CN117466974A - 一种抗微生物肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗微生物肽或其药物组合物及其应用，本发明的抗微生物肽是一类新型高效的抗微生物肽，它们具有分子量小、抗菌广谱性、高效性、无细胞毒性、无溶血性、稳定性高、不易产生抗药性等特点，可以杀灭包括临床上常见的耐药菌株、细菌和真菌等在内的微生物，并且它们结构简单、便于大规模合成且成本低廉，有望替代抗生素成为一种安全、绿色、高效的理想抗微生物剂，在制备抗微生物药物、抗微生物制剂和抗微生物产品等领域应用前景十分广阔。

Description

一种抗微生物肽及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种抗微生物肽及其应用，具体涉及一种新型的抗微生物肽和该抗微生物肽在控制微生物感染中的应用。
背景技术
抗生素在人类疾病的防控和治疗中发挥着巨大作用。二十世纪四十年代青霉素应用于临床后，感染性疾病普遍得到有效治疗。但随着抗生素的广泛长期应用，许多病原菌不断变异获得耐药基因，导致如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）、耐碳青霉烯类大肠埃希菌（CREC）、耐万古霉素肠球菌（VRE）、耐碳青霉烯铜绿假单胞菌（CRPA）、耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（CRKP）等多种耐药菌株大量产生。耐药菌株能够通过产生灭活酶、改变抗生素作用靶位、借助外排泵将药物泵出胞外等多种机制对抗生素产生耐药性，这些耐药菌株不仅传播速度极快且治愈困难。耐药菌株的产生为感染性疾病的治疗带来了极大困难，同时也使感染性疾病成为全球危害人类健康的十大公共威胁之一。然而，新型抗生素的研发速度相对远不及耐药菌株的产生速度，且新一代耐药菌株的耐药机制也更加复杂。因此，研发新型、有效、不易耐药的抗微生物药物以解决抗生素药物的耐药性问题迫在眉睫。
抗微生物肽（Antimicrobial peptides，AMPs）是一类重要的有抗微生物活性的多肽及其衍生物，对多种细菌、真菌、病毒等微生物均存在良好的抑制活性。除了具有抗微生物作用外，抗微生物肽在水产养殖、畜禽饲料、食品防腐、化妆品、口腔护理和动植物转基因等领域也有广阔的研发前景。与化学药物相比，抗微生物肽的优势主要表现为抗微生物活性高、可抗微生物谱广、热稳定性良好、毒性较低等。除此之外，相比于传统单靶点的抗生素，抗微生物肽的膜靶向抗微生物机制能够使其同时作用包括细胞膜在内的多个靶点，从而使细胞膜性质在短时间内保持稳定，因此菌种不易对其产生耐药性。其非膜靶向机制通过将抗微生物肽转移至胞内，参与抑制菌种DNA、RNA和蛋白质合成等重要生物学过程。抗微生物肽独特的抗微生物机制使其被认为在治疗感染性疾病中具有良好的前景和潜在的研发价值，同时有望替代抗生素成为新一代抗微生物药物。
抗微生物肽的来源广泛，目前发现的天然抗微生物肽大多数从动物、植物、细菌等生物体内提纯得到。尽管已知的天然抗微生物肽种类繁多，但其普遍存在分子量较大、含量较低、稳定性差、分离提纯成本高等问题，且许多抗微生物肽的抗微生物活性较弱甚至会对细胞产生溶血等毒副作用。除此之外，天然提纯的抗微生物肽大部分由L-型氨基酸组成，在体内不稳定易被蛋白酶降解。例如，从金环蛇蛇毒中分离得到的抗菌肽Cbf-K16由三十个L-型氨基酸组成，在血清中稳定性较差且易被蛋白酶降解而失活。与L-型氨基酸相比，由D-型氨基酸组成的抗微生物肽通常显示出更高的蛋白水解稳定性及代谢稳定性。因此，将D-型氨基酸引入抗微生物肽中可以破坏其两亲性螺旋结构从而降低可能存在的溶血活性和细胞毒性等副作用。
发明内容
发明目的：为了解决目前治疗感染性疾病存在的问题，本发明提出应用D-型抗微生物肽替代抗生素的策略，旨在提供一种通过引入D-型氨基酸替代L-型氨基酸的新型抗微生物肽，从而解决目前抗生素普遍存在的临床耐药性问题以及天然抗微生物肽的易降解、低活性和毒副作用问题，这对于新型、有效的抗感染药物的研发具有重大意义。
因此，本发明所要解决的技术问题是一方面提供了具有广谱抗微生物活性、低毒性、高效性、高稳定，且不易产生抗药性的新型抗微生物肽。
本发明还要解决的技术问题是另一方面提供了抗微生物肽在医药生产、畜禽养殖、水产养殖、果蔬保鲜、消毒防腐产品的生产、添加剂生产、农业生产、健康产品（食品、护理产品、保健品、饲料和化妆品等）生产等多领域中的应用。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种抗微生物肽，所述抗微生物肽包括如下共同的氨基酸通式：Ac-Arg-Leu-Leu-B-Z-Leu-Z-B-NH2，或Ac-Arg-Leu-Leu-B-Z-Leu-Z-B-Arg-NH2，或Ac-Arg-Arg-Leu-Leu-B-Z-Leu-Z-B-Arg-Arg-NH2，其中，Ac表示多肽的氨基端进行乙酰化修饰，NH2表示多肽的羧基端进行酰胺化修饰，B选自芳香族氨基酸残基，一个或两个Z选自精氨酸残基或赖氨酸残基。
其中，所述芳香族氨基酸残基是指分子结构中含有芳香环的氨基酸残基，主要包括3-(2-萘基)-丙氨酸残基、苯丙氨酸残基及其苯丙氨酸类衍生物残基。
其中，所述抗微生物肽的序列中的一个或多个Arg残基由赖氨酸残基取代。
其中，所述抗微生物肽的序列中的一个或多个Leu残基由正亮氨酸残基、正缬氨酸残基、高亮氨酸残基、丙氨酸残基或缬氨酸残基取代。
其中，所述抗微生物肽包括全L–型和全D–型对映异构体；或者所述抗微生物肽的任意一个或多个氨基酸用L–型或D–型氨基酸取代。
其中，所述抗微生物肽的氨基端、羧基端或赖氨酸残基的侧链氨基上连接聚乙二醇。
其中，所述聚乙二醇的分子量为200~4000，作为优选，所述聚乙二醇包括聚乙二醇200、聚乙二醇500、聚乙二醇1000、聚乙二醇2000或聚乙二醇4000。
本发明内容还包括一种药物组合物，其包括所述的抗微生物肽。
本发明内容还包括所述的抗微生物肽或其药物组合物在制备用于预防和/或控制微生物感染的药物中的应用。
本发明抗微生物肽优选制剂剂量范围是0.001-1000mg重量份。
其中，所述药物包含至少一种如所述的抗微生物肽或其药学上可接受的盐、酯、溶剂化物、水合物或前药，以及至少一种药学上可接受的载体、辅料、赋形剂、稀释剂、缓冲剂、佐剂、辅剂或媒介物。“药学上可接受的”的辅料是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应（如毒性、刺激和变态反应）的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在 Remington’s Pharmaceutical Sciences（Mack Pub.Co.，N.J.1991）中可找到关于药学上可接受的载体的充分说明。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。
术语“药学上可接受的辅料”是指，任何合适的用于药物制剂中的药学上可接受的佐剂、载体、稀释剂、防腐剂等。仅作为示例性的目的，已知的佐剂包括但不限于，例如完全弗氏佐剂，不完全弗氏佐剂，矿物质凝胶比如氢氧化铝，表面活性物质比如溶血软磷脂，复合多元醇，多聚阴离子，肽，油乳剂，烃乳状剂，钥孔血蓝蛋白等。已知的载体包括但不限于，无菌液体，例如水，生理盐水，油，或者水和油的混合物，所述油例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。已知的稀释剂包括但不限于，水、盐水、葡萄糖、乙醇、甘油及其类似物。已知的防腐剂包括但不限于硫柳汞和 EDTA 等。药学上可接受的辅料的选择可以通过本领域的已知技术来实现，本领域技术人员可以根据需要制备的多肽药物剂型基于现有技术选择合适的药学上可接受的辅料。例如，对于制备口服液体制剂（包括但不限于：悬浮液、微乳或复乳），所选用的辅料可以包括例如水、油、醇类、调味剂、防腐剂、着色剂等。又例如，对于制备口服固体制剂（包括但不限于：粉剂、粉雾剂、胶囊剂或片剂），所选用的辅料可以包括例如淀粉、糖类、稀释剂、成粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等。此外，如果需要，本发明的多肽药物还可以制备成糖包衣或肠溶衣，亦或者控释制剂。
其中，所述药物的剂型可以包括注射剂、片剂、口服剂、外用剂、滴眼剂、洗剂、散剂、颗粒剂、滴丸剂、胶囊剂、囊片剂、丸剂、粉剂、酏剂、混悬剂、合剂、灌肠剂、搽剂、溶液、液体制剂、橡胶剂、胶浆剂、流浸剂、浸膏剂、胶剂、小药囊、扁囊、溶液剂、糖浆剂、水剂、醑剂、甘油剂、透皮贴剂、涂膜剂、冲剂、烟剂、乳剂、透皮贴膏、酊剂、透入剂、酒剂、中药药剂、气雾剂、乳膏剂、滴耳剂、软膏剂、口腔膜剂、含漱剂、洗液剂、糊剂、喷雾剂、泡沫剂、吸入剂、凝胶剂、针剂、露剂、干粉针、肠溶衣、毫微球、微球、粉雾剂、汤剂、膏剂、丹剂、鼻喷剂、滴鼻剂、含漱剂、舌下片、吹入剂、栓剂、膜剂、滴剂、擦剂、洗鼻剂、洗眼剂、洗耳剂、眼内插入剂、眼膜剂、眼膏剂、喷粉剂、干粉吸入剂、粉末吸入剂、雾化吸入剂、棒剂、线剂、条剂、滴牙剂、混悬滴剂、乳胶剂、撒布剂、涂剂、涂布剂、霜剂、贴剂、贴膏剂、口腔贴片、植入剂、冲洗剂、锭剂、糕剂、饼剂、煎膏剂、膏药、茶剂、粥剂、油浸剂、溶胶剂、流浸膏剂、粉针剂、水针剂、无菌粉末、海绵剂、微囊剂、纳米囊剂、蜜丸、水丸、水蜜丸、糊丸、浓缩丸、蜡丸、糖丸、包衣片、肠溶片、泡腾片、咀嚼片、可溶片、分散片、缓释片、控释片、口崩片、含化丸、微乳或复乳。
作为优选，所述药物剂型包括注射剂、口服剂或外用剂，所述外用剂包括滴眼剂或洗剂，其中，所述剂型中抗微生物肽的剂量范围为：注射剂0.001-1000mg/kg；口服剂0.001-1000mg/kg；外用剂1/10000-30%/支；滴眼剂1/10000-30%/支；洗剂1/100000-20‰/支
其中，所述微生物包括细菌、真菌、放线菌、古细菌、蓝细菌、支原体、衣原体、立克次氏体、螺旋体、亚病毒、病毒、原生生物或藻类中的一种或多种。
其中，所述应用包括下列任一项：
（1）所述抗微生物肽或其药物组合物在制备抗炎和/或抗肿瘤药物中的应用；
（2）所述抗微生物肽或其药物组合物在水产养殖中的应用；
（3）所述抗微生物肽或其药物组合物在制备口腔护理产品中的应用；
（4）所述抗微生物肽或其药物组合物在制备口腔清洁制剂中的应用；
（5）所述抗微生物肽或其药物组合物在制备牙齿清洁用品中的应用；
（6）所述抗微生物肽或其药物组合物在制备牙涂料中的应用；
（7）所述抗微生物肽或其药物组合物在制备龋齿防治药物中的应用；
（8）所述抗微生物肽或其药物组合物在制备治疗皮肤感染的产品中的应用；
（9）所述抗微生物肽或其药物组合物在制备细胞内杀菌产品中的应用；
（10）所述抗微生物肽或其药物组合物在制备清除细菌生物被膜产品中的应用；
（11）所述抗微生物肽或其药物组合物在制备消毒产品中的应用；
（12）所述抗微生物肽或其药物组合物在预防和/或治疗小麦赤霉病中的应用；
（13）所述抗微生物肽或其药物组合物在制备防霉防腐剂的应用；
（14）所述抗微生物肽或其药物组合物在制备食品防腐剂的应用；
（15）所述抗微生物肽或其药物组合物在制备化妆品防腐剂的应用；
（16）所述抗微生物肽或其药物组合物在化妆品制备中的应用；
（17）所述抗微生物肽或其药物组合物在畜禽饲料和/或饲料添加剂中的应用；
（18）所述抗微生物肽或其药物组合物在动植物品种的改良和/或动植物育种中的应用；
（19）所述抗微生物肽或其药物组合物在制备伤口敷料中的应用；
（20）所述抗微生物肽或其药物组合物在制备抗微生物保鲜膜中的应用；
（21）所述抗微生物肽或其药物组合物在果蔬保鲜中的应用；
（22）所述抗微生物肽或其药物组合物在畜牧养殖中的应用；
（23）所述抗微生物肽或其药物组合物在制备抗微生物剂、药品、兽药、饲料、食品、日用化学品、保健品、化妆品、杀菌剂、杀病毒剂、杀藻剂、灭菌剂、饲料、添加剂、口腔清洁制剂、消毒剂、消炎产品、清洗剂、保鲜剂、辅料、防霉剂、防藻剂、洗涤助剂、洗涤组合物、清洁剂或防腐剂中的应用。
上述抗微生物肽及其药物组合物可以制备为任何一种医学上可用的生物载体或制剂形式给予感染疾病患者。
有益效果：与现有技术相比，本发明具备以下优点：本发明所述的抗微生物肽是一类新型高效的抗微生物肽，它们具有分子量小、抗菌广谱性、高效性、无细胞毒性、无溶血性、稳定性高、不易产生抗药性等特点，可以杀灭包括临床上常见的耐药菌株、细菌和真菌等在内的微生物，并且它们结构简单、便于大规模合成且成本低廉，有望替代抗生素成为一种安全、绿色、高效的理想抗微生物剂，在制备抗微生物药物、抗微生物制剂和抗微生物产品等领域应用前景十分广阔。
附图说明
图1为本发明中抗微生物肽LV-1～LV-30的细胞毒性实验结果。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
实施例1 抗微生物肽序列信息
由抗微生物肽序列信息汇总表1可知，从序号1到序号30的前30种抗微生物肽(LV-1～LV-30)均为全D-型氨基酸；从序号31到序号60的后30种抗微生物肽(LV-31～LV-60)均为全L-型氨基酸。表1中X表示3-(2-萘基)-丙氨酸残基，X1表示4-氟-苯丙氨酸残基，X2表示3,4-二氟苯丙氨酸残基，X3表示4-氯苯丙氨酸残基，X4表示3,4-二氯苯丙氨酸残基，X5表示4-三氟甲基-苯丙氨酸残基，X6表示4-溴苯丙氨酸残基，X7表示4-甲基-苯丙氨酸残基，X8表示正亮氨酸残基，X9表示正缬氨酸残基，X10表示高亮氨酸残基，Ac表示多肽的氨基端进行乙酰化修饰，NH2表示多肽的羧基端进行酰胺化修饰。苯丙氨酸类衍生物残基主要包括4-氟-苯丙氨酸残基、3,4-二氟苯丙氨酸残基、4-氯苯丙氨酸残基、3,4-二氯苯丙氨酸残基、4-三氟甲基-苯丙氨酸残基、4-溴苯丙氨酸残基和4-甲基-苯丙氨酸残基。同时，对于表1中所述序号1～25的25种抗微生物肽(LV-1～LV-25)和序号31～55的25种抗微生物肽(LV-31～LV-55)，它们的氨基端进行乙酰化修饰，且其羧基端进行酰胺化修饰。抗微生物肽LV-26和LV-56的PEG200即为聚乙二醇200，PEG200分别连接在LV-26和LV-56的羧基端上；抗微生物肽LV-27和LV-57的PEG500即为聚乙二醇500，PEG500分别连接在LV-27和LV-57的羧基端上；LV-28和LV-58的PEG1000即为聚乙二醇1000，PEG1000分别连接在LV-28和LV-58的羧基端上；抗微生物肽LV-29和LV-59的PEG2000，PEG2000分别连接在LV-29和LV-59的氨基端上；LV-30和LV-60的PEG4000即为聚乙二醇 4000，PEG4000分别连接在LV-30和LV-60的羧基端上。
抗微生物肽序列信息汇总见表1。所有60条多肽(LV 1～60)都具有共同氨基酸序列基序结构，它们的第1个、第2个、第6个、第8个、第10个和第11个氨基酸均是带正电荷的精氨酸或者赖氨酸, 且第3个、第4个和第7个氨基酸均是疏水性氨基酸，且第5个和第9个氨基酸均是芳香性氨基酸。从所有具有共同基序结构的60条多肽(LV 1～60)中，进行实验发现，其中选择10条具有代表性的多肽(包括LV-1, LV-2, LV-6, LV-12, LV-17, LV-18, LV-19, LV-20, LV-25和LV-27) 在进行高、中、低剂量组的体内药效实验时，获得了显著的效果。
表1抗微生物肽序列信息汇总表
实施例2：抗微生物肽的抑菌活性实验
1、LV-1～LV-60对金黄色葡萄球菌（NRS 384）的抗菌实验
根据美国临床实验室标准（NCCLS）抗微生物药物敏感性试验操作标准，采用经典的微量连续二倍稀释法测定所有60条多肽（序号：LV-1～LV-60）对金黄色葡萄球菌（NRS384）的最小抑菌浓度，实验平行重复5次，多肽溶液终浓度为0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128 µg/ml，以在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为抗微生物肽的最小抑菌浓度（MIC）。将抗菌药物左氧氟沙星和抗菌肽Cbf-K16（Cbf-K16的序列：KFFRKLKKSVKKRAKKFFKKPRVIGVSIPF）选作阳性对照，测试多肽对金黄色葡萄球菌（NRS 384）的抑菌效果。结果见表2。
由表2可知，与抗菌肽Cbf-K16（MIC=32 μg/ml）相比，所有测试的60条多肽（序号：LV-1～LV-60）对金黄色葡萄球菌（NRS 384）均显示了更好的抑菌效果（MIC≤8 μg/ml），其中30条多肽（序号：LV-1～LV-30）显示了最佳的抑菌活性（MIC=1 μg/ml），与抗菌药物左氧氟沙星的抑菌活性相当。
表2所有测试的60条多肽（序号：LV-1～LV-60）对金黄色葡萄球菌（NRS 384）的最小抑菌浓度MIC（μg/ml）的实验结果
2、LV-1～LV-30对临床常见的10种敏感菌株和6种真菌的抗菌实验
根据美国临床实验室标准（NCCLS）抗微生物药物敏感性试验操作标准，采用经典的微量连续二倍稀释法进一步测定30条抗微生物肽（序号：LV-1～LV-30）对临床常见的10种敏感菌株和6种真菌的最小抑菌浓度，实验平行重复5次，多肽溶液终浓度为0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128 µg/ml，以在小孔内完全抑制细菌或者真菌生长的最低药物浓度为抗微生物肽的最小抑菌浓度MIC（μg/ml）。结果见表3和表4。
由表3和表4实验结果可知，LV-1～LV-30对所有测试的16种临床常见敏感菌株和真菌均表现出了较强的抗微生物活性。
表3. LV-1～LV-30对10种常见敏感菌株的最小抑菌浓度MIC（μg/ml）实验结果
表4. LV-1～LV-30对常见真菌的最小抑菌浓度MIC（μg/l）实验结果
3、多肽LV-1～LV-30对5种临床常见的耐药性菌株的抗菌实验
根据美国临床实验室标准（NCCLS）抗微生物药物敏感性试验操作标准，采用经典的微量连续二倍稀释法进一步测定多肽LV-1～LV-30对5种临床常见的耐药性菌株的最小抑菌浓度，实验平行重复5次，多肽溶液终浓度为0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128µg/ml，以在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为抗微生物肽的最小抑菌浓度（MIC）。测试耐药菌株包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）、耐碳青霉烯类大肠埃希菌（CREC）、耐万古霉素肠球菌（VRE）、耐碳青霉烯铜绿假单胞菌（CRPA）、耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（CRKP）。结果见表5。
由表5可知，对于所有测试的5种常见耐药性菌株，抗微生物肽LV-1～LV-30均显示出良好的抗微生物活性（MIC≤8 μg/ml）。由表2、表3、表4和表5抗微生物实验表明，本发明所述的多肽LV-1～LV-30具有高效广谱的抗菌活性，可以杀灭包括临床上常见的细菌、真菌和耐药菌株等在内的微生物。
表5是LV-1～LV-30对临床常见的耐药性菌株的最小抑菌浓度MIC (μg/ml)实验结果
实施例3 抗微生物肽的溶血活性检测
取新鲜兔血500g离心5 min，去除上清，用PBS（0.01M，pH 7.4）反复多次洗涤红细胞，直至上清透亮。重悬红细胞至10ml，并用PBS（0.01M，pH 7.4）稀释25倍，红细胞约为2×108RBC/ml，制备红细胞悬液。用生理盐水（0.85%, w/v, NaCl）按照倍比稀释法将抗微生物肽分别进行梯度稀释，多肽溶液终浓度为1.95、3.9、7.8、15.6、31.3、62.5、125、250、500、1000、2000 µg/ml，分别取100μL抗微生物肽溶液加入96孔板中，每种浓度5个复孔；然后向每孔中加入红细胞约为2×108RBC/ml的兔血100μl，37℃孵育1h后，500g离心5 min，取100µl上清液至新的96 孔板中， 使用酶标仪在541nm波长处测定OD值。利用Triton X-100（10mg/ml作为起始浓度，两倍梯度稀释）作为阳性对照组。根据公式：溶血率=[实验组OD541-阴性对照组OD541]/[阳性对照组OD541-阴性对照组OD541］×100%。具体溶血试验结果见表6所示。最小溶血浓度（MHC）：能引起10%溶血的最低药物浓度。
由表6可知，在远远高于最小抑菌浓度（MIC）时，测试的所有抗微生物肽（LV-1～LV-60）对兔血红细胞均未见明显溶血现象，说明它们具有较好的安全性。
表6多肽对红细胞溶血的最小溶血浓度 (MHC)
实施例4抗微生物肽的细胞毒性测定
将HEK293T细胞（来源于美国ATCC菌种保藏中心）培养于含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，在37℃，5% CO2条件下的培养箱中培养。收集对数期的细胞，用0.25%胰酶处理贴壁的细胞，调整细胞悬液浓度为5×104个/mL；在96孔板中加入100μL细胞悬液，将96孔板放入细胞培养箱中，37℃，5% CO2，孵育24h后吸去培养基；用PBS清洗两遍后，每孔加入100μl的抗微生物肽溶液（终浓度为128 µg/ml），每个浓度设5个复孔，继续把96孔板放入细胞培养箱中培养，孵育48h；每孔加入20μL MTT溶液（5mg/ml），继续培养4h；将96孔板中的培养基小心吸去，每孔加入150μL的DMSO溶剂，小心震荡，使结晶物充分溶解后，用酶标仪在570nm波长处测量各孔吸光度(OD值)。计算细胞的存活率，细胞存活率(%)=(实验组 OD值-空白对照组OD值)/(对照组OD值-空白对照组OD值)×100%。
细胞毒性实验结果如图1所示，本发明所述的抗微生物肽LV-1～LV-30在128µg/ml高浓度作用下，对HEK293T细胞的存活率均没有明显影响，表明抗微生物肽对哺乳动物免疫细胞没有明显毒副作用，能够很好地区分细菌细胞和哺乳动物细胞，具有较高的安全性，在制备抗微生物药物、抗微生物制剂和抗微生物产品等领域应用前景十分广阔。
实施例5抗微生物肽的蛋白酶解稳定性测定
选用胰蛋白酶（250U/mg，pH=8.0）与抗微生物肽（LV-1～LV-30）按1:10(w/w)的比例加入反应缓冲液（0.2 M磷酸钠，1 mM CaCl2，pH 7.5）中，37℃孵育3h。根据实施例2中同一实验方法测定，分别取多肽溶液和金黄色葡萄球菌（NRS 384）菌液加入无菌的96孔细胞培养板中，每个浓度5个复孔，多肽的终浓度范围为0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128 µg/ml；37℃恒温培养箱孵育16～24h，直至阴性对照孔中有肉眼可见的浑浊液出现，观察经胰蛋白酶处理后抗微生物肽的MIC值。
结果如表7所示，本发明所述的抗微生物肽LV-1～LV-30经胰蛋白酶处理后，其MIC值未发生改变；而阳性对照L型抗微生物肽Cbf-K16经胰蛋白酶处理后，均失去抑菌活性，说明由D型氨基酸形成的肽键与L型氨基酸相比具有更强的酶抗抵力，显著提高了抗微生物肽的临床应用价值。
表7抗微生物肽的蛋白酶稳定性测定
实施例6抗微生物肽LV-1～LV-30的血清稳定性测定
将30 µL抗微生物肽（LV-1～LV-30）溶液（10 mg/mL储备液）加入人血清（300 µL）中进行孵育，于37℃下分别孵育12 h后取样，通过反相高效液相色谱方法测定人血清中抗微生物肽的残留量。
结果如表8所示，抗微生物肽LV-1～LV-30在人血清中孵育12 h后，发现抗微生物肽残留量均在97%以上，说明抗微生物肽LV-1～LV-30在人血清中均显示出良好的稳定性。
表8人血清中抗微生物肽的残留量
实施例7 抗微生物肽LV-1～LV-30外用剂对小鼠背部皮肤感染的治疗试验
本试验采用雌性和雄性ICR小鼠，雌雄各半，按体重随机分组，每组10只，分笼饲养。分为空白组、模型组、阳性对照甲氧西林（Methicillin）组、抗微生物肽LV-1～LV-30的外用剂组。制备甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（NRS 384）和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）菌悬液，将其浓度调整至5×106CFU/ml，备用。首先用剃须刀刮去小鼠背部被毛，活检穿孔器在背部表面创建伤口并感染甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌或者耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（0.1ml，5×106CFU/ml），建立感染模型。除了空白组和模型组外，其他各组均在伤口部位上对应涂抹不同的外用剂，剂量为0.1ml，每日2次，连续4天。末次给药后次日无菌取各组动物感染部位的皮肤，计算抑菌率，结果见表9。
由表9可知抗微生物肽LV-1～LV-30组的高、中、低剂量组与甲氧西林组相比，不仅对敏感金黄色葡萄球菌的抑菌率均在95％以上，而且对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抑菌率在85％以上，明显优于甲氧西林组。说明抗微生物肽LV-1～LV-30外用剂对皮肤伤口感染金黄色葡萄球菌有显著抑制效果。
表9抗微生物肽LV-1～LV-30外用剂对皮肤感染影响（n = 10）
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实施例8抗微生物肽LV-1～LV-30注射剂对小鼠腹膜炎感染的治疗试验
本试验采用雌性和雄性ICR小鼠，雌雄各半，按体重随机分组，每组10只，分笼饲养。分为空白对照组，阴性对照组，阳性对照左氧氟沙星组和抗微生物肽LV-1～LV-30组。制备铜绿假单胞杆菌ATCC 27853菌悬液，将其浓度调整至1×109CFU/ml，备用。除空白对照组外，通过将菌液（0.2ml，1×109CFU/ml）注射到小鼠腹腔建立模型。成功构建模型后，立即按体重给药，除空白对照组和感染阴性对照组外，其他各组均尾静脉注射不同的各注射剂，每日2次，连续给药3天，观察14天。观察每组小鼠的死亡情况，记录小鼠存活时间。抗微生物肽LV-1～LV-30注射剂对铜绿假单胞杆菌感染小鼠存活时间的影响结果见表10。
从表10可知，阴性对照组10只小鼠在造模后2天内全部死亡（10/10），抗微生物肽组(LV-1～LV-30)与阴性对照组的小鼠平均存活天数相比存在极显著性差异（**P＜0.01，***P＜0.001或****P＜0.0001），说明抗微生物肽LV-1～LV-30组均具有较好的抗感染效果。尽管左氧氟沙星对照组可以有效延长感染小鼠的存活时间，但抗微生物肽LV-1～LV-30组的感染小鼠存活时间明显优于左氧氟沙星组，因此可知抗微生物肽LV-1～LV-30注射剂对铜绿假单胞杆菌感染小鼠具有良好的体内治疗效果。此外，从所有具有共同基序结构的30条抗微生物肽(LV-1～LV-30)中, 选择10条具有代表性的多肽(包括LV-1，LV-2，LV-6，LV-12，LV-17，LV-18，LV-19，LV-20，LV-25和LV-27)进行了高、中、低剂量组的小鼠腹膜炎感染药效实验，由表10可知，这10条多肽的高、中、低剂量组与阴性对照组比较小鼠平均存活天数存在极显著差异（**P＜0.01，***P＜0.001或****P＜0.0001），它们的高、中、低剂量组的抗感染作用均明显优于左氧氟沙星组。
表10 抗微生物肽LV-1～LV-30注射剂对铜绿假单胞杆菌感染小鼠存活时间的影响（n = 10）
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注：与阴性对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001
实施例8 抗微生物肽LV-1～LV-30口服制剂对细菌全身感染动物的治疗试验
本试验采用雌性和雄性ICR小鼠，雌雄各半，按体重随机分组，每组10只，分笼饲养。分为空白对照，阴性对照组，阳性对照左氧氟沙星组和抗微生物肽LV-1～LV-30组。制备大肠埃希菌ATCC 25922菌悬液，将其浓度调整至1×107CFU/ml，备用。除空白对照组外，通过将大肠埃希菌（0.2ml，1×107CFU/ml）注射到小鼠腹腔建立模型。成功构建模型后，立即按体重给药，除空白对照组和感染阴性对照组外，其他各组均灌胃不同化合物，每天3次，连续灌胃给药7天，观察14天。观察每组小鼠的死亡情况，记录小鼠存活时间。抗微生物肽LV-1～LV-30口服制剂对大肠埃希菌感染小鼠存活时间的影响结果见表11。
从表11可知，阴性对照组10只小鼠在造模后5天内全部死亡（10/10），抗微生物肽LV-1～LV-30组与阴性对照组的小鼠平均存活天数相比存在显著性差异（**P＜0.01，***P＜0.001或****P＜0.0001），说明抗微生物肽LV-1～LV-30组均具有较好的抗感染效果。尽管左氧氟沙星对照组可以有效延长感染小鼠的存活时间，但抗微生物肽LV-1～LV-30组的感染小鼠存活时间均明显优于左氧氟沙星组，因此可知抗微生物肽LV-1～LV-30注射剂对大肠埃希菌感染小鼠具有良好的体内治疗效果。此外，从所有具有共同基序结构的30条抗微生物肽(LV-1～LV-30)中，其中10条具有代表性的多肽(包括LV-1，LV-2，LV-6，LV-12，LV-17，LV-18，LV-19，LV-20，LV-25和LV-27)进行高、中、低剂量组的小鼠全身感染药效实验中效果显著，由表11可知，这10条多肽的高、中、低剂量组与阴性对照组比较小鼠平均存活天数存在极显著差异（**P＜0.01，***P＜0.001或****P＜0.0001），它们的高、中、低剂量组的抗感染作用均明显优于左氧氟沙星组。
表11 抗微生物肽LV-1～LV-30口服制剂对大肠埃希菌感染小鼠存活时间的影响结果（n = 10）
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注：与阴性对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001
从以上实施例可以看出，本发明所述的抗微生物肽是一类高效的抗微生物肽，它们具有分子量小、抗菌广谱性、高效性、无细胞毒性、无溶血性、稳定性高、不易产生抗药性等特点，可以杀灭包括临床上常见的耐药菌株、细菌和真菌等在内的微生物，并且它们结构简单、便于大规模合成且成本低廉，有望替代抗生素成为一种安全、绿色、高效的理想抗微生物剂，在制备抗微生物药物、抗微生物制剂和抗微生物产品等领域应用前景十分广阔。

Claims (14)

1.一种抗微生物肽，其特征在于，所述抗微生物肽或其药物组合物包括如下共同的氨基酸通式：Ac-Arg-Leu-Leu-B-Z-Leu-Z-B-NH2，或Ac-Arg-Leu-Leu-B-Z-Leu-Z-B-Arg-NH2，或Ac-Arg-Arg-Leu-Leu-B-Z-Leu-Z-B-Arg-Arg-NH2，其中，Ac表示多肽的氨基端进行乙酰化修饰，NH2表示多肽的羧基端进行酰胺化修饰，B选自芳香族氨基酸残基，一个或两个Z选自精氨酸残基或赖氨酸残基。
2.根据权利要求1所述的抗微生物肽，其特征在于，所述芳香族氨基酸残基主要包括3-(2-萘基)-丙氨酸残基、苯丙氨酸残基或其他苯丙氨酸类衍生物残基。
3.根据权利要求1所述的抗微生物肽，其特征在于，所述抗微生物肽的序列中的一个或多个Arg残基由赖氨酸残基取代。
4.根据权利要求1所述的抗微生物肽，其特征在于，所述抗微生物肽的序列中的一个或多个Leu残基由正亮氨酸残基、正缬氨酸残基、高亮氨酸残基、丙氨酸残基或缬氨酸残基取代。
5.根据权利要求1~4中任一项所述的抗微生物肽，其特征在于，所述抗微生物肽包括全L–型和全D–型对映异构体；或者所述抗微生物肽的任意一个或多个氨基酸用L–型或D–型氨基酸取代。
6.根据权利要求1~4中任一项所述的抗微生物肽，其特征在于，所述抗微生物肽的氨基端、羧基端或赖氨酸残基的侧链氨基上连接聚乙二醇。
7.根据权利要求6所述的抗微生物肽，其特征在于，所述聚乙二醇的分子量为200~4000。
8.根据权利要求1所述的抗微生物肽，其特征在于，所述抗微生物肽的序列如表1所示：
表1：
，表1中X表示3-(2-萘基)-丙氨酸残基，X1表示4-氟-苯丙氨酸残基，X2表示3,4-二氟苯丙氨酸残基，X3表示4-氯苯丙氨酸残基，X4表示3,4-二氯苯丙氨酸残基，X5表示4-三氟甲基-苯丙氨酸残基，X6表示4-溴苯丙氨酸残基，X7表示4-甲基-苯丙氨酸残基，X8表示正亮氨酸残基，X9表示正缬氨酸残基，X10表示高亮氨酸残基，Ac表示多肽的氨基端进行乙酰化修饰，NH2表示多肽的羧基端进行酰胺化修饰；苯丙氨酸类衍生物残基主要包括4-氟-苯丙氨酸残基、3,4-二氟苯丙氨酸残基、4-氯苯丙氨酸残基、3,4-二氯苯丙氨酸残基、4-三氟甲基-苯丙氨酸残基、4-溴苯丙氨酸残基或4-甲基-苯丙氨酸残基。
9.一种药物组合物，其特征在于，其包括权利要求1~8中任一项所述的抗微生物肽。
10.权利要求1~8中任一项所述的抗微生物肽或权利要求9所述的药物组合物在制备用于预防和/或控制微生物感染的药物中的应用。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述药物包含至少一种如权利要求1至7中任一项所述的抗微生物肽或其药学上可接受的盐、酯、溶剂化物、水合物或前药，以及至少一种药学上可接受的载体、辅料、赋形剂、稀释剂、缓冲剂、佐剂、辅剂或媒介物。
12.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型包括注射剂、口服剂或外用剂。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述口服剂包括片剂、口服液体剂、胶囊剂、颗粒剂或中药制剂，所述外用剂包括膏剂、凝胶剂、栓剂或气雾剂。
14.根据权利要求10~13中任一项所述的应用，其特征在于，所述应用包括下列任一项：
（1）所述抗微生物肽或其药物组合物在制备抗炎和/或抗肿瘤药物中的应用；
（2）所述抗微生物肽或其药物组合物在水产养殖中的应用；
（3）所述抗微生物肽或其药物组合物在制备口腔护理产品中的应用；
（4）所述抗微生物肽或其药物组合物在制备口腔清洁制剂中的应用；
（5）所述抗微生物肽或其药物组合物在制备牙齿清洁用品中的应用；
（6）所述抗微生物肽或其药物组合物在制备牙涂料中的应用；
（7）所述抗微生物肽或其药物组合物在制备龋齿防治药物中的应用；
（8）所述抗微生物肽或其药物组合物在制备治疗皮肤感染的产品中的应用；
（9）所述抗微生物肽或其药物组合物在制备细胞内杀菌产品中的应用；
（10）所述抗微生物肽或其药物组合物在制备清除细菌生物被膜产品中的应用；
（11）所述抗微生物肽或其药物组合物在制备消毒产品中的应用；
（12）所述抗微生物肽或其药物组合物在预防和/或治疗小麦赤霉病中的应用；
（13）所述抗微生物肽或其药物组合物在制备防霉防腐剂的应用；
（14）所述抗微生物肽或其药物组合物在制备食品防腐剂的应用；
（15）所述抗微生物肽或其药物组合物在制备化妆品防腐剂的应用；
（16）所述抗微生物肽或其药物组合物在化妆品制备中的应用；
（17）所述抗微生物肽或其药物组合物在畜禽饲料和/或饲料添加剂中的应用；
（18）所述抗微生物肽或其药物组合物在动植物品种的改良和/或动植物育种中的应用；
（19）所述抗微生物肽或其药物组合物在制备伤口敷料中的应用；
（20）所述抗微生物肽或其药物组合物在制备抗微生物保鲜膜中的应用；
（21）所述抗微生物肽或其药物组合物在果蔬保鲜中的应用；
（22）所述抗微生物肽或其药物组合物在畜牧养殖中的应用；
（23）所述抗微生物肽或其药物组合物在制备抗微生物剂、药品、兽药、饲料、食品、日用化学品、保健品、化妆品、杀菌剂、杀病毒剂、杀藻剂、灭菌剂、饲料、添加剂、口腔清洁制剂、消毒剂、消炎产品、清洗剂、保鲜剂、辅料、防霉剂、防藻剂、洗涤助剂、洗涤组合物、清洁剂或防腐剂中的应用。
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CN102311492A (zh) * 2010-07-09 2012-01-11 中国科学院昆明动物研究所 非天然全D-型蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物、制备方法及应用
CN105017384A (zh) * 2015-07-13 2015-11-04 长春普莱医药生物技术有限公司 一种新型抗菌肽及其应用
CN113480627A (zh) * 2021-06-25 2021-10-08 华中农业大学 一种抗菌肽及其应用

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