CN106831946B - 抗癌肽及其制备方法与应用 - Google Patents
抗癌肽及其制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物医药领域,具体而言,涉及一种抗癌肽。所述抗癌肽选自下列组的序列中的一种或两种:a)、具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列;b)、具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。该抗癌肽具有尤其显著的抗癌活性,且毒性小,对人体更为安全。本发明还涉及该抗癌肽的制备方法及其在制备抗癌药物中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域,具体而言,涉及一种抗癌肽及其制备方法与应用。
背景技术
乳腺癌是女性群体中最常见的癌症,每年新增的乳腺癌患者可达138万人。WHO调查表明,2014年中国女性中乳腺癌患者已达到187,213人,在所有女性癌症种类中位列第二。
目前,化疗是治疗大多数癌症的一个标准疗法。已知的可以治疗乳腺癌的化疗药物包括天然活性成分(例如紫杉醇、姜黄素、长春新碱、芹黄素和三氧化二砷等)和化学药物(例如环磷酰胺、卡培他滨、5-氟尿嘧啶等)。由于乳腺癌分子表型各异,对同种药物或疗法的敏感性也差异甚大,不同表型的乳腺癌免疫原性也不尽相同,且反复用药还会导致耐药性的形成。因此,探索不同机制的药物克服以上困难迫在眉睫。
抗癌肽(Anticancer peptides,ACPs)是一类阳离子的两亲性小肽,其氨基酸残基不超过50个且含有碱性和疏水残基。由于微生物细胞膜表面和肿瘤细胞膜表面一样,都富含负电荷的糖脂和(或)糖蛋白,因而很多抗菌肽(Antimicrobal peptides,AMPs)往往同时兼备抗菌和抗肿瘤的双重作用。ACPs和AMPs均可通过自身的正电荷与肿瘤细胞膜或者微生物细胞膜表面带负电荷分子的静电作用而定位到细胞膜上,进而在膜上聚集镶嵌在细胞膜内或者穿透细胞膜进入细胞,通过干扰细胞膜的整合而使细胞裂解或者诱导细胞凋亡。所以ACPs和AMPs也被称为细胞渗透性多肽。由于CPPs的细胞渗透性,使其不仅可以作为开发ACPs和AMPs的资源库,也可以作为其他药物—核酸、蛋白、成像试剂和小分子药物等的载体,介导这些药物进入靶细胞。
ACPs因其独特的作用机制而可以成为很有潜力的抗肿瘤药物。但是,天然来源的ACPs有很多缺点,例如活性不高、选择性不强、溶血活性太强、稳定性差等,因而不能直接应用于临床。同时,采用化疗药物对不同亚型的乳腺癌进行治疗的过程中,药物可能会通过对乳腺癌细胞ABC转运蛋白(ATP binding cassette transporter)在翻译水平上进行调控,诱导癌细胞DNA甲基化的异常,或者促进乳腺癌细胞过表达诸如P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp/MDR1)、多药耐药相关蛋白(Multidrug resistance associatedprotein,MRP)和乳腺癌耐药蛋白(Breast cancer resistance protein,BCRP)药物外排转运蛋白等多种途径形成多药耐药机制。尽管肿瘤细胞对ACPs的耐药性尚未见报道,但是一些病原菌,例如链球菌属(Streptococcus)、葡萄球菌属(Staphylococci)和粪肠球菌(Enterococcus faecalis)对AMPs的耐药性已有报道。
因此,克服天然ACPs的不足,使其更加符合临床要求以改善其抗肿瘤活性势在必行。
有鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种天然抗癌肽的改造方法,以解决上述问题。
为了实现本发明的上述目的,特采用以下技术方案:
一种抗癌肽,其选自下列组的序列中的一种或两种:
a)、具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列;
b)、具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
本发明共提供了13条对癌细胞具有显著抑制作用的抗癌肽,其中CMAP-L-242(SEQID NO:1所示的氨基酸序列)及CMAP-L-253(SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列)具有尤其显著的抗癌活性,在本发明的实施例中,这两条多肽对癌细胞的抑制作用与对照组相比差异达到了极显著水平(Duncan-test,P<0.01),且细胞毒性也很小。
如上所述的抗癌肽在制备抗癌药物中的应用。
本发明提供的抗癌肽细胞毒性小,在人体中使用安全。优选的,所述抗癌药物对抗的肿瘤种类选自:
肠癌、卵巢癌、前列腺癌症、肝癌、肺癌、淋巴癌、胰腺癌、甲状腺癌、鼻咽癌、宫颈癌、子宫内膜癌、耳沟癌、腮腺癌、喉道癌等;更优选的,所述抗癌药物对抗的肿瘤选自乳腺癌。
本发明对所提供的抗癌肽在MDA-MB-231、MCF7、BT-474和ZR-75-1四种乳腺癌细胞的敏感性进行了验证,证明所述抗癌肽可很好地用于乳腺癌的治疗。
一种用于抑制癌细胞增殖或者增加癌细胞凋亡的药物组合物,所述药物组合物包含由选自于SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的氨基酸序列所示的肽或者上述两种肽的组合,以及可药用的载体、稀释剂或赋形剂。
包含所述肽或所述物质作为活性成分的组合物可以包含多于一类的选自于盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油和乙醇的药物稀释剂,但所述稀释剂不限于这些。
根据服药目的和具体疾病可以以不同的方式给予所述组合物。应理解,实际给予的活性成分的量应该根据多种相关因素确定,包括需要治疗的病症,患者症状的严重程度,同时服用的其他药物(例如化学治疗剂),所述患者个体的年龄、性别、体重,饮食,服药时间,选择的给药途径以及所述组合物的比例。所述组合物药的剂量和给药途径可根据疾病的类型和严重程度进行调节。
包含本发明的肽或物质的组合物可以通过口服或肠胃外途径给药。肠胃外服药意思是通过口服之外的途径给予药物,包括直肠给药、静脉内给药、腹膜内给药和肌内给药、动脉内给药、经皮给药、鼻内给药、吸入、眼部给药以及皮下给药。
可以将包含所述肽或物质的药物制剂制备成口服剂型、注射液或局部用制剂等任何形式。所述制剂可以被优选制备成口服和注射给药(真溶液、悬液或乳剂)的形式,并且最优选是口服形式例如片剂、胶囊、软胶囊、液体药剂、丸剂、颗粒剂等等。
在制备所述制剂过程中,可以在无任何赋形剂的情况下将所述肽填充进软胶囊中,或者将所述肽与载体混合或用载体稀释后形成适当的制剂。合适的载体的实例为淀粉、水、盐水、林格氏(Ringer’s)溶液、葡萄糖等。
本发明还请求保护编码如上所述抗癌肽的基因序列;
优选的,所述基因序列具有SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列;
SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列编码SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列;
需要注意的是,本发明还请求保护与上述核苷酸序列互补的核苷酸序列,以及功能等价体序列。本发明请求保护的基因序列不仅限于SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列,还包括根据宿主细胞对密码子的偏好性推算出来的具有简并性的其他核苷酸序列,这对本领域技术人员来说是熟悉的。功能等价体序列还包括与SEQ ID NO:1或2所示序列有至少90%、95%、96%、97%、98%、或99%序列同一性,且具有编码抗癌活性多肽的核苷酸序列,在基于本发明提供内容的基础上,这对本领域技术人员来说是容易通过有限次实验进行验证的。其中,序列同一性的百分比可以通过公知的生物信息学算法来获得,包括Myers和Miller算法(Bioinformatics,4(1):11-17,1988)、Needleman-Wunsch全局比对法(J.Mol.Biol.,48(3):443-53,1970)、Smith-Waterman局部比对法(J.Mol.Biol.,147:195-197,1981)、Pearson和Lipman相似性搜索法(PNAS,85(8):2444-2448,1988)、Karlin和Altschul的算法(Altschul等,J.Mol.Biol.,215(3):403-410,1990;PNAS,90:5873-5877,1993)。这对于本领域技术人员来说是熟悉的。
一种载体,其包含如上所述的基因序列。
本发明所提供的基因序列可被插入质粒、粘粒、病毒(如噬菌体、腺病毒、慢病毒等)、细菌人工染色体或其他适合转化进宿主细胞中的任何载体中。
优选的,如上所述的载体,所述载体为pGEX-3X或pMDTM19-T。
一种宿主细胞,其被如上所述的表达载体所转化。
优选的,如上所述的宿主细胞,所述宿主细胞为大肠杆菌。
一种制备如上所述抗癌肽的方法,包括如下步骤:
在培养基中和合适的培养条件下培养如上所述的宿主细胞;
从培养基中或从所培养的宿主细胞中回收如此产生的抗癌肽。
一种制备如上所述抗癌肽的方法,其特征在于,通过多肽合成仪进行人工合成。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为PEPstrMOD预测的多肽三级结构;A.CMAP-L-20;B.CMAP-L-23;C.CMAP-L-24;D.CMAP-L-25;
图2为第一阶段所设计的多肽对乳腺癌细胞的抑制作用;浓度(100μM),作用时间(24h);
图3为第二阶段所设计的多肽对乳腺癌细胞的抑制作用;浓度(100μM),作用时间(24h);
图4为PEPstrMOD预测的多肽三级结构;
A.CMAP-L-201;B.CMAP-L-202;C.CMAP-L-232;D.CMAP-L-233;
E.CMAP-L-242;F.CMAP-L-243;G.CMAP-L-252;H.CMAP-L-253;
图5为所选多肽对不同乳腺癌细胞的抑制作用;浓度(100μM),作用时间(24h);
图6为所选多肽对MCF10A和293FT的抑制作用;浓度(100μM),作用时间(24h);
图7为所选多肽在不同浓度下的溶血率;
A.CDDP;B.CMAP-L-20;C.CMAP-L-23;D.CMAP-L-24;
E.CMAP-L-242;F.CMAP-L-25;G.CMAP-L-253;
图8为所选多肽的螺旋-轮结构图;
图9为多肽CMAP-L-242和CMAP-L-25作用于乳腺癌细胞质的细胞形态变化;
A.MDA-MB-231;B.MCF7;C.BT-474;D.ZR-75-1。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将会理解,下列实施例仅用于说明本发明,而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
在本实施例中,以抗菌肽CMAP-8为例,论述本发明提供的抗癌肽改造方法。
一、材料与方法
1.1材料
1.1.1数据库
APD(http://aps.unmc.edu/AP/),用来计算多肽的净电荷和疏水度。CancerPPD数据库(http://crdd.osdd.net/raghava/cancerppd/),用来查看具有抗乳腺癌活性的ACPs的理化性质。
1.1.2软件
多肽三级结构预测软件PEPstrMOD:
http://osddlinux.osdd.net/raghava/pepstrmod/。
多肽抗癌活性预测软件AntiCP:
http://crdd.osdd.net/raghava/anticp/index.html。
多肽渗透性预测软件CellPPD:
http://crdd.osdd.net/raghava/cellppd/index.html。
多肽毒性预测软件ToxinPred:
http://crdd.osdd.net/raghava/toxinpred/。
多肽的螺旋-轮结构图生成软件HELIQUEST analysis:
http://heliquest.ipmc.cnrs.fr/(Romain Gautier等,2008)。
化学结构模拟软件:RasMol 2.7.2.1.1。
作图软件:GraphPad Prism 5.0。统计与分析软件:SPSS20.0。
1.1.3主要试剂
DMEM培养液(HyClone公司)
RPMI-1640培养液(HyClone公司)
DMEM/F12培养液(HyClone公司)
北美胎牛血清(SCIENCELL公司)
马血清(Gbico公司)
精蛋白生物合成人胰岛素(诺和诺德(中国)制药有限公司)
牛胰岛素(Sigma公司)
重组人表皮生长因子(PEPROTHECH公司)
氢化可的松(北京索莱宝科技有限公司)
胰酶消化液(HyClone公司)
MTT(噻唑蓝,北京索莱宝科技有限公司)
PBS(粉末,武汉博士德生物工程有限公司)
二甲基亚砜(DMSO)(化学纯,天津市致远化学试剂有限公司)
二甲基亚砜(DMSO)(生物纯,Sigma公司)
顺铂(cis-diamminedichloroplatinum,CDDP)(齐鲁制药有限公司)
1.1.3细胞株
人乳腺癌细胞:MDA-MB-231、MCF7、BT-474和ZR-75-1;人胚肾上皮细胞:293FT;人乳腺导管上皮细胞:MCF10A;人血红细胞:从人静脉血中分离所得。
1.1.4试剂配制
(1)多肽溶液的配制(1mM):所合成的多肽的规格均为20mg。根据各个多肽的相对分子量计算出配制1mM溶液所需PBS的体积后,无菌环境下将多肽粉末溶解于PBS溶液中,-20℃避光保存备用。
(2)MTT溶液的配制(5mg/mL):称取100.00mg MTT粉末溶解于20mL无菌PBS溶液中,充分搅拌溶解,无菌环境下滤膜(0.22μm)过滤除菌,分装后于-20℃避光保存备用。
(3)PBS溶液的配制:取PBS粉末按照包装说明溶解于对应体积的超纯水中,磁力搅拌器搅拌至完全溶解,分装后于105Kpa灭菌30min,4℃保存备用。
(4)氢化可的松溶液的配制(5mg/mL):称取100.00mg氢化可的松粉末溶解于20mL无水乙醇中,无菌环境下滤膜(0.22μm)过滤除菌,分装后于-20℃避光保存备用。
(5)人表皮生长因子(EGF)溶液的配制(20μg/mL):PEPROTHECH公司的EGF规格为100μg,并配有1mL的溶解液(原装超纯水)和10mL的PBS溶液。将EGF粉末于3000rpm离心5min后溶解于1mL溶解液中,再加入4mL的PBS溶液使终体积为5mL。无菌环境下滤膜(0.22μm)过滤除菌,分装后于-20℃避光保存备用。
(6)牛胰岛素溶液的配制(1mg/mL):Sigma公司的牛胰岛素规格为25mg。将胰岛素粉末溶解于不含酚红的F12培养液中,无菌环境下滤膜(0.22μm)过滤除菌,分装后于4℃保存备用。
(7)CDDP溶液的配制(1mM):称取10.00mg顺铂溶解于33.328mL生理盐水(0.9%的NaCl溶液)中,无菌环境下滤膜(0.22μm)过滤除菌,分装后于-20℃避光保存备用。
(8)细胞冻存液的配制(含10%的DMSO):取9mL胎牛血清和1mL DMSO(生物纯),混匀后即为细胞冻存液,分装后于-20℃避光保存备用。
1.2方法
1.2.1多肽设计
抗菌肽CMAP-8(KDLLSAMLSGVDPK)由贵州大学真菌资源研究所从蛹虫草(Cordyceps militaris)中分离所得。为了逐步探究影响ACPs抗肿瘤活性的理化因素和三级结构,以CMAP-8为母链进行两个阶段的设计。
在第一阶段中,首先对APD和CancerPPD数据库中具有抗乳腺癌活性多肽的理化性质(一级序列、氨基酸残基的数目、多肽构象、抗癌活性、净电荷和疏水残基的百分比)进行分析。随后,根据对所得信息分析的结果,利用Lys和Phe两种氨基酸分别从净电荷和疏水残基百分比两方面对CMAP-8进行设计改造,得到系列多肽。用PEPstrMOD服务器预测所得系列多肽的三级结构,并利用AntiCP、CellPPD和ToxinPred分别预测多肽衍生物是否具有抗肿瘤活性、细胞渗透性和毒性。最后,人工合成所设计的多肽并检测其体外对乳腺癌细胞的抑制活性。筛选出抗乳腺癌活性较好的多肽并分析所选多肽抗癌活性与理化性质和三级结构之间的关系。
以第一阶段中筛选所得的多肽为母链进行第二阶段的设计。不改变母链中氨基酸残基的种类和数目,仅通过多肽一级序列的调整使多肽中的α-螺旋位于不同的位置或者消失,再次得到系列多肽。用PEPstrMOD服务器预测所得系列多肽的三级结构,并利用AntiCP、CellPPD和ToxinPred分别预测多肽衍生物是否具有抗肿瘤活性、细胞渗透性和毒性。最后,人工合成所设计的多肽并检测其体外对乳腺癌细胞的抑制活性。筛选出抗乳腺癌活性较好的多肽并分析所选多肽抗癌活性与α-螺旋在多肽中的有无和位置之间的关系。综合分析多肽抗癌活性与理化性质和三级结构之间的关系,了解氨基酸残基对多肽三级结构的影响以及α-螺旋对多肽抗癌活性的影响。
2.2.2多肽合成
所有多肽均由上海波泰生物科技有限公司(Shanghai Bootech BioScience&Technology Co.,Ltd)采用Fmoc/PyBOP固相合成法合成,再用反向高效液相色谱仪(Reverse-phase high-performance liquid chromatography,RP-HPLC)纯化。纯化后多肽(纯度为98%)的分子量和纯度分别用质谱仪和高效液相色谱仪(High-performanceliquid chromatography,HPLC)测定。所有的多肽均以干冻粉的形式封装保存。
2.2.3细胞培养
MDA-MB-231、BT-474和293FT培养于含10%FBS、1%非必需氨基酸、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的DMEM完全培养液;ZR-75-1培养于含20%FBS、1%非必需氨基酸、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的RPMI-1640完全培养液;MCF7培养于含10%FBS、0.2U/mL人胰岛素、1%非必需氨基酸、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的DMEM完全培养液;MCF10A培养于含5%马血清、0.5μg/mL氢化可的松、20ng/mL EGF、10μg/mL牛胰岛素、1%非必需氨基酸、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的DMEM/F12完全培养液。所有的细胞均在37℃,5%CO2,100%湿度的条件下培养。
2.2.4细胞增殖抑制的测定(MTT法)
采用MTT法检测多肽对乳腺癌细胞体外抑制作用和对正常细胞毒性作用。MTT的化学名称是3-(4,5二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐,商品名为噻唑蓝,是一种四唑盐。外源的MTT进入活细胞线粒体后可被琥珀酸脱氢酶还原成蓝紫色的结晶物—甲瓒(Formazan),沉积在细胞中,而死细胞由于线粒体失活故不能还原MTT。因此,在一定的细胞数量范围内,活细胞还原MTT生成甲瓒的量与活细胞数成正相关。DMSO可溶解甲瓒,用酶标仪测定甲瓒溶液在570nm处的光密度OD值可间接反映活细胞的数量,计算可得多肽对细胞的增殖抑制率。
(1)培养细胞,在细胞状态好时收集对数期的乳腺癌细胞和正常细胞,用完全培养液将细胞吹打成单细胞悬液,倒置显微镜下计数。用各自细胞的完全培养液稀释细胞悬液,各细胞加入到96孔板中的细胞数如表1所示,每孔100μL。37℃,5%CO2,100%湿度下培养24h以保证细胞状态良好,贴壁正常。
(2)加药处理,多肽溶液经各细胞相应的完全培养液稀释后加入96孔板,使其终浓度为100μM,药物加入后每孔中液体总体积为200μL。CDDP也以同样的浓度和方式加入到96孔板中作为阳性对照,与多肽药物等体积的PBS溶液经相应细胞的完全培养液稀释后加入96孔板作为阴性对照,另外直接加入100μL各细胞相应的完全培养液作为空白对照。
(3)药物处理完成后,在37℃,5%CO2,100%湿度的细胞培养箱中继续培养24h。无菌条件下每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL,即0.5%MTT),继续在培养箱中孵育2h。
(4)测量结果,弃去孔内培养液,每孔加入200μL DMSO,振荡使甲瓒结晶充分溶解,在570nm处测OD值。
(5)计算细胞存活率(%)=(测试组OD值)/(空白组OD值)×100%
表1各细胞接种量
2.2.5显微镜观察细胞形态变化
(1)培养细胞,在细胞状态好时收集对数期的乳腺癌细胞和正常细胞,用完全培养液将细胞吹打成单细胞悬液,倒置显微镜下计数。用各自细胞的完全培养液稀释细胞悬液,各细胞加入到96孔板中的细胞数如表1所示,每孔100μL。37℃,5%CO2,100%湿度下培养24h以保证细胞状态良好,贴壁正常。
(2)加药处理,多肽溶液经各细胞相应的完全培养液稀释后加入96孔板,使其终浓度为100μM,药物加入后每孔中液体总体积为200μL。CDDP也以同样的浓度和方式加入到96孔板中作为阳性对照,另外直接加入100μL各细胞相应的完全培养液作为空白对照。
(3)药物处理完成后,在37℃,5%CO2,100%湿度的细胞培养箱中继续培养24h,在倒置显微镜下观察并照相。
2.2.6溶血活性测定
(1)用EDTAK2抗凝管采集人静脉血4mL,充分混匀后备用。
(2)取2mL血样4℃离心1000×g,10min。用生理盐水洗三遍,稀释成2%的红细胞混悬液。
(3)将血红细胞悬浮液吹打混匀,100μL/孔加入到U型96孔板中。以100μL/孔分别加入多肽和CDDP稀释液,使得终浓度分别为100μM、50μM、25μM和12.5μM。阴性对照组为与测试药物等体积的PBS溶液,阳性对照组为等体积的无菌超纯水。
(4)37℃,5%CO2,100%湿度的细胞培养箱中孵育4h,3000rpm水平离心10min。取上清液至平底96孔板中,410nm处测OD值
(5)计算溶血率(%)=(测试组OD值-阴性组OD值)/(阳性组OD值-阴性组OD值)×100%
三、结果与分析
3.1第一阶段多肽设计及检测的结果
3.1.1第一阶段多肽设计的结果
在第一阶段的设计改造中,根据净电荷和疏水残基的百分比的逐渐变化,共设计得到了13条多肽衍生物,其序列及理化性质见表2。
表2多肽衍生物的序列及分子特征
注:a“+”表示预测多肽有该性质,“-”表示预测多肽没有该项性质;b“Helical”表示预测多肽三级结构中α-螺旋所占的比例,“Coil”表示预测多肽三级结构中无规卷曲所占的比例。
从表2中AntiCP对多肽抗癌活性的预测结果可知,除了CMAP-8和CMAP-L-1两条多肽没有抗癌活性外其余多肽均预测到抗癌活性。因而可以推测,对乳腺癌细胞抑制效果较好的多肽可能也在除CMAP-8和CMAP-L-1两条多肽之外其他多肽中。同时,CellPPD对多肽细胞渗透性的预测结果表明,所有多肽均具有细胞渗透功能,而且CMAP-L-20、CMAP-L-23、CMAP-L-24和CMAP-L-25四条多肽细胞渗透性最强。ToxinePred对多肽毒性的预测结果表明,所有多肽均无细胞毒性,其中多肽CMAP-L-24细胞毒性预测值最低(-4.63),因而该多肽的细胞毒性可能也是最低。PEPstrMOD对多肽三级结构的预测结果表明,CMAP-L-20、CMAP-L-23和CMAP-L-25均为两段α-螺旋分别位于靠近多肽N端和C端的位置,而多肽CMAP-L-24仅在靠近N端的位置有一小段α-螺旋,该α-螺旋在多肽中所占的比例在所设计的13条多肽中为最小(20%)。所预测的4条多肽三级结构见图1。综合以上结果可以推测,CMAP-L-20、CMAP-L-23、CMAP-L-24和CMAP-L-25四条多肽在抗乳腺癌方面可能会有特殊的表现。
3.1.2第一阶段设计的多肽对乳腺癌细胞的抑制作用
采用MTT法检测了第一阶段设计改造的多肽对MDA-MB-231、MCF7、BT-474和ZR-75-1四种乳腺癌细胞的抑制率,其结果如图2所示。从图2中可知,抗菌肽CMAP-8对以上四种乳腺癌细胞均没有明显的抑制作用,而多肽CMAP-L-20、CMAP-L-23、CMAP-L-24和CMAP-L-25对4种乳腺癌细胞的抑制率与CMAP-8相比差异则均达到了极显著水平(Duncan-test,P<0.01)。其中,CMAP-L-25对ZR-75-1的抑制效果最明显,在100μM的浓度下,作用24h后细胞存活率为41.1%。MCF7多肽具有明显的耐受作用,4条多肽对其抑制率均低于对其他3种乳腺癌细胞。
设计改造的多肽体外抗乳腺癌结果与软件预测的结果基本一致。这表明AntiCP、CellPPD和ToxinPred三个多肽预测服务器对多肽相关性质的预测结果是比较准确的。其原因可能是这3个多肽预测软件是基于多肽的序列信息而建立起来的。例如,CellPPD在建立时考虑了多肽氨基酸的组成、二肽的组成、二进制的模式以及序列模体的信息等,而AntiCP在建立时则大量统计了多个数据库的ACPs、非ACPs和AMPs中高频出现的氨基酸进而建立的算法对其他多肽的活性进行预测。因此,同时综合以上3种预测指标可以对多肽进行有效的设计改造,进而为其他来源的天然多肽的设计改造提供一个有效的途径。
结合预测软件的设计和体外抗乳腺癌的检测结果可知,多肽的净电荷确实对ACPs的抗肿瘤活性有影响。所选出来对乳腺癌细胞抑制效果较好的多肽CMAP-L-20、CMAP-L-23、CMAP-L-24和CMAP-L-25净电荷数均比较大,为+6~+8,均属于阳离子多肽,表明多肽在与乳腺癌细胞相互作用时确实可能先通过静电吸引与乳腺癌细胞表面带负电荷的磷脂酰丝氨酸、O-糖苷粘蛋白唾液酸、和肝素等分子相互作用进而与细胞膜接触。而疏水残基在这些多肽中所占的比例并非越大越好,但也并非越小越好,而是处于一个合适的范围内。其原因可能是随着多肽中疏水残基比例的升高,多肽的水溶性会逐渐变差,不利于多肽发挥药物活性;而随着多肽中疏水残基比例的降低,虽然多肽的水溶性会变好,但是其两亲性会变差,对细胞膜的亲和力也会降低,因而多肽的药物活性也会降低。
3.2第二阶段多肽设计及检测的结果
3.2.1第二阶段多肽设计的结果
经过第一阶段的设计检测筛选后,得到了4条对MDA-MB-231、MCF7、BT-474和ZR-75-1四种乳腺癌细胞具有较好抑制活性的多肽,分别为:CMAP-L-20、CMAP-L-23、CMAP-L-24和CMAP-L-25。从图1中PEPstrMOD对4条多肽三级结构的预测结果可知,CMAP-L-20、CMAP-L-23和CMAP-L-25均有两段α-螺旋,分别位于靠近多肽N端和C端的位置,而多肽CMAP-L-24仅在靠近N端的位置有一小段α-螺旋。为了讨论多肽中α-螺旋的位置及数目对多肽抗乳腺癌活性的影响,不改变4条多肽中氨基酸的种类和数目,仅通过调整其一级序列而再次设计得到了系列多肽,结果见表3。
表3多肽衍生物的序列及分子特征
注:a加下划线的单字符表示形成α-螺旋的氨基酸残基;b“+”表示预测多肽有该性质,“-”表示预测多肽没有该项性质;c“Helical”表示预测多肽三级结构中α-螺旋所占的比例,“Coil”表示预测多肽三级结构中无规卷曲所占的比例。
表3中,所有多肽的α-螺旋部分均用加下划线的氨基酸单字符表示,可以看出多肽的净电荷和疏水度仅与多肽中氨基酸残基的数目和种类相关,与其一级序列无关。AntiCP对多肽抗癌活性的预测结果表明,所预测的多肽抗癌活性也仅与多肽中氨基酸残基的数目和种类相关,与其一级序列无关,其原因是AntiCP服务器对多肽的预测是基于对大量ACPs中不同氨基酸残基出现频率的统计而建立起来的。CellPPD和ToxinPred对多肽细胞渗透性和毒性的预测结果表明,所预测多肽的细胞渗透性和毒性与多肽的一级序列相关。由于多肽一级序列的改变会引起其三级结构的改变,进而也会导致多肽抗癌活性、细胞渗透性和毒性的改变。然而,AntiCP多肽抗癌活性的预测仅基于多肽中氨基酸残基的数目和种类而并未涉及多肽的三级结构,可能会导致其预测结果与实际检测的结果有所出入。
为了得到表3中不同三级结构的多肽,首先要确定Lys和Phe残基在多肽三级结构形成中的作用。为此,我们设计了由15个Lys残基组成的多肽CMAP-L和由15个Phe残基组成的多肽CMAP-LL(见表3)。PEPstrMOD对这两条多肽三级结构的预测结果表明,CMAP-L的三级结构中为100%无规卷曲而CMAP-LL的三级结构中则在靠近N端有66.7%的α-螺旋结构。由于Phe是疏水性氨基酸,其侧链不带电荷,因而不会产生排斥作用,所以多聚Phe可以形成α-螺旋结构。由此可知,多肽α-螺旋区多由疏水性氨基酸或者疏水性氨基酸和其他性质的氨基酸共同构成。而多聚Lys由于其侧链正电荷的相互排斥而不能形成链内氢键,因而也不能形成α-螺旋。结合表3中α-螺旋多肽序列的规律也可以发现,当有3个以上的Lys残基在多肽中聚集就会阻断多肽局部α-螺旋的形成。此外,在多肽α-螺旋形成的过程中,多肽N端或C端的末端氨基酸残基不参与α-螺旋的形成,而紧靠多肽α-螺旋区一端或两端的氨基酸残基若为疏水性氨基酸则有利于α-螺旋的形成。
3.2.2第二阶段设计的多肽对乳腺癌细胞的抑制作用
采用MTT法检测了第二阶段设计改造的多肽对MDA-MB-231、MCF7、BT-474和ZR-75-1四种乳腺癌细胞的抑制率,其结果如图3所示。由图3可知,第二阶段设计改造的多肽中,CMAP-L-202、CMAP-L-242和CMAP-L-253对MDA-MB-231细胞的抑制率与PBS阴性组相比差异均达到了极显著水平(Duncan-test,P<0.01),而多肽CMAP-L-201、CMAP-L-232、CMAP-L-233、CMAP-L-241、CMAP-L-243和CMAP-L-252对MDA-MB-231细胞的抑制率与PBS组相比差异则均达到了显著水平(Duncan-test,P<0.05)。多肽CMAP-L-202、CMAP-L-252和CMAP-L-253对ZR-75-1细胞的抑制率与PBS组相比差异均达到了显著水平(Duncan-test,P<0.05)。多肽CMAP-L-242对以上4种乳腺癌细胞均具有较好的抑制作用,与PBS组相比差异均达到了极显著水平(Duncan-test,P<0.01)。从表3中可知,CMAP-L-242的三级结构为两段α-螺旋,结合第一阶段所筛选出的多肽CMAP-L-20、CMAP-L-23和CMAP-L-25可以推断,分别在靠近多肽N端和C端各有一段α-螺旋结构的Motif可能是ACPs抗乳腺癌活性较好的Motif之一。
此外,多肽CMAP-L-253在100μM的浓度下,对MDA-MB-231细胞作用24h后,存活率为72.2%,与PBS组相比差异则达到了极显著水平(Duncan-test,P<0.01)。在同等条件下,该多肽作用于MCF7和ZR-75-1细胞后,细胞存活率分别为85.6%和85.1%,与PBS组相比差异则达到了显著水平(Duncan-test,P<0.05)。PEPstrMOD对CMAP-L-253三级结构的预测结果表明,该多肽的三级结构为100%无规卷曲,但其细胞渗透性的预测得分较高,为5.30(见表3)。多肽CMAP-L-243的预测三级结构也为100%无规卷曲,其细胞渗透性的预测得分为5.34(见表3),该多肽对MDA-MB-231细胞具有明显的抑制作用。由此可知,多肽的细胞渗透性对其抗乳腺癌活性的发挥至关重要,
即使在多肽没有α-螺旋结构的情况下也可使多肽具有一定的抗乳腺癌活性。PEPstrMOD对多肽CMAP-L-201、CMAP-L-202、CMAP-L-232、CMAP-L-233、CMAP-L-242、CMAP-L-243、CMAP-L-252和CMAP-L-253三级结构的预测见图4。
比较AntiCP、CellPPD和ToxinPred对多肽活性预测的结果和多肽抗乳腺癌活性的实际检测结果可知,多肽中α-螺旋所占的百分比对其抗乳腺癌活性影响不大,而α-螺旋的数目和位置对多肽抗乳腺癌的活性影响较大。有两段α-螺旋结构的多肽抗乳腺癌活性总体上比有一段或者没有的高,靠近N端的α-螺旋多肽抗乳腺癌活性比靠近C端的高。多肽的细胞渗透性对其抗乳腺癌活性有较大的影响,从表3中多肽细胞渗透性的预测得分可知,所筛选出来的具有抗乳腺癌活性的多肽细胞渗透性预测得分均大于5.0,但是并非细胞渗透性预测得分大于5.0的多肽都具有抗乳腺癌活性,例如CMAP-L的细胞渗透性预测得分为6.79,但是该多肽却没有任何抗乳腺癌活性(图3中未显示)。因此,多肽的抗乳腺癌活性是其细胞渗透性预测得分大于5.0之间的充分不必要条件。
综合两个阶段多肽设计和检测结果可知,ACPs的抗乳腺癌活性是由抗癌肽的净电荷、疏水度和三级结构等多种因素共同作用的结果。因此,在评价或设计改造ACPs的抗癌活性时应充分考虑以上多种因素。
3.2.3不同乳腺癌细胞对ACPs的敏感性差异
MDA-MB-231、MCF7、BT-474和ZR-75-1四种乳腺癌细胞对药物的敏感性各不相同。以上4种乳腺癌细胞对所筛选的多肽和CDDP的敏感性差异如图5所示。由图5可知,多肽CMAP-L-24、CMAP-L-242和CMAP-L-25对MDA-MB-231细胞的抑制作用与阳性对照组CDDP相比差异达到了极显著水平(Duncan-test,P<0.01);所有多肽对MCF7细胞的抑制作用CDDP相比差异均未达到显著水平;多肽CMAP-L-242和CMAP-L-25对BT-474细胞的抑制作用与CDDP相比差异达到了极显著水平(Duncan-test,P<0.01);多肽CMAP-L-24、CMAP-L-242和CMAP-L-25对ZR-75-1细胞的抑制作用与CDDP相比差异达到了极显著水平(Duncan-test,P<0.01),而多肽CMAP-L-23与CDDP相比差异则达到了显著水平(Duncan-test,P<0.05)。
此外,由图5还可知,CDDP是广谱性抗癌药物,其对MCF7、BT-474和ZR-75-1三种乳腺癌细胞的抑制作用接近,在100μM的浓度下,对以上3种细胞作用24h后,细胞存活率分别为53.3%、52.0%和54.7%,但在同等条件下对MDA-MB-231细胞的抑制作用则相对较差,作用后细胞存活率为64.1%。经过两个阶段的设计改造所筛选出来的6条多肽对MDA-MB-231、MCF7、BT-474和ZR-75-1四种乳腺癌细胞的抑制作用差异较大。其中,多肽CMAP-L-242和CMAP-L-25对MDA-MB-231细胞的抑制作用最好,其在100μM的浓度下,对MDA-MB-231细胞作用24h后,细胞存活率分别为24.8%和27.8%。
3.2.4所筛选多肽对正常细胞的毒性
为了评估所筛选多肽对正常细胞的毒性作用,分别检测了多肽对人乳腺导管上皮细胞MCF10A、人胚肾上皮细胞293FT及人血红细胞的抑制作用。所筛选的6条多肽对MCF10A细胞和293FT细胞的抑制作用如图6所示。由图6可知,在100μM的浓度下,CDDP作用于MCF10A细胞和293FT细胞24h后,细胞存活率分别为28.9%和44.7%,而在同等条件下,所筛选的6条多肽作用于以上两种细胞后,细胞存活率均高于CDDP。其中,多肽CMAP-L-24在100μM的浓度下作用293FT细胞24h后,细胞存活率为84.7%,表明该多肽对293FT细胞的毒性最弱。以上结果表明,所筛选的多肽对人正常细胞MCF10A和293FT的毒性低于CDDP,表现出了较好的选择杀伤性。
所筛选的6条多肽的溶血活性结果如图7所示。由图7可知,6条多肽和CDDP在12.5μM、25μM、50μM和100μM浓度下均对人血红细胞没有溶血活性,图中检测结果值波动最大不超过10%,在系统误差允许的范围内。所选多肽即使在最大浓度下(100μM)也没有表现出溶血活性,其原因可能是红细胞膜和乳腺癌细胞膜不同,没有富含阴离子的磷脂酰丝氨酸、O-糖苷粘蛋白唾液酸、和肝素等分子,因而多肽不能通过静电作用与红细胞膜相互作用,也就不能对红细胞膜产生裂解作用。
四、制备方法
菌株、载体与培养基
E.coli TOP10和E.coli BL21(DE3)以及表达载体p GEX-3X;p MDTM19-T克隆载体。
SOC培养基:0.5%Yeast extract,2%Tryptone,0.05%Na Cl,2.5mmol/L KCl,
10mmol/L MgCl2,20mmol/L Glucose,pH 7.0
LB培养液:1%Tryptone,0.5%Yeast extract,1%NaCl,p H 7.0
LB固体培养基:LB培养液+1.5%琼脂糖
TB培养液:1.2%Tryptone,2.4%Yeast extract,0.4%glycerol,0.2%KH2PO4,1.6%K2HPO4
方法:
1、大肠杆菌质粒DNA的提取质粒DNA采用宝生物(大连)工程有限公司的质粒小量提取试剂盒提取,具体操作参见说明书。
2、质粒DNA的限制性酶切验证用酶切体系为:质粒DNA 5μL,Bam HI 1μL,Eco RI 1μL,10×K buffer 2μL,加入双蒸水至20μL;胶回收用酶切体系为:质粒DNA 16μL,Bam HI 1μL,Eco RI 1μL,10×K buffer 5μL,用双蒸水补足至50μL。用1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物或回收目的片段。
3、DNA琼脂糖凝胶电泳
DNA琼脂糖凝胶电泳步骤如下:①配胶。用1×TAE缓冲液配制1%琼脂糖溶液,加热溶解;②胶板制备。待胶液冷却至约60℃时,加入染色剂Gel Green(1μL/20μL胶溶液),混匀后倒入制胶槽,待凝胶凝固后拔出制胶梳子,将凝胶放入装有1×TAE缓冲液电泳槽内;③加样。在待检测的DNA样品中加入10×Loading Buffer,用移液枪吸打混匀并点样(待测样品和DNA Marker)至加样孔;④电泳。启动电泳仪,调节电压至110V,保持稳压,电泳约40min;⑤观察照相。关闭电泳仪,取出凝胶,用凝胶成像仪拍照并观察电泳结果。
4、胶回收
DNA从琼脂糖凝胶中回收DNA,操作方法参见宝生物(大连)工程有限公司胶回收试剂盒产品说明书。
5、目的基因与载体的连接
SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的核苷酸片段和质粒的连接采用连接试剂盒。T载体连接前无需处理,而对于连接具有粘性末端的质粒和插入片段,将载体和插入片段按1∶1到1∶10的摩尔比混合,一般取前者0.03pmol,取后者0.3pmol,加入等体积的solution I连接溶液,混匀,16℃下连接1h或过夜。
6、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
大肠杆菌感受态细胞的制备方法参见宝生物(大连)工程有限公司感受态细胞制备试剂盒的产品说明书。转化步骤如下:①从-70℃超低温冰箱中取出分装有100μL感受态细胞的EP管,于冰上放置,融化感受态细胞;②将待转化的10μL DNA加入1.5m L eppendorf(EP)离心管中,用粗口吸头轻柔混合,于冰上放置45min;③于42℃水浴中,热激90s,不要摇动离心管;④快速将EP管转移至冰上,静置2~3min;⑤各管加入890μL LB培养基,37℃振荡培养60min,使细菌复苏并表达抗性基因;⑥将适当体积已转化的感受态细胞涂布在含有相应抗生素的LB平板上;⑦将平板置于37℃至液体被吸干;⑧倒置平板,37℃培养12~16h,待菌落长好后,挑取单菌落进行PCR验证,或接种于含抗生素的LB(或SOC)液体培养液中,过夜培养,抽提质粒,进行质粒双酶切验证。
6、T载体的构建
参照p MDTM19-T simple vector试剂盒说明,将目的基因的PCR产物经纯化试剂盒纯化后,取约0.1~0.3pmol的基因片段加入微量离心管中,并加入1μL的T载体,加水补足至5μL,后加入5μL的Solution I启动反应,16℃连接反应1h;将10μL的连接液加入100μL感受态细胞Top 10(冰上冻融),进心转化;取100μL已转化的感受态细胞涂布LB平板(含有X-Gal、IPTG、Amp),进行蓝白斑筛选,培养14h后,挑选白色菌落,PCR确认重组T载体中插入片段的长度大小。PCR上下游引物分别为Bca BEST Primer RV-M和Bca BEST Primer M13-47
7、重组表达载体的构建
将以上构建的重组T载体p MDTM19-T-Acp-1和p MDTM19-T-Acp-2分别与表达载体p GEX-3X分别进行Bam HI与Eco RI双酶切,胶回收目的片段及酶切后的表达载体,采用Solution I连接液,于16℃连接过夜,转化感受态细胞E.coli BL21(DE3),于Amp(100μg/mL)平板上筛选重组子。提取质粒后,经双酶切及测序鉴定阳性克隆。
8、重组菌株的诱导表达
分别挑含重组质粒与空载体质粒的E.coli BL21(DE3)单菌落于20m L含100μg/mL的Amp的LB培养基液中,37℃,200rpm摇瓶培养过夜。将过夜培养液2%转接入100m L TB培养液中,37℃,200rpm,摇瓶培养至菌体OD600值达到0.6~0.8,添加IPTG至终浓度为1mmol/L,37℃诱导培养3h。各取诱导前与诱导后1m L菌液,4℃,10000g,离心10min,收集菌体细胞,添加100μL 1×还原型电泳上样缓冲液重悬细胞,沸水煮5min,上样,12%SDS-PAGE分析全细胞中重组蛋白(GST-AHPM-1)的表达情况。
9、包涵体的洗涤与溶解
诱导培养条件:30℃,200rpm,诱导前OD600值0.6~0.8左右,IPTG终浓度0.4mmol/L,诱导5h。取摇瓶诱导培养后的菌悬液,离心(4℃,10000g,10min)收集菌体,按每克湿菌体10m L细胞裂解缓冲液重悬菌体,超声破菌后,小份分装,4℃,16000g,离心20min,去掉上清,收集包涵体沉淀。包涵体洗涤与溶解的基本缓冲液为:0.5%Triton X-100,1mmol/LEDTA,150mmol/L Na Cl,50mmol/L Tris-HCI,p H 8.0。通过在以上基本缓冲液中加入不同终浓度的尿素,或终浓度0.1mol/L二硫苏糖醇(DTT),或终浓度5%的甘油,或它们的组合溶液重悬包涵体,于室温磁力搅拌4h后离心(4℃,16000g,20min),分离上清和沉淀,利用12%SDS-PAGE分析来考察最适宜的包涵体洗涤液和溶解液组成。
10、包涵体的纯化
将菌体细胞超声破碎后,去掉上清,利用洗涤液(0.5%Triton X-100,1mmol/LEDTA,150mmol/L Na Cl,50mmol/L Tris-HCI,p H 8.0,4mol/L尿素)洗涤包涵体沉淀,然后4℃,16000g,离心20min,收集沉淀,重复洗涤两次后即为洗净的包涵体。然后用溶解液(1mmol/L EDTA,10mmol/L Tris-HCI,p H 8.0,8mol/L尿素,5%甘油)重悬洗涤后的包涵体,加入终浓度0.1mol/L DTT,于磁力搅拌器上室温搅(转速100rpm)溶解4h后,离心(4℃,16000g,20min),上清液即为随后用于纯化及复性的包涵体溶液。
11、离子交换色谱纯化
AKATA蛋白纯化系统:GE Health公司;阳离子交换色谱柱:Hi TrapTM CM FF(1mL)和Hi TrapTM SP FF(1m L),GE Health公司;检测波长:280nm;上样流速:0.3m L/min;洗脱流速:1m L/min;进样体积:0.5m L;蛋白浓度:2mg/m L;Binding buffer:1mmol/L EDTA,10mmol/L Tris-HCI,p H 8.0,8mol/L尿素,5%甘油;Elution buffer:1mmol/L EDTA,10mmol/L Tris-HCI,p H 8.0,8mol/L尿素,5%甘油,1mol/L Na Cl。Binding buffer与Elution buffer均过0.22μm微滤膜除杂待用。
纯化流程:先用超纯水清洗色谱柱10个柱体积,再用Binding buffer平衡10个柱体积,待基线校零后,上样,Binding buffer洗至无紫外吸收信号,换Elution buffer梯度洗脱。见峰收集,多次重复上样,合并同类峰,利用超滤离心管(膜截留分子量为3k Da),4℃,4500g,超滤离心浓缩至一定浓度。
12、梯度透析完全复性
将SEC纯化及部分复性后收集的目标蛋白峰溶液装入透析袋(截留分子量10kDa),放入复性缓冲液中,于4℃磁力搅拌(转速150rpm),进一步进行梯度透析完全复。透析复性液为:25mmol/L Tris-HCl,p H 7.3,0.15mol/L Na Cl,1mmol/L EDTA,1.5mmol/LGSH,0.3mmol/L GSSG,5%甘油,0~3mol/L尿素。每隔12h换一缓冲液,依次为含3mol/L、2mol/L、1mol/L与0mol/L尿素的复性液,最后对含0.9%Na Cl的生理盐水(p H 7.5)进行透析。
五、讨论
本试验中,根据影响净电荷、疏水度和三级结构等影响多肽抗肿瘤活性因素的差异对天然抗菌肽CMAP-8进行了两个阶段的设计改造。通过对CMAP-8第一阶段的设计改造和体外抗乳腺癌(MDA-MB-231、MCF7、BT-474和ZR-75-1)活性检测后,共得到4条对乳腺癌细胞具有显著抑制作用的多肽,分别为:CMAP-L-20、CMAP-L-23、CMAP-L-24和CMAP-L-25。这4条多肽都是阳离子多肽,其净电荷数均比较大,为+6~+8,而疏水残基在所占的比例均为46%(见表2)。结合表4中其他多肽的净电荷数和疏水残基在多肽中所占的比例可知,多肽的净电荷数和疏水残基的比例共同影响多肽的抗乳腺癌活性,但是这些参数并非越大越好(因为表2中疏水残基最多的多肽为CMAP-L-11,而该多肽并未表现出明显的抗乳腺癌活性,表3中净电荷数最多的多肽为CMAP-L,该多肽也未表现出明显的抗乳腺癌活性)。CellPPD对所得多肽细胞渗透性的预测得分在5.04~5.32之间,大于其他大部分没有抗乳腺癌活性的多肽(见表2)。这一结果表明,多肽的细胞渗透性对其抗肿瘤活性有一定的影响,Yenchu Lin等在他们的工作中也发现了这一影响因素的作用。
CMAP-L-20、CMAP-L-23和CMAP-L-25的预测三级结构均为两段α-螺旋分别位于靠近多肽N端和C端的位置(见图1),而多肽CMAP-L-24仅在靠近N端的位置有一小段α-螺旋,该α-螺旋在多肽中所占的比例在所设计的13条多肽中为最小(20%)(见图1和表2)。在第二阶段的设计改造过程中,为了讨论多肽中α-螺旋的位置及数目对多肽抗乳腺癌活性的影响,不改变所得4条多肽中氨基酸的种类和数目,仅通过一级序列的变化得到具有不同三级结构的多肽衍生物(见表3)。该系列多肽衍生物的体外抗乳腺癌检测结果表明,多肽的三级结构对其抗乳腺癌活性有很大的影响。多肽CMAP-L-202、CMAP-L-242和CMAP-L-253对MDA-MB-231细胞的抑制率与PBS阴性组相比差异均达到了极显著水平(Duncan-test,P<0.01),而多肽CMAP-L-201、CMAP-L-232、CMAP-L-233、CMAP-L-241、CMAP-L-243和CMAP-L-252对MDA-MB-231细胞的抑制率与PBS组相比差异则均达到了显著水平(Duncan-test,P<0.05)。多肽CMAP-L-242对MDA-MB-231、MCF7、BT-474和ZR-75-1四种乳腺癌细胞均具有较好的抑制作用,与PBS组相比差异均达到了极显著水平(Duncan-test,P<0.01)(见图3)。多肽CMAP-L-202、CMAP-L-232和CMAP-L-252的预测三级结构中均在靠近N端有一段α-螺旋结构,而多肽CMAP-L-242的预测三级结构为两段α-螺旋(见图4)。由此可知,有两段α-螺旋结构的多肽抗乳腺癌活性总体上比有一段或者没有的高,靠近N端的α-螺旋多肽抗乳腺癌活性比靠近C端的高。此外,多肽CMAP-L-233、CMAP-L-243和CMAP-L-253的预测三级结构为100%无规卷曲见表3和图4),该类结构具有抗乳腺癌活性还是第一次发现。CellPPD对该3条多肽细胞渗透性的预测得分分别为5.15、5.34和5.30,表明这3条多肽的细胞渗透性较好。但是,目前还不清楚100%无规卷曲的多肽在发挥抗乳腺癌作用时是如何与细胞膜接触的进而通过哪些机制对乳腺癌细胞进行杀伤的。
关于详细讨论ACPs中α-螺旋的位置及数目对多肽抗肿瘤活性的影响至今尚未见报道,而本试验的结果表明多肽中α-螺旋结构位置和数目的改变对其抗乳腺癌活性有着明显的影响。因此,在ACPs的设计和研究过程中应关注α-螺旋结构位置和数目对其抗癌活性的作用。此外,在第二阶段的设计改造过程中,为了得到不同三级结构的多肽衍生物,我们观察了氨基酸残基的疏水性和电荷在多肽α-螺旋形成中的作用。结果表明,疏水性氨基酸残基(如Phe等)参与了α-螺旋的形成,而带电荷的氨基酸残基(如Lys等)则不利于其形成。当有3个以上的Lys残基在多肽中聚集就会阻断多肽局部α-螺旋的形成。此外,在多肽α-螺旋形成的过程中,多肽N端或C端的末端氨基酸残基不参与α-螺旋的形成,而紧靠多肽α-螺旋区一端或两端的氨基酸残基若为疏水性氨基酸则有利于α-螺旋的形成。多肽CMAP-L-20、CMAP-L-23、CMAP-L-24、CMAP-L-242、CMAP-L-25和CMAP-L-253的螺旋-轮结构图如图8所示。由图8可知,多肽一级序列中相邻的
氨基酸残基在形成α-螺旋时由于多肽主链构象的改变而相互疏远,最终导致亲水残基在一侧而疏水残基在另一侧,形成疏水面(黄色圆圈部分)和亲水面(蓝色圆圈部分),而多肽CMAP-L-253由于不能形成α-螺旋构象,因而也不能形成明显的疏水面和亲水面(图8F)。同时,我们还发现,在氨基酸残基种类和数目不变的情况下,即使是个别氨基酸残基位置的改变都会导致整个多肽三级结构的改变。因此,不论是通过何种途径对ACPs进行设计改造,都应该考虑多肽氨基酸序列的改变对其三级结构的影响。
4.2不同乳腺癌细胞对药物的敏感性差异
本试验中,选用了MDA-MB-231、MCF7、BT-474和ZR-75-1四种乳腺癌细胞来检测所设计的多肽衍生物的抗肿瘤活性。结果表明,以上4种乳腺癌细胞对同一药物的敏感性差异较大。例如,多肽CMAP-L-242在100μM的浓度下分别作用MDA-MB-231、MCF7、BT-474和ZR-75-1细胞24h后,细胞存活率分别为24.8%、58.4%、41.5%和44.5%,而在同等条件下,CDDP作用于以上4种乳腺癌细胞后,细胞存活率则分别为64.1%、53.3%、52.0%和54.7%(见图5)。其原因可能是不同的乳腺癌细胞由于细胞表面分子表达的差异性,导致其对同种药物的敏感型有所差异,而CDDP属于广谱性抗肿瘤药,通过与DNA结合后形成交联导致DNA损伤,进而干扰DNA的复制活化损伤相关的应答引起细胞凋亡(Hee-Jin Ahn等,2015)。
根据乳腺癌细胞表面ER、PR、HER2和Ki-67分子的表达差异,可将乳腺癌细胞分为Luminal A、Luminal B、HER2/neu和Basal-like四个亚型(K.B.Reddy,2011;A.Goldhirsch等,2013;Kristina Subik等,2010)。本试验中所用的4种乳腺癌细胞MDA-MB-231、MCF7、BT-474和ZR-75-1的亚型归类见表4。其中,Basal-like亚型的乳腺癌细胞ER、PR和HER2三中分子均不表达,故该亚型的乳腺癌细胞又被称为三阴性乳腺癌(Triple negative breastcancer,TNBC)。人乳腺癌细胞MDA-MB-231是TNBC中的典型代表。TNBC是恶性较强的乳腺癌亚型,常见于年轻的女性患者,与内脏器官转移相关且预后较差,但其免疫原性较其他亚型更强一些(Kristina Subik等,2010;Ashley Cimino-Mathews等,2015)。在TNBC的发生发展过程中有Cripto-1、Notch/CSL、Wnt/b-catenin和JAK2等多种信号通路的参与(Michael T等,2015;Maria Cristina Rangel等,2016)。其中,Cripto-1可被脂筏中的糖基磷脂酰肌醇(Glycosylphosphatidylinositol,GPI)的磷脂部分锚定到细胞膜上,也可以通过Smad依赖的非经典途径作为GPI锚定的硫酸肝素糖蛋白Glypican-1的配体,后者可活化酪氨酸蛋白激酶(Tyrosine protein kinase,c-Src)/丝裂原活化的蛋白激酶(Mitogen-activatedprotein kinase,MAPK)和磷酸肌醇激酶(Phosphatidylinositol 3kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)信号通路进而调控细胞的繁殖、运动和生存(Maria CristinaRangel等,2016)。
表4 4种乳腺癌细胞的亚型分类(Kristina Subik等,2010)
本试验中,通过两个阶段的设计检测共得到13条对MDA-MB-231细胞有显著抑制作用的多肽,分别是多肽CMAP-L-20、CMAP-L-201、CMAP-L-202、CMAP-L-23、CMAP-L-232、CMAP-L-233、CMAP-L-24、CMAP-L-241、CMAP-L-242、CMAP-L-243、CMAP-L-25、CMAP-L-252和CMAP-L-253,其中多肽CMAP-L-24、CMAP-L-242和CMAP-L-25对MDA-MB-231细胞的抑制作用与CDDP相比差异达到了极显著水平(Duncan-test,P<0.01),而多肽CMAP-L-253对其抑制作用与PBS组相比差异达到了极显著水平(Duncan-test,P<0.01)。这些多肽可以作为一个资源库,用于ACPs对MDA-MB-231作用机制的研究。同时,这些结果表明,在对ACPs的设计改造过程中优化多肽中的多个影响因素可以显著改善多肽的抗癌活性。
此外,通过观察不同多肽作用于MDA-MB-231、MCF7、BT-474和ZR-75-1四种乳腺癌细胞后细胞的形态变化发现,同一多肽作用于不同的乳腺癌细胞,细胞裂解死亡后的形态大致相同但略有差异,而不同的多肽作用于同一乳腺癌细胞,细胞裂解死亡后形态却不尽相同。多肽CMAP-L-20、CMAP-L-242和CMAP-L-25作用于MDA-MB-231、MCF7、BT-474和ZR-75-1四种乳腺癌细胞后细胞的形态变化如图9所示。由图9可知,多肽CMAP-L-20作用于MDA-MB-231、MCF7、BT-474和ZR-75-1四种乳腺癌细胞后均会导致大量的细胞碎片产生,多肽CMAP-L-20、CMAP-L-242和CMAP-L-25作用于MCF7细胞后也会导致细胞碎片的产生,其原因可能是以上多肽是过类似的杀伤机制作用于相应的乳腺癌细胞的;而多肽CMAP-L-20、CMAP-L-242和CMAP-L-25作用于MDA-MB-231细胞后的细胞碎片产生情况却有所不同,多肽CMAP-L-20可导致MDA-MB-231细胞产生大量碎片,但是CMAP-L-242和CMAP-L-25作用之后产生的细胞碎片却少得多,这可能是因为不同的多肽由于理化性质和三级结构的差异导致其作用机制也有所区别。
因此,在开发抗乳腺癌药物的研究中应充分考虑不同亚型的乳腺癌细胞对药物的敏感性差异,选择多种亚型的乳腺癌细胞作为受试细胞株。同时,临床上治疗乳腺癌的过程中也应该区分患者乳腺癌的亚型,针对不同的亚型选择不同的治疗手段既可改善治疗效果也会减少药物的副作用。
最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,但本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
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Lys Lys Phe Phe Lys Lys Met Lys Lys Phe Val Lys Lys Phe Leu
1 5 10 15
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
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1 5 10 15
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aagaagaaga agttcttcat gttcgtgttc ttcaagaaga agaag 45
Claims (10)
1.一种抗癌肽,其特征在于,所述抗癌肽的氨基酸序列选自以下序列中的一种:
a)、SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列;
b)、SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
2.一种抗癌肽组合物,其特征在于,所述抗癌肽组合物选自以下序列所示的两种肽:
a)、SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列;和
b)、SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
3.权利要求1所述的抗癌肽或权利要求2所述的抗癌肽组合物在制备抗乳腺癌药物中的应用。
4.一种用于抑制癌细胞增殖或者增加癌细胞凋亡的药物组合物,其特征在于,所述药物组合物包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的氨基酸序列中的一种或两种的肽,以及可药用的载体、稀释剂或赋形剂。
5.编码权利要求1所述抗癌肽的基因序列;所述基因序列为SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
6.一种载体,其包含权利要求5所述的基因序列;所述载体为pGEX-3X或pMDTM19-T。
7.一种宿主细胞,其被权利要求6所述的载体所转化。
8.根据权利要求7所述的宿主细胞,其特征在于,所述宿主细胞为大肠杆菌。
9.一种制备权利要求1所述抗癌肽的方法,其特征在于,包括如下步骤:
在培养基中和合适的培养条件下培养权利要求8所述的宿主细胞;
从培养基中或从所培养的宿主细胞中回收如此产生的抗癌肽。
10.一种制备权利要求1所述抗癌肽的方法,其特征在于,通过多肽合成仪进行人工合成。
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Conformational study of a custom antibacterial peptide cecropin B1:implications of the lytic activity;Srisailam S等;《Biochimica et Biophysica Acta》;20000615;第1479卷(第1-2期);第275页摘要/第275页右栏第一段/第276页左栏第一段 * |
Designed Antimicrobial and Antitumor Peptides with High Selectivity;Jing Hu等;《Biomacromolecules》;20111114;第12卷(第11期);第3839-3843页 * |
Rational design of α-helical antimicrobial peptide with Val and Arg residues;Qingquan Ma等;《Acta Microbiologica Sinica》;20110304;第51卷(第3期);第346-351页 * |
利用亮氨酸和赖氨酸设计新型α-螺旋抗菌肽;王良等;《微生物学通报》;20140220;第41卷(第2期);第312-318页 * |
富含亮氨酸和精氨酸的抗菌肽设计;马清泉等;《畜牧兽医学报》;20110615;第42卷(第6期);第804-807页 * |
抗癌肽改造及其对人乳腺癌MCF7作用的评估;党军龙等;《山地农业生物学报》;20160828;第35卷(第4期);第74页表1/第73页左栏第2段/第75页左栏第1段/第74页左栏第2段 * |
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