌肽对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和真菌均表现出很强的抗菌活性，其中包括大量临床分离致病菌。MIC值处于4.69-75μg/ml的范围。
表2武夷湍蛙抗菌肽抗菌活性
实施例4
武夷湍蛙抗菌肽溶血活性测定：
将采集的新鲜C57小鼠血与阿氏液混合抗凝，生理盐水洗涤2次并重悬成107-108cell/ml的悬浮液。上述稀释好的红细胞悬液与溶解于生理盐水的武夷湍蛙抗菌肽样品混合，37℃保温30min，再于1000rpm离心5min，上清液于540nm测吸收值。阴性对照使用生理盐水，阳性对照使用Triton X-100，溶血百分比按以下公式计算：溶血百分比H％＝A样品-A阴性对照/A阳性对照×100％。
结果表明浓度为200μg/ml时，溶血百分比为7.97％。说明抗菌肽对哺乳动物红细胞具有极低的溶血活性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种武夷湍蛙抗菌肽，其特征在于：由24个氨基酸残基组成，氨基酸序列为：Lys1-Lys2-Cys3-Lys4-Phe5-Leu6-Cys7-Lys8-Val9-Lys10-Lys11-Lys12-Leu13-Lys14-Ser15-Val16-Gly17-Leu18-Gln19-Ile20-Ser21-Met22-Gly23-Ile24，其中Cys3和Cys7之间形成一对分子内二硫键。
2.根据权利要求1所述的一种武夷湍蛙抗菌肽的编码基因，其特征在于：所述武夷湍蛙抗菌肽的前体的编码基因由699个核苷酸组成，自5，端至3，端的核苷酸序列为：
atggaggtct ggcagtgtgt gttatggctc tgtgcagtca cattggaggt ggctcactct 60
cagtctttgg atcagggagg acggatcaga gaagctttgg atctctacaa ccagagagaa 120
gctggagagt tcctctttaa actcctgtct gtgctcccca ccccgcacct ggaggaggag 180
ggagactcta cagcaatcgc tttcttgata aaggagacgg actgccccaa atctgaggag 240
aaagccttgg agacatgtga ctacagggag gacggggagg tgaaggtctg cgctcggcac 300
cgcgaggaag aggaggtgaa gtgcgttagc ctgaccgaga attcgcgcag caagagatcc 360
agtaaaaaga aaaagtgcaa attcctctgc aaagtgaaaa agaagctcaa atctgtcggc 420
ctccagatct ctatgggaat ataatctctc tatatggaat ttaataagta aatcaccgcg 480
ccatcagtgc aagacgagcg caacgccgac cctcccccgt gtacaccgcg caatctccgc 540
ttcatcacaa atattctcta tcatggatac attgtatact gtgtgtgatt gtatcagatg 600
atctgcagat gacggttttc atttccttct aacatttctg caaattaatc caaataaaat 660
tatattccga aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 699
所述武夷湍蛙抗菌肽的编码基因为上述编码基因中的第370-441位核苷酸。
3.根据权利要求1所述的一种武夷湍蛙抗菌肽的应用，其特征在于：在制备抗菌和抑制细菌生长的药物、防腐剂、动物饲料以及化妆品中的用途。
4.根据权利要求3所述的武夷湍蛙抗菌肽的应用，其特征在于：在制备抵抗和抑制革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和真菌生长的药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的武夷湍蛙抗菌肽的应用，其特征在于：在制备抵抗和抑制大肠杆菌、铜绿假单胞菌、不动杆菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、痢疾杆菌、白色念珠菌、光滑念珠菌、嗜麦芽窄食单胞菌、表皮葡萄球菌和屎肠球菌生长的药物中的应用。
6.根据权利要求2所述的一种武夷湍蛙抗菌肽编码基因的应用，其特征在于：在多肽重组表达、转基因动物、植物、植物部分、动物细胞或植物细胞中的用途。
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