CN103724416B - 沼水蛙抗菌肽及其制备与应用 - Google Patents

沼水蛙抗菌肽及其制备与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种沼水蛙的抗菌肽的氨基酸序列、分离纯化、制备方法及其在生物医药方面的应用。该抗菌肽序列为FLGALFKVASKLVPAAIRSISKK，经检测可抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。本发明所涉及的抗菌肽具有结构新颖、抗菌活力强等特点，在新型多肽抗菌药物开发和应用方面具有重要价值。

Description

沼水蛙抗菌肽及其制备与应用
技术领域
本发明涉及沼水蛙抗菌肽及其制备与应用，属于生物医学领域。
背景技术
由于抗生素的滥用，许多微生物对抗生素产生了耐药性，出现了许多能够抵抗常用抗生素的超级细菌。寻找抑菌机理不同的抗菌药物成了医疗领域的当务之急。
两栖动物抗菌肽是生物抗菌肽研究中的一个重要组成部分，其特殊的结构和广谱抗菌活性使其具有重要的理论研究价值和开发成新型抗生素的潜力。自研究者从非洲爪蟾皮肤分泌物中发现第一个两栖动物皮肤抗菌肽开始，研究者已通过分离纯化和分子克隆手段从两栖动物皮肤分泌物中发现了上千种抗菌肽，这些多肽由10-50个氨基酸构成。目前研究者根据两栖动物抗菌肽的一级结构将其分成100多个不同的家族，这些不同家族的抗菌肽在分子量大小，电荷，疏水性，结构和功能上都不相同。通过这些抗菌肽的结构和功能的研究，不仅得到了许多高活性，具有广谱抗菌作用的多肽，而且利用抗菌肽结构与功能之间关系，研究者设计改进了许多天然抗菌肽。
不同来源的蛙皮肤抗菌肽在氨基酸组成和序列上存在显著差异，但是其二级结构却有很多相似性。研究者通过圆二色谱研究发现，许多抗菌肽，如来源于Xenopus laevis的23肽Magainin2，来源于Rana nigromaculata的抗菌肽temporin-1RNa、temporin-1RNb等在模拟细胞膜环境下会自发折叠成两亲的α-螺旋结构。这些抗菌肽通过作用于细菌细胞膜上的磷脂双分子层，破坏细胞膜完整性并在细胞膜上形成跨膜通道，造成细胞内容物溶出而导致细胞死亡。随着对抗菌肽结构与功能关系的深入研究，抗菌肽的医学价值越发明显，开发抗菌活性强，结构简单的抗菌肽已成为一个紧迫的任务。
沼水蛙（Hylarana guentheri）是中国南部地区常见两栖动物，其皮肤分泌物中含有多种抗菌肽。有研究表明，蛙科动物至少需要20-30种抗菌肽才能形成较好的抗菌屏障，而目前已报道的沼水蛙抗菌肽有9个，分别属于brevinin、temporin和guentherin家族，仍然有许多沼水蛙皮肤抗菌肽未被发现。沼水蛙皮肤抗菌肽的分离纯化和抗菌活性研究还需要进一步的加强，其二级结构及结构与功能关系研究还未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供沼水蛙抗菌肽及其制备与应用，具体提供了一种制备简单，抑菌活性强的沼水蛙抗菌肽，并且可以将该抗菌肽应用于抗菌类药物的研制与开发。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种沼水蛙抗菌肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1 ：FLGALFKVASKLVPAAIRSISKK。
所述抗菌肽能够抑制常见细菌生长，包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。
所述抗菌肽在模拟细胞膜环境下会折叠成两亲性的α-螺旋结构。
抗菌肽衍生物为所述抗菌肽的一个或者几个氨基酸被取代，或者环化，或者L-型氨基酸变为D-型氨基酸，或者缺失，或者加入而得到同等功能的多肽。
一种与所述抗菌肽SEQ ID NO.1具有80%及以上同源性的多肽，该多肽功能与SEQ ID NO.1相同或相似；
一种抗菌肽序列的前端，中端或者末端包含权利要求1所述抗菌肽，该多肽与权利要求1所述抗菌肽功能相同或者相似；
所述抗菌肽可以从天然沼水蛙皮肤分泌物分离纯化或人工合成方法得到。
具体制备步骤为：
1）提取皮肤分泌物：捕捉福建地区野生沼水蛙，充分洗净，采用市售9V直流电池对沼水蛙耳后腺及背部腺体发达部分皮肤适度电刺激，待实验个体皮肤表面产生大量分泌物，用体积比为0.05%三氟乙酸的去离子水冲洗分泌物，收集冲洗液冷冻干燥，即为沼水蛙皮肤分泌物粗提物；
2）分离纯化：取沼水蛙皮肤分泌物粗提物利用Sephadex G-50凝胶色谱进行分离，以去离子水为洗脱液，流速0.3 mL/min，测量洗脱组分214 nm波长处的吸光值。收集具有最佳抗菌活性的峰，利用反相高效液相色谱进一步分离。反相高效液相色谱的洗脱梯度为0～5min，0～20%（v/v）乙腈；5～40min，20～70%（v/v）乙腈；流速为1.0 mL/min，检测波长214 nm，收集体积分数为50%乙腈浓度的洗脱峰，冷冻干燥即得所述抗菌肽。
一种沼水蛙抗菌肽的应用于抗菌类药物的研制与开发。
本发明的优点在于：
该沼水蛙抗菌肽具有广谱抗菌活性，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有强抑制作用，表明其在抗菌药物开发和应用方面有重要价值。该抗菌肽对细菌的抑制作用见实施实例2与实施实例3。
本发明所述的抗菌肽在疏水环境中可形成α-螺旋结构，利用圆二色谱（CD）测定抗菌肽在不同浓度三氟乙醇（TFE，细胞膜疏水环境模拟）中的二级结构，结果表明该抗菌肽的α-螺旋结构含量随着TFE浓度提高而增加。该结构特征对研究抗菌肽的抑菌机理有重要意义。
鉴于上述抗菌肽的性质和功能，本领域普通技术人员可以以该抗菌肽为模板，通过改变该抗菌肽的一级结构或合成其衍生物以提高其抗菌活性，用于药物研发和临床治疗。
附图说明
图1：沼水蛙皮肤分泌物Sephedex G-50凝胶过滤色谱图。
图2：凝胶色谱洗脱峰峰1反相高效液相色谱图。
图3：沼水蛙抗菌肽对大肠杆菌（A）和金黄色葡萄球菌（B）的抑制作用。
图4：沼水蛙抗菌肽在不同浓度TFE溶液中的圆二色谱吸收。
图5：沼水蛙抗菌肽α-螺旋轮状图。
具体实施方式
实施实例1
本发明所述抗菌肽的分离纯化包括Sephadex G-50凝胶过滤色谱和反相高效液相色谱（RP-HPLC）两个步骤。
提取沼水蛙皮肤分泌物：成年沼水蛙，清水洗净，市售9 V直流电池电击沼水蛙耳后腺及背部腺体发达部分皮肤，待实验个体皮肤表面产生大量分泌物，用体积比0.05%三氟乙酸的去离子水冲洗并收集分泌物，12000rpm离心15min，取上清液冷冻干燥，-80℃低温保存。
Sephadex G-50凝胶过滤色谱：按上述方法获得沼水蛙皮肤分泌物冻干粉，溶解于去离子水中，12000rpm离心15min。取上清液用0.22μm孔径微滤膜过滤。Sephadex G-50凝胶柱（1.6cm×100cm）用去离子水平衡，将已过滤的样品上柱。用去离子水洗脱，流速0.3mL/min，于214nm波长处检测洗脱液吸光值，绘制洗脱曲线，如图1所示。收集洗脱峰峰1，冷冻干燥，-80℃低温保存备用。
高效液相色谱：去离子水溶解上述峰1冻干粉，采用RP-HPLC进一步分离。液相色谱系统为LC-20A，装配Gemini 5μ C18（250mm×10mm）反相柱 （Phenomenex，UK） ，用水和乙腈（含0.05%三氟乙酸）构成的洗脱系统进行梯度洗脱。洗脱梯度：0～5min，0～20%（v/v）乙腈；5～40min，20～70%（v/v）乙腈；洗脱流速1.0 mL/min，检测波长214nm，洗脱曲线如图2所示。收集体积分数为50%乙腈浓度的洗脱峰AMP-5（保留时间为24.8min），冷冻干燥即为本发明所述抗菌肽。
将收集到的抗菌组分AMP-5冷冻干燥，采用高效液相色谱检验所得到的组分纯度。经检测，该抗菌肽组分纯度达到95%，可测定其氨基酸序列。用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列，得到AMP-5的氨基酸序列（见SEQ ID NO.1）。
实施实例2
琼脂涂布法检测本发明所述天然抗菌肽抑菌活性：
所用菌种为大肠杆菌（Escherichia coli ATCC8099）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus CMCC26003）。具体操作如下：选取单菌落接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，过夜振摇培养（37℃，130rpm），将200μL过夜培养菌液接种于20mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，振摇培养4小时。培养好的菌悬液稀释1000倍，取100μL加入平板培养基表面，涂布均匀。在涂布好菌液的平板培养基表面均匀地贴上直径为5mm的圆形滤纸片，每个滤纸片上加10μL待测样品。庆大霉素作为阳性对照，无菌水做阴性对照。将加完样品的平板倒置于37 ℃恒温培养箱中培养18～20h，实验结果如图3所示。由图3可知，添加庆大霉素（标记为“+”）和上述抗菌肽样品（标记为“1”）的滤纸片周围出现明显的抑菌圈，而加无菌水（标记为“-”）的滤纸片周围细菌正常生长，表明本发明所述抗菌肽对大肠杆菌（图3A）和金黄色葡萄球菌（图3B）都有明显的抑制作用。
实施实例3
    利用液体生长抑制法检测本发明所述合成多肽对细菌的抑制活力：
本实施实例所用抗菌肽由上海吉尔生化有限公司根据序列SEQ ID NO.1合成，纯度为95%。采用96孔板法测定样品最小抑菌浓度（MIC），具体操作如下：
菌种复苏，接种斜面37℃培养过夜，挑单菌落接种于普通LB培养基中，37℃培养过夜，稀释菌液使菌浓度为104-105CFU/mL，按每孔100μL菌液接种于96孔板中，加入10μL以一定比例稀释后的多肽，将96孔板置于37℃过夜培养，用酶标仪检测630nm波长的吸光值，结果见表一。
含有抗菌肽的细菌生长浓度（OD630）与不加抗菌肽的细菌生长浓度的比值大于90%时的抗菌肽浓度即为最小抑菌浓度（MIC，定义为显著抑制细菌生长的最低浓度）。
由检测结果可知，该抗菌肽对常见的细菌的最小抑菌浓度均达到微克级，具有极强的抑菌活力。
表一：沼水蛙抗菌肽最小抑菌浓度
实施实例4
抗菌肽的结构研究：
为了研究抗菌肽在模拟细胞膜的环境条件下的二级结构特征，在室温下，用J-810圆二色谱仪测定抗菌肽在含有不同浓度2,2,2-三氟乙醇（TFE）的水溶液（5%，10%，20%，30%，50%，100%）中远紫外区的结构特征。样品池光径1mm，扫描速度为500 nm/min，扫描范围为190-260nm，扫描的波长间隔为1nm，连续扫描三次取平均值，除去抗菌肽以外的相同溶液作为背景扣除。根据公式[θ]=100θ/（c×l）将实验测得的椭圆率（mdeg）转化成摩尔椭圆率（deg·cm2 ·dmol-1），c表示抗菌肽摩尔浓度（mol·L-1），l表示比色皿厚度（cm）。
经圆二色谱测定可知（图4），在TFE浓度小于20%时，多肽仅在194nm附近处出现一个负峰，表明此时溶液中的多肽主要是无规卷曲结构；当TFE浓度高于20%时，在194nm波长处出现明显的正峰，208nm和222nm波长位置均出现负峰，是典型的α-螺旋结构特征吸收。随着TFE浓度的提高，负峰吸收增强，表明在TFE溶液浓度大于20%的条件下，抗菌肽由从无规卷曲结构折叠成α-螺旋结构。
为进一步研究沼水蛙抗菌肽的二级结构，将其全序列绘制成α-螺旋轮状图（Schiffer–Edmundson helical wheel）（图5），该图根据多肽的α-螺旋折叠规律绘制。如图5所示，白色圆形表示亲水氨基酸，灰色圆形表示疏水氨基酸，该抗菌肽的疏水氨基酸和亲水氨基酸分别聚集在螺旋结构两侧，构成极性表面和非极性表面，形成两亲性的螺旋结构。由于该抗菌肽整体上带+5电荷（K7，K11，R18，K22，K23），其可能通过静电作用吸附到带负电荷的细菌细胞膜表面，在细胞膜的疏水环境下，该抗菌肽自发折叠成两亲的α-螺旋结构，从而形成跨膜通道，破坏细胞膜，杀死细菌，发挥抗菌作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
  SEQUENCE LISTING
 
<110> 福州大学
 
<120> 沼水蛙抗菌肽及其制备与应用
 
<130>  1
 
<160>  1    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  23
<212>  PRT
<213> 抗菌肽
 
<400>  1
 
Phe Leu Gly Ala Leu Phe Lys Val Ala Ser Lys Leu Val Pro Ala Ala
1               5                   10                  15     
 
 
Ile Arg Ser Ile Ser Lys Lys
            20             
 

Claims (6)

1.一种沼水蛙抗菌肽，其特征在于：所述抗菌肽氨基酸序列为SEQ ID NO.1 ：FLGALFKVASKLVPAAIRSISKK。
2.根据权利要求1所述的一种沼水蛙抗菌肽，其特征在于：所述抗菌肽能够抑制常见细菌生长，包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。
3.根据权利要求1所述的一种沼水蛙抗菌肽，其特征在于：所述抗菌肽在模拟细胞膜环境下会折叠成两亲性的α-螺旋结构。
4.一种如权利要求1所述的沼水蛙抗菌肽的制备方法，其特征在于：所述抗菌肽从天然沼水蛙皮肤分泌物分离纯化或由人工合成方法得到。
5.根据权利要求4所述的沼水蛙抗菌肽的制备方法，其特征在于：具体制备步骤为：
1）提取皮肤分泌物：捕捉福建地区野生沼水蛙，充分洗净，采用市售9V直流电池对沼水蛙耳后腺及背部腺体发达部分皮肤适度电刺激，待实验个体皮肤表面产生大量分泌物，用体积比为0.05%三氟乙酸的去离子水冲洗分泌物，收集冲洗液冷冻干燥，即为沼水蛙皮肤分泌物粗提物；
2）分离纯化：取沼水蛙皮肤分泌物粗提物利用Sephadex G-50凝胶色谱进行分离，以去离子水为洗脱液，流速0.3 mL/min，测量洗脱组分214 nm波长处的吸光值；收集具有最佳抗菌活性的峰，利用反相高效液相色谱进一步分离；反相高效液相色谱的洗脱梯度为0～5min，0～20% v/v乙腈；5～40min，20～70% v/v乙腈；流速为1.0 mL/min，检测波长214 nm，收集体积分数为50%乙腈浓度的洗脱峰，冷冻干燥即得所述抗菌肽。
6.一种如权利要求1所述的沼水蛙抗菌肽在制备抗菌类药物上的应用。
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