CN1860235B

CN1860235B - 用于虫害控制的表达系统

Info

Publication number: CN1860235B
Application number: CN2004800281777A
Authority: CN
Inventors: L·阿尔菲
Original assignee: Oxitec Ltd
Current assignee: Oxitec Ltd
Priority date: 2003-07-28
Filing date: 2004-07-28
Publication date: 2011-05-04
Anticipated expiration: 2024-07-28
Also published as: WO2005012534A1; US20160060651A1; GB0317656D0; US20180312870A1; US20070056051A1; EP1649027B1; US10059961B2; US10844402B2; ZA200600728B; EP1649027A1; US20060242717A1; BRPI0413024B1; GB2404382A; US9133477B2; ES2447422T3; PT1649027E; AU2004261782B2; CN1860235A; GB2404382B; US9121036B2

Abstract

在昆虫中具有活性的启动子可以通过正反馈机制进行增强并与可抑制的致死效应相关联。

Description

用于虫害控制的表达系统

本发明涉及包含启动子的昆虫表达系统。

通过重组DNA方法进行除了黑尾果蝇(Drosophila melanogaster)之外的昆虫物种的遗传操作尚处于其初期(Alphey，2002；Alphey和Andreasen，2002；Alphey等，2002；Benedict和Robinson，2003；Berghammer等，1999；Catteruccia等，2000；Coates等，1998；Handler，2002；Horn等，2002；Jasinskiene等，1998；Lobo等，2002；Lozovsky等，2002；McCombs和Saul，1995；Moreira等，2004；Peloquin等，2000；Perera等，2002；Scott等，2004)，并且利用异源启动子只制成极少的非果蝇属(non-Drosophila)昆虫的转基因种系。

昆虫转化是一种需要在大量非转化个体的背景中鉴定罕有转化子的低效系统。所以，转化子具有易于评分的标记是重要的。目前最受欢迎的是荧光蛋白，诸如GFP，DsRed及其突变体衍生物。对于它们的功能而言，这些需要转录控制元件，包括启动子。这些了解最清楚的是来自果蝇属(Drosophila)Actin5C(Act5C)和ubi-p63E(Pub)基因。还曾使用过Act5C，BmA3的蚕蛾同源物，以及一对组织特异性启动子(3xP3，合成的眼特异性启动子，和特异于间接飞行肌的Act88F)。

不过，这些启动子没有完全令人满意的。Act5C曾被用来转化各种蚊子，以及果蝇属，但是其在蚊子中的表达模式远非遍在性的(Catteruccia等，2000；Pinkerton等，2000)。将它用作地中海实蝇(medfly)(Ceratitis capitata)中转化标记中的部分的尝试已经失败，而用Pub进行的相同试验则获得良好成功。Pub具有类似的限制：地中海实蝇转化子中所见的表达模式是高度可变的，提示该表达模式至少对于位置效应是高度敏感的。此外，在根据需要进行开和关的意义上不能对这些启动子进行调控。

Fussenegger等，(1998a；1998b)在一个实例中利用选择标记举例说明了正反馈驱动的多顺反子转录物。实验限于哺乳动物系统中。pTRIDENT被描述为一种三顺反子人工哺乳类操纵子。对于“代谢工程”描述了细胞周期阻滞基因(arresting gene)的表达或瞬时表达，即，所需蛋白质的调控性表达，并且提到由VP16反式激活蛋白结构域产生的转录“压制”效应可能对于宿主细胞是致死性的，即使是在中等表达水平上(Berger等，1990；Damke等，1995；Gill和Ptashne，1988；Gossen和Bujard，1992；Salghetti等，2001)。对自动调节性单或多顺反子系统的好处进行了讨论，包括一步，自动调节的和自动选择性多顺反子哺乳动物表达系统，其包括以多顺反子的，基于pTRIDENT的或quattrocistronic构型存在的tTA(pQuattro-tTA；Fussenegger等，(1998b)；图2)。由于tTA基因对多顺反子表达单位本身进行编码，所以少许或没有tTA在抑制性条件下得以表达。这种正反馈调控系统不显示压制信号。用转基因动物中的单顺反子正反馈构型进行的实验也不显示有害作用(Shockett等，1995)。

已经对极少的启动子或其它控制元件进行过特征描述，并且对这些元件保持紧迫需要。希望提供在广泛的昆虫的全部或大多数细胞中具有活性的通用启动子，或者能够更加广泛地利用现有的启动子。另一个目标是调控昆虫启动子的活性，特别是以生命阶段和/或性别特异性的方式。选择性地减弱或消除特定细胞或组织中的启动子活性也是一个目标。本发明提供这些系统。

令人吃惊的是，已经发现有可能采用正反馈机制来增强昆虫启动子的作用，以及控制其表达。

因而，在第一方面，本发明提供一种包含至少一种待表达基因和至少一种其启动子的昆虫基因表达系统，其中待表达基因的产物对于所述至少一种启动子作为阳性转录控制因子而起作用，并且由此所述产物或产物的表达是可以控制的。

本文所用的术语“基因”指可以转录或翻译成产物的任何DNA序列，至少一种具有体内的活性或功能。这种基因正常情况下将具有至少一种转录启动子以及与其可操作性关联的终止子。

能够进行阳性转录控制的产物可以任何合适的方式作用。特别地，例如，所述产物可以结合位于启动子附近或启动子中的增强子，由此作用来增强在启动子上的聚合酶结合。可以采用其它机制，诸如阻遏物对抗机制，诸如转录或翻译的抑制剂的阻抑。例如，利用发夹RNA或核酶阻抑编码抑制剂的mRNA的翻译可以阻抑转录抑制剂，例如，或者所述产物可以直接结合所述抑制剂，由此避免转录或翻译的抑制。

更加优选地，所述机制是正反馈机制，其中所述产物，其可以是RNA或其翻译产物，在转录增强子位点上作用，正常情况下是通过结合所述位点，由此增强启动子活性。启动子活性的增强随后作用来提高所述产物的基因的转录，所述产物接着进一步作用来提高抑制或增强促进，由此导致正反馈回路(loop)。

所述产物的控制可以通过任何合适的方式进行，并且可以在任何水平上有效。特别地，优选的是所述控制有效阻抑所述控制因子基因的转录或阻抑其RNA产物的翻译，或防止或抑制所述基因的翻译产物的作用。

例如，tTA(四环素可抑制性转录激活剂)的基因产物作用于tetO操纵基因序列(Baron和Bujard，2000；Gossen等，1994；Gossen和Bujard，1992)。在启动子的上游，在任一方向上，当被tTA基因的产物结合时，tetO能够提高来自与其紧邻的启动子的转录水平。如果tTA基因是包含tetO操纵基因以及启动子的表达盒的部分，那么当tTA基因产物被表达时发生正反馈。

通过暴露于四环素轻易实现这种系统的控制，所述四环素结合基因产物并且防止tetO上的反式激活。

tTA系统还具有在多种物种中提供阶段特异性毒性的优点。特别地，在许多昆虫的发育阶段观察到“压制”，易感昆虫的精确阶段是物种依赖性的。一些昆虫可以在幼虫死亡前到达蛹化，而其它的则在早期死亡。易感性从100％致死性到存活率小的降低。尽管如此，通常，成体昆虫好像对于tTA的压制作用具有免疫力，从而有可能在四环素存在的情况下饲养包含tTA正反馈系统的昆虫，并且随后将成体昆虫释放到野外。对于野生型来说这些昆虫具有少的或不具有竞争性缺点，并且将与野生型昆虫繁殖，但是携带tTA正反馈盒的幼虫将会在达到成熟前死亡。

修饰tTA序列以增强与所需昆虫物种的相容性是相对简单的，并且这已在后附的实施例中用tTAV进行证明，所述tTAV具有额外的两个氨基酸以提供一个蛋白质酶位点，但它是由基本上改变自tTA序列的序列所编码的，以便更接近果蝇属的用法。

因此，在一个优选的方面，如所述的那样本发明提供一种系统，其中至少一个基因是tTA，或是有效上调tetO启动子的编码与tTA相似产物的基因。

因而，本发明与显性致死基因的组合使用，允许显性致死基因的选择性表达，或根据需要，允许致死基因或致死表型的阶段特异性表达。将会理解的是显性致死基因不必是正反馈机制的完整部分，但是例如，可以是双顺反子盒的部分。与RIDL(携带显性致死因子的昆虫的释放)联合使用本发明是特别优选的。

对于tTA或其类似物而言，当使用tTA基因产物时，反馈机制的控制，简单地受到四环素存在或缺失影响，或由调节四环素浓度所影响。对于另一种优选的正反馈系统GAL4而言，这可以通过，例如温度进行控制，由此抑制有效基因，优选地显性致死基因，直到昆虫的释放。

还可以采用其它机制，诸如核酶或反义或部分自身互补的RNA分子，如发夹RNA，以抑制或防止激活肽，或封阻剂的表达，所述封阻剂防止激活剂结合增强子位点。

例如，这些封阻剂可以由昆虫自身在选择性条件下表达，或者可以施用作为培养基的部分。

当所述封阻剂或控制剂由昆虫产生时，那么优选的是它们的表达是选择性的，诸如性别特异性的。在培养基中施用所述封阻剂，例如，将能够在所有条件下抑制正反馈盒直到昆虫的释放，其后，阶段或性别特异性的选择将会发生，优选在后代中，特别优选接下来的世代。

更加优选地，所述包含正反馈机制的盒与阶段或性别特异性相关联。例如，对于在大多数昆虫中所见到的性别转换基因(transformer)和双性基因(doublesex)机制观察到性别特异性剪接，并且可以用来将所述反馈系统的表达限定到一个特定的性别，例如通过采用性别特异性剪接来删除全部或部分的效应物基因，或并入一个移码或终止密码子，或调节RNA稳定性或mRNA翻译效率，或者否则去影响表达从而在性别之间分化。特别优选靶向害虫物种的雌体。

尽管有可能在单独的位置中和甚至在分离的染色体上提供效应物基因，一般优选将所述效应物基因与反馈基因相连接。这可以通过随机放置所述两个基因，包括提供二者作为融合产物的可能性，或者例如通过在相反方向但是毗邻增强子位点处提供具有其自身启动子的每种基因而得以实现。

效应物基因是需要将其表达增强的基因。当正反馈产物作为阶段特异性致死因子也有效时，诸如在许多物种中的tTA，则效应物和反馈基因可以是一个并且是相同的，并且这是一个优选的实施方案。

效应物基因将通常是致死基因，并且据设想本发明的系统将会最常用于虫害种群的控制中，特别是如下所述与RIDL技术或相关方法相组合。

由于昆虫中的转化成功率极低，优选本发明的系统包括一种标记，诸如DsRed，绿色荧光蛋白及其变异体，从而使它能够用来以某种方式进行选择。

所述启动子可以是大的或复合的启动子，但是当被引入非宿主昆虫中时，这些通常具有使用不足或不调和(patchily)的缺点。因此，优选采用最小的启动子，如Hsp70启动子，其尽管天然地具有一定程度低水平的活性，但能够基本上由正反馈方案所增强，诸如通过使用tTA和tetO。

启动子是DNA序列，一般直接在编码序列的上游，对于基因的基本和/或受调控的转录是必需的。特别地，启动子具有足够的信息以允许转录的起始，一般具有转录起始开始位点和聚合酶复合物的结合位点。最小启动子一般将具有足够的额外序列以允许这二者有效。其它的序列信息，诸如，例如，决定组织特异性的信息，通常是缺乏的，作为这种缺乏的直接结果，优选的最小启动子正常情况下是基本上在缺失活性增强子的情况下失活。因而，当所述或每个启动子是最小启动子时，本发明的顺反子，或者系统，这两种术语在本文中通常优选是可以相互交换的，通常将是失活的，直到合适的增强子或其它调控元件被去抑制或激活，典型地是基因产物。

因而，将会理解的是最小启动子可以直接从启动子的已知来源获得，或者衍生自更大的天然发生的，或另外已知的启动子。适合的最小启动子以及如何获得它们对于本领域技术人员将是显而易见的。例如，适合的最小启动子包括源自hsp70的最小启动子，P最小启动子(下文中例示为WTP-tTA)，CMV最小启动子(下文中例示为JY2004-tTA)，基于Act5C的最小启动子，BmA3启动子片段，和Adh核心启动子(Bieschke，E.，Wheeler，J.，和Tower，J.(1998).Doxycycline-induced transgene expressionduring Drosophila development and aging.Mol Gen Genet 258，571-579)。例如，Act5C对转基因伊蚊(Aedes)和本发明中的tTA作出反应。

并非所有的最小启动子都一定会在所有昆虫物种中起作用，但是关于如何确保启动子具有活性，对于本领域技术人员而言是显而易见的。例如，包含本发明的顺反子和待测最小启动子的质粒，或其它载体进一步包含一种标记，这种基因编码一种荧光蛋白，其处于已知在该物种中起作用的启动子控制之下，所述方法进一步包括对推定的转基因个体分析所述标记的表达，其中随后对表达所述标记的个体分析在所述最小启动子控制下的基因表达，诸如通过分析转录的RNA进行。在诱导的或去抑制条件下于背景水平之上RNA的存在是指示性的，即所述最小启动子在研究的物种中是具有活性的；在非诱导的或去抑制条件下这种RNA只在低水平的缺失或存在是指示性的，即所述最小启动子具有低的内在基础活性。

我们只通过实施例的方式使用了下列标记启动子，但是许多其它的是有用的并且对于本领域技术人员是显而易见的：

mini-white(white启动子)：WTP2-tTA，JY2004-tTA

Act5C启动子：LA513和LA517

ubi-p63E启动子：LA656和LA1038

BmA3启动子：LA710

hr增强子和ie1启动子：LA928，LA1124和LA1188

所述这些作为最小启动子或在最小启动子的制备中都是有用的。

将会理解的是本发明的顺反子或系统可以含有两个或更多顺反子。系统可以进一步包含未连接的元件，诸如待表达的第二基因远离正反馈顺反子。

因而，在一个优选的方面，本发明提供在附图1中所示的一般形式的正反馈构建体。在此方案中，在表达时，四环素可抑制性转录激活剂(tTA)蛋白结合tetO操纵基因序列并驱动来自附近最小启动子的表达。在所示的构型中，这随后驱动tTA的表达，其随后结合tetO，等等，产生正反馈系统。这种系统被四环素所抑制，所述四环素结合tTA并防止它结合tetO。

表达是可控制的，并且这可以通过将启动子可操作性地连接到一种可控制的转录因子上而得以实现。如上所举例说明，例如，这可以是tTA(四环素可抑制性的或四环素可诱导性的)，或任何其它因子可控制系统，诸如GAL4(其是有些对冷敏感的，并且可以进一步通过使用GAL80或其突变体而得以控制)，或者链阳菌素调控的表达系统。将会理解的是对于适当转录因子的其它结合位点将依赖于有关的转录因子，例如，诸如GAL4的UASGAL4(上游活化序列)。

本发明的优选系统具有优选存在于几种诱导水平上的高水平诱导表达，伴随着受调控的基因但是还有任何其它组分的低的基础水平的表达，并且优选跨越多个物种的范围。在表达强烈有害时，基础水平优选是低的或基本不存在的，但是可接受的水平将依赖于产物的作用。最大水平一般不会是一个问题，因为正反馈条件通常将会提供致死水平的表达，即使在表达产物不是致死性的，或与致死性结果相关联的情况下，它也很可能以远高于大多数基因产物的浓度进行表达。

在需要基础水平的表达时，则可以采用不需要增强子存在的启动子序列，尽管随后一般会有反馈。除非有截断水平的反馈，低于该水平反馈产物将不起作用，则将要理解的是优选保持最小的反馈基因表达。

根据构建体的组分，本发明的不同构建体(描述于随附的实施例中)具有不同的活性。例如，在果蝇属中：

WTP-tTA给出低水平的诱导的(非抑制的)表达

当不受抑制时JY2004-tTA给出强烈的表达，大约与Act5C-tTA等同

当不受抑制时LA513是致死性的。

如通过利用报告基因(tRE-EGFP)所判断的，前两种好像给出组成性表达，评估致死性LA513是困难的，尽管于10μg/ml tet，其只是对于良好的存活是充分的，果蝇属中的LA513在成体的雄性和雌性种系中，以及在体细胞中驱动tetO₇-EGFP报告基因的表达。这将它与Act5C区分开来，所述Act5C一般用作“遍在的，组成性的”启动子，其事实上在这些细胞中表达得并不好。

这些构建体的特性显示于下面的表1中。

表1

因此，将要理解的是通过调节正反馈系统的序列能够以有用和可预测的方式来改进诱导的或非抑制的表达水平。可以通过几种方法，例如利用核定位信号，激活结构域的修饰等，能够不依赖转录和翻译控制信号来改进tTA蛋白质的毒性和/或活性(更多实例见Fussenegger，2001)。

由于以上给出的理由，LA513的致死性是有用的，并且更加特别地是因为：

a)它提供一种紧凑的，高度有效的可抑制致死基因系统；

b)由于它只使用来自果蝇属的简单控制元件(hsp70最小启动子，小的内含子和来自fs(1)K10的终止子)，它，或它的表达盒，跨越广泛的系统发生范围起作用；

c)如果有的话，它对于成体具有极小的有害作用，即使是在缺失四环素的情况下。这对于野外应用，例如在基于RIDI的控制计划中，是一种高度有希望的和令人吃惊的特性，因为对于计划的充分效力而言释放的成体必须是竞争性的和长期存活的。将要理解的是本发明系统的效果可以通过，例如在本文所述的“正反馈双向表达”构型中并入成体有效的致死因子而作进一步改进；和

d)根据其性质，将各种元件之间的“通讯(cross-talk)”最小化。这是因为：

(i)构建体的核心仅仅是一种单一复合的元件，而非在等分表达系统中正常的两个；(ii)自动调整组分的主要增强子，tTA结合位点，只有在四环素缺失的情况下才是基本上有活性的，和(iii)tTA在附近增强子影响下的适度表达不可能是显著有害的，所述增强子无论是在构建体的另一部分或在附近的染色质中。

JY2004-tTA在本发明中也是有用的。

不为理论所束缚，LA513杀死胚胎和早期幼虫，但不杀死成体的机制似乎是其毒性的固有特性。认为tTA毒性源自″转录压制″，其中高水平表达的转录激活剂结构域(对于tTA而言这是VP16或其片段)结合转录装置的元件并滴定(titrate)它们，导致对于转录的一般性作用，尽管它也可以作用来饱和遍在蛋白质降解途径。转录压制是被认为导致哺乳动物细胞系中有害效果的作用，所述哺乳动物细胞系高水平表达tTA；在LA513的优化表达背景中正反馈驱动tTA表达到致死水平。不过，发育阶段可能比成体对于转录的破坏更加敏感：它们必须以高度协调的方式表达基因以允许正确的发育，而成体可能对破坏更加耐受。

相对于它们的野生型同胞，LA513杂合子在培养基上的发育显示了明显的延迟，所述培养基具有中间水平的tet(3或10μg/ml)，只足以存活。利用更高浓度四环素，例如100μg/ml的平行实验并不显示任何发育延迟，由此提示tTA的亚致死表达能够不利地影响昆虫的正常发育。

优选的是正反馈系统比传统系统显示更高的开：关比率并且在更加狭窄的浓度范围上由开到关转换，由此允许使用更加广泛的效应物分子。可以使用较低毒性(较低特定活性)的效应物分子，因为它们能够在活性条件下以高水平表达而不会导致基础水平上的毒性问题。相反地，可以使用更具毒性(较高特定活性)的分子，因为当去抑制或诱导时必需的低基础水平并不排除高水平的表达。由于基础水平的表达只是部分由tTA的水平所决定，对于较低毒性的分子而言这一优点特别清楚。例如，能够用作LA513的正反馈背景中的致死因子的低特定活性效应物分子的一种优选实例是tTA。在狭窄的浓度范围上由开到关转换的优点是能够使用合适浓度的抑制剂，而无残余(未充分抑制)表达导致副作用和对于抗性的潜在选择的危险。相反地，对于可诱导系统而言，合适浓度的激活剂可以给出充分表达。

激活的或去抑制的驱动剂可用来表达效应物分子。效应物分子的实例包括功能性RNA′s，如发夹RNA′s，核酶等，以及一种或多种编码的蛋白质。将要理解的是，对于不同的应用，不同的表达水平是合适的。由于用来驱动正反馈系统的序列特异性转录因子也可以用来在等分表达系统中表达其它基因，这可以通过制备两种独立的构建体来实现，一种具有所述驱动剂(正常情况下是启动子-转录因子构建体，这里是正反馈构建体)，另一种具有在复合启动子(结合位点+最小启动子)控制下的目标基因或分子，所述启动子对于转录因子有反应(Bello等，1998；Brand等，1994)。这对于这些正反馈驱动剂也合适。或者，所述两种元件可以在同一构建体上组合。这一实施方案对于大多数野外应用具有明显优点，因为它非常充分地减少了两种功能性元件被重组所分离的危险。另外，完整的表达系统能够仅仅用单一转化事件引入，并且意味着对于系统纯合的昆虫只在一个基因座而非两个基因座上是纯合的，这使得它们更易于通过繁殖来构建，并且趋于减少由于插入突变造成的适合度成本。

还可能将这种表达系统压缩成更加紧凑的形式，诸如在附图2中所举例说明的。

这开发了增强子的双向性质，在此案中是在tTA存在情况下的tetO结合位点。这种排列进一步允许，或促进，使用绝缘体元件减弱增强子或抑制剂在相邻染色质中的作用：在此排列中完整的表达盒可以侧接绝缘体。这种排列还除去了在构建体中复制转录因子结合位点的需要。优选避免这种复制，因为它能够导致在整个同源重组中的不稳定性。由于类似的原因，一般优选使用不相同的绝缘体，如scs和scs’，而不是使用相同绝缘体两次。

还可能压缩所述系统以提供单一的转录物，双顺反子性的或表达单一多肽，其可能被进一步加工成一种以上的蛋白质，例如通过利用遍在蛋白融合技术(Varshavsky，2000)。这些方法的每一种(双向表达，双顺反子性表达，具有反式激活蛋白的融合蛋白)都趋于减小构建体的大小，这接着将趋于提高转化频率并减少诱变靶。如在附图3中所图示的，这种压缩能够以几种方式实现。图示的所述排列的适当延伸和变化对于本领域技术人员来说将是显而易见的。

作为这种系统用途的一个实例，可以通过利用反式激活蛋白系统构建一般的转化标记，已知所述反式激活蛋白系统在广泛的系统发生范围上起作用，例如基于tetR，GAL4，lexA或AcNPV ie-1的那些。这种通过任何以上方法(双向表达，双顺反子性表达，具有反式激活蛋白的融合蛋白)功能性连接到荧光蛋白编码区上的反式激活蛋白，将会提供在广泛组织和跨越宽广系统发生范围的发育阶段表达的遗传标记。例如，这种标记不仅可用于检测转化和其它实验室实验中的转基因学，还可用于将转基因蝇与野外的野生型蝇或在野外捕获的蝇区分开来。

另一个实例是转座酶的表达。整合入染色体后，这将会是一种″起跳物(jump-starter)″构建体，例如利用mariner/mosl整合入昆虫染色体中的piggyBac转座酶。这些构建体可用于再动员piggyBac元件。一种可以广泛应用的起跳物应当跨越广泛的系统发生范围在显著的水平上表达。本发明的表达系统提供这一点。而且，这种构建体(在以上结构其中一种的正反馈系统的控制下的piggyBac转座酶)还可用于通过瞬时表达进行的昆虫转化(“辅助”质粒的共表达，对于昆虫转化最广泛使用的方法)，并且再一次将会在跨越广泛的系统发生范围可用和具有功能。

除了能够通过改变环境条件调节表达水平之外，在阶段、性别或其它水平上调节表达系统的作用是有利的。合适的实例如下：

1.抑制剂蛋白的表达

抑制剂蛋白是已知的或者可以对于主要表达系统进行构建，例如GAL80或其对于GAL4系统的突变体衍生物，融合到tet系统抑制性蛋白上的tetR等。另一种选择是利用针对表达盒的部分的发夹RNA进行的转录因子的基因沉默。来自正反馈系统的基础表达相当低，所以它能够轻易被这种抑制剂的表达所抑制。

适合的抑制剂在适合控制下的表达将趋于抑制来自表达所述抑制剂的正反馈表达盒的表达。所以例如，雌体特异性表达能够通过在雄体中表达一种抑制剂来实现。

2.将特异性整合入正反馈系统中

通过利用自身是特异的组分可以将特异性整合入正反馈系统中。例如，已知pUAST的hsp70最小启动子+SV40内含子和polyA信号组合在果蝇属的雌性种系中不表达，而pUASp的P最小启动子+P内含子+fs(1)K10polyA信号则这样表达(Rorth，1998)。所以，依赖于适当调控元件的使用，可以构建在这种组织中特异性表达或不表达的正反馈表达系统。

在另一个实施方案中，可以通过利用性别特异性剪接将性别特异性整合入所述系统中。双性基因(doublesex)及其同源物的性别特异性剪接是保守的调控机制，所以，可以跨越广泛的系统发生范围以此方式使用。性别转换基因及其同源物的性别特异性剪接是另一种选择。如在附图4中所图示的，利用性别特异性剪接将特异性整合入正反馈表达系统中能够以几种方式实现。图示的所述排列的适当延伸和变化对于本领域技术人员来说将是显而易见的。

在另一种构型中，可以将特异性剪接位点插入反式激活蛋白编码区中从而在不同的条件中，例如，在不同的细胞类型中或在不同的性别中，产生两种(或更多种)选择性蛋白。可以对此进行排列从而在一种细胞类型中产生一种转录激活剂但在另一种细胞类型中产生一种转录抑制剂。这种排列具有这样的优点，即它对于无效(不完全的)剪接相对稳固-在不适合的细胞类型，例如在雄性细胞中，相对低比例的转录激活剂的产生将不大可能产生正反馈放大，因为这些细胞也产生较大量的抑制剂。由此提高两种细胞类型之间输出(在两种细胞类型中转录激活剂的水平的比率，或报告基因或功能性连接于转录激活剂表达的其它RNA或蛋白质的表达比率)的区别。

对于本领域技术人员来说将会显而易见的是，任何这些特异性反式激活剂排列都可以轻易地与任何本文公开的排列组合，以表达额外的蛋白质或RNA，例如，双向表达，双或多顺反子表达，融合蛋白的表达，或根据，或部分根据所述反式激活剂的表达与一种或多种独立的表达盒组合，在相同的构建体上或在基因组或细胞中的其它地方组合。

3.利用特异性效应物分子

通过使用特异性效应物分子还可以引入表型结果的特异性。当在本文所述的任何表达系统的控制下表达的分子，例如RNA或蛋白质只在特定细胞、组织或性别等中具有特异性作用时，则以所述反式激活剂的更广泛或更少特异性的表达可以获得表型特异性。例如，在RIDL型大量释放昆虫种群控制计划的背景下，利用所述系统表达只对前成体阶段具有毒性的分子，或优选对于前成体阶段具有毒性的分子，导致相对于野生型具有充分或相当竞争性的成体。这是合乎需要，因为所述计划的有效性依赖于当释放到野外时成体形式的竞争性和寿命。由于它们的内在抑制剂(例如四环素)浓度可能在野外降低，所以当它发生在成体上时，确保所述表达系统的诱导(去抑制)对于它们具有最小的负作用将是有利的。

作为另一个实例，通过一种在雄体和雌体中具有不同作用的分子在雄体和雌体二者中的表达可以实现性别分离，或性别特异性的效果。例如，在雄体果蝇属中性别转换蛋白的表达将趋于把它们转换成雌体，但对于雌体没有作用。类似地，在果蝇属中雄体特异性致死蛋白-2(Msl-2)的表达将趋于杀死雌体，但不杀死雄体(Gebauer等，1998；Kelley等，1995；Matsuo等，1997；Thomas等，2000)。相反地，在其自身互补或双链形成区具有对于性别转换基因的基本同源性的部分自身互补RNA分子(“针对性别转换基因的发夹RNA”)的表达将趋于把遗传性雌体转换成表型性雄体，而不影响遗传性雄体，并且针对msl-2的发夹RNA的表达将趋于对雄体是致死性的但对于雌体则不是。针对双性基因的雄体或雌体特异性外显子的发夹RNA的表达将趋于只影响那些性别，编码其它形式双性基因(即雌体中的DSXM或雄体中的DsxF)的刺激性表达将趋于改进或增强这种作用。蛋白质和发夹RNA分子的刺激性表达可以通过将上述双顺反子或融合蛋白方法与也是上述的利用双向表达系统进行的发夹RNA表达组合而轻易得以实现。如对于本领域技术人员将会显而易见的那样，通过将适合的特异性剪接或其它转录、翻译或其它翻译后控制信号整合入系统的任一部分可以将性别、阶段或其它特异性进一步加入到这种系统中。

可以构建和设想多功能性发夹RNA分子。例如，针对地中海实蝇Ceratitis capitata Wiedmann(medfly)性别转换基因的RNAi将趋于把遗传性雌体转换成可繁殖的雄体。对于基于这种昆虫的大量释放的区域范围的种群控制计划而言，优选使释放的蝇不育。这可以通过使用同时破坏性别转换基因和精子发生或胚胎或幼虫生存力必需的基因的表达的复合RNA分子来实现。许多这种基因在与蚊或其它动物具有同源物的果蝇属中是已知的。利用本领域技术人员已知的技术，用地中海实蝇可以轻易地分离出适合的同源物。我们优选使用允许产生精液的基因，并且也优选允许产生精子的基因，以减弱雌体在被受影响雄体授精之后再配对的趋向。我们特别优选将所述发夹RNAi分子的第二部分指向亲本效应致死因子，从而不能产生可存活的后代，或指向胚胎或幼虫存活力或发育所必需的合子表达的基因，从而将会影响遗传所述构建体的后代。考虑了其它的构型并且其对于本领域技术人员而言将是显而易见的：例如由双顺反子表达进行的雌体特异性致死蛋白的表达和由双向表达产生的导致亲本效应致死性的发夹RNA。与针对适合的性别决定基因的复合发夹RNA和亲本效应致死因子一样，这允许生成单一性别(只有雄性)的昆虫种群，其全部后代都通过亲本效应致死因子的作用死亡，不论它们的后代或配偶是否饲以四环素。因而，本发明提供一种受控制的启动子，如所定义的那样，其中所述启动子与编码引发致死性或不育性的RNAi的DNA可操作性地连接在一起。在此情况下，致死性可以对应于低适合度，诸如不能飞行，而非完全的致死性，前提是饲养的可能性被基本减弱。

4.利用位点特异性重组酶

特异性还可以通过插入灭活正反馈系统的“填充”片段来导入正反馈系统。如果这种“填充”片段侧翼是适合的位点特异性重组酶的靶位点，那么在活性重组酶存在的情况下它将趋于被切除。所以，活性重组酶的选择性表达，例如，在雌体特异性启动子控制下的重组酶的表达的任何系统都将趋于导致所述正反馈系统的选择性表达，在此情形中只在雌体中。如果所述重组酶只在体细胞中表达，例如通过利用上述的方法，那么传递到下一代的版本包括所述填充片段，所述下一代能够再次是女儿而非儿子。相反地，如果所述重组酶只在基因组中表达，活性重组酶的提供将由表达系统失活的亲本导致表达系统具有活性的后代。这可以例如用来生成包含活性显性致死或不育基因系统的配子(例如雌性特异性或非性别特异性)，用在昆虫种群控制策略中。

在一个优选的实施方案中，所述填充片段编码所述重组酶。这一实施方案特别简洁。在另一个优选的实施方案中，所述填充片段编码一种转录抑制剂，其趋于灭活所述正反馈表达系统-这一实施方案趋于在存在所述填充片段的情况下减弱所述系统的基础表达。

相反地，通过在适合的位置上导入适合的位点特异性重组酶的靶位点，并且随后在合适的细胞中表达或导入合适的活性重组酶，从而通过所述重组酶的靶位点之间的重组去除或破坏所述表达系统的一种或多种关键功能性元件，能够在某些细胞，或细胞的克隆中特异性灭活所述系统。

适合的重组酶系统包括cre/lox和Flp/FRT。

通过下列非限制性实施例阐明本发明。在下列实施例中，附图如下：

图1显示四环素可抑制性转录激活剂方案；

图2显示利用双向增强子的本发明的系统；

图3显示一种性别特异性系统；

图4显示另一种性别特异性系统；

图5是pJY2004的tetO₇-tTA区的图解；

图6是pLA513的示意图；

图7是LA513转座子的示意图；

图8是pLA517的示意图；

图9图解了在513A和513B蚊中tetO₇的双向作用；

图10是pLA656的示意图；

图11是pLA928的示意图；

图12是pLA1124的示意图；

图13是pLA670的示意图；

图14是pLA1038的示意图；

图15是pLA710的示意图；

图16图解了在地中海实蝇中Cctra的性别特异性剪接；

图17是pLA1188的示意图；和

图18图解了在地中海实蝇中的性别特异性剪接。

实施例

用正反馈构型中的tTA，即用由结合到tetO上的tTA调控的tTA表达制成一系列构建体。获得了携带这些构建体的转基因昆虫并对它们的特性进行分析。

tTAV

在一些情况下，目的是在缺失四环素时获得极高水平的tTA的表达。在下文所述的各种例示的构建体中，tTA表达如此高以致于致死。作为获得tTA强烈表达的过程的部分，将部分的tTA开放阅读框进行重新设计以表达类似的蛋白质，但是使用与黑尾果蝇(Drosophila melanogaster)的标准近似的密码子用法，并且缺少一些存在于原始核苷酸序列中的潜在隐蔽剪接位点。这种变异体tTA序列命名为tTAV(SEQ ID NO.31，蛋白质序列SEQ ID NO.32)。

实施例1

黑尾果蝇中的WTP-tTA和JY2004-tTA

在一种正反馈构型中，通过将来自pUHD15-1(SEQ ID NO.33，Gossen等，1994；Gossen和Bujard，1992)的tTA编码区(SEQ ID NO.29，tTA蛋白质序列SEQ ID NO.30)插入pWTP2(Bello等，1998)或pJY2004中，把它置于tetO控制之下，所述pJY2004是缺少绝缘体的pJY2000的版本(Stebbins和Yin，2001)。这些构建体分别命名为pWTP-tTA和pJY2004-tTA。将pJY2004的tetO₇-tTA区的简图提供为附图5，并且是SEQ ID NO.14。

在pWTP-tTA中，tetO₇结合位点之后是来自P元件的最小启动子，来自果蝇属hsp70的前导序列，来自果蝇属PP1a96A基因的短内含子，来自果蝇属hsp70的tTA编码区和转录终止子。如图5中所示，在pJY2004-tTA中，最小启动子和引导序列来自CMV，后接tTA编码区和来自兔β珠蛋白的转录终止子。

携带这些构建体的任一种的转基因黑尾果蝇是完全能够存活的，即使没有膳食性四环素。对于WTP-EGFP以及这些构建体的任一种二倍杂合的昆虫检查EGFP表达的绿色荧光特性。具有WTP-tTA和WTP-EGFP的昆虫显示极弱的荧光，仅仅稍高于背景自身荧光。相反，具有JY2004-tTA和WTP-EGFP的昆虫显示强烈的荧光，类似于携带在Actin5C启动子控制下的EGFP的昆虫中所见到的荧光，其被广泛用作果蝇属中的强组成性启动子(例如Reichhart和Ferrandon，1998)。当昆虫饲以添加了到100μg/ml四环素的食物时，EGFP的表达被抑制到不能检测到的水平。对于WTP-EGFP，JY2004-tTA或WTP-tTA杂合的对照昆虫不显示高于背景的荧光，不论它们是否饲以含有四环素的食物。

我们将tTA置于质粒pP[Casper-Act5C-tTA]中Actin5C启动子的控制下。饲以缺少四环素的食物给携带这种构建体和WTP-EGFP的转基因蝇，以与在具有JY2004-tTA和WTP-EGFP的相同蝇中所观察到的可比的强度显示绿色荧光。

这些结果显示正反馈构建体能够用来给出强烈的(JY2004-tTA)或微弱的(WTP-tTA)，来自适合构建体(这里是WTP-EGFP)的四环素可抑制性表达。

EGFP被广泛地用作中性报告基因。我们进一步通过将JY2004-tTA蝇与具有能够表达已知或预测有害的蛋白质的构建体的蝇杂交来对它们作进一步测试。我们将Nipp1Dm的中间结构域(Bennett等，2003；Parker等，2002)(″nipper″)，插入pJY2004中，以制成pJY2004-nipper，并用这种构建体转化果蝇属。我们还使用携带tetO-hid(Heinrich和Scott，2000)的蝇。在每种情况下，与JY2004-tTA蝇杂交都给出四环素可抑制的致死性。来自两个实例杂交的数据在下面表2中给出。

表2

利用正反馈构建体驱动果蝇属中致死基因的表达

实施例2

黑尾果蝇中的LA513

我们制成包含非自主性piggyBac转座子的构建体pLA513(SEQ IDNO.16，图6中所示的示意图)。我们通过与辅助质粒一起共注射入白眼品系中生成携带这种构建体的转基因黑尾果蝇(Handler，2002；Handler和James，2000)。对可能的转基因个体筛选DsRed2的荧光特性。回收了5个转基因品系，并命名为O513，M8，M13，F23和F24。LA513转座子的示意图显示于附图7中。

除非另外说明，将黑尾果蝇原种维持在25℃于酵母/糖/玉米/四环素培养基上(四环素(Sigma)终浓度100μg/ml)。全部实验都在25℃进行。有和无四环素的LA513/+转基因个体的存活

在有或无Tc(四环素)的培养基上将杂合的转基因个体与野生型进行至少三重杂交。在不存在任何致死性的情况下，预期这种杂交的大约一半后代将会是转基因的。利用具有荧光能力的Olympus SZX12显微镜对后代年轻成体的DsRed标记荧光进行评分[Matz等，1999]，并计算荧光性个体(转基因的)对全部蝇的比率。结果显示于下面表3中。在这些实验中，全部5种转基因品系都在不存在四环素的情况下显示100％的致死性，并且在存在100μg/ml四环素的情况下显示良好的存活(即荧光∶非荧光比率～1∶1)。在不存在Tc的情况下，小瓶观察显示少数或没有大量荧光性幼虫，尽管许多极小的荧光性幼虫存在，但同时在全部大小上都可见到非荧光性(LA513的野生型)幼虫。这提示在不存在四环素的情况下，LA513在发育早期(胚胎和/或早幼虫期)引发致死性。

表3

LA513插入是四环素可抑制的显性致死因子

显性致死性可以有几种原因。不受理论所束缚，好像可能，在不存在四环素的情况下，tTAV积聚到相到高的浓度并且这是致死性的，可能是归因为转录压制，或蛋白质降解的干扰。一个选择是，在不存在四环素的情况下，tTAV结合tetO并作为长距离增强子起作用，扰乱LA513插入附近的基因表达。这似乎是不大可能的，因为全部5种转基因品系都给也相似的结果。这些品系的每一种都源自不同的G0注射存活者，所以这些品系可能携带在不同的基因组位点上整合的LA513。我们通过反向PCR证实了这一点。下面的表4显示3种所述品系的整合位点；如由已知的piggyBac转座子的偏爱插入位点所预期的那样，在每种情况中LA513插入都在TTAA序列上。如预期的那样，3个插入实际上是在果蝇属基因组的3个不同位点上。

表4

LA513在果蝇属基因组的插入位点

品系	扩增或整合位点的序列	预测的染色体臂	预测的果蝇属细胞学	最接近的预测基因
					O513	CacagcgcatgatgagcacaTTAAcaaaatgtagtaaaatagga(SEQID NO.1)	2L	25F4-25F5	CG9171
M8	GtttcgataaatattgctatTTAAaatgcttattttcaatgcta(SEQ ID NO.2)	2L	36F6-36F6	CG15160
					F24	TttgttttctaacgttaaagTTAAagagagtccagccacatttt(SEQ IDNO.3)	2L	21C4-21C5	CG13691

侧翼序列以大写的TIAA插入位点显示。还显示了预测的染色体定位，以及最近的预测的基因；这些是基于公开的果蝇属基因组序列。

实施例3

减弱tTAV的毒性

认为tTAV的高水平表达的毒性作用是因为转录压制和/或遍在蛋白依赖型蛋白质水解通过VP16来源的部分的干扰(Gossen和Bujard，1992；Salghetti等，2001)。所以，我们通过去除所述VP16部分并代之以编码3个拷贝的源自VP16的一种多肽(PADALDDFDLDML)的合成序列来修饰tTAV(Baron和Buiard，2000；Baron等，1997)。将这种衍生物命名为tTAF；得到的质粒命名为pLA517，为SEQ ID NO.17，并且在附图8中进行图示。

用这种构建体转化黑尾果蝇，并获得一种转基因品系。将LA513杂合性雄体与野生型(对于LA513而言)雌体杂交并对后代荧光进行评分(作为成体)。如果全部后代都同等地可能存活，则全部后代的荧光性预期比例是50％。在不存在四环素的情况下，这一比例为32％，与当将亲本和后代饲以添加了100μg/ml四环素的食物时的48％相比只有适度的减少。结果显示于下面表5中。我们测试了是否在亲本的饮食中补充四环素，但所述后代并不能减弱这种致死性。在这种情况下，我们观察到一个中间比例0.37，显示母系贡献的四环素具有适度的有益作用。

表5

四环素对LA517/+果蝇属及其+/+同属存活的作用

由于单独的LA517对于生存能力具有很小影响，不像密切相关的构建体LA513，我们测试了它是否能够驱动杂合基因在tetO控制下的表达。为此，我们使用了tetO-hid(Heinrich和Scott，2000)。将对于tetO-hid杂合的蝇与对于LA517杂合的蝇杂交。在不存在四环素的情况下，只有3.4％的成体后代携带LA517。在存在100μg/ml四环素的情况下，这一比例为42％。所以LA517能够驱动杂合基因的有效表达。

表6

四环素对LA517/+，+/tetO-hid果蝇属及其+/+，+/tetO-hid同胞存活的作用

实施例4

使用四环素的类似物

使用品系F23来确定四环素的化学类似物是否能够用于替代四环素以抑制LA513的致死性。为此目的我们在0-100μg/ml浓度的范围上测试了3种类似物(厂商：四环素和多西环素，Sigma；4-epi-土霉素，AcrosOrganics；金霉素Fuzhou Antibiotic Group Corp.)。我们计算了半数最大存活所需的浓度。这些显示于下面的表7中。

表7

Tc类似物的效力

实施例5

LA513/+成体在不存在四环素情况下的寿命

LA513清楚地赋予显性致死性，在胚胎和/或早幼虫期具有活性。将幼虫饲以添加了100μg/ml四环素的食物。羽化后，将成体转移到缺少四环素的食物中。对这些成体的寿命进行测量，还对可比较的w¹¹¹⁸非转基因成体的寿命进行测量。如下面表8中所示，相对于非转基因对照，所述转基因品系显示良好的成体成活。这提示能够以此方式获得阶段特异性-这里LA513是一种幼虫/胚胎致死因子，但不是成体致死因子。

表8

LA513/+转基因果蝇属的平均成体寿命

通过假定通过饲养幼虫聚集四环素，并且将这种四环素保留至成体期，从而使它们作为成体即使在缺乏四环素的情况下也存活，有可能解释这些寿命数据。为了对此进行检验，将对于LA513/+杂合的蝇(M13品系)的幼虫饲以各种浓度的四环素。羽化后，将成体转移到缺少四环素的食物中并如上对这些成体的寿命进行测量。如下面表9中所示，幼虫膳食性四环素的浓度对于后来在缺乏四环素的情况下的成体寿命没有明显影响，暗示成体存活并非主要归因于来自幼虫喂饲的四环素的保留。在1μg/ml的浓度上，没有转基因个体存活到成体期，在3μg/ml仅有大约一半的预期数目存活到成体期，从而这种浓度接近于幼虫存活的最小值。

表9

幼虫四环素对于成体寿命的影响

对于LA513/+成体存活的另一个可能的解释是tTAV在成体中没有活性，从而所述正反馈循环不发挥作用，并且tTAV不积聚。我们通过由定量PCR随后进行逆转录酶反应(定量rt-PCR，或qPCR)测量tTAV mRNA的量对此进行检验。我们使用Taqman化学品和试剂(ABI)，以及ABIPrism 7000qPCR仪器。将每个样品分析3次；数据是这三次分析的平均值。18S引物退火到黑尾果蝇、Ceratitis capitata和埃及伊蚊(Aedesaegypti)18S RNA上，所以将这些引物用于全部三个物种。所用的引物：

18SRNA

SEQ ID NO.

正向引物：ACGCGAGAGGTGAAATTCTTG 4

反向引物：GAAAACATCTTTGGCAAATGCTT 5

TaqMan MGB探针：6-Fam-CCGTCGTAAGACTAAC-MGB 6

tTAV

正向引物：CATGCCGACGCGCTAGA 7

反向引物：GTAAACATCTGCTCAAACTCGAAGTC 8

TaqMan MGB探针：VIC-TCGATCTGGACATGTTGG-MGB 9

我们发现饲以100μg/ml四环素的O513具有0.00016(幼虫)和0.00013(成体)的tTA∶18S比率。在幼虫时饲以100μg/ml四环素，但随后在成体时转移到无四环素饮食中的成体在无四环素1，2，4和8天后分别具有0.0061，0.0047，0.0087和0.011的比率。这种相对于喂饲四环素的对照在表达上28到64倍的提高显示基于tTAV的正反馈表达系统在成体中是功能性的。

实施例6

埃及伊蚊中的LA513

用LA513转化埃及伊蚊(Aedes aegypti)(黄热蚊，也是城镇登革热的主要载体)。获得两种独立的插入品系，LA513A和LA513B。

使对于LA513A杂合的雄体(幼虫时饲以30μg/ml四环素)与野生型雌体配对。收集卵并将得到的幼虫在正常培养基中，或在添加了30μg/ml四环素(Tc)的培养基中饲养。测定来自这些卵的转基因和非转基因成体的数目。数据是至少5次实验之和。以≤250个体每升的密度饲养幼虫；在浸没之前将“无四环素”实验中的全部卵洗涤两次以避免传递四环素。对于“具有四环素”的实验，将亲本血和糖水补充以四环素到30μg/ml；对于“无四环素”实验则不这样做。转基因和野生型存活到成体比率的分化的χ²：“具有四环素”，任一方向：P＞0.05；“无四环素”，任一方向：P＜0.001(无效假设：关于LA513的表型对于存活没有影响)。

所以，LA513A是一种可抑制的显性致死因子，在这些实验中的外显率为95-97％。LA513B也是一种可抑制的显性致死因子，在这些实验中的外显率为100％。结果显示于下面的表10中。

表10

四环素对于LA513/+埃及伊蚊及其+/+同胞存活的作用

我们检查了LA513/+雄体的成活，所述雄体在幼虫时饲以四环素(30μg/ml)，但在成体时不给四环素。我们发现全部所测雄体都存活了三周，不管表型如何(LA513A/LA513A，LA513A/+或+/+)或在其饮食中存在或缺乏四环素(对于每种基因型n≥40)。

我们检查了LA513/+雄体的成活，所述雄体在幼虫时饲以四环素(30μg/ml)，但成体时不给四环素。我们发现全部所测雄体都存活了三周，不管表型如何(LA513A/LA513A，LA513A/+或+/+)或在其饮食中存在或缺乏四环素(对于每种基因型n≥40)。

我们利用qPCR研究了在停用四环素后成体LA513B/+蚊中tTAV的诱导动力学。如下表11中所示，在停用四环素后tTAV在雄体和雌体中增多。对于黑尾果蝇来说，去除Tc之后tTAV表达的诱导相当快。在每种情况中，利用这种正反馈系统，在含有不同水平四环素的食物之间转换提供了对由tTA(这里例示为tTA自身)控制的基因的表达水平进行控制的水平。

表11

在停用四环素后LA513B/+雄体tTA表达的诱导

性别无四环素的时 tTA∶18S表达比相对于具有四

间(天) 率环素的雄体的

tTA∶18S表达

雄性 0 0.00036 1

雌性 0 0.00060 1.7

雄性 3 0.0043 12

雌性 3 0.014 38

雄性 4 0.054 150

雌性 4 0.019 530

雄性 8 0.012 34

雌性 8 0.52 1500

雄性 16 0.10 280

雌性 16 0.032 88

实施例7

在正反馈构型中tTAV附近的启动子的四环素可抑制增强

我们观察到与存在四环素的情况下的模式相比，LA513A和LA513B转基因蚊的荧光标记在缺乏四环素的情况下显示不同的荧光模式。存在四环素的情况下的荧光在蚊中是典型的Actin5C驱动的表达(Catteruccia等，2000；Pinkerton等，2000)，并且在很大程度上限于胸廓的膨胀部分。相反地，在缺乏四环素的情况下，表达要强烈得多并且基本上在转基因个体的整个躯体上都明显。在每种情况中，利用荧光显微镜通过目测进行荧光强度和表达模式的评估。

所以，在这种正反馈环境中提高的tTAV表达似乎是来自附近Actin5C启动子的刺激性表达。这在图9中进行了图示。我们还发现，只是基本上足以抑制LA513的致死性的四环素中级浓度，并不抑制荧光的这种更宽的表达模式。在这些四环素中间浓度上tTAV积聚到中级水平-亚致死性的，但是高于在30μg/ml四环素中的，并且其仍然影响DsRed2的表达。这再一次示范了通过调节四环素浓度可以进行额外的控制。

图9举例说明了在513A和513B蚊中tetO₇的双向作用。在513中，DsRed2是在果蝇属Actin5C启动子的转录控制之下。

(A)在存在四环素的情况下，产生相对少的tTAV，这结合四环素并对于DsRed2表达具有小的或没有影响。DsRed2见于蚊中Actin5C表达的典型模式中。

(B)在缺乏四环素的情况下，tTAV在正反馈回路中刺激其自身的表达。

(C)tTAV结合tetO位点提高hsp70最小启动子的表达，并因此提高tTAV的表达，还提高Actin5C启动子的表达，并因此提高DsRed2的表达。

实施例8

Ceratitis capitata中的LA656，LA928和LA1124

利用pLA513没有获得地中海实蝇(medfly，Ceratitis capitata Wiedmann)的转基因品系，可能表明pLA513的基于Actin5C的标记不适用于地中海实蝇。这强调了具有广泛物种范围的表达构建体的需求。所以，我们将构建体修饰为包括基于多遍在蛋白(ubi-p63E)的标记而非pLA513的基于Actin5C的标记。一种这样的构建体为pLA656。利用基于hr5增强子的标记和来自杆状病毒(Autographica californica核多角体病毒，AcMNPV)的ie1启动子，我们还制成了两种其它构建体，pLA928和pLA1124(SEQ ID NO′s18，20和21，分别在图10，11和12中图示)。这些在所述标记关于tetO-tTAV盒的定位上不同。所述hr增强子与pLA1124中的tetO-tTAV盒比pLA928中的盒更接近。而且，pLA1124具有21个，而非7个tetO的拷贝，并且此外具有与pUASp的结合区有关的推定的GAGA因子结合区(Rorth，1998)。

由pLA656获得一种转基因品系，pLA928获得三种，而PLA1124获得三种。假定这些品系具有独立的插入，因为它们源自不同的G0注射存活者。

将每一种品系的杂合雄体与野生型雌体杂交。将后代饲以标准酵母/糖/麦芽或酵母/糖/玉米果蝇属饮食，适当补充四环素。将亲本饲以相同的饮食，在转基因雄体的情况下补充四环素至100μg/ml。不用四环素喂饲与这些雄体配对的野生型雌体，以消除任何潜在的四环素母系贡献。通过荧光显微镜对DsRed2评分来确定获自每个杂交的转基因和非转基因蛹和成体数。

这些杂交的结果显示于下面的表12中。在每种情况下，在缺乏四环素时，相对于其野生型，杂合转基因个体的存活小于2％，在含有不同水平四环素的食物之间转换，修饰所述构建体，以及利用位置效应，于本文其它地方进行讨论。

表12

四环素对于各种构建体杂合的转基因地中海实蝇，及其+/+同胞存活的作用

LA928m3	后代[Tc](μg/ml)	F/NF蛹	蛹的存活率(％)	F雄性	F雌性	NF雄性	NF雌性	成虫存活率(％)
									0	68/1026	6.6	13	4	489	449	1.8
	0.1	0/265	0	0	0	117	91	0
									1	358/446	80	154	100	228	164	65
	3	105/105	100	39	35	42	38	93
									10	nd	nd	nd	nd	nd	nd	nd
	100	245/245	100	109	121	117	108	100

F：荧光性的；

NF：非荧光性的。

收集蛹并记录荧光(栏3)，随后让其羽化。对存活的成体记录性别和荧光(栏5-8)。由这些成体上的数据，计算荧光性与非荧光性存活者的比率，在栏9中给出为相对于非荧光性观察到的荧光性成体的百分率。预期这种杂交平均给出相等的转基因和非转基因个体数；如果相等比例的转基因和非转基因个体存活到成体期，则这将给出100％的“成体存活率”。

我们通过定量(实时)rt-PCR(qPCR)进一步研究了这些转基因品系中tTA的表达。结果在下面表13中给出。

表13

在野生型和转基因地中海实蝇中tTA的表达水平

样品 tTA/18S比率 NT/T比率

幼虫

WT tet 3.13E-06

WT NT 2.81E-06

656 tet 5.80E-06 1.00

656 NT 2.06E-04 36

670A tet 2.71E-06 1.00

670A NT 1.10E-04 41

670e tet 9.70E-06 1.00

670e NT 8.40E-05 8.7

成虫

WT 雌性 2.83E-06

WR 雄性 2.16E-07

杂合的

656 tet M 0d 5.52E-06 1.00

656 tet M 8d 1.12E-05 2.0

656 NTM 0d 4.49E-05 8.1

656 NTM 2d 2.77E-04 50

656 NTM 4d 2.22E-04 40

656 NTM 8d 9.71E-05 18

656 NTM 16d 1.49E-04 27

670 M tet 4.21E-06 1.00

670 F tet 2.86E-06 0.68

670 M NT S 6.93E-05 16.45

670 F NT S 1.92E-04 45.57

928Am1 F tet 7.17E-06 1.00

928Am1 M tet 8.56E-06 1.19

928Am1 M NT

2d 1.71E-04 23.81

928Am1 M NT

4d 5.36E-04 74.72

928Am1 M NT

8d 1.91E-04 26.66

928Am1 M NT

16d 1.01E-05 1.41

928Am1 M tet

8d 1.11E-06 0.16

928Am1 M NT S 2.22E-04 31.02

928Am1 M NT S 1.51E-04 21.11

928Am3 F tet 9.09E-07 1.00

928Am3 M tet 9.09E-07 1.00

928Am3 F NTS 3.62E-05 39.85

928Am3 F NTS 8.74E-04 962.07

928Am3 F NT

S 2.99E-04 329.32

928Am3 M NT

S 5.53E-05 60.83

928Am3 M NT S 9.18E-04 1009.90

1124f1 F tet 2.86E-05 1.00

1124f1 F NT 7d 4.11E-04 14.35

1124m1 M tet 1.62E-05 1.00

1124m1 F NT S 9.30E-04 57.55

1124m2 F tet 8.98E-05 1.00

1124m2 F NT 7d 7.90E-04 8.79

纯合的

656 tet 8d 1.49E-05 1.00

656 NT 0d 9.23E-05 6.2

656 NT 2d 3.90E-03 262

656 NT 4d 1.92E-03 129

656 NT 8d 4.70E-03 316

656 NT 16d 8.58E-04 58

M：雄性；

F：雌性；

tet：饲以添加了100μg/ml四环素的食物；

NT S：饲以标准饮食(0μg/ml四环素)；

d：羽化后的天数；

NT(n)d：饲以tet饮食，随后如所示当成体时置于非tet(NT)饮食持续n天；

tet(n)d：饲以tet饮食，随后如所示当成体时置于tet饮食持续n天。

实施例9

Ceratitis capitata中的LA670

我们用pLA670转化获得地中海实蝇的单一转基因品系，所述pLA670是一种近似pLA656的构建体。这种质粒在随附的图13中进行图解，为SEQ ID NO.23。

不过，这种转基因品系给出显著数目的成体转基因后代，即使是当幼虫饲以缺乏四环素的食物的时候(表14)。但是，这种LA670插入品系确实在缺乏四环素的情况下产生可轻易检测的量的tTAV mRNA，并且这被膳食性四环素基本减弱(通过qPCR评估，结果显示于上面表13中)。所以，LA670代表一种有用的tTAV的可调控来源，用它去驱动tTAV反应性基因的表达。在结构上极其相似的LA656和LA670之间表型上的差异可能归因于位置效应，其是根据转基因在基因组中所插入的位置它们表达上的变化。这种变化还通过表型上的变化和具有相同构建体的不同转基因品系之间的tTAV表达水平来显示，如上面表13中所示。所以提供了一种获得转基因品系的简单方法，所述转基因品系携带具有不同表达水平和表型后果的正反馈构建体，包括生成一组插入品系并筛选适合的基础和去抑制的表达水平以及模式。

表14

四环素对于LA670杂合的转基因地中海实蝇，及其+/+同胞的存活的作用

F：荧光性的；

NF：非荧光性的。

我们测试了LA670驱动置于tetO转录控制下序列的表达的能力。我们分析了来自pLA1038的两种潜在mRNAs的表达(图14，SEQ ID NO.24)，所述pLA1038包含两种潜在的分开转录的tTA反应性转录单元。这些是CMV-tTA和hsp70-Cctra-nipper。对于这些转录单元在存在和缺乏pLA670的情况下的表达进行带有对照的PCR分析。两种转录单元都在pLA670存在的情况下进行表达。在缺乏LA670的情况下CMV-tTA在较低的，但可检测到的水平上于LA1038/+转基因个体中表达。hsp70-Cctra-nipper不在缺乏LA670的情况下进行可检测地表达，显示表达实际上是由，并且依赖于，pLA670提供的tTAV所驱动。

实施例10

红铃麦蛾(Pectinophora gossypiella)中的LA710

通过标准方法(Peloquin等，2000)用LA710(图15，SEQ ID NO.19)转化红铃麦蛾(粉红棉铃虫，一种鳞翅类)。回收到四种转基因品系。将这些品系的雄体与对于LA710野生型的雌体杂交。将新孵化的幼虫置于带有食物的单个1.7ml小瓶中，所述小瓶有或无7-金霉素(40μg/ml)，并对荧光进行评分。相对于其野生型同胞的数目在存活到成体期的转基因个体的数目上没有观察到显著差异，不管是有或无金霉素。我们推断LA710一般并不导致致死性水平的tTAV的积聚，即使是在缺乏膳食性金霉素的情况下。

我们通过PCR随后进行逆转录酶反应(rt-PCR)检查LA710转基因个体中tTAV mRNA的表达。我们发现，tTAV mRNA在喂养金霉素的幼虫中是不可检测出的，但在未接受金霉素的幼虫中是可以检测出的(数据未显示)。所以，在这些蛾中，这种正反馈构建体LA710提供了tTAV的一种来源，其能够通过供应膳食性金霉素而得以调控，并且去抑制的表达，尽管可以轻易检测出，对于它来说也是非致死性的。在来自不同品系的样品中我们还观察到相应于tTAV mRNA的带的强度的显著变化。

实施例11

红铃麦蛾中的LA1124

通过标准方法(Peloquin等，2000)用LA1124(图12，SEQ ID NO.21)转化红铃麦蛾(粉红棉铃虫，一种鳞翅类)。回收到单一的转基因品系。将这些品系的雄体与对于LA1124野生型的雌体杂交。将新孵化的幼虫置于带有食物的单个1.7ml小瓶中，所述小瓶有或无7-金霉素(40μg/ml)，并对荧光进行评分。当这些幼虫有时间发育到幼虫晚期时对它们再次进行筛选。如下面表15中所示，所有幼虫都存活，除了饲以缺乏金霉素食物的荧光性(LA1124/+)幼虫。

表15

粉红棉铃虫：饲以有或无金霉素食物的LA1124/+或其野生型同胞从幼虫早期到幼虫晚期的存活

我们通过PCR随后进行反转录酶反应(rt-PCR)检查LA1124粉红棉铃虫中tTAV mRNA的表达。我们发现tTAV mRNA在喂养金霉素的幼虫中可以轻易检测出，但在未接受金霉素的幼虫中显著提高(数据未显示)。在这种构建体中tTAV mRNA显著的基础表达也许归因于在LA1124中包含了hr增强子，其是为此原由而被包括的。LA1124的结构和功能与LA710的结构和功能的比较清楚地表明所述基因产物的基础和最大水平能够通过表达构建体的适当修饰而容易进行选择，在这里这种原理被tTAV依赖型RNA(在此情况下是tTAV mRNA)的表达的调控水平所证实。

实施例12

利用正反馈的性别特异性表达

优选通过设计控制来自正反馈构建体的tTAV的表达，从而使得它能够在例如，不同组织，或不同发育阶段，或不同性别中得以差别表达。对此的一种应用是在遗传雌雄分离中，其中在两种性别之间诱导性别双态现象并且这被用作分离两种性别的基础。在不育昆虫技术(Sterile InsectTechnique)的背景下，例如，对于地中海实蝇来说，这优选意味着杀死雌体，最优选在其发育早期。对于地中海实蝇来说没有已知的早期作用的雌性特异性启动子，这限制了所述二组分可抑制显性致死系统的潜能，所述系统是对于果蝇属进行例示的，其使用来自卵黄蛋白基因的启动子或增强子(Heinrich和Scott，2000；Thomas等，2000)。能够将条件性正反馈系统的有益特性与赋予雌性特异性的机制结合将是显然有利的。

所以，我们通过插入来自Cctra的性别特异性内含子区，黑尾果蝇性别转换基因的地中海实蝇同源物(Pane等，2002)，修饰了非性别特异性的正反馈构建体。Cctra的性别特异性剪接在图16中进行图示，其修改自Pane等，2002，同上。图16显示地中海实蝇tra基因的基因组组成。上面的线条代表基因组Cctra基因座。外显子显示为块形；aug标记共有的起始密码子。交替的剪接界被标记为i。用箭头标记推断的tra/tra-2结合位点。唯一编码功能性Cctra蛋白质的转录物F1是特异于雌性的。在雄性和雌性中都发现了转录物M1和M2。

产生了三种主要的转录物：M1，M2和F1。转录物F1只在雌体中发现，并且是唯一编码全长的功能性Cctra蛋白质的转录物。转录物M1和M2在雄性和雌性中都被发现，并且包括额外的外显性序列，其相对于转录物F1插入一个或多个终止密码子，导致开放阅读框的截断。

我们将Cctra内含子插入tTAV的开放阅读框中，从而使得以转录物F1的方式通过完整内含子的剪接进行的切除将重构一个完整的tTAV编码区，但是以M1或M2的方式进行的剪接将导致一个截短的蛋白质，其不能够作为转录增强子而起作用。将得到的质粒，pLA1188(图17，SEQ IDNO.22)，注射入地中海实蝇胚胎中。回收存活的幼虫，并通过rt-PCR分析来自这些幼虫的提取物以确定所述tTAV转录物的剪接模式。

雌性幼虫产生对应于预期大小的PCR产物，其产生自内源性Cctra基因模式中的剪接，换句话说对应于M1，M2和F1模式中的剪接。这些数据显示Cctra内含子能够在异源背景下正确地剪接，所以提供了一种合适的方法将性别特异性引入正反馈构建体中。另外，由于tra功能在广泛的系统发生范围中是保守的(Saccone等，2002)，并且其它的性别特异性内含子是已知的，例如在黑尾果蝇基因double-sex(dsx)中，其也是相当保守的，这提供了一种一般性方法来操作基因的表达。对于本领域技术人员来说显而易见的是，这些操作能够选择性地，或另外地，应用到其它对于转录激活剂有反应的基因上，从而能够通过将转录激活剂的非性别特异性表达与性别特异性表达组合，例如通过在所述转录激活剂的转录控制下的功能性RNA的剪接，来实现靶基因的性别特异性表达。而且，还将会显而易见的是这提供了两种或更多种不同的靶基因，或基因产物的差别表达的简单机制，从而使一个，或一组在两种性别中都得以表达，并且其它的，或其它组只在一种性别中表达。这在图18中对于地中海实蝇进行图示。所用的引物是：

Tra(tTAV)Seq+：5′-CCTGCCAGGACTCGCCTTCC(SEQ ID NO.12)

Tra(tTAV)Seq-：5′-GTCATCAACTCCGCGTTGGAGC(SEQ ID NO.13)

当源自雌性地中海实蝇1和2的cDNA被用作模板时产生～600和～200bp的RT-PCR产物，分别代表mRNA的“雄性”(M1和M2)和雌性特异性(F1)的剪接形式(数据未显示)。由于tTAV DNA的污染可以产生～200bp的产物-雌性被剪接形式完全去除了Cctra内含子从而导致一种PCR产物，其与获自几种含tTAV质粒或样品的任一种的PCR产物相同，所述质粒或样品是在相同实验室中处理的。相反，所述～600bp的带，保留～400bp的Cctra序列并且是所述构建体正确剪接的诊断。

在另一个实验中(数据未显示)，通过凝胶层析(数据未显示)对响应于来自LA670的tTAV的来自LA1038的转录物的表达进行分析，利用：

A：在来自LA1038/+，LA670/+双重杂合子的提取物中对来自LA1038的CMV-tTA的表达进行的rt-PCR；

B：在来自LA 1038/+，LA670/+双重杂合子的提取物中对hsp70-Cctra-nipper的表达进行的rt-PCR；

C：在来自无LA670的LA1038/+杂合子的提取物中对来自LA1038的

CMV-tTA的表达进行的rt-PCR。

全部蝇都在缺乏膳食性四环素的情况下饲养。在A和C中，在200bp和400bp之间存在两条带，分别代表来自剪接mRNA的cDNA(较低的分子量带)和来自未剪接信息的基因组DNA或cDNA(较高的分子量带)。在B中，于大约200bp上的一条带代表来自mRNA的cDNA，所述mRNA以Cctra雌性特异性F1转录物的模式剪接，上面的大约1500bp的带代表来自未剪接信息的基因组DNA或cDNA，以及代表以Cctra非性别特异性M1和M2转录物的模式剪接的cDNA的中间大小的带，或者非特异性带。所用的引物为：

hsp70-Cctra-nipper：NIP：5′-CATCGATGCCCAGCATTGAGATG和

HSP：5′-CAAGCAAAGTGAACACGTCGCTAAGCGAAAGCTA；

CMV-tTA：CMV：5′-GCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAG和

TTA：5′-GCCAATACAATGTAGGCTGCTCTACAC

这些数据(未显示)表明LA1038的hsp-Cctra-nipper部分显示在6/6雌性中以雌性形式正确剪接，并且在6/6雄性中以雄性形式正确剪接。参考序列：

JY2004-tTA(SEQ ID NO.14)-唯一tetO₇-tTA区的序列

pP[Casper-Act5C-tTA](SEQ ID NO.15)

pLA513(SEQ ID NO.16)

pLA517(SEQ ID NO.17)

pLA656(SEQ ID NO.18)

pLA670(SEQ ID NO.23)

pLA710(SEQ ID NO.19)

pLA928(SEQ ID NO.20)

pLA1038(SEQ ID NO.24)

pLA1124(SEQ ID NO.21)

pLA1188(SEQ ID NO.22)

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Claims

1.一种昆虫基因表达构建体，其包含至少一种待表达的基因和至少一个因之的启动子，其中待表达的基因的产物对于所述至少一个启动子作为阳性转录控制因子而起作用，并且由此所述产物或所述产物的表达是可以控制的。

2.权利要求1的构建体，其中一种增强子与所述启动子相关联，所述基因产物通过所述增强子作用来提高所述启动子的活性。

3.权利要求2的构建体，其中所述控制因子是tTA基因产物或其类似物，并且其中一种或多种tetO操纵基因单元被可操作地与启动子连接并且是增强子，tTA或其类似物通过tetO作用来提高所述启动子的活性。

4.权利要求3的构建体，其中所述基因编码tTAV或tTAF产物。

5.权利要求1的构建体，其中对所述基因进行修饰以便至少部分地遵循使用所述构建体的物种中的密码子用法。

6.权利要求1的构建体，其中所述启动子在缺乏阳性转录控制因子的情况下是失活的。

7.权利要求1的构建体，其中所述启动子是最小启动子。

8.权利要求7的构建体，其中所述启动子选自：hsp70，P最小启动子，CMV最小启动子，基于Act5C的最小启动子，BmA3启动子片段，Adh核心启动子，以及Act5C最小启动子，或其组合。

9.权利要求1的构建体，其中所述启动子源自CMV或Hsp70，或是CMV或Hsp70的片段。

10.权利要求1的构建体，当被激活或去抑制时其减小适合度。

11.权利要求10的构建体，其包含在所述构建体的启动子控制下的致死基因。

12.权利要求11的构建体，其中所述致死基因是显性致死的。

13.权利要求11的构建体，其中所述致死基因和阳性对照基因是相同的。

14.权利要求13的构建体，其中所述基因是tTA或其类似物。

15.权利要求11的构建体，其中所述致死基因和阳性对照基因是不同的。

16.权利要求10的构建体，其中所述减小的适合度是高死亡率。

17.权利要求1的构建体，其中所述阳性对照基因的表达是选择性的。

18.权利要求17的构建体，其中所述基因的表达由性别决定。

19.权利要求18的构建体，其包含双性基因，性别转换基因或性别特异性致死因子序列。

20.权利要求1的构建体，其中将效应物基因可操作地与至少一个所述启动子连接。

21.权利要求20的构建体，其中所述效应物基因是显性致死基因。

22.权利要求20的构建体，其中所述效应物基因编码RNAi。

23.权利要求20的构建体，其中可操作地连接所述效应物基因的启动子的激活通过在所述启动子控制下的DNA的转录或翻译产物导致选择性效应。

24.权利要求17的构建体，其中选择是物种特异性的。

25.权利要求17的构建体，其中选择是发育阶段特异性的。

26.权利要求1的构建体，其是至少一个顺反子。

27.权利要求26的构建体，其是至少两个顺反子，所述顺反子连接于所述阳性对照基因控制下的增强子。

28.权利要求1的构建体，其中所述阳性对照基因在去除所述基因的抑制剂后的表达对于成体的适合度没有影响，所述成体已经去除了所述抑制剂。

29.权利要求1的构建体，由绝缘体元件所划界。

30.权利要求29的构建体，其中所述绝缘体是不相同的绝缘体。

31.由SEQ ID NO.16所示的pLA513。

32.由SEQ ID NO.14所示的JY2004-tTA。

33.一种载体，其包含权利要求1的构建体。

34.权利要求33的载体，其进一步包含表达标记。

35.权利要求34的载体，其中所述表达标记是荧光蛋白或抗性标记。

36.权利要求33的载体，其进一步包含可表达的转座酶基因。

37.一种建立启动子与昆虫物种相容性的方法，其包括用含有按照权利要求1的构建体的质粒或其它载体转化所述昆虫细胞，所述构建体具有待检测的启动子，所述启动子与待分析基因可操作性地关联，所述质粒进一步包含在适于所述昆虫的启动子控制之下的标记，所述方法进一步包括对推定的转基因细胞分析所述标记的表达，其中对表达所述标记的细胞随后分析待分析基因的表达。