PT1649027E

PT1649027E - Sistemas de expressão para o controlo de pragas de insetos

Info

Publication number: PT1649027E
Application number: PT47435904T
Authority: PT
Inventors: Luke Alphey
Original assignee: Oxitec Ltd
Priority date: 2003-07-28
Filing date: 2004-07-28
Publication date: 2014-02-25
Also published as: WO2005012534A1; US10844402B2; CN1860235B; GB0317656D0; AU2004261782A1; EP1649027B1; ES2447422T3; US9133477B2; US10059961B2; BRPI0413024B1; AU2004261782B2; US20060242717A1; BRPI0413024A; CN1860235A; US20160060651A1; GB2404382A; GB2404382B; US9121036B2; US20070056051A1; EP1649027A1

Description

ΕΡ1649027Β1

DESCRIÇÃO

SISTEMAS DE EXPRESSÃO PARA O CONTROLO DE PRAGAS DE INSETOS A presente invenção refere-se a sistemas de expressão de insetos que compreendem um promotor. A manipulação genética de espécies de insetos para além de Drosophila melanogaster, por métodos de ADN recombinante, está na sua infância (Alphey, 2002, Alphey e Andreasen, 2002, Alphey et ai., 2002, Benedict e Robinson, 2003, Berg-hammer et al., 1999, Catteruccia et al., 2000, Coates et ai., 1998, Handler, 2002, Horn et al., 2002, Jasinskiene et al., 1998, Lobo et al., 2002, Lozovsky et ai., 2002, McCombs e Saul, 1995, Moreira et al., 2004, Peloquin et ai., 2000, Perera et ai., 2002, Scott e tal., 2004), e foram feitas muito poucas linhas transgénicas de insetos que não Drosophila, utilizando promotores heterólogos. A transformação de insetos é um sistema de baixa eficiência, que requer a identificação de transformantes raros, numa base de fundo de um número maior de indivíduos nao transformados.

E portanto .mportante, aue transformantes tenham um marcador facilmente avaliado. Os preferidos atualmente são as proteínas fluorescentes, tais como a GFP, a DsRed e os seus derivados mut antes. Estes exigem para. a sua função elementos de controlo de transcrição, incluindo um promotor. Os mais conhecidos destes são dos genes de ActinSC (Act5C) e de ubi-p63E (Pub) de Drosophila. Também tem sido utilizado um homólogo de Act5C, BmA3, de bicho da seda, bem como um par de promotores específicos de tecidos (3xP3, um promotor sintético 1 EP1649G27B1 específico de olhos, e Act88F, específico pcLra os muscuios aéreos indiretos).

No entanto, nenhum destes promotores é inteiramente satisfatório. Act5C tem sido usado para transrormar vários mosquitos, assim como Drosophila, mas o seu padrão de expressão em mosquitos está longe de ser ubíquo (Catteruccia et al., 2000, Pinkerton et al., 2000). Os esforços para usá-lo como parte de um marcador de transformação em mosca da fruta mediterrânica (Ceratitis capitata) falharam, onde experiencias equivalentes com Pub alcançaram um bom sucesso. Pub apresenta limitações semelhantes: o padrão de expressão observado em transformantes da mosca da fruta mediterrânica é altamente variável, o que sugere que o padrão de expressão é, pelo menos, altamente sensível ao efeito de posição. Para além disso, nenhum destes promotores pode ser regulado, no sentido de ser ligado e desligado como desejado.

Fussenegger et al., (1998a, 1998b) ilustram, num exemplo, um controlo retrógrado positivo conduzindo transcriptos multicistrónicos, usando um marcador de seleção. As experiências foram restritas a sistemas de mamíferos. pTRIDENT é descrito como u.m operão artificial tricistrónico de mamíferos. A expressão, ou a expressão transitória, de genes de impedimento do ciclo celular é descrita por "engenharia metabólica", ou se ja, a regulação da expressão das proteínas desejadas, e Θ referido que um efeito transcricional de "sileneiamento" pelo domínio transativador VP16 pode ser letal para a célula hospedeira, mesmo com níveis moderados de expressão (Berger et al., 1990, Damke et al., 1995, Gi.1.1 e Ptashne, 1988, Gossen e Bujard, 1992, Salghetti et al., 2001). São discutidas as vantagens de 2 ΕΡ1649027Β1 sistemas autoreguladores mono ou policistrónicos, incluindo sistemas de expressão multicistrónicos de mamíferos de uma etapa, autorregulados e autosseletivos, que incluíam tTA numa configuração multicistrónica, baseada em pTRIDENT ou quatrocistrónica (pQuattro-tTA, Fussenegger et al., (1998b), figura 2) . Uma vez que o gene tTA é codificado na própria unidade de expressão multicistrónica, pouco ou nenhum tTA é expresso sob condições de repressão. Este sistema de regulação por controlo retrógrado positivo não mostrou nenhuns sinais de silenciamento. As experiências com uma configuração monocistrónica de controlo retrógrado positivo em animais transgénicos também não mostraram nenhuns efeitos prejudiciais (Shockett et al., 1995). Têm sido caracterizados muito poucos promotores ou outros elementos de controlo, e continua a haver uma necessidade urgente para tais elementos. Seria desejável proporcionar um promotor universal ativo em todas, ou na maioria das células, de uma grande variedade de insetos, ou permitir a utilização mais generalizada de um promotor existente. É ainda um objetivo, a regulação da atividade dos promotores de insetos, especialmente de um modo específico do estádio de vida. e/ou do sexo. É também um objetivo, a redução ou eliminação seletiva da atividade do promotor em células ou tecidos específicos. A presente invenção proporcionai ditos sistemas.

Surpreendentemente, foi agora descoberto que é possível utilizar um mecanismo de controlo retrógrado positivo tanto para aumentar o efeito de um promotor de insetos, bem como para controlar a sua expressão. 3 ΕΡ1649027Β1

Assim, num primeiro aspeto, a presente invenção proporciona um sistema de expressão de genes de insetos, que compreende pelo menos um. gene a ser expresso e, pelo menos, um promotor para o mesmo, em que um produto de um gene a ser expresso serve como um fator de controlo transcricional positivo para, pelo menos, um promotor, e em que o produto, ou a expressão do produto, é controlável.

Tal como aqui utilizado, o termo "gene" refere-se a qualquer sequência de ADN que pode ser transcrita ou traduzida num produto, pelo menos um que tenha atividade ou função in vivo. Dito gene terá normalmente, pelo menos, um promotor de transcrição e, um terminador operacionalmente associado com o mesmo. 0 produto capaz de controlo transcricional positivo pode atuar de qualquer forma adequada. Sm particular, o produto pode ligar-se a um potenciador localizado na proximidade do promotor ou promotores, servindo assim, por exemplo, para. reforçar a ligação da polimerase no promotor. Podem ser utilizados outros mecanismos, tais como os mecanismos de contra-ação de repressor, tais como o bloqueio de um inibidor de transcrição ou. tradução. Os inibidores da transcrição podem ser bloqueados, por exemplo, pelo uso de ganchos de ARN ou de ribozimas para bloquear a tradução do ARNrn que codifica para o inibidor ou, por exemplo, o produto pode ligar-se diretamente ao inibidor, impedindo assim a. inibição da. transcrição ou tradução.

Ma is preferencialmente, o mecanismo é um mecanismo de controlo retrógrado positivo, em que o produto, qu.e pode quer ser ARN como o produto de tradução do mesmo, atua num local 4 ΕΡ1649027Β1 potenciador da transcrição, normalmente por ligação no local, aumentando assim a atividade do promotor. 0 aumento da atividade do promotor serve em seguida para aumentar a transcrição do gene para o produto que, por sua vez, serve ainda para quer retirar a inibição ou aumentar a promoção, conduzindo assim a um ciclo de controlo retrógrado positivo. 0 controlo do produto pode ser realizado por quaisquer meios adequados, e pode ser eficaz a qualquer nível. Em particular, é preferível que o controlo seja eficaz quer para bloquear a. transcrição do gene do fator de controlo, ou para bloquear a tradução do produto de ARN do mesmo, ou para evitar ou inibir a ação do produto de tradução do gene.

Por exemplo, o produto do gene de tTA (ativador da transcrição reprimível por tetraciclina) atua na sequência operadora de teto (Baron e Bujard, 2000, Gossen et ai., 1994, Gossen e Bujard, 1992) . A montante de um promotor, em qualquer orientação, teto é capaz de aumentar os níveis de transcrição de um promotor, em estreita proximidade do mesmo, quando ligado pelo produto do gene de rTA. Se o gene de rTA é parte da cassete que compreende o operador o.e teto junramente com o promotor, então ocorre de controio retrógrado positivo quando o produto do gene de tTA e expresso. O controlo deste sistema é facilmente alcançado por exposição a tetraciclina, a qual se liga ao produuo do gene e impede a transactivação de tetO. O sistema de tTA também tem a vantagem de proporcionar uma toxicidade específica do estádio num número de espécies. Em particular, e observado silenoiamento nos estádios de 5 ΕΡ1649027Β1 desenvolvimento de muitos insetos, sendo o estádio exato de insetos suscetíveis dependente da espécie. Alguns insetos podem atingir o estádio de pupa antes de a larva morrer, enquanto que outros morrem mais cedo. Ά suscetibilidade varia de 10 0% de letal idade até uma pequena redução nas taxas de sobrevivência. No entanto, em geral, os insetos adultos parecem ser imunes ao efeito de silenciamento de tTA, de modo que é possível criar insetos que compreendem um sistema de controlo retrógrado positivo de tTA na presença de tetraciclina, e, em seguida, libertar os insetos adultos na natureza. Estes insetos estão a pouca ou nenhuma desvantagem competit iva com os do tipo selvagem, e irão cruz ar-se com os insetos do tipo selvagem, mas as larvas qi ae transportam a cassete de cont rolo retrógrado positivo de tTA irão morrer antes de atingirem a maturidade. É relativamente fácil modificar a sequência de tTA para melhorar a compatibilidade com as espécies de insetos desejadas, e isto foi demonstrado nos exemplos que se seguem com tTAV, o qual tem dois aminoácidos adicionais para proporcionar um sítio de protease, mas que é codificado por uma sequência substancialmente alterada da de tTA, a fim de acompanhar mais de perto o uso de Drosophila.

Consequentemente, num aspeto preferido, a presente invenção proporciona um sistema tal como descrito, em que pelo menos um gene é de tTA, ou é um gene que codifica um produto semelhante a tTA, eficaz para regular positivamente o promotor de tetO.

Assim, a presente invenção é útil em combinação com um. gene letal dominante, permitindo a expressão seletiva do gene 6 ΕΡ1649027Β1 letal dominante, ou a expressão específica do estádio, tal como desejado, do gene letal ou do fenótipo letal. Será apreciado que o gene letal dominante não precisa de ser uma parte integrante do mecanismo de controlo retrógrado positivo, mas pode, por exemplo, ser parte de uma cassete bicistrónica. É particularmente preferida a utilização da presente invenção em associação com RIDL (libertação de insetos que transportam um dominante letal). 0 controlo do mecanismo de controlo retrógrado, no caso de tTA ou um análogo do mesmo, é efetuado simplesmente pela presença ou ausência de tetraciclina, ou através da modulação da concentração de tetraciclina, quando é usado o produto do gene de tTA. No caso de um outro sistema preferido de controlo retrógrado positivo, GAL4, isto pode, por exemplo, ser controlado pela temperatura, suprimindo assim o gene eficaz, de preferência um gene letal dominante, até à libertação do inseto.

Também podem ser empregues outros mecanismos, tais como as ribozimas ou antissentido ou moléculas de ARN parcialmente autocomplementares, tais como o gancho de ARN, para inibir ou impedir a expressão de um péptido de ativação, ou de agentes de bloqueio, que impedem a ligação do ativador ao local potenciador. expressos pelo ou podem, por de cultura.

Tais agentes de bloqueio podem ser próprio inseto sob condições seletivas, exemplo, ser administrados como parte do meio

No caso de o bloqueio, produzidos pelo inseto, é ou agentes de controlo, serem então preferível que a sua 7 ΕΡ1649027Β1

expressão seja seletiva, tal como ser especifica ao sexo. A ΕΡ1649027Β1 administração do agente bloquei exemplo, permitirá a supress retrógrado positivo em todas libertação do inseto, após o específica do estádio ou do geração sucessiva, sendo partici geração. dor no meio de cultura, por ío da cassete de controlo as circunstâncias, até à que irá ocorrer a seleção sexo, de preferência, numa larmente preferida a seguinte

Mais preferencialmente, a cassete que compreende o mecanismo de controlo retrógrado positivo está associada com especificidade do estádio ou do sexo. Por exemplo, o processamento específico do sexo é observado com os mecanismos transformer e doublesex vistos na maioria dos insetos, e pode ser utilizado para limitar a expressão do sistema de controlo retrógrado a um determinado sexo, quer, por exemplo, através da utilização de processamento específico do sexo para eliminar a totalidade ou parte do gene efector, ou para incorporar um desvio de quadro ou de codão de terminação, ou para modular a estabilidade de AP.N ou a eficiência de translação de ARNm, ou de outro modo para afetar a expressão de modo a diferenciar entre os dois sexos. É particularmente preferido o direcionamento às fêmeas de espécies de pragas.

Embora seja possível proporcionar o gene efector num local separado e, mesmo num cromossoma separado, é geralmente preferível ligar o gene efector com o gene de controlo retrógrado. Isto pode ser alcançado quer através da colocação dos dois genes em conjunto, incluindo a possibilidade de fornecer os dois como um produto de fusão, ou por exemplo, proporcionado cada gene com o seu próprio promotor em 8 EP1649G27B1 orientações opostas, mas em justaposição com o local potenciador.

Um gene efector é o gene cuja expressão se deseja melhorar. Sempre que um produto de controlo retrógrado positivo é também eficaz como um letal específico do estádio, tal como tTA em muitas espécies, então o efector e o gene de controlo retrógrado podem ser um e o mesmo, e esta é uma realização preferida. 0 gene efector será muitas vezes um gene letal, e prevê-se que o sistema da presente invenção seja empregue mais frequentemente no controlo de populações de pragas de insetos, em particular em combinação com a técnica RIDL ou um método relacionado, tal como descrito aqui em seguida. É preferível incluir um marcador com os sistemas da invenção, tal como o DsRed, a proteína fluorescente verde, e variantes dos mesmos, uma vez que as taxas de sucesso de transformação em insetos são extremamente baixas, de modo que é útil para ser capaz de selecionar de alguma forma. 0 promotor pode ser um promotor grande ou complexo, mas estes muitas vezes sofrem a desvantagem de ser mal ou irregularmente utilizados quando introduzidos em insetos não hospedeiros. Por conseguinte, é preferível empregar promotores mínimos, tais como o promotor Hsp70 que, embora tendo naturalmente um baixo nível de atividade, pode ser substancialmente melhorado por um cenário de controlo retrógrado positivo, tal como pelo uso de tTA e teto.

Um promotor é uma sequência de ADN geralmente 9 ΕΡ1649027Β1 diretamente a montante da sequência codificante, necessária para a transcrição basal e/ou regulada de um gene. Em particular, um promotor tem informação suficiente para. permitir a iniciação da transcrição, tendo em geral um local de iniciação da transcrição e um local de ligação para o complexo de polimerase. Um promotor mínimo terá geralmente sequência adicional suficiente para permitir que estes dois sejam eficazes. Outra informação de sequência, tal como, por exemplo, a que determina a especificidade do tecido, está geralmente ausente, e os promotores mínimos preferidos são, normalmente, como um resultado direto desta deficiência, substancialmente inativos na ausência de um potenciador ativo. Assim, um cistrão, ou sistema, sendo de preferência aqui os dois termos geralmente intermutáveis, da invenção, será em geral inativo, quando o ou cada promotor é um promotor mínimo, até que um potenciador adequado ou outro elemento regulador é desreprimido ou ativado, tipicamente o produto do gene.

Assim, será apreciado que os promotores mínimos podem ser obtidos diretamente a partir de fontes conhecidas de promotores, ou derivados de promotores maiores de ocorrência natural, ou de outro modo conhecidos. Os promotores mínimos adequados, e como obtê-los, serão evidentes para os peritos ηει tecnologia. Por exemplo, os promotores mínimos adequados incluem um promotor mínimo derivado de hsp70, um promotor mínimo de P (exemplif icado aqui em seguida como WTP-tTA) , um promotor mínimo de CMV (exemplificado aqui em seguida como JY2004-tTA), um promotor mínimo baseado em ActSC, um fragmento de promotor de BmA3, e um promotor central de Adh (Bieschke, E., Wheeler, J. e Tower, J. (1998). Doxycycline-induced transgene expression during Drosophila development 10 ΕΡ1649027Β1

and aging. Mol Gen Genet 258, 571-579). Act5C responde a tTA emAedes transgénicos, por exemplo, e a invenção.

Nem todos os promotores mínimos funcionarão necessariamente em todas as espécies de insetos, mas é prontamente evidente para os especialistas na tecnologia sobre a forma de garantir que o promotor é ativo. Por exemplo, um plasmídeo ou outro vetor, que compreende um cistrão da invenção com o promotor mínimo a ser testado, compreende ainda um marcador, dito gene codifica para uma proteína fluorescente sob o controlo de um promotor conhecido por trabalhar nessa espécie, compreendendo ainda o método o ensaio de indivíduos transgénicos putativos para ci expressão do marcador, e em que os indivíduos que expressam o marcador são então testados para a expressão do gene sob o controlo do promotor mínimo, tal como por ensaio de ARN transcrito. A presença do ARN acima dos níveis de fundo sob condições induzidas ou desreprimidas é indicativo de que o promotor mínimo é ativo na espécie sob investigação, a ausência ou presença de dito ARN em apenas níveis baixos em condições não induzidas ou reprimidas é indicativo de que o promotor mínimo tem baixa atividade basal intrínseca. Nós utilizámos os promotores de marcador que se seguem apenas por meio de exemplo, mas muitos outros são úteis e evidentes para os peritos na tecnologia:

JY2004-tTA mini-branco promotor de promotor de promotor de (promotor branco): WTP2-tTA, Act5C: LA513 e LA517 ubi-p63E: LA656 e LAI038 BmA3: LA710 LA928, LA1124 e LA1188 potenciador hr e promotor iel 11 ΕΡ1649027Β1 e todos estes são úteis como, ou na preparação de, promotores mínimos.

Será apreciado que um cistrão, ou sistema, da invenção pode compreender dois ou mais cistrões. Um sistema pode ainda incluir elementos não ligados, tais como onde um segundo gene a ser expresso está distante do cistrão de controlo retrógrado positivo.

Assim, num aspeto preferido, a presente invenção fornece construções de controlo retrógrado positivo da forma geral mostrada na figura 1 anexa. Neste cenário, a proteína ativadora da transcrição reprimível por tetraciclina (tTA), quando expressa, liga-se à sequência operadora de tetO e, dirige a expressão de um promotor mínimo na proximidade. Na configuração mostrada, esta, em seguida, dirige a expressão de tTA, a qual se liga em seguida a tetO, e assim por diante, criando um sistema de controlo retrógrado positivo. Este sistema é inibido pela tetraciclina, que se liga a tTA e impede-a de se ligar a tetO. A expressão é controlável, e isto pode ser alcançado através da ligação operacional do promotor a um fator de transcrição controlável. Tal como ilustrado anteriormente, este pode ser tTA (reprimível por tetraciclina ou induzível por tetraciclina), ou qualquer outro sistema de fator controlável, tal como GAL4 (que é um pouco sensível ao frio, e pode ser ainda mais controlada através do uso de GAL8 0 ou mutantes da mesma), ou, por exemplo, o sistema de expressão regulado por estreptogramina. Será apreciado que outros locais de ligação para o fator de transcrição apropriado irão depender do fator de transcrição em causa, tal como, por 12 ΕΡ1649027Β1 exemplo, UASGal4 (sequência de ativação a montante) para GAL4.

Os sistemas preferidos da presente invenção possuem níveis elevados de expressão induzida, de preferência, disponíveis a vários níveis induzidos, com um baixo nível de expressão basal do gene regulado, mas também de qualquer outro componente, e de preferência através de uma gama de espécies. Os níveis basais são preferencialmente baixos ou substancialmente inexistentes, onde a expressão é fortemente prejudicial, mas os níveis aceitáveis irão depender do efeito do produto. Os níveis máximos não irão no geral ser um problema, uma vez que a condição de controlo retrógrado positivo irá muitas vezes fornecer níveis fatais de expressão e, mesmo quando a expressão do produto não é fatal, ou associada com. consequências fatais, é suscetível de ser expresso em concentrações muito mais altas do que a maior parte dos produtos do gene.

Onde é desejado um nível basal de expressão, pode então ser empregue uma sequência promotora que não precisa da presença do potenciador, embora irá então geralmente, haver de controlo retrógrado. A menos que haja um nível de corte de controlo retrógrado, abaixo do qual o produto de controlo retrógrado não irá funcionar, será então apreciado que é preferível manter a um mínimo a expressão do gene de controlo retrógrado.

Diferentes construções da invenção (descritas nos exemplos anexos) têm atividade variável, de acordo com os componentes das construções. Por exemplo, em Drosophila: WTP-tTA dá um baixo nível de expressão induzida (não 13 ΕΡ1649027Β1 reprimida), JY2004-tTA dá uma expressão forte quando não reprimida, aproximadamente equivalente a Act5C-tTA, LAS13 é letal quando não reprimida.

As primeiras duas parecem dar expressão constitutiva, tal como avaliado através da utilização de um gene repórter (tRE-EGFP), isto é difícil de avaliar para a LA513 letal, embora a 10 yg/ml de tet, apenas suficiente para uma boa sobrevivência, LA51.3 em Drosophila dirige a expressão de um gene repórter tetCp-EGFP, tanto na linha germinai.iva do macho como da fêmea, em adultos, bem como em células somáticas. Isto distingue-a de ActSC, comummente usado como um promotor "ubíquo, constitutivo", que na verdade, não se expressa bem nestas células.

As propriedades destas construções estão apresentadas na tabela 1, em seguida.

Tabela 1

Expressão Promotor máx mínimo Intrão Região codificante otimizada? 3'UTR e poliA WTP—tTA Baixa P PPla96A Não fs (1)K10 JY2004- tTA Alta CMV β- globina de coelho Não β-globina de coelho LA513 Muito (letal altaHspã 0 ) Adh Sim fs (1)K10

Assim sendo, será apreciado que o nível de expressão induzido ou não reprimido pode ser modificado numa forma util e previsível, ajustando a sequência do sistema de controlo retrógrado positivo. A toxicidade e/ou a atividade da proteína 14 ΕΡ1649027Β1 tTA pode ser modificada de forma independente dos sinais de controlo da transcrição e tradução por várias abordagens, por exemplo, o uso de um sinal de localização nuclear, a modificação do domínio de ativação, etc (veja-se Fussenegger, 2001, para mais exemplos) . A letalidade de LA513 é útil pelas razões expostas anteriormente, e, mais particularmente, porque: a) Proporciona um sistema de gene letal reprimível altamente eficaz, compacto, b) Como usa apenas elementos de controlo simples de Drosophila (promotor mínimo hsp70, um pequeno intrão e um terminador de fs (1) KlO), ele, ou a sua cassete de expressão funciona ao longo de uma ampla gama filogenética, c) Tem muito pouco, se algum, efeito deletério sobre adultos, mesmo na ausência de tetraciclina. Esta é uma propriedade altamente desejável e surpreendente para uso em campo, por exemplo, num programa de controlo baseado em RIDL, uma vez que os adultos libertados devem ser competitivos e de longa duração para a plena eficácia do programa. Será apreciado que o efeito do sistema da invenção pode ainda ser modificado pela incorporação de um letal eficaz em adulto, por exemplo, na configuração de "controlo retrógrado positivo - expressão bidirecional" aqui descrita, e d) Pela sua natureza, a "conversa cruzada" entre os vários elementos é minimizada. Isto é, porque: (i) o centro da construção é apenas um único elemento de composição, em vez dos dois normais em. sistemas de expressão bipartidos, (ii) o principal potenciador da 15 ΕΡ1649027Β1 componente autorreguladora, os locais de ligação de tTA, é substancialmente ativo apenas na ausência de tetraciclina e, (iii) é pouco provável que seja significativamente prejudicial a expressão modesta de tTA sob a influência de um potenciador próximo, seja noutra parte da construção ou na cromatina vizinha. JY2004-tTA também é útil, na presente invenção.

Sem estar limitado pela teoria, o mecanismo pelo quar LAS 13 mata os embriões e as larvas iniciais, mas nao os adultos, parece ser uma propriedade inerente da sua toxicidcide. A toxicidade de tTA é acreditada derivar do "silenciamento transcricional", em que a expressão de elevado nível, do domínio ativador de transcrição (no caso de tTA este é VP16 ou um fragmento do mesmo) liga elementos da maquinaria transcricional e separa-os, o que leva a um efeito geral na transcrição, ainda que também possa atuar para saturar a via de degradação da ubiqu.it ina. 0 silenciamento transcricional é o efeito que se pensa levar a efeitos deletérios em linnas celulares de mamíferos que expressam tTA em níveis elevados, no contexto da expressão otimizada de LA513, o controlo retrógrado positivo conduz a expressão de tTA a níveis letais. No entanto, os estádios de desenvolvimento podem ser mais sensíveis à interrupção da transcrição do que os adultos: eles têm de expressar genes de uma forma altamente coordenada para permitir o desenvolvimento adequado, enquanto que os adultos podem ser mais tolerantes com as interrupções. 0 desenvolvimento de heterozigóticos LA513 em meios com um nivel intermédio de tet (3 ou 10 yg/ml), apenas suficiente para a sobrevivência, mostrou um atraso significativo em 16 ΕΡ1649027Β1 relação aos seus irmãos do tipo selvagem. As experiências paralelas usando maiores concentrações de tetraciclina, por exemplo, 100 pg/ml, não mostraram qualquer atraso no desenvolvimento, sugerindo assim que a expressão sub-letal de tTA pode afetar negativamente o desenvolvimento normal dos insetos. É preferido que um sistema de controlo retrógrado positivo mostre uma maior razão ligado : desligado, e mude de ligado para desligado ao longo de um intervalo de concentração mais estreito do que um sistema convencional, permitindo assim a utilização de uma gama mais ampla de moléculas efectoras. Podem ser utilizadas moléculas efectoras de baixa toxicidade (atividade especifica inferior), uma vez que podem ser expressas a um nível elevado em condições ativas, sem levar a problemas de toxicidade nos níveis basais. Por outro lado, podem ser utilizadas as mais tóxicas (maior atividade específica), à medida que o baixo nível basal necessário não se opõe a níveis elevados de expressão quando desreprimido ou induzido. Uma vez que o nível basal de expressão é apenas parcialmente determinado pelo nível de tTA, esta vantagem é particularmente evidente no caso de moléculas de menor toxicidade. tTA é um exemplo preferido de uma molécula efectora de baixa atividade específica que pode, por exemplo, ser utilizada como letal no contexto do controlo retrógrado positivo de LA51.3. A vantagem de variar de ligado para desligado ao longo de uma gama estreita de concentrações, é que pode ser utilizada uma concentração moderada de repressor sem o risco da expressão residual (não totalmente reprimida) levar a efeitos adversos e, potencialmente, selecionando para a resistência. Por outro lado, para um sistema indutível, as concentrações moderadas 17 ΕΡ1649027Β1 de ativador podem dar expressão completa.

Condutores ativados ou desreprimidos são úteis para expressar moléculas efetoras. Os exemplos de moléculas efectoras incluem ARN funcionais, tais como o ARN em gancho, ribozimas, etc, e uma ou mais proteínas codificadas. Será apreciado que para aplicações diferentes são apropriados diferentes níveis de expressão. Uma vez que os fatores de transcrição específicos da sequência, utilizados para dirigir o sistema de controlo retrógrado positivo, também podem ser utilizados para expressar outros genes num sistema de expressão bipartida, isto pode ser conseguido fazendo duas construções separadas, uma com o condutor (normalmente uma construção de fator de transcrição do promotor, aqui a construção de controlo retrógrado positivo), a outra com o gene ou molécula de interesse sob o controlo de um promotor composto (local de ligação + promotor mínimo), que responde ao fator de transcrição (Bello et aí., 1998, Brand et ai., 1994) . Isto também é apropriado para estes condutores de controlo retrógrado positivo. Em alternativa, os dois elementos podem ser combinados na mesma construção. Esta realização tem vantagens significativas na maioria das aplicações de campo, uma vez que reduz substancialmente o risco de que os dois elementos funcionais possam ser separados por recombinação. Para além disso, o sistema de expressão completo pode ser introduzido com um único evento de transformação, assim como que significa que os insetos homozigóticos para o sistema são homozigóticos em apenas um local, em vez de dois, o que os torna mais fáceis de construir por criação de animais, e tende a reduzir o custo da aptidão devido a mutagénese de inserção. 18 ΕΡ1649027Β1

Também é possível condensar um dito sistema de expressão numa forma mais compacta, tal como está ilustrado na figura 2 em anexo.

Isto explora a natureza bi-direcional de potenciadores, neste caso, o local de ligação de teto na presença de tTA. Este arranjo permite ainda, ou facilita, a utilização de elementos isolantes para reduzir o efeito de potenciadores ou supressores na cromatina adjacente: neste arranjo toda a cassete de expressão pode ser flanqueada por isoladores. Este arranjo também remove a necessidade de duplicar os locais de ligação do fator de transcrição dentro da construção. Dita duplicação é de preferência evitada, uma vez que pode levar a instabilidade através de recombinação homóloga. P°r razões semelhantes, é geralmente preferido que sejam utilizados isoladores não idênticos, tais como scs e scs', em vez de usar duas vezes o mesmo. É ainda possível condensar o sistema para. fornecer um único transcrito, quer bicistrónico ou a expressar um unico polipéptido, que pode potencialmente ser adicionalmente processado em mais do que uma proteína, por exemplo, por utilização da técnica de fusão de ubiquitina (Varsnavsky, 2000) . Cada uma destas abordagens (expressão bi-direcional, expressão bicistrónica, proteína de fusão com transativador) tende a reduzir o tamanho da construção, o que p°r sua vez tende a aumentar a frequência de transformação e reduzir o alvo mutagénico. Dita condensação pode ser conseguida de várias maneiras, tal como mostrado esquematicamente na figura 3 em anexo. Serão evidentes para os peritos na tecnologia as extensões apropriadas para, e as variações, das disposições mostradas esquematicamente. 19 ΕΡ1649027Β1

Como um exemplo da utilidade de um tal sistema, pode ser construído um marcador geral de transformação por utilização de um sistema transativador, conhecido por funcionar numa larga gama f ilogenét ica, por exemplo, aqueles com base em tetR, GAL4, lexA ou AcNPV ie-1. Dito transativador, ligado funcionalmente a uma região codificante para uma proteína fluorescente, por qualquer um dos métodos anteriores (expressão bi-direcional, expressão bicistrónica, proteína de fusão com transativador), iria proporcionar um marcador genético expresso numa grande variedade de tecidos e estádios de desenvolvimento numa ampla gama filogenética. Dito marcador seria útil não só para a deteção de transgénicos na transformação e outras experiências de laboratório, mas também para distinguir, por exemplo, moscas transgénicas de moscas do tipo selvagem no campo, ou as apanhadas no campo.

Um outro exemplo é a expressão de uma transposase. Integrada nos cromossomas, isto seria uma construção de "início de salto", por exemplo a transposase Bac de leitão integrada num cromossoma de inseto usando mariner/mosl. Ditas construções são úteis para remobilizar elementos Bac de leitão. Um início de salto amplamente aplicável deve ser expresso a um nível significativo numa ampla gama filogenética. 0 sistema de expressão desta invenção proporciona isso. Para além disso, dita construção (a transposase Bac de leitão sob o controlo de um sistema de controlo retrógrado positivo de uma das estruturas anteriores) também seria útil na transformação de insetos através de expressão transitória (coexpressão de um plasmídeo "ajudante", o método mais amplamente usado para a transformação de insetos) e, novamente, seria útil e funcional numa ampla gama filogenética. 20 ΕΡ1649027Β1 É vantajoso regular a ação de um sistema de expressão ao nível do estádio, do sexo, ou a outros níveis, para além de ser capaz de regular o nível de expressão por mudanças das condições ambientais. Os exemplos adequados são como os que se seguem: 1. Expressão de uma proteína repressora.

As proteínas repressoras são conhecidas, ou podem ser construídas para os principais sistemas de expressão, por exemplo, GAL80 ou os seus derivados mutantes para o sistema de GAL 4, tetR fusionado com proteínas inibidoras para o sistema de tet, etc. Uma outra alternativa é o silenciamento do gene do fator de transcrição usando um gancho de ARN dirigido contra uma parte da cassete de expressão. A expressão basal do sistema de controlo retrógrado positivo é bastante baixa, por isso, pode ser facilmente suprimida pela expressão de um dito inibidor. A expressão de um inibidor adequado, sob o controlo adequado, irá tender a inibir a expressão da cassete de expressão de controlo retrógrado positivo, onde o inibidor é expresso. A expressão especifica de fêmea, por exemplo, pode por conseguinte ser alcançada através da expressão de um inibidor em machos. 2. Integrando especificidade no sistema de controlo retrógrado positivo. A especificidade pode ser integrada no sistema de controlo retrógrado positivo utilizando componentes que são eles próprios específicos. Por exemplo, a combinação do 21 ΕΡ1649027Β1 promotor mínimo de hsp70 + intrão de SV40 + sinal de poliA de pUAST é conhecida por não ser expressa na linha germinativa feminina de Drosophila, enquanto que o promotor mínimo de P + intrão de P + sinal poliA fs(1)K10 de pUASp é aí expresso (Rorth, 1998), Os sistemas de expressão de controlo retrógrado positivo podem portanto ser construídos de forma a serem expressos especificamente, ou não, neste tecido, dependendo da utilização de elementos reguladores apropriados.

Numa outra realização, pode ser integrada no sistema a especificidade para o sexo, através da utilização de processamento específico do sexo. 0 processamento específico do sexo de doublesex e dos seus homólogos é um mecanismo regulador conservado e, por conseguinte, disponível para ser utilizado desta forma ao longo de uma ampla gama filogenética. Outra alternativa é o processamento específico do sexo de transformer e dos seus homólogos. 0 uso de processamento específico do sexo para integrar especificidade num sistema de expressão de controlo retrógrado positivo pode ser conseguido de várias maneiras, tal como se mostra esquematicamente na figura 4 em anexo. Serão evidentes para os peritos na tecnologia as extensões apropriadas para, e as variações, das disposições mostradas esquematicamente.

Numa outra configuração, pode ser inserido um local de processamento específico na região codificante do transativador, de modo a que são produzidas duas (ou mais) proteínas alternativas em diferentes condições, por exemplo, em diferentes tipos de células ou em diferentes sexos. Isto pode ser disposto de modo a que um ativador da transcrição é produzido num tipo de células, mas um repressor de 22 ΕΡ1649027Β1 transcrição é produzido num outro tipo de célula. Este arranjo tem a vantagem de que é relativamente robusto para a produção de processamento ineficiente (imperfeito) de uma proporção relativamente baixa do ativador da transcrição no tipo celular inadequado, por exemplo, em células masculinas será menos provável de produzir a amplificação de controlo retrógrado positivo, uma vez que estas células estão também a produzir uma quantidade maior de repressor. É assim aumentada a discriminação no produto (razão de níveis de ativador da transcrição nos dois tipos de células, ou a razão da expressão de um repórter ou outro ARN, ou proteína ligada funcionalmente à expressão do ativador da transcrição) entre os dois tipos de células.

Será facilmente aparente para os peritos na tecnologia, que qualquer destes arranjos específicos de transativadores pode ser facilmente combinado com qualquer um dos arranjos aqui divulgados para a expressão de uma proteína adicional ou ARN, por exemplo, expressão bi-direcional, expressão bi ou multicistrónica, expressão de uma proteína de fusão, ou combinado com uma ou mais cassetes de expressão separadas dependentes de, ou em parte, da expressão do transativador, quer combinados na mesma construção ou em. outro lugar no genoma ou célula. 3. Utilizando uma molécula efectora específica A especificidade com consequência fenotípica também pode ser introduzida através da utilização de uma molécula efectora especifica. Sempre que uma molécula, por exemplo, ARN ou proteína, expressa sob o controlo de qualquer um dos sistemas de expressão aqui descritos, tem um efeito 23 ΕΡ1649027Β1 específico apenas em células específicas, tecidos ou sexo, etc, então pode ser obtida especificidade fenotipica com a expressão mais ampla ou menos específica do transativador. Por exemplo, no contexto de um programa de controlo da populaçãio de insetos de libertação em massa do tipo RIDL, a utilização do sistema Para expressar uma molécula apenas tóxica, ou pre ferenciaiment e tóxica, em estádios de pré-adulto, resulta em adultos que são totalmente, ou razoavelmente competitivos, em relação ao tipo selvagem. Isto é desejável, uma vez que a eficácia do programa depende da competitividade e longevidade das formas adultas, quando soltas na natureza. Uma vez que a concentração do seu repressor interno (por exemplo, atetraciclina) tende a decair na natureza, seria vantajoso garantir que a indução (desrepressão) do sistema de expressão, como e quando ocorre em adultos, tem um efeito negativo mínimo sobre eles.

Como outro exemplo, a separação de sexo, ou eieitos específicos do sexo, podem ser alcançados através da expressão, tanto nos machos como nas fêmeas, de uma molécula com efeitos diferenciais em machos e fêmeas. Por exempio, a expressão da proteína transtormer no macho de Drosophila tenderá a transformá-los em fêmeas, mas não tem nenhum efeito sobre as fêmeas. Do mesmo modo, a expressão da proteína letal-2 (Msl-2) específica do macho em Drosophila, tenderá a matar as fêmeas mas não os machos (Gebauer et ai., 1998, Kelley et ai ., 1995, Matsuo et al., 1997, Thomas et al., 2000) . Por outro lado, a expressão de uma molécula de ARN parcialmente autocomplementar, com homologia substancial na sua região autocomplementar ou de formação de cadeia dupla ("contra gancho de ARN"), transformer, tenderá a transformar fêmeas genéticas em machos fenotípicos, embora não afete 24 ΕΡ1649027Β1 machos genéticos, e a expressão de gancho de ARN contra msl-2 tende a ser letal para os machos, mas não para as fêmeas. A expressão de gancho de ARN contra os exões de doublesex específicos de machos ou de fêmeas tenderá a afetar apenas agueles sexos, e a expressão simultânea de ARN que codifica para a outra forma de doublesex (isto é DsxMem fêmeas ou Dsx" em machos) tenderá a modificar ou aumentar este efeito. Esta expressão simultânea de uma proteína e uma molécula de gancho de ARN pode ser facilmente conseguida, através da combinação da abordagem bicistrónica ou de proteína de fusão descritas anteriormente, com. a expressão de um gancho de ARN utilizando o sistema de expressão bi-direcional também descrito anteriormente. Pode ainda ser adicionada a um tal sistema uma especificidade para o sexo, estádio, ou outra, por incorporação de processamento apropriado específico ou outro sinal de controlo da transcrição, tradução ou outros sinais de controlo pós-tradução, a qualquer parte do sistema, tal como será evidente para o perito na tecnologia.

As moléculas de gancho de ARN multifuncionais podem ser construídas e, estão previstas. Por exemplo, ARNi contra transformer na mosca da fruta mediterrânica Ceratitis capitata Wiedmann (mosca da fruta mediterrânica), tenderá a transformar fêmeas genéticas em machos férteis. Para um programa de controlo da população de toda a área com base na libertação em massa de ditos insetos, é preferível esterilizar as moscas 1 i o e r t a g a s * Isto pode ser alcançado através da utilização de uma moléc o 1 ci de RN A de composição, que interrompe simultaneamente a expressão, tanto de transformer, como de um gene necessário para a espermatogénese ou viabilidade embrionária ou larval. Muitos destes genes são conhecidos em Drosophila, com homólogos em 25 ΕΡ1649027Β1 mosquitos ou outros animais. Com a mosca da fruta mediterrânica, pode facilmente ser isolado um homólogo adequado, utilizando técnicas conhecidas dos peritos na tecnologia. Nós preferimos o uso de um gene que permite a produção de fluido seminal, e de preferência também de esperma, para reduzir a tendência da fêmea para voltar a acasalar após a inseminação pelo macho afetado. Nós preferimos em particular, dirigir esta segunda parte da molécula de gancho de ARNi contra um efeito letal paterno, de modo que não pode ser produzida nenhuma descendência viável, ou contra um gene expresso no zigoto, necessário para a viabilidade ou o desenvolvimento embrionário ou larval, de modo que será afetada a descendência que herda a construção. Estão previstas outras configurações e serão facilmente aparentes para os peritos na tecnologia: por exemplo a expressão de uma proteína letal específica da fêmea pela expressão bicistrónica, e um gancho de ARN que leva a uma letalidade de efeito paterno por expressão bi-direcional. Em comum com o gancho de ARN de composição contra um gene de determinação do sexo adequado e um efeito paterno letal, isto permite a geração de uma população de insetos de um único sexo (apenas masculino), cujos descendentes morrem pela ação do efeito letal paterno, independentemente de se os seus descendentes ou companheiros se alimentaram com tetraciclina. Assim, a presente invenção proporciona um promotor controlado, tal como definido, em que o promotor está ligado operacionalmente com ADN que codifica um ARNi, que causa letalidade ou esterilidade. Neste caso, a letalidade pode corresponder a baixa aptidão, tal como não voar, em vez de letalidade imediata, desde que a probabilidade de reprodução seia substancialmente reduzida. 26 ΕΡ1649027Β1 4. Utilizando recombinase(s) especifica(s) de local A especificidade também pode ser introduzida no sistema de controlo retrógrado positivo, através da inserção de um fragmento de "enchimento" que o inativa. Se este fragmento de "enchimento" é flanqueado por locais alvo para uma recombinase apropriada especifica do local, em seguida, tenderá a ser excisado na presença da recombinase ativa. Qualquer sistema para a expressão seletiva de recombinase ativa, por exemplo, a expressão da recombinase sob o controlo de um promotor especifico de fêmeas, tenderá por conseguinte, a conduzir a expressão seletiva do sistema de controlo retrógrado positivo, neste caso, apenas em fêmeas. Se a recombinase é expressa apenas em células somáticas, por exemplo, por utilização do método descrito anteriormente, então a versão transmitida à geração seguinte inclui o fragmento de enchimento, que pode novamente ser filhas, mas não filhos. Por outro lado, se a recombinase é expressa apenas no genoma, o fornecimento de recombinase ativa conduzirá a descendência em que o sistema de expressão está ativo, a partir de pais em que estava inativo. Isto pode ser utilizado, por exemplo, para gerar gâmetas contendo um sistema de gene letal ativo dominante ou estéril (por exemplo, especifico de fêmeas ou não especifico do sexo), para utilização numa estratégia de controlo da população de insetos.

Numa realização preferida, o fragmento de enchimento codifica a recombinase. Esta realização é particularmente compacta. Numa outra realização preferida, o fragmento de enchimento codifica um repressor transcricional, que tende a inativar o sistema de expressão de controlo retrógrado ΕΡ1649027Β1 positivo, esta realização tende a reduzir a expressão basal do sistema na presença do fragmento de enchimento.

Por outro lado, o sistema pode ser inativado especificamente em certas células ou clones de células, através da introdução de locais alvo para uma recombinase adequada específica do local, em posições adequadas, e, em. seguida, expressando ou introduzindo a recombinase ativa apropriada em células adequadas, de tal modo que um ou mais elementos funcionais principais do sistema de expressão são removidos ou interrompidos, por recombinação entre os locais alvo para a recombinase.

Os sistemas de recombinase adequados incluem cre/lox e Flp/FRT. A presente invenção é ilustrada pelos seguintes exemplos não limitativos. Nos exemplos que se seguem, as figuras são como se segue: A figura 1 mostra um cenário de ativador de transcrição reprimível por tetraciclina, A figura 2 mostra um sistema da invenção utilizando um potenciador bi-direcional, A figura 3 mostra um sistema específico do sexo, A figura 4 mostra um outro sistema específico do sexo, A figura 5 é um diagrama da região de tetCt-tTA de PJY2004, 28 ΕΡ1649027Β1 A figura 6 é um diagrama esquemático de pLA513, A figura 7 é um diagrama esquemático do transposão LAS13, A figura 8 é um diagrama esquemático de pLA517, A figura 9 ilustra a ação bidirecional de tet07 em. mosquitos 513A e 513B, A figura 10 é um diagrama esquemático de pLA656, A figura 11 é um diagrama esquemático de pLA928, A figura 12 é um diagrama esquemático de pLAH24, A figura 13 é um diagrama esquemático de pLA670, A figura 14 é um diagrama esquemático de pLA1038, A figura 15 é um diagrama esquemático de pLA710, A figura 16 ilustra o processamento de Cctra especifico do sexo na mosca da fruta mediterrânica, A figura 17 é um diagrama esquemático de pLA1188, e A figura 18 ilustra o processamento especifico do sexo na mosca da fruta mediterrânica.

EXEMPLOS

Foram feitas uma série de construções com o tTA numa 29 ΕΡ1649027Β1 configuração de controlo retrógrado positivo, isto λ ~ com a expressão de tTA regulada pela ligação de tTA a tet-'-· -L.O. Foram obtidos insetos transgénicos portadores destas const-v, J ^ Lrt!çoes, e as suas propriedades foram analisadas.

tTAV

Em alguns casos, a intenção era a de se obter cu ^ níveis de expressão de tTA, na ausência de tetracicl-i na Em várias construções exemplificadas, aqui descritas em seg-ida a expressão de t.TA foi tão elevada a ponto de ser c0iT10 parte do processo de obtenção de forte expressão de tTA rma parte do quadro aberto de leitura de tTA foi redesenhado para expressar uma proteína semelhante, mas com utilizaçg0 ge codões mais perto da norma para a Drosophila melanogaster, e com falta de alguns potenciais locais de Processamento crípticos, presentes na sequência de nucleótidos original. Esta sequência variante de tTA foi nomeada tTAV (SEQ id NO. 31, sequência de proteína SEQ ID NO. 32). EXEMPLO 1 WTP-tTA e JY2004-tTA em Drosophila melanogaster A região codificante de tTA (SEQ ID NO. 29, sequência da proteína de tTA SEQ ID NO. 30) de pUnDiõ—1 (SEQ ID NO. 33, Gossen et ai., 1994, Gossen e Bujard, 1992) foi colocada sob o controlo de tetO, numa configuração de controlo retrógrado positivo, inserindo-a em pWTP2 (Bello et ai., 1998) ou PJY2004, uma versão de pJY2000 que carece de isoladores (Stebbins e Yin, 2001). Estas construções foram nomeadas pWTP-tTA e pJY2004-tTA, respetivamente. É fornecido um 30 ΕΡ1649027Β1 diagrama da região tet07-tTA de pJY2004 como a figura 5 em anexo, e é a SEQ ID NO. 14.

Em pWTP-tTA, os locais de ligação tet07 são seguidos por um promotor minimo do elemento P, uma sequência lider de hsp70 de Drosophila, um intrão curto do gene PP1oí96A de Drosophila, a região codificante de tTA e um terminador da transcrição de hsp70 de Drosophila. Em pJY2004-tTA, o promotor minimo e as sequências lideres são de CMV, seguidas pela região codificante de tTA e um terminador da transcrição da β-globina de coelho, tal como mostrado na figura 5.

Os transgénicos de Drosophila rnelanogaster levando qualquer uma destas construções foram totalmente viáveis, mesmo sem tetraciclina na dieta. Os insetos duplamente heterozigóticos para WTP-EGFP e qualquer uma destas construções foram examinados para a fluorescência verde, característica da expressão de EGFP. Os insetos com WTP-tTA e WTP-EGFP mostraram, fluorescência muito fraca, apenas um pouco acima da autofluorescência do fundo. Em contraste, os insetos com JY2004-tTA e WTP-EGFP mostraram fluorescência forte, semelhante à observada em insetos portadores de EGFP sob o controlo do promotor de ActinSC, que é amplamente usado como um promotor constitutivo forte em Drosophila (por exemplo, Reichhart e Ferrandon, 1998). A expressão de EGFP foi reprimida para níveis não detetáveis quando os insetos foram criados em. dieta suplementada com tetraciclina. a 1.00 pg/ml. Os insetos controlo, heterozigóticos tanto para WTP-EGFP, JY2004-tTA ou WTP-tTA, não mostraram fluorescência acima do fundo, quer tenham sido criados numa dieta contendo ou não tetraciclina. 31 ΕΡ1649027Β1 Nós colocámos tTA sob o controlo do promotor de ActinõC, no plasmídeo pP [Casper-Act5C-tTA]. As moscas transgénicas levando esta construção e WTP-EGFP, criadas numa dieta deficiente em tetraciclina, mostraram fluorescência verde a uma intensidade comparável à observada em moscas equivalentes com JY2004-tTA e WTP-EGFP.

Estes resultados mostram que as construções de controlo retrógrado positivo podem ser usadas para dar uma forte (JY2004-tTA) ou fraca (WTP-tTA) expressão reprimível por tetraciclina de uma construção adequada (aqui WTP-EGFP). EGFP é amplamente usado como um repórter neutro. Nós testámos ainda moscas JY2004-tTA, cruzando-as com moscas com construções capazes de expressar proteínas conhecidas ou previstas serem prejudiciais. Inserimos o domínio central de NipplDm (Bennett et al., 2003, Parker et al., 2 0 02) ("nipper") em pJY2004, para fazer pJY2004-nipper, e transformámos Drosophila com. esta construção. Nós também usámos as moscas que transportam tetO-hid (Heinrich e Scott, 200 0) . Em cada caso, o cruzamento para moscas JY2004-tTA deu letalidade reprimível por tetraciclina. Os dados de dois cruzamentos de exemplo são apresentados na tabela 2, que se segue. 32 ΕΡ1649027Β1

Tabela 2

Utilização de construções de controlo retrógrado positivo para dirigir a expressão de genes letais em Drosophila. JY2004-tTA/CyO macho x tetO-hid/tetO-hid fêmea [tetraciclina] (pg/ml) JY2004-tTA Cyo 0 15 n U 9 10 100 JY2 0 0 4- tTA/CyO macho x JY2 0 0 4-n i pp e r/JY 2 0 0 4-n ippe r f ême a JY2004-tTA Cyo 0 20 r\ 16 13 100 EXEMPLO 2 LA513 em Drosophila melanogaster Nós fizemos a construção pLA513 (SEQ ID NO. 16, diagrama esquemático mostrado na figura 6) , contendo um transposão Bac de leitão não autónomo. Gerámos Drosophila melanogaster transgénicas levando esta construção, por coinjeção com um plasmídeo ajudante numa estirpe de olhos brancos (Handler, 2002, Handler e James, 2000). Os potenciais transgénicos foram selecionados para a fluorescência característica de DsRed2. Foram recuperadas 5 linhagens transgénicas, e foram designadas por 0513, M8, M13, F23 e F24. É mostrado um diagrama esquemático do transposão LA513 na figura 7 em anexo.

Os stocks de Drosophila melanogaster foram mantidos a 25°C em meio de levedura / açúcar / milho / tetraciclina (tetraciclina (Sigma) na concentração final de 100 pg/ml), a 33 ΕΡ1649027Β1 menos que indicado de outra íorma. Todas as experiências foram realizadas a 25°C.

Sobrevivência de transgénicos LA513/+ com e sem tetraciclina

Os transgénicos heterozigóticos foram cruzados em pelo menos triplicado, com o tipo selvagem, em meios com ou sem Tc (tetraciclina). Na ausência de qualquer letalidade, seria de esperar que aproximadamente metade da descendência de dito cruzamento seria transgénica. A descendência foi pontuada como adultos jovens para o marcador de fluorescência DsRed [Matz et al., 1999], usando um microscópio Olympus SZX12 com capacidade de fluorescência, e foi calculadói a razão de fluorescência (transgénicos) para o total de moscas. Os resultados são apresentados na tabela 3, em seguida. Nestas experiências, todas as 5 linhas transgénicas mostraram 100% de letalidade na ausência de tetraciclina, e boa sobrevivência (ou seja, razão de fluorescente : não fluorescente ~ 1:1) na presença de 100 yg/ml de tetraciclina. A inspeção aos frascos mostrou poucas ou nenhumas larvas grandes fluorescentes na ausência de Tc, embora estivessem presentes muitas larvas pequenas fluorescentes, num momento em que não eram visíveis larvas não fluorescentes (do tipo selvagem para LA513) em todos os tamanhos. Isto sugere que na ausência de tetraciclina, LA513 provoca letalidade num estádio inicial de desenvolvimento (embriónico e/ou de larvas iniciais). 34 ΕΡ1649027Β1 ΦλΗοΊ 5J ^ Jé» «Jéb Ca

Inserções LA513 são dominantes letais reprimíveis por tetraciclina Linha LAS 13 0 μg/ml de 4* ωΊ* v*a ri·? Ί *í na ^ 1^ Qb w V-4 J» JL· a A Ca N° de N° de mo s c as f1u o re s centes 100 μg/ml de tetraciclina N° de N° de Razão moscas fluorescentes 0 513 M8 Ml 3 F23 F2 4 Total 490 0 7 4 0 657 0 473 0 61 0 1755 0 1963 937 0,48 66 25 0,38 1838 892 0,49 1914 845 0,44 114 60 0,53 5895 2759 0,47 A letalidade dominante pode ter várias causas. Sem se ser restringido pela teoria, parece provável que, na cLUsência de tetracic lina, tTAV a cumula--· se a uma concentração r e 1 a t. i v ame n t e elevada, e que isto é let Cl 1. f p o s s i v e1mente devido ao silenciamento da transcrição, ou int erferência com a degradação da proteína. Uma alternativa é a de que, na

ausência de tetraciclina, tTAV liga-se a tet.0 e atua como um potenciador de longo alcance, perturbando a expressão de genes junto à inserção de LA513. Isto parece improvável, uma vez que todas as 5 linhas transgénicas deram resultados semelhantes. Cada uma destas linhas foi derivada a partir de um sobrevivente GO de injeção diferente, e estas linhas são, portanto, suscetíveis de transportar LA513 integrado em diferentes locais genómicos. Verificámos isso através de PCR inversa. A tabela 4, que se segue, mostra os locais integração para 3 das linhas, em cada C cL S O f a inserção LAS13 estava numa sequência TTAA, tal como esperado da preferência do conhecido local de inserção do transposão Bac de leitão. Tal como esperado, as 3 inserções foram, de facto em 3 locais diferentes do genoma de Drosophila. 35 ΕΡ1649027Β1

Tabela 4

Locais de inserção de LA513 no genoma de Drosophila Linha Sequência amplificada ou no local de integração Braço do cromossoma previsto Citologia de Drosophila prevista Gene mais próximo previsto 0513 CacagcgcatgatgagcacaTTAAcaaaatgtagtaaaatagga (SEQ ID MO. 1) 2L 25F4-25F5 CG9171 M8 GtttcgataaatattgctatTTAAaatgcttattttcaatgcta (SEQ ID MO. 2) 2L 36F6-36F6 CG15160 F24 TttgttttctaacgttaaagTTAAagagagtccagccacatttt (SEQ ID NO. 3) 2L 21C4-21C5 CG13691 A sequência flanqueada é apresentada com o local de inserção TTAA em maiusculas. Também são mostradas localizações cromossómicas previstas, e o gene mais próximo previsto, estes baseiam-se na sequência do genoma publicado de Drosophila. EXEMPLO 3

Redução da toxicidade de tTAV 0 efeito tóxico de expressão de nível elevado de tTAV é pensado ser devido ao silenciamento transcricional e/ou interferência com a proteólise dependente de ubiquitina, através da secção derivada de VP16 (Gossen e Bujard, 1992, Salghetti et al., 2001). Nós, por conseguinte, modificámos tTAV removendo a secção de VP16, e substituindo-a com uma sequência sintética que codifica 3 cópias de um péptído (PADALDDFDLDML) derivado de VP16 (Baron e Bujard, 2000, Baron et al., 1997). Este derivado foi designado tTAF, o pla.sm.ideo resultante foi denominado pLA517, e é a SEQ ID NO. 17, e é mostrado esquematicamente na figura 8, em anexo. 36 ΕΡ1649027Β1 As Drosophila melanogaster foj construção, e foi obtida uma linha heterozigóticos LA513 foram cru; selvagem (para LA513), e os descendent aiTí transformadas com este transgénicos. Os machos fS r\ r-, Λ , com. femeas do tipo fluorescência (como adultos) es foram pontuados para se igualmente suscetível de sobreviver descendência total que é fluorescent de tetraciclina, esta proporção f redução modesta eir toda descendência é a proporção esperada da e é de 50%. Na ausência 01 de 32%, apenas uma comparação com 40o , quando os pais e descendentes foram criados em Uleta suplementada com tetraciclina a 100 pg/ml. Os resu.ltado tabela 5, que se segue. Testámos tetraciclina na dieta dos pais, s são apresentados na se o fornecimento de tias poderia reduzir esta letalidade. Nes-*-proporção intermédia de 0,37, indicand'· não da descendência, :Le caso, observámos uma io que a tetraciclina de contribuição materna tem um efeito benéfico modesto.

Tabela 5

Uma vez que LA517, sozinho, teve pouco impacto sobre a viabilidade, ao contrário da construção LA5i3 íntimamente relacionada, testámos se era capaz de dirigir a expressão de um gene heterólogo sob o controlo de tet.0. Para isto utilizámos tetO-nid (Heinrich e Scott, 2000) . As moscas homozigóticas para tetO-hid foram cruzadas com moscas 37 ΕΡ1649027Β1 heterozigóticas para LA517. Na ausência de tetraciclina, apenas 3,4% da descendência adulta portava LA517. Na presença de 100 pg/ml de tetraciclina, esta proporção foi de 42%. LA517 é, portanto, capaz de dirigir a expressão eficiente de um gene heterólogo.

Tabela 6

Efeito da tetraciclina na sobrevivência de Drosophila LA517/+, +/tetO-hid e dos seus irmãos +/ + , +/tetO-hid TetO-Hid s LA517/+ [Tc] Não fluorescente Fluorescente Q 63 6 2 3 10 0 17 4 Ί O '1 .1. <3-, / EXEMPLO 4

Utilização de análogos de tetraciclina A linha F23 foi utilizada para determinar se os análogos químicos da tetraciclina poderiam ser utilizados em vez da tetraciclina, para suprimir a letalidade de LA513. Para este efeito, testámos 3 análogos numa gama de concentrações de 0 a 100 pg/ml (fornecedores: tetraciclina e doxiciclina da Sigma, 4-epi-oxitetraciclina da Acros Organics, clortetraciclina de Fuzhou Antibiotic Group Corp.). Calculámos as concentrações necessárias para a sobrevivência de metade do valor máximo. Estas são mostradas na tabela 7, em seguida. 38 ΕΡ1649027Β1

Tabela 7

Eficácia dos análogos de Tc Linha Tc / Análogo Concentração para a sobrevivência de metade do valor máximo, pg/ml F2 3 T e t r a c i c 1 i n a 5,0 F23 Doxiciclina 3, 9 F23 7 - c 1 o r t e t. r a c i c 1 i n a 1,7 F23 4-epi-oxitetraciclina 42, 0 EXEMPLO 5

Longevidade de adultos LA513/+ na ausência de tetraciclina LA513 confere claramente letalidade dominante, ativa num estádio embrionário e/ou larval precoce. As larvas foram criadas numa dieta suplementada com 100 yg/ml de tetraciclina. Depois da eclosão, os adultos foram transferidos psLra uma dieta deficiente em tetraciclina. Foi medida a longevidade destes adultos, e também de adultos tv1118 não transgénicos comparáveis. Tal como mostrado na tabela 8, em seguida, as linhas de transgénicos apresentaram boa sobrevivência em adulto, em relação ao controlo não transgénico. Isto sugere que a especificidade de fase pode ser obtida desta maneira, aqui LA513 é um letal larval / embrionário, mas não um letal adulto. 39 ΕΡ1649027Β1

ΦλΗοΊ sj A

E possível explicar estes dados de longevidade postulando que as larvas acumulam tetraciclina pela alimentação, e mantêm esta tetraciclina até à idade adulta, de modo que sobrevivem como adultos, mesmo na ausência de tetraciclina na dieta. Para examinar isto, foram criadas como larvas em diferentes concentrações de tetraciclina, moscas heterozigóticas para LA513/+ (linha M13) . Depois da eclosão, os adultos foram transferidos para a dieta sem tetraciclina, e foi medida a longevidade destes adultos, tal como anteriormente. Tal como mostrado na tabela 9, em seguida, a concentração de tetraciclina na dieta como larvas, não teve qualquer efeito óbvio na subsequente longevidade dos adultos na ausência de tetraciclina, o que implica que a sobrevivência de adultos não é primariamente devida à. retenção de tetraciclina da alimentação larval. A uma concentração de 1 pg/ml nenhuns transgénicos sobreviveram até à idade adulta, e a 3 pg/ml apenas cerca de metade do número esperado sobreviveram, até à idade adulta, de modo que esta concentração é próxima da mínima para a sobrevivência das larvas. 40 ΕΡ1649027Β1 ΕΡ1649027Β1 Tabela 9 Efeito da tetraciclina larval sobre a adultos longevidade de Tetraciclina Tempo de sobrevivência Desvio Número de larval ug/ml médio após a eclosão, dias no moscas 3 33,5 13,2 9 10 28,4 9, 6 17 30 26,3 11,3 23 100 29, 5 9, 9 4 7

Outra possível explicação para a sobrevivência de adultos LA513/+ é que tTAV está inativo em adultos, de modo que o ciclo de controlo retrógrado positivo não funciona, e tTAV não se acumula. Examinámos isto por medição da quantidade de ARNm de tTAV por PCR quantitativa, seguindo uma reação de transcriptase reversa (rt-PCR quantitativa, ou qPCR) . Usamos química de Taqman e reagentes (ABI), e um instrumento de qPCR ABI Prism 7000. Cada amostra foi testada em triplicado, os dados são a média destes três ensaios. Os

AvRN de 18S , e Aedes miciadores oligonucleótidos iniciadores 18S emparelham com o de Drosophila melanogaster, Ceratitis capitata aegypti, de forma que estes oligonucleótidos i foram utilizados para todas as três espécies. SEQ ID NO. 4 5

Oligonucleótidos iniciadores utilizados: ARN de 18S

Oligonucleótido iniciador sentido: ACGCGAGAGGTGAAATTCTTG

01igonucleótido iniciador antissentido GAAAACATCT T T GGCAAATGCT T Sonda MGB TaqMan: 6-Fam-CCGTCGTAAGACTAAC-MGB 41 ΕΡ1649027Β1 tTAV SEQ ID NO.

Oligonucleótido iniciador sentido: CATGCCGACGCGCTAGA 7

Oligonucleótido iniciador antissentido: G TAAACATC T GC T CAAACT CGAAGTC 8

Sonda MGB TaqMan: VIC- TCGATCTGGACATGTTGG-MGB 9

Verificou-se que 0513 criada em 100 pg/ml de tetraciclina tinha uma razão de tTA : 18S de 0,00016 (larvas), e 0,00013 (adulto). Adultos criados como larvas em 100 pg/ml de tetraciclina, mas em seguida transferidos para uma dieta sem tetraciclina como adultos, tinham razões de 0,0061, 0,0047, 0,0087 e 0,011 após 1, 2, 4 e 8 dias, sem tetraciclina, respetivamente. Este aumento de 28 a 64 vezes da expressão em relação ao controlo alimentado com tetraciclina, indica que o sistema de expressão de controlo retrógrado positivo com base em tTAV é funcional em adultos. EXEMPLO 6 LAS 13 em Aedes aegypti

Foram transformados com LA513 Aedes aegypti (o mosquito da febre amarela, também o principal vetor da dengue urbana). Foram obtidas duas linhas de inserção independentes, LA513A e LAS13B.

Os machos heterozigóticos para LA513A (criados como larvas em 30 pg/ml de tetraciclina) foram permitidos acasalar com as fêmeas do tipo selvagem. Os ovos foram recolhidos, e as larvas resultantes foram criadas em meios normais, ou em 42 ΕΡ1649027Β1 meio suplementado com tetraciclina (Tc) a 30 pg/ral. Foi determinado o número de adultos transgénicos e não transgénicos resultantes destes ovos. Os dados são a soma de, pelo menos, 5 experiências. As larvas foram criadas a uma densidade de d 250 indivíduos por litro, todos os ovos em experiências "sem tetraciclina" foram lavados duas vezes antes da submersão, para evitar a transferência de tetraciclina. Para as experiências "com tetraciclina", o sangue parental e açúcar - água foram suplementados com tetraciclina a 30 pg/ml, para as experiências "sem tetraciclina" não foram. O teste de χζpara a diferenciação em razão do transgene e tipos selvagens para a sobrevivência de adultos: "com tetraciclina", qualquer orientação: P > 0,05, "sem tetraciclina, qualquer orientação: P < 0,001 (hipótese nula: o genótipo em relação a LA513 não tem efeito sobre a sobrevivência). LA513A é, por conseguinte, um letal dominante reprimível, com uma penetrância nestas experiências de 95 -97%. LA513B também é um letal dominante reprimível, com uma penetrância nestas experiências de 100%. Os resultados são apresentados na. tabela 10, que se segue. 43 ΕΡ1649027Β1

Tabela 10

Eteito da tetraciclina na sobrevivência de Aedes aegypti LA513/+ e dos seus irmãos +/+.

Parental Descs índência Macho Fêmea Tc como larvas Genótipo Ovo Larvas de 1° estádio 2o 3 o 4° Pupas Adultos LA513A/+ 489 468 44 6 4 42 4 37 434 LA513A/+ + / + 1000 Sim Do tipo selvagem 444 431 403 400 396 392 LA513A/+ 4 42 42 0 404 399 393 383 + / + LA513A/+ 1000 Siríi Do tipo selvagem 466 444 428 417 412 404 LA513A/+ 274 2 65 235 208 155 7 LA513A/+ +/+ 540 Não Do tipo selvagem 233 225 214 212 209 206 LA513A/+ 216 205 181 168 131 9 + / + LA513A/+ 4 97 Não Do tipo selvagem 241 225 216 214 211 207 Macho Fêmea Tc como larvas Genótipo Ovo Larvas de 1° estádio 3° 3° 4o Pupas Adultos LA513B/+ 161 153 147 141 139 131 LA513B/+ + / + 377 Sim Do tipo selvagem 178 171 165 160 157 153 LA513B/+ 189 181 170 166 161 153 + / + LA513B/+ 442 Sim Do tipo selvagem 203 198 185 182 180 176 LA513B/+ 69 19 0 0 0 0 LA513B/+ +/+ 188 Não Do tipo selvagem 85 84 83 83 82 81 LA513B/+ 91 60 0 0 0 0 + / + LA513B/+ 240 Não Do tipo selvagem 107 104 99 98 95 93 44 ΕΡ1649027Β1 Nós examinamos a sobrevivência de machos LA513A/+ que tinham sido criados com tetraciclina (30 μσ/ml) como larvas, mas aos quais não se deu tetraciclina como adultos. Observámos que todos os machos testados sobreviveram durante três semanas, independentemente do genótipo (LA513A/LA513A, LA513A/+, ou +/+), ou da presença ou ausência de tetraciclina na sua dieta (n > 40 para cada genótipo) . Nós examinamos a sobrevivência de machos LA513A/+ que tinham sido criados com tetraciclina (30 μσ/ml) como larvas, mas aos quais não se deu tetraciclina como adultos. Observámos que todos os machos testados sobreviveram durante três semanas, independentemente do genótipo (LA513A/LA513A, LA513A/+, ou +/+), ou da presença ou ausência de tetraciclina na sua dieta (n > 40 para cada genótipo) . Nós investigamos utilizando qPCR, a cinética de indução de t T AV em mosquitos adultos LA513B/+ após a retirada de tetraciclina. Tal como mostrado na tabela 11, que se segue, t TAV aumentou em machos e fêmeas após a retirada da tetraciclina. A indução da expressão de tTA é relativamente rápida após a remoção de Tc, tal como com Drosophila. Em cada caso, a mudança, entre as dietas contendo diferentes níveis de tetraciclina oferece um nível de controlo sobre o nível de expressão de genes controlados por tTA (aqui exemplificado pela própria tTA), utilizando um dito sistema de controlo retrógrado positivo. 1 ΕΡ1649027Β1

Tabela 11

Indução da expressão de tTA em machos LA513B/+ após a retirada de tetraciclina Expressão de Sexo Tempo (dias) sem Razão de t'TA:18S em relação tetraciclina expressão ao macho tTA:18S com tetraciclina Macho n vj 0,00036 1 Fêmea n \J 0,00060 1,7 Macho T> 0,0043 12 Fêmea O 0, 014 38 Macho 4 LO o o 150 Fêmea 4 0,019 530 Macho 8 0,012 34 Fêmea 8 0,52 1500 Macho 16 0,10 280 Fêmea 16 0,032 88 EXEMPLO 7 Potenciação reprimível por tetraciclina de um promotor próximo, por tTAV numa configuração de controlo retrógrado positivo

Observámos que o marcador fluorescente em mosquitos transgénicos LA51.3A e LA513B mostrou um padrão diferente de fluorescência na ausência de tetraciclina, em comparação com o padrão na presença de tetraciclina. A fluorescência na presença de tetraciclina foi típica da expressão dirigida por ActinSC em mosquitos (Catteruccia et al., 2000, Pinkerton et al., 2000), e limitada em grande parte à parte inchada do tórax. Em contraste, na ausência de tetraciclina, a expressão foi muito mais forte e evidente, substancialmente por todo o corpo dos indivíduos transgénicos. Em cada caso, a avaliação da intensidade da fluorescência e do padrão de expressão foi feita por observação visual, utilizando microscopia de 2 ΕΡ1649027Β1 fluorescência . A expressão elevada de tTA.V nesta situação de controlo retrógrado positivo parece, por conseguinte, estimular a expressão do promotor de ActinSC próximo. Isto é ilustrado esquematicamente na figura 9. Descobrimos também que concentrações intermédias de tetraciclina, apenas suficientes para suprimir substancialmente a letalidade de LA513, não suprimiram este padrão de expressão de fluorescência mais amplo. A estas concentrações intermédias de tetraciclina, tTAV acumula-se a um nível intermédio - sub-letal, mas superior do que a 30 pg/ml de tetraciclina, e que ainda influencia a expressão de DsRed2. Isto exemplifica de novo o controlo adicional disponível através da modulação da concentração de tetraciclina. A figura 9 ilustra a ação bidirecional de tetCp em mosquitos 513A e 513B. Em 513, o DsRed2 está sob o controlo transcricional do promotor de ActinSC de Drosophila. (A) Na presença de tetraciclina, é produzida relativamente pouca tTAV, esta liga-se à tetraciclina e tem pouco ou nenhum efeito na expressão de DsRed2. O DsRed2 é visto num padrão típico da expressão de ActinõC em mosquitos. (B) Na ausência de tetraciclina, tTAV estimula a sua própria expressão num ciclo de controlo retrógrado positivo. (C) A ligação de tTAV aos locais de teto aumenta a expressão tanto do promotor mínimo de hsp70 e, por conseguinte de tTAV, mas também do promotor de ActinSC, e, portanto, de DsRed2. 3 ΕΡ1649027Β1 EXEMPLO 8 LA656, LA928 e LA1124 em Ceratitis capitata Não foram obtidas nenhumas linhagens transgénicas da mosca da fruta mediterrânica (Ceratitis capitata Wiedmann), utilizando pLA513, indicando provavelmente que o marcador à base de ActinSC de pLA513 é impróprio para uso na mosca da fruta mediterrânica. Isso enfatiza o desejo de construções de expressão com uma gama ampla de espécies. Nós, por conseguinte, modificámos a construção para incluir um marcador à base de poliubiquitina (ubi-p63E), em vez do à base de ActinSC de pLA513. Uma dita construção é pLA656. Nós também fizemos duas construções adicionais, pLA928 e pLAH24 (SEQ ID NO: 18, 20 e 21, respetivamente, e mostradas esquematicamente nas figuras 10, 11 e 12), usando um marcador com base no potenciador de hr5 e no promotor de iel de um baculovírus (vírus de poliedrose nuclear Autographica californica, AcMNPV). Estes diferem na orientação do marcador com respeito à cassete de tetO-tTAV. 0 potenciador de hr está mais perto da cassete de tetO-tTAV em pLA1124 do que em pLA928. Para além disso, pLA1124 tem 21, em vez de 7, cópias de tetO e, adicionalmente, tem uma região de ligação do fator GAGA putativo, relacionada com a de pUASp (Rorth, 1998).

Foi obtida uma linhagem transgénica a partir de pLA656, três a partir de pLA928, e três a partir de pLAI 124. Estas linhas assumem-se ter inserções independentes, uma vez que foraim obtidas a partir de diferentes sobreviventes GO de injeção.

Os machos heterozigóticos para cada linha foram cruzados 4 ΕΡ1649027Β1 com fêmeas do tipo selvagem. A descendência foi criada em dieta padrão de Drosophila de levedura / açúcar / gérmen de trigo ou levedura / açúcar / milho, suplementada com tetraciclina, conforme apropriado. Os pais foram criados na mesma dieta, suplementada com tetraciclina a 100 pg/ml no caso dos machos transgénicos. As fêmeas do tipo selvagem com as quais estes machos foram acasalados foram, criadas sem. tetraciclina, para eliminar qualquer potencial contribuição materna de tetraciclina. O número de pupas e adultos transgénicos e não transgénicos obtidos de cada cruzamento, foi determinado pela pontuação para. DsRed2 por microscopia de fluorescência.

Os resultados destes cruzamentos são mostrados na tabela 12, que se segue. Em cada caso, na ausência de tetraciclina, a sobrevivência dos transgénicos heterozigóticos era inferior a 2% em relação ao seu tipo selvagem, mudando entre dietas contendo diferentes níveis de tetraciclina, são aqui discutidas noutro sítio a modificação da construção, e a utilização do efeito de posição.

Tabela 12

Efeito da tetraciclina na sobrevivência da mosca da fruta mediterrânica transgénica heterozigótica para várias construções, e dos seus irmãos +/+ IA656 Descendência [Tc] (pg/ml) Pupas F/NF Razão de sobrevivência de pupa (%) Macho F Fêmea F Macho NF Fêmea NF Razão de sobrevivência de adultos (%) 0 84/1161 7 6 2 530 551 0,7 0, i 16/423 4 0 r\ Kj 205 177 0 1 124/384 32 34 12 155 174 14 3 258/370 70 84 53 165 133 46 10 249/252 99 91 98 107 127 81 100 330/307 107 151 150 134 148 107 5 ΞΡ1649027Β1 LAS28ml Descendência [Tc] (pg/rol) Pupas F/NF Razão de sobrevivência de pupa (%) Macho F Fêmea F Macho NF Fêmea NF Razão de sobrevivência de adultos (%) 0 28/1499 1,87 5 1 661 639 0, 46 0,1 0/765 0 0 r*. kJ 347 246 0 1 190/256 74 62 59 119 101 55 3 290/302 96 133 98 143 107 92 10 nd nd nd nd nd nd nd 100 222/286 7 7 117 84 146 126 74 LA92Sm3 Descendência [Tc] (pg/ml) Pupas F/NF Razão de sobrevivência de pupa (%) Macho F Fêmea F Macho NF Fêmea NF Razão de sobrevivência de adultos (%> 0 68/1026 6, 6 13 4 489 449 1,8 0,1 0/2 65 0 0 0 117 91 0 1 358/446 30 154 100 228 164 65 3 105/105 100 39 35 42 38 93 10 nd nd nd nd nd nd nd 100 245/245 100 109 121 117 108 100 LA 9 2 8 f1 Descendência [Tc] (pg/ml) Pupas F/NF Razão de sobrevivência de pupa (%) Macho F Fêmea F Macho NF Fêmea NF Razão de sobrevivência de adultos (%) 0 17/1331 1,3 2 0 639 599 0,16 0, 1 2/254 0,8 0 Γ; 100 84 0 1 461/567 81 218 146 244 181 85 3 520/527 99 214 1S2 249 202 88 10 350/399 91 139 112 131 159 87 100 126/117 108 63 57 57 49 113 LA1124f1 Descendência [Tc] (pg/ml) Pupas F/NF Razão de sobrevivência de pupa (%) Macho F Fêmea F Macho NF Fêmea NF Razão de sobrevivência de adultos (%> 0 104/213 51 0 3 95 62 1,9 100 47S/536 8 9 218 208 205 203 104 6 ΕΡ1649027Β1 LA1124ml Descendência [Tc] (pg/ml) Pupas F/NF Razão de sobrevivência de pupa (%) Macho F Fêmea F Macho NF Fêmea NF Razão de sobrevivência de adultos (%) 0 337/437 7 7 2 1 1 7 Ô 2 07 0, 78 100 84/90 93 35 31 30 26 118 LA1124m2 Descendência [Tc] (pg/ml) Pupas F/NF Razão de sobrevivência de pupa (%) Macho F Fêmea F Macho NF Fêmea NF Razão de sobrevivência de adultos (%> 0 104/145 72 0 1 46 34 1,3 100 7 7/77 100 24 14 19 13 119 F: fluorescente, NF: não fluorescente.

As pupas foram recolhidas e pontuadas para a fluorescência (coluna 3), depois deixadas eclodir. Os adultos sobreviventes foram pontuados por sexo e fluorescência (colunas 5-8) . A partir destes dados em adultos, foi calculada a razão de fluorescência para não fluorescência dos sobreviventes, apresentada na coluna 9, como a percentagem de adultos fluorescentes observada em relação aos não fluorescentes. É de se esperar que estes cruzamentos originem, em média, o mesmo número de indivíduos transgénicos e não transgénicos, se uma proporção igual de indivíduos transgénicos e não transgénicos sobrevivessem até à idade adulta, então isto daria uma "razão de sobrevivência de adulto" de 100%.

Investigámos ainda a expressão de tTA nestas linhas transgénicas por rt-PCR quantitativa (em tempo real) (qPCR). Os resultados são apresentados na tabela 13, que se segue. 7 ΕΡ1649027Β1

Tabela 13 Níveis de expressão de tTA em mosca da fruta mediterrânica do tipo selvagem e transgénica

Amostra Razão tTA/18S Razão NT/T Larvas WT tet 3,13E-06 WT NT 2,81E ~ 0 6 656 tet 5, 8 0 E - 0 6 1,0 0 65 6 NT 2,06E-04 3 6 67QA tet 2,71E-06 1,00 670A NT 1,10E-04 41 Amostra Razão tTA/18S Razão NT/T 670e tet 9,7 OE-O6 1,00 67Oe NT 8,40E-05 8,7 Adultos WT fêmea 2,83E-0 6 WT macho 2,16E-07 Heterozigótic o 656 tet M Od 5,5 2 E - 0 6 1,00 Heterozigótico 656 tet M 8d 1,12E-05 2,0 656 NT M Od 4,4 9E-05 8,1 656 NT M 2d 2,77E-04 5 0 656 NT M 4d 2,2 2 E-0 4 4 0 656 NT M 8d 9, 71E-05 18 656 NT Μ 16d 1,4 9E-04 o n 670 M tet 4,21E-06 1,0 0 670 F tet 2,86E-06 0, 6 8 670 M NT S 6,93E-05 16,45 670 F NT S 1, 9 2 E-0 4 4 5,57 92 8Am1 F tet 7,17E-06 1,00 928Aml M tet 8,5 6 E — 0 6 1,19 928Aml M NT 2d 1,71E-04 23, 81 928Aml M NT 4d 5,36E-04 74,72 928Aml M NT 8d 1,91E-04 26, 66 92 8Aml M NT 16d 1,01E-05 1,41 928Aml M tet 8d 1,11E-06 0,16 92 8Aml M NT S 2,22E-04 31,02 92 8Aml M NT S 1,51E-04 21,11 8 ΕΡ1649027Β1 928Am3 F tet 9, 0 9E- -07 i, uO 928Am3 M tet 9, 0 9E- -07 1,00 928Am3 F NT S 9 -* f 62E- -05 39, 85 928Am3 F NT S 8, 7 4E- -04 962,07 928Am3 F NT S 2, 99E- -04 329,32 928Am3 M NT S 5, 53E- -05 60,83 928Am3 M NT S 9, 18E- -04 1009,90 112 4 f 1 F tet. 9 í 8 6E- -05 1,00 112 4 f 1 F NT 7 d 4, 11E- -04 14,35 1124ml M tet 1, 62E- -05 1,00 1124ml F NT S 9, 30E- -04 57,55 1124m2 F tet 8, 98E- -05 1,00 1124m2 F NT 7 d 7, 90E- -04 8,79 Homozigó’ tico 656 tet 8d 1, 4 9E- -05 1,00 65 6 NT 0d 9, 23E- -05 6,2 65 6 NT 2d 3, 90E- -03 262 65 6 NT 4d 1, 92E- -03 129 65 6 NT 8 d 4, 70E- -03 316 65 6 NT 1 6 d 8, 5 8E- -04 58 M: macho, F: fêmea tet: criado em dieta suplementada com tetraciclina a 100 yg/ml, NT S: criado em dieta padrão (0 pg/ml de tetraciclina), d: dias após eclosão, NT (n)d: criado em dieta tet, depois tido como adultos em dieta não tet (NT) durante n dias, tal como indicado, tet (n)d: criado em dieta tet, depois tido como adultos em dieta tet durante n dias, tal como indicado. EXEMPLO 9 LA670 em Ceratitis capitata

Conseguimos obter uma única linha transgénica de mosca da fruta mediterrânica por transformação com pLA670, uma construção que se assemelha muito a pLA656. Este plasmídeo está ilustrado na figura 13, em anexo, e é a SEQ ID NO. 23. 9 ΕΡ1649027Β1

No entanto, esta linhagem transgénica deu um número significativo de descendentes transgénicos adultos, mesmo quando criados como larvas em dieta deficiente em tetraciclina (tabela 14) . No entanto, esta linha de inserção de LA670 produz uma quantidade facilmente detetável de ARNrn de tTAV na ausência de tetraciclina, e isto é substancialmente reduzido pela tetraciclina na dieta (avaliado por qPCR, resultados mostrados na tabela 13, anteriormente). Por conseguinte, LA670 representa uma fonte regulável útil de tTAV com que conduzir a expressão de genes que respondem, a tTAV. A diferença no fenótipo entre τ,Αβοβ e LA670, que são extremamente semelhantes em estrutura, é provavelmente devida ao efeito de posição, que é a variação na expressão de transgenes, dependendo de onde eles se inseriram no genoma. Dita variação é também mostrada pela variação no fenótipo e nos níveis de expressão de tTAV entre diferentes linhas transgénicas com a mesma construção, tal como mostrado na tabela 13, anteriormente. É portanto proporcionado um método simples para a obtenção de linhas de transgénicos portadores de construções de controlo retrógrado positivo, com diferentes níveis de expressão e consequências fenotípícas, que compreende a geração de um painel de linhas de inserção e a. triagem para os níveis e padrões de expressão basal e desreprimidos adequados. 10 ΕΡ1649027Β1

Tabela 14

Efeito da tetraciclina na sobrevivência da mosca da fruta mediterrânica t ransgénica heterozigótica para LA670, e dos seus irmãos +/+ LA670 Descendência [Tc] (pg/ml) Pupas F/NF Razão de sobrevivência de pupa (%) Macho F Fêmea F Macho NF Fêmea NF Razão de sobrevivência de adultos (%) 182/220 83 72 35 102 103 52 100 10/8 125 5 q 5 3 100 F: fluorescente, NF: não fluorescente.

As pupas foram recolhidas e pontuadas para a fluorescência (coluna 3) , e depois deixadas eclodir. Os adultos sobreviventes foram pontuados por sexo e f .1 uore s c ê n c i a (colunas 5-8) . A partir destes dados em. adultos, foi calculada a razã o de fluorescência para n ã o fluorescência dos sobreviventes, apresentada na coluna 9, como a percentagem de adultos fluorescentes observada em relação aos não fluorescentes. É de se esperar que estes cruzamentos originem, em média, o mesmo número de indivíduos transgénicos e não transgénicos, se uma proporção igual de indivíduos transgénicos e não transgénicos sobrevivessem até à idade adulta, então isto daria uma "razão de sobrevivência de adulto" de 100%. Nós testámos a capacidade de Ι.Ά670 para dirigir a expressão de sequências colocadas sob o controlo transcricional de teto. Analisou-se a expressão de dois ARNm potenciais de pLA1038 (figura 14, SSQ ID NO. 24), que contém duas unidades de transcrição potenciais que respondem, a tTA, transcritas divergentemente. Estas são CMV-tTA e hsp70-Cctra-nipper. A análise por PCR, com os controlos, foi realizada sobre a expressão destas unidades de transcrição na presença 11 ΕΡ1649027Β1 e na ausência de pLA670. Ambas as unidades de transcrição são expressas na presença de pLA670. CMV-tTA é expressa a um nível inferior, mas detetável, em transgénicos LA1038/+ na ausência de LA670. hsp70-Cctra-nipper não é expressa de forma detetável na ausência de pLA670, o que mostra que a expressão é de facto acionada por, e dependente de, tTAV fornecida por pLA670. EXEMPLO 10 LA710 em Pectinophora gossypiella

Pectinophora gossypiella (lagarta rosa, um lepidóptero) foi transformada com LA710 (figura 15, SEQ ID NO. 19) por métodos padrão (Peloquin et al., 2000). Foram recuperadas quatro linhagens transgénicas. Os machos destas linhas foram cruzados com fêmeas do tipo selvagem para LA710. As larvas recém eclodidas foram colocadas em frascos individuais de 1,7 ml com dieta, quer com ou sem 7-clortetraciclina (40 pg/ml) , e pontuadas para fluorescência. Não foi observada uma diferença significativa no número de sobreviventes transgénicos até à idade adulta em relação ao número dos seus irmãos do tipo selvagem, quer com ou sem clortetraciclina. Concluímos que LA710 não conduz normalmente à acumulação de níveis letais de tTAV, mesmo na ausência de clortetraciclina na dieta.

Foi avaliada a expressão de ARNm de tTAV em transgénicos LA710 por PCR, após uma reação de transcriptase reversa (rt-PCR) . Descobrimos que o ARNm de tTAV não era detetável em larvas alimentadas com clortetraciclina, mas foi detetado em larvas que não tinham recebido clortetraciclina (dados não 12 ΕΡ1649027Β1 mostrados). Esta construção de LA710 de controlo retrógrado positivo fornece por conseguinte, nestas traças, uma fonte de t T AV que pode ser regulada através do fornecimento de clortetraciclina na dieta, e para a qual a expressão desreprimida, embora prontamente detetável, não é letal. Observou-se também uma variação significativa na intensidade da banda correspondente ao ARNm de tIAV em amostras de diferentes linhas. EXEMPLO 11 LA1124 emPectinophora gossypiella

Pectinophora gossypiella (lagarta rosa, um lepidóptero) foi transformada com LA1124 (figura 12, SEQ ID NO. 21) por métodos padrão (Peloquin et al., 2000). Foi recuperada uma única linhagem transgénica. Os machos desta linha foram cruzados com fêmeas do tipo selvagem para LA1124. As larvas recém eclodidas foram colocadas em frascos individuais de 1,7 ml com dieta, quer com ou sem 7-clortetraciclina (40 pg/ml) , e pontuadas para fluorescência. Estas larvas foram novamente tríadas quando tiveram tempo de se desenvolverem até um estádio larval mais tardio. Todas as larvas sobreviveram, exceto as larvas fluorescentes (LA1124/+) com dieta deficiente em clortetraciclina, tal como mostrado na tabela 15, que se segue. 13 ΕΡ1649027Β1 ΕΡ1649027Β1 Tabela 15 Lagarta rosa: sobrevivência de estádio larval inicial a tardio de LA1124/+ ou dos seus irmãos do tipo selvagem, em dieta com ou sem clortetraciclina 100 pg/ml de c LA1124/+ lortetraciclina Do tipo selvagem 0 pg/ml de cio LA1124/+ rtetraciclina Do tipo selvagem 3 (0 mortos) 11 (0 mortos) 8 (8 mortos) 7 (0 mortos)

Foi avaliada a expressão de ARNm de tTAV em lagarta rosa LA1124 por PCR, após uma reação de transcripta.se reversa (rt-PCR). Descobrimos que o ARNm de tTAV foi facilmente detetável nas larvas alimentadas com clortetraciclina, mas consideravelmente elevado em larvas que não tinham recebido a clortetraciclina (dados não mostrados). A expressão basal significativa do ARNm de tTAV nesta construção é, provavelmente, devida à inclusão em LA1124 do potenciador hr, o qual foi incluído por esta razão. A comparação da estrutura e função de LAI124 com a de LA710, ilustra claramente que os níveis basais e máximos do produto do gene podem ser facilmente selecionados por modificação apropriada da construção de expressão, sendo este princípio demonstrado aqui pela regulação de níveis de expressão de um ARN dependente de tTAV (neste caso, o ARNm de tTAV). EXEMPLO 12

Expressão específica do sexo usando o controlo retrógrado positivo É preferível controlar, por conceção, a expressão de tTAV de modo a exemplo, uma construção de controlo retrógrado positivo, de que possa ser diferencialmente expressa em por diferentes tecidos, ou em diferentes estádios de 14 ΕΡ1649027Β1 desenvolvimento, ou diferentes sexos. Uma aplicação para isto está no sexismo genético, em que um dimorfismo sexual é induzido entre os dois sexos, e este é usado como uma base para a separação dos dois sexos. No âmbito da técnica do inseto estéril, por exemplo, para a mosca da fruta mediterrânica, isto significa preferencialmente matar as fêmeas, mais de preferência numa fase precoce do seu desenvolvimento. Não são conhecidos promotores específicos de fêmeas com ação precoce em moscas da fruta mediterrânica, o que limita o potencial do sistema letal dominante de dois componentes reprimível, exemplificado para Drosophila, usando promotores ou potenciadores de genes da proteína da gema (Heinrich e Scott, 2000, Thomas et ai., 2000). Seria claramente vantajoso ser capaz de combinar as características benéficas de um. sistema, de controlo .retrógrado positivo condicional, com um mecanismo que confere especificidade de fêmea.

Portanto, nós modificámos uma construção de controlo retrógrado positivo não específica do sexo, através da inserção de uma região intrónica específica do sexo de Cctra, o homólogo de mosca da fruta mediterrânica do gene transformer de Drosophila melanogaster (Pane et ai., 2002). O processamento específico do sexo de Cctra é ilustrado esquematicamente na figurói 16, que é adaptada a partir de (Pane et aí., 2002) supra. A figura 16 mostra a organização genómica do gene tra da mosca da fruta mediterrânica. A linha superior .representa o locus genómieo de Cctra. Os exões são mostrados como blocos, aug marca o codão de iniciação comum. As junções de processamento alternativo são marcadas i. Os locais de ligação tra/tra-2 putativos são marcados com setas. 0 transcripto Fl, o único que codifica a proteína funcional de 15 ΕΡ1649027Β1

Cctra, é específico para as fêmeas. Os transcriptos Ml e M2 são encontrados tanto em machos como em fêmeas. São produzidos três transcriptos principais: Ml, M2 e Fl. 0 transcripto F1 é encontrado apenas em fêmeas, e é o único que codifica para a proteína Cctra funcional de tamanho completo. Os transcriptos Ml e M2 são encontrados tanto em machos como em fêmeas, e incluem sequência exónica adicional, a qual insere um ou mais codões de terminação em relação ao transcripto Fl, o que leva ao truncamento do quadro aioerto de leitura. Nós inserimos o intrão de Cctra no quadro aberto de leitura de tTAV, de modo que a excisão por processamento do intrão completo, na forma do transcripto Fl, iria reconstituir uma região codificante intacta de tTAV, mas no processamento na forma quer de Ml ou de M2 iria resultar numa proteína truncada, incapaz de atuar como um potenciador da transcrição. 0 plasmídeo .resultante, pLA1188 (figura 17, SEQ ID NO. 22), foi injetado em embriões da mosca da fruta mediterrânica. As larvas sobreviventes foram recuperadas, e os extratos destas larvas foram analisados por rt-PCR para determinar o padrão de processamento do transcrito de tTAV.

As larvas fêmea produziram produtos de PCR correspondentes aos tamanhos esperados que resultariam do processamento no padrão do gene Cctra endógeno, por outras palavras, que correspondem ao processamento nos padrões Ml, M2 e Fl. Estes dados indicam que o intrão de Cctra pode processar corretamente num contexto heterólogo e, por conseguinte, fornece um método adequado para introduzir a especificidade do sexo numa construção de controlo retrógrado 16 ΕΡ1649027Β1 positivo. Para além disso, uma vez que a função de tra é conservada ao longo de uma ampla gama filogenética (Saccone et ai,, 2002), e são conhecidos outros intrões específicos do sexo, por exemplo, no gene double-sex (dsx) de Drosophila melanogaster, que é também bem conservado, isto proporciona um método geral para a manipulação da expressão de genes. Será evidente para o perito na tecnologia que ditas manipulações podem alternativamente, ou adicionalmente, ser aplicadas a outros genes que respondem a um ativador de transcrição, de modo a que a expressão especifica do sexo de um gene alvo pode ser conseguida através da combinação da expressão não especifica do sexo de um ativador de transcrição com a expressão especifica de sexo, por exemplo, através de processamento de um ARN funcional sob o controlo da transcrição do ativador de transcrição. Para além disso, também será evidente que isto proporciona um mecanismo simples para a expressão diferencial de dois, ou mais, genes alvo diferentes, ou produtos de genes, de tal modo que um, ou um grupo, é expresso em ambos os sexos, e o outro, ou outro grupo, é apenas num dos sexos. Isto é ilustrado para a mosca da fruta mediterrânica na figura 18.

Os oligonucleótidos iniciadores utilizados foram os seguintes:

Tra (t T AV) Seq +: 5'-CCTGCCAGGACTCGCCTTCC (SEQ ID NO. 12) Tra (t T A V) Seq 5'-GTCATCAACTCCGCGTTGG? iGC ( SEQ TD NO. 13) For am produzidos produtos de rt-PCR de ~ 60 0 e -200 pb, quando o ADNc derivado de fêmeas 1 e 2 da mosca da fruta mediterrânica foi utilizado como molde, o que representa as 17 ΕΡ1649027Β1 formas processadas de ARNm específicas de "macho" (Ml e M2) e de fêmea (Fl), respetivamente (dados não mostrados). 0 produto de ~ 200 pb pode ter sido produzido devido a contaminação com ADN de tTAV, a forma processada de fêmea remove completamente o intrão de Cctra e, assim conduz a um produto de PCR que é idêntico ao que seria obtido a partir de qualquer um dos vários plasmídeos contendo tTAV, ou amostras tratadas no mesmo laboratório. Em contraste, a banda de ~ 600 pb, mantém ~ 400 pb da sequência de Cctra e, é diagnóstico de processamento correto da construção.

Numa outra experiência (dados não mostrados), a expressão de transcritos de LA1038 em resposta a tTAV de LA670 foi analisada por cromatografia em gel (resultados não mo st rados), ut i1iz ando: A: rt-PCR para a expressão de CMV-tTA de LAI 038 em extratos de duplos heterozigóticos LA10 3 8/ +, LA 6 7 0/ +, B: rt-PCR para a expressão de hsp7 0-Cctra-nipper em extratos de duplos heterozig ót icos LAI 038/ + , LA 67 0/ + , O C: rt-PCR p cL 2Γ cL cL expressão de CMV-tTA de LAI 0 3 8 em extratos de heterozigóticos LA1038/+ sem LA670.

Todas as moscas foram criadas na ausência de tetraciclina na dieta. Em A e C, estavam presentes duas bandas entre 200 pb e 400 pb, e representam ADNc a partir de ARNm processado (banda de menor peso molecular), e ADN genómico ou ADNc de mensagem não processada (banda de maior peso molecular), respetivamente. Em B, uma banda a cerca de 200 pb representa ADNc a partir de ARNm processado no padrão do transcrito Fl de Cctra específico de fêmeas, uma banda superior de aproximadamente 1500 pb representando o ADN genómico ou ADNc a partir da mensagem não processada, e 18 ΕΡ1649027Β1 baindas de tamanho intermédio que representam ADNc processado no padrão dos transcritos Ml e M2 de Cctra não específicos do sexo, ou. bandas não específicas.

As sequências dos oligonucleótidos iniciadores utilizados foram: hsp'7 0-Cctra-nipper: NIP : 5 ' -CATCGATGCCCAGCATTGAGATG e HSP: 5'-CAAGCAAAGTGAACACGTCGCTAAGCGAAAGCTA,

CMV-tTA: CMV: 5'-GCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAG e TTA: 5'-GCCAATACAATGTAGGCTGCTCTACAC

Estes dados (não apresentados) demonstram que a secção de hsp-Cctra-nipper de LA1038 é mostrada ser corretamente processada na forma de fêmea em 6/6 fêmeas, e na forma de macho em 6/6 machos.

Sequências de referência:

JY2004-tTA (SEQ ID NO. 14) - sequência só da região tetO?-t TA pP [Casper-Act5C-tTA] (SEQ ID NO. 15) pLA513 (SEQ ID NO. 16) pldASl 7 (SEQ ID NO. 17) pLA656 (SEQ ID NO. 18) pLA670 (SEQ ID NO. 23) pLA710 (SEQ ID NO. 19) pLA928 (SEQ ID NO. 20) PLA1038 (SEQ ID NO. 24) pLAH24 (SEQ ID NO. 21) pLAH88 (SEQ ID NO. 22) 19 EP1649G27B1

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<223> Iniciador de PCR < 4 0 0 > 7 catgccgacg cgctaga 17 <210> 8 <211> 26

< 212 > ADN < 213 > A r t i f i c i a 1 <22 0>

<223> Iniciador de PCR ΕΡ1649027Β1 <40 0 > 8 gtaaacatct gctcaaactc gaagtc 26 <210 > < 211 > < 212 > < 213 > 9 18 ADN Artificial. <22 0> <223> Parte de nucleótido de sonda TaqMan MGB <400 > 9 tcgatc :tgga catgttgg 18 < 210 > < 211 > < 212 > < 213 > 10 25 ADN Artificial < 2 2 0 > < 2 2 3 > < 4 0 0 > Iniciador de PCR 10 gccctcgatg gtagacccgt aattg 25 <210> <211 > < 212 > < 213 > 11 2 7 ADN Artificial <22 0> < 2 2 3 > Iniciador de PCR < 4 0 0 > 11 gctaaacaat ctgcaggtac cctggcg 27

<210> <211> < 212 > <213 > 12 20 ADN Arti fi c i a1 <22 0> < 2 2 3 > Iniciador de PCR 28 ΕΡ1649027Β1 < 4 Ο Ο > 12 cctgccagga ctcgccttcc 20 <210> 13 <211> 22 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Iniciador de PCR <400 > 13 gtcatcaact ccgcgttgga gc 22 <210> 14 <211> 2556 <212> ADN <213> Artificial < 2 2 0 > <2 2 3> JY2 0 0 4-tTA < 4 0 0 > 14 gcggccgcat- agtcgacat-t -tcgagtttac ..eactecctat cegtgataga gaaaagtgaa 60 agtcgagttt acoactccct ateagtgata gagaaaagtg aaagtcgagt ttaccactce 120 otatcagtga tagagaaaag tgaaagtcga gtttaccact ccctatcagt gatagagaaa 180 agtgaaagtc gagtttacca ctccctatca gtgatagaga aaagtgaaag tcgagtttac 240 cactccctat cagtgataga gaaaagtgaa agtcgagttt accaetccct ateagtgata 300 gagaaaagtg aaagtogagc toggt&cccg ggtcgeggta ggcgtgtacg gtgggaggcc 360 tatataagca gagctcgttt agtgaaccgt cagatcgcct ggagacgcca tccacgctgt 420 tttgacctcc atagaagaca ccgggaccga tccagcctcc gcggccccga attcgagctc 480 ggtacccggg gatccccgct cgagctgaat agggaattgg gaattggagc agaggtgggt 540 tettcgeatt aeaetgttcg ccacaatctt gtttattcat togccttgca ggttgccaac 600 atggaattga gattagataa aagtaaagtg aetaacagcg cattagagct gcttaatgag 660 gtcggaatcg aaggttta&c aacccgtaaa ctcgcceaga agctaggtgt agagcagcct 720 acattgtatt ggcatgtaaa aaataagcgg gctttgctcg acgccttagc cattgagatg 780 ttagataggc accatactca cttttgccct ttagaagggg aaagctggca agatttttta 840 29 EP1649G27B1 cgtaataacg ctaaaagttt tagatgtgct ttactaagtc atcgcgatgg agcaaaagta 900 catfctaggfea cacggcctac agaaaaa^ag tatgaaactc tcgaaaatca attagccttt 960 ttatgccaac aaggtttttc actagagaat gcattatatg cactcagcgc tgtggggcat 1020 tttactttag gttgcgtatt ggaagatcaa gagcaccaag tcgctaaaga agaaagggaa 1080 acacebaeta ctgatagtat gccgccatta btaogacaag etategaatt atttgateac 1140 eaaggtgcag agecagcctt cttattcggc cttgaattga tcacatgcgg attagaaaaa 1200 eaacttaaat gtgaaagtgg gtccgcgtac agccgcgcgc gtacgaaaaa caattacggg 1260 tctaeeaceg agggcctgct cgatctcccg gacgacgacg cccccgaaga ggcggggctg 1320 gcggctccgc gcctgtcctt tctccccgcg ggacacacgc gcagactgtc gacggccccc 1380 ccgaccgatg tcagcctggg ggacgagctc cacttagacg gcgaggacgt ggcgatggcg 1440 catgeegacg cgctagacga tttcgatctg gacatgttgg gggacgggga ttccccgggt 1500 ccgggattta ccocccacga ctccgccccc tacggcgctc tggatatggc cgacttcgag 1S60 tttgagcaga tgtttaccga tgcccttgga attgacgagt acggtgggta gtgaaacgcg 1620 tetagagetg agaacttcag ggtgagtfctg gggacccttg attgttettt ctttttcgcfc 16ΘΟ attgtaaaat tcatgttata tggagggggc aaagttttca gggtgttgtt tagaatggga 1740 agatgtcccfc tgtatcacca tggaccctea tgaeaatttt gettetttca etttetaetfi 1800 tgttgacaac cattgtcccc tcttatttte ttttcatttt ctgtaacbte ttcgttaaac 1860 tttagcttgc atttgtaacg aatttttaaa ttcacttttg ttfcatttgtc agattgtaag 1920 tactttctct aatcactttt ttttcaaggc aatcagggfca tattatatbg tacttcagca 1980 cagteteaga gaacaattgt tataattaaa tgaeaaggta gaatatttct gcatataaat 2040 tctggcfcggc gtggaaatat tcttattggfc agaaacaact acaccctggt catcaccccg 2100 cctttctctt tatggttaca «tgatataca ctgtttgaga tgaggataaa atactctgag 2160 tccaaaccgg gcccctctgc taaccatgtt catgccbtct tctctttcct acagctcctg 222Q ggcaacgtgc tggttgttgt gctgtcfccat cabtttggca aagaattcac tectcaggtg 2280 caggetgcct ateagaaggt ggtggctggt gtggccaatg eeetggctca caaataccac 2340 tgagatcttt ttccctctgc caaaaafctat ggggacatca tgaagcccct tgagcatctg 2400 acttctggct a&taaaggaa atttatttte attgcaatag tgtgttggaa ttttttgtgt 2460 ctctcactcg gaaggacata tgggagggca aatcatttaa aacatcagaa tgagtatttg 2920 gfcbfcagagfrt tggcaacata tgcocatage ggccgc 2556 30 ΕΡ1649027Β1 < 210 > 15 < 211> 12087 < 212 > ADN <213> Artificial <22 0> <223> ρΡ[Casper-Act5C-tTA] < 4 0 0 > 15 31 ΕΡ1649027Β1 gatceatgag caattageat gaacgttctg aaaagcgcgt tfcagccctee aetactEaça 60 caíatetBtat gctgmat-at tgaaaatcta ataaacaaaa ctaaKgCacrs Ktaafcççtt.? 1:20

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Skcaassage eaatgtaatt atatttgtgc caataaaaac aagatatgac ctatagaata 1260 c&agtattfcc ccctfccgaac atccccacaa gtagactttg gatttgtctt ctaaceaaaa 1320 gactíoaèaca ectgcaeacc ttacatcaaa aactcgtttà tcgcfcaeata aaacaecggg 1380 atatatetfct tatatacata cttttcaaat cgcgcgcccfc ctfceataatfc cacctccacc 2440 acaccacgtt tcgtagttgc tcCttcgctg ccteccacce gefcctecgca acacattcac isoo jctittÈgkfccçí acgaccttgg agcgaetgsc gtetagtcccg cgcgatfccgpgtgcggcafctt 1560 cacacegcat atggfcgcact ctcagtasaa tetgctctga tgecgcat.ag fcfeaagccagc 1620 escgacaccd gçeaacaccc gctgaegcge cetgaegggc ttgtctgcte ccggeateeg · 168S * cttacagaca agctgtgacc gtctccggga getgcatgcg tcagaggtcc tcaccgtcat 1740 caccgaaacg cgcgagacga aagggecccg cgàtacgcct att fct Catag gttaatgfeca 1800

Igifeaalaoi: ggtttçttag acgtcaggtg gçactt.teeg gggaaafcgtg çgcggaaccc 1Θ60 .etafeefgtfcst; afcccttcsaa atacactcaa atatgeatcc gctcaEgaga caataaecct 1920 32 ΕΡ1649027Β1 gataaatgct tcaataasat tgaaaaaggà agagtaegag taCtcaacaE; :ttccgfcgÊteg 19 SO ccettàttcc cçtctttgcg gcafctttgcc tçcçtgfcctt tgetcaòeea gaaacgctgg 2040 tgaaagCsaa egatgctgaa gatcagttgggcgcacgagt gggttacatc gaacçggatç 2100 teaacagcgg tasgatcctt gagagttetc gceccgaaga acgttttcca atgatgagca 2-tSffi cttttaaagt cetgctatgt ggçgcggtat eatcccgtat tgacgccggg caagagqaac 3220 çcggtcgcçf catacaetat ectcagaatg acttggttga gtactcaeca gtcacagaaa 2200. agcaecttac ggacggcatg acagéaagag aattatgcag tgetgceata accatgagtg 3340 ataaeaetgc ggecaa«fcta Ottctgacaa cgâtcggagg accgaaggag ctaaecgett 2400 e^segçacaa oatgggggat catgtaaccc gccttgatcg ctgggaaecg gagctgaatg 24δ0 aágccaCacc aaacgacgag egtgacacca cgatgcctgt ageaatggca acaacgttgc 2520 gtaSaetáet· aactggcgaa çtâcttaete tagceeoccg gcaaeaatea at&gactgga 2S60 tggaggegga taaagttgca ggaceacttc tgçgcfccggc ccttccggct ggctggttta 2640 tcgctgaeaa aectgg&gcc ggtgagcgtg ggtcfccgcgg tatcattgca gçaqtggggc 2700 cagatggtaa gccefccccgt atcgtagcta tctacacgac ggggagtcag goaactatgg 2760 atgaáogaaa cagaGagafec gctgagafcag gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt 2820 cagaccaagt ítâcccatat afcactttaga tftgatttaaa «cetçatfctt tsattfcaáaa :2860 .ggetgeaggfr gaagateett tfcfcgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt 2940 cgttccactg agcgccagac eccatagaaa agatcaaagg atctcçttga gatcettttt 3000;: fetctgcgcgt áatèepigB' ttgeaàacaa aaaaaccacc geeaeeagçg geggt ttgtt 3060 tgcegwatca-agagctaoca actcttcttc .cgaaggtaae C.ggcfctcagc agagçgcaga 3120 taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca .çeagÇfcicaag aactctgtag 2182:: ;GSísçg$çtacs ssacfit«â^e;;2Ksefcaa8çç -çg^tae<;ãg:6 sgoigcegcc «gtggegata 3240. agtogtgtct taccgggttg gactcaagac gaeagttacc ggaeaaggcg cagcggtcgg 3300 gctga&cggg gggttcgtgc aeacagccca gcteggagcg aacgacctao e.ccgaactga 3360 ::gaeaççtaqi8: gcgtgagcta tgagaaagcg c^egetfccc éga.agggaga. aaggcggaca :|*#' iggtatffieggt:: aagcggeagg gteggaacag gagagegcaç gagggagettecagggsgaa 3:#ίό, ^a^eaftggfcis: fcctt bátagfc cctgtegggt ttcgccacèt :et^àetfcga|(t'i^tGgâfcefcife 354 C tg|ga;È9Õfca: gfcoagggggg aggagcct-.af. ggaaaaacgc «ei-feàsttotti^:^iàátóti«S^^icifc 3600 cggtgccagfe aeaccteaaa tssttgtcgfc acctcKcatg gttcegtCaG gecaacgagg 3660 gfccfcgctgac taacçaatgg gcggacgcgg &gccggge®a aattagecgc acatcgtega 3720 acsceacgtg cecéaefctcgggeáaggtca tcctggagac getcaãCtfec tccgccgccg 3780 atctgccgct. ggactacgtg ggtctggccc atgatgaaat aacataaggt ggtcccgtcg 3340 aaagccg&ãg ΕΛ sattcagtge acaWtgctt getgagagga 3906 33 ΕΡ1649027Β1 aaggBtgtgt gcggàcgaat ttttfctetga aaacattaac ccttaçgtgg astaaaaaaa :àáfcgâ|à£8t: ;eSGa^àfcti:ji;e .g|fcgc#i®é; 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<223> Iniciador de PCR <400> 26 caagcaaagt gaacacgtcg ctaagcgaaa gcta 34 <210> 27 <2ll> 28 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Iniciador de PCR <400> 27 100 ΕΡ1649027Β1 ΕΡ1649027Β1 28 gccatccacg ctgttttgac ctccatag

<210 > 28 <211> 27 < 212 > ADN !13:

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<223> Iniciador de PCR < 4 0 0 > 2 8 gccaatacaa tgtaggctgc tctacac 27 < 210 > 2 9 < 211> 1005 < 212 > ADN <213> Artificial <22 0> <223> Região codificante de tTA de pUHD15-l <4 0 0 > 2 9 101 EP1649G27B1 atgtetagat tagataaaag taaagtgatt aacagcgcat tagagctgce taatgaggcc 60 ggaatcgaag gtttaacaac ccgtaaactc gcccagaagc taggtgtaga gcagcctaca 120 ttgtattggc atgtaaaaaa taagcgggct ttgctcgacg cettagecat tgagatgtta lao gataggcacc atactcactt ttgcccttta gaaggggaaa gctggcaaga ttttttacgt 240 aaeaacgcta aaagttCCag atgtgcttta ctaagtcatc gcgatggagc aaaagtacat 300 ttaggtacac ggcctacaga aaaacagtat gaaactctcg eaaatcaatt agccttttta 360 tgccaacaag gttttccact agagaacgca ctatatgcac tcagcgccgt ggggcattcc 420 actttaggtt gcgtafctgga agatcaagag cafccaagtcg etaaagaaga aagggaaaca 480 cccactactg atagtatgcc gccattatta cgacaagcta tcgaateatt tgatcaccaa 540 ggtgcagagc cagccttctt afcteggoctt gaattgacca taegcggatt ag&aaaacaa 600 cttaaatgtg aaagtgggfcc cgcgtacagc cgcgcgcgta cgaaaaecaa ttacgggtct 660 accatcgagg geetgetcga tctcccggac gacgacgccc ccgaagaggc ggggccggcg 720 gctccgcgcc tgtectttct ccccgcggga cacacgcgca gactgecgac ggcccccccg 7Θ0 accgatgtca gcctggggga cgagctccac ttagacggcg aggacgtggc gatggegcat 840 gccgacgcgc tagaegattt egatctggac atgttggggg acggggattc ccegggtceg 900 _ggatt.taccc_cccaíigect:c cgccceetac .ggcgccctgg atatggccga cttcgagtet 960 gagcagatgt ttaccgatgc ccttggaatt gaegagtacg gtggg 1005 <210> 30 < 211> 33 6

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DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • GB 0317656 A [0126]

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Lisboa, 18 de Fevereiro de 2014 117

Claims

ΕΡ1649027Β1 REIVINDICAÇÕES 1. Um sistema de expressão de gene reprimível operacional num inseto, que compreende dois elementos na mesma construção, em que, o primeiro elemento compreende pelo menos um gene do fator de controlo a ser expresso e, pelo menos, um primeiro promotor do mesmo, e o segundo elemento compreende pelo menos um segundo promotor e, um gene de interesse sob o controlo de, pelo menos, um dito segundo promotor, em que um produto do gene do fator de controlo a ser expresso serve como um fator de controlo transcricional positivo, tanto para, pelo menos, um primeiro promotor no dito primeiro elemento e, pelo menos, um segundo promotor no dito segundo elemento, e em que o dito produto do gene do fator de controlo, ou a expressão do produto referido do gene do fator de controlo, éreprimível, o primeiro e o segundo promotores sendo promotores mínimos de insetos, que podem ser o mesmo ou diferentes.
2. Um sistema de acordo com a reivindicação 1, em que um potenciador está associado com o, ou cada promotor mínimo de insetos, servindo o produto do gene para aumentar a atividade do, ou cada. prom.otor mínimo de insetos, através do potenciador.
3. Um sistema de acordo com a reivindicação 2, em que o fator de controlo é o produto do gene t.TA, ou um análogo reprimível do mesmo, e em que uma ou mais unidades do 1 ΕΡ1649027Β1 operador tetO estão ligadas operativamente com o promotor, e o potenciador é tTA, ou um análogo do mesmo, que serve para aumentar a atividade do promotor através de tetO.
4. Um sistema de acordo com a reivindicação 3, no qual o gene do fator de controlo codifica o produto de tTAV (SEQ ID NO. 32).
5. Um sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o gene é modificado para pelo menos seguir parcialmente a utilização de codões, numa espécie em que o sistema está a ser utilizado.
6. Um sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o primeiro e/ou segundo promotor é substancialmente inativo na ausência do fator de controlo transcricional positivo.
7. Um sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o primeiro e/ou segundo promotor mínimo de insetos é selecionado a partir de: hsp70, um promotor mínimo de P, um promotor mínimo à base de Act5C, um fragmento de promotor de BmA3, um promotor central de Adh, e um promotor mínimo de ActSC, ou combinações dos mesmos.
8. Um sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o primeiro e/ou segundo promotor mínimo é obtido a partir de, ou é um fragmento de, Hsp70.
9. Um sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, que reduz substancialmente a aptidão quando desreprimido. ΕΡ1649027Β1
10. Um sistema de acordo com a reivindicação 9, que compreende um gene letal, sob o controlo de um promotor do sistema.
11. Um sistema de acordo com a reivindicação 10, em que o gene letal é um gene letal dominante.
12. Um sistema de acordo com a reivindicação 10 ou 11, em que o gene letal e o gene do fator de controlo são o mesmo.
13. Um sistema de acordo com a reivindicação 12, ern que o gene é tTA ou um análogo do mesmo.
14. Um sistema de acordo com a reivindicação 10 ou 11, em que o gene letal e o gene do fator de controlo são diferentes.
15. Um sistema de acordo com a reivindicação 9, em que a aptidão reduzida é uma taxa de mortalidade elevada.
16. Um sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a expressão do gene do fator de controlo é seletiva.
17. Um sistema de acordo com a reivindicação 16, em que a expressão do gene do fator de controlo é determinada pelo sexo.
18. Um sistema de acordo com a reivindicação 17, que compreende doublesex, transformer ou sequência letal específica do sexo. 3 ΕΡ1649027Β1
19. Um sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o gene de interesse está ligado operativamente a pelo menos um promotor mínimo de insetos. ΕΡ1649027Β1
2 0 . Um gene de sistema de acordo com a reivindicação interesse é um gene letal dominante. 9, em que o
21. Um sistema de acordo com a reivindicação 19, em que o gene de interesse codifica ARNi.
22. Um sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações de 19 a 21, em que a ativação do promotor mínimo de insetos, ao qual o gene de interesse está ligado operativamente, leva a um efeito seletivo através de um produto de transcrição ou de tradução de ADN, sob o controlo do promotor mínimo de insetos.
23. Um sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações de 16 a 22, em que a seleção é específica da espécie.
24. Um sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações de 16 a 23, em que a seleção é específica do estádio de de s e η v o 1 v i me n t o . das reivindicações cistrões, estando sob o controlo do
25. Um sistema de acordo com qualquer uma anteriores, o qual é, pelo menos, dois ditos cistrões ligados a um potenciador, gene do fator de controlo.
26. Um sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a expressão do gene do fator de controlo na remoção de um supressor para o gene, não tem 4 ΕΡ1649027Β1 substancialmente nenhum efeito sobre a aptidão de um adulto, a partir do qual o supressor foi removido.
27. Um sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, delimitado por elementos isoladores.
28. Um sistema de acordo com a reivindicação 27, em. que os isoladores são isoladores não idênticos.
29. pLA513 tal como identificado pela SEQ ID NO. 16.
30. JY2004-tTA tal como identificado pela SEQ ID NO. 14.
31. Um vetor que compreende o sistema de qualquer uma das reivindicações de 1 a 28.
32. Um vetor de acordo com a reivindicação 31, que compreende ainda um marcador de expressão.
33. Um vetor de acordo com a reivindicação 32, em que o marcador de expressão é uma proteína fluorescente ou um marcador de resistência.
34. Um vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações de 31 a 33, que compreende ainda um gene de transposase expressável.
35. Um inseto que compreende no seu genoma um sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 28.
36. Um inseto de acordo com a reivindicação 35, que está substancialmente descomprometido pelo sistema, sob condições 5 ΕΡ1649027Β1 permissivas em que o gene do fator de controlo não é exoresso.
37. Um inseto de acordo com a reivindicação 35 ou 36, que é de uma espécie de praga.
38. Um inseto de acordo com qualquer uma das reivindicações de 35 a 37, o qual é selecionado a partir de: mosquito, lagarta, mosca da fruta mediterrânica, eDrosophila.
39. Um inseto de acordo com qualquer uma das reivindicações de 35 a 38, em que a expressão do gene do fator de controlo é bloqueável ou controlável por suplementos dietéticos.
40. Um método para estabelecer a compatibilidade de um promotor mínimo de insetos com uma espécie de inseto, que compreende: 1) a transformação de dita espécie com. um plasmídeo, ou outro vetor, o plasmídeo, ou outro vetor, que compreende: um sistema, de acordo com reivindicações de 1 a 2 6, que qualquer inclui o mínimo de insetos ser testado operativamente ao gene de interesse uma das promotor ligado de dito S .1 S ΤΓ. θ ΓΓίά f Θ controlo de para a dita - um marcador de transformação, sob o um promotor marcador de inseto adequado espécie, 6 ΕΡ1649027Β1 2) avaliação de indivíduos transgénicos putativos para a expressão do marcador, e 3) avaliação de indivíduos que expressam o marcador para a expressão do gene de interesse.
41. A utilização do sistema de expressão do gene de insetos, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 10 a 14, no controlo de uma população de pragas de insetos. Lisboa, 18 de Fevereiro de 2014 7