CN114540421B - 一种针对家蚕msg和psg表达基因的可控编辑方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种针对家蚕MSG和PSG表达基因的可控编辑方法，其通过GAL4/UAS系统，分别构建了若干个在家蚕MSG中特异启动表达的GAL4表达载体和多个在家蚕PSG中特异启动表达的GAL4表达载体，通过将表达Cas9基因序列与U6驱动表达的gRNA靶点一起串联在UAS序列下游，最终构建成UAS表达载体，进而利用GAL4/UAS遗传操作工具达到家蚕基因的可控编辑。本发明根据家蚕基因组序列数据库中家蚕基因的序列密码子偏好性，对Cas9蛋白的基因序列进行了优化设计，使Cas9基因更有利于在家蚕丝腺中高效表达。本发明利用该可控的基因编辑技术可精准研究家蚕丝腺基因的功能和创制更多的生物遗传资源。

Description

一种针对家蚕MSG和PSG表达基因的可控编辑方法

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及一种针对家蚕MSG和PSG表达基因的可控编辑方法，其适用于家蚕泌丝器官丝腺的全基因可控编辑的方法及其应用。

背景技术

家蚕是以产丝著称的经济动物，具有5000多年的人工饲养和驯化历史，经济价值很高。2002年，国际无脊椎动物协会将家蚕确立为鳞翅目模式昆虫。2004年家蚕全基因组测序计划的完成，为家蚕模式生物的研究提供了关键理论基础和重要的技术平台。家蚕作为模式昆虫，不仅对害虫防控等昆虫领域具有重要价值，对促进揭示人类疾病发生机理和开发新型生物材料等方面也具有重要意义。

CRISPR/Cas是一种来自细菌免疫病毒DNA入侵的免疫机制，CRISPR系统共分成3类，其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种Cas蛋白共同发挥作用，而Ⅱ类系统只需要一种Cas蛋白，其中以CRISPR/Cas9应用最为广泛。Cas9蛋白含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA两条单链。Cas9蛋白与gRNA结合成复合物，然后通过与PAM序列结合形成发夹结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链发生断裂，随后这种DNA的损伤可以启动细胞内的修复机制，主要包括两种途径：一是非同源末端连接途径，此修复机制会导致碱基的缺失或插入，从而造成移码突变，最终达到基因敲除的目的。二是同源修复途径，在提供外源修复模板的情况下，靶向核酸酶对DNA的切割可以将同源重组发生的概率提高约1000倍，利用这种机制可以实现基因组的精确编辑。

家蚕全基因组上具备大量的PAM序列，可进行家蚕全基因敲除靶点设计，但现有研究基本上是采用广谱性启动子驱动表达Cas9从而进行全身性敲除，亦有通过注射外源Cas9蛋白进行敲除的报道，但组织特异性的基因敲除鲜有报道。若实现家蚕组织特异性的基因敲除，能够在个体水平上更加准确的阐释目的基因的生物学功能，并有助于创制出具有科学或开发价值的新型基因改造素材。

发明内容

基于现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种针对家蚕MSG和PSG表达基因的可控编辑方法，其具体为一种针对家蚕MSG(中部丝腺，下同)和PSG(后部丝腺，下同)表达基因的可控编辑方法，其适用于家蚕泌丝器官丝腺的全基因可控编辑的方法及其应用。

依据本发明的技术方案，提供一种针对家蚕MSG和PSG表达基因的可控编辑方法，其通过GAL4/UAS系统，分别构建了若干个在家蚕MSG中特异启动表达的GAL4表达载体和多个在家蚕PSG中特异启动表达的GAL4表达载体，通过将密码子优化的Cas9基因序列与U6驱动表达的gRNA靶点一起串联在UAS序列下游，最终构建成UAS表达载体，进而利用GAL4/UAS遗传操作工具实现家蚕基因的可控编辑。

其中所述若干个在家蚕MSG中特异启动表达的GAL4表达载体为4个在家蚕MSG中特异启动表达。所述多个在家蚕PSG中特异启动表达的GAL4表达载体为3个在家蚕PSG中特异启动表达。

进一步地，针对家蚕MSG和PSG表达基因的可控编辑方法，利用GAL4/UAS双元表达系统和CRISPR/Cas9基因编辑系统，用于产生一种能在家蚕中部丝腺和后部丝腺中进行组织特异性敲除的转基因表达载体。

所述针对家蚕MSG和PSG表达基因的可控编辑方法包括以下步骤：

步骤S1，家蚕MSG特异GAL4表达载体的构建；

步骤S2，针对家蚕MSG的UAS敲除表达载体的构建；

步骤S3，家蚕PSG特异GAL4表达载体的构建；

步骤S4，针对家蚕PSG的UAS敲除表达载体的构建；

步骤S5，转基因家蚕的制作；

步骤S6，形态学观察及分子检测。

其中，家蚕MSG特异GAL4表达载体的构建步骤包括分别构建了4种家蚕中部丝腺特异表达载体，所述表达载体目的基因表达框包括：启动子即4种家蚕中部丝腺特异的启动子：家蚕Ser1基因启动子(SEQ ID NO.1)[NCBI基因ID：AB007831.1]、家蚕Ser2基因启动子(SEQ ID NO.2)[NCBI基因ID：AB193317.1]、家蚕Ser3基因启动子(SEQ ID NO.3)[NCBI基因ID：AB299446.1]、家蚕Ser4基因启动子(SEQ ID NO.4)[NCBI基因ID：XM_038013949.1]。

进一步地，目的基因为编码GAL4蛋白结合结构域的基因序列GAL4BD(SEQ IDNO.5)；VP16为激活基因表达的蛋白结构域序列(SEQ ID NO.6)；Ser1-polyA为终止信号(SEQ ID NO.7)，将目的表达框插入到piggyBac载体骨架上即pBac[3×P3-DsRed]。

优选地，载体骨架由以下步骤完成：首先组装3×P3-DsRed序列(SEQ ID NO.8)，该3×P3-DsRed序列是由3倍重复的P3启动子(眼睛和神经特异的启动子)驱动表达了红色荧光蛋白(DsRed)序列组成；随后在3×P3-DsRed序列(SEQ ID NO.8)的5’端和3’端分别组装上piggyBac右臂(SEQ ID NO.9)和piggyBac左臂(SEQ ID NO.10)。

相比较于现有技术，本发明专利的一种针对家蚕MSG和PSG表达基因的可控编辑方法的有益效果如下：

1、本发明根据家蚕基因组序列数据库中家蚕基因的序列密码子偏好性，对Cas9蛋白的基因序列进行了密码子优化设计，使Cas9基因更有利于在家蚕丝腺中高效表达。

2、与现今的利用转基因蚕遍在表达Cas9蛋白或者注射外源Cas9蛋白实现目的基因敲除相比，本技术可实现在家蚕的丝腺组织中特异激活表达Cas9蛋白从而实现目的基因的可控编辑。

3、本发明可利用GAL4/UAS表达系统表达的Cas9蛋白对家蚕全部丝腺基因进行可控的基因编辑。

4、利用该可控的基因编辑技术可精准研究家蚕丝腺基因的功能和创制更多的生物遗传资源。

附图说明

附图1为家蚕丝腺特异性的GAL4表达载体示意图；

附图2为UAS敲除表达载体示意图；

附图3为制作的GAL4/UAS转基因家蚕结果图；

附图4为MSG特异敲除的GAL4/UAS转基因家蚕的丝腺观察结果图；

附图5为MSG特异敲除的GAL4/UAS转基因家蚕的靶点敲除效率鉴定结果图；

附图6为PSG特异敲除的GAL4/UAS转基因家蚕的丝腺观察结果图；

附图7为PSG特异敲除的GAL4/UAS转基因家蚕的靶点敲除效率鉴定结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本技术方案的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术方案的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。另外，不应当将本发明的保护范围仅仅限制至下述具体结构或部件或具体参数。

本发明提出一种针对家蚕MSG和PSG表达基因的可控编辑方法，其公开了一种基于GAL4/UAS和CRISPR/Cas9的家蚕基因可控编辑方法及其应用，其通过GAL4/UAS系统，分别构建了若干个在家蚕MSG中特异启动表达的GAL4表达载体和多个在家蚕PSG中特异启动表达的GAL4表达载体，通过将表达Cas9基因序列与U6驱动表达的gRNA靶点一起串联在UAS序列下游，最终构建成UAS表达载体，进而利用GAL4/UAS遗传操作工具达到家蚕基因的可控编辑。

具体地，其通过GAL4/UAS系统，分别构建了4个在家蚕MSG中特异启动表达的GAL4表达载体和3个在家蚕PSG中特异启动表达的GAL4表达载体，并通过转基因注射证明该研究方法可行。

本发明中的GAL4/UAS双元表达系统以特异性的启动子驱动表达GAL4(转录激活因子)，其可以特异性识别并结合UAS序列(一种可被GAL4特异识别并结合的上游激活序列)，进而激活下游靶基因的转录，该双元表达系统可以实现目的基因的组织特异性表达。此外，本发明针对家蚕MSG和PSG表达基因的可控编辑方法，利用GAL4/UAS双元表达系统和CRISPR/Cas9的基因编辑系统，提供一种在家蚕丝腺中能进行组织特异性的靶点敲除载体。以及提供一种家蚕中部丝腺及后部丝腺中特异性敲除的应用，以此证明该方法可应用于家蚕丝腺全基因的可控编辑。

本发明的一种针对家蚕MSG和PSG表达基因的可控编辑方法，其包括以下步骤：

步骤S1，家蚕MSG特异GAL4表达载体的构建：

分别构建了4种家蚕中部丝腺特异表达载体。所述表达载体目的基因表达框包括:启动子即4种家蚕中部丝腺特异的启动子：家蚕Ser1基因启动子(SEQ ID NO.1)[NCBI基因ID：AB007831.1]、家蚕Ser2基因启动子(SEQ ID NO.2)[NCBI基因ID：AB193317.1]、家蚕Ser3基因启动子(SEQ ID NO.3)[NCBI基因ID：AB299446.1]、家蚕Ser4基因启动子(SEQ IDNO.4)[NCBI基因ID：XM_038013949.1]；目的基因为编码GAL4蛋白结合结构域的基因序列GAL4BD(SEQ ID NO.5)；VP16为激活基因表达的蛋白结构域序列(SEQ ID NO.6)；Ser1-polyA为终止信号(SEQ ID NO.7)，将目的基因表达框插入到piggyBac载体骨架上即pBac[3×P3-DsRed]，该载体骨架由以下步骤完成：首先组装3×P3-DsRed序列(SEQ ID NO.8)，该3×P3-DsRed序列是由3倍重复的P3启动子(眼睛和神经特异的启动子)驱动表达了红色荧光蛋白(DsRed)序列组成；随后在3×P3-DsRed序列5’端和3’端分别组装上piggyBac右臂(SEQID NO.9)和piggyBac左臂(SEQ ID NO.10)。

步骤S2，针对家蚕MSG的UAS敲除表达载体的构建：

构建了一种以UAS串联Cas9蛋白及BmYki靶点(SEQ ID NO.11)的转基因表达载体。所述载体目的基因表达框包括：主要与GAL4蛋白特异结合的10×UAS上游序列(SEQ IDNO.12)；根据家蚕密码子偏好进行优化的编码Cas9基因序列(SEQ ID NO.13)；驱动表达BmYki靶点序列的U6启动子(SEQ ID NO.14)；2个BmYki靶点序列(SEQ ID NO.11)；Ser1-polyA(SEQ ID NO.7)为终止信号，将目的表达框插入到piggyBac载体骨架上即pBac[3×P3-ECFP]，该载体骨架由以下步骤完成：首先组装3×P3-ECFP序列(SEQ ID NO.15)，该序列是由3倍重复的P3启动子(眼睛和神经特异的启动子)驱动表达了蓝色荧光蛋白(ECFP)组成；随后在3×P3-ECFP序列5’端和3’端分别组装上piggyBac右臂(SEQ ID NO.9)和piggyBac左臂(SEQ ID NO.10)。

步骤S3，家蚕PSG特异GAL4表达载体构建：

分别构建了3种家蚕后部丝腺特异表达载体。所述载体目的基因表达框包括:启动子即3种家蚕后部丝腺特异的启动子即家蚕fibH基因启动子(SEQ ID NO.16)[NCBI基因ID：NM_001113262.1]、家蚕fibL基因启动子(SEQ ID NO.17)[NCBI基因ID：M76430.1]、家蚕P25基因启动子(SEQ ID NO.18)[NCBI基因ID：X04226.1]；目的基因为GAL4BD(SEQ ID NO.5)；VP16为激活基因表达的蛋白结构域序列(SEQ ID NO.6)；Ser1-polyA为终止信号(SEQ IDNO.7)，将目的表达框插入到piggyBac载体骨架上即pBac[3×P3-DsRed]，该载体骨架由以下步骤完成：首先组装3×P3-DsRed序列(SEQ ID NO.8)，该3×P3-DsRed序列是由3倍重复的P3启动子(眼睛和神经特异的启动子)驱动表达了红色荧光蛋白(DsRed)序列组成；随后在3×P3-DsRed序列(SEQ ID NO.8)的5’端和3’端分别组装上piggyBac右臂(SEQ ID NO.9)和piggyBac左臂(SEQ ID NO.10)。。

步骤S4，针对家蚕PSG的UAS敲除表达载体构建：

构建了一种以UAS串联Cas 9蛋白及BmHR3靶点(SEQ ID NO.19)的转基因表达载体。所述载体目的基因表达框包括：10×UAS上游序列(SEQ ID NO.12)；根据家蚕密码子偏好进行优化的编码Cas 9蛋白序列(SEQ ID NO.13)；U6启动子(SEQ ID NO.14)；2个BmHR3靶点序列(SEQ ID NO.19)；Ser1-polyA为终止信号(SEQ ID NO.7)，将目的表达框插入到piggyBac载体骨架上即pBac[3×P3-ECFP]，该载体骨架由以下步骤完成：首先组装3×P3-ECFP序列(SEQ ID NO.15)，该序列是由3倍重复的P3启动子(眼睛和神经特异的启动子)驱动表达了青色荧光蛋白(ECFP)组成；随后在3×P3-ECFP序列5’端和3’端分别组装上piggyBac右臂(SEQ ID NO.9)和piggyBac左臂(SEQ ID NO.10)。。

步骤S5，转基因家蚕的制作：

通过将上诉表达载体分别通过家蚕胚胎显微注射，获得眼睛发红色荧光的GAL4转基因家蚕和眼睛发青色荧光的UAS转基因家蚕，将两种转基因家蚕进行两两杂交，获得眼睛即发红色荧光也发青色荧光的MSG特异性敲除的转基因家蚕和PSG特异性敲除的转基因家蚕。

步骤S6，形态学观察及分子检测：

分别观察中部丝腺和后部丝腺的形态，并对中部丝腺和后部丝腺进行分子检测发现靶点已进行特异性敲除。

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1，家蚕丝腺特异性的GAL4表达载体的构建

步骤S1家蚕中部丝腺特异Ser1基因启动子驱动表达GAL4表达载体的构建

依次将以下序列顺序链接：家蚕Ser1基因启动子(SEQ ID NO.1)[NCBI基因ID：AB007831.1]、GAL4BD基因序列(SEQ ID NO.5)、VP16序列(SEQ ID NO.6)及终止信号Ser1-poly A(SEQ ID NO.7)串联形成目的基因表达框，通过利用AscI将载体骨架pBac[3×P3-DsRed]和目的基因表达框切开，该载体骨架由以下步骤完成：首先组装3×P3-DsRed序列(SEQ ID NO.8)，该3×P3-DsRed序列(SEQ ID NO.8)是由3倍重复的P3启动子(眼睛和神经特异的启动子)驱动表达了红色荧光蛋白(DsRed)序列组成；随后在3×P3-DsRed序列5’端和3’端分别组装上piggyBac右臂(SEQ ID NO.9)和piggyBac左臂(SEQ ID NO.10)，通过T4链接酶进行链接成如图1的GAL4表达载体，并命名为S1G4。

步骤S2家蚕中部丝腺特异Ser2基因启动子驱动表达GAL4表达载体的构建

与步骤S1不同的是：家蚕中部丝腺特异的启动子用的是家蚕Ser2基因启动子(SEQID NO.2)[NCBI基因ID：AB193317.1]，且最终表达载体命名为S2G4。

步骤S3家蚕中部丝腺特异Ser3基因启动子驱动表达GAL4表达载体的构建

与步骤S1不同的是：家蚕中部丝腺特异的启动子用的是家蚕Ser3基因启动子序列(SEQ ID NO.3)[NCBI基因ID：AB299446.1]，且最终表达载体命名为S3G4。

步骤S4家蚕中部丝腺特异Ser4基因启动子驱动表达GAL4表达载体的构建

与步骤S1不同的是：家蚕中部丝腺特异的启动子用的是家蚕Ser4基因启动子序列(SEQ ID NO.4)[NCBI基因ID：XM_038013949.1]，且最终表达载体命名为S4G4。

步骤S5家蚕后部丝腺特异fibH基因启动子驱动表达GAL4表达载体的构建

与步骤S1不同的是：家蚕后部丝腺特异的启动子用的是家蚕fibH基因启动子序列(SEQ ID NO.16)[NCBI基因ID：NM_001113262.1]，且最终表达载体命名为HG4。

步骤S6家蚕后部丝腺特异fibL基因启动子驱动表达GAL4表达载体的构建

与步骤S1不同的是：家蚕后部丝腺特异的启动子用的是家蚕fibL基因启动子序列(SEQ ID NO.17)[NCBI基因ID：M76430.1]，且最终表达载体命名为LG4。

步骤S7家蚕后部丝腺特异P25基因启动子驱动表达GAL4表达载体的构建

与步骤S1不同的是：家蚕后部丝腺特异的启动子用的是家蚕P25基因启动子序列(SEQ ID NO.18)[NCBI基因ID：X04226.1]，且最终表达载体命名为PG4

步骤S8所构建的7个家蚕丝腺特异性的GAL4表达载体均含有启动子3×P3启动的红色荧光蛋白(DsRed)基因表达框即3×P3-DsRed(SEQ ID NO.8)，其在家蚕眼和神经特异表达的红色荧光蛋白将作为阳性转基因家蚕的筛选标记。

实施例2，UAS敲除表达载体的构建

步骤S1优化序列：首先对Cas9基因序列进行家蚕的密码子偏好优化，确保在家蚕体内正常表达，结果序列SEQ ID NO.12。

步骤S2 UAS敲除表达载体的构建：将优化后的Cas9序列(SEQ ID NO.13)串联在10×UAS序列(SEQ ID NO.12)之后，随后依次对3×P3-ECFP(SEQ ID NO.15)、U6启动子(SEQID NO.14)、靶基因序列即BmYki靶点序列(SEQ ID NO.11)，BmHR3靶点序列(SEQ IDNO.19)、终止信号Ser1-polyA(SEQ ID NO.7)进行串联，随后将通过利用FseI和BgIII将载体骨架pBac[3×P3-ECFP]和目的基因表达框切开，该载体骨架由以下步骤完成：首先组装3×P3-ECFP序列(SEQ ID NO.15)，该序列是由3倍重复的P3启动子(眼睛和神经特异的启动子)驱动表达了青色荧光蛋白(ECFP)组成；随后在3×P3-ECFP序列5’端和3’端分别组装上piggyBac右臂(SEQ ID NO.9)和piggyBac左臂(SEQ ID NO.10)。通过T4链接酶进行链接成如图2的表达载体。步骤S3所构建的UAS敲除表达载体均含有启动子3×P3启动的青色荧光蛋白(ECFP)基因表达框即3×P3-ECFP序列(SEQ ID NO.15)，其在家蚕眼和神经特异表达的青色荧光蛋白将作为阳性转基因家蚕的筛选标记。

实施例3，GAL4/UAS转基因家蚕的制作

步骤S1转基因注射及荧光筛选：获得附图1和附图2所示的转基因表达载体后，将其与辅助质粒(A4Helper)分别以浓度450ng/μL(纳克/微升)进行等比例混合，通过Eppendorf显微注射仪注射，以多化性家蚕Nistari(一年内可以饲养多批次蚕种材料)为注射受体，注射前需要将蚕蛾交配6小时，4℃(摄氏度)放置一天后拿出室温产卵，取刚产卵一小时的胚胎，将其用浆糊粘在玻璃片上，使用Eppendorf显微注射仪注射，通过无毒胶水将其封口，经35％的甲醛蒸汽消毒5分钟后，置于25℃，相对湿度85％的环境中孵化，将孵化出的G0代(注射后第一代)蚁蚕用桑叶饲养至化蛾，获得的G0代(注射后第一代)蚕蛾，通过自交或回交得到G1代(注射后第二代)蚕卵，用Olympus荧光显微镜筛选，分别得到青色荧光的UAS敲除转基因蚕及红色荧光的GAL4转基因阳性家蚕的蛾圈。并通过饲养一代后正常保种。

步骤S2 MSG和PSG中特异敲除转基因家蚕的制作：通过筛选到的眼睛和神经发红色荧光的GAL4转基因家蚕饲养至化蛾，然后与筛选到的眼睛和神经发青色荧光的UAS敲除转基因家蚕进行两两杂交，通过置于温度25℃，相对湿度85％的环境中孵化，孵化后代饲养至四龄，并通过筛选获得了在转基因家蚕眼睛中特异表达的既发青色荧光又发红色荧光的GAL4/UAS转基因家蚕，结果如附图3所示，证明GAL4/UAS转基因家蚕制作成功。然后正常饲养至取材阶段。

实施例4，MSG特异敲除的GAL4/UAS转基因家蚕的丝腺表型观察

步骤S1饲养野生型家蚕Nistari和MSG特异敲除转基因家蚕即家蚕眼睛中特异表达的既发青色荧光又发红色荧光的GAL4/UAS转基因家蚕至五龄，通过在1×PBS(磷酸盐缓冲液)中解剖并观察野生型家蚕Nistari和MSG特异敲除GAL4/UAS转基因家蚕的五龄第一天(5L1D)到五龄第六天(5L6D)中部丝腺，并拍照，结果如附图4所示。

实施例5，MSG特异敲除的GAL4/UAS转基因家蚕的靶点敲除效率鉴定

步骤S1饲养野生型家蚕Nistari和MSG特异敲除转基因家蚕即家蚕眼睛中特异表达的既发青色荧光又发红色荧光的GAL4/UAS转基因家蚕至5L6D，通过在1×PBS(磷酸盐缓冲液)中解剖家蚕丝腺，并将丝腺分为前部丝腺、中部丝腺、后部丝腺，通过1.5mL的离心管收集中部丝腺。

步骤S2将上诉收集的中部丝腺进行基因组的提取，提取步骤如下：

(1)将研钵及研磨棒进行清洗后，置于烘箱中180℃高温灭菌2-3小时。在研磨操作进行前需对丝腺、研钵及研磨棒进行液氮预冷处理。预冷后对丝腺进行研磨至粉末后转移至1.5mL的离心管中，保存于液氮或-80℃备用。

(2)将1mL的DNA抽提Buffer(缓冲液)加入离心管中，3000rpm(每分钟转速)涡旋混匀。按100μL/mL的工作浓度加入RNA酶，置于37℃恒温水浴锅中消化1小时后加入蛋白酶K，55℃水浴消化过夜。

(3)将等体积的Tris饱和酚添加至离心管中后充分旋转振荡10min，随后4℃、13400rpm离心10min，取600μL上清液至新的离心管中。

(4)将600μL Tris酚/氯仿，充分旋转振荡10min，随后，4℃、13400rpm离心10min后，将上清转移至新的离心管中。

(5)将于上清等体积的氯仿，充分旋转振荡10min，随后，4℃、13400rpm离心10min，收集上清液。

(6)将在4℃预冷的无水乙醇等体积加入离心管中，轻轻上下颠倒直至出现均匀的白色絮状沉淀后静置5min。

(7)用100微升规格的无菌取样器小心挑出沉淀后转移至新的1.5mL离心管中，加入4℃预冷的75％乙醇清洗1-2次，4℃、13400rpm离心10min，弃上清液。

(8)打开离心管盖子，室温静置至乙醇挥发殆尽，加入30-50μL EB缓冲液溶解DNA沉淀。

(9)利用分光光度计检测DNA纯度及浓度及琼脂点凝胶电泳检验后置于-80℃长期保存备用。

步骤S3基因组PCR：

(1)利用Primer5软件设计靶点引物，该引物由华大基因合成，引物合成后加超纯水溶解稀释后4℃保存。

(2)以上述提取的基因组为模板进行PCR扩增目的片段，反应体系如下：

基因组DNA 1μL；

dNTP(脱氧核糖核苷三磷酸) 0.8μL；

HiFi Taq酶 0.1μL；

正反向引物 各0.2μL；

缓冲液Ⅰ 1μL；

双蒸水 6.7μL；

总共体系 10μL；

(3)PCR扩增条件如下：

94℃预变性 5min；

94℃变性 30s；

50℃退火 30s；

72℃延伸 30s；

重复35个循环；

72℃10min；

(4)上述反应结束后，制备1％的琼脂糖凝胶，取5μL PCR扩增产物进行电泳检测。

步骤S4胶回收：

将凝胶置于紫外切胶仪上，整齐切下含有目的片段的胶条装入1.5mL的离心管中。按100μg/300μL的量加入Binding Buffer(结合缓冲液)，置于50℃恒温金属浴上至充分溶解，每1min上下颠倒混匀一次，可加速胶块溶解。较快充分溶解后，取出冷却至室温。

(1)回收前按胶回收试剂盒的说明书将无水乙醇加入Wash Buffer(清洗缓冲液)中。

(2)将充分溶解后的溶液转移至吸附柱中，静置2min后13000rpm离心1min。

(3)加入600μL Wash Buffer，13000rpm离心1min。重复一次此操作。

(4)13400rpm空离2min，进一步除去残留的Wash Buffer，将吸附柱置于无菌的1.5mL离心管中，静置至乙醇挥发殆尽后加入35-50μL的Elution Buffer(洗脱缓冲液)，室温静置2min。13400rpm离心1min，收集流出液。

(5)分光光度计检测回收片段浓度，1％琼脂糖凝胶电泳进一步确认回收片段正确。

步骤S5 T克隆

(1)对目的片段进行T载体连接，连接体系如下：

回收产物 4μL；

pMD19T载体 1μL；

连接缓冲液 Ⅰ5μL；

轻轻混匀后，置于连接仪上25℃连接15min。

步骤S6质粒转化

(1)-80℃取出T1大肠杆菌感受态置于冰上，待即将完全溶解时，快速吸取30μL感受态细胞至1.5mL离心管中后，加入10μL连接产物轻轻吹打混匀。

(2)将离心管置于冰上静置30min。

(3)将200μL无抗LB液体培养基加入离心管后，于37℃恒温摇床扩大培养30min。

(4)吸取100μL菌液于LB/Amp固体平板上，使用无菌涂布棒十字交叉均匀涂布后，放于37℃恒温培养箱直至平板表面干燥后，倒置培养12小时。

步骤S7菌液电泳筛选阳性克隆

(1)利用高压灭菌后的100微升取样器挑取平板中的单克隆菌落，转移至含有500μL的氨苄青霉素抗性的液体培养基中。220rpm、37℃恒温摇床培养6小时或菌液出现浑浊。

(2)首先将50μL细菌裂解液于50μL 5×Loading Buffer(上样缓冲液)进行混匀后10μL为单位分装至PCR管中，分别向每个PCR管中加入10μL菌液，利用移液枪吹打混匀后裂解10min。

裂解结束后制备1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，选择阳性菌液送公司测序鉴定。测序结果如图5所示。结果证明MSG中设计的2个靶点成功敲除。

实施例6，PSG特异敲除的GAL4/UAS转基因家蚕的丝腺表型观察

步骤S1饲养野生型家蚕Nistari和PSG特异敲除转基因家蚕即家蚕眼睛中特异表达的既发青色荧光又发红色荧光的GAL4/UAS转基因家蚕至五龄，通过在1×PBS的缓冲液中解剖并观察野生型家蚕Nistari和PSG特异敲除GAL4/UAS转基因家蚕的五龄第六天(5L6D)后部丝腺，并拍照，结果如附图6所示，后部丝腺变短，萎缩。

实施例7，PSG特异敲除的GAL4/UAS转基因家蚕的靶点敲除效率鉴定

步骤S1饲养野生型家蚕Nistari和PSG特异敲除转基因家蚕即家蚕眼睛中特异表达的既发青色荧光又发红色荧光的GAL4/UAS转基因家蚕至5L6D，通过在1×PBS的缓冲液中解剖家蚕丝腺，并将丝腺分为前部丝腺、中部丝腺、后部丝腺，通过1.5mL的离心管收集后部丝腺。

步骤S2将上诉收集的后部丝腺进行基因组的提取，提取步骤如下：

(1)将研钵及研磨棒进行清洗后，置于烘箱中180℃高温灭菌2-3小时。在研磨操作进行前需对丝腺、研钵及研磨棒进行液氮预冷处理。预冷后对丝腺进行研磨至粉末后转移至1.5mL(毫升)的离心管中，保存于液氮或-80℃备用。

(2)将1mL的DNA抽提Buffer(缓冲液)加入离心管中，3000rpm(每分钟转速)涡旋混匀。按100μL/mL的工作浓度加入RNA酶，置于37℃恒温水浴锅中消化1小时后加入蛋白酶K，55℃水浴消化过夜。

(3)将等体积的Tris饱和酚添加至离心管中后充分旋转振荡10min，随后4℃、13400rpm离心10min，取600μL上清液至新的离心管中。

(4)将600μL Tris酚/氯仿，充分旋转振荡10min，随后，4℃、13400rpm离心10min后，将上清转移至新的离心管中。

(5)将于上清等体积的氯仿，充分旋转振荡10min，随后，4℃、13400rpm离心10min，收集上清液。

(6)将在4℃预冷的无水乙醇等体积加入离心管中，轻轻上下颠倒直至出现均匀的白色絮状沉淀后静置5min。

(7)用无菌100微升取样器小心挑出沉淀后转移至新的1.5mL离心管中，加入4℃预冷的75％乙醇清洗1-2次，4℃、13400rpm离心10min，弃上清液。

(8)打开离心管盖子，室温静置至乙醇挥发殆尽，加入30-50μL EB缓冲液溶解DNA沉淀。

(9)利用分光光度计检测DNA纯度及浓度及琼脂点凝胶电泳检验后置于-80℃长期保存备用。

步骤S3基因组PCR：

(1)利用Primer5软件设计靶点引物，该引物由华大基因合成，引物合成后加超纯水溶解稀释后4℃保存。

(2)以上述提取的基因组为模板进行PCR扩增目的片段，反应体系如下：

基因组DNA 1μL；

dNTP(脱氧核糖核苷三磷酸) 0.8μL；

HiFi Taq酶 0.1μL；

正反向引物 各0.2μL；

缓冲液Ⅰ 1μL；

双蒸水 6.7μL；

总共体系 10μL；

(3)PCR扩增条件如下：

94℃预变性 5min；

94℃变性 30s；

50℃退火 30s；

72℃延伸 30s；

重复35个循环；

72℃10min；

(5)上述反应结束后，制备1％的琼脂糖凝胶，取5μL PCR扩增产物进行电泳检测。

步骤S4胶回收：

将凝胶置于紫外切胶仪上，整齐切下含有目的片段的胶条装入1.5mL的离心管中。按100μg/300μL的量加入Binding Buffer(结合缓冲液)，置于50℃恒温金属浴上至充分溶解，每1min上下颠倒混匀一次，可加速胶块溶解。较快充分溶解后，取出冷却至室温。

(1)回收前按胶回收试剂盒的说明书将无水乙醇加入Wash Buffer(WB)(清洗缓冲液)中。

(2)将充分溶解后的溶液转移至吸附柱中，静置2min后13000rpm离心1min。

(3)加入600μL Wash Buffer，13000rpm离心1min。重复一次此操作。

(4)13400rpm空离2min，进一步除去残留的Wash Buffer，将吸附柱置于无菌的1.5mL离心管中，静置至乙醇挥发殆尽后加入35-50μL的Elution Buffer(EB)，室温静置2min。13400rpm离心1min，收集流出液。

(5)分光光度计检测回收片段浓度，1％琼脂糖凝胶电泳进一步确认回收片段正确。

步骤S5 T克隆

(1)对目的片段进行T载体连接，连接体系如下：

回收产物 4μL；

pMD19T载体 1μL；

链接缓冲液 Ⅰ5μL；

轻轻混匀后，置于连接仪上25℃连接15min。

步骤S6质粒转化

(1)-80℃取出T1大肠杆菌感受态置于冰上，待即将完全溶解时，快速吸取30μL感受态细胞至1.5mL离心管中后，加入10μL连接产物轻轻吹打混匀。

(2)将离心管置于冰上静置30min。

(3)将200μL无抗LB液体培养基加入离心管后，于37℃恒温摇床扩大培养30min。

(4)吸取100μL菌液于LB/Amp固体平板上，使用无菌涂布棒十字交叉均匀涂布后，放于37℃恒温培养箱直至平板表面干燥后，倒置培养12小时。

步骤S7菌液电泳筛选阳性克隆

(1)利用高压灭菌后的100微升取样器挑取平板中的单克隆菌落，转移至含有500μL的氨苄青霉素抗性的液体培养基中。220rpm、37℃恒温摇床培养6小时或菌液出现浑浊。

(2)首先将50μL细菌裂解液于50μL 5×Loading Buffer(上样缓冲液)进行混匀后10μL为单位分装至PCR管中，分别向每个PCR管中加入10μL菌液，利用移液枪吹打混匀后裂解10min。

裂解结束后制备1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，选择阳性菌液送公司测序鉴定。测序结果如图7所示。结果证明PSG中设计的2个靶点成功敲除。

本发明中涉及的序列表如下：

SEQ ID NO.1家蚕Ser1基因启动子序列

gtcgacgaaaacagcacacacactacataccatgtatttgacgcacacacgcatgtatactatttattgtcaaacttttgttcttgacgtctgtgttcaaactgagaatagattaaatattgtttgtctttattaatattttttaatagtgtagtcttggcgaaatttgtgattataaaagtataaaatacaatcataatagtgtacgaacttacaattccaattaattatagtcgaatttcgactactgcgggacctctagtattaataattctctttaaaaaaaaacagagcatcaaatactgcacaaatgtcaagcgggtctcaacgagccatgaataaattagaaatcaattaataacataaaataggcaaacaaaataaaaccatttacatagagaacgtttgttgaacaaaaacaataacttgtatacattgtttgcacaaatgtttgaagcgaaaatttattactctctacgtaagcttgatcaaacttcgttttcgtataaaacgcgttggcccaaccactttggcatagtcgtcttatcatcgggtctctaaggatcaagcgatccaaagaccgccaac

SEQ ID NO.2家蚕Ser2基因启动子序列

gatcccctggaagtcgtcgtggcctaagagataagaagtccggtgcattcgtgttgagcgatgcacctgtgttcgaatcctaggcgggtaccaatttttctaatgaattacgtacccaacaaatgttcacgattgccttccacggtgaaggaataacatcgtgcaataaaagtgaaacccgcaaaatccggtgcttttaagcttttcaagcaccggtcaccatcctcgttgaactcatcgatctacaagcgatctaatctatagacccaatccactaagatctcaccggatcttctcagtggttcgcattccagtggtagattcaattcgctgctcttgctagggctagtgttagcaaattccttcgggttaagcccgagagctcacctatccgtccgcgctaagctggaaaagccccttaagctgttttttttttgtatagcctttattgctaatactaaacaataactaataattttacatacagtaacaaattgttttaacttaaatctaatacatcggatttcccggttcagtgatcagcgtgtcctgtgacacataggcctcttccactgctttcatttttctctattggtagcttttcttgaccagattgtctctccaatcatcttgatatcgtctgtccatcttctagcttgcctggctcttttcctttaaaccaggggtcgtgaatttcaatcctcacaggaagccgggattaggtgggagaatatagttccgatgttttgaatgctttatattttctgtggtcgaaaatgatactagagctacgcgtcgacaattgaatattatgctaactaccctctatttattaaaagacttttacgattcatttcgcacagaaccaatcgactgggtttagaggtttagcagtttgttgaatgaactcgttttcatcttcacgattagaggatcccaggtgttaggtaaaggatattctagattgcaggagatttttcataaataatcacgcgatggagcggtaatcagccaacatagtcgatcggcatcattattggagaccaaacaacacttcagttatccaagcgcgtcttaagtcgcattcggataatcttgaatagcctggaagtgaatttttaaaaagtttgtctcgaacaaacatcaattactttgtaattgaaccgaaaaaagaggataaacattattagcattcgttgtaatgaaatataatgttgacacagtttgaccgacgtgcactgtcttttgtggcaccggctatataaaggtggtctgtccgttctgagccacacgagtcatc

SEQ ID NO.3家蚕Ser3基因启动子序列

ctcaccggtctagctcatgagttctttttttttattgttttaatattaaattattattgtctgattataattacataagttgattaaaaatgctatgcaatagctttaccgcagcagtccccgagggccacatgtgttttttttaaactaaacagttttaaaagttttaaatacaaaaggtttttctttacaaatatttataactttggaacctatgggtctgcggagggactttagttctctctgcattctgtacggtatgtggagagtttctaccatcgtaccgcccgccaccagagtagagttcatccatactacctggagccactgcgttcatccacagtgcgtttccagagatcttttttgccacataccatccggctttggaatgagctcccctccacggtgcttcaaacgaggcttgtggagagtacttaacggtaggttggcttggctaggcttgactctgcccctggcattgctgaagttcatggacgacggtaaccacttaccatcaggtgggccgtatgctaatccgactacaagggcaacagcaaaaaaagttaattttacaaaagtatcataattccgaggctcgctaaagatgttcgtagcatatgttacagaaacaaaaaaaaaaacaatttaaatgcgttatagaaaaacaagtgtattaaacaaataattaattatttattttattggtaactgtttattcataaagggaatatttctccaacaaattagtataaatagccggcctttgggcgtttacagacagagcaatcgaagcttcgaag

SEQ ID NO.4家蚕Ser4基因启动子序列

cgaggctactaggattgttagagaaaaaaattgcctatactatatatacgtttctaaattacacattatacctgttgctcttagatctttctcctccctgcgtcatattcctcgacaccgagagtcctgtgtgcttagtgcgagtttcttaacattctcgatagcgtaaaagttaacccaattttgtatgcagttggaacagcgcccctagcggcaaacgcacgcgaacgatcccattccatacaaatatgaactaacttttacgctatcgaaaacgttaaaaaactcgcactaagcacactgacctcccatatcactttgactcgcacgatctttccctatctctttctgtctctgtcgatgagggtgccgctgttagatcaataaatatttagtttaagaacgaaattaaatcgcacaaatagctttttatttgtttcttctatacagttggctgtttttagacatgcagccgtggttttgagataaaacaatttcatagacggtgtttgtaaaatatctattggcatgttcatctcaatctatctagattgagtagatcttgagacagtcttcttctgagtcttcttgtagtcaatggtgaatcttattcccacattgagaaaacattgtgtgatgagcagaattgtttgctctttgtttgagtgttcattatctatattatatatacgacggaggggctgattccatggtatttttaaaatgatgacgtcgctgatgccattctcttcataattattattgttattgccttccatattgatagtaatttaaacttacttttctaagcaaacttacttaagcttacttttccttttattgaatttcaagtgtacaacaacaatgacaacagcgggctccgcaccgttcggctgctcgagtcggaatgtgttgtgcgacaaaagtaactcgtatttatataagatcaacgggggtggtttgttcattaattttcctgaataccgtcttaagcaattattgacttgcgttggacttataacagttaaccaacaattttaacattgaggaaactctaatcttagttaactaaataacaaggttgcgccggtatatagatttaaaagtccttaagtatgtatgtgtcaggctctggtgcccataacacagggaaccctaatttgtgaccggataacttagcgggatttgttcccagttgtttccatttatttatgtagtattggaagtaacttataaggactcatctggttccaagatttaagatatacgagcattcttagcgcggaaccacattccgaatttactggtggtaggacctcttgtgagtccgcacgggtaggtaccaccacactgtctatatccgtcgtgaagcagtaatgcgcttcggtttgaaggatgaggcagccgttgtaactatactgagaccttagaactagtatctcaaggtgggtggcagcatttacgttgtagatgtctatgggctacggtaaccacataacaccaggtgggctgtggagctcgtccacccatctatgcaataaaaatacaaatcctcaggttttgcaacaacaatagaagcggcgtttaaaagttaattgtcccttcgatttgctatttaagtgcgtgtattttcgctttaagaatcacatagatatgttatgttatttcatattacggttcgtattatggagcacttgcgcaaacaccgctgacatataacgttatacatatataaactggtatagttcggtcggggcttattcaattcaatttttgtgtacgaggttggtgctagaggaa

SEQ ID NO.5GAL4BD基因序列

atgaaactgctctcatcaatcgaacaggcctgtgacatttgtagactcaaaaaactcaaatgctccaaggagaaacccaaatgtgccaaatgcctgaaaaacaactgggagtgccggtactctcctaaaaccaaacggagccctctcacacgggcccatctcactgaagtggaatctcgactcgaacggctcgaacagctctttctgctcatctttcctagagaggatctcgacatgatcctgaaaatggatagcctccaggacatcaaagccctgctcactggactgtttgtccaggataacgtgaacaaggacgccgtgaccgataggctggcatccgtggaaaccgatatgccactcacactgagacagcaccggattagtgccacatcttcttccgaggagtcatccaataagggacagcgacagctcaccgtgtca

SEQ ID NO.6蛋白激活结构域VP16序列

tgcaccgcccctattaccgatgtgtctctgggcgacgaactccggctggatggcgaggaagtcgatatgacccctgccgacgctctcgacgatttcgacctggaaatgctgggagatgtcgaatctccttctcctggcatgacacacgatcccgtgtcttacggagcactggatgtgtaa

SEQ ID NO.7终止信号Ser1-poly A序列

tacaactaaacacgacttggagtattccttgtagtgtttaagattttaaatcttacttaatgacttcgaacgattttaacgataactttctctttgtttaactttaatcagcatacataaaaagccccggttttgtatcgggaagaaaaaaaatgtaattgtgttgcctagataataaacgtattatcaaagtgtgtggttttcctttaccaaagacccctttaagatgggcctaatgggcttaagtcgagtcctttccgatgtgttaaatacacatttattacactgatgcgtcgaatgtacacttttaataggatagctccactaaaaattattttatttatttaatttgttgcaccaaaactgatacattgacgaa

SEQ ID NO.8 3×P3-DsRed序列

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SEQ ID NO.9 piggyBac右臂序列

ccctagaaagataatcatattgtgacgtacgttaaagataatcatgcgtaaaattgacgcatgtgttttatcggtctgtatatcgaggtttatttattaatttgaatagatattaagttttattatatttacacttacatactaataataaattcaacaaacaatttatttatgtttatttatttattaaaaaaaaacaaaaactcaaaatttcttctataaagtaacaaaacttttaaacattctctcttttacaaaaataaacttattttgtactttaaaaacagtcatgttgtattataaaataagtaattagcttaacttatacataatagaaacaaattatacttattagtcagtcagaaacaactttggcacatatcaatattatgctctcgacaaataacttttttgcattttttgcacgatgcatttgcctttcgccttattttagaggggcagtaagtacagtaagtacgttttttcattactggctcttcagtactgtcatctgatgtaccaggcacttcatttggcaaaatattagagatattatcgcgcaaatatctcttcaaagtaggagcttctaaacgcttacgcataaacgatgacgtcaggctcatgtaaaggtttctcataaattttttgcgactttggaccttttctcccttgctactgacattatggctgtatataataaaagaatttatgcaggcaatgtttatcattccgtacaataatgccataggccacctattcgtcttcctactgcaggtcatcacagaacacatttggtctagcgtgtccactccgcctttagtttgattataatacataaccatttgcggtttaccggtactttcgttgatagaagcatcctcatcacaagatgataataagtataccatcttagctggcttcggtttatatgagacgagagtaaggggtccgtcaaaacaaaacatcgatgttcccactggcctggagcgactgtttttcagtacttccggtatctcgcgtttgtttgatcgcacggttcccacaatggttt

SEQ ID NO.10 piggyBac左臂序列

agatctgacaatgttcagtgcagagactcggctacgcctcgtggactttgaagttgaccaacaatgtttattcttacctctaatagtcctctgtggcaaggtcaagattctgttagaagccaatgaagaacctggttgttcaataacattttgttcgtctaatatttcactaccgcttgacgttggctgcacttcatgtacctcatctataaacgcttcttctgtatcgctctggacgtcatcttcacttacgtgatctgatatttcactgtcagaatcctcaccaacaagctcgtcatcgctttgcagaagagcagagaggatatgctcatcgtctaaagaactacccattttattatatattagtcacgatatctataacaagaaaatatatatataataagttatcacgtaagtagaacatgaaataacaatataattatcgtatgagttaaatcttaaaagtcacgtaaaagataatcatgcgtcattttgactcacgcggtcgttatagttcaaaatcagtgacacttaccgcattgacaagcacgcctcacgggagctccaagcggcgactgagatgtcctaaatgcacagcgacggattcgcgctatttagaaagagagagcaatatttcaagaatgcatgcgtcaattttacgcagactatctttctaggg

SEQ ID NO.11 BmYki敲除靶点序列

ggactcaaagcgaccgctacagg

gatcttggacccttaccagcagg

SEQ ID NO.12 10×UAS序列

cggagtactgtcctccgagcggagtactgtcctccgagcggagtactgtcctccgagcggagtactgtcctccgagcggagtactgtcctccgagcggaagcttgcatgcctgcaggtcggagtactgtcctccgagcggagtactgtcctccgagcggagtactgtcctccgagcggagtactgtcctccgagcggagtactgtcctccgagcggagactctagcgagcgccggagtataaatagaggcgcttcgtctacggagcgacaattcaattcaaacaagcaaagtgaacacgtcgctaagcgaaagctaagcaaataaacaagcgcagctgaacaagctaaacaatctgcagtaaagtgcaagttaaagtgaatcaattaaaagtaaccagcaaccaagtaaatcaactgcaactactgaaatctgccaagaagtaattattgaatacaagaagagaactctgaatagggaattgg

SEQ ID NO.13密码子优化后的Cas9基因序列

atggacaaaaagtatagcatcggtctggatattggaactaactccgtcggctgggctgtaatcaccgacgaatacaaggtcccgtcaaaaaagttcaaggtattgggtaacacagatcgtcactctatcaaaaagaatctcattggagctctgttgttcgacagcggcgaaacagctgaggccactagactgaagcgcaccgccagacgccgttacacgaggagaaagaacagaatctgctacttgcaagaaatattctcaaacgagatggccaaagtggacgattcgttctttcataggttagaagagagtttccttgttgaagaggataaaaagcacgaaagacatccgatatttggaaacatcgtggacgaagttgcttatcacgagaagtaccccacgatctatcatctgcgtaaaaagttggtggactcgacagataaggccgacctcaggttaatataccttgcactggcgcacatgatcaaattcagaggccattttctgattgaaggtgacctgaaccctgacaatagtgatgtggacaaactcttcattcaattagttcagacctacaatcaactgtttgaagagaaccctatcaacgcttcaggagttgacgctaaggccatccttagtgcgagactgagcaaatcccgccgtctcgaaaacttaatcgcacagttgcctggagagaaaaagaacggtttgttcggaaatctcattgcgttgtcactcggactcacgccaaacttcaagtctaacttcgatttggcagaagacgcgaaactgcaactgagcaaagacacatatgacgatgacctcgataacctcttagctcagatcggcgatcaatacgccgacttgttcctcgctgccaaaaatctgtcggacgctatacttctgagtgatatcttgcgcgtcaacacagaaattactaaggctcctctgtcggccagtatgataaaacgctatgacgaacaccatcaggatttgacattgctcaaagccctcgtgcgtcaacagctcccagaaaagtacaaggagattttctttgatcagtccaagaatggctacgcaggttatatagacggtggagcgtcgcaagaagagttctacaagttcatcaagccaatattagaaaagatggacggcacggaagagttacttgttaagctgaatcgtgaggacctgttgcgtaaacagaggacattcgataacggatcaattccgcaccaaatacatcttggcgaactgcacgctatcctcaggagacaagaggacttctacccctttttaaaggataaccgtgaaaagatcgagaaaatcctgactttcaggattccttactatgtcggcccactggctcgtggtaatagcaggtttgcctggatgaccaggaagtccgaagagacaattactccgtggaacttcgaagaggtggttgataaaggagcatcagcgcagtctttcatagaacgcatgacaaattttgacaagaacttaccgaatgagaaggtccttcccaaacactcactcctctacgaatacttcacagtatacaacgagctcactaaagtcaagtacgtaaccgagggtatgcgcaaacccgctttcctgtctggagagcagaaaaaggccatcgtggaccttctgttcaagacaaaccgtaaggtcactgtaaagcaactcaaggaagactacttcaaaaagatagagtgtttcgattcagtggaaatctctggcgttgaggacagatttaacgcttccttgggtacttaccacgatttgctcaagatcattaaagataaggacttcctcgacaacgaagagaacgaagatatcttagaggacatagttctcacccttacgctgtttgaagatagagagatgattgaagagcgcctgaagacttatgctcatttgttcgatgacaaagtcatgaagcaactgaaacgccgtaggtacaccggctggggtagattatcgcgcaaacttattaatggtataagggacaagcagtcgggaaaaacgatattggactttctcaagagtgatggtttcgccaacagaaattttatgcaactcatacacgatgacagcttaacattcaaggaagatatccaaaaagcacaggtgtcgggacagggcgacagtttgcacgaacatattgctaacctcgccggctccccggcgataaaaaagggtatccttcagactgtgaaagtcgtagatgaactggtgaaggttatgggtcgtcataaacccgagaacatagttatcgaaatggctagggagaatcaaacaactcagaagggacagaaaaactcaagagaacgcatgaagcgcattgaagagggtatcaaagagcttggcagtcaaatcctgaaggaacaccctgtcgagaacacgcaacttcagaacgaaaaattgtacctctactatctgcagaatggtagagatatgtacgtagaccaagaattggatattaaccgcctctcagattacgacgtggatcatatagttccgcagtcattcttgaaggatgactctatcgacaacaaagtcctcacaagatcagacaagaaccgcggaaaatcagataatgtaccctctgaagaggtggttaaaaagatgaaaaactactggagacagttacttaacgctaagttgatcacgcaaagaaagttcgataacctcacaaaggctgaacgcggcggtttaagcgagcttgacaaggccggtttcataaaacgtcagttagtcgaaaccaggcaaattacgaaacacgtagcccaaatattggattcccgcatgaacactaaatacgatgaaaatgacaagctcatccgtgaggtcaaagtaattaccctgaaaagcaagttggtgtccgacttcagaaaggatttccagttctacaaagttcgcgaaatcaacaactaccaccatgcacatgacgcttacctgaacgcagtcgtaggcactgcgttaattaaaaagtaccctaaactggaatctgagttcgtgtacggtgactataaagtgtacgatgttagaaagatgatcgctaaaagcgaacaggagattggaaaggctaccgccaagtatttcttttactccaacatcatgaatttctttaagaccgaaatcacgttagcaaatggcgagatacgtaaaaggccacttatcgaaacaaacggagaaactggcgagatagtgtgggacaagggtagagattttgccactgtccgcaaagtactgtcgatgccgcaagtgaatatcgttaaaaagaccgaagttcaaacgggaggcttcagcaaagagtccatcctgcccaagcgtaacagtgataaattgatagctaggaaaaaggactgggaccctaaaaagtatggtggattcgacagcccaactgtcgcatactccgtattggtggttgcgaaagtcgaaaaaggaaagagcaaaaagctcaagtccgtaaaagagctgttgggcattaccataatggaaagatcatctttcgagaagaatcctatcgattttctggaagccaagggatataaagaggtcaaaaaggacctcataatcaagttaccaaaatacagtctgttcgaattggagaacggcagaaaacgcatgcttgcatcagcgggtgaactgcaaaagggaaatgagttagcacttccttctaaatacgtcaacttcctgtatttggcgtcacactacgaaaaactgaagggctctccagaagataacgagcaaaagcagttatttgtggaacagcacaaacattaccttgacgaaattatagagcaaatctcggagttcagtaagagagtgattttggctgacgccaatcttgataaagttctgtctgcttacaacaagcaccgtgataaaccgattagggaacaggccgagaacatcatacatctcttcacactcactaaccttggtgcacccgcagcgttcaaatattttgacaccacgatagatcgtaagaggtacaccagcacgaaagaagttttggacgcgacactcatccatcaatcaatcacgggcctgtacgagaccagaatcgacctgtcccagctcggtggcgacaaaaggccggcggccacgaaaaaggctggccaggcaaaaaagaaaaagtaa

SEQ ID NO.14 U6启动子序列

aggttatgtagtacacattgttgtaaatcactgaattgttttagatgattttaacaattagtacttattaatattaaataagtacataccttgagaatttaaaaatcgtcaactataagccatacgaatttaagcttggtacttggcttatagataaggacagaataagaattgttaacgtgtaagacaaggtcagatagtcatagtgattttgtcaaagtaataacagatggcgctgtacaaaccataactgttttcatttgtttttatggattttattacaaattctaaaggttttattgttattatttaatttcgttttaattatattatatatctttaatagaatatgttaagagtttttgctctttttgaataatctttgtaaagtcgagtgttgttgtaaatcacgctttcaatagtttagtttttttaggtatatatacaaaatatcgtgctctacaagt

SEQ ID NO.15 3×P3-ECFP序列

gcaaagtgaacacgtcgctaagcgaaagctaagcaaataaacaagcgcagctgaacaagctaaacaatcggggtaccgctagagtcgacggtacgatccaccggtcgccaccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctggggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacatcagccacaacgtctatatcaccgccgacaagcagaagaacggcatcaaggccaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaaactctagatcataatcagccataccacatttgtag

SEQ ID NO.16家蚕fibH基因启动子序列

cctgcgtgatcaggaaaaatgtggaaagcttaacgattttgtcacattttacttatcacaacttgtttttataataattcgcttaaatgagcagctattacttaatctcgtagtggtttttgacaaaatcagcttctttagaactaaaatatcatttttttcgtaatttttttaatgaaaaatgctctagtgttatacctttccaaaatcaccattaattaggtagtgtttaagcttgttgtacaaaactgccacacgcatttttttctccactgtaggttgtagttacgcgaaaacaaaatcgttctgtgaaaattcaaacaaaaatattttttcgtaaaaacacttatcaatgagtaaagtaacaattcatgaataatttcatgtaaaaaaaaaatactagaaaaggaatttttcattacgagatgcttaaaaatctgtttcaaggtagagatttttcgatatttcggaaaattttgtaaaactgtaaatccgtaaaattttgctaaacatatattgtgttgttttggtaagtattgacccaagctatcacctcctgcagtatgtcgtgctaattactggacacattgtataacagttccactgtattgacaataataaaacctcttcattgacttgagaatgtctggacagatttggctttgtatttttgatttacaaatgtttttttggtgatttacccatccaaggcattctccaggatggttgtggcatcacgccgattggcaaacaaaaactaaaatgaaactaaaaagaaacagtttccgctgtcccgttcctctagtgggagaaagcatgaagtaagttctttaaatattacaaaaaaattgaacgatattataaaattctttaaaatattaaaagtaagaacaataagatcaattaaatcataattaatcacattgttcatgatcacaatttaatttacttcatacgttgtattgttatgttaaataaaaagattaatttctatgtaattgtatctgtacaatacaatgtgtagatgtttattctatcgaaagtaaatacgtcaaaactcgaaaattttcagtataaaaaggttcaactttttcaaatcagcatcagttcggttccaactctcaag

SEQ ID NO.17家蚕fibL基因启动子序列

tgcatattggacatcccttttcttgacatcgtataaattcggtaattctcggtacggttcgtaaagttcacctgcggctatattccgactcgccaagttacgtcagtcgtattgtaatgagcgatttagtgggcaacttcattctgttaattttgtgtcacggtgcgcgcgcatcgtaaaacttcactctcatagatttttcataacgcgcctaaagaagtataacttcaataatttaaatttaaaaaaaaacatgcatagaataattatatgaattatttaaaatgtcatttaccgacattgacataacagacgacgttaacactacaaaacattttaattccacattgttacatattcaacagttaaatttgcgttaattctcgatgcgaacaaatataagaacaatcggatcaattagatcgctttgtttcgaacaacacttagtttaactagaggcgtacacctcaagaaatcatcttcattagaaactaaaccttaaaatcgcaataataaagcatagtcaattttaactgaaatgcaaagtcttttgaacgttagatgctgtcagcgttcgttggtacagttgtttgatatttattttaattgtctttttatatataaatagtggaacattaatcacggaatcctgtatagtatataccgattggtcacataacagaccactaa

SEQ ID NO.18家蚕P25基因启动子序列

tctcacacgtttattcccaaaacatttttgtcgggcaaattacagttttttcacaaatcagtaatcagaaggtatttacaaggcatatactatgcctataatagaagattttgctcaacagaaatcccgaaagaaaccgttatcgaaatcgtaaccaaaaaaccagcagcattctaatatcattaatgacatattatatcatactgtatttgattacctataataaatggtcatactcagtaaaaaaatgttaatataattcgctttttttactttccaaaagggcctcaaattcttgtgtgtccaagggccccatcctagtttaagacgtccctggctgtagcccagttaccgccaaacaaacgtgcattactccccgcctacaccgaggagaacattttgcgccttagaaaataaaatggcgtcgccgcggcgcaacaatgagaacttaattcgtgcaattgtttccacgacaatatttatttaacgttattcgttatgaggaacaatactttgtataattaatgttgatcggtgcctaacgacgcagttgtttattattcgcgcaac

SEQ ID NO.19 BmHR3敲除靶点序列

atgcggagataaatcgtcggggg

ccgatgccagtactgcagactac

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 西南大学

<120> 一种针对家蚕MSG和PSG表达基因的可控编辑方法

<141> 2022-03-04

<160> 19

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 588

<212> DNA

<213> 家蚕(Bombyx mori)

<400> 1

gtcgacgaaa acagcacaca cactacatac catgtatttg acgcacacac gcatgtatac 60

tatttattgt caaacttttg ttcttgacgt ctgtgttcaa actgagaata gattaaatat 120

tgtttgtctt tattaatatt ttttaatagt gtagtcttgg cgaaatttgt gattataaaa 180

gtataaaata caatcataat agtgtacgaa cttacaattc caattaatta tagtcgaatt 240

tcgactactg cgggacctct agtattaata attctcttta aaaaaaaaca gagcatcaaa 300

tactgcacaa atgtcaagcg ggtctcaacg agccatgaat aaattagaaa tcaattaata 360

acataaaata ggcaaacaaa ataaaaccat ttacatagag aacgtttgtt gaacaaaaac 420

aataacttgt atacattgtt tgcacaaatg tttgaagcga aaatttatta ctctctacgt 480

aagcttgatc aaacttcgtt ttcgtataaa acgcgttggc ccaaccactt tggcatagtc 540

gtcttatcat cgggtctcta aggatcaagc gatccaaaga ccgccaac 588

<210> 2

<211> 1300

<212> DNA

<213> 家蚕(Bombyx mori)

<400> 2

gatcccctgg aagtcgtcgt ggcctaagag ataagaagtc cggtgcattc gtgttgagcg 60

atgcacctgt gttcgaatcc taggcgggta ccaatttttc taatgaatta cgtacccaac 120

aaatgttcac gattgccttc cacggtgaag gaataacatc gtgcaataaa agtgaaaccc 180

gcaaaatccg gtgcttttaa gcttttcaag caccggtcac catcctcgtt gaactcatcg 240

atctacaagc gatctaatct atagacccaa tccactaaga tctcaccgga tcttctcagt 300

ggttcgcatt ccagtggtag attcaattcg ctgctcttgc tagggctagt gttagcaaat 360

tccttcgggt taagcccgag agctcaccta tccgtccgcg ctaagctgga aaagcccctt 420

aagctgtttt ttttttgtat agcctttatt gctaatacta aacaataact aataatttta 480

catacagtaa caaattgttt taacttaaat ctaatacatc ggatttcccg gttcagtgat 540

cagcgtgtcc tgtgacacat aggcctcttc cactgctttc atttttctct attggtagct 600

tttcttgacc agattgtctc tccaatcatc ttgatatcgt ctgtccatct tctagcttgc 660

ctggctcttt tcctttaaac caggggtcgt gaatttcaat cctcacagga agccgggatt 720

aggtgggaga atatagttcc gatgttttga atgctttata ttttctgtgg tcgaaaatga 780

tactagagct acgcgtcgac aattgaatat tatgctaact accctctatt tattaaaaga 840

cttttacgat tcatttcgca cagaaccaat cgactgggtt tagaggttta gcagtttgtt 900

gaatgaactc gttttcatct tcacgattag aggatcccag gtgttaggta aaggatattc 960

tagattgcag gagatttttc ataaataatc acgcgatgga gcggtaatca gccaacatag 1020

tcgatcggca tcattattgg agaccaaaca acacttcagt tatccaagcg cgtcttaagt 1080

cgcattcgga taatcttgaa tagcctggaa gtgaattttt aaaaagtttg tctcgaacaa 1140

acatcaatta ctttgtaatt gaaccgaaaa aagaggataa acattattag cattcgttgt 1200

aatgaaatat aatgttgaca cagtttgacc gacgtgcact gtcttttgtg gcaccggcta 1260

tataaaggtg gtctgtccgt tctgagccac acgagtcatc 1300

<210> 3

<211> 800

<212> DNA

<213> 家蚕(Bombyx mori)

<400> 3

ctcaccggtc tagctcatga gttctttttt tttattgttt taatattaaa ttattattgt 60

ctgattataa ttacataagt tgattaaaaa tgctatgcaa tagctttacc gcagcagtcc 120

ccgagggcca catgtgtttt ttttaaacta aacagtttta aaagttttaa atacaaaagg 180

tttttcttta caaatattta taactttgga acctatgggt ctgcggaggg actttagttc 240

tctctgcatt ctgtacggta tgtggagagt ttctaccatc gtaccgcccg ccaccagagt 300

agagttcatc catactacct ggagccactg cgttcatcca cagtgcgttt ccagagatct 360

tttttgccac ataccatccg gctttggaat gagctcccct ccacggtgct tcaaacgagg 420

cttgtggaga gtacttaacg gtaggttggc ttggctaggc ttgactctgc ccctggcatt 480

gctgaagttc atggacgacg gtaaccactt accatcaggt gggccgtatg ctaatccgac 540

tacaagggca acagcaaaaa aagttaattt tacaaaagta tcataattcc gaggctcgct 600

aaagatgttc gtagcatatg ttacagaaac aaaaaaaaaa acaatttaaa tgcgttatag 660

aaaaacaagt gtattaaaca aataattaat tatttatttt attggtaact gtttattcat 720

aaagggaata tttctccaac aaattagtat aaatagccgg cctttgggcg tttacagaca 780

gagcaatcga agcttcgaag 800

<210> 4

<211> 1800

<212> DNA

<213> 家蚕(Bombyx mori)

<400> 4

cgaggctact aggattgtta gagaaaaaaa ttgcctatac tatatatacg tttctaaatt 60

acacattata cctgttgctc ttagatcttt ctcctccctg cgtcatattc ctcgacaccg 120

agagtcctgt gtgcttagtg cgagtttctt aacattctcg atagcgtaaa agttaaccca 180

attttgtatg cagttggaac agcgccccta gcggcaaacg cacgcgaacg atcccattcc 240

atacaaatat gaactaactt ttacgctatc gaaaacgtta aaaaactcgc actaagcaca 300

ctgacctccc atatcacttt gactcgcacg atctttccct atctctttct gtctctgtcg 360

atgagggtgc cgctgttaga tcaataaata tttagtttaa gaacgaaatt aaatcgcaca 420

aatagctttt tatttgtttc ttctatacag ttggctgttt ttagacatgc agccgtggtt 480

ttgagataaa acaatttcat agacggtgtt tgtaaaatat ctattggcat gttcatctca 540

atctatctag attgagtaga tcttgagaca gtcttcttct gagtcttctt gtagtcaatg 600

gtgaatctta ttcccacatt gagaaaacat tgtgtgatga gcagaattgt ttgctctttg 660

tttgagtgtt cattatctat attatatata cgacggaggg gctgattcca tggtattttt 720

aaaatgatga cgtcgctgat gccattctct tcataattat tattgttatt gccttccata 780

ttgatagtaa tttaaactta cttttctaag caaacttact taagcttact tttcctttta 840

ttgaatttca agtgtacaac aacaatgaca acagcgggct ccgcaccgtt cggctgctcg 900

agtcggaatg tgttgtgcga caaaagtaac tcgtatttat ataagatcaa cgggggtggt 960

ttgttcatta attttcctga ataccgtctt aagcaattat tgacttgcgt tggacttata 1020

acagttaacc aacaatttta acattgagga aactctaatc ttagttaact aaataacaag 1080

gttgcgccgg tatatagatt taaaagtcct taagtatgta tgtgtcaggc tctggtgccc 1140

ataacacagg gaaccctaat ttgtgaccgg ataacttagc gggatttgtt cccagttgtt 1200

tccatttatt tatgtagtat tggaagtaac ttataaggac tcatctggtt ccaagattta 1260

agatatacga gcattcttag cgcggaacca cattccgaat ttactggtgg taggacctct 1320

tgtgagtccg cacgggtagg taccaccaca ctgtctatat ccgtcgtgaa gcagtaatgc 1380

gcttcggttt gaaggatgag gcagccgttg taactatact gagaccttag aactagtatc 1440

tcaaggtggg tggcagcatt tacgttgtag atgtctatgg gctacggtaa ccacataaca 1500

ccaggtgggc tgtggagctc gtccacccat ctatgcaata aaaatacaaa tcctcaggtt 1560

ttgcaacaac aatagaagcg gcgtttaaaa gttaattgtc ccttcgattt gctatttaag 1620

tgcgtgtatt ttcgctttaa gaatcacata gatatgttat gttatttcat attacggttc 1680

gtattatgga gcacttgcgc aaacaccgct gacatataac gttatacata tataaactgg 1740

tatagttcgg tcggggctta ttcaattcaa tttttgtgta cgaggttggt gctagaggaa 1800

<210> 5

<211> 441

<212> DNA

<213> 酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400> 5

atgaaactgc tctcatcaat cgaacaggcc tgtgacattt gtagactcaa aaaactcaaa 60

tgctccaagg agaaacccaa atgtgccaaa tgcctgaaaa acaactggga gtgccggtac 120

tctcctaaaa ccaaacggag ccctctcaca cgggcccatc tcactgaagt ggaatctcga 180

ctcgaacggc tcgaacagct ctttctgctc atctttccta gagaggatct cgacatgatc 240

ctgaaaatgg atagcctcca ggacatcaaa gccctgctca ctggactgtt tgtccaggat 300

aacgtgaaca aggacgccgt gaccgatagg ctggcatccg tggaaaccga tatgccactc 360

acactgagac agcaccggat tagtgccaca tcttcttccg aggagtcatc caataaggga 420

cagcgacagc tcaccgtgtc a 441

<210> 6

<211> 180

<212> DNA

<213> 人类疱疹病毒2株(human herpesvirus 2)

<400> 6

tgcaccgccc ctattaccga tgtgtctctg ggcgacgaac tccggctgga tggcgaggaa 60

gtcgatatga cccctgccga cgctctcgac gatttcgacc tggaaatgct gggagatgtc 120

gaatctcctt ctcctggcat gacacacgat cccgtgtctt acggagcact ggatgtgtaa 180

<210> 7

<211> 379

<212> DNA

<213> 家蚕(Bombyx mori)

<400> 7

tacaactaaa cacgacttgg agtattcctt gtagtgttta agattttaaa tcttacttaa 60

tgacttcgaa cgattttaac gataactttc tctttgttta actttaatca gcatacataa 120

aaagccccgg ttttgtatcg ggaagaaaaa aaatgtaatt gtgttgccta gataataaac 180

gtattatcaa agtgtgtggt tttcctttac caaagacccc tttaagatgg gcctaatggg 240

cttaagtcga gtcctttccg atgtgttaaa tacacattta ttacactgat gcgtcgaatg 300

tacactttta ataggatagc tccactaaaa attattttat ttatttaatt tgttgcacca 360

aaactgatac attgacgaa 379

<210> 8

<211> 831

<212> DNA

<213> 香菇珊瑚(Discosoma sp)

<400> 8

gcaaagtgaa cacgtcgcta agcgaaagct aagcaaataa acaagcgcag ctgaacaagc 60

taaacaatcg gggtaccgct agagtcgacg gtaccgcggg cccgggatcc accggtcgcc 120

accatggtgc gctcctccaa gaacgtcatc aaggagttca tgcgcttcaa ggtgcgcatg 180

gagggcaccg tgaacggcca cgagttcgag atcgagggcg agggcgaggg ccgcccctac 240

gagggccaca acaccgtgaa gctgaaggtg accaagggcg gccccctgcc cttcgcctgg 300

gacatcctgt ccccccagtt ccagtacggc tccaaggtgt acgtgaagca ccccgccgac 360

atccccgact acaagaagct gtccttcccc gagggcttca agtgggagcg cgtgatgaac 420

ttcgaggacg gcggcgtggt gaccgtgacc caggactcct ccctgcagga cggctgcttc 480

atctacaagg tgaagttcat cggcgtgaac ttcccctccg acggccccgt aatgcagaag 540

aagaccatgg gctgggaggc ctccaccgag cgcctgtacc cccgcgacgg cgtgctgaag 600

ggcgagatcc acaaggccct gaagctgaag gacggcggcc actacctggt ggagttcaag 660

tccatctaca tggccaagaa gcccgtgcag ctgcccggct actactacgt ggactccaag 720

ctggacatca cctcccacaa cgaggactac accatcgtgg agcagtacga gcgcaccgag 780

ggccgccacc acctgttcct gtagtcataa tcagccatac cacatttgta g 831

<210> 9

<211> 1051

<212> DNA

<213> 粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)

<400> 9

ccctagaaag ataatcatat tgtgacgtac gttaaagata atcatgcgta aaattgacgc 60

atgtgtttta tcggtctgta tatcgaggtt tatttattaa tttgaataga tattaagttt 120

tattatattt acacttacat actaataata aattcaacaa acaatttatt tatgtttatt 180

tatttattaa aaaaaaacaa aaactcaaaa tttcttctat aaagtaacaa aacttttaaa 240

cattctctct tttacaaaaa taaacttatt ttgtacttta aaaacagtca tgttgtatta 300

taaaataagt aattagctta acttatacat aatagaaaca aattatactt attagtcagt 360

cagaaacaac tttggcacat atcaatatta tgctctcgac aaataacttt tttgcatttt 420

ttgcacgatg catttgcctt tcgccttatt ttagaggggc agtaagtaca gtaagtacgt 480

tttttcatta ctggctcttc agtactgtca tctgatgtac caggcacttc atttggcaaa 540

atattagaga tattatcgcg caaatatctc ttcaaagtag gagcttctaa acgcttacgc 600

ataaacgatg acgtcaggct catgtaaagg tttctcataa attttttgcg actttggacc 660

ttttctccct tgctactgac attatggctg tatataataa aagaatttat gcaggcaatg 720

tttatcattc cgtacaataa tgccataggc cacctattcg tcttcctact gcaggtcatc 780

acagaacaca tttggtctag cgtgtccact ccgcctttag tttgattata atacataacc 840

atttgcggtt taccggtact ttcgttgata gaagcatcct catcacaaga tgataataag 900

tataccatct tagctggctt cggtttatat gagacgagag taaggggtcc gtcaaaacaa 960

aacatcgatg ttcccactgg cctggagcga ctgtttttca gtacttccgg tatctcgcgt 1020

ttgtttgatc gcacggttcc cacaatggtt t 1051

<210> 10

<211> 679

<212> DNA

<213> 粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)

<400> 10

agatctgaca atgttcagtg cagagactcg gctacgcctc gtggactttg aagttgacca 60

acaatgttta ttcttacctc taatagtcct ctgtggcaag gtcaagattc tgttagaagc 120

caatgaagaa cctggttgtt caataacatt ttgttcgtct aatatttcac taccgcttga 180

cgttggctgc acttcatgta cctcatctat aaacgcttct tctgtatcgc tctggacgtc 240

atcttcactt acgtgatctg atatttcact gtcagaatcc tcaccaacaa gctcgtcatc 300

gctttgcaga agagcagaga ggatatgctc atcgtctaaa gaactaccca ttttattata 360

tattagtcac gatatctata acaagaaaat atatatataa taagttatca cgtaagtaga 420

acatgaaata acaatataat tatcgtatga gttaaatctt aaaagtcacg taaaagataa 480

tcatgcgtca ttttgactca cgcggtcgtt atagttcaaa atcagtgaca cttaccgcat 540

tgacaagcac gcctcacggg agctccaagc ggcgactgag atgtcctaaa tgcacagcga 600

cggattcgcg ctatttagaa agagagagca atatttcaag aatgcatgcg tcaattttac 660

gcagactatc tttctaggg 679

<210> 11

<211> 46

<212> DNA

<213> 家蚕(Bombyx mori)

<400> 11

ggactcaaag cgaccgctac agggatcttg gacccttacc agcagg 46

<210> 12

<211> 483

<212> DNA

<213> 酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400> 12

cggagtactg tcctccgagc ggagtactgt cctccgagcg gagtactgtc ctccgagcgg 60

agtactgtcc tccgagcgga gtactgtcct ccgagcggaa gcttgcatgc ctgcaggtcg 120

gagtactgtc ctccgagcgg agtactgtcc tccgagcgga gtactgtcct ccgagcggag 180

tactgtcctc cgagcggagt actgtcctcc gagcggagac tctagcgagc gccggagtat 240

aaatagaggc gcttcgtcta cggagcgaca attcaattca aacaagcaaa gtgaacacgt 300

cgctaagcga aagctaagca aataaacaag cgcagctgaa caagctaaac aatctgcagt 360

aaagtgcaag ttaaagtgaa tcaattaaaa gtaaccagca accaagtaaa tcaactgcaa 420

ctactgaaat ctgccaagaa gtaattattg aatacaagaa gagaactctg aatagggaat 480

tgg 483

<210> 13

<211> 4155

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 13

atggacaaaa agtatagcat cggtctggat attggaacta actccgtcgg ctgggctgta 60

atcaccgacg aatacaaggt cccgtcaaaa aagttcaagg tattgggtaa cacagatcgt 120

cactctatca aaaagaatct cattggagct ctgttgttcg acagcggcga aacagctgag 180

gccactagac tgaagcgcac cgccagacgc cgttacacga ggagaaagaa cagaatctgc 240

tacttgcaag aaatattctc aaacgagatg gccaaagtgg acgattcgtt ctttcatagg 300

ttagaagaga gtttccttgt tgaagaggat aaaaagcacg aaagacatcc gatatttgga 360

aacatcgtgg acgaagttgc ttatcacgag aagtacccca cgatctatca tctgcgtaaa 420

aagttggtgg actcgacaga taaggccgac ctcaggttaa tataccttgc actggcgcac 480

atgatcaaat tcagaggcca ttttctgatt gaaggtgacc tgaaccctga caatagtgat 540

gtggacaaac tcttcattca attagttcag acctacaatc aactgtttga agagaaccct 600

atcaacgctt caggagttga cgctaaggcc atccttagtg cgagactgag caaatcccgc 660

cgtctcgaaa acttaatcgc acagttgcct ggagagaaaa agaacggttt gttcggaaat 720

ctcattgcgt tgtcactcgg actcacgcca aacttcaagt ctaacttcga tttggcagaa 780

gacgcgaaac tgcaactgag caaagacaca tatgacgatg acctcgataa cctcttagct 840

cagatcggcg atcaatacgc cgacttgttc ctcgctgcca aaaatctgtc ggacgctata 900

cttctgagtg atatcttgcg cgtcaacaca gaaattacta aggctcctct gtcggccagt 960

atgataaaac gctatgacga acaccatcag gatttgacat tgctcaaagc cctcgtgcgt 1020

caacagctcc cagaaaagta caaggagatt ttctttgatc agtccaagaa tggctacgca 1080

ggttatatag acggtggagc gtcgcaagaa gagttctaca agttcatcaa gccaatatta 1140

gaaaagatgg acggcacgga agagttactt gttaagctga atcgtgagga cctgttgcgt 1200

aaacagagga cattcgataa cggatcaatt ccgcaccaaa tacatcttgg cgaactgcac 1260

gctatcctca ggagacaaga ggacttctac ccctttttaa aggataaccg tgaaaagatc 1320

gagaaaatcc tgactttcag gattccttac tatgtcggcc cactggctcg tggtaatagc 1380

aggtttgcct ggatgaccag gaagtccgaa gagacaatta ctccgtggaa cttcgaagag 1440

gtggttgata aaggagcatc agcgcagtct ttcatagaac gcatgacaaa ttttgacaag 1500

aacttaccga atgagaaggt ccttcccaaa cactcactcc tctacgaata cttcacagta 1560

tacaacgagc tcactaaagt caagtacgta accgagggta tgcgcaaacc cgctttcctg 1620

tctggagagc agaaaaaggc catcgtggac cttctgttca agacaaaccg taaggtcact 1680

gtaaagcaac tcaaggaaga ctacttcaaa aagatagagt gtttcgattc agtggaaatc 1740

tctggcgttg aggacagatt taacgcttcc ttgggtactt accacgattt gctcaagatc 1800

attaaagata aggacttcct cgacaacgaa gagaacgaag atatcttaga ggacatagtt 1860

ctcaccctta cgctgtttga agatagagag atgattgaag agcgcctgaa gacttatgct 1920

catttgttcg atgacaaagt catgaagcaa ctgaaacgcc gtaggtacac cggctggggt 1980

agattatcgc gcaaacttat taatggtata agggacaagc agtcgggaaa aacgatattg 2040

gactttctca agagtgatgg tttcgccaac agaaatttta tgcaactcat acacgatgac 2100

agcttaacat tcaaggaaga tatccaaaaa gcacaggtgt cgggacaggg cgacagtttg 2160

cacgaacata ttgctaacct cgccggctcc ccggcgataa aaaagggtat ccttcagact 2220

gtgaaagtcg tagatgaact ggtgaaggtt atgggtcgtc ataaacccga gaacatagtt 2280

atcgaaatgg ctagggagaa tcaaacaact cagaagggac agaaaaactc aagagaacgc 2340

atgaagcgca ttgaagaggg tatcaaagag cttggcagtc aaatcctgaa ggaacaccct 2400

gtcgagaaca cgcaacttca gaacgaaaaa ttgtacctct actatctgca gaatggtaga 2460

gatatgtacg tagaccaaga attggatatt aaccgcctct cagattacga cgtggatcat 2520

atagttccgc agtcattctt gaaggatgac tctatcgaca acaaagtcct cacaagatca 2580

gacaagaacc gcggaaaatc agataatgta ccctctgaag aggtggttaa aaagatgaaa 2640

aactactgga gacagttact taacgctaag ttgatcacgc aaagaaagtt cgataacctc 2700

acaaaggctg aacgcggcgg tttaagcgag cttgacaagg ccggtttcat aaaacgtcag 2760

ttagtcgaaa ccaggcaaat tacgaaacac gtagcccaaa tattggattc ccgcatgaac 2820

actaaatacg atgaaaatga caagctcatc cgtgaggtca aagtaattac cctgaaaagc 2880

aagttggtgt ccgacttcag aaaggatttc cagttctaca aagttcgcga aatcaacaac 2940

taccaccatg cacatgacgc ttacctgaac gcagtcgtag gcactgcgtt aattaaaaag 3000

taccctaaac tggaatctga gttcgtgtac ggtgactata aagtgtacga tgttagaaag 3060

atgatcgcta aaagcgaaca ggagattgga aaggctaccg ccaagtattt cttttactcc 3120

aacatcatga atttctttaa gaccgaaatc acgttagcaa atggcgagat acgtaaaagg 3180

ccacttatcg aaacaaacgg agaaactggc gagatagtgt gggacaaggg tagagatttt 3240

gccactgtcc gcaaagtact gtcgatgccg caagtgaata tcgttaaaaa gaccgaagtt 3300

caaacgggag gcttcagcaa agagtccatc ctgcccaagc gtaacagtga taaattgata 3360

gctaggaaaa aggactggga ccctaaaaag tatggtggat tcgacagccc aactgtcgca 3420

tactccgtat tggtggttgc gaaagtcgaa aaaggaaaga gcaaaaagct caagtccgta 3480

aaagagctgt tgggcattac cataatggaa agatcatctt tcgagaagaa tcctatcgat 3540

tttctggaag ccaagggata taaagaggtc aaaaaggacc tcataatcaa gttaccaaaa 3600

tacagtctgt tcgaattgga gaacggcaga aaacgcatgc ttgcatcagc gggtgaactg 3660

caaaagggaa atgagttagc acttccttct aaatacgtca acttcctgta tttggcgtca 3720

cactacgaaa aactgaaggg ctctccagaa gataacgagc aaaagcagtt atttgtggaa 3780

cagcacaaac attaccttga cgaaattata gagcaaatct cggagttcag taagagagtg 3840

attttggctg acgccaatct tgataaagtt ctgtctgctt acaacaagca ccgtgataaa 3900

ccgattaggg aacaggccga gaacatcata catctcttca cactcactaa ccttggtgca 3960

cccgcagcgt tcaaatattt tgacaccacg atagatcgta agaggtacac cagcacgaaa 4020

gaagttttgg acgcgacact catccatcaa tcaatcacgg gcctgtacga gaccagaatc 4080

gacctgtccc agctcggtgg cgacaaaagg ccggcggcca cgaaaaaggc tggccaggca 4140

aaaaagaaaa agtaa 4155

<210> 14

<211> 467

<212> DNA

<213> 家蚕(Bombyx mori)

<400> 14

aggttatgta gtacacattg ttgtaaatca ctgaattgtt ttagatgatt ttaacaatta 60

gtacttatta atattaaata agtacatacc ttgagaattt aaaaatcgtc aactataagc 120

catacgaatt taagcttggt acttggctta tagataagga cagaataaga attgttaacg 180

tgtaagacaa ggtcagatag tcatagtgat tttgtcaaag taataacaga tggcgctgta 240

caaaccataa ctgttttcat ttgtttttat ggattttatt acaaattcta aaggttttat 300

tgttattatt taatttcgtt ttaattatat tatatatctt taatagaata tgttaagagt 360

ttttgctctt tttgaataat ctttgtaaag tcgagtgttg ttgtaaatca cgctttcaat 420

agtttagttt ttttaggtat atatacaaaa tatcgtgctc tacaagt 467

<210> 15

<211> 867

<212> DNA

<213> 维多利亚水母(Aequorea victoria)

<400> 15

gcaaagtgaa cacgtcgcta agcgaaagct aagcaaataa acaagcgcag ctgaacaagc 60

taaacaatcg gggtaccgct agagtcgacg gtacgatcca ccggtcgcca ccatggtgag 120

caagggcgag gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg gtcgagctgg acggcgacgt 180

aaacggccac aagttcagcg tgtccggcga gggcgagggc gatgccacct acggcaagct 240

gaccctgaag ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg ccctggccca ccctcgtgac 300

caccctgacc tggggcgtgc agtgcttcag ccgctacccc gaccacatga agcagcacga 360

cttcttcaag tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag cgcaccatct tcttcaagga 420

cgacggcaac tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag ggcgacaccc tggtgaaccg 480

catcgagctg aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac atcctggggc acaagctgga 540

gtacaactac atcagccaca acgtctatat caccgccgac aagcagaaga acggcatcaa 600

ggccaacttc aagatccgcc acaacatcga ggacggcagc gtgcagctcg ccgaccacta 660

ccagcagaac acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg cccgacaacc actacctgag 720

cacccagtcc gccctgagca aagaccccaa cgagaagcgc gatcacatgg tcctgctgga 780

gttcgtgacc gccgccggga tcactctcgg catggacgag ctgtacaagt aaactctaga 840

tcataatcag ccataccaca tttgtag 867

<210> 16

<211> 1126

<212> DNA

<213> 家蚕(Bombyx mori)

<400> 16

cctgcgtgat caggaaaaat gtggaaagct taacgatttt gtcacatttt acttatcaca 60

acttgttttt ataataattc gcttaaatga gcagctatta cttaatctcg tagtggtttt 120

tgacaaaatc agcttcttta gaactaaaat atcatttttt tcgtaatttt tttaatgaaa 180

aatgctctag tgttatacct ttccaaaatc accattaatt aggtagtgtt taagcttgtt 240

gtacaaaact gccacacgca tttttttctc cactgtaggt tgtagttacg cgaaaacaaa 300

atcgttctgt gaaaattcaa acaaaaatat tttttcgtaa aaacacttat caatgagtaa 360

agtaacaatt catgaataat ttcatgtaaa aaaaaaatac tagaaaagga atttttcatt 420

acgagatgct taaaaatctg tttcaaggta gagatttttc gatatttcgg aaaattttgt 480

aaaactgtaa atccgtaaaa ttttgctaaa catatattgt gttgttttgg taagtattga 540

cccaagctat cacctcctgc agtatgtcgt gctaattact ggacacattg tataacagtt 600

ccactgtatt gacaataata aaacctcttc attgacttga gaatgtctgg acagatttgg 660

ctttgtattt ttgatttaca aatgtttttt tggtgattta cccatccaag gcattctcca 720

ggatggttgt ggcatcacgc cgattggcaa acaaaaacta aaatgaaact aaaaagaaac 780

agtttccgct gtcccgttcc tctagtggga gaaagcatga agtaagttct ttaaatatta 840

caaaaaaatt gaacgatatt ataaaattct ttaaaatatt aaaagtaaga acaataagat 900

caattaaatc ataattaatc acattgttca tgatcacaat ttaatttact tcatacgttg 960

tattgttatg ttaaataaaa agattaattt ctatgtaatt gtatctgtac aatacaatgt 1020

gtagatgttt attctatcga aagtaaatac gtcaaaactc gaaaattttc agtataaaaa 1080

ggttcaactt tttcaaatca gcatcagttc ggttccaact ctcaag 1126

<210> 17

<211> 690

<212> DNA

<213> 家蚕(Bombyx mori)

<400> 17

tgcatattgg acatcccttt tcttgacatc gtataaattc ggtaattctc ggtacggttc 60

gtaaagttca cctgcggcta tattccgact cgccaagtta cgtcagtcgt attgtaatga 120

gcgatttagt gggcaacttc attctgttaa ttttgtgtca cggtgcgcgc gcatcgtaaa 180

acttcactct catagatttt tcataacgcg cctaaagaag tataacttca ataatttaaa 240

tttaaaaaaa aacatgcata gaataattat atgaattatt taaaatgtca tttaccgaca 300

ttgacataac agacgacgtt aacactacaa aacattttaa ttccacattg ttacatattc 360

aacagttaaa tttgcgttaa ttctcgatgc gaacaaatat aagaacaatc ggatcaatta 420

gatcgctttg tttcgaacaa cacttagttt aactagaggc gtacacctca agaaatcatc 480

ttcattagaa actaaacctt aaaatcgcaa taataaagca tagtcaattt taactgaaat 540

gcaaagtctt ttgaacgtta gatgctgtca gcgttcgttg gtacagttgt ttgatattta 600

ttttaattgt ctttttatat ataaatagtg gaacattaat cacggaatcc tgtatagtat 660

ataccgattg gtcacataac agaccactaa 690

<210> 18

<211> 570

<212> DNA

<213> 家蚕(Bombyx mori)

<400> 18

tctcacacgt ttattcccaa aacatttttg tcgggcaaat tacagttttt tcacaaatca 60

gtaatcagaa ggtatttaca aggcatatac tatgcctata atagaagatt ttgctcaaca 120

gaaatcccga aagaaaccgt tatcgaaatc gtaaccaaaa aaccagcagc attctaatat 180

cattaatgac atattatatc atactgtatt tgattaccta taataaatgg tcatactcag 240

taaaaaaatg ttaatataat tcgctttttt tactttccaa aagggcctca aattcttgtg 300

tgtccaaggg ccccatccta gtttaagacg tccctggctg tagcccagtt accgccaaac 360

aaacgtgcat tactccccgc ctacaccgag gagaacattt tgcgccttag aaaataaaat 420

ggcgtcgccg cggcgcaaca atgagaactt aattcgtgca attgtttcca cgacaatatt 480

tatttaacgt tattcgttat gaggaacaat actttgtata attaatgttg atcggtgcct 540

aacgacgcag ttgtttatta ttcgcgcaac 570

<210> 19

<211> 46

<212> DNA

<213> 家蚕(Bombyx mori)

<400> 19

atgcggagat aaatcgtcgg gggccgatgc cagtactgca gactac 46

Claims (1)

1.一种针对家蚕MSG和PSG表达基因的可控编辑方法，其特征在于，其通过GAL4/UAS系统，构建了若干个分别在家蚕MSG和PSG中特异启动表达的GAL4表达载体，通过将密码子优化的Cas9基因序列与U6驱动表达的gRNA靶点一起串联在UAS序列下游，最终构建成UAS表达载体，进而利用GAL4/UAS遗传操作工具达到家蚕基因的可控编辑；

所述若干个在家蚕MSG中特异启动表达的GAL4表达载体为4个在家蚕MSG中特异启动表达；

所述若干个在家蚕PSG中特异启动表达的GAL4表达载体为3个在家蚕PSG中特异启动表达；

所述可控编辑方法利用GAL4/UAS双元表达系统和CRISPR/Cas9的基因编辑系统，用于产生一种能在家蚕中部丝腺和后部丝腺中进行组织特异性敲除的转基因表达载体；

所述的针对家蚕MSG和PSG表达基因的可控编辑方法包括以下步骤：

步骤S1，家蚕MSG特异GAL4表达载体的构建：

分别构建了4种家蚕中部丝腺特异表达载体，所述表达载体的目的基因表达框包括选自以下4种家蚕中部丝腺特异的启动子中的一种：家蚕Ser1基因启动子，其序列为SEQ IDNO.1、家蚕Ser2基因启动子，其序列为SEQ ID NO.2、家蚕Ser3基因启动子，其序列为SEQ IDNO.3、家蚕Ser4基因启动子，其序列为SEQ ID NO.4；所述表达载体的目的基因表达框的目的基因为编码GAL4蛋白结合结构域的基因序列GAL4BD，其基因序列为SEQ ID NO.5、VP16为激活基因表达的蛋白结构域序列，其基因序列为SEQ ID NO.6、Ser1-poly A为终止信号，其序列为SEQ ID NO.7；将目的基因表达框插入到piggyBac载体骨架上即pBac[3×P3-DsRed]，该载体骨架由以下步骤完成：首先组装3×P3-DsRed序列，其序列为SEQ ID NO.8，该3×P3-DsRed序列是由3倍重复的P3眼睛和神经特异的启动子驱动表达了红色荧光蛋白DsRed序列组成；随后在3×P3-DsRed序列5’端和3’端分别组装上piggyBac右臂，其序列为SEQ ID NO.9和piggyBac左臂，其序列为SEQ ID NO.10；

步骤S2，针对家蚕MSG的UAS敲除表达载体的构建：

构建了一种以UAS串联Cas9蛋白及BmYki靶点的转基因表达载体；所述载体的目的基因表达框包括：与GAL4蛋白特异结合的10×UAS上游序列，其序列为SEQ ID NO.12、根据家蚕密码子偏好进行优化的编码Cas 9基因序列，其基因序列为SEQ ID NO.13、驱动表达BmYki靶点序列的U6启动子，其序列为SEQ ID NO.14、2个BmYki靶点序列，其序列分别为ggactcaaagcgaccgctacagg和gatcttggacccttaccagcagg、Ser1-poly A为终止信号；将目的表达框插入到piggyBac载体骨架上即pBac[3×P3-ECFP]，该载体骨架由以下步骤完成：首先组装3×P3-ECFP序列，其序列为SEQ ID NO.15，该序列是由3倍重复的P3眼睛和神经特异的启动子驱动表达了蓝色荧光蛋白ECFP序列组成；随后在3×P3-ECFP序列5’ 端和3’ 端分别组装上piggyBac右臂和piggyBac左臂；

步骤S3，家蚕PSG特异GAL4表达载体的构建：

分别构建了3种家蚕后部丝腺特异表达载体，所述表达载体的目的基因表达框包括选自以下3种家蚕后部丝腺特异的启动子中的一种：家蚕fibH基因启动子，其序列为SEQ IDNO.16、家蚕fibL基因启动子，其序列为SEQ ID NO.17、家蚕P25基因启动子，其序列为SEQID NO.18；所述表达载体的目的基因表达框的目的基因为GAL4BD、VP16为激活基因表达的蛋白结构域序列、Ser1-poly A为终止信号；将目的表达框插入到piggyBac载体骨架上即pBac[3×P3-DsRed]，该载体骨架由以下步骤完成：首先组装3×P3-DsRed序列，该3×P3-DsRed序列是由3倍重复的P3眼睛和神经特异的启动子驱动表达了红色荧光蛋白DsRed序列组成；随后在3×P3-DsRed序列的5’端和3’端分别组装上piggyBac右臂和piggyBac左臂；

步骤S4，针对家蚕PSG的UAS敲除表达载体的构建：

构建了一种以UAS串联Cas 9蛋白及BmHR3靶点的转基因表达载体；所述载体的目的基因表达框包括10×UAS上游序列、根据家蚕密码子偏好进行优化的编码Cas 9蛋白序列、U6启动子、2个BmHR3靶点序列，其序列分别为atgcggagataaatcgtcggggg和ccgatgccagtactgcagactac、Ser1-poly A为终止信号；将目的表达框插入到piggyBac载体骨架上即pBac[3×P3-ECFP]，该载体骨架由以下步骤完成：首先组装3×P3-ECFP序列，该序列是由3倍重复的P3眼睛和神经特异的启动子驱动表达了青色荧光蛋白ECFP组成；随后在3×P3-ECFP序列5’端和3’端分别组装上piggyBac右臂和piggyBac左臂；

步骤S5，转基因家蚕的制作：

通过将表达载体分别通过家蚕胚胎显微注射，获得眼睛发红色荧光的GAL4转基因家蚕和眼睛发青色荧光的UAS转基因家蚕，将两种转基因家蚕进行两两杂交，获得眼睛即发红色荧光也发青色荧光的MSG特异性敲除的转基因家蚕和PSG特异性敲除的转基因家蚕；

步骤S6，形态学观察及分子检测：

分别观察中部丝腺和后部丝腺的形态，并对中部丝腺和后部丝腺进行分子检测发现靶点已进行特异性敲除。