CN107426986A - 一种培育雄性不育库蚊的方法 - Google Patents

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Abstract

通过敲除其转化体‑2基因可以培育都是雄性的库蚊种群，造成X染色体精子功能障碍，从而产生严重的雄性后代偏向。不同于以往的方法，我们最近发现Tra 2敲除还导致雌性特异性合子死亡(XX)。这种技术也因此被用于杀死可能在以前的敲除过程中存活下来的早期雌性合子(XX)，只有当向食品和饮料中添加一种抗菌物质时才能产生都是雄性的后代。抗生素曝光时间的严格限制允许蚊子适应沃尔巴克氏体细菌以生存下来。所选的沃尔巴克氏体细菌可能诱发胞质不相容性(CI)达到100％。因此在自然的环境中，所有转基因后代都是雄性，与被另一个沃尔巴克氏体品系感染的雌性(双向CI)异交或未感染雌性(单向CI)杂交时导致不育。

Description

一种培育雄性不育库蚊的方法
技术领域
本发明涉及一种培育雄性不育库蚊的方法，以用作防蚊措施。
背景技术
一种发明用于控制昆虫种群的方法被称为“昆虫不育技术”或SIT，该方法一直被视为有效的、具有种属特异性并且环保的害虫种群控制方法。SIT法可通过辐射或不育剂培育雄性不育昆虫，将其释放至自然栖息地，雄性不育昆虫将在自然栖息地本能地寻找雌性进行交配。当长期释放出大量的不育雄性时，可能导致自然昆虫种群崩溃，甚至灭绝1-3。
使用SIT法的一个例子是，人们利用该方法已经成功消灭了美国南方各州、墨西哥和中美洲各国的新大陆螺旋蝇(Cochliomyia hominivorax)4。
由SIT法培育的昆虫需要接受雌雄鉴别，以排除雌性个体；这是因为，如果释放包含不育雌性的大量昆虫，他们将会寻找血餐，并且可能传播疾病(对于蚊子)或造成水果腐败(对于苍蝇)5。
然而以物理方式区分种群中的雄性昆虫非常费力；此外，这样做会导致小型昆虫受伤，例如蚊子(未公布数据)。蚕采用另一种方法进行性别鉴定，易位染色体片段连接在性染色体上为不同卵色进行编码的基因上，但蚊子体内不存在这样的标记6-7。
与野生雄性相比，通过辐射或化学药剂产生的突变体通常伴随有雄性交配竞争力显著下降，这可能会导致涉及释放雄蚊的控制策略失效。此刻社会最关心的是，昆虫遗传修饰技术还不够先进，不足以替代SIT法。这是因为通过繁殖交配进入野生蚊子体内的转基因可能导致意外后果。一旦发生这种情况，弥补不良后果变得非常困难，甚至是不可能逆转的5。
很多SIT试验都曾经释放过蚊子。在这些情况下，虽然这些方案不足以在非隔离区域产生效果，但一般能够观察到对产卵不育性和野生种群密度的适度影响。这种失效是由于三个主要因素导致的：(1)由于缺少性别鉴定，产生的雄性数量不足以用于释放；(2)雄性健康状况下降和(3)外来种群进入释放区域；在继续进行新的SIT试验之前，急需解决这些问题5。
在缅甸，人们利用沃尔巴克氏体-诱导的致倦库蚊细胞质不亲和性(CI)对SIT进行了改进。当被沃尔巴克氏体感染的雄性与被另一种沃尔巴克氏体菌株感染的雌性或未受感染的雌性交配时，发生CI(双向CI)。这个项目使用经过CI绝育的雄性蚊子，可以快速灭绝致倦库蚊8的隔离种群。虽然这似乎是进行病媒生物控制的有效方法，但在实施大规模释放计划之前清除大量雌性个体的成本高昂。此外，如果在没有非隔离区域没有足够的雄性可供释放，当然控制计划会失败。
O Neill提供了一种方法，可以使没有以自然方式获得沃尔巴克氏体的蚊子感染新的沃尔巴克氏体9。此方法包括在蚊子细胞株中培养沃尔巴克氏体并将其注入蚊子胚胎的步骤。据称这种新的转染方法能够保护宿主免受病原体感染同时还能改变宿主的一些生物学特性。为了在病媒生物控制中实施此方法，发明者需要将雌性蚊子释放到自然栖息地，因为沃尔巴克氏体仅通过生殖传播。
Dobson提出了一种将新的沃尔巴克氏体转染至蚊子体内的微注射方法，通过胚胎细胞质转移，从宿主转移至非宿主物种10。该方法使用CI作为控蚊工具，将感染沃尔巴克氏体的雄性蚊子释放至尚未以自然方式感染沃尔巴克氏体的蚊子种群。该方法需要在释放之前以机械方式分离雌性蚊子。
Asburner等公开了转化带有外源DNA的昆虫物种的方法11。这些方法为生产转基因物种提供了新的途径。
DeVault等12,13发明了一种两段式方法，对SIT流程进行了改进；通过稳定插入雌性特异性启动子以表达致死基因，对昆虫的性别进行区分。该方法可以成功地杀死雌性并获得全部是雄性的种群。然后可以通过辐射或化学处理对雄性进行绝育，并释放到环境中。然而，通过辐射或化学处理对雄性进行绝育可能导致雄性健康状况显著下降，这意味着需要释放比简单模型所预测数量多得多的雄性。蚊子群体中的50％是雌性；与能够产生100％雄性的方法相比，该方法设计用于杀死雌性以获得50％的雄性。
Bello等14评估了Tet-off四环素调控基因表达系统在果蝇体内的效果，采用的方法是通过表达四环素控制的反式激活蛋白(tTA)生成转基因株系，在胚胎和幼虫发育过程中采用特异表达模式。ANTP的条件表达对果蝇胚胎会产生致命的影响。该研究者指出，通过促进tTA表达的调控序列和四环素，可以分别在空间上和时间上密切监控四环素诱导启动子控制下的基因表达。这为创建用于控制昆虫体内基因表达的多功能二元系统及其潜在应用提供了基础。
为了避免辐射损伤，一种名为RIDL(释放携带显性致死基因昆虫)的新方法已经被申请专利15，16。RIDL由显性致死基因产生杀伤力并利用四环素抑制反式激活蛋白(tTA)来控制类似于Bello所使用基因的表达(见上面的例子)。显性致死基因的调控系统需要使用Tet-off系统。在实验室饲养条件下，当存在四环素或强力霉素(物质)时，可以保持允许条件。如果物质被清除，该体系将会被激活并导致死亡。高效抑制RIDL系统首先在果蝇模型中展示，然后是地中海果蝇。在伊蚊中，RIDL已被证明是有效的，与野生雄性相比，人工培育的雄性蚊子没有显示出任何健康状况下降17,18。
然而，RIDL的现场试验受到很多居民和环保人士的坚决反对，他们对释放数以百万计的转基因蚊子(由于在性别鉴定步骤中的识别错误，每个试验中包括0.5％的雌性蚊子)感到不安。此外，RIDL后代中约3％甚至可以在存在四环素(TET)或强力霉素(Dox)的情况下存活下来；这显示出转基因蚊子通过繁殖交配进入野生蚊子会出现发生不可预知后果的风险19。
Heinrich和Scott报道20了同时使用RIDL系统和Tet-off系统进行生物防治，以果蝇为模型系统，实现雌性特异致死，其中蛋黄蛋白1(YP1)启动子用于驱动雌性特异tTA，并将TRE增强子与细胞死亡基因—头部退化缺陷基因(hid)连接起来。
Fu等21结合了RIDL系统和来自埃及伊蚊的内源性雌性特异性肌动蛋白-4启动子。tTA蛋白质在飞行肌中的过度表达可以通过Tet-off系统进行调控，并导致雌性失去飞行功能。性别鉴定问题由此得到解决，存活的雄性后代可以将转化基因传递给下一代，但是，这种方法有其不足之处；雄性仍然携带无法飞行的基因，需要食用不含四环素的食物，与野生雄性相比，用于飞行的时间减少21％22。此外，当大量不会飞行的雌性蚊子仍停留在水面上时，它们的身体和腿的动作可能妨碍其他雄性的羽化，使雄性最终被淹死。由于这个原因，在工业养虫室中，以高密度饲养是唯一的选择。此外，经转化的雄性将转基因物质传递至自然群体，这被认为是违反了卡塔赫纳生物安全议定书的生物多样性方针。
Hoang和Hoang23提出了一种方法，以转基因方式获得全部为雄性的库蚊群体。该专利申请利用了我们对库蚊中转换基因-2的研究结果；具体地，敲除该基因导致带有X染色体的精子死亡。在这种情况下，我们建议通过早期精子特异性启动子(例如β2)24促进Tra-2RNAi干扰基因的构建。该RNAi将通过胞质桥被分配至所有精母细胞和精子细胞；因此没有X染色体的精子才能存活下来。通过该方法创建的所有雄性都具有繁殖能力，因此遗传系统可以通过Tet-off系统调控；其中没有激活杀死精子的物质(因此产生的都是雄性)。用这种方法产生的遗传性别鉴定菌株可产生都是雄性的群体，从而直接用于病媒生物控制策略。简单地说，这种方法可以确保不会产生雌性后代，仅获得雄性后代。当此类Tra-2 RNAi的遗传结构受到四环素抑制反式激活蛋白控制并链接到Y染色体时，将产生超级孟德尔式分离并建立人工调节减数分裂驱动系统。事实上，这种方法利用了Tra-2调节模式以创建人工减数分裂驱动系统。由于该物质被移除，在其他染色体的位置插入也会导致全部为雄性后代。该系统可以在较短时间内完成目标群体的敲除。在缺少这些物质时，将出现性别偏向比。
该方法具有不希望出现的缺点，因此长时间存在争议；即释放时它可能会导致群体灭绝，由于自身的自驱动机制，甚至整个物种灭绝。通过这种减数分裂驱动方式，转基因材料将被传递给自然群体，这可能违反卡塔赫纳生物安全议定书。
将Tet-on系统用于生物控制的实际用途尚未得到实施。在这个“Tet-on”系统中，基因表达取决于是否存在多西环素，在果蝇中也曾出现这一结果。该系统的优点包括更迅速地控制转基因诱导，因为Tet-off系统可能需要数天从生物体中清除Tet或Dox14，25。
在另一方面，为了诱导CI绝育，如果需要将上述RIDL或其它遗传性别鉴定系统与沃尔巴克氏体重新组合，实际应用起来将是极为困难的，因为如果不杀死昆虫体内的共生细菌，在存在Tet或Dox(Tet-off系统)的情况下，在实验室允许条件保持昆虫细胞系是很困难的26。
在使用上述方法的蚊虫控制领域，同时需要避免上述问题。
本发明提供了克服这些问题的方法。
发明内容
本发明提供了一种培养全部为雄性不育库蚊群体的方法。这个Tra-2 RNAi系统是由Tet-on系统控制。只有向转换基因-2敲除遗传系统提供一种物质之后，才能使培育的蚊子全部为雄性，这也是转染到一个或多个不同沃尔巴克氏体共生菌中。选定的沃尔巴克氏体与自然蚊子群体中已经存在的类型不同。雄性与野生雌性杂交繁殖后导致不育，可直接用于蚊虫控制。
本发明利用两个发现：1)当Tra-2基因被敲除时，带有X染色体的精子被杀死(Hoang和Hoang，2012)23。这一发现与Tet-off关闭系统结合使用，可以获得都是雄性个体的后代群体23。然而，该系统的缺点是具有自驱动性，如果连接到Y染色体，将导致群体灭绝。我们在本发明中将该系统23与Tet-on相结合，收集带有未激活Tra-2 RNAi系统的所有雄性后代；2)我们最近发现，当从库蚊中敲除Tra-2基因时，早期雌性合子(XX)也被杀死。第一个发现以前已经用于开发转基因生产上述全部为雄性库蚊的方法23。本发明与已有技术的关键区别是，在这种遗传方式的调控系统中，我们设计为只有只能当存在指定物质(Tet-on系统)时才有杀伤作用，而针对雌性的杀伤作用也出现在早期受精卵阶段。该Tet-on系统的唯一物质是多西环素，这意味着该方法的允许条件是不含有该物质，当向转化体昆虫中加入该物质时，将出现都是雄性的后代。这种策略不需要为了进行基因性别鉴定连续保持Dox条件。该Tra-2敲除基因系统由Tet-on系统，仅在存在Dox的条件下表达，因此该转基因在自然环境将沉默。
本发明之前使用Tet系统的所有方法都是利用自然环境中不存在Tet或Dox，在通过Tet-off调控机制在自然环境中激活蚊子的遗传致死系统。在释放之前，在实验室存在抗菌素的条件下连续培养转基因生物也意味着生物体中没有细菌(如内共生沃尔巴克氏体)可以存活，可以在生物生存，此外，如果目标是在将此后代用于特定目的之前获得仅一个性别的后代，可以使用相反的调节系统(Tet-on系统)来实现调控技术。在这样的情况下，只有当遗传系统的反式激活蛋白被激活并且使用者希望收集所需性别的后代时，才需要使用该物质。因此这个策略将减少添加到食品中的物质的成本。此外，这种方法还可以减少Dox通过废弃食物或饲料对自然环境造成污染的风险，这种污染可能导致更强的微生物抗药性。
如果没有Dox，本发明中的昆虫在实验室或自然环境中都会产生正常性比的后代，因此Tra-2敲除遗传系统是沉默的，不会产生造成食物链污染风险的转基因蛋白。在生物体的自然环境中，不会存在Dox。增加控制条件允许Tra-2敲除遗传系统的表达。当Tra-2敲除遗传系统被激活时，带有X染色体的精子和早期雌性受精卵被杀死，从而获得的都是雄性。
本发明第二个最重要的方面是，在Tet-off系统中，必须连续为昆虫喂食Tet或Dox。遗传性别品系昆虫长期接触抗生素会消灭昆虫中可能包含所有内共生细菌。白纹伊蚊中的一些沃尔巴克氏体可以耐受较高浓度的抗生素，但是这不适用于其他昆虫26。该Tet-on系统适用于此Tra-2 RNAi系统，仅需在开始形成精母细胞的第三幼虫期阶段和最后一代成年阶段之间要求存在Dox，以获得全是雄性的后代，同时通过抗生素去除沃尔巴克氏体要求至少处理一个离散世代。用于激活和保持Tet-on系统的物质浓度范围很广，在1毫克/升至1000毫克/升之间25。对于我们创建的Tra-2 Tet-on系统，30毫克/升能够在12小时之内显著诱导敲除(更多内容查看实施例)。同时，为了从昆虫中清除沃尔巴克氏体，需要将125毫克Tet/升用于两个不连续世代的果蝇27，最多要5000毫克/升，用于一个世代白纹伊蚊26(10-15天)。因此Tet-on雄性后代的沃尔巴克氏体是安全的，需要经过2-3天的蛹期，以及两天达到成熟期。
如果雄性昆虫体内没有沃尔巴克氏体，或与自然种群中的不同，则会诱发胞质不兼容(CI)。一些研究报告，在创建新的沃尔巴克氏体转染蚊子品种之后，出现CI和母婴传播的概率接近100％28，29。合适的沃尔巴克氏体能引起完整CI并使与该雄性交配所有的野生雌性失去生育能力。该Tra-2敲除系统/Tet-on雄性可以简单地与所需的被感染雌性杂交，创建携带沃尔巴克氏体的基因性别鉴别品系，从而导致与野生雌性交配时产生完整的CI。通过成体直接显微注射法，Tra-2敲除系统/Tet-on系也可以用作转染所需沃尔巴克氏体的材料。
本发明获得的雄性可以用于种群控制；它们会过交配传递遗传系统，他们也可以潜在地与野生雄性进行交配竞争。“Tra-2敲除系统/Tet-on以及沃尔巴克氏体”雄性分布在环境中可以启动蚊子生物和遗传控制方法，但目前该系统还没有传播至蚊子自然种群的风险。
在另一个方面，TaRA-2敲除系统/Tet-on品系也可以用于辐射或化学不育处理。这提供了蚊子的SIT提供了新的出口。在蚊子和沃尔巴克氏体品种的某些组合中，当Ci(100％)不完整时，这种策略加强了不育性。
该不育雄性可用于控制自身物种，但对于异地的近亲物种，这些雄性可以与其他物种的雌性交配，由于交配后的生殖隔离导致不育。这可以在埃及伊蚊和白纹伊蚊之间进行，因为目前为止尚未有这些物种之间基因渗入的报道。
通过本发明的研究，我们不排除使用Tet-off调控获得雄蚊的创造可能性23。使用Tet-off调控在所有发育阶段将致死基因表达为RIDL，完全限制了在存在抗生素的条件下携带沃尔巴克氏体的基因品种。在Hoang和Hoang23提供的方法中，精子特异性启动子用于促进tTA基因的表达，以调控反式激活蛋白系统。这个特定的启动子与其他启动子相比的优点在于，它仅需要有限的许可条件时间(精母细胞形成的第三幼虫期和成年期之间)。然而，在这些条件需要在每一代进行重复，导致他们携带沃尔巴克氏体的风险较高。该沃尔巴克氏体在昆虫中的密度对可能导致的CI水平起到至关重要的作用。每一代接触抗生素可以降低沃尔巴克氏体密度和CI。可获得具有生育能力的雄性，并携带该Tra-2 RNAi/Tet-off系统进入自然环境。使用沃尔巴克氏体转染品种作为背景材料来改造Tra-2 RNAi/Tet-off系统，需要通过PCR检查每一代的一系列样品中是否存在沃尔巴克氏体。针对该问题的解决方案，在释放之间，将带有Tra-2 RNAi/Tet-off的雄性与所需的上一代沃尔巴克氏体转染雌性杂交。这需要在杂交之前进行一个另外的性别鉴定步骤以清除沃尔巴克氏体转染雄性。与使用沃尔巴克氏体转染品种改造Tra-2敲除系统/Tet-on品系相比，成本和时间都大大增加(当使用者需要在该方法中收获所有雄性时，仅需将该物质添加到食物中喂给转染的转化体品系)。
现在，我们已经发现了控制蚊子的新方法，适用于不同的昆虫和库蚊。任何具有Tra-2遗传物质的昆虫，类似于白纹伊蚊，埃及伊蚊或库蚊等昆虫，杀死带有X染色体的精子和早期雌性受精卵，在他们的Tra-2敲除时，都可以采用这种方法。Tra-2敲除遗传系统/Tet-on品系和完整沃尔巴克氏体诱导CI生产各种不育雄性，可用于控制方案。当不使用沃尔巴克氏体诱导CI或CI未完成时，辐射或化学不育提供了另一种选择。虽然在性别鉴定步骤之后使用辐射具有进一步的缺点，但可以严密防止转基因材料进入自然环境。与杀死50％后代以保留所需性别的方法相比，该Tra-2敲除遗传系统/Tet-on可以用一半的时间提供所需的全部雄性12，13，21。这种遗传系统，因此可以与任选的辐射或化学绝育剂一起使用。
RIDL和上述其他性别鉴定系统必须在自然环境中表达自己的遗传系统，以完成杀死一个或两个性别的任务。他们唯一的选择就是在他们的监控系统中使用Tet-off。在允许条件下，在实验室条件下正常饲养的生物体对于沃尔巴克氏体具有毒性，因此使得二者的结合既成本高昂，难度也高。抗生素的使用也比较昂贵，而且有可能增加在自然环境中的抗生素耐药性。在本发明中，使用Tet-on系统不需要使用所述物质，因此沃尔巴克氏体可以组合以诱导CI绝育。本发明提供了一种更便宜，更安全，更方便的昆虫生物控制方法。
附图说明
图1垂直方向平行位置的部分可以交换，以组装不同的Tet-on+Tra-2 RNAi构建体。示意图中说明了A的创建。Tra-2长dsmRNAi构建体；E。Tra-2 shRNA构建体；F。Tra-2 miRNA构建体和G。多个Tra-2构建体可以过表达该基因。所有的构建体都通过Tet-On机制进行反式激活30。B.昆虫早期合子启动子可用于表达反式激活蛋白。C.rtTA或tTS可以根据不同情况选择使用。D.这导致分别使用pTre-tight或pTRE-MOD/U6。
图1垂直方向平行位置的部分可以交换，以组装不同的Tet-on+Tra-2 RNAi构建体。A.可产生长dsmRNAs，已完成的Tet-On+Tra2-RNAi系统示意图；B.昆虫早期合子启动子可用于表达反式激活蛋白；C.在不同遗传背景下，tTS可以与rtTA交换；D.昆虫U6最小启动子可以用来表达短发夹RNA和miRNA；E.shRNA结构；F.mRNA结构；G.整个Tra-2 cDNA可用于Tra-2蛋白的过度表达
图2Tra-2在不同Dox浓度诱导的Tet-on转基因株系中的不同敲除水平(结果来自实施例10中的实验)。
SEQ ID:No 1
CAAGACGAAGGTTTCCCGAGGGTTCGGATTCGTGTACTTCCAGGAACAGAGTGCGACCACCGAAGCCAAAATGCAGTGTAATGGAATGATGCTGCATGAGCGCACGATTAGAGTGGATTATTCGGTGACCGAAAGACCGCATACGCCCACGCCCGGTGTCTACATGGGAGCTAGAAGCACTGAGAAACGGAAGCACCGCAGTTCCTATAGCTACAGGAGACGGAGCTATGATGACGATTACCATCATCGGCGGTCAAGACGCAGCAGATCTCGTTCCTGTCATCATCACCGTAGATCTAGTCATCGCCATCACCATCGACGTGACCGTGCTCGTGATCGTTCTCCATCTTATTCCTCAGTTGACTCACGTCGATCCTATCGATAATGTGCTAGAAGGATTGTGTTTTTGACGTAAGTCATCTTTTTCAAGACCTCACGAAGACCCTACAAACAAAGAAGTTCAAGTCAAGTATTATTGAAGATAGAATCTGTATCAGTAAAAACTATTCTTCAAATGACACAAGGGAAGAACAGATTACTCTTCATTAATCCAAGGGTAAATTGTATGTAGCTAACCGTTCTGTTTTTCTTTTCGTTTCAGGATGTTTGGATTTCTTCACATTTTAGAGAACTAGTTTTCATTATTCCGCGATTCAAACTAAACATTTTATTTATTTATTAGTTAAAGATCGTGTGGTTATGAAATGTCGTTTGTGCAACCATTAACCAAAAATAAGGGATTGCTAAAAAAAAA
SEQ ID:No 2
TGCCAAGACGAAGGTTTCCCGTGGGTTCGGATTCGTGTACTTCCAGGAGCAGAGTGCGGCCACCGAAGCCAAAATGCAGTGCAATGGGATGATGCTGCATGAGCGCACGATTAGAGTGGATTATTCGGTGACCGAAAGACCGCATACGCCCACGCCCGGTGTCTACATGGGAGCTAGAAGCACTGAGAAACAGAAGCACCGCAGTTCCTATAGCTACAGGAGACGGAGCTATGATGACGATTACCATCATCGGCGGTCAAGACGCAGCAGATCTCGTTCCTGTCATCACCATCGTAGATCTAGTCATCACCATCGCCATCGACGTGACCGTGCTCGTGATCGTTCTCCATCTTATTCCTCAGTTGACTCACGTCGATCCTATCGATAATGTGCTAGAAGGATTGTGTTTTTGATGTAAGTCATCTTTTTCAAGACCTCACGAAGACCCTACAAACAAAGAAGTTCACGTCAAGTATTATTGAAGATAGAATCTGTATCAGTAAAAACTACTCTTCAAATGACACAAGGGAAGAACAGATTACTCTTCATTAATCCAAGGGTAAATCATATGTAGCTAACCGATCTGTTTTTCTTTTCGTTTCAGGATGTTTGGATTTCTTCACATTTTAGAGAACTAGTTTTCATGGTTCCGCGATTCAAACTAAACATTTTATTTATTTATTAGTAAAAGATCGTGTGGTTATGAAATGTCGTTTGGGCAACCATTAACCAAAAATAAGGGATTGCTAAAAAAAAA
序列ID1是在雄性中发现的Tra-2mRNA，而序列ID2为主要在雌性中发现的Tra-2。序列ID1被用来创建构建体以将多个Tra-2基因座引入伊蚊基因组。
具体实施方式
本发明中的Tra-2敲除遗传系统包含Tra-2 RNAi的核心结构，其类似于在我们在先发明中所公开的内容23，但与调控组件相比，本发明为Tra-2敲除遗传系统与其它现有概念的组合提供了新的途径。在本发明中，Tet-on系统被用于反式激活Tra-2基因敲除核心结构。在本发明中，针对雌性的杀伤作用用于不仅在带有X染色体的精子中表达，而且由不同启动子在早期受精卵阶段表达。本发明所创建的基因株也可以包含不同的启动子或其他基因敲除系统。
Hoang和Hoang23发现，库蚊中Tra-2基因的敲除导致带有X染色体的精子死亡。我们最近发现，Tra-2敲除还导致早期雌性受精卵(XX)死亡。这些雌性受精卵来自某些带有X染色体的精子，这些精子在精子发生过程中存活下来。我们设计了特异性早期合子启动子敲除Tra-2并杀死早期雌性合子。并不是所有情况都需要这种方法，根据RNAi构建体的插入位点和物种，一些Tra-2 RNAi基因性别鉴定株可以在精子发生过程中杀死多达100％的带有X染色体的精子，仅留下部分雌性幸存者。本发明公开了使用昆虫精子特异性启动子来调节Tet-on系统的方法，这会让带有X染色体的精子在某些物质存在时死亡。与此同时，我们利用昆虫早期合子特异性启动子来驱动Tet-on系统。这将对所有从之前的精子敲除和胚胎繁殖中逃脱的X染色体精子产生杀伤作用。这种杀伤仅在存在此物质时发生。
本发明中的Tra-2敲除遗传系统可以定义为通过生物转化子-2基因减少基因表达的遗传技术。敲除试剂可以表达为一种或多种Tra-2 RNAi基因结构[长DsRNA(siRNA)，shRNA]31，其产生的双环状mRNA束带有最小长度的互补部分，该长度可能小于19个碱基对。所述敲除试剂可以是一个或多个microRNA遗传构建物的表达，其中所述补充部分是来自mRNA Tra-2基因的3’UTR或5’UTR序列。另一方面，Tra-2基因的敲除可以是很多基因转化过度表达的结果，这些基因包含整个Tra-2转录区，和下游的大约1000个核苷酸的侧翼区。所述Tet-on调控部分可以附着到所需Tra-2转化体的启动子，多西环素可用于诱导该基因的表达。在本发明中，详细提供了在存在Dox的情况下创建遗传构建体以转录长DsRNAs(siRNA)，但是我们不排除上述技术的实用性，可用于沉默Tra-2基因导致的雌性特异性死亡。
本发明中的所述Tra-2敲除遗传系统可以是来自白纹伊蚊，伊蚊，致倦库蚊或其它库蚊的Tra-2基因的Tra-2编码序列(mRNA)的任何一部分，能够对各个物种的Tra-2基因产生敲除(干扰)效应。我们不排除这种可能性，即来自某些库蚊物种并包含Tra-2重组序列的Tra-2 RNAi系统也能对其它近亲蚊子物种产生敲除(干扰)效应。mRNA Tra-2基因的3’UTR或5’UTR序列不排除能够用于miRNA基因结构以沉默基因。任何昆虫显示的Tra-2遗传都类似于在白纹伊蚊或埃及伊蚊中发现的遗传，使用本方法敲除他们的Tra-2基因时，杀死带有X染色体的精子和早期雌性受精卵。
在本发明中，Tet-On先进激活蛋白(Clontech)中首先设计成由昆虫精子特异性启动子控制。对于这种驱动基因，可以选择不受数量限制的候选启动子(Bam,nanos,aly和β2)24。这种复杂性带来的是集成的TRE基表达载体(例如，pTre-Tight)，它在存在系统诱导剂的条件下表达了Tra-2敲除遗传系统，例如多西环素。
对带有X染色体精子的杀伤率优选为90％以上。在该系统最好的情况下，带有X染色体精子100％死亡，因此产生100％的雄性后代。对带有X染色体精子的杀伤作用取决于Tra-2敲除系统在基因组中的插入位置，以及选定启动子在目标物种遗传背景下的异位表达。产生小于100％雄性后代的遗传品系接受第二Tra-2敲除系统的处理，其中，所述Tet-On反式激活蛋白由早期合子启动子驱动。我们更希望所有早期雌性受精卵在胚胎期或孵化后很快死亡。早期合子启动子被用于此Tra-2敲除，例如AaKLC2启动子或其直系同源物32。我们不排除其他昆虫早期合子启动子可用于本发明。
本发明中公开的Tra-2敲除系统可以驻留在一个或不同的染色体上。当使用长DsmRNAs(siRNA)沉默Tra-2时，RNAi核心结构是类似的，但用于驱动Tet-On反式激活蛋白的启动子可能与精子或早期合子表达不同。如果所述miRNA技术被选择用于沉默Tra-2基因，Tra-2 mRNA的3’UTR或5’UTR序列可以插入miRNA骨架。这促进了miRNA的表达，并且不需要异位启动子。过量表达技术使用相同的启动子驱动Tet-On，但核心遗传结构是整个Tra-2转录区，以及距离大约1000个核苷酸的下游侧翼区(3’UTR)。
敲除系统的表达与特定精子相关，并可能延长到早期合子阶段。该Dox诱导Tet-On需要在初步形成精母细胞的第三幼虫期和成虫期之间进行。早期合子敲除可以通过收集浸泡在所需浓度Dox中滤纸上的卵细胞来诱导。在这种诱导条件下，调控卵细胞三天可以杀死从前述精子敲除中存活下来的所有带有X染色体的受精卵。与需要在整个生命周期中使用大量抗生素的Tet-Off系统相比，这种方法可以节约大量成本。因此，这种方法减少了微生物对Dox的耐药性。
我们更希望选择合适的昆虫精子特异性启动子，它可以激活Tra-2 RNAi构建体并在所有精子细胞中产生dsmRNA，从而杀灭所有带有X染色体的精子。基本上，不同的精子特异性启动子可用于改变带有X(m)染色体精子的功能障碍比率，以重新调整性别比例。这些雄性是携带Y染色体的遗传雄性。在存在Dox的情况下，用这种方法获得的雄性失去生育能力，但产生仅带有Y染色体的精子。
我们优选的是，Tra-2敲除构建体可以位于任何染色体，杂合子或纯合子，一个或多个基因座，然而，我们可以分别根据不同的目的利用该系统。
我们建议含有单个插入转基因的转基因株，可以用作另一个转化的背景。同一染色体上发生的第二次转化将是特别优选的。在同一染色体上发生的两次转化将防止连续世代被隔离，并且在两个或更多个Tra-2位点在相同物种中存在(如在白纹伊蚊和埃及伊蚊)的情况下将特别有价值，其中需要进行两次RNAi转化以抑制两个基因座(或等位基因)。
本发明公开了所有的创建所需要的方法Tra-2敲除DNA构建，将其改造成虫，并观察其表现。该构造的生产可能会长dsmRNAs，shRNA(RNA干扰)或miRNA，其中有一个共享的中心生物部分用于沉默Tra-2。本发明中所述的Tra-2 RNAi系统的可以使用Tra-2编码序列的任何部分，包括Tra-2 mRNA基因的5’和3’非翻译区(多个),来自白纹伊蚊，埃及伊蚊，致倦库蚊或其他库蚊，能够对各物种的Tra-2基因产生敲除(干扰)作用。我们不排除这种可能性，即来自某些库蚊物种并包含Tra-2重组序列的Tra-2 RNAi系统也能对其它近亲蚊子物种产生敲除效应。本发明范围也适用于Tra-2或Tra-2同源敲除导致X染色体精子和早期雌性受精卵死亡的任何昆虫物种，因此具有与库蚊相似的性别决定基因。敲除也可以通过过表达获得，因为Tra-2基因可拷贝到目标物种的基因组。最后，合适的昆虫精子特异性启动子需要用于驱动四环素-调控反式激活蛋白系统，以开启和关闭干扰影响。如果需要，可以使用早期合子启动子。
在第一种方法中，本发明使用源自Tra-2基因mRNA的cDNA序列，用于DNA操控。在使用长dsmRNAs或短发夹RNA的情况下(shRNA)，这可以获得siRNA(19-25bp)用于沉默Tra-2，该材料可以创建与Hoang和Hoang所提到材料相同的核心结构23。区别在于，Hoang和Hoang23使用Tet-Off来调节并表达在该物种的自然栖息地的系统，而本发明采用的Tet-On和敲除系统在自然环境中是沉默的。
Hoang和Hoang报道了该Tra-2基因序列或其同源物23。详细内容为：假定使用来自白纹伊蚊，玻里尼西亚斑蚊，致倦库蚊或其他库蚊(埃及伊蚊)的转化体-2编码基因序列或其直系同源物作为原料，使用重组DNA技术组装Tra-2 RNAi遗传构建物。
采用RACE或MARATHON试剂盒(Clontech公司)可以获得所述Tra-2基因序列或其直系同源物作为完整的mRNA序列。
在“本发明的实施例”中，部分或整个RRM(RNA识别基序)使用了来自白纹伊蚊，玻里尼西亚斑蚊和致倦库蚊的Tra-2编码序列。通过Blastn将果蝇Tra-2氨基酸序列与埃及伊蚊GenBank数据库对比，以识别埃及伊蚊的所述Tra-2。其结果是，AAAEL004293-RA蛋白属于supercontig 1.113(埃及伊蚊-Vectorbase)。埃及伊蚊与白纹伊蚊和玻里尼西亚斑蚊是近亲。从AAAEL004293-RA序列衍生的引物也可用于扩增这些蚊子的Tra-2的序列。与Tra-2基因直系同源体中相似度最高的区域是长度为240bp的RRM(RNA识别模体)。这些引物在许多伊蚊属体内经过测试并能成功扩大了240bp的区域。我们发现了两个RRM基因座(或等位基因)；每一个都存在于白纹伊蚊和玻里尼西亚斑蚊体内。它们之间的氨基酸差异差异为10％并被命名为SEQ ID:No 1(RRM1)和SEQ ID:No 2(RRM2)(图5,Hoang和Hoang23)。该序列被录入GenBank，所述RRM序列的登录号是RRM1(KJ147318，KJ147321，KJ147316和KJ147314)和RRM2(KJ147317，KJ147320和KJ147315)。为了敲除这两个基因座(等位基因)，可能需要将不同RNAi构建体转化为每一个物种以抑制各个RRM基因座(等位基因)。
通过将RRM1和RRM2序列与致倦库蚊数据库进行对比，可以确认推定的致倦库蚊Tra-2基因。supercontig 3.780:5008-5247的结果命名为CPIJ016646。库蚊Tra-2基因同源物的RRM被命名为SEQ ID:No 3(RRM3)(图5，Hoang和Hoang23)。取自RRM3区域始端和末端的引物已在多种其它库蚊属体内经过测试，并能成功扩大这些240bp的区域。
为了利用RNAi技术敲除白纹伊蚊，玻里尼西亚斑蚊，致倦库蚊和其它类型蚊子的Tra-2基因，本发明提供了三种解决方案。
·第一个解决方案是使用SEQ.ID：1(RRM1)为材料，创造体外的RNAi内核序列1。这是结合RRM1的两个相同序列的重组DNA片段，但朝向相反。两个RRM1重复片段之间的连接是直链内含子，或连接子DNA序列。所述RNAi内核序列1，然后用反式激活蛋白和调控元件和内荧光标记物连接piggyBac质粒。然后将该质粒转入白纹伊蚊和白纹伊蚊以敲除其RRM1基因。
用于内核序列的调控元件是与操纵子序列(tetOx7)相关的最小启动子。最小启动子以及tetOx7可使用市售转化激活蛋白调控系统(Clontech公司)制成。tTA蛋白质与位于最小启动子内的四环素应答元件(TRE)结合，导致基因表达被激活。
为了优化表达，本发明建议使用昆虫精子特异性启动子来控制tTA的蛋白的表达。我们也倾向于从昆虫精子特异性启动子提取最小启动子，用于控制所述RNAi内核序列1，这有助于避免发生渗透。此解决方案可以用于任何其它伊蚊属，其中有与RMM1高度相似的RRM序列，或获得自己的后Tra-2用相同的引物对的RRM序列。
第二解决方案是使用SEQ ID：No 2(RRM2)作为原料，以创建体外RNAi内核序列2。这是结合两个相同RRM2列获得的重组DNA片段，但都是处于相反方向。两个RRM2重复片段之间的连接是直链内含子或连接子的DNA序列。所述RNAi内核序列2然后与调控元件和荧光标记物在piggyBac质粒中连接。然后可将该质粒转入白纹伊蚊和玻里尼西亚斑蚊以敲除其RRM2基因位点。
在细节上，在第二解决方案中的调控元件与第一解决方案中的相同。此解决方案可以被应用于任何其它具有与RMM2相比高度相似的RRM序列，或通过相同引物对获得自己Tra-2RRM序列的伊蚊属。
·第三解决方案是使用SEQ.ID:No 3(RRM3)为原料体外创建RNAi内核序列3。这是结合两个相同RRM3列获得的重组DNA片段，但都是处于相反方向。两个RRM3重复片段之间的连接是直链内含子或连接子的DNA序列。所述RNAi内核序列3然后与调控元件和荧光标记物在piggyBac质粒中连接。然后该质粒可用于转入致倦库蚊。在细节上，在第三解决方案中的调控元件与所述第一和第二解决方案中描述的相同。此解决方案可以被应用于任何其它具有与RMM3相比高度相似的RRM序列，或通过实施例中所述引物获得的Tra-2序列的任何其它库蚊属。两个Tra-2 RRM反向重复片段之间的结缔组织或内含子可以是任何真核内含子序列；然而，来自目标物种的内含子是优选的。结缔组织连接子或内含子的长度可以从几个到几百个核苷酸。我们优选将GT和AG两个核苷酸分别插入内含子或连接子的始端和末端。这些是剪接体的加强信号，用于识别和拼接结缔组织内含子或连接子。本发明提供了三个DNA内核序列，Tra-2 RNAi RRM-1，Tra-2 RNAi RRM-2，Tra-2 RNAi RRM-3作为使用Tra-2 DNA序列以对各个物种产生干扰作用的实施例。含有两个相同反向重复DNA内核结构的转录将产生mRNA单链，从而在其末端露出两个互补序列。互补序列将结合在一起形成双链发夹mRNA结构(dsRNAi)，其中所述循环部分由内含子或接头形成。蚊子细胞识别该异常结构并通过防御机制切割所述dsRNA，然后破坏完整内源性单链Tra-2 mRNA33,34。从而将该Tra-2基因敲除。
如果所需的敲除效应的目标是获取shRNA构建体，从Tra-2或其同源mRNA序列中选取19bp的目标序列，排除5’和3’的mRNA非翻译区。除了使用Tet-on预先产生的rtTA蛋白调控长dsmRNA转录，转录沉默融合蛋白(tTS或tTR)是由市售质粒(PT3813-5Clontech)创建以调控shRNA基因座的操作子。我们优选使用来自pTremod的改性四环素应答启动子(pTremod/U6)和质粒中人U6启动子(PT3811-5Clontech公司)的U6启动子序列，用于替代对应于目标物种的U6昆虫或特定启动子。
如果需要从miRNA构建体中获得所需的敲除效应，从Tra-2或其同源物的3’(5’)mRNA非翻译区中获得19-25bp的序列用于创建miRNA构建体。rtTA或tTS可以与pTre-Tight或p TRE-MOD/U6分别结合使用。
我们不排除rtTA/pTre-Tight，tTs/pTre-mod/U6或其他调控系统可以互换，以表达包括长dsmRNAs，shRNA或miRNA在内的RNAi系统，以沉默Tra-2或其在所述昆虫物种体内的直系同源物。含有19bp的tet操作子序列的36bp直接重复序列(tetO)的数量可以根据各个情况进行修改，以增强调控。
不同的启动子可以用于驱动RNAi系统，然而，我们优选使用昆虫精子启动子，例如来自果蝇的Bam-2,nanos,aly,β2，或来自冈比亚按蚊的β2。这些启动子专门驱动精子发生中的Tra-2 RNAi干扰系统，当部分精子在敲除和卵子受精之后存活时，可以杀死带有X染色体的精子。我们执行了进一步转化，将早期受精卵子(例如AaKLC2启动子)用于驱动rtTA/pTre-Tigh或tTS/pTre-mod/U6系统。
一些定义：
·库蚊是指具有一对尺寸类似，但是可区别的染色体，C-中间带异染色质存在X(m)或不存在Y(M)的蚊子物种35。
·来自库蚊的Tra-2基因序列指mRNA的编码序列，仅包括5’和3’非编码区36。
·所述RNAi内核序列指任何重组DNA序列，它包括与连接子或内含子(环)序列结合的两个反向重复序列(IR)。IR序列来自库蚊Tra-2 mRNA序列的任何一部分。
·我们定义Tra-2 RNAi内核序列为RNAi编码序列，其表达受到阻遏反式激活蛋白系统的控制。
·我们定义Tra-2微RNA序列为使用内源性miRNA特异性骨干的人工miRNA，用于携带来自Tra-2 mRNA的3’或5’UTR的目标序列。
实施例：获得全是不育雄性的昆虫群体
实施例1创建Tet-on系统以表达长dsmRNA，敲除Tra-2及其同系物或直系同源物
I.组件：该构建体的示意图如图1A所示。1/RRM Tra-2序列：在这些实施例中，我们使用了三种类型的RRM(RRM1，RRM2和RRM3)来创建Tra-2 RNAi内核结构。这些序列来自目标物种测序或blasting(http://www.vectorbase.org/)。一些序列被列入GenBank。对于RRM序列的登录号为：KJ147314；KJ147315；KJ147316；KJ147317；KJ147318；KJ147319；KJ147320；KJ14732。本发明涵盖了使用白纹伊蚊，埃及伊蚊，玻里尼西亚斑蚊，致倦库蚊或任何其他库蚊的Tra-2基因序列。质粒的其它组件是相同的。2/果蝇β2微管蛋白启动子(或其他昆虫精子启动子)：通过PCR获得果蝇脱氧核糖核酸。3/反式激活蛋白组件30(pTet-On在高级质粒-rtTA)：Clontech公司。4/调控子组件：pTre-tight质粒(Cat.No.631059)-Clontech公司。5/报告基因：http://piggybac.bio.nd.edu/.6/piggyBac质粒：http:// piggybac.bio.nd.edu/.7/辅助质粒：http://piggybac.bio.nd.edu/.
II.来自白纹伊蚊和玻里尼西亚斑蚊的RRM
白纹伊蚊，玻里尼西亚斑蚊，埃及伊蚊或其他库蚊中(伊蚊属)都曾鉴定出Tra-2的RRM序列，Hoang和Hoang对此进行了详细说明23。该RRM1和RRM2序列可以来自GenBank(KJ147314；KJ147315；KJ147316；KJ147317；KJ147318；KJ147319；KJ147320；KJ14732)。下面第一个实施例显示了用于创建DNA重组RNAi内核序列的方法，该方法可通过Tra-2 RRM序列获得长dsmRNA并构建Tet-On调控系统。
RRM1 DNA序列
5’AGTAAGTGCCTCGGTGTGTTCGGCCTAAGCAGCTACACCAACGAAACCAGCCTGATGGACGTTTTCGCACCGTACGGAACCATTGACAAGGCGATGATTGTCTACGATGCCAAGACGAAGGTTTCCCGNGGGTTCGGATTCGTGTACTTCCAGGAGCAGAGTGCGGCCACCGAAGCCAAAATGCAGTGYAATGGNATGATGCTGCATGAGCGCACGATTAGAGTG GATTATTCGGTGACC-3’
RRM2 DNA序列
5’AGTAAGTGCCTCGGTGTGTTCGGCCTNAGYAGCTAYACCAMCGAARCCARCCTGATGGAYGTNTTCKCNCCGTWCGGNACCATHGACAAGGCNATGATTGTCTACGATGCCAAGACGAAGGYNTCCCGNGGGTTYGGNTTCGTGTAYTTCCAGGAGCAGAGTKCGGCCACNGARGCCAAAMTGCAGTGYAAYGGAATGRWRCTGCAYGAGCGNACGATTAGAGTG GATTATTCGGTGACC-3’
RRM1氨基酸序列
1-S--K--C--L--G--V--F--G--L--S--S--Y--T--N--E--T--S--L--M--D-
21-V--F--A--P--Y--G--T--I--D--K--A--M--I--V--Y--D--A--K--T--K-
41-V--S--R--G--F--G--F--V--Y--F--Q--E--Q--S--A--A--T--E--A--K-
61-M--Q--C--N--G--M--M--L--H--E--R--T--I--R--V--D--Y--S--V--T-
RRM2氨基酸序列
1-S--K--C--L--G--V--F--G--L--S--S--Y--T--T--E--T--N--L--M--D-
21-V--F--S--P--F--G--T--I--D--K--A--M--I--V--Y--D--A--K--T--K-
41-A--S--R--G--F--G--F--V--Y--F--Q--E--Q--S--S--A--T--E--A--K-
61-L--Q--C--N--G--M--E--L--H--E--R--T--I--R--V--D--Y--S--V--T-
(下划线区域表示为引物选择的区域。粗体和下划线字符分别表示核苷酸DNA和氨基酸取代物)。
来自这些RRM1及RRM2区域底部部分(3’)的两个135bp片段用于组装Tra-2 RNAi构建体。因为RRM1及RRM2序列仅在某些区域不同，衍生自序列之外的区域的引物可用于扩增两个RRM。PCR反应在一个25μl反应体系中进行：2.5μL PCR缓冲液；1.5μL氯化镁(25mM)；0.5微升的dNTPs(10mM)；每个引物0.5μL(10pmol/μl)；0.15μl Taq DNA聚合酶(5U/μl)；和10-40ng DNA模板。PCR的温度分布为[94℃/4；(94℃/30”；59℃/30”；72℃/45”)x3；(94℃/30”；57℃/30”；72℃/45”)x3；(94℃/30”；54℃/30”；72℃/45”)x35；72℃/10’].
1-(BA-EX1F)5’CGATCTCGGATCCATGCCAAGACGAAGGTTTCCCGAG 3’
2-(X-Ex1R)5’CGGCAATGACCTCGAGACCGGTCACCGAATAATCCACTCAA 3’
3-(SAL-EX1F)5’GGCGTCAATGTCGACATGCCAAGACGAAGGTTTCCCGAG 3’
4-(ECORI-EX1R)5’CGGACGTTGGAATTCGACGGTCACCGAATAATCCACTCAA 3’
引物1和3，以及2和4，分别类似于前向和反向引物。1和2的组合会产生相同的PCR产物，如图3和4所示。这些PCR产物的唯一的区别在于限制性内切酶序列，该序列被插入引物(下划线)的前部(5’)。这使得PCR产物能够连接到包含在所需方向上具有相同限制性位点的内含子或连接子。如果两个反向重复之间的连接是一个约10bp的连接子，PCR反应可以扩增相同反向引物(2或4)中使用的这些片段，因此该产物包含3’端(XhoI或EcoRI)的相同限制性位点。经过XhoⅠ或EcoRI位酶处理后，两个PCR产物进行反向连接，然而，如果内含子被插入两个反向重复之间，则需要同时使用两个反相引物。两个PCR产物在3’端(XhoI和EcoRI位)具有不同的粘性末端并很容易与终结于XhoI和EcoRI限制性位点的内含子连接。在本发明中，来自任何昆虫的连接子或内含子序列可以用于连接两个反向重复，只要该核苷酸GT和AG分别插入该序列的始端和末端。这些是内含子剪接位点的识别信号。在通过内含子或接头反向连接两个相同的DNA片段之后，这些RNAi的内核序列(1和2)以所需方向接入反式蛋白激活系统，条件是所述反式激活蛋白包含相同的限制性位点。
III.来自致倦库蚊的RRM
Tra-2的RRM序列来自致倦库蚊的基因序列，可在Vectorbase网站获得(http:// www.vectorbase.org/)。用于扩增来自致倦库蚊或从其他库蚊属的序列的方法/过程，如Hoang和Hoang所述23。
RRM3 DNA序列
CGTAACGGAATAGTCCACCCGGATGGTTCGCTCGTGCATTACCATTCCGTTGCACTGCACCTTGGCTGCGGAAGCGTCCTCCAGGTTGACAAAGTACACGAATCCGAACCCGCGGGACGCCTTCGTCTTGGCATCGTACACGATCTGCACCTTCTCGATCAATCCGAACCGGCCAAACACGGTCCTCAGGTCCGCCTCCTGGGTGTAATTGCTGAGGCCAAACACGC CGAGGCAGGTCGA
RRM3氨基酸序列
1–S--T--C--L--G--V--F--G--L--S--N--Y--T--Q--E--A--D--L--R--T-
21-V--F--G--R--F--G--L--I--E--K--V--Q--I--V--Y--D--A--K--T--K-
41-A--S--R--G--F--G--F--V--Y--F--V--N--L--E--D--A--S--A--A--K-
61-V--Q--C--N--G--M--V--M--H--E--R--T--I--R--V--D--Y--S--V--T-
(下划线区域表示为引物选择的区域)。
在致倦库蚊中，整个RRM3序列被用作创建RNAi内核序列，因为3’和5’端的核苷酸序列都适合设计适当的引物。RRM3始端24bp和末端22bp(下划线)被用于创建引物对。这些引物被用于扩增其它库蚊属的Tra-2 RRM 240bp区域，即使是关系较远的物种，例如类似条件下的杂鳞库蚊，淡色库蚊或带喙库蚊。使用相同的PCR条件，在其它条带中扩增了一个240bp条带。使用Qiagen色谱柱对240bp条带进行凝胶提取步骤。该DNA洗脱液在水中稀释10-20倍，并加入1μl作为同一PCR的模板。对特定240bp条带进行扩增并用于组装各物种的Tra-2RNAi构建体。
7-(BA-EX1F)5’CGATCTCGGATCCCGTAACGGAATAGTCCACCCGGAT 3’
8-(X-Ex1R)5’CGGCAATGACCTCGAGACTCGACCTGCCTCGGCGTGTTTG 3’
9-(SAL-EX1F)5’GGCGTCAATGTCGACCGTAACGGAATAGTCCACCCGGAT 3’
10-(ECORI-EX1R)5’CGGACGTTGGAATTCGATCGACCTGCCTCGGCGTGTTTG 3’
PCR反应在一个25μl反应体系中进行：2.5μL PCR缓冲液；1.5μL氯化镁(25mM)；0.5μldNTPs(10mM)；每个引物0.5μL(10pmol/μl)；0.15μl Taq DNA聚合酶(5U/μl)；和10-40ngDNA模板。PCR的温度分布为[94℃/4；(94℃/30”；59℃/30”；72℃/45”)x3；(94℃/30”；57℃/30”；72℃/45”)x3；(94℃/30”；54℃/30”；72℃/45”)x35；72℃/10’].随后，这些PCR产物以相同的方式被处理，如上述的例子中所述的白纹伊蚊，埃及伊蚊和玻里尼西亚斑蚊。将这些片段通过连接子或内含子连接，然后构建此RNAi的内核序列(3)，将其连接到反式激活蛋白质粒以转化致倦库蚊胚胎。
IV.连接RNA干扰内核结构(长dsmRNAs)与pTre-tight抑制子
来自Clontech的所述pTre-tight质粒(Cat.No.631059)与RNAi的内核序列(1或2或3)或者，摩尔比为1：3，在BamHI和SalI限制性酶的存在下进行30μL反应。消化后，通过变性限制酶混合物中加入T4连接质粒进行连接。圆形质粒被转入感受态细胞(DH5αTM衍生物，New England Biolabs公司)，分离和培养过夜以获得每个克隆较大数量的质粒DNA。新质粒的大小是2556kb，加上所述RNAi内核序列的大小。对于来自白纹伊蚊，埃及伊蚊和玻里尼西亚斑蚊的在RRM1及RRM2，每个RRM仅使用135bp，如果使用200bp内含子，质粒的大小约为3026bp。如果使用10bp连接子，所述质粒为约2826bp。对于致倦库蚊，使用整个240bp，因此，如果伴有200bp内含子，所述片段大小为3236bp。如果使用10bp连接子，所述质粒为约3046bp。通过含有HindⅢ和Acc65I酶切位点两个引物，对包括Tre操作子和RNAi内核序列(tetOx7+PminCMV+RNAi内核序列+SV40polyA)的片段进行扩增。这些位点分别可用于与连接piggyBac质粒和构建体的其他部分。
(Tre-HindIII)CGATCTAAGCTTCTCGAGTTTACTCCCTATCAGTGA
(Tre-Acc65I)CGATCTGGTACCAGTCAGTGAGCGAGGAAGCTCGAG
PCR反应在一个25μl反应体系中进行：2.5μL PCR缓冲液；1.5μL氯化镁(25mM)；0.5μldNTPs(10mM)；每个引物0.5μL(10pmol/μl)；0.15μl Taq DNA聚合酶(5U/μl)；和10-40ngDNA模板。PCR的温度分布为[94℃/4；(94℃/90”；54℃/60”；72℃/3min 30”)x35；72℃/10’]。由白纹伊蚊和玻里尼西亚斑蚊中带有10bp连接子的RRMS扩增的PCR产物长度为875bp，同时200bp内含子被引入1065bp产物。由致倦库蚊RRM扩增PCR产物分别为1085bp和1275bp，其中包括分别10bp连接子或200bp内含子。PCR产物通过Acc65I和HindIII消化，由Qiagen柱纯化。该产物然后可用于最终连接。
V.连接果蝇β2精子特异性启动子与反式激活蛋白序列
该果蝇β2微管蛋白启动子序列来自GenBank或http://flybase.org/reports/ FBgn0003889.html。其他昆虫精子特异性启动子序列可以来自Genbank，vectorbase或flybase。如可用，我们优选将内源性启动子用于目标物种。通过该序列设计了包含EcoRI和Apa I酶切位点的两个引物。这些引物扩增来自果蝇基因组DNA的230bp的β2微管蛋白基因的5’UTR。PCR的温度分布为[94℃/4；(94℃/30”；55℃/30”；72℃/45”)x35；72℃/10’]。
β2-ApaI-F CGATCTGGGCCCGGAAATCGTAGTAGCCTATTTGTGA
β2-EcoRI-R CGGACGTTGGAATTCCCTGAATGTGTACAATTTCACGCAT
用两种限制酶EcoRI和HindIII消化该pTet-On高级质粒(Clontech公司，目录号630930)，产生1222bp的条带。然后通过EcoRI限制位点将该DNA片段连接到β2微管蛋白启动子序列，以产生1458bp片段。然后通过β2微管蛋白精子特异性启动子控制rtTA蛋白质的产生。然后使用ApaI消化连接产物，并用Qiagen柱纯化。该产物然后可用于最终连接。
VI.整个质粒组装。
使用来自http://piggybac.bio.nd.edu/的pXL-BacII-ECFP质粒来组装上述所有片段，以完成Tra-2 RNAi构建。该pXL-BacII-ECFP质粒携带一个3xP3启动子，可驱动ECEP报告基因。此报告基因以组织特异性方式表达，受到3xP3启动子的控制。此标记被转入文字，蚊子的眼睛会发出荧光青色。使用ApaI和Acc65I消化所述pXL-BacII-ECFP质粒，由Qiagen柱纯化。线性质粒为5390bp。然后将所述质粒与Tre片段(Ⅲ，实施例1)，以及β2+rtTA片段(Ⅳ，实施例1)混合，摩尔比为1:3:3。T4连接质粒加入到30μl反应中。连接产物用于转入感受态细胞。连接产物的尺寸不同，范围如下：对于白纹伊蚊，埃及伊蚊和玻里尼西亚斑蚊，含10bp的连接子或200bp内含子的两个质粒分别是7723bp和7913bp。同时，致倦库蚊质粒的10bp连接子和200bp的内含子分别为7933bp和8123bp。
实施例2创建Tet-on系统以表达shRNA，敲除Tra-2或其同系物或直系同源物
该构建体的示意图如图1C,D&E所示。
I.组件：当shRNA构建体诱导敲除作用时，有两个选项，tetO-操作子片段(pTre-tight或pTre-mod/U6)和两个反式激活蛋白系统(rtTA-advanced或tTS)分别用于控制表达。1/Tra 2基因序列：在这些实施例中，我们使用Tra-2编码基因序列创建shRNA。这些序列来自目标物种Tra-2 cDNA测序或blasting(http://www.vectorbase.org/)。一些序列被列入GenBank。对于RRM序列的登录号为：KJ147314；KJ147315；KJ147316；KJ147317；KJ147318；KJ147319；KJ147320；KJ14732。本发明涵盖了使用白纹伊蚊，玻里尼西亚斑蚊，致倦库蚊或任何其他库蚊的Tra-2基因序列。质粒的其它组件是相同的。2/果蝇β2微管蛋白启动子(或其他昆虫精子启动子)：通过PCR获得果蝇脱氧核糖核酸。3/反式激活蛋白组件有两个选项(rtTA或tTS)：Clontech公司。4/有两个选项的调控元件：pTre-tight质粒(Cat.No.631059)或pTre-mod/U6(Cat.No.630925),Clontech。5/报告基因：http://piggybac.bio.nd.edu/.6/piggyBac质粒：http://piggybac.bio.nd.edu/.7/辅助质粒：http:// piggybac.bio.nd.edu/.
II.与pTre-tight系统连接
在这种情况下，使用rtTA/pTre-tight系统，源自Tra-2 mRNA的短RNA的19-28bp选定序列，不包括5’和3’UTR，可以进行选择，以形成shRNA寡核苷酸。事实上，来自19bp的片段(GTCTACGATGCCAAGACGA)来自AAEL004293-RA基因的340位至358位(Tra-2 RRM1)，位于埃及伊蚊的supercont1.113，用于创建短的mRNA终端，使用8bp poly A作为终止子。环路(下划线)用作Mcintyre GJ和Fanning GC37。短mRNA序列是[GTCTACGATGCCAAGACGA TTCAAGAGATCGTCTTGGCACGTAGACTTTTTTTT]。这一发夹的两个引物是BamHI-F[GCCGCGGGATCCGTCTACGATGCCAA GACGATTCAAGAGATCGTCTTGGCAT]和Sh2-SalI-R[GCCGCGGTCGACAAAAAAAAGTCTACGATGCCAAGACGAGATGAGGTCG]。整个短发夹中，包括聚腺苷酸在内的长度是55bp。该PCR产物经过Qiagen纯化，并以3：1的比例与pTre-tight质粒混合，由BamHI和SalI消化。T4连接步骤产生了2616bp的质粒。412bp片段包括Tre操作子，使用包含HindIII和Acc65I限制性位点的两个引物扩增shRNA序列(tetOx7+PminCMV+shRNA)。这些位点分别可用于与连接piggyBac质粒和构建体的其他部分。
(Tre-HindIII) CGATCTAAGCTTCTCGAGTTTACTCCCTATCAGTGA
(Tre-Acc65I) CGATCTGGTACCGTCGACAAAAAAAAGTCTACGATG
PCR反应在一个25μl反应体系中进行：2.5μL PCR缓冲液；1.5μL氯化镁(25mM)；0.5μldNTPs(10mM)；每个引物0.5μL(10pmol/μl)；0.15μl Taq DNA聚合酶(5U/μl)；和10-40ngDNA模板。PCR的温度分布为[94℃/4；(94℃/15”；54℃/10”；72℃/30”)x35；72℃/10’].PCR产物通过Acc65I和HindIII消化，由Qiagen柱纯化。该产物然后可用于最终连接。
III.与pTre-mod/U6系统连接
在这种情况下，使用tTS/pTre-mod/U6系统，质粒的启动子被哺乳动物U6启动子的质粒被埃及伊蚊的最小U6启动子代替。通过该黑腹果蝇U6snRNA基因序列(GenBank登录号NR002083)的BLAST搜索来确认埃及伊蚊中推定的U6snRNA基因。在Supercont 1.287：1096905-1097016(AAGE02013372.1)中发现了一个U6同源基因。正向引物被重新设计，以在含有启动子核心序列的54bp最小启动子的上游包括一个NdeI位限制位点，以及TATA[GTAGAAGACTATATAAGAGCAGAGGCAAGAGTAGTGAAATGTCTTTGCTTCGGCGTCTACGATGCCAAGACGATTC AAGAGATCGTCTTGGCATCGTAGACTTTTTTTT]。引物是Sh1-Ndel-F[GCCGCGCATATGGTAGAAGACTATATAAGAGCAGAGGCAAGAGTAGTGAAATGTCTTTGCTTCGGCGTCTACGATGCCAAGACGATTCAAGAGATCGTCTTGGCAT]和反向含有BamHI的位点。Sh2-BamHI-R[GCCGCGGGATCCAAAAAAAAGTCTACGATGCCAAGACGAGATGAGGTCG]。所述PCR产物用BamHI和SalI消化，以产生121bp的片段。所述pSIREN-RetroQ-TetH病媒生物(Cat.630925，Clontech公司)被NdeI和BamHI消化，以除去哺乳动物U6启动子并由含有伊蚊U6和上述短发夹121bp的片段重新结合。该质粒用两个引物进行PCR，TetR-HindIII-F[CGATCT AAGCTTCTTTCGTCTTCACTTGAGTTTACTCCCTA]和TetR-Acc65I-R[CGATCT GGTACCGGATCCAAAAAAAAGTCTACGATGCCAAGACGAG]并产生含Tet-R操作子+Aedes U6最小启动子+shRNA的416bp片段。该片段是可用于最后连接以转录抑制因子(TTS)。
IV.连接果蝇β2精子特异性启动子与pTet-On反式激活蛋白(rtTA)或转录抑制因子(TTS)
这个步骤类似于在实施例1(IV)中使用rtTA的情况。对于tTS系统，需要果蝇β2微管蛋白启动子序列的反向引物以包含XbaI限制位点。其中带有XbaI和Apa I酶切位点的两个引物根据β2序列设计。这些引物扩增了果蝇基因组DNA中β2微管蛋白基因的5’UTR的230bp片段。PCR的温度分布为[94℃/4；(94℃/20”；55℃/15”；72℃/30”)x35；72℃/10’]。
β2-ApaI-F CGATCTGGGCCCGGAAATCGTAGTAGCCTATTTGTGA
β2-XbaI-R CGGACGTCTAGACATCCTGAATGTGTACAATTTCACGCAT
用两种限制酶XbaI和HindIII消化所述tTS质粒(Clontech公司，目录号630925)，产生2021bp的条带。然后通过XbaI限制性位点将所述DNA片段与β2微管蛋白启动子序列连接，以产生2257bp片段。然后用β2微管蛋白精子特异性启动子控制tTS蛋白的产生。然后使用ApaI消化连接产物，并用Qiagen柱纯化。该产物然后可用于最终连接。
V.全质粒组装。
这一步的执行类似于实施例1中所述的上一步。它需要使用骨架Piggybac质粒连接两个操作片段、反式激活蛋白和RNAi操作。使用来自http://piggybac.bio.nd.edu/的pXL-BacII-ECFP质粒来组装上述所有片段，引入完成的Tra-2 shRNA构建物。该pXL-BacII-ECFP质粒携带一个3xP3启动子，可驱动ECEP报告基因。使用ApaI和Acc65I消化所述pXL-BacII-ECFP质粒，由Qiagen柱纯化。线性质粒为5390bp。然后将所述质粒与pTre-tight片段(I，实施例2)，以及β2+rtTA片段(IIⅣ实施例2)混合，摩尔比为1:3:3。在使用tTS系统的其它情况下，所述Piggybac质粒然后与pTre-mod/U6片段(II，实施例2)和β2+tTS片段(III，实施例2)混合，摩尔比为1:3:3。T4连接质粒加入到30μl反应中。连接产物用于转入感受态细胞。连接产物的尺寸不同，范围如下：
对于rtTA系统，Piggybac质粒中的shRNA构建物最终为7248bp。与此同时，tTS系统产生8063bp的产物。这是用于敲除白纹伊蚊中Tra-2基因的shRNA系统。我们在本文中没有以致倦库蚊为例实施构建，然而原理是相同的。
实施例3创建Tet-on系统以表达miRNA，敲除Tra-2或其同系物或直系同源物
该构建体的示意图如图1F所示。
I.组件：当shRNA构建体诱导敲除作用时，有两个选项，tetO-操作子片段(pTre-tight或pTre-mod/U6)和两个反式激活蛋白系统(rtTA-advanced或tTS)分别用于控制表达。1/Tra 2基因序列：在这些例子中，我们使用Tra-2 3’UTR序列创建miRNA[SEQUENCE ID.No1]。这些序列来自目标物种Tra-2 cDNA测序或使用Marathon或RACE套件。本发明涉及使用属于白纹伊蚊，玻里尼西亚斑蚊，致倦库蚊或任何其他库蚊的mRNA Tra 2序列的3’或5’UTR。质粒的其它组件是相同的。2/果蝇β2微管蛋白启动子(或其他昆虫精子启动子)：通过PCR获得果蝇脱氧核糖核酸。3/反式激活蛋白组件有两个选项(rtTA或tTS)：Clontech公司。4/有两个选项的调控元件：pTre-tight质粒(Cat.No.631059)或pTre-mod/U6(Cat.No.630925),Clontech。5/报告基因：http://piggybac.bio.nd.edu/.6/piggyBac质粒：http:// piggybac.bio.nd.edu/.7/辅助质粒：http://piggybac.bio.nd.edu/.
II.人工miRNA创建
人工miRNA是从一个miRNA骨架构建的。我们在果蝇和蚊子之间选择了共同miRNA基团中的miRNAs，但特定表达在白纹伊蚊雄性体内。库蚊的雄性特定表达miRNA可以用于创建人工miRNA。我们不排除使用其他动物miRNA的骨干敲除Tra-2基因的可能性，因为miRNA的跨类群非常保守。对应于成熟aae-mir-932的22bp序列被Tra 2 mRNA 3’UTR完全互补序列代替，生成两个新的miRNA，aae-mir-932-mir-Tra-2.1和aae-mir-932-mir-Tra-2.2。Tra2 mRNA转录的不同位点作为靶点，以尽量减少会阻止miRNA-RISC复合物结合和清除mRNA的二级结构。使用多个miRNA以常见转录为靶点，但位于不同位置，同样限制了单个突变事件(在miRNA或目标序列中)的可能性，这将导致在敲除效率下降。白纹伊蚊microRNA mir-932来自http://www.mirbase.org/，成熟序列搜索自Vectorbase。整个序列存在于supercont1.1064:154096-154190；基因︰AAEL017875。我们的靶点为两个位点，白纹伊蚊Tra 2雄性特定mRNA(序列ID 1)3’UTR的22bp。目标序列为GCGATTCAAACTAAACATTTTA和GATCGTGTGGTTATCAAATGTC。对于第一个目标位点，设计了两个引物。Mi-932-F1.1[CCATAGTACTGACGAAAGATAGCCGTTTCTGTAATCATAGAATAGCTGCGATTCAAACTAAACATTTTATGTGCTTTAGACGAAC]和Mi-932-R1.1[CTGGTATCAATCACACTTGAGATTGTTGATGATCATTGAGAATCGGCGATTCAAACTAAACATTTTAGTTCGTCTAAAGCACA]。两个引物经过PCR处理，以填充两个3’末端并产生152bp片段。对于第二个目标位点，设计了两个引物。Mi-932-F1.2[CCATAGTACTGACGAAAGATAGCCGTTTCTGTAATCATAGAATAGCTGATCGTGTGGTTATCAAATGTCTGTGCTTTAGACGAAC]and Mi-932-R1.2[CTGGTATCAATCACACTTGAGATTGTTGATGATCATTGAGAATCGGATCGTGTGGTTATCAAATGTCGTTCGTCTAAAGCACA].两个引物也经过处理，以产生152bp片段。PCR的温度分布为[94℃/4；(94℃/10”；55℃/5”；72℃/15”)x35；72℃/10’]。这些片段被用作模板以使用在5’和3’方向包含mi-932序列的两对引物扩增两个较大片段。当具有较长侧翼序列时，这一战略提高了人工miRNA效率。与第二对的前向引物相比，初始片段的第一引物对在反向引物上具有相同的限制性位点。这用来连接两个片段，每个都包含一个目标序列，形成有两个发夹环的miRNA分子。第一个扩展片段不包含poly A。该片段的长度是304和334bp。
Mi-932-F2.1-Bam
CGATCTCGGATCCCCTATCTTAAAATATAAACTAATCAAACGAATAGTGATCACCAGAGCATTACCTAAAAAATGTTGAGAAATTTTCCATAGTACTGACGAAAGATAG
Mi-932-R2.1-Eco-RI
CGGACGTTGGAATTCGTGTTGCCATGTCATCATTTTTTGTTGAACATCCACTGACTGGCGTTTATCGATTGTCATTCACTTCTGGTATCAATCACACTT
Mi-932-F2.1-Eco-RI
CGGACGTTGGAATTCCCTATCTTAAAATATAAACTAATCAAACGAATAGTGATCACCAGAGCATTACCTAAAAAATGTTGAGAAATTTTCCATAGTACTGACGAAAGATAG
Mi-932-R2.1-SalI
GGCGTCAATGTCGACTGACTCCATTCCATTTTCTTTTTGTTCCTCGTGTTGCCATGTCATCATTTTTTGTTGAACATCCACTGACTGGCGTTTATCGATTGTCATTCACTTCTGGTATCAATCACACTT
PCR反应在一个25μl反应体系中进行：2.5μL PCR缓冲液；1.5μL氯化镁(25mM)；0.5μldNTPs(10mM)；每个引物0.5μL(10pmol/μl)；0.15μl Taq DNA聚合酶(5U/μl)；和10-40ngDNA模板。PCR的温度分布为[94℃/4；(94℃/15”；55℃/10”；72℃/30”)x35；72℃/10’]。
III.与pTre-tight系统连接
两个包含不同miRNA靶点的304和334bp片段与BamHI、EcoRI和SalI混合，并使用Qiagen柱纯化。进行T4连接，632bp片段与BamHI/EcoRI酶解的pTre-tight质粒连接并产生3203bp质粒。事实上，我们仅需要tetOx7+PminCMV+miRNA片段，因此质粒序列被用作模板，利用包含HindIII和Acc65I限制性位点的引物扩增1017bp片段。这些位点分别可用于与连接piggyBac质粒和构建体的其他部分。
(Tre-HindIII) CGATCTAAGCTTCTCGAGTTTACTCCCTATCAGTGA
(Tre-Acc65I)
CGATCTGGTACCTGACTCCATTCCATTTTCTTTTTGTTCCTCGTGTTG
PCR反应在一个25μl反应体系中进行：2.5μL PCR缓冲液；1.5μL氯化镁(25mM)；0.5μldNTPs(10mM)；每个引物0.5μL(10pmol/μl)；0.15μl Taq DNA聚合酶(5U/μl)；和10-40ngDNA模板。PCR的温度分布为[94℃/4；(94℃/20”；54℃/45”；72℃/60”)x35；72℃/10’].PCR产物通过Acc65I和HindIII消化，由Qiagen柱纯化。该产物然后可用于最终连接。
IV.与pTre-mod/U6系统连接
使用所需的pTre-mod/U6系统替代U6哺乳动物启动子，如实施例2(II)所述。所述前向引物经过重新设计，以包括Ndel限制性位点，54bp最小启动子的上游含有启动子的核心序列和TATA，PCR产生686bp片段。所述引物是miR1-Ndel-F[GCCGCGCATATGGTAGAAGACTATATAAGAGCAGAGGCAAGAGTAGTGAAATGTCTTTGCTTCGGCCCTATCTTAA AATATAAACTAATC]和反向包含的BamHI位点。miR2-BamHI-R[GCCGCGGGATCCTGACTCCATTCCATTTTCTTTTTGTTCCTCGTGTTG]。RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-TetH病媒生物(Cat.No.630925)经过Ndel和BamHI消化以清除哺乳动物U6启动子并重新包含686bp片段，其中包含白纹伊蚊最小U6和人工miRNA两个环。这个质粒与两个引物经过PCR，TetR-HindIII-F[CGATCTAAGCTTCTTTCGTCTTCACTTGAGTTTACTCCCTA]和TetR-Acc65I-R[CGATCTGGTACCTGACTCCATTCCATTTTCTTTTTGTTCCTCGTGTTG]并产生969bp片段，其中包含Tet-R操作子+白纹伊蚊U6最小启动子+miRNA。该片段可用于连接转录抑制因子(TTS)。
V.连接果蝇β2精子特异性启动子与pTet-On反式激活蛋白(rtTA)或转录抑制因子(tTS)
这一步与实施例2(III)完全相同。使用精子特异性启动子制备了两个反式激活蛋白系统(rtTA和tTS)，然后用于连接。
VI.整个质粒组装。
使用来自http://piggybac.bio.nd.edu/的pXL-BacII-ECFP质粒来组装上述所有片段，以完成Tra-2 miRNA构建。该pXL-BacII-ECFP质粒携带一个3xP3启动子，可驱动ECEP报告基因。此报告基因以组织特异性方式表达，受到3xP3启动子的控制。
使用ApaI和Acc65I消化所述pXL-BacII-ECFP质粒，由Qiagen柱纯化。线性质粒是5390bp。然后将所述质粒与Ptre-tight片段(实施例3,II)，和β2+tTA片段(实施例3，IV)混合，摩尔比为1:3:3。在使用tTS系统的其它情况下，所述Piggybac质粒然后与pTre-mod/U6片段(III，实施例3)和β2+tTS片段(IV，实施例3)混合，摩尔比为1:3:3。T4连接质粒加入到30μl反应中。将连接产物用于转化感受态细胞。预计连接产物的尺寸不同，范围如下：
对于rtTA系统，Piggybac质粒中的miRNA构建物最终为7853bp。与此同时，tTS系统产生8604bp的产物。这是用于敲除白纹伊蚊中Tra-2基因的miRNA系统。我们在本文中没有以致倦库蚊为例实施构建。然而，原理是相同的。
实施例4改进早期受精卵启动子以表达RNAi并敲除Tra 2或其同系物或直系同源物
该构建体的示意图如图1B所示。
当无法完全根除带有X染色体精子，仅有很低比例雌性可能存活时，采用这种方法。早期受精卵启动子将有助于杀死胚胎或早期阶段的雌性合子。可以改进这种类型的启动子用于rtTA或tTS系统，这些系统可以用来调控长mRNAs、shRNA或miRNA的表达。在这种情况下，可以使用任何昆虫早期受精卵特异性启动子。我们使用埃及伊蚊-AaKLC2.1启动子29(AAEL011410Ra)以以促进反式激活蛋白的表达。在使用rtTA的情况下，我们使用两个限制性位点，前向引物中是ApalI，反向引物中是EcoRI。
AAKLC2.12-APAI-F CGATCTGGGCCCATATGAAAATTGTTATGAAGAAA
AAKLC2.1-ECORI-R CGGACGTTGGAATTCTGTTGATTGATTGGAAGATTTGGAA
同时，tTS要求在反向引物中使用XbaI限制性位点。
AAKLC2.1-APAI-F CGATCTGGGCCCATATGAAAATTGTTATGAAGAAA
AAKLC2.1-XBAI-R CGGACGTCTAGATGTTGATTGATTGGAAGATTTGGAA
可以对这个启动子进行改进以适应长dsmRNA干扰构建物或Tra-2基因的shRNA。然而，无法适应上文所述的特定miRNA，因为aae-mir-932是针对成年雄性的。
实施例5Tra-2基因的过度表达
该构建体的示意图如图1G所示。
我们还使用一种通过基因过表达来沉默Tra 2的方法，仅需克隆整个Tra 2 cDNA雄性特异性基因，包括3’和5’[SEQUENCE ID.No1]。这个片段与pTre-tight质粒中的CMV最小启动子连接，并与rtTa片段一起插入Piggybac质粒。在这种情况下，Tra 2雄性特异性cDNA可与该质粒中存在的SV40 polyA 3’UTR结合使用。这种基因可以诱导Dox并导致过度表达。
实施例6质粒注射和转化体选择
Tra 2 RNAi质粒(长DsRNA(siRNA)，shRNAs或miRNA)或Tra 2过表达构建物与pBSII-IE1-orf(http://piggybac.bio.nd.edu/)辅助质粒混合。所述辅助子产生转座酶酶，有助于piggyBac Tra 2 RNAi质粒跳转至蚊子的基因组。适宜浓度的注射混合物将为Tra 2 RNAi质粒600ng以及每微升(μ)1x磷酸缓冲液中加入400ng辅助质粒。产卵后2小时内将蚊子胚胎注入后端。注射4天后，将卵子浸入无氧水。G0幸存者与野生型雄性或雌性杂交。G1幼虫经过荧光显微镜筛检；发现的任何荧光幼虫被认为与转化品系之间的转化体。此类品种分别在Dox条件经过检查，每升加入10到30毫克Dox，了解Tet-on对性别比的影响以进行基因表达。任何显示出偏向雄性的品种(Tet-on条件超过80％)都被保留，以供进一步分析，并可能用于病媒生物控制用途。这些品系被视为遗传性别鉴定菌株(GSS)。
实施例7瞬态实验中多西环素诱导Tra 2敲除
在此实施例中，我们展示了Tra 2 RNAi构建物的瞬时表达，其中产生长dsmRNAs。实施例4中介绍了创建此构建物的详细方法。所述促进rtTA蛋白的启动子是AaKLC2.1。当强力霉素(Dox)存在时，Tet-On结合pTre-tight中的四环素应答元件，并产生下游基因的高水平转录。埃及伊蚊种系(Hanoi1)食用含有三个不同浓度Dox的血液，以产生不同剂量Dox的卵子(毫克/升)。所述构建物名为AaKLC2.1-long-02，经过Maxiprep净化后，在1.6μg/μl的1x注射缓冲液中稀释。胚胎经过简单干燥50秒，通过双层胶带粘在塑料滑盖上。使用Voltalef覆盖所述胚胎。注射后，立即将盖玻片转移到27℃下，放入保持100％湿度的密闭塑料盒中3-4天，然后在Dox脱氧水中孵化。在每个浓度的Dox中注入500胚胎。在标准条件下饲养幼虫。三个不同的Dox浓度相当于加入养殖水的血粉浓度。每个Dox浓度下存活者的性别比率如下表所述。
表1。长dsmRNA构建注射和雌性杀伤力Dox浓度不同所致。
实施例8沃尔巴克氏体转染
在获得Tra 2遗传性别鉴定菌株(GSS)之后，可用作沃尔巴克氏体感染的原料。实现这一目标的最简单方法是将CI品系中感染沃尔巴克氏体的GSS雄性进行杂交。该方法可获得许多此类蚊子品种(这可以诱导达100％CI)28，29。在Tra 2敲除/沃尔巴克氏体品种建立之后，需要通过与来自目标种群的雌性杂交对雄性进行测试，以获得精确的CI水平。基于该结果，可以得出一种控制策略。在我们的例子中，这种品种不可用，但可以通过下文所述的交叉感染进行：
产卵之后的70或30分钟，分别收集感染所需沃尔巴克氏体的蚊子或果蝇卵。在20ml均质缓冲区中对500-1000个卵进行匀浆[(250mM蔗糖、90mM氯化钾，30mM氯化钠，15mM硫酸镁，5.5mM氯化钙，0.1％[wt/vol]芦布若尔；ICN公司，科斯塔梅萨，加利福尼亚州)]39。通过0.95μm孔径大小过滤均匀混合物，并在150xg条件下离心10分钟以去卵表面杂物。然后含有沃尔巴克氏体的悬浮物在5000g条件下制粒10分钟。颗粒被重新悬浮在均质化缓冲液中。在一到两天内，对老年雌性伊蚊受体进行麻醉，并使用femtotips II玻璃针直接进行胸腔内微量注射。将雌性保存在20到22℃条件下。这一温度可以减缓沃尔巴克氏体的繁殖并显著增加注入雌性的存活率。让雌性与未受感染的雄性进行交配，以获得单雌品系。一旦雌性产卵，对其进行PCR测试，使用通用wsp引物81F和691R检查是否存在沃尔巴克氏体38。对F1雄性使用同一引物进行检查，以查看交叉感染。
实施例9成年雌性转染和Dox挑战
使用来自果蝇的沃尔巴克氏体转染白纹伊蚊(Hanoi 1和Laos2)(俄勒冈州-R)。这只苍蝇携带wMel沃尔巴克氏体。如上文所述收集果蝇胚胎。1-2天龄的雌性被麻醉并直接在胸部进行微量注射。表2显示两次注射的结果。这些品系被养殖在标准条件下，并在进入幼虫第三期的4-5天至3日龄成虫期间试验Dox(30毫克/升)。对其进行PCR再次测试，使用通用wsp引物81F和691R检查是否存在沃尔巴克氏体38。
表2。沃尔巴克氏体转染至成年雌性
表3。沃尔巴克氏体转染品系和Dox试验。
实施例10
埃及伊蚊株命名为河内，使用Tra 2 RNAi(长dsmRNA)构建物转化。这种构建物与rtTA(pTet-on)和pTre-tight调控系统组装，如实施例1所述。使用不同浓度的Dox(0.3mg/L；3mg/L和30mg/L)对该株进行测试，第三幼虫阶段至3日龄成虫。从每个Dox浓度试验中的雄性被分为两组；一组采用荧光定量PCR来检测Tra 2敲除水平。另一组是与野生型雌性进行杂交。河内1野生型雄性和Tra 2 RNAi/河内1转基因雄性的总RNA被隔离在3个生物重复样本的5个雄性中。用于Actin5C(内源性参考基因)的引物是F：(5’-ATCGTACGAACTTCCCGATG-3’)和R:(5’-ACAGATCCTTTCGGATGTCG-3‘)产生一个125bp的片段。用于扩增Tra 2的引物，可产生Tra 2 RNAi目标位点附近的125bp片段如下︰前向：(5'AGCGAAACATCGGCCTGTTCATC 3')和反向︰(5'AGGCTGGTTTCGTTGGTGTAGC 3')。在每个Dox条件进行三次生物重复样本。其中Act5C作为内源性参考和野生型河内作为外源校验仪子，使用相对标准曲线法(应用生物系统)计算表达水平的敲除。PCR反应周期在95℃下为15分钟；95℃是为10秒，40个周期，XC条件下为10秒，72℃条件下为20秒，干板读数。X是退火温度，其中59℃用于参比基因Actin5C，55℃用于Tra 2引物。图1显示了三个不同Dox浓度下诱导的雄性体内Tra 2表达水平。0.3mg/L造成与野生型(96.98％野生型)相比略有不同。3mg/L诱导了较高的敲除水平(73.7％，野生型)，同时30mg/L导致在经过5天处理后达到较高的敲除水平(33.26％野生型)。请参见图2中的详细信息。
每个浓度下的10纯合子雄性(3天龄)，10个野生型雌性杂交。表1显示了杂交的性别比。
雄性(3mg/L) 雄性(30mg/L)
卵 500 500 500
孵化率 477/500(95.40) 453/500(90.60) 458/500(91.60)
雄性比例 235/221(51.53) 279/151(64.88) 387/27(93.47)
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Claims (10)

1.一种培育全雄性不育库蚊的方法，其中包括：
i)培育库蚊生物品系，所述库蚊品系携带一个或多个插入的Tet-on+转化子-2遗传敲除系统，以沉默内源性Tra-2基因，其中所述敲除效应仅发生在所述饲养条件下(实验室或饲养)，所述敲除系统只能通过添加所述物质激活，所述Tra-2敲除系统可以在雄性精子形成期间表达，并杀死带有X(m)染色体的精子，当X(m)染色体的精子存活时表达可杀死早期雌性受精卵，所有类型的敲除效应将产生严重的雄性偏向，雄性后代可达100％；
ii)在缺乏所述物质的情况下形成所述育种品系，因此在自然环境中的物种沉默，该物质在自然栖息地不存在，只能通过喂养提供给转化昆虫从而诱导敲除系统；
iii)所述昆虫品系还携带一个或多个内共生沃尔巴克氏体，其中雌性感染昆虫与Tet-on+Tra 2 RNAi品系雄性杂交，或通过胚胎细胞质感染昆虫，向目标物种的成年雌性的胸肌中进行微量注射，以生成人工细菌感染蚊子(所述沃尔巴克氏体不同于那些天然种群中可能已经存在的沃尔巴克氏体，如果雄性与自然种群选育的雌性昆虫杂交，可诱导胞质不相容性(Ci))，其中所述添加剂抗生素物质在Tra 2 RNAi的生命周期中的短暂存在，以允许沃尔巴克氏体可安全地保留在昆虫的品系内；
iv)将所述品系的雄性Tet-on+Tra 2 RNAi/沃尔巴克氏体后代释放至自然种群中，不需要性别鉴定步骤以清除雌性，可以通过喂养野生雌性实现种群控制，通过CI对其进行部分或全部绝育。
2.一种根据权利要求1所述的有机体，其中用于创建RNAi基因重组构建物(长dsmRNA、shRNA或miRNA)的任何序列可用于所述有机体的序列。
3.根据权利要求1和2所述的有机体，其中Tra-2RNAi效应位于任何染色体上。
4.根据权利要求1和3所述的有机体，其中整个Tra-2mRNA/cDNA基因序列可用于添加更多复制基因到基因组中，以通过过表达沉默所述基因。
5.根据权利要求1-4所述的RNAi重组构建物，其中所述构建物用于转化含有Tra-2基因序列中的已部分或全部的库蚊。
6.根据权利要求1，2和3所述的一种RNAi重组构建物，其中所述构建物用于转化库蚊，所述库蚊包括昆虫精子特异性启动子，用于调控反式激活蛋白(tTA基因)的条件，例如果蝇β2，早期受精卵启动子还可以用于在带有X(m)染色体的精子存活的条件下杀死早期雌性受精卵(例如埃及伊蚊-AaKLC2.1启动子)。
7.根据权利要求4用于转化库蚊的DNA重组构建物，其中所述构建物包含昆虫精子特异性启动子，用于调控反式激活蛋白(tTA基因)，例如果蝇β2，早期受精卵启动子还可以用于在带有X(m)染色体的精子存活的条件下杀死早期雌性受精卵(例如，埃及伊蚊-AaKLC2.1启动子)。
8.根据权利要求1，2和3所述的用于转化库蚊一种RNAi重组构建物，其中所述狗家务包含U6昆虫最小启动子，所述启动子与调控敲除效应的tetO(n)操作子序列结合。
9.一种根据任意前述权利要求的Tet-on+Tra-2RNAi系统，可用于通过辐射或化学绝育，在CI无法诱导某一物种达到100％的情况下实现绝育。
10.任何具有类似于白纹伊蚊，埃及伊蚊或库蚊等昆虫体内Tra-2遗传物质的昆虫，例如带有X染色体的精子和早期雌性受精卵，都可以在其Tra-2被敲除采用这种方法。
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