CN102392025B - 家蚕BmSpry基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物基因领域，特别是涉自于家蚕的控制家蚕对核型多角体病毒（BmNPV）抗性的关键基因，所述家蚕BmSpry基因含有如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；其以家蚕cDNA为模板进行PCR扩增而得，其在调节家蚕型多角体病毒抗性中的应用；BmSpry基因表达量降低一半导致家蚕对BmNPV的抵抗性降低了100倍，本发明克隆和鉴定一个影响家蚕对BmNPV抗性的关键基因；BmSpry基因在培育家蚕抗BmNPV品种的理论研究和生产应用中都具有重要的价值。

Description

家蚕 BmSpry 基因及其应用

技术领域

本发明涉及生物基因领域，特别是涉及家蚕的控制家蚕对核型多角体病毒（BmNPV）抗性的关键基因。

背景技术

蚕桑生产是丝绸工业的基础，在我国很多农村地区，养蚕业是当地经济的支柱性产业和农民的主要经济收入来源，蚕丝业每年为蚕农创收上百亿元。核型多角体病毒病是蚕业生产上最常见而且危害最严重的一类蚕病，引起该病的病原为核型多角体病毒（BmNPV），该病的传染力极强并且难以控制，全国各蚕业主产区经常因为该病的爆发而造成严重的经济损失。

由于BmNPV在蚕业生产上危害严重，科研工作者对它的病原特性、感染性和抵抗性作了持续深入的研究。目前的研究结果显示：不同的家蚕品种对BmNPV的抵抗性不一样，家蚕对BmNPV的抵抗性是由多基因控制的，其中至少有一个是主效基因。对家蚕抗性关键基因及其调控序列进行克隆和鉴定，为阐明家蚕抵抗BmNPV的机制，以及培育抗性品种应用于蚕业生产有着重要的理论价值和实践意义。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一段核苷酸序列及其制备方法，该序列为家蚕调控核型多角体病毒抗性的关键基因。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

家蚕BmSpry基因，所述家蚕BmSpry基因的核苷酸序列含有如SEQ ID NO:1所示。

进一步，所述家蚕BmSpry基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

所述的家蚕BmSpry基因的制备方法，以家蚕大造品种全蚕或者组织cDNA为模板进行PCR扩增，设计的上游引物为 F：5'- cggtcgtttcgttggagc-3'，设计的下游引物为R：5'- atttgcgtagaatccaaaatactaac-3'，PCR反应条件为：94℃预变性4分钟，然后94℃变性40秒、58℃退火40秒、72℃延伸1分钟，共30个循环，最后72℃延伸10分钟，得如SEQ ID NO:2所示的家蚕BmSpry基因。

本发明的目的之二在于提供家蚕BmSpry基因的应用，该应用为调控家蚕核型多角体病毒抗性提供了新方法。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

所述的家蚕BmSpry基因在调节家蚕型多角体病毒抗性中的应用。

本发明的有益效果在于：通过对转基因家蚕敏感系统LI-S进行检测，克隆得到了一个家蚕抗性关键基因BmSpry全长序列，包括213bp的5’非翻译区序列（5’Untranslated region，5’UTR）、642bp编码区序列（Coding sequence，CDS）和332 bp的3’非翻译区序列（3’UTR）。BmSpry基因表达量降低一半导致家蚕对BmNPV的抵抗性降低了100倍，本发明克隆和鉴定了一个影响家蚕对BmNPV抗性的关键基因。BmSpry基因在培育家蚕抗BmNPV品种的理论研究和生产应用中都具有重要的价值。

附图说明

图1为LI-S和正常大造添食不同浓度BmNPV以后的死亡率统计结果。

图2为LI-S外源片段在家蚕基因组和染色体上的插入位点分析。

图3为RT-PCR检测正常大造和LI-A以及LI-S中BmSpry的表达量。

图4为定量PCR检测正常大造和LI-A以及LI-S中BmSpry的表达量。

图5为插入位点附近其他基因RT-PCR检测结果。

图6为BmSpry基因的结构示意图（上）和全长序列及对应的氨基酸序列（下）。

具体实施方式

实施例 1 转基因家蚕 LI-S 和 LI-A 的构建

一 构建转基因增量表达载体pBac[IE1P- lipase-1-3×P3-EGFPafm]

1 用Kpn Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切载体pBSII-IE1-orf，回收获得IE1启动子片段，并把其连入L4440载体，用SV40引物（SV40 F: 5‘-tgctctagaagatcataatcagccata-3’, SV40 R: 5‘-ggaagatctgcagtgaaaaaaatgctt-3’）从piggyBac [3×p3 EGFP afm]中扩增出SV40终止信号，由于引物两端分别加有Xba Ⅰ和Bgl Ⅱ酶切位点，以此两个酶双酶切把SV40加入已经带有IE1启动子的L4440载体，这样重组载体L4440-IE1P-SV40中既包含IE1启动子序列，又含有SV40终止信号。

2用Bmlipase-1引物（Lipase-1 F: 5‘-ccggaattcatgcctgatggcgagggtgt- 3’, Lipase-1 R: 5‘-ctagtctagattagaaaggccaactgctgcc-3’）从家蚕中肠cDNA中扩增出Bmlipase-1的CDS序列（如SEQ ID NO:3所示），TA克隆连入pMD19-T simple载体，进行PCR和酶切检测确定无误，并送由上海生物工程有限公司测序做进一步验证。

3 用Xba Ⅰ和EcoR Ⅰ分别双酶切L4440-IE1P-SV40和Bmlipase-1 T克隆质粒，连接重组后，得到含有增量表达骨架结构（包含启动子、表达基因序列和终止信号）的L4440- IE1P- Bmlipase-1-SV40重组载体。

4 用Kpn Ⅰ和Bgl Ⅱ分别酶切pSLfa1180fa载体和L4440- IE1P- Bmlipase-1-SV40重组载体，连接重组后，得1180- IE1P- Bmlipase-1-SV40重组载体。

5用限制性内切酶Asc Ⅰ分别酶切1180- IE1P- Bmlipase-1-SV40及piggyBac[3×p3 EGFP afm]质粒。由于pSLfa1180fa载体骨架在多克隆位点两端都含有一个Asc Ⅰ位点，切下的增量表达骨架结构便可与经Asc Ⅰ酶切后5’端去磷酸化的piggyBac 3×p3 EGFP afm线性片段连接，形成最终的转基因增量表达载体pBac[IE1P-Bmlipase-1-sv40-3×P3-EGFPafm]。

上述实验的完成参见了西南大学陈杰的《增量表达抗病毒蛋白Bmlipase-1的家蚕转基因系统的建立》一文。

二 转基因显微注射和阳性个体的筛选

1 将家蚕大造品种蚕卵浸酸解除滞育以后，放于15℃和80%湿度的黑暗环境中催青直至孵化，将蚁蚕收好置于标准环境中饲养，化蛾以后将雌雄蚕蛾交配4h，拆对后产下的蚕卵为非滞育蚕卵，用于下一步的显微注射；

2 将产下的蚕卵在干净的载玻片上排列整齐，在蚕卵产后2h 用Eppendorf显微注射仪将实施例1所得的转基因增量表达载体pBac[IE1P-Bmlipase-1-sv40-3×P3-EGFPafm]和辅助质粒A3H，一起注射进932粒大造蚕卵中，用无毒胶水封口以后置于25℃、相对湿度80%的环境中催青孵化，将孵化的510头G0代蚁蚕用桑叶收集饲养至化蛾；

3 G0代蚕蛾通过自交或回交共获得32蛾圈G1代蚕卵，用 Olympus®电动宏观荧光显微镜观察筛选并获得7个阳性蛾圈，转化效率为21.88%。

三 转基因系统的抗性检测

1 将实施例2所得的7个阳性蛾圈各自单蛾圈饲养，继代扩大得到7个转基因系统LI，随机选择3个转基因系统进行后续的抗性检测。

2 取3个转基因系统和正常大造品种，在4龄起蚕时期以半致死剂量单头经口添食BmNPV病毒，4个系统各设置3个重复区，每个重复区100头蚕，同时每个系统设置3个不攻毒对照区，死亡率统计到化蛾时期；

3 攻毒结果显示3个转基因系统中有两个系统(分别命名为LI-A和LI-B)提高了家蚕对BmNPV的抗性（符合我们的预期结果），但其中一个系统（命名为LI-S）对BmNPV的抗性明显降低。抗性检测结果显示：和正常大造系统相比较，转基因系统LIA一直具有明显的抗性效果，能降低35%左右的死亡率。LI-S对BmNPV的抵抗性比正常亲本低了100倍左右。具体为：

（1）将LI-A、LI-S和正常大造蚕卵浸酸（盐酸比重为1.073，温度为46℃，时间为5分钟）解除滞育以后，放于25℃和85%湿度的环境中催青10天左右直至孵化，将蚁蚕收好置于标准环境中饲养（温度：25℃，湿度：80%）。

（2）在四龄起蚕经口添食BmNPV病毒检测抗性。将新鲜的桑叶切成直径一厘米的小块，然后将病原涂抹在切好的桑叶小块上面，一头蚕单独吃一小块涂抹过病原的桑叶，只有将这小块桑叶吃完了的蚕才被挑选出来继续饲养，统计死亡率到化蛾。攻毒数据统计结果（图1）显示，在四龄起蚕以10⁴多角体/头经口添食感染BmNPV后，正常亲本（大造）和LI-S的死亡率分别为10%和50%左右；在以10⁶多角体/头经口添食感染BmNPV后，正常亲本（大造）和LI-S的死亡率分别为50%和80%左右。和正常亲本相比，LI-S对BmNPV的抵抗性降低了100倍左右。

实施例 2 检测 LI-S 中外源片段的插入位点

一 反向PCR鉴定LI-S外源片段的插入位点

取20 μg实施例1提及的LI-S的基因组在37℃用 Hae Ⅲ酶切过夜，酶切产物纯化后用Solution Ⅰ（购买自TaKaRa）进行连接，以自连产物为模板，用转座子特异的引物进行PCR扩增(pb-left F: 5‘-atcagtgacacttaccgcattgaca-3’, pb-left R: 5‘-tgacgagcttgttggtgaggattct-3’)，PCR反应条件为：94℃预变性4分钟，然后94℃变性40秒、54℃退火40秒、72℃延伸2分钟，共30个循环，最后72℃延伸10分钟；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，然后与pMD19-T载体连接，连接反应在T4 DNA 连接酶作用下，16℃过夜连接，然后转化DH5α感受态细胞，获得阳性克隆后送往上海生工生物技术有限公司测序。将测序结果在家蚕基因组数据库中进行比对，结果（图2）显示外源片段插入在nscaf1898的12392322处，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示， 其距离最近的上游基因35.8Kb，距离最近的下游基因14.6Kb。

二 LI-S外源片段插入位点的再次确定

根据反向PCR的结果和家蚕基因组序列，设计两对引物对插入位点再次进行检测（LIS-Pb-1 F：5'-acaagcacgcctcacgg-3'，R：5'-tacaacaagcaaacatagcga-3'；LIS-Pb-2 F：5'- taccgcattgacaagcac-3'，R：5'-actcgatatgcctgctcc-3'），每对引物的上游引物在插入的载体序列上，下游引物在家蚕基因组上。以LI-S基因组为模板，用LIS-Pb-1和LIS-Pb-2两对引物进行PCR扩增，PCR反应条件为：94℃预变性4分钟，然后94℃变性40秒、52℃退火40秒、72℃延伸35秒，共30个循环，最后72℃延伸10分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，发现扩增出目地条带，将目的条带回收连接转化，挑取阳性克隆测序。测序结果显示反向PCR的结果是正确的，LI-S的外源片段确实插入在家蚕基因组nscaf1898的12392322处（图2）。

实施例 3 检测 LI-S 外源片段插入位点附近基因的表达量变化情况

在家蚕基因组数据库中下载插入位点附近的基因序列和对应的EST序列，结果显示在距离插入位点150kb范围内，插入位点上游基因BGI000882、BGI001264、BGI001265（上述基因详见家蚕基因组数据库）有EST证据，插入位点下游基因BGI000879、BGI001266、BGI001267、BGI001268、BGI001269（上述基因详见家蚕基因组数据库）有EST证据。选择上述基因设计检测引物（BGI001266QRT F：5'-cgtgaaggcgctgttctacca-3'，R：5'-gcggcgggactagataatactgg-3'；其他基因检测引物略）。

插入位点下游距离最近的基因为BGI001266基因。通过RT-PCR进行检测，RT-PCR的反应条件为：94℃预变性4分钟，然后94℃变性40秒、58℃退火40秒、72℃延伸30秒，共30个循环，最后72℃延伸10分钟。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果发现除了LI-S中BGI001266基因表达量降低以外（图3），其他基因的表达量在LI-A、LI-S和正常大造中没有区别（图5）；定量PCR的结果显示，和正常大造和LI-A相比，LI-S中BGI001266的表达量降低了一半（图4）。LI-A外源片段插入在家蚕基因组12号染色体的nscaf2987上（TTACAGCGACTTAAACTTCT TTAA-piggyBac-TTAA AGTTGCTATTTTCATCAG），LI-A插入位点附近的基因表达量没有受到影响。由于LI-S和LI-A唯一的区别就是外源片段在家蚕基因组上的插入位点不一样，所以，LI-S对BmNPV病毒抵抗性大幅降低是由外源片段的插入导致BGI001266表达量降低引起的。

实施例 4 克隆 BGI001266 基因全长序列

在家蚕基因组数据库中下载该基因的EST序列，根据家蚕基因组序列和该基因的EST序列，设计引物克隆该基因（BGI001266qc F：5'-cggtcgtttcgttggagc-3'，R：5'- atttgcgtagaatccaaaatactaac-3'）。以家蚕大造品种5龄3天幼虫cDNA为模板进行PCR扩增，PCR反应条件为：94℃预变性4分钟，然后94℃变性40秒、58℃退火40秒、72℃延伸1分钟，共30个循环，最后72℃延伸10分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，发现扩增出目地条带，将目的条带回收连接转化，挑取阳性克隆测序。

测序结果显示我们克隆了BGI001266的1190bp全长序列，如SEQ ID NO:2所示，包括213bp的5’UTR、642bp CDS（如SEQ ID NO:1所示）和332 bp的3’UTR。

该基因的GC含量高达71.5%，有两个外显子，编码区序列（Coding sequence，CDS）位于第2外显子上面。LI-S外源片段的插入位点距离该基因有14.6Kb。

生物信息学分析发现该基因具有一个Spry的结构域，我们将其命名为BmSpry。在NCBI站点上用BLAST完成序列同源性分析，结果没有发现该基因的报道，说明BmSpry基因是一个新基因。BmSpry的全长序列以及对应的氨基酸序列如图6所示。

查阅相关文献报道（Hong Joo Kim. Modulation of signalling by Sprouty: a developing story. (J) NATURE REVIEWS. 2004; Mark A. Lemmon.Cell Signaling by Receptor Tyrosine Kinases. (J) Cell. 2010; Susumu Katsuma. ERK- and JNK-Dependent Signaling Pathways Contribute to Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus Infection. (J) J Virol. 2007），我们发现Spry基因是MAPKs信号传导通路上游的一个负调控因子，BmNPV感染家蚕后利用MAPKs信号通路来进行复制增殖，当用抑制剂分别抑制家蚕细胞中MAPKs信号传导通路的ERK和JNK蛋白后，家蚕细胞中的病毒含量明显减少。

在LI-S系统中，由于外源片段插入到BmSpry基因上游，可能破坏了BmSpry基因的调控序列，从而导致BmSpry的表达量降低一半，导致对MAPKs信号通路的抑制能力减弱。当BmNPV感染家蚕后，病毒能更加容易的利用该信号通路进行复制增殖，最终导致家蚕对BmNPV的抵抗性严重降低。所以，BmSpry基因是控制家蚕对BmNPV的抵抗性的关键基因。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

<110> 西南大学

<120> 家蚕 BmSpry 基因及其应用

<160> 4

<210> 1

<211> 642

<212> DNA

<213> 家蚕(Bombyx mori)

<220>

<223> BmSpry 基因 CDS

<400> 1

atggatgagt atggcgggcc ggcggcgccg ccccggccgc ccaagccggc ggcgcgcgtc 60

cacaggccgt cgggcgcgcg ccagcccacc gtatcattgc tgcggccgcg ccctgaagcc 120

gagcgcgagc gcaacgccta cgtggaggct cctcggcgaa ctcacgtgtc acccgcagcg 180

gcacacgcgg gcgcgcacca acctctcaag ccggtgacga cgcagccggc cgccgcggcc 240

gacaagcggc gcgccggcgc cctccaggcc gattctatag tgtgcgaaac gtgcgggcga 300

tgtcgctgcg agcagtgcgc tcgacctcgg ccgctaccct cgcgctggct gtgcggctcc 360

tgtctatgca gcgcggaagc atgcgttgac tacgcgtcgt gcatgtgctg cgtgaaggcg 420

ctgttctacc actgcgggag cggcgaggag gaagccggcg agccgtgtgc gtgcggaccg 480

cgactcgcat gtgtgggtgc gctggcggtg ccgctgccgt gcctgtggct gtattggccg 540

ctgcgtggat gtacagcggc gggagcagcg ctgtacgcgc ggtgtcgccg ctccggctgt 600

cgttgtccgg accctcagcc gcggctctcc agtattatct ag 642

<210> 2

<211> 1187

<212> DNA

<213> 家蚕(Bombyx mori)

<220>

<223> BmSpry 基因全长序列

<400> 2

cggtcgtttc gttggagcgt agcgctagcg ctcccggttt tccattaaaa tgtgtataag 60

aataagtgca gtgaatccgc acgagttcgg aacggtcaca aaaaacgccg tcgtcgagat 120

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gctcctcggc gaactcacgt gtcacccgca gcggcacacg cgggcgcgca ccaacctctc 420

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cggccgctac cctcgcgctg gctgtgcggc tcctgtctat gcagcgcgga agcatgcgtt 600

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gaggaagccg gcgagccgtg tgcgtgcgga ccgcgactcg catgtgtggg tgcgctggcg 720

gtgccgctgc cgtgcctgtg gctgtattgg ccgctgcgtg gatgtacagc ggcgggagca 780

gcgctgtacg cgcggtgtcg ccgctccggc tgtcgttgtc cggaccctca gccgcggctc 840

tccagtatta tctagtcccg ccgcgcgcca ccaccccctc cgaagcgccg agtcgagcgg 900

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actcagtgat cgctgtgcct gtccgtggag tgtggtggcg cggggccggc gtcggacgtg 1020

cgccccgcct cgctgtgtga atcgtctacg agtaccttgt aaatatagtt ttatagtgtg 1080

aatgtatgtg aacgtgtcgc ccgaacgtcg aaagtctcaa attttcttga gaccgtaacg 1140

tgtcataaaa aaaacgttaa cgttagtatt ttggattcta cgcaaat 1187

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<212> DNA

<213> 家蚕(Bombyx mori)

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<223> Bmlipase-1 CDS

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atgcctgatg gcgagggtgt tcctcacctc gttgacctgg aagaaccggc cgaggaagac 60

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aacggaatct acggactcag aactggcagc agttggcctt tctaa 885

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LI-S插入位点序列

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atcagtgaca cttaccgcat tgacaagcac gcctcacggg agctccaagc ggcgactgag 60

atgtcctaaa tgcacagcga cggattcgcg ctatttagaa agagagagca atatttcaag 120

tatgcatgcg tcaattttac gcagactatc tttctagggt taaataaata aactttaaat 180

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gaattagcat cacatgatgt catgtatccg gctgcatcca taaggggggg ctataaatcg 480

aaccagttag atattttacc ttagcgcaac cggtaatgga agatatcaga ttaataaaag 540

atgtcgatga gagcggccct gggacttttg ttgaactcgc cgaaaggcga ggcc 594

Claims (4)

1.家蚕BmSpry基因，其特征在于，所述家蚕BmSpry基因的编码区序列是如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的家蚕BmSpry基因，其特征在于，所述家蚕BmSpry基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.权利要求1所述的家蚕BmSpry基因的制备方法，其特征在于：以家蚕大造品种全蚕或者组织cDNA为模板进行PCR扩增，设计的上游引物为 F：5'- cggtcgtttcgttggagc-3'，设计的下游引物为R：5'- atttgcgtagaatccaaaatactaac-3'，PCR反应条件为：94℃预变性4分钟，然后94℃变性40秒、58℃退火40秒、72℃延伸1分钟，共30个循环，最后72℃延伸10分钟，得如SEQ ID NO:2所示的家蚕BmSpry基因。

4.权利要求1所述的家蚕BmSpry基因在培育家蚕抗核型多角体病毒品种中的应用。

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