CN108546285B - 一种抗癌生物活性肽CB1a及其应用 - Google Patents

一种抗癌生物活性肽CB1a及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗癌生物活性肽CB1a及其应用，属于生物医药技术领域。抗癌生物活性肽CB1a由天蚕素B改造得到，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其对于肺癌细胞、人胶质瘤细胞、肝癌细胞等的增殖均有一定的抑制作用，CB1a多肽还可以使癌细胞处于生长静止期，并能诱导其晚期凋亡及抑制迁移。CB1a多肽能够用于制备抗癌药物，其比天蚕素B抗癌效果更好。本发明为抗癌多肽药物的开发和抗癌机理的研究奠定了良好的基础。

Description

一种抗癌生物活性肽CB1a及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及到一种抗癌生物活性肽CB1a及其应用。
背景技术
由于当前治疗癌症的方法对机体造成的损伤较大，且容易出现术后炎症反应，因此寻找高效、低毒的抗癌药物一直是当前世界范围内的研究热点之一。近年来，国内外陆续发现了一批具有生物活性的多肽如蛙皮素、蜂毒素、豹毒素等。多肽药物，尤其是抗癌肽由于具有分子量小、靶向性高、毒性低等特点，在癌症临床治疗上具有重要的研究价值及前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种毒性低、特异性强、不易形成耐药性的抗癌生物活性肽CB1a，本发明的目的还在于提供所述抗癌生物活性肽CB1a的应用。
本发明对天蚕素B(CB)进行改造后得到一种效果更好(毒性低、特异性强、不易形成耐药性)的抗癌生物活性肽CB1a，CB1a能够抑制不同类型的癌细胞。本发明通过研究发现CB1a对于肺癌细胞A549、人胶质瘤细胞LN-229、肝癌细胞HepG2等的增殖均有一定的抑制作用，CB1a多肽还可以使癌细胞(A549)处于生长静止期，并能诱导其晚期凋亡及抑制迁移，表明CB1a能够用于制备抗癌药物。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种抗癌生物活性肽CB1a，其分子量为4189.32，电荷为+12价，具体氨基酸序列为：KWKVFKKIEK-KWKVFKKIEK-AGP-KWKVFKKIEK-NH2(SEQ ID NO.1)。
所述抗癌生物活性肽CB1a或含CB1a的组合物在制备抑制癌细胞增殖的药物中的应用。
所述抗癌生物活性肽CB1a或含CB1a的组合物在制备诱导癌细胞凋亡的药物中的应用。
所述抗癌生物活性肽CB1a或含CB1a的组合物在制备抑制癌细胞迁移的药物中的应用。
所述抗癌生物活性肽CB1a或含CB1a的组合物在制备抗癌药物中的应用。
所述的癌细胞包括肺癌细胞、人胶质瘤细胞、肝癌细胞等。
本发明具有如下优点和有益效果：本发明的抗癌生物活性肽CB1a比天蚕素B(CB)抗癌效果更好，且毒性更低，为癌症的治疗提供了新的药物，为抗癌多肽药物的开发和抗癌机理的研究奠定了良好的基础。
附图说明
图1是CB1a在类膜环境中的二级结构图。
图2是不同浓度CB1a对A549细胞增殖影响的结果图。
图3是CB1a对肺癌细胞A549周期影响的结果图。
图4是CB1a处理A549细胞24h后的AO/EB染色结果图(400×)。
图5是CB1a处理A549细胞后AnnexinV-iFlour/PI双染检测细胞凋亡散点图。
图6是CB1a处理A549细胞后不同时间段的迁移变化图(100×)。
图7是CB1a对A549细胞迁移率影响的结果图。
图8是不同浓度CB1a对LN-229细胞增殖影响的结果图。
图9是不同浓度CB1a对HepG2细胞增殖影响的结果图。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
一、CB1a多肽的合成与配制
(1)CB1a多肽由强耀生物多肽有限公司合成，其氨基酸序列如下：KWKVFKKIEK-KWKVFKKIEK-AGP-KWKVFKKIEK-NH2。天蚕素B(CB)的氨基酸序列：KWKVFKKIEKMGRNIRNGIVKAGPAIAVLGEAKAL。CB1a多肽有着33个氨基酸和净+12价，由CB N-端原本的10个氨基酸KWKVFKKIEK重复3次，并且在第二次和第三次重复之间保留天蚕素的保守的铰链序列AGP构建而成。KWKVFKKIEK是两性的α-螺旋，一端亲水，一端疏水；AGP是连接2个螺旋的铰链桥。扭结处的脯氨酸残基对肽的离子通道门控和寡聚化起作用。CB1a的寡聚化影响其抗癌效果。CB1a多肽在类膜环境中的二级结构图如图1所示，CB1a会形成螺旋-铰链-螺旋的结构，且铰链具有灵活性、可变性，因而2个螺旋结构间的铰链弯曲角度在60°到110°之间。
(2)取1mg CB1a加100μL无菌水配制成2mM的储存液，10μL分装成10管，然后再取2mM的储存液稀释成若干管浓度为200μM，备用。在进行实验前，放在-20度冰箱保存。
二、A549细胞的培养与处理
肺癌细胞A549用F12K培养基(含10％FBS)进行培养，根据实验要求加入不同浓度的CB1a，对照组则使用CB处理。
三、A549细胞的活力检测
(1)接种细胞：在37℃、5％CO2培养条件下，用含10％FBS的F12K培养基在6cm皿中培养A549细胞，待细胞铺满皿底的80％左右时，将其稀释成50000个/mL，加入到96孔板中，每孔加入100μL，即接种密度在5000个/孔，边缘则用无菌的PBS进行填充。
(2)加药：设置2-4个浓度梯度的加药(CB1a)实验组、对照组(CB)，每个浓度梯度做3个重复。待前一天所铺的细胞贴壁后，弃去孔内旧的培养液并补加100μL新鲜培养基，然后于相应试验孔加入不同浓度的CB1a和天蚕素CB。
(3)加MTT：加药处理24h后，在96孔板每孔中加入20μL MTT后置于培养箱孵育4h。
(4)溶解：孵育4h后取出96孔板，小心吸弃孔内培养上清液终止培养。然后每孔加150μL DMSO，震荡8-10min，使甲臜结晶充分溶解。
(5)比色：待甲臜充分溶解后，以OD570nm测量各孔的吸光值。按下式计算存活率与抑制率：存活率(％)＝实验组平均值/阴性对照平均值×100％；抑制率(％)＝1-存活率。
结果见图2，在浓度20-100μM的浓度范围内，CB1a都比CB表现出良好的抑制肺癌细胞A459增殖能力的作用。
四、A549细胞的周期检测
(1)铺24孔培养板：用含10％胎牛血清的F12K培养基在6cm皿中培养A549细胞，待细胞生长铺满皿底的80％左右时弃掉旧的培养基，用PBS洗涤一遍后加入500μL胰酶(0.25％含EDTA)消化，将皿置于37度培养箱消化1-2min，待细胞变圆后加入1mL新鲜的含10％胎牛血清的F12K培养基终止消化，小心吹打悬浮后补加新鲜培养基至3mL。然后将细胞密度稀释成1×105个/mL，加入到24孔板中，每孔加入500μL，最后把培养板置于37℃、CO2培养箱中过夜培养12h。
(2)CB1a处理：观察A549细胞生长状态，待绝大多数细胞贴壁后就可以进行加药理：实验组细胞每孔(500μL培养液)加入终浓度为20μM的CB1a处理，对照组加终浓度为20μM的CB。
(3)收集细胞：细胞经过CB1a或CB处理24h后用胰酶消化1-2min，待细胞变圆后加入500μL新鲜培养基终止消化并吹打悬浮。然后用移液枪将细胞悬液转移至EP管中，1000rpm离心5min。
(4)洗涤细胞：弃上清，PBS洗涤2次。
(5)乙醇固定：接着加入300μL PBS溶液重悬细胞，待细胞充分分散后加入700μL无水乙醇(即终浓度为70％乙醇)悬浮，4℃固定过夜。
(6)PI染色：固定过夜的细胞于离心机3000rpm离心5min，弃掉上清，加80μL PI，4℃避光孵育30min。
(7)流式细胞仪检测：PI选用FL2通道检测。
结果见图3，CB1a处理过的癌细胞G2期只有4.8％相比CB处理癌细胞组的21.7％明显减少，同时CB1a处理过的癌细胞G1期66.5％相比CB处理癌细胞组的51.7％明显增多，说明CB1a处理组的癌细胞出现G1期周期阻滞。
五、A549细胞的凋亡检测
I AO/EB染色
(1)铺96孔板：用含10％胎牛血清的F12K培养基在6cm皿中培养A549细胞，待细胞铺满皿底后弃掉旧的培养基，胰酶消化1-2min，然后加入3mL新鲜培养基悬浮。用血球计数板进行计数，将细胞培养液的密度调整为5000个/孔，加入到96孔板中，每孔100μL，接种好的96孔板置于37℃、5％CO2培养箱培养。
(2)CB1a处理：细胞贴壁后，实验组加入终浓度为20μM的CB1a处理24h，对照组加终浓度20μM的CB处理24小时。
(3)换液：处理时间(24小时)到后，弃去旧的培养基，用PBS洗涤一次。
(4)配制AO/EB染色工作液：使用前根据用量，将AO溶液和EB溶液按体积比1:1混合配制成工作液，现用现配。96孔板每孔加100μL，配成400μL＝2μL AO(200μg/mL)+2μL EB(200μg/mL)+400μL PBS。
(5)荧光显微镜观察：把配制好的染色工作液分别加入对照组、实验组，每孔100μL。室温静置5min后在荧光显微镜下观察并拍照。
结果见图4，CB1a处理组比CB处理组在EB染色中出现更多的红色信号(图4B、D)，说明有细胞大量凋亡；在融合图像中CB1a处理组比CB处理组表现出更多的绿色和红色的融合色即黄色(图4A、C)，也说明凋亡细胞增多。
II Annexin V-iFluor488/PI双染
(1)铺24孔板：用含10％胎牛血清的F12K培养基在6cm皿中培养A549细胞，待A549细胞铺满皿底后弃掉旧的培养基，胰酶消化1-2min，然后加入3mL新鲜培养基悬浮。用血球计数板进行计数，将细胞培养液的密度调整为1×105个/孔，加入到24孔板中，每孔500μL。最后把接种好的24孔板置于37℃、5％CO2培养箱培养过夜。
(2)CB1a处理：观察A549细胞生长状态，待绝大多数细胞贴壁后就可以进行加药处理：实验组细胞每孔(500μL培养液)加入5μL浓度为80μM的CB1a处理，对照组加入5μL浓度为80μM的CB。
(3)收集细胞：细胞经过CB1a或CB处理24h后用胰酶(不含EDTA)消化1-2min，待细胞变圆后加入500μL新鲜培养基终止消化并吹打悬浮。然后用移液枪将细胞悬液转移至EP管中，1000rpm离心5min。
(4)洗涤A549细胞：弃掉上清液，然后用预冷的PBS小心吹打细胞，室温1000rpm离心5min。
(5)染色：用100μL的Assay Buffer悬浮细胞，加入1μL的100×AnneinV-iFluor488混匀后，再加1μL 100×PI混匀。
(6)孵育：避光，室温孵育30-60min。
(7)流式细胞仪检测：上机前，补加100-200μL的Assay Buffer。AnneinV-iFluor488用FL1通道，PI用FL3通道检测。Q1-LL区域细胞：PI﹣/Annexin V﹣，代表活细胞；Q1-UL区域细胞：PI﹢/Annexin V﹣，代表非凋亡的死细胞；Q1-LI区域细胞:PI﹣/Annexin V﹢，代表早期凋亡细胞；Q1-U区域细胞：PI﹢/Annexin V﹢，代表晚期凋亡细胞。
结果见图5，CB1a处理组癌细胞出现26.1％的凋亡率，CB处理组只有8.7％的凋亡率，说明CB1a有明显的诱导癌细胞凋亡的效果。
六、A549细胞的迁移检测
(1)接种细胞：接种24孔板，在接种细胞前，先用记号笔在细胞培养板后面用直尺划三道竖线，以便选取视野。然后将处于对数生长期的A549细胞用胰酶消化，再用F12K培养液调整细胞浓度至5×106个/孔(每孔500μL培养液)，置于37℃、5％CO2培养箱过夜培养。
(2)划痕：待A549细胞铺满的80％左右时，用粗细尖端相同的20μL黄枪头垂直划一条横线，与之前划的三道竖线垂直。(注意划的宽度尽量保持一致)。然后弃掉旧的F12K培养液，用PBS洗涤2-3次以洗去划掉的漂浮细胞，最后加入含1％胎牛血清的培养基培养。
(3)CB1a处理：实验组细胞每孔(500μL培养液)加入终浓度为20μM的CB1a处理，对照组加入终浓度为20μM的CB处理。
(4)显微镜观察：加药处理后立即在显微镜下拍照，然后每隔12h记录一次，直至24h为止。
(5)数据分析处理：利用image pro plus软件对所拍照片进行计算处理，分析加药后A549细胞的迁移率。
结果见图6、7，CB1a处理组的癌细胞迁移能力在12小时和24小时都比CB处理组表现弱，这说明CB1a比CB对细胞迁移能力抑制的影响大。
实施例2
一、LN-229细胞的培养与处理
人胶质瘤细胞LN-229用DMEM培养基(含10％FBS)进行培养，后续处理方式同实施例1的A549细胞的培养与处理。
二、LN-229细胞的活力检测
步骤同实施例1的A549细胞的活力检测，结果见图8，CB1a对癌细胞LN-229增殖的抑制作用强于CB。
实施例3
一、HepG2细胞的培养与处理
具体步骤同实施例1的A549细胞的培养与处理。
二、HepG2细胞的活力检测
步骤同实施例1的A549细胞的活力检测，结果见图9，CB1a对癌细胞HepG2增殖的抑制作用强于CB。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 湖北汉元基因技术有限公司
<120> 一种抗癌生物活性肽CB1a及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Lys Trp Lys Val Phe Lys Lys Ile Glu Lys Lys Trp Lys Val Phe Lys
1 5 10 15
Lys Ile Glu Lys Ala Gly Pro Lys Trp Lys Val Phe Lys Lys Ile Glu
20 25 30
Lys

Claims (2)

1.抗癌生物活性肽CB1a在制备抑制癌细胞增殖的药物中的应用，其特征在于：所述的抗癌生物活性肽CB1a的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的癌细胞为人胶质瘤细胞、肝癌细胞。
2.含抗癌生物活性肽CB1a的组合物在制备抑制癌细胞增殖的药物中的应用，其特征在于：所述的抗癌生物活性肽CB1a的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的癌细胞为人胶质瘤细胞、肝癌细胞。
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Granted publication date: 20211026

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