CN102925484A - 家蚕核型多角体病毒多基因反向重复序列和家蚕脂肪酶1基因的应用及其重组载体 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了家蚕核型多角体病毒BmNPV多基因反向重复序列和家蚕脂肪酶1基因的应用,具体为将BmNPV多基因反向重复序列和家蚕脂肪酶1基因用于构建重组载体,该载体能够表达干扰BmNPV多个基因的发夹RNA和家蚕脂肪酶1,通过增量表达Bmlipase-1在家蚕肠液中灭活BmNPV,减少侵入家蚕中肠细胞的BmNPV病毒数量;表达的发夹RNA能够降解BmNPV病毒基因的mRNA,抑制病毒在家蚕体内的复制增殖,利用该载体制备转基因家蚕后,能够有效抑制BmNPV在转基因家蚕体内的增殖并降低病毒含量,使家蚕在感染BmNPV后的存活率大大提高。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,特别是涉及家蚕核型多角体病毒多基因反向重复序列和家蚕脂肪酶1基因的应用,还涉及含有家蚕核型多角体病毒多基因反向重复序列和家蚕脂肪酶1基因的重组载体和制备方法。
背景技术
家蚕是重要的经济昆虫和鳞翅目昆虫模式生物,在我国已经有5000多年的饲养和驯化历史。蚕丝业是许多地区农民的主要经济收入来源之一,为世界经济、文化、社会发展做出了重要贡献。但是,当家蚕遭遇病毒侵害的时候,通常会对蚕丝业造成巨大的损失。据统计,我国养蚕的几个主产区,每年因病毒性疾病所造成的损失,约占蚕病总损失的70-80%。其中家蚕核型多角体病毒病是三大病毒病中最常见、危害最为严重的一种,该病传染性强,难以控制。
引起核型多角体病毒病的病原为家蚕核型多角体病毒(B ombyx mori Nuclear Polyhedrosis Virus,BmNPV)。
BmNPV属于杆状病毒科,真杆状病毒亚科,核型多角体病毒属,病毒粒子呈杆状,全基因组大小为128413bp。病毒结构主要由外层的囊膜和内层的核衣壳组成,在不同感染时期分别以出芽型病毒粒子(budded virus,BV)和包埋型病毒粒子(occluded virus, ODV)两种形态存在,而多角体是在感染细胞的核或质中产生的包含和保护病毒粒子的一种蛋白质结晶,很稳定。多角体病毒对不良环境、消毒药剂等有较强的抵抗性,在环境中可以长期存活,但极易溶于碱性溶液。BmNPV主要通过经口食下感染家蚕,当家蚕食下多角体病毒,在中肠强碱性消化液(pH9.2~9.4)作用下,多角体被溶解,释放的病毒粒子ODV借囊膜与中肠上皮细胞微绒毛膜的融合作用脱去囊膜,核衣壳进入中肠细胞开始原发感染(Primary infection),在细胞内复制核衣壳并通过“出芽”方式产生BV进入血体腔,继而感染其他组织细胞。最终,蚕体多以体壁破裂,流出病毒多角体浓汁而死。病毒多角体浓汁中含有大量的病毒粒子,污染蚕座环境,使得周围健康蚕感染病毒。可见,家蚕核型多角体病毒病是蚕业生产中的一个重要的危害原,一旦产生,极易爆发。
由于家蚕核型多角体病毒病在蚕业生产中危害严重,蚕业界一直希望能够培育出对此病毒具有较高抗性的蚕品种。但是,由于目前病毒致病分子机制研究较少,加之主要通过传统的方法进行遗传筛选,周期长而且定向性差,所以收效甚微。
转基因技术在生物素材创新、现代遗传育种等方面发挥着重要的作用。自2000年日本科学家报道首次成功培育转基因家蚕以来,国内外已陆续报道转基因家蚕成功的消息。2007年,印度学者报道通过转基因干涉病毒基因的方法来提高家蚕的抗性,他们利用的是家蚕多化性品系的非滞育卵,主要是因为多化性家蚕品种所产的卵为生种卵,其不需要任何的人工处理便能够在适当的温湿度下连续发育直至孵化,这个特点极大地方便了转基因实验中的操作控制。但是,通过转基因干涉利用多化性家蚕品种制备的抗病毒品系具有以下两个方面明显的缺陷:①生产用种普遍为二化性滞育种,用多化性家蚕品种制备的抗病毒品系不利于生产推广,同时与滞育性的家蚕品种相比较,多化性家蚕品种不具有滞育期,对其继代维持只能依靠连续的饲养繁殖,这样需要耗费大量的人力物力对获得的转基因家蚕品系进行维持和继代,同时也大大增加了获得的转基因家蚕品种资源丢失的风险。②转基因干涉品系只能在病毒入侵后抑制病毒的复制增殖,不能在病毒侵染的其他阶段发挥作用。因此,利用家蚕滞育品种,制备一种能在BmNPV病毒侵染的多个阶段发挥抑制作用的转基因品系是一个制备高抗病毒品种的有效方法。
在前期研究中,我们制备了增量表达家蚕内源抗性基因Bmlipase-1的转基因品系,检测结果显示该品系能显著提高家蚕对BmNPV的抵抗力。Bmlipase-1在家蚕中肠特异表达,然后分泌到家蚕肠液中发挥作用,该蛋白在肠液中能够抑制灭活BmNPV病毒,减少侵入家蚕中肠细胞的ODV病毒数量,从而提高家蚕对BmNPV的抗性,但是抗性提高有限。
发明内容
本发明的目的之一在于提供家蚕核型多角体病毒多基因反向重复序列和家蚕脂肪酶1基因的应用;本发明的目的之二在于提供含有家蚕核型多角体病毒多基因反向重复序列和家蚕脂肪酶1基因的重组载体;本发明的目的之三在于提供重组载体的制备方法。
1. 家蚕核型多角体病毒多基因反向重复序列和家蚕脂肪酶1基因在制备重组载体中的应用,所述多基因反向重复序列的正向序列如SEQ ID NO.1所示,反向序列如SEQ
ID NO.4所示,所述家蚕脂肪酶1基因如SEQ
ID NO.11第1081-1965位所示核苷酸。
更优选的,所述家蚕核型多角体病毒多基因反向重复序列的正向序列和反向序列之间连入家蚕肌动蛋白基因Actin 3内含子A3intron,所述家蚕肌动蛋白基因Actin 3内含子A3intron的核苷酸序列如SEQ
ID NO.5所示。
2.含所述家蚕核型多角体病毒多基因反向重复序列和家蚕脂肪酶1基因的重组载体。
优选的,所述家蚕核型多角体病毒多基因反向重复序列的5’端为IE1启动子,所述家蚕脂肪酶1基因的5’端连接家蚕中肠特异表达启动子P2。
更优选的,所述重组载体的IE1启动子的5’端连接Hr3增强子。
最优选的,所述重组载体是由SEQ
ID NO.12所述的载体序列经Asc Ⅰ酶切后回收含家蚕核型多角体病毒多基因反向重复序列和家蚕脂肪酶1基因的片段,连接经Asc Ⅰ酶切的piggyBac[3×p3 EGFP afm]载体而得。
3.所述重组载体的制备方法,包括如下步骤:
(1)合成SEQ
ID NO.1所示的核苷酸序列,经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶切后连接经同样双酶切的含家蚕肌动蛋白基因Actin 3内含子的pMD-19载体,得pMD-19-FS-A3intron载体;克隆如SEQ ID NO.4所示的序列,连入所得pMD-19-FS-A3intron载体的家蚕肌动蛋白基因Actin 3内含子的3’端,得pMD-19-FS-A3intron-FA载体;
(2)将步骤(1)所得pMD-19-FS-A3intron-FA载体用EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ进行双酶切,将含SEQ ID NO.1、家蚕肌动蛋白基因Actin 3内含子和SEQ
ID NO.4的片段FS-A3intron-FA连入L4440载体的IE1启动子IE1P和SV40终止信号序列之间,得L4440-IE1P-FS-A3intron-FA-SV40载体;
(3)克隆家蚕中肠特异表达启动子P2和家蚕脂肪酶1基因,将家蚕中肠特异表达启动子P2用Kpn Ⅰ和Not Ⅰ酶切后连接经同样酶切的含SV40终止信号序列的pSLfa1180fa载体,得1180-P2-SV40载体,然后同时用Not Ⅰ和Xho Ⅰ酶切所得1180-P2-SV40载体和克隆的家蚕脂肪酶1基因,连接后得1180-P2-Bmlipase-1-SV40载体,载体序列如SEQ ID NO.11所示;
(4)克隆Hr3增强子,连接进pSLfa1180fa载体得1180-Hr3载体;将步骤(2)所得L4440-IE1P-FS-A3intron-FA-SV40载体中的含IE1启动子IE1P和FS-A3intron-FA的片段连接入所得1180-Hr3载体,得1180-Hr3-IE1P-FS-A3intron-FA-SV40载体,然后将所得1180-Hr3-IE1P-FS-A3intron-FA-SV40载体用Kpn Ⅰ和Hind Ⅲ进行双酶切,同时用Kpn Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切所得1180-P2-Bmlipase-1-SV40载体,将含家蚕中肠特异表达启动子P2和家蚕脂肪酶1基因的序列连接酶切后的1180-Hr3-IE1P-FS-A3intron-FA-SV40载体,得1180-Hr3-IE1P-FS-A3intron-FA-SV40-P2-Bmlipase-1-SV40载体,载体序列如SEQ ID NO.12所示;
(5)将步骤(4)所得1180-Hr3-IE1P-FS-A3intron-FA-SV40-P2-Bmlipase-1-SV40重组载体经Asc Ⅰ酶切后回收含家蚕核型多角体病毒多基因反向重复序列和家蚕脂肪酶1基因的片段,连接经Asc Ⅰ酶切的piggyBac[3×p3 EGFP afm]载体,得重组载体。
本发明的有益效果在于:为了获得高抗家蚕核型多角体病毒的家蚕品系,将家蚕核型多角体病毒多基因反向重复序列与家蚕脂肪酶1基因进行联合应用,在同一载体中实现同时表达抗性基因家蚕脂肪酶1和表达干扰家蚕核型多角体病毒复制的反向重复序列,反向重复序列中含有家蚕核型多角体病毒的ie1、gp64、lef1、lef2和DNA 聚合酶基因的双链RNA,经家蚕体内加工后,形成小分子双链RNA,因此能在病毒侵染的多个阶段抑制病毒,控制家蚕核型多角体病毒在家蚕体内繁殖,降低家蚕核型多角体病毒在体内的含量,从而达到抗家蚕核型多角体病毒的效果。利用该载体转化家蚕后,抗病毒效果明显,与未转化的相比,存活率提高51.11%,并且转化该载体后不影响家蚕的经济形状,因此用于育种,获得高抗家蚕核型多角体病毒的家蚕品系。
附图说明
图1为pb-HFPL重组载体结构图。
图2为转基因家蚕和非转基因家蚕抗性检测结果图(SW-H1、SW-H2和SW-H3分别为不同转基因品系;SW为非转基因品种)。
图3为转基因系统SW-H1和非转基因品种SW感染病毒后gp41基因的荧光定量PCR结果。
图4为转基因家蚕和非转基因品种的全茧量和茧层率(A:全茧量;B:茧层率)。
具体实施方式:
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如分子克隆实验指南(第三版,J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例中使用的家蚕品种为“芙蓉”品种,由中国西南大学家蚕基因资源库提供。
实施例 1、构建转基因载体
一、构建L4440-IE1P-FS-A3intron-FA-SV40载体
(1)根据已经报道的BmNPV 基因组序列及家蚕核型多角体病毒的ie1(GenBank: N0.X58442.1)、gp64(GenBank: N0. AB253773.1)、lef1(GenBank: N0. L09723.1)、lef2(GenBank: AF036245.1)和DNA 聚合酶基因(GenBank: N0. D16231.1)5个基因的序列,人工合成包括以上所述5个基因部分序列的串联DNA双链序列,命名为FS,如SEQ ID NO.1所示。在FS的5’端设置有EcoR Ⅰ酶切位点,FS的3’端设置有BamHⅠ酶切位点。根据人工合成的FS序列设计扩增FS的反向互补序列FA,上游引物为FA sense:5'-cccaagcttcgctgtctgaactatcacaa-3'(SEQ ID NO.2),下划线为HindⅢ酶切位点;下游引物为FA anti: 5'-gctctagaatatcatgacaatattgcgag-3'(SEQ ID NO.3),下划线为Xba Ⅰ酶切位点,以人工合成的FS为模板进行PCR扩增,PCR反应条件为:94℃预变性4分钟,然后94℃变性40秒、50℃退火40秒、72℃延伸45秒,共30个循环,最后72℃延伸10分钟;PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收,然后与pMD19-T simple载体连接,连接反应在T4 DNA 连接酶作用下,16℃过夜连接,然后转化DH5a感受态细胞,获得阳性克隆后送往上海生工生物技术有限公司测序,测序结果表明本实施例成功克隆了FS的反向互补序列FA,如SEQ ID NO.4所示核酸序列。
(2) 将人工合成的FS序列用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ进行双酶切,经琼脂糖电泳鉴定并回收,得FS酶切片段,同时用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切已经包含家蚕肌动蛋白基因Actin 3内含子(简称A3intron)的pMD-19载体,A3intron的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示,经琼脂糖电泳鉴定并回收,得pMD-19载体酶切片段。将FS酶切片段和pMD-19载体酶切片段连接,然后进行转化,筛选阳性克隆,得到含FS 和A3intron的载体,命名为pMD-19-FS-A3intron;将反向互补片段FA和pMD-19-FS-A3intron载体分别用Hind Ⅲ和Xba Ⅰ进行双酶切,回收目的条带后连接转化,筛选阳性克隆,得到含FS、A3intron和FA的载体,命名为pMD-19-FS-A3intron-FA载体。pMD-19-FS-A3intron-FA载体中,A3intron位于FS序列和FA序列之间,因此表达含FS、A3intron和FA的片段(命名为FS-A3intron-FA)后能形成回文结构。
(3)将已经包含IE1启动子(简称IE1P)和SV40终止信号序列的L4440载体用EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ进行双酶切,收集L4440载体骨架,同时用EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ酶切pMD-19-FS-A3intron-FA载体,回收含有FS、A3intron和FA的片段,然后与L4440载体骨架连接,转化,筛选阳性克隆,得到L4440-IE1P-FS-A3intron-FA-SV40载体,序列如SEQ ID NO.6所示。L4440-IE1P-FS-A3intron-FA-SV40载体即在L4440载体的IE1启动子和SV40终止信号序列之间插入了FS-A3intron-FA序列。
(二) 构建1180-P2-Bmlipase-1-SV40载体
(1)根据公开号为102296070A的中国专利公开的家蚕中肠特异表达启动子P2的序列,设计引物 ,上游引物为P2
sense:5'-ggggtaccgtcccccatccagcagtc-3'(SEQ
ID NO.7),下划线为Kpn Ⅰ酶切位点,下游引物为P2
anti:5'-ataagaatgcggccgcttttgctgaaagaaacgtacaata-3'(SEQ
ID NO.8),下划线为Not Ⅰ酶切位点。以家蚕基因组DNA为模板进行PCR扩增,PCR反应条件为:94℃预变性4分钟,然后94℃变性40秒、57℃退火40秒、72℃延伸55秒,共30个循环,最后72℃延伸10分钟;PCR产物经回收、克隆和测序,测序结果显示克隆获得序列与公开的家蚕中肠特异表达启动子P2的序列一致。
(2)根据已经报道的家蚕脂肪酶1(简称为Bmlipase-1)的基因序列(GenBank: N0. AB076385),设计引物,上游引物为Bmlipase-1 sense:5'-ataagaatgcggccgcatgcctgatggcgagggtgt-3'(SEQ
ID NO.9),下划线为Not Ⅰ酶切位点;下游引物为Bmlipase-1 anti:5'-ccgctcgagttagaaaggccaactgctgcc-3'(SEQ
ID NO.10),下划线为Xho Ⅰ酶切位点,以家蚕cDNA为模板进行PCR扩增,PCR反应条件为:94℃预变性4分钟,然后94℃变性40秒、62℃退火40秒、72℃延伸45秒,共30个循环,最后72℃延伸10分钟;PCR产物经回收、克隆和测序,证明成功克隆Bmlipase-1基因。
(3) 将已含有SV40终止信号序列的pSLfa1180fa载体用Kpn Ⅰ和Not Ⅰ双酶切,回收pSLfa1180fa载体骨架,同时用Kpn Ⅰ和Not Ⅰ双酶切克隆所得家蚕中肠特异表达启动子P2,回收目的条带。将回收的家蚕中肠特异表达启动子P2与pSLfa1180fa载体骨架连接后转化,筛选阳性克隆,得到在pSLfa1180fa载体的SV40终止信号序列前插入家蚕中肠特异表达启动子P2的载体,命名为1180-P2-SV40载体。将所得1180-P2-SV40载体用Not Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切,回收载体骨架,同时用Not Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切克隆的Bmlipase-1基因,回收目的条带,然后将回收的1180-P2-SV40载体骨架与Bmlipase-1基因连接,即将Bmlipase-1基因连入1180-P2-SV40的家蚕中肠特异表达启动子P2和SV40终止信号序列之间,得1180-P2-Bmlipase-1-SV40载体(SEQ ID NO.11)。
(三) 构建pBac[Hr3-IE1P-FS-A3intron-FA-SV40-P2-Bmlipase-1-SV40-3×P3-EGFP
afm]载体
(1) 根据公开号为102492692A的中国专利公开的Hr3增强子序列,用Nco Ⅰ单酶切以后连接到1180载体上,得到1180-Hr3载体,将1180-Hr3载体用Sal Ⅰ和Bgl Ⅱ进行双酶切,回收载体骨架,然后将L4440-IE1P-FS-A3intron-FA-SV40用Sal Ⅰ和Bgl Ⅱ进行双酶切,回收含IE1启动子、FS-A3intron-FA和SV40终止信号序列的片段,然后连入1180-Hr3载体骨架的Hr3增强子序列之后、转化,筛选阳性克隆,得到1180-Hr3-IE1P-FS-A3intron-FA-SV40载体。
将1180-Hr3-IE1P-FS-A3intron-FA-SV40载体用Kpn Ⅰ和Hind Ⅲ进行双酶切,回收载体骨架;同时用Kpn Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切1180-P2-Bmlipase-1-SV40载体,回收含家蚕中肠特异表达启动子P2、Bmlipase-1和SV40终止信号序列的片段(简称为P2-Bmlipase-1-SV40)。将回收的P2-Bmlipase-1-SV40片段连入1180-Hr3-IE1P-FS-A3intron-FA-SV40载体的酶切位点处,即将P2-Bmlipase-1-SV40连入1180-Hr3-IE1P-FS-A3intron-FA-SV40载体,得到1180-Hr3-IE1P -FS-A3intron-FA-SV40-P2-Bmlipase-1-SV40载体,载体序列如SEQ ID NO.12所示。
(2) 用限制性内切酶Asc Ⅰ酶切1180-Hr3-IE1P-FS-A3intron-FA-SV40-P2-Bmlipase-1-SV40载体,琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收,得依次含有Hr3增强子、IE1启动子、FS-A3intron-FA序列、SV40终止信号序列、家蚕中肠特异表达启动子P2、Bmlipase-1基因序列和SV40终止信号序列的片段,命名为Hr3-IE1P-FS-A3intron-FA-SV40-P2-Bmlipase-1-SV40片段;同时用内切酶Asc Ⅰ单酶切piggyBac[3×p3 EGFP afm],得piggyBac[3×p3
EGFP afm]线性片段,然后对获得piggyBac[3×p3 EGFP afm]线性片段5’端去磷酸化,将Hr3-IE1P-FS-A3intron-FA-SV40-P2-Bmlipase-1-SV40和piggyBac[3×p3 EGFP
afm]连接,转化后筛选阳性克隆,得到重组载体pBac[Hr3-IE1P-FS-A3intron-FA-SV40-P2-Bmlipase-1-SV40 -3×P3-EGFP afm] (命名为pb-HFPL重组载体),结构如图1所示。
实施例 2、转基因显微注射和阳性个体的筛选
(1)将家蚕“芙蓉”品种蚕卵浸酸(盐酸浓度为1.073
g/mL,温度为46℃,时间为5分钟)解除滞育以后,放于15℃和80%湿度的黑暗环境中催青30天左右直至孵化,将蚁蚕收好置于标准环境中饲养(温度:25℃,湿度:80%),化蛾以后将雌雄蚕蛾交配4小时,拆对后产下的蚕卵为非滞育蚕卵,用于下一步的显微注射。
(2)将产下的蚕卵在干净的载玻片上排列整齐,在蚕卵产后2小时用Eppendorf显微注射仪将pb-HFPL重组载体和辅助质粒A3H,一起注射进387粒蚕卵中,用无毒胶水封口以后置于25℃、相对湿度80%的环境中催青10天左右孵化,将孵化的226头G0代蚁蚕用桑叶收集饲养至化蛾,G0代蚕蛾通过自交或回交共获得51个蛾圈G1代蚕卵,用 Olympus®电动宏观荧光显微镜观察G1胚胎筛选并获得21个阳性蛾圈,转化效率为41.18%。
(3)随机选择3个阳性蛾圈各自单蛾圈饲养,继代扩大得到3个转基因系统,分别命名为SW-H1、SW-H2和SW-H3。
实施例
3
、转基因系统的抗性检测
取转基因家蚕SW-H1、SW-H2、SW-H3和非转基因家蚕SW(亲本芙蓉品种),在3龄起蚕时期以5×105多角体/头单头经口添食BmNPV病毒,4个系统各设置3个重复区,每个重复区60头蚕,同时设置3个不攻毒对照区SW(C),连续10天统计死亡率。统计结果如图2所示,由图2可知,SW-H1、SW-H2、SW-H3和SW的存活率分别为64.03%、61.42%、60.10%和12.92%,转基因系统的抗性明显高于非转基因对照,SW-H1的存活率提高了51.11%。
与2007年Kanginakudru,S.和2012年Liang
Jiang研究结果相比,发现同时增量表达抗性基因和干涉多个病毒基因能进一步提高家蚕对BmNPV病毒的抗性(参见Liang
Jiang.,et al. 2012. Resistance to Bombyx mori nucleopolyhedrovirus via
overexpression of an endogenous antiviral gene in transgenic silkworms. Arch
Virol 157,1323-1328.和Kanginakudru,S.,et al. 2007. Targeting ie-1
gene by RNAi induces baculoviral resistance in lepidopteran cell lines and in
transgenic silkworms. Insect Mol Biol 16,635-644.)。
实施例
4
、定量
PCR
检测攻毒后家蚕中
BmNPV
病毒的含量
在攻毒后48h,转基因系统SW-H1和非转基因品种SW各取10头蚕提取总DNA。每个DNA模板各取20 ng,以BmNPV病毒gp41基因的特异引物进行定量PCR检测,上游引物为GP41 F:
5‘-cgtagtagtagtaatcgccgc-3’ (SEQ ID NO.13),GP41 R: 5‘-agtcgagtcgcgtcgcttt-3’ (SEQ ID NO.14),以家蚕看家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(BmGAPDH)为内参,上游引物为BmGAPDH F: 5‘-gctgcctccttgaccttttgc-3’ (SEQ ID NO.15),下游引物为BmGAPDH R: 5‘
-cattccgcgtccctgttgctaat- 3’(SEQ
ID NO.16)。荧光定量使用TaKaRa公司的SYBR Premix Ex Taq Kit试剂盒,定量PCR检测仪器为ABI StepOnePlusTM
Real-Time PCR System,Applied
Biosystems,具体操作按照试剂盒和仪器说明书进行操作。荧光定量PCR的结果如图3所示。由图3可知,在食下病毒量一致的情况下,在攻毒后48h,gp41基因的拷贝数在SW-H1中的含量不到SW中的10%。表明BmNPV病毒在SW-H1转基因系统中拷贝数极低,因此SW-H1明显抑制了BmNPV病毒在其体内的复制增殖,提高了蚕体对BmNPV病毒的抗性,从而使存活率显著提高。
实施例
5
、调查转基因系统的经济性状
SW-H1、SW-H2、SW-H3和非转基因品种SW各系统各自随机抽取30颗茧,分别称取每颗茧的全茧量和茧层率。统计的全茧量结果显示(如图4A所示)转基因系统和非转基因品种SW之间差异不显著,因此,转基因对全茧量无影响。同时,统计SW-H1、SW-H2、SW-H3和非转基因品种SW的茧层率(如图4B所示),结果显示转基因系统和非转基因品种SW之间茧层率没有明显差异,因此转基因对茧层率也无影响。
以上调查结果显示转基因系统在抗性显著提高的同时没有影响其正常的经济性状,预示着该品种可以在蚕业生产进行推广使用。
实施例
6
、
pb-HFPL
重组载体转化的家蚕其他品种
我们按照前述的方法,将pb-HFPL重组载体通过转基因显微注射方法导入家蚕品种932、7532、湘晖、苍松、碧海、日新、星月、781、夏芳-A、夏芳-B、秋白-A、秋白-B、8810、8711、彩黄1、彩黄2,制备以上每个品种的转基因系统。对获得的转基因系统检测其对BmNPV病毒抗性,并调查其经济性状。结果显示,获得的转基因系统抗性提高,并不影响家蚕的经济性状。
最后说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述,但本领域的普通技术人员应当理解,可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变,而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
<110> 西南大学
<120> 家蚕核型多角体病毒多基因反向重复序列和家蚕脂肪酶1基因的应用及其重组载体
<160> 16
<210> 1
<211> 878
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FS序列
<400> 1
gaattcatat catgacaata ttgcgagtaa taataacgcg gaaaatttaa
aaaaggttaa 60
gaaggaggac ggcagcatgc acattgtcga acagtatttg actcagaatg tggataatgt
120
aaaaggtcac aattttatag tattgtcttt caaaaacgaa gagcggttga ctatagctaa
180
gaatgccgtg caccaatccg ccggcacaca ccagtaattg ctacaacaac agcatttaca
240
aagaagggcg ttgggtggcc aacacggact cgtcgcaatg catagatttt agcaactaca
300
aggaactagc aatcgacgac gacgtcgaat tttggattcc gaccatcggc cagttttgcg
360
cattgtgtga gagaggccgt acgtttgtac attccgcata tgcaagattc aaacttggac
420
gcgctcacgt tgcagtattg gccggacgtg gacagggata ttttttgtaa cgttaacaaa
480
caaatacgcg caccgtacag ctataattat aagggaacgc ggcggtatgt acaggaagag
540
gtttatacta aactgttaca ttgcaaacgt ggtttcgtgt accaaatgtg aaaaccgatg
600
tttgatcaag gctctgacac atttttacaa ttacgactcc aagtgtgtgg gtgaagtcat
660
gcatctttta atcaaatccc aagatgagga taatcttgca aagtgtttta ccgcaattat
720
gcaaaagtac atgcagaatc aattgtacga tcgaaaagaa ccagtgttag taaaaattaa
780
ccaaaaaaaa tgcagtgtca aacgcaaacg tgacgacgac gacgacaata atgatgatga
840
tgatgacgat ggttgtgata gttcagacag
cgggatcc
878
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FA上游引物
<400> 2
cccaagcttc gctgtctgaa ctatcacaa 29
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FA下游引物
<400> 3
gctctagaat atcatgacaa tattgcgag 29
<210> 4
<211> 878
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FA序列
<400> 4
aagcttcgct gtctgaacta tcacaaccat cgtcatcatc atcatcatta
ttgtcgtcgt 60
cgtcgtcacg tttgcgtttg acactgcatt ttttttggtt aatttttact aacactggtt
120
cttttcgatc gtacaattga ttctgcatgt acttttgcat aattgcggta aaacactttg
180
caagattatc ctcatcttgg gatttgatta aaagatgcat gacttcaccc acacacttgg
240
agtcgtaatt gtaaaaatgt gtcagagcct tgatcaaaca tcggttttca catttggtac
300
acgaaaccac gtttgcaatg taacagttta gtataaacct cttcctgtac ataccgccgc
360
gttcccttat aattatagct gtacggtgcg cgtatttgtt tgttaacgtt acaaaaaata
420
tccctgtcca cgtccggcca atactgcaac gtgagcgcgt ccaagtttga atcttgcata
480
tgcggaatgt acaaacgtac ggcctctctc acacaatgcg caaaactggc cgatggtcgg
540
aatccaaaat tcgacgtcgt cgtcgattgc tagttccttg tagttgctaa aatctatgca
600
ttgcgacgag tccgtgttgg ccacccaacg cccttctttg taaatgctgt tgttgtagca
660
attactggtg tgtgccggcg gattggtgca cggcattctt agctatagtc aaccgctctt
720
cgtttttgaa agacaatact ataaaattgt gaccttttac attatccaca ttctgagtca
780
aatactgttc gacaatgtgc atgctgccgt cctccttctt aacctttttt aaattttccg
840
cgttattatt actcgcaata ttgtcatgat
attctaga
878
<210> 5
<211> 96
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 家蚕肌动蛋白基因Actin 3内含子序列
<400> 5
cggtgagctc atcgattctg gactatgcac ttcgcctctc ggccggtggg ccgttatcga 60
ccgttatctg acgaatgact ttgttctgtt
tcagcc
96
<210> 6
<211> 2605
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L4440-IE1P-FS-A3-FA-SV40载体序列
<400> 6
aagcttcgat gtctttgtga tgcgccgaca tttttgtagg ttattgataa
aatgaacgga 60
tacagttgcc cgacattatc attaaatcct tggcgtagaa tttgtcgggt ccattgtccg
120
tgtgcgctag catgcccgct aacggacctc gtacttttgg cttcaaaggt tttgcgcaca
180
gacaaaatgt gccacacttg cagctctgca tgtgtgcgcg ttaccacaaa tcccaacggc
240
gcagtgtact tgttgtatgc aaataaatct cgataaaggc gcggcgcgcg aatgcagctg
300
atcacgtacg ctcctcgtgt tccgttcaag gacggtgtta tcgacctcag attaatgttt
360
atcggccgac tgttttcgta tccgctcacc aaacgcgttt ttgcattaac attgtatgtc
420
ggcggatgtt ctatatctaa tttgaataaa taaacgataa ccgcgttggt tttagagggc 480
ataataaaag aaatattgtt atcgtgttcg ccattagggc agtataaatt gacgttcatg
540
ttggatattg tttcagttgc aagtgaattc atatcatgac aatattgcga gtaataataa
600
cgcggaaaat ttaaaaaagg ttaagaagga ggacggcagc atgcacattg tcgaacagta
660
tttgactcag aatgtggata atgtaaaagg tcacaatttt atagtattgt ctttcaaaaa
720
cgaagagcgg ttgactatag ctaagaatgc cgtgcaccaa tccgccggca cacaccagta
780
attgctacaa caacagcatt tacaaagaag ggcgttgggt ggccaacacg gactcgtcgc
840
aatgcataga ttttagcaac tacaaggaac tagcaatcga cgacgacgtc gaattttgga
900
ttccgaccat cggccagttt tgcgcattgt gtgagagagg ccgtacgttt gtacattccg
960
catatgcaag attcaaactt ggacgcgctc acgttgcagt attggccgga cgtggacagg
1020
gatatttttt gtaacgttaa caaacaaata cgcgcaccgt acagctataa ttataaggga
1080
acgcggcggt atgtacagga agaggtttat actaaactgt tacattgcaa acgtggtttc
1140
gtgtaccaaa tgtgaaaacc gatgtttgat caaggctctg acacattttt acaattacga
1200
ctccaagtgt gtgggtgaag tcatgcatct tttaatcaaa tcccaagatg aggataatct
1260
tgcaaagtgt tttaccgcaa ttatgcaaaa gtacatgcag aatcaattgt acgatcgaaa
1320
agaaccagtg ttagtaaaaa ttaaccaaaa aaaatgcagt gtcaaacgca aacgtgacga
1380
cgacgacgac aataatgatg atgatgatga cgatggttgt gatagttcag acagcgggat
1440
cccggtgagc tcatcgattc tggactatgc acttcgcctc tcggccggtg ggccgttatc
1500
gaccgttatc tgacgaatga ctttgttctg tttcagccaa gcttcgctgt ctgaactatc
1560
acaaccatcg tcatcatcat catcattatt gtcgtcgtcg tcgtcacgtt tgcgtttgac
1620
actgcatttt ttttggttaa tttttactaa cactggttct tttcgatcgt acaattgatt
1680
ctgcatgtac ttttgcataa ttgcggtaaa acactttgca agattatcct catcttggga
1740
tttgattaaa agatgcatga cttcacccac acacttggag tcgtaattgt aaaaatgtgt
1800
cagagccttg atcaaacatc ggttttcaca tttggtacac gaaaccacgt ttgcaatgta
1860
acagtttagt ataaacctct tcctgtacat accgccgcgt tcccttataa ttatagctgt
1920
acggtgcgcg tatttgtttg ttaacgttac aaaaaatatc cctgtccacg tccggccaat
1980
actgcaacgt gagcgcgtcc aagtttgaat cttgcatatg cggaatgtac aaacgtacgg
2040
cctctctcac acaatgcgca aaactggccg atggtcggaa tccaaaattc gacgtcgtcg
2100
tcgattgcta gttccttgta gttgctaaaa tctatgcatt gcgacgagtc cgtgttggcc
2160
acccaacgcc cttctttgta aatgctgttg ttgtagcaat tactggtgtg tgccggcgga
2220
ttggtgcacg gcattcttag ctatagtcaa ccgctcttcg tttttgaaag acaatactat
2280
aaaattgtga ccttttacat tatccacatt ctgagtcaaa tactgttcga caatgtgcat
2340
gctgccgtcc tccttcttaa ccttttttaa attttccgcg ttattattac tcgcaatatt
2400
gtcatgatat tctagaagat cataatcagc cataccacat ttgtagaggt tttacttgct
2460
ttaaaaaacc tcccacacct ccccctgaac ctgaaacata aaatgaatgc aattgttgtt
2520
gttaacttgt ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc
2580
acaaataaag catttttttc
actgc
2605
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P2上游引物
<400> 7
ggggtaccgt cccccatcca gcagtc 28
<210> 8
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P2下游引物
<400> 8
ataagaatgc ggccgctttt gctgaaagaa acgtacaata 40
<210> 9
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Bmlipase-1上游引物
<400> 9
ataagaatgc ggccgcatgc ctgatggcga gggtgt
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Bmlipase-1下游引物
<400> 10
ccgctcgagt tagaaaggcc aactgctgcc 30
<210> 11
<211> 2160
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1180-P2-Bmlipase-1-SV40载体序列
<400> 11
gtcccccatc cagcagtcct ggtcggtggg gacgaagtac ggctccgcag
cgacagcgac 60
gtcgattgac cactccgcca tggtgtggac gaggagatcc tgtgccctgg cggagtggtt
120
caaattactt tgaaggaagc gatggacaca acccattacg gggctacatc catcgctccc
180
tcgtctgttc cgccctgcgg ctcgacaaca gccgcggcgg gaactgactc gccggctgcc
240
cttgttgcag ccggcttctt tttctttccg cccctcctcg tttttgtaga ggagggggcg
300
gacttgcacg ccgggccccc ggcccggtgg tcagccttcc ttttagccgc gtcgcacaag
360
acgcagtgcg gcgcggctgc ggtgcaggag gctgccttgt gccccggttg gccgcagcgg
420
aagcacaggt tgctgcggtc cccgatagct gttgtcctat ccaattccat ttttttttca
480
agtaagccaa atttggagta tgacaacgta ttaagactaa ataatttcag gcatcttgaa
540
gtaatgccat acatgtatta aagaacagtt caaaaacatt tcatgaatct tgacataata
600
aatatatctt taatgtctta aatgaactca tcacgaaaat gaacgaaaac tctgcaataa
660
ggatgataat atttacttct ttgtttcagt aatattttcc aaatttatca ccaatctatc
720
gatttcgtga ttatcacgtc tcaatttaat tttgttttca ctttgaaatg taataatata
780
cacatttcaa tcagataatc ttgatcaaga ttgttttaat gtacgtcagc taatagagaa
840
tacgttatca gcttaagcgt aggaaacagt ataaataccg aatgaaaatt caataaatcg
900
tacacattta tttggtgagg taagagcatt tgtgtttctc agggaaacac tgaaaattac
960
ataaatttta acttctgttc tctctatcaa aacaatttca aatcatacca gtttaaatcg
1020
caggtgccaa gtaacattta tacttcatta ttgtacgttt ctttcagcaa aagcggccgc
1080
atgcctgatg gcgagggtgt tcctcacctc gttgacctgg aagaaccggc cgaggaagac
1140
atccttatgt caaggaacgg tgcaaacaac caatactggc ttttcaccag acgtaaccaa
1200
aacaaccatc aagttattac aaatggcaat gtcaactcta tccggaactc gaactacaat
1260
ggaaacctgc ctctctttgt tattgtccac ggctggaaca gcaacggaaa ctccgctgtg
1320
aacaccatga tccgccccgc cttgctggcc gtctccgact gcaacgttat tgttgtggac
1380
tggcgtggtc ttgccaacgg tctatacaac actgccgtca atggagttcc cagtgtcgga
1440
cagttccttg gcaacttttt ggtctggctc atcaacaacg gaggcggcaa ttggggtcga
1500
gtccacttga ttggcttcag cttgggcgcg cacgttgtcg gtaacgctgg acgacaggct
1560
ggtggcagac ccaacagggt taccggtttg gatccggctg ggcccaggtg gggtggtaac
1620
aaccaagccc tgaaccgtaa cgcaggagct tatgtggagg caatccacac cgacggtggt
1680
cttctcggta tttttgaccg cattgctcat ggtgactttt accccaacgg tggcagaaac
1740
ccccaaccgg gttgcagagt tagtacctgc tctcacagtc gagcctacga attgtacgcc
1800
tccactgttc gtcacaatcg tttcgttggc agactatgta acaacctcaa tcaggctcag
1860
aacaatcagt gctctggagg taccttcaac atgggtaatg ccgtatttgg taagcgcgga
1920
aacggaatct acggactcag aactggcagc agttggcctt tctaactcga gagatcataa
1980
tcagccatac cacatttgta gaggttttac ttgctttaaa aaacctccca cacctccccc
2040
tgaacctgaa acataaaatg aatgcaattg ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttata
2100
atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc 2160
<210> 12
<211> 5814
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1180-Hr3-IE1P-FS-A3intron-FA-SV40-P2-Bmlipase-1-SV40载体序列
<400> 12
ccatggaaaa agaagccgtg cccagtcacg tgtacgccaa cctgaacacg
caatccaacg 60
acggcgtcaa atacaatcgt tggttgcacg ctaaaaatga ccaatacatg gcgtgtcctg
120
aagaattgta cgataacaac gaatttaaat gtaacgtaga atcggataaa ttatattatt
180
tggataattt acaagaagat tccattgtat aaacatttta tgtcgaaaac aaatgacatc
240
agcttatgat tcatacttaa tcgtgcgtta caagtagaat tctactcgta aagcgagttt
300
aatttggaaa aacaaattag tcattattaa acatgttaac aatcgtgtat aaaatgacat
360
cagtttaatg atgacatcat ctcttgatta tgttttacac gtagaattct actcgtaaag
420
ccagttcagt tttgaaaaac aaatgacatc atctcttgat tatgttttac aagtagaatt
480
ctactcgtaa agccggttca gttttgaaaa acaaatgaca tcatctcttg actgtgtttt
540
acacgtagaa ttctactcgc aaagcaagtt tagttttgaa aaacaaatga catcattcag
600
ttttgaaaaa caaatgacat catctcttga ttgtgtttta cacgtagaat tctgctcgta
660
aagcgagttt ggttttgaaa aacaaatgac atcatttctt aaattcggtt ttgaaaaacg
720
aatgacatca tcttttgatt gtgttttaca cgtagaattc tactcgtaaa gcgagtttgg
780
ttttgaaaaa caaatgacat catctcttga ttatgtttta cacgtagaat tctactcgta
840
aagcgagtta gttttaaaaa acaaatgaca tcatcttaga ggtagacccg tcttggcgac
900
gggtctgctc atacgtcgtt ttgtatttgt cattgcctct tttcacgacg ctgccatggc
960
catgggacgt cgacggtatc gataagcttc gatgtctttg tgatgcgccg acatttttgt
1020
aggttattga taaaatgaac ggatacagtt gcccgacatt atcattaaat ccttggcgta
1080
gaatttgtcg ggtccattgt ccgtgtgcgc tagcatgccc gctaacggac ctcgtacttt
1140
tggcttcaaa ggttttgcgc acagacaaaa tgtgccacac ttgcagctct gcatgtgtgc
1200
gcgttaccac aaatcccaac ggcgcagtgt acttgttgta tgcaaataaa tctcgataaa
1260
ggcgcggcgc gcgaatgcag ctgatcacgt acgctcctcg tgttccgttc aaggacggtg
1320
ttatcgacct cagattaatg tttatcggcc gactgttttc gtatccgctc accaaacgcg
1380
tttttgcatt aacattgtat gtcggcggat gttctatatc taatttgaat aaataaacga
1440
taaccgcgtt ggttttagag ggcataataa aagaaatatt gttatcgtgt tcgccattag
1500
ggcagtataa attgacgttc atgttggata ttgtttcagt tgcaagtgaa ttcatatcat
1560
gacaatattg cgagtaataa taacgcggaa aatttaaaaa aggttaagaa ggaggacggc
1620
agcatgcaca ttgtcgaaca gtatttgact cagaatgtgg ataatgtaaa aggtcacaat
1680
tttatagtat tgtctttcaa aaacgaagag cggttgacta tagctaagaa tgccgtgcac
1740
caatccgccg gcacacacca gtaattgcta caacaacagc atttacaaag aagggcgttg
1800
ggtggccaac acggactcgt cgcaatgcat agattttagc aactacaagg aactagcaat
1860
cgacgacgac gtcgaatttt ggattccgac catcggccag ttttgcgcat tgtgtgagag
1920
aggccgtacg tttgtacatt ccgcatatgc aagattcaaa cttggacgcg ctcacgttgc
1980
agtattggcc ggacgtggac agggatattt tttgtaacgt taacaaacaa atacgcgcac
2040
cgtacagcta taattataag ggaacgcggc ggtatgtaca ggaagaggtt tatactaaac
2100
tgttacattg caaacgtggt ttcgtgtacc aaatgtgaaa accgatgttt gatcaaggct
2160
ctgacacatt tttacaatta cgactccaag tgtgtgggtg aagtcatgca tcttttaatc
2220
aaatcccaag atgaggataa tcttgcaaag tgttttaccg caattatgca aaagtacatg
2280
cagaatcaat tgtacgatcg aaaagaacca gtgttagtaa aaattaacca aaaaaaatgc 2340
agtgtcaaac gcaaacgtga cgacgacgac gacaataatg atgatgatga tgacgatggt
2400
tgtgatagtt cagacagcgg gatcccggtg agctcatcga ttctggacta tgcacttcgc
2460
ctctcggccg gtgggccgtt atcgaccgtt atctgacgaa tgactttgtt ctgtttcagc
2520
caagcttcgc tgtctgaact atcacaacca tcgtcatcat catcatcatt attgtcgtcg
2580
tcgtcgtcac gtttgcgttt gacactgcat tttttttggt taatttttac taacactggt
2640
tcttttcgat cgtacaattg attctgcatg tacttttgca taattgcggt aaaacacttt
2700
gcaagattat cctcatcttg ggatttgatt aaaagatgca tgacttcacc cacacacttg
2760
gagtcgtaat tgtaaaaatg tgtcagagcc ttgatcaaac atcggttttc acatttggta
2820
cacgaaacca cgtttgcaat gtaacagttt agtataaacc tcttcctgta cataccgccg
2880
cgttccctta taattatagc tgtacggtgc gcgtatttgt ttgttaacgt tacaaaaaat
2940
atccctgtcc acgtccggcc aatactgcaa cgtgagcgcg tccaagtttg aatcttgcat
3000
atgcggaatg tacaaacgta cggcctctct cacacaatgc gcaaaactgg ccgatggtcg
3060
gaatccaaaa ttcgacgtcg tcgtcgattg ctagttcctt gtagttgcta aaatctatgc
3120
attgcgacga gtccgtgttg gccacccaac gcccttcttt gtaaatgctg ttgttgtagc
3180
aattactggt gtgtgccggc ggattggtgc acggcattct tagctatagt caaccgctct
3240
tcgtttttga aagacaatac tataaaattg tgacctttta cattatccac attctgagtc
3300
aaatactgtt cgacaatgtg catgctgccg tcctccttct taaccttttt taaattttcc
3360
gcgttattat tactcgcaat attgtcatga tattctagaa gatcataatc agccatacca
3420
catttgtaga ggttttactt gctttaaaaa acctcccaca cctccccctg aacctgaaac
3480
ataaaatgaa tgcaattgtt gttgttaact tgtttattgc agcttataat ggttacaaat
3540
aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata aagcattttt ttcactgcag atctgcgcgc
3600
gatcgatatc agcgctttaa atttgcgcat gctagctata gttctagagg taccgtcccc
3660
catccagcag tcctggtcgg tggggacgaa gtacggctcc gcagcgacag cgacgtcgat
3720
tgaccactcc gccatggtgt ggacgaggag atcctgtgcc ctggcggagt ggttcaaatt
3780
actttgaagg aagcgatgga cacaacccat tacggggcta catccatcgc tccctcgtct
3840
gttccgccct gcggctcgac aacagccgcg gcgggaactg actcgccggc tgcccttgtt
3900
gcagccggct tctttttctt tccgcccctc ctcgtttttg tagaggaggg ggcggacttg
3960
cacgccgggc ccccggcccg gtggtcagcc ttccttttag ccgcgtcgca caagacgcag
4020
tgcggcgcgg ctgcggtgca ggaggctgcc ttgtgccccg gttggccgca gcggaagcac
4080
aggttgctgc ggtccccgat agctgttgtc ctatccaatt ccattttttt ttcaagtaag
4140
ccaaatttgg agtatgacaa cgtattaaga ctaaataatt tcaggcatct tgaagtaatg
4200
ccatacatgt attaaagaac agttcaaaaa catttcatga atcttgacat aataaatata
4260
tctttaatgt cttaaatgaa ctcatcacga aaatgaacga aaactctgca ataaggatga
4320
taatatttac ttctttgttt cagtaatatt ttccaaattt atcaccaatc tatcgatttc
4380
gtgattatca cgtctcaatt taattttgtt ttcactttga aatgtaataa tatacacatt
4440
tcaatcagat aatcttgatc aagattgttt taatgtacgt cagctaatag agaatacgtt
4500
atcagcttaa gcgtaggaaa cagtataaat accgaatgaa aattcaataa atcgtacaca
4560
tttatttggt gaggtaagag catttgtgtt tctcagggaa acactgaaaa ttacataaat
4620
tttaacttct gttctctcta tcaaaacaat ttcaaatcat accagtttaa atcgcaggtg
4680
ccaagtaaca tttatacttc attattgtac gtttctttca gcaaaagcgg ccgcatgcct
4740
gatggcgagg gtgttcctca cctcgttgac ctggaagaac cggccgagga agacatcctt
4800
atgtcaagga acggtgcaaa caaccaatac tggcttttca ccagacgtaa ccaaaacaac
4860
catcaagtta ttacaaatgg caatgtcaac tctatccgga actcgaacta caatggaaac
4920
ctgcctctct ttgttattgt ccacggctgg aacagcaacg gaaactccgc tgtgaacacc
4980
atgatccgcc ccgccttgct ggccgtctcc gactgcaacg ttattgttgt ggactggcgt
5040
ggtcttgcca acggtctata caacactgcc gtcaatggag ttcccagtgt cggacagttc
5100
cttggcaact ttttggtctg gctcatcaac aacggaggcg gcaattgggg tcgagtccac
5160
ttgattggct tcagcttggg cgcgcacgtt gtcggtaacg ctggacgaca ggctggtggc
5220
agacccaaca gggttaccgg tttggatccg gctgggccca ggtggggtgg taacaaccaa
5280
gccctgaacc gtaacgcagg agcttatgtg gaggcaatcc acaccgacgg tggtcttctc
5340
ggtatttttg accgcattgc tcatggtgac ttttacccca acggtggcag aaacccccaa
5400
ccgggttgca gagttagtac ctgctctcac agtcgagcct acgaattgta cgcctccact
5460
gttcgtcaca atcgtttcgt tggcagacta tgtaacaacc tcaatcaggc tcagaacaat
5520
cagtgctctg gaggtacctt caacatgggt aatgccgtat ttggtaagcg cggaaacgga
5580
atctacggac tcagaactgg cagcagttgg cctttctaac tcgagagatc ataatcagcc
5640
ataccacatt tgtagaggtt ttacttgctt taaaaaacct cccacacctc cccctgaacc
5700
tgaaacataa aatgaatgca attgttgttg ttaacttgtt tattgcagct tataatggtt
5760
acaaataaag caatagcatc acaaatttca caaataaagc atttttttca
ctgc 5814
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GP41上游引物
<400> 13
cgtagtagta gtaatcgccg c 21
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GP41下游引物
<400> 14
agtcgagtcg cgtcgcttt 19
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BmGAPDH上游引物
<400> 15
Gctgcctcct tgaccttttg c 21
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BmGAPDH下游引物
<400> 16
cattccgcgt ccctgttgct aat 23
Claims (7)
1.家蚕核型多角体病毒多基因反向重复序列和家蚕脂肪酶1基因在制备重组载体中的应用,所述多基因反向重复序列的正向序列如SEQ
ID NO.1所示,反向序列如SEQ ID
NO.4所示,所述家蚕脂肪酶1基因如SEQ ID NO.11第1081-1965位所示核苷酸。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述家蚕核型多角体病毒多基因反向重复序列的正向序列和反向序列之间连入家蚕肌动蛋白基因Actin 3内含子,所述家蚕肌动蛋白基因Actin 3内含子的核苷酸序列如SEQ
ID NO.5所示。
3.含所述家蚕核型多角体病毒多基因反向重复序列和家蚕脂肪酶1基因的重组载体。
4.根据权利要求3所述的重组载体,其特征在于:所述家蚕核型多角体病毒多基因反向重复序列的5’端为IE1启动子,所述家蚕脂肪酶1基因的5’端连接家蚕中肠特异表达启动子P2。
5.根据权利要求4所述的重组载体,其特征在于:所述重组载体的IE1启动子的5’端连接Hr3增强子。
6.根据权利要求4或5所述的重组载体,其特征在于:所述重组载体是由SEQ ID NO.12所述的载体序列经Asc Ⅰ酶切后回收含家蚕核型多角体病毒多基因反向重复序列和家蚕脂肪酶1基因的片段,连接经Asc Ⅰ酶切的piggyBac[3×p3 EGFP afm]载体而得。
7.权利要求4-6任一项所述重组载体的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)合成SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列,经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶切后连接经同样双酶切的含家蚕肌动蛋白基因Actin 3内含子的pMD-19载体,得pMD-19-FS-A3intron载体;克隆如SEQ ID NO.4所示的序列,连入所得pMD-19-FS-A3intron载体的家蚕肌动蛋白基因Actin 3内含子的3’端,得pMD-19-FS-A3intron-FA载体;
(2)将步骤(1)所得pMD-19-FS-A3intron-FA载体用EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ进行双酶切,将含SEQ ID NO.1、家蚕肌动蛋白基因Actin 3内含子和SEQ ID NO.4的片段FS-A3intron-FA连入L4440载体的IE1启动子IE1P和SV40终止信号序列之间,得L4440-IE1P-FS-A3intron-FA-SV40载体;
(3)克隆家蚕中肠特异表达启动子P2和家蚕脂肪酶1基因,将家蚕中肠特异表达启动子P2用Kpn Ⅰ和Not Ⅰ酶切后连接经同样酶切的含SV40终止信号序列的pSLfa1180fa载体,得1180-P2-SV40载体,然后同时用Not Ⅰ和Xho Ⅰ酶切所得1180-P2-SV40载体和克隆的家蚕脂肪酶1基因,连接后得1180-P2-Bmlipase-1-SV40载体,载体序列如SEQ ID NO.11所示;
(4)克隆Hr3增强子,连接进pSLfa1180fa载体得1180-Hr3载体;将步骤(2)所得L4440-IE1P-FS-A3intron-FA-SV40载体中的含IE1启动子IE1P和FS-A3intron-FA的片段连接入所得1180-Hr3载体,得1180-Hr3-IE1P-FS-A3intron-FA-SV40载体,然后将所得1180-Hr3-IE1P-FS-A3intron-FA-SV40载体用Kpn Ⅰ和Hind Ⅲ进行双酶切,同时用Kpn Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切所得1180-P2-Bmlipase-1-SV40载体,将含家蚕中肠特异表达启动子P2和家蚕脂肪酶1基因的序列连接酶切后的1180-Hr3-IE1P-FS-A3intron-FA-SV40载体,得1180-Hr3-IE1P-FS-A3intron-FA-SV40-P2-Bmlipase-1-SV40载体,载体序列如SEQ ID NO.12所示;
(5)将步骤(4)所得1180-Hr3-IE1P-FS-A3intron-FA-SV40-P2-Bmlipase-1-SV40重组载体经Asc Ⅰ酶切后回收含家蚕核型多角体病毒多基因反向重复序列和家蚕脂肪酶1基因的片段,连接经Asc Ⅰ酶切的piggyBac[3×p3 EGFP afm]载体,得重组载体。
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