CN104151415A - 一种天然抗菌肽Alligatorin4及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种天然抗菌肽Alligatorin4及其在抗菌方面的应用。本发明的抗菌肽Alligatorin4来源于扬子鳄。通过检索扬子鳄基因数据库，筛选分析获得抗菌肽成熟肽序列，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。通过对比分析，该天然抗菌肽Alligatorin4与目前已知所有抗菌肽的氨基酸序列存在明显差异，属于一种新型抗菌肽。抗菌实验结果表明，本发明的抗菌肽Alligatorin4对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和真菌具有极强的抗菌活性，抗菌作用广谱高效，此外具有溶血活性低、盐耐受性、热耐受性和热稳定性好等特点，可应用于制备抗菌、抑制细菌生长的药物、防腐剂、兽药、动物饲料以及化妆品中。

Description

一种天然抗菌肽Alligatorin4及其应用

技术领域

本发明涉及一种天然抗菌肽及其应用，更具体的说，涉及一种来源于扬子鳄的天然抗菌肽Alligatorin4及其应用，属于生物医学技术领域。

背景技术

传统抗生素在治疗细菌性感染疾病方面取得了显著效果，但是近年来，随着传统抗生素在医学和养殖业等领域的滥用，微生物对传统抗生素产生了越来越强的耐受性，同时也出现了一些耐药性极强的超级细菌，微生物耐药问题已成为严重威胁人类健康的难题。一直以来微生物耐药性的应对手段是使用对耐药微生物尚未使用过的新的或者替代性的抗微生物制剂，而这种新的抗生素使用一段时间后，微生物会进一步对这种新的抗生素产生耐药性，因此这就需要持续开发新的抗微生物制剂。开发出一种新型抗菌机制药物是解决微生物耐受性问题的一个新方向。

抗菌肽是一种小分子多肽，对细菌、真菌、病毒和原虫等均具有杀灭作用。抗菌肽具有分子量小、结构简单、杀菌活性强等特点。大多数抗菌肽的杀菌机制是通过作用于细菌细胞膜上的磷脂双分子层，破坏细胞膜完整性并在细胞膜上形成跨膜通道，造成细胞内容物溶出而导致细胞死亡。这种独特的杀菌机制一般不易引起微生物耐药性。而且抗菌肽对哺乳动物正常细胞和组织一般没有毒害性，不存在残留问题，因此抗菌肽有望成为一种新型的高效的抗菌药物，具有广阔的开发应用前景。

发明内容

本发明目的是为解决传统抗生素的不足之处，提供了一种来源于扬子鳄的天然抗菌肽Alligatorin4，另外提供了该抗菌肽的氨基酸序列以及其在抗菌方面的应用。扬子鳄抗菌肽Alligatorin4具有广谱高效的抗菌作用，对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和真菌具有极强的抗菌活性，且具有分子量小、合成简单、溶血活性低、盐耐受性、热耐受性和热稳定性好的特点，可应用于医药、化妆品、食品保鲜和养殖业领域。

为实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案：

本发明中天然抗菌肽Alligatorin4来自于爬行动物扬子鳄体内的一种抗菌肽，抗菌肽Alligatorin4由38个氨基酸组成，分子量为4402.5Da，等电点为12.78。氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示Arg Arg Gly Leu PheLys Lys Leu Arg Arg Lys Ile Lys Lys Gly Phe Lys Lys Ile Phe Lys Arg LeuPro Pro Val Gly Val Gly Val Ser Ile Pro Leu Ala Gly Arg Arg，所有氨基酸均为L-型。

本发明也提供了抗菌肽Alligatorin4的化学制备方法：

根据获得天然抗菌肽Alligatorin4成熟肽的氨基酸序列，用自动多肽合成仪(433A,Applied Biosystems)合其全序列，通过HPLC反相柱层析脱盐纯化；用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。

另外，本发明提供了抗菌肽Alligatorin4的应用，在制备抗菌药物或组合物、抑制细菌生长药物或组合物、防腐剂、动物饲料添加剂或化妆品添加剂中的应用。

本发明的优点是提供了一种来源于扬子鳄的天然抗菌肽Alligatorin4以及其在抗菌方面的应用。抗菌肽Alligatorin4具有广谱高效的抗菌作用，且具有分子量小、合成简单、溶血活性低、盐耐受性、热耐受性和热稳定性好的特点，可应用于医药、化妆品、食品保鲜和养殖业领域。

具体实施方式

实施例1：

天然抗菌肽Alligatorin4的发现

通过检索，从美国国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)网站的扬子鳄基因组数据中发现一条基因序列(XP_006037273.1)，长度为519bp，编码的多肽前体由172个氨基酸残基组成。该基因及其编码的多肽前体分别如SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:3所示：

atgcagacctgctgggtcatcctgctcctgcccctgctcggggcagccagcaccgagctg

 M  Q  T  C  W  V  I  L  L  L  P  L  L  G  A  A  S  T  E  L

cccacccctggcaccgacccaccacagctcacgccgacctacgcccaggccctggccacg

 P  T  P  G  T  D  P  P  Q  L  T  P  T  Y  A  Q  A  L  A  T

gccgtcgacgtctacaaccaagggcccggcgtggacttcgccttccggctcctggaggca

 A  V  D  V  Y  N  Q  G  P  G  V  D  F  A  F  R  L  L  E  A

gagtcccgggacgactgggacgcgagcacggatcccctgcggcagctggagttcaccctg

 E  S  R  D  D  W  D  A  S  T  D  P  L  R  Q  L  E  F  T  L

aaggagaccgagtgccccgtgggcgaggaccagcccctggaccagtgcgacttcaaggat

 K  E  T  E  C  P  V  G  E  D  Q  P  L  D  Q  C  D  F  K  D

ggcggggcggtgctggactgcacagggaccttctcctgctccgaggcctcgctcatggtg

 G  G  A  V  L  D  C  T  G  T  F  S  C  S  E  A  S  L  M  V

ctggtcacctgccaacccgccgagcccctgcctgaccgcgtccgcaggggtctattcaag

 L  V  T  C  Q  P  A  E  P  L  P  D  R  V  R  R  G  L  F  K

aagctgaggaggaaaatcaagaagggctttaagaaaatcttcaagcgcctgcctcccgtc

 K  L  R  R  K  I  K  K  G  F  K  K  I  F  K  R  L  P  P  V

ggtgtcggtgtctccatcccactcgcaggaaggcggtga

 G  V  G  V  S  I  P  L  A  G  R  R  -

将该基因序列用NCBI网站的blastX软件(http://blast.st-va.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastx&PAGE_TYPE＝BlastSearch&LINK_LOC＝blasthome)进行序列比对分析结果表明，该基因的编码产物可能为扬子鳄cathelicidins家族抗菌肽前体。进一步将该基因编码的多肽前体序列用NCBI网站的protein blast软件(http://blast.st-va.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastp&PAGE_TYPE＝BlastSearch&LINK_LOC＝blasthome)进行序列比对，并与之前发现的其它动物来源cathelicidins家族抗菌肽序列进行比较分析，确定该抗菌肽成熟过程中酶切位点为-R¹³³-V¹³⁴-，从而获得该抗菌肽成熟肽序列RRGLFKKLRRKIKKGFKKIFKRLPPVGVGVSIPLAGRR(氨基酸单字母简写序列)，命名为Alligatorin4。Alligatorin4与目前已知所有抗菌肽的氨基酸序列存在明显差异。

实施例2

抗菌肽Alligatorin4的化学合成方法

(1)用自动多肽合成仪(433A,Applied Biosystems)合成Alligatorin4的全序列，通过HPLC C₁₈反相柱层析脱盐纯化。(2)分子量测定采用常规基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)法。(3)纯化的Alligatorin4用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度>95％，分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF，4402.5Da)，等电聚焦电泳测定等电点为12.78，用自动氨基酸测序仪确定其氨基酸序列结构与天然Alligatorin4一致。

实施例3：

抗菌肽Alligatorin4抗菌活性检测

(1)分别挑取保存于斜面上的试验菌株(大肠杆菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，其它菌株从当地医院收集)均匀涂布于MH固体培养基(购自青岛海博生物技术有限公司)平板上，将经过灭菌的0.5cm直径的滤纸片置于培养基表面，滴加溶解于灭菌去离子水的2mg/ml的Alligatorin4样品溶液10μl，于37℃倒置培养18-20小时，观察抑菌圈形成与否。若样品具有抗菌活性，则会在滤纸片周围形成清晰透明的抑菌圈，抑菌圈越大表明样品抗菌活性越强。结果表明，抗菌肽Alligatorin4对表2中列出的菌株种类均具有抗菌活性。

(2)采用2倍稀释法测定最小抑菌浓度(Minimum InhibitoryConcentration)：选择上述实验步骤(1)中具有抑菌圈的菌株进行MIC测定实验。将试验菌株接种到MH液体培养基(购自青岛海博生物技术有限公司)中，然后在培养箱中37℃振荡培养到对数生长期，而后用新鲜MH液体培养基将培养至对数生长期的菌株培养液稀释到2×10⁵cfu/ml待用。

在无菌96孔板各孔中预先加入100μl MH液体培养基，然后在第一孔中加入100μl用MH液体培养基稀释到一定浓度的经0.22μm孔滤膜过滤的的Alligatorin4样品溶液，混匀后取100μl加入第2孔，依次倍比稀释(参见表1)，自第9孔吸出100μl弃去，第10孔为对照管。

表1 稀释方法

向各孔中加入已稀释好的菌株培养液100μl，然后将96孔板放置于培养箱中37℃缓慢振荡培养18小时，于600nm波长处测定光吸收。最小抑菌浓度为看不见细菌生长的最低样品浓度。结果如表2所示。

由表2可见，抗菌肽Alligatorin4对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和真菌均表现出极强的抗菌活性，其中包括大量临床分离致病菌。其MIC值处于4.69-75μg/ml的范围。

表2 扬子鳄抗菌肽Alligatorin4的抗菌活性

实施例4：

抗菌肽Alligatorin4的杀菌速度测定

大肠杆菌ATCC25922用MH液体培养基(青岛海博生物技术有限公司)在37℃培养12小时，然后用新鲜的MH液体培养基稀释成10⁶cfu/ml的菌悬液。将溶解于灭菌的去离子水中的Alligatorin4样品加入到菌悬液中，使终浓度为5×MIC(46.9μg/ml)。将加入Alligatorin4样品的菌液放置于培养箱中37℃震荡培养，分别在0、10、20、30、45、60、90、120和180分钟取50μl菌液稀释1000倍，然后取50μl稀释的菌液涂布到MH固体培养基上，于培养箱中37℃培养过夜后菌落计数。本实施例中用美罗培南作为阳性对照，灭菌的去离子水作为阴性对照。实验结果如表3所示。

从表3中的对比可以看出，Alligatorin4的杀菌速度与阳性对照美罗培南相近，在180分钟内即可杀死所有细菌细胞；

表3 抗菌肽Alligatorin4的杀菌速度

实施例5：

Alligatorin4溶血活性的测定

将采集的新鲜人血与阿氏液混合抗凝，生理盐水洗涤2次并重悬成10⁷-10⁸cell/ml的悬浮液。上述稀释好的红细胞悬液与溶解于生理盐水的一定浓度的Alligatorin4样品溶液混合，37℃保温30min，再于1000rpm离心5min，上清液于540nm波长处测定光吸收值。阴性对照使用生理盐水，阳性对照使用TritonX-100，溶血百分比按以下公式计算：溶血百分比H％＝A_样品-A_{阴性 对照}/A_阳性对照×100％。结果表明Alligatorin4浓度为100μg/ml和200μg/ml时，溶血百分比分别为3.6％和3.9％，说明Alligatorin4对人红细胞具有极低的溶血活性。

实施例6：

抗菌肽Alligatorin4盐耐受性、热耐受性和热稳定性测定

(1)测定抗菌肽Alligatorin4盐耐受性：将大肠杆菌ATCC25922用MH液体培养基(青岛海博生物技术有限公司)于培养箱中37℃培养12小时，然后分别用含0、50、100、150、200和400mM氯化钠的新鲜MH液体培养基稀释到10⁶cfu/ml。用含有不同氯化钠浓度的MH液体培养基制备不同浓度梯度的Alligatorin4样品溶液。如表4所示。利用上述实施例2所述的2倍稀释法测定Alligatorin4的MIC值。其结果如表4所示。

(2)测定抗菌肽Alligatorin4热耐受性：将Alligatorin4溶解于灭菌的去离子水中，配置成浓度为2mg/ml的样品溶液，于培养箱中在4℃、20℃、37℃、50℃、70℃和90℃各孵育1小时，然后取孵育后的Alligatorin4样品溶液，利用实施例2所述的2倍稀释法测定Alligatorin4对大肠杆菌ATCC25922的MIC值。其结果如表5所示。

(3)测定抗菌肽Alligatorin4的热稳定性：将Alligatorin4溶解于灭菌的去离子水中，配置成浓度为2mg/ml的样品溶液，于培养箱中37℃孵育0-96小时。于0、6、12、24、48、72和96小时分别取Alligatorin4样品溶液，利用实施例2所述的2倍稀释法测定Alligatorin4对大肠杆菌ATCC25922的MIC值。其结果如表6所示。

从表4中可以看出，Alligatorin4具有极强的盐耐受性，盐离子的浓度对其活性无影响。低于或高于人体生理盐浓度时(150mM NaCl)，Alligatorin4的MICs值介于6.25-12.5μg/ml之间，波动范围较小，其抗菌活性基本保持不变。

从表5所示可以看出，Alligatorin4具有极强的热耐受性，Alligatorin4溶液在90℃放置1小时之后，MICs值介于9.38-12.5μg/ml之间，波动较小，其抗菌活性基本不会改变。

从表6所示可以看出，Alligatorin4溶液具有很好的热稳定性。在37℃下放置96小时后，其抗菌活性几乎不会改变。而许多传统的抗生素，如头孢类抗生素的溶液极不稳定，几个小时内就会失去活性。所以Alligatorin4相对于一些传统抗生素应用范围更为广泛。

表4 含有不同氯化钠浓度的Alligatorin4溶液对大肠杆菌ATCC25922的MIC

NaCl浓度(mM)	Alligatorin4MIC(μg/ml)
		0	12.5
50	12.5
		100	12.5
150	6.25
		200	12.5
400	6.25

表5 不同温度孵育后的Alligatorin4溶液对大肠杆菌ATCC25922的MIC

温度(℃)	Alligatorin4MIC(μg/ml)
		4	9.38
20	9.38
		37	9.38
50	9.38
		70	12.5
90	9.38

表6于37℃孵育不同时间后Alligatorin4溶液对大肠杆菌ATCC25922的MIC

时间(h)	Alligatorin4MIC(μg/ml)
		0	9.38
6	9.38
		12	6.25
24	9.38
		48	7.81
72	4.69
		96	7.81

通过上述实施例可以看出，本发明中的扬子鳄抗菌肽Alligatorin4可通过化学合成的方式获得，该抗菌肽对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和真菌，其中包括部分临床分离致病菌均有极强的抗菌活性。其次该抗菌肽具有分子量小、合成简单、溶血活性低、盐耐受性、热耐受性和热稳定性好的特点，可应用于医药、化妆品、食品保鲜和养殖业领域。

Claims (2)

1.一种天然抗菌肽Alligatorin4，其特征在于，所述抗菌肽来源于扬子鳄，由38个氨基酸组成，分子量为4402.5Da，等电点为12.78，其氨基酸序列表如SEQ ID NO:1所示：Arg Arg Gly Leu Phe Lys Lys Leu Arg ArgLys Ile Lys Lys Gly Phe Lys Lys Ile Phe Lys Arg Leu Pro Pro Val Gly ValGly Val Ser Ile Pro Leu Ala Gly Arg Arg，所有氨基酸均为L-型。

2.一种如权利要求1所述的天然抗菌肽Alligatorin4在制备抗菌药物或组合物、抑制细菌生长药物或组合物、防腐剂、动物饲料添加剂或化妆品添加剂中的应用。