CN114540420B - 一种通过特异上调家蚕蜕皮激素应答因子制备转基因丝胶茧的方法及其家蚕品种 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种通过特异上调家蚕蜕皮激素应答因子制备转基因丝胶茧的方法及其家蚕品种，其通过在家蚕PSG特异上调家蚕蜕皮激素应答因子，家蚕蜕皮激素应答因子包括BmEcRA、BmUSP、BmE74、BmHR4、BmHR3、BmFtz‑f1，使得家蚕PSG不同程度的退化，影响或阻止了丝素蛋白的合成，通过特异上调家蚕蜕皮激素应答因子制备转基因丝胶茧的方法获得的转基因家蚕具有只生产丝胶蛋白的特性，使其只能生产丝胶茧。该家蚕的蚕丝可作为一种良好的材料使用于医学、军工、光电等各个领域，具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种通过特异上调家蚕蜕皮激素应答因子制备转基因丝胶茧的方法及其家蚕品种。
背景技术
丝胶蛋白在家蚕茧壳中的主要蛋白之一，约占茧壳重量的20-30％。丝胶蛋白具有良好的亲水性和较低的免疫原性，已被广泛用于床上用品、贴身衣物、人造皮革类护垫等产品开发，此外，丝胶蛋白还可以与其他高分子材料混合制成功能性、可降解性的高分子材料，如人造骨钉、人造皮肤等，小分子量的丝胶水解物可以用于护肤品的制作。随着人们对丝胶蛋白的应用需求日益增加，目前常规的从普通家蚕茧壳中提取丝胶蛋白的方法不但技术繁杂，提取成本也很高，极有必要开发新的可低成本大量获取丝胶蛋白的方法。
发明内容
基于现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种通过特异上调家蚕蜕皮激素应答因子制备转基因丝胶茧的方法及其家蚕品种。
依据本发明技术方案的第一方面，提供一种通过特异上调家蚕蜕皮激素应答因子制备转基因丝胶茧的方法，其通过在家蚕PSG特异上调家蚕蜕皮激素应答因子，家蚕蜕皮激素应答因子包括BmECRA(SEQ ID NO.1)、BmUSP(SEQ ID NO.2)、BmE74(SEQ ID NO.3)、BmHR4(SEQ ID NO.4)、BmHR3(SEQ ID NO.5)、BmFtz-f1(SEQ ID NO.6)，使得家蚕PSG不同程度的退化，影响或阻止了丝素蛋白的合成，通过特异上调家蚕蜕皮激素应答因子制备转基因丝胶茧的方法获得的转基因家蚕具有只生产丝胶蛋白的特性，使其只能生产丝胶茧。
其中通过特异上调家蚕蜕皮激素应答因子制备转基因丝胶茧的方法包括以下步骤：
第一步、GAL4/UAS表达载体构建；
第二步、获得杂交得PSG过表达的GAL4/UAS转基因家蚕；
第三步、通过对杂交得PSG过表达的GAL4/UAS转基因家蚕的丝腺进行形态学的观察，并用相机拍摄照片留证和验证；
第四步、通过对PSG特异的GAL4/UAS转基因家蚕的茧壳进行形态学的观察，并用相机拍摄照片留证和验证；
第五步、通过对PSG特异的GAL4/UAS转基因家蚕的丝腺进行DNA提取，提取成功的DNA根据设计的引物进行PCR扩增，扩增结果进行核酸电泳；根据设计引物的大小与扩增出来的大小一致，说明转基因成功。
其中，GAL4/UAS表达载体构建包括构建了1种家蚕PSG特异GAL4表达载体，载体目的基因表达框包括：家蚕fibH基因启动子(SEQ ID NO.7)(SEQ ID NO.7)；目的基因为编码GAL4蛋白结合结构域的基因序列即GAl4BD(SEQ ID NO.8)；VP16为激活基因表达的蛋白结构域序列(SEQ ID NO.9)；Ser1-poly A为终止信号(SEQ ID NO.10)，将目的表达框插入到piggyBac载体骨架上即pBac[3×P3-DsRed]，该骨架载体由以下步骤完成：首先组装3×P3-DsRed序列(SEQ ID NO.11)，该序列是由3倍重复的P3启动子(眼睛和神经特异的启动子)驱动表达了DsRed(红色荧光蛋白)序列组成；随后在3×P3-DsRed(SEQ ID NO.11)序列5’端和3’端分别组装上piggyBac右臂(SEQ ID NO.12)和piggyBac左臂(SEQ ID NO.13)，筛选标记为眼睛发红色荧光。
进一步地，GAL4/UAS表达载体构建包括分别构建了6种UAS表达载体：所述载体目的基因表达框包括：与GAL4蛋白结合的10×UAS序列(SEQ ID NO.14)；6种家蚕蜕皮激素应答因子即BmECRA(SEQ ID NO.1)、BmUSP(SEQ ID NO.2)、BmE74(SEQ ID NO.3)、BmHR4(SEQID NO.4)、BmHR3(SEQ ID NO.5)、BmFtz-f1(SEQ ID NO.6)为目的基因；Ser1-polyA(SEQ IDNO.10)为终止信号，将目的表达框插入到piggyBac载体骨架上即pBac[3×P3-ECFP]，该骨架载体由以下步骤完成：首先组装3×P3-ECFP序列(SEQ ID NO.15)，该序列是由3倍重复的P3启动子(眼睛和神经特异的启动子)驱动表达了青色荧光蛋白(ECFP)序列组成；随后在3×P3-ECFP序列(SEQ ID NO.15)5’端和3’端分别组装上piggyBac右臂(SEQ ID NO.12)和piggyBac左臂(SEQ ID NO.13)，筛选标记为眼睛发青色荧光。
优选地，获得杂交得PSG过表达的GAL4/UAS转基因家蚕包括将GAL4/UAS表达载体通过家蚕胚胎显微注射，获得眼睛发红色荧光的GAL4转基因家蚕和眼睛发青色荧光的UAS转基因家蚕，将GAL4转基因家蚕分别与UAS转基因家蚕进行两两杂交，获得6种眼睛即发红色荧光也发青色荧光的PSG过表达的GAL4/UAS转基因家蚕。
更进一步地，第四步具体为：通过对上述6种PSG特异过表达的GAL4/UAS转基因家蚕的5L6D丝腺进行形态学的观察，并用相机拍摄照片。
依据本发明技术方案得第二方面，提供一种通过特异上调家蚕蜕皮激素应答因子制备转基因丝胶茧的家蚕品种，其为通过上述通过特异上调家蚕蜕皮激素应答因子制备转基因丝胶茧的方法生产得家蚕品种。
相比较于现有技术，本发明专利的一种通过特异上调家蚕蜕皮激素应答因子制备转基因丝胶茧的方法的技术方案的优点在于：
1、通过GAL4/UAS双元表达系统，在家蚕后部丝腺中特异过表达6种家蚕蜕皮激素应答因子即BmECRA(SEQ ID NO.1)、BmUSP(SEQ ID NO.2)、BmE74(SEQ ID NO.3)、BmHR4(SEQID NO.4)、BmHR3(SEQ ID NO.5)、BmFtz-f1(SEQ ID NO.6)，均获得了后部丝腺突变的转基因家蚕；
2、本发明获得的6种不同的转基因家蚕，均能正常吐丝结茧。特别地，6种转基因家蚕的蚕茧均为丝胶茧，可大规模进行饲养。与普通蚕茧相比，丝胶茧的丝胶含量更高(达到95％以上)，有利于实现规模化和低成本提取丝胶蛋白；
3、本发明利用转基因技术对蜕皮激素应答因子进行遗传改造，进而获得了后部丝腺突变的丝胶茧家蚕品种，为蚕丝改造和新型蚕丝功能材料开发提供了素材基础。
附图说明
附图1为成功制作PSG特异性的GAL4/UAS转基因家蚕结果图；
附图2为PSG特异性的GAL4/UAS过表达BmECRA(SEQ ID NO.1)、BmUSP(SEQ IDNO.2)、BmE74(SEQ ID NO.3)、BmHR4(SEQ ID NO.4)、BmHR3(SEQ ID NO.5)、BmFtz-f1(SEQID NO.6)转基因家蚕的丝腺结果图；
附图3为PSG特异性的GAL4/UAS过表达BmE74(SEQ ID NO.3)、BmHR4(SEQ IDNO.4)、BmHR3(SEQ ID NO.5)转基因家蚕的茧壳示意图；
附图4为PSG特异性的GAL4/UAS过表达BmECRA(SEQ ID NO.1)、BmUSP(SEQ IDNO.2)、BmE74(SEQ ID NO.3)、BmHR4(SEQ ID NO.4)、BmHR3(SEQ ID NO.5)、BmFtz-f1(SEQID NO.6)转基因家蚕的基因组鉴定结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本技术方案的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术方案的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。另外，不应当将本发明的保护范围仅仅限制至下述具体结构或部件或具体参数。
本发明基于蜕皮激素是调控昆虫生长发育和变态的关键激素，在家蚕中蜕皮激素对丝腺生长发育和丝蛋白合成具有非常重要的调控作用。通过基因调控蜕皮激素应答因子的表达，可影响家蚕丝腺的发育，进而控制丝蛋白的表达与合成。通过对蜕皮激素相关应答因子的改造利用，有望开发出丝胶茧家蚕品种，促进丝胶蛋白的规模化和低成本生产。
本发明提供一种通过特异上调家蚕蜕皮激素应答因子制备转基因丝胶茧的方法及其家蚕品种，本发明通过在家蚕PSG特异上调家蚕蜕皮激素应答因子(包括BmECRA(SEQID NO.1)、BmUSP(SEQ ID NO.2)、BmE74(SEQ ID NO.3)、BmHR4(SEQ ID NO.4)、BmHR3(SEQID NO.5)、BmFtz-f1(SEQ ID NO.6))使家蚕PSG不同程度的退化，影响或阻止了丝素蛋白的合成，该方法获得的转基因家蚕具有只生产丝胶蛋白的特性，使其只能生产薄茧(丝胶茧)，丝胶蛋白含量可达90％以上。有关研究表明，丝胶可以广泛用于床上用品、贴身衣物、人造皮革类护垫等商品；同样还可以与其他高分子材料混合制成功能性、可降解性的高分子材料，如人造骨钉、人造皮肤等；小分子量的丝胶水解物可以用于护肤品的制作，因此本发明提供的大规模生产丝胶方法具有很高的应用价值。
本发明通过特异上调家蚕蜕皮激素应答因子制备转基因丝胶茧的方法及其家蚕品种，其主要基于GAL4/UAS双元表达系统创制一种后丝退化，丝素蛋白合成受阻的转基因方法；还利用所述方法制作转基因家蚕品种，使其只生产不同程度的丝胶茧以便于大规模生产丝胶蛋白。
本发明的通过特异上调家蚕蜕皮激素应答因子制备转基因丝胶茧的方法，包括以下步骤：
第一步、GAL4/UAS表达载体构建：
构建了1种家蚕PSG特异GAL4表达载体。载体目的基因表达框包括:启动子为fibH(SEQ ID NO.7)；目的基因为编码GAL4蛋白结合结构域的基因序列即GAl4BD(SEQ IDNO.8)；VP16(SEQ ID NO.9)为增强子(SEQ ID NO.9)；Ser1-polyA为终止信号(SEQ IDNO.10)，将目的表达框插入到piggyBac载体骨架上即pBac[3×P3-DsRed]。该骨架载体由以下步骤完成：首先组装3×P3-DsRed序列(SEQ ID NO.11)，该序列是由3倍重复的P3启动子(眼睛和神经特异的启动子)驱动表达了DsRed(红色荧光蛋白)序列组成；随后在3×P3-DsRed序列(SEQ ID NO.11)5’端和3’端分别组装上piggyBac右臂(SEQ ID NO.12)和piggyBac左臂(SEQ ID NO.13)，筛选标记为眼睛发红色荧光。
分别构建了6种UAS表达载体：所述载体目的基因表达框包括：与GAL4蛋白结合的10×UAS序列(SEQ ID NO.14)；6种家蚕蜕皮激素应答因子即BmECRA(SEQ ID NO.1)、BmUSP(SEQ ID NO.2)、BmE74(SEQ ID NO.3)、BmHR4(SEQ ID NO.4)、BmHR3(SEQ ID NO.5)、BmFtz-f1(SEQ ID NO.6)为目的基因；Ser1-polyA为终止信号(SEQ ID NO.10)，将目的表达框插入到piggyBac载体骨架上即pBac[3×P3-ECFP]。该骨架载体由以下步骤完成：首先组装3×P3-ECFP序列(SEQ ID NO.15)，该序列是由3倍重复的P3启动子(眼睛和神经特异的启动子)驱动表达了ECFP(青色荧光蛋白)序列组成；随后在3×P3-ECFP序列(SEQ ID NO.15)5’端和3’端分别组装上piggyBac右臂(SEQ ID NO.12)和piggyBac左臂(SEQ ID NO.13)，筛选标记为眼睛发青色荧光。
第二步、获得杂交得PSG过表达的GAL4/UAS转基因家蚕；
具体包括：将GAL4/UAS表达载体通过家蚕胚胎显微注射，获得眼睛发红色荧光的GAL4转基因家蚕和眼睛发青色荧光的UAS转基因家蚕，将GAL4转基因家蚕分别与UAS转基因家蚕进行两两杂交，获得6种眼睛即发红色荧光也发青色荧光的PSG过表达的GAL4/UAS转基因家蚕。
第三步、通过对杂交得PSG过表达的GAL4/UAS转基因家蚕的丝腺进行形态学的观察，并用相机拍摄照片留证和验证；具体为：通过对上述6种PSG特异过表达的GAL4/UAS转基因家蚕的五龄第六天(5L6D)丝腺进行形态学的观察，并用相机拍摄照片。
第四步、通过对PSG特异的GAL4/UAS转基因家蚕的茧壳进行形态学的观察，并用相机拍摄照片留证和验证；具体为：通过对上述PSG特异的GAL4/UAS转基因家蚕的茧壳进行形态学的观察，并用相机拍摄照片。
第五步、通过对PSG特异的GAL4/UAS转基因家蚕的丝腺进行DNA提取，提取成功的DNA根据设计的引物进行PCR扩增，扩增结果进行核酸电泳；具体为：通过对上述6种PSG特异的GAL4/UAS转基因家蚕的5L6D丝腺进行DNA提取，提取成功的DNA根据设计的引物进行PCR扩增，扩增结果进行核酸电泳。根据设计引物的大小与扩增出来的大小一致，说明转基因成功。
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1，其为家蚕PSG特异性GAL4/UAS表达载体的构建，构建一种后部丝腺特异的GAL4系统，过表达6种家蚕蜕皮激素应答因子即BmECRA(SEQ ID NO.1)、BmUSP(SEQ IDNO.2)、BmE74(SEQ ID NO.3)、BmHR4(SEQ ID NO.4)、BmHR3(SEQ ID NO.5)、BmFtz-f1(SEQID NO.6)的UAS表达系统，其包括以下步骤：
步骤S1构建PSG特异的GAL4表达载体：
依次将家蚕fibH基因启动子序列(SEQ ID NO.7)与GAl4BD基因序列(SEQ IDNO.8)、增强子VP16序列(SEQ ID NO.9)及终止信号Ser1-poly A(SEQ ID NO.10)串联形成目的基因表达框，通过利用AscI将骨架载体pBac[3×P3-DsRed]和目的基因表达框切开，通过T4链接酶进行链接，成功构建家蚕PSG特异性GAL4的表达载体并命名为HG4。
步骤S2构建以BmECRA(SEQ ID NO.1)为目的基因的UAS表达载体：
UAS串联的过表达基因表达框依次为：10×UAS序列(SEQ ID NO.14)，BmECRA(SEQID NO.1)为目的基因，Ser1-polyA为终止信号(SEQ ID NO.10)，通过利用FseI和BgIII将骨架载体pBac[3×P3-ECFP]和目的基因表达框切开，通过T4链接酶进行链接，最终形成UAS过表达载体。
步骤S3构建以BmUSP(SEQ ID NO.2)为目的基因的UAS表达载体
基本与步骤S2相同；与步骤S2不同的是，目的基因为BmUSP(SEQ ID NO.2)，其余均与步骤2一致。
步骤S4构建以BmE74(SEQ ID NO.3)为目的基因的UAS表达载体：
基本与步骤S2相同；与步骤S2不同的是，目的基因为BmE74(SEQ ID NO.3)，其余均与步骤2一致。
步骤S5构建以BmHR4(SEQ ID NO.4)为目的基因的UAS表达载体
基本与步骤S2相同；与步骤S2不同的是，目的基因为BmHR4(SEQ ID NO.4)，其余均与步骤2一致。
步骤S6构建以BmHR3(SEQ ID NO.5)为目的基因的UAS表达载体
基本与步骤S2相同；与步骤S2不同的是，目的基因为BmHR3(SEQ ID NO.5)，其余均与步骤2一致。
步骤S7构建以BmFtz-f1(SEQ ID NO.6)为目的基因的UAS表达载体
基本与步骤S2相同；与步骤S2不同的是，目的基因为BmFtz-f1(SEQ ID NO.6)，其余均与步骤2一致。
实施例2，其为GAL4/UAS转基因家蚕的制作，分别制作了过表达BmECRA(SEQ IDNO.1)、BmUSP(SEQ ID NO.2)、BmE74(SEQ ID NO.3)、BmHR4(SEQ ID NO.4)、BmHR3(SEQ IDNO.5)、BmFtz-f1(SEQ ID NO.6)的GAL4/UAS转基因家蚕，其包括以下步骤：
步骤S21转基因注射及荧光筛选：
将构建成功的家蚕后部丝腺特异性GAL4/UAS表达载体，分别与辅助质粒(A4Helper)以浓度450ng/μL(纳克每微升)进行等比例混合，通过Eppendorf显微注射仪注射，以多化性家蚕Nistari(一年内可以饲养多批次蚕种材料)为注射受体，注射前需要将蚕蛾交配6小时，4度放置一天后拿出室温产卵，取刚产卵一小时的胚胎，将其用浆糊粘在玻璃片上，使用Eppendorf显微注射仪注射，通过无毒胶水将其封口，经35％的甲醛蒸汽消毒5分钟后，置于温度25℃，相对湿度85％的环境中孵化，将孵化出的G0代(注射第一代)蚁蚕用桑叶饲养至化蛾，获得的G0代蚕蛾，通过自交或回交得到G1代(注射第二代)蚕卵，用Olympus荧光显微镜筛选，分别得到命名为BmECRA(SEQ ID NO.1)、BmUSP(SEQ ID NO.2)、BmE74(SEQID NO.3)、BmHR4(SEQ ID NO.4)、BmHR3(SEQ ID NO.5)、BmFtz-f1(SEQ ID NO.6)青色荧光的UAS转基因蚕及并命名为HG4的红色荧光的GAL4转基因家蚕的蛾圈。并通过饲养一代后正常保种。
步骤S22过表达BmECRA(SEQ ID NO.1)转基因家蚕的制作：
通过将HG4转基因家蚕与BmECRA(SEQ ID NO.1)的UAS转基因家蚕进行两两杂交，通过置于温度25℃，相对湿度85％的环境中孵化，孵化后代饲养至四龄，并通过筛选获得了在转基因家蚕眼睛中特异表达的既发青色荧光又发红色荧光的GAL4/UAS转基因家蚕，结果如附图1所示，证明GAL4/UAS转基因家蚕制作成功。
步骤S23过表达BmUSP(SEQ ID NO.2)转基因家蚕的制作：
通过将HG4转基因家蚕与BmUSP(SEQ ID NO.2)的UAS转基因家蚕进行两两杂交，通过置于温度25℃，相对湿度85％的环境中孵化，孵化后代饲养至四龄，并通过筛选获得了在转基因家蚕眼睛中特异表达的既发青色荧光又发红色荧光的GAL4/UAS转基因家蚕，结果如附图1所示，证明GAL4/UAS转基因家蚕制作成功。
步骤S24过表达BmE74(SEQ ID NO.3)转基因家蚕的制作：
通过将HG4转基因家蚕与BmE74(SEQ ID NO.3)的UAS转基因家蚕进行两两杂交，通过置于温度25℃，相对湿度85％的环境中孵化，孵化后代饲养至四龄，并通过筛选获得了在转基因家蚕眼睛中特异表达的既发青色荧光又发红色荧光的GAL4/UAS转基因家蚕，结果如附图1所示，证明GAL4/UAS转基因家蚕制作成功。
步骤S25过表达BmHR4(SEQ ID NO.4)转基因家蚕的制作：
通过将HG4转基因家蚕与BmHR4(SEQ ID NO.4)的UAS转基因家蚕进行两两杂交，通过置于温度25℃，相对湿度85％的环境中孵化，孵化后代饲养至四龄，并通过筛选获得了在转基因家蚕眼睛中特异表达的既发青色荧光又发红色荧光的GAL4/UAS转基因家蚕，结果如附图1所示，证明GAL4/UAS转基因家蚕制作成功。
步骤S26过表达BmHR3(SEQ ID NO.5)转基因家蚕的制作：
通过将HG4转基因家蚕与BmHR3(SEQ ID NO.5)的UAS转基因家蚕进行两两杂交，通过置于温度25℃，相对湿度85％的环境中孵化，孵化后代饲养至四龄，并通过筛选获得了在转基因家蚕眼睛中特异表达的既发青色荧光又发红色荧光的GAL4/UAS转基因家蚕，结果如附图1所示，证明GAL4/UAS转基因家蚕制作成功。
步骤S27过表达BmFtz-f1(SEQ ID NO.6)转基因家蚕的制作：
通过将HG4转基因家蚕与BmFtz-f1(SEQ ID NO.6)的UAS转基因家蚕进行两两杂交，通过置于温度25℃，相对湿度85％的环境中孵化，孵化后代饲养至四龄，并通过筛选获得了在转基因家蚕眼睛中特异表达的既发青色荧光又发红色荧光的GAL4/UAS转基因家蚕，结果如附图1所示，证明GAL4/UAS转基因家蚕制作成功。
实施例3，PSG特异性的GAL4/UAS过表达转基因家蚕丝腺表型观察，其包括以下：
步骤S31 PSG特异过表达BmECRA(SEQ ID NO.1)的GAL4/UAS转基因家蚕的丝腺表型观察：
饲养野生型家蚕Nistari和PSG特异过表达BmECRA(SEQ ID NO.1)的GAL4/UAS转基因家蚕即家蚕眼睛中特异表达的既发青色荧光又发红色荧光的GAL4/UAS转基因家蚕至五龄，通过在1×PBS的缓冲液中解剖并观察野生型家蚕Nistari和PSG特异特异过表达BmECRA(SEQ ID NO.1)的GAL4/UAS转基因家蚕的五龄第六天(5L6D)后部丝腺，并拍照，结果如附图2所示，后部丝腺变短。
步骤S32 PSG特异过表达BmUSP(SEQ ID NO.2)的GAL4/UAS转基因家蚕的丝腺表型观察：
饲养野生型家蚕Nistari和PSG特异过表达BmUSP(SEQ ID NO.2)的GAL4/UAS转基因家蚕即家蚕眼睛中特异表达的既发青色荧光又发红色荧光的GAL4/UAS转基因家蚕至五龄，通过在1×PBS的缓冲液中解剖并观察野生型家蚕Nistari和PSG特异特异过表达BmUSP(SEQ ID NO.2)的GAL4/UAS转基因家蚕的五龄第六天(5L6D)后部丝腺，并拍照，结果如附图2所示，后部丝腺变短。
步骤S33 PSG特异过表达BmE74(SEQ ID NO.3)的GAL4/UAS转基因家蚕的丝腺表型观察：
饲养野生型家蚕Nistari和PSG特异过表达BmE74(SEQ ID NO.3)的GAL4/UAS转基因家蚕即家蚕眼睛中特异表达的既发青色荧光又发红色荧光的GAL4/UAS转基因家蚕至五龄，通过在1×PBS的缓冲液中解剖并观察野生型家蚕Nistari和PSG特异特异过表达BmE74(SEQ ID NO.3)的GAL4/UAS转基因家蚕的五龄第六天(5L6D)后部丝腺，并拍照，结果如附图2所示，后部丝腺变短。
步骤S34 PSG特异过表达BmHR4(SEQ ID NO.4)的GAL4/UAS转基因家蚕的丝腺表型观察：
饲养野生型家蚕Nistari和PSG特异过表达BmHR4(SEQ ID NO.4)的GAL4/UAS转基因家蚕即家蚕眼睛中特异表达的既发青色荧光又发红色荧光的GAL4/UAS转基因家蚕至五龄，通过在1×PBS的缓冲液中解剖并观察野生型家蚕Nistari和PSG特异特异过表达BmHR4(SEQ ID NO.4)的GAL4/UAS转基因家蚕的五龄第六天(5L6D)后部丝腺，并拍照，结果如附图2所示，后部丝腺变短。
步骤S35 PSG特异过表达BmHR3(SEQ ID NO.5)的GAL4/UAS转基因家蚕的丝腺表型观察：
饲养野生型家蚕Nistari和PSG特异过表达BmHR3(SEQ ID NO.5)的GAL4/UAS转基因家蚕即家蚕眼睛中特异表达的既发青色荧光又发红色荧光的GAL4/UAS转基因家蚕至五龄，通过在1×PBS的缓冲液中解剖并观察野生型家蚕Nistari和PSG特异特异过表达BmHR3(SEQ ID NO.5)的GAL4/UAS转基因家蚕的五龄第六天(5L6D)后部丝腺，并拍照，结果如附图2所示，后部丝腺变短。
步骤S36 PSG特异过表达BmFtz-f1(SEQ ID NO.6)的GAL4/UAS转基因家蚕的丝腺表型观察：
饲养野生型家蚕Nistari和PSG特异过表达BmFtz-f1(SEQ ID NO.6)的GAL4/UAS转基因家蚕即家蚕眼睛中特异表达的既发青色荧光又发红色荧光的GAL4/UAS转基因家蚕至五龄，通过在1×PBS的缓冲液中解剖并观察野生型家蚕Nistari和PSG特异特异过表达BmFtz-f1(SEQ ID NO.6)的GAL4/UAS转基因家蚕的五龄第六天(5L6D)后部丝腺，并拍照，结果如附图2所示，后部丝腺变短。
实施例4，其为如图3所示结果为PSG特异过表达GAL4/UAS转基因家蚕的蚕茧观察，其包括以下：
步骤S41 PSG特异过表达BmHR3(SEQ ID NO.5)的GAL4/UAS转基因家蚕的蚕茧表型观察，具体为饲养野生型家蚕Nistari和PSG特异过表达BmHR3(SEQ ID NO.5)转基因家蚕至上蔟，置于温度25℃，相对湿度65％的环境中饲养至上蔟第7天，上蔟环境通风良好，温度为25℃，采茧，并观察Nistari和过表达BmHR3(SEQ ID NO.5)转基因家蚕茧壳，结果如附图3所示，其茧壳为丝胶茧。
步骤S42 PSG特异过表达BmHR4(SEQ ID NO.4)的GAL4/UAS转基因家蚕的蚕茧表型观察，具体为饲养野生型家蚕Nistari和PSG特异过表达BmHR4(SEQ ID NO.4)转基因家蚕至上蔟，置于温度25℃，相对湿度65％的环境中饲养至上蔟第7天，上蔟环境通风良好，温度为25℃，采茧，并观察Nistari和过表达BmHR4(SEQ ID NO.4)转基因家蚕茧壳，结果如附图3所示，其茧壳为丝胶茧。
步骤S43 PSG特异过表达BmE74(SEQ ID NO.3)的GAL4/UAS转基因家蚕的蚕茧表型观察，具体为饲养野生型家蚕Nistari和PSG特异过表达BmE74(SEQ ID NO.3)转基因家蚕至上蔟，置于温度25℃，相对湿度65％的环境中饲养至上蔟第7天，上蔟环境通风良好，温度为25℃，采茧，并观察Nistari和过表达BmE74(SEQ ID NO.3)转基因家蚕茧壳，结果如附图3所示，其茧壳为丝胶茧。
实施例5，其包括PSG特异过表达GAL4/UAS转基因家蚕的鉴定，主要包括PSG特异过表达BmECRA(SEQ ID NO.1)、BmUSP(SEQ ID NO.2)、BmE74(SEQ ID NO.3)、BmHR4(SEQ IDNO.4)、BmHR3(SEQ ID NO.5)、BmFtz-f1(SEQ ID NO.6)的转基因家蚕的基因组鉴定。
其中，PSG特异性的GAL4/UAS过表达BmECRA(SEQ ID NO.1)转基因家蚕的分子鉴定包括步骤：
步骤S51、解剖野生型家蚕Nistari和PSG特异过表达BmECRA(SEQ ID NO.1)转基因家蚕五龄第六天(5L6D)的PSG，并通过1.5mL的离心管收集。
步骤S52、将解剖并收集的PSG进行基因组的提取，提取步骤如下：
(1)将研钵及研磨棒进行清洗后，置于烘箱中180℃高温灭菌2小时-3小时。在研磨操作进行前需对丝腺、研钵及研磨棒进行液氮预冷处理。预冷后对丝腺进行研磨至粉末后转移至1.5mL的离心管中，保存于液氮或-80℃备用。
(2)将1mL的DNA抽提Buffer缓冲液加入离心管中，3000rpm涡旋混匀。按100μL/mL(微升每毫升)的工作浓度加入RNA酶，置于37℃恒温水浴锅中消化1小时后加入蛋白酶K，55℃水浴消化过夜。
(3)将等体积的Tris饱和酚添加至离心管中后充分旋转振荡10min，随后4℃、13400rpm离心10min，取600μL(微升)上清液至新的离心管中。
(4)将600μL Tris酚/氯仿，充分旋转振荡10min，随后，4℃、13400rpm离心10min后，将上清转移至新的离心管中。
(5)将于上清等体积的氯仿，充分旋转振荡10min，随后，4℃、13400rpm离心10min，收集上清液。
(6)将在4℃预冷的无水乙醇等体积加入离心管中，轻轻上下颠倒直至出现均匀的白色絮状沉淀后静置5min。
(7)用无菌枪头小心挑出沉淀后转移至新的1.5mL离心管中，加入4℃预冷的75％乙醇清洗1次-2次，4℃、13400rpm离心10min，弃上清液。
(8)打开离心管盖子，室温静置至乙醇挥发殆尽，加入30μL-50μL TE缓冲液溶解DNA沉淀。
(9)利用分光光度计检测DNA纯度及浓度及琼脂点凝胶电泳检验后置于-80℃长期保存备用。
步骤S53基因组PCR：
(1)利用Primer5软件设计引物，该引物由华大基因合成，引物合成后加超纯水溶解稀释后4℃保存。
(2)以上述提取的基因组为模板进行PCR扩增目的片段，反应体系如下：
基因组DNA 1μL；
dNTP(脱氧核糖核苷三磷酸) 0.8μL；
HiFi Taq酶 0.1μL；
正反向引物 各0.2μL；
缓冲液Ⅰ 1μL；
双蒸水 6.7μL；
总共体系 10μL；
(3)PCR扩增条件如下：
94℃预变性 5min；
94℃变性 30s；
50℃退火 30s；
72℃延伸 30s；
重复35个循环；
72℃10min。
(4)上述反应结束后，制备1％的琼脂糖凝胶，取5μL PCR扩增产物进行电泳检测，检测结果如图4所示，证明过表达BmECRA(SEQ ID NO.1)转基因制作成功。
PSG特异性的GAL4/UAS过表达BmUSP(SEQ ID NO.2)转基因家蚕的分子鉴定包括以下步骤：
步骤S61解剖野生型家蚕Nistari和PSG特异过表达BmUSP(SEQ ID NO.2)转基因家蚕五龄第六天(5L6D)的PSG，并通过1.5mL的离心管收集。
步骤S62将解剖并收集的PSG进行基因组的提取，提取步骤见步骤S52。
步骤S63基因组PCR：
具体步骤见步骤S53，在BmUSP(SEQ ID NO.2)两端设计引物，通过基因组PCR进行扩增，扩增结果通过核酸凝胶电泳显示，结果如图4。结果证明过表达BmUSP(SEQ ID NO.2)转基因家蚕制作成功。
PSG特异性的GAL4/UAS过表达BmE74(SEQ ID NO.3)转基因家蚕的分子鉴定包括以下步骤：
步骤S71、解剖野生型家蚕Nistari和PSG特异过表达BmE74(SEQ ID NO.3)转基因家蚕五龄第六天(5L6D)的PSG，并通过1.5mL的离心管收集。
步骤S72、将解剖并收集的PSG进行基因组的提取，提取步骤见步骤S52。
步骤S73基因组PCR：
具体步骤见步骤S53，在BmE74(SEQ ID NO.3)两端设计引物，通过基因组PCR进行扩增，扩增结果通过核酸凝胶电泳显示，结果如图4。结果证明过表达BmE74(SEQ ID NO.3)转基因家蚕制作成功。
PSG特异性的GAL4/UAS过表达BmHR4(SEQ ID NO.4)转基因家蚕的分子鉴定包括以下步骤：
步骤S81解剖野生型家蚕Nistari和PSG特异过表达BmHR4(SEQ ID NO.4)转基因家蚕五龄第六天(5L6D)的PSG，并通过1.5mL的离心管收集。
步骤S82将解剖并收集的PSG进行基因组的提取，提取步骤见步骤S52。
步骤S83基因组PCR：
具体步骤见步骤S53，在BmHR4(SEQ ID NO.4)两端设计引物，通过基因组PCR进行扩增，扩增结果通过核酸凝胶电泳显示，结果如图4。结果证明过表达BmHR4(SEQ ID NO.4)转基因家蚕制作成功。
PSG特异性的GAL4/UAS过表达BmHR3(SEQ ID NO.5)转基因家蚕的分子鉴定包括以下步骤：
步骤S91解剖野生型家蚕Nistari和PSG特异过表达BmHR3(SEQ ID NO.5)转基因家蚕五龄第六天(5L6D)的PSG，并通过1.5mL的离心管收集。
步骤S92将解剖并收集的PSG进行基因组的提取，提取方法见步骤S52。
步骤S93基因组PCR：
具体步骤见步骤S53，在BmHR3(SEQ ID NO.5)两端设计引物，通过基因组PCR进行扩增，扩增结果通过核酸凝胶电泳显示，结果如图4。结果证明过表达BmHR3(SEQ ID NO.5)转基因家蚕制作成功。
PSG特异性的GAL4/UAS过表达BmFtz-f1(SEQ ID NO.6)转基因家蚕的分子鉴定包括以下步骤：
步骤S101、解剖野生型家蚕Nistari和PSG特异过表达BmFtz-f1(SEQ IDNO.6)转基因家蚕五龄第六天(5L6D)的PSG，并通过1.5mL的离心管收集。
步骤S102、将解剖并收集的PSG进行基因组的提取，提取方法见步骤S52。
步骤S103、基因组PCR：
具体步骤见步骤S53，在BmFtz-f1(SEQ ID NO.6)两端设计引物，通过基因组PCR进行扩增，扩增结果通过核酸凝胶电泳显示，结果如图4。结果证明过表达BmFtz-f1(SEQ IDNO.6)转基因家蚕制作成功。
本发明涉及的基因序列如下：
SEQ ID NO.1 BmECRA序列
atgggtaagcctatccctaaccctctcctcggtctcgattctacggagctgaaacacgaggtggcgtaccgcggcgtgctgcccggccaggtgaaggccgagcctggcgtcagtcacaacggccatccggtcaacggacacgtccgggactggatggcggggggagctgcgggcgggggttcgccctccccaggcgcgccgggacaaccgcagcccagcaacggatactcgtcgccactatcctcaggcagctacggtccgtacagccctaatggaaaaatagcctgctctcccgttcttcatcaaataggtcgagaggaactttcgccggcttcaagcataaatggctgcagtgctgatgctgacgccagacggcagaagaaaggtcctgcacctcgacagcaagaggagctatgtcttgtctgcggcgacagagcctccggataccactacaacgcactgacgtgtgaaggatgcaaaggattcttcaggcggagtgtcaccaaaaacgcagtatatatttgtaaatttggacatgcctgtgaaatggatatgtacatgaggaggaaatgtcaagagtgtcgattaaagaaatgtctagcggtaggaatgaggcctgaatgtgtcatacaggagcccagtaaaaataaagacaggcaaagacaaaagaaagacaaaggaatattattacctgttagtacgaccacagtcgaagaccacatgcccccgatcatgcaatgtgatccacctccgcccgaggccgccaggattcacgaagtcgtcccgaggtatctttcggagaagctgatggagcagaacaggcagaagaacataccaccattgtcggcgaatcagaagtctctgatcgcgaggctcgtgtggtaccaggagggatatgagcagccctcttacgaggatctcaaaagagtaacgcagacttggcagtcggatgaagaggacgaggaatccgatctagaacacgctgtatctaatttcatgatgagaatgtgcgaaatgaaaattcacgtgatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaa
SEQ ID NO.2 BmUSP序列
atgtacccatacgacgtcccagactacgcttcgagcgtggcgaagaaagataaaccgacaatgtcggtaactgcgttgatcaatagggcgtggccaatgacgcctagcccacagcagcagcagcagatggtgccgtctacacagcattcgaatttcctgcagccaatggctacgccttcaaccacacccaatgttgaactcgatatacaatggctgaacatagagtcagggtttatgtcgcctatgtcaccgcccgaaatgaagccagatacggcgatgctcgacggtttccgagacgactcgacgccgccccctcccttcaagaattatccccctaaccatcccttgagcggctcaaaacatctatgctccatatgtggtgacagagcctcgggcaaacattacggagtatacagttgtgaaggctgcaaagggttcttcaagaggacagtcaggaaggatctcacatacgcgtgccgggaggacaagaattgtataatagataaacgccagcggaatcgttgccagtactgccgataccagaagtgtctcgcttgcggcatgaagagggaggctgtgcaagaggagagacagcgagccgcgaggggtacagaagacgcccatcccagcagctctgtacaggagctatcgatcgagcggctgctggaattggaggcgttagttgcggattcagctgaggagttacagatcctacgtgtcggtcccgaaagcggcgtaccggccaagtaccgagcccccgtctcgagtctttgtcaaataggcaacaaacagatagccgctctcattgtttgggcgcgtgacattccacacttcgggcagctagaaatcgacgatcagatccttctaatcaagggctcctggaacgaactgctgctgttcgctatcgcatggcggtctatggagttcctgaatgatgaaagagagaacgtagactcgcggaatacggcgccgcctcaactcatttgtttaatgccaggcatgacgctgcaccgcaactccgcgctgcaggccggcgtggggcagatcttcgaccgcgtgctctccgagctgtcgctcaagatgcgctccctccgcatggaccaggccgagtacgtcgcgctcaaggccatcatactcctcaatcctgacgtaaaaggattgaagaataaacaagaagtggacgttcttcgagaaaagatgttcttatgcctggacgagtactgccggcgctcgcgcggcggggaggagggtcggttcgcggcgctgctgctgcggctgccggcgctgcgctccatctcgctcaagagcttcgagcacctctacctgttccacctcgtggccgagggcagcgtgagctcgtacatccgcgacgcgctctgcaaccacgcgccgcccatcgacaccaacatcatgatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaa
SEQ ID NO.3 BmE74序列
atgccatttattgaagacgagtggtggtccgccgagaatgagggcagaatggtcgatctctcaaattgccttcagggacagtttcaggacgcggtagtggctgccggcggtcaggcggcggcccagcttcagcagatggcctcgtcactaggcgagctgtcgcaggccgagctgtccaacatcgtgggcggcctcaccctggagccggagagctctgaagcggcagaccccgacgacatcctgaagcagctcggggagaccgcgttcgacaacttcgatacgtttttcacggatctcactaacgccaccgcttcgggcgcaccacctatcgagataaagcaagaagagaacaacaacatatcgtcgccagcgtccagcagtcaactgcaagggtactaccctcaaagtcaattacatttacaaaacaacgggcagcaaagattgcagcaactccttagatcgggcaccaacgccattaacaatgccgttaataataacattaacaatggaagatataatattgcgtcgcaaaatccgttgctcgccgagaaattatcttcaacgcccagcggcatcaagcaagaaccagtcagttcagagtacacggggacgagtatgaactatggaagtgcatcgccgttgcagcgagtgccgagcgggaaaccgcaagctcacgacgctggtggagtgaatggagaaccaacaggactggccctcggagccagagcgctgctgcacggtctcctggcgccctcaccctcggtcaggcaccatcccctgtacacggcgcccaacacaggctccctcccaccttcgccagcggacagtggggtatcggatgtggagtcgtcctcgtccggagcaggttccgctgaggacctgaagacgaggcttcaacctcccccgccggcgcccttccacgcccccttcctgcccttctaccagcatcatcagatcgcttccacattgcagcacgccgctgcacatcctcgaccaccagtgggagcgttgagcgatcgtgacgcatatggatatggttacggcggcgggggaggcgggactcaccacttcgcagcgcctgcgcccccgccgctgccgcacgacgagctgccatactccgtattcgacttcggcgactaccagcgccaccatcatcacaacaaactgaagccgaagaaaaggcctcgctccgatgcacctcccacgccgggcgtcaagcgcaagagccgggagggctccaccacgtacctgtgggagttcctgctgaagctgctgcaggaccgcgagtactgcccgcgcttcatcaagtggacgaaccgcgagaagggcgtgttcaagctggtcgactcgaaggcggtgtcgcgactctggggcctgcacaagaacaagccagacatgaactacgagaccatgggccgcgccctgcgctattactaccagcgcggcatcctcgctaaggtggacggccagcgcctcgtctaccagttcgtggacgtgcccaaggacatcgtcgagatcgactgttcgttggcg
SEQ ID NO.4 BmHR4序列
atgacctccacaatgggaataatgacacttagccgcgggccgtgtgacctcgacaacatgagtctatttcaagacctcaaactaaagaggcggaaagttgactccagatgtagcagcgatggcgagtcggcggccgacaccagcacttcgtcacctgacccaggaccgccttcgccgcgtatgtctgaagccgggtgcagcacgccgccgcacccgccgcccgtgttcgatggcggtggctctccgtcaccttcacccgcttgccatcccaccgttatacgctcggcgccaccctactcagtcatcaagtttgaaggtgcacaatccgctgtcaaagcagaaagttcgcctgcgagtggaaaaaaccagcccacaacgcagtctcagttgtcttcagtgaagttggaaagcgcaccgcaagaatcaccacaaccgttcagaccacgtaccctcgtaccgcctccgcctggagttcacgctaatctatcaccaggacattggccgccggccgcttgtataaatggtgttaaacctgaacttataggcggaaattttccaccacagccgattgaaaataaaccaggtgcgcgtggacaaacacaatggagaggtactcctgctgttataatgggcgaatccggaggtgtccgaacaatgttctggaccttaccagcgcctagttcaagtagtgagcctgcagccagtgcttcgcatacttcatccacgccttctcctgatccagcttcatgcagtgaggagtcagcagcgaggctattactcaatttaggtggcgagttacgacgacctagagggccaccattgaacatggaactactctgggccggagacgtgtcccagctccctgctcaccaacaaattcatgcgttaaatctgagcgccgctgccggaagcatcgcgggttcttctccaatggcaggtgctagttccttagcgttacccagaccagaactgcgtacatatgcaccagagactgaacgcgatgaagacgaacaaccaatgatatgcatgatttgcgaagacaaagcgactggactgcattacggcataattacttgtgaaggctgtaagggatttttcaaacgaactgtccaaaacagaagggtttacacgtgcgtcgctgacggtggctgtgaaattacaaaggcacaaagaaatagatgccagtattgtagattcaaaaaatgtattgaacaaggaatggttctacaagctgtacgagaggacaggatgcctggtgggaggaacagtggagctgtttacaatttatacaaagtgaaatataagaagaacaagaaagccaacaaaacagctacggctacaagtcgagcttcgccaccagaaaaacctaaagaacccttacccccactcccaccgcatttggtcaatggtaccatacttaagactgcactaacaaatcccagcgaggttgttcatttgagagcaaggcttgaaagtgccgtgtcgtcgtcacgagatcgagccgtccctttggacagggcgctgcacatgattcgcgctctgattgactgtgacgctatggaagacattgcgacagtacgacacctccctgacttgcttcatgacacttcggaaataagcgacaaattgtgtaagatcggtgattctattgtgcacaaaatggtagcgtggacgaaaaaactaccgttcattatggaaatccctatggaaatacactcaaaattattaatggaaaagtggcatgagatctcagtattaacgacagcggcgtatcaagcgatgcacggaaagcagacccacgctcctccctcgtcagatcacgaacaggactttatgcaagaggtaaacgccaacctccggacattgcagaattgcttgacgtcacttatgggcaggcccattacgctggagcagttgcgattggatgtaggacttgtcgtggaaaagatgacgcagataacctgtgttttccgtcgcatacagctccgaatggaggaatacgtctgcctcaaagtctatatactgcttaatcaagaagtcgaactcgagggaatccaggaccgctacgtgcaagtactacgcagctaccttgaacacgccaacccgcaccatccgggcaggctacaggaactgttcgccagaatcccagagatccaggcggcggctaacttgctcctcgagagcaaaatgttctacgttccgttcgtgctgaactcggcggagatcaga
SEQ ID NO.5 BmHR3序列
atgttgaacatgtttgatatgtggaactctgtgagcaagctggaggcgcagtccaatgtgcagcaaagccaacagccacacacttcaggtgggagcattaaagcccaaatcgagataataccgtgcaaggtatgcggagataaatcgtcgggggtgcactatggcgtgatcacctgcgagggatgcaaaggattcttcagacgatcccagagcacagtggtgaactaccagtgtcctcgcaacaaggcctgcgtcgtggacagggtcaaccgcaaccgatgccagtactgcagactacagaagtgcctcaaactcggcatgagtcgtgatgccgtgaaattcggtcgcatgtcgaagaagcagcgagagaaggtcgaggacgaggtcagataccacaaggcgcagatgcgggtgcaggctgatgcggcgccggactccgtgtacgacgcccagcagcagacgcccagctcgagcgaccagttccacgggcattataacagctacccaggatacgggtcgccgttgtcttcgtatggctacaacaacgccgggccagcgctaccctcgaacatgagcgggatgcagccgcagcccccagcccagcccccgtacgaggtctcaggcgactacgtggactccacaacgacatacgagcccaaacagacagggttcttggacgcagacttcataagtcacgtggagggtgacattagcaaggtgctagtgaaaagtttgacagaggcgcacgcgaatacaaatccgaagctggattacatacatgagatgttcggcaagccccaggatgtttctaagctcttgttctataactccatgacctacgaggagatgtggttggactgcgccgacaagctcaccgcgatgatccagaacatcattgagttcgcgaaactcatacctggtttcatgaagctcacccaggacgatcaaatactgctgcttaaatcaggttcgttcgagttggcgatcgtccgcctgtcgcggctaatcgacgtgaaccgcgaccaggtgctctacggagacgtggtgctacccgtgcgggagtgcgtgcacgcgcgcgatcccagagacgtagctctggtgcaaggaatctttgaggctgccaagagcatcgctcgactgaagctgaccgagactgaactggctctataccagagccttgtgctcctgtggccagagcgtcacggcgtgatgggcaactcggagatcagatgtctcttcaacatgtccatgtcggcgatgcggcatgagatcgaggtcaaccacgcgccgctcaagggtgacgtcaccgtgctggatacactcctggccaagatacccactttcagagatctctccctgatgcacctcggagcgctgagccgtttcaaagcgacgcatccgcatcacgttttcccagctttatacaaagaattgttctctttagacagtgttttagattacacgcacgga
SEQ ID NO.6 BmFtz-f1序列
atgcacgaagacgctccaaaaatgagtatagcgcaaagtctggccgcctccacgagccagccaaaaggtgatatcgttacagaaattcccctggaattcgccatgagctctatggagacaaaatctatcgaaacaaccaacgtggagttgaaaattacctacgtagatcctacaactggcactggaggtgaaccaggagcgtatctgccgacagcaggaacagtttgcgaccaaactgataccaaggatgtaatagaagaattgtgtcccgtctgtggagacaaagtcagcggctaccactatggattgctgacgtgcgaatcctgcaaaggtttcttcaaaagaaccgttcagaacaagaaggtttatacatgcgtcgccgaaagagcctgccacatagacaaaactcaacggaaacgctgtcccttttgccgtttccagaaatgtcttgatgtgggcatgaaacttgaagcggttcgagcagatcgtatgcgcggtggtcgcaataaatttggccctatgtacaaacgagaccgtgcccgtaaactacaaatgatgcgtcagcgacaaatcgccgttcagactctgcgcggttctctaggggacggtggattagtccttggttttggttctccgtacacagctgtatccgttaaacaagagatacagattccgcaagtatcatcattgacgtcctcgcctgagtcgtcgccgggaccagcgctccttggggctcagccacagccgccgcagccacctccaccaccaactcacgacaagtgggaagcccactcaccacactcggcgtcgccggatgctttcacgttcgatacacaatcgaacaccgccgctacaccatccagcacagccgaagctactagcactgaaactttacgagtttctccaatgatcagagaattcgtacaaaccgtcgatgaccgcgagtggcagaatgcactgttcggactcttacaaagccaaacatataaccagtgcgaagtagatctcttcgagttaatgtgcaaagtgctggaccaaaatttattctctcaagtggattgggcaagaaacacagtgttctttaagtatttaaaggttgatgaccaaatgaaacttctacaggactcatggtctgttatgctggttttggatcatttacaccagagaatgcacaatggtctgccagacgagaccacactccacaacgggcagaagtttgacctgctctgtttggggctacttggagttccttcattagccgaccacttcaatgaattacagaataaactagcagaattgaaattcgacgttccagattacatatgcgttaaattcatgcttcttctcaatcccgaggttaggggtatcgtaaacgtgaagtgcgttcgtgaaggttaccaaacagtacaagccgcccttcttgactacactcttacctgctatccaacgatacaggataagtttggaaaacttgtaatggtagtgccagagatacacgctttagcggctcggggagaagagcacctgtaccagcggcattgtgcaggccaggcacctacccagactcttctcatggaaatgctgcacgcaaaacgcaaatctgactacaaggacgacgacgacaagtga
SEQ ID NO.7家蚕fibH基因启动子序列
cctgcgtgatcaggaaaaatgtggaaagcttaacgattttgtcacattttacttatcacaacttgtttttataataattcgcttaaatgagcagctattacttaatctcgtagtggtttttgacaaaatcagcttctttagaactaaaatatcatttttttcgtaatttttttaatgaaaaatgctctagtgttatacctttccaaaatcaccattaattaggtagtgtttaagcttgttgtacaaaactgccacacgcatttttttctccactgtaggttgtagttacgcgaaaacaaaatcgttctgtgaaaattcaaacaaaaatattttttcgtaaaaacacttatcaatgagtaaagtaacaattcatgaataatttcatgtaaaaaaaaaatactagaaaaggaatttttcattacgagatgcttaaaaatctgtttcaaggtagagatttttcgatatttcggaaaattttgtaaaactgtaaatccgtaaaattttgctaaacatatattgtgttgttttggtaagtattgacccaagctatcacctcctgcagtatgtcgtgctaattactggacacattgtataacagttccactgtattgacaataataaaacctcttcattgacttgagaatgtctggacagatttggctttgtatttttgatttacaaatgtttttttggtgatttacccatccaaggcattctccaggatggttgtggcatcacgccgattggcaaacaaaaactaaaatgaaactaaaaagaaacagtttccgctgtcccgttcctctagtgggagaaagcatgaagtaagttctttaaatattacaaaaaaattgaacgatattataaaattctttaaaatattaaaagtaagaacaataagatcaattaaatcataattaatcacattgttcatgatcacaatttaatttacttcatacgttgtattgttatgttaaataaaaagattaatttctatgtaattgtatctgtacaatacaatgtgtagatgtttattctatcgaaagtaaatacgtcaaaactcgaaaattttcagtataaaaaggttcaactttttcaaatcagcatcagttcggttccaactctcaag
SEQ ID NO.8 GAl4BD基因序列
atgaaactgctctcatcaatcgaacaggcctgtgacatttgtagactcaaaaaactcaaatgctccaaggagaaacccaaatgtgccaaatgcctgaaaaacaactgggagtgccggtactctcctaaaaccaaacggagccctctcacacgggcccatctcactgaagtggaatctcgactcgaacggctcgaacagctctttctgctcatctttcctagagaggatctcgacatgatcctgaaaatggatagcctccaggacatcaaagccctgctcactggactgtttgtccaggataacgtgaacaaggacgccgtgaccgataggctggcatccgtggaaaccgatatgccactcacactgagacagcaccggattagtgccacatcttcttccgaggagtcatccaataagggacagcgacagctcaccgtgtca
SEQ ID NO.9蛋白激活结构域VP16序列
tgcaccgcccctattaccgatgtgtctctgggcgacgaactccggctggatggcgaggaagtcgatatgacccctgccgacgctctcgacgatttcgacctggaaatgctgggagatgtcgaatctccttctcctggcatgacacacgatcccgtgtcttacggagcactggatgtgtaa
SEQ ID NO.10终止信号Ser1-poly A序列
tacaactaaacacgacttggagtattccttgtagtgtttaagattttaaatcttacttaatgacttcgaacgattttaacgataactttctctttgtttaactttaatcagcatacataaaaagccccggttttgtatcgggaagaaaaaaaatgtaattgtgttgcctagataataaacgtattatcaaagtgtgtggttttcctttaccaaagacccctttaagatgggcctaatgggcttaagtcgagtcctttccgatgtgttaaatacacatttattacactgatgcgtcgaatgtacacttttaataggatagctccactaaaaattattttatttatttaatttgttgcaccaaaactgatacattgacgaa
SEQ ID NO.11 3×P3-DsRed序列
gcaaagtgaacacgtcgctaagcgaaagctaagcaaataaacaagcgcagctgaacaagctaaacaatcggggtaccgctagagtcgacggtaccgcgggcccgggatccaccggtcgccaccatggtgcgctcctccaagaacgtcatcaaggagttcatgcgcttcaaggtgcgcatggagggcaccgtgaacggccacgagttcgagatcgagggcgagggcgagggccgcccctacgagggccacaacaccgtgaagctgaaggtgaccaagggcggccccctgcccttcgcctgggacatcctgtccccccagttccagtacggctccaaggtgtacgtgaagcaccccgccgacatccccgactacaagaagctgtccttccccgagggcttcaagtgggagcgcgtgatgaacttcgaggacggcggcgtggtgaccgtgacccaggactcctccctgcaggacggctgcttcatctacaaggtgaagttcatcggcgtgaacttcccctccgacggccccgtaatgcagaagaagaccatgggctgggaggcctccaccgagcgcctgtacccccgcgacggcgtgctgaagggcgagatccacaaggccctgaagctgaaggacggcggccactacctggtggagttcaagtccatctacatggccaagaagcccgtgcagctgcccggctactactacgtggactccaagctggacatcacctcccacaacgaggactacaccatcgtggagcagtacgagcgcaccgagggccgccaccacctgttcctgtagtcataatcagccataccacatttgtag
SEQ ID NO.12 piggyBac右臂
ccctagaaagataatcatattgtgacgtacgttaaagataatcatgcgtaaaattgacgcatgtgttttatcggtctgtatatcgaggtttatttattaatttgaatagatattaagttttattatatttacacttacatactaataataaattcaacaaacaatttatttatgtttatttatttattaaaaaaaaacaaaaactcaaaatttcttctataaagtaacaaaacttttaaacattctctcttttacaaaaataaacttattttgtactttaaaaacagtcatgttgtattataaaataagtaattagcttaacttatacataatagaaacaaattatacttattagtcagtcagaaacaactttggcacatatcaatattatgctctcgacaaataacttttttgcattttttgcacgatgcatttgcctttcgccttattttagaggggcagtaagtacagtaagtacgttttttcattactggctcttcagtactgtcatctgatgtaccaggcacttcatttggcaaaatattagagatattatcgcgcaaatatctcttcaaagtaggagcttctaaacgcttacgcataaacgatgacgtcaggctcatgtaaaggtttctcataaattttttgcgactttggaccttttctcccttgctactgacattatggctgtatataataaaagaatttatgcaggcaatgtttatcattccgtacaataatgccataggccacctattcgtcttcctactgcaggtcatcacagaacacatttggtctagcgtgtccactccgcctttagtttgattataatacataaccatttgcggtttaccggtactttcgttgatagaagcatcctcatcacaagatgataataagtataccatcttagctggcttcggtttatatgagacgagagtaaggggtccgtcaaaacaaaacatcgatgttcccactggcctggagcgactgtttttcagtacttccggtatctcgcgtttgtttgatcgcacggttcccacaatggttt
SEQ ID NO.13 piggyBac左臂
agatctgacaatgttcagtgcagagactcggctacgcctcgtggactttgaagttgaccaacaatgtttattcttacctctaatagtcctctgtggcaaggtcaagattctgttagaagccaatgaagaacctggttgttcaataacattttgttcgtctaatatttcactaccgcttgacgttggctgcacttcatgtacctcatctataaacgcttcttctgtatcgctctggacgtcatcttcacttacgtgatctgatatttcactgtcagaatcctcaccaacaagctcgtcatcgctttgcagaagagcagagaggatatgctcatcgtctaaagaactacccattttattatatattagtcacgatatctataacaagaaaatatatatataataagttatcacgtaagtagaacatgaaataacaatataattatcgtatgagttaaatcttaaaagtcacgtaaaagataatcatgcgtcattttgactcacgcggtcgttatagttcaaaatcagtgacacttaccgcattgacaagcacgcctcacgggagctccaagcggcgactgagatgtcctaaatgcacagcgacggattcgcgctatttagaaagagagagcaatatttcaagaatgcatgcgtcaattttacgcagactatctttctaggg
SEQ ID NO.14 10×UAS序列
cggagtactgtcctccgagcggagtactgtcctccgagcggagtactgtcctccgagcggagtactgtcctccgagcggagtactgtcctccgagcggaagcttgcatgcctgcaggtcggagtactgtcctccgagcggagtactgtcctccgagcggagtactgtcctccgagcggagtactgtcctccgagcggagtactgtcctccgagcggagactctagcgagcgccggagtataaatagaggcgcttcgtctacggagcgacaattcaattcaaacaagcaaagtgaacacgtcgctaagcgaaagctaagcaaataaacaagcgcagctgaacaagctaaacaatctgcagtaaagtgcaagttaaagtgaatcaattaaaagtaaccagcaaccaagtaaatcaactgcaactactgaaatctgccaagaagtaattattgaatacaagaagagaactctgaatagggaattgg
SEQ ID NO.15 3×P3-ECFP序列
gcaaagtgaacacgtcgctaagcgaaagctaagcaaataaacaagcgcagctgaacaagctaaacaatcggggtaccgctagagtcgacggtacgatccaccggtcgccaccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctggggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacatcagccacaacgtctatatcaccgccgacaagcagaagaacggcatcaaggccaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaaactctagatcataatcagccataccacatttgtag
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 西南大学
<120> 一种通过特异上调家蚕蜕皮激素应答因子制备转基因丝胶茧的方法及其家蚕品种
<141> 2022-03-04
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1749
<212> DNA
<213> 家蚕(Bombyx mori)
<400> 1
atgggtaagc ctatccctaa ccctctcctc ggtctcgatt ctacggagct gaaacacgag 60
gtggcgtacc gcggcgtgct gcccggccag gtgaaggccg agcctggcgt cagtcacaac 120
ggccatccgg tcaacggaca cgtccgggac tggatggcgg ggggagctgc gggcgggggt 180
tcgccctccc caggcgcgcc gggacaaccg cagcccagca acggatactc gtcgccacta 240
tcctcaggca gctacggtcc gtacagccct aatggaaaaa tagcctgctc tcccgttctt 300
catcaaatag gtcgagagga actttcgccg gcttcaagca taaatggctg cagtgctgat 360
gctgacgcca gacggcagaa gaaaggtcct gcacctcgac agcaagagga gctatgtctt 420
gtctgcggcg acagagcctc cggataccac tacaacgcac tgacgtgtga aggatgcaaa 480
ggattcttca ggcggagtgt caccaaaaac gcagtatata tttgtaaatt tggacatgcc 540
tgtgaaatgg atatgtacat gaggaggaaa tgtcaagagt gtcgattaaa gaaatgtcta 600
gcggtaggaa tgaggcctga atgtgtcata caggagccca gtaaaaataa agacaggcaa 660
agacaaaaga aagacaaagg aatattatta cctgttagta cgaccacagt cgaagaccac 720
atgcccccga tcatgcaatg tgatccacct ccgcccgagg ccgccaggat tcacgaagtc 780
gtcccgaggt atctttcgga gaagctgatg gagcagaaca ggcagaagaa cataccacca 840
ttgtcggcga atcagaagtc tctgatcgcg aggctcgtgt ggtaccagga gggatatgag 900
cagccctctt acgaggatct caaaagagta acgcagactt ggcagtcgga tgaagaggac 960
gaggaatccg atctagaaca cgctgtatct aatttcatga tgagaatgtg cgaaatgaaa 1020
attcacgtga tggtgagcaa gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc 1080
gagctggacg gcgacgtaaa cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat 1140
gccacctacg gcaagctgac cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc 1200
tggcccaccc tcgtgaccac cctgacctac ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgac 1260
cacatgaagc agcacgactt cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc 1320
accatcttct tcaaggacga cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc 1380
gacaccctgg tgaaccgcat cgagctgaag ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc 1440
ctggggcaca agctggagta caactacaac agccacaacg tctatatcat ggccgacaag 1500
cagaagaacg gcatcaaggt gaacttcaag atccgccaca acatcgagga cggcagcgtg 1560
cagctcgccg accactacca gcagaacacc cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc 1620
gacaaccact acctgagcac ccagtccgcc ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat 1680
cacatggtcc tgctggagtt cgtgaccgcc gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg 1740
tacaagtaa 1749
<210> 2
<211> 2133
<212> DNA
<213> 家蚕(Bombyx mori)
<400> 2
atgtacccat acgacgtccc agactacgct tcgagcgtgg cgaagaaaga taaaccgaca 60
atgtcggtaa ctgcgttgat caatagggcg tggccaatga cgcctagccc acagcagcag 120
cagcagatgg tgccgtctac acagcattcg aatttcctgc agccaatggc tacgccttca 180
accacaccca atgttgaact cgatatacaa tggctgaaca tagagtcagg gtttatgtcg 240
cctatgtcac cgcccgaaat gaagccagat acggcgatgc tcgacggttt ccgagacgac 300
tcgacgccgc cccctccctt caagaattat ccccctaacc atcccttgag cggctcaaaa 360
catctatgct ccatatgtgg tgacagagcc tcgggcaaac attacggagt atacagttgt 420
gaaggctgca aagggttctt caagaggaca gtcaggaagg atctcacata cgcgtgccgg 480
gaggacaaga attgtataat agataaacgc cagcggaatc gttgccagta ctgccgatac 540
cagaagtgtc tcgcttgcgg catgaagagg gaggctgtgc aagaggagag acagcgagcc 600
gcgaggggta cagaagacgc ccatcccagc agctctgtac aggagctatc gatcgagcgg 660
ctgctggaat tggaggcgtt agttgcggat tcagctgagg agttacagat cctacgtgtc 720
ggtcccgaaa gcggcgtacc ggccaagtac cgagcccccg tctcgagtct ttgtcaaata 780
ggcaacaaac agatagccgc tctcattgtt tgggcgcgtg acattccaca cttcgggcag 840
ctagaaatcg acgatcagat ccttctaatc aagggctcct ggaacgaact gctgctgttc 900
gctatcgcat ggcggtctat ggagttcctg aatgatgaaa gagagaacgt agactcgcgg 960
aatacggcgc cgcctcaact catttgttta atgccaggca tgacgctgca ccgcaactcc 1020
gcgctgcagg ccggcgtggg gcagatcttc gaccgcgtgc tctccgagct gtcgctcaag 1080
atgcgctccc tccgcatgga ccaggccgag tacgtcgcgc tcaaggccat catactcctc 1140
aatcctgacg taaaaggatt gaagaataaa caagaagtgg acgttcttcg agaaaagatg 1200
ttcttatgcc tggacgagta ctgccggcgc tcgcgcggcg gggaggaggg tcggttcgcg 1260
gcgctgctgc tgcggctgcc ggcgctgcgc tccatctcgc tcaagagctt cgagcacctc 1320
tacctgttcc acctcgtggc cgagggcagc gtgagctcgt acatccgcga cgcgctctgc 1380
aaccacgcgc cgcccatcga caccaacatc atgatggtga gcaagggcga ggagctgttc 1440
accggggtgg tgcccatcct ggtcgagctg gacggcgacg taaacggcca caagttcagc 1500
gtgtccggcg agggcgaggg cgatgccacc tacggcaagc tgaccctgaa gttcatctgc 1560
accaccggca agctgcccgt gccctggccc accctcgtga ccaccctgac ctacggcgtg 1620
cagtgcttca gccgctaccc cgaccacatg aagcagcacg acttcttcaa gtccgccatg 1680
cccgaaggct acgtccagga gcgcaccatc ttcttcaagg acgacggcaa ctacaagacc 1740
cgcgccgagg tgaagttcga gggcgacacc ctggtgaacc gcatcgagct gaagggcatc 1800
gacttcaagg aggacggcaa catcctgggg cacaagctgg agtacaacta caacagccac 1860
aacgtctata tcatggccga caagcagaag aacggcatca aggtgaactt caagatccgc 1920
cacaacatcg aggacggcag cgtgcagctc gccgaccact accagcagaa cacccccatc 1980
ggcgacggcc ccgtgctgct gcccgacaac cactacctga gcacccagtc cgccctgagc 2040
aaagacccca acgagaagcg cgatcacatg gtcctgctgg agttcgtgac cgccgccggg 2100
atcactctcg gcatggacga gctgtacaag taa 2133
<210> 3
<211> 1533
<212> DNA
<213> 家蚕(Bombyx mori)
<400> 3
atgccattta ttgaagacga gtggtggtcc gccgagaatg agggcagaat ggtcgatctc 60
tcaaattgcc ttcagggaca gtttcaggac gcggtagtgg ctgccggcgg tcaggcggcg 120
gcccagcttc agcagatggc ctcgtcacta ggcgagctgt cgcaggccga gctgtccaac 180
atcgtgggcg gcctcaccct ggagccggag agctctgaag cggcagaccc cgacgacatc 240
ctgaagcagc tcggggagac cgcgttcgac aacttcgata cgtttttcac ggatctcact 300
aacgccaccg cttcgggcgc accacctatc gagataaagc aagaagagaa caacaacata 360
tcgtcgccag cgtccagcag tcaactgcaa gggtactacc ctcaaagtca attacattta 420
caaaacaacg ggcagcaaag attgcagcaa ctccttagat cgggcaccaa cgccattaac 480
aatgccgtta ataataacat taacaatgga agatataata ttgcgtcgca aaatccgttg 540
ctcgccgaga aattatcttc aacgcccagc ggcatcaagc aagaaccagt cagttcagag 600
tacacgggga cgagtatgaa ctatggaagt gcatcgccgt tgcagcgagt gccgagcggg 660
aaaccgcaag ctcacgacgc tggtggagtg aatggagaac caacaggact ggccctcgga 720
gccagagcgc tgctgcacgg tctcctggcg ccctcaccct cggtcaggca ccatcccctg 780
tacacggcgc ccaacacagg ctccctccca ccttcgccag cggacagtgg ggtatcggat 840
gtggagtcgt cctcgtccgg agcaggttcc gctgaggacc tgaagacgag gcttcaacct 900
cccccgccgg cgcccttcca cgcccccttc ctgcccttct accagcatca tcagatcgct 960
tccacattgc agcacgccgc tgcacatcct cgaccaccag tgggagcgtt gagcgatcgt 1020
gacgcatatg gatatggtta cggcggcggg ggaggcggga ctcaccactt cgcagcgcct 1080
gcgcccccgc cgctgccgca cgacgagctg ccatactccg tattcgactt cggcgactac 1140
cagcgccacc atcatcacaa caaactgaag ccgaagaaaa ggcctcgctc cgatgcacct 1200
cccacgccgg gcgtcaagcg caagagccgg gagggctcca ccacgtacct gtgggagttc 1260
ctgctgaagc tgctgcagga ccgcgagtac tgcccgcgct tcatcaagtg gacgaaccgc 1320
gagaagggcg tgttcaagct ggtcgactcg aaggcggtgt cgcgactctg gggcctgcac 1380
aagaacaagc cagacatgaa ctacgagacc atgggccgcg ccctgcgcta ttactaccag 1440
cgcggcatcc tcgctaaggt ggacggccag cgcctcgtct accagttcgt ggacgtgccc 1500
aaggacatcg tcgagatcga ctgttcgttg gcg 1533
<210> 4
<211> 2229
<212> DNA
<213> 家蚕(Bombyx mori)
<400> 4
atgacctcca caatgggaat aatgacactt agccgcgggc cgtgtgacct cgacaacatg 60
agtctatttc aagacctcaa actaaagagg cggaaagttg actccagatg tagcagcgat 120
ggcgagtcgg cggccgacac cagcacttcg tcacctgacc caggaccgcc ttcgccgcgt 180
atgtctgaag ccgggtgcag cacgccgccg cacccgccgc ccgtgttcga tggcggtggc 240
tctccgtcac cttcacccgc ttgccatccc accgttatac gctcggcgcc accctactca 300
gtcatcaagt ttgaaggtgc acaatccgct gtcaaagcag aaagttcgcc tgcgagtgga 360
aaaaaccagc ccacaacgca gtctcagttg tcttcagtga agttggaaag cgcaccgcaa 420
gaatcaccac aaccgttcag accacgtacc ctcgtaccgc ctccgcctgg agttcacgct 480
aatctatcac caggacattg gccgccggcc gcttgtataa atggtgttaa acctgaactt 540
ataggcggaa attttccacc acagccgatt gaaaataaac caggtgcgcg tggacaaaca 600
caatggagag gtactcctgc tgttataatg ggcgaatccg gaggtgtccg aacaatgttc 660
tggaccttac cagcgcctag ttcaagtagt gagcctgcag ccagtgcttc gcatacttca 720
tccacgcctt ctcctgatcc agcttcatgc agtgaggagt cagcagcgag gctattactc 780
aatttaggtg gcgagttacg acgacctaga gggccaccat tgaacatgga actactctgg 840
gccggagacg tgtcccagct ccctgctcac caacaaattc atgcgttaaa tctgagcgcc 900
gctgccggaa gcatcgcggg ttcttctcca atggcaggtg ctagttcctt agcgttaccc 960
agaccagaac tgcgtacata tgcaccagag actgaacgcg atgaagacga acaaccaatg 1020
atatgcatga tttgcgaaga caaagcgact ggactgcatt acggcataat tacttgtgaa 1080
ggctgtaagg gatttttcaa acgaactgtc caaaacagaa gggtttacac gtgcgtcgct 1140
gacggtggct gtgaaattac aaaggcacaa agaaatagat gccagtattg tagattcaaa 1200
aaatgtattg aacaaggaat ggttctacaa gctgtacgag aggacaggat gcctggtggg 1260
aggaacagtg gagctgttta caatttatac aaagtgaaat ataagaagaa caagaaagcc 1320
aacaaaacag ctacggctac aagtcgagct tcgccaccag aaaaacctaa agaaccctta 1380
cccccactcc caccgcattt ggtcaatggt accatactta agactgcact aacaaatccc 1440
agcgaggttg ttcatttgag agcaaggctt gaaagtgccg tgtcgtcgtc acgagatcga 1500
gccgtccctt tggacagggc gctgcacatg attcgcgctc tgattgactg tgacgctatg 1560
gaagacattg cgacagtacg acacctccct gacttgcttc atgacacttc ggaaataagc 1620
gacaaattgt gtaagatcgg tgattctatt gtgcacaaaa tggtagcgtg gacgaaaaaa 1680
ctaccgttca ttatggaaat ccctatggaa atacactcaa aattattaat ggaaaagtgg 1740
catgagatct cagtattaac gacagcggcg tatcaagcga tgcacggaaa gcagacccac 1800
gctcctccct cgtcagatca cgaacaggac tttatgcaag aggtaaacgc caacctccgg 1860
acattgcaga attgcttgac gtcacttatg ggcaggccca ttacgctgga gcagttgcga 1920
ttggatgtag gacttgtcgt ggaaaagatg acgcagataa cctgtgtttt ccgtcgcata 1980
cagctccgaa tggaggaata cgtctgcctc aaagtctata tactgcttaa tcaagaagtc 2040
gaactcgagg gaatccagga ccgctacgtg caagtactac gcagctacct tgaacacgcc 2100
aacccgcacc atccgggcag gctacaggaa ctgttcgcca gaatcccaga gatccaggcg 2160
gcggctaact tgctcctcga gagcaaaatg ttctacgttc cgttcgtgct gaactcggcg 2220
gagatcaga 2229
<210> 5
<211> 1470
<212> DNA
<213> 家蚕(Bombyx mori)
<400> 5
atgttgaaca tgtttgatat gtggaactct gtgagcaagc tggaggcgca gtccaatgtg 60
cagcaaagcc aacagccaca cacttcaggt gggagcatta aagcccaaat cgagataata 120
ccgtgcaagg tatgcggaga taaatcgtcg ggggtgcact atggcgtgat cacctgcgag 180
ggatgcaaag gattcttcag acgatcccag agcacagtgg tgaactacca gtgtcctcgc 240
aacaaggcct gcgtcgtgga cagggtcaac cgcaaccgat gccagtactg cagactacag 300
aagtgcctca aactcggcat gagtcgtgat gccgtgaaat tcggtcgcat gtcgaagaag 360
cagcgagaga aggtcgagga cgaggtcaga taccacaagg cgcagatgcg ggtgcaggct 420
gatgcggcgc cggactccgt gtacgacgcc cagcagcaga cgcccagctc gagcgaccag 480
ttccacgggc attataacag ctacccagga tacgggtcgc cgttgtcttc gtatggctac 540
aacaacgccg ggccagcgct accctcgaac atgagcggga tgcagccgca gcccccagcc 600
cagcccccgt acgaggtctc aggcgactac gtggactcca caacgacata cgagcccaaa 660
cagacagggt tcttggacgc agacttcata agtcacgtgg agggtgacat tagcaaggtg 720
ctagtgaaaa gtttgacaga ggcgcacgcg aatacaaatc cgaagctgga ttacatacat 780
gagatgttcg gcaagcccca ggatgtttct aagctcttgt tctataactc catgacctac 840
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ttcgcgaaac tcatacctgg tttcatgaag ctcacccagg acgatcaaat actgctgctt 960
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gaccaggtgc tctacggaga cgtggtgcta cccgtgcggg agtgcgtgca cgcgcgcgat 1080
cccagagacg tagctctggt gcaaggaatc tttgaggctg ccaagagcat cgctcgactg 1140
aagctgaccg agactgaact ggctctatac cagagccttg tgctcctgtg gccagagcgt 1200
cacggcgtga tgggcaactc ggagatcaga tgtctcttca acatgtccat gtcggcgatg 1260
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ctcctggcca agatacccac tttcagagat ctctccctga tgcacctcgg agcgctgagc 1380
cgtttcaaag cgacgcatcc gcatcacgtt ttcccagctt tatacaaaga attgttctct 1440
ttagacagtg ttttagatta cacgcacgga 1470
<210> 6
<211> 1629
<212> DNA
<213> 家蚕(Bombyx mori)
<400> 6
atgcacgaag acgctccaaa aatgagtata gcgcaaagtc tggccgcctc cacgagccag 60
ccaaaaggtg atatcgttac agaaattccc ctggaattcg ccatgagctc tatggagaca 120
aaatctatcg aaacaaccaa cgtggagttg aaaattacct acgtagatcc tacaactggc 180
actggaggtg aaccaggagc gtatctgccg acagcaggaa cagtttgcga ccaaactgat 240
accaaggatg taatagaaga attgtgtccc gtctgtggag acaaagtcag cggctaccac 300
tatggattgc tgacgtgcga atcctgcaaa ggtttcttca aaagaaccgt tcagaacaag 360
aaggtttata catgcgtcgc cgaaagagcc tgccacatag acaaaactca acggaaacgc 420
tgtccctttt gccgtttcca gaaatgtctt gatgtgggca tgaaacttga agcggttcga 480
gcagatcgta tgcgcggtgg tcgcaataaa tttggcccta tgtacaaacg agaccgtgcc 540
cgtaaactac aaatgatgcg tcagcgacaa atcgccgttc agactctgcg cggttctcta 600
ggggacggtg gattagtcct tggttttggt tctccgtaca cagctgtatc cgttaaacaa 660
gagatacaga ttccgcaagt atcatcattg acgtcctcgc ctgagtcgtc gccgggacca 720
gcgctccttg gggctcagcc acagccgccg cagccacctc caccaccaac tcacgacaag 780
tgggaagccc actcaccaca ctcggcgtcg ccggatgctt tcacgttcga tacacaatcg 840
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tctccaatga tcagagaatt cgtacaaacc gtcgatgacc gcgagtggca gaatgcactg 960
ttcggactct tacaaagcca aacatataac cagtgcgaag tagatctctt cgagttaatg 1020
tgcaaagtgc tggaccaaaa tttattctct caagtggatt gggcaagaaa cacagtgttc 1080
tttaagtatt taaaggttga tgaccaaatg aaacttctac aggactcatg gtctgttatg 1140
ctggttttgg atcatttaca ccagagaatg cacaatggtc tgccagacga gaccacactc 1200
cacaacgggc agaagtttga cctgctctgt ttggggctac ttggagttcc ttcattagcc 1260
gaccacttca atgaattaca gaataaacta gcagaattga aattcgacgt tccagattac 1320
atatgcgtta aattcatgct tcttctcaat cccgaggtta ggggtatcgt aaacgtgaag 1380
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tatccaacga tacaggataa gtttggaaaa cttgtaatgg tagtgccaga gatacacgct 1500
ttagcggctc ggggagaaga gcacctgtac cagcggcatt gtgcaggcca ggcacctacc 1560
cagactcttc tcatggaaat gctgcacgca aaacgcaaat ctgactacaa ggacgacgac 1620
gacaagtga 1629
<210> 7
<211> 1126
<212> DNA
<213> 家蚕(Bombyx mori)
<400> 7
cctgcgtgat caggaaaaat gtggaaagct taacgatttt gtcacatttt acttatcaca 60
acttgttttt ataataattc gcttaaatga gcagctatta cttaatctcg tagtggtttt 120
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atcgttctgt gaaaattcaa acaaaaatat tttttcgtaa aaacacttat caatgagtaa 360
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acgagatgct taaaaatctg tttcaaggta gagatttttc gatatttcgg aaaattttgt 480
aaaactgtaa atccgtaaaa ttttgctaaa catatattgt gttgttttgg taagtattga 540
cccaagctat cacctcctgc agtatgtcgt gctaattact ggacacattg tataacagtt 600
ccactgtatt gacaataata aaacctcttc attgacttga gaatgtctgg acagatttgg 660
ctttgtattt ttgatttaca aatgtttttt tggtgattta cccatccaag gcattctcca 720
ggatggttgt ggcatcacgc cgattggcaa acaaaaacta aaatgaaact aaaaagaaac 780
agtttccgct gtcccgttcc tctagtggga gaaagcatga agtaagttct ttaaatatta 840
caaaaaaatt gaacgatatt ataaaattct ttaaaatatt aaaagtaaga acaataagat 900
caattaaatc ataattaatc acattgttca tgatcacaat ttaatttact tcatacgttg 960
tattgttatg ttaaataaaa agattaattt ctatgtaatt gtatctgtac aatacaatgt 1020
gtagatgttt attctatcga aagtaaatac gtcaaaactc gaaaattttc agtataaaaa 1080
ggttcaactt tttcaaatca gcatcagttc ggttccaact ctcaag 1126
<210> 9
<211> 441
<212> DNA
<213> 酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 9
atgaaactgc tctcatcaat cgaacaggcc tgtgacattt gtagactcaa aaaactcaaa 60
tgctccaagg agaaacccaa atgtgccaaa tgcctgaaaa acaactggga gtgccggtac 120
tctcctaaaa ccaaacggag ccctctcaca cgggcccatc tcactgaagt ggaatctcga 180
ctcgaacggc tcgaacagct ctttctgctc atctttccta gagaggatct cgacatgatc 240
ctgaaaatgg atagcctcca ggacatcaaa gccctgctca ctggactgtt tgtccaggat 300
aacgtgaaca aggacgccgt gaccgatagg ctggcatccg tggaaaccga tatgccactc 360
acactgagac agcaccggat tagtgccaca tcttcttccg aggagtcatc caataaggga 420
cagcgacagc tcaccgtgtc a 441
<210> 9
<211> 180
<212> DNA
<213> 人类疱疹病毒2株(human herpesvirus 2)
<400> 9
tgcaccgccc ctattaccga tgtgtctctg ggcgacgaac tccggctgga tggcgaggaa 60
gtcgatatga cccctgccga cgctctcgac gatttcgacc tggaaatgct gggagatgtc 120
gaatctcctt ctcctggcat gacacacgat cccgtgtctt acggagcact ggatgtgtaa 180
<210> 10
<211> 379
<212> DNA
<213> 家蚕(Bombyx mori)
<400> 10
tacaactaaa cacgacttgg agtattcctt gtagtgttta agattttaaa tcttacttaa 60
tgacttcgaa cgattttaac gataactttc tctttgttta actttaatca gcatacataa 120
aaagccccgg ttttgtatcg ggaagaaaaa aaatgtaatt gtgttgccta gataataaac 180
gtattatcaa agtgtgtggt tttcctttac caaagacccc tttaagatgg gcctaatggg 240
cttaagtcga gtcctttccg atgtgttaaa tacacattta ttacactgat gcgtcgaatg 300
tacactttta ataggatagc tccactaaaa attattttat ttatttaatt tgttgcacca 360
aaactgatac attgacgaa 379
<210> 11
<211> 831
<212> DNA
<213> 香菇珊瑚(Discosoma sp)
<400> 11
gcaaagtgaa cacgtcgcta agcgaaagct aagcaaataa acaagcgcag ctgaacaagc 60
taaacaatcg gggtaccgct agagtcgacg gtaccgcggg cccgggatcc accggtcgcc 120
accatggtgc gctcctccaa gaacgtcatc aaggagttca tgcgcttcaa ggtgcgcatg 180
gagggcaccg tgaacggcca cgagttcgag atcgagggcg agggcgaggg ccgcccctac 240
gagggccaca acaccgtgaa gctgaaggtg accaagggcg gccccctgcc cttcgcctgg 300
gacatcctgt ccccccagtt ccagtacggc tccaaggtgt acgtgaagca ccccgccgac 360
atccccgact acaagaagct gtccttcccc gagggcttca agtgggagcg cgtgatgaac 420
ttcgaggacg gcggcgtggt gaccgtgacc caggactcct ccctgcagga cggctgcttc 480
atctacaagg tgaagttcat cggcgtgaac ttcccctccg acggccccgt aatgcagaag 540
aagaccatgg gctgggaggc ctccaccgag cgcctgtacc cccgcgacgg cgtgctgaag 600
ggcgagatcc acaaggccct gaagctgaag gacggcggcc actacctggt ggagttcaag 660
tccatctaca tggccaagaa gcccgtgcag ctgcccggct actactacgt ggactccaag 720
ctggacatca cctcccacaa cgaggactac accatcgtgg agcagtacga gcgcaccgag 780
ggccgccacc acctgttcct gtagtcataa tcagccatac cacatttgta g 831
<210> 12
<211> 1051
<212> DNA
<213> 粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)
<400> 12
ccctagaaag ataatcatat tgtgacgtac gttaaagata atcatgcgta aaattgacgc 60
atgtgtttta tcggtctgta tatcgaggtt tatttattaa tttgaataga tattaagttt 120
tattatattt acacttacat actaataata aattcaacaa acaatttatt tatgtttatt 180
tatttattaa aaaaaaacaa aaactcaaaa tttcttctat aaagtaacaa aacttttaaa 240
cattctctct tttacaaaaa taaacttatt ttgtacttta aaaacagtca tgttgtatta 300
taaaataagt aattagctta acttatacat aatagaaaca aattatactt attagtcagt 360
cagaaacaac tttggcacat atcaatatta tgctctcgac aaataacttt tttgcatttt 420
ttgcacgatg catttgcctt tcgccttatt ttagaggggc agtaagtaca gtaagtacgt 480
tttttcatta ctggctcttc agtactgtca tctgatgtac caggcacttc atttggcaaa 540
atattagaga tattatcgcg caaatatctc ttcaaagtag gagcttctaa acgcttacgc 600
ataaacgatg acgtcaggct catgtaaagg tttctcataa attttttgcg actttggacc 660
ttttctccct tgctactgac attatggctg tatataataa aagaatttat gcaggcaatg 720
tttatcattc cgtacaataa tgccataggc cacctattcg tcttcctact gcaggtcatc 780
acagaacaca tttggtctag cgtgtccact ccgcctttag tttgattata atacataacc 840
atttgcggtt taccggtact ttcgttgata gaagcatcct catcacaaga tgataataag 900
tataccatct tagctggctt cggtttatat gagacgagag taaggggtcc gtcaaaacaa 960
aacatcgatg ttcccactgg cctggagcga ctgtttttca gtacttccgg tatctcgcgt 1020
ttgtttgatc gcacggttcc cacaatggtt t 1051
<210> 13
<211> 679
<212> DNA
<213> 粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)
<400> 13
agatctgaca atgttcagtg cagagactcg gctacgcctc gtggactttg aagttgacca 60
acaatgttta ttcttacctc taatagtcct ctgtggcaag gtcaagattc tgttagaagc 120
caatgaagaa cctggttgtt caataacatt ttgttcgtct aatatttcac taccgcttga 180
cgttggctgc acttcatgta cctcatctat aaacgcttct tctgtatcgc tctggacgtc 240
atcttcactt acgtgatctg atatttcact gtcagaatcc tcaccaacaa gctcgtcatc 300
gctttgcaga agagcagaga ggatatgctc atcgtctaaa gaactaccca ttttattata 360
tattagtcac gatatctata acaagaaaat atatatataa taagttatca cgtaagtaga 420
acatgaaata acaatataat tatcgtatga gttaaatctt aaaagtcacg taaaagataa 480
tcatgcgtca ttttgactca cgcggtcgtt atagttcaaa atcagtgaca cttaccgcat 540
tgacaagcac gcctcacggg agctccaagc ggcgactgag atgtcctaaa tgcacagcga 600
cggattcgcg ctatttagaa agagagagca atatttcaag aatgcatgcg tcaattttac 660
gcagactatc tttctaggg 679
<210> 14
<211> 483
<212> DNA
<213> 酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 14
cggagtactg tcctccgagc ggagtactgt cctccgagcg gagtactgtc ctccgagcgg 60
agtactgtcc tccgagcgga gtactgtcct ccgagcggaa gcttgcatgc ctgcaggtcg 120
gagtactgtc ctccgagcgg agtactgtcc tccgagcgga gtactgtcct ccgagcggag 180
tactgtcctc cgagcggagt actgtcctcc gagcggagac tctagcgagc gccggagtat 240
aaatagaggc gcttcgtcta cggagcgaca attcaattca aacaagcaaa gtgaacacgt 300
cgctaagcga aagctaagca aataaacaag cgcagctgaa caagctaaac aatctgcagt 360
aaagtgcaag ttaaagtgaa tcaattaaaa gtaaccagca accaagtaaa tcaactgcaa 420
ctactgaaat ctgccaagaa gtaattattg aatacaagaa gagaactctg aatagggaat 480
tgg 483
<210> 15
<211> 867
<212> DNA
<213> 维多利亚水母(Aequorea victoria)
<400> 15
gcaaagtgaa cacgtcgcta agcgaaagct aagcaaataa acaagcgcag ctgaacaagc 60
taaacaatcg gggtaccgct agagtcgacg gtacgatcca ccggtcgcca ccatggtgag 120
caagggcgag gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg gtcgagctgg acggcgacgt 180
aaacggccac aagttcagcg tgtccggcga gggcgagggc gatgccacct acggcaagct 240
gaccctgaag ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg ccctggccca ccctcgtgac 300
caccctgacc tggggcgtgc agtgcttcag ccgctacccc gaccacatga agcagcacga 360
cttcttcaag tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag cgcaccatct tcttcaagga 420
cgacggcaac tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag ggcgacaccc tggtgaaccg 480
catcgagctg aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac atcctggggc acaagctgga 540
gtacaactac atcagccaca acgtctatat caccgccgac aagcagaaga acggcatcaa 600
ggccaacttc aagatccgcc acaacatcga ggacggcagc gtgcagctcg ccgaccacta 660
ccagcagaac acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg cccgacaacc actacctgag 720
cacccagtcc gccctgagca aagaccccaa cgagaagcgc gatcacatgg tcctgctgga 780
gttcgtgacc gccgccggga tcactctcgg catggacgag ctgtacaagt aaactctaga 840
tcataatcag ccataccaca tttgtag 867
Claims (3)
1.一种通过特异上调家蚕蜕皮激素应答因子制备转基因丝胶茧的方法，其特征在于，其通过在家蚕PSG特异上调家蚕蜕皮激素应答因子使得家蚕PSG不同程度的退化，影响或阻止了丝素蛋白的合成，家蚕蜕皮激素应答因子为下列应答因子之一：BmECRA、其基因序列为SEQ ID NO.1，BmUSP、其基因序列为SEQ ID NO.2，BmE74、其基因序列为SEQ ID NO.3，BmHR4、其基因序列为SEQ ID NO.4，BmHR3、其基因序列为SEQ ID NO.5，BmFtz-f1、其基因序列为SEQ ID NO.6，通过特异上调家蚕蜕皮激素应答因子制备转基因丝胶茧的方法获得的转基因家蚕具有只生产丝胶蛋白的特性，使其只能生产丝胶茧；
所述通过特异上调家蚕蜕皮激素应答因子制备转基因丝胶茧的方法包括以下步骤：
第一步、GAL4/UAS表达载体构建；
第二步、通过杂交获得PSG特异过表达的GAL4/UAS转基因家蚕；
第三步、对PSG特异过表达的GAL4/UAS转基因家蚕的丝腺进行形态学的观察，并用相机拍摄照片留证和验证；
第四步、对PSG特异过表达的GAL4/UAS转基因家蚕的茧壳进行形态学的观察，并用相机拍摄照片留证和验证；
第五步、对PSG特异过表达的GAL4/UAS转基因家蚕的丝腺进行DNA提取，提取成功的DNA根据设计的引物进行PCR扩增，扩增结果进行核酸电泳；根据设计引物的大小与扩增出来的大小一致，说明转基因成功；
其中，GAL4/UAS表达载体构建包括构建了1种家蚕PSG特异GAL4表达载体，载体目的基因表达框包括:启动子为fibH、其基因序列为SEQ ID NO.7；目的基因为编码GAL4蛋白结合结构域的基因序列GAL4BD、其基因序列为SEQ ID NO.8；VP16为增强子、其基因序列为SEQID NO.9；Ser1-polyA为终止信号、其基因序列为SEQ ID NO.10；将目的表达框插入到piggyBac载体骨架上即pBac[3×P3-DsRed]；
GAL4/UAS表达载体构建包括分别构建了6种UAS表达载体：所述载体目的基因表达框包括：与GAL4蛋白结合的10×UAS序列、其基因序列为SEQ ID NO.14；6种家蚕蜕皮激素应答因子中的任一种为目的基因，即BmEcRA、其基因序列为SEQ ID NO.1，BmUSP、其基因序列为SEQID NO.2，BmE74、其基因序列为SEQ ID NO.3，BmHR4、其基因序列为SEQ ID NO.4，BmHR3、其基因序列为SEQ ID NO.5，或者BmFtz-f1、其基因序列为SEQ ID NO.6；Ser1-poly A为终止信号；将目的表达框插入到piggyBac载体骨架上即pBac[3×P3-ECFP]。
2.依据权利要求1所述的通过特异上调家蚕蜕皮激素应答因子制备转基因丝胶茧的方法，其特征在于，通过杂交获得PSG特异过表达的GAL4/UAS转基因家蚕包括将GAL4/UAS表达载体通过家蚕胚胎显微注射，获得眼睛发红色荧光的GAL4转基因家蚕和眼睛发蓝绿色荧光的UAS转基因家蚕，将GAL4转基因家蚕分别与UAS转基因家蚕进行两两杂交，获得6种眼睛既发红色荧光也发蓝绿色荧光的PSG过表达的GAL4/UAS转基因家蚕。
3.依据权利要求2所述的通过特异上调家蚕蜕皮激素应答因子制备转基因丝胶茧的方法，其特征在于，第三步具体为：对上述6种PSG特异过表达的GAL4/UAS转基因家蚕的5L6D丝腺进行形态学的观察，并用相机拍摄照片。
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102187845A (zh) * | 2010-03-05 | 2011-09-21 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 一种提高蚕丝产量的转基因方法 |
| JP2012187123A (ja) * | 2004-09-27 | 2012-10-04 | National Institute Of Agrobiological Sciences | カイコ中部絹糸腺特異的遺伝子発現系を利用したタンパク質の製造方法 |
| WO2014104269A1 (ja) * | 2012-12-25 | 2014-07-03 | 独立行政法人農業生物資源研究所 | 後部絹糸腺遺伝子発現ユニット及びそれを有する遺伝子組換え絹糸虫 |
| CN107619836A (zh) * | 2017-09-30 | 2018-01-23 | 西南大学 | 一种降低吐丝期活性20e浓度改变丝蛹营养分配比例增加蚕茧产量的系统及应用和方法 |
-
2022
- 2022-03-04 CN CN202210213288.5A patent/CN114540420B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012187123A (ja) * | 2004-09-27 | 2012-10-04 | National Institute Of Agrobiological Sciences | カイコ中部絹糸腺特異的遺伝子発現系を利用したタンパク質の製造方法 |
| CN102187845A (zh) * | 2010-03-05 | 2011-09-21 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 一种提高蚕丝产量的转基因方法 |
| WO2014104269A1 (ja) * | 2012-12-25 | 2014-07-03 | 独立行政法人農業生物資源研究所 | 後部絹糸腺遺伝子発現ユニット及びそれを有する遺伝子組換え絹糸虫 |
| CN107619836A (zh) * | 2017-09-30 | 2018-01-23 | 西南大学 | 一种降低吐丝期活性20e浓度改变丝蛹营养分配比例增加蚕茧产量的系统及应用和方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Insights into the regulatory characteristics of silkworm fibroin gene promoters using a modified Gal4/UAS system;Rongpeng Liu等;Transgenic Res.;第28卷(第5-6期);627-636 * |
| miR-34 regulates larval growth and wing morphogenesis by directly modulating ecdysone signalling and cuticle protein in Bombyx mori;Zulian Liu等;RNA Biol.;第17卷(第9期);1342-1351 * |
| The BmE75 nuclear receptors function as dominant repressors of the nuclear receptor BmHR3A;Luc Swevers等;J. Biol. Chem.;第277卷(第44期);41637-41644 * |
| 家蚕蜕皮激素受体和超气门蛋白基因的诱导表达模式及蜕皮激素响应元件核心保守区的识别;刘云垒等;蚕业科学;第42卷(第3期);425-431 * |
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