CN109750058A

CN109750058A - 一种白色念珠菌的研究方法

Info

Publication number: CN109750058A
Application number: CN201811324325.XA
Authority: CN
Inventors: 李长润; 曾雪
Original assignee: Anhui University
Current assignee: Anhui University
Priority date: 2018-11-07
Filing date: 2018-11-07
Publication date: 2019-05-14

Abstract

本发明公开了一种白色念珠菌的研究方法，涉及生物技术领域。包括：采用PCR技术获得白色念珠菌的Iqg1p蛋白，以其为研究对象；采用基因敲除和荧光定位筛选出Iqg1p的IQ模体、GAP、GAPC三个功能区段；构建IQ模体、GAP、GAPC三个功能区段的体外表达质粒，获得各自空间结构；采用不同诱导培养基对区段敲除后菌株菌丝进行诱导，获得各区段敲除后菌株形成菌丝最佳诱导培养基；采用Western‑Blot检测Iqg1p的GAP功能区段与Cdc42p及Rho1p在体外相互作用，获得Iqg1p蛋白在白色念珠菌细胞生物学特性。本发明方法在白色念珠菌生物特性研究上具有完整性、准确性和科学性。

Description

一种白色念珠菌的研究方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种白色念珠菌的研究方法。

背景技术

白色念珠菌，也被称为白色假丝酵母菌，此类真菌不仅会感染人的呼吸系统、消化系统、皮肤、粘膜、神经系统组织，它还可引起白色念珠菌病。在免疫力正常的人体中，它可引起皮肤黏膜浅部感染，但在免疫力低下的病人中，如艾滋病患者、化疗病人、器官移植病人等，白色念珠菌可侵入人体血液，导致致命性的深部感染，也称系统性感染。白色念珠菌是二倍体生物，呈革兰氏阳性。该菌的菌体为单细胞，呈现卯圆形、椭圆形等形状，可以在显微镜下观察到明显的牙管，直径一般分布在3～6μm之间，出芽方式繁殖，大多数是需氧型真菌。它的一个重要生物学特征是它能以单细胞的孢子体和多细胞的菌丝体等多种形态生长，这些形态可以同时并存于寄主体内。近年来随着对白色念珠菌致病机制过程的了解不断加深，治疗白色念珠菌感染的新疗法和诊断策略将不断增多。为了寻找新的有效治疗白色念珠菌感染的方法，对于白色念珠菌致病机理已有较多研究，但众多研究方法的准确性和科学性较低。

发明内容

有鉴于此，本发明实施例提供了一种白色念珠菌的研究方法，主要目的是解决白色念珠菌的研究方法不完善、准确性与科学性较低的问题。

为达到上述目的，本发明主要提供了如下技术方案：

一方面，本发明实施例提供了一种白色念珠菌的研究方法，包括以下步骤：

采用PCR技术获得白色念珠菌的Iqg1p目的蛋白，以所述Iqg1p蛋白为研究对象；采用基因敲除和荧光定位技术对所述Iqg1p蛋白的CH、IQ、GAP及GAPC功能区段逐一敲除，筛选出对细胞形态具有重要意义的Iqg1p的IQ模体、GAP、GAPC三个功能区段；构建所述IQ模体、GAP、GAPC三个功能区段的体外表达质粒，获得各自空间结构；采用不同诱导培养基对区段敲除后的菌株菌丝进行诱导培养，获得各区段敲除后的菌株形成菌丝的最佳诱导培养基；采用Western-Blot检测所述Iqg1p的GAP功能区段与 Cdc42p及Rho1p在体外的相互作用，获得Iqg1p蛋白在白色念珠菌中的细胞生物学特性。

作为优选，所述诱导培养基为液体培养基和固体培养基；所述液体培养基为LB培养基、SOC培养基、 Amp/Kan抗性培养基、YPD培养基、GMM培养基或Mal培养基；所述固体培养基为LB培养基、LB+Amp 培养基、LB+Kan培养基、YPD培养基、GMM培养基、Mal培养基、YPD+10％牛血清培养基或Spider 培养基。

作为优选，所述LB培养基的配方：10g Tryptone，5g Yeast Extract，10g NaCl，加dH₂O定容至1L， 121℃灭菌20min；所述Amp/Kan抗性培养基的配方：在100mL LB液体培养基中加入100μL 100mg/mL Amp或100mg/mL Kan 1；所述SOC培养基的配方：除含有20mmol/L葡萄糖外，其他成分与SOB培养基相同；20g Tryptone，5g Yeast Extract，0.5g NaCl，混匀使溶质充分溶解，加10mL 250mmol/L KCl 溶液，调pH为7.0，加dH₂O定容至1L，121℃灭菌20min；溶液在使用前，加入5mL灭菌的2mol/L MgCl₂，高温高压灭菌后的SOB培养基冷却至50℃左右，加20mL过滤除菌的1mol/L葡萄糖溶液，即为SOC培养基；所述YPD培养基的配方：20g Peptone，10g Yeast Extract，20g葡萄糖，加dH₂O 定容至1L，115℃灭菌30min；所述10x GMM培养基的配方：200g葡萄糖，67g Yeast Nitrogen Base without Amino Acids，加dH₂O定容至1L，搅拌均匀，待其充分溶解，用0.22μm的滤膜过滤除菌，使用时稀释10倍即可；所述10x Mal培养基的配方：200g麦芽糖，67g Yeast Nitrogen Base without AminoAcids，加dH₂O定容至1L，搅拌均匀，待其充分溶解，用0.22μm的滤膜过滤除菌，使用时稀释10倍即可；所述LB培养基、Amp/Kan抗性培养基、YPD培养基、GMM培养基、Mal培养基在液体培养基的基础上加入2％的琼脂粉即为固体培养基；所述YPD+10％牛血清固体培养基的配方：将高温高压灭菌后YPD固体培养基(90mL)冷却至50℃左右，加入10ml过滤除菌的胎牛牛血清蛋白，混匀后倒平板，每个平板约20mL左右；所述Spider培养基的配方：10g营养肉汤，10g甘露醇，2g K₂HPO₄，20g琼脂粉，调 pH为6.8，加dH₂O定容至1L，115℃灭菌30min。

作为优选，所述采用PCR技术获得白色念珠菌的目的蛋白的具体过程包括：以提取的白色念珠菌基因组DNA为模板，利用上下游引物进行PCR扩增以获得目的片段；采用一步双酶法对所述目的基因和载体进行双酶切并进行酶连反应，获得连接产物，所述目的基因与所述载体的摩尔比为1-5∶1；转化所述连接产物，获得菌液；采用PCR鉴定所述菌液；筛选阳性克隆质粒后，抽提质粒，对质粒进行酶切验证，测序，将序列完整正确的重组质粒转入大肠杆菌表达型菌株Rosetta中，构建MBP-IQ、MBP-GAP、 MBP-GAPC，pET28a-IQ、pET28a-GAP、pET28a-GAPC，GST-Cdc42及GST-Rho1蛋白的表达质粒；对目的蛋白进行表达与纯化；采用BCA技术测得纯化后目标蛋白的浓度；采用悬滴技术获得所述目标蛋白的最佳结晶体。

作为优选，所述采用基因敲除技术和荧光定位技术对所述Iqg1p蛋白的CH、IQ、GAP及GAPC功能区段逐一敲除，筛选出对细胞形态具有重要意义的Iqg1p的IQ模体、GAP、GAPC三个功能区段的具体过程包括：首先根据待敲除目的基因设计其左右同源臂的引物，然后用easy-taq酶分别扩增出左右同源臂序列AB、CD；再将二者进行融合PCR形成AD目的片段；将AD连接到T-Vector上进行酶连接；挑取阳性克隆鉴定，抽质粒，获得基因敲除质粒，构建Iqg1、Rho1、Rho1-shut off质粒；采用改进的醋酸锂转化技术将所述基因敲除质粒导入到白色念珠菌中进行同源置换，获得目标菌落；对所述目标菌落进行阳性克隆鉴定，获得阳性目标菌落。

作为优选，对于所述Iqg1p的IQ、GAP区段敲除基因序列，由于太长，采用了改进的融合PCR；具体步骤如下：应用特异性引物，对各片段进行独立扩增，特异性引物的5′-末端带有一段相邻片段的互补序列；添加第一步反应的已纯化产物，不添加引物，通过10～13个循环，复性延伸片段之间的重叠部分；将第二步反应的未纯化产物，添加外侧引物通过25～30个循环进行融合片段的全长扩增，获得目的片段后，分别将其连接到改造后的CIp10质粒，标记上GFP蛋白。

作为优选，所述采用Western-Blot检测所述Iqg1p的GAP功能区段与Cdc42p及Rho1p在体外的相互作用的具体过程包括：(1)建立Cdc42p、Rho1p过表达突变体：首先设计引物，分别将Cdc42p、Rho1p 克隆到CIp10质粒质粒上，使蛋白质在N端标记上荧光蛋白；然后根据定点突变引物设计原则设计突变引物，采用全质粒定点突变的方法，分别以克隆成功的质粒CIp10-GFP-Cdc42、CIp10-GFP-Rho1为模板，进行定点突变；PCR反应结束后，直接用DpnI进行消化处理，去除甲基化的残余模板以及半甲基化的 DNA；向50μL PCR反应物中加入1μL的DpnI限制性酶，轻轻地混合均匀，简短离心后放到37℃水浴锅中反应1h；然后取10μL DpnI消化产物转入到感受态细胞DH5α中，通过Amp抗性平板筛选阳性克隆，抽质粒进行测序，通过测序结果的对比来验证是否成功将Cdc42p 61位谷氨酰胺突变成了亮氨酸、Rho1p 67位谷氨酰胺突变成亮氨酸；通过激光共聚焦倒置显微镜来观察荧光蛋白以及细胞的形态；(2) 区段敲除菌菌丝诱导分析：分别在液体和固体培养基中培养区段敲除细胞及野生型细胞，然后诱导其菌丝生长；(3)蛋白质印迹技术：通过GST-pull down实验将与GST标记蛋白相互作用的蛋白质洗脱下来，然后利用SDS-PAGE对蛋白质进行分离，再利用通用型半干转印电泳槽将蛋白质转移到PVDF膜上，经牛奶封闭孵抗后用底物化学发光的方法来检测相互作用的蛋白质；其中，采用的抗体为His-tag鼠抗一抗，过氧化物酶标记羊抗鼠IgG，His-tag标记的蛋白质为内参；(4)Cdc42p、Rho1p与Iqg1p在功能上的作用关系：将N端标记GFP的Cdc42p、Rho1p进行突变过表达，使其一直处于激活状态，然后分别将二者转入iqg1-shut off菌株中，显微镜观察它们对于Iqg1蛋白功能缺失后造成的细胞形态缺陷具有怎样的影响；再分别取同等适量的iqg1Δ/Δ、GFP-Cdc42_iqg1-shut off、GFP-Rho1_iqg1-shut off菌液划线于YPD 平板上，倒置于30℃和42℃恒温培养箱中培养3-5天，观察它们的生长状态是否具有差异。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明通过采用基因敲除、荧光定位等技术手段准确且较为完整的研究得到白色念珠菌Iqg1p各功能区段的生物学功能。本发明通过Western-Blot找出与白色念珠菌Iqg1p相互作用的靶蛋白，然后再进一步在功能上验证它们之间的作用关系。由于Iqg1p全长较大，难以构建全长序列进行结构解析，故本发明构建了Iqg1p的IQ模体、GAP、GAPC三个功能区段的体外表达菌株，进一步表达纯化、进行晶体初筛，解析得到它们的三维结构。上述研究结果为Iqg1p在白色念珠菌的细胞形态、胞质分裂、细胞骨架等多个细胞生物学过程中的调控机制提供了重要的理论基础，也为进一步研究治疗防白色念珠菌感染的药物提供了理论依据。

附图说明

图1是本发明提供的白色念珠菌Iqg1p的结构域组成示意图；

图2是本发明提供的质粒定点突变过程示意图；

图3是本发明提供的pET30a-MBP-GAP的构建图；

(A、PrimeSTAR高保真聚合酶扩增出的GAP片段，片段大小为1053bp，以核酸Marker作为对照可以看出片段大小与目的条带一致，M代表DNAMarker；B、菌落PCR初步鉴定阳性克隆，琼脂糖凝胶电泳显示7-10号菌落为阳性克隆；C、质粒双酶切鉴定，用NotI、XhoI对抽提的质粒进行双酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳显示1、2、4号质粒切出两条片段，大条带为载体大小，小条带与目的基因条带大小相当，故抽取1，2，4号质粒各30μL送通用公司测序。)

图4-图6分别是本发明提供的MBP-IQ、MBP-GAPC及MBP-GAP试表达结果图；

图7-图9是本发明提供的MBP-IQ Ni²⁺-NTA亲和层析纯化SDS-PAGE结果图、凝胶过滤层析收集样的 SDS-PAGE结果图及MBP-IQ凝胶过滤层析峰图；

图10-图12是本发明提供的MBP-GAPC Ni²⁺-NTA亲和层析纯化SDS-PAGE结果图、MBP-GAPC凝胶过滤层析峰图及凝胶过滤层析收集样的SDS-PAGE结果图；

图13-图15是本发明提供的MBP-GAP Ni²⁺-NTA亲和层析纯化SDS-PAGE结果图、凝胶过滤层析收集样的SDS-PAGE结果图及MBP-GAP凝胶过滤层析峰图；

图16-图18是本发明提供的MBP-GAP阴离子交换层析峰图、阴离子交换层析收集样的SDS-PAGE结果图及MBP-GAP的稳定性分析SDS-PAGE图；

图19-图21是本发明提供的iqg1Δ/His质粒的构建图、iqg1Δ/His鉴定(上游)图及iqg1Δ/His鉴定(下游) 图；

图22-图25是本发明提供的CH功能区段敲除图、IQ功能区段敲除图、GAP功能区段敲除及GAPC功能区段敲除图；

图26-图44是本发明提供的iqg1Δ/Δ菌株图、野生型菌株SC5314的菌丝图、CH区段敲除菌株的菌丝图、 IQ区段敲除菌株的菌丝图、GAP区段敲除菌株的菌丝图、GAPC区段敲除菌株的菌丝图、野生型菌株 SC5314的菌丝图、iqg1Δ/Δ突变菌株的菌丝图、CH区段敲除菌株的菌丝图、IQ区段敲除菌株的菌丝图、 GAP区段敲除菌株的菌丝图、GAPC区段敲除菌株的菌丝图、野生型菌株SC5314的菌丝图、iqg1Δ/Δ突变菌株的菌丝图、CH区段敲除菌株的菌丝图、IQ区段敲除菌株的菌丝体、GAP区段敲除菌株的菌丝图及GAPC区段敲除菌株的菌丝图；

图45-图48是本发明提供的GAP-pET28a Ni²⁺-NTA亲和层析纯化SDS-PAGE结果图、目标蛋白GST亲和层析纯化SDS-PAGE结果图、Western-Blot结果图及Western-Blot对应的SDS-PAGE结果图；

图49-图53是本发明提供的iqg1-shut off菌株的形态图、Cdc42p在iqg1-shutoff菌株中过表达图、Rho1p 在iqg1-shut off菌株中过表达图、各突变菌株在YPD上的生长情况(30℃)图及各突变菌株在YPD上的生长情况(42℃)图。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下以较佳实施例，对依据本发明申请的具体实施方式、技术方案、特征及其功效，详细说明如后。下述说明中的多个实施例中的特定特征、结构、或特点可由任何合适形式组合。

实施例

菌株与质粒：E.coli TOP10与E.coli DH5α(用于扩增质粒，实验室保藏)，E.coliRosetta(表达型菌株，实验室保藏)，BWP17与Sc5314、iqg1-shut off(实验室保藏)，iqg1Δ、iqg1Δ/Δ菌株(本发明构建)； pET28a、pET28a-SUMO、pET30a-MBP、pGEX-6P-1(表达质粒，实验室保藏)，pGEM-T Easy(来自于 Promega试剂盒)，CIp10、CIp10-Rp10(实验室保藏)。

液体培养基：LB培养基、SOC培养基、Amp/Kan抗性培养基、YPD培养基、GMM培养基、Mal 培养基；固体培养基：LB培养基、LB+Amp培养基、LB+Kan培养基、YPD培养基、GMM培养基、Mal 培养基、YPD+10％牛血清培养基、Spider培养基。

配方：(1)LB培养基：10g Tryptone，5g Yeast Extract，10g NaCl，加dH₂O定容至1L，121℃灭菌20min。(2)Amp/Kan抗性培养基：在LB液体培养基(100mL)中加入100μL Amp(100mg/mL) 或Kan 100mg/mL)。(3)SOC培养基：除含有20mmol/L葡萄糖外，其他成分与SOB培养基相同。20 g Tryptone，5g Yeast Extract，0.5g NaCl，混匀使溶质充分溶解，加10mL250mmol/L KCl溶液，调 pH为7.0，加dH₂O定容至1L，121℃灭菌20min；溶液在使用前，加入5mL灭菌的2mol/L MgCl₂，高温高压灭菌后的SOB培养基冷却至50℃左右，加20mL过滤除菌的1mol/L葡萄糖溶液，即为SOC 培养基。(4)YPD培养基：20g Peptone，10g Yeast Extract，20g葡萄糖，加dH₂O定容至1L，115℃灭菌30min。(5)10x GMM培养基：200g葡萄糖，67g YeastNitrogen Base without Amino Acids，加 dH₂O定容至1L，搅拌均匀，待其充分溶解，用0.22μm的滤膜过滤除菌，使用时稀释10倍即可。(6) 10x Mal培养基：200g麦芽糖，67gYeast Nitrogen Base withom Amino Acids，加dH₂O定容至1L，搅拌均匀，待其充分溶解，用0.22μm的滤膜过滤除菌，使用时稀释10倍即可。(7)LB培养基、Amp/Kan 抗性培养基、YPD培养基、GMM培养基、Mal培养基在液体培养基的基础上加入2％的琼脂粉即为固体培养基。(8)YPD+10％牛血清固体培养基：将高温高压灭菌后YPD固体培养基(90mL)冷却至50℃左右，加入10ml过滤除菌的胎牛牛血清蛋白，混匀后倒平板，每个平板约20mL左右。(9)Spider培养基： 10g营养肉汤，10g甘露醇，2g K₂HPO₄，20g琼脂粉，调pH为6.8，加dH₂O定容至1L，115℃灭菌30min。

(1)核酸电泳相关溶液：核酸电泳缓冲液(50x TAE)：242g Tris，57.1mL冰乙酸，37.2g Na₂EDTA·2H₂O，溶于900mL去离子水中，1M浓盐酸调节pH为8.0，加ddH₂O定容至1L，使用时稀释50倍。0.8％DNA琼脂糖凝胶：称取0.24g琼脂糖加到30mL 1xTAE溶液中，微波炉加热充分溶解后，加入3μL EB染料，混匀倒入胶架，插入梳子后待凝。SDS-PAGE相关溶液：10％SDS溶液：称取 10g SDS粉末溶于90mL去离子水中，加热至68℃助溶，用ddH₂O定容至100mL。10％APS溶液：称取1g APS粉末溶于10mL去离子水中，滤膜过滤后分装，4℃保存备用。30％丙烯酰胺溶液：29g丙烯酰胺，1g甲叉双丙烯酰胺，加ddH₂O定容至100mL，装在棕色试剂瓶中，4℃保存备用。分离胶缓冲液(1.5M Tris-HCl)：称取18.17g Tris碱溶于90mL去离子水中，1M浓盐酸调节pH为8.8，用ddH₂O 定容至100mL。浓缩胶缓冲液：(1M Tris-HCl)：称取12.11g Tris碱溶于90mL去离子水中，1M浓盐酸调节pH为6.8，用ddH₂O定容至100mL。将以上溶液分别配制成12％的分离胶和5％的浓缩胶。⑥ 2x SDS-PAGE Loading Buffer：2mL 1MTris-HCl(pH 6.8)，4mL甘油，8mL 10％SDS，2mL 1％溴酚蓝，加90mL去离子水，待其充分溶解后，用ddH₂O定容至20mL，分装成小份(1mL)于室温保存。使用前每管加入25μL的β-巯基乙醇。5x Tris-甘氨酸缓冲液：称取15.1g Tris，94g甘氨酸，5.0g SDS 溶于900mL去离子水中，待其充分溶解，加ddH₂O定容至1L，室温保存，使用时稀释5倍。考马斯亮蓝染色液：称取0.25g R-250考马斯亮蓝粉末，加入90mL甲醇与水的混合物(V/V＝1∶1)，10mL冰乙酸，充分溶解后滤纸过滤，保存于棕色试剂瓶中。Western blotting相关溶液：洗涤及稀释液PBST：称取 32g NaCl，11.6g Na₂HPO₄·2H₂O，0.8g KH₂PO₄，0.8g KCl，加去离子水800mL，待其充分溶解后，加2mL Tween20，用ddH₂O定容至1L。蛋白质转移缓冲液：称取2.9g甘氨酸，5.8gTris碱，0.37g SDS，加去离子水600mL，待其充分溶解后，再加200mL甲醇，用ddH₂O定容至1L，室温保存。此溶液可重复使用2～3次。5％脱脂牛奶封闭液：称取1.5g脱脂牛奶，溶解于PBST溶液中，现配现用。His-tag鼠抗一抗溶液：用封闭液稀释至1∶2500，现配现用。过氧化物酶标记羊抗鼠IgG溶液：用封闭液稀释至1∶5000，现配现用。蛋白质诱导表达、纯化相关试剂溶液：1M Tris-HCl(pH 8.0)溶液：称取121.1g Tris碱溶于 900mL去离子水中，1M浓盐酸调节pH为8.0，用ddH₂O定容至1000mL。4M咪唑溶液：81.6g咪唑，去离子水定容至300mL，过滤后室温保存。1M NaCl溶液：233.76g NaCl，去离子水定容至1000mL，过滤后室温保存。蛋白质重悬缓冲液：量取20mL 1M Tris-HCl(pH 8.0)溶液，50mL 1M NaCl溶液，去离子水定容至1000mL。(在此溶液基础上可加入适量的咪唑、甘油、Tween20等溶液，可配置成不同的蛋白质重悬缓冲液。)1M IPTG溶液：称取2.5g IPTG粉末，去离子水定容至10mL，用0.22μm的滤膜过滤，分装成1mL，存于-20℃中，使用时将其终浓度稀释至0.5mM。0.5MEDTA溶液：称取37.22g Na₂EDTA·2H₂O，加入150mL的去离子水，充分搅拌，用NaOH粉末调节pH至8.0，EDTA才能完全溶解，加去离子水定容至200mL，高温高压灭菌，室温保存。(5)白色念珠菌转化相关溶液：1M LiAc 溶液：称取65.985g LiAc，加去离子水定容至1L，过滤除菌，4℃保存。50％PEG/LiAc溶液：称取100 g PEG4000，加1M LiAc溶液定容至200mL，过滤除菌，4℃保存。1000xHistidine溶液：称取2g组氨酸，溶解于100mL去离子水中，过滤除菌，4℃保存，使用时稀释1000倍，使其终浓度为20μg/mL。 (20μg/mL Arginine及40μg/mL Uridine溶液配制方法相同。)(6)山梨醇溶液：0.9mol/L山梨醇，100 mmol/L Tris(pH 7.6)，10mol/L EDTA。表1.分离胶

表2.5％浓缩胶

注：APS和TEMED的量可根据环境温度适当增加或者减少。

(1)目的基因扩增引物(利用primer premier 5软件设计引物，送到滁州通用生物系统有限公司进行合成，详情见表2)，PrimeSTAR高保真聚合酶(购于Takara)，T4DNA连接酶(慢酶购于Takara，快酶购于Thermo Scientific)，Easy-taq polymerase、DNA Marker、蛋白Marker(购于北京TransGen Biotech)，限制性内切酶慢酶NotI、XhoI、KpnI、PstI、ClaI、NdeI等(购于Takara)，限制性内切酶快酶BamHI、 StuI、XhoI、NdeI、AgeI等及去磷酸化酶FastAP(购于Thermo Scientific)；

(2)质粒小量抽提试剂盒、DNA回收试剂盒、PCR清洁试剂盒(Axygen，购于康宁生命科学有限公司)，BCA试剂盒(购于美国Thermo Scientific)，pGEM-T Easy载体系统I试剂盒(购于美国Promega)， CloneEZ PCR克隆试剂盒(购于南京金斯瑞生物科技有限公司)，定点突变试剂盒(购于上海生物工程有限公司)；Pierce ECL Western Blotting Substrate(购于美国Thermo Scientific)；

(3)琼脂糖、组氨酸、精氨酸、尿嘧啶，卡那霉素、氨苄霉素，D-葡萄糖、D-麦芽糖、D-甘露醇(购于阿拉丁)、Peptone、Tryptone、酵母粉、Yeast Nitrogen Base without AminoAcids(购于上海生物工程有限公司)，营养肉汤、胎牛牛血清蛋白、鲑鱼精DNA、His-tag鼠抗一抗、过氧化物酶标记羊抗鼠免疫球蛋白等，所有化学试剂均为国产或进口分析纯。

(4)琼脂糖凝胶电泳缓冲液(50x TAE)、蛋白重悬缓冲液、咪唑洗脱缓冲液、30％丙烯酰胺溶液、 10％SDS、10％APS、2x SDS-PAGE Loading Buffer、5x Tris-甘氨酸溶液、考马斯亮蓝染色液、PBST缓冲液、蛋白质转移缓冲液、封闭液、50％PEG溶液、1M醋酸锂溶液等。

主要仪器设备见表3。

表3主要仪器设备列表

实验技术与方法：

白色念珠菌基因组DNA的提取：

(1)从平板上挑取大小合适的白色念珠菌SC5314单菌落至YPD液体培养基中，30℃，160rpm摇床过夜培养；

(2)将过夜培养的菌液转移到2mL EP管中，12000rpm，室温离心1min，弃上清(菌液较清时，可多次离心将菌体沉积到一个离心管内)；

(3)菌体量大概有3个无菌接种环的量，向菌体中加入300μL山梨醇溶液(配方见附录一)，80μL 3g/L溶细胞酶(山梨醇溶液稀释)，80μL 0.28mol/L巯基乙醇，将菌体充分重悬混匀后，30℃水浴锅孵育2h。

(4)再加入150μL提取缓冲液(3％SDS，50mmol/L)，65℃水浴15min。

(5)加入300μL苯酚-氯仿-异戊醇(体积比为1∶1∶1)混合液，12000rpm，离心5min(反复抽提1～3 次直到界面不再有白色物质)；

(6)将上清转移到另一离心管中，加入2倍体积的无水乙醇上下轻轻颠倒，充分混匀，12000rpm离心10min，弃上清，室温干燥。

(7)向风干后的离心管中加入150μL 10mM Tris(pH 8.0)，1mM EDTA，1μL RNase，37℃孵育 1h。分装到PCR管中(每管20μL)，-20℃保存备用。

大肠杆菌感受态细胞的制备：以制备一种感受态细胞DH5α为例(TOP10、Rosetta制备方法相同)； (1)用枪头取少量超低温冰箱冻存的DH5α菌种，划线于LB固体培养基平板，37℃培养箱倒置过夜培养。(2)挑取E.coli DH5α单菌落接种于5mL新鲜LB液体培养基中，37℃，180rpm/min培养6h。(3) 将5mL LB小管种子液转接到300mL新鲜LB培养基中扩大培养，37℃，200rpm/min培养1-2h，至 OD₆₀₀为0.3-0.5。(4)将培养好的300mL菌液置于冰中预冷5min，然后于超净工作台中再将菌液平分到50mL已灭菌且预冷后的离心管中(分10管，每管30mL菌液)，再置于冰中预冷10min。(5)4℃离心，4000rpm/min离心5min，弃上清，收集菌体。(6)每管加入3.75mL预冷的0.1M CaCl₂溶液，轻轻摇动离心管，使菌体充分悬浮，冰浴10min，尽量洗去培养基。(7)再次4℃离心，4000rpm/min 离心5min，弃上清，收集菌体。(8)每管加入1.5mL预冷的0.1M CaCl₂溶液(含15％甘油)，冰上轻轻摇动，充分悬浮菌体。冰浴1h，每10min摇晃一次，避免菌体沉淀。(9)在超净工作台内分装， 100μL/每EP管，分装结束后标记好日期、菌种名称，置于超低温冰箱-80℃保存备用。

目的蛋白表达型菌株的构建：(1)DNA片段的获取：以提取的白色念珠菌基因组DNA为模板，利用上下游引物扩增目的片段。根据具体的实际情况，可先利用rTag酶进行梯度PCR来选择最佳退火温度。为了减少DNA突变的概率，扩增目的片段最终选用PrimeSTAR高保真聚合酶。具体的PCR反应体系如下(50μL体系)：

表4.PCR反应体系

按照上述体系依次加入样品，混匀后离心，置于PCR仪中按以下程序进行扩增：

PCR反应结束后，每管加入5μL 10x loading buffer混匀。点入0.8％琼脂糖凝胶孔中，80V电泳50min，在紫外光凝胶成像分析仪下检测PCR结果，将目的片段迅速切下放入EP管中，利用Axygen PCR回收试剂盒，对目的基因进行回收，-20℃保存用于后续实验。(2)目的基因和克隆载体双酶切及酶连反应：本实验采用一步双酶法对目的基因和载体进行双酶切，使其均产生黏性末端，利于后面的酶连反应。以 GAP目的基因连接到pET30a-MBP载体上为例，两者的双酶切体系如表5。

表5.GAP、MBP载体的双没切体系

混匀，离心后将上述酶切反应体系置于37℃水浴锅中反应6～8h，然后利用Axygen酶切反应清洗试剂盒进行酶切产物回收，再进行0.8％琼脂糖凝胶电泳定性分析酶切产物的回收量。根据核酸电泳结果确定进行酶连反应时，目的基因与载体的体积比(一般将两者的摩尔量比控制在1∶1～5∶1之间)，具体的酶连反应体系见表6。

表6.GAP与pET30a-MBP的连接体系(10μL)

混匀，离心后将上述酶连反应体系置于16℃低温恒温槽中，连接8～10h。酶连结束后，将连接产物转入到大肠杆菌感受态细胞，用LB+Kan固体培养基平板筛选阳性克隆(具体的抗性筛选是由连接载体的抗性决定的)。(3)连接产物的转化：从-80℃超低温冰箱取出感受态细胞DH5α或TOP10，置于冰上融化；在超净工作内将10μL连接产物加到含感受态细胞的EP管内，吹打均匀后，冰浴30min；将上述步骤中EP管放入42℃水浴锅中热激90s后，立即转移到冰上静置2～4min；在超净工作台内向上述含热激后的感受态细胞的EP管内加入500μL无抗的LB液体培养，37℃摇床培养1h；取上述复苏的菌液适量，涂布于相应的抗性筛选平板上，置于37℃恒温培养箱中，倒置培养10～14h。(4)菌液PCR鉴定：从过夜培养后的平板上挑取适量数目的单菌落至含有相应抗性LB培养基的96孔板的孔内，同时在平板和96孔板上做好相应的菌落标记，放入37℃摇床，200rpm培养2～3h，然后做菌液PCR鉴定。菌液 PCR的反应不需要高保真聚合酶，选用easy-Tag酶即可，反应体系如表7。

表7.菌液PCR鉴定反应体系(25μL)

将上述反应混合物混匀、离心后进行PCR反应，反应程序和目的基因PCR时的程序一样。反应结束后进行0.8％的琼脂糖核酸电泳，选出阳性克隆的标记菌落。(5)阳性克隆质粒抽提、酶切验证及测序：筛选出阳性克隆后，将其接种到5mL抗性液体培养基中扩大培养。用Axygen的质粒小抽试剂盒按照说明书步骤抽提质粒。然后对质粒进行酶切验证，酶切反应和前面的一致，只需适当缩小反应体系即可。再经核酸电泳鉴定，将酶切条带大小正确的质粒送去测序。测序结果用NCBI数据库进行比对，序列完全正确的重组质粒转入大肠杆菌表达型菌株Rosetta中，并将剩余的质粒冻存于-80℃超低温冰箱中。通过以上方法，本发明构建了MBP-IQ、MBP-GAP、MBP-GAPC，pET28a-IQ、pET28a-GAP、pET28a-GAPC， GST-Cdc42、GST-Rho1等蛋白的表达质粒。

目的蛋白的诱导表达与纯化：(1)蛋白质的试表达及诱导条件摸索：首先，对目标蛋白进行小规模的试表达，从导入重组质粒的Rosetta平板上挑取2个菌落，接入20mL含有对应抗性的液体LB培养基中，37℃摇床，200rpm培养至OD₆₀₀为0.6～0.8之间时，在超净工作台内保种到50％甘油内，-80℃冻存；再取1mL菌液到1.5mLEP管内，4℃冰箱保存，作为诱导前目标菌的蛋白表达样；剩余的菌液加入诱导剂IPTG，使其终浓度为0.5mM，放入16℃的摇床，200rpm培养20h。此时，再从菌液中取1mL 作为诱导后的蛋白表达样，4℃冰箱保存。其余菌液6000rpm，离心15min收集菌体，再加入2mL蛋白重悬液(20mM Tris-HCl，200mM NaCl，pH8.0)，用移液枪吹打将菌体充分悬浮起来，吸取1mL至 1.5mL离心管中，然后放置在浮漂上浮在冰水混合物的烧杯里，利用超声破碎仪裂解细胞，使重悬菌液清澈时，放到预冷后的高速离心机中，4℃，12000rpm，离心30min。取上清加入等体积的2x SDS-Loading buffer，沉淀加入适量的ddH2O使其悬浮及等体积的2x SDS-Loading buffer。从4℃冰箱中取出IPTG诱导前和诱导后的菌液，6000rpm，离心10min，分别收集菌体，菌体的处理方式和细胞裂解液沉淀的处理方式一样。然后，将所有的样品放到100℃的沸水中，煮6min，沉淀和菌体可以适当延长煮沸时间。然后进行SDS-PAGE来检测目标蛋白质的表达情况。理想的目标蛋白表达状况是其在上清液中，可溶性高。然而事实上，往往有些蛋白会形成包涵体，沉积在沉淀中。因此，本发明需要改变蛋白质的诱导条件，使其尽可能多溶在蛋白重悬液中，方便后续的蛋白质纯化。通常情况下，可依次改变蛋白质诱导的温度、诱导时间、诱导剂IPTG的终浓度来寻找目标蛋白的最佳诱导条件。

(2)目标蛋白的扩大培养：为了获得更多目的蛋白，需要扩大培养。从-80℃冰箱中取出保存的甘油菌种，接2μL到30mL含相应抗性的液体LB培养基中，过夜培养作为种子液。然后转接到1L 的LB液体培养基中，同样含有对应的抗生素，终浓度为100mg/mL。后续的诱导表达用试表达时摸索出来的最佳诱导表达条件组合。

(3)蛋白质的分离与纯化：细胞的收集与破碎：将诱导完成的大量菌液转移到500mL收菌瓶中， 6000rpm，15min离心收集菌体。加入35mL蛋白重悬液，将菌体细胞充分混匀。然后用超声破碎仪破碎细胞，功率设为48％，每隔4s超声破碎2s，破碎总时间为10～15min。破碎结束后，将其置入预冷后的 4℃高速离心机，12000rpm，离心40min，收集上清，弃沉淀。为了避免目的蛋白被错误地降解，笔者在破碎细胞的时加入了适量的由0.1-1mM的PMSF制成的蛋白酶抑制剂；除此之外，缓冲液里也可以加入适量甘油，以防止蛋白之间由于疏水相互作用而发生聚集沉淀的现象；加入最高浓度达2％的Triton，Tween 等非离子型的去垢剂也是一种颇为有效的方法，它可以减少背景蛋白污染和去除核酸污染。例如，在纯化MBP-GAP蛋白时，就在缓冲液中加了5％的甘油和2％的Tween 20，发现可以去除更多的杂蛋白。

His-tag蛋白过镍柱亲和层析柱：His-tag标记的目标蛋白破碎上清过镍柱之前，要对镍柱预处理，以方便目标蛋白结合。首先，加入一个柱体积的ddH₂O冲洗亲和层析柱填料，使镍柱重悬；然后加入5mL 0.1M的NiSO₄溶液，使结合到填料上的Ni²⁺达到饱和状态；再次加ddH₂O冲洗镍柱，直至滴下来的水滴为无色；最后用平衡buffer(与蛋白质重悬液相同)平衡镍柱，为蛋白质提供一个良好适宜的结合环境，所有的加样冲洗都要缓慢进行。将离心后的上清液缓慢加入到上述处理好的镍柱中，待样品全部通过镍柱后，在用不同浓度的梯度咪唑溶液进行洗脱(用平衡buffer稀释4M的咪唑母液，使其形成咪唑终浓度为 10mM、20mM、50mM、100mM、250mM、500mM、1M的洗脱buffer)，依次收集各浓度咪唑溶液洗脱下的蛋白质，分别从每个收集管中取20μL洗脱液至1.5mL的EP管中，加入等体积的2x SDS-Loadingbuffer，100℃沸水浴中煮沸6min，再按照梯度顺序依次取10μL上样到聚丙烯酰胺蛋白胶孔内，浓缩胶用120V电压进行电泳，待所有孔的蛋白质形成一条线后，换80V电压进行电泳，使蛋白质分离。 SDS-PAGE结束后，将蛋白胶转移到考马斯亮蓝染色液中，置于摇床上染色2h左右；然后倒掉染色液(染色液可重复使用)，将着上色的蛋白胶转移到清水中，放到微波炉内加热脱色，就可以分析蛋白质的镍柱纯化效果。为了去除更多的杂蛋白，可将目标蛋白洗脱液浓缩置换到无咪唑的buffer内，再次过镍亲和层析柱。镍柱使用结束后，要进行适时的处理。首先加0.1M EDTA溶液洗去Ni²⁺，直到镍柱颜色褪去，一般6mL左右；再加1mL 0.1M的NaOH溶液，使残存的蛋白质变性；不断加入ddH₂O冲洗镍柱，直到pH为中性；加满水封存柱子(若长时间不用，则用20％乙醇封柱)，放到4℃冰箱内保存。

凝胶过滤层析纯化目标蛋白：根据SDS-PAGE结果，将目标蛋白多且相对比较纯的洗脱收集液混合到一起，转移到超滤浓缩管中(根据目标蛋白分子量的大小选用规格为30KD的浓缩管)，3000rpm，4℃离心15min，轻轻摇晃超滤浓缩管，使蛋白质和滤膜壁充分接触避免沉降，如此反复直到将目标蛋白溶液浓缩到5mL。接着用移液枪将浓缩管里的目标蛋白溶液转移到2mL EP管中，放到预冷的4℃高速离心机中，12000rpm，10min。至此，凝胶过滤层析的样品已处理好。在蛋白质样品上样之前，需要做以下准备。首先准备1L蛋白质重悬buffer(20mM Tris-HCl，200mM NaCl，pH 8.0)，1L超纯水，先用0.22 μm孔径的滤膜过滤，然后超声震荡30min去除气泡；用超纯水冲洗凝胶过滤层析柱，用waste模式，设置流速10mL/min，冲洗2min消除气泡后，改为load模式冲洗柱子30min，设置流速1mL/min，然后换成蛋白质重悬buffer平衡柱子直到电导恒定(2h左右)，表明凝胶过滤层析柱已经处理好，可以上样。上样时，首先用超纯水和上样buffer(同蛋白质重悬液)清洗上样环各3次，然后上蛋白质样品。上样完成后改为inject模式，直到出现紫外吸收峰开始收集纯化后的样品，收集体积设为1.5mL。待紫外吸收峰降下来以后，依次取各收集管中的样品以及上样前的蛋白质原液样品处理，进行SDS-PAGE分析蛋白质的纯化情况。再次用超纯水冲洗凝胶层析柱，使电导变为零。

离子交换层析纯化蛋白质：离子交换层析的原理是利用各蛋白质分子表面静电荷的差异来分离不同的蛋白质分子。表面静电荷的差异越大，它们与带相反电荷的介质骨架相互作用的结合力差异就越大，就越利于各蛋白的分离。首先利用ExPASy-Compute PIMw数据库对目标蛋白理论等电点进行预测来选择离子交换柱的类型，接下来具体的离子交换操作步骤见GE Healthcare离子交换手册。处理收集的样品，进行 SDS-PAGE分析蛋白质的分离情况，定性评估蛋白质的纯度。相对较纯，则可以进行蛋白质定量和晶体初筛。

BCA法定量目标蛋白：BCA法是理想的蛋白质定量方法，BCA工作液有二奎啉甲酸(bicinchonininc acid，BCA)与CuSO₄等其他试剂组成，呈现蓝绿色。在碱性环境下，蛋白质与Cu²⁺络合，将其还原成 Cu⁺，而两分子的BCA可与一分子的一价铜离子Cu⁺螯合成蓝紫色的复合物，且蓝紫色复合物在562nm 处有最大的光吸收值并与蛋白质浓度(20-2000μg/mL)成正比，因此可测定蛋白质浓度。采用微孔板法计算蛋白质的浓度。首先将蛋白质稀释成不同倍数的浓度，每个浓度设置3个平行；按照50∶1的比例混合A液与B液，37℃水浴3min；取200μL混合液加入稀释好的蛋白质溶液25μL，37℃反应30min，按顺序依次加到96孔板内，注意加200μL蛋白稀释buffer作为空白对照；放入酶标仪内测各孔在562nm 的光吸收值。计算目标蛋白在各稀释度下的平均光吸收值，分别代入蛋白质定量公式y＝1.57x+0.0043(y 为平均光吸收值；x为蛋白质含量，单位为mg/mL)，可得到蛋白质的含量，再取平均值即为蛋白质的最终含量，-80℃超低温保存。

结晶条件的初筛与优化：蛋白质结晶方法主要分为三种：透析法、微尺度批量法、扩散法。而扩散法是目前应用最为广泛的一种，其原理是在含有高浓度的蛋白质(10～50mg/mL)溶液加入适当的溶剂，缓慢地降低蛋白质的溶解度，当接近自发性的沉淀状态时，蛋白质分子就会在整齐的堆栈下形成晶体。根据操作的不同，气相扩散法又可以细分为悬滴法、坐滴法和三明治法，本课题主要采用悬滴法进行晶体的初筛和优化。将定量的蛋白质分为三个浓度，尝试Index、Crystal screen I&II、Salt、PEGION四种常用试剂盒，共384种条件对目的蛋白进行晶体初筛。悬滴前，用超纯水对24孔悬滴晶体板超声清洗3次，每次20min，然后将其放到65℃烘箱内烘干，确保晶体生长板干燥清洁。点样时，首先在晶体板上标记清楚蛋白质名称、试剂盒名称及点晶日期；其次将凡士林涂在晶体板表明，涂抹均匀；再按照试剂盒内试剂顺序，依次取100μL槽液加到空槽内；然后在硅化好的盖玻片上将蛋白质与槽液按照1∶1的比例混合，盖上盖玻片，放置在10℃冷库中培养。一周后，通过显微镜初步观察蛋白质的结晶状况。若观察到晶体，需记录下晶体生长的试剂盒及生长条件，以便进一步优化生长条件。通常采用梯度网格法对晶体生长条件进行调整，可改变蛋白质的浓度、buffer的pH值、结晶母液的离子强度、沉淀剂的浓度及添加一些有机添加剂、还原剂和去污剂等来进行晶体生长的优化，从而获得一颗完美的单一晶体。

GFP蛋白的荧光标记：在不影响蛋白质功能的情况下，可以对目标蛋白进行N端或者C端GFP标记，可以作为目标蛋白转入细胞的筛选标记，也方便观察目标蛋白转入细胞后的表达情况及其亚细胞定位， CIp10质粒是白色念珠菌特有的整合质粒。本实施例有两种在这个质粒基础上改造的质粒，即 GFP-Gin4-CIp10，GFP-CT3-RP10-CIp10，前者没有RP10(the ribosomal protein 10 coding region，核糖体蛋白质编码序列)位点。GFP基因序列克隆到了XhoI和ClaI两个酶切位点之间，选择ClaI、PstI这对酶切位点克隆目标序列，就可以实现GFP蛋白的N端标记。CH区段敲除序列替换Gin4序列，在其N端标记了GFP；切除GFP-CT3-RP10-CIp10质粒中的CT3序列，连接Rho1p、Cdc42p基因序列。此外，本研究还对GFP-Gin4-CIp10质粒进行了改造，切除Gin4目的基因，添加了终止序列gal4-UTR，选择KpnI、Xhol双酶切位点克隆IQ、GAP、GAPC基因敲除序列，在目标蛋白C端实现了GFP标记。后续显微镜观察发现，C端标记GFP的蛋白质不表达，又将它们连接到GFP-CT3-RP10-CIp10质粒，变成N端标记GFP，在细胞内表达。没有RP10位点，携带目标蛋白序列的质粒会整合到它在白色念珠菌基因组上固有的位置；而添加了RP10位点，目标蛋白质就会在RP10位点表达。选择RP10位点有以下原因：RP10高水平表达，因此CIp10质粒可以高效的重组到其位点；染色体整合发生在一个高表达的位点可以促进整合到CIp10 载体上基因的表达，从而避免不利的位置效应；白色念珠菌基因组中有两个非常相关的RP10位点，这样即使去除一个RP10序列，也不会严重影响白色念珠菌转化菌株的生长。所以，可以作为进行相关实验研究的优选载体。

基因敲除技术：(1)基因敲除质粒的构建：本实验采用同源重组法敲除目的基因。首先根据待敲除目的基因设计其左右同源臂的引物，然后用easy-taq酶分别扩增出左右同源臂序列AB、CD，这样可以使它们两端形成Poly(A)的尾巴，便于后面连接到pGEM-TEasy Vector；再将二者进行融合PCR形成AD 目的片段；将AD连接到T-Vector上，具体的连接体系见表8。

表8.酶连体系

将试剂按照上述比例混合均匀，离心后室温下反应1h。将连接产物加到DH5α感受态细胞内，混合均匀，冰浴20min；42℃热激50s，冰上静置2min；加入600μL室温的SOC液体培养基，37℃，150 rpm培养1.5h；离心弃500μL培养基上清，将剩余的细胞培养液混匀。取100μL涂布于Amp抗性LB 固体培养基上，37℃过夜培养。挑取阳性克隆鉴定，抽质粒。用BamHI单酶切T-AD质粒，然后分别连接到同样用BamHI单酶切后的His、Arg筛选基因序列，鉴定阳性克隆，抽质粒，基因敲除质粒就构建完成了，只需选择合适的单酶切位点，就可以转入白色念珠菌内进行同源置换。本课题用上面方法分别构建了Iqg1(T-AD-His、T-AD-Arg)、Rho1(T-AD-Arg)、Rho1-shut off(T-AD-His-mal2)等质粒，实现了相关基因的敲除和关闭。对于Iqg1p的IQ、GAP区段敲除基因序列，由于太长，本实验采用了改进的融合PCR，具体步骤如下：应用特异性引物，对各片段进行独立扩增，特异性引物的5′-末端带有一段相邻片段的互补序列；添加第一步反应的已纯化产物，不添加引物，通过10～13个循环，复性延伸片段之间的重叠部分；将第二步反应的未纯化产物，添加外侧引物通过25～30个循环进行融合片段的全长扩增。获得目的片段后，分别将它们连接到改造后的CIp10质粒，标记上GFP蛋白。

(2)白色念珠菌转化：本发明采用了改进的醋酸锂(LiAc)转化法将线性化的质粒导入到白色念珠菌中。LiAc使白色念珠菌细胞呈现一种可摄取外源DNA的感受性状态；PGE一方面有利于细胞间的凝聚，促进DNA吸收，另一方面可以减少高浓度LiAc对细胞膜的损伤，保护细胞膜；鲑鱼精ssDNA则可以保护外源DNA片段免于被白色念珠菌体内DNA酶降解，还可能协助白色念珠菌摄取外源性DNA。具体的操作步骤如下：

将目标菌划线于YPD平板上活化，30℃电热恒温培养箱培养2天；从平板上挑取单克隆到5mL液体YPD中，30℃，180rpm过夜培养；接种到10mL新鲜的液体YPD中，30℃，200rpm摇床培养至 OD₆₀₀＝0.3时，再生长4h。4000rpm离心培养好的菌液，5min；弃上清培养基，用10mL ddH₂O悬浮菌体，洗去残留的培养基，4000rpm，离心5min；弃上清，用500μL LiAcbuffer重悬菌体细胞；取600μL 50％PEG到1.5mL EP管中，加10μL ssDNA，10μL线性化质粒，200μL细胞溶液，充分混匀；将上述混合物置于30℃恒温培养箱中孵育3h；再转移到44℃恒温培养箱中孵育15min；4000rpm离心5min，弃上清，取筛选的液体培养基重悬细胞，立即涂布于筛选平板上，30℃恒温培养箱中培养5天左右。

(3)菌落PCR鉴定阳性克隆：标记好待鉴定的菌落，依次挑取8个适量大小的菌落到25μL 1/2TAE 中，混合均匀；微波炉中高温旋转2min，再转移到漩涡混合器上旋转2min；12000rpm离心2min，取上清作为PCR鉴定的模板。分别用上下游2对引物，easy-Taq酶进行PCR扩增，扩增体系在表2.3的基础上各扩大1倍即可，PCR结束后进行0.8％水平核酸胶鉴定，挑取相应的阳性克隆到50％甘油中，混匀冻存于-80℃超低温冰箱中。

Cdc42p、Rho1p过表达突变体的建立：首先设计引物，分别将Cdc42p、Rho1p克隆到CIp10质粒质粒上，使蛋白质在N端标记上荧光蛋白。然后根据定点突变引物设计原则(详见定点突变试剂盒)设计突变引物，采用全质粒定点突变的方法(图2)，分别以克隆成功的质粒CIp10-GFP-Cdc42、CIp10-GFP-Rho1 为模板，进行定点突变，具体的反应体系和程序设置参照表9和表10。

表9.质粒定点突变反应体系(50μL)

表10.质粒定点突变反应程序

PCR反应结束后，直接用DpnI进行消化处理，去除甲基化的残余模板以及半甲基化的DNA。向50μL PCR反应物中加入1μL的DpnI限制性酶，轻轻地混合均匀，简短离心后放到37℃水浴锅中反应1h。然后取10μL DpnI消化产物转入到感受态细胞DH5α中，通过Amp抗性平板筛选阳性克隆，抽质粒进行测序，通过测序结果的对比来验证是否成功将Cdc42p 61位谷氨酰胺突变成了亮氨酸、Rho1p 67位谷氨酰胺突变成亮氨酸。

显微镜观察：本实验中的荧光蛋白以及细胞的形态学观察都是通过激光共聚焦倒置显微镜来完成的，其主要的实验步骤如下：1、先将绿色荧光蛋白标记的质粒转入到野生型缺陷菌株BWP17或相应的突变菌株中，30℃恒温培养箱培养，3-5天后从平板上挑取若干单菌落到对应的选择性液体培养基中，做好标记，30℃摇床，200rpm过夜培养；2、用移液枪吸取5mL相同的选择性液体培养基到50mL灭菌的离心管中，转接入500μL过夜培养的菌液到新鲜培养基中，做好相应的标记，30℃摇床，200rpm培养2 h；3、样品制备：收集500μL培养的细胞，离心后留取适量培养基混匀细胞，然后取2μL重选细胞液滴到载玻片上，用盖玻片轻轻压好细胞，注意尽量避免气泡的产生；4、细胞观察：滴一小滴与显微镜相匹配的油到60倍物镜镜头上，选择488nm的蓝色激发光来观察绿色荧光蛋白以及明场来观察一般的细胞形态。区段敲除菌菌丝诱导分析：为了探究区段敲除后，细胞菌丝形成能力的变化，分别在液体和固体培养基中培养区段敲除细胞及野生型细胞，然后诱导其菌丝生长。细胞在液体培养基中菌丝诱导的一般步骤如下：(1)从平板上挑取适当大小的菌落到对应的5mL液体培养基中，30℃，220rpm过夜培养；(2)取50μL 菌液到1.5mL EP管中，8000rpm离心2min，收集菌体；(3)加500μL灭菌的超纯水，充分重悬细胞，8000 rpm离心2min，收集菌体；(4)将水吸干，加50μL灭菌水重悬，加入800μL的YPD液体培养基，200μL 小牛血清，37℃恒温摇床诱导3h；(5)离心、收菌、清洗，加入50μL灭菌水重悬，吸取5μL显微镜观察。对于细胞在固体培养基上的菌丝生长情况，我们采用YPD+10％小牛血清和Spider培养基。制板时，小牛血清用0.22μm的滤膜进行过滤除菌，待YPD固体培养基冷却到50℃以下，加入相应比例的小牛血清。首先用SC5314野生型菌株做预实验，摸索出涂板时的最佳稀释倍数：从平板上挑取适当大小的菌落到对应的5mL液体培养基中，30℃，220rpm过夜培养；将过夜培养的菌液OD₆₀₀稀释到0.3，再依次稀释10²、10⁴、10⁶、10⁸、10¹⁰等不同的倍数，然后分别涂板，37℃恒温培养箱，培养3-5天观察细胞生长情况，通过预实验找到了细胞的最佳稀释倍数为10⁶。再分别将各区段敲除菌和野生型菌接种到相应的液体培养基中，过夜培养，将菌液OD₆₀₀稀释到0.3，再稀释10⁶，分别涂板于YPD+10％小牛血清和Spider 平板上，倒置于37℃恒温培养箱，3-5天后观察细胞菌丝的生长情况。

蛋白质印迹法：本实验先通过GST-pull down实验将与GST标记蛋白相互作用的蛋白质洗脱下来，然后利用SDS-PAGE对蛋白质进行分离，再利用通用型半干转印电泳槽将蛋白质转移到PVDF膜上，经牛奶封闭孵抗后用底物化学发光的方法来检测相互作用的蛋白质。本实验常用的抗体为His-tag鼠抗一抗，过氧化物酶标记羊抗鼠IgG，His-tag标记的蛋白质为内参，主要步骤如下：1、目标蛋白质的诱导(诱导方法同上)。2、蛋白质的纯化与结合：His-tag标记的蛋白质用镍柱亲和层析柱纯化，GST标记的蛋白质纯化如下：(1)轻轻摇动高亲和力GST纯化介质，使其充分重悬；(2)吸取适量的浆液至重力柱中； (3)用10倍柱体积的冷的蛋白重悬buffer洗涤高亲和力GST纯化介质；(4)将制备好的含GST融合蛋白质的澄清细胞裂解液加入到层析柱中，流速控制为10-15cm/h；(5)待裂解液全部流出后，加入蛋白重悬buffer清洗柱子，所需量大约为柱体积的8-15倍左右。向上述挂有GST重组蛋白的柱子中加入适量的纯化的His-tag标记的蛋白质，同时在一个新的GST柱子中加入适量的GST空载蛋白及等量的His-tag 标记的蛋白质作为阴性对照。放置到4℃振荡仪上缓慢晃动使各蛋白质和亲和树脂充分结合。2h后，弃缓冲液，继续加入蛋白重悬液进行冲洗，大约需5-8个柱体积的buffer。然后加入3mL谷胱甘肽还原酶进行最终的洗脱，脱色摇床震荡20min后，将蛋白质结合液分别收集到5mL EP管中。3、SDS-PAGE：首先对样品进行处理，加入2x SDSloading buffer，100℃煮沸5min。取10μL进行蛋白质凝胶电泳，凝胶电泳结束后，电转至PVDF膜上，同时点一块对应胶进行考马斯亮蓝染色分析。4、转膜：(1)在蛋白质凝胶电泳结束前半小时进行准备工作，将PVDF膜放到甲醇溶液中润湿，然后连同厚的滤纸一起放到装有转移液的盒子中，浸泡30min左右；(2)SDS-PAGE结束后，将分离胶也浸泡在转移液中，然后组装“三明治”结构，顺序为：厚滤纸、PVDF膜、蛋白胶、厚滤纸，注意避免气泡的产生；(3)盖上半干转印电泳槽槽盖，调节电压为10v，40min。5、牛奶封闭：将现配的5％的牛奶封闭液倒入洗膜盒中，然后把转移后的PVDF膜浸没在封闭液中，4℃过夜孵育。6、洗膜：将封闭液倒掉，换成PBST溶液，震荡摇床上洗10min，反复进行3次。7、孵育一抗：配制His-tag鼠抗一抗溶液，将PVDF膜转移到一抗溶液内，常温孵育3h。8、洗膜：回收一抗溶液，用PBST溶液洗涤3次，每10min一次。9、孵育二抗：配制过氧化物酶标记羊抗鼠IgG溶液，将洗过的PVDF膜转移到二抗溶液内，常温孵育1.5h。10、ECL 孵育：在暗室中，先用适量的ECL显色液浸润PVDF膜，用枪头轻轻铺平液体，避免气泡的产生，孵育 2min，然后用透明胶带将保鲜膜包好的PVDF膜固定在暗盒内。11、曝光：在PVDF膜上方压上柯达医用X光胶片，盖上曝光盒，将曝光时间分别设为5min、10min、30min，等曝光时间一到，立即将胶片转移到显影液中，轻轻摇晃，待清晰的条带出现后，转移到定影液中进行最终的定影。12、若曝光效果不好，需重新孵育一抗，将PVDF膜从保鲜膜中取出放到洗膜盒中，PBST缓冲液洗3次，每次10min，然后根据步骤7-11重复进行。

Cdc42p、Rho1p与Iqg1p在功能上的作用关系：通过WB找出与Iqg1p相互作用的蛋白质，为了进一步印证它们之间的相互作用关系，本课题又做了一些功能上的研究。首先，将N端标记GFP的Cdc42p、 Rho1p进行突变过表达，使其一直处于激活状态，然后分别将二者转入iqg1-shut off菌株中，显微镜观察它们对于Iqg1蛋白功能缺失后造成的细胞形态缺陷具有怎样的影响；另外，再分别取同等适量的iqg1Δ/Δ、 GFP-Cdc42_iqg1-shut off、GFP-Rho1_iqg1-shut off菌液划线于YPD平板上，倒置于30℃和42℃恒温培养箱中培养3-5天，观察它们的生长状态是否具有差异。

目的蛋白表达质粒的构建结果：为了获得Iqg1p各功能区段的三维结构，本实验利用酶切酶连的方式，构建了IQ、GAP、GAPC表达质粒，现以pET30a-MBP-GAP克隆为例。A、PrimeSTAR高保真聚合酶扩增出的GAP片段，片段大小为1053bp，以核酸Marker作为对照可以看出片段大小与目的条带一致，M 代表DNAMarker；B、菌落PCR初步鉴定阳性克隆，琼脂糖凝胶电泳显示7-10号菌落为阳性克隆；C、质粒双酶切鉴定，用NotI、XhoI对抽提的质粒进行双酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳显示1、2、4号质粒切出两条片段，大条带为载体大小，小条带与目的基因条带大小相当，故抽取1，2，4号质粒各30μL送到通用公司测序。

目标蛋白的表达纯化：将测序结果的氨基酸形式分别与对应的IQ、GAP、GAPC 3个功能区段的氨基酸序列(表11-13)进行比对，序列正确的质粒转入表达型菌株Rosetta中，先分别进行小剂量的试表达，若目标蛋白表达在上清溶液中，再进行镍柱亲和层析柱分析，经前两步初步试验，本研究最终选定 pET30a-MBP载体作为各目标蛋白的标签蛋白。

表11.IQ的氨基酸序列

表12.GAP的氨基酸序列

表13.GAPC的氨基酸序列

从20mL小量的菌液试表达结果可看出，MBP-IQ，MBP-GAPC，MBP-GAP目标蛋白都能够在终浓度为0.5mM的IPTG诱导下顺利表达，细胞破碎后有大量目标蛋白溶在上清中，因此便于接下来大批量表达蛋白时的进一步纯化。扩大培养并诱导目标蛋白MBP-IQ的表达，2L诱导菌液超声破碎后，将上清进行Ni²⁺-NTA的亲和层析纯化，收集蛋白质洗脱液，处理后进行SDS-PAGE分析，结果见图5。结果显示该蛋白质挂柱效果不理想，大多数的蛋白质都随蛋白重悬buffer溶到流川里，只有少数的蛋白质结合到镍柱上。挂在镍柱上的目标蛋白，用梯度咪唑溶液洗脱，发现该蛋白可被250mM咪唑、500mM咪唑洗脱液洗脱下来。将250mM咪唑、500mM咪唑洗脱液洗脱下来的目标蛋白质收集混合，于30KDa的超滤浓缩管中离心浓缩至5ml，然后将样品上样到处理好的superdex G200凝胶层析柱中进行分子筛纯化，其紫外吸收的峰图见6。发现上样40分钟后紫外吸收峰开始出现，且仅有一个峰，表明该蛋白质的均一性良好，挑取吸收峰处收集的蛋白质纯化样品进行SDS-PAGE。SDS-PAGE结果表明，MBP-IQ蛋白量不仅少且依然有杂蛋白存在，尝试培养更多的目标蛋白表达菌，纯化效果依然不理想。同样扩大培养目标蛋白MBP-GAPC并诱导其表达，2L菌液超声破碎后，上清进行Ni²⁺-NTA亲和层析纯化，收集蛋白质洗脱液，处理后进行SDS-PAGE分析，结果见图8。结果显示该蛋白质挂柱效果和MBP-IQ蛋白一样，都不理想，大多数的目标蛋白质都在流川里，只有少数的蛋白质结合到镍柱上。用梯度咪唑溶液洗脱，发现该蛋白可被100mM咪唑、250mM咪唑洗脱液洗脱下来。将100mM咪唑、250mM咪唑洗脱液中的目标蛋白收集于30KDa的超滤浓缩管中，离心浓缩至5mL，然后将样品上样到处理好的superdex G200凝胶层析柱中进行分子筛纯化，其紫外吸收的峰图和对应的SDS-PAGE分析见图9和图10。发现上样40分钟后，开始出现紫外吸收峰，且仅有一个峰，表明该蛋白质的均一性也良好，挑取吸收峰处收集的样品进行 SDS-PAGE分析，结果表明该蛋白质在量少的情况下，杂蛋白较少。后进一步扩大培养，纯化效果仍然不太理想。所以目前，MBP-GAPC和MBP-IQ这两个蛋白质仍然处在最佳溶解buffer及蛋白质纯化条件的摸索阶段，没有办法进行下面的晶体初筛。扩大培养MBP-GAP蛋白，2L的诱导菌破碎后过镍离子亲和层析柱，用梯度咪唑洗脱液依次洗脱，处理样品并进行SDS-PAGE分析，见图11。结果显示，虽然流川里有一定量的目标蛋白质存在，但仍然有大量的目标蛋白质结合到了镍柱上，用梯度咪唑buffer洗脱发现各浓度咪唑下均有目标蛋白质被洗脱下来，但50mM咪唑、100mM咪唑、250mM咪唑浓度下洗脱下来的目标蛋白质浓度比较大。将50mM咪唑、100mM咪唑、250mM咪唑浓度下洗脱下来的目标蛋白质混合在一起，离心浓缩至5mL，然后高速离心去除杂质沉淀，上样至平衡好后的superdex G200凝胶过滤层析柱中进行纯化，紫外吸收峰开始出现时，收集纯化后的蛋白质溶液。由紫外吸收的峰图可知，存在两个峰，通过SDS-PAGE分析可知这两个峰图的蛋白质都是目标蛋白，说明MBP-GAP蛋白质有一部分聚体存在；单看每一个峰，峰图的对称性相对比较高，说明每个峰图部分的蛋白质状态比较均一；几乎没有杂峰说明蛋白质的纯度较好，将两个峰图处的蛋白质收集液分别处理，然后进行SDS-PAGE分析，也说明了蛋白质的纯度相对比较好。分子筛是根据不同分子量大小蛋白的流经路线不同从而达到分离蛋白的目的，分子量大的蛋白质从凝胶孔径间先流出来，而分子量小的蛋白质可进到凝胶孔径内，因此流经路径较长，较之于大分子量蛋白会晚一些时间流出来；为了保证目标蛋白质的均一性及易于长出晶体，将分子筛纯化后的样品收集，进一步纯化，即将后面的峰对应的蛋白质样品混合并转移到30KDa的超滤浓缩管中离心浓缩至10mL，然后采用泵上样，进行阴离子交换层析，从峰图的整体趋势可以看出，洗脱峰更加对称且基本上没有拖尾现象，说明蛋白质更为均一。取紫外吸收峰处的收集样品进行SDS-PAGE，相对于如此大量的目标蛋白，杂蛋白已经相对较少，因此将阴离子交换柱分离纯化的蛋白质收集液混合，低温离心浓缩至500μL左右，经BCA法测得蛋白质浓度为92mg/mL。取一小部分蛋白质稀释后放置于4℃冰箱中，隔天取样进行SDS-PAGE分析，结果表明MBP-GAP蛋白质相当稳定，不降解；将目标蛋白质分成三个浓度梯度，即原始浓度，1/3原始浓度，1/6原始浓度，手动点晶体进行初筛。目前尝试了Index、Crystal screen I&II、Salt、PEGION四种常用试剂盒，处于等待晶体生长阶段。

基因敲除及关闭质粒的构建结果：为了探究一些功能基因蛋白的具体作用和它们之间是否存在一定的相互作用关系，本文利用酶切酶连的方式，构建了iqg1基因敲除和关闭的相关质粒，现以iqg1Δ/His质粒的构建过程为例。用同样的方式构建iqg1Δ/Arg质粒，然后采用改进的醋酸锂转化法将构建完的质粒导入到相应的缺陷菌株中，并涂布于相应的筛选平板上，根据同源置换的原理进行相关基因的敲除。待筛选平板上长出菌落，用上下游两对鉴定引物初步筛选阳性克隆。菌落PCR鉴定结果表明，2、3、4号菌落上下游都扩增出来相应的目的片段，条带大小正确且比较清晰，故初步鉴定为阳性克隆，接下来显微镜观察是否有形态上的缺陷可进一步鉴定。

Iqg1p各功能区段敲除菌的形态变化：白色念珠菌Iqg1p是一个非常重要的支架蛋白，它有4个功能结构域，参与到多种细胞活动中。为了研究白色念珠菌Iqg1p各功能区段对细胞形态具体影响，本实施例先构建各功能区段敲除的质粒，并在其N端标记上GFP蛋白，分别敲除各个功能区段，然后显微镜下观察细胞的形态，并与iqg1Δ/Δ缺陷菌株进行形态比较。

从图中iqg1Δ/Δ突变菌株有明显的形态缺陷，不能形成正常的单细胞，细胞增大，细胞成串形成假菌丝。图显示的是CH功能区段敲除以后的细胞形态，细胞也成串，形成假菌丝，但是与iqg1Δ/Δ突变菌株相比，形态缺陷没有后者的明显；图是IQ功能区段敲除突变菌株，显微镜观察细胞形态，显示细胞变大且成串连接，没有iqg1Δ/Δ突变菌株缺陷突出，但是较之于CH功能区段敲除菌株更为明显；图是GAP 功能区段敲除菌株，细胞成串形成假菌丝，缺陷十分突出；GAPC功能域敲除以后，细胞形态缺陷更尤为明显。推测iqg1基因及其各功能区段的分别敲除所造成的的细胞形态缺陷，即无法形成单细胞，细胞成串等缺陷，可能是由于这个基因在细胞胞质分裂过程中发挥着重要的作用，它的缺失和不完整造成了胞质分裂失败。基于此推测，从各功能区段敲除后的形态缺陷可看出，Iqg1p的N端功能结构域对于胞质分裂的正常进行不是那么重要，而Iqg1p的C端功能结构域控制着细胞分裂的顺利完成，对于细胞正常形态的形成十分重要。

Iqg1p各功能区段敲除菌菌丝诱导情况：Iqg1p各功能区段敲除以后，细胞出现了不同的形态缺陷。因此，本课题想进一步探讨功能区段敲除以后，各缺陷菌株的菌丝诱导情况有什么变化。首先在液体培养中诱导菌丝生长，然后制片，放置于激光共聚焦显微镜下观察菌丝的形态。

图是野生型菌株SC5314在液体培养基中生长的菌丝，菌丝细长，细胞成团；CH功能区段敲除以后，突变菌株在液体培养基中的菌丝生长与野生型菌株的菌丝生长，基本没有区别，都形成细长的菌丝；IQ 区段敲除菌株的菌丝变得短小，说明菌丝生长能力不如野生型菌株强；GAP功能区段敲除以后的突变型菌株，它在液体中的菌丝变得短小且比较粗；GAPC区段敲除菌株的菌丝缺陷则更为严重，菌丝长度更短，菌丝的横向直径更大；以上实验结果表明，IQ、GAP、GAPC 3个功能区段控制着细胞菌丝的正常生长，从而对于白色念珠菌的致病性具有重要的意义；而CH功能区段在菌丝生长方面的作用似乎并不大。另外，完全敲除Iqg1p，细胞则丧失在液体培养基中的菌丝形成能力，说明了Iqg1p在细胞菌丝形成以及白色念珠菌病原体的侵袭力方面是必不可少的。此外，本发明还做了有关Iqg1p各功能区段敲除菌在固体平板上形成菌丝能力的研究，具体探讨了各突变菌株在Spider培养基平板和营养丰富培养基YPD+10％牛血清平板上的菌丝生长情况。上述实验结果显示，在Spider培养基上，野生型菌株SC5314形成正常的圆润的孢子和细长的菌丝；iqg1Δ/Δ突变菌株只能形成单菌落，无菌丝生长；CH和GAP功能区段敲除以后，在Spider 培养基上仍然能够形成正常的孢子和菌丝；IQ区段敲除菌株的菌丝有明显的缺陷，菌丝相对变短，孢子变大且不规则；GAPC区段敲除菌株在Spider培养基上形成的菌落则表现为菌丝正常，孢子变小。

图表明，野生型菌株SC5314在YPD+10％牛血清平板上也能够形成菌丝，只是菌丝较短小，没有在 Spider固体培养基上形成的菌丝长，也没有其在相对应的液体培养基中的菌丝生成能力强，表明白色念珠菌在液体环境中的侵袭力更强；iqg1Δ/Δ突变菌株，IQ和GAP功能区段敲除菌，在YPD+10％牛血清平板上都丧失了菌丝形成能力；而CH和GAPC功能域去除以后，大部分细胞也不能再形成菌丝，只有极少数细胞可以形成菌丝。以上3个菌丝诱导实验表明，Iqg1p控制菌丝的生成，各功能区段敲除以后，其菌丝生成能力根据不同诱导条件表现出不同的情况；白色念珠菌病原体在液体培养基中比固体培养基中的菌丝形成能力强，在Spider固体平板上比YPD+10％牛血清平板上的菌丝生长能力强。

Western-Blot检测与Iqg1p相互作用的靶蛋白：以往的相关研究表明，Rho GTPase家族在真核生物中具有一定的功能保守性，参与到许多细胞生物学的调控过程中，例如胞质分裂、细胞的定向生长、极性建立等生物学过程。有研究表明，Iqg1p的同源蛋白IQGAP1与Cdc42p具有功能上的相互作用；因此，本研究通过Western-Blot检测Iqg1p与Cdc42p及Rho1p在体外是否具有相互作用。首先通过酶切酶连的方式构建了GAP-pET28a、Rho1-GST、Cdc42-GST蛋白表达型质粒，分别通过镍柱亲和层析柱和GST亲和层析柱纯化目标蛋白。Western-Blot检测结果显示，Iqg1p的GAP功能区段和Rho1p及Cdc42p在体外具有较强相互作用。

Rho1p、Cdc42p蛋白过表达对Iqg1-shut off缺陷的影响：首先构建N端GFP蛋白标记的Rho1、Cdc42 的过表达突变质粒，即将Cdc42p 61位谷氨酰胺突变成亮氨酸，Rho1p 67位谷氨酰胺突变成亮氨酸，使 Rho1p、Cdc42p一直处于激活状态，然后将过表达质粒转入iqg1-shut off突变菌株内，激光共聚焦显微镜下观察细胞形态的变化。显微镜观察结果显示，iqg1-shut off菌株具有十分明显的形态缺陷，无法形成正常的单个细胞，而形成枝丫状的假菌丝，且假菌丝较长，基本没有单细胞存在；Cdc42p在iqg1-shut off 菌株中过表达，细胞形态缺陷得到了一定的补偿，虽然还有十分明显的形态缺陷，但假菌丝的长度明显变短；Rho1p过表达，iqg1-shut off菌株的形态缺陷得到了更多的补偿，大量的枝丫状假菌丝已经不存在。由此说明Rho1p、Cdc42p在功能上也与Iqg1p有很强的相互作用，可以在一定程度上弥补Iqg1p缺失造成的细胞形态上的缺陷，推测三者在细胞正常分裂的过程中可能具有一定的协作互促作用。在细胞培养过程中，发现iqg1-shut off突变菌株与在iqg1-shut off菌株中过表达Cdc42p和Rho1p的突变菌株相比，前者的生长速度较慢。因此，猜测这三个突变菌株在相同的生长环境下，生长能力具有一定的差异，那是否说明它们对环境的耐受力也有一定的差异呢？因此，设计了以下实验进行验证。图显示，三种突变菌株都能够在白色念珠菌的最佳生长温度30℃下生长良好，但iqg1-shut off菌株在YPD平板上形成的菌落较小，生长能力较之于在其细胞内过表达Cdc42p或Rho1p的突变菌株弱；从图可以看出，Cdc42p和Rho1p过表达，iqg1-shut off菌株的环境适应能力增强，在42℃高温下依然能够生长存活，其中，Rho1p过表达使iqg1-shut off菌株的环境耐受力最高；但是Cdc42p和Rho1p正常表达的iqg1-shut off菌株则不能够在此高温下存活。

基因敲除标记物His、Arg的引物：

His1-BamHI-F aaaggatccTTAGTAGTAATTTGGTAGTGaaaacc

His1-BamHI-R aaaggatccTGGGTACACAAGTTGAACtccc

Arg-5′p aataggatccagtaagatttttcAAGAGtagtctcaaa

Arg-3′p atatggatccATTGTAGTACAAGgtatctctgtgttaat

基因敲除标记物His、Arg的鉴定引物：

His-332fw：5′AGAAAGCTGGTGCAACCGAT3′

His148-re：5′TGTATCCTCTTCTGTCCCCA3′

Arg-473F：5′GATGCATTGACTACAGTAGAACA3′

Arg333-R：5′GTTGTTGTTGGGATGGCCA3′

iqg1Δ引物：

iqg1-A：GGGAAGAGAAAAAGAGGATAC

iqg1-B：TTTAGTGTGTCCCCTTTTGGT

iqg1-C：ACCAAAAGGGGACACACTAAAggatccAGCCTATTCATTGCCAATACC

iqg1-D：GTTGGCTGAGGTGGTAACT

Arg-Iqg1-F：AGGGGACACACTAAAggatccagtaagatttttcAAGAGtagtctcaaa

Arg-Iqg1-R：GGCAATGAATAGGCTggatccATTGTAGTACAAGgtatctctgtgttaat

CH区段敲除引物(N端标记GFP)：

Iqg1-NT1200del-ClaI-F：GGATGAATTGTACAAAatcgatAAAATTAGTAGGGATGACCCCTTTACTG

Iqg1-NT1200del-PstI-R：GCGTGAATTCGATGGGctgcagCAAATCTTGACCAGATTTTGTCTGA

IQ、GAP区段敲除引物(C端标记GFP)：

Iqg1-361-KpnI-F：aaaaggtaccTCTGATGAAACTCCTAGTTGGG

IQdel-1200-R：GTTTGTAAGCATTTTGAGCAAAAACGGAGAGTCCGCTAGAATCTT

IQdel-2401-F：AAGATTCTAGCGGACTCTCCGTTTTTGCTCAAAATGCTTACAAAC

Iqg1-CT-XhoI-R：acttctcgagTTATTCTTTCTTCAAATCATAGAACTTTC

GAPdel-F：GCACAGGCAATTTTGCAACGTTTTTTGAAACCATTGAATGAGTACAT

GAPdel-R：ATGTACTCATTCAATGGTTTCAAAAAACGTTGCAAAATTGCCTGTGC

GAPC区段敲除引物(C端标记GFP)：

GAPCdel-KpnI-F：aaaaggtaccAGCACATCAAGCAAGTTGTTAAAG

GAPCdel-Xhol-R：atttctcgagAATGATTGACTTAACGGTGTCG

IQ、GAP区段敲除引物(N端标记GFP)：

Iqg1-NT-ClaI-F：GGATGAATTGTACAAAatcgatATGGCGATTGGTAATATAGCAG

Iqg1-CT-PstI-R：AAAACGAACTCATCActgcagTTATTCTTTCTTCAAATCATAGAACTTTC

IQdel-2401-F：

AAGATTCTAGCGGACTCTCCGTTTTTGCTCAAAATGCTTACAAAC

Iqg1-CT-XhoI-R：

acttctcgagTTATTCTTTCTTCAAATCATAGAACTTTC

GAPdel-F：GCACAGGCAATTTTGCAACGTTTTTTGAAACCATTGAATGAGTACAT

GAPdel-R：ATGTACTCATTCAATGGTTTCAAAAAACGTTGCAAAATTGCCTGTGC

GAPC区段敲除引物(N端标记GFP)：

Iqg1-NT-ClaI-F：GGATGAATTGTACAAAatcgatATGGCGATTGGTAATATAGCAG

GAPC-del-PstI-R：AAAACGAACTCATCActgcagAATGATTGACTTAACGGTGTCG

Cdc42、Rho1-N端标记GFP蛋白引物：

cdc42-CalI-F：cctatcgatATGCAAACTATAAAATGTGTTGTTGT

cdc42-PstI-R：gggctgcagCTATAGCCTCGTCAAACACTG

Rho1-CalI-F：cctatcgatATGGTTAACGGTCCAGCTGAACTTCG

Rho1-PstI-R：aaactgcagTTACAAGACAACACATTTCTTCTTCT

Cdc42、Rho1蛋白点突变引物：

cdc42Q61L-mutation-F：TATTTGATACTGCTGGTctaGAAGATTACGACAGATT

cdc42Q61L-mutation-R：AATCTGTCGTAATCTTCtagACCAGCAGTATCAAATA

rho1Q67L-mutation-F：TATGGGATACTGCTGGTctaGAAGATTATGATAGATT

rho1Q67L-mutation-R：AATCTATCATAATCTTCtagACCAGCAGTATCCCATA

rho1敲除引物：

rho1-A：CAGTCGATATTAGAGAAGACCAA

rho1-B：AAAGGGGAAGAGGGGAGG

rho1-C：CCTCCCCTCTTCCCCTTTggatccGAACAAGAAGAAGAAGAAGAAGC

rho1-D：GGCGATAAGGGAGTAGTTATC

rho1关闭引物：

rho1-shutoff-C：CCTCCCCTCTTCCCCTTTggatccATGGTTAACGGTCCAGCTGAA

rho1-shutoff-D：CTTCAATAGTATGAGGATCATCTC

rho1-HIS1_Mal2-F：CCCCTCTTCCCCTTTggatccTTAGTAGTAATTTGGTAGTGaaaacc

rho1-HIS1_Mal2-R：TGGACCGTTAACCATggatccTGTAGTTGATTATTAGTTAAACCACTG

rho1敲除鉴定引物：

rho1-A1：GTTTTCGGCCCTATCGTTTGA

rho1-D1：ACTTGGAGGAGGTAGATGAG

rho1关闭鉴定引物：

rho1-A1：GTTTTCGGCCCTATCGTTTGA

His148-re：CACTGTATCCTCTTCTGTCCCCA

mal2-454F：GCGATAGACGAAGACACGGTATAA

rho1-shutoff-D1：TCAGAAGTTGAGACTGGTTGTTGTTG

GFP-iqg1引物：

Iqg1-GFP-ClaI-F：ggggatcgatATGGCGATTGGTAATATAGCAG

Iqg1-GFP-PstI-R：tttctgcagTCGATTGGCAGTTCGAATGTC

IQ区段克隆引物：

IQ-Not1-F：gccgcggccgcgTCTGACTATTATACCCCAGAGTTG

IQ-Xhol-R：cgcctcgagGTAGTCACTAAACTCATAAATCGATCCTCTCATCAACTTCCC

GAP区段克隆引物：

GAP-Not1-F：ccggcggccgccAATTTGGAACGATTGAATAAATCATTGAAG

GAP-Xhol-R：ggcctcgagCAACTTAGGTCTCTGATGAGTCA

GAP-C区段克隆引物：

GAPC-Not1-F：ccggcggccgccACCGATTTGTCATCGGTTACTTTG

GAPC-Xhol-R：cgcctcgagCTCATACTGCAATGCCAACAATTC

Cdc42克隆引物：

CDC42-BamH1-F：gccggatccATGCAAACTATAAAATGTGTTGTTGTC

CDC42-Sal1-R：ggccgtcgacCTATAAAATAGTACACTTTTTCGATTTTTT

Rho1克隆引物：

Rho1-BamH1-F：gccggatccATGGTTAACGGTCCAGCTGAA

Rho1-Sal1-R：ggccgtcgacTTACAAGACAACACATTTCTTCTTCTTTT

以上公开的仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以上述权利要求的保护范围为准。

Claims

1.一种白色念珠菌的研究方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

采用PCR技术获得白色念珠菌的Iqg1p目的蛋白，以所述Iqg1p蛋白为研究对象；

采用基因敲除技术和荧光定位技术对所述Iqg1p蛋白的CH、IQ、GAP及GAPC功能区段逐一敲除，筛选出对细胞形态具有重要意义的Iqg1p的IQ模体、GAP、GAPC三个功能区段；

构建所述IQ模体、GAP、GAPC三个功能区段的体外表达质粒，获得各自空间结构；

采用不同诱导培养基对区段敲除后的菌株菌丝进行诱导培养，获得各区段敲除后的菌株形成菌丝的最佳诱导培养基；

采用Western-Blot检测所述Iqg1p的GAP功能区段与Cdc42p及Rho1p在体外的相互作用，获得Iqg1p蛋白在白色念珠菌中的细胞生物学特性。

2.如权利要求1所述的一种白色念珠菌的研究方法，其特征在于，所述诱导培养基为液体培养基和固体培养基；所述液体培养基为LB培养基、SOC培养基、Amp/Kan抗性培养基、YPD培养基、GMM培养基或Mal培养基；所述固体培养基为LB培养基、LB+Amp培养基、LB+Kan培养基、YPD培养基、GMM培养基、Mal培养基、YPD+10％牛血清培养基或Spider培养基。

3.如权利要求2所述的一种白色念珠菌的研究方法，其特征在于，所述LB培养基的配方：10g Tryptone，5g Yeast Extract，10g NaCl，加dH₂O定容至1L，121℃灭菌20min；

所述Amp/Kan抗性培养基的配方：在100mL LB液体培养基中加入100μL 100mg/mL Amp或100mg/mL Kan 1；

所述SOC培养基的配方：除含有20mmol/L葡萄糖外，其他成分与SOB培养基相同；20gTryptone，5g Yeast Extract，0.5g NaCl，混匀使溶质充分溶解，加10mL 250mmol/L KCl溶液，调pH为7.0，加dH₂O定容至1L，121℃灭菌20min；溶液在使用前，加入5mL灭菌的2mol/LMgCl₂，高温高压灭菌后的SOB培养基冷却至50℃左右，加20mL过滤除菌的1mol/L葡萄糖溶液，即为SOC培养基；

所述YPD培养基的配方：20g Peptone，10g Yeast Extract，20g葡萄糖，加dH₂O定容至1L，115℃灭菌30min；

所述10x GMM培养基的配方：200g葡萄糖，67g Yeast Nitrogen Base without AminoAcids，加dH₂O定容至1L，搅拌均匀，待其充分溶解，用0.22μm的滤膜过滤除菌，使用时稀释10倍即可；

所述10x Mal培养基的配方：200g麦芽糖，67g Yeast Nitrogen Base without AminoAcids，加dH₂O定容至1L，搅拌均匀，待其充分溶解，用0.22μm的滤膜过滤除菌，使用时稀释10倍即可；

所述LB培养基、Amp/Kan抗性培养基、YPD培养基、GMM培养基、Mal培养基在液体培养基的基础上加入2％的琼脂粉即为固体培养基；

所述YPD+10％牛血清固体培养基的配方：将高温高压灭菌后YPD固体培养基(90mL)冷却至50℃左右，加入10ml过滤除菌的胎牛牛血清蛋白，混匀后倒平板，每个平板约20mL左右；

所述Spider培养基的配方：10g营养肉汤，10g甘露醇，2g K₂HPO₄，20g琼脂粉，调pH为6.8，加dH₂O定容至1L，115℃灭菌30min。

4.如权利要求1所述的一种白色念珠菌的研究方法，其特征在于，所述采用PCR技术获得白色念珠菌的目的蛋白的具体过程包括：以提取的白色念珠菌基因组DNA为模板，利用上下游引物进行PCR扩增以获得目的片段；采用一步双酶法对所述目的基因和载体进行双酶切并进行酶连反应，获得连接产物，所述目的基因与所述载体的摩尔比为1-5∶1；转化所述连接产物，获得菌液；采用PCR鉴定所述菌液；筛选阳性克隆质粒后，抽提质粒，对质粒进行酶切验证，测序，将序列完整正确的重组质粒转入大肠杆菌表达型菌株Rosetta中，构建MBP-IQ、MBP-GAP、MBP-GAPC，pET28a-IQ、pET28a-GAP、pET28a-GAPC，GST-Cdc42及GST-Rho1蛋白的表达质粒；对目的蛋白进行表达与纯化；采用BCA技术测得纯化后目标蛋白的浓度；采用悬滴技术获得所述目标蛋白的最佳结晶体。

5.如权利要求1所述的一种白色念珠菌的研究方法，其特征在于，所述采用基因敲除技术和荧光定位技术对所述Iqg1p蛋白的CH、IQ、GAP及GAPC功能区段逐一敲除，筛选出对细胞形态具有重要意义的Iqg1p的IQ模体、GAP、GAPC三个功能区段的具体过程包括：首先根据待敲除目的基因设计其左右同源臂的引物，然后用easy-taq酶分别扩增出左右同源臂序列AB、CD；再将二者进行融合PCR形成AD目的片段；将AD连接到T-Vector上进行酶连接；挑取阳性克隆鉴定，抽质粒，获得基因敲除质粒，构建Iqg1、Rho1、Rho1-shut off质粒；采用改进的醋酸锂转化技术将所述基因敲除质粒导入到白色念珠菌中进行同源置换，获得目标菌落；对所述目标菌落进行阳性克隆鉴定，获得阳性目标菌落。

6.如权利要求1所述的一种白色念珠菌的研究方法，其特征在于，对于所述Iqg1p的IQ、GAP区段敲除基因序列，由于太长，采用了改进的融合PCR；具体步骤如下：应用特异性引物，对各片段进行独立扩增，特异性引物的5′-末端带有一段相邻片段的互补序列；添加第一步反应的已纯化产物，不添加引物，通过10～13个循环，复性延伸片段之间的重叠部分；将第二步反应的未纯化产物，添加外侧引物通过25～30个循环进行融合片段的全长扩增，获得目的片段后，分别将其连接到改造后的CIp10质粒，标记上GFP蛋白。

7.如权利要求1所述的一种白色念珠菌的研究方法，其特征在于，所述采用Western-Blot检测所述Iqg1p的GAP功能区段与Cdc42p及Rho1p在体外的相互作用的具体过程包括：

(1)建立Cdc42p、Rho1p过表达突变体：首先设计引物，分别将Cdc42p、Rho1p克隆到CIp10质粒质粒上，使蛋白质在N端标记上荧光蛋白；然后根据定点突变引物设计原则设计突变引物，采用全质粒定点突变的方法，分别以克隆成功的质粒CIp10-GFP-Cdc42、CIp10-GFP-Rho1为模板，进行定点突变；PCR反应结束后，直接用DpnI进行消化处理，去除甲基化的残余模板以及半甲基化的DNA；向50μL PCR反应物中加入1μL的DpnI限制性酶，轻轻地混合均匀，简短离心后放到37℃水浴锅中反应1h；然后取10μL DpnI消化产物转入到感受态细胞DH5α中，通过Amp抗性平板筛选阳性克隆，抽质粒进行测序，通过测序结果的对比来验证是否成功将Cdc42p 61位谷氨酰胺突变成了亮氨酸、Rho1p 67位谷氨酰胺突变成亮氨酸；通过激光共聚焦倒置显微镜来观察荧光蛋白以及细胞的形态；

(2)区段敲除菌菌丝诱导分析：分别在液体和固体培养基中培养区段敲除细胞及野生型细胞，然后诱导其菌丝生长；

(3)蛋白质印迹技术：通过GST-pull down实验将与GST标记蛋白相互作用的蛋白质洗脱下来，然后利用SDS-PAGE对蛋白质进行分离，再利用通用型半干转印电泳槽将蛋白质转移到PVDF膜上，经牛奶封闭孵抗后用底物化学发光的方法来检测相互作用的蛋白质；其中，采用的抗体为His-tag鼠抗一抗，过氧化物酶标记羊抗鼠IgG，His-tag标记的蛋白质为内参；

(4)Cdc42p、Rho1p与Iqg1p在功能上的作用关系：将N端标记GFP的Cdc42p、Rho1p进行突变过表达，使其一直处于激活状态，然后分别将二者转入iqg1-shut off菌株中，显微镜观察它们对于Iqg1蛋白功能缺失后造成的细胞形态缺陷具有怎样的影响；再分别取同等适量的iqg1Δ/Δ、GFP-Cdc42_iqg1-shut off、GFP-Rho1_iqg1-shut off菌液划线于YPD平板上，倒置于30℃和42℃恒温培养箱中培养3-5天，观察它们的生长状态是否具有差异。