CN111374317B - 一种天然抗菌肽Hc-CATH在食品防腐保鲜中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种天然抗菌肽Hc‑CATH在食品防腐保鲜中的应用。本发明中的天然抗菌肽Hc‑CATH对常见食品腐败菌具有广谱高效的抗菌作用,杀菌作用迅速,与传统防腐剂对羟基苯甲酸丁酯有较好的协同作用。Hc‑CATH与对羟基苯甲酸丁酯联合使用显著抑制腐败菌生长,提高感官评价分数,延长食品贮藏时间。在三文鱼肉、熟肉酱和鲜榨果汁食品贮藏实验中,Hc‑CATH显著抑制腐败菌生长,提高感官评价分数,延长食品贮藏时间。在橙汁贮藏实验中,Hc‑CATH与对羟基苯甲酸丁酯联合使用,显著抑制腐败菌生长,延长食品贮藏时间,呈现良好的协同效果。此外,Hc‑CATH可被胰蛋白酶完全降解,对人体无毒副作用。Hc‑CATH作为新型食品防腐剂具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种天然抗菌肽Hc-CATH在食品防腐保鲜中的应用,属于食品化学技术领域。
背景技术
在食品工业中,腐败微生物是食品生产和保存过程中的重大危害,造成不必要的浪费和巨大的经济损失。腐败微生物会导致食品的物理化学性质改变,从而使食品失去原来的品质、营养价值和组织特性,最终导致不符合食品卫生标准。细菌、霉菌和酵母会导致食品腐败,其中细菌和霉菌最常见。为了抑制腐败微生物的生长,食品工业采用了多种保存方法,包括化学和物理保存技术。但是,食品腐败仍是一个重大问题。
化学防腐剂是过去几十年来在食品工业中广泛使用的最经济,最有效的方法之一。目前已批准可用于食品存储的化学防腐剂有苯甲酸及其盐、山梨酸及其盐、对羟基苯甲酸酯类、二氧化硫、亚硫酸盐和亚硝酸盐等。然而,化学防腐剂潜在的毒性以及消费者对天然健康食品的需求,越来越迫切地需要从植物、动物和微生物中开发天然化学物质作为新型食品生物防腐剂。
抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)是一组天然存在的肽,广泛分布于几乎所有类型的多细胞生物中,是宿主先天免疫系统的重要物质,在抵抗微生物入侵的免疫反应中起着关键作用。AMPs可直接作用于几乎所有种类的微生物(包括细菌,真菌,病毒,甚至寄生虫),发挥抗菌活性。特别对其中一些微生物耐药菌株作用显著。此外,许多AMPs还广泛参与增强和调节宿主的免疫反应,增强宿主对病原微生物的免疫力。因此,AMPs可作为常规抗生素的替代品,在细菌感染性疾病的治疗领域具有巨大的潜在应用价值。抗菌肽作为食品生物防腐剂目前已有相关报道,而且已有一个抗菌肽产品—乳酸链球菌素Nisin作为食品防腐剂在市场上应用多年。但是,目前报道的抗菌肽类生物防腐剂存在两个缺点:首先是抗菌谱窄,只能杀死部分食品腐败菌,如Nisin只对革兰氏阳性腐败菌有效。其次绝大多数抗菌肽稳定性差,容易被食品中的酶类降解,单独作为防腐剂使用无法长期发挥效果。
发明内容
本发明的目的是解决传统化学防腐剂和现有的抗菌肽的不足,本发明提供一种天然抗菌肽Hc-CATH在食品防腐保鲜中的应用。Hc-CATH对常见食品腐败菌具有广谱高效的抗菌作用,杀菌作用迅速,与传统防腐剂对羟基苯甲酸丁酯有较好的协同作用。Hc-CATH与对羟基苯甲酸丁酯联合使用显著抑制腐败菌生长,提高感官评价分数,延长食品贮藏时间。作为新型食品防腐剂具有广泛的应用前景。
本发明的第一个目的是提供一种天然抗菌肽Hc-CATH在食品防腐保鲜中的应用。
进一步地,所述的天然抗菌肽Hc-CATH的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地,所述的应用是采用天然抗菌肽Hc-CATH抑制或杀灭食品中的腐败菌。
进一步地,所述的腐败菌为琼氏不动杆菌、约翰逊不动杆菌、粪嗜冷杆菌、奇异变形杆菌、草莓假单胞菌、恶臭假单胞菌、沙雷氏菌、多食鞘氨醇杆菌、海藻希瓦氏菌、腐败希瓦氏菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、特基拉芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌、河流漫游杆菌中的一种或几种。
进一步地,所述的应用还包括采用天然抗菌肽Hc-CATH与对羟基苯甲酸丁酯协同作用,抑制或杀灭食品中的腐败菌。
本发明的第二个目的是提供一种包含天然抗菌肽Hc-CATH的食品防腐剂。
进一步地,所述的防腐剂中还包括对羟基苯甲酸丁酯。
进一步地,所述防腐剂中,天然抗菌肽Hc-CATH与对羟基苯甲酸丁酯质量比为1:0.5~2。
本发明的有益效果是:
本发明中的天然抗菌肽Hc-CATH对常见食品腐败菌具有广谱高效的抗菌作用,杀菌作用迅速,与传统防腐剂对羟基苯甲酸丁酯有较好的协同作用。Hc-CATH与对羟基苯甲酸丁酯联合使用显著抑制腐败菌生长,提高感官评价分数,延长食品贮藏时间。在三文鱼肉、熟肉酱和鲜榨果汁食品贮藏实验中,Hc-CATH显著抑制腐败菌生长,提高感官评价分数,延长食品贮藏时间。在橙汁贮藏实验中,Hc-CATH与对羟基苯甲酸丁酯联合使用,显著抑制腐败菌生长,延长食品贮藏时间,呈现良好的协同效果。此外,Hc-CATH可被胰蛋白酶完全降解,对人体无毒副作用。Hc-CATH作为新型食品防腐剂具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为Hc-CATH在生鱼片中的杀菌效果;
图2为Hc-CATH在熟肉酱中的杀菌效果;
图3为Hc-CATH在鲜榨橙汁中的杀菌效果;
图4为pH值测定结果;
图5为联合使用时在鲜榨橙汁中的杀菌效果;
图6为胰蛋白酶对Hc-CATH的降解水平。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明,以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施,但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1:
Hc-CATH的制备
(1)、Hc-CATH的化学合成方法:用自动多肽合成仪(433A,Applied Biosystems)合成Hc-CATH的全序列,通过HPLC反相柱层析脱盐纯化。
(2)、分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)。
(3)、纯化的Hc-CATH用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度,分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF),等电聚焦电泳测定等电点,用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。
天然抗菌肽Hc-CATH由30个氨基酸组成,分子量3628.5Da,等电点12.61。所述Hc-CATH氨基酸序列为:
Lys1Phe2Phe3Lys4Arg5Leu6Leu7Lys8Ser9Val10Arg11Arg12Ala13Val14Lys15Lys16Phe617Arg18Lys19Lys20Phe21Arg22Leu23Ile24Gly25Leu26Ser27Thr28Leu29Leu30,其中所有氨基酸均为L-型。
实施例2:
Hc-CATH对常见腐败菌的抗菌活性检测:
采用最小抑菌浓度法测定。选择鱼肉分离腐败菌株进行MIC测定实验。试验菌株接种到MH液体培养基(英国OXOID公司)中,37℃振荡培养到对数生长期,而后用新鲜MH液体培养基将培养至对数生长期的菌液稀释到2×105CFU/ml待用。
在无菌96孔板各孔中预先加入100μl LB液体培养基,然后在第一孔中加入100μl用MH液体培养基稀释到一定浓度的经0.22μm孔滤膜过滤的的Hc-CATH样品溶液,混匀后取100μl加入第2孔,依次倍比稀释(参见表1),自第9孔吸出100μl弃去,第10孔系对照管。
表1稀释方法
将96孔板放置37℃缓慢振荡培养18小时,于600nm波长处测定光吸收。最小抑菌浓度为看不见细菌生长的最低样品浓度。结果如表2所示。
由表2可见,相较于防腐剂对羟基苯甲酸丁酯,Hc-CATH对检测的分离腐败菌均表现出更强的抗菌活性。
表2 Hc-CATH对腐败菌抗菌活性
实施例3:
Hc-CATH杀菌速度测定:
选取四株腐败菌(琼氏不动杆菌、海藻希瓦氏菌、奇异变形杆菌、枯草芽孢杆菌)用MH液体培养基(英国OXOID公司)在37℃培养12小时,然后用新鲜的MH液体培养基稀释成106CFU/ml的菌悬液。将溶解于灭菌的去离子水中的Hc-CATH样品加入到菌悬液中,使终浓度为5×MIC。将加入Hc-CATH样品的菌液放置于37℃培养箱中震荡培养,分别在0、15、30、60、90、120和180分钟取10μl菌液稀释1000倍,然后取50μl稀释的菌液涂布到MH固体培养基平板上,37℃培养箱培养过夜后菌落计数。该实验用对羟基苯甲酸丁酯作为阳性对照,灭菌的去离子水作为阴性对照。
结果如表3-6所示,Hc-CATH对4株腐败菌的杀菌速度极其迅速,在15分钟内即可杀死所有细菌,而阳性对照对羟基苯甲酸丁酯杀菌速度较慢。
表3 Hc-CATH对琼氏不动杆菌的杀菌速度
表4 Hc-CATH对海藻希瓦氏菌的杀菌速度
表5 Hc-CATH对奇异变形杆菌的杀菌速度
表6 Hc-CATH对枯草芽孢杆菌的杀菌速度
实施例4:
Hc-CATH与对羟基苯甲酸丁酯的协同抗菌效果测定:
采用棋盘微稀释法测定抗菌肽Hc-CATH与对羟苯甲酸丁酯的协同作用。将琼氏不动杆菌、海藻希瓦氏菌、奇异变形杆菌、枯草芽孢杆菌在37℃的MH肉汤中培养至指数生长期,再用新鲜的MH稀释至2×106CFU/ml。
Hc-CATH在MH培养基连续沿行稀释(50μl),对羟基苯甲酸丁酯在MH培养基中沿列稀释(50μl),在96孔板中创建一个11×7矩阵。每孔添加50μl细菌培养液,37℃孵育18h。用微孔板阅读器(Bio-Tek ELX800,美国)测定各孔。确定Hc-CATH的FIC,其中FICA为抗菌肽A在单独A组合时的MIC(FICA=MICA+B/MICA),FICB为单独B组合时对羟基苯甲酸丁酯的MIC(FICB=MICA+B/MICB)。FIC指数计算为FICindex=FICA+FICB。协同作用定义为FICindex≤0.5,无交互作用定义为0.5<FICindex≤4,拮抗作用定义为FICindex>4。
结果如表7所示,除奇异变形杆菌外,Hc-CATH与对羟基苯甲酸丁酯对腐败菌菌表现出较强的协同作用。
表7 Hc-CATH与对羟基苯甲酸丁酯的协同抗菌效果
实施例5:
Hc-CATH在食品基质中的应用:
(1)、Hc-CATH在生鱼片中的杀菌效果
从当地超市(中国江苏苏州)购买新鲜生鱼片(4℃)立即进行实验准备。将三文鱼肉切成1cm×0.8cm×0.2cm的小块,用2mg/ml的Hc-CATH浸泡20min,沥干后放入无菌离心管,4℃冰箱保存6天。随机选取鱼样本,匀质化,涂于MH琼脂板上,分别于0、3、6天进行微生物菌落测定。阳性对照采用对羟基苯甲酸丁酯。
结果如图1所示,Hc-CATH在生鱼片保存过程中并没有起到有效的防腐作用。对照组和Hc-CATH的总活菌数在整个贮藏期间无明显差异。与对照组相比,对羟基苯甲酸丁酯明显降低了生鱼片在贮藏期间的细菌总数(P<0.01)。
(2)、Hc-CATH在熟肉酱中的杀菌效果
鲜肉生三文鱼在121℃下灭菌30min,加入无菌PBS溶液用组织匀浆机制备成肉酱。加入Hc-CATH值肉酱中使其终浓度为200μg/mL。琼氏不动杆菌在MH肉汤中孵育至对数生长期,PBS缓冲液洗涤三次。肉酱中加入菌液使其终浓度为1×104CFU/ml。样品在25℃保存5天,并于每天同一时间取样稀释,涂布MH固体平板进行微生物菌落计数。阳性对照采用对羟基苯甲酸丁酯。
结果如图2所示,在肉酱的保鲜实验中,Hc-CATH表现出一定的杀菌作用。与对照组相比,Hc-CATH组菌落数在贮藏初期4天内明显减少(P<0.01)。
(3)、Hc-CATH在鲜榨橙汁中的杀菌效果
采用榨汁机提取鲜榨橙汁。在橙汁中添加Hc-CATH使其终浓度为200μg/mL。样品在25℃中保存5天。并于每天同一时间取样稀释,涂布MH固体平板进行微生物菌落计数。阳性对照采用山梨酸钾和苯甲酸钠。
结果如图3所示,在果汁保鲜实验中,Hc-CATH的杀菌作用最强。与对照组相比,Hc-CATH在整个5天的贮藏期间显著降低了总活菌数(P<0.01)。
实施例6:
pH值测定:
采用榨汁机提取鲜榨橙汁。在橙汁中添加Hc-CATH使其终浓度为200μg/mL。样品在25℃中保存8天。并于每天同一时间使用数字pH计测定样品的pH值。以对羟基苯甲酸丁酯、山梨酸钾、苯甲酸钠为阳性对照。
结果如图4所示,Hc-CATH在25℃下贮藏8天,pH值均有轻微下降的趋势。Hc-CATH与常规防腐剂处理组间差异无统计学意义(P>0.05)。
实施例7:
感官评价分析:
新鲜生三文鱼切成1cm×0.8cm×0.2cm的小块,用2mg/ml的Hc-CATH物浸泡20min,沥干后置于无菌离心管中,25℃保存5天。每天同一时间对生三文鱼进行感官评价。其方法基于先前报道的质量指数法,涉及四个重要的质量参数,包括外观、气味、硬度和整体接受度。随机选取七位有经验的评委根据质量指数法对所有样本进行评分,评分范围为1-5分,其中5分代表最好的质量(表2),低于3分为不能接受。
结果如表8所示,所有的组在外观、气味、硬度和整体接受度上都随储存时间延长而降低。但PBS组下降较快,第2天感官评分降至3分以下,不能接受。相比之下,Hc-CATH组和常规防腐剂组在第2天的感官评分仍高于3。抗菌肽组的得分与传统防腐剂对羟基苯甲酸丁酯、山梨酸钾、苯甲酸钠组非常接近。
表8感官评价结果
实施例8:
Hc-CATH与对羟基苯甲酸丁酯协同效果在食品基质中的应用:
采用榨汁机提取鲜榨橙汁。正常实验组在橙汁中分别添加Hc-CATH、对羟基苯甲酸丁酯使其终浓度为200μg/mL。协同实验组在橙汁中联合添加Hc-CATH、对羟基苯甲酸丁酯使其终浓度都为100μg/mL。样品在25℃中保存5天。并于每天同一时间取样稀释,涂布MH固体平板进行微生物菌落计数。
结果如图5所示,在果汁保鲜实验中,Hc-CATH与对羟基苯甲酸联合使用,与PBS组相比显著降低了总活菌数(P<0.01),而且大大降低了防腐剂的使用量。
实施例9:
蛋白酶降解试验:
采用反相高效液相色谱法测定胰蛋白酶对Hc-CATH的降解作用。在PBS缓冲液中制备Hc-CATH和胰蛋白酶溶液(Gibco,USA),最终摩尔比为300:1,分别在37℃下孵育3h和6h。用反相高效液相色谱法(Thermo Scientific Syncronis C18柱,250mm×4.6mm)提取和分析样品,用乙腈/水(含0.1%TFA)线性梯度混合洗脱。
结果如图6所示,Hc-CATH被胰蛋白酶逐步降解,逐渐从100%下降为26.81%(3h),最终降至19.59%(6h)。表明Hc-CATH作为新型防腐剂,可在肠道内完全降解,避免了多肽在体内的积累和毒性。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例,本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换,均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
序列表
<110> 苏州大学
<120> 一种天然抗菌肽Hc-CATH在食品防腐保鲜中的应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 30
<212> PRT
<213> (人工序列)
<400> 1
Lys Phe Phe Lys Arg Leu Leu Lys Ser Val Arg Arg Ala Val Lys Lys
1 5 10 15
Phe Arg Lys Lys Phe Arg Leu Ile Gly Leu Ser Thr Leu Leu
20 25 30
Claims (1)
1.一种采用天然抗菌肽Hc-CATH与对羟基苯甲酸丁酯协同作用,抑制或杀灭食品中的腐败菌的方法,其特征在于,所述的天然抗菌肽Hc-CATH的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示;所述的腐败菌为琼氏不动杆菌、海藻希瓦氏菌中的一种或两种;天然抗菌肽Hc-CATH与对羟基苯甲酸丁酯的质量比为1:0.5~2。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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