CN102311492A - 非天然全D-型蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物、制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供不易被蛋白酶降解的非天然全D-型氨基酸组成的蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物的序列及制备方法，本发明还提供非天然全D-型氨基酸组成的蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物的应用。非天然全D-型氨基酸组成的蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物具有显著的抑制细菌以及真菌生长的作用，尤其是对临床耐药细菌有很好的抑制作用，且具有结构简单、人工合成方便、抗菌谱系广的有益特点。其显著特点在于耐受各种蛋白酶的降解，抗菌活性保留时间长，无药物残留。可以应用于人或动物感染性疾病的预防和治疗、临床人工生物材料、食品防腐及果蔬保鲜、饲料添加剂以及日化用品中。
Description
技术领域
本发明提供了非天然全D-型蛇毒Cathelicidin组成的抗菌肽及其衍生物，本发明还涉及这些肽及其衍生物的制备及其应用，属生物医学领域。
背景技术
抗菌肽是存在于生物体内能抵抗外界微生物侵害的一类小分子多肽，它是先天免疫系统的重要组成部分。抗菌肽通常由15～45个氨基酸残基组成，大部分带正电荷。抗菌肽广泛地分布在两栖类、昆虫、植物和哺乳动物中。与目前广泛使用的抗生素相比，多肽抗生素具有很多优点：如在最小作用浓度时，快速而广谱的杀灭微生物活性；不易产生耐药性；热稳定、水溶性好；对局部感染和全身感染都有效等。由于抗生素耐药性和残留问题的日益突出，抗菌肽作为一种抗生素的替代物备受关注。
绝大多数抗菌肽分子含有较多的碱性氨基酸残基，因此又被称为阳离子抗菌肽，自然界也存在少数含有较多酸性氨基酸残基的阴离子抗菌肽。抗菌肽具有广谱抗微生物活性，对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌、真菌和被膜病毒都有抑杀作用，特别对一些耐药菌，如伤寒杆菌、金黄色葡萄球菌等同样敏感。其作用机制主要是带正电的抗菌肽与带负电的微生物细胞膜发生作用，按作用特点可分为膜结构破坏型和非膜结构破坏型。在当前不少病原菌对原有抗生素逐步产生耐药性的情况下，加强对动物体内自然产生的抗菌肽功能的了解，并在此基础上设计新型的抗菌肽以替代抗生素的研究有着重要的理论和实际意义。
蛇毒Cathelicidin是主要在哺乳动物体内发现的一类结构多变的抗微生物肽，因在表达的信号肽与成熟肽间含有一高度保守的cathelin肽段而自成一家族，成熟抗菌肽位于前体分子的C-末端，具有很高的变异性。目前发现的天然存在的蛇毒蛇毒Cathelicidin抗菌肽分子是由L-型氨基酸残基组成的，因分子中含有较多的碱性氨基酸残基而易受到各种蛋白酶的降解，影响了它们的抗菌活性。
发明内容
本发明的目的是提供不易被蛋白酶降解的非天然全D-型氨基酸组成的蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物，本发明同时提供非天然全部由D-型氨基酸残基组成的蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物的制备方法，本发明还提供非天然全D-型氨基酸组成的蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物的应用。非天然全D-型氨基酸组成的蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物具有显著的抑制细菌以及真菌生长的作用，尤其是对临床耐药细菌有很好的抑制作用，且具有结构简单、人工合成方便、抗菌谱系广的有益特点。其显著特点在于耐受各种蛋白酶的降解，抗菌活性保留时间长，无药物残留。可以应用于人或动物感染性疾病的预防和治疗、抗肿瘤、临床人工生物材料、食品防腐及果蔬保鲜、饲料添加剂以及日化用品中。
为了实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案：
非天然全D-型蛇毒Cathelicidin抗菌肽，所述抗菌肽具有以下序列：SEQ ID NO：1：赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-亮氨酸-赖氨酸-天冬酰氨-丝氨酸-缬氨酸-赖氨酸-赖氨酸-精氨酸-丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-脯氨酸-精氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-丝氨酸-异亮氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸(Lys Phe Phe Lys Lys Leu Lys AsnSer Val Lys Lys Arg Ala Lys Lys Phe Phe Lys Lys Pro Arg Val Ile Gly Val Ser Ile Pro Phe)；
本发明的非天然全部由D-型氨基酸残基组成的蛇毒Cathelicidin抗菌肽的衍生物，所述衍生物是非天然全部由D-型氨基酸残基组成的蛇毒Cathelicidin抗菌肽的氨基酸残基突变物，所述衍生物均为D-型氨基酸组成并符合以下序列之一：
SEQ ID NO：2：赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-亮氨酸-赖氨酸-天冬酰氨-丝氨酸-缬氨酸-赖氨酸-赖氨酸-精氨酸-丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-脯氨酸-赖氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-苏氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸(Lys Phe Phe Lys Lys Leu Lys AsnSer Val Lys Lys Arg Ala Lys Lys Phe Phe Lys Lys Pro Lys Val Ile Gly Val Thr Phe Pro Phe)；SEQ ID NO：3：赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-赖氨酸-亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-丝氨酸-缬氨酸-赖氨酸-赖氨酸-精氨酸-丙氨酸-赖氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-脯氨酸-精氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-丝氨酸-异亮氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸(Lys Phe Phe Arg Lys Leu Lys Lys SerVal Lys Lys Arg Ala Lys Glu Phe Phe Lys Lys Pro Arg Val Ile Gly Val Ser Ile Pro Phe)；
本发明的非天然全部由D-型氨基酸残基组成的蛇毒Cathelicidin抗菌肽的衍生物，所述衍生物是来源于非天然全部由D-型氨基酸残基组成的蛇毒Cathelicidin抗菌肽的片段的变异体，所述衍生物本身全部由D-型氨基酸残基组成并符合以下序列之一：SEQ ID NO：4：赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-丙氨酸-缬氨酸-赖氨酸-赖氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-丙氨酸-赖氨酸-缬氨酸(Lys Phe Phe Lys Lys Leu Lys Lys Ala Val Lys Lys GlyPhe Lys Lys Phe Ala Lys Val)；
SEQ ID NO：5：甘氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-缬氨酸-赖氨酸-赖氨酸-丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-丙氨酸(Gly Ile Gly Lys Phe Phe Lys Lys LeuLys Lys Phe Val Lys Lys Gly Phe Lys Lys Phe Ala)；
SEQ ID NO：6：苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸(Phe Lys Lys Phe Phe Lys Lys Phe PheLys Lys Phe)；
SEQ ID NO：7：赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸(Lys Phe Phe Lys Lys Phe Phe Lys LysPhe Phe Lys)。
非天然全D-型蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物的制备方法：采用全自动多肽合成仪合成全部由D-型氨基酸残基组成的抗菌肽全序列。通过HPLC反相C18柱层析脱盐、纯化。然后用HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用快原子轰击质谱法(Fast atombombardment mass spectrometry，FAB-MS)。
所述抗菌肽及其衍生物可用于制备人或动物抗微生物感染药物。
所述抗菌肽及其衍生物用于抗肿瘤药物药物的制备。
所述抗菌肽及其衍生物在临床人工生物材料中的应用，所述临床人工生物材料可以是但不局限于医用高分子生物材料、医用金属材料、医用生物复合物、医用生物衍生材料和医用凝胶。
所述抗菌肽及其衍生物在食品防腐及果蔬保鲜中的应用。
所述抗菌肽及其衍生物在饲料添加剂中的应用。
所述抗菌肽及其衍生物在日化用品中的应用，所述日化用品可以是但不局限于：化妆品；洗手液、沐浴露、卫生巾、剃须膏、须后水等卫生用品；漱口水、口腔喷剂、牙膏、含片和口腔糖等口腔保健品。
非天然全D-型蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物作为制备抗微生物物质的应用。
本发明以天然存在的蛇毒Cathelicidin抗菌肽为模板，设计合成了非天然全D-型氨基酸组成的蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物，在保留了抗菌活性的同时，不易受到蛋白酶的降解，有效延长了作用时间。
本发明的抗菌肽全部为D-型氨基酸残基组成，能抵抗胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶以及弹性蛋白酶的降解，在抗微生物活性方面与天然爬行动物蛇毒Cathelicidin抗菌肽及衍生物存在差异。非天然全D-型蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物具有显著的抑制细菌以及真菌生长的作用，尤其是对临床耐药细菌有很好的抑制作用。与其它来源抗菌多肽相比，该组抗菌肽具有结构简单、人工合成方便、抗菌谱系广的有益特点，尤其是具有抵抗蛋白酶水解作用的显著特点，可更长时间保持抗微生物活性，无药物残留。
具体实施方式
实施例1非天然全D-型蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物的制备：
1、分别用全自动多肽合成仪利用不同D-型氨基酸残基为原料合成非天然全D-型蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物的全序列。通过HPLC反相C18柱层析脱盐、纯化。
2、分子量测定采用快原子轰击质谱法(Fast atom bombardment mass spectrometry，FAB-MS)，以甘油：间硝基苄醇：二甲亚砜(1∶1∶1，V∶V∶V，体积比)为底物，Cs+作为轰击粒子，电流为1μA，发射电压为25Kv。
3、纯化的蛇毒抗菌肽用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用快原子轰击质谱法。
所合成非天然全D-型蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物的序列如下所示：OH-CATH30-D(SEQ ID NO：1)：
赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-亮氨酸-赖氨酸-天冬酰氨-丝氨酸-缬氨酸-赖氨酸-赖氨酸-精氨酸-丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-脯氨酸-精氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-丝氨酸-异亮氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸(Lys Phe Phe Lys Lys Leu Lys Asn Ser Val Lys LysArg Ala Lys Lys Phe Phe Lys Lys Pro Arg Val Ile Gly Val Ser Ile Pro Phe)；NN-CATH30-D(SEQ ID NO：2)：
赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-亮氨酸-赖氨酸-天冬酰氨-丝氨酸-缬氨酸-赖氨酸-赖氨酸-精氨酸-丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-脯氨酸-赖氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-苏氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸(Lys Phe Phe Lys Lys Leu Lys Asn Ser Val Lys LysArg Ala Lys Lys Phe Phe Lys Lys Pro Lys Val Ile Gly Val Thr Phe Pro Phe)；BF-CATH30-D(SEQ ID NO：3)：
赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-赖氨酸-亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-丝氨酸-缬氨酸-赖氨酸-赖氨酸-精氨酸-丙氨酸-赖氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-脯氨酸-精氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-丝氨酸-异亮氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸((Lys Phe Phe Arg Lys Leu Lys Lys Ser Val Lys LysArg Ala Lys Glu Phe Phe Lys Lys Pro Arg Val Ile Gly Val Ser Ile Pro Phe)CATH20-D(SEQ ID NO：4)：
赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-丙氨酸-缬氨酸-赖氨酸-赖氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-丙氨酸-赖氨酸-缬氨酸(Lys Phe Phe Lys Lys Leu Lys Lys Ala Val Lys Lys Gly Phe Lys LysPhe Ala Lys Val)；
CATH21-D(SEQ ID NO：5)：
甘氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-缬氨酸-赖氨酸-赖氨酸-丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-丙氨酸(Gly Ile Gly Lys Phe Phe Lys Lys Leu Lys Lys Phe ValLys Lys Gly Phe Lys Lys Phe Ala)；
FK-12-D(SEQ ID NO：6)：
苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸(Phe Lys Lys Phe Phe Lys Lys Phe Phe Lys LysPhe)；
KF-12-D(SEQ ID NO：7)：
赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸(Lys Phe Phe Lys Lys Phe Phe Lys Lys Phe PheLys)。
实施例2非天然全D-型蛇毒Cathelicidin抗菌肽或其衍生物的抑制细菌生长的作用：
抗菌活性检测，按常规倍比稀释法进行。96孔板每空加菌液90μl，(终浓度106CFU/ml)，每孔设3个复孔，以pH7.0LB培养基(每升含10克胰蛋白胨，Oxoid公司生产，5克酵母提取物，Oxoid公司生产和10克氯化钠，国产分析纯试剂)为阴性对照。加入不同浓度的用无菌超纯水配制的抗菌肽10μl，使终浓度成倍比下降。37℃孵育14-16小时，测定各孔600nm的吸光度，吸光度无变化的最低浓度为最小抑菌浓度(MIC)。此试验重复三次，取平均值，结果如表1。
表1，非天然全D-型抗菌肽抑制微生物生长的作用
实验所用细菌以及真菌菌株说明：
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 43300，是耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌ATCC标准株，对青霉素类，β-内酰胺类耐药，对万古霉素敏感。
大肠杆菌(Escherichia coli)ML-35P，是氨苄耐药标准株。
大肠杆菌(Escherichia coli)临床耐药株1和2，均为产超广谱β-内酰胺酶的临床分离株，对青霉素，头孢1代、2代、3代以及4代耐药，对泰能，氨基糖甙类敏感。
绿脓杆菌(Bacillus pyocyaneus)临床耐药株，为多药耐药临床分离株，对目前临床使用各类抗生素均耐药，包括泰能，MEM。
真菌类的白色念珠菌Candida albicans ATCC 10231以及毕赤酵母Pichia pastorisATCC 2601均为标准株。
由表1可见，非天然全D-型蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物具有显著的抑制细菌以及真菌生长的作用，可作为抗微生物物质用于制备抗微生物感染制剂。
实施例3非天然全D-型蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物抗蛋白酶水解作用：
实验方法：将采购自Sigma公司的胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶以及弹性蛋白酶按酶∶抗菌肽＝1∶10(摩尔比)的比例混合后，37℃孵育24小时后进行大肠杆菌的抗菌活性测定，抗菌肽的终浓度均为400μg/ml。抗菌活性检测采用琼脂糖打孔法进行，培养基配方为：1％低熔点琼脂糖(Sigma A6013)，0.3mg/ml胰蛋白胨(Oxoid产品)溶于10mM pH 7.4Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液中。制备的培养基20ml于42℃时分别加入过夜培养对数生长期大肠杆菌ATCC 25922(约105-106CFU)，摇匀后使其在直径76mm培养皿中均匀摊布。待凝固后，培养基上打3mm的圆孔，每孔分别加10μl样品后37℃继续孵育16小时后，测量无菌生长的透明环直径进行抗菌活性的测定。抗菌活性的计算：抗菌活性单位U＝(抗菌环的直径毫米-3)×10。37℃孵育24小时的相同浓度抗菌肽和蛋白酶分别作为阳性对照和阴性对照，37℃孵育24小时的酶+抗菌肽孵育液为实验组，结果见表2。
表2，抗菌肽与蛋白酶37℃保温24小时后的抗菌活性单位
由表2可见，非天然全D-型蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物与胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶以及弹性蛋白酶按酶∶抗菌肽＝1∶10(摩尔比)的比例混合后，37℃孵育24小时后抗菌活性保持不变，揭示了多种蛋白酶不能水解非天然全D-型蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物，因而它们的生物学活性可以长时间保留。
实施例4非天然全D-型蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物对绿脓杆菌角膜感染的保护作用
实验方法：新西兰大白兔平均2.5千克/只，每组3只。绿脓杆菌(ATCC 27853)在LB培养基中过夜培养，并重新接种培养至对数生长期，离心收集细菌用无菌生理盐水调整细菌数目为105CFU/ml。兔子用2％的戊巴比妥钠经耳缘静脉全身麻醉，盐酸普鲁卡因于眼眶外局部麻醉后，用手术镊触及角膜无反应，将异丙醇20μl滴于直径为0.5cm的角膜环钻内30秒，造成角膜上皮损伤，吸去异丙醇，用生理盐水冲洗角膜。将调整好浓度的绿脓杆菌30μl滴于损伤的角膜中心，按上述方法处理后，实验动物100％发生感染。接种细菌于角膜12小时后，开始滴眼治疗。左眼为抗菌肽(4mg/ml)，右眼为生理盐水对照，每次10μl，实验头三天每天进行六次治疗，此后每天早晚各进行一次治疗。最后一次滴眼后4小时处死兔子，用角膜环钻取大小相同的角膜，称重。用生理盐水冲洗三次后，用微量匀浆器5000转/分钟，匀浆三次，每次30秒。将匀浆液按10倍稀释法稀释后，分别进行LB平板培养计数。每个抗菌肽用3只兔子进行平行对照实验，结果见表3。
表3，非天然全D-型蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物对绿脓杆菌角膜感染的保护作用
由表3可见，非天然全D-型蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物对绿脓杆菌引起的角膜感染具有显著的保护作用，可应用于抗眼部微生物感染制剂的制备。
实施例5非天然全D-型蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物与抗生素的协同作用：
实验方法：临床分离鉴定的鲍氏不动杆菌菌株由昆明医学院第一附属医院检验科提供，注射用头孢哌酮钠为哈药集团制药总厂生产。按照实施例2所述抗菌活性检测方法得到的头孢哌酮钠对该菌株的MIC值为32μg/ml，非天然全D-型蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物对该菌株的MIC值见表4。根据以上结果，固定非天然全D-型蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物的剂量为MIC值的一半(1/2MIC)，加入不同浓度的头孢哌酮钠，测定完全抑制细菌生长所需的抗生素浓度。实验重复3次，每次3孔，结果见表4。
表4，非天然全D-型蛇毒Cathelicidin抗菌肽与抗生素抑制临床鲍氏不动杆菌生长的协同作用*
*，头孢哌酮钠单独使用时对鲍氏不动杆菌菌株的MIC值为32μg/ml
由表4可见，非天然全D-型蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物与临床抗生素对微生物的抑制作用有显著的协同性，有助于抗菌肽与现有抗生素联合应用用于人或动物感染性疾病的预防和治疗。
实施例6非天然全D-型蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物的内毒素中和作用：
实验方法：细菌内毒素(LPS)的检测按常规方法进行，内毒素定量鲎试剂盒购自厦门市鲎试剂实验厂有限公司，细菌内毒素(LPS)为Sigma产品(0111：4b)25μl LPS(终浓度10ng/ml)与不同浓度的抗菌肽等体积混合，于37℃水浴孵育30min，然后加入50μl鲎试剂37℃继续孵育8min，最后加入50μl显色基质孵育6min后，用酶标仪测定OD450nm的吸收值，通过检测未加抗菌肽与加入抗菌肽后LPS的变化计算抗菌肽与LPS的结合率。结果见表5所示。
表5，非天然全D-型蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物与内毒素的结合能力
由表5可见，除了直接的杀菌作用外，非天然全D-型蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物具有结合内毒素的能力，而目前临床使用的抗生素绝大部分无内毒素中和作用。内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁中的一种成分，叫做脂多糖(LPS)。内毒素只有当细菌死亡溶解或用人工方法破坏菌细胞后才释放出来。内毒素对宿主是有毒性的，可引起内毒素血症与内毒素休克。因此，非天然全D-型蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物用于制备抗微生物感染制剂时具有抗微生物和内毒素中和的双重作用。
实施例7非天然全D-型蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物对人红细胞的溶血活性：
实验方法：健康人红细胞购自昆明市中心血站，人红细胞与0.38％柠檬酸钠按1∶9(v/v)的比例混合后，2000转/分钟离心5分钟，弃上清。然后用生理盐水充分洗涤人红细胞至不再呈红色为止。将上述洗涤好的人红细胞加生理盐水稀释成约108个细胞/ml浓度的悬浮液。上述稀释好的悬浮液与溶解于生理盐水的不同浓度的样品于37℃保温1小时，2000转/分钟离心5分钟后于540nm测定上清液的吸收值，溶血活性根据各样品与加入1％的Triton X-100得到的最大溶血值相比而确定，结果见表6。
表6，非天然全D-型蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物对人红细胞的溶血活性
| 剂量 | 50μg/ml | 100μg/ml | 200μg/ml |
| OH-CATH30-D | 0 | 0 | 0.81％ |
| NN-CATH30-D | 0 | 0 | 1.00％ |
| BF-CATH30-D | 0 | 0 | 0.90％ |
| CATH20-D | 0.14％ | 0.20％ | 0.53％ |
| CATH21-D | 3.80％ | 5.00％ | 7.96％ |
| FK-12-D | 0 | 0.34％ | 0.78％ |
| KF-12-D | 0.20％ | 0.68％ | 5.72％ |
由表6可见，非天然全D-型蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物除CATH21-D以及KF-12-D溶血活性相对较高，其余抗菌肽在浓度为200μg/ml时，基本不具有对人红细胞的溶血活性，有利于它们的临床应用。
实施例8非天然全D-型蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物对肿瘤细胞的毒性作用：
实验材料：RAW264.7为小鼠单核巨噬细胞白血病细胞，源自Abelson鼠科白血病病毒诱导的肿瘤，人结肠癌HT29细胞。上述2株真核细胞来源于中国科学院典型培养物保藏委员会昆明细胞库。
实验方法：在96孔平底细胞培养板上，将待测抗菌肽用完全培养基进行2倍倍比稀释，共六个稀释度，每个稀释度设3个重复孔，每孔100μl，同时设置正常细胞对照。每孔滴加1×105/ml的细胞100μl。置37℃，5％CO2培养箱内培养。12小时后用MTT方法测定待测抗菌肽对细胞的毒性作用并计算IC50值。IC50是指对50％培养细胞产生细胞毒作用时所需的抗菌肽浓度，结果见表7。
表7，非天然全D-型蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物对肿瘤细胞的细胞毒活性
由表7可见，非天然全D-型蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物对肿瘤细胞有不同的细胞毒活性，可用于抗肿瘤药物的制备。
实施例9非天然全D-型蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物在临床人工生物材料中的应用
本实施例实验材料来源：医用涤纶补片为北京佰仁医疗科技有限公司产品；医用几丁糖凝胶为石家庄亿生堂医用品有限公司产品；注射用头孢哌酮钠为哈药集团制药总厂生产；一次性使用气管插管为博罗其乐康医疗用品有限公司产品；邦迪防水创可贴，上海强生有限公司产品。兔子购自昆明医学院动物房。
1、非天然全D-型蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物在医用涤纶补片及医用几丁糖凝胶中的应用
兔涤纶补片细菌感染模型的构建及实验结果：
实验方法：兔6只，每只兔背部皮肤手术切开四个1cm2大小袋状空隙。将医用涤纶补片剪成1×1cm小块，分为四组，分别处理。空白组：不做任何处理；几丁糖组：均匀涂布几丁糖，70℃固化1h；抗生素组：均匀涂布几丁糖+抗生素(头孢哌酮)，10mg/ml，70℃固化1h；抗菌肽组：均匀涂布几丁糖+抗菌肽，200μg/ml，70℃固化1h。将处理过的医用涤纶补片分别植入袋状空隙中，向内注入1ml(含2×107cfu大肠杆菌)菌液，缝合切口。7天后处死兔子取出涤纶补片进行悬浮和紧密附着于涤纶补片的细菌计数。OH-CATH30-D(SEQ ID NO：1)的实验结果如表8、表9所示：
表8，OH-CATH30-D处理涤纶补片7天后第一遍洗涤液的细菌数
| 动物A | 动物B | 动物C | 动物D | 动物E | 动物F | |
| 空白组 | 6.27X108 | 1.43X109 | 4.19X108 | 4.14X108 | 4.25X108 | 2.67X108 |
| 几丁糖组 | 1.69X108 | 4.39X108 | 4.55X108 | 2.96X108 | 4.03X108 | 2.35X108 |
| 抗生素组 | 3.40X107 | 4.57X108 | 2.67X108 | 3.57X108 | 3.80X107 | 1.57X108 |
| 抗菌肽组 | 4.30X107 | 1.78X108 | 2.84X108 | 4.60X107 | 2.18X107 | 6.20X107 |
表9，OH-CATH30-D处理7天后，涤纶补片洗两遍后*，震荡一分钟，取液铺板培养菌落数(18h)
| 动物A | 动物B | 动物C | 动物D | 动物E | 动物F | |
| 空白组 | 20 | 17 | 9 | 8 | 16 | 6 |
| 几丁糖组 | 9 | 8 | 45 | 10 | 23 | 5 |
| 抗生素组 | 3 | 5 | 3 | 6 | 0 | 4 |
| 抗菌肽组 | 0 | 2 | 4 | 0 | 0 | 0 |
*说明：涤纶补片洗两遍后，经铺板培养后菌落数为0，说明洗涤两遍后涤纶补片无游离的细菌残留，震荡一分钟后产生的细菌为牢固附着于涤纶补片的产生了生物膜(Biofilm)样结构的细菌。
实验结果表明：医用涤纶补片经OH-CATH30-D抗菌肽处理后，能显著降低大肠杆菌的附着，降低生物膜(Biofilm)的形成，有助于预防临床生物材料相关感染的治疗。200μg/ml抗菌肽OH-CATH30-D处理医用涤纶补片的效果相当或优于10mg/ml头孢哌酮。但OH-CATH30-D对大多数临床耐药株有效，揭示了OH-CATH30-D可应用于临床医用涤纶补片类人工生物材料。同时，抗菌肽组(几丁糖+抗菌肽)与几丁糖组(仅加几丁糖)比较，抗菌肽组对微生物的抵抗作用显著优于几丁糖组。因此，OH-CATH30-D也可应用于临床医用凝胶类人工生物材料。
在兔涤纶补片细菌感染模型中，NN-CATH30-D、BF-CATH30-D、CATH20-D、CATH21-D、FK-12-D以及KF-12-D也显示了类似的实验结果，表明非天然全D-型蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物可应用于临床医用涤纶补片类以及临床医用凝胶类人工生物材料中。
2、非天然全D-型蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物在医用导尿管中的应用兔导尿管细菌感染模型的构建及实验结果
实验方法：实验共分四组，空白组、几丁糖组、抗生素组、抗菌肽组，每组兔子6只。用双腔导尿管(杭州富善医疗器械有限公司产品)留置导尿，1N的盐酸酸化处理膀胱，24小时后更换为已处理的导尿管，并注入O.D600nm＝1时稀释107的大肠杆菌1ml，夹闭导尿管一个小时。导尿管的处理方法：空白组：不做任何处理；几丁糖组：均匀涂布几丁糖，70℃固化1小时；抗生素组：均匀涂布几丁糖+抗生素(10mg/ml头孢哌酮)，70℃固化1小时；抗菌肽组：均匀涂布几丁糖+抗菌肽(200μg/ml)，70℃固化1小时。分别于0，1，5，10天留尿，第十天处死实验动物后将导尿管取出，分为头段和中段，每段长约1cm，洗涤两次，震荡1分钟，取液体50微升铺板培养测定菌落数。OH-CATH30-D处理导尿管的实验结果见表10至表14所示。
表10，空白组尿培养结果
表11，几丁糖组尿培养结果
表12，抗生素组尿培养结果
表13，抗菌肽组尿培养结果
表14，OH-CATH30-D处理的导尿管洗涤2遍震荡后的铺板培养结果
实验结果表明：医用导尿管经OH-CATH30-D抗菌肽处理后，能显著降低大肠杆菌的附着，降低生物膜(Biofilm)的形成，有助于预防临床生物材料相关感染的治疗。200μg/ml OH-CATH30-D抗菌肽处理医用导尿管的效果优于10mg/ml头孢哌酮。但OH-CATH30-D抗菌肽对大多数临床耐药株有效，揭示了OH-CATH30-D可应用于临床医用导尿管类人工生物材料。同时，抗菌肽组(几丁糖+抗菌肽)与几丁糖组(仅加几丁糖)比较，抗菌肽组对微生物的抵抗作用显著优于几丁糖组。因此，OH-CATH30-D也可应用于临床医用凝胶类人工生物材料。
在兔导尿管细菌感染模型中，NN-CATH30-D、BF-CATH30-D、CATH20-D、CATH21-D、FK-12-D以及KF-12-D也显示了类似的实验结果，表明非天然全D-型蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物可应用于临床医用导尿管以及临床医用凝胶类人工生物材料中。
3、非天然全D-型蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物在气管插管中的应用
实验方法：实验共分三组，空白组、几丁糖组和抗菌肽组。气管插管的处理方法：空白组：不做任何处理；几丁糖组：均匀涂布几丁糖，70℃固化1小时；抗菌肽组：均匀涂布几丁糖+抗菌肽(200μg/ml)，70℃固化1小时。上述处理的气管插管用打孔器制备成4毫米直径的圆片，抗菌活性检测采用琼脂糖扩散法进行。培养基配方为：1％低熔点琼脂糖(Sigma A6013)，0.3mg/ml胰蛋白胨(Oxoid产品)溶于10mM pH 7.4Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液中。制备的培养基20ml于42℃时分别加入过夜培养对数生长期细菌(约105-106CFU)，摇匀后使其在直径76mm培养皿中均匀摊布。待凝固后，在培养基表面放入气管插管圆片后37℃继续孵育16小时，然后测量无菌生长的透明环直径进行抗菌活性的测定。抗菌活性的计算：抗菌活性单位U＝(抗菌环的直径毫米-3)×10，在本实验条件下，空白组和几丁糖组未见对测试微生物的抑制作用，抗菌肽组的实验结果见表15。
表15，非天然全D-型Cathelicidin抗菌肽及其衍生物的抗微生物活性
由表15可见，医用气管插管经非天然全D-型蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物处理后具备了良好的抗微生物活性。因此，非天然全D-型蛇毒蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物可应用于临床医用气管插管人工生物材料，增强临床医用气管插管的抗微生物活性，有助于预防和降低临床常见的气管插管相关感染的发生率。
4、创可贴添加非天然全D-型蛇毒毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物后对微生物的抑制作用
实验方法：邦迪防水创可贴有效部位(吸收垫)无菌条件下剪成3毫米直径的圆片，实验分为2组，对照组创可贴圆片浸入灭菌超纯水30秒后取出，实验组创可贴圆片浸入超纯水稀释的抗菌肽溶液(终浓度200μg/ml)30秒后取出，上述制备的创可贴圆片无菌条件下置于37℃干燥2小时备用。抗菌活性检测采用琼脂糖扩散法进行。培养基配方为：1％低熔点琼脂糖(Sigma A6013)，0.3mg/ml胰蛋白胨(Oxoid产品)溶于10mMpH 7.4Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液中。制备的培养基20ml于42℃时分别加入过夜培养对数生长期大肠杆菌临床耐药株2(终浓度105CFU/ml)，摇匀后使其在直径76mm培养皿中均匀摊布。待凝固后，在培养基上分别加入制备好的对照组及实验组创可贴圆片，37℃继续孵育16小时，然后测量无菌生长的透明环直径进行抗菌活性的测定。抗菌活性的计算：抗菌活性单位U＝(抗菌环的直径毫米-3)×10，实验结果见表16。
表16、创可贴添加非天然全D-型蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物后对大肠杆菌临床耐药株2的抑制作用
| 组别 | 抗菌活性单位(U) |
| 空白对照组 | 0 |
| OH-CATH30-D | 28 |
| NN-CATH30-D | 25 |
| BF-CATH30-D | 26 |
| CATH20-D | 14 |
| CATH21-D | 8 |
| FK-12-D | 10 |
| KF-12-D | 6 |
由表16可见，创可贴经非天然全D-型蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物处理后，能显著创可贴对微生物的抵抗能力，非天然全D-型蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物不被蛋白酶水解，可较长时间保持抗微生物活性，有利于伤口的抗感染，可应用于广泛使用的创可贴类人工材料。
实施例10非天然全D-型蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物在食品防腐及果蔬保鲜中的应用：
1、非天然全D-型蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物在食品防腐中的应用
实验方法：昆明德和罐头厂生产红烧牛肉罐头购自超市，所有实验操作均在实验室非无菌条件下进行。开罐后将罐头内容物全部取出，机器匀浆后于10000转/分钟离心10分钟，取上清液备用。实验组为900μl上清液+50μl抗菌肽(终浓度200μg/ml)+50μl大肠杆菌临床耐药株2(终浓度105CFU/ml)，对照组为900μl上清液+50μl灭菌超纯水+50μl大肠杆菌临床耐药株2(终浓度105CFU/ml)，然后置于培养箱25℃进行培养，观察并记录48小时培养液发生的变化，实验结果见表17。
表17，非天然全D-型蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物对罐头食品的保护作用
| 组别 | 48小时后培养液的变化 |
| 空白对照组 | 混浊 |
| OH-CATH30-D | 澄清、透明 |
| NN-CATH30-D | 澄清、透明 |
| BF-CATH30-D | 澄清、透明 |
| CATH20-D | 澄清、透明 |
| CATH21-D | 澄清、透明 |
| FK-12-D | 略微混浊 |
| KF-12-D | 澄清、透明 |
由表17可见，罐头食品内含物经非天然全D-型蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物处理后，能显著增强罐头食品内含物对以大肠杆菌为代表的环境微生物的抵抗能力，非天然全D-型蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物无药物残留问题，可用于食品防腐。
2、非天然全D-型蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物在果蔬保鲜中的应用
实验方法：新鲜杨梅及荔枝购自超市，所有实验操作均在实验室非无菌条件下进行。杨梅经自来水充分洗涤后，随机分为实验组与对照组，10个/组。实验组杨梅用终浓度为200μg/ml的抗菌肽溶液浸泡1分钟，对照组杨梅用超纯水浸泡1分钟，然后置于培养箱25℃进行培养，观察并记录72小时时杨梅发生的变化。荔枝小心去皮后，随机分为实验组与对照组，10个/组。实验组荔枝用终浓度为200μg/ml的抗菌肽溶液浸泡1分钟，对照组杨荔枝用超纯水浸泡1分钟，然后置于培养箱25℃进行培养，观察并记录72小时时荔枝发生的变化。以上实验结果见表18。
表18，非天然全D-型蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物对新鲜水果的保护作用
由表18可见，新鲜水果经非天然全D-型蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物处理后，能显著增强新鲜水果对环境微生物的抵抗能力，且非天然全D-型蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物无药物残留问题，可用于果蔬保鲜。
实施例11非天然全D-型蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物在饲料添加剂中的应用：
实验方法：颗粒饲料购自昆明医学院动物科，所有实验操作均在实验室非无菌条件下进行。颗粒饲料经研磨后，按1∶1(重量/体积)用灭菌生理盐水溶解，10000转/分钟离心10分钟，取上清液备用。实验组为900μl上清液+100μl抗菌肽(终浓度200μg/ml)，对照组为900μl上清液+100μl灭菌超纯水。然后置于培养箱25℃进行培养，72小时后用显微镜观察培养液，实验结果见表19。
表19，非天然全D-型蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物对饲料的作用
| 组别 | 72小时后培养液显微镜观察结果 |
| 空白对照组 | 有大量杆状细菌及真菌的生长 |
| OH-CATH30-D | 无杆状细菌及真菌的生长 |
| NN-CATH30-D | 无杆状细菌及真菌的生长 |
| BF-CATH30-D | 无杆状细菌及真菌的生长 |
| CATH20-D | 有少量杆状细菌及真菌的生长 |
| CATH21-D | 有少量杆状细菌及真菌的生长 |
| FK-12-D | 有少量杆状细菌及真菌的生长 |
| KF-12-D | 有少量杆状细菌及真菌的生长 |
结果表明：动物饲料经非天然全D-型蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物处理后，能显著增强动物饲料环境微生物的抵抗能力，非天然全D-型蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物具备抗细菌及抗真菌的活性，无药物残留问题，可作为饲料添加剂。
实施例12非天然全D-型蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物在日化用品中的应用
实验材料：液体类：金喉健喷雾剂，贵州宏宇药业有限公司出品；黑妹口泰漱口水，美晨集团日化公司生产；梦之雾润肤保湿补水喷雾(肌水)，深圳市赛亚气雾剂有限公司产品。泡沫类：吉列洁面剃须啫喱，上海吉列有限公司出品；剑露牌(青苹果)洗手液，贵州天健堂生物科技有限公司出品。上述实验材料均购自云南健之佳连锁健康药房。
实验方法：抗菌活性检测采用琼脂糖扩散法进行。培养基配方为：1％低熔点琼脂糖(SigmaA6013)，0.3mg/ml胰蛋白胨(Oxoid产品)溶于10mM pH 7.4Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液中。制备的培养基20ml于42℃时分别加入过夜培养对数生长期大肠杆菌临床耐药株2(终浓度105CFU/ml)，摇匀后使其在直径76mm培养皿中均匀摊布。待凝固后，在培养基上利用灭菌圆环打3毫米的圆孔。液体类实验材料，因本身具有一定的抗菌活性，因此在取出后用灭菌超纯水稀释10倍，然后分为对照组(1/10稀释液)和实验组(1/10稀释液+抗菌肽)分别加入，实验组抗菌肽的终浓度均为100μg/ml。泡沫类实验材料，取出后置4℃放置1小时后再于4℃，12000转/分离心10分子以消除泡沫。小心制备对照组(吉列洁面剃须啫喱或洗手液)与实验组(吉列洁面剃须啫喱+抗菌肽或洗手液+抗菌肽)，实验组抗菌肽的终浓度均为100μg/ml。充分混匀后重复上述低温放置离心去泡沫步骤，室温放置1小时。液体类和泡沫类实验材料的对照组和实验组各取10μl分别加入打好的圆孔后37℃继续孵育16小时，然后测量无菌生长的透明环直径进行抗菌活性的测定。抗菌活性的计算：抗菌活性单位U＝(抗菌环的直径毫米-3)×10，实验结果见表20。
表20，日化用品添加非天然全D-型蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物后对大肠杆菌临床耐药株2的抵抗作用
1，金喉健喷雾剂对照组对大肠杆菌临床耐药株2的抗菌活性单位为：0U
2，黑妹口泰漱口水对照组对大肠杆菌临床耐药株2的抗菌活性单位为：10U
3，润肤保湿补水喷雾对照组对大肠杆菌临床耐药株2的抗菌活性单位为：0U
4，洁面剃须啫喱对照组对大肠杆菌临床耐药株2的抗菌活性单位为：0U
5，洗手液对照组对大肠杆菌临床耐药株2的抗菌活性单位为：6U。
结果表明：日化用品添加非天然全D-型蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物后显著增强了日化用品对微生物的抵抗作用，有助于日化用品的储存及对使用者的保护。
Claims (10)
1.一种非天然全部由D-型氨基酸残基组成的蛇毒Cathelicidin抗菌肽，其特征在于所述抗菌肽为选自序列表SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列：
SEQ ID NO：1：赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-亮氨酸-赖氨酸-天冬酰氨-丝氨酸-缬氨酸-赖氨酸-赖氨酸-精氨酸-丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-脯氨酸-精氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-丝氨酸-异亮氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸。
2.非天然全部由D-型氨基酸残基组成的蛇毒Cathelicidin抗菌肽的衍生物，其特征在于所述衍生物是权利要求1所述肽的氨基酸残基突变物，所述衍生物本身全部由D-型氨基酸残基组成并符合以下序列之一：
SEQ ID NO：2：赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-亮氨酸-赖氨酸-天冬酰氨-丝氨酸-缬氨酸-赖氨酸-赖氨酸-精氨酸-丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-脯氨酸-赖氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-苏氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸；
SEQ ID NO：3：赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-赖氨酸-亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-丝氨酸-缬氨酸-赖氨酸-赖氨酸-精氨酸-丙氨酸-赖氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-脯氨酸-精氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-丝氨酸-异亮氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸；
3.非天然全部由D-型氨基酸残基组成的蛇毒Cathelicidin抗菌肽的衍生物，其特征在于所述衍生物是来源于权利要求1所述肽的片段的变异体，所述衍生物本身全部由D-型氨基酸残基组成并符合以下序列之一：
SEQ ID NO：4：赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-丙氨酸-缬氨酸-赖氨酸-赖氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-丙氨酸-赖氨酸-缬氨酸；
SEQ ID NO：5：甘氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-缬氨酸-赖氨酸-赖氨酸-丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-丙氨酸；
SEQ ID NO：6：苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸；
SEQ ID NO：7：赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸。
4.非天然全部由D-型氨基酸残基组成的蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物的制备方法，其特征在于：采用固相化学法合成。
5.非天然全部由D-型氨基酸残基组成的蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物的应用，其特征在于：所述抗菌肽及其衍生物可用于制备人或动物抗微生物感染药物。
6.非天然全部由D-型氨基酸残基组成的蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物的应用，其特征在于：所述抗菌肽及其衍生物用于抗肿瘤药物药物的制备。
7.非天然全部由D-型氨基酸残基组成的蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物的应用，其特征在于：所述抗菌肽及其衍生物在临床人工生物材料中的应用，所述临床人工生物材料可以是但不局限于医用高分子生物材料、医用金属材料、医用生物复合物、医用生物衍生材料和医用凝胶。
8.非天然全部由D-型氨基酸残基组成的蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物的应用，其特征在于：所述抗菌肽及其衍生物在食品防腐及果蔬保鲜中的应用。
9.非天然全部由D-型氨基酸残基组成的蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物的应用，其特征在于：所述抗菌肽及其衍生物在饲料添加剂中的应用。
10.权利要求1-2所述非天然全部由D-型氨基酸残基组成的蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物的应用，其特征在于：所述抗菌肽及其衍生物在日化用品中的应用，所述日化用品可以是但不局限于：化妆品；洗手液、沐浴露、卫生巾、剃须膏、须后水等卫生用品；漱口水、口腔喷剂、牙膏、含片和口腔糖等口腔保健品。
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