CN102796176B - 一种昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医学技术领域，具体的说是一种昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin及其制备和应用。昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin为环状多肽，分子量1584.97Da，等电点8.96。本发明所得抗菌肽Kunyuenin分子量小、对金黄色葡萄球菌和星形诺卡菌具有强的杀灭作用。此外还具有低的溶血活性和一定的抗氧化活性。

Description

一种昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin及其制备和应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体的说是一种昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin及其制备和应用。

背景技术

随着青霉素等传统抗生素的大规模和不恰当使用，微生物对传统抗生素产生了越来越强的耐受性，在临床上已经出现了大量能够完全耐受青霉素等传统抗生素的微生物，已有的抗生素对这些病原微生物无能为力。抗菌肽是一种新型的抗微生物多肽，大多数抗菌肽分子量小于10000Da，带正电，富含疏水碱基，能够形成两亲性的结构。抗菌肽的杀菌机制主要是通过静电相互作用吸引并结合到带负电的细菌细胞膜表面，进一步在细菌细胞膜上形成跨膜的孔洞，导致细菌细胞内容物的外泄，从而导致细菌细胞的死亡。而传统抗生素主要是作用于细菌细胞内的一些酶类。正是由于作用方式的不同，抗菌肽介导的杀菌作用远远快于传统抗生素，并且不易使细菌产生耐受性。除此之外，越来越多的文献报道表明抗菌肽还具有其他的杀菌机制，如抑制细菌细胞壁合成、改变细菌细胞质膜抑制隔膜形成、激活自溶素、抑制细胞内酶活性、抑制DNA、RNA和蛋白质的合成等。

两栖类动物作为水生和陆生动物的中间类群，其生活环境恶劣，容易滋生各种病原微生物。为了避免微生物感染，两栖类动物进化出强大的先天免疫系统，用以抵抗病原微生物的侵袭。其中抗菌肽是两栖类动物先天免疫系统中的重要组分，在两栖类动物抵御外界微生物侵袭过程中发挥了重要的作用。到目前为止，已从各种两栖类动物中发现大量抗菌肽，这些抗菌肽具有不同的结构和抗菌活性，是新型多肽类抗微生物药物开发的优良模板库。目前，国外对多种两栖类抗菌肽进行了研究开发，已有多种进入临床试验阶段。如来源于非洲爪蟾抗菌肽magainin的改造体MSI-78对糖尿病患者的足部溃疡有显著疗效且副作用小，已进入临床Ⅲ期试验阶段。

昆嵛林蛙（Rana kunyuensis)属于两栖纲无尾目蛙科蛙属，为中国特有种，仅分布于山东省烟台市昆嵛山。目前关于昆嵛林蛙形态、发育和分子进化已有报道，但是关于昆嵛林蛙抗菌肽的研究还没有报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种昆嵛林蛙（Rana kunyuensis)抗菌肽Kunyuenin及其制备和应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin，昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin为环状多肽，分子量1584.97Da，等电点8.96。

所述昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin氨基酸序列为：

Phe¹ Leu² Pro³ Phe⁴ Phe⁵ Ala⁶ Ala⁷ Cys⁸ Ala⁹ Ile¹⁰ Thr¹¹ Arg¹² Lys¹³ Cys¹⁴。

所述编码昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin前体的基因由279个核苷酸组成，自5’端至3’端序列为:

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昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin的制备方法，所述抗菌肽是以化学合成方法产生，氧化环化，其中两个半胱氨酸残基之间形成一对分子内二硫键，C末端酰胺化。

昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin的应用，所述昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin用于制备抗微生物药物或化妆品添加剂的用途。

本发明所具有的优点：本发明克隆得到昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin的编码基因，并利用化学合成的方法合成了Kunyuenin。该抗菌肽分子量小，对金黄色葡萄球菌和星形诺卡菌具有强的杀灭作用。同时还具有低的溶血活性和一定的抗氧化活性。

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。

实施例1

昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin基因克隆：

1）昆嵛林蛙皮肤总RNA提取：

①取300mg昆嵛林蛙皮肤组织，放入研钵中加入液氮研磨成粉末，转移到EP管中，加入1m1总RNA提取缓冲液(Trizol，美国Invitrogen公司产品)，充分混匀，而后于4℃，12000rpm离心10min。

②离心取上清，加入0.2ml氯仿溶液，剧烈混匀，室温放置10分钟，而后以4℃，12000rpm离心10分钟，弃除沉淀。

③上清加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟，以4℃，12000rpm离心10分钟，收集沉淀用75％（V/V）乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即为昆嵛林蛙皮肤总RNA。

2）昆嵛林蛙皮肤cDNA文库构建：采用CLONTECH公司In-Fusion SMARTer^TM Directional cDNA Library Construction Kit。

（1）cDNA第一链合成(mRNA反转录)：

①经DEPC处理（DEPC处理是在含0.1％（V/V）DEPC的水浸泡过夜，高压灭菌，烘干）的离心管中加入1μl昆嵛林蛙皮肤总RNA、1μl 3’端一链合成引物（3’In-Fusion SMARTer CDS Primer）和2.5μl经DEPC处理（DEPC处理是将含0.1％（V/V）DEPC的水，放置过夜，高压灭菌）的水使总体积达到4.5μl，混匀后短暂离心（2000rpm，30s），离心后于72℃保温3分钟；保温后再将离心管在42℃孵育2分钟。

②在上述离心管中加入以下试剂（均为CLONTECH公司In-FusionSMARTer^TM Directional cDNA Library Construction Kit建库试剂盒中配备），2.0μl 5×第一链缓冲液、0.25μl 100mM DTT、1.0μl 10mM dNTPMix、1.0μl SMARTer V Oligonucleotide、0.25μl RNase Inhibitor和1.0μl SMARTScribe Reverse Transcriptase反转录酶，混合离心管中试剂并短暂离心（2000rpm，30s），在42℃保温90min，然后68℃保温10min。保温处理后将离心管置于冰上中止第一链的合成。从离心管取2μl所合成的cDNA第一链备用。

（2）采用长末端聚合酶链式反应(LD-PCR)方法扩增第二链（所用试剂均为CLONTECH公司In-Fusion SMARTer^TM Directional cDNA LibraryConstruction Kit建库试剂盒中配备）

①将2μl cDNA第一链（mRNA反转录）、80μl去离子水、10μl 10×Advantage 2PCR缓冲液、2μl 50×dNTP混合物、2μl 5’PCR引物、2μl CDS III/3’PCR引物以及2μl 50×Advantage 2 Polymerase Mix在95℃预热的PCR管中进行混合。

②在PCR仪中按以下程序扩增：95℃，1min；18个循环：95℃，15sec，65℃，30sec，68℃，6min。循环结束后，将离心管中合成的cDNA双链－80℃保存。

（3）昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin基因克隆筛选：

根据蛙科抗菌肽信号肽区保守序列设计正向引物进行PCR扩增，其序列为5’-CCAAAGATGTTCACCTTGAAG-3’，PCR另一扩增引物为CLONTECH公司In-Fusion SMARTer^TM Directional cDNA Library Construction Kit中的3’-PCR引物，其序列为5’-CGGGGTACGATGAGACACCAT-3’。PCR反应在如下条件下进行：94℃ 4min，94℃ 30sec，57℃ 30sec和72℃ 1min，30个循环。扩增完成后用胶回收试剂盒（天根生物）进行目的片段回收。将回收的目的片段连接到pMD19-T载体(Takara,大连)，转化进CaCl₂-MgCl₂法制备好的DH5α感受态细胞。涂板并进行氨苄青霉素和蓝白斑双重筛选，挑取单菌落用M13引物PCR检测插入片段大小。挑取阳性菌落，摇菌提取质粒，使用Applied Biosystems DNA sequencer,model ABIPRISM 377进行核苷酸测序。

测定结果：

编码昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin前体的基因自5’端至3’端序列SEQ IDNo.1所示：

atgttcaccttgaagaaatccctgttgcttcttttcttccttgggatcatcaacgtatct  60

ctctgtgaggaagagagaaatgccgaggaagaaagaagagatgatcccgaagaaagggcc  120

gttgaggtggaaaaaagatttttaccattttttgcagcatgtgcaattaccagaaaatgt  180

ggaaaatgatttttctaaatacacatcgggtgtcttataaaaaataaagatgaagcctac  240

aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa             279。

昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin基因核苷酸的序列表为：序列长度为279个碱基，序列类型：核酸，链数：单链，拓扑学：直链状，序列种类：cDNA，来源：昆嵛林蛙皮肤。

实施例2

昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin的化学合成：

Ⅰ、昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin的化学合成方法：根据基因推导的成熟肽氨基酸序列，用自动多肽合成仪(433A,Applied Biosystems)合成其全序列，通过HPLC反相柱层析脱盐。

Ⅱ、分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）。

Ⅲ、纯化的昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF），等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。

昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin是昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin基因编码的一种环状多肽，含有十四个氨基酸残基，分子量1584.97Da，等电点8.96。昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin全序列为：苯丙氨酸－亮氨酸－脯氨酸－苯丙氨酸－苯丙氨酸－丙氨酸－丙氨酸－半胱氨酸－丙氨酸－异亮氨酸－苏氨酸－精氨酸－赖氨酸－半胱氨酸，其中两个半胱氨酸残基之间形成一对分子内二硫键，且C末端酰胺化。

实施例3

昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin药理实验：

1.昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin抗菌活性检测：

分别挑取保存于斜面上的试验菌株（金黄色葡萄球菌ATCC25923、金黄色葡萄球菌090223+和星形诺卡菌090312+）均匀涂布于MH固体培养基（购自青岛海博生物技术有限公司）平板上，将经过灭菌的0.5cm直径的滤纸片置于培养基表面，滴加溶解于灭菌去离子水的2mg/ml的昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin样品溶液10μl，于37℃倒置培养18－20小时，观察抑菌圈形成与否。若样品具有抗菌活性，则会在滤纸片周围形成清晰透明的抑菌圈，抑菌圈越大表明样品抗菌活性越强。

2.昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin最小抑菌浓度（Minimum InhibitoryConcentration）测定：

试验菌株（金黄色葡萄球菌ATCC25923、金黄色葡萄球菌090223+和星形诺卡菌090312+）接种到MH液体培养基（青岛海博生物技术有限公司）中，37℃振荡培养到对数生长期，而后用新鲜MH液体培养基将培养至对数生长期的培养液稀释到2×10⁵cfu/ml待用。

取1.9mL上述稀释的细菌培养液，加入经0.22m孔径膜过滤的2mg/ml的昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin样品溶液0.1mL作为第一管,第一管混匀后取出1mL加入第2管中，依次倍比稀释（参见表1），自第9管吸出1mL弃去，第10管系对照管。

表.1稀释方法

将上述各管混匀后放置37°C缓慢振荡培养18小时，于600nm波长处测定光吸收。最小抑菌浓度为看不见细菌生长的最低样品浓度。结果如表2所示。

由表2可见，昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin对金黄色葡萄球菌和星形诺卡菌具有较强的抗菌活性，尤其是对金黄色葡萄球菌ATCC25923的最小抑菌浓度值达到4.7μg/ml。表明其在金黄色葡萄球菌和星形诺卡菌感染的治疗方面具有一定应用潜力。

表2昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin抗菌活性

菌株	MIC(μg/ml)
		金黄色葡萄球菌ATCC25923	4.7
金黄色葡萄球菌090223+	37.5
		星形诺卡菌090312+	37.5

MIC：最小抑菌浓度，以上结果为三次独立重复实验平均值。

3.昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin溶血活性测定：

将采集的兔血与阿氏液混合抗凝，生理盐水洗涤2次并重悬成10⁷-10⁸cell/ml的悬浮液。上述稀释好的红细胞悬液与溶解于生理盐水的昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin样品混合，37℃保温30min，再于1000rpm离心5min，上清液于540nm测吸收值。阴性对照使用生理盐水，阳性对照使用TritonX-100，溶血百分比按以下公式计算：溶血百分比H％=A_样品-A_阴性对照/A_阳性对照×100％。结果表明样品浓度为100μg/ml时，Kunyuenin的溶血百分比为2％，说明Kunyuenin具有极低的溶血活性，不会引起人体红细胞破裂溶解而对人体产生伤害，因此十分利于其在医药领域进一步的开发应用。

4.昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin抗氧化活性测定：

DPPH（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl hydrate）（2,2′-二苯代苦味酰基苯肼）用甲醇溶解配成6×10-5M的溶液。将48μl DPPH溶液分别与不同浓度的2μl Kunyuenin样品混合，室温下避光静置30min，于517nm处测定吸光值(参见表3)。空白对照组为溶解样品所用灭菌去离子水。实验做三个平行，紫外分光光度计调零时使用甲醇。

DPPH·清除率(％)=(AB－AA)/AB×100（AB:空白对照组吸光值;AA:样品组吸光值）。

表3昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin抗氧化活性

结果如表3所示，昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin具有一定的抗氧化活性，且其活性随着浓度的升高而逐步增强。在样品浓度为400μg/ml时，其DPPH清除率I％达到30.6％。

Claims (4)

1.一种昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin，其特征在于：昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin为环状多肽，分子量1584.97Da，等电点8.96；

所述昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin氨基酸序列为：

Phe¹ Leu² Pro³ Phe⁴ Phe⁵ Ala⁶ Ala⁷ Cys⁸ Ala⁹ Ile¹⁰ Thr¹¹ Arg¹² Lys¹³ Cys¹⁴。

2.按权利要求1所述昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin，其特征在于：所述编码昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin前体的基因由279个核苷酸组成，自5’端至3’端序列为:

3.一种权利要求1所述的昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin的制备方法，其特征在于：所述抗菌肽是以化学合成方法产生，氧化环化，其中两个半胱氨酸残基之间形成一对分子内二硫键，C末端酰胺化。

4.一种权利要求1所述的昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin的应用，其特征在于：所述昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin用于制备抗微生物药物或化妆品添加剂的用途;所述微生物为金黄色葡萄球菌和星形诺卡菌。