MX2008010285A

MX2008010285A - Sistema de expresion genetica usando un empalme alternativo en insectos.

Info

Publication number: MX2008010285A
Application number: MX2008010285A
Authority: MX
Inventors: Luke Alphey
Original assignee: Oxitec Ltd
Priority date: 2006-02-10
Filing date: 2007-02-12
Publication date: 2009-01-16
Also published as: EP3159414A1; EP1984512B1; EP1984512A1; CN101421408A; AU2007213444B2; WO2007091099A1; US20090183269A1; AU2007213444A1

Abstract

Se provee un sistema de expresión de polinucleótidos que es capaz de empalmar de forma alternativa los transcriptos de ARN de una secuencia de polinucleótidos que van a expresarse en un organismo.

Description

SISTEMA DE EXPRESIÓN GENÉTICA USANDO UN EMPALME ALTERNATIVO EN INSECTOS Campo de la Invención La presente invención se refiere a un sistema de expresión genética, en combinación con secuencias de control del empalme, las secuencias de control proporcionan un mecanismo para el empalme alternativo. Antecedentes de la Invención Todas las referencias citadas aquí se incorporan como referencia, a menos que sea evidente lo contrario. El empalme alternativo incluye el retiro de uno o más intrones y el ligado de los exones flanqueantes. Esta reacción es catalizado por el spliceosoma, una máquina macromolecular compuesta de cinco ARN y cientos de proteínas (Jurica, M. S. & Moore, M. J. (2003) Mol. Cell 12, 5-14). El empalme alternativo genera múltiples mARN a partir de un simple gen, así aumentando la diversidad de proteomas (Graveley, B. R. (2001) Trends Gent. 17, 100-107). El empalme alternativo también tiene un papel importante en la regulación de la expresión genética en muchos procesos del desarrollo que van desde la determinación del sexo hasta la apóptosis (Black, D. L. (2003) Annu. Rev. Biochem. 72, 291-336) y los defectos en el empalme alternativo ha sido asociado a muchos problemas humanos (Caceres, J. F. & Kornblihtt, A. R. (2002) Trends Gent. 18, 186-193). En general el empalme alternativo se regula por medio de las proteínas que se asocian con el pre-mARN y funciona para mejor o reprimir la capacidad del spiiceosoma para reconocer los sitios de empalme que flanquean al exón regulado (Smith, C. W. & Valcarcel, J. (2000) Trends Biochem. Sd. 25, 381-388). Cuando un exón alternativo en particular se incluirá o excluirá del ARN maduro en cada célula se cree que se determina por medio de la concentración relativa de un número de reguladores de empalme positivos y negativos y las interacciones de esos factores con el pre-mARN y los componentes del spiiceosoma (Smith, C. W. & Valcarcel, J. (2000) Trends Biochem. Sd. 25, 381-388). Los spliceosomas son complejos grandes de ARN nucleares pequeños y partículas de proteína (SnRNP) que se ensamblan con el pre-mARN, para producir el empalme de ARN, al retirar los intrones de los ARN nucleares eucarióticos, produciendo mARN que entonces se traslada a proteína en las ribosomas. Aunque cuando menos el 74% de los genes humanos codifican a los mARN empalmados alternativamente (Smith, C. W. & Valcarcel, J. (2000) Trends Biochem. Sd. 25, 381-388), relativamente pocos reguladores de empalme han sido identificados. Descripción Detallada de la Invención Así en un primer aspecto, la presente invención proporciona un sistema de expresión de polinucleótidos que comprende: cuando menos una secuencia polinucleótida heteróloga que codifica a una proteína funcional, definida entre un codón de inicio y un codón de paro, y/o polinucleótidos para el ARN de interferencia (ARNi), que va a ser expresado en un organismo; cuando menos un promotor ligado operativamente; y cuando menos una secuencia de control de empalme que en cooperación con un spliceosoma, es capaz de (i) mediar el empalme de un trascripto de ARN de la secuencia codificante para dar un primer producto de ARN mensajero empalmado (mARN) y (ii) mediando cuando menos un empalme alternativo de la transcripción de ARN para producir un producto de mARN empalmado alternativo; en el cual cuando la cuando menos una secuencia polinucleótida heteróloga codifica a una proteína funcional, cuando menos uno de los productos de mARN maduros comprenden un marco de lectura abierto (ORF) que se extiende desde el codón de inicio al codón de paro, definiendo una proteína que es la proteína funcional, o está relacionada a la proteína funcional por medio de cuándo menos una deleción de aminoácido y que es funcional cuando se traslada y opcionalmente ha sido sometido a una modificación post-traslacional; la medición se selecciona del grupo consistente de: mediación específica al sexo, mediación específica a la etapa, mediación específica a la línea germinal, mediación específica al tejido, y sus combinaciones. El sistema de expresión puede ser ADN o ARN o un híbrido o combinación de ambos. Se prevé que el sistema comprenda tanto ribo- como desoxi-ribonucléotidos, esto es porciones de ADN y porciones de ARN. Estos podrían corresponder a diferentes elementos genéticos, de al forma que el sistema es un híbrido de ADN/ARN, con algunos elementos funcionales proporcionados por el ADN y los otros por el ARN. Preferentemente, la mediación se realiza de una manera específica al sexo, específica a la etapa, específica a la línea germinal o específica al tejido. En particular se prefiere la medición específica al sexo. Sin embargo se prefiere que pueda ser utilizada una combinación de esas cuatro maneras de mediación. Es particularmente preferido que cuando se usa una combinación de esos modos, que esto incluye mediación específica al sexo. Un ejemplo particularmente preferido de esa combinación es una combinación de mediación específica al sexo, al tejido y a la etapa de empalme alternativo. El sistema puede ser adaptado para la expresión de un gen.

Preferentemente, la secuencia polinucleótida que va a expresarse comprende una secuencia codificante para una proteína o un polipéptido, esto es cuando menos un exón y preferentemente 2 o más exones, capaces de codificar a un polipéptido, tal como una proteína o un fragmento del mismo. Se entenderá que un exón es cualquier región del ADN dentro de un gen que está presente en una molécula madura de ARN derivada desde ese gen, y no ha sido desempalmada de la molécula de ARN transcrita. Para los genes codificantes a la proteína, las moléculas de ARN maduras corresponden a las moléculas de mARN maduras, que pueden codificar una o más proteínas o polipéptidos. Los exones pueden ser genes eucarióticos interpolados con segmentos de ADN no codificante. La cuando menos una secuencia polinucleótida heteróloga puede codificar a una proteína funcional, definida ente un codón de inició y un codón de paro que va a ser expresado en ün organismo. Esas secuencias que van a ser expresadas en el organismo también pueden ser llamadas secuencias, cuya expresión debe ser regulada en el organismo. ¦ Preferentemente, la secuencia polinucleótida que va a expresar comprende dos o más exones de codificación, que son segmentos o secuencias de polinucleótidos que codifican a aminoácidos cuando se traslada desde el mARN. Preferentemente, los exones diferentes se empalman diferencialmente entre sí para proporcionar mARN alternativos. Preferentemente esos mARN empalmados alternativos tienen diferente potencial de codificación, esto es codifican a diferentes proteínas o secuencias de polipéptidos. Así la expresión de la secuencia codificante se regula al empalme alternativamente las maneras de mediación antes mencionadas. La secuencia de polinucleótidos que va a expresar puede comprender polinuclótidos para la ARN de interferencia (ARNi). Esas secuencias son capaces de proporcionar por ejemplo uno o más extensiones de ARN de tira doble (dsARN), preferentemente en la forma de un transcripto primario, que a su vez es capaz de procesarse por medio del "desmenuzador" de enzima tipo ARN Pol III. Esas extensiones incluyen por ejemplo extensiones de ARN de tira sencilla que puede formar circuitos tales como aquellos encontrados en los ARN de orquilla corta (shARN), o con regiones más largas que son substancialmente auto-complementarias. Asi cuando el sistema es ADN, los polinucleótidos para el ARN de interferencia son desoxiribonuceótidos que cuando se transcriben en reibonucleotidos pre-ARN, proporciona una extensión de dsARN, como se describe antes. Los polinucleótidos para el ARN de interferencias se prefieren en particular cuando los polinucléotidos se posicionan para minimizar con empalme alternativo. Esto puede lograrse por medio del posicionamiento distal de esos polinucleótidos desde secuencias de control de empalme alternativas, preferentemente 3' a las secuencias de control. En otra modalidad preferida, las regiones substancialmente auto-complementaras pueden separarse entre sí por medio de una o más secuencias de control de empalme, tal como un intrón, que medie el empalme alternativo. Preferentemente, las regiones auto-complementarias se colocan como una serie de dos o más repeticiones invertidas, cada repetición invertida está separo por la secuencia de control de empalme preferentemente un intrón, tal como se define antes. En esta configuración, los diferentes transcriptos empalmados alternativamente pueden tener sus regiones substancialmente auto-complementarias separos por diferentes longitudes de secuencias no auto-complementarias en el trascripto maduro (post-empalme alternativo). Se apreciará que las regiones que son sustancialmente auto-complementarias son aquellas que son capaces de formar orquillas por ejemplo como porciones de la secuencia que son capaces de formar pares de bases con otras porciones de la secuencia. Esas dos porciones no tienen que ser exactamente complementarias entre sí, ya que puede haber uniones mal hechas o tolerancia de extensiones en cada porción que no forman pares de bases entre sí. Esas extensiones pueden no tener un equivalente en otra porción tal que se pierde la simetría y se forman "burbujas", como se conoce generalmente con la complementación de pares de base. En otra modalidad preferida, uno o más segmentos de la secuencia sustancialmente complementarios a otra sección de la transcripción primario se coloca, en relación a la cuando menos una secuencia de control de empalme, de tal forma que no se incluye en todos los transcriptos producidos al empalme alternativamente de la transcripción primario. Por medio de ese método se producen algunos transcriptos que tienden a producir dsARN mientras que otros no; por medio de la medicación del empalme alternativo, esto es mediación específica al sexo, mediación específica a la etapa, mediación específica a la línea germinal, mediación específica al tejido, y sus combinaciones. El sistema preferentemente es capaz de expresar cuando menos una proteína de interés, esto es la proteína funcional que va a expresarse en un organismo. Esa cuando mneos una proteína de interés puede tener un efecto terapéutico o puede, preferentemente e un mrcador, por ejemplo DsRed, proteína fluorescente verde (GF) o uno o más de sus mutantes o variantes, u otros marcadores que son bien conocidos en la técnica. Más preferentemente la proteína funcional que se va a expresar en un organismo tiene un efecto letal, dañino o esterilizante. Cuando se hace referencia a un efecto letal, se apreciará que esto se extiende a un efecto dañino o esterilizante, tal que es capaz de matar un organismo per se o a su descendencia, o capaz de reducir o destruir la función de ciertos tejidos, de los cuales se prefieren en particular los tejidos reproductivos, de tal forma que el organismo o su descendencia es estéril. Por lo tanto algunos efectos letales tales como los venenos mataran al organismo o el tejido en un periodo de tiempo corto en relación a su tiempo de vida, mientras que otros simplemente reducirán la capacidad del organismo para funcionar, por ejemplo para reproducirse. Un efecto letal resultante en la esterilización se prefiere particularmente ya que esto permite que el organismo complete en el medio natural ("en la naturaleza") con los organismos tipo nativo, pero el insecto estéril no puede producir descendencia viable. De esta manera la presente invención logra un resultado similar a las técnicas tales como la técnica del insecto estéril (SIT) en los insectos, sin los problemas asociados con SIT, tales como el costo, el peligro al usuario, y la reducida competitividad del organismo radiado.

Preferentemente, el sistema comprende cuando menos un mecanismo de retroalimentación positivo, de hecho cuando menos una proteína funcional que va a expresarse diferencialmente por medio de empalme alternativo y cuando menos un promotor del mismo, en donde un producto de un gen que va a expresarse sirve como un factor de control de transcripción positivo para cuando menos un promotor, y en donde el producto o la expresión del producto es controlable. Preferentemente, un reforzador está asociado con el promotor, el producto genético sirve para mejorar la actividad del promotor por medio del reforzador. Preferentemente el factor de control es el producto genético tTA o su análogo, y en donde uno o más unidades operadores tetO está enlazado de forma operable con el promotor y su reforzador, tTA o su análogo sirven para mejorar la actividad del promotor via tetO. Se prefiere que la proteína funcional codifique al producto ¡TAV o tTAF y preferentemente el promotor es sustancialmente inactivo en la ausencia del factor de control de transcripción positivo. Es adecuado que los promotores para este sistema, preferentemente mínimos se seleccionen de: hsp70, un promotor mínimo P, un promotor mínimo CMV, un promotor mínimo a base de SAct5C, un fragmento de promotor BmA3, un fragmento promotor de un jorobado, un promotor de núcleo Adh, y un promotor mínimo Act4C, o sus combinaciones. En una modalidad la proteína funcional preferentemente es un factor inductor de la apóptosis tal como la proteína AIF descrita por ejemplo por Cande y otros (Journal of Cell Science 115, 4727-4734 (2002)) o sus homólogos. Los homólogos de AIF se encuentran en mamíferos y hasta en invertebrados incluyendo insectos, nematodos, hongos, y plantas, lo que significa que el gen AIF ha sido conservado en el reino eucariótico. También se prefiere el Hid, el producto proteico del gen defectuoso de la involución superior de Drosofila melanogaster, o segador (Rpr), el producto del gen segador de Drosofila o sus mutantes. El uso de Hid se describió por Heinrich y Scott (Proc. Nati Acad. Sci USA 97, 8229-8232 (2000). El uso de un derivado muíante, HidA'a5 se describió por Horn y Wimmer (Nature Biotechnology 21, 64-70 (2003)). Uso de un derivado mutante de Rpr, RprKR, es descrito aquí (ver también White y otros 1996, Wing y otros., 2001, y Olson y otros., 2003). Tanto Rpr y Hid son proteínas pro-apópticas, que se cree se enlazan a IAP1. IAP1 es una proteína anti-apóptica. Hid y Rpr por lo tanto se espera que trabajen a través de un amplio rango filogenético (Huang y otros., 2002, Vernooy y otros., 2000) aun cuando su propia secuencia no es bien conservada. También se prefiere el NippIDm, el homologo de Drosofila de mamífero Nippl (Parker y otros Biochemical Journal 368, 789-797 (2002); Bennett y otros, Genetics 164, 235-245 (2003)). NippIDm es otro ejemplo de una proteína con un efecto letal expresado a un nivel adecuado como sería entendido por la persona experta. De hecho muchos otros ejemplos de proteína con efecto letal serán bien conocidos para las personas expertas en la técnica. También se prefiere que la propia proteína funcional sea un transactivador transcripcional tal como el sistema tTAV descrito antes. Se prefiere que el promotor pueda ser activado por medio de condiciones ambientales, por ejemplo la presencia o ausencia de un factor particular tal como tetraciclina en el sistema tet descrito aquí, de tal forma que la expresión del gen de interés puede ser manipulado fácilmente por alguien experto en la técnica. Alternativamente, un ejemplo preferido de un promotor adecuado es el promotor de choque térmico hsp70, que permite que el usuario controle la expresión por medio de la variación de la temperatura ambiental a la cual los anfitriones se exponen en un laboratorio o en el campo por ejemplo. Otro ejemplo preferido del control de temperatura es descrito por Fryxell and Miller (Journal of Economic Entomology 88, 1221-1232 (1995)). También se prefiere como promotor es el promotor srya especifico al embrión (Horn & Wirnmer (2003), de Drosofila melanogaster, o sus homólogos o promotores de otros genes específicos o activos de embriones tales como el gen de Drosofila slow as molasses (slam) o sus homólogos de otras especies. También se prefiere que el sistema comprenda otros factores corriente arriba 5' y/o corriente abajo 3' para controlar la expresión. Ejemplos incluyen reforzadores tales como reforzadores de cuerpo graso de los genes de la proteína de yema de Drosofila, y los reforzadores de región de homología (hr) de baculovirus, por ejemplo /AcMNPV. también se apreciará que los productos incluirán UTR 5' y 3', por ejemplo. La secuencia de control de empalme permite un nivel adicional de control de la expresión de proteína, además del promotor y/o el reforzador del gen. Por ejemplo la expresión específica al tejido o al sexo de los embriones de insecto únicamente, sería extremadamente difícil por medio de métodos convencionales. Los promotores con esta especificidad son desconocidos aun en Drosofila. Sin embargo al usar control de combinación de acuerdo con la presente invención, un promotor específico al embrión, por ejemplo srya, puede combinarse con un sistema de empalme alternativo adecuado. Se prefiere considerar cualquier combinación de promotor y mecanismo de empalme alternativo. El promotor preferentemente es específico a una proteína particular que tenga un efecto espacial temporal o confinado corto, por ejemplo un efecto autónomo celular. Alternativamente se prefiere que el promotor pueda ser específico para una clase más amplia de proteínas o una proteína específica que tiene un efecto a largo plazo y/o sistémico amplio, tal como una hormona, factor de crecimiento positivo o negativo, morfogeno y otra molécula secretada o de señalización de la superficie celular. Esto permitiría por ejemplo un patrón de expresión mayor de tal forma que una combinación de un promotor morfogeno con un mecanismo de empalme alternativo específico a la etapa podría resultado en que el morfogeno se exprese solo una vez que se ha alcanzado una cierta etapa en el ciclo de vida, pero el efecto del morfogeno aun sería sentido (esto es el morfogeno todavía puede actuar y tener un efecto) más allá de esa etapa de ciclo de vida. Ejemplos preferidos serían las moléculas de morfogeno/señalización de erizo, wigless/WNT, ?T?ß/???, EGF y sus homólogos, que son moléculas de señalización conservadas en la evolución bien conocidos. También se prevé que un promotor que está activado por un rango de factores proteicos, por ejemplo transactivadores o que tenga un amplio efecto sistémico, tal como una hormona o morfogeno, podrían ser usados en combinación con un mecanismo de empalme alternativo para obtener un control específico al tejido y al seño o un control específico al sexo y a la etapa, o una combinación de control específico a la etapa, el tejido, la línea germinal y el sexo. También se prevé que más de un promotor y opcíonalmente un reforzador, puede usarse en el presente sistema, ya sea como medios alternativos para la transcripción inicial de la misma proteína o en virtud del hecho que el sistema genético comprende más de un sistema de expresión genético (esto es más de un gen y su promotor que lo acompaña). En otro aspecto, la presente invención provee un método de transformación que comiste en expresar dos o más moléculas de ARN, derivado desde un único trascripto primario o transcriptos primarios sustancialmente similares, por medio de empalme alternativo, esas dos o más moléculas de ARN que preferentemente codifican a diferentes proteína so polipéptidos, en un organismo al poner en contacto el organismo con el sistema de expresión y preferentemente inducir la expresión del sistema de expresión. Métodos de inducción o transformación del sistema genérico e inducción de la expresión son bien conocidos en la técnica con respecto al organismo relevante. También se proveen organismos (o transformantes) transformados por medio del presente sistema. Cuando se hace referencia a un nucleótido o una secuencia proteica, se entenderá que incluye referencia a cualquier mutante o variante del mismo, que tenga una actividad biológica sustancialmente equivalente. Preferentemente, el mutante o variante tiene cuando menos 85%, preferentemente cuando menos 90%, preferentemente cuando menos 95%, preferentemente cuando menos 99%, preferentemente cuando menos 99.9%, y más preferentemente cuando menos 99.99% de identidad de secuencia con las secuencias de referencia. Las secuencias provistas pueden tolerar alguna variación de secuencia y aun se empalmean correctamente. Hay pocos nucleótidos que se sabe son importantes. Estos son los que se requieren para todo el empalme, por ejemplo como se muestra en la figura 34. El GU inicial y el AG final del intrón son particularmente importantes y por lo tanto se prefieren, como se describe en todos lados, aunque aproximadamente el 5% de los intrones inician en GC, Esta secuencia de consenso se prefiere aunque se aplica a todos los empalmes no específicamente a los empalmes alternativos. En la figura 34, PU=A o G; PY = C o U. Preferentemente el sistema es o consiste de un plasmido. Como se menciona antes, este puede ser un ADN, o ARN o una mezcla de ambos. Si el sistema comprende ARN, que pueden ser preferentes para trasladar inversamente el ARN en ADN por medio de transcriptasa inversa. Si la transcriptasa inversa es requerida, entonces el sistema también puede comprende una secuencia codificante para la proteína RT y un promotor adecuado. Alternativamente la RTasa y el promotor por lo tanto pueden proveerse en un sistema separado tal como un virus. En este caso el sistema solo sería activado después de la infección con ese virus. La necesidad de incluir secuencias de acción cis adecuadas para la transcriptasa inversa o la polimerasa de ARN dependiente de ARN será evidente para los expertos en la técnica. Sin embargo se prefiere en particular que el sistema sea predominantemente ADN y más preferentemente consista solo de ADN, cuando menos con respecto a las secuencias que van a expresarse en el organismo. Aunque en otras modalidades la cuando menos una secuencia polinucléotida heteróloga que va a expresarse en un organismos es una secuencia polinucelótida capaz de codificar una proteína funcional. La descripción predominantemente se enfocara en las secuencias polinucleótidas que codifique a una proteína funcional pero se entenderá que esto también se refiere a polinucleótidos para el ARN de interferencia (ARNi) a menos que sea evidente lo contrario. Se entenderá que se hace referencia a los codones de inicio y de paro entre los cuales se define la secuencia polinucleótida que va a expresarse en un organismo, pero que no excluye el colocar cuando menos una secuencia de control de empalme, sus elementos u otras secuencias, tales como intrones en esta región. Además la secuencia de control de empalme, por ejemplo pueden traslaparse con el codón de inicio cuando menos, en el sentido de que G del ATG puede ser en algunas modalidades el 5'G inicial de la secuencia de control de empalme. Así el término "entre" puede considerarse que se refiere a desde el inicio (3' al nucleótido inicial, esto es A) del codón inicial, preferentemente 3' al segundo nucleótido del codón de inicio (esto es T) hasta el lado del primer nucleótido del codón de paro. Alternativamente, como será evidente simplemente al leer una secuencia polinucleótida, el codón de paro también puede incluirse. La cuando menos una secuencia polinucleótida heteróloga que va a expresarse en un organismo es una secuencia heteróloga. Con "heteróloga", se entendería que se refiere a una secuencia que en el tipo nativo no se encontraría en asociación con, o enlazado a, cuando menos un elemento o componente de la cuando menos una secuencia de control de empalme. Por ejemplo en donde la secuencia de control de empalme se deriva de un organismo particular y el polinucleótdo heterólogo es una secuencia de codificación para una proteína o un polipéptido, esto es una secuencia polinucleótida que codifica a una proteína funcional, entonces podría derivarse la secuencia codificante, en parte o totalmente, de un gen del mismo organismo, con la condición de que el origen de cuando menos una parte de la secuencia polinucleótida transcrita no fue la misma que el origen de cuando menos una secuencia de control de empalme. Alternativamente, la secuencia codificante podría ser de un organismo diferente, y en este contexto, podría pensarse que es "exógeno". El polinucleótido heterólogo podría también considerarse como "recombinante", en que la secuencia que codifica a una proteína o polipéptido se derivan de diferentes lugares, ya sea dentro del mismo genoma (esto es el genoma de una única especie o sub-especie) o de diferentes genomas (esto es genomas de diferentes especies o subespecies). Heteróloga puede referirse a una secuencia diferente a la secuencia de control de empalme, y por lo tanto relacionarse al hecho de que el promotor y otras secuencias tales como 5'UTR y/o 3'UTR pueden ser heterologas a la secuencia polinucleótida que va a expresarse en el organismo, con la condición de que la secuencia polinucleótida no se encuentra en asociación u enlazada de forma operativa al promotor 5'UTR y/o 3'UTR en el tipo nativo, esto es el contexto natural de la secuencia polinucleótida, si la hay. Se entenderá que heterólgo también aplcia a secuencias de "diseñador" o híbridas que no se derivan de un organismo particular pero que se basan en un número de componentes de diferentes organismos y esto también satisfaría el requisito de que la secuencia y cuando menos un componente de la secuencia de control de empalme no estén enlazados o encontrados en asociación con el tipo nativo, aun si una parte o elemento de la secuencia híbrida se encuentra así, sí cuando menos una parte o elemento no lo esté. Preferentemente, una porción de cuando menos 50 nucleótidos de la secuencia híbrida no se encuentra en asociación con cuando menos un componente de la secuencia de control de empalme, más preferentemente 200 nucleótidos y lo más preferentemente 500 nucléotidos. Se entenderá que también se consideran las versiones sintéticas de secuencias naturales. Esas secuencias sintéticas también se consideran heterólogas a menos que sean la secuencia idéntica a una secuencia que en el tipo nativo o en el contexto natural, normalmente se encontraría en asociación con o asociado a cuando menos un elemento o componente de cuando menos una secuencia de control de empalme. Esto aplica igualmente cuando el polinucléotido heterólogo es un polinucléotido para el ARN de interferencia. En una modalidad, en la cual el polinucléotido va a expresarse consiste en una secuencia que va a expresarse comprende una secuencia codificante para una proteína o polipéptido, se entenderá que la referencia a la expresión en un organismo se refiere a la provisión de una o más secuencias de ARN trascritas, preferentemente mARN maduras, pero esto puede preferentemente también referirse a polipéptidos trasladados en ese organismo. RT-PCR que demuestra la presencia de un trascrito no una proteína, puede usarse para identificar las secuencias de ARN trascritas. Esto también es particularmente útil cuando la propia proteína no se traslada o no es funcional o no es identificable por los anticuerpos surgidos contra la proteína natural o tipo nativo, debido a ARNi, modificación post-traslacional o plegado distorsionado. En otra modalidad, en la cual la secuencia polinucleótida que va a expresarse comprende polinucléotidos para el ARN de interferencia, también se entenderá que la referencia a la expresión en un organismo se refiere a la interacción de los polinucléotidos para el ARN de interferencia, o transcriptos en la trayectoria ARNi, por ejemplo al enlazar el desmenuzador o formación de AR interferentes pequeños (siARN). De hecho se prefiere particularmente que los polinucléotidos para el ARN de interferencia comprenden secuencias de siARN y por lo tanto tienen una longitud de 20-25 nucleótidos, especialmente cuando el organismo es un mamífero. En insectos u nematodos especialmente, se prefiere proporcionar porciones de dsARN, por ejemplo por medio de la formación de orquillas que pueden ser procesadas por el sistema desmenuzador. Las células mamíferas generalmente producen generalmente una respuesta de interferón contr alas secuencias de dsARN largas, de tal forma que para las células mamíferas es más común proporcionar secuencias más cortas tales como siARN. Las secuencias antisentido o las secuencias que tengan homología a los microARN que son moléculas de ARN naturales que se dirigen a los 3'UTR de proteína se consideran como las secuencias para el ARN i de acuerdo con una modalidad de la presente invención. Cada secuencia de control de empalme en el sistema comprende cuando menos un sitio aceptor de empalme y cuando menos un sitio donador de empalme. El número de los sitios donadores y aceptores puede variar dependiendo del número de segmentos de la secuencia que van a empálmese entre sí. Preferentemente, los sitios de ramificación se incluyen en cada secuencia de control de empalme. Un sitio de ramificación es la secuencia a la cual se une inicialmente el donador de empalme, ver figura 32, que muestra que el empalme ocurre en dos etapas, en las cuales el exón 5' está separado y luego se une al exón 3'. Refiriéndonos a esa figura la A es el único nucléotido esencial y por lo tanto se incluye preferentemente. Sin quererse limitar a la teoría, se cree que el empalme pre-mARN avanza por medio del intermedio de lartiato, como lo hace en el auto-empalme del grupo II. Primero la ruptura ocurre en ela unión 5' algunas veces llamada sitio donador de empalme. El fosfato en el extremo 5' del intrón entonces se enlaza al 2?? de una adenina aproximadamente 25 nucléotidos corriente arriba del extremo 30 del intrón, que algunas veces se le conoce como el sitio aceptor. Este residuo A es llamo el punto de ramificación. La siguiente etapa es que la ruptura ocurre en la unión de empalme 3' y el fosfato 5' del exón corriente abajo se une con el exón 3' OH del exón corriente arriba. Se prefiere en particular que la manera o mecanismo del empalme alternativo es específico al sexo. Preferentemente, la secuencia de control de empalme se deriva de un intrón tra. Sin embargo se prefiere en particular que el mecanismo de empalme alternativo se deriva del gen transformador Cetra de la mosca del mediterráneo, o de otro ortólogo u homologo del gen transformador de Drosofila, preferentemente de C, rosa o B. zonata especialmente uno derivado del la mosca de la fruta tefritida. También se prefiere que la secuencia de control de empalme se derive del mecanismo de empalme alternativo del gen Actin-4, en particular del Aedes spp y más preferentemente de AaActin-4, que es un gen de Aedes/Stegomyia aegypti que muestra empalme especifico al tejido, a la etapa y al sexo. Preferentemente el empalme alternativo, particularmente le mediado por Actin-4k puede agregar secuencias que afectan a translación o estabilidad de ARN, por ejemplo. También se prefiere que el mecanismo de empalme comprende un fragmento del gen de doublesex (dsx) que se deriva de Drosofila, B. morí, gusano rosa, polillas de las manzanas, o un mosquito, en particular A. gambiae o especialmente A. aegypti. Se prefiere en particular que la secuencia de control de empalme se derive de dsx (preferentemente minigen 1 como se escribe en los ejemplos y se representa en las secuencias SEQ ID NO. 149 (los exones están presentes en las posiciones 1-135, 1311-2446 y 3900-4389 de SEQ ID NO. 149) que se incluyen en la construcción LA3491) o Actina-4. Ejemplos particularmente preferidos de la presente invención se proven en los ejemplos y pueden seleccionarse del grupo consistente de plasmidos o construcciones, en particular cualquiera de acuerdo con cualquiera de las figuras 19-31, especialmente cualquiera de los plasmidos presentado en las figuras 16-18, 22- 24, 26-32, 49, 52-55, y 61-69, y/o SEQ ID NOS. 46-48, 50-56, 143-145 y 151-162. Preferentemente, la proteína funcional que va a expresarse en un organismo es tTAV, tTAV2 o tTAV3. Otras proteínas que van a expresarse en los organismos obviamente se consideran en combinación con la proteína funcional, preferentemente un gen letal como se describe en otros lados. Un ORF continuo puede también considerarse como un ORF, esto es una secuencia polinucleótida en mARN madura, que no incluye nucléotidos no codificantes, por ejemplo aquellos que tengan el potencial a ser trasladados de aminoácidos. En esta definición, se prefiere que no se incluya el codón de tope. En algunas modalidades, la cuando menos una secuencia de control de empalme regula el empalme alternativo por medio de nucléotidos intrónicos y exónico. Sin embargo, en una modalidad se prefiere en particular que la cuando menos una secuencia de control de empalme sea una secuencia de control de empalme intrónica. En otras palabras se prefiere que cuando menos una secuencia de control de empalme se deriva sustancialmente de los polinucleótidos que forman parte de un intrón y así se cortan de la transcripción primario por medio del empalme, tal como esos nucleótido que no son retenidos en la secuencia de mARN madura. Por lo tanto, las secuencias intrónicas pueden considerarse como secuencias distintas de las "exónicas" que se retienen en la molécula ARN procesa (post-empalme). Cuando la molécula de ARN procesada codifica a una proteína o una secuencia ep olipéptido, y es capaz de ser transladado, esto es tiene la estructura correcta y modificaciones tales como una tapa y una señal de poliadenilación, por ejemplo se conoce como mARN maduro o procesado y algunas de las secuencias exónicas entonces codifican a los aminoácidos cuando se trasladan. Se entenderá que en el empalme alternativo, las secuencias pueden ser intrónicas bajo algunas circunstancias (esto en otras variantes). Así la cuando menos una secuencia de control de empalme de la presente invención preferentemente se deriva sustancialmente de los polinucleótidos que forman parte de un intrón en cuando menos una variante de empalme alternativo, esto es ya sea en el primer producto de mARN empalmado o el cuando menos un producto de mARN alternativamente empalmado. Así los intrones o las secuencias intrónicas pueden considerarse desempalmadas en cuando menos un transcripto o tipo de transcripto.

Por ejemplo considerar el intrón tra de C. capitata (intron Cetra, que es un ejemplo particularmente preferido de cuando menos una secuencia de control de empalme de acuerdo con la presente invención. De acuerdo con la figura 2A de Pane y otros, reproducida como la figura 33, todos los 7 de los sitios de enlace Tra/Tra2 destacados se encuentran en la secuencia intrónica en el sentido de que se encuentran en porciones de secuencias desempalmadas en la transcripción F1, pero por el otro lado 6 de cada 8 son exónicas en el sentido de que se encuentran en exones que están incluidos o son retenidos en cualquier transcripto M1 o M2, o ambos. Así esos tipos de enlace Tra/Tra2 son intronicos en el presente sentido porque son capaces de controlar el empalme alternativo, pero se desempalman, esto es no están presentes, en cuando menos una variante de empalme alternativa, esto es cuando menos un mARN que ha sido empalmada en una manera alternativa del pre-ARN. En el empalmado "normal" (no alternativo) y en el empalmado alternativo, los intrones generalmente se retiran de pre-ARN para formar un mARN empalmado, que entonces puede trasladarse en un polipéptido tal como una proteína o un fragmento de proteína, que tiene una secuencia aminoácida. Así será fácilmente evidente para los expertos en la técnica como determinar aquellas secuencias del presente sistema que se consideraran intronicas más que exónicas. Obviamente ese apreciará que solo una parte de un mARN realmente se traslada, esto es típicamente la parte entre el codón de inicio y el codón de paro, aunque se entenderá que algunas veces están presentes múltiples inicios y paros. Así cuando se hace referencia a la traslación de una secuencia de mARN, se apreciará que se refiere a la traslación de la porción iniciando en el primer nucleótido del codón inicial y que termina después del último nucleótido antes del inicio del codón de paro, que puede considerarse como la porción de codificación. Como se mencionó las secuencias exónicas pueden involucrarse en la medición del control del empalme alternativo, pero se prefiere que cuando menos algunas secuencias de control intrónico se involucran en la mediación del empalme alternativa. En otras palabras el sistema de expresión genético de la presente invención puede también incluir secuencias de control de empalme derivadas de o que contienen elementos del gen dsx, en donde sin quererse limitar a la teoría, se cree que las secuencias exónicas ayudan al mecanismo de empalme alternativo. Así en algunas modalidades, la cuando menos una secuencia de control de empalme comprende la secuencia exónica y se entenderá que se incluye en las definiciones usadas para describir la presente invención. Así como será evidente es posible que algunos nucleótidos sean incluidos dentro de la definición de cuando menos una secuencia de control de empalme y también dentro de la definición de una secuencia polinucleótida que codifica a una proteína funcional. En otras palabras la definición de esos elementos puede traslaparse de tal forma que ciertos nucleótidos pueden ser cubiertos por la definición de más de un elemento. Sin embargo el experto en la técnica reconocerá que esto no es inusual en la biología molecular ya que los nucleótidos frecuentemente realizan más de un papel. Por ejemplo en la presente invención un nucleótido puede formar parte de una secuencia codificante de una proteína funcional, pero también podría formar parte de una secuencia reconocida y enlazada por un factor de empalme un ejemplo del cual es la proteína TRA o el complejo TRA/TRA, como se describe en otros lados. Esto no es inusual ya que por ejemplo algunos virus tienen genomas altamente concentrados en donde la misma extensión de polinucleótidos puede codificar dos o hasta tres proteínas diferentes, cada una leída en un marco diferente. Obviamente, también puede ser que la o las secuencias de control de empalme son únicamente intrónicas, esto es sin influencia exónica. De hecho esto se prefiere en particular. En algunas modalidades, se prefiere que cuando menos una secuencia de control de empalme sea capaz de ser retirada del pre-ARN por medio de empalme. Preferentemente cuando menos una secuencia de control de empalme no da como resultado un desplazamiento de marco en cuando menos una variante de empalme. Preferentemente es una variante de empalme que codifica a una proteína funcional de longitud completa. En otras palabras, la cuando menos una secuencia de control de empalme no es mediadora del retiro de los nucleótidos que forman parte, o que se pretendía formaran parte de la secuencia de polinucleótidos que codifican a una proteína funcional, definida entre un codón de inicio y un codón de paro y/o los polinucleótidos para ARN de interferencia (ARNi), que va a ser expresada por un organismo. Con esto se quiere decir que los nucléotidos son cortados por medio de empalme, en cuando menos una variante de empalme, no son nucleótidos que codifican a los aminoácidos en la forma tipo nativo de la proteína o gen. Una o más variantes de empalme pueden tener los nucleótidos recortados, pero cuando menos una variante deben retener esos nucleótidos, de tal forma que no se induce un desplazamiento de marco en la cuando menos una variante. Esos nucleótidos removidos son aquellos que se retiran además de las secuencias que normalmente son desempalmadas tales como el intrón. Sin embargo, en vista de lo anterior, también se prevé que diferentes variantes de empalme pueden dar como resultado el que la misma secuencia sea leída en diferentes marcos. La interacción por la cuando menos una secuencia de control de empalme con maquinaria de empalme celular, por ejemplo el spliceosoma, conduce a o media el retiro de una serie de, preferentemente, por lo menos 50 nucleótidos consecutivos de la transcripción primaria y la ligadura (el empalme) de las secuencias de nucleótido que no eran consecutivas en la transcripción primaria (porque ellos, o su complemento si se considera la secuencia antisentido, no eran consecutivos en la secuencia original de la plantilla de la cual la transcripción primaria fue transcrita). La serie de cuando menos de 50 nucleótidos consecutivos abarca un intrón. Esta mediación actúa preferentemente de una manera específica al sexo, específica a la etapa, específica a la línea germinal o específica al tejido o sus combinaciones, tal que las transcripciones primarias equivalentes en diversos sexos, las etapas, los tipos del tejido, etc, tienden a retirar los intrones del diverso tamaño o secuencia, o puede retirar en algunos casos un intrón en un caso pero no en otros. Este fenómeno, el retiro de intrones de diverso tamaño o secuencia en diversas circunstancias, o el retiro diferenciado de intrones de un tamaño o de una secuencia dada, en diversas circunstancias, se conoce como empalme alternativo. El empalme alternativo es un fenómeno bien conocido en naturaleza, y muchos casos se conocen, ver arriba. En algunas modalidades preferidas, por lo menos una secuencia de control de empalme es asociada a un marco de lectura abierto heterólogo tal que, en por lo menos una variante del empalme, el marco de lectura abierto heterólogo está interrumpido, por ejemplo por un codón de paro o un desplazamiento de marco, mientras que en por lo menos una variante alternativa del empalme el marco de lectura abierto heterólogo no se interrumpe. Las transcripciones del segundo tipo codifican o potencialmente codifican una proteína funcional, mientras que las del primer tipo codifican una proteína función alterada, interrumpida o aún ninguna función, actividad o estabilidad relativas a los del segundo tipo. Será generalmente evidente a la persona experta en la técnica que el marco de lectura abierto heterólogo puede en sí mismo ser un compuesto o una fusión de secuencias de varias fuentes. El empalmer para producir una proteína funcional puede todavía producir una proteína alterada relacionada al prototipo heterólogo abre el marco de lectura, por ejemplo si el intrón alternativamente empalmado insertado incluye la secuencia que es exonica en todas las formas de empalme alternativas, y por lo tanto conservado en mARN maduros del segundo tipo. Sin embargo, es particularmente preferido que por lo menos una transcripción retire toda, o substancialmente toda la, secuencia alternativamente empalmada insertada, tales que el marco de lectura abierto heterólogo está restaurado, o restaurado substancialmente, a la forma intacta, permaneciendo poco o nada de secuencia endógena asociada al intrón en el mARN maduro. El término endógeno se utiliza aquí en contraste con heterólogo, así que será entendido que éste refiere a una secuencia que, en el tipo nativo, se encuentre normalmente en asociación con, o se liga, por lo menos a un elemento o componente por lo menos de la una secuencia de control de empalme. Alternativamente, una o más transcripciones pueden retirar los nucleótidos adicionales, para interrumpir el marco de lectura abierto heterólogo, no por la inserción de nucleótidos adicionales (por ejemplo codón de paro o desplazamiento del marco, sino también potencialmente la secuencia de codificación que interrumpe la función), sino más bien por la deleción de nucleótidos del marco de lectura abierto heterólogo, por ejemplo con el fin de inducir un "desplazamiento de marco". Una o más variantes del empalme pueden haber recortado dichos nucleótidos, pero por lo menos una variante debe conservar estos nucleótidos, para no inducir un desplazamiento de marco en por lo menos la una variante. Estos nucleótidos retirados son los que se retiran además de las secuencias que se normalmente desempalman por ejemplo el intrón, donde una secuencia intronica se puede considerar como una que forme la parte de un intrón en por lo menos una variante de empalme alternativa del análogo natural. Cuando los nucleótidos exonicos deben ser retirados, éstos deben ser retirados en múltiplos de tres, si se desea para evitar un desplazamiento de marco, sino como un solo nucleótido o múltiplos de dos (que no sean también múltiplos de tres) si se desea para inducir un desplazamiento de marco. Será apreciado que si solamente uno o ciertos múltiplos de dos nucleótidos se retira, después éste podría llevar a una secuencia totalmente diversa de la proteína que era codificada en o alrededor de la unión del empalme del mARN. Este es particularmente el caso en una modalidad del sistema donde los exones del cartucho se utilizan para interrumpir un marco de lectura abierto en algunas variantes pero no en otras del empalme, tales como, por ejemplo, tra, especialmente Cetra.

En otra modalidad preferida de la presente invención, todo o una parte de un bastidor de lectura abierto está en un exón del cartucho, por ejemplo algunas modalidades de Dsx derivadas de Aedes, se proveen, por ejemplo, con una región de la codificación del tTAV en un exón del cartucho que esté solamente presente en variantes del empalme específicas a hembras. Cuando la mediación del empalme alternativo es especifica al seco, se prefiere que la variante del empalme que codifica una proteína funcional que se expresará en un organismo es la variante del empalme F1, es decir una variante del empalme encontrada solamente o predominante en hembras, y es preferentemente la variante más abundante encontrada en hembras, aunque esto no es esencial. Correspondientemente para las configuraciones donde todo o una parte de un marco de lectura abierto funcional se encuentra en un exón del cartucho, se prefiere que este exón del cartucho está incluido en las transcripciones encontradas solamente o predominante en hembras, y tales transcripciones sean preferentemente, individualmente o en la combinación, las variantes más abundantes encontradas en hembras, aunque esto no sea esencial. En una modalidad preferida, las secuencias se incluyen en una secuencia híbrida o recombinante o una construcción que se derivan de las secuencias intronicas naturales que están sujetos al empalme alternativo, en su contexto nativo u original. Por lo tanto, una secuencia intrónica se puede considerar como una que forme parte de un ¡ntrón en por lo menos una variante de empalme alternativa del análogo natural. Así, se prevén las secuencias que corresponden a las extensiones contiguas individuales de la secuencia intrónica natural, pero también híbridos de tales secuencias, incluyendo híbridos a partir de dos diversas secuencias intronicas naturales, y también de secuencias con extensiones contiguas en relación con de las deleciones o de las inserciones individuales de la secuencia ¡ntronica natural, y sus híbridos. Las secuencias derivadas de las secuencias intronicas naturales pueden estar asociadas, en la invención, con las secuencias que no son parte de cualquier intrón natural. Si tales secuencias se transcriben, y se conservan preferentemente en el ARN maduro en por lo menos una variante del empalme, pueden entonces ser consideradas exónicas. También será apreciado que referencia a un "desplazamiento" del marco; podría también referirse a la codificación directa de un codón de paro, que es también probable conducir a una proteína no funcional como una interrupción de la secuencia empalmada del mARN causada por la inserción o la deleción de nucleótidos. También se prevé la producción de diversas variantes del empalme de dos o más proteínas diversas o las secuencias de polipéptidos de función diferenciada, además de la producción de dos o más diversas proteínas o de secuencias de polipéptidos de las cuales una o más no tienen ninguna función prevista o discernible. También se prevé la producción de diversas variantes del empalme de dos o más proteínas diversas o secuencias de polipéptidos de función similar, pero difiriendo la localización subcelular, estabilidad o capacidad de enlace o de asociación a otras proteínas o ácidos nucleicos. Preferentemente, por lo menos una secuencia de control del empalme es intronica y abarca en su extremo 5' un nucleótido del de guanina(G). En otras palabras, el 5' nucleótido de la secuencia de control del empalme, 3' al sitio donador de empalme, y preferentemente en el interfaz o la unión del exón con la secuencia de control de empalme, es guanina (G), en el pre-ARN, o C en una secuencia antisentido del ADN que corresponde a esta. Además, el nucleótido adyacente (3' a G) es preferentemente la citosina (c) en el pre-ARN, o un G correspondiente en una secuencia de ADN, pero es más preferentemente el uracilo (U) en el pre-ARN, o una A correspondiente en una secuencia antisentido de la ADN. Así, los dos nucleótidos 5' de la secuencia de control de empalme son preferentemente 5 ' GT con respecto a la tira de sentido de ADN, 5' - GU en la transcripción primaria. Preferentemente, por lo menos una secuencia de control intrónica del empalme también abarca en su extremo 3' un nucleótido 3' de guanina y preferentemente AG-3' en la unión del sitio del aceptador del empalme con el exón, por ejemplo, véase la figura 34. Preferentemente, la secuencia flanqueante 5' al sitio donador de empalme en el sistema abarca 5' - TG, para poder representar la secuencia 5 ' - TG-* - secuencia de control del empalme ** - 3' , donde * representa el sitio donador de empalme y ** representa el sitio del aceptador del empalme. Preferentemente, la secuencia de control de empalme también es flanqueada en su extremo 3' por un nucleótido G, y más preferentemente por los nucleótidos GT, tales que la secuencia se podría representar como: 5' - TG-* secuencia de control de empalme ** - GT-3'. Se apreciara que ésta es la secuencia del ADN de la tira de sentido (TG). Así, el pre-ARN transcrito leerá el UG por ejemplo, cuando U substituye a T. Los derivados de guanina o de timina que tiene la misma función también se consideran. Es particularmente preferido que el empalme sea específico al sexo y que además sea mediado lejos o controlado por el enlace de la proteína TRA o del complejo proteínas TRA/TRA2, u homólogos del mismo. En los insectos, por ejemplo, la proteína de TRA se expresa diferenciada en diversos sexos. Particularmente, la proteína de TRA es conocida por estar presente en gran parte ampliamente en hembras y, por lo tanto, es mediadora del empalme alternativo de una manera tal que una secuencia de codificación se exprese en una manera específica al sexo, es decir que una proteína se exprese en algunos casos solamente en hembras o en un nivel mucho en hembras que en machos o, alternativamente, en otros casos que una proteína se expresa solamente en machos, o en un nivel mucho mayor en machos que en hembras. Mientras que se prefiere que la proteína esté expresada solamente en machos, sin embargo es particularmente preferido que la proteína sea expresada solamente en hembras. El mecanismo para alcanzar este empalme alternativo específico al sexo mediado por la proteína de TRA o el complejo TRA/TRA-2 se conoce y se describe, por ejemplo por en Pane el al. (Development 129, 3715-3725 (2002)). Preferentemente, la cuando menos una secuencia de control de empalme abarca, y preferentemente consiste en, el intrón tra derivado del gen tra de Ceratitis capitata (Cctrd), que tiene una región alternativamente empalmada. En la transcripción F1, según lo ilustrado en la figura 33 (la figura 2 A de Pane et. al (2002) supra), éste es el primer intrón. Los homólogos del gen de tra en otras especies, tales como Bactrocera oleae, Ceratitis rosa, Bactrocera zonata and Drosofila melanogaster también han empalmado alternativamente las regiones en una localización similar dentro de la secuencia de codificación de tra, intrones tra derivados de estos insectos son también particularmente preferidos. El patrón de empalme en Cetra se conserva particularmente bien, con esas transcripciones encontradas en los machos que contienen el material exonico adicional relacionado a la transcripción F1, de tal forma que estas transcripciones no codifican a la proteína integral, funcional Tra. Por el contrario, la transcripción de la F1 codifica a la proteína integral, funcional de Tra; esta transcripción es substancialmente específica a las hembras en la mayoría de las etapas del ciclo vital, aunque se especula que los embriones muy tempranos de ambos sexos pueden contener una pequeña cantidad de esta transcripción. Describimos la secuencia empalmada fuera de la transcripción de F1, pero no las transcripciones no específicas a machos o no específicas al sexo, como el intrón tra, o aún el intrón tra F1. Así la versión de esta secuencia encontrada en el gen Cetra es el intrón Cetra. Así el gen del tra es regulado en parte por el empalme alternativo especifico al sexo, mientras que su producto clave, la proteína Tra, está implicada propiamente en el empalme alternativo. En insectos, el empalme alternativo especifico al sexo mediado por la proteína de TRA, o un complejo que abarca las proteínas TRA y TRA2, incluye las secuencias de control del empalme de Dípteros derivadas del gen doublesex (dsx) y también del intrón tra, aunque éste excluyera el intrón tra de Drosofila (Dmtra), que es mediada principalmente por el producto del gen Sxl en Drosofila, en vez del TRA o el complejo TRA/TRA2. Además de Drosofila, el producto del gen Sxl diferenciado no se expresa en los diversos sexos. No se cree que Sxl actué en la mediación del empalme alternativo específico al sexo en insectos no drosofilidos. Los ejemplos de la proteína de TRA que enlaza a los sitios de enlace de proteína (las secuencias de nucleótido reconocidas específicamente por la proteína TRA) en el intrón tra son preferentemente de dípteros, preferentemente de la familia Tephritidae, preferentemente de los géneros Ceratitis, Anastrepha or Bactrocera. Sin embargo, también se considera que los otros dípteros, tal como drosofilidos o los mosquitos de las varias formas discutidas abajo, es también capaz de proporcionar la proteína de TRA o sus homólogos que son capaces de enlazarse a los sitios apropiados en las secuencias de control del empalme derivadas del gen dsx, del gen del tra o del intrón del tra, es decir el intrón tra alternativamente empalmado completamente retirado en la transcripción F1, incluso en esos casos, tales como Drosofila, donde el gen natural tra (Dmtra) no es regulado por la proteína de TRA. En algunas modalidades, el "intrón" del tra; puede ser definido como secuencia de control de empalme en donde el empalme alternativo de la transcripción del ARN es regulado por TRA, por ejemplo enlazándolo, solamente o en combinación (es decir cuando está complejado) con TRA2. Esto excluye el intrón del tra de Drosofila. Es particularmente preferido que las secuencias de control del empalme sean derivadas del intrón tra. El intrón tra se puede derivar, según lo descrito en otra parte, de Ceratitis, Anastrepha o Bactrocera. El intrón tra de Ceratitis capitata del gen transformador fue caracterizado inicialmente por Pane y otros (2002), supra. Siri embargo, será apreciado que los homólogos existen en la otra especie, y pueden ser identificados fácilmente en la especie mencionada y también en sus varios géneros. Así, cuando se hace referencia al tra se apreciara que éste también se relaciona con los homólogos de tra en otras especies, especialmente en las especies de Ceratitis, Anastrepha o Bactrocera. Con el término "derivado" se entenderá que, haciendo referencia al intrón del tra, éste refiere a las secuencias que se aproxime a o replique exactamente el intrón del tra, según lo descrito en la técnica, en este caso por Pane y otros (2002), supra. Sin embargo, se apreciará que, como éstas son las secuencias intronicas, algunos nucleótidos pueden ser agregados o suprimidos o substituidos sin una pérdida substancial en su función. Los ejemplos preferidos incluyen el intrón dsx, proporcionado preferentemente bajo la forma de minigen. En este caso, puede ser preferible a la deleción, como lo hemos hecho en los ejemplos, cantidades importantes de intrones alternativamente empalmados, por ejemplo en algunos casos el 90% o más de un intrón, conservando aun la función de empalme alternativo. Así, aunque se prevén grandes deleciones, también se prevé que también se prefieran inserciones, substituciones o deleciones más pequeñas, e incluso individuales del nucleótido La longitud exacta de la secuencia de control del empalme derivada del intrón tra no es esencial, siempre y cuando sea capaz de mediar el empalme alternativo. A este respecto, se piensa que alrededor 55 a 60 nucleótidos son la longitud mínima para un intrón modificado de tra, aunque el tipo nativo intrón del tra - (variante de empalme F1) de C capitata, está en la región de 1345 nucleótidos de largo. Es particularmente preferido que se use la secuencia integral 1345 del ntd de Cetra. Como con todas las secuencias de nucleótido descritas aquí, se prefiere que se considere cierto grado de homología de la secuencia, a menos que sea evidente otra cosa. Así, se prefiere que la secuencia de control del empalme tenga por lo menos una homología a la secuencia del 80% con referencia a la SEQ ID No., preferentemente una homología del 80% con referencia a la SEQ ID No., preferentemente cuando menos 80% de homología con referencia a la SEQ ID No., más preferentemente por lo menos una homología del 90% con referencia a la SEQ ID No., preferentemente por lo menos una homología del 95% con referencia a la SEQ ID No., más preferentemente por lo menos una homología del 99% con referencia a la SEQ ID No., y más preferentemente por lo menos una homología del 99.9% con referencia a la SEQ ID No.. Un algoritmo conveniente tal como BLAST puede utilizarse para determinar la homología de la secuencia. Si granes cantidades de secuencia se delecionan cf del tipo nativo, entonces la comparación de la secuencia puede realizarse sobre toda la longitud del tipo nativo o sobre las secuencias alineadas de homología similar. Sin embargo, se entenderá que a pesar de la homología antes dicha de la secuencia, deben ser conservados ciertos elementos, particularmente los nucleótidos y el sitio del ramal de flanqueo, para el funcionamiento eficiente del sistema. Es decir mientras que las porciones pueden ser suprimidas o alteradas de otra manera, debe mantenerse una funcionalidad del empalme alternativo o de la actividad, de por lo menos al 30%, preferentemente 50%, preferentemente 70%, preferentemente el 90%, y más preferentemente el 95% comparado con el tipo nativo. Éste podría ser el cf elevado del tipo nativo, también, al manipular convenientemente, por ejemplo los sitios de enlace de los factores de empalme alternativos o interactúan con el spliceosoma. Particularmente, se prefiere que cuando la secuencia de control del empalme abarque un intrón modificado de TRA, éste abarque por lo menos 20 a 40 pares de base desde 5' y, preferentemente, el extremo 3' de tal intrón. Además, se prefiere que estén provistos por lo menos 3 o 4 y más preferentemente, por lo menos 5, preferentemente 6, preferentemente 7 y más preferentemente los 8 de los 8 dominios obligatorios atribuidos a TRA del intrón tra de C. capitata, según lo enseñado por Pane y otros. (2002), o los homólogos del mismo. Por supuesto, a su debido tiempo se descubren más de esos sitios, entonces se considera que la secuencia de control del empalme podría incluir más de 8 sitios. De hecho, se considera que los más de 8 sitios pueden ser manipulados en la secuencia de control de empalme y que el empalme de la alternativa se puede regular de esta manera, especialmente si algunos sitios están enlazados con afinidades diferentes que conducen a diversos resultados del empalme alternativo. Una secuencia de consenso para los dominios obligatorios supuestos de TRA del intrón tra de C. capitata, se da adelante como SEQ ID NO 1, una secuencia de ADN, aunque el equivalente correspondiente del ARN también se prefiere. Las secuencias de consenso preferidas son 1: TCWWCRATCAACA (SEQ ID No. 1), donde W = A o T y R = A o G. Consideraciones similares se aplican al doublesex, donde la secuencia de consenso para la proteína de TRA es también la dada bajo la SEQ No. 1, como complejo de proteínas que abarca las proteínas Tra y TRA2 es un regulador clave del empalme alternativo del doublesex, como es para los homólogos tra (sin embargo no los homólogos tra encontrados en las drosofilidas). Según lo mencionado anteriormente, las secuencias de control de empalme se derivan preferentemente del intrón tra, preferentemente de la familia Tephritidae. Es particularmente preferido que el intrón tra se derive de B. zonata o, preferentemente, de otras moscas de la fruta no drosofilidas. Sin embargo, es particularmente preferido que el intrón tra sea derivado del género Ceratitis, particularmente C. rosa y, más •preferentemente, C. capitata. Que se conocen más extensamente como las moscas de la fruta de Natal y del mediterráneo, respectivamente.

Con respecto al intrón tra derivado de B. zonata, hemos demostrado que éste puede conducir al empalme alternativo específico al sexo en mosca mex transgénica (de Anastrapha ludens) y en la mosca del mediterráneo transgénica (C. capitata). También hemos demostrado que una variedad de proteínas se pueden expresar en una manera específica al sexo por medio del empalme alternativo, incluyendo el tTAV 3 y Rpr. En lo que se refiere al intrón tra derivado de C. rosa, hemos proporcionado con éxito el empalme alternativo de una manera específica a cada sexo de un transgén en la mosca del mediterráneo. Con respecto al intrón tra derivado del C capitata (mosca del mediterráneo), hemos demostrado que éste puede mediar el empalme específico a cada sexo en mosca del mediterráneo transgénica, y otros tefritidas, y el otro tephritida tal como A. ludens (mosca mex). No sólo eso, hemos demostrado que este intrón puede trabajar con éxito a través de una gama de insectos y, particularmente, de Dípteros. De hecho, hemos demostrado que el intrón de TRA de C capitata (designado como Cetra) puede proporcionar el empalme específico al sexo en la Drosofila transgénica, que no es un tefritida, y también en el mosquito aedes aegypti. Aunque los mosquitos sean dípterso, se derivaron de Drosofila y del Tefritidas hace cerca de 250 millones de años y, por lo tanto, están relacionados de una forma mucho más distante que lo que las drosofilidas están de tefritidas, para el cual el tiempo de la divergencia se ha estimado en 120-150 millones de años. Así, esto demuestra la aplicabilidad amplia de la presente invención a través de una amplia gama de insectos. Con respecto a las secuencias de control de empalme derivadas del intrón dsx, también hemos demostrado que esto se puede utilizar para empalme alternativamente, de una manera específica al sexo, en una gama amplia de insectos. Por consiguiente, es particularmente preferido que el dsx sea derivado del Bombyx mori (polilla de seda), Pectinophora gossypiella (gusano rosa) Pectinophora gossypiella, Cydia pomonella (polilla de la manzana), Drosofilas, y mosquitos tales como Anopheles sp ejemplo A. gambiae. Los mosquitos particularmente preferidos incluyen Stegomyia spp., particularmente S. aegypti. (también conocido como Aedes aegypti). De hecho, en A aegypti, hemos demostrado un considerable número de construcciones de ADN, que son capaces de proveer empalmes alternativos específicos al sexo. Se apreciará que el sistema o la construcción son administrados preferentemente como plásmido, pero es probado generalmente después de integrarlo en el genoma. La administración puede realizarse por métodos conocidos en la técnica, tal como parenteral, intravenoso, intramuscular, transdérmico, administración oral a través de una membrana mucosa, y así sucesivamente. La inyección en embriones es particularmente preferida. El plásmido se puede linearizar antes o durante la administración, y no todo el plásmido puede ser integrado en el genoma. Cuando solamente está integrada parte del plásmido en el genoma, se prefiere que esta parte incluya por lo menos la secuencia de control del empalme capaz de mediar el empalme alternativo. Preferentemente, el sistema de la expresión del polinucleótido es un sistema genético letal dominante recombinante, el efecto letal del mismo es condicional. Las condiciones convenientes incluyen temperatura, de tal forma que el sistema se exprese a una temperatura pero no, o a un menor grado, a otra temperatura, por ejemplo. El sistema genético letal puede actuar en las células o los tejidos específicos o imponer su efecto en todo el organismo en general. También se proveen sistemas que no son estrictamente letales pero que dañan la salud substancialmente, por ejemplo llevan a la ceguera, impedimento de volar (para los organismos que podían volar normalmente), o a la esterilidad. También se proveen sistemas que interfieren con la determinación de sexo, por ejemplo que transforman o tienden a transformar total o parcialmente a un organismo a partir de un tipo sexual a otro. Se entenderá que todos esos sistemas y consecuencias son abarcados por el término letal tal como se usa aquí. Similarmente, el término "matar", y los términos similares se refieren a la expresión eficaz del sistema letal y así a la imposición de un fenotipo dañino o que distorciona el sexo, por ejemplo la muerte.

Preferentemente, el sistema de expresión de polinucleótido es un sistema genético letal dominante recombinante, el efecto letal el cual es condicional y no se expresa bajo condiciones permisivas requiere la presencia de una sustancia que esté ausente en el ambiente natural del organismo, de tal forma que el efecto letal del sistema letal ocurra en el ambiente natural del organismo En otras palabras las secuencias de codificación codifican un letal enlazado a un sistema tal como el sistema tet descrito en WO 01/39599 y/o WO2005/012534. Se prefiere de hecho que la expresión del gen letal en cuestión esté bajo el control de una proteína reprimible del transactivador. También se prefiere que el gen cuya expresión es regulada por el empalme alternativo codifique a una proteína del transactivador tal como tTA. Esto no es incompatible con la proteína regulada letal. De hecho, particularmente se prefiere que sea ambos. A este respecto, preferimos particularmente que el sistema incluya un sistema de regeneración positiva según lo enseñado en WO2005/012534. Preferentemente, el efecto letal del sistema letal dominante es condicionalmente suprimible. Los organismos convenientes bajo los cuales el actual sistema puede ser utilizado incluyen mamíferos tales como ratones, ratas y animales de granja. También se prefieren los peces, tales como salmones y truchas. Las plantas también se prefieren, pero es particularmente preferido que el organismo anfitrión sea un insecto, preferentemente un díptero o un tefritida. Preferentemente, el organismo no es un ser humano, preferentemente no es mamífero, preferentemente no es un ave, preferentemente es un invertebrado, preferentemente es un artrópodo. En particular, se prefiere que el insecto sea del orden Díptera, especialmente Díptera superior y particularmente que sea una mosca de fruta tefiritida, preferentemente mosca del mediterráneo (Ceratitis capitata), preferentemente mosca mex (Anastrepha ludens), preferentemente mosca de fruta oriental (Bactrocera dorsalis), mosca de la oliva (Bactrocera oleae), mosca del melón (Bactrocera cucurbitae), mosca de la fruta de Natal fly (Ceratitis rosa), mosca de la cereza (Rhagoletis cerasi), mosca de la fruta de Queensland (Bactrocera tyron'i), mosca del fruto del durazno (Bactrocera zonata) mosca de la fruta caribeña (Anastrepha suspensa) o mosca de la fruta de las Indias occidentales (Anastrepha obliqua). También se prefiere en particular que el organismo sea un mosquito, preferentemente del genero Stegomyia, Aedes, Anopheles o Culex. Se prefieren en particular Stegomyia aegyptae, también conocido como Aedes aegypti, Stegomyia albopicta (también conocido como Aedes albopictus), Anopheles stephensi, Anopheles albimanus y Anopheles gambiae. Dentro de los dípteros, otro grupo preferido es Calliphoridae, particularmente el gusano del nuevo mundo (Cochliomyia hominivorax), el gusano del viejo mundo (Chrysomya bezziana) y la mosca australiano del ganado lanar (Lucilia cuprina). Lepidópteros y coleópteros también se prefieren, especialmente se prefieren en particular polillas, incluyendo polilla de manzana (Cydia pomonella), y el gusano de la seda (Bombyx mori), el gusano rosa (Pectinophora gossypiella), la polilla diamante (Plutella xylostella), la polilla gitana (Lymantria dispar), el gusano naranja (Amyelois transitella), barrenador de ramas de durazno (Anarsia lineatella) y el barrenador del tallo del arroz (Tryporyza incertulas), también las polillas nocturnas, especialmente Heliothinae. Entre los coleópteros, el escarabajo japonés (Popilla japónica), escarabajo rayado (Graphognatus spp.), gorgojo (Anthonomous grandis), gusano de raíz de maíz (Diabrotica spp) y gusano de la papa de Colorado (Leptinotarsa decemlineata). Preferiblemente, el insecto no es un drosfilida, especialmente Dm. Así, en algunas modalidades, se excluye la expresión en Drosofilidas, especialmente Dm. En otras modalidades, la secuencia de control de empalme no se deriva del intrón de un drosfilida, especialmente Dm de tra. Se prefiere que la expresión de la secuencia heteróloga del polinucleótido conduzca a una consecuencia fenotípica en el organismo. Particularmente se prefiere que la proteína funcional no sea beta-galactosidasa, pero puede asociarse a los marcadores visibles (incluyendo fluorescencia), a la viabilidad, a la fertilidad, a la fecundidad, a la aptitud, a la capacidad de vuelo, a la visión, y a las diferencias del comportamiento. Será apreciado, por supuesto, que, en algunas modalidades, los sistemas de la expresión son típicamente condicionales, expresándose el fenotipo solamente bajo algunas condiciones, por ejemplo restrictivas. En otro aspecto, también se proporciona un método de control de población de un organismo en un ambiente natural, que consiste en: i) criar una reserva del organismo, el organismo que porta un sistema de expresión de gen que abarca un sistema según la presente invención que es un sistema genético letal dominante, ii) distribuir los animales reserva en el ambiente en una zona para el control de población; y iii) lograr el control de la población por medio de la letalidad en las etapas tempranas por medio de la expresión del sistema letal en el descendiente resultante del cruce de los individuos de esa reserva con los individuos del sexo opuesto de la población nativa. Preferiblemente, la letalidad a edad temprana es embrionaria o antes de la madurez sexual, preferiblemente temprano en el desarrollo, más preferiblemente en las etapas larvales o embrionarias tempranas de la vida. Preferiblemente, el efecto letal del sistema letal es condicional y ocurre en el ambiente natural por medio de la expresión de un gen letal, la expresión del gen letal está bajo control de una proteína reprimible del transactivador, la crianza que se encuentra bajo condiciones permisivas en presencia de una sustancia, la sustancia no está presente en el ambiente natural y es capaz de reprimir al transactivator. Preferiblemente, el efecto letal se expresa en los embriones de los descendientes dicho. Preferiblemente, el organismo es un animal multicelular invertebrado o como se describe en otra parte. También se proporciona un método de control biológico, que incluye: i) la crianza de una reserva de los organismos macho y hembra transformados con el sistema de la expresión según la presente invención bajo condiciones permisivas, permitiendo la sobrevivencia de machos y de hembras, para proporcionar un agente de control biológico de sexo dual; ii) opcionalmente antes del siguiente paso que impone o que permite que las condiciones restrictivas causen la muerte de individuos de un sexo y proporcionando un agente de control biológico de un solo sexo que abarca a individuos del otro sexo que portan el sistema genético letal condicional; ¡ii) liberar del agente de control biológico del sexo dual o de un solo sexo en el ambiente en un lugar específico para el control biológico; y iv) alcanzar el control biológico con la expresión del sistema genético en descendientes resultantes del cruce de los individuos del agente de control biológico con los individuos del sexo opuesto de la población nativa. Preferiblemente, hay separación de sexo antes de la distribución del organismo por la expresión de un sistema genético letal específico del sexo. Preferiblemente, el efecto letal da lugar a una matanza mayor al 90% de la clase objetivo de la progenie de cruzas entre los organismos liberados y la población salvaje. También se proporciona un método de separación del sexo que incluye: i) crianza de una reserva de organismos masculinos y femeninos transformados con el sistema de expresión genética bajo condiciones permisivas o restrictivas, permitiendo la supervivencia de machos y de hembras, y ii) eliminar las condiciones permisivas o restrictivas para inducir el efecto letal del gen letal en un sexo y no en el otro por medio del empalme alternativo específico al sexo del gen letal. Preferiblemente, el efecto letal da lugar a la matanza de más del 90% de la clase objetivo de la progenie de acoplamientos entre los organismos liberados y la población salvaje. También se proporciona un método para el control biológico o de la población; i) crianza de una reserva de organismos masculinos y femeninos transformados con el sistema de expresión genética bajo condiciones permisivas o restrictivas, permitiendo la supervivencia de machos y de hembras; ii) eliminar las condiciones permisivas o restrictivas para inducir al efecto letal del gen letal en un sexo y no en el otro por empalme alternativo específico al sexo del gen letal que produzca la separación del sexo; iii) esterilizar o parcialmente esterilizar a los individuos separados y iv) obtener el control a través de la liberación de los individuos estériles o parcialmente estériles separados dentro del ambiente natural del organismo. Preferiblemente, la esterilización se realizará con el uso de radiación ionizante. Sin embargo en general se prefieren los métodos que evitan la radiación tales como los usados en la Técnica de Insecto Estéril (SIT) y tienen muchas ventajas de costos y de salud sobre los métodos asociados con o seguidos por el uso de la radiación. También se provee un método para eliminar selectivamente a las hembras de una población. El equivalente para los machos también se considera. Los métodos de separación del sexo son enormemente importantes comercialmente en, por ejemplo los gusanos de seda, donde los machos producen más y una mejor seda que las hembras. Así, los métodos de separación del sexo que eliminan a hembras y, particularmente los gusanos de seda femeninos son particularmente preferidos. También se considera que la proteína funcional puede ser expresada de forma diferencial, pero puede ser detectada en más de una variante del empalme y preferiblemente, por lo tanto, en ambos sexos, por ejemplo. Tales ejemplos incluyen una proteína fluorescente, tal como eGFP, CopGFP y DsRed2. Esta se puede utilizar en un método de separación inocua o de clasificación del sexo, de modo que una pueda separar los dos tipos sin matar a ninguno de ellos. También hemos descubierto asombrosamente que la colocación de la secuencia de control del empalme puede ser alterada y hemos obtenido mejores resultados. Preferiblemente, la secuencia de control de empalme es el "primera" la secuencia de control de empalme, cuando se ha leído del promotor, en la dirección 5' a 3'. Hemos encontrado eso en ciertas construcciones con un intrón en el 5' UTR del sistema que conlleva a niveles reducidos o la expresión de la proteína alternativamente empalmada mediada por la secuencia de control de empalme de la presente invención. Preferiblemente, la secuencia de control de empalme es 3' al codón de inicio. Preferiblemente, la secuencia de control de empalme se inserta dentro del primer exón, es decir el estiramiento de la secuencia inmediatamente 3' al sitio del inicio de la transcripción. Se entenderá que tales términos pueden referirse a la secuencia de ADN que codifica la transcripción, o a la transcripción del propio ARN. Cuando la secuencia de control de empalme es 3' al codón de inicio, se prefiere que sea también 5' al primer codón de paro en el marco (que es 3' a y en al marco con el codón de inicio), de modo que el empalme alternativo produce transcripciones que codifican que codifican diversas secuencias de la proteína o del polipéptido. Así en una modalidad preferida, la construcción o la secuencia del polinucleótido abarca los elementos siguientes en el orden 5' a 3', con respecto a la tira de sentido o a la transcripción primaria: inicio de la transcripción, inicio de la translación, intrón capaz de empalme alternativo, secuencia de codificación para toda o una parte de una proteína, codón de paro. La secuencia de control del empalme se puede definir como preferiblemente hasta e incluyendo el 5' G (GT/C) y su equivalente 3'G, especialmente en tra, pero como se menciona anteriormente, esto puede incluir una cierta secuencia exónica y por lo tanto, podría incluir el nucleótido más cercano a 3' (último) del exón (es decir G). Se prefiere particularmente que la secuencia de control del empalme sea inmediatamente adyacente, en el 3' dirección, el codón de inicio, de modo que el G del ATG se encuentra a 5' al inicio (extremo 5') de la secuencia de control del empalme. Esto es particularmente ventajoso pues permite que el G del codón de inicio de ATG sea la secuencia flanqueante 5' G a la secuencia de control de empalme.

Alternativamente, la secuencia de control del empalme es 3' al codón de inicio pero dentro de 1000 bp exónieas, preferiblemente 500 bp exónieas, preferiblemente 300 bp exónieas, preferiblemente 200 bp exónieas, preferiblemente 150, preferiblemente bp exónieas 100 bp exónieas, más preferiblemente 75 bp exónieas, más preferiblemente 50 bp exónieas, más preferiblemente 30 bp exónieas, más preferiblemente 20, y lo más preferiblemente 10 o aún 5, 4, 3, 2, o 1 bp exónieas. La presente invención es una mejora en el sistema definido como LA1188 en WO2005/012534. Este plásmido tenía varios defectos, el principal de ellos es que los nucleótidos exónicos fueron suprimidos con el intrón Cetra usado aquí, de tal modo que se tiene por resultado un desplazamiento de marca inducido en la transcripción. Específicamente, además de la secuencia derivada de Cetra (el intrón Cetra), 4 nucleótidos de secuencia del tTAV fueron retirados en la transcripción específica a las hembras. Por lo tanto, aunque fueron producidas varias transcripciones alternativamente empalmadas, incluyendo una transcripción específica para hembras, ninguna fue capaz de codificar la proteína funcional tTAV. Por lo tanto, esta construcción no fue capaz de proporcionar la expresión específica al sexo de la proteína funcional tTAV. Ya que el empalme no fue dirigido a la secuencia donadora del empalme (5' - GT...) utilizada normalmente en el intrón Cetra, esta construcción claramente no contuvo todas las secuencias reguladoras necesarias para dirigir el empalme bajo la forma de intrón de Cetra en "su contexto nativo". Sin embargo, esto es otro problema. Probablemente los único faltante fue el flanqueo TG ... GT, del cual es posible que solamente importara el 5' G. Un beneficio clave de la presente invención, particularmente en lo referente a tra, que los requisitos para la secuencia exónica son tan mínimos (por ejemplo 2 nucleotidos en cada extremo) que se pueden diseñar fácilmente en la mayoría de las secuencias de codificación, usando la redundancia en el código genético. De tal forma que los nucleotidos exónicos "extra" pueden ser tanto parte de la secuencia heteróloga de la proteína, y al mismo tiempo la secuencia que flanquea al intrón en su contexto nativo. Además, el intrón de Ccfra en LAI 188 era +132bp 3' a la G del codón de inicio ATG (al último nucleótido exónico). De hecho, aunque el intrón Cetra en LA1188 sea el primer intrón leído en la dirección 5' a 3 desde el codón de inicio de ATG, no es el " primer" intrón cuando es leído en la dirección 5' a 3' desde el promotor. De hecho, es el 2do intrón, pues hay otro intrón (derivado del gen de Drosophila melanogaster Adh) corriente arriba desde el codón de inicio ATG. Esta información se incluye en la tabla 3. Se entenderá que cuando se hace referencia a los codones de inicio ATG o a G flanqueante, o secuencias 5' - TG... GT-3' esto en lo referente a una secuencia de ADN, pero ésta también cubre la secuencia antisentido de DNA correspondiente e, igualmente, la secuencia correspondiente del ARN.

Descripción de las secuencias de la presente invención SEQ ID NO. 1 secuencia de consenso tra SEQ ID NO. 2 secuencia flanqueante de 5' LA3097 SEQ ED NO. 3 secuencia flanqueante de 3' LA3097 SEQ ID NO.4 cebador 688 - ¡el-transcr SEQ ID NO. 5 cebador 790 - Aedsx-m-r2 SEQ ID NO. 6 cebador 761 - Aedsx-fem-r SEQ ID NO.7 cebador AedsxRI SEQ ID NO. 8 secuencia de consenso de Pane y otros SEQ ID NO. 9 secuencia de consenso de Scali y otros 2005 SEQ ID NOS. 10 - 33 y 107 - 138 secuencias de consenso de sitios de enlace asignados Tra/Tra2 deducidos de Drosophila (ver Tabla 2). ' SEQ ID NO. 34: Marco de lectura abierto de tTAV SEQ ID NO. 35: Secuencia de proteína de tTAV SEQ ID NO. 36: Marco de lectura abierto de tTAV2 SEQ ID NO. 37: Secuencia de proteína de tTAV2 SEQ ID NO. 38: Marco de lectura abierto de tTAV3 SEQ ID NO. 39: Secuencia de proteína de tTAV3 SEQ ID NO.40: Fragmento 1 de la secuencia específica al gusano rosa hembra dsx SEQ ID NO.41: Fragmento 1 de la secuencia específica al gusano rosa hembra dsx (PBW, Pectinophora gossypiella) SEQ ID NO.42: Fragmento de la secuencia específica al gusano rosa macho dsx (PBW, Pectinophora gossypiella) SEQ ID NO.43: Secuencia genética parcial de Aedes aegypti dsx. la secuencia exónica AU se incluye, pero solo la secuencia intrónica parcial - ver figures 47 y 48 para la anotación. SEQ ID NO.44: Secuencia genética hembra dsx de polilla de la manzana (Cydia pomonella): incluye una extensión de nucleótidos desconocidos, preferentemente menos de 100, preferentemente menos de 5,0, más preferentemente menos de 20, más preferentemente menos de 10, y lo más preferentemente menos de 5. SEQ ID NO.45: Secuencia macho dsx de polilla de la manzana (Cydia pomonella). SEQ ID NO.46: Secuencia de la construcción/plasmido de pLA3435-Bombyx mori-dsx. SEQ ID NO.47: Secuencia de la construcción de pLA3359-Anopheles gambiae dsx. SEQ ID NO.48: Secuencia de la construcción de pLA3433-Agdsx (Anopheles gambiae) incluyendo 2 exones. SEQ ID NO.49: Secuencia de la construcción del intrón pLAI 188-cctra. SEQ ID NO. 50: Secuencia de la construcción de pLA3077-a Cetra intron-tTAV. SEQ ID NO. 51 : Secuencia de la construcción de pLA3097-a Cetra intron-tTAV. SEQ ID NO. 52: Secuencia de la construcción de pLA3233-Cctra-intron-tTAV2.

SEQ ID NO 53: Secuencia de la construcción de pLA3014-Cctra-intron-Ubiquitina-reaperKR. SEQ ID NO. 54: Secuencia de la construcción de pLA3166-Cctra intron-Ubiquitina-reaperKR. SEQ BD NO. 55: Secuencia de pLA3376-Bztra intron-reaperKR y Bztra-intron-tTAV3. SEQ ED NO. 56: Secuencia de la construcción de pLA3242-Crtra intron-reaperKR. SEQ ID NO. 57: Secuencia parcial de una transcripción de un macho generada en Drosophila melanogaster de los transformantes LA3077 que difiere de la secuencia generada en los linajes de la mosca del mediterráneo LA3077 lines. Esta secuencia corresponde al transcripto M3 mostrado en la figura 36. SEQ ID NO. 58: Secuencia parcial de un homologo de Bactrocera zonata tra. Secuencia intrónica que se predijo se iba a desempalme en una transcripción específica para las hembras de B. zonata tra ( + 3 a +970bp in la secuencia). Los nucléotidos exónicos flanqueantes se encuentran en las posiciones 1-2 y 971-972, esto es en los extremos 5' y 3' de la secuencia intrónica. De hecho vale la pena notar que la secuencia intrónica está flanqueada en su extremo 5' por un nucléotido de guanina, que se cree es crítico para una extracción para la salida limpia del intrón. SEQ ID NO 59: Secuencia parcial de un homologo de Ceratitis rosa tra. Secuencia intrónica que se predijo se iba a desempalme en una transcripción específica para las hembras de C. rosa tra ( + 3 a 1311 bp de secuencia). Nucleótidos exónicos flanqueantes están presentes en las posiciones 1-2 y 1312-3. Otra vez vale la pena observar que la secuencia intrónica está flanqueada en su extremo 5' por un nucléotido de guanina, que se cree es crítico para una extracción para la salida limpia del intrón. SEQ ID NOS. 60-70: Cebadores referidos en las figuras 44-46 y 50-51. SEQ ID NO. 71 : Fragmento 3 de la secuencia específica al gusano rosa hembra dsx (PBW, Pectinophora gossypiella) SEQ ID NO. 72: Marco de lectura abierto de ubiquitina de Drosophila melanogaster. SEQ ID NO. 73: Secuencia de proteína de ubiquitina deDrosophila melanogaster. SEQ ID NOS. 74-105 Son los cebadores descritos en los ejemplos SEQ ID NO. 106 es la secuencia nucleótida LAI 172, que incluye una base de plasmido. SEQ ID NOs 107-138 son como se describen antes. SEQ ID NO. 139 cebador HSP SEQ ID NO. 151 plasmido completo LA3619 SEQ ID NO. 140 secuencia de cebadores VP 16 SEQ ID NO. 141 cebador AgexonlF SEQ ID NO. 152 plasmido completo LA3612 SEQ ID NO. 142 secuencia de cebadores TETRRI SEQ ID NO. 143 secuencia de plasmidos LA3576 SEQ ID NO. 153 secuencia de plasmidos LA3491 SEQ ID NO. 144 secuencia de plasmidos LA3582 SEQ ID NO. 154 secuencia de plasmidos LA3515 SEQ ID NO. 145 secuencia de plasmidos LA3596 SEQ ID NO. 155 secuencia de plasmidos LA3545 SEQ ID NO. 146 PBW-dsx (Fig 6) SEQ ID NO. 156 secuencia de plasmidos LA3604 SEQ ID NO. 147 bombyx-dsx (Fig 6) SEQ ID NO. 157 secuencia de plasmidos LA3646 SEQ ID NO. 148 codling-dsx (Fig 6) SEQ ID NO. 158 secuencia de plasmidos LA3054 SEQ ID NO. 149 DSX Minigen de la construcción LA3491 SEQ 3D NO. 159 secuencia de plasmidos LA3056 SEQ ID NO. 160 secuencia de plasmidos LA3488 SEQ ID NO. 150 DSX Minigen2 de la construcción LA353 SEQ ID NO. 161 secuencia de plasmidos LA3641 SEQ ID NO. 162 secuencia de plasmidos LA3570 La invención ahora será descrita por la referencia al siguiente, no-limitando ejemplos. EJEMPLOS Transformador Ejemplo 1 - Intrón tra de Ceratitis capitata Hemos preparado una inserción de un cartucho del intrón de Cetra en un marco de lectura abierto sintético (ORP). Dos versiones de esto empalman correctamente en la mosca del mediterráneo, es decir el empalme del cartucho del intrón de Cetra recapitulan fielmente lo que haría normalmente en el contexto del gen endógeno Cetra. Esto es producir 3 variantes del empalme (principales o únicas) en las hembras, una de las cuales (llamada F1) es específica a las hembras mientras que las otras dos se encuentran tanto en machos como en hembras (llamados M1 y M2). Puesto que cada uno de las transcripciones no específicas contiene el material exónico adicional con codones de paro, también hemos arreglado esto de modo que solamente la variante femenina del empalme produzca la proteína funcional. Cada uno de éstas construcciones (LA3077 y LA3097) tiene al intrón de Cetra flanqueado por TG y GT (para dar 5'. .TG | i ntrón |GT... 3'. Una construcción más antigua, que no trabaja perfectamente, es LA1188. LA1188 está absolutamente bien caracterizada - el empalme es exactamente como el anterior salvo que se eliminan los 4 nucleótidos adicionales. El intrón está en el contexto 5' ... TGGCAC|intron] GT... 3' ; el empalme retira las 4 bases adicionales, es decir 5' ... TG|GCACintron|GT... 3' (figura 33). En todos los casos el intrón es invariante, y es simplemente la secuencia completa del intrón Cetra. Como es normal para los intrones, comienza en GT y termina en AG. Casi todos los intrones comienzan en GT, así que el uso de la rara alternativa GC en LA1188 es sorprendente [los intrones GC-AG son una alternativa conocida - en un estudio a gran escala, se reportó que el 0.5% de todos los intrones usaron GC-AG (Burset y otros, 2001), aunque esto puede ser una desventaja, particularmente para los intrones alternativamente empalmados, de los cuales tal vez el 5% pudieron utilizar GC-AG (Thanaraj y Clark, 2001)]. El análisis de RT-PCR fue realizado en LA3077, (una construcción de la retroalimentación positiva con el intrón CcTRA en el marco de lectura abierto tTAV). Moscas adultas transformadas de ambos sexos fueron criadas con una dieta substancialmente libre de la tetraciclina ("sin tetraciclina") durante 7 días. Las moscas entonces fueron recolectadas para la extracción del ARN y RT PCR usando los cebadores (HSP- SEQ ID NO. 104 y VP16 SEQ ID NO. 105) para analizar el patrón de empalme del intrón CcTRA (figura 34). En dos muestras femeninas encontramos el patrón correcto del empalme de Cetra (776bp, correspondiendo al retiro exacto del intrón de Cetra) y no vimos ninguna banda de ese tipo en los machos. Encontramos que LA3077 y LA3097 correspondientemente dieron una letalidad específica a las hembras reprimible. L A3077 fue probado fenotípicamente a través del cruce de moscas heterozigóticas para LA3077 al tipo nativo, con intervalos de administración de tetraciclina. La letalidad femenina se extendió desde el 50 hasta el 70%. LA3097 (una versión modificada de LA3077 por el que el intrón de Cetra sigue inmediatamente al codón de inicio en el tTAV ORF), demostrado un mucho mayor nivel de letalidad específica femenina, llegado al 100% (figura 35). El intrón Cetra también fue insertado en tTAV2 en la misma posición que LA3097, en la construcción LA3233, y ésta dio un resultado fenotípico similar a LA3097 (figura 35). También hemos preparado transformantes de LA3077 en Drosophila. Fenotípicamente, la construcción trabaja perfectamente, lo que quiere decir que es altamente letal especifica a las hembras. Sin embargo, la secuencia de las variantes de empalme de una de estas inserciones ha demostrado que el empalme de esta construcción en Drosophila no es absolutamente igual a la de la mosca del mediterráneo (SEQ ID No. 57). La transcripción crítica, la específica a las hembras, es igual en ambas, pero por lo menos es diferente una de las transcripciones no específicas al sexo. Todavía incorpora una secuencia exónica adicional, con codones de paro, pero las uniones del empalme no son absolutamente iguales (figura 36). Esta observación es extremadamente importante porque demuestra que este método (regulación de la expresión de gen por medio de los intrones alternativamente empalmados) se puede utilizar a través de un amplio rango filogenético. Una prueba simple para determinar si un regulador exonico de empalme hasta ahora no caracterizado (tal como reforzadores y supresores) puede modificar la función del intrón alternativamente empalmado, podría incluir la realización de la construcción y la introducción de ella en un tejido objetivo, después el examen de su patrón del empalme. En muchos casos esto no requerirá la transformación de la línea germinal, así que la prueba puede ser absolutamente rápida, por ejemplo por la expresión transitoria en células de cultivo convenientes del tejido o in vivo. Por ejemplo, la prueba in vivo en insectos podía ser obtenida proporcionando el ANA por microinyeccion. Sin embargo, como el experto en la técnica apreciará, la microinyeccion junto con la electroporacion, o la electroporacion, transformación química, métodos balísticos, por ejemplo, todos han sido utilizados en varios contextos y tales métodos de introducción y de expresión de la proteína del plásmido son conocidos en la técnica. También recientemente hemos producido y hemos obtenido transgenicos con, el intrón Cetra en un gen diferentes (LA3014) (todos los ejemplos anteriores están en tTAV). LA3014 contiene una fusión de ubiquitin-reaperKR corriente abajo de un intrón de Cetra. Los datos fenotípicos (figura 35) demuestran que la mosca del mediterráneo transgénica LA3014 produjo la letalidad específica a las hembras reprimible. El análisis de RT-PCR en el ARN extraído de machos y de hembras adultos criados sin tetraciclina, usando los cebadores (HSP, SEQ ID NO 74) y ReaperKR (SEQ ID No. 75), demuestra que el empalme correcto ocurría en las hembras (banda 508bp) y no se encontrado ninguna banda de ese tipo en los machos (figura 37). LA3166 es otra construcción con el intrón Cetra colocado dentro de la región de codificación de ubiquitina fusionada a reaperKR, pero puesta en una diversa posición en la ubiquitina. LA3166 también produce un efecto letal específico a las hembras reprimible dominante en la mosca del mediterráneo (figura 35). También recientemente, hemos producido y obtenido transgénicos con construcciones de 'solo intrones' a base de Cetra con el intrón en un diferente gen (todos los ejemplos antes mencionados están en el tTAV o una de sus variantes, es decir tTAV2 o tTAV3). Estas construcciones funcionan según lo antes dicho. Esto es un resultado importante, demostrando así que no hay secuencias exónicas esenciales en Cetra que simplemente hayamos duplicado por casualidad (en la función, si no necesariamente en secuencia), en tTAV.. También tenemos construcciones del ubi- rpr01 de este tipo (LA3014 y LA3166), que también validan el método de fusión del ubiquitina antes descrito.

Para demostrar el gama filogenética del intrón de Cetra generamos LA3097 transgénicos de y LA3233 de Anastrepha ludens. LA3097 y LA3233 fueron seleccionados para la inyección en los Anastrepha ludens ya que demostraron la mejor letalidad específica femenina del Ceratitis capitata (véase el ejemplo 13). Los datos fenotípicos fueron generados para 4 líneas independientes de LA3097 y 1 línea de LA3233 (véase la figura 38). La letalidad específica femenina era generalmente algo más baja en Anastrepha ludens al ser comparo con C. capitata pero alcanzó el 100% en una línea. Los Anastrepha ludens transformados con LA3097 y criados con la tetraciclina hasta el eclosión fueron aislados y se mantuvieron bajo tetraciclina durante 7 días. El ARN entonces fue extraído y el análisis de RT-PCR fue realizado usando los cebadores HSP (SEQ ID No. 76) y TETRRI (SEQ ID No. 77). El patrón correcto del empalme específico a las hembras (tipo F1) fue observado en aislados de ARN de hembras (348bp) pero no de los machos lo que demuestra la función del intrón Cetra en una especie diferente (figura 39). La banda masculina más brillante y la banda específica femenina fueron purificadas y precipitadas para ser secuenciada. Se encontrado que la transcripción específica femenina estaba empalmada correctamente en las hembras de mosca Mex según lo esperado para LA3097: LA3097. AGCCACCATG | GT ...AG del intrón ...| GTCAGCCGCC. Las dos secuencias de flanqueado antes indicadas son la SEQ ID No. 2 y 3, respectivamente. Ejamplo 2: intron tra de Bactocera zonata Aislamos el intron tra de Bactocera zonata (B. zonata) (SEQ ID NO. 58) usando cebadores ROSA1 (SEQ ID NO. 78), ROSA2 (SEQ ID NO. 79), y ROSA3 (SEQ ID NO. 80). Estas secuencias de los cebadores fueron diseñadas basardose en la secuencia de codificación conservada de homólogos tra de Ceratitis capitata y de Bactrocera oleae. Usando ROSA2 y ROSA3 o ROSAI y ROSA3 como cebadores, el intrón tra y su región de codificación flanquente fueron amplificados de ADN genómico de Bactrocera zonata. Después utilizamos estos productos PCR como plantilla y amplificamos el fragmento del intrón tra para hacer la construcción -LA3376 (figura 31 y la SEQ ID No. 55). Los cebadores (BZNHE SEQ ID No. 81 y BZR-SEQ ID No. 82 de) fueron utilizados para hacer las construcciones; estos cebadores contienen las secuencias adicionales para los propósitos de reproducción. El intrón de Bztra en LA3376 se reproduce en ORF de tTAV3 y también de reaperKR. Se generaron os transformantes de la mosca del mediterráneo y se extrajo el ARN de moscas macho y hembra. Entonces se realizo RT-PCR en el reaperKR (SEQ ID No. 83 de HB y la SEQ No. 84 de reaperKR) y empalme tTAV3 (SEQ ID No. 85) y SRY SEQ ID No. 85 y AV3F SEQ ID No. 86). Los fragmentos esperados de 200bp para reaperKR y de 670bp para tTAV3, que corresponde al empalme en un patrón equivalente a la transcripción F1 de Cetra (Pane y otros, 2002), fueron generados en las hembras (figura 40). Ejemplo 3: Aislamiento y empalme del intrón tra de Ceratitis rosa (C. rosa, mosca de la fruta de Natal) Los cebadores ROSA2 (SEQ ID NO. 87) y ROSA3 (SEQ ID NO. 88) se diseñaron en base a la secuencia de codificación conservada de Ceratitis capitata y Bactrocera oleae. Usando ROSA2 y ROSA3 como cebadores, el intron tra y su región codificadora flanqueante se amplificaron a partir de ADN genómico de Ceratitis rosa (SEQ ID NO. 59). Entonce usamos los productos de PCR como plantilla y amplificó el fragmento del intron tra para producir construcciones. Los cebadores (CRNHE- SEQ ID NO 89 and CRR SEQ ID NO 90) se usaron durante la construcción de LA3242 (SEQ ID NO. 56 y Figura 32. LA3242 contiene el intrón C. rosa en el extremo 5' del ORF de reaperKR. Embriones de Ceratitis capitata se inyectaron con ADN de LA3242, los embriones inyectados fueron criados hasta la edad adulta con una dieta substancialmente libre de tetraciclina. El ARN fue extraído de machos y hembras adultos; esto se utilizó como plantilla para la RT PCR usando los cebadores HB (SEQ ID No. 91) y ReaperKR (SEQ ID No. 92). La banda específica de la hembra del empalme (200bp) esperada, que corresponde al empalme en el patrón equivalente a el de la transcripción F1 de Cetra, fue observada en las hembras y no en los machos (figura 41). Doublesex (Doble sexo) Ejemplo 4: Bombyx morí dsx en PBW La secuencia de un homólogo del Bombyx morí (polilla de seda) de Drosophila Dsx (Bmdsx) se ha descrito previamente y se ha identificado un producto de empalme específico a hembras y macho (Suzuki y otros, 2001). Los machos y las hembras utilizan el mismo 3' polyA, y allí hay dos exones específicos femeninos. Un documento ha sugerido que el empalme específico al sexo no es dependiente de tra/tra2, es decir aunque el patrón parece igual, el mecanismo subyacente puede ser diferente (Suzuki y otros, 2001), aunque sus datos, principalmente la carencia de puntos de enlace reconocibles tra-tra2, sin embargo, no son obligatorios. Además, una construcción del mini-gen dsx de B mori. (que contiene secuencia exonica y secuencia intronica truncada) ha sido transformado en B. mori y los transformantes de la línea germinal muestra el empalme específico al sexo (Funaguma y otros, 2005). Hemos generado un minigen de Bmdsx basado en la secuencia usada en el escrito de Funaguma y otros, con algunos cambios significativos, y se ha inyectado en el gusano rosado de la polilla para comprobar si uno puede obtener empalmes específicos al sexo en una especie divergente. La construcción del mini-gen que generamos no incluye el exón 1, que está presente en machos y hembras. Además, retiramos el intrón entre el exón 3 y 4 (los dos exones específicos femeninos), incluyendo una secuencia heteróloga (que contiene los sitios múltiples de la reproducción, MCS), utilizamos la secuencia de refuerzo/promotor Hr5-IE1 del baculovirus AcNPV y utilizamos una secuencia de transcripción de la terminación de 3' derivada de SV40 (ver figura 42 para un diagrama esquemático). El exón individual/los fragmentos del intrón flanqueante usados fueron amplificados y recombinados juntos por medio de PCR y ligados en una construcción que portaba un fragmento promotor de refuerzo Hr5/IE1 y SV40 3' UTR (figura 22 y SEQ ID No. 22). LA3435 fue inyectado en embriones del gusano rosado (Pectinophora gossypiella). Las primeras larvas instar fueron recogidas después de 5-7 días y analizadas individualmente por medio de RT-PCR (usando los cebadores transcr- SEQ ID No. 93 y SV40-RT-P2 SEQ ID No. 94) para determinar si BMdsx puede someterse al empalme específico a machos y hembras (figura 43). Nuestro análisis detectó la banda específica masculina (que se previo era 442bp) en 4 muestras (carriles 1, 2, 3 y 4) y la banda específica femenina (prevista para ser 612bp) en 1 muestra (carril 5). El empalme correcto del dsx de B. mori en PBW demuestra que podemos alcanzar (hemos alcanzado) la expresión especifica al sexo de una secuencia heteróloga (aquí, el MCS) en un lepidóptero utilizando un sistema de empalme alternativo. Además, puesto que este sistema de empalme fue derivado de una especie heteróloga, esto sugiere que tales construcciones pudieran trabajar sobre una gama filogenética amplia. Sin embargo, también se prevé la identificación de los sistemas de empalme alternativos en la especie de interés, y los métodos para identificar tales sistemas de empalme alternativos se proveen aquí o son conocidos por los expertos en la técnica. Al proporcionar un MCS en nuestro ejemplo (véase figura 42), la expresión de una secuencia de interés, por ejemplo una región de la codificación para una proteína de interés podría ser obtenida fácilmente insertando la secuencia. Si la secuencia codifica una proteína adecuada, un fenotipo especifico al sexo, por ejemplo letalidad condicional especifica al sexo, de tal modo se podría introducir, por ejemplo en un gusano rosado. Ejemplo 5: Aislamiento del dsx de la polilla de manzanas El gen dsx de la polilla de manzana (pomonella de Cydia) fue aislado al realizar 3' RACE usando los cebadores que fueron basados en alineaciones de la secuencia de B. oleae, B. tyroni, C. capitata, D. melanogaster, B. mori, y A. gambiae. El ARN fue aislado de una polilla de manzana macho y hembra y se realizó un 3'RACE, para generar el cADN, usando el cebador TT7T25 (SEQ ID No. 95). La PCR fue realizada usando los cebadores dslc (SEQ ID No. 96) y TT7 (SEQ ID No. 97). Se realizaron dos rondas de PCR subsecuentes en el producto de la primera PCR usando los cebadores codling2a (SEQ ID No. 98) y TT7 (SEQ ID No. 99) y el producto de la segunda ronda de PCR usando Codling2b (SEQ ID No. 100) y TT7. Las secuencias aisladas específicas para machos y hembras comparten similitud de secuencias con los homólogos previamente aislados de dsx (SEQ ID No. 43 para el macho y SEQ ID No.42 para la hembra). Ejemplo 6: Aislamiento de dsx de PBW El gen dsx de gusano rosado fue aislado al realziar 3'RACE usando cebadores que se basaron en alineaciones de la secuencia de B. oleae, B. tyroni, C. capitata, D. melanogaster, B. mori, y A. gambiae. El ARN fue aislado de polillas de manzana machos y hembra y se realizo un 3'RACE, para generar el cADN, usando TT7T25 (secuencia definida aquí). La PCR se realizó usando los cebadores Pbwdsx2 (SEQ ID No. 101) y TT7 (SEQ ID No. 102). La PCR jerarquizada se realizó entonces en el producto de la PCR usando los cebadores Pbwdsx3 (SEQ ID No. 103) y TT7. Tres secuencias específicas femeninas fueron aisladas: PBWdsx-FI (SEQ ID NO. 40), PBWdsx-F2 (Figura 10), y PBWdsx-F3 (SEQ ID NO. 71) y una secuencia específica a los machos (SEQ ID NO. 42). Las secuencias aisladas específicas para machos y hembras comparten semejanza de la secuencia con los homólogos previamente aislados del dsx. Ejemplo 7: dsx en Anopheles gambiae La secuencia del gen dsx de Anopheles gambiae se ha descrito previamente (Scali y otros 2005). Sin embargo, cuando hemos intentado repetir el trabajo descrito en el documento encontramos que hay algunas diferencias en el empalme. Cuando intentamos repetir la amplificación de la transcripción específica a las hembras usando cebadores diseñados de la secuencia mARN (acceso; AY903308 para la secuencia de codificación femenina y AY903307 para la secuencia de codificación masculina), la amplificación falló. Sin embargo, cuando Scali y sus colegas demostraron que había un exón compartido, que no había sido descrito previamente, diseñamos los cebadores para amplificar la transcripción y el gen dsx completos. Usando estos cebadores y los cebadores diseñados a partir de la secuencia genómica de ADN (acceso: Gl 19611767) encontramos que el empalme de la transcripción femenina es diferente del descrito por Scali y otros 2005 (figura 44). La transcripción mostró que el exón femenino estaba en una posición diferente. Hay varias explicaciones para estas diferencias, pero la más probable es una cierto tipo de diferencia de la cepa los anofeles de los cuales conseguíamos los datos, o que la secuencia publicada no es de Anopheles gambiae, o hay más de una isoforma femenina como se muestra para Stegomyia aegypti en el ejemplo 20." También hemos utilizado con éxito los cebadores, diseñados alrededor de nuestra versión del empalme de dsx de Anopheles gambiae, que pueden distinguir entre los machos y las hembras de Anopheles gambiae (figura 45). Esto proporciona buena evidencíade que el sistema servirá como un mecanismo de empalme especifico al sexo cuando está fundido a una proteína de interés, tal como tTAV o un asesino. El gen dsx de Anopheles gambiae que hemos aislado del ADN genómico, que tiene varios cambios en la secuencia de nucleótidos en comparación con la secuencia genómica descrita, fue reproducido en LA3359 (SEQ ID No. 47) y LA3433 (SEQ ID No. 48), diagramas esquemáticos se puede encontrar en las figuras 23 y 24, respectivamente. Ejamplo 8: dsx en Stegomyia aegypti El empalme del gen parece ser similar al dsx de Anopheles gambiae (Scali y otros 2005). El gen dsx de Stegomyia aegypti se ilustra esquemáticamente en las figuras 47 o 48. Se produce una transcripción específica al macho (M1) que no incluye los exones 5a o 5b. Dos variantes específicas femeninas del empalme (la F1 y F2) tienen la estructura siguiente; la F1 abarca los exones 1-4, 5a, 6 y 7 pero no 5b, F2 abarca exones 1-4 y 5b (figura 46). Además, otra transcripción (C1) está presente en machos y hembras; esta abarca los exones 1-4 y 7, pero no los exones 5a, 5b o 6. El empalme del gen parece ser similar al dsx de Anopheles gambiae (Scali y otros 2005). El gen dsx de Stegomyia aegypti se ilustra esquemáticamente en la figura 47 o 48. Actin 4 Ejemplo 9: gen Actin-4 de Stegomyia aegypti Una forma para conseguir la expresión específica al sexo, al tejido y a la etapa de un gen de interés es ligarlo al gen Actin-4 de Stegomyia aegypti(AeAct-4). Este gen se expresa solamente en los músculos de vuelo en desarrollo de la hembra de Stegomyia aegypti (Muñoz y otros 2004). Utilizaron la hibridación in-situ a un ARN para detectar el perfil de la expresión de AeAct-4. Hemos tomado un fragmento del gen Actin-4 de Stegomyia aegypti, abarcando una región del promotor asignada, un intrón alternativamente empalmado, y una sección de la región 5' sin trasladar (UTR) y colocado delante de la codificación de secuencia para el tTAV (figura 49) para probar la función del empalme específico al sexo cuando está fusionado al tTAV. Integramos LA 72 en el genoma de Stegomyia aegypti usando piggyBac. Dos líneas independientes fueron generadas (las líneas 2 y 8). Ambas líneas muestran el empalme correcto del gen Actin-4 de tTAV de (figuras 50 y 51). El promotor Actin-4 y el intrón alternativamente empalmado pueden por lo tanto ser utilizados con éxito para proporcionar empalmes específico al sexo, al tejido y a la etapa de un gen de interés en Stegomyia aegypti. Descripción de las figuras y de los listados de la secuencia de los ejemplos 1-9 Figura 19: Un uso del elemento de P en la generación de la expresión de la expresión específica a la línea germinal de un gen de interés (gen E). La inserción del elemento P IVS3 y las secuencias exónicas flanqueantes corriente arriba desde una fusión ubiquitina-gen E permiten la expresión específica a la línea germinal del gen E debajo de un promotor del activo de la línea germinal A - Promotor activo de la línea germinal; B - marco de lectura abierto del elemento P; C - Intrón P TVS3'; D - Ubiquitina; E - Región de codificación para la proteína de interés por ejemplo tTAV. Figura 20: Expresión específica al sexo usando dsx. A: Intrón usado como intrón Cetra arriba, pero dando la expresión específica al macho. Un fragmento de dsx (aquí la versión del anófeles) se inserta en una región heteróloga de la codificación (cajas sombreadas). El intrón se retira totalmente en los machos, pero en las hembras la región de la codificación se termina prematuramente. B: Un intento alternativo a la expresión específica al macho, en la cual una región heteróloga de la codificación está fusionada a un fragmento del dsx.

C: expresión específica a la hembra: la región heteróloga de la codificación se inserta en el exón específico femenino, como fusión en-marco a un fragmento de Dsx, o con sus propios codones del inicio y paro. D: Expresión diferenciada: los diseños B y C se pueden combinar para dar la expresión del gen a en hembras y b en machos. Figura 21: Empalme alternativo específico al sexo de Cetra A: Cetra se empalma en hembras para producir tres transcripciones: F1, que codifica la proteína funcional de Tra, y M1 y M2, que no lo hacen, porque incluyen exones adicionales con los codones de paro (recopilados por Pane y otros 2002). Los machos producen solamente las transcripciones M1 y los M2 y por lo tanto no producen la proteína funcional de Tra en absoluto. B si este intrón fuera a funcionar semejantemente en una región heteróloga de la codificación, esto permitiría similarmente que las hembras, pero no los machos, produjeran la proteína funcional X. Figura 22: Representación diagramática de la construcción/ plásmido pLA3435 (SEQ ID NO.46). Figura 23: Mapa del plásmido del gen dsx de Anopheles gambiae pLA3359 colocado bajo el control de un promotor Hr5-IE1 para determinar el empalme vía la expresión transitoria. Figura 24: Gen dsx pLA3433 de Anopheles gambiae colocado bajo control de un promotor Hr5-IE1, con la adición del exón 2, para determinar el empalme vía la expresión transitoria. Figura 25: Representación esquemática de la construcción pLA1188. Figura 26: Diagrama esquemático de la construcción pLA3077 Figura 27: Diagrama esquemático de la construcción pLA3097 Figura 28: Diagrama esquemático de la construcción pLA3233 Figura 29: Diagrama esquemático de la construcción PLA3014 Figura 30: Diagrama esquemático de la construcción pLA3166 Figura 31: Diagrama esquemático de la construcción pLA3376 Figura 32: Diagrama esquemático de la construcción pLA3242 Figura 33: Secuencia flanqueante de Cetra Empalme del intrón Cetra en LA3077 y LA3097 es exactamente como se vería en el intrón nativo de Cetra. El empalme en LA1188 da lugar al retiro de 4 nucleótidos adicionales. En todos los casos los intrones son flanqueados por 5' TG y 3' GT exónicos. Figura 34: Gel que muestra el empalme específico al sexo correcto de los intrones derivados de CcTra (banda 776bp en hembras) en Ceratitis capitata transformado con LA3077. Carril 1: Marcador (SmartLadder™ de Eurogentec, se indican bandas de aproximadamente 0.8, de 1.0 y de 1.5kb); Carriles 2 y 3: Machos del Ceratitis capitata LA3077/+; Carriles 4 y 5: Hembras de Ceratitis capitata LA3077/+. Figura 35: Datos fenotípicos para las construcciones espe'cificas para hembras transformadas en Ceratitis capitata. Columna 1: La designación de construcción LA#, por ejemplo LA3077, LA3097, LA3233, etc, es indicada por un número, con las líneas independientes de la inserción referidas con letras; Columnas 2 y 3: resultados sin tetraciclina (NT) para cada línea transformada dada en machos totales (2) y hembras totales (3). Columnas 4 y 5: Resultado de tetraciclina (TET) para cada línea transformada dada en machos totales (4) y hembras totales (5). Figura 36: Transcripción de las construcciones de intron Cetra en Drosophila y Ceratitis capitata. La línea superior representa el ADN de la construcción que contiene Al intrón tra flanqueado por el gen deseado (la caja abierta). La caja roja representa los exones específicos masculinos. Los intrones son representados por las líneas llenas. La flecha sobre la primera línea representa las posiciones de los oligonucleótidos usados en los experimentos de RT-PCR. La barra indica la escala de la figura. Figura 37: Gel que muestra el empalme específico a las hembras correcto de la secuencia derivada de CcTRA (banda 508bp) en Ceratitis capitata hembra transformado con LA3014. Carril 1: Marcador (SmartLadder™ de Eurogentec, se indican las bandas de aproximadamente 0.4 y 1.0kb); Ceratitis capitata macho LA3014/+ del carril 2; Carril 4: Hembra de Ceratitis capitata LA3014/+; Carriles 3 y 5: ningún control negativo de transcriptasa inversa (las bandas del fondo, probablemente del ADN genómico, se pueden ver en los carriles 2 y 4). Figura 38: Datos fenotípicos para los transgénicos de Anastrepha ludens transformados con LA3097 o LA3233. Columna 1: La construcción LA# (LA3097 o LA3233) indicada, las líneas independientes de la inserción se indican con letras; Columnas 2 y 3: Resultados sin tetraciclina (NT) para cada línea transformada dada en machos totales (2) y hembras totales (3). Columnas 4 y 5: Resultados con tetraciclina (TET) para cada línea transformada dada en machos totales (4) y hembras totales (5). Figura 39: Gel que muestra el empalme específico al sexo correcto de empalme CcTRA (la banda 348bp en hembras) en de Anastrepha ludens transformados con LA3097. Carril 1: Marcador (SmartLadder™ de Eurogentec, se indican las bandas de aproximadamente 0.4 y 1.0kb); Carriles 2, 3 y 4: Machos de A. ludens LA3097/+; Carriles 5, 6 y 7: Hembras de A. ludens LA3097/+. Figura 40: Gel que muestra el empalme específico al sexo correcto de BzTRA en el reaperKR (banda 200bp en hembras) y tTAV3 (banda 670bp en hembras) las regiones de LA3376, en el Ceratitis capitata transformado con LA3376. Carril 1 : Marcador (SmartLadder™ de Eurogentec, se indican bandas de aproximadamente 0.2, de 0.6 y de 1.0kb)¡ Carriles 2 y 3: Machos de C capitata LA3376/+. probados para el empalme en reaperKR; Carriles 4 y 5: Hembras del C. capitata LA3376/+ probadas para el empalme en reaperKR; Carril 6: SmartLadder™; Carriles 7 y 8: Machos del C, capitata LA3376/+. probados para el empalme en tTAV; Carriles 9 y 10: Hembras de C. capitata LA3376/+ probada en el empalme en tTAV; Carril 11: SmartLadder™.

Figura 41: Gel que muestra el empalme específico al sexo correcto en CrTRA-reaperKR (banda 200bp en hembras) en el Ceratitis capitata inyectado con LA3242. Carril 1: Marcador (SmartLadder™ de Eurogentec, se indican bandas de aproximadamente 0.2, de 0.6 y de 1.0kb)¡ Carriles 2-7: machos tipo nativo Ceratitis capitata inyectados con LA3242; Carril 8: SmartLadder™; Carriles 9-14: hembras tipo nativo de Ceratitis capitata, inyectadas con LA3242; Carril 15: SmartLadder™. Figura 42: Representación esquemática de las construcciones del minigen de Bmdsx. Dos construcciones de minigen derivadas del gen dsx de Bombyx mori se ilustran esquemáticamente, junto con el empalme alternativo previsto de estas construcciones (patrón femenino mostrado por encima de la construcción, patrón masculino por debajo). (A) es la construcción del mini-gen de dsx de Bombyx mori usada por Funaguma y otros, 2005) (B) es pLA3435. A y B se diferencian entre si de varias maneras: (i) El exón 1 se excluye de pLA3435s (ii) el intrón entre los exones específicos a hembra 3 y 4 se ha eliminado y una secuencia heterloga corta se ha insertado en pLA3435 (iii) Funaguma y otros, utilizan al promotor del promotor iel del baculovirus BmNPV y BmA3 3' UTR en comparación con pLA3435 que utiliza el refuerzo/ promotor de hr5-IEI del baculovirus AcNPV y un 3" SV40 3' UTR. (iv) pLA3435 usa secuencias levemente más largas del intrón en comparación con (A) (véase la figura 15 para la secuencia). Dos construcciones de minigen derivadas del gen de dsx de Bombyx mori se ilustran esquemáticamente, junto con el empalme alternativo previsto de estas construcciones (patrón femenino es mostrado por encima de la construcción, patrón masculino es mostrado por debajo). Figura 43: Empalme específico al sexo de la construcción del mini-gen de BMdsx en PBW. Análisis de la expresión transitoria de pLA3435 usando RT-PCR muestra la presencia de un fragmento 442bp (carriles 1.2.3 y 4) en machos y un fragmento 612bp en las hembras (carril 5), demostrando que el mini-gen de BMdsx con un fragmento heterólogo insertado entre el exón 3 y 4 puede empalme correctamente en la polilla divergente, PBW. Los marcadores son SmartLadder™ de Eurogentec; se indican las bandas de aproximadamente 0.2, 0.4 y 0.6 kb. Figura 44: Empalme específico al sexo de dsx de Anopheles gambiae . Los anofeles (A) muestran el empalme que fue descrito por Scali y otros 2005. Sin embargo, fue realizada la RT-PCR usando nuestros cebadores (spl-agdsx-e3 (SEQ ID No. 60) y SPL-agdsx-m (SEQ ID No. 61)) fue revelado un diverso patrón empalmado para hembras, representado por Anopheles (B). Figura 45: Identificación de los Anopheles gambiae machos y hembra usando los cebadores dsx. El ARN fue extraído de Anopheles gambiae machos y hembras y las transcripciones de dsx fueron amplificados por RT- PCR usando los cebadores spl-agdsx-e3 (SEQ ID No. 62) y el SPL-agdsx-m (SEQ ID No. 63); el patrón de bandas resultante se muestra en el gel DE arriba. Las bandas previstas para las transcripciones masculinas y femeninas, son indicadas por las flechas blancas, se han reproducido y se han ordenado las bandas y son idénticas a la secuencia prevista de nuestra versión de la transcripción de dsx (véase la SEQ ID No. 47 (LA3359) y la SEQ ID No. 48 (LA3433)). Los marcadores del peso molecular se muestran en el kb (SmartLadder™ de Eurogentec; los tamaños son aproximados). Figura 46; Identificación de Stegomyia aegypti masculino y femenino usando los cebadores dsx. Los cebadores para la RT-PCR de Stegomyia aegypti para A y B fueron el aedesxFI (SEQ ID No. 64) y aedesxR5 (SEQ ID No. 65) fueron probados inicialmente en las crisálidas, una etapa de la vida del Stegomyia aegypti cuyo seco que puede ser determinado convenientemente y exactamente; la amplificación resultante de RT-PCR se muestra en la imagen de gel (A). Las crisálidas macho y hembra una banda distintiva específica al sexo. Entonces los cebadores fueron probados en extracciones del ARN de las larvas, que no pueden ser fácilmente diferenciadas sexulmente por su morfología y la amplificación resultante de RT-PCR mostrada en la imagen del gel (B). Las larvas muestran un patrón de bandas claro en el cual se distinguen a machos de hembras de forma inequívoca. La imagen del gel (C) muestra una banda aproximadamente 600bp de RT-PCR usando el aedessxFI y el aedesxR2 (SEQ ID No. 66) de los cebadores de crisálidas masculinas y femeninas individuales. La secuencia de esta banda mostró una variante específica femenina del empalme la cuál no parece poseer el exón compartido masculino al cual se predice que aedesxR5 se unirá (el exón 7, véase el figura 56). Los marcadores del peso molecular se demuestran en el kb (SmartLadder™ de Eurogentec; los tamaños son aproximados). Figura 47: Representación diagramática del gen del dsx de Stegomyia aegypti (no escalar). Un fragmento del gen dsx de Stegomyia aegypti se representa arriba. Los exones 5a y 5b son específicos femeninos y el exón 6 es un exón específico masculino. Se han encontrado dos variantes del empalme específicas a las hembras (F1 y F2) que abarcan los exones 1-4, 5b, 6 y 7 (F1) o I-4, 5a (F2); las transcripciones en los machos (M1) abarcan los exones 1-4, 6 y 7 pero no el exón 5a o 5b y una transcripción (C1) de 1-4 y de 7 pero no de los exones 5a, 5b o 6 se muestran en machos y hembras. Los números para cada uno de los exones después de # se refiere al contig 1.370 (http://www.broad.mit.edu/annotation/disease vector/aedes aeqypti/), que se lee en la orientación opuesta, y después de * se refiere a la secuencia de nucleótido mostrada en SEQ ID No. 43. Figura 48: Representación diagramática del gen dsx de Stegomyia aegypti.

El gen entero dsx de Stegomyia aegypti que se representa sobre el exón 5 es el exón específico femenino y el exón 6 es un exón específico masculino asignado. El principio, las transcripciones en hembras abarca los exones 1.2.3.4.5 y 7, y los en machos abarcan los exones 1.2.3.4.6 y 7. Los números para cada uno de los exones después de # se refiere al contig 1.370 (http://www.broad.mit.edu/annotation/disease/lectura vector/ aedes aeqypti/) que se lee en la orientación opuesta, y después de * se refiere a la figura 12. Figura 49: Mapa del plásmido de pLA 1172. Una región de la codificación de tTAV se ha puesto bajo control de un fragmento del gen actin-4 de Stegomyia aegypti (Muñoz y otros 2005) que incluye el 5' UTR, primer intrón, y secuencias corrientearriba (promotor asignado). La construcción también contiene una secuencia Insecto tet07. La construcción tiene extremos piggyBac y un marcador DsRed2 para la integración estable en un genoma. Figura 50: Empalme específico al sexo de tTAV en los transformantes LA1172. La imagen del gel de RT-PCR del ARN extraído de la línea 2 de crisálidas machos y hembras de LA 1172. Los cebadores usados fueron Agexonl (SEQ ID No. 67) y Tra (tTAV) seq+ (SEQ ID No. 68). La secuencia de las bandas de RT-PCR mostró la el empalme esperado ocurrido en machos y hembras. Los datos mostrados en el diagrama anterior son para la línea 2, la línea 8 de LAI 172 mostraron exactamente los mismos resultados (datos no mostrados). Los marcadores son SmartLadder™ de Eurogentec; los tamaños aproximados se indican, en kb). Figura 51: RT-PCR de muestras tipo nativo, mostrando las variantes específicas al sexo del empalme de gen Actin-4 de Stegomyia aegypti. Imagen del gel de RT-PCR del ARN extraído de diversas etapas de desarrollo, y disecciones de adultos, de la línea 8 de LAI 172. Los cebadores usados fueron Agexonl (SEQ ID No. 69) y el exón 3 (SEQ ID No. 70). La imagen del gel muestra que la expresión fuerte del gen Actin-4 ocurre solamente en la etapa de crisálida, y que la expresión adulta está limitada generalmente al tórax femenino donde se encuentran los músculos del vuelo. La tabla 17, de adelante muestra el contenido de cada carril.

E = acumulación de ~ 100 embriones MH = cabeza del adulto macho L4 = 4a larva instar MT = thorax del macho adulto ME = crisálida macho joven (<4 horas de edad) MA = abdomen del adulto macho FE = crisálida hembra joven (<4 horas de edad) FH = cabeza del hembra adulto MP = crisálida macho FT = tórax de hembra adulta FP = crisálidas hembras FA = abdomen de hembra adulta -ve = control del ag ua Tabla 1 . Otros ejemplos Ejemplo 1 0 : polillas Hemos realizado nuevamente las construcciones basadas en nuestros datos de la expresión transitoria usando una construcción recombinante del m inigen derivada de Bom byx morí . Esto se describe más detalladamente abajo en la sección titulada "Alineación de la secuencia dsx de la pol il la y los motivos conservados" Ejemplo 1 1 : Uso de Bztra Hemos hecho nuevamente dos construcciones a base de Bztra , expresadas en mosca Mex (LA3376) . LA3376 produce a letalidad reprimible específica a las hembras. LA3376 que hemos mostrado previa mente para funcionar y empálmese correctamente en la mosca del mediterráneo. Transformantes en la mosca Mex { Anastrepha ludens) también fueron generadas con LA3376. Éstos fueron analizados en cuanto al empalme correcto del intrón de Bztra para demostra r la gama filogenética del intrón de Bztra por RT-PCR usando los cebadores SRY y AV3F (fig ura 1 5 y "Geles pa ra RT-PCR pa ra la mosca de mediterráneo" ; sección anterior) . Esto muestra el em palme correcto del i ntrón de Bztra en la mosca Mex.

Ejemplo 12: Dmdsx en la mosca del mediterráneo (DmDsx en el ejemplo de mosca del mediteraneo transgénica: fusión insecto en #797) También hemos nuevamente recolectado datos en una construcción de Dmdsx en mosca del mediterráneo. La construcción utilizó un fragmento del gen doublesex de Drosophila melanogaster para dar la expresión específica al sexo de un fragmento del gen NippIDm de Drosophila melanogaster (llamamos este fragmento; "insecto "). Nosotros no vimos un empalme claro específico al sexo. Sin embargo, los datos fenotípicos demuestran una cierta especificidad al sexo; vimos la letalidad creciente de hembras, penetración de aproximadamente 75%. Por supuesto esta penetración incompleta podría deberse al nivel de la expresión, a la carencia de la toxicidad de insecto en la mosca del mediterráneo, etc. También tuvimos una reducción significativa en el número de machos, pero la fuente del tTA, LA670, usada en este experimento podría por sí misma matar a algunos de los machos. Hemos probado tres líneas transgénicas independientes de la mosca del meditarraneo que llevan una fusión del insecto a la secuencia de DmDsx que fue pensada para ser expresada específicamente en hembras. Esta construcción pudo no haber trabajado perfectamente, posiblemente debido a la secuencia esencial para el empalme correcto alternativo y/o los puntos de enlace de Sxl requeridos por DmDsx, y puesto que la mosca del mediterráneo no utiliza Sxl en la forma determinante del sexo, DmDsx puede no poder empalme totalmente esta fusión de la manera correcta en la mosca del mediterráneo. Sin embargo, tuvimos éxito en causar de forma reproducible una letalidad creciente en las hembras en comparación con los varones a través de las tres líneas con una eficacia muy similar (aproximadamente 75% de mayor letalidad observada en hembras que en varones). Esto demuestra el sistema dsx puede trabajar a través de especies distantemente relacionadas (separación evolutiva es alrededor 120-150 millones de años), y si la secuencia de Ccdsx fue utilizada puede haber trabajado bien debido al requisito de Sxl de Dmdsx. Los 797 resultados se muestran adelante, usando un sistema de insecto de empalme dsx Tet014 (Pub EGFP). Demuestran que este sistema es letal en la etapa larval (- el 50%), y es probable que se tenga éxito en hembras (- el 75%). 797 se marca con verde(G), 670 con rojo (R).670 es una fuente de tTAV, así que uno espera ver que un fenotipo en las moscas R+G; G (y R) solamente son controles. NF - no fluorescente (es decir tipo nativo) también es un control en donde es incluido. Toda la progenie se crió en medios libres de tet. Las tres lineas indepenientes parecen actuar de manera similar. 797A797A M2 x 670A/+: Crisálidas Adultos Ma cho s : Hembr a s G 184 176 85: 91 R+G 74 57 44 13 77C/797C MI x 670A/+: Crisálidas Adultos Ma cho s : Hembr a s G 169 157 89: 68 R+G 94 67 54: 13 797G797C M2 x 670A/+; Cris alida s Adulto s Ma cho : Hembr a s O 406 377 179: 1 8 R+G 171 147 121: 26 670A/+ 797C/+M2: Crisálidas Adultos Ma cho s : Hembras NF 198 192 92:100 G 162 147 67: 80 R 149 72 43:29 R+G 45 22 20: 2 Promedio de las 3 líneas: número de hembras de R+G el = 21% del número de varones de R + G, por lo tanto exceso de letalidad substancial en las hembras en relación con los varones de R+G. Este efecto no se observa en las hembras del control de R solamente o de G solamente, ni en el tipo nativo. Ejemplos 13-15: Hemos demostrado nuevamente: (5) el empalme específico al sexo en construcciones de minigen a base de Aadsx recombinante (6) fenotipo específico al sexo de una construcción basada en Cetra; y (7) el empalme específico al sexo en construcciones basadas en Actin4 de Aedes. Por lo menos alguno de cada uno de estos ejemplos no sólo muestra minigenes, sino que realmente muestra el empalme para generar tTAV/tTAV2 o ubi-tTAV2 Ejemplo 13: minigenes de Aedes doublesex (dsx) Ver también la sección titulada puntos de enlace a Tra2 de Aedes dsx. Hemos aisladoel gen dsx de Aedes aegypti (Aadsx) e identificado 6 transcripciones de esta región (figura 1): Éstas son: 2 transcripciones específicas al macho (mi y M2), 3 transcripciones específicas a las hembras (F1, F2 y F3) y una transcripción encontrada en varones y hembras (frecuencia intermedia). Hicimos dos construcciones del minigen. En estas construcciones, suprimió a la gran mayoría de las secuencias intronicas. Por ejemplo, el minigen 1 de DSX tiene aproximadamente 4.4kb de longitud, mientras que sus secuencias terminales son separos por aproximadamente 26kb en su contexto natural, es decir en el ADN genómico del Aedes aegypti. El empalme en el minigen2 de la figura 1 es ilustrativo pues el empalme ocurre en la forma "femenina" en varones y hembras. Esto puede significar que este sistema depende del uso alternativo del aceptador del empalme. En este modelo, hay competición entre los aceptadores alternativos del empalme, con un cierto factor específico al sexo predisponiendo esto, el factor específico al sexo probablemente es Tra. Pero suprimiendo los aceptores de empalme M1 y M23' forza el empalme en las formas de F, al elmiminar la alternativa. Por lo tanto, se prefiere que se provean uno o más aceptadores de enripíame 3' específicos a las hembras (F1 y/o F2) junto con un aceptador del empalme 3' adicional. Más preferiblemente, el aceptador adicional del empalme es el el aceptador de empalme 3' de la variante del empalme M1 o M2 (o ambas), aunque se considere que esto no es esencial ya que se sabe que otros aceptadores del empalme 3' conocidos; es probable que funcionen. La figura 1 ilustra las varias transcripciones producidas por el empalme alternativo del gen doublesex de Aedes aegypti (Aadsx). Se apreciará que Aedes aegypti también es conocido como Stegomyia aegypti. La figura muestra el gen Aadsx del cuarto exón, que no se empalma alternativamente, es decir está presente en todas las transcripciones discutidas aquí. La enumeración empieza desde el primer nucleótido del cuarto exón (acgacgaact... ). Observar que el diagrama no está a escala - los intrones son mucho más largos que los exones. La región alternativamente empalmada en total abarca más de 43kb. Este fragmento del minigen fue incluido en una construcción de expresión (LA3515). El Aedes aegypti transgénico fue generado por la recombinación específica al sitio en un sitio del attP, usando el método de Nimmo y otros (2006: Nimmo, D.D., Alphey, L.

Meredith, J.M. y Eggleston, P (2006). High efficiency site-specific gentic engineering of the mosquito genome. Insect Molecular Biology, 15: 129-136) Un segundo minigen más pequeño se construyo de manera semejante (minigen2 DSX) y una construcción de expresión para esto fue insertada en el mismo sitio atfP que el minigen 1 de DSX, para permitir la comparación directa (LA3534). El minigen 2 no mostró empalme específico al sexo. Esto indica que las secuencias presentes en el minigen 1 de DSX pero no en el minigen 2 de DSX (2029bp aproximados, ver figura 1 y la SEQ ID No. 150, donde los exones se encuentran en las posiciones 29-163 y 1535-2572) son esenciales para el empalme alternativo correcto, aunque el primer intrón empalmado alternativamente, y la secuencia exónica que lo flanqueaba inmediatamente, están presentes en ambas construcciones. Hemos producido dos líneas transgénicas (LA3491 y LA3534) usando construcciones del minigen del gen dsx de Aedes aegypti del. LA3491 es una fusión del exon4 compartido, los exones-específicos a las hembras del cartucho, y parte del primer exón 3' compartido; (exón 5 en la transcripción M1). Las transcripciones de la región del minigen LA3491 fueron analizadas por medio de PCR de transcriptasa inversa (RT-PCR) y formación de secuencia. Las transcripciones que correspondían al empalme alternativo en la forma F2 fueron encontradas en hembras pero no en varones (figuras 2 y 3) y en la forma F1 había una cierta expresión masculina pero muy baja (figura 4). Mientras que las transcripciones que correspondían a la forma M1 fueron detectadas en varones pero no en las hembras (figura 2). Puesto que el minigen no contuvo el aceptador de empalme 3' de la variante M2, esta transcripción no fue posible con esta construcción. Este minigen no contiene ninguna secuencia exógena, aunque demuestra claramente el empalme específico al sexo de un fragmento Aadsx, de hecho un fragmento de "minigen" altamente suprimido. Será evidente que ciertas secuencias son importantes para controlar el empalme y se deben por consiguiente conservar, según lo discutido en otra parte. Esto se puede establecer fácilmente por la deleción de ciertas porciones y de la prueba del empalme alternativo por RT-PCR por ejemplo. La figura 2 muestra RT-PCR de varones y hembras de la línea transgénica de aedes aegypti LA3491 usando los cebadores 688 - el iel-transcr (SEQ IDNo. 4) y 790 - Aedsx-m-r2 (SEQ IDNo. 5). Usando esos cebadores, el empalme en el patrón F2 daría una banda de aproximadamente 985bp mientras que el empalme en el patrón de M1 daría una banda de aproximadamente 516bp. Una banda de 985bp aproximadamente (F2) apareció solamente en carriles que representaban a las hembras y una banda de la transcripción específica masculina 1 aproximadamente de 516bp apareció solo en los machos. Estas bandas se han secuenciado y muestran que había ocurrido el empalme correcto, es decir el tipo F2 y el tipo M1 respectivamente. La ausencia de bandas en los controles sin RT (-RTCON) muestra que no había contaminación genómica del ADN en las muestras. Los carriles 1 y 11 son marcadores (SmartLadder™ de Eurogentec, se indican bandas de 1.5kb a 0.2kb). Los carriles 2 y 3 son controles negativos (sin transcriptasa inversa) y los carriles 2-9 representan las reacciones realizadas en los extractos de varones o de hembras según lo marcado. La figura 3 muestra RT-PCR de varones y de hembras de líneas transgénicas LA3491 de Aedes aegypti usando los cebadores 688 - iel-transcr (SEQ IDNo. 4) y 761 - el Aedsx-fem-r (SEQ IDNo. 6). Usando estos cebadores, el empalme en el patrón F2 daría una banda de aproximadamente 525bp. Una banda de 525bp estaba aproximadamente presente en reacciones en los extractos de hembras, pero no de reacciones correspondientes en los extractos de varones. La secuencia de esta banda de 525bp confirmó que era correcto, es decir que había ocurrido el empalme del tipo F2. Marcador (SmartLadder™ de Eurogentec, se indican bandas de 1.5kb a 0.2kb). La figura 4 muestra RT-PCR de varones y de hembras de líneas transgénicas LA3491de aedes aegypti usando los cebadores 688 - el iel-transcr (SEQ ID No. 4) y AedsxRI (SEQ ID No. 4). Usando estos cebadores el empalme en el patrón de F1 daría una banda de 283bp. Una banda de 283bp está presente predominantemente en hembras, aunque hay evidencia de una pequeña cantidad de empalme en varones. La secuencia confirmo que esta banda correspondió de hecho al empalme en el patrón F1. Marcador (SmartLadder™ de Eurogentec, se indican bandas de 1.5kb a 0.2kb). LA3534 es idéntico a LA3491 a excepción de una deleción 3' de 2kb aproximadamente. Esta construcción no mostró ningún empalmen diferencial entre el varones y las hembras (figura 1, minigen 2). Los geles de RT-PCR no se mostraron para este caso. De acuerdo con estos resultados varias construcciones se han diseñado para incorporar empalmes específicos al sexo de LA3491 (figura 1, minigen 1) en un sistema de retroalimentación positiva. LA3612 (figura 5), que incorpora una fusión de ubiquitina y tTAV2 en la región de la codificación dsx, se diseña para cuando se produce la transcripción femenina F2, la ubiquitina de rompe y el tTAV2 se libera para iniciar y para sostener el sistema de retroalimentación positiva. LA3619 (el figura 5) tiene tTAV2 sin ubiquitina y usa su propio codón de inicio de la traslación. LA3646 (figura 5) es idéntico a LA3619 excepto que los codones de inicio para el gen dsx han sido mutados; esto debe mejorar la cantidad de tTAV2 producido retirando la traslación no específica. La figura 5 es una representación diagramática de los plásmidos basados alrededor del empalme en el minigen dsx de Aedes aegypti. Para mayor claridad se entenderá que el primer intrón femenino representa cualquiera del empalme F1, F2 o F3, y el tTAV en el diagrama se refiere a tTAV2 (se apreciara que otras proteínas u otras versiones del tTA o del tTAV se podrían utilizar alternativamente). En cada uno de estos plásmidos, aparte de LA3491, la secuencia heteróloga se ha agregado al exón F2. "ATG asignado"; representa cualquier secuencia del trío de ATG en 5' localizado en la secuencia exonica concerniente al ADN heteróloga. En LA3646 estos codones de inicio asignados de la traslación (" ATG asignada") fueron retirados o modificados. En el caso de la construcción LA3612, la traslación de (5') ATG corriente arriba que está en marco con la región de la codificación del ubi-tTAV todavía producirá el tTAV funcional (asumiendo que ningún codón de paro interviene), después de la separación de las mitades del ubiquitina y del tTAV por la acción de la proteasa. Los varios cartuchos que empalman alternativos se ligan operativamente a un promotor conveniente, a un adaptador transcriptivo y a otras secuencias reguladoras. Este ejemplo demuestra el empalme específico al sexo de un fragmento altamente comprimido de un "minigen" en un contexto heterólogo (es decir un promotor heterólogo, 5' UTR y 3' UTR). Aunque no muestren la expresión diferenciada de una secuencia no-Aedes, pues los exones alternativamente empalmados se derivan del gen de Aadsx y no contienen material adicional, ilustra claramente la viabilidad de esta modalidad. En todo caso, el promotor 5' UTR y el 3' UTR son heterólogos. Tenemos construcciones adicionales que ilustran varios métodos diversos para obtener la expresión (específica al sexo) diferenciada de una proteína heteróloga por este dsx. Alineación de la secuencia de TRA Pane y otros (2002) sugirió que ciertas secuencias que se relacionan con los puntos de enlace conocidos del complejo Tra/Tra-2 en Drosophila pudieran ser importantes en la regulación del empalme de Cetra, y esto también se conoce para dsx de Drosophila y también se ha sugerido para el dsx de los Anopheles gambiae (Scali y otros 2005). La secuencia de consenso se describe variadamente como UC(U/A)(U/A)C(A/G)AUCAACA (Pane y otros), SEQ ID NO. 8, o UC(U/A)(U/A)CAAUCAACA (Scali y otros 2005), SEQ ID NO. 9. Es importante que estas definiciones son extremadamente similares. Pane y otros identifican 8 coincidencias parciales a este consenso en la secuencia de Cetra (7 o más nucleótidos que coicinden con la secuencia de consenso de 13 nucleótidos. Scali y otros identifican 6 coicindencias en Agdsx (9/13 o mejor). Tales secuencias también son conocidas por regular el empalme alternativo del gen fruitless (estéril) de Drosophila; Scali y otros revisan 3 coincidencias en esa secuencia (12/13 o mejor). El empalme correcto de dsx puede también requerir una región rica en purina, según lo discute Scali y otros. Como puede ser visto en la tabla 2 y la figura 7, hemos identificado cuáles son probablemente los agrpamientos significativos de puntos de enlace para Tra/Tra2 en el migen de dsx de Aedes aegypti.

Alineación de la secuencia dsx de polilla y motivos conservados La figura 6 muestra una alineación de los segundos exones -específicos a las hembras y de las secuencias flanqueantes de los genes dsx del grusano rosado (Pectinophora gossypiella, PBW-dsx, SEQ ID No. 146), del gusano de seda (Bombyx nori, bombyx-dsx, SEQ ID No. 147) y de la polilla de manzanas (Cydia pomonella, dsx de manzana, SEQ ID No. 148). El segundo exón específico a la muestra se en negrillas. Identificamos copias múltiples de una secuencia de nucleótido corta repetida, conservada en secuencia y de una localización aproximada entre estas polillas relacionadas de forma relativamente distante; éstos son localizados a 5' del exón específico femenino. Se subrayan las repeticiones conservadas AGTGAC/T. Los asteriscos (*) representan los nucleótidos idénticos, los guiones (-) representan los espacios para la mejor alineación. Los exones son representados en la SEQ ID No. por la numeración siguiente del nucleótido: SEQ ID NO. 146289-439; SEQ ID NO. 147 339-492; e SEQ ID No. 148285-439. Sitios de enlace de Tra2 de Aedes dsx En hembras de Drosophila melanogaster, Tra y un producto del gen constitutivo activo tra2, actúan como reguladores de empalme al enlazar a los sitios del reforzador de empalme en el pre-mARN del dsx, que activa el sitio del aceptador 3' débil; del exón específico a las hembras (Scali y otros). En varones no hay expresión de TRA y el sitio del aceptador 3' débil no es reconocido y el empalme ocurre en el exón masculino. Para buscar puntos de enlace asignados Tra/Tra2 utilizamos la secuencia de consenso de estos puntos de enlace deducidos para Tra/Tra2 de Drosophila y buscamos la distribución de éstos en la secuencia del gen dsx de Aedes aegypti del. Esto se muestra en la tabla 2, que sigue. 33 acatcgattcaca 16085 10 6 [ H5_ 34 cgctca tcaaca 16175 10 5 116 tctaccataaaaa 16511 10 5 117 36 aaa gaatcaaca 20044 10 5 118 37 acatcgttcaacg 21374 10 5 119 38 tcttgatitcacca 215S0 10 <5 120 39 tctgcagacaaca 22408 10 <5 121 L O tcttcggtaatca 23285 10 5 122 41 1 tctataaaea&ta SI 25436 10 <5 123 42 1 taaacaal-.fí.¾ata SI 25440 10 6 124 43 ' taaacaagc.aaaa ' 28242 10 5 125 ¡ 44 tcaacga cggcg 30309 10 6 126 45 tgatccatcatca 30910 10 5 127 46 -aacatgcaaga 32295 10 <5 128 47 i. taaabaeaga 32862 10 5 129 48 tcaaagatctata 40551 10 5 j 130 49 Laatgaattaaca 40847 10 5 : 131 50 tttaccatcaaci 41712 110 5 ! 132 1 taatgaaaeaaca 43380 10 5 133 52* gtttcaattaaaa SI 13500 9 6 134 53* tattcaat ataa SI 13602 9 6 135 54* tcttcaatecttt I 15002 9 6 136 55* tcaacgatccttt SI 15533 9 6 137 Tabla 2: * = en 3491, solo 9/13 pero 6/6 en leí núcleo. Esta tabla no incluye identidades 9/13 además de los que están en 3491 con identidad de 6/6 con la secuencia núcleo de wwcrat. Esta secuencia núcleo de consenso (WWCRAT) se prefiere en particular. La figura 7 es una representación diagramática de los sitios de enlace asignado Tra/Tra2 dentro de la región de codificación del plasmido LA3491. Este diagrama está aproximadamente a escala y representa una secuencia de aproximadamente 4kb. Podemos calcular la ocasión de un coincidencia al azar a la secuencia de consenso Tra/Tra2. Si se asume que los 4 nucleótidos ocurren con una igual frecuencia, las probabilidades de que cualquier nucleótido dado en una secuencia al azar sea el primer nucleótido de una coincidencia de 10/13 o mejor que el consenso es de 7XIO"4 aproximadamente. Por lo tanto, uno esperaría ligeramente menos de una coincidencia de ese tipo por cada 1000 nucleótidos de tal secuencia al azar. El cálculo para esto está abajo. Empalme específico al sexo: probabilidades Preguntas Una secuencia de consenso del punto de enlace consiste de 13 bases. Diez de esas posiciones (fijas) (llamemos a este sistema X) debe cada una ser una base específica. Las otras tres (llamemos a este sistema Y) puede cada una ser una de dos bases específicas. ¿Si se asume que cada base posible A, G, C y T es igualmente probable y que la base en cada posición es independiente de las bases en las otras posiciones, cual es la probabilidad de que una secuencia de 13 bases seleccionada al azar coincida exactamente con esta secuencia? ¿Cuáles son las probabilidades de tal secuencia sea una casi una no coincidencia (que permite hasta una, dos, tres o cuatro diferencias)? Las respuestas se proporcionan en la tabla 2 que sigue y los procedimientos se muestran después de esa tabla.

Respustas Tabla 3 Procedimiento P(coiiicidencia exacta) — Pa ~ = 1.192x10"' a 3 d.p. (3 d.p. todos los que siguen) P(no coincidencia en exactamente 1 posición) = P(no coincidencia en una de las 10 posiciones X o no coincidencia en una de las 3 posiciones Y) = ./> = 10] riYrsYiV + , 3 jiYVit .oo*3)+3 33 3,93 x10" U ) U ? 2 J 419 x 23 P(no coincidencia en exactamente 2 posiciones) = P(no coincidencia en 2 de las 10 posiciones X o no coincidencia en una de las una de 10 posiciones X y 1 de las 3 posiciones Y o no coincidencia en 2 de las 3 posiciones Y) + I0x iV sYiV iWtY 2J 2) ((45 x 3 ) - (30 ? 3) + 3) _ 498 _ 249 _ , ?_, ^23 2. " ' P(no coincidencia en exactamente 3 posiciones) = P(no coincidencia en 3 de las 10 posiciones X o no coincidencia en 2 de las una de 10 posiciones X y 1 de las 3 posiciones Y o no coincidencia en 1 de las 10 posiciones X y 2 de las 3 posiciones Y o no coincidencias en las 3 posiciones Y) (120 33) + (45 33 ) + (30x ) + l) = 5356 _ 1339 = g5 ? , =* 2"" 2a *" ~2"~ P(no coincidencia en exactamente 4 posiciones) = P(no coincidencia en 4 de las 10 posiciones X o no coincidencia en 3 de las una de 10 posiciones X y 1 de las 3 posiciones Y o no coincidencia en 2 de las 10 posiciones X y 2 de las 3 posiciones Y o no coincidencias en 1 de las 10 posiciones x y 3 de las 3 posiciones Y) P(no coincidencia en hasta en 1 posición) 1 + 33 17 ,23 *22 «4.053x10" P(no coincidencia en hasta en 2 posiciones) „ 1+33+498 532 133 «i¾ +Pi+P2 ^G— -^r = ^r = 6J42xlO-s P(no coincidencia en hasta en 3 posiciones) 1 + 33 + 498 + 5356 5888 = + >]÷ 2 +P3 = P(no coincidencia en hasta en 4 posiciones) 1 +33+498 + 5356 + 27975 _ 33863 -P +P1+P3 + ¡+ = - 4.037x10 ,-·? Experimento 14: Cetra Tenemos una línea de LA3097 (LA3097A) que muestre la expresión muy buena de su marcador fluorescente; se desconoce si esta línea es un solo acontecimiento de integración. Esta línea demuestra evidencia de empalme específico al sexo, cuando es criada sin tetraciclina todas las hembras mueren como embriones, y cuando se encuentran bajo 30 g/ml de la tetraciclina los varones y las hembras sobreviven. Este ejemplo es importante. Demuestra que Cetra proporciona un emplame alternativo específico al sexo en aedes, y que esto se puede utilizar para dar letalidad específica al sexo. Esto, por lo tanto, proporciona la evidencia de la gama filogenética parael empalme de Cetra. Así, es completamente plausible que la presente invención se puede aplicar a todos los dípteros, pues hemos demostrado que Cetra funciona en Drosophila, tefritidas y mosquitos, que esencialmente se extiende a la orden entera de Dípteros. Es sorprendente que Cetra funciona en el aedes, dada la rápida evolución de la secuencia del tra. Transformamos Aedes aegypti con la construcción LA3097.

Se cruzaron a los varones heterozigóticos de la línea transgénica resultante con las del tipo nativo y la progenie se crio en medio acuoso complementado con tetraciclina a una concentración final de 30 pg/ml. Se recuperaron los adultos de la sigue forma: 14 varones y una hembra, demostrando así una significativa letalidad específica a las hembras. Estas especie y cepa tienen normalmente un cociente de sexo aproximadamente del 1:1, por lo tanto esta construcción dio letalidad específica hembra en Aedes aegypti. Las construcciones equivalentes que no contuvieron la secuencia intronica de Cetra presentaron letalidad no específica al sexo. Por lo tanto, el intrón de Cetra se puede utilizar para proporcionar regulación diferencial (esto es específica al sexo) de la expresión del gen en mosquitos, y esto se puede utilizar además para proporcionar letalidad específica al sexo y un método para la eliminación selectiva de hembras de una población. Más detalladamente: en 0 pg/ml de tetraciclina, los varones sobreviven solamente hasta ser crisálidas, es decir no llegan a adultos. Las hembras mueren tan temprano que nosotros no las vemos, probablemente como embriones, así que sigue siendo un efecto diferenciado entre los sexos. Sin embargo, la letalidad pupal en varones sugiere que el sistema no esté totalmente apagado en varones. La única línea de la inserción que recuperamos es inusual, porque demuestra la expresión extremadamente fuerte del marcador; otras inserciones con niveles más típicos de la expresión no pudieron demostrar bien la letalidad masculina. Empalme en LA3097A El análisis de empalme de LA3097 de mosquitos transgénicos LA3097A por RT-PCR demostró que los varones y las hembras compartieron dos transcripciones, una banda de aproximadamente 950 pares de base y una banda con menos bp aproximadamente 800 (figura 59). La secuencia de estas bandas demostró que la banda con -900 bp corresponde a una variante no específica al sexo del empalme (AeM2, bp -920), y la banda más débil era una mezcla de una variante no específica al sexo del empalme (AeMI, ~804bp) y la forma femenina (AeFI, ~765bp), véase el figura 60. El empalme de la transcripción de AeFI fue idéntico al mostrado para esta construcción en la mosca del mediterráneo (figura 33). El empalme de las transcripciones de M se diferencia algo considerado en el contexto nativo (Cetra que se empalma en la mosca del mediterráneo , o el gen nativo o como observamos de LA3097 en la mosca del mediterráneo transgénica); en AeMI el segundo exón alternativamente empalmado (MEIb) no se incluye en la transcripción madura de AeMI y en AeM2 el segundo exón alternativamente empalmado (ME2b) no se incluye igualmente en la transcripción madura AeM2. En otras palabras, para cada una de estas transcripciones está presente el primero pero no el segundo exón del cartucho, relativo al prototipo de la mosca del mediterráneo. Observar que como consecuencia de la ausencia del segundo exón del cartucho en AeMI, y el marco de lectura de tTAV2 concerniente al primer exón del cartucho en esta construcción, el empalme en el patrón de AeMI no lleva a la interrupción del marco de lectura abierto tTAV2, sino más bien a la adición de 39 nucleótidos (que corresponden a 13 aminoácidos) entre el ATG y el resto del tTAV2 del marco abierto de lectura. Es probable que esta variante del tTAV 2 conserve una cierta actividad, relacionada a tTAV2 normal o prototípico (según lo codificado por la variante del empalme F1). En la ausencia de tetraciclina, un efecto fenotípico fue observado en varones así como en las hembras, aunque más débil en varones que en las hembras. La producción de una variante parcialmente activa de tTAV2 de la transcripción de AeMI en varones (y hembras) puede explicar esto. Figura 59 - muestra RT-PCR en varones y hembras de la línea transgénica de aedes aegypti LA3097 usando los cebadores HSP (SEQ ID. No. 139) y VP16 (SEQ ID. No. 140). Usando estos cebadores, el empalme en el patrón de CcFI (es decir correspondiendo a la variante F1 de Ceratitis capitata) daría una banda de aproximadamente 765bp y empalme en CcMI 1005bp y CcM2 1094bp. En varones y hembras, fue observada una banda fuerte de 950bp (1) aproximadamente junto con una banda más débil de aproximadamente 800bp (2). Marcador (SmartLadder™ de Eurogentec, se indican bandas de 1.5kb a 0.4kb). Análisis de secuencia de varios clones de la banda 2 (es decir variantes del empalme de AeMI/AeFI) de varones y las hembras mostraron que uno de cinco clones de hembras mostró empalme de AeM2 (el 20%), mientras que en varones tres de las cuatro copias mostraron empalme de AeM2 (75%); el resto de copias mostraron empalme de AeFI. Esto indica que hay más transcripción de AeFI presente en hembras que en varones y esto explicaría el efecto diferenciado de la matanza observada en entre ellos. La figura 60 ilustra las varias transcripciones producidas por el empalme alternativo de Cetra de línea transgénica del Aedes aegypti LA3Q91A. 3097 representa la secuencia de la ADN de Cetra y los números se relacionan con la figura descrita en otra parte. El sombreado y las cajas también se relacionan a la figura 33. Observar que el diagrama no está a escala. Ejemplo 15: Actin-4 de Aedes; Tenemos once líneas de LA3545, que utiliza el gen actin-4 de Aedes (AeAct-4 o AaAct4) para conducir a la expresión de tTAV2. En la construcción LA3545, una codificación de secuencia tTAV2 se ha insertado en el segundo exón de AaAct4 (figura 10). Para las transcripciones empalmadas en el patrón característico de AaAct4 empalmada en hembras, el ATG de la región de la codificación tTAV2 será el primer (en su mayoría 5 ') ATG de la transcripción. El empalme en el patrón característico de AaAct4 que se empalma en varones introduce un arreglo de codones de inicio y de paro antes de la secuencia tTAV2 que tiende a inhibir o a interferir con la translación del ATG de la región de la codificación tTAV2. Estas líneas deben expresar solamente tTAV2 en crisálidas femeninas. El empalme se muestra en la figura 8, adelante. La figura 8 muestra RT-PCR de los adultos masculinos y femeninos de la línea transgénica de Aedes aegypti de LA3545AeC usando los cebadores AgexonlF (SEQ ID. No. 141) y TETRRI (SEQ ID. No. 142). Usando estos cebadores, el empalme en un patrón equivalente al del gen nativo AaAct4 daría bandas de 347bp aproximado para la variante del empalme tipo hembra y de 595bp aproximado para la variante de empalme tipo varón. Una banda 347bp de la banda aproximada (F) fue encontrada solamente en reacciones en los extractos de hembras; una banda de 595bp aproximadamente (M) fue encontrada en varones y hembras. La secuencia ha confirmado que el empalme correcto ocurrió en varones y hembras. Marcador (SmartLadder™ de Eurogentec, se indican bandas de 1.5kb a 0.2kb). También tenemos aedes aegypti transgénico LA3604, que es similar a LA3545 a menos que tenga un codón de inicio dirigido en la porción de exón 1 que esté presente en las transcripciones tipo varón y tipo hembra (figura 10). Éste se arregla para ser el primer ATG en cualquier tipo de transcripción. LA3604 codifica tTAV2 fusionado a ubiquitina (LA3545 codifica a tTAV, mientras que LA3604 codifica a ubi-tTAV2). Esta construcción debe producir unaa proteína completamente funcional tTAV2 en hembras solamente, incluso si la forma masculina se expresa en hembras el exón masculino adicional contiene varios de los codones de inicio y de paroque prevendrían la traslación de la proteína de fusión Ubi-tTAV2. El empalme alternativo de AaAct4 ocurre en el 5' UTR (del gen nativo). Puede o no tener un papel regulador en el gen nativo. Una posibilidad es la siguiente: en la variante del empalme específica a hembras, el codón de inicio de la región de la codificación AaAct4 es el primer ATG de la transcripción. Sin embargo, en la variante del empalme específica al varón hay varias secuencias adicionales 5' ATG; al codón de inicio de la región de la codificación AaAct4; la mayor parte de éstos tienen codones de paro en el marco a una distancia corta 3' . Este arreglo de la secuencia puede interferir con la traslación eficiente de la proteína AoAct4 y de tal modo reducir la expresión de la proteína en varones con respecto a hembras. Éste es el arreglo en LA3545. Sin embargo, un mayor efecto diferenciado entre los varones y las hembras sería esperado si el intrón fue incluido en la región de la codificación (más que 5' UTR), es decir insertado entre los codones de inicio y de paro del polinucleótido para la expresión en el organismo. En este caso, el exón específico al varón del cartucho cambiaría el potencial de la codificación de la transcripción, y no solo simplemente interfiriendo con la traslación.

Esto se alcanza en la construcción LA3604. Modificamos el primer exón compartido para incluir una secuencia de ATG en un contexto conveniente de la secuencia para la iniciación de la translación. En esta secuencia modificada, éste es el primer ATG en las variantes del empalme tipo varón (M) o tipo hembra (F). Después del empalme en la forma F, este 5' ATG (modificado) está en el marco con la región de la codificación de ubi-tTAV. Las transcripciones tipo F por lo tanto codificarían una proteína de fusión, abarcando las secciones codificadas por (i) la parte de lo que es normalmente Act4 5' UTR (pero aquí trasladado obviamente, y así nada de UTR en absoluto), (ii) región de la codificación de ubiquitina y (iii) región de codificación de tTAV2. La actividad de las proteasas celulares de ubiquitina producirá la proteína tTAV2. La traslación del 5' ATG modificada terminaría por codones de paro en el marco en la secuencia adicional (exón del cartucho) presnete en las transcripciones empalmadas en la forma de M. Esto por lo tanto prevendría la expresión de tTAV2 funcional en varones, dando así la expresión específica al sexo de tTAV2. Obviamente, esto da un método general para la expresión específica al sexo de una proteína, substituyendo el segmento tTAV2 por otra proteína o la secuencia de interés. Usando esta estrategia hemos proporcionado transgenicos y hemos demostrado el empalme específico al sexo (figura 9). La figura 9 muestra RT-PCR de varones y de hembras de la línea transgénica LA3604AeA de Aedes aegypti usando los cebadores AgexonlF (SEQ IDNo. 141) y TETRRI (SEQ IDNo. 142). Usando esos cebadores, el empalme en la forma femenina daría una banda de aproximadamente 575 bp, mientras que la inclusión del exón específico al varón del cartucho aumentaría esto a aproximadamente 823bp. Una banda de 575bp aproximadamente fue observada en cada hembra analizada, mientras que una banda de 823bp aproximadamente fue observada en cada varón analizado. Estas bandas parecen ser substancialmente específicas a los respectivos sexos. La secuencia de estas bandas demostró que el empalme correcto había ocurrido en varones y hembras. Marcador: SmartLadder™ de Eurogentec, se indican bandas de 1.5kb a 0.2kb. La figura 10, de adelante, es una representación diagramática de los plásmidos LA3545 y LA3604. S1: exón compartido 1; MI: secuencia adicional incluida en el exón específico al varón 1; S2: exón compartido 2 (solamente extremo 5'); ubi: secuencia de codificación de ubiquitina; tTAV2: secuencia de codificación de tTAV2. En varias de las líneas trangenicas LA3545 fue observado un efecto específico al sexo y al tejido: las hembras no pueden volar. Dos de las líneas muestran un fenotipo hembra que no puede volar del 90-100% una línea muestra 70% de falta de vuelo y el otro 50%. Este fenotipo probablemente se deba a la expresión específica a las hembras de tTAV2 en los músculos del vuelo en desarrollo. La diferencia en los fenotipos entre las líneas se debe a los efectos posicionales sobre la expresión del promotor AaAct4. Debido a que la posición de los genes en la expresión del genoma puede ser influenciada por un número de factores (las regiones de heterocromatina o de eucromatina, los elementos de refuerzo y del supresor, proximidad a otros genes) que se puedan observar fácilmente en los marcadores fluorescentes usados para identificar transgenicos. Todas las once líneas LA3545 fueron identificadas porque tienen diversos perfiles fluorescentes, aunque tienen los mismos promotores y marcadores. Esta variación se debe a los efectos posicionales. Esto entonces significaría que esperaríamos que algunas líneas LA3545 expresaran más tTAV2 que otras debido a efectos posicionales, y esas líneas que expresan más producirían un fenotipo de falta de vuelo específico a las hembras.

Para probar esta hipótesis desarrollamos una línea separo de Aedes aegypti con un gen reportero tetO-DsRed2 (LA3576 ver SEQ IDNo. 143 del figura 17and), cuando se cruzo con las diversas líneas LA3545 permitiría la visualización de donde y de cuando se expresa Actin4-tTAV2. De las 8 líneas LA3545 cruzadas a LA3576 todas mostraron fluorescencia indirecta específica a las hembras del músculo del vuelo en las larvas L4 tardías, las crisálidas y los adultos. En cuatro de las líneas la expresión de DsRed2 aparecía ser específica (es decir exclusiva) a los músculos indirectos femeninos del vuelo; en los otros cuatro tejidos adicionales se mostró la expresión de DsRed2. Este fenómeno, en el cual la expresión de un transgén depende en parte de la región o punto en el genoma en el cual se ha insertado, se llama efecto de posición, y es bien conocido y entendido por el experta en la técnica. Usando LA3576 se probó que la expresión de tTAV2 en LA3604 fue específica a las hembras, ocurre principalmente en los músculos indirectos del vuelo y es específica a la etapa. Varias construcciones diversas del efector tetO entonces fueron construidas para analizar sus efectos. El tetO-MichelobX transgénico (LA3582, ven figura 15 y la SEQ ID No. 144) al cruzarlo con LA3545 todos demostraron fenotipos con falta de vuelo específicos a las hembras se podrían reprimir por medio de la tetraciclina. Esto prueba que Actin4 se puede utilizar para conducir un gen efector en una manera específica a la etapa, el tejido y el sexo. Debido a que algunas líneas de LA3545 tenían un fenotipo específico a las hembras sin la presencia de un gen inducido determinante, se demostró que tTAV2 podría actuar como molécula del determinante. tTAV2 se compone de un tTA, de un dominio obligatorio y de VP 16, una proteína del tetO del virus de herpes simplex. VP 16 activa la transcripción de genes virales tempranos inmediatos usando sus secuencias amino-terminales para enñazarse a una o más proteínas codificadas por el anfitrión que reconozcan secuencias ADN en sus promotores. En LA3604 un gen del determinante tetO-VP16 se ha agregado para realzar el efecto de tTAV2. En tres líneas transgénicas de LA360 esto ha conducido que un 100% de fenotipo de valta de vuelo específico a las hembras cuando son criadas sin tetraciclina, demostrando que ese VP 16 es una molécula efectora eficaz. Observar que LA3604 tiene un codón de inicio potencial 5' (ATG) modificado; al intrón alternativamente empalmado. Por lo tanto, en esta construcción, se espera que el exón específico a los machos interrumpa el tTAV de la codificación del marco de lectura abierto (ubi-tTAV); puesto que la secuencia específica a los machos contiene varios codones de paro, ésta tenderá a reducir o a eliminar la producción de tTAV funcional en varones. Por la comparación, el exón específico a los machos es 5' al codón de inicio del tTAV en LA3545. Sin embargo, insertando un número de codones de inicio 5' al codón de inicio del gen tTAV (que es el primer ATG de la transcripción femenina pero no de la transcripción masculina), ningunos de estos codones de inicio adicionales que son convenientes para la producción eficiente de tTAV funcional debido a que están fuera de marco o porque tienen, codones de paro de intervención, este arreglo también tenderá a reducir o a eliminar la producción de tTAV funcional en varones, consistente con los datos fenotípicos anteriores. Ejemplo 16: uso de la colocación de ubiquitina y del intrón Hemos hecho nuevamente construcciones basadas en Cetra con el cartucho del intrón de Cetra en una variedad de diversos contextos, es decir flanqueado por diversas secuencias. Las varias líneas de mosca de mediterráneo transgénicas que las portan se han construido. Esto demuestra que el sistema es general y robusto, es decir funcionará para una amplia gama de secuencias heterólogas de interés. También tenemos por lo menos un ejemplo nuevamente realizado de una fusión de Cctra-ubi-tTAV que da el empalme correcto (DsRed-cctra-ubi-tTAV). Los ejemplos preferidos de la proteína funcional colocan la secuencia de codificación ya sea para el ubiquitin o el tTA, o sus mutantes funcionales y o las variantes tales como tTAV, tTAV2 o tTAV3, 3' al intrón. Se arreglan de modo que estos elementos estén substancialmente adyacentes al extremo 3' del intrón, preferiblemente de tal forma que la región de codificación comienza dentro de 20 nucleótidos o menos del 3' límite del intrón), y más preferentemente, inmediatamente adyacente al 3' extremo del intrón, aunque esto sea menos relevante si se utiliza el sistema de Ubiquitina. Los ejemplos preferidos de construcciones según la presente invención se enumeran en la figura 4, abajo. Se apreciará que LAI 188 no está dentro del alcance de la actual invención, pues no codifica a una proteína funcional, es decir no funciona correctamente. Esto es probablemente debido a el uso inesperado de donador de emplame de 4 bp 5' a la unión con la secuencia de intrón de Cetra, conduciendo a un mutágeno 'desplazamiento de marco' que se induce en todos los empalmes. Por lo tanto, se incluye por razones informativas únicamente.

Tabla 4 La figura 4 muestra las construcciones que contienen una secuencia de control de empalme que se deriva de un intrón tra. Los intrones fueron derivados del C capitata (mosca del mediterráneo), de C. zonata o de B. rosa (ver la columna 2). El intrón fue insertado dentro de la región de codificación tal que la distancia entre el iniciador asignado ATG y el últimpo nucleótido del exón inmediatamente anterioer tra del intrón como debe ser indicado en la columna 3. El intrón se inserta en o adyacente a la región para para ya sea ubiquitina, tTAV, reaperKR, nipper o ubiquitina-DsRed según las indicaciones de la columna 4. Éstos fueron generados y se mostró que empalman con éxito, por medio de RT-PCR o fenotípicamente en la mosca del mediterráneo y, en algunos casos, también en Drosophila melanogaster (LA3077) o Anastrepha ludens (LA3097, LA3233, LA3376). En adición, la distancia entre el ATG y el extremo del exón inmediatamente antes del intrón I tra (asumiendo el empalme en forma tipo F1) puede extenderse de Obp a por lo menos +949bp sin consecuencias adversas para el empalme (véase la tabla 4, columna 3). Así, es razonable asumir que esta distancia puede ser hasta por lo menos de 900 bp y preferiblemente hasta por lo menos 949 bp. La información adicional sobre estos ejemplos se resume en la figura 5. La opción preferida es no utilizar ninguna secuencia endógena para alcanzar el control de empalme alternativo correcto de la expresión (+0bp en la figura 4). Preferimos insertar el intrón tra entre los dinucleótidos flanqueantes TG... GT en la región codificante de la proteína de interés para que sea empalmado alternativamente para asegurar el empalme correcto ya que esto puede ser importante, no obstante no nos restringiremos a esto si es necesario ya que también pueden funcionar correctamente otros nucleótidos flanqueantes. Ejemplos de LA1038, LA3054 y LA3056 incluyen una cierta secuencia exonia endógena flanqueante del gen natural Cetra. En la tabla 5, si son incluidos 6 nucleótidos o menos (codón de inicio incluyendo ATG) de fusiones particulares al 3' o 5' de la unión de empalme, con el propósito de resumir en esta tabla éstos no se considerará que sean parte de la fusión. La tabla 4 se puede correlacionarse con la figura 3 para encontrar qué intrón tra (Cetra, Bztra o Crtra) se utiliza en cada ejemplo. Una vez más LA1188 se incluye solo con propósitos informativos y no entra en el ámbito de la presente invención.

No.de el intron tra está , el intron tra está secuencia tra exoiuca secuencia tra exonica construcción fusionado a 5* fusionada a 5" (bp) fusionada a 3" (bp) (Figs #0 fusionado a 3" LA 1188 (80) Hsp70-tTAV cTAV +0bp +0bp LA3014 (29) Hsp7Q» ubiquitina ubiquitina 0bp -i-Obp nsaper R-svj10 DV316<3 (30) Hsp7Q-' ubiquitina ubiquitina +0bp ÷0bp rea})crKR-5v40 LA30S>7 (27) Hsp70 íTAV-KlO *0bp ÷0bp T..A3077 (26) Hsp70-íTAV ITAV- 10 +0bp ÷Qbp LA3233 (28) Hsp70 ITAV2- 10 +0bp +0bp LA3376 (31) Bsp70 tTAV2-K10 •i-0bp + p LA3376(31) Sry*a t'TÁV3-sv40 +0bp 40¾p LA3376(3J) MB reaperK -sv4C +0bp +0bp LA3242 (32) HB reaperK -sv40 +0bp ÷0¾p LA1038 (14) Hsp70-tra Tra-Nippl +22bp ÷20bp (nipper)-sv40 LA3054 (61) 0pie2-R.ls QsRcd- tra- ubiquitina +22bp +20bp tra VTAY-SV40 LA3056 (62) Opie2- ls-D5 cd- tra- ubiquitina +?.?.bp +242bp tra tTAV-svlO LA3488 (63) Tel-nls- ubiquitina n!s- +0bp K)bp TurboGieen-nls- DsRcd-Eis-sv40 ubiquituia LA3596 (67) lel-nls- ubiquitinanls- -Ob -t-Obp TurboGreen-nls- DsRcd-als-sv- 0 ubiquitina Tabla 5 Según lo mencionado anteriormente cuando un itron es colocado a 5' ade una región de la codificación de la proteína (ORF-X), se prefiere colocar o utilizar la ubiquitina 3' al intrón, 5' a ORP-X, así y proporcionando la regulación específica femenina de ORF-X, mientras que introduce la separación física entre esa secuencia y el intrón tra, reduciendo de sa forma las ocasiones en las que las secuencias dentro de ORF-X interferirán con el empalme del intrón tra. Las construcciones y las secuencias del compuesto también se consideran, por ejemplo de la forma: X-ubi-Y con el intrón alternativamente empalmado insertado entre la región X de la codificación y la ubiquitina de la codificación de la región (ubi), o dentro de la región de la codificación de la ubiquitina, o entre la ubiquitina y la región codificante Y. Así X será expresado independientemente del empalme del intrón, mientras que Y será expresada solamente cuando el intrón se empalme en una forma conveniente. Otras Configuraciones y disposiciones de este tipo general serán evidentes para el experto en la técnica. Algunos ejemplos de esto son LA3014, LA3054, LA3056, LA3166, LA3488 y LA3596 todos los cuales utilizan las fusiones del ubiquitin demostrando de esta manera la capacidad de que esta idea sea aplicada con éxito en mosca del mediterráneo transgénica. Los ejemplos alternativos en mosquitos transgénicos incluyen LA3604 y LA3612, demostrando la aplicabilidad filogenética amplia de este sistema en no sólo especies diversas (los mosquitos y las moscas del mediterráneo), sino también en diversos contextos incluyendo AaActin4, Aadsx y Cetra. LA3596 (véase el figura 67 y la SEQ ID No. 145) tiene un diseño similar a LA3488, pretendiéndo generar fluorescencia verde (por la expresión de la proteína fluorescente localizada en el núcleo de TurboGreen) en ambos sexos, pero fluorescencia roja solamente en hembras (por la expresión de la proteína fluorescente localizada en el núclea DsRed2). Esto se logra por medio de la fusión de estas dos proteínas, promovida por el cartucho del reforzador/ promotor de Hr5-le1, enlazado junto con un enlazante corto de 11 aminoácidos (enlazante SG4) y una región de codificación que abarca ubiquitina (con un punto de mutación pretendido para estabilizar la proteína resultante reduciendo su propensión a la degradación mediada con ubiquitona) y el intrón de Cetra para limitar la expresión de DsRed2 a las hembras. La mosca del mediterráneo transgénica fue generada con esta construcción. La fluorescencia roja se limitó a las hembras en esta línea según lo esperado, mientras que la fluorescencia verde fue observada en todos los varones y las hembras. Esto se podría utilizar para la separación por sexos por discriminación de fluorescencia de una proteína fluorescente particular, en este caso fluorescencia roja que representaba la expresión de DsRed2. Ejemplo 17: Otra ejemplificación Cetra También se hace referencia a LA3014 y LA3166 y los datos fenotípicos de estos en otros ejemplos Previamente hemos hecho, y hemos obtenido transgenicos con el intrón Cetra en una proteína funcional con excepción de tTAV, tales como LA3014 y LA3166. LA3014 contiene una fusión ubiquitina-reaperK corriente abajo de un intrón Cetra. Los datos fenotípicos que la mosca del mediterráneo transgénica LA3014 produjo una letalidad específica a las hembras reprimible. El análisis de RT-PCR en el ARN extraído de varones adultos y de hembras criados sin tetraciclina, usando los cebadores y ReaperKR, demuestra que el empalme correcto ocurría en las hembras (banda 508bp) y no se encontrado ninguna banda de ese tipo en los varones (figura 37). LA3166 es otra construcción con el intrón de Cetra colocado dentro de la región de codificación de ubiquitina fusionada a reaperKR, pero colocada en una diversa posición en ubiquitina. LA3166 también produce un efecto letal específico a las hembras reprimible dominante en la mosca del mediterráneo. LAI 038 es un nuevo ejemplo del uso del intrón Cetra en un diverso contexto de secuencia, aquí colocado en un fragmento de NippIDm llamado "nipper" que también se empalma correctamente en la mosca del mediterráneo transgénica cuando es analizada por medio de RT-PC (figura 12). LA670 fue requerido como una fuente de tTAV para conducir la expresión del nipper alternativamente empalmado. También hemos hecho nuevamente, y hemos obtenido transgénicos con, construcciones de "solo intrones" a base de Cetra con el intrón en un diverso gen (muchos de los ejemplos anteriores, a menos que sean evidentes de otra forma, están en el tTAV o en una de sus variantes, es decir tTAV2 o tTAV3). Estas construcciones funcionan según lo indicado. Esto es un resultado importante, demostrando así que no hay secuencias exónicas esenciales Cetra que hemos duplicado simplemente (en la función, si no necesariamente en la secuencia) por casualidad, en tTAV. También tenemos construcciones de ubi-rprKR de este tipo (LA3014 y LA3166), que también valida el método de fusión del ubiquitina descrito antes. El método de fusión de ubiquitina es ejemplificado más profundamente por el análisis RT-PCR de LA3054, LA3056 y LA3488 (figuras 11, 13, 14), según lo descrito en el ejemplo 16, anterior. Figura 11: Gel que muestra el empalme específico al sexo de intrones derivados de Cetra (banda 780bp en hembras) en el Ceratitis capitata transformada con LA3488. El empalme en la forma F1 produciría un producto de aproximadamente 780bp. Una banda de este tamaño es claramente visible de las hembras (carril 4), pero no en los varones, ni en los carriles con las reacciones de las cuales se omitió la enzima transcriptasa inversa ("sin RT"). Por lo tanto, el intrón derivado de Cetra es capaz del empalme alternativo específico al sexo en este nuevo contexto de secuencia. Carril 1: Marcador (SmartLadder™ de Eurogentec, se indican bandas de aproximadamente 0.8, de 1.0 y de 1.5kb); Carriles 2 y 3: Ceratitis capitata LA3488/+ machos (control RT y sin control RT, respectivamente); Carriles 4 y 5: Ceratitis capitata LA3488/+ hembras (control RT y sin control RT, respectivamente). Figura 12: Gel que muestra el empalme específico al sexo de intrones derivado de Cetra en Ceratitis capitata transformado con LA1038. El empalme en la forma F1 producirá un producto de aproximadamente 230bp. Una banda de este tamaño es claramente visible en las hembras (carriles 1, 2, 7, 8, 9 y 10), pero no en varones. Por lo tanto, el intrón derivado de Cetra es capaz del empalme alternativo específico al sexo en este nuevo contexto de la secuencia. Carril 15: Marcador (SmartLadder™ de Eurogentec, se indican bandas de aproximadamente 0.2, de 0.4 y de 0.6kb); Carriles 1 , 2, 7, 8, 9 y 10: Ceratitis capitata LA670; Hembras LA1038; Carriles 3, 4, 5, 6, 11, 12, 13 y 14: Ceratitis capitata LA670; LAI 038 varones. Figura 13:Gel que muestra el empalme específico al sexo de intrones derivados de Cetra en Ceratitis capitata transformado con LA3054. El empalme en la forma F1 producirá un producto de aproximadamente 340bp. Una banda de este tamaño es claramente visible en el carril 7, pero no en los varones. Por lo tanto, el intrón derivado de Cetra es capaz del empalme alternativo específico al sexo en este nuevo contexto de la secuencia. Carril 1 : Marcador (SmartLadder™ de Eurogentec, se indican bandas de aproximadamente 0.4, de 0.6, de 0.8 y de 1.0kb); Carriles 2-5: Ceratitis capitata LA3054 machos; Carril 7: Ceratitis capitata LA3054 hembras. Figura 14: Gel que muestra el empalme específico al sexo de intrones derivados de Cetra en Ceratitis capitata transformado con LA3056. El empalme en la forma F1 producirá un producto de aproximadamente 200 bp. Una banda de este tamaño es claramente visible de una hembra (carril 6), pero no de los varones (carriles 2-4). Por lo tanto, el intrón derivado de Cetra es capaz del empalme alternativo específico al sexo en este nuevo contexto de la secuencia. Carril 1: Marcador (SmartLadder™ de Eurogentec, se indican bandas de aproximadamente 0.2,' de 0.4, de 0.6 y de 0.8kb); Carriles 2-5: Ceratitis capitata LA3056/+ machos; Carriles 6-7: Ceratitis capitata LA3056/+hembras. Figura 15: Gel que muestra el empalme específico al sexo de intrones derivados de BzTra en Anastrepha ludens transformados con LA3376. El empalme en la forma F1 producirá un producto de aproximadamente 672 bp. Una banda de este tamaño es claramente visible de las hembras (carril 4), pero no en los varones, ni en los carriles con las reacciones de las cuales la enzima transcriptasa inversa fue omitida ("RT"), los cebadores usados fueron SRY y AV3F. Por lo tanto, el intrón derivado de Bztra es capaz del empalme alternativo específico al sexo en este nuevo contexto de la secuencia. Carril 1: Marcador (SmartLadder™ de Eurogentec, se indican bandas de aproximadamente 0.6, de 0.8, y de 1.0kb)¡ Carriles 2 y 3: Anastrepha ludens LA3376/+ machos (con control RT y sin control RT, respectivamente); Carriles 4 y 5: Anastrepha ludens LA3376/+ hembras (con control RT y sin control RT, respectivamente). Figura 18 y SEQ ID no. 149 y 150 muestran las secuencias del minigen DSX y minigen2 DSX y mapa del plásmido LA3619. Las figuras 19-51 corresponden a los ejemplos 1-9 anteriores. Las figuras 52-58, 68 y 69 muestran varios diagramas y secuencias del plásmido. Las figuras 59-60 se describen antes y las figuras 61-66 muestran varios diagramas y secuencias adicionaes del plásmido. La figura 67 es pLA3596, según lo deserto en otra parte. Referencias Alien ML, Christensen BM. Related 2004 Flight muscle-specific expression of act88F: GFP in transgenic Culex quinquefasciatus Say (Díptera: Culicidae). Parasitol Int. 55 (4): 307- 14. Bennett D5 Szoor B, Gross S, VereshchaginaN, Alphey L. 2003 Ectopic expression of inhibitors of protein phosphatase type 1 (PPI) can be used to analyze roles of PPI in Drosophila development. Genetics. 164(1) :235-45. Black, D. (2003). Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing. Annu Rev Biochem 72, 291-336. Burset, M., Seledtsov, L, and Solovyev, V. (2001). SpliceDB: datábase of canonical and non- canonical splice sites in mammalian genomes. Nucleic Acids Research 2P5 255-259. Caceres JF, Kornblihtt AR. 2002 Alternative splicing: múltiple control mechanisms and involvement in human disease. 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Mini-gen dsx de Anopheles gambiae (Agdsx), [un mini-gen es una secuencia recombinante derivada de un gen particular (el gen Agdsx en este ejemplo) ligando entre sí segmentos no contiguos mientras que conserva el orden original 5'- 3' orden; esto es equivalente a la deleción de algunos segmentos internos de un fragmento más largo de la secuencia genomica derivada del gen], (1-3135): incluyendo la parte Agdsx de exon3, del exón 4a (hembra), del exón 4b (hembra) y de la parte de exon5 (varón y hembra). <***> Exones derivados de Agdsx de las posiciones 426 a 560 (parte del exón 3); 1068 a 2755 (incluyendo parte del exón 4, encontrado en hembras); 1809 a 2755 (incluyendo parte del exón 4, encontrado en hembras); y 2914 a 3135 (incluyendo parte del exón 5, encontrado en varones). <***> La transcripción alternativamente empalmada empieza en el segmento derivado del baculovirus AcMNPV leí (inmediatamente anterior 1) en la posición -8031 (el fragmento de leí es de la posición 7431 a la 8060). <***> Caracerística incluida: 1. El intrón adicional derivado del gen Drosophila scraps (' intron scraps') corriente arriba a la secuencia Agdsx desde la posición 8075 a 8137. <223> Secuencia de pLA3433 (SEQ ID NO. 48). <*** Las características clave incluyen: 1. Mini-gen Agdsx (778-4623): incluyendo la parte de Agdsx del exón 2, exon3, exón 4a (hembra), exón 4b (hembra) y parte de exon5 (varón y hembra). <***> Exones derivados de Agdsx de la posición 778 a 908 (parte del exón 2); 1913 a 2048 (parte del exón 3); 2556 a 2642 (parte del exón 4a); 3297 a 4243 (parte del exón 4b) y 4402 a 4623 (parte del exón 5). <***> La transcripción alternativamente empalmada empieza en el segmento derivado del baculovirus AcMNPV leí (inmediatamente anterior 1) en la posición -606 (el fragmento de leí es la posición 6 a 635). <***> Característica incluida: 1. El intrón adicional derivado del gen Drosophila scraps (' intron scraps') corriente arriba a la secuencia Agdsx desde la posición 650 a 712. <223> Secuencia de pLA3491. <***> Las características clave incluyen: 1. Mini-gen dsx de Aedes aegypti (Aadsx): incluyendo la parte del exón 4, de exon5a (hembra), del exón 5b (hembra), y la parte de exon 6 (varón y hembra) de Aadsx. <***> Exones derivados de Aadsx de la posición 1316 a 1450 (parte del exón 4); 2626 a 3761 (parte del exón 5a); 3293 a 3761 (parte del exón 5b); y 5215 a 5704 (parte del exón 6). <***> La parte de la transcripción F1 se predice que comprende los nucleótidos -1174-1450, 2626-3761, 5215-5850. <***> La parte de la transcripción F2 se predice que comprende los nucleótidos -1174-1450, 3293-3761, 5215-5850. <***> La parte de la transcripción F3 se predice que comprende los nucleótidos -1174-1450, 2626-3083, 3293-3761, 5215-5850. <***> La parte de la transcripción del M1 se predice que comprende los nucleótidos -1174-1450, 5215-5850. <***> La transcripción alternativamente empalmada comienza en el segmento derivado del baculovirus AcMNPV leí (inmediato anterior 1) en la posición -1174 (el fragmento de leí es la posición 574 a 1203). <***> Característica incluida: 1. El intrón adicional derivado del gen Drosophila scraps (' intron scraps') corriente arriba a la secuencia Agdsx desde la posición 1218 a 1280. <223> Secuencia de pLA3646. <***> Las características clave incluyen: 1. Mini-gen de Aadsx (17218-11707): incluyendo la parte de la posición 17113 a 16979 del exón 4, el exón 5a de la posición 15803 a 15025 a + 14010 a 13650, el exón 5b de la posición 15136 a 15025 a + 14010 a a 13650 y a la posición 12196 a 11707 del exón 6 (nota: orientación inversa) de Aadsx. <***> la parte del exón 4 contiene 4 mutaciones puntuales en relación al tipo salvaje en las posiciones 17087 (ATG- ACG), 17053 (ATG-ACG), 17050 (ATG-ACG) y 17041 (ATG-ACG) (nota: orientación inversa); la parte del exón 5a y 5b contiene de 3 mutaciones puntales en relación al tipo salvaje en las posiciones 15129 (ATG-ATA), 15116 (ATG-ATA) y 15113 (ATG-ATA) (nota: orientación inversa). Todas estas mutaciones son para eliminar las secuencias de ATG. tTAV2 se inserta en los exones traslapados 5a y 5b de la posición 15024 a 14011 (nota: orientación inversa). <***> La transcripción alternativamente empalmada inicia en el fragmento derivado de hsp70 en la posición ~17312 (el fragmento hsp70 es de la posición 17354 a 17225); (nota: orientación inversa). <***> Característica incluida: 1. El intrón adicional derivado del gen Drosophila scraps (' intron scraps') corriente arriba a la secuencia Agdsx desde la posición 1107 a 1045. (nota: orientación inversa). Secuencia de pLA3435 (SEQ ID NO.46) <***> Las características clave incluyen: 1. Mini-gen Bombyx mori dsx (Bmdsx) (1411-3161): con un enlace exógena entre los exones femeninos funsionados 3 y 4. <***> Fragmento del exon dos compartido (1411 bp-1554bp) <***> La parte del exón específico femenino tres (2121 bp-2202) fusiona a la parte del exón específico femenino 4 (2225bp-2290bp) usando un ligante exógeno (2203bp-2224bp) <***> fragmento del del exón compartido cinco (3007bp-3161 bp) <***> |jn producto de empalme del mini-gen dsx hembra es codificado por 1411-1554 + 2121-2290 +3007- 3161. <***> Un producto de empalme del mini-gen dsx macho es codificado por 1411-1554 +3007-3161. <***> La transcripción se predice para comenzar en aproximadamente la posición -1239 dentro del segmento derivado del promotor de baculovirus AcMNPV leí (inmediatamente anterior 1) (639bp-1268bp). <223> Secuencia de pLA3534. <***> Las características clave incluyen: 1. Mini-gen de Aadsx (6996-4425): que contiene el exón 4, la parte de exon5a (hembra) y la parte del exón 5b (hembra), de Aadsx que incluyendo los fragmentos del intrón de Aadsx. <***> Exones derivados de Aadsx de la posición 6968 a 6834 (parte del exón 4), 5462 a 4425 (parte del exón 5a) y 4795 a 4425 (parte del exón 5b); (nota: orientación inversa). <***> Parte de la transcripción de F1 se predice que comprende los nucleótidos -7146-6834, 5462-4300 (nota: orientación inversa). <***>Parte de la transcripción F2 se predice que comprende los nucleótidos -7146-6834, 4795-4300 (nota: orientación inversa). <***> Parte de la transcripción F3 se predice que comprende los nucleótidos -7146-6834, 5462-5005, 4795-4300 (nota: orientación inversa). <***> La transcripción alternativamente empalmada comienza en el segmento derivado del baculovirus AcMNPV leí (inmediato anterior 1) en la posición ~7146 (el fragmento de leí es de la posición 7746 a 7117, orientación inversa). <223> Secuencia de pLA3612. <***> Las características clave incluyen: 1. Región de codificación de Ubiquitina-tTAV2 insertada en un exon hembra del gen Aadsx. <***> Ubiquitina-tTAV2 se encuentra de la posición 15185-16429 en Aadsx (ubiquitina se encuentra de 15185- 15412; tTAV2 se encuentra en 15413-16429), incluyendo los codones de inicio y paro. <***> Secuencia derivada de Aadsx: 13150-15184, 16438-18805. <***> La transcripción alternativamente empalmada Aadsx-ubiquitina-tTAV2 inicia en el segmento derivado de hsp70 (el fragmento hsp7Q se encuentra en 13014-13143). <223> Secuencia de pLA3619. <***> Las características clave incluyen: 1. Región de codificación tTAV2 insertada en un exón hembra del gen Aadsx. <***> Secuencia derivada de Aadsx: 5635-364I5 2610-243 (nota: orientación inversa). <***> La transcripción Aadsx-tTAV2 empalmada alternativamente inicia a en el segmento derivado de hsp70 a partir del 5642 - 5771 (nota: orientación inversa). <***> Se predice que la transcripción tTAV2 es trasladada entre 2619-3635, incluyendo el codón de inicio y paro (nota: orientación inversa). <223> Secuencia de pLA3545. <***> Las características clave incluyen: 1. Promotor AaActin4 y 5' UTR incluyendo el primer intrón regula la expresión del tTAV. <***> La secuencia derivada de AaActin4 se encuentra de la posición 923-4285. <***> La transcripción alternativamente empalmada se predice que empieza desde aproximadamente -2366. <***> £| primer intrón de AaActin4 (variante femenina del empalme) se extiende desde 2458-4259. <***> Se predice que tTAV se traslada entre 4300-5316, incluyendo el codón de inicio y paro. <223> Secuencia de pLA3604. <***> Las características clave incluyen: 1. Promotor AaActin4 y 5' UTR regula la expresión de ubiquitina-tTAV2. <***> La secuencia derivada de AaActin4 se extiende la posición 5795-2407 (nota: orientación inversa). <***> Se predice que la transcripción alternativamente empalmada empieza en aproximadamente ~4353 (nota: orientación inversa). <***> El primer intrón de AaActin4 (variante femenina del empalme) se extiende a partir de la 2455-4254 (nota: orientación inversa). <***> Se predice la transcripción de Ubquitin-tTAV2 que se traslada desde un codón de inicio dirigido en el primer exón del gen AaAct4 en 4299-4297 (la ubiquitina se extiende 2406-2179; tTAV2 se extiende desde 2178 - 1162); (nota: orientación inversa). <223> Secuencia de pLA364 . <***> Las características clave incluyen: 1. Región de la codificación tTAV insertada en un exón femenino del gen de CodlingDsx. <***> tTAV se extiende la posición 2731-3747 en el gen CodlingDsx. <***> Transcripción Dsx-tTAV alternativamente empalmada inicia en el segmento derivado de hsp70 (el fragmento hsp70 se extiende a partir de 4811-4940). <***> Se predice que la transcripción del tTAV se translada entre 2731-3747, incluyendo el codón de inicio y de paro (nota: orientación inversa). <223> Secuencia de pLA3570. <***> Las características clave incluyen: 1. Región de la codificación tTAV insertada en un exón femenino del gen de PBX-Dsx. <***> tTAV se extiende la posición 2336-3352 <***> La transcripción Dsx-tTAV alternativamente empalmada inicio en el segmento derivado hsp70 (fragmento hsp70 se extiende 4683-4812). <***> La transcripción del tTAV se predice que va a ser trasladada entre 2336-3352, incluyendo el codón de inicio y de paro (nota: orientación inversa). <223> Secuencia de pLA1118 (SEQ ID NO.49). <***> Las características clave incluyen: 1. Región de codificación tTAV con el intrón insertado de Cetra. <***> El intrón de Cetra es de la posición 3905-2561 en el tTAV (nota: orientación inversa). <***> La transcripción del tTAV alternativamente empalmada inicia en el segmento derivado hsp70 en la posición 4217 (el fragmento hsp70 se extiende desde 4260-4131); (nota: orientación inversa). <***> La transcripción tTAV F1 se predice que va a ser trasladada entre 4040 - 1679 (nota: orientación inversa). <***> Característica incluida: 1. Intrón Adh dentro de la transcripción prevista de F1 de la posición 4118-4049 (nota: orientación inversa). <223> Secuencia de pLA3077 (SEQ ID NO. 50). <***> Las características clave incluyen: 1. Región de codificación tTAV con el intrón insertado de Cetra. <***> El intrón de Cetra es de la posición 3975-2631 en el tTAV (nota: orientación inversa). <***> La transcripción del tTAV alternativamente empalmada inicia en el segmento derivado hsp70 en la posición ~4217 (el fragmento hsp70 se extiende desde 4260-4131); (nota: orientación inversa). <***> La transcripción tTAV F1 se predice que va a ser trasladada entre 4039 - 1678, incluyendo el codón de inicio y de paro (nota: orientación inversa). <***> Característica incluida: 1. Intrón Adh dentro de la transcripción prevista de F1 de la posición 4117-4048 (nota: orientación inversa). <223> Secuencia de pLA3097 (SEQ ID NO. 51). <***> Las características clave incluyen: 1. Región de codificación tTAV con el intrón insertado de Cetra. <***> El intrón de Cetra es de la posición 3282-1938 en el tTAV (nota: orientación inversa). <***> se predice que la transcripción del tTAV alternativamente empalmada inicia en el segmento derivado hsp70 en la posición -3382 (el fragmento hsp70 se extiende desde 3425-3296); (nota: orientación inversa). <***> tTAV F1 va a ser trasladada entre 3285 - 924. incluyendo el codón de inicio y de paro (nota: orientación inversa). <223> Secuencia de pLA3097 (SEQ ID NO. 52). <***> Las características clave incluyen: 1. Región de codificación tTAV2 con el intrón insertado de Cetra. <***> El intrón de Cetra es de la posición 3289-1945 en el tTAV2 (nota: orientación inversa). <***> La transcripción de tTAV2 alternativamente empalmada inicia en el segmento derivado hsp70 en la posición -3389 (el fragmento hsp70 se extiende desde 3432-3303); (nota: orientación inversa). <***> |_a transcripción tTAV2 F1 se predice que va a ser trasladada entre 3285 - 931. incluyendo el codón de inicio y de paro (nota: orientación inversa). <223> Secuencia de pLA3014 (SEQ ID NO. 53). <***> Las características clave incluyen: 1. Región de codificación del ubi-reaper[KR] con el intrón Cetra insertado. <***> El intrón Cetra está en la posición 3356-4700 en el ubi-reaper[KR]. <***> la transcripción de ubi- reaper [KR] alternativamente empalmada inicia en el segmento derivado de hsp70 en la posición ~ 3234 (el fragmento hsp70 se encuentra a partir de 3191-3320). <***> se predice que la transcripción del ubi-reaper [KR] F1 va a ser trasladada entre 3331-5143, incluyendo el codón de inicio y de paro (ubiquitina se encuentra a partir de 3331-3355, 4701-4948; el reaper [KR] se encuentra a partir del 4949 - 5143). <223> Secuencia de pLA3166 (SEQ ID NO. 54). <***> Las características clave incluyen: 1. Región de codificación del ubi-reaper[KR] con el intrón Cetra insertado. <***> El intrón Cetra está en la posición 9987-8643 en el ubi- reaper[KR]. (nota: orientación inversa). <***> la transcripción de ubi- reaper [KR] alternativamente empalmada inicia en el segmento derivado de hsp70 en la posición ~ 10227 (el fragmento hsp70 se encuentra a partir de 10270-10141). (nota: orientación inversa). <***> se predice que la transcripción del ubi-reaper [KR] F1 va a ser trasladada entre 10126-8359, incluyendo el codón de inicio y de paro (ubiquitina se encuentra a partir de 10126-9988, 8642-8554; el reaper [KR] se encuentra a partir del 8553 - 8359). (nota: orientación inversa). <223> Secuencia de pLA3376 (SEQ ID NO. 55). <***> Las características clave incluyen: 1. región de codificación tTAV2 con el intrón Cetra insertado. 2. región de la codificación tTAV3 con el intrón Bztra insertado. 3. región de la codificación reaper[KR] con el intrón Bztra insertado. <***>EI intrón de Cetra se encuentra desde la posición 3289-1945 en tTAV2 (nota: orientación inversa). <***> El intrón de Bztra se encuentra desde la posición 5981-5014 en tTAV3 (nota: orientación inversa). <***> El intrón de Bztra se encuentra desde la posición 16391-17358 en el reaper[KR]. <***> la transcripción de tTAV2 alternativamente empalmada inicia en el segmento derivado de hsp70 en la posición ~ 3389 (el fragmento hsp70 se encuentra a partir de 3432-3303). (nota: orientación inversa). <***>la transcripción de tTAV3 alternativamente empalmada inicia en el segmento derivado de sry-alfa en la posición ~ 3389 (el fragmento sry-alfa se encuentra a partir de 6243-5999). (nota: orientación inversa). <***> la transcripción de reaper[KR] alternativamente empalmada inicia en el segmento derivado de hunchback en la posición ~ 16339 (el fragmento hunchback se encuentra a partir de 16289-16372). (nota: orientación inversa). <***> se predice que la transcripción de tTAV2 F1 va a ser trasladada entre 3292-931, incluyendo el codón de inicio y de paro (nota: orientación inversa). <***> se predice que la transcripción de tTAV3 F1 va a ser trasladada entre 5984-4006, incluyendo el codón de inicio y de paro (nota: orientación inversa). <***> se predice que la transcripción de reaper[KR] F1 va a ser trasladada entre 16385-17550, incluyendo el codón de inicio y de paro (nota: orientación inversa). <223> Secuencia de pLA3342 (SEQ ID NO. 56). <***> [_as características clave incluyen: 1. región de codificación tTAV con el intrón Cetra insertado. 2. región de la codificación reaper[KR] con el intrón Cetra insertado. <***>EI intrón de Cetra se encuentra desde la posición 3282-1938 en tTAV (nota: orientación inversa). <***> El ¡ntrón de Cetra se encuentra desde la posición 5488-4180 en el reaper[KR]. (nota: orientación inversa). <***> la transcripción de reaper[KR] alternativamente empalmada inicia en el segmento derivado de hunchback en la posición ~ 5540 (el fragmento hunchback se encuentra a partir de 5590-5507). (nota: orientación inversa). <***> la transcripción de tTAV alternativamente empalmada inicia en el segmento derivado de hsp70 en la posición ~ 3382 (el fragmento hsp70 se encuentra a partir de 3425-3296). (nota: orientación inversa). <***> se predice que la transcripción de reaper[KR] F1 va a ser trasladada principalmente entre 4088-5494, incluyendo el codón de inicio y de paro (nota: orientación inversa). <***> se predice que la transcripción de tTAV F1 va a ser trasladada principalmente entre 924-3285, incluyendo el codón de inicio y de paro (nota: orientación inversa). <223> Secuencia de pLA1172 (SEQ ID NO. 106). <***> Las características clave incluyen: 1. región de codificación tTAV ente los fragmentos derivados de AaActin4. <***> Los fragmentos derivados de AaActin4 se encuentan desde 7868-11257 y 12366-13100. <***> se predice que la transcripción de tTAV va a ser trasladada principalmente entre 11342-12358, incluyendo el codón de inicio y de paro <***> se predice que la transcripción de AaActin4 inicia en la posición ~9312. <***>AaActin4 contiene un intron (variante de empalme tipo femenino) desde la posición 9403-11204. <223> Secuencia de pLA1038 (SEQ ID NO. 12). <***> Las características clave incluyen: 1. región de codificación del fragmento de NippIDm ("nipper") con el intrón Cetra insertado con la secuencia exónica tra flanqueante <***> El intrón de Cetra se encuentra desde la posición 3365-4709 en nipper. <***> El intrón Ccctra es flanqueada por la secuencia exónica Cetra en las posiciones 3343-3364 y 4710-4729. <***>la transcripción de nipper alternativamente empalmada inicia en el segmento derivado de hsp70 en la posición ~ 3243 (el fragmento hsp70 se encuentra a partir de 3200-3329). <***> se predice que la transcripción de nipper F1 va a ser trasladada principalmente entre 3340-5014, incluyendo el codón de inicio y de paro. <223> Secuencia de pLA3054 (SEQ ID NO. 158). <***> |_as características clave incluyen: 1. región de codificación del fragmento de DsRed-ubi-tTAV con el intrón Cetra insertado con la secuencia exónica tra flanqueante <***> El intrón de Cetra se encuentra desde la posición 3509-2165 en DsRed-ubi-tTAV. <***> El intrón Ccctra es flanqueada por la secuencia exónica Cetra en las posiciones 3531-3510 y 2164-2145. (nota: orientación inversa). <***>la transcripción de DsRed-ubi-tTAV alternativamente empalmada inicia ya sea en el segmento derivado de hsp70 en la posición ~ 3245 (el fragmento hsp70 se encuentra a partir de 4930-4801) o en el segmento derivado de Opie2 en la posición ~ 4353 (el fragmento Opie2 se encuentra a partir de 4795-4255) (nota: orientación inversa). <***> se predice que la transcripción de DsRed-ubi-tTAV F1 va a ser trasladada principalmente entre 4320-888, incluyendo el codón de inicio y de paro (DsRed es de 4212-3538; ubiquitina se encuentra desde 2135-1908; tTAV se encuentra de 1907-888). (nota: orientación inversa). <223> Secuencia de pLA3056 (SEO. ID NO. 159). <***> |_as características clave incluyen: 1. Región de codificación del fragmento de DsRed-ubi-tTAV con el intrón Cetra insertado con la secuencia exónica tra flanqueante <***> El intrón de Cetra se encuentra desde la posición 3731-2387 en DsRed-ubi-tTAV. (nota: orientación inversa). <***> f£| ¡ntrón Ccctra es flanqueada por la secuencia exónica Cetra en las posiciones 3753-3732 y 2386-2145. (nota: orientación inversa). <***>la transcripción de DsRed-ubi-tTAV alternativamente empalmada inicia ya sea en el segmento derivado de hsp70 en la posición>~ 5109 (el fragmento hsp70 se encuentra a partir de 5152- 5023) o en el segmento derivado de Opie2 en la posición ~ 4575 (el fragmento Opie2 se encuentra a partir de 5017-4477) (nota: orientación inversa). <***> se predice que la transcripción de DsRed-ubi-tTAV F1 va a ser trasladada principalmente entre 4542-888, incluyendo el codón de inicio y de paro (DsRed es de 4434-3760; ubiquitina se encuentra desde 2135-1908; tTAV se encuentra de 1907-888). (nota: orientación inversa). <***> Característica incluida: 1. intron adicional derivado del gen Cetra (segundo intron de la transcripción Cetra F1) dentro de la transcripción F1 predicha de la posición 2222-2168 (nota: orientación inversa). <223> Secuencia de pLA3488 (SEO. ID NO. 160). <***> Las características clave incluyen: 1. Región de codificación de . TurboGreen-ubi-DsRed con el intrón Cetra insertado. <***> El intrón de Cetra se encuentra desde la posición 2263-3607 en TurboGreen-ubi-DsRed. <***> La transcripción alternativamente empalmada de TurboGreen-ubi-DsRed comienza en el segmento derivado del baculovirus AcMNPV leí (inmediato anterior 1) en la posición ~1180 (el fragmento de leí es de la posición 580 a 1209). <***> Se precide que la trascripción TurboGreen-ubi-DsRed F1 será transladado entre 1311-4467, incluyendo al codón de inicio y paro (TurboGreen se encuentra desde 1311-2093; enlazante SG4 se encuentra desde 2094-2123; ubiquitina se encuentra desde 2124-3696, incluyendo intrón Cetra; DsRed se encuentra desde 3697-44-67). <***> Característica incluida: 1. Intrón adicional derivado del gen Drosophila scraps ("intron serps") dentro de la transcripción F1 predicha desde la posición 1224-1286. <223> Secuencia de pLA3596 (SEQ ID NO. 145). <***> Las características clave incluyen: 1. Región de codificación de TurboGreen-ubi-DsRed2 con el intrón Cetra insertado. <***> El intrón de Cetra se encuentra desde la posición 5947-7291en TurboGreen-ubi-DsRed2. <***> La transcripción alternativamente empalmada de TurboGreen-ubi-DsRed2 comienza en el segmento derivado del baculovirus AcMNPV leí (inmediato anterior 1) en la posición -4864 (el fragmento de leí es de la posición 4264-4893). <***> Se precide que la trascripción TurboGreen-ubi-DsRed2 F1 será transladada entre 4995-8148, incluyendo al codón de inicio y paro (TurboGreen se encuentra desde 4995-5777; enlazante SG4 se encuentra desde 5778-5807; ubiquitina se encuentra desde 5808-7380, incluyendo intrón Cetra; DsRed2 se encuentra desde 7381-8151). <***> Característica incluida: 1. Intrón adicional derivado del gen Drosophila scraps ("intron scrps") dentro de la transcripción F1 predicha desde la posición4908-4970. 2. Mutación aminoácida pretendida comparada a LA3488 en la posición 7294-7296.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un sistema de expresión de polinucléotido que comprende: cuando menos una secuencia polinucleótida heteróloga que codifica a una proteína funcional, definida entre un codón de inicio y un codón de paro, y/o polinucleótidos para el ARN de interferencia (ARNi), que va a ser expresado en un organismo; cuando menos un promotor ligado operativamente; y cuando menos una secuencia de control de empalme que en cooperación con un spliceosoma, es capaz de (i) mediar el empalme de un trascripto de ARN de la secuencia codificante para dar un primer producto de ARN mensajero empalmado (mARN) y (ii) mediando cuando menos un empalme alternativo de la transcripción de ARN para producir un producto de mARN empalmado alternativo; en el cual cuando la cuando menos una secuencia polinucleótida heteróloga codifica a una proteína funcional, cuando menos uno de los productos de mARN maduros comprenden un marco de lectura abierto (ORF) que se extiende desde el codón de inicio al codón de paro, definiendo una proteína que es la proteína funcional, o está relacionada a la proteína funcional por medio de cuando menos una deleción de aminoácido y que es funcional cuando se traslada y opcionalmente ha sido sometido a una modificación post-traslacional; la medición se selecciona del grupo consistente de: mediación específica al sexo, mediación específica a la etapa, mediación específica a la línea germinal, mediación específica al tejido, y sus combinaciones.
2. Un sistema de expresión de polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1 , en el cual la medición es específica al sexo.
3. Un sistema de expresión de polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el cual la secuencia polinucleótidaque va a expresarse comprende dos o más exones de codificación para la proteína funcional.
4. Un sistema de expresión de polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anterores, en el cual la proteína es un marcador, o tiene un efecto letal, dañino o esterilizante.
5. Un sistema de expresión de polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 4, en el cual la la proteína tiene un efecto letal que da como resultado la esterilización.
6. Un sistema de expresión de polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 5, en el cual el efecto letal de la proteína puede suprimirse condicionalmente.
7. Un sistema de expresión de polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 4, en el cual la proteína se selecciona del grupo consistente de un factor de inducción de la apoptosis, Hid, Reaper (Rpr) y NippIDm.
8. Un sistema de expresión de polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual el sistema comprende cuando menos un mecanismo de retroalimentación positivo, siendo cuando menos una proteína funcional que va a expresarse diferencialmente por medio de empalme alternativo y cuando menos un promotor del mismo, en donde un producto de un gen que va a expresarse sirve como un factor de control de transcripción positivo para cuando menos un promotor, y en donde el producto o la expresión del producto es controlable.
9. Un sistema de expresión de polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 8, en el cual un refuerzo se asocia con el promotor, el producto genético sirve para elevar la actividad del promotor por medio de refuerzo.
10. Un sistema de expresión de polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 9, en el cual el factor de control es el producto genético tTA o su análogo, y en donde uno o más unidades operadores teto está enlazado de forma operable con el promotor y su reforzador, tTA o su análogo sirven para mejorar la actividad del promotor via tetO.
11. Un sistema de expresión de polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual la propia proteína funcional es una transactivador de transcripción tal como el sistema es tTAV que consiste de tTAV, tTAV2 o tTAV3.
12. Un sistema de expresión de polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anterores, en el cual el promotor pueda ser activado por medio de condiciones ambientales, por ejemplo la presencia o ausencia de un factor particular tal como tetraciclina en el sistema tet o por medio de la variación de la temperatura ambiental.
13. Un sistema de expresión de polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el cual promotor se selecciona del grupo consistente del es el promotor srya especifico al embrión o sus homólogos, el gen de Drosofila slow as molasses (slam) o sus homólogos.
14. Un sistema de expresión de polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que además comprende un refuerzo.
15. Un sistema de expresión de polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual la medición del empalme alternativo es específico al sexo y la secuencia de control de empalme se deriva de un intrón tra.
16. Un sistema de expresión de polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 15, en el cual el control de empalme alternativo se deriva del gen transformador Cetra de la mosca del mediterráneo, o de otro ortólogo u homologo del gen transformador de Drosofila.
17. Un sistema de expresión de polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 16, en el cual el otro ortólogo u homologo del gen transformador de Drosofila es de una mosca de la fruta tefritida.
18. Un sistema de expresión de polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 17, en el cual la mosca de la fruta tefritida es C, rosa o B. zonata.
19. Un sistema de expresión de polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en el cual la secuencia de control de empalme se deriva del mecansimo de empalme alternativo del gen Actin-4.
20. Un sistema de expresión de polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 19, en el cual el gen Actin-4 es de Aedes spp.
21. Un sistema de expresión de polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 19, en el cual el gen Actin-4 es de Aedes aegyti AeActin-4.
22. Un sistema de expresión de polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en el cual el mecanismo de empalme comprende cuando menos un fragmento del gen doublesex (dsx) preferente el que se deriva de Drosofila, B. morí, gusano rosa, polillas de las manzanas, o un mosquito, en particular /Aedes gambiae o especialmente /Aedes aegypti.
23. Un sistema de expresión de polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 19-22, en el cual la secuencia de control de empalme y la secuencia polinucléotida heterologa que codifican una proteína funcional definida entre un codón de inicio y un codón de paro, y/o los polinoculéotidos para la interferencia con ARN (ARN1), que van a ser expresados en un organismo se proveen en la forma de una construcción de minigen o un exón de cartucho.
24. Un sistema de expresión de polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 4, en el cual el sistema es un plásmido o una construcción seleccionada del grupo consistente de cualquiera de las figuras 16-18, 22- 24, 26-32, 49, 52-55, y 61-69, y/o SEQ ID NOS. 46-48, 50-56, 143-145 y 151-162.
25. Un sistema de expresión de polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual la cuando menos una secuencia de control de empalme es intrónico y comprende en su extremo 5' un nucleótido de guanina (G), en ARN.
26. Un sistema de expresión de polinucleotido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual la cuando menos una secuencia de control de empalme es intrónico y comprende en su extremo 5' nucleótidos UG y UT en su extremo 3', en ARN.
27. Un sistema de expresión de polinucleotido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual la mediación es específica al sexo y es mediada o controlada adicionalmente al enlazar la proteína TRA o el complejo TRA/TRA, o sus homólogos
28. Un sistema de expresión de polinucleotido de acuerdo con la reivindicación 27, en el cual el sistema comprende una secuencia de consenso: TCWWCRATCAACA (SEQ ID No. 1), donde W = A o T y R = A o G.
29. Un sistema de expresión de polinucleotido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual el organismo es un mamífero, un pez, un invertebrado, un artrópodo o un insecto o planta.
30. Un sistema de expresión de polinucleotido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual el organismo es un insecto del orden de los dípteros.
31. Un sistema de expresión de polinucleotido de acuerdo con la reivindicación 30, en el cual el insecto es una mosca de fruta de tefiritida seleccionada del grupo consistente de mosca del mediterráneo (Ceratitis capitata), preferentemente mosca mex (Anastrepha ludens), preferentemente mosca de fruta oriental (Bactrocera dorsalis), mosca de la oliva (Bactrocera oleae), mosca del melón (Bactrocera cucurbitae), mosca de la fruta de Natal fly (Ceratitis rosa), mosca de la cereza (Rhagoletis cerasi), mosca de la fruta de Queensland (Bactrocera tyron'í), mosca del fruto del durazno (Bactrocera zonata) mosca de la fruta caribeña (Anastrepha suspensa) o mosca de la fruta de las Indias occidentales (Anastrepha obliqua).
32. Un sistema de expresión de polinucleotido de acuerdo con la reivindicación 30, en el cual el insecto es un mosquito de los géneros Stegomyia, Aedes, Anopheles o Culex.
33. Un sistema de expresión, de polinucleotido de acuerdo con la reivindicación 32, en el cual el mosquito se selecciona de Aedes aegypti, Stegomyia albopictus, Anopheles stephensi, Anopheles albimanus y Anopheles gambiae.
34. Un sistema de expresión de polinucleotido de acuerdo con la reivindicación 30, en el cual el insecto se selecciona del grupo consistente de el gusano del nuevo mundo (Cochliomyia hominivorax), el gusano del viejo mundo (Chrysomya bezziana) y la mosca australiano del ganado lanar (Lucilia cuprina). Lepidópteros y coleópteros también se prefieren, especialmente se prefieren en particular polillas, incluyendo polilla de manzana (Cydia pomonella), y el gusano de la seda (Bombyx mori), el gusano rosa (Pectinophora gossypiella), la polilla diamante (Plutella xylostella), la polilla gitana (Lymantria dispar), el gusano naranja (Amyelois transitella), barrenador de ramas de durazno (Anarsia lineatella) y el barrenador del tallo del arroz (Tryporyza incertulas), también las polillas nocturnas, especialmente Heliothinae. Entre los coleópteros, el escarabajo japonés (Popilla japónica), escarabajo rayado (Graphognatus spp.), gorgojo (Anthonomous grandis), gusano de raíz de maíz (Diabrotica spp) y gusano de la papa de Colorado (Leptinotarsa decemlineata).
35. Un sistema de expresión de polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 30, en el cual el insecto no es una Drosofilida.
36. Un sistema de expresión de polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual la expresión de una secuencia polinucleótida heteróloga conduce a una consecuencia fenotípica en el organismo. .
37. Un sistema de expresión de polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 31 o 2, en el cual la secuencia polinucleótida que va a expresarse comprende polinucleótidos para el ARN de interferencia (ARNi).
38. Un método para el control de la población de un organismo en un medio natural, el cual comprende: i) criar una reserva del organismo, el organismo que porta un sistema de expresión de gen que abarca un sistema según las reivindicaciones 1 a 36 que es un sistema genético letal dominante, i¡) distribuir los animales reserva en el ambiente en una zona para el control de población ; y iii) log rar el control de la población por medio de la letalidad en las etapas tempranas por medio de la expresión del sistema letal en el descendiente resultante del cruce de los individuos de esa reserva con los individuos del sexo opuesto de la población nativa .
39. Un método de acuerdo con la reivi ndicación 38 , en el cual la letalidad a edad tem prana es embrionaria o antes de la madu rez sexual .
40. Un método de acuerdo con la reivi ndicación 39 , en el cual la letalidad a edad temprana ocurre al in icio del desarrollo.
41 . U n método de acuerdo con la reivi ndicación 38 o 39, en el cua l el efecto letal del sistema es cond icional y ocurre en el ambiente natural por medio de la expresión de u n gen letal , la expresión del gen letal está bajo el control de una proteína transactivadora reprimible, la crianza se realiza bajo condiciones permisivas en la presencia de una sustancia , la sustancia está ausente del ambiente natural y es capaz de repri mir al transactivador.
42. Un método para el control biológ ico, q ue comprende: i) la crianza de una reserva de los organismos macho y hembra transformados con el sistema de la expresión según las reivindicaciones 1 a 36 bajo condiciones permisivas, permitiendo la sobrevivencia de machos y de hem bras, para proporcionar u n agente de control biológico de sexo dual; ii) opcionalmente antes del siguiente paso que impone o que permite que las condiciones restrictivas causen la muerte de individuos de un sexo y proporcionando un agente de control biológico de un solo sexo que abarca a individuos del otro sexo que portan el sistema genético letal condicional; iii) liberar del agente de control biológico del sexo dual o de un solo sexo en el ambiente en un lugar específico para el control biológico; y iv) alcanzar el control biológico con la expresión del sistema genético en descendientes resultantes del cruce de los individuos del agente de control biológico con los individuos del sexo opuesto de la población nativa.
43. Un método de separación del sexo que incluye: i) crianza de una reserva de organismos masculinos y femeninos transformados con el sistema de expresión según las reivindicaciones 1 a 36 bajo condiciones permisivas o restrictivas, permitiendo la supervivencia de machos y de hembras; y ii) eliminar las condiciones permisivas o restrictivas para inducir el efecto letal del gen letal en un sexo y no en el otro por medio del empalme alternativo específico al sexo del gen letal.
44. Un método para el control biológico o de la población; i) crianza de una reserva de organismos masculinos y femeninos transformados con el sistema de expresión según las reivindicaciones 1 a 36 bajo condiciones permisivas o restrictivas, permitiendo la supervivencia de machos y de hembras; ii) eliminar las condiciones perm isivas o restrictivas para inducir al efecto letal del gen letal en un sexo y no en el otro por empalme alternativo específico al sexo del gen letal q ue produzca la separación del sexo; iii) esteri lizar o parcialmente esteri lizar a los ind ividuos separados y iv) obtener el control a través de la liberación de los individuos estériles o parcialmente estériles sepa rados dentro del ambiente natu ral del organismo. RES U M E N Se provee un sistema de expresión de polinucleótidos que es capaz de empalmar de forma alternativa los transcriptos de ARN de una secuencia de polinucleótidos que van a expresarse en un organismo.