CN105017384A

CN105017384A - 一种新型抗菌肽及其应用

Info

Publication number: CN105017384A
Application number: CN201510403782.8A
Authority: CN
Inventors: 陈育新; 曲相如; 陈明侠; 白石琦; 黄宜兵
Original assignee: Changchun Protelight Pharmaceutical & Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Protelight Pharmaceutical & Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2015-07-13
Filing date: 2015-07-13
Publication date: 2015-11-04
Anticipated expiration: 2035-07-13
Also published as: CN105017384B

Abstract

本发明公开了一种新型抗菌肽及其应用。其中，该新型抗菌肽具有SEQ？ID？NO：1的氨基酸序列，SEQ？ID？NO：1为Ac-Lys_D-Lys_D-Leu_D-Leu_D-Phe_D-Lys_D-Leu_D-Lys_D-Phe_D-Lys_D-Lys_D-NH₂。本发明的新型抗菌肽可以通过人工合成即多肽固相合成的方法制备，该新型抗菌肽可以用作抗微生物制剂的多肽及其相关化合物，解决日益严重的细菌、真菌抗药性问题及顽固感染对广大患者造成的痛苦。本发明的新型抗菌肽抗菌作用起效稳定，无毒性，易于人体接受，可以应用于各种顽固感染性疾病及普通感染，作为现有抗生素的优良替代药物或辅助药物。

Description

一种新型抗菌肽及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种新型抗菌肽及其应用。

背景技术

抗生素是能抵抗致病微生物的药物，是抗菌消炎药中最大的一类。抗生素是由细菌、真菌或其他微生物在生活过程中所产生的物质，具有抑制或杀灭细菌、真菌、螺旋体、支原体、衣原体等致病微生物的作用，因此作为抗感染药物。还有的抗生素可治疗恶性肿瘤。抗生素类药物广泛地应用于各种感染性疾病，其品种繁多。

目前，由于抗生素的滥用，一些顽固感染对患者造成了巨大的痛苦。细菌耐药性是细菌产生对抗生素不敏感的现象，产生原因是细菌在自身生存过程中的一种特殊表现形式。天然抗生素是细菌产生的次级代谢产物，用于抵御其他微生物，保护自身安全的化学物质。人类将细菌产生的这种物质制成抗菌药物用于杀灭感染的微生物，微生物接触到抗菌药，也会通过改变代谢途径或制造出相应的灭活物质抵抗抗菌药物。

阳离子抗菌肽可以代表一类新型的抗生素，虽然阳离子抗菌肽的作用模式尚未完全确定，但所有的阳离子两亲性抗菌肽都会与细胞膜相互作用，细胞膜是抗菌肽的主要靶点，抗菌肽分子在细胞膜上的聚集会导致细胞膜通的透性增加并使细胞膜丧失其屏障功能。微生物产生对抗菌肽的抗药性需要对微生物细胞膜脂成分的实质性改变，因此，针对这些膜活性的抗菌肽产生抗药性是几乎不可能的。

α-螺旋型和β-折叠型抗菌肽是最主要的两大类阳离子抗菌肽。β-折叠型抗菌肽包括由分子内二硫键固定的环形多肽，例如防卫素和保护素，以及具有N末端到C末端的共价键的多肽，例如短杆菌肽S和短杆菌酪肽。与β-折叠型抗菌肽不同，α-螺旋型抗菌肽是更加线性的分子，其在水介质中以无序结构存在，但它们通过与疏水细胞膜相互作用，呈两亲螺旋状态，例如蛾血素，马加宁和蜂毒肽。

抗菌肽作为一种新型的抗生素，不易使微生物产生耐药性，具有广阔的应用前景，需要不断有新的抗菌肽研制出来。

发明内容

本发明旨在提供一种新型抗菌肽及其应用，以解决细菌、真菌等日益严重的抗药性问题及顽固感染对广大患者造成的痛苦。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种新型抗菌肽。该新型抗菌肽具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列，SEQ ID NO：1为Ac-Lys_D-Lys_D-Leu_D-Leu_D-Phe_D-Lys_D-Leu_D-Lys_D-Phe_D-Lys_D-Lys_D-NH₂。

进一步地，新型抗菌肽中的一个或多个Leu_D残基由Ala_D残基，Val_D残基或Lys_D残基取代。

进一步地，新型抗菌肽中的一个或多个Phe_D残基由Ala_D残基，Leu_D残基或Lys_D残基取代。

进一步地，新型抗菌肽中的Phe_D残基由Leu_D残基取代，具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列，SEQ ID NO：2为Ac-Lys_D-Lys_D-Leu_D-Leu_D-Leu_D-Lys_D-Leu_D-Lys_D-Leu_D-Lys_D-Lys_D-NH₂。

进一步地，新型抗菌肽中的一个或多个Lys_D残基由Phe_D残基或Val_D残基取代。

进一步地，新型抗菌肽的氨基酸残基由相应的L型氨基酸残基取代形成的对映异构体。

根据本发明的另一方面，提供了一种新型抗菌肽在制备用于控制微生物感染的药物组合物中的应用，微生物为细菌和真菌。

根据本发明的再一方面，提供了一种药物组合物。该药物组合物包括有效量的上述新型抗菌肽，以及药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。

进一步地，药物组合物的剂型为注射剂、口服剂或外用剂，其中，新型抗菌肽的含量为注射剂0.01～500mg/支，口服剂0.01～500mg/例，外用剂1/10000～10％/支。

本发明的新型抗菌肽可以通过人工合成即多肽固相合成的方法制备，该新型抗菌肽可以用作抗微生物制剂的多肽及其相关化合物，解决日益严重的细菌、真菌抗药性问题及顽固感染对广大患者造成的痛苦。本发明的新型抗菌肽抗菌作用起效稳定，无毒性，易于人体接受，可以应用于各种顽固感染性疾病及普通感染，作为现有抗生素的优良替代药物或辅助药物。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1A示出了SEQ ID NO：1的氨基酸序列及螺旋轮和螺旋网示意图，其中，图1A中的A为SEQ ID NO：1的螺旋轮图，图1A中的B为SEQ ID NO：1的螺旋轮示意图；

图1B示出了SEQ ID NO：2的氨基酸序列及螺旋轮和螺旋网示意图，其中，图1B中的A为SEQ ID NO：2的螺旋轮图，图1B中的B为SEQ ID NO：2的螺旋轮示意图；

图1C示出了NK的氨基酸序列及螺旋轮和螺旋网示意图，其中，图1C中的A为NK的螺旋轮图，图1C中的B为NK的螺旋轮示意图；

图2示出了抗菌肽NK与SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2系列多肽比较的圆二色谱图；以及

图3示出了抗菌肽NK与SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2温度曲线及自我相互作用能力的比较示意图。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

目前，由于抗生素的滥用，一些顽固感染对患者造成了巨大的痛苦。针对该技术问题，本发明提供了一种新型抗菌肽。

根据本发明一种典型的实施方式，提供一种新型抗菌肽。该新型抗菌肽具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列，SEQ ID NO：1为Ac-Lys_D-Lys_D-Leu_D-Leu_D-Phe_D-Lys_D-Leu_D-Lys_D-Phe_D-Lys_D-Lys_D-NH₂(单字母序列Ac-K_D-K_D-L_D-L_D-F_D-K_D-L_D-K_D-F_D-K_D-K_D-NH₂)(序列表中仅显示了各序列的氨基酸序列，各序列的具体信息见说明书中描述)。其中，序列中下脚标表示该位置氨基酸为D-型氨基酸，Ac代表N-端乙酰化，NH₂代表C-端酰胺化。

发明人发现新型抗菌肽的一些物理特性对于其抗菌活性是至关重要的，这些特性包括：在亲水pH值下带有适宜的电荷数，同时存在疏水残基与碱性残基，将疏水残基与碱性残基分开的两亲性，可诱导的或预先形成的二级结构(α-螺旋或β-折叠)。

本发明的新型抗菌肽衍生自抗菌肽NK，NK是一种新型多肽，具有Ac-Lys_D-Lys_D-Leu_D-Leu_D-Leu_D-Lys_D-Lys_D-Leu_D-Leu_D-Lys_D-Lys_D-NH₂的序列。NK是本实验室研发设计、通过人工合成得到的一种具有显著抗菌活性的新型抗菌肽。SEQ ID NO：1在NK的基础上，将第5及9位上的Leu_D由Phe_D取代，在保持其高疏水性特点的同时，将第7位上的Lys_D及8位上的Leu_D，换成Leu_D与Lys_D，提高其抗菌活性。因为氨基酸取代改变多肽的序列结构及空间排布，降低了SEQ ID NO：1的螺旋度，从而使得其溶血活性低，最终达到优化的目的，抗菌活性增强，同时细胞毒性(溶血活性)降低。总之，本发明的SEQ ID NO：1系列新型抗菌肽较原序列NK具有更高的抗菌活性，毒性降低，抗菌特异性更强，可以用作人类药物和/或牲畜药物、兽用药物或者作为农业、食品及工业上有效的化合物试剂。

根据本发明一种典型的实施方式，新型抗菌肽中的一个或多个Leu_D残基由Ala_D残基，Val_D残基或Lys_D残基取代，上述取代形成的多肽类似物具有与亲本新型抗菌肽类似的生物活性。根据本发明一种典型的实施方式，新型抗菌肽中的一个或多个Phe_D残基由Ala_D残基，Leu_D残基或Lys_D残基取代，上述取代形成的多肽类似物具有与亲本新型抗菌肽类似的生物活性。

根据本发明一种典型的实施方式，新型抗菌肽SEQ ID NO：1疏水面第5位及第9位上的Phe_D残基由Leu_D残基取代，具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列，SEQ ID NO：2为Ac-Lys_D-Lys_D-Leu_D-Leu_D-Leu_D-Lys_D-Leu_D-Lys_D-Leu_D-Lys_D-Lys_D-NH₂(Ac-K_D-K_D-L_D-L_D-L_D-K_D- L_D-K_D-L_D-K_D-K_D-NH₂)，这种取代便是得到了特异性更强的多肽序列。表1示出了SEQ ID NO：1和2的多肽及其氨基酸序列。

表1

根据本发明一种典型的实施方式，新型抗菌肽中的一个或多个Lys_D残基由Phe_D残基或Val_D残基取代，上述取代形成的多肽类似物具有与亲本抗菌肽类似的生物活性。根据本发明一种典型的实施方式，新型抗菌肽的氨基酸残基由相应的L-型氨基酸残基取代形成的对映异构体。

根据本发明一种典型的实施方式，提供一种上述新型抗菌肽在制备用于控制微生物感染的药物组合物中的应用，微生物为细菌和真菌。该药物组合物可以应用于各种顽固感染性疾病及普通感染，作为现有抗生素的优良替代药物或辅助药物。

根据本发明一种典型的实施方式，提供一种药物组合物。该药物组合物包括有效量的上述人一种新型抗菌肽，以及药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。

在临床实践中，微生物感染包括细菌、病毒、真菌或原生动物的一种或多种病原体所引起的感染。

临床常见感染性眼病，如眼结膜炎和角膜炎等多以细菌性感染为主。大量的临床病原学分析表明，革兰氏阳性球菌，如表皮葡萄球菌，金黄色葡萄球菌和微球菌等是主要致病菌；革兰氏阴性杆菌，如铜绿假单胞菌和大肠埃希菌等次之。然而，临床检测是哪种感染的过程及确定治疗方案，相对繁琐。本发明通过一种给药方式(抗菌肽)，可治疗复杂型及耐药型病原体感染。

本发明中利用多肽固相技术从头设计，在NK序列基础上进行优化，合成得到了SEQ ID NO：1及其类似物。这些多肽具有非常强的抗菌活性，同时对人体细胞毒性很低。

本发明的多肽分子在疏水环境中呈一定的二级结构(例如螺旋结构)。发明人已经利用圆二色谱(CD)监测了抗菌肽分子在50％三氟乙醇(细胞膜疏水环境的模拟)中的α-螺旋结构。

本发明优选的抗菌肽是具有潜在的生物学活性的螺旋类似物，通过圆二色谱检测，该抗菌肽在亲水环境中(如含有100mM氯化钾，pH7的50mM磷酸缓冲液)具有很少的α-螺旋结构，而在50％三氟乙醇(细胞膜疏水环境的模拟)中的α-螺旋结构。该结构特征可能对抗菌肽活性机理有重要意义，例如：a)降低在亲水环境中形成聚合体的能力，即自我相互作用能力；b)允许抗菌肽分子更容易穿过细胞壁到达微生物的细胞膜。并且，在亲水环境中对α-螺旋结构的破坏，不会对抗菌肽(正电性)与微生物的细胞壁(负电性)的静电吸引作用产生影响；然而，特定结构的缺少可以降低细胞壁表面对抗菌肽的亲和作用(细胞壁中的疏水基团与多肽疏水面的疏水相互作用)，从而允许抗菌肽更易于通过细胞壁，进入到细胞膜的亲/疏水的临界面，在该区域抗菌肽与膜表面呈平行状态。在膜内，抗菌肽可以被细胞膜的疏水环境诱导成α-螺旋结构。由于此α-螺旋结构，发明人猜测抗菌肽的非极性面可以和细胞膜的疏水部分相互作用，而其极性面上的极性基团和带正电的基团可以和细胞膜表面上磷脂极性头部(负电性)相互作用。

当抗菌肽呈α-螺旋结构时，抗菌肽分子呈现带净正电和两亲性。例如，α-螺旋型抗菌肽在分子的一侧有非极性或疏水表面，在分子另一侧有极性或者带正电荷的表面，即两亲性分子。

通过高效液相色谱反相柱RP-HPLC的温度监控技术，在5℃～80℃的范围内，对一些抗菌肽类似物在溶液中的自我相互作用的能力进行评估。抗菌肽的自我相互作用能力是衡量其抗菌活性与溶血活性的另一个重要指标。上述抗菌肽及其组合物可以制备为任何一种医学上可用的生物载体或制剂形式给予感染疾病患者。

本发明原料药优选制剂剂量范围是0.01～500mg重量份。

制备本发明注射制剂常用辅料包括：甘露醇、乙醇、丙二醇、甘油、盐酸、醋酸、醋酸钠乳酸、氢氧化钠、枸缘酸、枸缘酸钠、酒石酸、酒石酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠碳酸氢钠、碳酸钠、亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、硫代硫酸钠、苯酚、苯甲醇、硫柳汞、氯化钠、葡萄糖、乙二胺四乙酸二钠、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素、果胶、乳糖、蔗糖、聚氧乙烯蓖麻油、聚山梨酯、聚维酮等。

制备本发明口服固体制剂常用的辅料包括：聚乙烯吡咯烷酮、滑石粉、乳糖、糊精、蔗糖、甘露醇、葡萄糖、山梨醇、果糖、赤鲜糖、氯化钠、淀粉、微晶纤维素、磷酸二氢钙、碳酸镁、碳酸钙、硫酸钙、硅酸铝、硅酸钙、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、微晶纤维素、乙基纤维素、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚维酮、明胶、阿拉伯胶、西黄耆胶、海藻酸钠、琼脂、海藻酸、海藻酸钠、羟丙基淀粉、羧甲基淀粉钠、羧甲基纤维素钙、硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸、微粉硅胶、聚乙二醇、十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸镁、聚氧乙烯单硬脂酸酯、聚氧乙烯月桂醇醚等。

制备本发明外用制剂所述常用辅料包括：甘露醇、聚山梨酯-80、硬脂酸聚烃氧酯、三乙醇胺、聚乙烯吡咯烷酮、碳酸氢钠、氯化钠、葡萄糖、硼酸、硼砂、凡士林、石蜡、液体石蜡、羊毛脂、蜂蜡、鲸蜡、二甲基硅油、硬脂酸、石蜡、十八醇、甘油、丙二醇、山梨醇、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、海藻酸钠、海藻酸、皂土、卡波姆、果胶、没食子酸烷酯、丁羟基茴香醚、丁羟基甲苯、抗坏血酸、异抗坏血酸、亚硫酸盐、枸橼酸、酒石酸、乙二胺四乙酸二钠、巯基二丙酸、乙醇、异丙醇、氯丁醇、三氯叔丁醇、苯基-对-氯苯丙二醇、苯氧乙醇、苯甲酸、脱氢乙酸、丙酸、山梨酸、肉桂酸、茴香醚、香茅醛、丁子香酚、香兰酸酯、醋酸苯汞、硼酸苯汞、硝酸苯汞、苯酚、苯甲酚、麝香草酚、对氯邻甲苯酚、对氯-间二甲苯酚、煤酚、水杨酸、对羟基苯甲酸(乙酸、丙酸、丁酸)酯、苯扎氯铵、溴化烷基三甲基铵、可可豆酯、半合成椰油酯、半合成棕榈油脂、硬脂酸丙二醇酯、聚乙二醇、聚氧乙烯、单硬脂酸酯类、泊洛沙姆、硬脂酸、氢化蓖麻油、单硬脂酸甘油酯、硬脂酸铝等。

制备本发明口服液体制剂辅料包括：乙醇、羟苯乙酯、羟苯甲酯、苯甲酸钠、山梨酸、蜂蜜、蔗糖、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、抗坏血酸、硫脲、乙二胺四乙酸二钠、磷酸、枸橼酸、枸橼酸盐、酒石酸、酒石酸盐、甘油、乳糖、聚氧乙烯脂肪酸酯、碘化钾、醋酸钠、丙二醇、聚乙二醇、苯甲醇、对羟基苯甲酸酯、苯扎溴铵、邻苯基苯酚、桉叶油、桂皮油、薄荷油、甘露醇、阿司帕坦、糖精钠、天冬甜精、蛋白糖、香精、阿拉伯胶、羧甲基纤维素钠、琼脂、明胶、甲基纤维素、碳酸氢钠、色素、阿拉伯胶、西黄耆胶、桃胶、海藻酸钠、琼脂、淀粉浆、硅皂土、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟甲基纤维素、卡波普、聚维酮、葡聚糖、单硬脂酸铝、聚山梨酯类、聚氧乙烯蓖麻油类、泊洛沙姆、硬脂酸钠、硬脂酸钾、油酸钠、硬脂酸钙、十二烷基硫酸钠、十六烷基硫酸化蓖麻油、单甘油脂肪酸酯、三甘油脂肪酸酯、聚甘油硬脂酸酯、蔗糖单月桂酸酯、脂肪酸山梨坦、聚山梨坦、氢氧化钙、氢氧化锌、鲸蜡醇、蜂蜡、单硬脂酸甘油脂、硬脂酸、硬脂醇等。

上述原料组分可与一定比例的常用药用辅料相配，按照本领域常规方法可制成包含注射剂、片剂、散剂、丸剂、乳剂、混悬剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、软膏剂、凝胶剂、滴眼剂、贴膜剂、栓剂、喷雾剂、气雾剂、涂膜剂、洗剂中的一种。

优选的，药物组合物的剂型为注射剂、口服剂或外用剂，其中，抗菌肽的含量为注射剂0.01～500mg/支，口服剂0.01～500mg/例，外用剂1/10000～10％/支。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

实施例1

衍生自SEQ ID NO：1的相关抗菌肽序列信息

多肽SEQ ID NO：1是由11个氨基酸残基所组成，序列为Ac-Lys_D-Lys_D-Leu_D-Leu_D-Phe_D-Lys_D-Leu_D-Lys_D-Phe_D-Lys_D-Lys_D-NH₂，衍生于NK序列的抗菌肽。SEQ ID NO：1为具有一个极性表面和一个非极性表面的两亲性α-螺旋型抗菌肽，在本发明中作为模板多肽。它的极性表面由6个亲水氨基酸(赖氨酸)组成。相比之下，其非极性表面含有5个疏水氨基酸(3个亮氨酸，2个苯丙氨酸)组成。

多肽表面的疏水氨基酸通过疏水相互作用，构成多肽整体疏水面。对组成NK的氨基酸残基特别是疏水氨基酸进行重组(可以是将非极性表面上疏水氨基酸残基进行重组，或者将极性表面上的亲水氨基酸残基进行重组，或者在极性表面及非极性表面进行氨基酸残基的重组而不实质改变多肽分子的两亲性的组合)组成的多肽仍然具有很好的生物学活性，SEQ ID NO：2为部分序列信息(选取了任意2个氨基酸进行位点互换)，这种重组其活性比NK抗菌活性更优。SEQ ID NO：10为上述多肽的对映异构体。

SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4分别是将SEQ ID NO：1氨基酸残基重组后形成的多肽类似物。在SEQ ID NO：1多肽的不同位点进行多点取代形成的多肽能够依然保持活性。对于多点取代形成的特定多肽，这样的在非极性面中心的多点取代至少会与单点取代具有同样的效果。考虑到多肽序列的氨基酸组成，特别是疏水氨基酸在生物活性中的重要性，认为与SEQ ID NO：1同样具有很好的生物学活性。SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12 为上述三条多肽的对映异构体。

通过多种不同方式取代其中某些氨基酸，筛选得到了系列SEQ ID NO：1多肽类似物。图1A、图1B和图1C表明NK及本发明中优选的多肽SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2的氨基酸序列及螺旋轮图形，其中灰色部分的氨基酸表示位于螺旋的非极性/疏水表面的疏水氨基酸，没有底色部分的氨基酸表示位于极性/亲水表面上的亲水氨基酸。Ac指N端乙酰化，NH₂指C端酰胺化。

发明人设计了其对映异构体多肽SEQ ID NO：1/SEQ ID NO：2主要由对应的D-型氨基酸组成。大量研究工作表明，SEQ ID NO：1/SEQ ID NO：2相对NK在药效与毒性方面存在明显的优势。

SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8为多点取代SEQ ID NO：1形成的多肽类似物。在发明多肽的不同位点进行多点取代形成的多肽能够依然保持活性。对于多点取代形成的特定多肽，这样的在非极性面中心的多点取代至少会与单点取代具有同样或更优的效果。SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16为上述四条多肽的对映异构体。部分多肽序列信息汇总表2。

表2

a.上面一组(1-9)9种抗菌肽均为全D-型氨基酸

b.下面一组(10-17)均为L型对映异构体，9种抗菌肽均为全L-型氨基酸

实施例2

相似的疏水氨基酸取代形成的多肽类似物

本发明中更多的多肽是通过单一位点相似的疏水性氨基酸残基的取代来形成的多肽类似物。采用具有类似疏水性侧链的氨基酸来进行单个疏水性氨基酸的取代通常会产生具有生物学活性的多肽，见表3(可用于同源氨基酸取代的氨基酸残基)。

表3

SEQ ID NO：1中的残基	取代的氨基酸残基
		Leu	Ala，Val，Lys
Phe	Leu，Ala，Lys
		Lys	Phe，Val

SEQ ID NO：1及相关抗菌肽制备及相关参数检测

本发明中的多肽全部采用多肽固相合成方法，使用N-芴甲氧羰基保护的方法合成。需要指出的是，从技术角度来说，本发明中的多肽可以采用其它的合成策略与合成方法进行合成和生产。合成的多肽粗产物通过制备型反相高效液相色谱进行分离纯化，实验条件如下：Zorbax300 SB-C₈柱(250×9.4mm内径；6.5μm粒径，孔径；安捷伦公司)，AB线性洗脱梯度(0.1％乙腈/min)，洗脱速度为2mL/min，其中，A流动相为含有0.1％TFA的水溶液，B流动相为含有0.1％TFA的乙腈。制备得到的纯品肽采用分析型反相高效液相色谱RP-HPLC按照下述方法进行分析。多肽产物的进一步鉴定采用质谱方法和氨基酸组分分析方法。

多肽的RP-HPLC分析--采用安捷伦1200系列液相色谱进行多肽产物的分析。实验条件如下：Zorbax 300SB-C₈柱(150×4.6内径；5μm粒径；孔径)，AB线性洗脱梯度(1％乙腈/min)，洗脱速度为1mL/min。其中，A流动相为含有0.1％TFA的水溶液，B流动相为含有0.1％TFA的乙腈。

螺旋结构的表征--利用Jasco J-720圆二色谱(CD)仪，在25℃亲水条件下(50mM KH₂PO₄/K₂HPO₄/100mM KCl，pH 7)和含有50％α-螺旋诱导试剂2，2，2-三氟乙醇(TFE)的溶液(50mM KH₂PO₄/K₂HPO₄/100mM KCL，pH7缓冲溶液50％TFE)。分别测定抗菌肽的平均残基摩尔椭圆率，将750μM的多肽母液经过10倍稀释以后加入到0.02cm石英测试管中，通过190到250nm的扫描得到产物多肽的椭圆度数值。数值越大，表示多肽螺旋程度越大。

为了测定不同环境下的多肽二级结构，我们在亲水条件(100mM KCl，50mM KH₂PO₄/K₂HPO₄，pH 7，叫做KP缓冲液)以及50％三氟乙醇(TFE)中(模拟细胞膜的疏水环境条件下)利用圆二色谱仪测定SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：10的圆二色性。SEQ ID NO：1等多肽的圆二图谱见图2。如图所示，在含有50％TFE诱导下，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2两个序列多肽均充分折叠成α-螺旋结构，与NK序列多肽相比，SEQ IDNO：1和SEQ IDNO：2螺旋度略有降低。

RP-HPLC的保留行为是判断多肽疏水性的常用方法。众所周知，由多肽的二级结构而产生的疏水结合域会影响多肽与反相柱固定相的相互结合，这种现象在两亲性的多肽中尤为明显。由于这种优先结合域，两亲性的α-螺旋肽会比与其具有同样氨基酸组成的非两亲多肽保留时间更长。另外，RP-HPLC的色谱条件(疏水固定相，非极性洗脱剂)也可以在潜在的螺旋多肽中以与螺旋诱导溶剂三氟乙醇相似的方式诱导并稳定螺旋结构。这样一来由不同氨基酸取代所带来的疏水性的变化可以直接反应在RP-HPLC的保留时间上。

进一步利用高效液相色谱反相柱温度监控技术来确定SEQ ID NO：1及相关肽的自我相互作用的能力，自我相互作用是通过两亲性多肽的α-螺旋的非极性表面相互作用而实现的。利用0.1％TFA乙腈水溶液和色谱反相柱的疏水条件(疏水的固定相和在流动相中的疏水有机试剂)，反相柱的疏水环境也可以诱导α-螺旋结构。RP-HPLC温度监控技术自发明至今已经应用在许多不同类型的分子上，其中包括环状β-折叠多肽，单体α-螺旋肽和二聚体α-螺旋肽及形成超螺旋结构的二聚体螺旋肽。多肽在色谱反相柱上的洗脱主要靠吸附和解吸附机理，即使一个多肽强烈结合在疏水固定相上，当流动相中乙腈的浓度达到一定高度时该多肽还是会在流动相与固定相之间进行分配。总体来说，机理基于4种假设：1)低温时有能力形成二聚体的两亲性α-螺旋分子，它一定会在反相色谱的水溶液(疏水性，非极性表面)中形成二聚体；2)在高温时由于二聚体被破坏，单体-二聚体的平衡倾向于单体；3)温度足够高时水溶液中只有单体存在；4)多肽只能以单体的形式结合到色谱柱固定相上，即二聚体只能存在溶液中，只有已被破坏的二聚体才能与色谱柱固定相相结合。

在利用高效液相色谱反相柱温度监控来衡量多肽聚合能力时，一个呈无序结构的多肽(多肽C)被作为对照多肽。这个序列为Ac-ELEKGGLEGEKGGKELEK-NH₂的18个残基多肽，即使在低温5℃和强α-螺旋诱导剂50％三氟乙醇(TFE)存在的条件下，依然呈无序结构。由于肽C在水相和疏水介质中均呈单体无序状态，它由5℃到80℃内保留行为的变化仅仅体现了温度对多肽保留行为的影响，即肽保留时间随着温度的升高保留时间呈线性降低，这是由于在固定相和流动相之间高温所引起的更高的溶质扩散性和增强的质量转移。在5℃多肽呈聚合体状态存在，而在80℃由于高温使多肽变性，聚合体分解成单体。因此以多肽C的保留时间做标准对照后，多肽保留行为仅代表多肽自我相互作用能力，自我相互作用能力与多肽的疏水性直接相关，除了由于上述的温度作用以外，升高温度时α-螺旋结构被破坏，多肽的无序结构增多，保留时间下降。

图3示出了SEQ ID NO：1及其类似物于RP-HPLC中的保留时间变化曲线。P_A表示在RP-HPLC控温监测中，每种肽的解离常数。在温度变化范围内，用多肽最大的保留时间差值即((t_R ^t-t_R ⁵螺旋肽)-(t_R ^t-t_R ⁵对照肽C))来表示，其中，(t_R ^t-t_R ⁵)表示多肽在特定温度(t)条件下的保留时间与其在5℃条件下的保留时间的差值。多肽C是无序结构的对照多肽，其在RP-HPLC的保留行为可以反映因温度变化导致RP-HPLC体系的变化。用于扣除因温度变化引起的色谱条件对多肽保留时间的影响，从而仅反映多肽在不同温度下的物理性质变化。

图3表示随温度变化(5℃～80℃)多肽在RP-HPLC中的保留时间变化曲线。如上所述多肽的自我相互作用是与温度相关的。多肽在PR-HPLC中的分配呈聚合体-单体间互相转化的动态平衡中，低温下多肽倾向于以二聚体或多聚体形式存在(自我相互作用)。通常自我相互作用是通过多肽疏水面的疏水相互作用实现的，这样造成聚合体与色谱柱固定相的结合能力变弱，因此保留时间相对低。随着温度的升高，聚合体一单体相互转化的平衡向更易于形成单体的方向移动。高浓度的单体在色谱柱上的分配增加了多肽与色谱柱的结合机率，所以保留时间相对增加。值得注意的是升高温度同时也引入其它的作用，如降低流动相粘度和增加在流动相与固定相之间的质量转移等。正如无序结构对照肽C的保留时间所示，随着温度的增加，其保留时间会呈线性的降低。相反地，对于聚合的多肽而言，升高温度会破坏聚合体而转换成单体，单体结合色谱柱固定相的能力强，这样保留时间会达到最大值。在这一临界温度之上，我们可以观察到随着温度继续升高多肽的保留时间开始下降。这主要是由于降低流动相粘度和增加质量转移以及高温造成多肽分子变性所引起的。RP-HPLC的温度监控技术引入的无序结构的对照多肽，其保留行为用来反映温度变化过程中，色谱柱条件的变化状况，从而去除因色谱条件变化对多肽保留行为的影响。

本发明中的SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2两序列多肽在水溶液中表现出不同的自我相互作用能力。图内保留时间差值变化((多肽的t_R ^t-t_R ⁵)-(多肽C的t_R ^t-t_R ⁵))的最大数值被定义为多肽自我相互作用系数(P_A)，用来量化多肽在水溶液中形成聚合体的能力。由图3可以看出，SEQ ID NO：1的自我相互作用能力高于SEQ ID NO：2序列，但与NK相比，都有一定程度的降低，表明SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2多肽在保持一定疏水性的同时，降低了自我相互作用的能力，有利于降低其溶血毒性，提高其抗菌特异性。

实施例3

SEQ ID NO：1系列抗菌肽抗细菌药物敏感性试验

选择实验室保存标准菌株和临床分离耐药菌株20株，采用平皿二倍稀释法和Denlay多点接种器进行药敏实验，试验菌用营养肉汤及脑心浸液增菌。药物溶解后用MH肉汤二倍稀释成各种所需浓度，分别加适量到平皿中。平皿中培养基凝固后用多点接种器接种试验菌(10⁴CFU/点)，置35℃恒温培养18小时后观察结果。无菌生长的平皿中所含药物最小的浓度即为最低抑菌浓度(MIC)。大量研究工作表明，对映异构体多肽在各种理化性质及生物活性方面一致，因而在本实施例中，仅选列了其中部分代表性多肽序列的实验数据。SEQ ID NO：1系列样品对20株细菌的抗菌作用。

表4 SEQIDNO：1系列代表多肽最低抑菌浓度MIC(μg/ml)

上述结果表明，经过筛选后的SEQ ID NO：1系列多肽，抗菌活性明显增强，且对于绝大多数常见敏感细菌，SEQ ID NO：1系列抗菌肽杀菌效果与NK比较有很大优势。

实施例4：SEQ ID NO：1系列多肽溶血活性及治疗指数比较

如表所示，本系列多肽溶血活性，因设计上有意改变疏水氨基酸成分，或者以D-型氨基酸取代L-型氨基酸，从而达到降低新改造序列溶血活性的目的。

表5 待测多肽溶血活性(MHC)检测比较

实验结果表明，经过上述序列改造，SEQ ID NO：1与SEQ ID NO：2相对NK多肽溶血活性均得到明显减低。

为了更好地评价本系列多肽的生物学活性，采用治疗指数这个被广泛应用的代表抗菌药物特异性的参数来进行比较。治疗指数由MHC(溶血活性)和MIC(抗菌活性)的比值计算而来，数值越大，表示多肽抗菌特异性越强。如表6所示，本系列多肽经过对特点位点精心设计改造，治疗指数明显变大，平均增加倍数在10倍以上，SEQ ID NO：1对于金葡菌ATCC25923治疗指数可增至NK的170.72倍，对绿脓杆菌H188其治疗指数可增至128.04倍，SEQ ID NO：2对于金葡菌ATCC 25923治疗指数最高可增至NK的256.08倍，意味着抗菌特异性有着非常明显的增加。

表6 SEQ IDNO：1系列多肽治疗指数比较

*分隔线前数据代表多肽治疗指数，由MHC与MIC的比值计算得出；

分隔线后数据为该多肽与NK比较治疗指数增加的倍数

实施例5：SEQ ID NO：1与SEQ ID NO：2皮肤外用剂抗感染试验

金葡菌ATCC25923和铜绿假单胞菌ATCC27853菌液稀释至5×10⁶CFU/ml，备用。ICR小鼠，按体重随机分组，每组10只。分为感染阴性对照组，百多邦阳性对照组，5mg/ml浓度外用剂组，1mg/ml浓度外用剂和空白基质对照组。将小鼠背部脱毛后，以60目砂纸打磨至渗血。皮下注射浓度为5×10⁶CFU/ml的菌液0.1ml。除感染阴性对照组外，其他各组均对应给以不同剂量的外用剂，剂量为0.1ml，每天早晚各外用1次，连续4天。末次给药后次日无菌取各组动物感染部位的皮肤，检测活菌并计数统计，检测结果见表7。

表7 SEQ ID NO：1与SEQ ID NO：2外用剂对皮肤感染影响(CFU/皿n＝10)

上述结果显示SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2外用剂可有效抑制金葡菌及铜绿假单胞菌ATCC27853引起的皮肤感染，且抑菌率均可以提高至95％以上，明显优于NK(其高低浓度对上述两种致病菌的抑菌率均＜50％)。

实施例6：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2滴眼剂对眼部刺激试验

新西兰种大耳兔，雌雄各半。取裂隙灯显微镜检查眼睛正常的家兔每组6只，在每只兔的左右眼结膜囊内分别滴入0.1ml的抗菌肽和辅料，连续滴药7天，每天滴4次，观察眼角膜、虹膜、结膜的刺激反应情况，并将每只兔子的眼角膜、虹膜、结膜的刺激反应的分值相加，然后将5只兔子的总积分值相加除以动物数，得出各药物对眼刺激性的最后分值，判定其刺激程度。

表8眼部刺激反应评分

眼刺激反应	分值
		角膜混浊(以最致密部位为准)
无混浊	0
		散在或弥漫性混浊，虹膜清晰可见	1
半透明区易分辨，虹膜模糊不清	2
		出现灰白色半透明区，虹膜细节不清，瞳孔大小勉强看清	3
角膜不透明，由于混浊，虹膜无法辨认	4
		虹膜
正常	0
		皱褶明显加深，充血、肿胀、角膜周围有轻度充血、瞳孔对光仍有反应	1
出血、肉眼可见坏死、对光无反应(或出现一种反应)	2
		结膜
A、充血(指脸结膜、球结膜部位)
		血管正常	0
血管充血呈鲜红色	1
		血管充血呈深红色、血管不易分辨	2
弥漫性充血呈紫红色	3
		B、水肿
无水肿	0
		轻度水肿(包括瞬膜)	1
明显水肿，伴有部分眼睑外翻	2
		水肿至眼睑近半闭合	3

水肿至眼睑超过半闭合	4
		C、分泌物
无分泌物	0
		少量分泌物	1
分泌物使眼睑和睫毛潮湿或粘着	2
		分泌物使整个眼区潮湿或粘着	3
总积分	16

表9 眼刺激性评价标准

刺激程度	积分
		无刺激性	0-3
轻度刺激性	4-8
		中度刺激性	9-12
强度刺激性	13-16

表10 抗菌肽SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2滴眼剂及其辅料对眼刺激反应评分结果

*分值是指在各观察时间点中记录的最高分值。

结论：抗菌肽SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2外用剂及辅料对家兔刺激反应平均积分均小于2，即为无明显眼部刺激性。

实施例7：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2滴眼剂对细菌性角膜炎疗效试验

新西兰种大耳兔，雌雄各半。取裂隙灯显微镜检查眼睛正常的家兔每组6只，开始参照角膜环钻法造模(正常对照组除外)。实验前称重，用0.75％盐酸布比卡因注射液滴眼2-3滴，轻轻按摩片刻，用环钻压迫角膜无反应，先后用5mm和3mm直径角膜环钻轻轻按压角膜顺时针旋转，造成环形创伤。拉开眼睑呈杯形，5ml注射器吸取金黄色葡萄球菌菌液滴于兔眼。金黄色葡萄球菌感染组在第一次感染后1天出现角膜炎症状：畏光、流泪、眼睑红肿，分泌物增多，角膜散在或弥漫性混浊，球结膜充血并红肿。每天进行观察，综合多种症状进行评分，评分标准见表11。

表11细菌性角膜炎动物模型症状分级及评分标准

眼刺激反应	分值
		角膜混浊(以最致密部位为准)
无混浊	0
		散在或弥漫性混浊，虹膜清晰可见	1
半透明区易分辨，虹膜模糊不清	2
		出现灰白色半透明区，虹膜细节不清，瞳孔大小勉强看清	3
角膜不透明，由于混浊，虹膜无法辨认	4
		虹膜
正常	0
		皱褶明显加深，充血、肿胀、角膜周围有轻度充血、瞳孔对光仍有反应	1
出血、肉眼可见坏死、对光无反应(或出现一种反应)	2
		结膜
A、充血(指脸结膜、球结膜部位)
		血管正常	0
血管充血呈鲜红色	1
		血管充血呈深红色、血管不易分辨	2
弥漫性充血呈紫红色	3
		B、水肿
无水肿	0
		轻度水肿(包括瞬膜)	1
明显水肿，伴有部分眼睑外翻	2
		水肿至眼睑近半闭合	3
水肿至眼睑超过半闭合	4
		C、分泌物
无分泌物	0
		少量分泌物	1
分泌物使眼睑和睫毛潮湿或粘着	2
		分泌物使整个眼区潮湿或粘着	3
总积分	16

将症状评分累加，0-4分为无角膜炎症状，5-7分轻度角膜炎，8-12分中度角膜炎，13-16重度角膜炎。

症状观察疗效结果每日观察兔角膜炎症状，记录评分，评分结果见表。用t检验进行统计学分析，可见与模型组比较，SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2均有显著性差异，且SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2效果明显优于NK。

表12 金葡菌感染家兔角膜炎各组症状每日评分表(n＝6)

与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01

实验结果表明，SEQ ID NO：1与SEQ ID NO：2滴眼剂对试验动物家兔细菌性角膜炎具有一定的治疗效果。

疗效标准：

疗效率＝(1-治疗后积分/治疗前积分)×100％

显效：全部症状消失或主要症状体征消失，疗效率≥60％

有效：主要症状体征基本消失，疗效率≥30％

无效：各方面症状体征无改善，疗效率＜30％

表13 抗菌肽SEQ ID NO：1与SEQ ID NO：2滴眼剂对金黄色葡萄球菌感染的角膜炎治疗第十天的疗效率(％)

表14 抗菌肽SEQ ID NO：1与SEQ ID NO：2滴眼剂对金黄色葡萄球菌感染的角膜炎治疗效果

试验结果表明，SEQ ID NO：1滴眼液低、中、高浓度组的显效率为83.3％、100％、100％，有效率均为100％。SEQ IDNO：2滴眼液低、中、高浓度组的显效率为83.3％、100％、100％，有效率均为100％。NK的低、中、高浓度组的显效率为667％、667％、83.3％，有效率均为100％。说明抗菌肽SEQ ID NO：1与SEQ ID NO：2滴眼剂对金黄色葡萄球菌引起的角膜炎具有很好的治疗效果。并且SEQ ID NO：1与SEQ ID NO：2滴眼药治疗效果明显优于其初始化合物NK。

实施例8：SEQ ID NO：1注射剂对细菌全身感染动物的治疗试验

金黄色葡萄球菌ATCC29213和铜绿假单胞菌ATCC27853菌液稀释至5×10⁷CFU/ml，备用。ICR小鼠按体重随机分组，每组10只，分为空白对照组，阴性对照组，SEQ IDNO：1/SEQ ID NO：2/NK高、中、低剂量组。除空白对照组外，每只小鼠腹腔注射菌液0.2ml造模。造模后立即按体重给药，除空白对照组和感染阴性对照组外，其他各组均尾静脉注射不同剂量的各注射剂，2次/日，连续给药5天，观察14天。观察动物死亡情况，记录动物存活时间。SEQ ID NO：1注射剂对全身感染小鼠存活时间影响试验结果详见表15-16。

表15 SEQ ID NO：1系列注射剂对金黄色葡萄球菌全身感染小鼠存活时间的影响(n＝10)

注：与阴性对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01

表16 SEQ IDNO：1系列注射剂对铜绿假单胞菌全身感染小鼠存活时间的影响(n＝10)

注：与阴性对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01

由表15及表16可知，直至试验结束，SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2高、中、低剂量组与阴性对照组比较小白鼠平均存活天数相比差异均极显著(p＜0.01)，NK试药组1mg/kg剂量组虽然也可以有效延长感染动物生存时间，但SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2高、中、低剂量的抗感染作用明显优于NK组，感染动物存活时间比NK组延长2-3倍。

实施例9 SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2口服剂对沙门菌感染小鼠的治疗作用

沙门菌(ZN55)菌液稀释至1.5×10⁶CFU/ml备用。4周龄的ICR健康小鼠按每组6只，分为空白对照组、阴性对照组、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和NK高中低剂量组，高中低剂量分别为1mg/kg，0.3mg/kg，0.1mg/kg。除空白对照组外，每组每日一次灌服0.3ml/次沙门菌(1.5×10⁶CFU/ml)，连续4d。除空白对照组和阴性对照组外，其他各组均灌服不同剂量各口服剂0.3ml/(次.d)6天。逼迫法采集小鼠粪便并用无菌生理盐水混匀涂于不同选择培养基上，置于37℃温箱培养24h，根据数据算出每克粪便含有不同种细菌的数量。小鼠粪便菌群检测结果如下表：

表17 SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和NK治疗组对小鼠粪便菌群检测结果(n＝6)

注：菌株数目单位为LgCFU/g；与阴性对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01

试验结果表明，SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2高、中、低剂量均能够调节动物机体肠道菌群数量，使肠道菌群数量达到平衡，且可以有效的抑制肠道不良肠杆菌的生长，防止肠道疾病发生。

实施例10 25mg/支滴眼剂(5ml/支)

处方

SEQ IDNO：1系列抗菌肽	5g
		乙二胺四乙酸二钠	0.2g
羟苯乙酯	0.15g
		羟苯甲酯	0.1g
注射用水	994g
		制成	1000g

将处方量20％的注射用水加热至60℃，加入处方量的羟苯乙酯和羟苯甲酯，搅拌至溶解后，放至室温。另取处方量原料和乙二胺四乙酸二钠加入处方量60％的注射用水溶解，搅拌至均匀，与羟苯乙酯和羟苯甲酯溶液混合，加剩余注射用水补充至全量，搅拌至均匀。微孔滤膜过滤除菌，检验合格后灌装。得成品

实施例11 5mg/支水针注射剂(5ml：5mg)

处方

SEQ ID NO：1系列抗菌肽	5g
		乙二胺四乙酸二钠	3.5g
注射用水	5000g
		制成	1000支

称取处方量总体积的60％注射用水，然后加入处方量SEQ ID NO：1系列抗菌肽，搅拌使其全部溶解。加0.1％的针用活性炭加热至50℃，搅拌吸附30分钟，滤过脱炭，加用注射用水至总体积。除菌过滤，中间体检验合格后灌装。将灌装完成的半成品放入灭菌柜内。设定灭菌温度为105℃，时间为30分钟开始灭菌。灭菌后的产品灯检合格包装，得成品

实施例12 20mg/支冻干粉针注射剂

处方

SEQ ID NO：1系列抗菌肽	20g
		甘露醇	300g
注射用水	2000g
		制成	1000支

量取配方量60％注射用水，加配方量的甘露醇，搅拌溶解，然后加入处方量的SEQ ID NO：1系列抗菌肽，搅拌溶解。加0.05％的针用活性碳搅匀，搅拌吸附30分钟，脱碳过滤。用注射用水补足体积。然后除菌过滤，检查可见异物，合格后进灌装工序。灌装完成后，进行冻干工序(速冻法)。冻干结束后，在真空状态下启动加塞装置，把塞压严，然后出箱。待制品全部取出后化霜。轧盖。目检合格后包装

实施例13 2mg/片

处方

SEQ ID NO：1系列抗菌肽	2g
		微晶纤维素	75g
低取代-羟丙基纤维素	75g
		羧甲基淀粉钠	40g
聚乙烯吡咯烷酮	适量
		乙醇	适量
硬脂酸镁	1g
		制成	1000片

辅料微晶纤维素75g、低取代-羟丙基纤维素75g，羧甲基淀粉钠30g混合均匀。等量递增法与SEQ ID NO：1系列抗菌肽混合至均匀。以5％聚乙烯吡咯烷酮50％乙醇溶液为黏合剂，采用流化喷雾制粒技术制粒，外加羧甲基淀粉钠10g，硬脂酸镁1g，混合均匀，压片，即得。

实施例14 15mg/片

处方

SEQ ID NO：1系列抗菌肽	15g
		交联聚乙烯吡咯烷酮	60g
羧甲基淀粉钠	110g
		低取代羟丙纤维素	110g
聚维酮	10g
		微晶纤维素	80g
微粉硅胶	5g
		滑石粉	8g
硬脂酸镁	2g
		乙醇	适量
制成	1000片

原料和辅料分别过100目筛，将交联聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙纤维素、微晶纤维素混合均匀。等量递增法与SEQ ID NO：1系列抗菌肽混合至均匀。以聚乙烯吡咯烷酮50％乙醇溶液为黏合剂制备合适软材。16-24目尼龙筛网制粒，制成的颗粒于40-65℃干燥。干颗粒过16-24目筛网整粒，外加滑石粉和硬脂酸镁，混合均匀后压片，得成品。

实施例15 10mg/粒胶囊(0.3g/粒)

处方

SEQ ID NO：1系列抗菌肽	10g
		淀粉	100g
微粉硅胶	90g
		羧甲基纤维素钠	90g
滑石粉	7g
		硬脂酸镁	3g
制成	1000粒

原辅料分别过100目筛。取淀粉10克制成12％的淀粉糊，另取处方中除滑石粉和硬脂酸镁外的原辅料混合均匀，加淀粉糊制粒，过40目筛网。55-60℃干燥。干颗粒40目筛网整粒，加滑石粉和硬脂酸镁混合均匀，装入胶囊，得成品。

实施例16 20mg/包颗粒剂(3g/包)

处方

SEQ ID NO：1系列抗菌肽	20g
		乳糖	2700g
糊精	180g
		乙醇	适量
制成	1000包

乳糖粉碎过100目筛。糊精和SEQ ID NO：1系列抗菌肽分别过100目筛。将乳糖和糊精等量递增法混合均匀后，继续采用等量递增法将原料混合至均匀。以40％乙醇作为粘合剂制粒，软材过24目筛网。55-60℃干燥。干燥后18-24目筛网整粒，颗粒分装，得成品。

实施例17 10mg/支口服液制剂(10g/支)

处方

SEQ ID NO：1系列抗菌肽	10g
		蔗糖	2000g
羟苯乙酯	100g
		注射用水	10000g
制成	1000支

量取处方量50％的注射用水加蔗糖使其溶解，另量取处方量20％的注射用水将SEQ ID NO：1系列抗菌肽溶解，与蔗糖水溶液混合均匀。量取处方量10％的注射用水加热至60℃，加入羟苯乙酯使溶解，搅拌均匀。与混合好的蔗糖水溶液中。混合均匀。采用0.2um微孔滤膜过滤除菌，检验合格后灌装，得成品。

实施例18 0.5mg/克软膏剂(5g/支)

处方

SEQ ID NO：1系列抗菌肽	0.1g
		聚乙二醇4000	480g
聚乙二醇400	320g
		氮酮	10g
吐温80	15g
		注射用水	175g
制成	1000g

将聚乙二醇4000和聚乙二醇400水浴加热到60℃，搅拌均匀。氮酮和吐温80混合均匀，加入聚乙二醇混合溶液中，搅拌均匀。放置室温。SEQ ID NO：1系列抗菌肽用注射用水溶解后，与聚乙二醇混合物等量递增法搅拌至均匀，检验合格后灌装，得成品。

实施例19 20mg/支乳膏(5g/支)

处方

SEQ ID NO：1系列抗菌肽	4g
		硬脂酸甘油酯	35g
硬脂酸	120g
		液状石蜡	60g
白凡士林	10g
		羊毛脂	50g
三乙醇胺	4g
		羟苯乙酯	1g
蒸馏水	适量
		制成	1000g

将处方量油相成分(即硬脂酸甘油酯，硬脂酸，液状石蜡，凡士林，羊毛脂)加热至80℃保温放置。原料加入水相成分(三乙醇胺、羟苯乙酯溶于蒸馏水)中，搅拌均匀分后也加热至80℃。将熔融的油相加入水相中，搅拌，制成乳剂。放置室温后灌装。得成品。

实施例20 30mg/支凝胶剂(10g/支)

处方

SEQ ID NO：1系列抗菌肽	3g
		卡波姆940	10g
丙二醇	200g
		丙三醇	100g
三乙醇胺	适量
		注射用水	680g
制成	1000g

取处方量丙三醇、丙二醇和卡波姆940，充分乳化使润湿并加注射用水300g使其溶胀，搅拌使其混合均匀。加入三乙醇胺使其成为凝胶状态。另取处方量原料加剩余注射用水使其溶解，加入凝胶基质中，搅拌至均匀，检验合格后灌装，得成品。

实施例21 50mg/支喷雾剂(20g/支)

处方

SEQ ID NO：1系列抗菌肽	2.5g
		氮酮	1 g
吐温80	1.5g
		羟苯乙酯	1g
注射用水	994g
		制成	1000g

取处方量60％的注射用水溶解原料，搅拌至均匀。取处方量10％的注射用水加热至60℃，加入羟苯乙酯溶解。将原料水溶液和羟苯乙酯水溶液混合，加入混合均匀的处方量氮酮和吐温80，加水至1000g检验合格后灌装入喷雾瓶中，得成品。

实施例22 30mg/贴剂

处方

SEQ ID NO：1系列抗菌肽	30g
		聚丙烯酸	30g
甘油	120g
		甘羟铝	1.5g
乙二胺四乙酸二钠	0.15g
		酒石酸	1 g
注射用水	220g
		制成	1000贴

取处方量的聚丙烯酸，加入甘油、甘羟铝和乙二胺四乙酸二钠充分分散均匀，作为A。另取原料加注射用水和酒石酸搅拌溶解后，缓慢加入A中，边加边搅拌，使其交联。涂布于

背衬层，覆盖保护膜后，室温固化24小时。冲切得成品。

实施例23 20mg/膜剂

处方

SEQ ID NO：1系列抗菌肽

10g

聚乙烯醇	300g
		羧甲基纤维素钠	110g
甘油	80g
		注射用水	510g
制成	1000g

取处方量聚乙烯醇、羧甲基纤维素钠溶于水，加入原料，加热至50～70℃使其完全融化，加入甘油，搅拌均匀，加热脱气泡，待冷却后涂在玻璃板上，干燥后切割即得。

实施例24 0.5mg/支涂膜剂(25ml/瓶)

处方

SEQ ID NO：1系列抗菌肽	0.02g
		聚乙烯醇	150g
羧甲基纤维素钠	150g
		甘油	100g
注射用水	600g
		制成	1000g

将处方量SEQ ID NO：1系列抗菌肽加入注射用水中溶解后加入处方量的聚乙烯醇和羧甲基纤维素钠使其充分溶胀，待溶胀完全后，搅拌至均匀。然后加入处方量的甘油，继续搅拌均匀。检测合格后灌装，得成品。

实施例25 50mg/支洗剂(50g/支)

处方

SEQ ID NO：1系列抗菌肽	1g
		薄荷脑	1g
苯甲酸钠	1g
		注射用水	997g
制成	1000g

取SEQ ID NO：1系列抗菌肽原料用60％处方量的水溶解后，搅拌均匀。另取苯甲酸钠和薄荷脑，加水溶解，加入上述混合液，加水至1000g，搅拌至全部溶解，检测合格后灌装，得成品。

从以上实施例可以看出，本发明的抗菌肽抗菌作用起效稳定，无毒性，可以应用于各种顽固感染性疾病及普通感染，作为现有抗生素的优良替代药物或辅助药物。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种新型抗菌肽，其特征在于，具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列，所述SEQ ID NO：1为Ac-Lys_D-Lys_D-Leu_D-Leu_D-Phe_D-Lys_D-Leu_D-Lys_D-Phe_D-Lys_D-Lys_D-NH₂。

2.根据权利要求1所述的新型抗菌肽，其特征在于，所述新型抗菌肽中的一个或多个Leu_D残基由Ala_D残基，Val_D残基或Lys_D残基取代。

3.根据权利要求1或2所述的新型抗菌肽，其特征在于，所述新型抗菌肽中的一个或多个Phe_D残基由Ala_D残基，Leu_D残基或Lys_D残基取代。

4.根据权利要求3所述的新型抗菌肽，其特征在于，所述新型抗菌肽中的Phe_D残基由Leu_D残基取代，具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列，所述SEQ ID NO：2为Ac-Lys_D-Lys_D-Leu_D-Leu_D-Leu_D-Lys_D-Leu_D-Lys_D-Leu_D-Lys_D-Lys_D-NH₂。

5.根据权利要求1至3中任一项所述的新型抗菌肽，其特征在于，所述新型抗菌肽中的一个或多个Lys_D残基由Phe_D残基或Val_D残基取代。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的新型抗菌肽，其特征在于，所述新型抗菌肽的氨基酸残基由相应的L型氨基酸残基取代形成的对映异构体。

7.根据权利要求1至6中任一项所述新型抗菌肽在制备用于控制微生物感染的药物组合物中的应用，所述微生物为细菌和真菌。

8.一种药物组合物，其特征在于，包括有效量的如权利要求1至中任一项所述新型抗菌肽，以及药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。

9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型为注射剂、口服剂或外用剂，其中，所述新型抗菌肽的含量为注射剂0.01～500mg/支，口服剂0.01～500mg/例，外用剂1/10000～10％/支。