CN103965340B - 沼水蛙抗菌肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及两种沼水蛙抗菌肽的序列、制备方法及其应用。本发明从沼水蛙皮肤分泌物中分离出两种抗菌肽，对其抗菌和溶血活性进行了检测，并对其在模拟膜环境下的二级结构进行了研究。得到2条抗菌肽：抗菌肽A，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所述；抗菌肽B，其序列如SEQ ID NO.2所述。本发明所述抗菌肽A对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌都有抑制作用，抗菌肽B对枯草芽孢杆菌和大金黄色葡萄球菌杀灭效果很好。本发明所涉及的两种抗菌肽具有结构新颖、抗菌活力强等特点，在药物开发和应用方面具有重要价值。本发明对于抗菌肽抑菌机制的研究和抗菌肽的进一步改造和开发利用具有重要的意义。

Description

沼水蛙抗菌肽及其应用

技术领域

本发明涉及两种天然抗菌肽及其在制药领域中的应用，属于生物医学领域。

背景技术

抗菌肽由于其广谱抗菌活性和特殊的抑菌机制使其具有重要的理论研究和药物开发应用价值。两栖动物皮肤能够分泌大量的抗菌肽来抵御外来微生物的侵袭，自研究者从非洲爪蟾皮肤分泌物中发现第一个两栖动物抗菌肽magainins开始，已经有上千种抗菌肽从两栖动物皮肤分泌物中通过分离纯化或基因克隆方法得到，这些抗菌肽一般由10-50个氨基酸构成。根据抗菌肽的氨基酸序列将其分成100多个不同的家族，这些不同家族的抗菌肽在分子量大小、电荷、疏水性、结构和功能上都不相同。通过对这些抗菌肽的结构和功能的研究，不仅得到了许多具有广谱高效的杀菌作用的多肽，而且还改进了许多天然抗菌肽。

不同来源的两栖动物抗菌肽在氨基酸组成和序列上存在显著差异，根据二级结构特征可以将其分为α-螺旋抗菌肽，β-折叠抗菌肽，无规卷曲抗菌肽和扩展型抗菌肽。研究者通过圆二色谱研究发现，许多抗菌肽，如来源于Xenopuslaevis的Magainin2，来源于Rananigromaculata的temporin-1RNa、temporin-1RNb等在抗菌肽在模拟细胞膜环境下会自发折叠成两亲性的α-螺旋结构。这些抗菌肽通过静电相互作用与细菌细胞膜上的磷脂双层结合，在细胞膜环境下折叠成两亲性的α-螺旋结构，从而破坏细胞膜完整性，造成细胞内容物溶出而导致细胞死亡。随着对抗菌肽结构与功能关系的深入研究，抗菌肽的医学价值越发明显，被研究者称为“多肽抗生素”。目前开发抗菌活性强，毒副作用小，结构简单的抗菌肽已成为一个紧迫的任务。

沼水蛙（Hylaranaguentheri）是中国南部地区常见两栖动物，其皮肤分泌物中含有多种抗菌肽。有研究表明，蛙科动物至少需要20-30种抗菌肽才能形成较好的抗菌屏障，而目前已报道的沼水蛙抗菌肽有9个，分别属于brevinin、temporin和guentherin家族，仍然有许多沼水蛙皮肤抗菌肽未被发现。沼水蛙皮肤抗菌肽的分离纯化和抗菌活性研究还需要进一步的加强。

发明内容

本发明目的是提供两种制备简单，抑菌活性强的沼水蛙抗菌肽，并且可以将该抗菌肽应用于抗菌类药物的研制与开发。

一种沼水蛙抗菌肽，所述抗菌肽A由29个氨基酸构成，序列为SEQIDNO.1：FLQHIIGALSKIFLVSIDKVRCKVAGGCN，C端的两个半胱氨酸形成一对二硫键。

一种沼水蛙抗菌肽，所述抗菌肽B由18个氨基酸构成，序列为SEQIDNO.2：FFPLIFGALSKILPKIFL，C末端酰胺化。

本发明所述抗菌肽包括与SEQIDNO.1或者SEQIDNO.2所述抗菌肽具有80%或以上同源性的多肽，该多肽功能与SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所述抗菌肽相同或相似。

本发明的另一个目的是提供一种多肽片段，包括序列为SEQIDNO.1或SEQIDNO.2的多肽或同源性多肽。该多肽片段与序列为SEQIDNO.1或SEQIDNO.2的抗菌肽功能相同或相似。

所述抗菌肽A具有广谱抗菌活性，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有强抑制作用，而抗菌肽B对革兰氏阳性菌效果突出。与其最小抑菌浓度相比，抗菌肽A和B的溶血性均比较低，表明它们在抗菌药物开发和应用方面有重要价值。上述抗菌肽对细菌的抑制作用见实施例3，溶血活性结果见实施例4。

本发明所述抗菌肽在疏水环境中形成α-螺旋结构。利用圆二色谱（CD）测定抗菌肽在不同浓度三氟乙醇（2,2,2-Trifluoroethanol，TFE，模拟细胞膜疏水环境）中的二级结构，结果表明抗菌肽A和B的α-螺旋结构含量随着TFE浓度提高而增加。该结构特征对研究抗菌肽的抑菌机理有重要意义。

本发明所述抗菌肽的螺旋轮状图分析可知，该抗菌肽的疏水面或者亲水面对应氨基酸替换、缺失或修饰得到的抗菌肽A或B的类似物都可能与原抗菌肽具有相同或相似的活性。

鉴于上述抗菌肽的性质和功能，本领域普通技术人员可以以该抗菌肽为模板，通过改变该抗菌肽的序列对沼水蛙抗菌肽定向改造或合成其衍生物以提高其抗菌活性，用于药物研发和临床治疗。

附图说明

图1：沼水蛙皮肤分泌物SephedexG-50凝胶过滤色谱图。

图2：凝胶过滤色谱分离组分峰1和峰2对大肠杆菌（A）和金黄色葡萄球菌（B）的抑制作用。

图3：凝胶色谱洗脱峰峰1的反相高效液相色谱图。

图4：沼水蛙抗菌肽A和B在不同浓度TFE溶液中的圆二色谱。

图5：沼水蛙抗菌肽A的螺旋轮状图（A）和抗菌肽B的螺旋轮状图（B）。

具体实施方式

本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不仅限于下述的实施例。

实施例1

本发明所述抗菌肽的分离纯化包括SephadexG-50凝胶过滤色谱和反相高效液相色谱（RP-HPLC）两个步骤。

提取沼水蛙皮肤分泌物：成年沼水蛙，去离子水洗净，市售9V直流电池电击沼水蛙耳后腺及背部腺体发达部分皮肤，待实验个体皮肤表面产生大量分泌物，用含0.05%（V/V）三氟乙酸的去离子水冲洗并收集分泌物，12000rpm离心15min，取上清液冷冻干燥，-80℃低温保存。

SephadexG-50凝胶过滤色谱：按上述方法获得沼水蛙皮肤分泌物冻干粉，溶解于去离子水中，12000rpm离心15min。取上清液用0.22μm孔径微滤膜过滤后，上样到用去离子水平衡的SephadexG-50凝胶柱（1.6cm×100cm）。用去离子水洗脱，流速0.3mL/min，于214nm波长处检测洗脱液吸光值，绘制洗脱曲线，得到两个洗脱峰峰1和峰2，如图1所示。收集洗脱峰，冷冻干燥，进行抗菌活性测定。

反向高效液相色谱：去离子水溶解上述峰1冻干粉，采用反相高效液相色谱进一步分离。液相色谱系统为LC-20A，装配Gemini5μC18（250mm×10mm）反相柱（Phenomenex，UK），用含0.05%（V/V）的三氟乙酸的水和乙腈溶液构成的洗脱系统进行梯度洗脱。洗脱梯度：0～5min，0～20%乙腈；5～40min，20%～70%乙腈；洗脱流速1.0mL/min，检测波长214nm，洗脱曲线如图3所示。收集所有洗脱峰，测定抗菌活性。

收集具有较强抗菌活性的组分，冷冻干燥，用自动氨基酸测序仪测序，得到抗菌肽A（SEQID:NO.1）和抗菌肽B的序列（SEQID:NO.2）。

实施例2

琼脂涂布法检测凝胶过滤色谱分离组分的抑菌活性：

所用菌种大肠杆菌（EscherichiacoliATCC8099）和金黄色葡萄球菌（StaphylococcusaureusCMCC26003）为本室保存。具体操作如下：选取单菌落接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，过夜振摇培养（37℃，130rpm），将200μL过夜培养菌液接种于20mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，振摇培养4小时。培养好的菌悬液稀释1000倍，取100μL加入平板培养基表面，涂布均匀。在涂布好菌液的平板培养基表面均匀地贴上直径为5mm的圆形滤纸片，每个滤纸片上加10μL待测样品。庆大霉素作为阳性对照，无菌水做阴性对照。将加完样品的平板倒置于37℃恒温培养箱中培养18～20h，实验结果如图2所示。添加庆大霉素（标记为“+”）和SephadexG-50凝胶色谱分离组分F1的样品（标记为“1”）的滤纸片周围出现明显的抑菌圈，而加无菌水（标记为“—”）和SephadexG-50凝胶色谱分离组分F2的样品（标记为“2”）的滤纸片周围细菌正常生长，表明SephadexG-50凝胶色谱组分F1对大肠杆菌（图2A）和金黄色葡萄球菌（图2B）都有明显的抑制作用，采用高效液相色谱进一步分离。

实施例3

利用液体生长抑制法检测本发明所述多肽对细菌的抑制活力：

本实施例所用抗菌肽由上海吉尔生化有限公司根据序列SEQIDNO.1和序列SEQIDNO.2合成，合成的抗菌肽保持原有的修饰，其中抗菌肽A的C端半胱氨酸形成二硫键，抗菌肽B的C端酰胺化。两个合成肽纯度均不小于95%。采用96孔板法测定样品最小抑菌浓度（minimalinhibitoryconcentration，MIC），具体操作如下：

菌种复苏，接种斜面37℃培养过夜，挑单菌落接种于普通LB培养基中，37℃培养过夜，稀释菌液使菌浓度为10⁴-10⁵CFU/mL，按每孔100μL菌液接种于96孔板中，加入10μL以一定比例稀释后的多肽，将96孔板置于37℃过夜培养，用酶标仪检测630nm波长的吸光值，结果见表一。

含有抗菌肽的细菌生长浓度（OD₆₃₀）与不加抗菌肽的细菌生长浓度的比值大于90%时的抗菌肽浓度即为最小抑菌浓度（定义为显著抑制细菌生长的最低浓度）。

由检测结果可知，抗菌肽A和抗菌肽B对常见的细菌的最小抑菌浓度均达到微克级，具有极强的抑菌活力。抗菌肽B对革兰氏阳性菌的杀灭作用尤为明显。

表一：沼水蛙抗菌肽的最小抑菌浓度

注：“-”表示当抗菌肽浓度达到250μg/mL时未发现对该细菌有抑制作用

实施例4

本实施例通过拔除小鼠眼球取血，测定溶血活性。

取血后分离血红细胞：采集好的血液和抗凝剂充分混匀，3000rpm离心3min，去除上清液。下层血红细胞用生理盐水重悬，再次离心，重复上述步骤，直至上清液不再呈红色（处理4~5次）。最后用磷酸盐缓冲液（10mM，pH7.4）将沉淀配制成5%（压缩体积）的血红细胞溶液备用。

测定样品溶血活性：用磷酸盐缓冲液将抗菌肽溶解，配制成浓度为500μg/mL的样品溶液，每个离心管加450μL配制好的血红细胞溶液，加入50μL样品溶液，置于37℃恒温箱中反应30min后，3000rpm离心3min，取上清液于540nm波长处测定吸光值。以生理盐水为空白对照，1%（V/V）的TritonX-100作为阳性对照，溶血率按照下面公式计算。

式中：A₀阳性对照组的吸光值；A₁样品组的吸光值

经测定，沼水蛙抗菌肽A在125μg/mL时的溶血率仅为14%，溶血率较低。抗菌肽B在浓度为15.6μg/mL时的溶血率为11%，浓度为31.3μg/mL时的溶血率达到24%。与抗菌肽A相比，抗菌肽B的溶血率较高，但由于其活性较强，与其最小抑菌浓度相比，其溶血性相对较弱。上述结果表明抗菌肽A和B具有作为药物前体开发和利用的价值。

实施例5

在室温下，用J-810圆二色谱仪测定抗菌肽A和B在不同浓度三氟乙醇（TFE）水溶液（5%，10%，20%，30%，50%，100%）中的远紫外区的结构特征。样品池光径1mm，扫描速度为500nm/min，扫描范围为190-260nm，扫描的波长间隔为1nm，连续扫描三次取平均值，除去抗菌肽以外的相同溶液作为基线扣除。

经圆二色谱测定可知（图4），在TFE浓度小于20%时，抗菌肽A的圆二色谱吸收弱，仅在194nm附近处出现一个负峰（图4A），抗菌肽B在194nm的负峰更为明显（图4B），表明此时溶液中的抗菌肽A和B主要是无规卷曲结构；当TFE浓度高于20%时，在194nm波长处出现明显的正峰，208nm和222nm波长位置均出现负峰，是典型的α-螺旋结构特征吸收。随着TFE浓度的提高，负峰吸收增强，表明当TFE溶液浓度大于20%时，抗菌肽A和B都会从无规卷曲结构折叠成α-螺旋结构。上述实例表明沼水蛙抗菌肽A和B可能作用于细胞膜。

实施例6

为进一步研究沼水蛙抗菌肽的二级结构，将抗菌肽A序列（F1-R21）和抗菌肽B的全序列绘制成α-螺旋轮状图，该图根据多肽的α-螺旋折叠规律绘制。灰色小球为疏水氨基酸，白色小球为亲水氨基酸。

如图5A所示，抗菌肽A的螺旋结构中，疏水氨基酸和亲水氨基酸都占据一定比例，分别聚集在螺旋结构两侧，形成亲水面和疏水面，为两亲性的螺旋结构。由于抗菌肽A带+3电荷，其可能通过静电作用吸附到带负电荷的细菌细胞膜表面，在细胞膜的疏水环境下，该抗菌肽折叠成两亲性的α-螺旋结构，从而形成跨膜通道，破坏细胞膜，杀死细菌，发挥抗菌作用。抗菌肽B的疏水氨基酸比例较高，未形成明显的疏水面和亲水面（图5B）。但是该抗菌肽在模拟膜环境下同样会折叠成α-螺旋结构，且带有+2电荷，因而其作用位点也是细胞膜，与抗菌肽A的作用机理相同。

抗菌肽构效关系的研究有重要意义，对于人工设计新型抗菌肽分子起指导作用。抗菌肽的特殊氨基酸、螺旋结构、正电荷和疏水性对抗菌肽的活性至关重要。根据抗菌肽的构效关系，若将沼水蛙抗菌肽对应位置的氨基酸取代，可能会提高其抗菌活性或者降低其溶血性，具有重要的研究意义。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCELISTING

<110>福州大学

<120>沼水蛙抗菌肽及其应用

<130>2

<160>2

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>29

<212>PRT

<213>抗菌肽A

<400>1

PheLeuGlnHisIleIleGlyAlaLeuSerLysIlePheLeuValSer

151015

IleAspLysValArgCysLysValAlaGlyGlyCysAsn

2025

<210>2

<211>18

<212>PRT

<213>抗菌肽B

<400>2

PhePheProLeuIlePheGlyAlaLeuSerLysIleLeuProLysIle

151015

PheLeu

Claims (2)

1.一种沼水蛙抗菌肽，其特征在于：所述抗菌肽氨基酸序列为SEQIDNO.2：FFPLIFGALSKILPKIFL，C末端酰胺化。

2.一种如权利要求1所述的一种沼水蛙抗菌肽在制备抗菌药物上的应用。