CN110028555A - 抗菌肽fw-50及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种人工合成的新型抗菌肽FW‑50，其氨基酸序列为：FWRRIRVTPVVNPWFLQQT‑NH₂。体外抑菌实验表明，本发明所述的抗菌肽对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌等具有抑制作用，可用于制备抗菌药物。

Description

抗菌肽FW-50及其应用

技术领域

本发明涉及一种抗菌肽FW-50，该肽为人工设计合成的含19个氨基酸残基的直链肽，且C端羧基酰胺化。

背景技术

抗菌肽是一类有生物学活性的小分子多肽，通常是由12～60个氨基酸组成。富含赖氨酸、精氨酸等碱性氨基酸，并且通常含有高于30％的疏水性氨基酸。抗菌肽大多为两亲性且带有一定量的正电荷，为阳离子多肽。

自1928年Fleming发现青霉素以来，人们逐渐进入控制和治疗细菌感染性疾病的时代。然而大量广谱抗生素的使用加速了致病菌的进化，使得近些年大量耐药细菌及多重耐药细菌不断出现。目前，所有的常规抗生素都出现了相应的耐药性致病株系，致病菌的抗药性问题已经日益严重地威胁着人们的健康。抗菌肽因为抗菌活性高，抗菌谱广，种类多，可供选择的范围广，靶菌株不易产生抗性突变等原因，被认为将会在医药工业上有着广阔的应用前景。但是抗菌肽也存在一些缺点，主要包括生产成本高、难以获取，体内有限稳定性、微生物耐受性(膜变异)、异质性、未知毒理和药代动力学等，限制了其在临床上的应用。

发明内容

本发明设计了一种新型的抗菌肽FW-50，它为19个天然氨基酸构成的线性多肽，可方便人工合成，成本低且副作用小。

本发明的抗菌肽序列为：

FWRRIRVTPVVNPWFLQQT-NH₂

本发明所涉及的多肽用固相合成法制备，技术成熟，产物质量容易控制，能满足大规模工业化生产的需要。

药效学试验证明本发明的多肽能抑制或杀灭单核增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌等。

毒副作用试验表明本发明的多肽对绵羊红细胞未观测到溶血活性，说明其溶血活性低，副作用小。

本发明的多肽也可以和药学上可接受的盐结合，同样具有其药效。这些盐包括(但不局限于)与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐。其他盐包括与如下无机酸形成的盐：如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸，以及与有机酸形成的盐，而有机酸则指乙酸、草酸、丁二酸、酒石酸、甲磺酸和马来酸。药学上可接受的盐优选钠盐。

本发明公开了一种抗菌肽制成的制剂，其中含有该多肽或其药学上可接受的盐及药学上可接受的载体。

上述多肽可以制成注射剂、片剂、注射用无菌粉末、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、膏剂、霜剂等多种剂型。上述各种剂型均可以根据药学领域的常规方法制备。可以通过注射、口服、滴鼻、滴眼、物理或化学介导的方法导入肌肉、内皮、皮下、静脉、粘膜组织，或是被其他物质混合或包裹后导入肌体。

一般地，本发明的多使用剂量在0.001～10克/天，也可以根据疾病的情况偏离这个剂量范围。

下面是本发明的多肽的部分药效学试验及结果，所用多肽是根据以下序列，上海强耀生物科技有限公司合成，采用标准的Fmoc固相化学合成方法，即由去保护和激活交联两个反应反复循环而最终将制备肽合成。使用C18制备柱，通过高效液相色谱(HPLC)法纯化多肽，纯度达到95％以上，并通过质谱(MS)进行多肽鉴定。

抗菌肽FW-50序列为(Peptide 1，本专利保护序列)：

FWRRIRVTPVVNPWFLQQT-NH₂

Peptide 2序列为(其它参照序列)

FLRRIRV-NH₂

Peptide 3序列为(其它参照序列)

TPVVNPPFLQQT-NH₂

一、微量肉汤法测定MIC：

1.挑选单个菌落到10ml液体培养液试管中，置37℃，200转，摇床培养，让菌液生长到对数生长期(OD600值约为0.5)。

2.将金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、单核增生李斯特氏菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌的种子液用培养基分别稀释到OD600值为0.08-0.1之间的菌悬液。

3.在96孔板的第一个孔加入180μl稀释的菌悬液，2-11个孔加入100μl稀释的菌液，12孔加入无菌LB培养基或PYG培养基作为对照。

4.在第一个孔加入20μl药物母液，混匀，取100μl至第二个孔，依次至第11个孔，弃去100μl，使多肽母液一次倍比稀释为256、128、64、32、16、8、4μg/ml。每株菌做3行平行。用头孢呋辛代替多肽母液，作为阳性对照；用培养基代替多肽母液，作为阴性对照。

5.置于37℃培养4小时后，用酶标仪测定OD值，观察菌体生长情况。

6.以不生长细菌的最小药物浓度作为MIC值。

抑菌试验结果如表1～表3所示，+号表示孔内有菌生长，一号表示孔内没有菌生长。从试验结果可以看出Peptide 1对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌都有一定的抑菌效果，MIC在16～128μg/ml；Peptide 2对金黄色葡萄球菌有弱的抑制效果，MIC为128μg/ml，但对铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌没有抑制效果；Peptide 3对金黄色葡萄球菌的MIC在64μg/ml，同样对铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌没有抑制效果；

表1对金黄色葡萄球菌的抑菌效果

表2对铜绿假单胞菌的抑菌效果

表3对大肠埃希氏菌的抑菌效果

二、溶血毒性试验

1、红细胞悬液的制备：取脱纤维的绵羊血红细胞10ml，加入离心管中，加入10ml生理盐水洗涤后离心，离心力设定为3000g，离心3min，取出后弃上清，留底部细胞，反复洗涤直到上清液不显红色之后弃去上清液，吸取2ml下层沉淀物，加入生理盐水稀释至100ml，配成2％的红细胞悬浮。

2、药液准备：称样配置浓度为2560μg/ml的多肽母液500ml，依次稀释，最后获得浓度分别为128μ/ml，64μg/ml，32μg/ml，16μg/ml，8μg/ml的多肽溶液。另准备3个EP管，一个加600μl生理盐水作底色管，一个加300μl蒸馏水做阳性对照管，另一个加300μl生理盐水作阴性对照管。

3、将各EP管放到37℃恒温锅中孵育30min后，取不同浓度的多肽药液300μl分别和300μl红细胞悬液混匀，阳性对照管和阴性对照管也分别加入300μl红细胞悬液混匀。放到37℃恒温锅中孵育1小时。

4、取出EP管，用6000rpm转速离心5min，离心完成后肉眼观察上清，取上清液100μl加入96孔板中，至酶标仪570nm测OD值。独立三次重复实验。

5、计算溶血度。溶血度计算公式：样品吸光度＝式样管吸光度-底色管吸光度；溶血度＝(样品吸光度-阴性对照吸光度)/(阳性对照吸光度-阴性对照吸光度)×100％

6、溶血度大于5％的浓度标注为溶血

溶血毒性试验结果表明所测定的几条多肽均未表现出明显的溶血毒性。

上述试验结构表明，Peptide 1为Peptide 2和Peptide 3拼接并将第二为L突变为W改造而来，具有了抗革兰氏阴性菌的活性，而母肽不具备抗革兰氏阴性菌活性。Peptide 1是人工设计的合成多肽，与对照多肽相比抗菌谱更广，具有母肽所不具备的抗革兰氏阴性菌，尤其是铜绿假单孢菌的活性，对金黄色葡萄球菌的活性也由于母肽，因此就有良好的创新性，是本专利保护的新型抗菌肽。

具体实施方式

实施例1

含抗菌肽抑菌溶液的制备

根据Peptide 1所示序列，委托上海强耀生物科技有限公司合成多肽，称取64mg多肽，溶于500ml去离子水中，加入100ml甘油，20ml无水乙醇，搅拌均匀后，补充去离子水到1000ml。该抑菌溶液可以用于手部、面部的清洁，加入的甘油还可以起到保湿防冻的作用。

实施例2

含抗菌肽的漱口水制备

称取32mg多肽，溶于500ml去离子水中，加入10g木糖醇，1滴丁香精油，20ml无水乙醇，10ml甘油，搅拌均匀后，补充去离子水到1000ml。该漱口水具有丁香的清香，其中含有的抗菌肽可以有效抑制口腔中的细菌，维持口气的清新。

实施例2

含抗菌肽的药物组合物的制备(胶囊)

按照100个胶囊的用量，称取以上各辅料分别研细过筛后混合均匀，然后用等量递加法加入抗菌肽Peptide 1，充分研磨，使其分散均匀，再过80目筛，然后灌制成胶囊。

Claims (5)

1.一种抗菌肽含以下氨基酸序列的肽或其药学上可接受的盐：

FWRRIRVTPVVNPWFLQQT-NH₂。

2.权利要求1中抗菌肽的特征为含上述19个氨基酸残基的多肽，且C端羧基酰胺化。

3.一种抗菌药物，其中含有权利要求1的肽或其药学上可接受的盐及药学上可接受的载体。

4.权利要求1的肽或其药学上可接受的盐用于制备抗菌药的用途。

5.权利要求4的用途，其中抗菌药物可用于预防或治疗金黄色葡萄球菌或铜绿假单胞菌等感染疾病的药物。