ES2447422T3 - Sistemas de expresión para el control de insectos dañinos - Google Patents
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Abstract
Un sistema de expresión génica que se puede reprimir, operativo en un insecto, que comprende dos elementosen la misma construcción, en la que: el primer elemento comprende al menos un gen de factor de control que hay que expresar y al menos un primerpromotor del mismo; y el segundo elemento comprende al menos un segundo promotor y un gen de interés bajo elcontrol de dicho al menos un segundo promotor; en el que un producto del gen de factor de control que hay que expresar sirve como factor de control de latranscripción positivo para ambos, el al menos un primer promotor en dicho primer elemento y el al menos unsegundo promotor en dicho segundo elemento, con lo que dicho producto del gen de factor de control, o la expresiónde dicho producto del gen factor de control, se puede reprimir, siendo el primer y el segundo promotores, promotores mínimos de insecto, que pueden ser el mismo o diferentes.
Description
Sistemas de expresión para el control de insectos dañinos
5 La presente invención se refiere a sistemas de expresión en insectos que comprenden un promotor.
La manipulación genética de insectos distintos de Drosophila melanogaster, por procedimientos de ADN recombinante está en su infancia (Alphey, 2002; Alphey y Andreasen, 2002; Alphey y col., 2002; Benedict y Robinson, 2003; Berghammer y col., 1999; Catteruccia y col., 2000; Coates y col., 1998; Handler, 2002; Horn y col.,
10 2002; Jasinskiene y col., 1998; Lobo y col., 2002; Lozovsky y col., 2002; McCombs y Saul, 1995; Moreira y col., 2004; Peloquin y col., 2000; Perera y col., 2002; Scott y col., 2004), y se han obtenido muy pocas líneas transgénicas de insectos no-Drosophila, utilizando promotores heterólogos.
La transformación de insectos es un sistema de baja eficacia que requiere la identificación de transformantes
15 escasos, en un contexto con un gran número de individuos no transformados. Por tanto, es importante que los transformantes tengan un marcador fácilmente valorable. Actualmente los marcadores favoritos son las proteínas fluorescentes, tales como la GFP, DsRed y sus derivados mutantes. Estos requieren elementos de control de la transcripción, incluyendo un promotor, para su funcionamiento. Los mejor conocidos de estos son los genes de la Drosophila Actin5C (Act5C) y ubi-p63E (Pub). También se ha utilizado una seda de polilla homóloga de Act5C, el
20 BmA3, así como un par de promotores específicos de tejido (3xP3, un promotor sintético específico de ojo, y Act88F, específico de los músculos indirectos de vuelo).
Sin embargo, ninguno de estos promotores es satisfactorio completamente. El Act5C se ha utilizado para transformar varios mosquitos, así como Drosophila, pero su patrón de expresión en mosquitos está lejos de ser 25 ubicuo (Catteruccia y col., 2000; Pinkerton y col., 2000). Los esfuerzos para utilizarlo como parte de un marcador de transformación en la mosca mediterránea de la fruta (Ceratitis capitata) han fallado, donde los experimentos con Pub habían conseguido un buen resultado. El Pub tiene limitaciones similares: el patrón de expresión que se ha visto en los transformantes de la mosca mediterránea de la fruta es muy variable, sugiriendo que el patrón de expresión es al menos muy sensible al efecto de posición. Además, ninguno de estos promotores se puede regular en un sentido o
30 activarse o desactivarse si se desea.
Fussenegger y col., (1998a; 1998b) ilustra una retroalimentación positiva que controla transcripciones multicistrónicas, utilizando un marcador de selección, en un ejemplo. Los experimentos se restringieron a sistemas mamíferos. Se describe el pTRIDENT como un operón artificial mamífero tricistrónico. Se ha descrito la expresión o 35 la expresión transitoria de genes del ciclo celular detenidos para “manipulación metabólica”, es decir, que regulan la expresión de proteínas deseadas, y se menciona que un efecto de “silenciamiento” del dominio transactivador VP16 puede ser letal para la célula huésped, incluso a niveles de expresión moderados (Berger y col., 1990; Damke y col., 1995; Gill y Ptashne, 1988; Gossen y Bujard, 1992; Salghetti y col., 2001). Se han tratado los beneficios de los sistemas autorreguladores mono o policistrónicos, incluyendo los sistemas de expresión multicistrónicos selectivos 40 de mamíferos que incluyen el tTA en una configuración basada en pTRIDENT o una configuración tetracistrónica (pQuatro-tTA; Fussenegger y col., (1998b); Figura 2). Aunque el gen tTA se codifica en la unidad de expresión multicistrónica por sí misma, no se expresa o se expresa poco tTA bajo condiciones de restricción. Este sistema de regulación por retroalimentación positiva no muestra signos de silenciamiento. Los experimentos con una configuración monocistrónica de retroalimentación positiva en animales transgénicos, tampoco ha mostrado efectos
45 perjudiciales (Shockett y col., 1995).
Se han caracterizado muy pocos promotores u otros elementos de control, y existe una necesidad acuciante para tales elementos. Sería deseable proporcionar un promotor universal activo en todas o casi todas las células de un amplio intervalo de insectos, o que fuera capaz de una utilización más amplia que un promotor existente. Una
50 pretensión más es regular la actividad de los promotores de insectos, especialmente en una manera de estadio de vida y/o específica de sexo. También se pretende reducir o eliminar selectivamente la actividad del promotor en células o tejidos particulares. La presente invención proporciona tales sistemas.
Sorprendentemente, se ha descubierto ahora que es posible emplear un mecanismo de retroalimentación positiva 55 tanto para mejorar el efecto de un promotor de insectos, así como para controlar su expresión.
Por tanto, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un sistema de expresión génica de insectos, que comprende al menos un gen que hay que expresar y al menos un promotor del mismo, en el que el producto del gen que hay que expresar sirve como factor de control positivo de la transcripción para al menos un promotor, y que es
60 controlable por el producto, o la expresión del producto.
Como se utiliza en el presente documento, el término “gen” se refiere a cualquier secuencia de ADN que se pueda transcribir o traducir en un producto, al menos uno de los cuales tiene una actividad o función in vivo. Tal gen normalmente tendrá al menos un promotor de transcripción y un terminador asociado operativamente con él.
65 El producto capaz del control positivo de la transcripción puede actuar de cualquier manera adecuada. En particular, el producto se puede unir a un potenciador localizado en las proximidades del promotor o promotores, sirviendo de esta manera para mejorar la unión de la polimerasa al promotor, por ejemplo. Se pueden emplear otros mecanismos, tales como contra un represor de los mecanismos, tal como el bloqueo de un inhibidor de la
5 transcripción o la traducción. Los inhibidores de la transcripción se pueden bloquear, por ejemplo, utilizando ARN en horquilla o ribozimas para bloquear la traducción del ARNm que codifica el inhibidor, por ejemplo, o el producto se puede unir al inhibidor directamente, previniendo de esta manera la inhibición de la transcripción o la traducción.
Más preferentemente, el mecanismo es un mecanismo de retroalimentación positiva, en el que el producto, que puede ser el ARN o el producto de la traducción del mismo, actúa en el sitio del potenciador de la transcripción, normalmente uniéndose al sitio, y así aumentando la actividad promotora. El aumento de la actividad promotora sirve entonces para incrementar la transcripción del gen para el producto, que a su vez, además sirve para elevar la inhibición o mejorar la promoción, llevando de esta manera a un bucle de retroalimentación positiva.
15 El control del producto puede ser por cualquier medio adecuado, y puede efectuarse a cualquier nivel. Se prefiere que el control sea eficaz bien para bloquear la transcripción del gen de factor de control o para bloquear la traducción del producto ARN del mismo, o para prevenir o inhibir la acción de la traducción del producto del gen.
Por ejemplo, el producto del gen tTA (activador de transcripción que se reprime en presencia de tetraciclina) actúa en la secuencia del operador tetO (Baron y Bujard, 2000; Gossen y col., 1994; Gossen y Bujard, 1992). Corriente arriba de un promotor, en cualquier orientación, cuando el tetO se une al producto del gen tTA, es capaz de aumentar los niveles de transcripción a partir de un promotor que esté muy próximo al mismo. Si el gen tTA es parte del casete que comprende el operador tetO junto con el promotor, se produce entonces la retroalimentación positiva cuando se expresa el producto génico del tTA.
25 El control de este sistema se consigue fácilmente por exposición a la tetraciclina, la cual se une al producto génico e impide la transactivación del tetO.
El sistema tTA también tiene la ventaja de proporcionar una toxicidad específica del estadio en varias especies. En particular, se observa el “silenciamiento” en las fases de desarrollo de muchos insectos, siendo la fase precisa de los insectos susceptibles dependiente de la especie. Algunos insectos pueden alcanzar el estadio de pupa antes de que muera la larva, mientras que otros mueren antes. La susceptibilidad varía del 100 % de mortalidad a una pequeña reducción de las tasas de supervivencia. Sin embargo, en general, los insectos adultos parecen ser inmunes al efecto de silenciamiento de tTA, por lo que es posible criar insectos que comprendan un sistema tTA de
35 retroalimentación positiva en presencia de tetraciclinas, y luego liberar los insectos adultos en el medio. Estos insectos no suponen o mínimamente, una desventaja para el tipo silvestre, y se cruzarán con los insectos de tipo silvestre, pero las larvas que portan el casete tTA de retroalimentación positiva morirán antes de alcanzar la madurez.
Es relativamente sencillo modificar la secuencia de tTA para mejorar la compatibilidad con la especie de insecto que se desee, y esto se ha demostrado en los Ejemplos adjuntos, con tTAV, el cual tiene dos aminoácidos adicionales que proporcionan un sitio para proteasas, pero que se codifica por una secuencia que se ha cambiado sustancialmente a partir de la del tTA con el fin de que se ajuste más estrechamente a su uso en Drosophila.
45 En consecuencia, en un aspecto preferido, la presente invención proporciona un sistema como el que se describe, en el que al menos un gen es tTA, o es un gen que codifica un producto similar al tTA eficaz para regular positivamente el promotor tetO.
Por tanto, la presente invención es útil en combinación con un gen letal dominante, que permita la expresión selectiva del gen letal dominante, o la expresión en un estadio específico, como se desee, del gen letal o del fenotipo letal. Se apreciará que el gen letal dominante no necesita de una parte integral del mecanismo de retroalimentación positiva, sino que puede ser parte de un casete bicistrónico, por ejemplo. Particularmente se prefiere el uso de la presente invención en asociación con RIDL (Liberación de Insectos que son portadores de un Dominante Letal).
55 El control del mecanismo de retroalimentación positiva, en el caso de tTA o un análogo del mismo, se efectúa simplemente por la presencia o ausencia de tetraciclina, o por modulación de la concentración de tetraciclina, cuando se utiliza el producto del gen tTA. En el caso de otro sistema de retroalimentación positiva, el GAL4, se puede controlar por ejemplo, por temperatura, suprimiendo de esta manera el gen eficaz, preferentemente un gen letal dominante, hasta que se libere el insecto.
Se pueden emplear también otros mecanismos, tales como ribozimas o antisentido o moléculas ARN parcialmente autocomplementarias, tales como ARN en horquilla, para inhibir o evitar la expresión de un péptido activador, o agentes bloqueantes que impidan la unión del activador al sitio potenciador.
65 Tales agentes bloqueantes pueden expresarse en el mismo insecto bajo condiciones selectivas, o se pueden administrar, por ejemplo, como parte del medio de cultivo.
Cuando el agente bloqueante o controlador se produce en el insecto, se prefiere entonces que su expresión sea selectiva, tal como que sea específica del sexo. La administración del agente bloqueante en el medio de cultivo, por ejemplo, hará posible la supresión del casete de retroalimentación positiva bajo cualquier circunstancia, hasta la liberación del insecto, tras la cual se producirá la selección específica sea por el sexo o el estadio, preferentemente
5 en una generación posterior, preferentemente, de manera particular, en la siguiente generación.
Más preferentemente, el casete que comprende el mecanismo de retroalimentación positiva se asocia con la especificidad por el sexo o el estadio. Por ejemplo, se ha observado corte y empalme específico del sexo en los mecanismos de transformación y de sexo doble vistos en la mayoría de insectos, y se puede emplear para limitar la expresión del sistema de retroalimentación en un sexo en particular, empleando el corte y empalme específico de sexo por ejemplo, para eliminar todo o parte del gen efector, o para incorporar un desplazamiento de la fase de lectura o un codón de terminación, o para modular la estabilidad de ARN o la eficacia traduccional de ARNm, o cualquier otra cosa que afecte la expresión para la diferenciación entre sexos. Se prefiere particularmente dirigirlo contra las hembras de las especies dañinas.
15 Aunque es posible proporcionar el gen efector en un lugar diferente e incluso en un cromosoma separado, generalmente es preferible unir el gen efector con el gen de retroalimentación. Esto se puede conseguir bien situando los dos genes en tándem, incluyendo la posibilidad de proporcionar los dos como un producto de fusión, o por ejemplo proporcionando cada gen con su propio promotor en orientaciones opuestas pero en yuxtaposición con el sitio potenciador.
Un gen efector es el gen del que se desea potenciar la expresión. Cuando el producto de retroalimentación positiva también es eficazmente letal para un estadio específico, tal como el tTA en muchas especies, entonces el gen efector y el gen de retroalimentación puede ser uno y el mismo, y esto es una realización preferida.
25 El gen efector será a menudo un gen letal, y se prevé que el sistema de la presente invención se empleará más frecuentemente en el control de las poblaciones de insectos dañinos, particularmente en combinación con la técnica RIDL o un procedimiento relacionado, como se describe posteriormente.
Se prefiere incluir un marcador con los sistemas de la invención, tales como DsRed, proteínas fluorescentes verdes, y variantes de los mismos, ya que las tasas de éxito en insectos son extremadamente bajas, es útil ser capaces de poderlos seleccionar de alguna manera.
El promotor puede ser un gran promotor complejo, pero estos tienen a menudo la desventaja de que se utilizan muy
35 poco o esporádicamente cuando se utilizan en huéspedes no insectos. En consecuencia, se prefiere emplear promotores mínimos, tales como Hsp70, que aunque tiene naturalmente relativamente un bajo nivel de actividad, puede potenciarse sustancialmente en un escenario de retroalimentación positiva, tal como el que usan tTA y tetO.
Un promotor es una secuencia de ADN, generalmente directamente corriente arriba de la secuencia codificante, que se necesita para la transcripción básica y/o regulada de un gen. En particular, un promotor tiene la información suficiente para permitir el inicio de la transcripción, que tiene generalmente un sitio de inicio del comienzo de la transcripción y un sitio de unión para el complejo de la polimerasa. Un promotor mínimo generalmente tendrá suficiente secuencia adicional para permitir que esos dos sean eficaces. Normalmente se suprime cualquier otra secuencia de información, tal como la que determina la especificidad tisular, por ejemplo, y el que se prefieran los
45 promotores mínimos es, normalmente, porque como resultado de esta deficiencia, son sustancialmente inactivos en ausencia de un potenciador activo. Por tanto, un cistrón, o sistema, los dos términos son preferentemente intercambiables en general en el presente documento, de la invención generalmente estará inactivo cuando el o cada promotor es un promotor mínimo, hasta que un potenciador adecuado u otro elemento regulador se activa o deja de estar reprimido, normalmente el producto génico.
Por tanto, se apreciará que los promotores mínimos se pueden obtener directamente de fuentes conocidas de promotores, o derivados de los promotores más grandes que se producen naturalmente, o que por otra parte ya se conocen. Los promotores mínimos adecuados incluyen un promotor mínimo derivado de hsp70, un promotor mínimo P (ejemplificado posteriormente como WTP-tTA), un promotor mínimo CMV (ejemplificado posteriormente como
55 JY2004-Tta), un promotor mínimo basado en Act5C, un fragmento del promotor BmA3, y un promotor core Adh (Bieschke, E., Wheeler, J., y Tower, J. (1998). Doxycycline-induced transgene expression during Drosophila development and aging. Mol Gen Genet 258, 571-579). Por ejemplo, el Act5C responde al tTA en Aedes transgénicos y la presente invención.
No todos los promotores mínimos funcionarán necesariamente en todas las especies de insectos, pero es fácilmente evidente para los expertos en la técnica cómo hacer para asegurar que el promotor se active. Por ejemplo, un plásmido u otro vector, que comprenda un cistrón de la invención con el promotor mínimo a ensayarse además comprende un marcador, un gen que codifica una proteína fluorescente, bajo el control de un promotor que se sepa que funciona en esas especies, el procedimiento además comprende el ensayo de la expresión del marcador en 65 individuos transgénicos relacionados, y el ensayo de la expresión del gen bajo el control del promotor mínimo en los individuos que expresan el marcador, ensayando el ARN transcrito. La presencia del ARN por encima de los valores
antecedentes bajo condiciones inducidas o no reprimidas es indicativo de que el promotor mínimo está activo en las especies que se investigan; la ausencia o presencia de solo bajos niveles de tal ARN en condiciones no inducidas o reprimidas es indicativo de que el promotor mínimo tiene una actividad intrínseca basal baja.
5 Nosotros hemos utilizados los siguientes promotores marcadores, a modo de ejemplo solamente, pero muchos otros son útiles y aparentes para los expertos en la técnica:
mini-blanco (promotor blanco): WPT-tTA, JY2004-tTA
Promotor Act5C: LA513 y LA517
10 Promotor ubi-p63E: LA656 y LA1038 Promotor BmA3: LA710 Potenciador hr y promotor ie1: LA920, LA1124 y LA1188 y todos estos son útiles como o en la preparación de promotores mínimos.
15 Se apreciará que un cistrón o sistema de la invención puede comprender dos o más cistrones. Un sistema puede comprender además elementos no unidos, tal como cuando un segundo gen que va a expresarse está lejos del cistrón de retroalimentación positiva.
Por lo tanto, en un aspecto preferido, la presente invención proporciona construcciones de retroalimentación positiva
20 de la forma general que se muestra en la Figura 1. En este escenario, la proteína activadora de la transcripción que reprime la tetraciclina (tTA), cuando se expresa, se une a la secuencia del operador tetO y da lugar a la expresión de un promotor mínimo cercano. En la configuración mostrada, este da lugar entonces a la expresión de tTA, que se une entonces al tetO, y así sucesivamente, creando un sistema de retroalimentación positiva. Este sistema se inhibe por la tetraciclina, que se une a la tTA y evita que se una a etO.
25 La expresión es controlable, y puede conseguirse uniendo operativamente el promotor a un factor de transcripción controlable. Como se ilustró anteriormente, puede ser tTA (que se reprime o se induce por tetraciclina), o cualquier otro sistema de factor controlable, tal como GAL4 (que es ligeramente sensible al frío, y que puede además controlarse por el uso de GAL80 o mutantes del mismo), o por ejemplo, el sistema de expresión regulado por
30 estreptogramina. Se apreciará que los otros sitios de unión apropiados del factor de transcripción dependerán del factor de transcripción de que se trate, tales como, por ejemplo UASGAL4 (secuencia de activación corriente arriba) para GAL4.
Los sistemas preferidos de la presente invención tienen altos niveles de expresión inducida, preferentemente
35 disponible a varios niveles de inducción, con un bajo nivel basal de expresión del gen regulado, pero también de cualquier otro componente, y preferentemente a través de un intervalo de especies. Los niveles basales preferentemente son bajos o esencialmente no existen cuando la expresión es fuertemente perjudicial, aunque los niveles aceptables dependerán del efecto del producto. Los niveles máximos generalmente no serán un problema, ya que la condición de retroalimentación positiva a menudo producirá niveles de expresión mortales e, incluso
40 cuando la expresión del producto no es mortal, o asociado con consecuencias fatales, es posible que se expresen en mayores concentraciones que la mayoría de los productos génicos.
Cuando se desea un nivel basal de expresión, se puede emplear una secuencia que no necesite la presencia de un potenciador, aunque generalmente habrá retroalimentación. Como al menos hay un nivel de corte de la
45 retroalimentación, por debajo del cual la retroalimentación no funciona, se apreciará entonces que se prefiere mantener un mínimo de expresión retroalimentada del gen.
Las diferentes construcciones de la presente invención (descritas en los Ejemplos adjuntos) tienen varias actividades, según los componentes de las construcciones. Por ejemplo, en Drosophila: WPT-tTA da lugar a un nivel
50 bajo de expresión inducida (no reprimida). JY2004-tTA da lugar a una fuerte expresión cuando no se reprime, aproximadamente equivalente al Act5C-tTA LA513 es letal cuando no se reprime.
Los primeros dos parecen que dan una expresión constitutiva, a juzgar por el uso de un gen indicador (tRE-EGFP),
55 esto es difícil de evaluar para el LA513 letal, aunque a 10 μg/ml tet, es justo suficiente para una buena supervivencia, el LA513 en Drosophila conduce a la expresión de un gen indicador tetO7-EGFP tanto en la línea germinal masculina y femenina en adultos, así como en células somáticas. Esto lo distingue de Act5C, que se utiliza comúnmente como un promotor “ubicuo, constitutivo”, que, de hecho, no se expresa bien en estas células.
60 Las propiedades de estas construcciones se muestran en la Tabla 1, a continuación.
Tabla 1
- Expresión Máx.
- Promotor Intrón ¿Región 3’UTR y poliA
- mínimo
- codificante
- optimizada?
- WPT-tTA
- Baja P PP1α96A No fs(1)K10
- JY2004-tTA LA513
- AltaMuy alta (letal) CMV Hsp70 β-globina Conejo Adh No Sí β-globina Conejo fs(1)K10
En consecuencia, se apreciará que el nivel de expresión inducida o no reprimida se puede modificar de manera útil y predecible ajustando la secuencia del sistema de retroalimentación positivo. La toxicidad y/o la actividad de la
5 proteína tTA se puede modificar independientemente de las señales de control de la transcripción o traducción por medio de varias estrategias, por ejemplo, utilizando una señal de localización nuclear, una modificación del dominio de activación, etc. (véase Fussenegger, 2001 para más ejemplos).
La letalidad de LA513 es útil, por las razones dadas anteriormente, y más particularmente porque:
10 a) Proporciona un sistema génico letal que se puede reprimir compacto y altamente eficaz; b) Como utiliza solamente elementos de control simples de Drosophila (promotor mínimo hsp70, un intrón pequeño y un terminador de fs (1) K10), tanto este, como su casete de expresión, funcionan a lo largo de un amplio intervalo filogenético;
15 c) Tiene un efecto perjudicial muy pequeño, si tiene alguno en adultos, incluso en ausencia de tetraciclina. Esta es una propiedad muy deseable y sorprendente en el campo de su uso, por ejemplo en un programa de control basado en RIDL, en el que los adultos liberados deben ser competitivos y tienen que tener una vida larga para la eficacia completa del programa. Se apreciará que el efecto del sistema de la invención podría ser modificado además incorporando un letal eficaz para adultos, por ejemplo en la configuración “expresión bidireccional
20 retroalimentación positiva” descrita en el presente documento; y d) Por su naturaleza, se minimiza la “comunicación” entre varios elementos. Esto es porque: (i) el core de la construcción solamente es un elemento compositivo, mejor que los dos sistemas de expresión bipartita: (ii) el potenciador principal del componente autorregulador, los sitios de unión tTA, está activo esencialmente solo en ausencia de tetraciclina y (iii) la expresión modesta de tTA bajo la influencia de un potenciador próximo, sea en
25 otra parte de la construcción o en el cromatina cercana, es poco probable que sea perjudicial de manera significativa.
JY2004-tTA también es útil en la presente invención.
30 Sin quedar ligados por ninguna teoría, el mecanismo por el cual el LA513 mata los embriones y las larvas recientes, pero no los adultos parece ser que es una propiedad inherente de su toxicidad. La toxicidad de tTA se cree que deriva de su “silenciamiento de la transcripción”, en el que el alto nivel de expresión del dominio activador de la transcripción (en el caso de tTA es el VP16 o un fragmento del mismo) se une a elementos de la maquinaria de la transcripción y los valora, conduciendo a un efecto general sobre la transcripción, aunque también puede actuar
35 saturando la ruta de degradación de la ubiquitina. El silenciamiento de la transcripción es el efecto que se cree que produce los efectos perjudiciales en las líneas celulares de mamíferos que expresan altos niveles de tTA; en el contexto de la expresión optimizada de retroalimentación positiva de LA513 conduce a la expresión de tTA a niveles letales. Sin embargo, los estados en desarrollo pueden ser más sensibles a la ruptura de la transcripción que los adultos: puesto que tienen que expresar los genes de una manera altamente coordinada para alcanzar un desarrollo
40 apropiado, mientras que los adultos pueden ser más tolerantes a la ruptura.
El desarrollo de los heterocigotos LA513 en el medio con un nivel intermedio de tet (3 o 10 μg/ml), siendo suficiente para sobrevivir, mostró un retraso significativo, en relación a sus hermanos del tipo silvestre. Experimentos paralelos utilizando altas concentraciones de tetraciclina, por ejemplo 100 μg/ml, no mostraron ningún retraso del desarrollo,
45 sugiriendo de esta manera que la expresión subletal de tTA puede afectar adversamente el desarrollo normal de los insectos.
Se prefiere que el sistema de retroalimentación positivo muestre una alta relación entre conexión: desconexión y que el cambio de conectado a desconectado sea sobre un intervalo de concentración más estrecho que en un sistema
50 convencional, permitiendo de esta manera la utilización de una amplia variedad de moléculas efectoras. Se pueden utilizar moléculas efectoras con toxicidad baja (baja actividad específica), que se puedan expresar a altos niveles bajo las condiciones activas sin llevar a problemas de toxicidad a niveles basales. A la inversa, las más tóxicas (con actividad específica alta) se pueden utilizar a niveles basales necesariamente bajos que no impidan altos niveles de expresión cuando se dejan de reprimir o se inducen. Como el nivel basal de expresión se determina solo
55 parcialmente por el nivel de tTA, en el caso de las moléculas de toxicidad baja supone una ventaja particularmente clara. La tTA es un ejemplo preferido de una molécula efectora con una baja actividad específica que se puede utilizar como letal en el contexto de retroalimentación positiva de LA513, por ejemplo. La ventaja del cambio de conectado a desconectado en un intervalo de concentración estrecho es que se puede utilizar una concentración modesta de represor sin riesgo de expresión residual (no totalmente reprimida) que conduzca a efectos adversos que potencialmente seleccionen por la resistencia. Por el contrario, para un sistema inducible, las concentraciones modestas del activador pueden dar una expresión completa.
5 Los controladores activados o no reprimidos son útiles para expresar moléculas efectoras. Ejemplos de moléculas efectoras incluyen ARN funcionales, ribozimas, etc., y una o más proteínas codificadas. Se apreciará que, son apropiados diferentes niveles de expresión, para diferentes aplicaciones. Como los factores de transcripción específicos de secuencia utilizados para controlar el sistema de retroalimentación positiva también se pueden utilizar
10 para expresar otros genes en un sistema de expresión bipartita, se puede conseguir haciendo dos construcciones separadas, una con el controlador (normalmente una construcción de un factor promotor de la transcripción, siendo aquí una construcción de retroalimentación positiva), el otro con el gen o la molécula de interés bajo el control de un promotor compuesto (sitio de unión + promotor mínimo) que responde al factor de transcripción (Bello y col., 1998; Brand y col., 1994). Esto también es apropiado para estos controladores de la retroalimentación positivos. De
15 manera alternativa, los dos elementos se pueden combinar en la misma construcción. Esta realización tiene ventajas significativas para la mayoría de las aplicaciones de campo, como que se reduce sustancialmente el riesgo de que los dos componentes se separen por recombinación. Además, el sistema completo de expresión se puede introducir en un solo acontecimiento de transformación, lo que significa que los insectos homocigotos para el sistema son homocigotos para un locus solamente mejor que dos, lo que hace más fácil construirlos por reproducción, y tiende a
20 reducir pérdida en la aptitud biológica debido a mutagénesis por inserción.
También es posible condensar tal sistema de expresión en una forma más compacta, tal como se ilustra en la Figura 2 adjunta.
25 Esto aprovecha la naturaleza bidireccional de los potenciadores, en este caso el sitio de unión tetO en presencia de tTA. Esta disposición además permite, o facilita, el uso de elementos aisladores para reducir el efecto de potenciadores o supresores de la cromatina adyacente: en esta disposición el casete de expresión completo puede estar flanqueado por aisladores. Esta disposición también elimina la necesidad de duplicar los sitios de unión del factor de transcripción en la construcción. Tal duplicación es preferible evitarla, porque puede llevar a inestabilidad
30 durante la recombinación homóloga. Por razones similares, generalmente se prefiere utilizar aisladores no idénticos, tales como scs y scs’, mejor que utilizar el mismo dos veces.
Es posible además condensar el sistema para proporcionar una transcripción única, sea bicistrónica o expresando un único polipéptido, el cual puede potencialmente procesarse además en más de una proteína, por ejemplo por el 35 uso de una técnica de fusión a ubiquitina (Varshavsky, 2000). Cada una de estas estrategias (expresión bidireccional, expresión bicistrónica, proteína de fusión con transactivador) tiende a reducir el tamaño de la construcción, lo que a su vez tiende a aumentar la frecuencia de transformación y reduce el que se convierta en una diana mutagénica. Tal condensación se puede conseguir por varias formas, como se muestra, en forma de diagrama, en la Figura 3 adjunta. Las extensiones apropiadas y las variaciones de las disposiciones mostradas en
40 forma de diagrama serán evidentes para los expertos en la técnica.
Como un ejemplo de la utilidad de tal sistema, se puede construir un marcador general de transformación utilizando un sistema transactivador que se sepa que funciona sobre un amplio intervalo filogenético, por ejemplo, el que se basa en tetR, GAL4, lexA o AcNPV ie-1. Tal transactivador, unido funcionalmente a una región codificante por una 45 proteína fluorescente por cualquiera de los procedimientos anteriores (expresión bidireccional, expresión bicistrónica, proteína de fusión con transactivador), proporcionaría un marcador genético expresado por un amplio intervalo de tejidos y estadios de desarrollo a lo largo de un intervalo filogenético amplio. Tal marcador debería ser útil no solo para detectar los transgénicos en transformación y otros experimentos de laboratorio, sino también para distinguir, por ejemplo, las moscas transgénicas de las moscas de tipo silvestre en el campo, o aquellas capturadas
50 en el campo.
Otro ejemplo es la expresión de una transposasa, integrada en los cromosomas, que sería una construcción “impulsadora”, por ejemplo la transposasa piggyBac integrada en un cromosoma de insecto utilizando mariner/mos1. Tales construcciones son útiles para removilizar elementos piggyBac. Un impulso aplicable ampliamente debería 55 expresarse a un nivel significativo a lo largo de un amplio intervalo filogenético. El sistema de expresión de la presente invención proporciona esto. Además, tal construcción (piggyBac transposasa bajo el control de un sistema de retroalimentación positivo de una de las estructuras mencionadas) debería ser útil también en la transformación de insectos por medio de expresión transitoria (co-expresión de un plásmido “auxiliar”, el procedimiento utilizado más ampliamente para transformación de insectos), y así mismo sería útil y funcional a lo largo de un amplio
60 intervalo filogenético.
Es ventajoso regular la acción de un sistema de expresión en el estadio, sexo u otros niveles, además de ser capaz de regular el nivel de expresión cambiando las condiciones ambientales. Ejemplos adecuados son los siguientes:
65 1. Expresión de una proteína represora.
Las proteínas represoras se conocen o pueden construirse para los principales sistemas de expresión, por ejemplo GAL80 o sus derivados mutantes por el sistema GAL4, el tetR fusionado a proteínas inhibidoras por el sistema tet,
5 etc. Otra alternativa es el silenciamiento génico del factor de transcripción utilizando un ARN en horquilla dirigido contra parte del casete de expresión. La expresión basal a partir del sistema de retroalimentación positiva es bastante bajo, de forma que se puede suprimir fácilmente por la expresión de tal inhibidor.
La expresión de un inhibidor adecuado bajo un control adecuado tenderá a inhibir la expresión a partir del casete de expresión de retroalimentación positiva donde se expresa el inhibidor. La expresión específica femenina, por ejemplo, puede alcanzarse de esta manera expresando un inhibidor en machos.
2. Integración de especificidad en el sistema de retroalimentación positiva.
15 La especificidad se puede integrar en el sistema de retroalimentación positiva utilizando componentes que son específicos por sí mismos. Por ejemplo, la señal de la combinación del promotor mínimo hsp70 + intrón SV40 y poliA de pUAST se sabe que no se expresa en la línea germinal femenina de Drosophila, mientras que la señal del promotor mínimo P + intrón P + fs (1) K10 poliA de pUASp se expresa (Rorth, 1998). Los sistemas de retroalimentación positiva pueden, de este modo, construirse para que específicamente se expresen o no en este tejido, dependiendo del uso de los elementos reguladores apropiados.
En otra realización, se puede integrar una especificidad de sexo en el sistema por el uso de un corte y empalme específico de sexo. El corte y empalme específico de sexo de doble sexo y sus homólogos es un mecanismo regulador conservativo y, por tanto, disponible para su uso de esta forma en un amplio intervalo filogenético. El corte
25 y empalme específico de sexo de transformación y sus homólogos es otra alternativa. El uso de corte y empalme específico de sexo en un sistema de expresión de retroalimentación positivo se puede conseguir de varias formas, como se muestra, en forma de diagrama en la Figura 4 adjunta. Las extensiones apropiadas y las variaciones de las disposiciones mostradas en forma de diagrama serán evidentes para los expertos en la técnica.
En otra configuración, un sitio de corte y empalme específico se puede insertar en una región que codifica el transactivador de forma que dos o más proteínas alternativas se producen en distintas condiciones, por ejemplo, en diferentes tipos celulares o en sexos diferentes. Esto se puede ordenar de forma que se produzca un activador de transcripción en un tipo celular pero en otro tipo celular lo que se produce es un represor de transcripción. Esta disposición tiene la ventaja de que es relativamente robusta frente a la producción debido a un corte y empalme
35 ineficaz (imperfecto) de una proporción relativamente baja de activador de la transcripción en el tipo celular apropiado, por ejemplo, en células masculinas, será menos probable que produzca una amplificación de retroalimentación positiva ya que estas células están produciendo también una gran cantidad de represor. La discriminación en el resultado (relación entre los niveles de activador de transcripción en los dos tipos celulares, o la relación de la expresión de un indicador u otro ARN o proteína ligado funcionalmente a la expresión del activador de la transcripción) entre los dos tipos celulares se mejora de esta manera.
Será fácilmente evidente para los expertos en la técnica que cualquiera de estas disposiciones del transactivador específico puede combinarse fácilmente con cualquiera de las disposiciones desveladas en el presente documento para la expresión de una proteína adicional o ARN, por ejemplo, expresión bidireccional, expresión bi o
45 multicistrónica, expresión de una proteína de fusión, o combinado con uno o más casetes de expresión separados dependiendo de, o parcialmente dependiendo de, la expresión del transactivador, sea combinado en la misma construcción o en cualquier sitio del genoma o la célula.
3. Utilización de una molécula efectora específica
La especificidad en la consecuencia fenotípica también se puede introducir por el uso de una molécula efectora específica. Cuando una molécula, por ejemplo ARN o una proteína, que se expresa bajo el control de cualquiera de los sistemas de expresión descritos en el presente documento tiene un efecto específico solo en células particulares, tejidos, o sexo, etc., entonces, se puede obtener la especificidad fenotípica con una expresión específica más o
55 menos amplia del transactivador. Por ejemplo, en el contexto de un programa de control de la población con liberación masiva de insectos tipo RIDL, utilizando el sistema de expresión de una molécula solamente tóxica o preferentemente tóxica, para los estadios previos a adultos, da como resultado adultos que son completamente, o razonablemente competitivos en relación al tipo silvestre. Esto es deseable, ya que la efectividad del programa depende de la competitividad y la longevidad de las formas adultas, cuando se liberan en el medio. Como la concentración de su represor interno (por ejemplo, la tetraciclina) es probable que disminuya en el medio libre, sería ventajoso asegurar que la inducción (sin represión) del sistema de expresión, como y cuando ocurre en adultos, tenga un efecto negativo mínimo sobre ellos.
Como otro ejemplo, la separación de sexos, o los efectos específicos del sexo, se pueden conseguir por la expresión
65 en machos y hembras de una molécula con efectos diferentes en machos y en hembras. Por ejemplo, la expresión de la proteína Transformadora en machos de Drosophila tenderá a transformarles en hembras, pero no tendrá efecto
en hembras. Similarmente, la expresión de la proteína específica de machos letal-2 (Msl-2) en Drosophila tenderá a matar hembras, pero no machos (Gebauer y col., 1998; Kelley y col., 1995; Matsuo y col., 1997; Thomas y col., 2000). A la inversa, la expresión de una molécula de ARN parcialmente autocomplementaria con homología sustancial en su región autocomplementaria, o región formadora de doble cadena (“contra ARN en horquilla”) para la 5 transformación tenderá a transformar las hembras genéticas en machos fenotípicos, mientras que los machos genéticos no se afectan, y la expresión de ARN en horquilla contra msl-2 tenderá a ser letal para los machos pero no para las hembras. La expresión de ARN en horquilla contra los exones específicos de machos o hembras de doble sexo tenderán a afectar esos sexos solamente, y la expresión simultanea de ARN que codifique la otra forma de doble sexo (es decir, DsxM en hembras o DsxF en machos) tenderá a modificar o potenciar este efecto. Esta expresión simultanea de una proteína y una molécula de ARN en horquilla se puede conseguir fácilmente combinando la estrategia bicistrónica o de proteína de fusión descrita anteriormente con la expresión de un ARN en horquilla utilizando un sistema de expresión bidireccional como se ha descrito anteriormente. Se puede añadir además especificidad de sexo, estadio u otra a tal sistema por la incorporación del corte y empalme específico apropiado u otras señales de control de la transcripción, traducción u otras post-traduccionales en cualquier parte del
15 sistema como será evidente para la persona experta en la técnica.
Las moléculas de ARN en horquilla multifuncionales se pueden construir y están previstas. Por ejemplo, el ARNi contra la transformación de la mosca mediterránea de la fruta Ceratitis capitata Wiedmann (mosca mediterránea de la fruta) tenderá a transformar la hembras genéticas en machos fértiles. Para un programa de control de la población en un área amplia que se base en la liberación masiva de tales insectos, es preferible esterilizar las moscas liberadas. Esto se puede conseguir utilizando una molécula ARN compuesta que rompa simultáneamente la expresión de ambas trasformaciones y un gen necesario para la espermatogénesis o la viabilidad embrionaria o larvaria. Muchos de tales genes se conocen en Drosophila con homólogos en mosquitos u otros animales. Con la mosca mediterránea de la fruta, se puede fácilmente aislar un homólogo adecuado, utilizando técnicas conocidas 25 por los expertos en la técnica. Nosotros preferimos utilizar un gen que permita la producción de fluido seminal, y preferentemente también esperma, para reducir la tendencia de la hembra a aparearse de nuevo después de la inseminación por el macho afectado. Particularmente preferimos dirigir esta segunda parte de la molécula de ARNi en horquilla contra el efecto letal paterno, de forma que no se produzca una descendencia viable, o contra el gen expresado zigóticamente que se necesita para la viabilidad embrionaria o larvaria o el desarrollo, de forma que la descendencia heredera de la construcción estará afectada. Se han concebido otras construcciones y serán fácilmente evidentes para los expertos en la técnica: por ejemplo la expresión de una proteína letal específica de hembras por la expresión bicistrónica y un ARN en horquilla que da lugar a un efecto letal paterno por expresión bidireccional. En común con el ARN en horquilla compuesto contra un gen adecuado de determinación del sexo y un efecto letal paterno, se permite la generación de una población de insectos de un solo sexo (solo machos), cuya 35 descendencia entera morirá por la acción de la acción del efecto letal paterno, independientemente de si su progenie
o parejas se alimentan con tetraciclina. Por tanto, la presente invención proporciona un promotor controlado, como se ha definido, en el que el promotor está unido operativamente con el ADN que codifica un ARNi que produce mortalidad o esterilidad. En este caso, la mortalidad puede corresponder a baja salud, tal como falta de vuelo, más que a una letalidad instantánea, produciendo que la probabilidad de emparejamiento se reduzca sustancialmente.
4. Utilización de recombinasa(s) específica(s) del sitio
La especificidad se puede introducir también en un sistema de retroalimentación positiva insertando un fragmento “tapón” que lo inactive. Si este fragmento “tapón” está flanqueado por los sitios diana para una recombinasa
45 específica del sitio adecuada, entonces tenderá a escindirse en presencia de la recombinasa activa. Cualquier sistema para la expresión selectiva de una recombinasa activa, por ejemplo, la expresión de la recombinasa bajo el control de un promotor específico de hembras, tenderá por tanto a producir la expresión selectiva del sistema de retroalimentación positiva, en este caso solamente en hembras. Si la recombinasa solamente se expresa en células somáticas, por ejemplo utilizando el procedimiento descrito anteriormente, entonces la versión transmitida a la siguiente generación incluye el fragmento tapón, el cual puede estar de nuevo en las hijas pero no en los hijos. A la inversa, si la recombinasa se expresa solamente en el genoma, la provisión de recombinasa activa conducirá a una prole en la que el sistema de expresión está activo, a partir de los padres en los que está inactivo. Esto se puede utilizar, por ejemplo para generar gametos que contienen un sistema génico letal dominante o estéril (por ejemplo, específico de hembras o no específico del sexo) para su uso en una estrategia de control de población de insectos.
55 En una realización preferida, el fragmento tapón codifica la recombinasa. Esta realización es particularmente compacta. En otra realización preferida, el fragmento tapón codifica un represor de la transcripción que tiende a inactivar el sistema de expresión de retroalimentación positiva- esta realización tiende a reducir la expresión basal del sistema en presencia del fragmento tapón.
A la inversa, el sistema se puede inactivar específicamente en ciertas células o clones de células, introduciendo sitios diana para una recombinasa específica del sitio adecuada en posiciones adecuadas, y luego expresando o introduciendo la recombinasa activa adecuada en las células apropiadas, tal que uno o más elementos funcionales clave del sistema de expresión se eliminan o rompen por recombinación entre los sitios diana de la recombinasa.
65 Los sistemas de recombinasa adecuados incluyen cre/lox y Flp/FRT.
La presente invención se ilustra por los siguientes Ejemplos, no limitantes. En los siguientes ejemplos, las Figuras son las siguientes:
La Figura 1 muestra un escenario de activador de la transcripción que se reprime por tetraciclina;
5 La Figura 2 muestra un sistema de la invención que utiliza un potenciador bidireccional;
La Figura 3 muestra un sistema específico de sexo;
La Figura 4 muestra otro sistema específico de sexo;
La Figura 5 es un di agrama de la región tetO7-tTA del pJY2004:
La Figura 6 es un diagrama esquemático de pLA513:
La Figura 7 es un diagrama esquemático del transposón del LA513;
La Figura 8 es un diagrama esquemático del pLA517;
La Figura 9 ilustra la acción bidireccional de tetO7 en mosquitos 513A y 513B;
La Figura 10 es un diagrama esquemático de pLA656;
La Figura 11 es un diagrama esquemático de pLA928;
15 La Figura 12 es un diagrama esquemático de pLA1124; La Figura 13 es un diagrama esquemático de pLA670; La Figura 14 es un diagrama esquemático de pLA1038; La Figura 15 es un diagrama esquemático de pLA710; La Figura 16 ilustra el corte empalme específico de sexo de Cctra en la mosca mediterránea de la fruta; La Figura 17 es un diagrama esquemático de pLA1188; y La Figura 18 ilustra el corte empalme específico de sexo en la mosca mediterránea de la fruta.
25 Se hicieron una serie de construcciones con tTA en una configuración de retroalimentación positiva, es decir con la expresión de tTA regulada por la unión de tTA a tetO. Se obtuvieron los insectos transgénicos que portaban estas construcciones y se analizaron sus propiedades.
En algunos casos, la intención era obtener niveles muy altos de expresión de tTA en ausencia de tetraciclina. En varias construcciones ejemplificadas descritas posteriormente en el presente documento, la expresión de tTA era tan alta como para ser letal. Como parte del proceso de obtención una fuerte expresión de tTA, parte de la fase de lectura abierta de tTA se rediseñó para expresar una proteína similar, pero con el uso de un codón cercano a la
35 norma para Drosophila melanogaster, y deficiente en algunos sitios crípticos potenciales de corte y empalme presentes en la secuencia de nucleótidos original. Esta variante de la secuencia de tTA se llamó tTAV (SEC ID Nº 3, secuencia proteica SEC ID Nº 32).
EJEMPLO 1
WTP-tTA y JY2004-tTA en Drosophila melanogaster
La región codificante de tTA (SEC. ID Nº 29, secuencia proteica SEC ID Nº 30) de pUHD15-1 (SEC ID Nº 33, Gossen y col., 1994, Gossen y Bujard, 1992) se situó bajo el control de tetO, en una configuración de
45 retroalimentación positiva, insertándola en pWPT2 (Bello y col., 1998) o pJY2004, una versión de pJY2000 que carece de aisladores (Stebbins y Yin, 2001). Estas construcciones se llamaron pWTP-tTA y pJY2004-tTA, respectivamente. Se proporciona un diagrama de la región tetO7-tTA de pJY2004 en la Figura 5 adjunta, y es la SEC ID Nº 14.
En pWTP-tTA los sitios de unión del tetO7 están seguidos por un promotor mínimo del elemento P, una secuencia directora de Drosophila hsp70, un intrón corto del gen PP1α96A de Drosophila, la región codificante de tTA y un terminador de Drosophila hsp70. En pJY2004-tTA, el promotor mínimo y las secuencias directoras son de CMV, seguido por la región codificante de tTA y un terminador de la transcripción de la β-globina de conejo, como se muestra en la Figura 5.
55 Las Drosophilas melanogaster transgénicas que portaban cualquiera de estas construcciones eran totalmente viables, incluso sin tetraciclina en la dieta. Se examinaron los insectos doblemente heterocigotos por WTP-EGFP y cualquiera de estas construcciones viendo su fluorescencia verde característica de la expresión de EGFP. Los insectos con WTP-tTA y WTP-EGFP mostraron una fluorescencia muy débil solamente ligeramente por encima de la autofluorescencia anterior. Por el contrario, los insectos con JY2004-tTA y WTP-EGFP mostraron una fuerte fluorescencia, similar a la vista en los insectos que portaban EGFP bajo control del promotor Actin5C, el cual se utiliza ampliamente como un promotor fuerte, constitutivo en Drosophila (por ejemplo, Reichhart y Ferrandon, 1998). La expresión de EGFP se reprimió hasta niveles indetectables cuando los insectos se criaron con una dieta suplementada con 100 μg/ml de tetraciclina. En el control de los insectos heterocigotos tanto WTP-EGFP, JY2004
65 tTA o WTP-tTA no mostraron fluorescencia por encima del antecedente tanto si se criaron con una dieta que contuviera tetraciclina, como si no.
Nosotros situamos la tTA bajo el control del promotor Actin5C, en el plásmido pP [Casper-Act5C-tTA]. Las moscas transgénicas que portaban esta construcción y WTP-EGFP, criadas con una dieta que carecía de tetraciclina, mostraron fluorescencia verde de intensidad comparable a la observada en moscas equivalentes con JY2004-tTA y WTP-EGFP.
5 Estos resultados muestran que las construcciones de retroalimentación positiva pueden utilizarse para dar una expresión reprimida por la tetraciclina fuerte (JY2004-tTA) o débil (WTP-tTA), a partir de una construcción adecuada (aquí WTP-EGFP).
10 El EGFP se utiliza ampliamente como un indicador neutro. Nosotros además ensayamos el cruzamiento de las moscas JY2004-tTA con moscas con construcciones capaces de expresar proteínas conocidas o predichas de ser perjudiciales. Insertamos el dominio central de Nipp1Dm (Bennett y col., 2003; Parker y col., 2002) (“nipper”), en el pJY2004, para crear el pJY2004-nipper, y se transformaron Drosophila con esta construcción. También utilizamos moscas que portaban tetO-hid (Heinrich y Scott, 2000). En cada caso, el cruzamiento con moscas JY2004-tTA
15 producía mortalidad reprimida por la tetraciclina. Los datos de los dos cruzamientos del ejemplo se presentan en la Tabla 2, siguiente.
Tabla 2
- Uso de construcciones de retroalimentación positiva para dirigir la expresión de genes letales en Drosophila
- Macho JY2004-tTA/CyO x Hembra tetO-hid/tetO-hid
- [tetraciclina] (μg/ml)
- JY2004-tTA
- CyO
- 0
- 15
- 0
- 9
- 10 100
- Macho JY2004-tTA/CyO x Hembra JY2004-nipper/JY2004-nipper
- JY2004-tTA
- CyO
- 0
- 20
- 0
- 16
- 13 100
EJEMPLO 2
Preparamos una construcción pLA513 (SEC ID Nº 16, diagrama esquemático mostrado en la Figura 6), que contenía un transposón piggyBac no autónomo. Generamos Drosophila melanogaster transgénica que portaba esta
25 construcción por coinyección de un plásmido auxiliar en una cepa con ojos blancos (Handler, 2002; Handler y James, 2000). Los transgénicos potenciales se seleccionaron por la fluorescencia característica de DsRed2. Se recuperaron 5 líneas transgénicas, que se designaron como O53, M8, M13, F23 y F24. Un diagrama esquemático del transposón LA513 se muestra en la Figura 7 adjunta.
30 Las estirpes de Drosophila melanogaster se mantuvieron a 25 ºC en un medio con levadura/ azúcar/ maíz/ tetraciclina (tetraciclina (Sigma) a una concentración final de 100 μg/ml), a menos que se establezca otra cosa. Todos los experimentos se llevaron a cabo a 25 ºC.
35 Se cruzaron los heterocigotos transgénicos con el tipo silvestre al menos por triplicado en el medio con y sin Tc (tetraciclina). En ausencia de letalidad alguna, se debería esperar que aproximadamente la mitad de la descendencia de tal cruzamiento sería transgénica. La descendencia se valoró como adultos jóvenes por el marcador de fluorescencia DsRed [Matz y col., 1999] utilizando un microscopio Olympus SZX12 con capacidad de
40 fluorescencia, y se calculó la relación de fluorescentes (transgénicos) con respecto al total de moscas. Los resultados se muestran en la Tabla 3, a continuación. En estos experimentos, todas las 5 líneas transgénicas mostraron un 100 % de mortalidad, en ausencia de tetraciclina y una buena supervivencia (es decir una relación fluorescentes: no fluorescentes de ∼1:1), en presencia de 100 μg/ml de tetraciclina. La inspección de los viales mostraba poca o no mucha fluorescencia en ausencia de Tc, aunque estaban presentes muchas larvas con una
45 fluorescencia muy pequeña, al tiempo que eran visibles larvas no fluorescentes (tipo silvestre para LA513) de todos los tamaños. Esto sugiere que, en ausencia de tetraciclina, el LA513 produce mortalidad a un estadio temprano (embrionario y/o larvario reciente) del estadio de desarrollo.
Tabla 3
- Las inserciones LA53 son letales dominantes que se reprimen por la tetraciclina
- Línea LA513
- 0 g/ml Tetraciclina 100 g/ml Tetraciclina
- Nº de moscas Nº de fluorescentes
- Nº de moscas Nº de fluorescentes
- Relación
- 0513M8M13F23F24Total
- 490 0 74 0 657 0 473 0 61 0 1755 0 1963 937 66 25 1838 892 1914 845 114 60 5895 2759 0,48 0,38 0,49 0,44 0,53 0,47
La letalidad dominante podría tener varias causas. Sin estar restringidos por teoría alguna, parece probable que, en ausencia de tetraciclina, se acumula tTAV a una concentración relativamente alta y que es letal, posiblemente 5 debido al silenciamiento de la transcripción, o la interferencia con la degradación proteica. Una alternativa es que, en ausencia de tetraciclina, la tTAV se une a tetO y actúa como un potenciador a largo plazo, perturbando la expresión de genes cercanos a la inserción del LA513. Esto parece improbable, porque todas las 5 líneas dieron resultados similares. Cada una de estas líneas derivaba de un superviviente diferente G0 a la inyección, y por tanto estas líneas están probablemente portando el LA513 integrado en diferentes sitios genómicos. Verificamos esto por PCR inversa.
10 La tabla 4, a continuación, muestra los sitios de integración para 3 de las líneas; en cada caso la inserción LA513 estaba en la secuencia TTAA, como se esperaba por la preferencia de inserción en el sitio del transposón piggyBac. Como se esperaba, las tres inserciones estaban además en 3 sitios diferentes en el genoma de la Drosophila.
Tabla 4
- Sitios de inserción de LA513 en el genoma de Drosophila
- Línea
- Secuencia amplificada o al sitio de integración Brazo del cromosoma predicho Citología de Drosophila predicha Gen más próximo predicho
- O513
- CacagcgcatgatgagcacaTTAAcaaaatgtagtaaaatagga (SEC ID Nº 1) 2L 25F4-25F5 CG9171
- M8
- GtttcgataaatattgctatTTAAaatgcttattttcaatgcta (SEC ID Nº 2) 2L 36F6-36F6 CG15160
- F24
- TttgttttctaacgttaaagTTAAagagagtccagccacatttt (SEC ID Nº 3) 2L 21C4-21C5 CG13691
15 Se muestra la secuencia que está flanqueando el sitio de inserción, TTAA, en mayúsculas. Las localizaciones cromosómicas predichas, y el gen más próximo predicho, se muestran también; estos están basados en la secuencia de Drosophila publicada.
EJEMPLO 3
El efecto tóxico del nivel de expresión alto de tTAV se cree que es debido al silenciamiento de la transcripción y/o a la interferencia con la proteólisis dependiente de ubiquitina, por medio de la sección derivada de VP-16 (Gossen y
25 Bujard, 1992; Salghetti y col., 2001). Por lo tanto, nosotros hemos modificado el tTAV eliminando la sección VP16 y sustituyéndola con una secuencia sintética que codifica 3 copias de un péptido (PADALDDFDLDML) derivado del VP16 (Baron y Bujard, 2000; Baron y col., 1997). Este derivado se llamó tTAF; el plásmido resultante se llamó pLA517, y es la SEC ID Nº 17, y se muestra, en forma de diagrama, en la Figura 8 adjunta.
30 Se transformó la Drosophila melanogaster con esta construcción, y se obtuvo una línea transgénica. Los machos LA513 heterocigotos se cruzaron con hembras del tipo silvestre (para LA513) y se valoró la fluorescencia de la descendencia (como adultos). Si toda la descendencia tenía la misma probabilidad de sobrevivir, la proporción esperada de la descendencia total fluorescente era del 50 %. En ausencia de tetraciclina, esta proporción fue del 32 %, solamente una reducción modesta comparada con el 48 % cuando los parentales y la descendencia se
35 mantuvieron con una dieta se suplementó con 100 μg/ml. Los resultados se muestran en la Tabla 5, a continuación. Ensayamos si la suplementación de tetraciclina en la dieta de los parentales pero no de la descendencia podría reducir esta mortalidad. En este caso, observamos una proporción intermedia de 0,37, indicando que la tetraciclina
contribuida maternalmente tenía un efecto beneficioso modesto.
Efecto de la tetraciclina en la supervivencia de LA517/+ Drosophila y sus hermanos +/+
LA517 Parental [Tc] μg/ml
0 165 78 100
100 524 482 100
0 502 297
Como el LA517, solo, tiene poco impacto sobre la viabilidad, a diferencia de la construcción LA513 estrechamente
5 relacionada, ensayamos si era capaz de controlar la expresión de un gen heterólogo bajo el control de tetO. Para esto utilizamos tetO-hid (Heinrich y Scott, 2000). Las moscas homocigotas por tetO-hid se cruzaron con las moscas heterocigotas por LA517. En ausencia de tetraciclina solamente el 3,4 % de los descendientes adultos llevaban el LA517. En presencia de 100 μg/ml de tetraciclina, la proporción era del 42 %. Por lo tanto el LA517 es capaz de dirigir la expresión eficaz de un gen heterólogo.
Tabla 6
- Efecto de la tetraciclina en la supervivencia de LA517/+, +/tetO-hid de Drosophila y sus hermanos +/+, +/tetO-hid
- TetO-Hid x LA517/+
- [Tc]
- No fluorescentes Fluorescentes
- 0 100
- 636 23 174 127
EJEMPLO 4
Utilización de análogos de la tetraciclina
15 Se utilizó la línea F23 para determinar si análogos químicos de la tetraciclina podían utilizarse en lugar de la tetraciclina para suprimir la letalidad de LA513. Con este fin, ensayamos 3 análogos en una intervalo de concentraciones de 0 a 100 μg/ml (suministradores: tetraciclina y doxiciclina, Sigma; 4-epi-oxitetraciclina, Acros Organics: clortetraciclina Fuzhou Antibiotic Group Corp.). Calculamos las concentraciones necesarias para la
20 supervivencia media máxima. Se muestran en la tabla 7, a continuación.
Tabla 7
- Eficacia de los análogos de Tc
- Línea Tc/Análogo
- Concentración para la supervivencia media máxima, g/ml
- F23 Tetraciclina F23 Doxiciclina F23 7-Clortetraciclina F23 4-epi-oxitetraciclina
- 5,0 3,9 1,7 42,0
EJEMPLO 5
LA513 claramente confiere letalidad dominante, activa en el estadio embrionario o de larva reciente. Las larvas se criaron con una dieta suplementada con 100 μg/ml de tetraciclina. Después de la eclosión, los adultos se transfirieron a una dieta que carecía de tetraciclina. Se midió la duración de la vida de estos adultos, y también la de
30 los adultos w1118 no transgénicos comparables. Como se muestra en la Tabla 8, a continuación, las líneas transgénicas mostraron una supervivencia buena como adultos con respecto al control no transgénico. Esto sugiere que la especificidad de estadio se había obtenido de este modo- aquí LA513 es letal larvario/embrionario, pero no es letal para adultos.
Tabla 8
Media de la duración de vida de los adultos LA513/+ transgénicos de Drosophila
Desviación estándar
Número de Moscas
Línea
días
O513
40,3 12,3
M8
26,1 2,5
M13
29,5 9,9 47
F23
29,6 11,3 83
F24
19,9 10,0 9
w
22,2 8,6 88
Es posible explicar estos datos de longevidad proponiendo que las larvas acumulan tetraciclina alimentándose, y que retienen esta tetraciclina en la madurez, de forma que sobreviven como adultos incluso en la ausencia de 5 tetraciclina en la dieta. Para examinar esto, se criaron moscas heterocigotas de LA513/+ (línea M13) como larvas con varias concentraciones de tetraciclina. Tras la eclosión, los adultos se transfirieron a una dieta carente de tetraciclina y se midió la duración de la vida de estos adultos, como anteriormente. Como se muestra en la Tabla 9, a continuación, la concentración de la tetraciclina de la dieta mientras eran larvas no tiene un efecto obvio sobre la longevidad de los adultos subsecuentes en ausencia de tetraciclina, lo que implica que la supervivencia de los
10 adultos no se debe primariamente a la retención de tetraciclina durante la alimentación de las larvas. A una concentración de 1 μg/ml, ningún transgénico sobrevivió hasta la madurez, y a 3 μg/ml solo sobrevivió hasta la madurez aproximadamente la mitad del número esperado, por lo que esta concentración está cerca del mínimo para la supervivencia de las larvas.
Tabla 9
- Efecto de la tetraciclina de las larvas en la longevidad de los adultos
- Tetraciclina de las larvas μg/ml
- Media de tiempo de supervivencia posteclosión, días Desviación estándar Número de Moscas
- 1 3 1030100
- --33,5 13,2 28,4 9,6 26,3 11,3 29,5 9,9 -9 17 23 47
15 Otra posible explicación para la supervivencia de los adultos LA513/+ es que el tTAV sea inactivo en adultos, por lo que el ciclo de retroalimentación positiva no funciona, y el tTAV no se acumula. Examinamos esto midiendo la cantidad de ARNm tTAV por PCR cuantitativa a continuación de una reacción de transcriptasa inversa (rt-PCR cuantitativa, o qPCR). Utilizamos química Taqman y reactivos (ABI), y un instrumento de QPCR ABI Prism 7000.
20 Cada muestra se ensayó por triplicado: los datos son la media de estos tres ensayos. Los cebadores 18S se hibridaron al ARN18S de Drosophila melanogaster, Ceratitis capitata y Aedes aegypti, entonces estos cebadores se utilizaron para las tres especies.
Cebadores utilizados:
25 18S RNA SEC ID Nº Cebador directo: ACGCGAGAGGTGAAATTCTTG 4 Cebador inverso: GAAAACATCTTTGGCAAATGCTT 5 Sonda TaqMan MGB: 6-Fam-CCGTCGTAAGACTAAC-MGB 6
tTAV Cebador directo: CATGCCGACGCGCTAGA 7 Cebador inverso: TAAACATCTGCTCAAACTCGAAGTC 8 Sonda TaqMan MGB: VIC-TCGATCTGGACATGTTGG-MGB 9
Encontramos que los 0513 criados con 100 μg/ml de tetraciclina tenían una relación tTA: 18S de 0,00016 (larvas) y 0,00013 (adultos). Los adultos que provenían de larvas con 100 μg/ml de tetraciclina, pero que se transferían a una di eta sin tetraciclina cuando eran adultos tenían unas relaciones de 0,0061, 0,0047, 0,0087 y 0,011 después de 1, 2, 4 y 8 días sin tetraciclina respectivamente. Este aumento de 28 y 64 veces en la expresión con respecto a los controles alimentados con tetraciclina indica que el sistema de expresión con retroalimentación positiva basada en tTAV es funcional en adultos.
LA513 en Aedes aegypti
Se transformaron mosquitos Aedes aegypti (el mosquito de la fiebre amarilla, también el vector principal del dengue 10 febril urbano) con LA513. Se obtuvieron dos líneas independientes de inserción, la LA513A y la LA513B.
A los machos heterocigotos por LA513A (criados como larvas con 30 μg/ml de tetraciclina) se les dejó aparearse con hembras tipo silvestre. Se recogieron los huevos y las larvas resultantes se criaron en medio normal, o en medio suplementado con tetraciclina (Tc) a 30 μg/ml. Se determinó el número de adultos transgénicos y no transgénicos 15 resultantes de esos huevos. Los datos son la suma de al menos 5 experimentos. Las larvas se criaron con una densidad de ≤ 250 individuos por litro; todos los huevos de los experimentos “sin tetraciclina” se lavaron dos veces antes de la sumersión para evitar la transferencia de tetraciclina. Para los experimentos “con tetraciclina”, se suplementaron la sangre parental y el agua azucarada con 30 μg/ml de tetraciclina; mientras que para los experimentos “sin tetraciclina” no. El ensayo χ 2 para la diferenciación en la relación entre la supervivencia de
20 adultos transgénicos y de tipo silvestre: “con tetraciclina”, en cualquier orientación: p> 0,05; “sin tetraciclina” en cualquier orientación p< 0,001 (hipótesis nula: el genotipo con respecto a LA513 no tiene efecto sobre la supervivencia).
Por tanto, LA513A es dominante letal que se puede reprimir, con una penetración en estos experimentos el 95-97 %. 25 El LA513B también es dominante letal que se puede reprimir, con una penetración en estos experimentos del 100 %. Los resultados se muestran en la Tabla 10, a continuación.
Tabla 10
Efecto de tetraciclina en la supervivencia de Aedes aegypti LA513/+ y sus hermanos +/+
- Parentales
- Descendencia
- Macho
- Hembra Tc en Genotipo
- larvas
- Huevos
- 1er 2º 3º 4º Pupa Adultos
- estado
- larvario
- LA513A/+
- +/+ 1000 Sí LA513A/+ Tipo silvestre 489 444 468 431 446403 442 400 437 396 434 392
- +/+
- LA513A/+ 1000 Sí LA513A/+ Tipo silvestre 442 466 420 444 404428 399 417 393 412 383 404
- LA513A/+
- +/+ 540 No LA513A/+ Tipo silvestre 274 233 265 225 235214 208 212 155 209 7 206
- +/+
- LA513A/+ 497 No LA513A/+ Tipo silvestre 216 241 205 225 181216 168 214 131 211 9 207
- Parentales
- Descendencia
- Macho
- Hembra Tc en Genotipo
- larvas
- Huevos
- 1er 2º 3º 4º Pupa Adultos
- estado
- larvario
- LA513B/+
- +/+ 377 Sí LA513B/+Tipo silvestre 161 178 153 171 147 165 141 160 139 157 131 153
- +/+
- LA513B/+ 442 Sí LA513B/+ Tipo silvestre 189 203 181198 170 185 166182 161 180 153 176
- LA513B/+
- +/+ 188 No LA513B/+Tipo silvestre 69 85 19 84 0 83 0 83 0 82 0 81
LA513B/+ 91 60 0 0 0
+/+ LA513B/+
497 No Tipo
107 10499 98 95 93
silvestre
Examinamos la supervivencia de los machos LA513A/+ que habían sido criados con tetraciclina (30 μg/ml), cuando eran larvas, pero a los que no se les dio tetraciclina cuando fueron adultos. Encontramos que todos los machos 5 ensayados sobrevivieron durante tres semanas, independientemente del genotipo (LA513A/LA513A, LA513A/+ o +/+) o de la presencia o ausencia de tetraciclina en su dieta (n≥ 40 para cada genotipo).
Investigamos las cinéticas de inducción de tTAV en mosquitos adultos LA513B/+ después de la retirada de la tetraciclina utilizando qPCR. Como se muestra en la Tabla 11, a continuación, el tTAV aumentaba en machos y
10 hembras tras la retirada de tetraciclina. La inducción de la expresión de tTA es bastante rápida tras eliminar la Tc, como en la Drosophila. En cada caso, el cambio entre las dietas que contenían diferentes niveles de tetraciclina proporciona un nivel de control sobre el nivel de expresión de los genes controlados por tTA (ejemplificado aquí por el mismo tTA), utilizando tal sistema de retroalimentación positiva.
Inducción de la expresión de tTA en machos LA513B/+ después de la retirada de tetraciclina Expresión de tTA:18S con
Tiempo (días) sin Relación de expresión
Sexo respecto a machos con
tetraciclina tTA:18S
tetraciclina Macho 0 0,00036 1
Hembra 0 0,00060 1,7
Macho 3 0,0043 12
Hembra 3 0,014 38
Macho 4 0,054 150 Hembra 4 0,019 530 Macho 8 0,012 34 Hembra 8 0,52 1500 Macho 16 0,10 280 Hembra 16 0,032 88 15
EJEMPLO 7
Potenciación reprimible por tetraciclina de un promotor cercano por tTAV en una configuración de retroalimentación positiva
20 Observamos que el marcador fluorescente en mosquitos transgénicos LA513A y LA513B mostraba un patrón diferente en ausencia de tetraciclina, cuando se comparaba con el patrón en presencia de tetraciclina. La fluorescencia en presencia de tetraciclina era típica de la expresión dirigida por Actin5C en mosquitos (Catteruccia y col., 2000; Pinkerton y col., 2000), y limitada sobre todo a la parte hinchada del tórax. Por el contrario, en ausencia
25 de tetraciclina, la expresión era mucho más fuerte y evidente sustancialmente por todo el cuerpo de los individuos transgénicos. En cada caso, la evaluación de la intensidad de la fluorescencia y el patrón de expresión se hizo por observación visual utilizando microscopía de fluorescencia.
La expresión de tTAV en esta situación de retroalimentación positiva parece, por tanto, que estimula la expresión del
30 promotor cercano Actin5C. Esto se ilustra, en forma de diagrama en la Figura 9. También descubrimos que la concentración intermedia de tetraciclina, se ajustaba sustancialmente a la supresión de la letalidad de LA513, y no suprimía este patrón de expresión amplio de fluorescencia. A esas concentraciones intermedias de tetraciclina, se acumulaba el tTAV a un nivel intermedio – subletal, pero mayor que con 30 μg/ml de tetraciclina, y que aún influenciaba la expresión de DsRed2. Esto ejemplifica de nuevo el control adicional disponible modulando la
35 concentración de tetraciclina.
La Figura 9 ilustra la acción bidireccional de tetO7 en mosquitos 513A y 513B. En 513, el DsRed2 está bajo el control de transcripción del promotor Actin5C de Drosophila.
40 (A) En presencia de tetraciclina, se produce relativamente poco tTAV, que se une a la tetraciclina y que no tiene
- o tiene poco efecto sobre la expresión de DsRed2. Se ve DsRed2 en un patrón típico de la expresión de Actin5C en mosquitos.
- (B)
- En ausencia de tetraciclina, tTAV estimula su propia expresión en un bucle de retroalimentación positiva.
(C) tTAV se une a los sitios tetO y aumenta la expresión del promotor mínimo hsp70, y por tanto de tTAV, pero 45 también del promotor Actin5C, y por tanto de DsRed2.
EJEMPLO 8
LA656, LA928 y LA1124 en Ceratitis capitata
5 No se obtuvieron líneas transgénicas de la mosca mediterránea de la fruta (mosca mediterránea de la fruta, Ceratitis capitata), utilizando pLA513, probablemente indicando que el marcador basado en Actin5C de pLA513 no es apropiado para su uso en mosca mediterránea de la fruta. Esto enfatiza el deseo de que haya construcciones de expresión con un intervalo amplio de especies. Nosotros, por tanto, modificamos la construcción para incluir un marcador basado en una poliubiquitina (ubi-p63E) en vez de la que se basaba en Actin5C de pLA513. Tal
10 construcción es pLA656. También hicimos dos construcciones adicionales, pLA928, y pLA1124 (SEC ID Nos 18, 20 y 21, respectivamente, y que se muestra en forma de diagrama en las Figuras 10, 11, y 12), utilizando un marcador basado en el potenciador hr5 y el promotor ie1 de un baculovirus (virus de poliedrosis nuclear Autographica califórnica, AcMNPV). Este se diferencia en la orientación del marcador con respecto al casete tetO-tTAV. El potenciador hr está más próximo al casete tetO-tTAV en pLA1124 que en pLA928. Además, el pLA1124 tiene 21, en
15 vez de 7, copias de tetO y adicionalmente tiene una región GAGA-factor de unión aparente relacionada con la de pUASp (Roth, 1998).
Se obtuvo una línea transgénica por pLA656, tres por pLA928 y tres por pLA1124. Se asumió que estas líneas tienen inserciones independientes, ya que se derivaron de diferentes G0 supervivientes de la inyección.
20 Se cruzaron machos heterocigotos de cada línea con hembras tipo silvestre. La descendencia se crio con una dieta de referencia para Drosophila de levadura/azúcar/germen de trigo o levadura/azúcar/maíz, suplementada apropiadamente con tetraciclina. Los parentales se mantuvieron con la misma dieta, suplementada con 100 μg/ml de tetraciclina en el caso de los machos transgénicos. Las hembras del tipo silvestre con las que se aparearon los
25 machos se mantuvieron sin tetraciclina, para eliminar cualquier contribución potencial materna de tetraciclina. Se determinó el número de pupas y adultos transgénicos y no transgénicos obtenidos en cada cruzamiento clasificándolos por el DsRed2 mediante microscopía de fluorescencia.
Los resultados de estos cruzamientos se muestran en la Tabla 12, a continuación. En cada caso, en ausencia de
30 tetraciclina, la supervivencia de los heterocigotos transgénicos era menor del 2 % en relación con su tipo silvestre. El cambio entre las dietas que contenían diferentes niveles de tetraciclina, la modificación de la construcción y el efecto del uso de una posición, se tratan en otra parte del presente documento.
Tabla 12
- Efecto de la tetraciclina sobre las moscas mediterráneas de la fruta heterocigotas transgénicas por varias construcciones y sus hermanos +/+
- LA656
- Descendencia [Tc] ( g/ml) Pupas F/NF Relación de supervivencia pupal (%) Macho F Hembra F Macho NF Hembra NF Relación de supervivencia de adultos (%)
- 0
- 84/1161 7 6 2 530 551 0,7
- 0,1
- 16/423 4 0 0 205 177 0
- 1
- 124/384 32 34 12 155 174 14
- 3
- 258/370 70 84 53 165 133 46
- 10
- 249/252 99 91 98 107 127 81
- 100
- 330/307 107 151 150 134 148 107
- LA928m1
- Descendencia [Tc] ( g/ml) Pupas F/NF Relación de supervivencia pupal (%) Macho F Hembra F Macho NF Hembra NF Relación de supervivencia de adultos (%)
- 0
- 28/1499 1,87 5 1 661 639 0,46
- 0,1
- 0/765 0 0 0 347 246 0
- 1
- 190/256 74 62 59 119 101 55
- 3
- 290/302 96 133 98 143 107 92
- 10
- nd nd nd nd nd nd nd
- 100
- 222/286 77 84 84 146 126 74
- LA928m3
- Descendencia [Tc] ( g/ml) Pupas F/NF Relación de supervivencia pupal (%) Macho F Hembra F Macho NF Hembra NF Relación de supervivencia de adultos (%)
- 0
- 68/1026 6,6 13 4 489 449 1,8
- 0,1
- 0/265 0 0 0 117 91 0
- 1
- 358/446 80 154 100 228 164 65
- 3
- 105/105 100 39 35 42 38 93
- 10
- nd nd nd nd nd nd nd
- 100
- 245/245 100 109 121 117 108
- 100
- LA928F1
- Descendencia [Tc] ( g/ml) Pupas F/NF Relación de supervivencia pupal (%) Macho F Hembra F Macho NF Hembra NF Relación de supervivencia de adultos (%)
- 0
- 17/1331 1,3 2 0 639 599 0,16
- 0,1
- 2/254 0,8 0 0 100 84 0
- 1
- 461/567 81 218 146 244 181 85
- 3
- 520/527 99 214 182 249 202 88
- 10
- 350/399 91 139 112 131 159 87
- 100
- 126/117 108 63 57 57 49 113
- LA1124f1
- Descendencia [Tc] ( g/ml) Pupas F/NF Relación de supervivencia pupal (%) Macho F Hembra F Macho NF Hembra NF Relación de supervivencia de adultos (%)
- 0
- 104/213 51 0 3 95 62 1.9
- 100
- 478/536 89 218 208 205 203 104
- LA1124m1
- Descendencia [Tc] ( g/ml) Pupas F/NF Relación de supervivencia pupal (%) Macho F Hembra F Macho NF Hembra NF Relación de supervivencia de adultos (%)
- 0
- 337/437 77 2 1 176 207 0,78
- 100
- 84/90 93 35 31 30 26 118
- LA1124m2
- Descendencia [Tc] ( g/ml) Pupas F/NF Relación de supervivencia pupal (%) Macho F Hembra F Macho NF Hembra NF Relación de supervivencia de adultos (%)
- 0
- 104/145 72 0 1 46 34 1,3
- 100
- 77/77 100 24 14 19 13 119
- F: fluorescente NF: no fluorescente
Se recolectaron las pupas y se valoró su fluorescencia (columna 3), entonces se les dejó eclosionar. Se evaluaron la fluorescencia y el sexo (columnas 5-8) de los adultos supervivientes. A partir de estos datos en adultos, se calculó la relación entre supervivientes fluorescentes y no fluorescentes, y se presenta en la columna 9 como el porcentaje de
5 adultos fluorescentes observados en relación con los no fluorescentes. Se esperaba que estos cruzamientos darían, de media, igual número de individuos transgénicos y no transgénicos; de esta forma si sobreviven hasta la madurez la misma proporción de individuos transgénicos y no transgénicos, entonces debería dar una “relación de supervivencia de adultos” del 100 %.
10 Además investigamos la expresión de tTA en estas líneas transgénicas por PCR-rt (tiempo real) cuantitativa (qPCR). Los resultados se dan en la Tabla 13, a continuación.
Niveles de expresión de tTA en mosca mediterránea de la fruta tipo silvestre y transgénicas
Larvas
WT tet 3,13E-06 WT NT 2,81E-06 656 tet 5,80E-06 1,00 656 NT 2,06E-04 36 670A tet 2,71E-06 1,00 670A NT 1,10E-04 41 670e tet 9,70E-06 1,00 670e NT 8,40E-05 8,7
Adultos
Hembra WT 2,83E-06 Macho WT 2,16E-07
Heterocigotos 656 tet M 0d 5,52E-06 1,00
- 656 tet M8d
- 1,12E-05 2,0
- 656 NT M 0d
- 4,49E-05 8,1
- 656 NT M 2d
- 2,77E-04 50
- 656 NT M 4d
- 2,22E-04 40
- 656 NT M 8d
- 9,71E-05 18
- 656 NT M 16d
- 1,49E-04 27
- 670 M tet
- 4,21E-06 1,00
- 670 F tet
- 2,86E-06 0,68
- 670 M NT S
- 6,93E-05 16,45
- 670 F NT S
- 1,92E-04 45,57
- 928Am1 F tet
- 7,17E-06 1,00
- 928Am1 M tet
- 8,56E-06 1,19
- 928Am1 M NT 2d
- 1,71E-04 23,81
- 928Am1 M NT 4d
- 5,36E-04 74,72
- 928Am1 M NT 8d
- 1,91E-04 26,66
- 928Am1 M NT 16d
- 1,01E-05 1,41
- 928Am1 M tet 8d
- 1,11E-06 0,16
- 928Am1 M NT S
- 2,22E-04 31,02
- 928Am1 M NT S
- 1,51E-04 21,11
- 928Am3 F tet
- 9,09E-07 1,00
- 928Am3 M tet
- 9,09E-07 1,00
- 928Am3 F NT S
- 3,62E-05 39,85
- 928Am3 F NT S
- 8,74E-04 962,07
- 928Am3 F NT S
- 2,99E-04 329,32
- 928Am3 M NT S
- 5,53E-05 60,83
- 928Am3 M NT S
- 9,18E-04 1009,90
- 1124f1 F tet
- 2,86E-05 1,00
- 1124f1 F NT 7d
- 4,11E-04 14,35
- 1124m1 M tet
- 1,62E-05 1,00
- 1124m1 F NT S
- 9,30E-04 57,55
- 1124m2 F tet
- 8,98E-05 1,00
- 1124m2 F NT 7d
- 7,90E-04 8,79
- Homocigotos
- 656 tet 8d
- 1,49E-05 1,00
- 656 NT 0d
- 9,23E-05 6,2
- 656 NT 2d
- 3,90E-03 262
- 656 NT 4d
- 1,92E-03 129
- 656 NT 8d
- 4,70E-03 316
- 656 NT 16d
- 8,58E-04 58
M: Sexo masculino;
F: Sexo femenino;
tet: Criado con una dieta suplementa da con 100 μg/ml de tetraciclina;
NT S: Criado con dieta de referencia (0 μg/ml de tetraciclina);
d: días post eclosión; NT (n)d: alimentados con dieta tet, cuando llegan a adultos con dieta no tet (NT) durante n días, como se indica;
tet (n)d: alimentados con dieta tet, cuando llegan a adultos con dieta tet durante n días, como se indica
EJEMPLO 9
LA670 en Ceratitis capitata
5 Obtuvimos una sola línea transgénica de mosca mediterránea de la fruta por transformación con pLA670, una construcción que se parecía mucho a pLA656. Este plásmido se ilustra en la Figura 13 adjunta, y es la SEC ID Nº
23.
Sin embargo, esta línea transgénica dio una cantidad significativa de descendientes adultos transgénicos, incluso cuando se criaron con una dieta carente de tetraciclina cuando eran larvas (Tabla 14). Sin embargo esta línea de inserción LA670 produce una cantidad fácilmente detectable de ARNm tTAV en ausencia de tetraciclina, que se reduce sustancialmente por la tetraciclina de la dieta (evaluado por qPCR, los resultados se muestran en la Tabla 13 5 anterior). Por tanto, LA670 representa una fuente regulable útil de tTAV con la cual controlar la expresión de los genes que responden a tTAV. La diferencia fenotípica entre LA656 y LA670, que son extremadamente similares en su estructura, es debida probablemente al efecto de posición., que es la variación en la expresión de los transgenes dependiendo de donde están insertados en el genoma. Tal variación se muestra también por la variación de fenotipo y los niveles de expresión de tTAV entre diferentes líneas transgénicas con la misma construcción, como se muestra
10 en la Tabla 13, anterior. Por tanto, se proporciona un procedimiento simple para obtener líneas transgénicas que porten construcciones de retroalimentación positiva con diferentes niveles de expresión y consecuencias fenotípicas, que comprende la generación de un panel de líneas de inserción y selección de los niveles y patrones de expresión reprimida y basal.
Tabla 14
- Efecto de la tetraciclina sobre las moscas mediterráneas de la fruta heterocigotas transgénicas por LA670, y sus hermanos +/+
- LA670
- Descendencia [Tc] ( g/ml) Pupas F/NF Relación de supervivencia pupal (%) Macho F Hembra F Macho NF Hembra NF Relación de supervivencia de adultos (%)
- 0
- 182/220 83 72 35 102 103 52
- 100
- 10/8 125 5 3 5 3
- 100
- F: fluorescente NF: no fluorescente
15 Se recogieron las pupas y se valoró la fluorescencia (columna 3), entonces se les dejó eclosionar. Se evaluaron la fluorescencia y el sexo (columnas 5-8) de los adultos supervivientes. A partir de estos datos en adultos, se calculó la relación entre supervivientes fluorescentes y no fluorescentes, y se presenta en la columna 9 como el porcentaje de adultos fluorescentes observados en relación con los no fluorescentes. Se esperaba que estos cruzamientos darían,
20 de media, igual número de individuos transgénicos y no transgénicos; de esta forma si sobreviven hasta la madurez la misma proporción de individuos transgénicos y no transgénicos, entonces debería dar una “relación de supervivencia de adultos” del 100 %.
Ensayamos la capacidad de LA670 para dirigir la expresión de secuencias situadas bajo del control de la
25 transcripción de tetO. Analizamos la expresión de dos ARNm potenciales de pLA1038 (Figura 14, SEC ID Nº 24), que contiene dos unidades de transcripción que responden a tTA, transcritas divergentemente. Estos son CMV-tTA y hsp70-Cctra-nipper. Se llevó a cabo un análisis por PCR, con controles, de la expresión de estas unidades de transcripción en presencia y ausencia de pLA670. Ambas unidades de transcripción se expresan en presencia de pLA670. CMV-tTA se expresa a un nivel más bajo pero detectable en transgénicos LA1038/+ en ausencia de LA670.
30 La hsp70-Cctra-nipper no se expresaba detectablemente en ausencia de pLA670, lo que muestra que la expresión además está controlada por, y depende de, la tTAV suministrada por pLA670.
EJEMPLO 10
La Pectinophora gossypiella (gusano rosado o lagarta rosada, un lepidóptero) se transformó con LA710 (Figura 15, SEC ID Nº 19) por procedimientos de referencia (Peloquin, y col., 2000). Se recuperaron cuatro líneas transgénicas. Los machos de esta línea se cruzaron con hembras de tipo silvestre para LA710. Las larvas recién nacidas se
40 situaron en viales individuales de 1,7 ml con una dieta, o bien con o sin 7-clortetraciclina (40 μg/ml), y se valoró su fluorescencia. No se observó ninguna diferencia significativa en el número de transgénicos supervivientes en la madurez con respecto al número de sus hermanos de tipo silvestre, tanto con o sin clortetraciclina. Concluimos que LA710 no produce normalmente la acumulación de niveles letales de tTAV, incluso en ausencia de clortetraciclina en la dieta.
45 Examinamos la expresión de ARNm tTAV en los transgénicos LA710 por PCR a continuación de una reacción de transcriptasa inversa (rt-PCR). Encontramos que no era detectable el ARNm tTAV en las larvas alimentadas con clortetraciclina, pero era detectable en las larvas que no habían recibido la clortetraciclina (datos no mostrados). Esta construcción de retroalimentación positiva, por lo tanto, proporciona en estas polillas, una fuente de tTAV que se
50 puede regular por el suministro en la dieta de clortetraciclina, y para la que la expresión no reprimida, aunque detectable fácilmente, no es letal. También observamos una variación significativa en la intensidad de la banda correspondiente al ARNm tTAV en muestras de diferentes líneas.
EJEMPLO 11
LA1124 en Pectinophora gossypiella
5 La Pectinophora gossypiella (gusano rosado o lagarta rosada, un lepidóptero) se transformó con LA1124 (Figura 12, SEC ID Nº 21) por procedimientos de referencia (Peloquin, y col., 2000). Se recuperó una única línea transgénica. Los machos de esta línea se cruzaron con hembras de tipo silvestre para LA1124. Las larvas recién nacidas se situaron en viales individuales de 1,7 ml con una dieta, o bien con o sin 7-clortetraciclina (40 μg/ml), y se valoró su fluorescencia. Estas larvas se evaluaron de nuevo cuando tenían un tiempo de desarrollo de último estadio larvario.
10 Todas las larvas sobrevivieron, excepto las larvas fluorescentes (LA1124/+) con la dieta que carecía de clortetraciclina, como se muestra en la Tabla 15, a continuación.
Tabla 15
Examinamos la expresión de ARNm tTAV en los gusanos rosas del algodón LA1124 por PCR a continuación de una
15 reacción de transcriptasa inversa (rt-PCR). Encontramos que el ARNm tTAV se detectaba fácilmente en las larvas alimentadas con clortetraciclina, y estaba elevado considerablemente en las larvas que no habían recibido la clortetraciclina (datos no mostrados). La expresión basal significativa de ARNm tTAV en esta construcción se debe probablemente a la inclusión en LA1124 del potenciador hr, que se incluyó por esta razón. La comparación de la estructura y función de LA1124 y la de LA710 ilustra claramente que los niveles basal y máximo del producto génico
20 se pueden seleccionar fácilmente, modificando apropiadamente la construcción de expresión, este principio se demuestra, aquí, regulando los niveles de expresión de un ARN dependiente de tTAV (en este caso el ARNm tTAV).
EJEMPLO 12
Se prefiere controlar, por el diseño, la expresión de tTAV a partir de una construcción de retroalimentación positiva, de forma que se puede expresar deferencialmente en diferentes tejidos, o en diferentes estadios de desarrollo, o diferentes sexos, por ejemplo. Una aplicación para esto es en la determinación del sexo genético, en el que se 30 induce un dimorfismo sexual entre los dos sexos y que se utiliza como base para separar los dos sexos. En el contexto de la Técnica de insectos Estériles, por ejemplo, para la mosca mediterránea de la fruta, esto significa preferentemente matar las hembras, más preferentemente en un estadio temprano de su desarrollo. No se conocen promotores de actuación temprana específicos de hembras para mosca mediterránea de la fruta, lo cual limita el potencial del sistema de dos componentes dominante letal que se puede reprimir, ejemplificado para Drosophila, que
35 utiliza promotores o potenciadores de genes de proteína de yema de huevo (Heinrich y Scott, 2000; Thomas y col., 2000). Sería claramente ventajoso ser capaces de combinar las características beneficiosas de un sistema de retroalimentación positiva condicional con un mecanismo que confiriera la especificidad femenina.
Por tanto, modificamos una construcción de retroalimentación positiva no específica del sexo insertando una región
40 intrónica específica del sexo de Cctra, el homólogo en la mosca mediterránea de la fruta del gen transformador de Drosophila melanogaster (Pane y col., 2002). El corte y empalme específico del sexo de Cctra se ilustra en forma de diagrama en la Figura 16, que se ha adaptado de Pane y col., 2002, mencionado anteriormente. La Figura 16 muestra la organización genómica del gen tra de la mosca mediterránea de la fruta. La línea superior representa el locus genómico Cctra. Los exones se muestran como bloques, aug marca el codón de inicio compartido. Las
45 uniones alternadas de corte y empalme se marcan como i. Los sitios de unión aparentes tra/tra-2 se marcan con puntas de flecha. La transcripción F1, es el único que codifica proteína Cctra funcional, y es específico de hembras. Las transcripciones M1 y M2 se encuentran tanto en machos como en hembras.
Se producen tres transcripciones principales: M1, M2 y F1. La transcripción F1 se encuentra solamente en hembras,
50 y es el único que codifica la proteína Cctra funcional, de longitud completa. Las transcripciones M1 y M2 se encuentran tanto en machos como en hembras, e incluyen una secuencia exónica adicional, que inserta uno o más codones de parada relativos a la transcripción F1, dando lugar a que se trunque la fase de lectura abierta.
Insertamos el intrón Cctra en la fase de lectura abierta de tTAV, de forma que la escisión por corte y empalme del
55 intrón completo, en forma de transcripción F1, debería reconstituirse en una región codificadora intacta tTAV, pero cortando y empalmando en la manera de M1 o M2 resultaría en una proteína truncada incapaz de actuar como un potenciador de la transcripción. El plásmido resultante pLA1188 (Figura 17, SEC ID Nº 22), se inyecto en los embriones de mosca mediterránea de la fruta. Se recuperaron las larvas supervivientes, y se analizaron extractos de estas larvas por rt-PCR para determinar el patrón de corte y empalme de la transcripción tTAV.
Las larvas hembras rendían productos PCR que correspondían a los tamaños esperados que resultarían del corte y empalme en el patrón del gen Cctra endógeno, en otras palabras correspondiendo al corte y empalme en los patrones M1, M2 y F1. Estos datos indican que el intrón Cctra puede cortar y empalmar correctamente en un contexto heterólogo, y por tanto, proporcionar un procedimiento adecuado para introducir una especificidad del sexo 5 en una construcción de retroalimentación positiva. Además, como se conservó la función de tra a lo largo de un intervalo filogenético amplio (Saccone y col., 2002), y se conocen otros intrones específicos del sexo, por ejemplo, en Drosophila melanogaster el gen de sexo doble (dsx), que también se conserva bien, proporciona un procedimiento general para manipular la expresión de genes. Será aparente para la persona experta en la técnica que tales manipulaciones pueden alternativamente, o adicionalmente, aplicarse a otros genes que responden a un activador de la transcripción, de forma que se puede conseguir la expresión específica del sexo de un gen diana combinando la expresión no específica del sexo de un activador de la transcripción con la expresión específica del sexo, por ejemplo, por medio de corte y empalme de un ARN funcional bajo el control de la transcripción del activador de la transcripción. Además, será también aparente que esto proporciona un mecanismo simple para la expresión diferencial de dos, o más, genes diana diferentes, o productos génicos, tal que uno, o un grupo, se
15 exprese en ambos sexos y el otro, u otro grupo, en un solo sexo. Esto se ilustra para la mosca mediterránea de la fruta en la Figura 18.
Los cebadores utilizados fueron:
Tra(tTAV)Sec+: 5’-CCTGCCAGGACTCGCCTTCC (SEC ID Nº 12)
Tra(tTAV)Sec-: 5’-GTCATCAACTCCGCGTTGGAGC (SEC ID Nº 13)
Se produjeron productos RT-PCR de ∼600 y -200 pb cuando el ADNc derivado de hembras de mosca mediterránea de la fruta 1 y 2 se utilizaron como matriz, representando respectivamente formas cortadas y empalmadas de ARNm
25 específicas de “macho” (M1 y M2) y específicas de hembras (F1) (datos no mostrados). El producto de ∼200 pb puede que se produjera debido a la contaminación con ADN tTAV - la forma femenina de corte y empalme eliminaba completamente el intrón Cctra y por tanto llevaba a un producto PCR que es idéntico al que se debería obtener de cualquiera de los varios plásmidos que contienen tTAV o las muestras manejadas en el mismo laboratorio. La banda de ∼600 pb, por el contrario, retiene ∼400 pb de la secuencia Cctra y es diagnóstica del correcto corte y empalme de la construcción.
En otro experimento (datos no mostrados), se analizó la expresión de las transcripciones de LA1038 en respuesta a tTAV de LA670 por cromatografía en gel (datos no mostrados), utilizando:
35 A: rt-PCR para la expresión de CMV-tTA de LA1038 en extractos de heterocigotos dobles LA1038/+, LA670/+;
B: rt-PCR para la expresión de hsp70-Cctra-nipper en extractos de heterocigotos dobles LA1038/+, LA670/+; y
C: rt-PCR para la expresión de CMV-tTA de LA1038 en extractos de heterocigotos LA1038/+ sin LA670.
Todas las moscas se criaron en ausencia de tetraciclina en la dieta. En A y C, se presentaron dos bandas entre 200 pb y 400 pb y representaban el ADNc del ARNm cortado y empalmado (la banda de bajo peso molecular) y el ADN genómico o el ADNc del mensaje sin cortar y empalmar (la banda de mayor peso molecular) respectivamente. En B, una banda de aproximadamente 200 pb representa el ADNc del ARNm cortado y empalmado en el patrón de la transcripción de Cctra específica de hembra, una banda superior de aproximadamente 1500 pb que representa el ADN genómico o el ADNc del mensaje sin cortar y empalmar, y bandas de tamaño intermedio que representan el
45 ADNc cortado y empalmado en el patrón de las transcripciones M1 y M2 de Cctra no específicas de sexo, o bandas no específicas.
Las secuencias cebadoras utilizadas fueron.
hsp70-Cctra-nipper: NIP: 5’-CATCGATGCCCAGCATTGAGATG y
HSP: 5’-CAAGCAAAGTGAACACGTCGCTAAGCGAAAGCTA;
CMV-tTA: CMV: 5’- GCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAG y
TTA: 5’-GCCAATACAATGTAGGCTGCTCTACAC
55 Estos datos (no mostrados) demuestran que la sección hsp-Cctra-nipper de LA1038 demuestra que se cortó y empalmó correctamente en la forma femenina en 6/6 hembras, y en la forma masculina en 6/6 machos.
JY2004-tTA (SEC ID Nº 14) – secuencia solamente de la región tetO7-tTA
pP[Casper-Act5C-tTA] (SEC ID Nº 15)
pLA513 (SEC ID Nº 16)
pLA517 (SEC ID Nº 17)
pLA656 (SEC ID Nº 18)
65 pLA670 (SEC ID Nº 23) pLA710 (SEC ID Nº 19)
pLA928 (SEC ID Nº 20)
pLA1038 (SEC ID Nº 24)
pLA1124 (SEC ID Nº 21)
pLA1188 (SEC ID Nº 22)
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<120> Control de Plagas
<130> WPP88353 45
<150> UK 0317656.7
<151>
<160> 33
<170> PatentIn versión 3.2
<210> 1
<211> 44
<212> ADN 55 <213> Drosophila sp.
<400> 1
cacagcgcat gatgagcaca ttaacaaaat gtagtaaaat agga 44
<210> 2
<211> 44
<212> ADN
- <213>
- Drosophila sp.
- <213>
- Artificial
65 <400> 2 gtttcgataa atattgctat ttaaaatgct tattttcaat gcta 44
- 5
- <210> 3 <211> 44 <212> ADN <213> Drosophila sp. <400> 3 tttgttttct aacgttaaag ttaaagagag tccagccaca tttt 44
- <210> 4 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial
- 15
- <220> <223> Cebador de PCR
- <400> 4 acgcgagagg tgaaattctt g
- 21
- <210> 5 <211> 23 <212> ADN <213> Artificial
- 25
- <220> <223> Cebador de PCR
- <400> 5 gaaaacatct ttggcaaatg ctt
- 23
- 35
- <210> 6 <211> 16 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Parte de nucleótido de sonda TaqMan MGB
- <400> 6 ccgtcgtaag actaac
- 16
- 45
- <210> 7 <211> 17 <212> ADN <213> Artificial
- <220> <223> Cebador de PCR
- <400> 7 catgccgacg cgctaga
- 17
- 55
- <210> 8 <211> 26 <212> ADN <213> Artificial
- <220> <223> Cebador de PCR
- <400> 8 gtaaacatct gctcaaactc gaagtc
- 26
- 65
- <210> 9 <211> 18 <212> ADN
<220>
<223> Parte de nucleótido de sonda TaqMan MGB 5
<400> 9
tcgatctgga catgttgg 18
<210> 10 10 <211> 25
<212> ADN
<213> Artificial
<220> 15 <223> Cebador de PCR
<400> 10 gccctcgatg gtagacccgt aattg 25
20 <210> 11
<211> 27
<212> ADN
<213> Artificial
25 <220>
<223> Cebador de PCR
<400> 11
gctaaacaat ctgcaggtac cctggcg 27 30
<210> 12
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial 35
<220>
<223> Cebador de PCR
<400> 12 40 cctgccagga ctcgccttcc 20
<210> 13
<211> 22
<212> ADN 45 <213> Artificial
<220>
<223> Cebador de PCR
50 <400> 13 gtcatcaact ccgcgttgga gc 22
<210> 14
<211> 2556 55 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> JY2004-tTA 60
<400> 14
<210> 15
<211> 12087
5 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> pP[Casper-Act5C-tTA] 10
<400> 15
<210> 16
<211> 11920 5 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> pLA513 10
<400> 16
<210> 17
<211> 11570 5 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> pLA517 10
<400> 17
<210> 18
<211> 11251 5 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> pLA656 10
<400> 18
<210> 19
<211> 9468
5 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> pLA710 10
<400> 19
<210> 20
<211> 10140 5 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> pLA928 10
<400> 20
<210> 21
<211> 10522
5 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> pLA1124 10
<400> 21
<210> 22
<211> 11867
5 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> pLA1188 10
<400> 22
<210> 23
<211> 10786 5 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> pLA670 10
<400> 23
<210> 24
<211> 14720
5 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
- <223>
- pLA1038 10
<400> 24
<210> 25
<211> 23
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador de PCR
<400> 25 catcgatgcc cagcattgag atg 23
<210> 26
<211> 34
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador de PCR
<400> 26 caagcaaagt gaacacgtcg ctaagcgaaa gcta 34
<210> 27
<211> 28
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador de PCR
<400> 27 gccatccacg ctgttttgac ctccatag 28
<210> 28
<211> 27
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador de PCR
<400> 28 gccaatacaa tgtaggctgc tctacac 27
<210> 29
<211> 1005
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Región codificante de tTA de pUHD15-1
<400> 29
<210> 30
<213> Artificial
<220>
- <223>
- tTA 15
<400> 30
<210> 31
<211> 1017
<212> ADN 5 <213> Artificial
<220>
<223> tTAV
10 <400> 31
<210> 32 15 <211> 338
<212> PRT
<213> Artificial
<220> 20 <223> tTAV
<400> 32
<210> 33
<211> 4455
5 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> pUHD15-1 10
<400> 33
Claims (41)
- REIVINDICACIONES
- 1.
- Un sistema de expresión génica que se puede reprimir, operativo en un insecto, que comprende dos elementos en la misma construcción, en la que: el primer elemento comprende al menos un gen de factor de control que hay que expresar y al menos un primer promotor del mismo; y el segundo elemento comprende al menos un segundo promotor y un gen de interés bajo el control de dicho al menos un segundo promotor; en el que un producto del gen de factor de control que hay que expresar sirve como factor de control de la transcripción positivo para ambos, el al menos un primer promotor en dicho primer elemento y el al menos un segundo promotor en dicho segundo elemento, con lo que dicho producto del gen de factor de control, o la expresión de dicho producto del gen factor de control, se puede reprimir, siendo el primer y el segundo promotores, promotores mínimos de insecto, que pueden ser el mismo o diferentes.
-
- 2.
- Un sistema de acuerdo con la reivindicación 1, en el que se asocia un potenciador con el, o cada, promotor mínimo de insecto, sirviendo el producto génico para potenciar la actividad del, o cada, promotor mínimo de insecto por medio del potenciador.
-
- 3.
- Un sistema de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el factor del control es el producto génico tTA o un análogo que se puede reprimir del mismo, y en el que una o más unidades operadoras tetO están unidas operativamente al promotor y es el potenciador, sirviendo tTA o sus análogos para potenciar la actividad del promotor por medio del tetO.
-
- 4.
- Un sistema de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el gen de factor de control codifica el producto tTAV (SEC ID Nº 32).
-
- 5.
- Un sistema de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que el gen se modifica para casi seguir parcialmente el uso de un codón en una especie en la que el sistema es para su uso.
-
- 6.
- Un sistema de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que el primer y/o el segundo promotores están sustancialmente inactivos en ausencia del factor de control de transcripción positivo.
-
- 7.
- Un sistema de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que el primer y/o el segundo promotores mínimos de insecto se seleccionan de entre: hsp70, un promotor mínimo P, un promotor mínimo basado en Act5C, un fragmento del promotor BmA3, un promotor core Adh y un promotor Act5C, o combinaciones de los mismos.
-
- 8.
- Un sistema de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el primer y/o el segundo promotores mínimos se derivan de, o son un fragmento de, Hsp70.
-
- 9.
- Un sistema de acuerdo con cualquier reivindicación anterior que reduce la aptitud biológica cuando se deja de reprimir.
-
- 10.
- Un sistema de acuerdo con la reivindicación 9, que comprende un gen letal bajo el control de un promotor del sistema.
-
- 11.
- Un sistema de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el gen letal es un gen letal dominante.
-
- 12.
- Un sistema de acuerdo con las reivindicaciones 10 u 11, en el que el gen letal y el gen de factor de control son el mismo.
-
- 13.
- Un sistema de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el gen es tTA o un análogo del mismo.
-
- 14.
- Un sistema de acuerdo con las reivindicaciones 10 u 11, en el que el gen letal y el gen factor de control son diferentes.
-
- 15.
- Un sistema de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la reducción de la aptitud biológica es una alta tasa de mortalidad.
-
- 16.
- Un sistema de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que la expresión del gen de factor de control es selectiva.
-
- 17.
- Un sistema de acuerdo con la reivindicación 16, en el que la expresión del gen de factor de control está determinado por el sexo.
-
- 18.
- Un sistema de acuerdo con la reivindicación 17, que comprende una secuencia letal de sexo doble, transformación o específica del sexo.
-
- 19.
- Un sistema de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que el gen de interés está unido operativamente a al menos un promotor mínimo de insecto.
-
- 20.
- Un sistema de acuerdo con la reivindicación 19, en el que el gen de interés es un gen letal dominante.
-
- 21.
- Un sistema de acuerdo con la reivindicación 19, en el que el gen de interés codifica ARNi.
-
- 22.
- Un sistema de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, en el que la activación del promotor mínimo de insecto al que está unido operativamente el gen de interés da lugar a un efecto selectivo por medio de un producto de transcripción o de traducción de ADN bajo el control del promotor mínimo de insecto.
-
- 23.
- Un sistema de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 22, en el que la selección es específica de la especie.
-
- 24.
- Un sistema de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 23, en el que la selección es específica del estadio de desarrollo.
-
- 25.
- Un sistema de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, que es al menos dos cistrones, estando dichos cistrones unidos a un potenciador bajo el control del gen de factor de control.
-
- 26.
- Un sistema de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que al eliminarse un supresor del gen la expresión del gen de factor de control no tiene sustancialmente ningún efecto sobre la aptitud biológica del adulto en el que se ha eliminado el supresor.
-
- 27.
- Un sistema de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, limitado por elementos aisladores.
-
- 28.
- Un sistema de acuerdo con la reivindicación 27, en el que los aisladores son aisladores no idénticos.
-
- 29.
- pLA513 tal como se identifica por la SEC ID Nº 16.
-
- 30.
- JY2004-tTA tal como se identifica por la SEC ID Nº 14.
-
- 31.
- Un vector que comprende el sistema de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28.
-
- 32.
- Un vector de acuerdo con la reivindicación 31, que comprende además un marcador de expresión.
-
- 33.
- Un vector de acuerdo con la reivindicación 32, en el que el marcador de expresión es una proteína fluorescente o un marcador de resistencia.
-
- 34.
- Un vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 31 a 33, que comprende además un gen de transposasa que se puede expresar.
-
- 35.
- Un insecto que comprende, en su genoma, un sistema de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28.
-
- 36.
- Un insecto de acuerdo con la reivindicación 35, que sustancialmente no está amenazado por el sistema bajo condiciones tolerantes cuando el gen factor de control no se expresa.
-
- 37.
- Un insecto de acuerdo con las reivindicaciones 35 o 36 que forma parte de una especie dañina.
-
- 38.
- Un insecto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 35 a 37, que se selecciona de entre: mosquito, gusano rosado, mosca mediterránea de la fruta y Drosophila.
-
- 39.
- Un insecto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 35 a 38, en el que la expresión del gen de factor de control es bloqueable o controlable por medio de suplementos de la dieta.
-
- 40.
- Un procedimiento para establecer la compatibilidad de un promotor mínimo de insecto con una especie de insecto, que comprende:
1) Transformar dicha especie con un plásmido, u otro vector, comprendiendo el plásmido o el otro vector:- -
- un sistema, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, que incluye el promotor mínimo de insecto que hay que ensayar unido operativamente al gen de interés de dicho sistema; y
- -
- un marcador de transformación, bajo el control de un promotor de marcador de insecto apropiado a dicha especie:
2) Ensayar la expresión del marcador de los individuos transgénicos putativos; y 3) Ensayar la expresión del gen de interés en los individuos que expresan el marcador. - 41. El uso del sistema de expresión génica de insectos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10-14 en el control de una población de insectos dañinos.
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