CN102925484B - 家蚕核型多角体病毒多基因反向重复序列和家蚕脂肪酶1基因的应用及其重组载体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了家蚕核型多角体病毒BmNPV多基因反向重复序列和家蚕脂肪酶1基因的应用，具体为将BmNPV多基因反向重复序列和家蚕脂肪酶1基因用于构建重组载体，该载体能够表达干扰BmNPV多个基因的发夹RNA和家蚕脂肪酶1，通过增量表达Bmlipase-1在家蚕肠液中灭活BmNPV，减少侵入家蚕中肠细胞的BmNPV病毒数量；表达的发夹RNA能够降解BmNPV病毒基因的mRNA，抑制病毒在家蚕体内的复制增殖，利用该载体制备转基因家蚕后，能够有效抑制BmNPV在转基因家蚕体内的增殖并降低病毒含量，使家蚕在感染BmNPV后的存活率大大提高。

Description

家蚕核型多角体病毒多基因反向重复序列和家蚕脂肪酶 1 基因的应用及其重组载体

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及家蚕核型多角体病毒多基因反向重复序列和家蚕脂肪酶1基因的应用，还涉及含有家蚕核型多角体病毒多基因反向重复序列和家蚕脂肪酶1基因的重组载体和制备方法。

背景技术

家蚕是重要的经济昆虫和鳞翅目昆虫模式生物，在我国已经有5000多年的饲养和驯化历史。蚕丝业是许多地区农民的主要经济收入来源之一，为世界经济、文化、社会发展做出了重要贡献。但是，当家蚕遭遇病毒侵害的时候，通常会对蚕丝业造成巨大的损失。据统计，我国养蚕的几个主产区，每年因病毒性疾病所造成的损失，约占蚕病总损失的70-80%。其中家蚕核型多角体病毒病是三大病毒病中最常见、危害最为严重的一种，该病传染性强，难以控制。

引起核型多角体病毒病的病原为家蚕核型多角体病毒(B ombyx mori Nuclear Polyhedrosis Virus，BmNPV)。 BmNPV属于杆状病毒科，真杆状病毒亚科，核型多角体病毒属，病毒粒子呈杆状，全基因组大小为128413bp。病毒结构主要由外层的囊膜和内层的核衣壳组成，在不同感染时期分别以出芽型病毒粒子(budded virus，BV)和包埋型病毒粒子(occluded virus, ODV)两种形态存在，而多角体是在感染细胞的核或质中产生的包含和保护病毒粒子的一种蛋白质结晶，很稳定。多角体病毒对不良环境、消毒药剂等有较强的抵抗性，在环境中可以长期存活，但极易溶于碱性溶液。BmNPV主要通过经口食下感染家蚕，当家蚕食下多角体病毒，在中肠强碱性消化液(pH9.2~9.4)作用下，多角体被溶解，释放的病毒粒子ODV借囊膜与中肠上皮细胞微绒毛膜的融合作用脱去囊膜，核衣壳进入中肠细胞开始原发感染(Primary infection)，在细胞内复制核衣壳并通过“出芽”方式产生BV进入血体腔，继而感染其他组织细胞。最终，蚕体多以体壁破裂，流出病毒多角体浓汁而死。病毒多角体浓汁中含有大量的病毒粒子，污染蚕座环境，使得周围健康蚕感染病毒。可见，家蚕核型多角体病毒病是蚕业生产中的一个重要的危害原，一旦产生，极易爆发。

由于家蚕核型多角体病毒病在蚕业生产中危害严重，蚕业界一直希望能够培育出对此病毒具有较高抗性的蚕品种。但是，由于目前病毒致病分子机制研究较少，加之主要通过传统的方法进行遗传筛选，周期长而且定向性差，所以收效甚微。

转基因技术在生物素材创新、现代遗传育种等方面发挥着重要的作用。自2000年日本科学家报道首次成功培育转基因家蚕以来，国内外已陆续报道转基因家蚕成功的消息。2007年，印度学者报道通过转基因干涉病毒基因的方法来提高家蚕的抗性，他们利用的是家蚕多化性品系的非滞育卵，主要是因为多化性家蚕品种所产的卵为生种卵，其不需要任何的人工处理便能够在适当的温湿度下连续发育直至孵化，这个特点极大地方便了转基因实验中的操作控制。但是，通过转基因干涉利用多化性家蚕品种制备的抗病毒品系具有以下两个方面明显的缺陷：①生产用种普遍为二化性滞育种，用多化性家蚕品种制备的抗病毒品系不利于生产推广，同时与滞育性的家蚕品种相比较，多化性家蚕品种不具有滞育期，对其继代维持只能依靠连续的饲养繁殖，这样需要耗费大量的人力物力对获得的转基因家蚕品系进行维持和继代，同时也大大增加了获得的转基因家蚕品种资源丢失的风险。②转基因干涉品系只能在病毒入侵后抑制病毒的复制增殖，不能在病毒侵染的其他阶段发挥作用。因此，利用家蚕滞育品种，制备一种能在BmNPV病毒侵染的多个阶段发挥抑制作用的转基因品系是一个制备高抗病毒品种的有效方法。

在前期研究中，我们制备了增量表达家蚕内源抗性基因Bmlipase-1的转基因品系，检测结果显示该品系能显著提高家蚕对BmNPV的抵抗力。Bmlipase-1在家蚕中肠特异表达，然后分泌到家蚕肠液中发挥作用，该蛋白在肠液中能够抑制灭活BmNPV病毒，减少侵入家蚕中肠细胞的ODV病毒数量，从而提高家蚕对BmNPV的抗性，但是抗性提高有限。

发明内容

本发明的目的之一在于提供家蚕核型多角体病毒多基因反向重复序列和家蚕脂肪酶1基因的应用；本发明的目的之二在于提供含有家蚕核型多角体病毒多基因反向重复序列和家蚕脂肪酶1基因的重组载体；本发明的目的之三在于提供重组载体的制备方法。

1. 家蚕核型多角体病毒多基因反向重复序列和家蚕脂肪酶1基因在制备重组载体中的应用，所述多基因反向重复序列的正向序列如SEQ ID NO.1所示，反向序列如SEQ ID NO.4所示，所述家蚕脂肪酶1基因如SEQ ID NO.11第1081-1965位所示核苷酸。

更优选的，所述家蚕核型多角体病毒多基因反向重复序列的正向序列和反向序列之间连入家蚕肌动蛋白基因Actin 3内含子A3intron，所述家蚕肌动蛋白基因Actin 3内含子A3intron的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

2.含所述家蚕核型多角体病毒多基因反向重复序列和家蚕脂肪酶1基因的重组载体。

优选的，所述家蚕核型多角体病毒多基因反向重复序列的5’端为IE1启动子，所述家蚕脂肪酶1基因的5’端连接家蚕中肠特异表达启动子P2。

更优选的，所述重组载体的IE1启动子的5’端连接Hr3增强子。

最优选的，所述重组载体是由SEQ ID NO.12所述的载体序列经Asc Ⅰ酶切后回收含家蚕核型多角体病毒多基因反向重复序列和家蚕脂肪酶1基因的片段，连接经Asc Ⅰ酶切的piggyBac[3×p3 EGFP afm]载体而得。

3.所述重组载体的制备方法，包括如下步骤：

（1）合成SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶切后连接经同样双酶切的含家蚕肌动蛋白基因Actin 3内含子的pMD-19载体，得pMD-19-FS-A3intron载体；克隆如SEQ ID NO.4所示的序列，连入所得pMD-19-FS-A3intron载体的家蚕肌动蛋白基因Actin 3内含子的3’端，得pMD-19-FS-A3intron-FA载体；

（2）将步骤（1）所得pMD-19-FS-A3intron-FA载体用EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ进行双酶切，将含SEQ ID NO.1、家蚕肌动蛋白基因Actin 3内含子和SEQ ID NO.4的片段FS-A3intron-FA连入L4440载体的IE1启动子IE1P和SV40终止信号序列之间，得L4440-IE1P-FS-A3intron-FA-SV40载体；

（3）克隆家蚕中肠特异表达启动子P2和家蚕脂肪酶1基因，将家蚕中肠特异表达启动子P2用Kpn Ⅰ和Not Ⅰ酶切后连接经同样酶切的含SV40终止信号序列的pSLfa1180fa载体，得1180-P2-SV40载体，然后同时用Not Ⅰ和Xho Ⅰ酶切所得1180-P2-SV40载体和克隆的家蚕脂肪酶1基因，连接后得1180-P2-Bmlipase-1-SV40载体，载体序列如SEQ ID NO.11所示；

（4）克隆Hr3增强子，连接进pSLfa1180fa载体得1180-Hr3载体；将步骤（2）所得L4440-IE1P-FS-A3intron-FA-SV40载体中的含IE1启动子IE1P和FS-A3intron-FA的片段连接入所得1180-Hr3载体，得1180-Hr3-IE1P-FS-A3intron-FA-SV40载体，然后将所得1180-Hr3-IE1P-FS-A3intron-FA-SV40载体用Kpn Ⅰ和Hind Ⅲ进行双酶切，同时用Kpn Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切所得1180-P2-Bmlipase-1-SV40载体，将含家蚕中肠特异表达启动子P2和家蚕脂肪酶1基因的序列连接酶切后的1180-Hr3-IE1P-FS-A3intron-FA-SV40载体，得1180-Hr3-IE1P-FS-A3intron-FA-SV40-P2-Bmlipase-1-SV40载体，载体序列如SEQ ID NO.12所示；

（5）将步骤（4）所得1180-Hr3-IE1P-FS-A3intron-FA-SV40-P2-Bmlipase-1-SV40重组载体经Asc Ⅰ酶切后回收含家蚕核型多角体病毒多基因反向重复序列和家蚕脂肪酶1基因的片段，连接经Asc Ⅰ酶切的piggyBac[3×p3 EGFP afm]载体，得重组载体。

本发明的有益效果在于：为了获得高抗家蚕核型多角体病毒的家蚕品系，将家蚕核型多角体病毒多基因反向重复序列与家蚕脂肪酶1基因进行联合应用，在同一载体中实现同时表达抗性基因家蚕脂肪酶1和表达干扰家蚕核型多角体病毒复制的反向重复序列，反向重复序列中含有家蚕核型多角体病毒的ie1、gp64、lef1、lef2和DNA 聚合酶基因的双链RNA，经家蚕体内加工后，形成小分子双链RNA，因此能在病毒侵染的多个阶段抑制病毒，控制家蚕核型多角体病毒在家蚕体内繁殖，降低家蚕核型多角体病毒在体内的含量，从而达到抗家蚕核型多角体病毒的效果。利用该载体转化家蚕后，抗病毒效果明显，与未转化的相比，存活率提高51.11%，并且转化该载体后不影响家蚕的经济形状，因此用于育种，获得高抗家蚕核型多角体病毒的家蚕品系。

附图说明

图1为pb-HFPL重组载体结构图。

图2为转基因家蚕和非转基因家蚕抗性检测结果图（SW-H1、SW-H2和SW-H3分别为不同转基因品系；SW为非转基因品种）。

图3为转基因系统SW-H1和非转基因品种SW感染病毒后gp41基因的荧光定量PCR结果。

图4为转基因家蚕和非转基因品种的全茧量和茧层率（A：全茧量；B：茧层率）。

具体实施方式：

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等著）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例中使用的家蚕品种为“芙蓉”品种，由中国西南大学家蚕基因资源库提供。

实施例 1、构建转基因载体

一、构建L4440-IE1P-FS-A3intron-FA-SV40载体

(1)根据已经报道的BmNPV 基因组序列及家蚕核型多角体病毒的ie1（GenBank: N0.X58442.1）、gp64（GenBank: N0. AB253773.1）、lef1（GenBank: N0. L09723.1）、lef2（GenBank: AF036245.1）和DNA 聚合酶基因（GenBank: N0. D16231.1）5个基因的序列，人工合成包括以上所述5个基因部分序列的串联DNA双链序列，命名为FS，如SEQ ID NO.1所示。在FS的5’端设置有EcoR Ⅰ酶切位点，FS的3’端设置有BamHⅠ酶切位点。根据人工合成的FS序列设计扩增FS的反向互补序列FA，上游引物为FA sense：5'-cccaagcttcgctgtctgaactatcacaa-3'（SEQ ID NO.2），下划线为HindⅢ酶切位点；下游引物为FA anti: 5'-gctctagaatatcatgacaatattgcgag-3'（SEQ ID NO.3），下划线为Xba Ⅰ酶切位点，以人工合成的FS为模板进行PCR扩增，PCR反应条件为：94℃预变性4分钟，然后94℃变性40秒、50℃退火40秒、72℃延伸45秒，共30个循环，最后72℃延伸10分钟；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，然后与pMD19-T simple载体连接，连接反应在T4 DNA 连接酶作用下，16℃过夜连接，然后转化DH5a感受态细胞，获得阳性克隆后送往上海生工生物技术有限公司测序，测序结果表明本实施例成功克隆了FS的反向互补序列FA，如SEQ ID NO.4所示核酸序列。

(2) 将人工合成的FS序列用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ进行双酶切，经琼脂糖电泳鉴定并回收，得FS酶切片段，同时用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切已经包含家蚕肌动蛋白基因Actin 3内含子（简称A3intron）的pMD-19载体，A3intron的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，经琼脂糖电泳鉴定并回收，得pMD-19载体酶切片段。将FS酶切片段和pMD-19载体酶切片段连接，然后进行转化，筛选阳性克隆，得到含FS 和A3intron的载体，命名为pMD-19-FS-A3intron；将反向互补片段FA和pMD-19-FS-A3intron载体分别用Hind Ⅲ和Xba Ⅰ进行双酶切，回收目的条带后连接转化，筛选阳性克隆，得到含FS、A3intron和FA的载体，命名为pMD-19-FS-A3intron-FA载体。pMD-19-FS-A3intron-FA载体中，A3intron位于FS序列和FA序列之间，因此表达含FS、A3intron和FA的片段（命名为FS-A3intron-FA）后能形成回文结构。

(3)将已经包含IE1启动子（简称IE1P）和SV40终止信号序列的L4440载体用EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ进行双酶切，收集L4440载体骨架，同时用EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ酶切pMD-19-FS-A3intron-FA载体，回收含有FS、A3intron和FA的片段，然后与L4440载体骨架连接，转化，筛选阳性克隆，得到L4440-IE1P-FS-A3intron-FA-SV40载体，序列如SEQ ID NO.6所示。L4440-IE1P-FS-A3intron-FA-SV40载体即在L4440载体的IE1启动子和SV40终止信号序列之间插入了FS-A3intron-FA序列。

(二) 构建1180-P2-Bmlipase-1-SV40载体

(1)根据公开号为102296070A的中国专利公开的家蚕中肠特异表达启动子P2的序列，设计引物 ，上游引物为P2 sense：5'-ggggtaccgtcccccatccagcagtc-3'(SEQ ID NO.7)，下划线为Kpn Ⅰ酶切位点，下游引物为P2 anti：5'-ataagaatgcggccgcttttgctgaaagaaacgtacaata-3'(SEQ ID NO.8)，下划线为Not Ⅰ酶切位点。以家蚕基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应条件为：94℃预变性4分钟，然后94℃变性40秒、57℃退火40秒、72℃延伸55秒，共30个循环，最后72℃延伸10分钟；PCR产物经回收、克隆和测序，测序结果显示克隆获得序列与公开的家蚕中肠特异表达启动子P2的序列一致。

(2)根据已经报道的家蚕脂肪酶1（简称为Bmlipase-1）的基因序列（GenBank: N0. AB076385），设计引物，上游引物为Bmlipase-1 sense：5'-ataagaatgcggccgcatgcctgatggcgagggtgt-3'(SEQ ID NO.9)，下划线为Not Ⅰ酶切位点；下游引物为Bmlipase-1 anti：5'-ccgctcgagttagaaaggccaactgctgcc-3'(SEQ ID NO.10)，下划线为Xho Ⅰ酶切位点，以家蚕cDNA为模板进行PCR扩增，PCR反应条件为：94℃预变性4分钟，然后94℃变性40秒、62℃退火40秒、72℃延伸45秒，共30个循环，最后72℃延伸10分钟；PCR产物经回收、克隆和测序，证明成功克隆Bmlipase-1基因。

(3) 将已含有SV40终止信号序列的pSLfa1180fa载体用Kpn Ⅰ和Not Ⅰ双酶切，回收pSLfa1180fa载体骨架，同时用Kpn Ⅰ和Not Ⅰ双酶切克隆所得家蚕中肠特异表达启动子P2，回收目的条带。将回收的家蚕中肠特异表达启动子P2与pSLfa1180fa载体骨架连接后转化，筛选阳性克隆，得到在pSLfa1180fa载体的SV40终止信号序列前插入家蚕中肠特异表达启动子P2的载体，命名为1180-P2-SV40载体。将所得1180-P2-SV40载体用Not Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切，回收载体骨架，同时用Not Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切克隆的Bmlipase-1基因，回收目的条带，然后将回收的1180-P2-SV40载体骨架与Bmlipase-1基因连接，即将Bmlipase-1基因连入1180-P2-SV40的家蚕中肠特异表达启动子P2和SV40终止信号序列之间，得1180-P2-Bmlipase-1-SV40载体(SEQ ID NO.11)。

(三) 构建pBac[Hr3-IE1P-FS-A3intron-FA-SV40-P2-Bmlipase-1-SV40-3×P3-EGFP afm]载体

(1) 根据公开号为102492692A的中国专利公开的Hr3增强子序列，用Nco Ⅰ单酶切以后连接到1180载体上，得到1180-Hr3载体，将1180-Hr3载体用Sal Ⅰ和Bgl Ⅱ进行双酶切，回收载体骨架，然后将L4440-IE1P-FS-A3intron-FA-SV40用Sal Ⅰ和Bgl Ⅱ进行双酶切，回收含IE1启动子、FS-A3intron-FA和SV40终止信号序列的片段，然后连入1180-Hr3载体骨架的Hr3增强子序列之后、转化，筛选阳性克隆，得到1180-Hr3-IE1P-FS-A3intron-FA-SV40载体。

将1180-Hr3-IE1P-FS-A3intron-FA-SV40载体用Kpn Ⅰ和Hind Ⅲ进行双酶切，回收载体骨架；同时用Kpn Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切1180-P2-Bmlipase-1-SV40载体，回收含家蚕中肠特异表达启动子P2、Bmlipase-1和SV40终止信号序列的片段（简称为P2-Bmlipase-1-SV40）。将回收的P2-Bmlipase-1-SV40片段连入1180-Hr3-IE1P-FS-A3intron-FA-SV40载体的酶切位点处，即将P2-Bmlipase-1-SV40连入1180-Hr3-IE1P-FS-A3intron-FA-SV40载体，得到1180-Hr3-IE1P -FS-A3intron-FA-SV40-P2-Bmlipase-1-SV40载体，载体序列如SEQ ID NO.12所示。

(2) 用限制性内切酶Asc Ⅰ酶切1180-Hr3-IE1P-FS-A3intron-FA-SV40-P2-Bmlipase-1-SV40载体，琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，得依次含有Hr3增强子、IE1启动子、FS-A3intron-FA序列、SV40终止信号序列、家蚕中肠特异表达启动子P2、Bmlipase-1基因序列和SV40终止信号序列的片段，命名为Hr3-IE1P-FS-A3intron-FA-SV40-P2-Bmlipase-1-SV40片段；同时用内切酶Asc Ⅰ单酶切piggyBac[3×p3 EGFP afm]，得piggyBac[3×p3 EGFP afm]线性片段，然后对获得piggyBac[3×p3 EGFP afm]线性片段5’端去磷酸化，将Hr3-IE1P-FS-A3intron-FA-SV40-P2-Bmlipase-1-SV40和piggyBac[3×p3 EGFP afm]连接，转化后筛选阳性克隆，得到重组载体pBac[Hr3-IE1P-FS-A3intron-FA-SV40-P2-Bmlipase-1-SV40 -3×P3-EGFP afm] (命名为pb-HFPL重组载体)，结构如图1所示。

实施例 2、转基因显微注射和阳性个体的筛选

（1）将家蚕“芙蓉”品种蚕卵浸酸（盐酸浓度为1.073 g/mL，温度为46℃，时间为5分钟）解除滞育以后，放于15℃和80%湿度的黑暗环境中催青30天左右直至孵化，将蚁蚕收好置于标准环境中饲养（温度：25℃，湿度：80%），化蛾以后将雌雄蚕蛾交配4小时，拆对后产下的蚕卵为非滞育蚕卵，用于下一步的显微注射。

（2）将产下的蚕卵在干净的载玻片上排列整齐，在蚕卵产后2小时用Eppendorf显微注射仪将pb-HFPL重组载体和辅助质粒A3H，一起注射进387粒蚕卵中，用无毒胶水封口以后置于25℃、相对湿度80%的环境中催青10天左右孵化，将孵化的226头G₀代蚁蚕用桑叶收集饲养至化蛾，G₀代蚕蛾通过自交或回交共获得51个蛾圈G1代蚕卵，用 Olympus^®电动宏观荧光显微镜观察G₁胚胎筛选并获得21个阳性蛾圈，转化效率为41.18%。

（3）随机选择3个阳性蛾圈各自单蛾圈饲养，继代扩大得到3个转基因系统，分别命名为SW-H1、SW-H2和SW-H3。

实施例 3 、转基因系统的抗性检测

取转基因家蚕SW-H1、SW-H2、SW-H3和非转基因家蚕SW（亲本芙蓉品种），在3龄起蚕时期以5×10⁵多角体/头单头经口添食BmNPV病毒，4个系统各设置3个重复区，每个重复区60头蚕，同时设置3个不攻毒对照区SW(C)，连续10天统计死亡率。统计结果如图2所示，由图2可知，SW-H1、SW-H2、SW-H3和SW的存活率分别为64.03%、61.42%、60.10%和12.92%，转基因系统的抗性明显高于非转基因对照，SW-H1的存活率提高了51.11%。

与2007年Kanginakudru，S.和2012年Liang Jiang研究结果相比，发现同时增量表达抗性基因和干涉多个病毒基因能进一步提高家蚕对BmNPV病毒的抗性（参见Liang Jiang.，et al. 2012. Resistance to Bombyx mori nucleopolyhedrovirus via overexpression of an endogenous antiviral gene in transgenic silkworms. Arch Virol 157，1323-1328.和Kanginakudru，S.，et al. 2007. Targeting ie-1 gene by RNAi induces baculoviral resistance in lepidopteran cell lines and in transgenic silkworms. Insect Mol Biol 16，635-644.）。

实施例 4 、定量 PCR 检测攻毒后家蚕中 BmNPV 病毒的含量

在攻毒后48h，转基因系统SW-H1和非转基因品种SW各取10头蚕提取总DNA。每个DNA模板各取20 ng，以BmNPV病毒gp41基因的特异引物进行定量PCR检测，上游引物为GP41 F: 5‘-cgtagtagtagtaatcgccgc-3’ (SEQ ID NO.13)，GP41 R: 5‘-agtcgagtcgcgtcgcttt-3’ (SEQ ID NO.14)，以家蚕看家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因（BmGAPDH）为内参，上游引物为BmGAPDH F: 5‘-gctgcctccttgaccttttgc-3’ (SEQ ID NO.15)，下游引物为BmGAPDH R: 5‘ -cattccgcgtccctgttgctaat- 3’（SEQ ID NO.16）。荧光定量使用TaKaRa公司的SYBR Premix Ex Taq Kit试剂盒，定量PCR检测仪器为ABI StepOnePlus^TM Real-Time PCR System，Applied Biosystems，具体操作按照试剂盒和仪器说明书进行操作。荧光定量PCR的结果如图3所示。由图3可知，在食下病毒量一致的情况下，在攻毒后48h，gp41基因的拷贝数在SW-H1中的含量不到SW中的10%。表明BmNPV病毒在SW-H1转基因系统中拷贝数极低，因此SW-H1明显抑制了BmNPV病毒在其体内的复制增殖，提高了蚕体对BmNPV病毒的抗性，从而使存活率显著提高。

实施例 5 、调查转基因系统的经济性状

SW-H1、SW-H2、SW-H3和非转基因品种SW各系统各自随机抽取30颗茧，分别称取每颗茧的全茧量和茧层率。统计的全茧量结果显示（如图4A所示）转基因系统和非转基因品种SW之间差异不显著，因此，转基因对全茧量无影响。同时，统计SW-H1、SW-H2、SW-H3和非转基因品种SW的茧层率（如图4B所示），结果显示转基因系统和非转基因品种SW之间茧层率没有明显差异，因此转基因对茧层率也无影响。

以上调查结果显示转基因系统在抗性显著提高的同时没有影响其正常的经济性状，预示着该品种可以在蚕业生产进行推广使用。

实施例 6 、 pb-HFPL 重组载体转化的家蚕其他品种

我们按照前述的方法，将pb-HFPL重组载体通过转基因显微注射方法导入家蚕品种932、7532、湘晖、苍松、碧海、日新、星月、781、夏芳-A、夏芳-B、秋白-A、秋白-B、8810、8711、彩黄1、彩黄2，制备以上每个品种的转基因系统。对获得的转基因系统检测其对BmNPV病毒抗性，并调查其经济性状。结果显示，获得的转基因系统抗性提高，并不影响家蚕的经济性状。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

<110> 西南大学

<120> 家蚕核型多角体病毒多基因反向重复序列和家蚕脂肪酶1基因的应用及其重组载体

<160> 16

<210> 1

<211> 878

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FS序列

<400> 1

gaattcatat catgacaata ttgcgagtaa taataacgcg gaaaatttaa aaaaggttaa 60

gaaggaggac ggcagcatgc acattgtcga acagtatttg actcagaatg tggataatgt 120

aaaaggtcac aattttatag tattgtcttt caaaaacgaa gagcggttga ctatagctaa 180

gaatgccgtg caccaatccg ccggcacaca ccagtaattg ctacaacaac agcatttaca 240

aagaagggcg ttgggtggcc aacacggact cgtcgcaatg catagatttt agcaactaca 300

aggaactagc aatcgacgac gacgtcgaat tttggattcc gaccatcggc cagttttgcg 360

cattgtgtga gagaggccgt acgtttgtac attccgcata tgcaagattc aaacttggac 420

gcgctcacgt tgcagtattg gccggacgtg gacagggata ttttttgtaa cgttaacaaa 480

caaatacgcg caccgtacag ctataattat aagggaacgc ggcggtatgt acaggaagag 540

gtttatacta aactgttaca ttgcaaacgt ggtttcgtgt accaaatgtg aaaaccgatg 600

tttgatcaag gctctgacac atttttacaa ttacgactcc aagtgtgtgg gtgaagtcat 660

gcatctttta atcaaatccc aagatgagga taatcttgca aagtgtttta ccgcaattat 720

gcaaaagtac atgcagaatc aattgtacga tcgaaaagaa ccagtgttag taaaaattaa 780

ccaaaaaaaa tgcagtgtca aacgcaaacg tgacgacgac gacgacaata atgatgatga 840

tgatgacgat ggttgtgata gttcagacag cgggatcc 878

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FA上游引物

<400> 2

cccaagcttc gctgtctgaa ctatcacaa 29

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FA下游引物

<400> 3

gctctagaat atcatgacaa tattgcgag 29

<210> 4

<211> 878

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FA序列

<400> 4

aagcttcgct gtctgaacta tcacaaccat cgtcatcatc atcatcatta ttgtcgtcgt 60

cgtcgtcacg tttgcgtttg acactgcatt ttttttggtt aatttttact aacactggtt 120

cttttcgatc gtacaattga ttctgcatgt acttttgcat aattgcggta aaacactttg 180

caagattatc ctcatcttgg gatttgatta aaagatgcat gacttcaccc acacacttgg 240

agtcgtaatt gtaaaaatgt gtcagagcct tgatcaaaca tcggttttca catttggtac 300

acgaaaccac gtttgcaatg taacagttta gtataaacct cttcctgtac ataccgccgc 360

gttcccttat aattatagct gtacggtgcg cgtatttgtt tgttaacgtt acaaaaaata 420

tccctgtcca cgtccggcca atactgcaac gtgagcgcgt ccaagtttga atcttgcata 480

tgcggaatgt acaaacgtac ggcctctctc acacaatgcg caaaactggc cgatggtcgg 540

aatccaaaat tcgacgtcgt cgtcgattgc tagttccttg tagttgctaa aatctatgca 600

ttgcgacgag tccgtgttgg ccacccaacg cccttctttg taaatgctgt tgttgtagca 660

attactggtg tgtgccggcg gattggtgca cggcattctt agctatagtc aaccgctctt 720

cgtttttgaa agacaatact ataaaattgt gaccttttac attatccaca ttctgagtca 780

aatactgttc gacaatgtgc atgctgccgt cctccttctt aacctttttt aaattttccg 840

cgttattatt actcgcaata ttgtcatgat attctaga 878

<210> 5

<211> 96

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 家蚕肌动蛋白基因Actin 3内含子序列

<400> 5

cggtgagctc atcgattctg gactatgcac ttcgcctctc ggccggtggg ccgttatcga 60

ccgttatctg acgaatgact ttgttctgtt tcagcc 96

<210> 6

<211> 2605

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> L4440-IE1P-FS-A3-FA-SV40载体序列

<400> 6

aagcttcgat gtctttgtga tgcgccgaca tttttgtagg ttattgataa aatgaacgga 60

tacagttgcc cgacattatc attaaatcct tggcgtagaa tttgtcgggt ccattgtccg 120

tgtgcgctag catgcccgct aacggacctc gtacttttgg cttcaaaggt tttgcgcaca 180

gacaaaatgt gccacacttg cagctctgca tgtgtgcgcg ttaccacaaa tcccaacggc 240

gcagtgtact tgttgtatgc aaataaatct cgataaaggc gcggcgcgcg aatgcagctg 300

atcacgtacg ctcctcgtgt tccgttcaag gacggtgtta tcgacctcag attaatgttt 360

atcggccgac tgttttcgta tccgctcacc aaacgcgttt ttgcattaac attgtatgtc 420

ggcggatgtt ctatatctaa tttgaataaa taaacgataa ccgcgttggt tttagagggc 480

ataataaaag aaatattgtt atcgtgttcg ccattagggc agtataaatt gacgttcatg 540

ttggatattg tttcagttgc aagtgaattc atatcatgac aatattgcga gtaataataa 600

cgcggaaaat ttaaaaaagg ttaagaagga ggacggcagc atgcacattg tcgaacagta 660

tttgactcag aatgtggata atgtaaaagg tcacaatttt atagtattgt ctttcaaaaa 720

cgaagagcgg ttgactatag ctaagaatgc cgtgcaccaa tccgccggca cacaccagta 780

attgctacaa caacagcatt tacaaagaag ggcgttgggt ggccaacacg gactcgtcgc 840

aatgcataga ttttagcaac tacaaggaac tagcaatcga cgacgacgtc gaattttgga 900

ttccgaccat cggccagttt tgcgcattgt gtgagagagg ccgtacgttt gtacattccg 960

catatgcaag attcaaactt ggacgcgctc acgttgcagt attggccgga cgtggacagg 1020

gatatttttt gtaacgttaa caaacaaata cgcgcaccgt acagctataa ttataaggga 1080

acgcggcggt atgtacagga agaggtttat actaaactgt tacattgcaa acgtggtttc 1140

gtgtaccaaa tgtgaaaacc gatgtttgat caaggctctg acacattttt acaattacga 1200

ctccaagtgt gtgggtgaag tcatgcatct tttaatcaaa tcccaagatg aggataatct 1260

tgcaaagtgt tttaccgcaa ttatgcaaaa gtacatgcag aatcaattgt acgatcgaaa 1320

agaaccagtg ttagtaaaaa ttaaccaaaa aaaatgcagt gtcaaacgca aacgtgacga 1380

cgacgacgac aataatgatg atgatgatga cgatggttgt gatagttcag acagcgggat 1440

cccggtgagc tcatcgattc tggactatgc acttcgcctc tcggccggtg ggccgttatc 1500

gaccgttatc tgacgaatga ctttgttctg tttcagccaa gcttcgctgt ctgaactatc 1560

acaaccatcg tcatcatcat catcattatt gtcgtcgtcg tcgtcacgtt tgcgtttgac 1620

actgcatttt ttttggttaa tttttactaa cactggttct tttcgatcgt acaattgatt 1680

ctgcatgtac ttttgcataa ttgcggtaaa acactttgca agattatcct catcttggga 1740

tttgattaaa agatgcatga cttcacccac acacttggag tcgtaattgt aaaaatgtgt 1800

cagagccttg atcaaacatc ggttttcaca tttggtacac gaaaccacgt ttgcaatgta 1860

acagtttagt ataaacctct tcctgtacat accgccgcgt tcccttataa ttatagctgt 1920

acggtgcgcg tatttgtttg ttaacgttac aaaaaatatc cctgtccacg tccggccaat 1980

actgcaacgt gagcgcgtcc aagtttgaat cttgcatatg cggaatgtac aaacgtacgg 2040

cctctctcac acaatgcgca aaactggccg atggtcggaa tccaaaattc gacgtcgtcg 2100

tcgattgcta gttccttgta gttgctaaaa tctatgcatt gcgacgagtc cgtgttggcc 2160

acccaacgcc cttctttgta aatgctgttg ttgtagcaat tactggtgtg tgccggcgga 2220

ttggtgcacg gcattcttag ctatagtcaa ccgctcttcg tttttgaaag acaatactat 2280

aaaattgtga ccttttacat tatccacatt ctgagtcaaa tactgttcga caatgtgcat 2340

gctgccgtcc tccttcttaa ccttttttaa attttccgcg ttattattac tcgcaatatt 2400

gtcatgatat tctagaagat cataatcagc cataccacat ttgtagaggt tttacttgct 2460

ttaaaaaacc tcccacacct ccccctgaac ctgaaacata aaatgaatgc aattgttgtt 2520

gttaacttgt ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc 2580

acaaataaag catttttttc actgc 2605

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P2上游引物

<400> 7

ggggtaccgt cccccatcca gcagtc 28

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P2下游引物

<400> 8

ataagaatgc ggccgctttt gctgaaagaa acgtacaata 40

<210> 9

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Bmlipase-1上游引物

<400> 9

ataagaatgc ggccgcatgc ctgatggcga gggtgt

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Bmlipase-1下游引物

<400> 10

ccgctcgagt tagaaaggcc aactgctgcc 30

<210> 11

<211> 2160

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1180-P2-Bmlipase-1-SV40载体序列

<400> 11

gtcccccatc cagcagtcct ggtcggtggg gacgaagtac ggctccgcag cgacagcgac 60

gtcgattgac cactccgcca tggtgtggac gaggagatcc tgtgccctgg cggagtggtt 120

caaattactt tgaaggaagc gatggacaca acccattacg gggctacatc catcgctccc 180

tcgtctgttc cgccctgcgg ctcgacaaca gccgcggcgg gaactgactc gccggctgcc 240

cttgttgcag ccggcttctt tttctttccg cccctcctcg tttttgtaga ggagggggcg 300

gacttgcacg ccgggccccc ggcccggtgg tcagccttcc ttttagccgc gtcgcacaag 360

acgcagtgcg gcgcggctgc ggtgcaggag gctgccttgt gccccggttg gccgcagcgg 420

aagcacaggt tgctgcggtc cccgatagct gttgtcctat ccaattccat ttttttttca 480

agtaagccaa atttggagta tgacaacgta ttaagactaa ataatttcag gcatcttgaa 540

gtaatgccat acatgtatta aagaacagtt caaaaacatt tcatgaatct tgacataata 600

aatatatctt taatgtctta aatgaactca tcacgaaaat gaacgaaaac tctgcaataa 660

ggatgataat atttacttct ttgtttcagt aatattttcc aaatttatca ccaatctatc 720

gatttcgtga ttatcacgtc tcaatttaat tttgttttca ctttgaaatg taataatata 780

cacatttcaa tcagataatc ttgatcaaga ttgttttaat gtacgtcagc taatagagaa 840

tacgttatca gcttaagcgt aggaaacagt ataaataccg aatgaaaatt caataaatcg 900

tacacattta tttggtgagg taagagcatt tgtgtttctc agggaaacac tgaaaattac 960

ataaatttta acttctgttc tctctatcaa aacaatttca aatcatacca gtttaaatcg 1020

caggtgccaa gtaacattta tacttcatta ttgtacgttt ctttcagcaa aagcggccgc 1080

atgcctgatg gcgagggtgt tcctcacctc gttgacctgg aagaaccggc cgaggaagac 1140

atccttatgt caaggaacgg tgcaaacaac caatactggc ttttcaccag acgtaaccaa 1200

aacaaccatc aagttattac aaatggcaat gtcaactcta tccggaactc gaactacaat 1260

ggaaacctgc ctctctttgt tattgtccac ggctggaaca gcaacggaaa ctccgctgtg 1320

aacaccatga tccgccccgc cttgctggcc gtctccgact gcaacgttat tgttgtggac 1380

tggcgtggtc ttgccaacgg tctatacaac actgccgtca atggagttcc cagtgtcgga 1440

cagttccttg gcaacttttt ggtctggctc atcaacaacg gaggcggcaa ttggggtcga 1500

gtccacttga ttggcttcag cttgggcgcg cacgttgtcg gtaacgctgg acgacaggct 1560

ggtggcagac ccaacagggt taccggtttg gatccggctg ggcccaggtg gggtggtaac 1620

aaccaagccc tgaaccgtaa cgcaggagct tatgtggagg caatccacac cgacggtggt 1680

cttctcggta tttttgaccg cattgctcat ggtgactttt accccaacgg tggcagaaac 1740

ccccaaccgg gttgcagagt tagtacctgc tctcacagtc gagcctacga attgtacgcc 1800

tccactgttc gtcacaatcg tttcgttggc agactatgta acaacctcaa tcaggctcag 1860

aacaatcagt gctctggagg taccttcaac atgggtaatg ccgtatttgg taagcgcgga 1920

aacggaatct acggactcag aactggcagc agttggcctt tctaactcga gagatcataa 1980

tcagccatac cacatttgta gaggttttac ttgctttaaa aaacctccca cacctccccc 2040

tgaacctgaa acataaaatg aatgcaattg ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttata 2100

atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc 2160

<210> 12

<211> 5814

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1180-Hr3-IE1P-FS-A3intron-FA-SV40-P2-Bmlipase-1-SV40载体序列

<400> 12

ccatggaaaa agaagccgtg cccagtcacg tgtacgccaa cctgaacacg caatccaacg 60

acggcgtcaa atacaatcgt tggttgcacg ctaaaaatga ccaatacatg gcgtgtcctg 120

aagaattgta cgataacaac gaatttaaat gtaacgtaga atcggataaa ttatattatt 180

tggataattt acaagaagat tccattgtat aaacatttta tgtcgaaaac aaatgacatc 240

agcttatgat tcatacttaa tcgtgcgtta caagtagaat tctactcgta aagcgagttt 300

aatttggaaa aacaaattag tcattattaa acatgttaac aatcgtgtat aaaatgacat 360

cagtttaatg atgacatcat ctcttgatta tgttttacac gtagaattct actcgtaaag 420

ccagttcagt tttgaaaaac aaatgacatc atctcttgat tatgttttac aagtagaatt 480

ctactcgtaa agccggttca gttttgaaaa acaaatgaca tcatctcttg actgtgtttt 540

acacgtagaa ttctactcgc aaagcaagtt tagttttgaa aaacaaatga catcattcag 600

ttttgaaaaa caaatgacat catctcttga ttgtgtttta cacgtagaat tctgctcgta 660

aagcgagttt ggttttgaaa aacaaatgac atcatttctt aaattcggtt ttgaaaaacg 720

aatgacatca tcttttgatt gtgttttaca cgtagaattc tactcgtaaa gcgagtttgg 780

ttttgaaaaa caaatgacat catctcttga ttatgtttta cacgtagaat tctactcgta 840

aagcgagtta gttttaaaaa acaaatgaca tcatcttaga ggtagacccg tcttggcgac 900

gggtctgctc atacgtcgtt ttgtatttgt cattgcctct tttcacgacg ctgccatggc 960

catgggacgt cgacggtatc gataagcttc gatgtctttg tgatgcgccg acatttttgt 1020

aggttattga taaaatgaac ggatacagtt gcccgacatt atcattaaat ccttggcgta 1080

gaatttgtcg ggtccattgt ccgtgtgcgc tagcatgccc gctaacggac ctcgtacttt 1140

tggcttcaaa ggttttgcgc acagacaaaa tgtgccacac ttgcagctct gcatgtgtgc 1200

gcgttaccac aaatcccaac ggcgcagtgt acttgttgta tgcaaataaa tctcgataaa 1260

ggcgcggcgc gcgaatgcag ctgatcacgt acgctcctcg tgttccgttc aaggacggtg 1320

ttatcgacct cagattaatg tttatcggcc gactgttttc gtatccgctc accaaacgcg 1380

tttttgcatt aacattgtat gtcggcggat gttctatatc taatttgaat aaataaacga 1440

taaccgcgtt ggttttagag ggcataataa aagaaatatt gttatcgtgt tcgccattag 1500

ggcagtataa attgacgttc atgttggata ttgtttcagt tgcaagtgaa ttcatatcat 1560

gacaatattg cgagtaataa taacgcggaa aatttaaaaa aggttaagaa ggaggacggc 1620

agcatgcaca ttgtcgaaca gtatttgact cagaatgtgg ataatgtaaa aggtcacaat 1680

tttatagtat tgtctttcaa aaacgaagag cggttgacta tagctaagaa tgccgtgcac 1740

caatccgccg gcacacacca gtaattgcta caacaacagc atttacaaag aagggcgttg 1800

ggtggccaac acggactcgt cgcaatgcat agattttagc aactacaagg aactagcaat 1860

cgacgacgac gtcgaatttt ggattccgac catcggccag ttttgcgcat tgtgtgagag 1920

aggccgtacg tttgtacatt ccgcatatgc aagattcaaa cttggacgcg ctcacgttgc 1980

agtattggcc ggacgtggac agggatattt tttgtaacgt taacaaacaa atacgcgcac 2040

cgtacagcta taattataag ggaacgcggc ggtatgtaca ggaagaggtt tatactaaac 2100

tgttacattg caaacgtggt ttcgtgtacc aaatgtgaaa accgatgttt gatcaaggct 2160

ctgacacatt tttacaatta cgactccaag tgtgtgggtg aagtcatgca tcttttaatc 2220

aaatcccaag atgaggataa tcttgcaaag tgttttaccg caattatgca aaagtacatg 2280

cagaatcaat tgtacgatcg aaaagaacca gtgttagtaa aaattaacca aaaaaaatgc 2340

agtgtcaaac gcaaacgtga cgacgacgac gacaataatg atgatgatga tgacgatggt 2400

tgtgatagtt cagacagcgg gatcccggtg agctcatcga ttctggacta tgcacttcgc 2460

ctctcggccg gtgggccgtt atcgaccgtt atctgacgaa tgactttgtt ctgtttcagc 2520

caagcttcgc tgtctgaact atcacaacca tcgtcatcat catcatcatt attgtcgtcg 2580

tcgtcgtcac gtttgcgttt gacactgcat tttttttggt taatttttac taacactggt 2640

tcttttcgat cgtacaattg attctgcatg tacttttgca taattgcggt aaaacacttt 2700

gcaagattat cctcatcttg ggatttgatt aaaagatgca tgacttcacc cacacacttg 2760

gagtcgtaat tgtaaaaatg tgtcagagcc ttgatcaaac atcggttttc acatttggta 2820

cacgaaacca cgtttgcaat gtaacagttt agtataaacc tcttcctgta cataccgccg 2880

cgttccctta taattatagc tgtacggtgc gcgtatttgt ttgttaacgt tacaaaaaat 2940

atccctgtcc acgtccggcc aatactgcaa cgtgagcgcg tccaagtttg aatcttgcat 3000

atgcggaatg tacaaacgta cggcctctct cacacaatgc gcaaaactgg ccgatggtcg 3060

gaatccaaaa ttcgacgtcg tcgtcgattg ctagttcctt gtagttgcta aaatctatgc 3120

attgcgacga gtccgtgttg gccacccaac gcccttcttt gtaaatgctg ttgttgtagc 3180

aattactggt gtgtgccggc ggattggtgc acggcattct tagctatagt caaccgctct 3240

tcgtttttga aagacaatac tataaaattg tgacctttta cattatccac attctgagtc 3300

aaatactgtt cgacaatgtg catgctgccg tcctccttct taaccttttt taaattttcc 3360

gcgttattat tactcgcaat attgtcatga tattctagaa gatcataatc agccatacca 3420

catttgtaga ggttttactt gctttaaaaa acctcccaca cctccccctg aacctgaaac 3480

ataaaatgaa tgcaattgtt gttgttaact tgtttattgc agcttataat ggttacaaat 3540

aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata aagcattttt ttcactgcag atctgcgcgc 3600

gatcgatatc agcgctttaa atttgcgcat gctagctata gttctagagg taccgtcccc 3660

catccagcag tcctggtcgg tggggacgaa gtacggctcc gcagcgacag cgacgtcgat 3720

tgaccactcc gccatggtgt ggacgaggag atcctgtgcc ctggcggagt ggttcaaatt 3780

actttgaagg aagcgatgga cacaacccat tacggggcta catccatcgc tccctcgtct 3840

gttccgccct gcggctcgac aacagccgcg gcgggaactg actcgccggc tgcccttgtt 3900

gcagccggct tctttttctt tccgcccctc ctcgtttttg tagaggaggg ggcggacttg 3960

cacgccgggc ccccggcccg gtggtcagcc ttccttttag ccgcgtcgca caagacgcag 4020

tgcggcgcgg ctgcggtgca ggaggctgcc ttgtgccccg gttggccgca gcggaagcac 4080

aggttgctgc ggtccccgat agctgttgtc ctatccaatt ccattttttt ttcaagtaag 4140

ccaaatttgg agtatgacaa cgtattaaga ctaaataatt tcaggcatct tgaagtaatg 4200

ccatacatgt attaaagaac agttcaaaaa catttcatga atcttgacat aataaatata 4260

tctttaatgt cttaaatgaa ctcatcacga aaatgaacga aaactctgca ataaggatga 4320

taatatttac ttctttgttt cagtaatatt ttccaaattt atcaccaatc tatcgatttc 4380

gtgattatca cgtctcaatt taattttgtt ttcactttga aatgtaataa tatacacatt 4440

tcaatcagat aatcttgatc aagattgttt taatgtacgt cagctaatag agaatacgtt 4500

atcagcttaa gcgtaggaaa cagtataaat accgaatgaa aattcaataa atcgtacaca 4560

tttatttggt gaggtaagag catttgtgtt tctcagggaa acactgaaaa ttacataaat 4620

tttaacttct gttctctcta tcaaaacaat ttcaaatcat accagtttaa atcgcaggtg 4680

ccaagtaaca tttatacttc attattgtac gtttctttca gcaaaagcgg ccgcatgcct 4740

gatggcgagg gtgttcctca cctcgttgac ctggaagaac cggccgagga agacatcctt 4800

atgtcaagga acggtgcaaa caaccaatac tggcttttca ccagacgtaa ccaaaacaac 4860

catcaagtta ttacaaatgg caatgtcaac tctatccgga actcgaacta caatggaaac 4920

ctgcctctct ttgttattgt ccacggctgg aacagcaacg gaaactccgc tgtgaacacc 4980

atgatccgcc ccgccttgct ggccgtctcc gactgcaacg ttattgttgt ggactggcgt 5040

ggtcttgcca acggtctata caacactgcc gtcaatggag ttcccagtgt cggacagttc 5100

cttggcaact ttttggtctg gctcatcaac aacggaggcg gcaattgggg tcgagtccac 5160

ttgattggct tcagcttggg cgcgcacgtt gtcggtaacg ctggacgaca ggctggtggc 5220

agacccaaca gggttaccgg tttggatccg gctgggccca ggtggggtgg taacaaccaa 5280

gccctgaacc gtaacgcagg agcttatgtg gaggcaatcc acaccgacgg tggtcttctc 5340

ggtatttttg accgcattgc tcatggtgac ttttacccca acggtggcag aaacccccaa 5400

ccgggttgca gagttagtac ctgctctcac agtcgagcct acgaattgta cgcctccact 5460

gttcgtcaca atcgtttcgt tggcagacta tgtaacaacc tcaatcaggc tcagaacaat 5520

cagtgctctg gaggtacctt caacatgggt aatgccgtat ttggtaagcg cggaaacgga 5580

atctacggac tcagaactgg cagcagttgg cctttctaac tcgagagatc ataatcagcc 5640

ataccacatt tgtagaggtt ttacttgctt taaaaaacct cccacacctc cccctgaacc 5700

tgaaacataa aatgaatgca attgttgttg ttaacttgtt tattgcagct tataatggtt 5760

acaaataaag caatagcatc acaaatttca caaataaagc atttttttca ctgc 5814

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GP41上游引物

<400> 13

cgtagtagta gtaatcgccg c 21

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GP41下游引物

<400> 14

agtcgagtcg cgtcgcttt 19

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BmGAPDH上游引物

<400> 15

Gctgcctcct tgaccttttg c 21

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BmGAPDH下游引物

<400> 16

cattccgcgt ccctgttgct aat 23

Claims (7)

1.家蚕核型多角体病毒多基因反向重复序列和家蚕脂肪酶1基因在制备抗家蚕核型多角体病毒的家蚕品系中的应用，所述多基因反向重复序列的正向序列如SEQ ID NO.1所示，反向序列如SEQ ID NO.4所示，所述家蚕脂肪酶1基因如SEQ ID NO.11第1081-1965位所示核苷酸。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述家蚕核型多角体病毒多基因反向重复序列的正向序列和反向序列之间连入家蚕肌动蛋白基因Actin 3内含子，所述家蚕肌动蛋白基因Actin 3内含子的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

3.含家蚕核型多角体病毒多基因反向重复序列和家蚕脂肪酶1基因的重组载体，所述多基因反向重复序列的正向序列如SEQ ID NO.1所示，反向序列如SEQ ID NO.4所示，所述家蚕脂肪酶1基因如SEQ ID NO.11第1081-1965位所示核苷酸。

4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于：所述家蚕核型多角体病毒多基因反向重复序列的5’端为IE1启动子，所述家蚕脂肪酶1基因的5’端连接家蚕中肠特异表达启动子P2。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体的IE1启动子的5’端连接Hr3增强子。

6. 根据权利要求4或5所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体是由SEQ ID NO.12所述的载体序列经Asc Ⅰ酶切后回收含家蚕核型多角体病毒多基因反向重复序列和家蚕脂肪酶1基因的片段，连接经Asc Ⅰ酶切的piggyBac[3×p3 EGFP afm]载体而得。

7.权利要求6所述重组载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）合成SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶切后连接经同样双酶切的含家蚕肌动蛋白基因Actin 3内含子的pMD-19载体，得pMD-19-FS-A3intron载体；克隆如SEQ ID NO.4所示的序列，连入所得pMD-19-FS-A3intron载体的家蚕肌动蛋白基因Actin 3内含子的3’端，得pMD-19-FS-A3intron-FA载体；

（2）将步骤（1）所得pMD-19-FS-A3intron-FA载体用EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ进行双酶切，将含SEQ ID NO.1、家蚕肌动蛋白基因Actin 3内含子和SEQ ID NO.4的片段FS-A3intron-FA连入L4440载体的IE1启动子IE1P和SV40终止信号序列之间，得L4440-IE1P-FS-A3intron-FA-SV40载体；

（3）克隆家蚕中肠特异表达启动子P2和家蚕脂肪酶1基因，将家蚕中肠特异表达启动子P2用Kpn Ⅰ和Not Ⅰ酶切后连接经同样酶切的含SV40终止信号序列的pSLfa1180fa载体，得1180-P2-SV40载体，然后同时用Not Ⅰ和Xho Ⅰ酶切所得1180-P2-SV40载体和克隆的家蚕脂肪酶1基因，连接后得1180-P2-Bmlipase-1-SV40载体，载体序列如SEQ ID NO.11所示；

（4）克隆Hr3增强子，连接进pSLfa1180fa载体得1180-Hr3载体；将步骤（2）所得L4440-IE1P-FS-A3intron-FA-SV40载体中的含IE1启动子IE1P和FS-A3intron-FA的片段连接入所得1180-Hr3载体，得1180-Hr3-IE1P-FS-A3intron-FA-SV40载体，然后将所得1180-Hr3-IE1P-FS-A3intron-FA-SV40载体用Kpn Ⅰ和Hind Ⅲ进行双酶切，同时用Kpn Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切所得1180-P2-Bmlipase-1-SV40载体，将含家蚕中肠特异表达启动子P2和家蚕脂肪酶1基因的序列连接酶切后的1180-Hr3-IE1P-FS-A3intron-FA-SV40载体，得1180-Hr3-IE1P-FS-A3intron-FA-SV40-P2-Bmlipase-1-SV40载体，载体序列如SEQ ID NO.12所示；

（5）将步骤（4）所得1180-Hr3-IE1P-FS-A3intron-FA-SV40-P2-Bmlipase-1-SV40重组载体经Asc Ⅰ酶切后回收含家蚕核型多角体病毒多基因反向重复序列和家蚕脂肪酶1基因的片段，连接经Asc Ⅰ酶切的piggyBac[3×p3 EGFP afm]载体，得重组载体。