JPS63500142A - 細菌酵素類 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 細菌酵素類 この発明は、細菌ｌｌ？素類の製法並びにこの製法に有用なハイブリッドプラス ミド類および微生物類に関する。さらにこの発明は、生物物質（ｂｉｏｌｏｇｉ ｃａｌ　ｍａｔｅｒｉａｌ　）から核酸類を除去するための、一つの酵素である ヌクレアーゼの使用および形質発現を開始するのに有用な調節領域に関する。

セラチア　５ｔ）Ｉ）　（Ｓｅｒｒａｔｉａ　Ｓｐｐ、）が、多数の加水分解酵 素を産生して培養基中に排出することが見出された。このことは、蛋白が周囲の 培地よりも細胞周辺腔（ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ　５ｐａｃｅ　）に優先的に排 出される、他のグラム陰性菌とは箸しく異なる。かようなペリブラズミック蛋白 は、特に細胞が高密度に成育する場合に、培養基に湿田する傾向がある。

この発明によって、細胞外セラチア　Ｓｐｐ酵素類（づなわちセラチアに発現さ れるとぎは細胞外に分泌される）をエンコード（ｅｎｃｏｃｌｅ）するＤＮＡが 単離された。そして遺伝子産物の工業的生産に適しかつ前記セラチア菌のＤＮ、 Ａを保有する微生物が培養され、前記セラチア酵素類を産生ずることが見出され た。

また、細胞外セラチア　Ｓｐｐ醇索をエンコードする挿入ＤＮＡを有するハイブ リッドプラスミドを、通常、遺伝子産物を培養基に排出しない他の微生物、すな わちエシェリヒア・コリに保有させても、前記セラチア酵素がエシェリヒア・コ リによって培養基にある程度排出されることが見出された（実施例１．および６ 参照）。それ故、エシェリヒア・コリ細胞から培養基に、比較的簡単に排出され る前記セラチア酵素の部分を部分的に精製することが可能であり、例えば濾過し てエシェリヒア・コリの細胞を除去し、次いで例えば硫酸アンモニウムを用いて 濾液から前記酵素を沈澱させて行われる。この明細書において、°゛排出という 用語は、遺伝子産物が少なくとも細胞の細胞質膜を通じて移動することを意味す る。

したがって、この発明は、−態様として、細胞外セラデアｓｐｐ　酵素をエンコ ードする、セラチア　Ｓｐｐ由来のＤＮＡを含むハイブリッドプラスミドを保有 する微生物を、培養基内で培養し、培養物から酵素を収穫することからなる細菌 酵素の製造法を提供するものである。

特定の態様として、この発明は、セラチア　Ｓｐｐ醇素の部分がセラチア　Ｓｐ ｐから培養基に排出されその培養基から収８づ−ることからなる、実質的に他の 細菌蛋白を含有しないセラチアＳｐｐ醇素の製造法に関する。

微生物の培養は、微生物の最適の発育に必要な栄養と無別物を含有する液体培養 基で行うのが好ましい。酵素の収穫は、それ自体公知の方法で行うことができる 。上記のように、酵素の精製は、濾過して宿主細胞を除去し、次いで濾液からヌ クレアーゼを沈澱させることによって行ってもよい。通常、その沈澱は、例えば トリス−ＥＤＴＡのような適切な緩衝液に溶解され次いで透析によって沈澱剤が 除去される。

セラチア　ＳｐｐによつＣ産生される加水分解酵素としては、核酸類を加水分解 して、ヌクレオチド類、オリゴヌクレオチド類もしくは小さな核酸のフラグメン トにするヌクレアーげ、及び脂質類や燐脂質類由来の脂肪酸を加水分解するリパ ーゼとホスホリパーゼが挙げられる。

微生物として代表的なものは細菌であり、グラム陰性菌が好ましい。セラチア　 Ｓｐｐは便宜主義的な病原菌であるので、セラチア　ＳＤｐＭ素の製造にセラチ ア　Ｓｐｐを利用することは通常好ましいことではなく、生産微生物としての利 用が制限されている。さらにセラチア　Ｓｐｐは、所望の産物を汚染する細胞外 プロテアーゼを産生ずる。セラチア　Ｓｐｐ酵素類産生用の産生微生物として使 用されるグラム陰性菌として好ましいのは、エシェリヒア・コリのような遺伝子 産物の産生に一般に用いられる細菌である。

また、この発明は、上記のように細胞外セラデア　Ｓｐｐ酊索をエンコードする 、セラデア　Ｓｐｐ由来のＤＮＡを有するハイブリッドプラスミドに関する。

この発明によるＶｆ累類の産生用のベクターとして有用なプラスミド類は、問題 の微生物内に複製できる、前記目的のために通常用いられるいずれのタイプのプ ラスミドであってもよい。

問題のＷ！素類を大量生産するのに用いてもよいプラスミド類は例えばいわゆる ランアウェイプラスミド類、すなわら、ある条件下で非制御の複製の挙動（ｕｎ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｂｅｈａｖｉｏｕｒ　）を示す プラスミドである。この挙動を示すプラスミド類は、例えば、米囚特許第４，４ ９５，２８７号およびヨーロッパ特許願公開第０１０９１５０号に開示されてい る。

細菌ヌクレアーゼは、例えば、遺伝子粗挽え技術によって変性されて天然では問 題の細胞と関連のない産物を産出する細胞を醗酵させることによって産出される 産物のような微生物の光醇によって製造される蛋白質産物を精製するのに茗しく 価値の高い酵素である。これらの産物の精製の重要な工程は、細胞由来の核酸か ら蛋白性産物を分１ｉｆｔケる工程である。この精製が、核酸を沈澱させるとい うようｔｉｔ　ａ準の化学処理で行われる場合、所望の産物を含有する物質が高 粘度なために所望物質の分離が困難になることから、細胞によって産生される所 望の産物をロスする危険をまねくが、一方ヌクレアーゼによって核酸を分解させ る方法は、所望の産物を実質的にロスすることは全くない。

また産物から核酸を効率的に完全に除去することは重要である。

例えば、産物がヒトへの投与に用いられるとき、産物は、これを産生ずるのに用 いた細胞からのハイブリッド生成可能ＤＮＡを含有していてはいけないというこ とが、いくつか国の衛生当局の要件になっている。

それ故に、セラチア　Ｓｐｐによって産出される非常に興味深い酵素は、非常に 強力であることが見出されかつ生物物質から核酸類を除去するのに工業的に非常 に重要なヌクレアーゼである。この明細書にお、いて、゛核酸類の除去パという 用品は、長い核酸の塩基配列が分解されて短いフラグメントもしくはオリゴヌク レオチド類になるか、又はある場合にはモノもしくはジヌクレオチド類どなるこ とを意味する。これは、ヌクレアーゼの作用によって生成する産物の方が、通常 の分離法によって除去しやすいことを意味する。

従って、さらにこの発明は、下記アミノ酸配列（公知の方法でそのＤＮＡ１基配 列から推定され、Ｎ−末端シグナルベブチきまた酵素を再度使用ぐきるようにな −）て（、＞る−ｈＸら−ぐある。ｈλようなマトリックス物質の例としくは、 デキス１へランもしり（，１アガ「１−スグルまたは石英質物質のごとき無機物 質、（伺え（まシリカ、ケイ酸およびその誘導体が挙げられる。固定化（ま公知 の方法で行われる。。

潜在的利点のあるもう一つの酵素は、セラチア　ｓｐｐ　ｃこよって産生される ボスボリバーゼである。それ故この発明（よ、下８ｄＤＮＡの塩基配列によって エンコードされるセラチア　３ｐｐ　ｉｐスホリパーゼに関する。

ドを含む）を有するセラチア　ｓｐｐヌクレアーゼである細菌ヌクレアーゼに関 する。

この酵素は、例えば上記方法によって製造してもよい。

特別な応用の場合、例えば、ヌクレアーゼが、別の方法で実質的に精製された生 合成産物から残留核酸を除去するのに用いられる場合（以下に詳細に述べる）、 酵素は実質的に純粋な形態が好ましい。実質的に純粋な酵素を得るために、粗製 の酵素製剤（ｅｎｚｙｍｅ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）を限外濾過法もしくは例 えばｆＡ酸アンモニウムでの沈澱法によって部分的に精製し、さらに例えばクロ マトグラフィ（イオン交換クロマトグラフィもしくは親和性クロマトグラフィの ような）又は分離用ゲル電気泳動法によって精製してもよい。場合によっては、 適切なマトリックスに固定化された形態で酵素を提供するが有利である。という のは、このマトリックスは、使用後ヌクレアーゼを容易に除去で別の態様として 、この弁明は、セラチア　ＳＯＤヌクレアーゼからなる、生物物質から核酸を除 去するための組成物に関する。

この明細書において、゛生物物質′°という用品には、少なくとも一つの製糸が 生物源の要素であるいずれの物質も示すと解される。その故この用語には、核酸 類だけの溶液（例えば生体外の実験室での研究に基づり）、生合成産物を産生ず る細胞培養物を含有するｌＩ！１醇媒体、生合成産物を産生ずる細胞培養物が培 養される（それ故自発的な細胞破壊から生成する核酸のみならず前記産物を含有 していてもよい）醗酵媒体、または細胞培養物の再懸濁液が含まれる。そしてこ れらのものは、細胞を、例えば遠心分離によって媒体から収穫した後に生合成産 物を産生ずるものであり、その細胞培養物は全細胞もしくは溶解された細胞（ｌ ｙｓｅｄ　ｃｅｌｌｓ　）を含有している。

゛生合成産物″という用語は、蛋白、ポリベプヂド、グリコリピド、グリコリビ ドカーボハイドレートもしくは低分子ω化合物であってもよい産物を意味すると 解される。生合成産物が細胞から排出されず、産物を収穫するために細胞の溶解 （ｃｅｌｌＩｙｓｉｓ）を要する場合には、核酸は特に重大な汚染物であり、こ れらの核酸は細胞溶解物（ｃｅｌｌ　＋ｙｓａｔｅ　）に粘度を与え産物の精製 を困難にする。それ故に、細胞溶解物の粘度を低下させるために、この発明のＣ ラチア　ｓｐｐヌクレアーゼのごどさヌクレアーゼを含有する組成物を提供する ことは有利である。このヌクレアーゼは、例えば上記のアミノＭ塩基配列をもっ ていてもよい。この発明のヌクレアーゼ組成物は実質的に蛋白分解活性のないも のが好ましい。というのは、この種の組成物中にプロテアーゼ類が存在すると、 細胞培養物によって産生される蛋白性産物を分解する最も重大な原因になるから である。この発明の方法によって製造されたヌクレアーゼ、すなわちその遍伝情 報を指定する選仏子がセラチア　ｓｐｐ微生物から得られたヌクレアーゼは、実 際には、実質的に蛋白分解活性を有しないことが見出された（実施例２参照〉。

組成物が、別個に精製された蛋白性産物から、残留核酸を除去するのに用いられ る場合、実質的にプロテアーゼなしの組成物が特に重要であるといわねばならな い。というのは、ヌクレアーゼが未精製の細胞溶解物に添加されると、溶解物自 体の蛋白分解活性は、ヌクレアーゼ組成物に残っているいずれの蛋白分解活性を もはるかに超えているからである。実質的にプロテア−ぎを含有しないヌクレア ーゼ組成物は、それ故、すぐにいくつかの精製工程を受けた蛋白性産物について 使用（勿論、実質的に純粋な形態で）するのに特に有利である。

過剰のヌクレアーゼが細胞溶解物に添加された場合でも（溶解物の核Ｆｉ要素に 帰因づる粘度を低下させるため過剰に）、核酸類の少量のフラクションが残って 蛋白性産物を汚染する場合があることが実験によって分かった。このことは、例 えば、核酸と、溶解物の膜および／または蛋白要素との相互作用による、核酸類 のマスキングが原因で起ると信じられる。しかし、組換えＤＮＡ技術もしくは組 織培養物で製造される生合成産物が医療目的に使われる場合、核酸類の完全除去 （ＤＮＡもしくはＲＮＡプローブによってハイ１リツド化可能な核酸がないと定 義される）が、いくつかの国の衛生当局（例えばＦＤＡ）によってしばしば要求 されている。かような産物が、核酸類がｌａｄ存在しても所望の結果を阻害する 他の目的に用いられる場合、残留核酸の完全除去は非常に望ましいことである。

この発明の弁間者らは、ある種の界面活性剤もしくは蛋白変性剤をヌクレアーゼ とともに添加すると、ｈ）、Ｊ：うな残留核酸類が完全に除去されることを見出 した。それ故に、核酸類の完全除去を要する用途に対しては、このｉｌ明の組成 物がセラチア　Ｓｐｐヌクレアーゼのようなヌクレアーゼと、界面活性剤および ／またはカオトロピック試薬とからなるということは、有利である。界面活性剤 は、例えばポリオキシエチレンアルコール例えば３　ｒｉｊ■５８もしくはオク トオキシツール例えばＴｒｉｔｏｎ（ＦＤＸ−１ｏｏのような非イオン性界面活 性剤、ドデシルｆａ酸ナトリウム（ＳＤＳ）のようなイオン性界面活性剤、また はナトリウムデオキシコーレートのようなデオキシコーレートであってもよい。

カオトロピック試薬は、尿素、チオ尿素もしくはチオシアン酸の塩から選択でき る。

さらに他の態様において、この発明は、セラチア　Ｓｐｐヌクレアーゼを生物物 質に加えることからなる生物物質（上記定義どおりの）から核酸類を除去づる方 法に関する。特にこの発明の方法は、核酸による汚染が問題である次のような種 々の場合に有用である。すなわら生物物質が、例えば、核酸を用いる生体外の実 験から生じかつ実験設備を汚染する核酸の廃溶液もしくは廃懸濁液からなる場合 ；生物物質が、生合成産物（上記窓ｉと同じ）を産生する細胞培養物を含有する 醗酵媒体からなり、生物物質中の多量の核酸を確実に、除去するために、細胞溶 解の前後に、充分な聞のヌクレアーゼが生物物質に添加される場合；生物物質が 、生合成産物を産生ずる細胞培養物を培養し次いでその細胞を実質的に除去した ｆａｉｌ酵媒体からなり、その媒体が、自発的な細胞破壊が原因である間の核酸 を含有し、Ｊ３よび細胞から媒体に排出された生合成産物を任意に含イ１する場 合；および生物物質が、醗酵媒体を除去した後生合成産物を産生する細胞培養物 の再黙濁物から４１す、ヌクレアーゼが細胞溶解の前後に添加される場合である 。そのヌクレアーゼは上記のアミノ酸配列を有するヌクレアーＵである。この弁 明のブこ間者らは、この発明のヌクレアーゼを、細胞溶解の前に生物物質に添加 すると特に有利な結果が得られることを見出した。ヌクレアーゼを、細胞溶解の 前に細胞１８拾物（懸濁物もしくは媒体中の）に添加すると、例えば、Ｊシエリ ヒア・コリの溶解物（凍結融解溶解物やフレンチプレス溶解物のごとき）の粘度 が、高い再現上をもって演失することが、実験で証明された。またある相対粘度 を得るのに、予想外のことであるが、ヌクレアーゼを細胞溶解後に添加する場合 よりも、短時間（時間単位でなく分単位）しかか）らずかつ低温でよいことが見 出された。このようにすることによって生合成産物が高収率Ｃ１りられる（例え ば核酸除去の工程での蛋白性産物の分解が少ないなど）。

多くの衛生当局は、絹換え微生物は、閉じた醗酵システムから取出す前に殺さね ばならないと要求し又いる。この処理は、醗酵の最終段階でフェノールとトルエ ンを添加することによっ１行われることが多い。この弁明のヌクレアーゼは、ｈ １醇器中で細胞を殺ずのに必要な吊のフェノールとトルエンの存在下でも活性を 保持することが見出されたのである。

生物′ＩＩＪｅの粘度を低下させるため、この発明に従ってその生物物質にヌク レアーゼを加えると、ヌクレアーゼの作用によるＲ柊産物は、大きさの異なる核 酸フラグメントや、モノもしくはジヌクレオチド類よりもむしろオリゴヌクレオ チド類を含有している。ある種の目的のため、例えばハイブリッド化可能の核酸 をすべて除去された高科度の最終産物を製造したい場合は、すでに精製された産 物、すなわち生物物質の他の要素から少なくとも実質的に分離された産物に酵素 を加えることが勧められる。

上記のように、残留核酸、すなわち限界消化（ｌｉｍｉｔ　ｄｉｇｅｓｔ）の後 に生物物質中に残る核ｒｙ１＜この限界消化の場合、ヌクレアーゼは、生物物質 の粘度を低下させるために、ヌクレアーゼをさらに添加してもそれ以上核酸の量 が低下しないほど過剰に添加される）は、実際には、与えられた生物物質中の核 酸の全量の０．１％よりも小さい微小なフラクションを構成し、前に論議された ように、膜要素および／または蛋白の相互作用により、ヌクレアーゼに通常近づ きにくい核酸であることが見出された。

このヌクレアーゼ処理が界面活性剤および／又はカオトロピック試薬の存在下で 行われると残留核酸を消化することができるということが見出された。

かくして、この発明は、ハイブリッド形成によって検出できないオリゴヌクレオ チドもしくはヌクレオチドとして存在する核酸類を消化するため、ヌクレアーゼ が界面活性剤および／又はカオトロピック試薬の存在下で添１ｊ［１される、生 合成産物がら残留核酸類を除去する方法を提供するものである。界面活性剤およ びカオトロピック試薬は、はとんど同様に作用し、核酸のセグメントがヌクレア ーゼに近づきにくい？！！雑な構造を形成させる疎水力と静電気力を妨害する。

選択された界面活性剤とカオトロピック試薬は、生物物質中に存在する所望の蛋 白系産物の第二級および第三級蛋白構造を永久的に損傷しないものでなＣ）れば ならない。すなわらこれらの物質は、その存在下で、ヌクレアーゼが、正しい構 造の産物か得られるようなしかたで作用して核酸を除去した後に除去される。か ような界面活性剤とカオトロピック試薬は、例えば、」−記のものであってもよ い。界面活性剤もしくはカオトロピック試薬を用いる場合は、ヌクレアーゼの活 性が損われたり消失したりするような聞で添加しないよう注意しなければならな い。

試薬が非イオン性界面活性剤の場合、通常生物物質の０．２〜１．５％のｍで添 加され、特に約０．４〜１．０％が添加される。イオン性界面活性剤の場合、生 物物質の０．０１〜１．０％の（６）で一般に添加される。カオトロピック試桑 ＩＪ一般に、２〜８Ｍの闇（生物物質の約１０〜５０　ｗ／ｖ％）で添加される 。

完全に核酸の存在しない産物を１ｑるには、細胞溶解物の粘度を低下させ、その 中に存在する大部分の核酸を除去するため、生産工程の初期の工程で最初にこの 発明のヌクレアーゼを用いるのが有利である。、精製処理に°続く工程で、産物 からいずれの残留核酸も除去するためには、精製ヌクレアーゼが溶液もしくは固 定化された形態で用いられる。

この発明のヌクレアーゼ含有の組成物は、感染試薬の感染力を除くために、その 感染力自体を確実に除く手段としＣか又はワクチンもしくは診断試薬の製造が強 くのぞまれるこれら試薬の成分を回収する手段として用いることができる。この 明４１１１１円において゛感染性試薬″という用語は、その感染力が核酸の成分 に原因する注試薬（１１ｖ団りａｇｅｎｔ　）もしくは非生試薬（ｎｏｎ−１ｉ ｖｉｎｇ　ａｇｅｎｔ）を意味すると解される。これらの核酸成分は、感染力に 必須のＲＮＡ種（ＲＮ　Ａ　５ｐｅｃｉｅｓ）および／又は蛋白をエンコードす るか（口れらの成分は、ｌ？ｌえは増殖に必要である）、又は感染性試薬内で純 粋１．：構造的な役割を演する。従って感染性試薬には、プラスミド類、ウィル ス類、細菌類、ブリオン類（ｐｒｉｏｎｓ）および寄生虫類であってもよい。

これらの試薬の感染力は、ある場合には化学薬品によって破壊することができる が、汚染除去のためにヌクレアーゼを用いると有利な場合が多・い。培養中、細 胞から遊離されるプラスミドのようなＭｅｌｔのＤＮＡ分子は、例えばこの発明 のヌクレアーゼによって容易に消化することができるが、また実験室からのＲ漬 物中に存在する潜在的に感染性のＤＮＡの場合も容易に消化できる。安全対策と して、組換えＤＮＡ技術による生合成産物の工業生産からもたらされる廃棄物か ら核酸を除くことが望まれる場合が多い。かような廃棄物中に存在する感染性試 薬の核酸成分が、この発明のヌクレアーゼに、自由に近づけない場合、存在する すべての核酸を除去するには、前記のように、同時に界面活性剤もしくはカオト ロピック試薬を添加することが勧められる。

この発明のヌクレアーゼの用ｉ１としてもう一つ考えられるのは、抗原とワクチ ンとの製造における用途である。現在細菌やウィルスの弱毒性味は通常、同じ種 のごルレントメンバー（Ｖｉｒｔｌｌｅｎｔ　ｌＲｅｍｂｅｒ　）に免疫反応を 引き出すために用いられ、その重要な利点は、生体内での該試薬の限られた期限 の増殖中の感染性試薬内もしくは表面の複雑な抗原的な構造を無傷のま）で保存 できることである。この発明のヌクレアーゼを用いることによって、抗原的複雑 性を保持し、免疫反応を問題の感染性試薬と結合されるいずれの強い抗原決定基 に対してもむけさせ、一方では、弱毒性微生物を用いる生ワクチンについて時々 みられる予防接種後遺症の危険を回避することができる。この発明のヌクレアー ゼは、核酸をヌクレアーゼで処理できるようにするために、任意に界面活性剤お よび／又はカオトロピック試薬とともに用いるとかでき、界面活性剤もしくはカ オトロピック試薬およびこれらが用いられる際の濃度は、問題の抗原構造をＣ１ 害しないように選択して用いられる。

この発明の方法によって製造されるセラチア　５ＤＩ）加水分解酵素は、その酵 素を産生ずる微生物がセラチア　Ｓｐｐもしくはエシェリヒア・コリのいずれで あろうとも、その微生物の生長周期の後期に発現（ｅｘｐｒｅｓｓ　）されるこ とが見出された。実施例で示すように、この後期での発現は、問題の発現もしく は遺伝子が開始される調節領域の遺伝子発現調節挙動の結果である。

かくして、培養物の指数増殖期のほとんどでは、加水分解酵素はほとんど合成さ れないかもしくは全く合成されない。一方細胞が後期指数増殖期に入ると、高率 の遺伝子発現が起こる。この明細書における“調節領域゛°という用語は、プロ モーター、（遺伝子発現を調節する）調節蛋白質たとえば環式ＡＭＰ結合蛋白質 （ＣＡＰ）の結合座位、および転写調節における機能は知られていないが欠失地 図作成によって転写調節のためにｆｆ１Ｄであることが見出された配列のような 配列からなる遺伝子の転写調節を行う分子配列を意味づると解される。

この調節の原理がこの発明によって利用され、ひとつの調節領域を有するプラス ミド、すなわちその調節領域の上流側に位置する遺伝子の発現が、そのプラスミ ドを有する微生物の生長周期の後期に、そのｙ４節領域から開始又は増大される プラスミドが提供される。この遺伝子は、その調節領域に天然では関連のない遺 伝子である。

遺伝子発現（形質発現）が、微生物の生長周期の後期に開始もしくは増大される 上記の調節機構は、培養物産生にとって有利で望ましいことが多い。かくして発 酵工程において、高い細胞密度が得られる後期は、潜右的に培養物が最も生産力 のある期間であり、この期間に、大きな価値があるのは高い比率で形質発現がな されることである。この発現は公知のプロモーターを用いても通常得られない。

どいつのはこれらプロモーターの活性は、通常培養物の生長速度に追随するので 、細胞密度が最凸の段階で最小になるからである。微生物は成育がすでに停止し たかほとんど停止した時にのみ有毒物質を合成するので、セラデア　ｓｐｐ内に 見出された調節領域の前記の特別の挙動は、培養物によって産生されるべき産物 が問題の微生物に対し有毒である場合、特に価値がある。

かくしてこの発明はさらに、一つの調節領域を有するプラスミド、すなわちその 調節領域の下流側に位置する遺伝子の発現が、そのプラスミドを保有する微生物 の生長周期の後期に、開始または増大されるプラスミドに関する。かような調節 領域は、これを有するプラスミドが、そのプラスミドを保有する微生物の発酵に よって、広範囲の工業用もしくは医療用の生合成産物を得ることを目的としてク ローニングベクターもしくは産生ベクターとして用いられる場合のような、その 調節領域に天然では関連のない遺伝子の発現を調節するのに特に有用である。か ような生合成産物の例は、ポリペプチド類、蛋白類もしくはそのフラグメント、 酵素および酵素と普通培地中の化合物との反応による非蛋白質の産物、ホルモン のごとき低分子間産物、並びに核酸類であり：特に＠四と考えられる産物は、真 核遺伝子持に吐乳類の遺伝子の産物、および上記のごとく、これら産物が産生さ れる微生物に対して有毒な産物である。

調節領域は、類似のものがセラチア　Ｓｐｐ以外の微生物内にも見出されうると 考えられるが、セラチア　ｓｐｐ　ａ伝子内で見出されたものでもよい。特にそ の調節領域はセラチア　Ｓｐｐ由来のヌクレアーゼもしくはホスホリパーゼの調 節領域であり、その例を、第７図の１−３８５位置と第９図の２０１−４１５位 置に示す。

上記の調節領域は、標準の組換えＤＮＡ技術によっていずれの公知もしくは新規 のクローニングベクターや生産ベクターにも挿入できる。

上記のタイプの調節領域をｈ′するクローニングベクターもしくは生産ベクター として有用な特に■味深いプラスミドはいわゆるランアウェイプラスミドであり 、すなわち、ある条件下で非制御２Ｉｌ複製挙動を示すプラスミドである。この 挙動を示すプラスミドは、例えば、米国特許第４，４９５，２８７号およびヨー ロッパ特許願公開第０１０９１５０号に開示されている。

例えばヌクレアーゼ遺伝子の調節領域に含まれているプロモーターの強さは、あ る種の産生を目的とするときには必ずしも充分ではない。それ故、調節鎖酸の下 流に位置する遺伝子の発現が（ｊわれる光育相を起こさゼる調節領域の性能Ｉま 、既存のブロモ−クーを、前記発育相に依存する発現が保護されるようなしかた で、より強力な構成プロモーターで置換することによって利用される。

生合成産物の発現のために調ｊｖＪ領域を利用することの外に、調節領域の特に 興味深い応用は、調節領域の下流側に位置するある遺伝子の転写を増大するのに 利用することであり、その遺伝子が、ある細菌のプラスミドの複製を制御して、 非制御のプラスミド複製くいわゆるランアウェイ複製）を、そのプラスミドを保 有する細胞の発育相の後期に起こさせる場合である。今まぐ記述されてきたほと んどのランアウェイプラスミドはく例えばヨーロッパ特許願公開第（１１０９１ ５０号参照）、非制御複製を開始するには、例えば温度を上昇させるというよう な、発育条件を外部から操作する必要がある。プラスミドの複製を調節するため に上記の調節領域を用いることによって、新規な方法が可能になった。すなわち そのプラスミドを保有する細胞の光育相にランアウェイ複製を開始させる方法で ある。この方法は、三つの観点から有利である。第一に発育条件の外部からの操 作が全く不要であること、第二にランアウェイ複製を開始するのに、宿主細胞の 特別の性質が不要なこと、第三に微生物の培養が後期指数増殖期に入るとき、す なわら発現すべき遺伝子のコピー数を増やす効果が最大のときに、非制御複製が 開始されることである。後期指数増殖ＩＶＪにランアウェイ複製を開始づるのに 好ましい調節領域は、二つの制御システムによるホスホリパーゼの調節領域であ る。一方の調節システムは、ホスホリパーゼ調節領域により制御される遺伝子の 発現を、確実に、後期指数増殖期に限定させ、他方の調節システムは、上記の一 方の制御システムを無効にすることができ、グルコース抑制システムを含むもの である。

上記調節領域を実際に利用覆る場合には、ホスホリパーゼの調節領域からの両方 の調節システムを有するＤＮＡフラグメントが、プラスミドに、単一もしくは複 数の複製調１１ｉ１遺伝子の上流側で挿入され、そのプラスミドは適切な宿主微 生物に形質転換され、その形質転換細胞はグルコースの存在下で選別きれる。

これらの形質転換細胞はグルコースの供給をた）れると、後期指数増殖期にラン アウェイ？１２ｉ１表現型を示プ。所望の生合成産物を発現する遺伝子が、前記 のようにして作製されたプラスミドに挿入され、得られたハイブリッドプラスミ ドが適切な宿主微生物に形質転換され、その宿主は、グルコースの非存在下もし くは、宿主微生物の細胞が後期指数増殖期に入る前に消費する量のグルコースの 存在下で、量産規模の培養物にまで培養される。いずれの場合でも、非制御の複 製は、後期指数増殖期に、ｖＩ節領域からの増大された転写によって開始される 。生合成産物は、充分な生産量を確実に得るため、適切な時間後に培養物から収 穫される。上記の特定小項を除りば、培養は、その宿主として用いられる微生物 種にＭＪであることが知られている通常の栄養培地を含めて通常の技（（、ｉを 用いて適切に行われる。またその生合成産物の収穫は、特定の生合成産物の本質 と性能、宿主の性能などに採用される公知の方法によっ０行われる。

またこの発明は、上記のＸ１ｆｌｉ’ｌ領域をもつプラスミドを保有する微生物 を提供するものである。この微生物の代表的なものはグラム陰性菌であり、好ま しいグラム陰性菌は生合成産物を製造するのに一般に用いられる細菌、例えばエ シェリヒア・コリである。

ヌクレアーゼのＮ−末端部をエンコードする塩基配列は、そのヌクレアーゼのト ランスメンブラン運搬のために必須のシグナルペプチドをエンコードするが、遺 伝子産物を排出させるのに用いてもよいと考えられる。所望の生合成産物の遺伝 情報を指定づる塩基配列は、ヌクレアーゼのシグナルペプチドのＣ末端を指定し て所望の蛋白を排出させる塩基配列と直接結合させ“Ｃもよく、そしてそのシグ ナルペプチドは工程中で除去される。

実際上、前記シグナルベブブ・ドの遺伝情報を指定する塩基配列（第７図参照） は、ヌクレアーゼ調節領域と共に１から４４８位置までのびるＤＮＡフラグメン トとして単離される。そしてその４４８位置が好都合にもＡｈａｌ［ｌの認識Ｐ ｒ位に相当し、（シグナルペプチドＨｇｌ座位を含む）シグナルペプチドの最後 のコドンに正確に相当する。次いでこのＤＮＡフラグメントは、適当ないずれか のベクターに挿入され次いで排出されるべき産物の遺伝情報を指定する塩基配列 に、（フレノウ・ポリメラーゼによっｒ）”挿入された”　（”ｆｉｌｌｅｄ　 ｉｎ　”　）ＡｈａＩＩＩ座位に連結される。さらに、ヌクレアーゼ調節領域が 任意に存在すると、発現が細胞発育の後期に限定される。

図面の説明 この発明はさらに下記図面によって説明される。

第１図は、線状＄り限酵素とセラチア・マルセッセンス（３ｅｒｒａｔ　ｉａ　 ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ　）〜ｖ２２５のヌクレアーゼ遺伝子（ＮＬＩＣ）を持つ ハイブリッドプラスミドｐＮ　Ｕ　１２１−ｎｕｃ◆の遺伝子地図とを示す。用 いられる記号は次のとおり。構造遺伝子１ｍ１Ｗ　Ｏ−）　−プロモーター：△ ｐ＝アンピシリン耐性耐性：Ｔｃ−デクサイクリン耐性：Ｃ，ｌまラムダ・リブ レッリーｊｉ伝了：λ　ｐＲ＝ラムダ・モロモーター：Ｐ＝ＰｓむＩ　：Ｅ１＝ ＥｃｏＲＩ　：Ｅ５＝Ｅｃ。

ＲＶ：Ｆ２＝ＦｎｕＤｆｆ。

第２図は、エシェリヒア・コリのＸ−プレスによる溶解物（Ｉｙｓａｔｅ）をヌ クレアーゼ処理した場合の時間経過を示し、縦軸は相対粘度（０℃の水を基準と する）、横軸はＸ−プレスによる溶解後の０℃における培養のｈｒ数である。

第３図は、エシェリヒア・コリのフレンチプレスによる溶解物をヌクレアーゼ処 理した場合の時間経過を示い縦＠は相対粘度（０℃の水を基準とする）、横軸は フレンチプレス溶１１’ｌ後の０℃における培養時間（ｈｒ）Ｔある。

第４図は、エシエリヒ？・コリのフレンチプレスによる溶解物をヌクレアーゼで 処理した場合の時間経過を示す。左欄は細胞の溶解前もしくは溶解後に添加され たヌクレアーゼの濃度（Ｕ／ｆｆ／）を示す。６つの試料はそれぞれ別個に時間 経過実験を行った（０℃での培養時間、　ｍｉｎ　）　；時間の零はフレンチ・ プレスから放出された時間に相当する。粘度の肉眼判定を、各ラインに示すよう に、０〜７０分間にわたって行った（ラインの下に示す記号を参照のこと）。相 対粘度（０℃の水を標準とする）を、０℃での培養の７０ｍ　ｉ　ｎと１５ｈｒ 後に測定した。

第５図は、相対粘度（０℃の水を基準とする）（縦軸１、ヌクレアーゼの濃度（ 横軸）　１３よび０℃での培養期間との関係を示す。数字は第５１図に与えられ たデータを示す。横軸は対数目盛である。

第６図は、粘度が一般に“水状“と評価された際、ダイジェスト（（ｌｉ（ｌｅ ｓｔ）中に存在づる非消化のｉ　ｎｏｎ−ｄｉｇｅｓｔｅｄ　）核酸のアガロー スゲル電気泳動パターンを示す。試料は第５図に示ずダイジェストから採取した 。

第７図（図７８と７ｂとで構成される）は、セラチアＷ２２５由来のヌクレアー ゼ遺伝子を右する１、３ＫＢＤＮ八フラグメント（第１図に示すＦ２フラグメン ト）のヌクレオチド塩基配列を示す。

第８図は、線状制限酵素と、４．５Ｋｂベクター１）Ｎ　Ｕ　１２１と、ホスホ リパーゼオペロンの遺伝子を有する３、２Ｋｂセラチア５ｌｉｔ）ＡＩＤＮＡの 挿入物とＣ″構成れるハイブリッドプラスミドｐＮ　Ｕ　１２１−ｐｈＩ　＝の 遺伝子地図を示す。壇はその遺伝子のプロモーターと転写の方向を示ず。■１ｊ 構造遺伝子を示す。

ＡＩ）とＴＣはそれぞれアンピシリンとテトラサイクリン耐性の遺伝子を示す。

Ｃｆはλリゾレフ１ナー遺伝子を意味する。制限酵素類：Ｅｔ−ＥｃｏＲｌ、Ｅ ｓ　＝ＥｃｏＲＶ、Ｐ−Ｐｓｔ１．５ａ＝ＳａｌＩ、５ｌ−３ＯｌａＩ、Ｎ＝Ｎ ａｒＩ、Ｈｓ　＝Ｈｉｎｄ　ｍ、Ｂｃ＝３ｃ１１．Ｂａ　−ＢａｍＨＩ 第９図（９ａと９ｂとからなる）は、ホスホリパーゼ（ｐｈＩ）遺伝子を有する ３、２Ｋｂセラチア　５ｔ）Ｉ）ＡＩＤＮＡの１．６ＫｂＤＮＡヌクレオチドの 塩基配列を示ず。少数の制限座位の位置が示されている。アンダーラインの施さ れた塩基配列を有するＣＡＰは、推定上のカタボライト活性化蛋白の結合座位の 位置とホスホリパーゼ遺伝子の調節領域を示す。Ｓ、Ｄ、はりボソーム結合座位 のシャインーダルガルノホモロジイの位置を示す。

その遺伝子は４１６位置から始まり１３７２３７２位置る。

原料と方法 エシェリヒア・コリに−１２とセラチア・マルセッセシスＷ２２５の菌株類を第 １表に挙げる。使用されるプラスミド類とバクテリオファージ類を第２表に埜げ る。

利用した実験技術はすべて、Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ　：　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｌ−１ａｒｂｏｒ　Ｌ　ａｂｏｒ ａｔｏｒｙ、　１９８２．　及びＪ、　Ｍｉｌｌｅｒ　：　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎ ｔｓ　ｉｎ　１ｖｌｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｑｅｎｅｔｉｃｓ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｌ−１ａｒｂｏｒ、　１９７２に記載の標準技術であ る。

すべての細胞は、ビタミン類やアミノ酸類を添加したＬＢ培地（Ｂｅｒｔａｎｉ 、　Ｊ、　Ｂａｃｔ、　６２：　１９５１．　ｐ、２９３）もしくはΔ’Ｂ最少 培地（Ｃｌａｒｋ　ａｎｄ　Ｍａａ１９ｔｅ、Ｊ、　１ｖｌｏｌ、　３ｉｏｌ、 　２３゜１９６７、　ｐ９９）で培養した。細菌培養用のプレートは、ＬＢ培地 と抗生物質：°テトラサイクリン８μａ／ｘｉ、アンピシリン５０μＱ／１１． クロラムフェニコール２０μｇ／ｌ！を含有もしくは含有しない１．５％寒天を 含有している。ヌクレアーピ活性のスクリーニング用プレートは、ＯＮアーゼ活 性用のＤＮアーゼ試験寒天（［）ｉｒｃｏ）を含有している。

実施例１ セラチア・マルセッセンスＷ２２５の染色体ＤＮＡの調製セラチア・マルセッセ ンスＷ２２５の培養物は、１９８５年５月８日、ＤＳＭ　（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ　 Ｓａｍｍｌｕｎｏ　ｖｏｎ　Ｍｌｋｒｏｏｒｏａｎｉｓｍｅｎ、ドイツ微生物寄 託局、西ドイツ　１）−３４００ゲッチンゲン、グリセバッハストラツセ　８） に、第３３０８号で寄託された。その培養物をＬＢ培地で一夜培養し、遠心分離 （８０００ｒｐｍ　、５分間）にかけて取出した。その細胞をＴＥＮ−緩衝液（ １０ｍＭｔ−リス［ｉ緩衝液ＰＨ８，ＥＤＴ△　１ｍＭ、　Ｎａｃｌ　１００１ １　Ｍ）　ｒ２回洗浄し、リゾチーム１ｍｇ／ν！とりボヌクレアーゼ（ＲＮア ーゼ）０．１１１ｇ／ｌ！含有のＴＥＮ緩衝Ｆ？ｔ２０ｘｌ中に再懸濁させた。

その細胞を３７℃で３０分間培養し、２０％ドデシル硫ＦａＮａ　（ＳＤＳ）を 加えて最終的に１％の濃度にした。（完全溶解（ｔｏｔａｌ　１ｙｓｉｓ　）の ために）３１℃で６０分后、溶解物を４℃で１晩培養した。習日、細胞の組織片 は、遠心分離（１８０００ｒｐｍ、　２！＋分間）で除去した。

上澄液を３Ｍ酢酸ナトリウム２ｘ１とイソプロパツール２容量部の入った新しい 試験管に移した。ゆっくりＩｊ２１＄するとＤＮＡは糸状の形で沈澱し、湾曲し たガラス針で取り出した。この沈澱したＤＮＡは８０％Ｅｔ　０ｆ−１で２回洗 浄し、ＴＥＮ緩衝液に再懸濁させた。このＤＮＡはさらに遊離密度勾配遠心法（ ｂｕｏｙａｎｔｄｅｎｓｉｔｙ　ｇｒａｄｉｅｎｔ　ｃｅｎｔｒＨｕｇａｔｉｏ ｎ　）により精製した後、適当に希釈して、フェノールで抽出し、ＴＥ−緩衝液 （１０ＩＩＩＭトリスー塩酸ｐＨ８，１ｍＭＥＤＴＡ）に対して透析した。最後 に、ＤＮＡは３７℃で制限酵素の緩衝液で培養ケることによりヌクレアーゼの有 無がテストされた。

セラチア・マルセッセンスＷ２２５からのシーンバンク（ｇｅｎｅｂａｎｋ　） の作製 クローニングベクタープラスミドのＤＮ　Ｕ　１２１をセラデア・マルセッセン スＷ２２５のシーンバンクの作製に用いた。このプラスミドはアンピシリン耐性 とテトラサイクリン耐性の遺伝情報を指定するＩ）Ｂ　Ｒ３２２の二六導体であ るが、テトラサイクリン耐性遺伝子のプロモーターはファージスプロモーターの λｐＲで置きかえられ、そのλリプレッサー遺伝子のＣ工がｐＮ　Ｕ　１２１に 存在しているから、テトラサイクリン耐性は通常発現しない。しかしながらもし Ｃ１１ｆｆ仏子の中にＤＮＡを挿入することによりＣ１３ｆｆ伝子が破壊される と、この耐性が発現する。

故にＣＩ遺伝子に唯一つのＥＣ０１で１座位を持つｐＮＵ１２１　［）ＮＡは制 限酵素ＥＣ０ＲＩで消化（ｄｉｇｅｓｔ）され、次いで、ＥＣＯＲ■で一部が消 化されたセラチア・マルセッセンスＤＮＡと混合した。このＤＮＡを１５℃で一 夜Ｔ４リガーゼで連結し、エシェリヒア・コリ菌株ＭＴ１０２に形質転換した。

テ１〜う１ノ−イタリン８μＱ／ｚｌ含有のＬＢ板上３７℃で選択すると、挿入 したＤＮＡをもつＯＮ　Ｕ　１２＋を保有する細胞だけがコロニーをつくる。

セラチア・マルセッセンスＷ２２５のシーンバンクを示す約２５００のコロニー がこの方法でｉｌｌ　ｆｆｌ　ｇれた。

セラチア・マルセッセンスＷ２２５からヌクレアーゼ遺伝子の単離 セラデア・マルセッセンスＷ２２５からのシーンバンクはＤＮアーゼインジケー ターブレー！・（原料及び方法の項参照）にレプリカ培養され、２日間３７℃で 培養した後、プレートを０．１Ｎ塩酸で展開した。ＤＮアーゼ陽性のコロニーは 、透明領域（ｃｌｅａｒｉｎｇ　Ｚｏｎｅ　）　テ囲まれた。１つの陽性クロー ン、ｐＮＵ１２１−ｎｕｃ、１が主プレートから再分離され、細胞外酸素をコー ドする他の遺伝子の存在をテストされた。（エシェリヒア・コリＭＴ１０２　／ 　Ｉ）ＮＵ１２＋−ｎｕｃ　４　はＤＳＭに１９８５年５４８日第３３０９号と して寄託された）。このクローンは、ＲＮアーゼも光用することが見出されたが このクローンから他の細胞外酵素は発現されなかった。そのヌクレアー１道伝子 を有づるＥＣ０ＲＩフラグメントをランアウェイクローニングベクターＩＩＢＥ ｔＪ５０に挿入し、プラスミドｔ）Ｂ　Ｅ　ＩＪ　５Ｏ−ｎｕｃ＋　とした。（ エシェリヒア・コリ　Ｃ６００／　ｐＢ　Ｅ　Ｕ３０−ｎｕｃｌはＤＳＭに１９ ８５年５月８日第３３１０号として寄託された）。

ヌクレアーゼ遺伝子の制限酵素地図の作成ヌクレアーゼ遺伝子を保有するイー・ コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）菌株ＭＴＩＱ２由来のプラスミドＤＮＡを調製し、制限酵 素Ｅ　ＣＯＲＩ　。

ＰＳｔＩおよびＥ　ＣＯＲＶの各々で消化した。消化されたフラグメントをアガ ロースゲル電気泳動法で分析し、第１図に示り地図を得た。ｐｓｔ：［で消化さ れたＤＮＡは、Ｔ４ＤＮΔリガーゼで再連結されＭ　Ｔ　１０２菌株に形質転換 させた。８μｇ／ｌ！テトラサイクリン含有のＤＮアーゼインジケータープレー トで選択を行った。培養后、プレートを展開したところ、全コロニーがヌクレア ーゼ陽性表現型を示した。ＥｃｏＲＶで消化されたＤＮＡを再連結し、Ｍ　Ｔ　 １０２に形質転換し、アンピシリン耐性で選択したが、全形質転換細胞がヌクレ アーゼ陰性であった。それ故、ヌクレアーゼ遺伝子は、第１図で示す２ＫｂのＰ ｓｔＩ−ＥｃｏＲ■フラグメントが右している。

さらにサブクローニングの為に、そのプラスミドＤＮＡはＰｓＢとＥＣ０ＲＩの 両方で消化し、電気泳動法に付した後、ヌクレアーゼ遺伝子を有するＰｓｔｌ− ＥｃｏＲＩフラグメントをゲルから精製した。そのＤＮＡを制限酵素ＦｎｕＤ１ １（ヌクレアーゼ遺伝子内にいくつかの切断座位をもつ、４塩基プラント末端制 限醇素）で部分的に消化し、制限酵素３ｍａ■で切断されたプラスミドＩ）ＧＶ ４０３からのＤＮＡと混合した。混合したＤＮＡはＴ４リガーゼで連結され、Ｍ Ｔ１０２に形質転換した。りＯラムフェニコール２０μＱ／１！含有のＬＡプレ ートで選択を行い（ｐＧｖ４０３の耐性）、その形質転換細胞はＤＮアーゼイン ジケータープレート上でレブリノＪ　Ｊ８７１した。２０ケのヌクレアーゼ陽性 のコロニーが単離され、プラスミドＤ　Ｎ　Ａ　ｌｆｉ調製された。その最小の プラスミドは１．３ＫｂのＤＮＡ挿入部分をもち、その挿入８５分は第１図に示 されるＥＣ０ＩＩＶ座位に関して地図化した。口のプラスミドをＩ）ＧＶ４０３ −８Ｄ２　／１０と表示した。同じ挿入物を有するプラスミドであるが、ｔ）Ｇ 　Ｖ　４０３の唯一のＥＣ０ＲＩとＨｉｎｄｌ［ｌ認１部位に関して反対方向に 右するプラスミドはｐＧＶ４０３−８Ｄ２　／１４．！：、表示した。

ヌクレアーゼ遺伝子のヌクレオチド配列シークエンシングベクターブラスミドＩ ）ＧＶ４０３　（△ｍｅｒｓｈａｍ）を用いるマクサム・ギルバーｔ１人を用い た（　Ｐ　ｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ　ＵＳ△７４．１９７７、　ｐｐ５６０−６４　） 　、配列されるべきＤＮＡはベクターの５ＩｎａＩ座位に挿入される。３ｍａ■ は、制限酵素Ｔｔ旧ＩＩＩ（種々の５−ｐｒｉｍｅ　ｏｖｅｒｈａｎｇＩｎｇ　 ｅｎｄｓを与える〉の２つの制限座位を両側に有し、その酵素は対称的に開裂す るので、ＤＮＡは３２ｐでラベルした後直接に配列することができる。

それ故ＤＧ　Ｖ　４０３の３　ｍａ　Ｉ　ＦＦ位にもともとクローンされたＬ３ Ｋｂのヌクレアーぜフラグメントは、ハイブリッドプラスミドをＴｔｈｌｌｌ　 Ｉで消化した后ア刀ｌコースグルからＩＪｉ　１１した。

このＤＮＡフラグメンｉ〜は制限酵素ＦｎｕＤｉもしくはｌ−１ａｅＩ１１の一 つで消化され、Ｓｍａ工で開裂されたｐＧＶ４０３　ｔ）ＮＡに連結され、脱リ ン酸化された。ついでこのＤＮＡは、Ｍ　Ｔ　１０２に形質転換され、フロラハ フ１ニコール２０μ板で選択された。形質転換ｗＩ胞からプラスミドＤＮＡが作 製され１分析された。このように、１，３ＫＩ）フラグメント全体をカバーする ２００−４００ｂｐ　（塩基対）由来のＤＮＡを挿入することによつＣ１一連の Ｉ）Ｇ　Ｖ　４０３ハイブリツドプラスミドが組立てられ、そして両ストランド 中のごれらプラスミドの配列によって上記のヌクレオチド配列が得られた。

第７図に示されるヌクレオブト配列を分析した結果、ヌクレアーゼが３８６〜１ １６５位厘にコードされているのを示している。

第一に、読み取り枠が３００００ドル１−ンの蛋白をエンコードしているこの領 域全体にわたつ【のびている。第二に完全なリボゾ／−ム結合ル位が、３７４− ７８位置りなわら開始コドンのちょうど上流位置にある。第三に調節領ｊ吹を構 成する配列は、３３０〜３３６位＠（“−１０塩基配列″）及び３０６〜３１３ 位置（゛ー３５シークエンス″）にある。

ヌクレアーゼが、相補的ストランドにある長い読み取り枠からよりもむしろ指示 された配列によって実際にエンコードされル；Ｘ　トラＴｉｆｉ　ＬＸ　ｔ　ル 為ニ、ｐＧ　Ｖ　４０３−Ｓ　Ｄ　２　／　１０＃　Ｊ：　Ｕ　ＤＧ　Ｖ２Ｏ３ −８　Ｄ　２　／　１４への挿入物は、ＥＣ０ＲＩとＨｉｎｄｌとによる二重消 化で切除された。これら挿入物の方向はＤＧＶ４０３ベクターの二つの制限座位 に関して、反対側であることに留意すべきである。切除されたフラグメントは、 ＥＣ０ＲＩと）ｌｉｎｄｌ［ｌで二重に消化されたｐｐ　Ｌ　１９５と連結され た。このベクターｐＰＬ１９５ハ、λｐＬ７ｏーＥーターｔｌ）下流にＥｃｏＲ ＩとＨｉｎｄＩ［１ｆｌｉ座位を有するポリリンカーを挿入することによりｐｌ ｃ２８から誘導される。イー・コリＮ１：１に形質転換した後、３０℃でのＡＤ Ｒ　についての選択を行うことによってｐＰ　Ｌ　１９５−３　Ｄ　２　／１０ とｐＰ　Ｌ　１９５−８　Ｄ２　／１４の２つのプラスミドが分に１された。

前者には、λＩ）Ｌプロモーターが上述の推定上のヌクレアーゼコーディング領 域の上流に位置し、一方接者のプラスミドには、λＩＩＬプロモーターが相補ス トランドが転写されるようなしかたで位置している。イー・コリＮＦ１は、Ｃｌ ８５７選伝子によってエンコードされる温度感受性λ−リプレッサーの肩伝情報 を指定する欠陥λに対して溶除性である。ｃｌリプレッサーは３０℃で活性であ り、１）ＰＬ１９５上にあるλｐＬのようなリプレッサーによって調節されるプ ロモーターはこのようにして抑ｉｌｌされる。３１℃以上ではそのリプレッサー は不活性でありｐＰＬ１９５中のλｐＬからの転写がおこる。３０℃と４２℃と でヌクレアーゼの活性を比較すると、ｐＰ　Ｌ　１９５−３　Ｄ２　／１４でな くてｐＰＬ１９５−３Ｄ２　／１０が温度誘導ヌクレアーゼ合成を行い、それは λプロモーターに関するヌクレアーゼコーディング領域の方向はＤＰ　Ｌ　１９ ５−３　ｌ）２　／１０が正しいことを示している。

更に、予測されるヌクレアーゼコーディング領域が直接λプロモーターと結合す る時、高水準の（温度誘導）ヌクレアーゼ合成がなされる。３５７から１２９５ までの位置の領域にわたっているｐＧＶ４０３−３ｌ）２　／１ｏ山来のＲｓａ Ｉ−Ｈｉｎｄ　１１１７ラグメント（第７図）は、３ｍａ工とＨｉｎｄｌＪで消 化されたＩＩＰＬ　１９５と結合させた。この事によりコーディング領域は、λ プロモーターに関してはｌ］ＰＬ１９５−３Ｄ２　／ｌｏ内にあると位置づけら れる。

このプラスミドはｐＰＬ１９５−８Ｄ２　／ＲＩと表示した。

ヌクレアーゼのアミノ末端に対応するヌクレオチド配列は部分的に精製した蛋白 のアミノ酸配列分析により認識されてきた。

ヌクレアーゼのカルボキシ末端に対応覆るヌクレオチド配列は、第二の塩基配列 決定法のザンガーら（３ａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ　）のジデＡキシ（ｄｉｄｅＯ ＸＶ　）ヌクレオブト　シーフェンシング法、ｐ　ｒｏｃ、Ｎ　ａｔ、Δｃａｄ 、３ｃｉ、　ＵＳΔ７４．　Ｄ１１５４６３−５４６７を用いて、その領域の配 列を決定することによってＦｌｌ［明された。

（以下余白、次頁に続く） ヌクレアーゼの予測されるアミノ末端の塩基配列は、２０ケのアミノ酸のシグナ ルベクヂトの存在を示し、このペプチドは、４４８位にある、シグナルペブヂタ ーゼの認識塩基配列によって終結する。

ヌクレアーゼの酵素活性 セラチアマルセッセンスＷ２２５株と、プラスミドｐ　Ｂ　Ｅ　ＩＪ　５Ｏ−ｎ ｕｃ”を保存するイー・コリＣ６００との培養物を、３０°ＣにてＬＢ培地で指 数増殖させた。ＯＬ’１４％。とヌクレアーゼ活性を測定するために、種々の時 間にＩｍＱづつの試料を採取した。ヌクレアーゼ活性は、クロロホルム１００μ ｍを加えてペリプラズムから酵素を放出させることによって測定した。１０，０ ＯＯｒ、ｐ、ｍ。

Ｘ５分間の遠心分離後、上澄液２５μＱをヌクレアーゼ活性の測定用に採取した 。そのヌクレアーゼ含有試料を、０．０５Ｍ　トリス（ｐ　Ｈ８，０）＋０．０ １ＭＭ　ｇ　ＣＩ！２に溶解された鮭の精液のＤＮＡ（Ｉ　ｍ　ｇ　／ｍ＋２） の０．５ｍＱ中に添加し、得られた混合物を３７℃でｌｈｒ培養した。ついで４ ％ＰＣＡ（過塩素酸）０．５ｍ１）を加えて３０分間水上に放置した。未消化の ＤＮＡの沈澱を遠心分離で除き、０Ｄｙａ。（波長２６０ｎｍの紫外線吸収）値 を、分光光度計を用いて、石英キャベツト中で測定した。第３表に示す活性は、 定常増殖をしている培養物の試料について上記のようにして得られた０Ｄｔａ。

値である。両方の培養液において、その酵素は、成長サイクルの後期に優先的に 合成されることは明らかである。

平行実験において、ペリプラズムと増殖培地間のヌクレアーゼの分布を培養物試 料を２つの部分に分けて測定した。その一つは細胞の存在しない増殖培地だけを 含有し、他方は、ペリプラズムと増殖培地の両者（上記クロロホルム処理）を含 有している。その結果を第４表に示す。

上記の通り、セラチア・マルセッセンスＷ２２５では本質的に全ヌクレアーゼが 全部排泄されるが、一方イー・コリからは約５０％しか排出されない。

実施例２ ヌクレアーゼの精製 定常増殖期を１６〜２０ｈｒ経過後、プラスミｐＧＶ４０３−ＳＤ２を含むイー ・コリＭＴ１０２（実施例１に記載）の培養液２５Ｑから、発酵液を０．４５μ ｍの薄膜を介して限外濾過して収穫し、次いでフィルターを用いて限外濾過を行 って濃縮し、１０，０００ダルトンでカットオフした。ＩＯｍＭ）リス−ＨＣ１ ２（ｐ　Ｎ７．５）、ＬｍＭＥＤＴＡに対して透析した後、得られた製剤をグラ スフィルタで濾過し、次いで０．４５μｍと０．２２μｍのフィルターで濾過し た。

得られた酵素製剤（ｅｎｚｙ亀ｅ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）を次に要約する標 準ガ訂欣で捏々のハフメータについて、試ＩＩ’ｌ＋　１，１こ。

５０ｍＭ）リス（ｐ　Ｈ８，２）、１ｍＭＭｇＣＱｔおよび５０ｔｔｇ／ｍＱＢ ｓＡ含有の緩衝液４００μσと、１００　ｍ　１７のＩ）　Ｎ　Ａ溶液（蛙精液 ＤＮＡの水溶液、５ｍｇ／ｍ１２）および上記緩衝液ＣＤＮＡなし）で箱釈され た２５μｅの酵素製剤を３７℃で６０分間培養した。この反応混合物に４％の冷 過塩素酸４００μＱを加えた。

反応混合物を３０分間氷上に放置しついで５分間１５０００Ｘｇで遠心分離した 。２５０ｎｍの吸収を測定した。標準定量分析法において、ＤＮＡがｌｈｒに１ ｍ（２当り可溶性物質の１ＯＤｔｓ。を放出する活性を１単位と定義する。

最適ｐＨを決定するために標準定量法用緩衝液のｐｉ−ｔを変化させＤＮＡを加 えた後に測定した。ヌクレアーゼ活性についての最適範囲は７．５−９．６で最 高のＰ　Ｉ−１は８．５−９．２である。最適のＭｇ　′”は、標準定量法でＭ 　ｇ　ＣＱ　ｙの濃度を０から１００ｍＭに変化させて決定した。０，１〜１ｍ 　Ｍ　Ｍ　ｇ　ＣＱｔの軸回に明確に定義される最適域がある。しかしその酵素 は、Ｍ　ｇ　ＣＱ、を加えなくても約４０５の活性を保持した。１価の陽イオン の最通濃度は標準定量法でＮａＣｌ！とＫＣｇの濃度を変化させて決定した。活 性はＮ３゛濃度が増加すると急速に減少した。その酵素はＫＣＱＯ〜５０′ｍＭ で活性であることが分かった（活性は減少しなかった）。

そして特にイー・コリの細胞が溶解するときには、そのに゛の細胞内濃度が１０ ０−１５０ｍ　Ｍ　Ｋ　”であるためむしろ適量に産生ずるので重要である。短 期間の酵素安定性は標準定量用緩衝液中でＤＮＡなしで、４．２３および３７℃ でそれぞれ１．４お上び１８時間、酵素を予備培養することにより決定した。Ｄ ＮＡを加えて酵素活性を標準定量法で決定した。下記第５表に、標準定量法によ る２５０　ｎ　ｍにおける吸光度の測定値を示す。安定な酵素は各カラムで同じ 値を示す。

第５表から、酵素は、４°Ｃと２３℃の時緩衝液中１８時間安定であることが分 かる。３７℃では長時間の培養では活性が減少している。

変性剤の影響は尿素、非イオン性界面活性剤（Ｂｒｉｊθ８．Ｔｒｉｔｏ　ｎ＠ ｘ−１００）及びイオン性界面活性剤（ＳＤＳ及びデオキシコール酸ナトリウム ）の存在下で酵素活性を試験することによって測定した。これらの物質は、け準 定量分析法において、種々の濃度で、製剤に添加した。酵素は尿素１−８Ｍで活 性であることが見出され、実際は４−８Ｍで活性が増加し、４Ｍの時最高であっ た。また酵素は、Ｂｒｉ　ｊＯ５８（１％）及びトリトン（りＸ　−１００（ｏ 。

４％）のような非イオン性界面性剤の存在下で完全に活性であった。イオン性界 面活性剤に関しては、ＳＤＳは０．０１％より高い濃度で酵素活性が完全に抑制 され、一方１％のデオキシコール酸ナトリウムの存在下では約４０％の活性度が 残る。

酵素の純度は、標準変性５ＤＳ−ＰＡＧＥ法によって分析した。その酵素製剤は 、多数の蛋白質のバンドを有していた。見掛けの分子ｆｆ１３００００のヌクレ アーゼに相当する領域内に、全製剤の５−１θ％に当る明確なバンドがあった。

そのヌクレアーゼ製剤中のプロテアーゼ活性が、異なった定量法が測定されノこ 。第一に、５０μＱのヌクレアーゼ試料を蛋白質（脱脂乳）寒天板（緩衝液中２ ０％乳）上の水中にスポットした。透明域の形成（板上の乳蛋白の分解）は、３ ７°Ｃ２Ａｈｒ後及び２３℃４８ｈｒ後に全く認められなかった。

第二に、酵素２０μρとＩ　ｍ　ｇのアゾ−カゼイン［緩衝液：５０ｍＭ）リス （ｐ　Ｎ３．０）、ｌ　ＯｍＭＭ　ｇ　ＣＱｔｌを０．１６および３０°Ｃで＋ ２ｈｒ培養し、次いで酸に可溶なアゾ染料をＡ３７６で測定したが、測定可能な アゾ−カゼインの分解は認められなかった。第三に、５　ｍＭＭ　ｇ　Ｃｌ２ｔ の存在下３７℃でヌクレアーゼを培養してＳ　Ｄ　Ｓ　−Ｉ）　Ａ　Ｇ　Ｅで分 析した。ヌクレアーゼ製剤中に存在する約２０種の蛋白のパターンの変化すなわ ち自動蛋白加水分解は認められず、蛋白分解酵素が存在していないことを示す。

このことは、ヌクレアーゼの実際的応用で、酵素製剤中の蛋白質加水分解活性が 低いことは、処理される細胞溶解物中の蛋白分解酵素の全量に比較して最小であ ることを意味する。

有機溶媒の存在下で、ヌクレアーゼが、ＤＮＡとＲＮＡを分解する能力が測定さ れた。イー・コリＭＴ１０２のＦＴＬ−溶解物（トリス−ＥＤＴＡ緩衝液１容爪 部に対して細胞１容量部で、細胞溶解の前にヌクレアーゼを１２０００単位／ｍ Ｑ加えた。下記の実施例３参照）の試料に更にフェノール（１％）、トルエン（ １％）、クロロホルム（１％）エタノール（５％）又はＥＤＴＡ　（０，２５Ｍ ）を加えた。４．５ｈｒ、２０℃で培養した後試料をアガロースゲル電気泳動法 で分析した。ヌクレアーゼは上記濃度のＥＤＴＡで事実上不活性になる為、ＥＤ ＴＡが加えられた試料は、コントロールとして利用できる。種々の有機溶媒を加 えても、有機溶媒を全く添加しなかった試料と比べて、ヌクレアーゼの活性１、 −影響しなか・・たが、９５％のＤＮＡが２００ｂｐ以下のフラグメントに分解 された。

実施例３ 神胞溶解−物の帖工麿ｐ低−下 実施例２で製造された酵素をイー・コリ０．２７ｇの高粘性のＦＴＬ（リゾチー ム−凍結−融解）溶解物に、全容量５００μｇで約２．６ＸＩＯ”及び２．６Ｘ ＩＯ３単位をそれぞれ添加した。−組の試料にはＭ　ｇ＊　’イオンを加えない で、他方の組の試料にはＭｇ１″イオン１０ｍＭを加えた。これらの試料を０℃ もしくは２４℃で培養した。

下記第６表は、細胞溶解物が、゛水状”になった時間すなわち明らかに水の粘度 に近い粘度になった時間を示す（溶解物の試料をピペットで吸引採取し、溶解物 が、独立の非粘性の液滴としてピペットから排出されるかどうかを観察すること によって測定した）。

しかしながら異なった溶解物を含む実験でかなりの変化が観察されたことに注目 すべきである。例えばＦｌ）（フレチンプレス）の溶解物を用いると、ある程度 せん断された核酸が得られた。このタイプの溶解物は酵素に対して良好な基質を 提供することが見出された。これは恐ら＜ＦＰ溶解物のそれほど密にパックされ ていないゲル構造によるものであろう。イー・コリＷ３１１０７．５ｇ　（ａ重 量）から得られたＦＰ溶解物（１５ｍ１２）の粘度は、２１酵素単位／　ｍ　Ｑ とともに０℃で４０分間培養すると、低下して“氷状”になった。

細胞溶解前のヌクレアーゼの添加 Ａ、ＴＥ　（ＴＥは１０ｍＭ）リス（ｐ　Ｈ８，０）、１　ｍ　Ｍ　Ｅ　Ｄ　Ｔ Ａ）０．２５ｍｆ２中に再懸濁させた０、２５ｇのイー−ｆｆすＭ　Ｃ１０００ （昼型１）に、実施例２で製造した１２単位のヌクレアーゼを添加した。この懸 濁液を標準方法（凍結−融解３ザイクル）によるＦＴＬ溶解法に付した。粘度は 目で監視し、溶解物の粘度減少の指標として、ピペットで採取して“水状”液滴 の生成を用いた。最後のＦＴＬザイクルの後、溶解物を０°Ｃで培養した。０℃ で５分後、溶解物は“氷状”になった。

この実験は、細胞破壊に先立って酵素を加えることによる予想外の効果を示した 。即ちヌクレアーゼを細胞溶解後に加えた場合、粘度を低下させるのに５２００ 単位／　ｍ　Ｑ溶解物を添加して１２分要したのに比べて、ヌクレアーゼを細胞 溶解前に添加すると、２４単位／　ｍ　Ｑの酵素を添加するだけで粘度を低下さ 仕るのに５分しか要しなかった。

Ｔ３．粘度の低下をより定量的に得るために、凍結−融解効果と高圧溶解を組合 せたＸ−プレス（Ｂｉｏｔｅａ）で作製したイー・コリ溶解物で試験した。

７．５ｇのイー・コリＭ　Ｃ１０００（湿重量）を７．５ｍｆ２のＴＥ中に再！ ３濁させた。Ｍ　ｇ　ＣＱｔを２ｍＭ添加し、ヌクレアーゼを２５単位／　ｍ　 Ｑ添加した。その懸濁液をＸ−プレス中で凍結し、−２０℃で５回の圧縮サイク ルにかけた。得られたホモジネートを、０℃にて２時間かけて融解させた。眼で みて、その粘度は融解時に減少したが（即ちピペット採取時の“氷状”液／ｌ！ ｉ）、融解時間を延長するとヌクレアーゼの活性がなくなるタイムゼロを確認す ることが困難になる。それ故、もしヌクレアーゼを溶解前に加える時には、Ｘ− プレス溶解物の粘度を低下させるのに、２４単位／　ｍ　Ｑ溶解物がａ用である 。

得られたホモジネートを、（０℃にて）ＴＥで３７．５ｍｆｆに希釈し、引続い て２４時間、粘度を（オストワルド粘度計で）監視した。ヌクレアーゼ消化を０ ℃に保持した粘度計内で続けた。

第２図に示す時間（横軸）に粘度を測定した。第２図の縦軸は、０℃における水 の粘度に対する相対粘度を示す。反応条件は９．６単位のヌクレアーゼ／　ｍ　 Ｑ溶解物であった。相対粘度は、最初の１０分間に急速に減少し、次いで０℃で 培養した続く数時間は定常的に減少した。２４ｈｒで相対粘度は１．５であった 。

Ｃ，イー・コリＭ　Ｃ１０００（昼型ｆｆ１）　７．５ｇをＴＥ７．５ｍｆ２中 に再懸濁させた。Ｍ　ｇ　ＣＱｖを６ｒｎＭ添加し、ヌクレアーゼを２４単位／ 　ｍ　Ｑ添加した。細菌＋酵素を、１ｏｏｏｏｐｓｉでＦｒｅｎｃｈＰｒｅｓｓ ｕｒｅ　Ｃｅ１ｌを通過させた。溶解物を直ちに０℃に保持した。

タイムゼロをプレス器から放出された時間とした。放出直後、溶解物はピペット 法で“粘性の゛液滴を生成したが、０℃に保持して５分以内に“氷状”の液滴に 変化した。

それ故溶解物について２４単位がＦＰ溶解物の粘度を低下させるのに有用である 。

５分後にこの溶解物を、ＴＥ４１衝液（０℃）で３０ｍＣに希釈して、その粘度 をオストワイルド粘度計でいろいろの時間に測定した（第３図、横軸）。その結 果は対照として０℃の水の粘度を用いた相対粘度として示した（縦軸）。粘度計 内の反応条件は次の通りである。イー・コリＭ　Ｃ１０００，２５ｇ　／　ｍＱ からの溶解物のｍＱ当りヌクレアーゼ１２単位、温度は０℃である。

溶解前にヌクレアーゼを添加することの有利な効果を説明する為に、次の実験を 行った。溶解物は上記と同様にして調製した。イー・コリＷ３１１０　（細胞７ ．５ｇ　）の懸濁液の試料１５ｍＣに、ヌクレアーゼの４を変化さ仕て、０．２ ４ｍ２４０単位／ｍＱの最終濃度まで添加した（第４図中のライン１〜５）。フ レンチプレスによる溶解に続いて、溶解物を０℃で培養して、肉眼ですなわちピ ペットで採取して粘度を追跡した。その格付けを第４図に示した。

ヌクレアーゼが２４０単位／　ｍ　Ｑの場合（ライン５）、溶解物は、プレスか ら放出された時に“氷状”であり、一方ヌクレアーゼが２．４単位／ｍＱ（ライ ン２）の時は、０℃で約２０分後に“水状”液滴となった。、　０．２４単位／ ｍＱ　（ラインｌ）の場合は、７０分後に”グリセロース状”液滴になり、続い て０℃で１５時間培養した結果、“氷状”液滴に変化した。

上記試料を２．５倍希釈したものの相対粘度を０℃で７０分および＋５ｈｒｓ培 養した後に測定した。ライン２〜５は、この実験で”氷状”液滴という視覚的印 象は、相対粘度では１．５〜２．１の範囲であることを示している。過剰の酵素 では（ライン５）、、１．５という最小値が得られる。この最小値は多分７０分 で到達すると思われ、核酸に帰因する粘度の成分が除去された事を示している。

特殊な応用に必要なヌクレアーゼの量について情報を提供する為に、加える酵素 の量と、７０分および１５ｈｒでの粘度との間の相関関係をプロットした（第５ 図）。ヌクレアーゼを３６００単位添加すると、０℃での７０分と１５時間の培 養でほぼ同値、即ちそれぞれ１．５２と１．４７の値が得られた。それ故ｌ、５ ０という値は、問題の溶解物のｔ目対粘度の最小値といえる。

０℃で７０分間培養した場合、相対粘度は、ｌｏｇ　（加えた酵素）或いはｌｏ ｇ　（酵素濃度）に比例する。外挿法によれば、１５００単位（１００単位／　 ｍ　Ｑ　）添加すると、核酸の存在に帰因する場合がある溶解物の粘性成分か完 全に除去され、即ち１５００単位という過剰の酵素を添加したり或いは培養期間 を延長しても、それ以上相対粘度は減少せず、最小値は１．５である。

添加する酵素１を１／ｌＯに減少すると同じ粘度を得る為には０℃で培養時間を １０倍に延長する必要があることは第５図から明らかである（例えば３６単位／ ７０分対３．６単位／１５ｈｒおよび３６０単位７７０ｍ１ｎ対３６対／１５ｈ ｒ）　。

細胞破壊前にヌクレアーゼを加える新しい方法を、細胞溶解後にヌクレアーゼを 加える従来法と比較する為に、溶解物１５ｍＱを上記のようにして作製したが、 細胞破壊前にはヌクレアーゼを添加しなかった。フレンチプレスで溶解後３６０ 単位のヌクレアーゼを添加して最終Ｑ度を２４単位／ｍＱとした。その溶解物を ０℃で培養した。第４図のライン６は、段階的に粘度が低下し、４０分で“氷状 ”液滴になることを示している。その７０分での相対粘度は、ライン３で示す試 料（溶解前に８単位／ｍＱ添加）の相対粘度と同等であった。しかし粘度の初期 の低下速度は明らかに異なる。細胞溶解前にヌクレアーゼを約１．５単位／　ｍ 　Ｑ添加すれば、ライン６と同じ時間的なパターンが得られるが、得られた相対 粘度は、明らかに高い値で２．１３−２．５３のε囲である。（酵素所要量に関 する）利得は、“粘度の低下”を定義するのに用いられる基準に依存するが、３ 倍らしくは２０倍である。

第４図のライン２〜６に示す溶解物が“水状”状態に達した時１．［取した試料 をアガロースゲル（１％）の電気泳動に付し、ついでエチジウムプロミドで染色 した。全レーンにおいて、染色可能な残留産物は２１Ｋｂｐのマーカーからブロ モフェノールブルーバンドまでひろがったスミア−（ｓｍｅａｒ）となり、高濃 度ヌクレアーゼの試料ではゆっくり移動する物質の量が少ない。

この物質は、ヌクレアーゼ処理以面には１％未満〜数％の核酸を含有している（ 第６図）。

実施例４ 残留核酸類の除去 細菌溶解物の限界消化物のゲル電気泳動分析の結果から、溶解物中に存在する約 ０．１％の核酸は、ヌクアーゼの作用を受けないと結論した。核酸の全潰のうち ごく微量だけがヌクアーゼ処理後に残留するので、残留核酸が存在するというこ とは、特定の塩基配列の防御的なマスキング、恐らくゲノムの膜が関連する領域 に帰因することを示唆している。

残留核酸を除去するため、細胞溶解物を種々の蛋白質変性試験の存在下、ヌクレ アーゼで処理した。

全容積が０．６ｍＱＯ）、０．ｚ５イー・コリ（湿重量）のＦＴＬ溶解物を、１ −１２Ｍの尿素の存在下、２４０単位のヌクアーゼで処理した。その溶解物を３ ０℃で、１ｈｒＩ！：１８ｈｒ培養した。培養後、５μＣの残留物をアガロース ゲル電気泳動法で分析し、エチジウムプロミドで染色した。

＋８ｈｒ消化後、２〜４Ｍの尿素に著しい正の効果があることが観察された。特 に４Ｍの尿素が存在することによって、ゲル中に入ったすべての染色可能な物質 が除去された。

全容積２．５ｍ１２のＴＥ中の０．６８ｇのイー・コリ（湿重量）のＦＴＬ溶解 物を０．１％ＳＤＳもしくは０．６トリトン”Ｘ−１００の存在下、２．６Ｘ１ ０’単位のヌクアーゼで２４ｈｒ％　１６℃で処理した。

ゲル電気泳動分析法は、界面活性剤が存在すると残留核酸はヌクアーゼによって 消化できることを示した。

これらの実験から、界面活性剤と蛋白変性剤の両者が、溶解物中に残留している マスクされた核酸を、ヌクアーゼの作用を受けさせるようにすることは明らかで ある。

実施例５ セラデア５ｐｐＡ　Ｉの単離 菌を腐敗したキュウリから採取し、ＤＮアーゼの試験寒天上にプレートアウトし た。高レベルのエクソヌクレアーゼ活性を示す一つのコロニイをさらに分析した 。ゲノム染色法によってそれがゲノム陰性であることが分かった。予備的な同定 法によって、その単離された微生物がセラチア・リキファシエンス（Ｓｅｒｒａ ｔｉａ　１ｉｑｕｅｒａｃｉｅｎｓ）であることが分かった。しかしその微生物 がセラチアグループに属することを示す徴候があるので、分類が完全になされる まで、仮にセラチアｓｐｐと命名した。その微生物はテトラシリンとアンピシリ ンに対して耐性であり、セラチア・マルセッセンスと同じ細胞外酵素のパターン を示す（セラチアリキファシエンスΔｌは、ＤＳＭに、１９８５年５月８日、第 ３３０７号として寄託された）。

セラデアｓｐｐΔｌ由来の染色ｃ＋ＤＮＡの調製セラチア５ｐｐＡ　１の培養物 を一夜１．Ｉ３培地で培養し、遠心分離（８，０ＯＯｒｐｉ、　５ｉｉｎ）　Ｉ 、て収穫した。得られた細胞をＴＥＮ−緩衝液（ＩＱｍＭ）リス塩酸、　ｐ１４ ８　：　１ｍＭＥＤＴＡ　：１０［１ｍＭＮａＣＱ）で２回洗浄し、Ｉ　ｍ　ｇ 　／　ｍ　Ｑのリゾチームと０．１ｍ　ｇ　／　ｍ　ＱのＲＮアーゼ含有のＴＥ Ｎ緩衝液２０ｍ１！に再懸濁させた。その細胞を３０℃で３０分間培養し、２０ ％ＳＤＳを添加して最終濃度１％とした。３７℃で６０分間経過後（完全溶解の ため）、溶解物を４℃で一夜培養した。翌日、細胞の細片を遠心分離（１ＢＱＱ Ｏｒｐｍ、２５分間）で除去した。上澄液を、２ｍ１２の３Ｍ酢酸ナトリウムと ２容量部のイソプロパツールの入った新しい試験管に移した。穏やかに撹拌する とＤＮＡが繊維状に沈澱し、これを湾曲したガラス針で採取した。沈澱したＤＮ Ａを８０％エタノールで２回洗浄し、ＴＥＮ−緩衝液に再懸濁させた。そのＤＮ Ａをさらに、浮遊密度勾配遠心分離法で精製し、適当に希釈した後、フェノール で抽出し、ＴＥ−緩衝液（１０ｍＭ）リス−塩酸ｐＨ８、Ｌ　ｍ　Ｍ　Ｅ　Ｄ　 Ｔ　Ａ　）に対して透析した。

最後に、そのＤＮＡを制限酵素緩衝液とともに、３７℃で培陀することによって ヌクレアーゼの存在しないことを試験した。

セラチア５ｐｐＡ　ｌ由来のシーンバンクの作製クローニングベクタープラスミ ドｐＮ　ｔＪ　１２１を、セラチア５ｐｐＡ　ｌ由来のシーンバンクの作製に用 いた。このプラスミドは実施例１に記戦されている。

そのＣｒ遺伝子に唯一のＥｃｏＲＩ座位を宵するｐ　Ｎ　Ｕ　１２１ＤＮＡを制 限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、セラチアｓｐｐと混合した。

ＡＩ　ＤＮＡはＥｃｏＲＩによって部分的に消化された。そのＤＮＡを、Ｔ４Ｄ ＮＡリガーゼによって、１５℃で一夜かけて連結し、イー・コリＭ　Ｔ　１０２ に形質転換した。８μｍ／ｍＱのテトラサイクリン含有のＬＢプレート上３７℃ で選択が行われ、挿入されたＤＮＡをもつｐ　Ｎ　Ｕ　１２１を保有する細胞だ けがコロニイを生成した。セラチアｓｐｐのシーンバンクを提供する約８．００ ０のコロニイをこの方法で単離した。

リパーゼ活性のスクリーニング イー・コリＭＴ１０２細胞をセラチア５ＰｐＡ　１のゲノムバンク（ｇｅｎｏｍ ｉｃ　ｂａｎｋ）で形質転換し、ハイブリッドブスミドを有する細胞をテトラサ イクリン含有のＬＢプレート上で選択した。

−ロニイを採取し、各ウェルに、Ａ”Ｂ培地°１％カサミノ酸゛チアミンと、２ ００ｍ　ｇ　／　＋ｎ　Ｑのストレプトマイシンと８μｇ／ｍＱのテトラサイク リンを含イ１ケるマイクロタイマー皿に移した。細胞を一夜３７℃て培養し、前 期皿のレプリカを作製した。

リパーゼ酵素の乱質のｐ−二トロフェニルパルミテートを最初６　ｍ　ｇ　／　 ｍ　Ｑの濃度でイソプロパツール中に懸濁させた。その懸濁液１０ｍ１２を、２ ０７ｍｇのデオキシコール酸ナトリウム含有ノ０．０５Ｍ燐酸塩Ｕ、衝液新液ｐ 　１１８．０）９０ｍｌ！ｌ：添加した。コノ溶液０．５ｍｌ！を前記の皿の各 ウェルに添加した。ウェルが黄色になればリパーゼ活性の存在を示す。リパーゼ 活性を示す一つのクローンが得られた。ＤＮＡを調製し、イー・コリＣ５）１５ ０を形質転換するのに用いた。形質転換細胞はリパーゼ陽性であった。

リパーゼ活性の一つのクローンを単離しＩ）　Ｎ　Ａを調製した。選択されたク ローンは、プロテアーゼ、ホスホリパーゼもしくはヌクレアーゼの活性を示さな かった。

リパーゼを有するプラスミドｐ　Ｎ　Ｕ　１２１−　ｌｉｐ”そのリパーゼ陽性 クローンから単離されたプラスミドＤＮＡは、約８．４Ｋ　ｂの挿入されたＥｃ ｏＲＩフラグメントを有するｐ　Ｎ　Ｕ　１２１で構成されていた。そのハイブ リッドプラスミドをｐＮＵ１２１−１　ｉ　ｐ”と呼フ（エシェリヒア−コリＣ ５Ｈ３Ｏ／ｐＮＵ１２１−１　ｉ　ｐ’は、ＤＳＭに１９８５年５月８日、第３ ３１３号として寄託された）。

リパーゼの酵素活性 基質のｐ−ニトロフェニルパルミテートに対するリパーゼ活性の作用は、０Ｄ４ １゜で分光光度計によって追跡できる。イー・コリ／　ｐＮＵ＋！＋　ｌ　ｉ　 ｐ”とセラチア５ｐｐＡ　１との両者を、Ａ゛Ｂ培地゛１％カサミノ酸およびチ アミン中で指数増殖した際、その酵素が培養基内に存在していることを示した。

実施例６ セラチア５ｐｐＡ　Ｉ由来の染色体ＤＮＡの調製セラデア５ｐｐＡ　１の培養物 （実施例５参照）を−夜Ｉ、Ｂ培地で培養し、遠心分離（８０００ｒｐｍ、　５ 分）で収穫した。得られた細胞をＴＥＮ−ｍ新液（ｌｏｍＭ）リス−塩酸ｐＨ８ ，１ｍＭＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ４１００ｍＭＮ　ａ　Ｃｆ２）で２回洗浄し、１　ｍ　 ｇ　／　ｍ　Ｑリリチウムおよび０．１ｍ　ｇ　／　ｍＱｎ　Ｎアーゼ含有の２ ０ｍＱＴＥＮ−緩衝液に再懸闇させた。得られた細胞を３７℃で３０分間培養し 、２０％ＳＤＳを添加して最終濃度１％とした。３７℃で６０分後（完全溶解の ため）、溶解物をｌ夜４℃で培養した。

翌日、細胞片を遠心分離（１８，０ＯＯｒ　ｐｍ、　２５分間）で除去した。

上澄液を２ｍＱの３Ｍ酢酸ナトリウムと２容量部のイソプロパツールの入った新 しい試験管に移した。穏やかに撹拌すると、ＤＮＡが繊維状に沈澱し、これを湾 曲したガラス針で採取した。

沈澱したＤＮＡを８０％エタノールで２回洗ａトシ、’ｌ’　Ｅ　Ｎ緩衝液に再 懸濁さＵ・た。得られたＤＮＡを、浮遊密度勾配遠心分離法でさらに精製し、適 当に希釈した後フェノールで抽出し、ＴＥ−緩衝液（ＩＯｍＭ）リス−塩酸ｐ１ （８，１ｍ　Ｍ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　）に対して透析した。最後に、ＤＮＡを、制 限酵素緩衝液とともに３７℃で培養することによってヌクレアーゼが存在してい ないかどうかを試験した。

セラチア　５ｐｐＡ１由来のシーンバンクの作製クローニングベクタープラスミ ドのｐＮＵ１２１（実施例１参照）をセラチア５ｐｐＡ　１　（実施例５参照） 由来のシーンバンク作製に用いた。

そのＣＩ遺伝子に唯一のＥｃｏＲＩ座位ををするｐＮＵ１２１ＤＮＡを制限酵素 ＥｃｏＲＩで消化し、ＥｃｏＲＩで部分的に消化されたセラデア５ｐｐＡＩＤＮ Ａと混合した。そのＤＮＡを、Ｔ４ＤＮΔリガーゼで、１５℃で１夜かけて連結 し、イー・コリ菌株ＭＴ１０２に形質転換した。８μｇ／ｍＱのテトラサイクリ ン含有のＬＢプレート上３７℃で選択を行い、挿入されたＤＮＡをらっｐ　Ｎ　 Ｕ　１２１を保有する細胞だけにコロニイを生成させた。ｔ’ラチ７５ｐｐＡ１ のシーンバンクを提供する約８０００のコロニイをこの方法で単離した。

ホスホリパーゼ陽性のクローンのスクリーニングイー・コリＭ〕’１０２の細胞 をセラチア５ｐｐＡ　Ｉのゲノムバンクで形質転換し、ハイブリッドプラスミド を有する細胞をテトラサイクリン含有のＬＢプレート上で選択し、得られたコロ ニイをテトラサイクリン含有の卵黄プレート上でレプリカを作製した。コロニイ の周囲の透明領域とコロニイの上部の白色沈澱カニｌ：スホリパーゼ活性を示づ °。この活性を示ず１５のコロニイを分離した。ＤＮＡを調製しＣＳ　Ｉ−１５ ０に形質転換するのに用いた。用いたホスホリパーゼクローンはこのような活性 のクローンであった。選択されたり【１−ンのｐＮＵ１２１−ｐｈｃ”は、ホス ホリパーゼ活性のみを示した。（エシェリヒア・コリＭＴ１０２／　ｐ　Ｎ　Ｕ 　１２１−　ｈ　ｐ　１２’ｌ；Ｌ、Ｄ　Ｓ　Ｍ　１．：１９１１１５年５月８ 日、寄託番号第３３１１号で寄託された）。

ホスホリパーゼを有するプラスミドのｐ　ＮＵ１２１−　ｐ　ｈＱ”とｐＯＵ５ ７−ｐｈＱ″ ホスホリパーゼを産生ずるクローンのｐ　Ｎ　Ｕ１２１−　ｐ　ｈ１２°がら単 離したプラスミドＤＮＡは、そのＣ＋遺遺伝円内挿入された３、２Ｋ　ｂのＥｃ ｏｒｔＩフラグメントを有するｐＮＵ１２１で構成されている（第８図）。この ＥｃｏＲＩフラグメントをランアウェイプラスミドｐＯＬＩ５７にクローンさせ た。このランアウェイハイブリッドプラスミドｐＯＵ５７−ｐｈｃ”は、他のイ ー・コリ菌株にホスホリパーゼ表現型を与え、これがセラデア菌殊に存在°する と、ホスホリパーゼの発現の向上が認められた（エシェｌＪヒ７−：＋’ＪＳ１ ７−１／ｐＯＵ５７−ｐｈＱ”ｌ；ｔ、Ｄ　Ｓ　Ｍ　＋、１１９８５年５月８０ 、第３３１２号として寄託された）。このホスホリパーゼ発現は、前記試験菌株 の温度を３０℃から４０’Ｃに上昇させると増幅された。

ホスホリパーゼの酵素清風 プラスミドＩ）　Ｎ　Ｕ１２１−　ｐ　ｈｆ！”を有するイー・コリ細胞を、Ａ ’Ｂ”１％カサミノ酸およびチアミンの培地らしくはＬＩ３培地で培養した際、 ホスホリパーゼは培養物が０．７０Ｄ−ｓ。単位に相当する細胞密度に到達した 後の培養基にのみ検出される。そのイー・コリ菌株の生存率は、そのプラスミド の存在に全く影響されなかった。

ホスホリパーゼ活性の定量分析法は、卵黄との反応に基づくものである。活性は 、卵黄と、ゲル内での細胞の生育と蛋白合成とを阻害するクロラムフェニコール とを含有する２％アガロースゲル内で定量分析される。

複数の小さなウェルをゲル中に作り、生育培養物の上澄液試料５μＱづ＼（細胞 は遠心分離によって除去した）を、このウェルにピペットで採取した。

卵黄と酵素の反応によって、濁ったゲル中に透明な領域が生成した。酵素拡散速 度、すなわちＩｎ　ｍ　”透明領域／′単位時間が酵素活性の尺度として用いら れる。イー・フリ／ｐＮＵ１２１−ｐｈＱ”とセラチア５ｐｐＡ　１の生育培養 物とのホスホリパーゼ活性の測定値を第７表に示す。

イー・コリ培養物は、セラチアより効果的に酵素を培養基に分泌することは明ら かである。両菌株について、培地中に酵素が出現するのは、後期指数増殖期であ り、定常増殖期にも発生しつづける。培地中に１％のグルコースが存在すると、 上記二つの宿主における酵素の合成を効率的に阻止する（記載せず）。

培養基中に少量の界面活性剤（０，５％Ｔ　ｗｅｅβ８０）を添加すると分泌を 刺戟する効果がある。（記載せず）。

ホスホリパーゼクローンのＤＮＡ配列 ホスホリパーゼ遺伝子を含んでいる３、２Ｋ　ｂのＥｃｏＲＩ制限フラグメント をＭｌ　３フア一ジ誘導体のＭｐ８とＭｐ９とに行うＭｅｓｓｉｎｇらのショッ ト・ガンクローニング法［Ｎｕｃｌ。

Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、９，１９８１．１）、３Ｑ９）と５ａｎｚｅｒらのジデオキ シチェインターミネイター法（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃｏｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ ７４，１９８１．ｐ、５４６３）とを用いて配列した。前記フラグメントをサブ クローニングする場合に次の多くの種々の制限酵素を用いた。ずなわち５ａｕ３ Ａ、Ｔａｑｌ。

入ｆ１．Ｒｓａ１．ｓａ（！ｌ、Ｓｍａ１．ｌ’ｓＬｌ、ＥｃｏＲ１，Ｐｖｕｌ 、Ｂｓ５ｌｌＩｌおよびＥｃｏＲＶである。全塩基配列は、小さなピース（１０ ０〜３００塩括）のｌ）ＮΔ配列のコレクションをマージ（ｍｅｒｇｅ）するこ とによって完成した。大部分の塩基配列が両ストランドについて測定された。

第９図の塩基配列は、フラグメントの左端の４１６位置から出発して、ＳａＱ　 Ｉ座位を通過し１３７２３７２位置る主読取り枠（ｍａｊｏｒ　ｒｅａｄｉｎｇ 　ｆｒａｍｅ）を示す〇この伜の上流に、ンヤインーダルガルノホモロジ−（Ｓ ｈｉｎｅ。

Ｄｏｌｇａｒｎｏ、Ｎａｔｕｒｅ　２５４，１９７５．ｐ、３４）ＡＡＧＧＡＧ が、ＡＴＣスタートコドンのすぐ上流の４０５位置にある。読取り伜の上流に、 ３５１位置の一３５塩基配列ＣＴＧＣＣと３７４位置の−ｌＯ塩茫配列ＴＡＴＴ ＴＡとで構成され゛たプロモーター領域がある。−３５塩基配列の上流に、３０ ら位置から３３６位置までの潜在ＣＡＰ−結合座位がある。

この塩基配列は、推定分子量が３４０５６ダルトンの３１９のアミノ酸かるなる 蛋白質をエンコードする遣医子が存在することを示している。

０位置からｌａｃ遺伝子の上流の４４１位置のＰｓｔｌ座位までのＤＮＡを挿入 することによって、このＤＮＡフラグメント内に機能プロモータが存在すること を示した。このプロモータは、細胞の生育集団中に０．７のＯＤ、、。値でｌａ ｃ発現を開始する。またこのプロモータは、グルコースの存在下ではいずれの細 胞密度においても非機能性であり、恐らく前記のＣＡＰ結合座位を経由するカタ ボライトリプレッションを示すものである。

サブクローニングによって、細胞外ホスホリパーゼ活性に必要な遺伝情報が３６ ０位置から、１５５１５５１位置ｐｌ座位までの１．２Ｋ　ｂのフラグメント内 に位置することが確認された。また、塩基配列の情報を保持させるのに、イー・ コリ細胞内にホスホリパーゼ活性を得るために、このフラグメントをブロモ−ク ーの前にクローンすることが必要であることが見出された。このように、遺伝子 のオリエンテーションも確認された。遺伝子の転写の方向は塩基配列データを保 Ｆ、’？　４’る左のＥ　ｃ　ｏ　Ｔｔ　Ｉ座位からＦ　ｓ　ｐ　Ｉ座位への方 向である。使用されたプロモーターは、ｃ　１８５７とλｐＲの温度誘導性シス テムであった。イー・コリ細胞内での３０℃におけるホスホリパーゼの合成は、 通常のプレート分析法で判断して非常に低かった。３７°Ｃ以上では酵素が多量 に産生された。この１．２Ｋ　ｂのＤＮＡフラグメントの遺伝子産物は、放射能 でラベルされたメチオニンを組込むことによって、生体内および生体外の両者で 同定された。５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって、遺伝子産物 の大きさが３４キロダルトンであることが決定され、またこのゲルシステムにお いて、ホスホリパーゼ活性が放射能でラベルされた３４キロダルトンの蛋白質と ともに移動することが分かった。

Claims (55)

【特許請求の範囲】
1. １．細胞外セラチアｓｐｐ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｓｐｐ．）酵素をエンコードす るセラチアｓｐｐ由来のＤＮＡを含有するハイブリッドプラスミドを保有する微 生物を、培養基中で培養し、次いでその培養物から前記酵素を収穫することから なる細菌酵素の製造方法。
2. ２．前記酵素が前記微生物から培養基に排出され、次いで培養基から収穫するこ とからなる実質的に他の細菌蛋白質を含有しない細菌酵素を製造する請求の範囲 第１項の方法。
3. ３．セラチアｓｐｐ酵素が加水分解酵素である請求の範囲第１項らしくは第２項 の方法。
4. ４．セラチアｓｐｐ酵素がセラチアｓｐｐヌクレアーゼである請求の範囲第１項 もしくは第２項の方法。
5. ５．セラチアｓｐｐ酵素がセラチアｓｐｐリパーゼである請求の範囲第１項もし くは第２項の方法。
6. ６．セラチアｓｐｐ酵素がセラチァｓｐｐホスホリパーゼである請求の範囲第１ 項もしくは第２項の方法。
7. ７．微生物が細菌である請求の範囲第１〜６項のいずれかひとつの方法。
8. ８．徴生物がグラム陰性菌である請求の範囲第７項の方法。
9. ９．グラム陰性菌がイー・コリ（Ｅ．ｃｏ１ｉ）である請求の範囲第８項の方法 。
10. １０．細胞外セラチアｓｐｐ酵素をエンコードする、セラチアｓｐｐ由来の挿入 されたＤＮＡを含有するハイブリッドプラスミド。
11. １１．セラチアｓｐｐＤＮＡがセラチアｓｐｐヌクレアーゼをエンコードするＤ ＮＡフラグメントである請求の範囲第１０項のハイブリッドプラスミド。
12. １２．セラチァｓｐｐＤＮＡがセラチアｓｐｐリパーゼをエンコードするＤＮＡ フラグメントである請求の範囲第１０項のハイブリッドプラスミド。
13. １３．セラチアｓｐｐＤＮＡがセラチアｓｐｐホスホリパーゼをエンコードする ＤＮＡフラグメントである請求の範囲第１０項のハイブリッドプラスミド。
14. １４．条件付きで非制限の複製挙動を示すプラスミドである請求の範囲第１０〜 １３項のいずれかひとつのハイブリッドプラスミド。
15. １５．請求の範囲第１０〜１４項のいずれかひとつで請求されたプラスミドを保 有する微生物。
16. １６．微生物に保有されているプラスミドのセラチアｓｐｐＤＮＡの遺伝子産物 が微生物から培養基に排出される請求の範囲第１５項の微生物。
17. １７．細菌である請求の範囲第１６項の微生物。
18. １８．グラム陰性菌である請求の範囲第１７項の微生物。
19. １９．イー・コリで請求の範囲第１８項の微生物。
20. ２０．下記アミノ酸配列 【配列があります】 を有するセラチアｓｐｐヌクレアーゼ （Ｎ−末端シグナルペプチドを含む）である細菌ヌクレアーゼ。
21. ２１．実質的に純粋な形態である請求の範囲第２０項の酵素。
22. ２２．マトリックスに固定化される請求の範囲第２０項もｄくは第２１項の酵素 。
23. ２３．下記ＤＮＡ塩基配列： 【配列があります】 によってエンコードされるヤラチア ｓｐｐホスホリパーゼであるホスホリパーゼ。
24. ２４．セラチアｓｐｐヌクレアーゼからなる、生物物質から核酸類を除去するた めの組成物。
25. ２５．セラチアｓｐｐヌクレアーゼが請求の範囲第２０項のヌアゼである請求の 範囲第２４項の組成物。
26. ２６．実質的に蛋白分解活性をもたない請求の範囲第２４項もしくは第２５項の 組成物。
27. ２７．ヌクレアーゼと界面活性剤および／またはカオトロピック試薬とからなる 組成物。
28. ２８．界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルコール類例えばＢｒｉｊＲ５８も しくはオクトオキシノール類の例えばＴｒｉｔｏｎＲｘ−１００のような非イオ ン性界面活性剤、またはドデシル硫酸ナトリウムもしくはデオキシコール酸ナト リウムのごときデオキシコール酸塩のようなイオン性界面活性剤から選択される 請求の範囲第２７項の組成物。
29. ２９．カオトロピック試薬が、尿素、チオ尿素もしくはチオシアン酸の塩から選 択される請求の範囲第２７項の組成物。
30. ３０．ヌクレアーゼがセラチアｓｐｐヌクレアーゼである請求の範囲第２７〜２ ９項のいずれかひとつの組成物。
31. ３１．セラチアｓｐｐヌクレアーゼが請求の範囲第２０項のヌクレアーゼである 請求の範囲第３０項の組成物。
32. ３２．セラチアｓｐｐヌクレアーゼが生物物質に添加されることからなる、生物 物質から核酸類を除去する方法。
33. ３３．生物物質が核酸類の溶液からなる請求の範囲第３２項の方法。
34. ３４．生物物質が、生合成産物を産生する細胞培養物を含有する発酵培地からな る請求の範囲第３２項の方法。
35. ３５．生物物質が、生合成産物を産生する細胞培養物が培養された発酵培地から なる請求の範囲第３２項の方法。
36. ３６．生物物質が、生合成産物を産生する細胞培養物の懸濁物からなる請求の範 囲第３２項の方法。
37. ３７．ヌクレアーゼが、細胞溶解の前に生物物質に添加される生物範囲第３４項 もしくは第３６項の方法。
38. ３８．セラチアｓｐｐヌクレアーゼが請求の範囲第２０項のヌクレアーゼである 請求の範囲第３２〜３７項のいずれかひとつの方法。
39. ３９．ヌクレアーゼが界面活性剤および／またはカオトロピック試薬とともに添 加されることからなる、生合成産物から残留核酸類を除去する方法。
40. ４０．ヌクレアーゼがセラチアｓｐｐヌクレアーゼである請求の範囲第３９項の 方法。
41. ４１．セラチアｓｐｐヌクレアーゼが請求の範囲第２０項のヌクレアーゼである 請求の範囲第４０項の方法。
42. ４２．界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルコール類の例えばＢｒｉｊＲ５８ もしくはオクトオキシノール類の例えばＴｒｉｔｏｎＲ×−１００のような非イ オン性界面活性剤、またはドデシル硫酸ナトリウムもしくはデオキシコール酸ナ トリウムのごときデオキシコール酸塩のようなイオン性界面活性剤から選択され る請求の範囲第３９〜４１項のいずれかひとつの方法。
43. ４３．非イオン性界面活性剤が、生合成産物の、０．１〜１．５％好ましくは０ ．４〜１．０％の量で添加される請求の範囲第４１項の方法。
44. ４４．イオン性界面活性剤が虫合成産物の０．０１〜１０％の量で添加される請 求の範囲第４２項の方法。
45. ４５．蛋白質変性剤が尿素、チオ尿素もしくはチオシアン酸の塩から選択される 請求の範囲第３９〜４１項のいずれかひとつの方法。
46. ４６．蛋白質変性剤が２〜８Ｍの量で添加される請求の範囲第４５項の方法。
47. ４７．調節領域の下流に位置する遺伝子の発現が、プラスミドを保有する微生物 の発育周期の後期に前記領域から開始もしくは増大される、前記調節領域を有す るプラスミド。
48. ４８．遺伝子が、調節領域に、天然には関連がない請求の範囲第４７項のプラス ミド。
49. ４９．遺伝子がプラスミドの複製調節遺伝子からなる請求の範囲第４７項のプラ スミド。
50. ５０．調節領域がセラチアｓｐｐから得られる請求の範囲第４７〜４９項のいず れかひとつのプラスミド。
51. ５１．調節領域が、セラチアｓｐｐからの、ヌクレアーゼ調節領域もしくはホス ホリパーゼ調節領域である請求の範囲第５０項のプラスミド。
52. ５２．請求の範囲第４７〜５１項のいずれかひとつのプラスミドを保有する微生 物。
53. ５３．細菌である請求の範囲第５２項の微生物。
54. ５４．グラム陰性菌である請求の範囲第５３項の微生物。
55. ５５．イー・コリである請求の範囲第５４項の微生物。