CN107266546A

CN107266546A - 抗菌肽HlDFS1及其应用

Info

Publication number: CN107266546A
Application number: CN201710455996.9A
Authority: CN
Inventors: 戴建锋; 潘文; 孙塔
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2017-06-16
Filing date: 2017-06-16
Publication date: 2017-10-20
Anticipated expiration: 2037-06-16
Also published as: CN107266546B

Abstract

本发明涉及一种抗菌肽HlDFS1，抗菌肽HlDFS1的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明还公开了上述抗菌肽HlDFS1在制备抗菌药物或抗病毒药物中的应用。本发明的抗菌肽HlDFS1，抗菌效果佳，其制备方法快速高效节能，能够获得其核酸，氨基酸序列信息，有利于大量生产。

Description

抗菌肽HlDFS1及其应用

技术领域

本发明涉及生物领域，尤其涉及一种抗菌肽HlDFS1及其应用。

背景技术

目前，几乎所有的常规抗生素都出现了相应的抗药性致病株系，致病菌的抗药性问题已经日益严重地威胁着人们的健康。寻找全新类型的抗生素是解决抗药性问题的一条有效途径。

抗菌肽，又称为宿主防御肽(素)，是由多种生物细胞特定基因编码的一类小分子裂解肽，通常只有几十到几百个氨基酸残基。在非特异性免疫系统中发挥重要作用，它可以抵抗不同种类的病原菌，如真菌、病毒，及一些细胞裂解酶等引起的感染。在人类研究中还具有抗肿瘤作用。抗菌肽多由唾液、体表黏液、循环系统和其它一些高位感染区分离得到。抗菌肽因为抗菌活性高，抗菌谱广，种类多，可供选择的范围广，靶菌株不易产生抗性突变等原因，而被认为将会在医药工业上有着广阔的应用前景。

蜱虫是仅次于蚊虫的第二大虫媒传染病传播媒介，已知蜱可携带至少83种病毒、14种细菌、17种回归热螺旋体、32种原虫，其中大多数是重要的自然疫源性疾病和人兽共患病，如森林脑炎、出血热、蜱传斑疹伤寒、野兔热等，给人类健康及畜牧业带来很大危害。蜱虫能携带多种致病微生物，并与这些致病微生物共存，其体内抗菌肽发挥了很大的保护作用。长角血蜱(Haemaphysalis longicornis)在我国大多数省份广泛分布，对其开展研究有利于对我国蜱虫传播疾病的治疗与控制。

目前，国内涉及蜱虫抗菌肽的技术较少，申请号为201110025156.1的中国专利提供了一种来源长角血蜱的新型抗菌肽，并提供了其氨基酸序列，制备方法及用途。其制备方法通过收集长角血蜱的唾液，对唾液进行离心过滤层析纯化，得到抗菌肽组分再进行氨基酸序列分析。并对纯化后的抗菌肽进行了对革兰氏阳性菌，革兰氏阴性菌的抗菌实验。但该技术从蜱虫唾液中筛选纯化，对原材料蜱虫的要求量大，且纯化过程工序多，成本过高。该抗菌肽的制备过程中并未获得抗菌肽的核酸序列，不适合大量投入生产，以供后续开发使用。且该技术仅公开了抗菌肽对普通细菌的抗菌活性，并未涉及对其他微生物及抗生素耐药菌的抗菌活性的研究，说明其抗菌性能可能存在一定局限性。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种抗菌肽HlDFS1及其应用，本发明的抗菌肽HlDFS1，抗菌效果佳，对多种微生物具有抗菌性能，且其制备方法快速高效节能，能够获得其核酸，氨基酸序列信息，有利于大量生产。

本发明公开了一种抗菌肽HlDFS1，抗菌肽HlDFS1的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

进一步地，编码抗菌肽HlDFS1的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

进一步地，抗菌肽HlDFS1的信号肽片段的基因序列如SEQ ID No.3所示。

进一步地，抗菌肽HlDFS1的最小功能片段的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

抗菌肽HlDFS1的最小功能片段可通过多肽合成，大量获得具有生物学活性的抗菌肽HlDFS1，进而快速大量的投入实际应用。

进一步地，抗菌肽HlDFS1来源于长角血蜱。也可从越原血蜱，嗜群血蜱，西藏血蜱，亚洲血蜱，中华血蜱，日本血蜱，森林革蜱，中华硬蜱等其他蜱类中发现同属抗菌肽家族的其他同源蛋白。

进一步地，HlDFS1抗菌肽的制备方法包括以下步骤：

(1)通过聚合酶链反应方法从长角血蜱cDNA文库中扩增出编码抗菌肽HlDFS1的目的基因；

(2)将目的基因HlDFS1克隆到载体上，在大肠杆菌中表达，得到抗菌肽HlDFS1。

进一步地，在步骤(1)中，载体为pGEX-6P-2、pET-28a、pET-32a或pET-41a。

进一步地，在步骤(2)中，大肠杆菌为大肠杆菌DH5α、大肠杆菌BL21(DE3)、大肠杆菌DH10B或大肠杆菌Rosetta(DE3)。

HlDFS1抗菌肽的制备也可以通过直接合成多肽的方法进行，从而获得有抗菌活性的抗菌肽HlDFS1。

本发明还公开了上述抗菌肽HlDFS1在制备抗菌药物或抗病毒药物中的应用。

进一步地，抗菌药物为抗细菌药物或抗真菌药物。

进一步地，细菌为革兰氏阳性菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、牛型结核菌、革兰氏阴性菌和大肠杆菌中的一种或几种，真菌为白色念珠菌、皮肤藓菌、隐球菌、曲霉和克柔念珠菌中的一种或几种。

进一步地，上述抗菌肽HlDFS1对部分临床耐药株，如：金黄色葡萄球菌527，鲍氏不动杆菌531亦有抗菌活性。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

本发明提供了一种来源长角血蜱的新型抗菌肽，并在制备过程中，获得该抗菌肽的编码基因及氨基酸序列；该抗菌肽的制备方法高效节能，比直接从虫体中纯化要简单节约，并利于后期大量生产和应用；本发明的抗菌肽不仅对普通细菌具抗菌活性，还对两株耐药性细菌有抗菌活性，并通过细胞及动物实验验证了其作为药物的可能性和治疗效果。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

图1是本发明HlDFS1抗菌肽与其他抗菌肽序列差异的比较图；

图2是本发明HlDFS1抗菌肽与抗菌肽同源性分析结果；

图3图示了本发明HlDFS1抗菌肽的表达验证结果；

图4图示了HlDFS1在未吸血(UF)和已吸血(FD)长角血蜱中表达差异；

图5图示了HlDFS1最小功能片段对藤黄微球菌的抗菌活性；

图6图示了HlDFS1最小功能片段对金黄色葡萄球菌的抗菌活性；

图7图示了HlDFS1最小功能片段对大肠杆菌的抗菌活性；

图8图示了HlDFS1最小功能片段对水泡型口炎病毒的抑制效果；

图9为HlDFS1最小功能片段的溶血实验分析结果；

图10为HlDFS1最小功能片段的细胞活性实验结果；

图11图示了HlDFS1抗菌肽对感染藤黄微球菌的C3H小鼠治疗效果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1 抗菌肽HlDFS1的制备

利用OMEGA公司的RNA提取试剂盒提取长角血蜱的总RNA(total RNA)，并逆转录构建cDNA文库。取长角血蜱total RNA进行高通量测序分析。对测序结果进行生物信息学分析，发现一种新的抗菌肽同源序列HlDFS1(长角血蜱抗菌肽1，Haemaphysalis longicornisdefensin1)，得出其对应的氨基酸序列，并分析了与其他已报道抗菌肽的序列差异(图1)及同源性(图2)。从分析结果可知，HlDFS1是一类新的新的抗菌肽。

通过生物信息学分析，预测HlDFS1除信号肽外的序列(SEQ ID No.5)。设计克隆引物，前后克隆引物中都分别含有BamHⅠ和Eco RⅠ酶切位点。HlDFS克隆引物如下：

HlDFS1-F：CGGGATCCAAAGGAGCAGTCACTGAAGAG(SEQ ID No.6)

HlDFS1-R：GGAATTCACGGACGCAAGTGCAGGTGAG(SEQ ID No.7)

通过PCR的方法从蜱虫cDNA文库中扩增出编码HlDFS1抗菌肽的目的基因，用BamHⅠ和Eco RⅠ进行双酶切。对载体pGEX-6P-2用BamHⅠ和Eco RⅠ双酶切。将酶切好的HlDFS1片段与pGEX-6P-2连接，转化到大肠杆菌DH5α，抽提质粒得到所需重组质粒pGEX-6P-2-HlDFS1。对重组质粒pGEX-6P-2-HlDFS1进行测序分析，验证其是否真实存在，结果如图3所示。

实施例2 HlDFS1在不同生理状态蜱虫中的差异表达

取多只未吸血长角血蜱，分两组。一组寄养在小鼠体表进行吸血处理，直至蜱虫饱食脱落。另一组不做任何处理。将每组蜱虫分为三等份，分别用核糖核酸酶(RNase)的镊子和剪刀剪碎。采用实施例1中的方法，以未吸血和已饱食血的长角血蜱cDNA文库为模板，构建不同生理状态蜱虫的重组质粒，利用实时PCR技术，分析HlDFS1在不同生理状态蜱虫中的差异表达(图4)。其中，蜱虫内参引物如下：

nTACTIN-F：GCCCTGGACT TCGAGCAGGA(SEQ ID No.8)

nTACTIN-R：CACGTCGCAC TTCATGATGG(SEQ ID No.9)

由图4的DNA胶电泳结果可看出，在已吸血蜱虫中HlDFS1的表达量明显增多，以上实施例证明，HlDFS1的原核表达提供了工业化大量生产的可能性。

实施例3 HlDFS1的抗菌或抗病毒活性检测

通过生物信息学分析确定HlDFS1最小功能片段；进行化学合成并纯化，其序列如SEQ ID No.4所示；对合成的HlDFS1功能小分子粉末进行溶解，溶剂为含1uMβ-巯基乙醇的PBST溶液；通过BCA测蛋白浓度和HlDFS1功能小分子分子量分析，将HlDFS1功能小分子稀释浓度为1mg/ml，以及1、2、5、10、20、50、100、200、500uM。

鉴定化学合成纯化的HlDFS1对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、藤黄微球菌、短小芽孢杆菌、卡介苗BCG以及11种临床耐药菌的抗菌活性。具体方法如下：

1)摇菌(金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、藤黄微球菌和短小芽孢杆菌)至其对数生长期0.4～0.6。

2)用PB培养基(1％蛋白胨，0.5％NaCl)稀释菌液至其OD值为0.001。

3)先进行预实验组。有浓度为0.1、1、10uM的HlDFS1功能小分子实验组，阴性对照组，空白对照组，每组两个复孔。在96孔板中每组先加入90μl菌液，实验组加入10μl浓度为1、10、100uM的HlDFS1功能小分子，阴性对照组加入10μl溶解小分子溶剂。空白对照为90μlPB培养基和10μl溶解小分子溶剂。37℃摇菌20h。

4)测595nm处吸光度，分析实验结果。

5)根据实验结果进行下一步实验，细分实验组抗菌肽小分子浓度组别。

6)根据上述实验方法再分析鉴定HIDFS1对11种临床耐药菌，BCG抑菌效果。

为了鉴定HlDFS1是否对真菌和病毒同样具有抑制作用，以白色念珠菌和水泡型口炎病毒对象，根据上述实验方法再分析鉴定HIDFS1对其效果。

采用以下方法观察HlDFS1在病毒(VSV-GFP病毒)入侵细胞中的作用，具体方法如下：

1)293T细胞培养，48孔板中铺板，培养至细胞浓度为80％左右。

2)除去细胞上清，加入培养基。分三组，每组三个复孔。三组为：阴性对照(加溶剂)，浓度为20uM的BSA，HlDFS1功能小分子组。终体积200μl。

3)37℃培养3h后，加入适量VSV-GFP病毒。

4)37℃培养，在8h，10h，12h，16h观察病毒入侵情况。

图5-7的结果显示HlDFS1对革兰氏阳性菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、牛型结核菌、革兰氏阴性菌和大肠杆菌均有显著抗菌活性；对部分临床耐药株如金黄色葡萄球菌527，鲍氏不动杆菌531亦有抗菌活性。结果显示HlDFS1对真菌和病毒稍有抑制作用，没有对细菌类的抗菌效果明显，但后期可能通过对抗菌肽的突变或其他修饰再开发具更广谱抗菌及抗病毒应用。图8中，左侧一列代表显微镜白光下细胞状态，右侧为荧光下观测结果，病毒带有绿色荧光标记，绿色荧光量越多显示病毒扩增量越大。图8中可看出，对比NC组，HlDFS1组的荧光明显较弱，表明HlDFS1对VS V-GFP病毒的感染扩增具有抑制作用。

表1和表2分别为HlDFS1常见革兰氏阳性菌、阴性菌、真菌的抗菌活性结果及对临床抗生素耐药菌的抗菌活性结果，其中，MIC为最小抑菌浓度(Minimal InhibitoryConcentration)，MIC50表示半数抑菌范围，MIC90表示90％抑菌范围。

表1 HlDFS1的抗菌活性

表2 HlDFS1对临床抗生素耐药菌的抗菌活性

实施例4 HlDFS1溶血实验和细胞活性实验

为了分析HlDFS1是否具备作为新的小分子药物应用的可能性，检验用化学合成纯化的HlDFS1对成年人血红细胞是否有破坏的副作用，并分析鉴定化学合成纯化的HlDFS1对多种不同的人细胞系A549(人非小细胞肺癌细胞系)，293T(人肾上皮细胞系)，K562(人慢性髓系白血病细胞)，THP1(人外周血的单核细胞系)生长是否有破坏的副作用。其中，溶血实验的具体方法如下：

1)取健康人血液，利用人淋巴细胞分两层，提取人红细胞。用50倍人红细胞体积的无菌PBS重悬人红细胞。在96孔板中进行铺板，每孔180μl溶液。

2)分组，每组两复孔，阳性对照组、阴性对照和不同浓度HlDFS1组。

3)阳性对照组加入20μl 0.4％Triton X-100(in PBS)；阴性对照加20μl溶解小分子的溶剂；HIDFS1组加入20μl浓度为1、2、5、10、20、50、100、200、500uM的HlDFS1功能小分子。

4)37℃，孵育2h。测405nm处吸光度值。

5)数据处理：溶血率＝(实验组值-阴性对照组值)/(阳性对照组值-阴性对照组值)*100％。

HlDFS1对细胞活性的影响实验方法如下：

1)293T、K562、THP1、A549细胞培养，在96孔板中铺板，培养至细胞浓度为80％左右。

2)除去细胞上清，加入培养基。分三组，每组三个复孔。三组为：阴性对照(加溶剂)，浓度为20uM的BSA，HlDFS1功能小分子组。终体积90μl。

3)37℃培养24h后，加入10μl blue再培养3h。

4)测细胞活力。

上述实验的结果如图9-10所示，实验结果显示化学合成纯化的HlDFS1对人血红细胞及其他细胞活性均无较大影响，具备作为用作人用药物的可能性。

实施例5

为了进一步鉴定HlDFS1的生物学功能,利用藤黄微球菌和C3H小鼠建立小鼠模型，分析鉴定HlDFS1是否对感染藤黄微球菌的C3H小鼠有治疗作用。具体方法如下：

1)选取藤黄微球菌，摇菌至其对数生长期0.4～0.6。

2)用PBS稀释菌液至其OD值为0.01。

3)6-8周大小C3H小鼠，每只腹腔注射100μl、OD值为0.01的藤黄微球菌。

4)6h后，实验组(每组9只)每只小鼠腹腔注射100ug的HlDFS1功能小分子(实验组)，阴性对照组注射等体积溶解小分子的溶剂。

5)观察记录小鼠死亡时间。

图11中，曲线M.l.+PBS代表阴性对照组，曲线M.l.+HlDFS1代表实验组结果，图11表明，HlDFS1可使部分藤黄微球菌易感的CH3小鼠延长2天寿命，具有一定的治疗效果，后期可以研究给药量给药时间的最佳参数，以达到更好的治疗或预防效果。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 苏州大学

<120> 抗菌肽HlDFS1及其应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 74

<212> PRT

<213> 氨基酸序列

<400> 1

Met Lys Leu Leu Ala Val Val Leu Ala Leu Val Leu Val Ile Gly

5 10 15

Ala Val Ala Lys Gly Ala Val Thr Glu Glu Lys Gly Glu Val Ala

20 25 30

His Leu Arg Val Arg Arg Trp Gly Phe Gly Cys Pro Phe Asn Ala

35 40 45

Arg Arg Cys His Arg His Cys Arg Ser Ile Arg Arg Arg Ala Gly

50 55 60

Tyr Cys Ala Gly Arg Leu Arg Leu Thr Cys Thr Cys Val Arg

65 70

<210> 2

<211> 222

<212> PRT

<213> 核苷酸序列

<400> 2

ATGAAGCTGC TAGCTGTCGT CCTCGCCCTT GTTTTAGTTA TCGGGGCTGT TGCTAAAGGA 60

GCAGTCACTG AAGAGAAAGG CGAAGTGGCT CATTTGAGAG TCCGTCGTTG GGGATTCGGC 120

TGCCCGTTCA ATGCCCGGAG ATGCCATCGA CATTGCCGCA GTATCCGCCG CAGGGCCGGA 180

TACTGCGCCG GTCGGCTCAG GCTCACCTGC ACTTGCGTCC GT 222

<210> 3

<211> 54

<212> PRT

<213> 核苷酸序列

<400> 3

ATGAAGCTGC TAGCTGTCGT CCTCGCCCTT GTTTTAGTTA TCGGGGCTGT TGCT 54

<210> 4

<211> 33

<212> PRT

<213> 氨基酸序列

<400> 4

Gly Phe Gly Cys Pro Phe Asn Ala Arg Arg Cys His Arg His Cys

5 10 15

Arg Ser Ile Arg Arg Arg Ala Gly Tyr Cys Ala Gly Arg Leu Arg

20 25 30

Leu Thr Cys

<210> 5

<211> 56

<212> PRT

<213> 氨基酸序列

<400> 5

Lys Gly Ala Val Thr Glu Glu Lys Gly Glu Val Ala His Leu Arg

5 10 15

Val Arg Arg Trp Gly Phe Gly Cys Pro Phe Asn Ala Arg Arg Cys

20 25 30

His Arg His Cys Arg Ser Ile Arg Arg Arg Ala Gly Tyr Cys Ala

35 40 45

Gly Arg Leu Arg Leu Thr Cys Thr Cys Val Arg

50 55

<210> 6

<211> 29

<212> PRT

<213> 核苷酸序列

<400> 6

CGGGATCCAA AGGAGCAGTC ACTGAAGAG 29

<210> 7

<211> 28

<212> PRT

<213> 核苷酸序列

<400> 7

GGAATTCACG GACGCAAGTG CAGGTGAG 28

<210> 8

<211> 20

<212> PRT

<213> 核苷酸序列

<400> 8

GCCCTGGACT TCGAGCAGGA 20

<210> 9

<211> 20

<212> PRT

<213> 核苷酸序列

<400> 9

CACGTCGCAC TTCATGATGG 20

Claims

1.一种抗菌肽HlDFS1，其特征在于：所述抗菌肽HlDFS1的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的抗菌肽HlDFS1，其特征在于：编码所述抗菌肽HlDFS1的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.根据权利要求1所述的抗菌肽HlDFS1，其特征在于：所述抗菌肽HlDFS1的信号肽片段的基因序列如SEQ ID No.3所示。

4.根据权利要求1所述的抗菌肽HlDFS1，其特征在于：所述抗菌肽HlDFS1的最小功能片段的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的抗菌肽，其特征在于，所述HlDFS1抗菌肽的制备方法包括以下步骤：

(1)通过聚合酶链反应方法从长角血蜱cDNA文库中扩增出编码所述抗菌肽HlDFS1的目的基因；

(2)将所述目的基因克隆到载体上，在大肠杆菌中表达，得到所述抗菌肽HlDFS1。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述载体为pGEX-6P-2、pET-28a、pET-32a或pET-41a。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：在步骤(2)中，所述大肠杆菌为大肠杆菌DH5α、大肠杆菌BL21(DE3)、大肠杆菌DH10B或大肠杆菌Rosetta(DE3)。

8.根据权利要求1-4中任一项所述的抗菌肽HlDFS1在制备抗菌药物或抗病毒药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述抗菌药物为抗细菌药物或抗真菌药物。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述细菌为革兰氏阳性菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、牛型结核菌、革兰氏阴性菌和大肠杆菌中的一种或几种，所述真菌为白色念珠菌、皮肤藓菌、隐球菌、曲霉和克柔念珠菌中的一种或几种。