KR20000048845A - 곤충-특이적 진드기 독소 유전자를 발현하는 생물학적 곤충방제제, 방법 및 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 감염 후 초기에 발현된 강한 프로모터의 규정조절하에서 광범위한 곤충세포에서 곤충-특이적 독소, 바람직하게 마비 신경독소를 발현하는 유전학적으로 처리된 바쿠로바이러스를 제공하는 것이다. 특히 바람직한 곤충-특이적 마비 신경독소는 Pyemotes를 포함하는 곤충-육식 진드기의 것이다. 본 발명의 유전학적으로 처리된 바쿠로바이러스는 특히 폴리헤드린 또는 그래뉼린 프로모터의 조절하에서 독소가 발현된 바쿠로바이러스와 비교하여 감염후 보다 이른 시간에 신경독소의 효과적인 곤충-독소 수준을 생성하는 점에서 선행기술 바이러스를 통해 개선된다. 곤충-독소 조성물은 제공되고 이들 조성물을 사용하여 곤충 방제 방법이 기술된다.

Description

곤충-특이적 진드기 독소 유전자를 발현하는 생물학적 곤충방제제, 방법 및 조성물{BIOLOGICAL INSECT CONTROL AGENTS EXPRESSING INSECT-SPECIFIC MITE TOXIN GENES, METHODS AND COMPOSITIONS}

해충의 생물학적 방제에 대한 관심은 통상적인 화학적 살충제의 불편의 결과로서 상승한다. 화학적 살충제는 일반적으로 유해한 종뿐만 아니라 이로운 종에도 영향을 미치고 해충은 이러한 화학물질에 대해 저항성을 얻으려는 경향이 있다. 더욱이, 화학적 잔류물은 환경적인 위험과 있을 수 있는 건강상의 관심 문제를 나타낸다. 생물학적 방제는 화학적 살충제에 대한 의존성을 감소시킬수 있는 해충 방제의 선택적인 수단을 제시한다.

바쿠로바이러스는 오직 절지동물을 감염시키는 진화론적으로 관련된 바이러스의 거대한 그룹이다[밀러, 엘.케이.(Miller,L.K.)(1981) Genetic Engineering in the Plant Sciences, N. Panopoulous, (ed.), Praeger Publ. 뉴욕, pp. 203-224; 카스텐스(Carstens)(1980) Trends in Biochemical Science 52:107-110; 하래프(Harrap)와 파인(Payne)(1979) Advances in Virus Research, 25권, 러퍼(Lawfer)등 (eds), Academic Press, 뉴욕, pp 273-355, 그라나도스, 알.알.(Granados, R.R.)과 페데리치, 비.에이(Federici, B.A.) eds.(1986) The Biology of Baculoviruses, 1권, Biological Properties and Molecular Biology, CRC Press Inc. Boca Raton, 플로리다). 어떤 바쿠로바이러스는 상업적으로 중요한 농업적 및 임업 수확물의 해충인 곤충을 단지 감염시킨다. 다른 바쿠로바이러스는 특이적으로 다른 해충, 예를들면, 모기와 벼룩을 감염시키는 것으로 알려져 있다. 이러한 바쿠로바이러스는 생물학적 방제제로서 잠재적으로 가치가 있다. 생물학적 살충제와 같은 바쿠로바이러스의 잠재적인 잇점은 숙주 특이적이라는 것이다. 개별적인 바쿠로바이러스 균주는 보통 하나 또는 몇개의 곤충종을 감염시키기 때문에 그들은 사람이나 환경에 거의 또는 어떤 위험도 없고 유익한 곤충종에 역으로 영향을 미치지 않고 사용될 수 있다.

바쿠로바이러스 아족(subgroup)은 현재 뉴클레오폴리헤드로 바이러스(NPVs)로 불리는 핵 다면성 비루스증 바이러스와 현재 그래뉼로바이러스(GV)로 불리는 과립증 바이러스를 포함한다. 바쿠로바이러스의 폐색(occluded)된 형태에서, 비리온(virion : 싸여진 뉴클레오캡시드)은 결정 단백질 매트릭스에 묻힌다. 폐색체로서 언급된 이러한 구조는 사실상 여분 유기체적으로 발견된 형태이고 일반적으로 곤충들 사이의 감염을 만연시키는데 책임이 있다. NPVs의 특징적인 형태는 많은 비리온이 각각의 폐색체에 묻히고 상대적으로 크다는(5㎛이하)것이다. SNPVs(단일 뉴클레오폴리헤드로시스 바이러스)의 폐색체는 보다 적고 각각 복합 뉴클레오캡시드를 갖는 단일 비리온을 함유한다. 복합 뉴클레오폴리에드로시스 바이러스(MNPVs) 는 비리온당 복합 뉴클레오캡시드와 폐색체당 복합 비리온을 갖는다. 과립증 바이러스(GVs)는 폐색체당 하나의 뉴클레오캡시드를 갖는 단일 비리온을 갖는다. 이들 형태의 폐색체의 결정 단백질 매트릭스는 우선적으로 폴리헤드린 또는 그래뉼린으로 알려진 단일 25-33kDa 폴리펩티드로 구성된다. 9장, 표 2와 7에서 참고로 도입되는 그뢰너(Groner)등의 The Biology of Baculoviruses, 1권, supra는 NPV숙주와 GV숙주의 광범위한 목록을 제공한다.

사실상, 감염은 곤충이 바쿠로바이러스 입자, 전형적으로 폐색체 형태를 갖는 바쿠로바이러스 입자로 오염된 음식을 섭취할 때 개시된다. 폐색체는 장을 정렬하는 상피 세포를 침범하는 비리온을 방출시키면서 곤충 중장(midgut)의 알칼리 조건하에서 분리한다. 예비폐색체는 또한 감염성이다(97. 3. 6.에 공고된 WO 97/08297). 숙주세포에서 바쿠로바이러스는 복제가 일어나는 핵으로 이동한다. 초기에, 특이적인 바이러스 단백질은 소위 "초기 유전자"의 전사와 전이를 통해 감염된 세포내에서 생성된다. 다른 기능 가운데 이들 단백질은 바이러스 DNA의 복제가 요구되고 이는 바이러스가 세포에 침입한 후 4-6시간에 시작한다. 바이러스 DNA복제는 약 24시간 이하의 후-감염(pi)을 진행시킨다. 약 8-24시간 pi에서 감염된 세포는 높은 수준으로 "후기 유전자"를 발현한다. 이들은 후손(progeny) 바이러스 입자 형성동안 바이러스 DNA를 둘러싸는 뉴클레오캡시드의 성분을 포함한다. 후손 바이러스 입자 생성은 약 12시간 pi에서 시작한다. 초기에, 결과 바이러스는 그들이 세포 표면으로부터 자라기 시작하기 때문에 외피를 획득하는 세포막으로 이동한다. 비폐색된 바이러스 입자는 곤충내에서 다른 세포를 감염시킬 수 있다. 폴리헤드린 합성은 감염후 대략 18시간에 시작하고 24-48시간 pi 근처에서 매우 높은 수준으로 증가한다. 약 24시간 pi에서, 비폐색된 바이러스 생성 속도 감소가 있고 대부분의 후손 바이러스 입자는 폐색체에 묻혀진다. 폐색체 형성은 세포 소멸 또는 세포용해가 될 때까지 계속된다. 어떤 바쿠로바이러스는 감염 과정 마지막에서 전체 곤충이 다른 곤충을 감염 시킬 수 있는 매우 많은 수의 폐색체를 방출하면서 액화되도록 하기 위해 숙주 곤충에서 사실상 모든 조직을 감염시킨다. [The Biology of Baculoviruses; I와 Ⅱ권, 그라나도스와 페데리치(eds.), CRC Press, 플로리다, 보카 라톤, 1986]

AcMNPV의 유도체이고 발현벡터로서 유용한 바쿠로바이러스는 미국특허 제 5,244,805(1993년 9월 14일에 밀러(Miller)에게 허여됨); 란킨(Rankin)등 (1988) Gene 70 : 39-49; 우이(Ooi)등(1989) J.Mol. Biol. 210 : 721-736, 티엠(Thiem)과 밀러(1990)Gene 91 : 87-95에 기술되어 있다. 특히 강한 후기(late) 및 매우 후기 프로모터는 변성된 폴리헤드린 프로모터 LSXⅣ, 잡종 Cap/Polh 프로모터 및 합성 프로모터 Syn을 포함한다. 그러나, 수확물 손해가 최소화되도록 선행기술보다 빨리 곤충에게 섭취 중단을 일으키게하는 바쿠로바이러스가 필요하다.

개선된 살충 성질을 갖는 바쿠로바이러스가 기술되어 있다. 예를들면, egt(ecdysone glucosyl transferase)유전자가 불활성화되는 AcMNPV는 야생형 AcMNPV로 감염된 유충과 비교할 때 보다 이른 섭취 중지와 보다 이른 유충 소멸을 일으킨다[예를들면, 1994년 10월 4일에 밀러등에게 허여된 미국특허 제 5,352,451호 참조],

Pyemotes tritici, 스트로-이치(straw-itch) 진드기는 Pyemotes 속에서 13개의 알려진 진드기 종중 하나이고 이들 모두는 육식이고 표적 곤충에서 극도의 독성에 대해 순하게 발생하는 독액을 소유한다. 13개의 알려진 종은 숙주 선택, 분산 방법과 그들의 표적 먹이에 대한 독성, 및 곤충과 사람에 대한 그들 독소의 효과가 다른 2개의 형태학상 그룹으로 나누어질 수 있다. scolyti와 ventricosus군은 표 1에 요약된다. ventricosus군의 대부분은 극단적으로 곤충-독성 독액을 갖는다. 독액이 광범위한 곤충 숙주와 비숙주 종에 대해 독성이기 때문에 진드기 독액은 특별한 곤충에 대해 특이성을 나타내지 않는다. 그러나, P.tritici 독소는 포유동물에 독성을 나타내지 않는다.

P. tritici 의 독액에 있는 곤충-특이적 독소는 정제되고 특성화 되었다.[토말스키(Tomalski)등(1988) Toxicon 26 : 127-132; 토말스키등(1989) Toxicon 27 : 1151-1167]. 이들 독소는 암컷 진드기에서 생성되고 독액 성분으로서 곤충 먹이에 주입되어 먹이의 마비를 가져오게 되고 이러한 섭취가 암컷 진드기를 배부르게 하여 재생산을 위한 적절한 영양물을 보장한다. TxP-I로 설계된 독소는 명백한 동질성으로 정제되고 ; SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 측정된 바와같이 27,000의 명목상 분자를 갖는다. 2개의 다른 성분은 용해되고 이는 28,000과 29,000의 분자량을 나타낸다; 이들 2개의 성분은 TxP-Ⅱ를 포함한다. 펩티드 지도와 면역블롯 실험에 기초하여 TxP-Ⅰ와 TxP-Ⅱ의 단백질 성분은 이소프로테인인 것으로 측정되었다[토말스키등 (1989)supra). P. tritici 독소 단백질을 엔코딩하는 DNA 서열은 분리되고 특성화 된 후 AcMNPV에서 발현되었다. 예를들면 전체로서 여기에 참고로 도입된 미국특허 제 5,266,317호를 참조바람.

곤충-특이적 신경독소는 제한되는 것은 아니지만 전갈, 말벌 및 거미를 포함하는 다른 절지동물의 독액에서도 발견되었다 [즐로트킨(Zlotkin)(1985) Comprehensive Insect Physiology, Biochemistry and Pharmacology, I. Kerkut와 L.I Gilbert (eds.) Pergamon Press, 영국, 옥스포드, pp499-546]. 전갈과 다른 곤충 육식동물로부터 몇가지 곤충-특이적 독소(해당하는 코딩 서열)도 기술되어 있다.[예를들면 EP 505 207(1992년 9월 23일에 공고됨, 캐이레이(Caylay)등); 매다(Maeda)등(1991) Virology 184 : 777-780; 맥커첸(McCutchen) 등 (1991) Bio/Technology 9 : 848-852 ; 스테왈트(Stewart) 등 (1991) Nature 352 :85-88].메리웨더(Merryweather) 등 (1990) J.Gen. Virology 71 : 1535-1544는 발현된 폴리헤드린 프로모터의 조절하에서 발현된 Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki HD-73 델타 내독소를 함유하는 바쿠로바이러스의 구축을 보고했다.

본 발명은 해충의 개선된 생물학적 방제를 위한 방법과 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게, 본 발명은 생물학적 곤충 방제제로서 사용하기 위한 바쿠로바이러스에서 곤충-특이적 코딩서열의 효과적인 발현에 관한 것이다.

도 1A-1E는 이치 진드기 독소 코딩 서열로 시험된 신호서열의 뉴클레오티드와 아미노산 서열을 나타낸다. 제시된 신호서열은 tox34(도 1A:SEQ의 뉴클레오티드 12-56 ID NO:1), S. peregrina의 sarcotoxin IA 유전자(도 1B, SEQ ID NO;10), D. melanogaster의 표피 유전자(도 1C ; SEQ ID NO:12), P. tritici로부터 tox21A(도 1D ; SEQ의 뉴클레오티드 119-208 ID NO:3)및 변성된 tox34 신호서열(도 1E; SEQ ID NO:14)에 해당한다. 각각의 신호 펩티드의 아미노산 서열은 이에 해당하는 뉴클레오티드 서열 아래 어두운 박스에 의해 강조된다. tox34의 성숙한 N-말단은 개방 박스에서 아미노산 잔기(residue)에 의해 표시된다. 사르코톡신 IA유전자 서열의 경우(도 1B)글리신 잔기는 Tox34의 성숙 말단에 도입되었다. 반 화살표는 tox21A신호서열을 갖는 tox34를 생성하기 위해 사용된 PCR 프라이머의 위치와 방향을 나타낸다(도 1D). A의 뉴클레오티드 서열에서 어두운 박스는 도 1E에서 별표에 의해 표시된 염기 쌍에서 돌연변이된 보완적인 TAAG서열의 위치를 제시한다.

도 2A-2C는 다른 프로모터의 조절하에서(도2B) 교호적인 신호서열을 갖고 (도2A) ; 변성된 천연 tox34신호서열을 갖는 (도2C) tox34를 발현하는 바쿠로바이러스 재조합체의 폴리헤드린 유전자 영역을 나타내는 개략도이다. 각각의 바이러스 이름은 왼쪽에 제시된다. 모든 재조합 바이러스는 폴리헤드린 유전자(polh)와 이의 프로모터(pp)에 대해 반대배향의 상향 AcMNPV 게놈으로 삽입된 독소 유전자를 함유한다. 신호 서열(상기에 라벨화됨)과 독소 발현(화살표로 하기에 라벨화됨)을 이끌기 위해 사용된 프로모터는 각각의 재조합체에 제시된다.

도 3은 SF-21 세포에서 Tox34의 발현과 분비에서 다른 곤충 신호 서열의 효과를 설명하고 있다. 표시된 바이러스로 감염된 SF-21세포로부터 세포 용해질(레인 1-6)또는 상청액(레인 7-12)은 감염 후 48h (p.i.)에 거두어지며, 단백질은 SDS-PAGE에 의해 분리되고 면역 브로팅에 의해 시각화되었다.

도 4A-4B는 TN-368세포에서 Tox34 발현과 분비에 대한 다른 프로모터의 효과를 설명하고 있다. 표시된 바이러스로 감염된 TN-368세포로부터 세포 용해질(도 4A)또는 상청액(도 4B)은 표시된 시간 후 감염에서 거두어졌다. 단백질은 SDS-PAGE에 의해 분리되고 막에 반점이 생기고 Tox34로 향하는 항체로 검사되었다. Tox34와 이의 전구물질(pTox34)형태는 오른쪽에 표시되었다.

도 5는 vDA26tox34-또는 vHSP70tox34-감염된 SF-21 또는 TN-368 세포로부터 Tox34의 분비된 수준의 비교를 제공한다. SF-21(레인1-10) 또는 TN-368(레인 11-20)세포는 vDA26tox34 또는 vHSP70tox34로 감염되고 상청액은 표시된 시간 p.i.에서 수집되었다. 상청액 프랙션에서 단백질은 농축되고 SDS-PAGE에 의해 분리되고 막에 반점이 생겼다. Tox34는 정제된 Tox34에 특이적인 항체를 사용하여 검출되었다.

도 6A-6B는 Tox34 단백질의 발현과 분비에 대한 본래의 tox34 신호서열에서 보완적인 TAAG 서열의 효과를 설명하고 있다. 18,24 및 48h p.i.에서 표시된 바이러스로 감염된 TN-368세포로부터 세포 용해질(도 6A) 또는 상청액(도 6B)에서 단백질은 SDS-PAGE에 의해 분리되고 막으로 이송되어 항-Tox 34 항체로 검사되었다.

도 7은 재조합 HzSNPV 바이러스를 제조하기 위해 사용된 플라즈미드 전이 벡터를 나타내는 도표이다. 플라즈미드 pHzEGT는 완전한 egt 유전자를 함유하는 반면에 모든 다른 것들은 egt 유전자에서 제거 및/또는 삽입을 함유한다. 바이러스 서열은 왼쪽에서 pBluescript KS의 EcoRI부위에 삽입되었고 반면에 오른쪽에서 접합은 바이러스 Sal I 부위와 벡터 X hoI 부위의 융합이다. 바이러스 DNA삽입으로 표시되는 제한 부위는 SalI(S), Bsu36I(Bsu)및 Sse8387I(Sse)이다. 프로모터(hsp70, DA26 또는 p6.9)는 어둡거나 진한 박스에 의해 제시되는 반면에 외부 유전자 삽입(GUS 또는 tox 34)는 개방박스에 의해 표시된다.

도 8은 감염된 Hz세포로부터 제거된 배양물 상청액에서 EGT활성도의 평가 결과를 도시하고 있다. 세포는 거짓 감염되거나 HzSNPV 또는 AcNPV로 감염되었다. UDP-글루코스(Glc) 또는 UDP-갈락토스(Gal)는 기질로서 사용되었다. 반응 생성물은 박막 크로마토그래피에 의해 기질로부터 분리되었다. [³H]탈피 호르몬 기질의 위치는 탈피호르몬-글루코스 (E-Glc) 또는 탈피호르몬-갈락토스(E-Gal)생성물의 위치로서 오른쪽에 표시된다(E).

도 9A는 IE-1과 polh 유전자의 위치를 나타내는 HzSNPV의 HindIII 제한 지도의 도표이다[코완(Cowan)등 (1994) J. Gen. Virol. 75 : 3211-3218]. 도 9B는 Bsu36I부위(SEQ ID NO:22)를 함유하는 Hind III-C의 2.1kB ClaI입자의 5'말단의 뉴클레오티드 서열을 제공한다.

도 10A-10B는 HzSNPV egt유전자의 뉴클레오티드 서열과 유래된 아미노산 서열을 제공한다. 예견된 전이 출발과 정지 코돈과 잠재적인 폴리아데닐화 부위는 굵은 형이다. EGT코딩서열에서 SalI부위는 이중선에 의해 표시된다. SEQ ID NOS :23 및 24를 참조바람.

도 11A는 서열 정보가 이용가능한 바쿠로바이러스 에크디스테로이드 (ecdysteroid) 글리코실 전이효소의 계통발생 계도이다. 1538의 길이와 0.81의 밀도지수를 갖는 가장 간단한 계도는 Branch and Bound Search Program of Paup 3.1을 사용하여 구축되었다[스워포드, 디.엘.(Swofford, D.L.)(1993) Phylogenetic analysis using parsimony 3.1버젼, 일리노이, 샴페인, Illinois Natural History Survey에 의해 분배된 컴퓨터 프로그램]. 선위의 숫자는 결절과 바이러스 사이의 변화 숫자인 반면에 선아래 밑줄 그어진 숫자는 100복제를 갖는 부트스트랩 (bootstrap)분석 후 그 집단의 빈도를 나타낸다. 도 11B는 에크디스테로이드 UDP글루코실 전이효소의 정렬된 아미노산 서열을 나타낸다. 분석된 EGT 서열은 AcMNPV[오레일리(O'Reilly)와 밀러 (1990) J. Virol. 64 : 1321-1328]; Buzura suppressaria NPV, BsSNPV[휴(Hu)등(1997) Virus Res. 47 : 91-97]; Bombyx mori NPV, BmNPV[Genbank Accession No. L33180]; Choristoneura fumiferana NPV, CfMNPV와 이와 관련된 결손 바이러스, CfDEF브레트 (Barrett) 등 (1995) J. Gen. Virol. 76 : 2447-2456]; Lymantria dispar NPV, LdMNPV[리겔(Riegel)등 (1994) J. Gen. Virol. 75 : 829-838]; Mamestra brassicae NPV, MbMNPV[클레르크(Clarke)등 (1996) J. Gen. Viol이. 77 : 2865-2871]; Orgyia psedotsugata NPV, OpMNPV[아렌(Ahrens)등(1997) Virology 229 : 381-399; Genbank Accession No. U75930]; S.littoralis NPV, SlMNPV[페토르(Faktor)등 (1995)Virus Genes 11 : 47-52] 및 Lacanobia oleracea GV, LoGV[Genbant Accession No. Y08294] 등을 포함한다.

[발명의 요약]

본 발명의 목적은 선행기술 바이러스에 의한 감염보다 감염된 곤충이 섭취를 중지하고 빨리 죽는 결과를 가져오는 선행기술 바이러스에 의해 가능하게 되는 것보다 빠른 시간에 독소 서열의 충분한 발현이 있도록 독소 코딩 서열의 발현을 가능하게 하는 프로모터의 조절하에서 곤충 특이적 독소 유전자를 함유하고 발현하기 위한 유전공학적으로 처리되는 바쿠로바이러스를 제공하는 것이다. 상세하게 예시된 바와같이, 발현된 독소 유전자는 Pyemotes 속과 같은 곤충-기생 진드기, 특히 Pyemotes 속의 ventricosus군으로부터 발현된 것이다. 특이적인 실시예에서 곤충-특이적 마비 신경독소 코딩서열은 Pyemotes tritici로부터 유도된 Tox34이고 ; 이 코딩 서열은 SEQ ID NO:1에서 제공되며; 곤충 마비 신경독소 코딩서열의 제 2 특이적 실시예는 Pyemotes tritici로부터 여기에서 Tox21a로 언급된다(SEQ ID NO : 3 SEQ ID NO:4). 선행기술에서 진드기로부터 다른 곤충-특이적 마비 신경독소 코딩서열은 여기에 제공된 서열정보를 사용하여 하이브리다이제이션(Hybridization) 실험으로 측정된 바와같이 [예를들면, 햄스(Hames)와 히긴스(Higgins)(1985) Hybridiztion, IRL Press, 워싱톤 디씨]뉴클레오티드 서열 상동관계(homology)에 의해 분리되고 입증될 수 있다고 이해될 것이다. SEQ ID NO:1에서 코딩 서열에 대해 최소한 70%뉴클레오티드 서열상동관계를 갖고 곤충에서 실질적으로 유사한 생물학 활성도를 갖는 독소를 엔코드하는 곤충-육식 진드기로부터 곤충-특이적 마비 독소 코딩 서열은 본 발명의 범위내에 있다.

여기에 기술된 바와같이, 이치 진드기 독소 코딩 서열에서 재조합 HzSNPV는 AcMNPV 6.9K 프로모터 또는 열충격 프로모터, 바람직하게는 곤충 열 충격 유전자 또는 hsp 70, hsp 83, hsp 22 또는 hsp 23과 같은 유전자 과(family)로부터의 규정조절하에서 발현된다. 바람직한 열 충격 프로모터는 Drosophila melanogaster hsp 70 프로모터이다. 곤충-특이적 독소 유전자가 D. melanogaster hsp70 프로모터 또는 AcMNPV 6.9K 프로모터(또는 DA26 프로모터)와 같은 프로모터의 조절하에서 발현되는 바쿠로바이러스는 곤충 방제제로서 선행기술 바쿠로바이러스 보다 개선되었다. 이들 재조합 HzSNPV 유도체는 진드기 독소 코딩 서열이 폴리헤드린 프로모터와 같은 매우 느린 프로모터의 조절하에서 발현되는 것보다 빠른 곤충마비와 살멸을 일으킨다.

예시된 AcMNPV와 HzSNPV와 다른 곤충 방제를 위한 유전학적으로 처리된 바쿠로바이러스는 선행기술에 잘 알려진것으로 만들어진 명세서의 설명을 사용하여 생성될 수 있다. tox34와 tox21a 코딩 서열에 의해 엔코드되는 것과 다른 독소는 독소 코딩 서열이 느리거나 매우 느린 프로모터의 규정조절하에서 삽입된 바쿠로바이러스와 비교할 때 살멸 특성을 생성하기 위해 여기에 개시된 바와 같이 열충격 프로모터, 바람직하게 hsp 70 프로모터 또는 6.9K 또는 DA 26 프로모터의 규정 조절하에서 삽입될 수 있다.

본 발명은 곤충-특이적 마비 신경독소용 코딩서열을 포함하는 재조합 DNA를 포함하고 여기에서 상기 엔코드된 곤충-특이적 마비 신경독소가 바람직하게 동물, 보다 바람직하게는 곤충, 특히 Drosophila hsp70 프로모터 또는 AcMNPV 6.9K 프로모터로부터 열 충격 프로모터의 규정조절하에서 발현된다. DA26 프로모터도 사용될 수 있다. 특히, hsp70 프로모터는 광범위한 종으로부터 곤충세포에 잘 발현된다. 즉, 이 프로모터의 규정조절하에서 곤충-특이적 독소를 발현하는 유전학적으로 처리된 바쿠로바이러스는 마비가 일어나는 시간과 이러한 유전학적으로 처리된 바쿠로바이러스가 곤충방제제로서 효과적인 점에서 놀랍게 개선된다. 이러한 유전학적으로 변성된 바쿠로바이러스의 특히 바람직한 실시예는 폐색된 AcMNPV와 HzSNPV유도체이고; 예비폐색된 바이러스는 곤충 독소 조성물과 같은 것을 사용하는 해충의 방제방법에 또한 유용하다. 비폐색된 핵 다면성비루스증 또는 과립증 바이러스 유도체의 어떤 예에서, 당업자는 과도한 실험 비용없이 유사한 폐색된 바이러스를 제조하는 방법을 이해하고 있다.

다른 바쿠로바이러스의 유전자 사이에 유의성 있는 동족관계가 있으므로 당업자는 유사한 중요하지 않은 위치에서 다른 바쿠로바이러스의 게놈내로 적당한 프로모터에 결합된 독소 유전자를 삽입하는 방법을 또한 이해할 것이다.

따라서, 본 발명은 특히 폴리헤드린 유전자와 같은 다른 프로모터와 비교할 때 감염후 상대적으로 이른 시간에 강한 유전자 발현을 가능하게 하는 프로모터의 규정 조절하에서 유전자 엔코딩 곤충-특이적 독소, 바람직하게는 마비 신경독소를 함유하고 발현하기 위해 유전학적으로 변성된 바쿠로바이러스를 포함한다.

상세하게 예시된 바와같이, 본 발명은 Pyemotes 속 진드기, 특히 Pyemotes tritici 종의 진드기의 곤충-특이적 마비 신경독소용 코딩 서열을 함유하고 발현하기 위해 유전학적으로 변성된 바쿠로바이러스를 제공한다. 상세하게 예시된 독소 코딩서열은 약 뉴클레오티드 120에서 엔코드된 아스팔테이트로부터 약 뉴클레오티드 873에서 엔코드된 시스테인까지 SEQ ID NO:1에 주어진 바와같은 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 곤충-육식 진드기의 곤충-특이적 신경독소용 선택적인 코딩서열은 약 뉴클레오티드 120에서 엔코드된 아스팔테이트로부터 약 뉴클레오티드 873에서 엔코드된 시스테인까지 SEQ ID NO:3에 제시된 바와같은 것이다. 또한 본 발명의 범위내에 SEQ ID NO:1과 SEQ ID NO:3에 제공된 바와같이 예시된 코딩서열에 대한 최소한 약 70% 뉴클레오티드 서열 동등성을 갖는 진드기 독소 코딩 서열이 있다.

예시된 바와같이, 바쿠로바이러스 유도체는 NPV바쿠로바이러스, 상세하게는 AcMNPV유도체 또는 HzSNPV유도체이다.

본 발명의 또 다른 목적은 표적된 곤충에 독성효과를 가져오는 수준으로 곤충-특이적 마비 신경독소를 발현하기 위해 유전학적으로 처리되고 농경적 또는 그렇지 않으면 환경적으로 수용가능한 캐리어인 바쿠로바이러스의 곤충-독성량을 포함하는 곤충-독성 조성물이다. 이러한 조성물은 해충으로부터 식물보호를 위해 사용될 수 있다. 바람직한 방제제는 곤충-마비 진드기 특히 Pyemotes 속 진드기로부터 곤충-특이적 마비 신경독소 유전자를 발현하는 것이다. 바쿠로바이러스 입자는 폐색 또는 예비폐색된 형태로 존재된다. 상세하게 예시된 바와같이, 바쿠로바이러스 유도체는 AcMNPV유도체 또는 HzSNPV유도체이고 재조합 바이러스는 선행기술 바이러스에 의해 가능하게 되는 것보다 이른 시간에 곤충-독소 또는 곤충마비 수준으로 곤충-특이적 독소를 발현한다.

본 발명의 또 다른 목적은 선행기술 바이러스에 의해 가능해지는 것보다 이른 시간에 효과적인 양으로 곤충-마비 진드기로부터 곤충-특이적 마비 신경독소 유전자와 같은 곤충-선택적인 독소 유전자를 발현하기 위해 유전학적으로 처리된 바쿠로바이러스의 곤충-독성량을 함유하는 곤충-독소 조성물을 살포하는 단계를 포함하는 해충의 생물학적 방제 방법을 제공하는 것이다. 이러한 곤충-독성 조성물은 표적곤충, 곤충 서식지 근처 또는 해충으로부터 보호되어야 할 지역, 식물 또는 환경에 살포된다. 상기 조성물에서 상기 바쿠로바이러스 유도체의 양과 바쿠로바이러스의 서열을 코딩하는 상기 독소의 발현 수준은 상기 조성물이 표적 곤충에 독성 효과를 가져오고 감소, 보다 바람직하게는 섭취 중지를 가져온다. 바람직한 바쿠로바이러스 유도체는 AcMNPV유도체와 HzSNPV유도체를 포함한다. 유전학적으로 변경된 핵 다면성비루스증 바이러스의 폐색된 형태는 본 발명에 가장 유용하다. 당업자는 곤충독소를 발현하는 유전학적으로 변경된 바이러스는 그 스스로 폐색할 수 있거나 그 폐색은 예를들면 폐색-양성 바이러스를 갖는 공동감염 같은 다른 방법에 의해 달성될 수 있음을 이해하고 있다. 독소 코딩 서열 발현에 유용한 프로모터는 열충격 프로모터, 바람직하게는 동물세계, 더욱 바람직하게는 곤충, 바람직하게는 hsp70, hsp83, hsp22 및 hsp23 유전자과(family), 예를들면 D. melanogaster hsp70 프로모터로부터의 것을 포함한다. 곤충-특이적 독소 유전자 발현의 조절에 특히 바람직하게 유용한 것은 상대적으로 강하게 구성적으로 발현된 열충격 프로모터이다. 그러나, 많은 열 충격 프로모터 서열은 잘 알려져 있고 선행기술로부터 입수가능하다. 바람직하게, 곤충 독소 코딩서열은 Drosophila melanogaster hsp70 프로모터 또는 AcMNPV 6.9K 프로모터의 규정조절하에서 발현된다. 본 발명은 상기 해충의 서식지, 예를들면 식물에 본 발명의 살충 조성물의 곤충-독성량을 도포하는 단계를 포함하는 해충의 방제방법을 포함한다.

유사하게, 본 발명은 신경-특이적 마비 신경독소 코딩 서열을 발현하기 위해 유전학적으로 변경된 바쿠로바이러스를 제공하고 이는 식물에 대해 공격적이거나 해로운 것들과는 달리 해충에 대해 효과적인 것이 목적이다. 이러한 제제는 본 기술분야에서 이해되는 바와같이 환경적으로 수용가능한 캐리어와 함께 곤충-독성, 곤충-마비 또는 살충 조성물에 도입될 수 있고 사용된 특정 바쿠로바이러스에 대해 가능한 표적 해충을 방제하기 위한 방법에 사용될 수 있다. 예를들면, 각각의 모기와 벼룩을 특별히 감염시키기 위해 알려진 바쿠로바이러스이다. 비어드(Beard)등 (1989) J. Invertebrate Path. 54 : 128-131과 페데리치(1980) Virology 100:1-9를 참조바람. 표적 곤충은 마비 독소를 발현하기 위해 변성된 특정 바쿠로바이러스의 선택에 보통의 당업자를 안내한다.

본 발명의 재조합 바쿠로바이러스, 살충 조성물 및 방법에서 특히 바람직한 것은 곤충-특이적 신경독소 코딩 서열이 발현되고 에크디스테로이드 UDP-글리코실 전이효소 유전자가 불활성되는 바쿠로바이러스이다.

생물학적 곤충 방제제는 해충 방제에 효과적인 제제이다. 여기에 사용된 바와같이, 곤충 방제제는 독소 유전자 발현의 보다 높은 수준을 촉진하는 프로모터의 사용으로 인한 선행기술 바쿠로바이러스보다 빠른 시간과 이미 기술된 바쿠로바이러스보다 이른 시간에 섭취중단, 곤충마비 또는 곤충 죽음을 가져오는 방법으로곤충-특이적 독소, 바람직하게는 곤충-특이적 마비 신경독소를 발현하기 위해 유전학적으로 변성된 바쿠로바이러스를 포함한다.

방제는 섭취 행동의 제한 또는 해충의 죽음을 의미할 수 있다. 본 발명의 생물학적 곤충 방제제는 최소한 부분적으로 곤충-특이적 독소 코딩 서열의 발현에 기여가능한 곤충-독소 효과를 갖는다. 곤충-독소 효과는 표적 곤충에 대한 어떤 역 효과에 관한 것이고 마비 및/또는 곤충의 죽음으로써 또는 섭취행동, 정당한 반응 또는 다른 진부한 행동과 같은 표적 곤충의 정상적인 행동변화로써 관찰가능하다. 이러한 독소효과는 독소코딩서열의 조기 및 충분한 발현에 기인하여 생기게 된다.

곤충-육식 진드기는 곤충을 섭취하는 진드기이다. 이러한 진드기중 많은 것은 그들이 섭취하는 곤충 숙주에 독액을 주입한다. 이러한 독액은 숙주곤충을 이동할 수 없게 하기위해 곤충-특이적 마비 신경독소를 함유한다. 곤충-특이적 마비 독소 유전자를 발현하는 진드기는 P. anobii, P. beckeri, P. emerginatus, P. schwerdtfegeri, P. tuberculatus, P. tritici, P. ventricosus 및 P. zwoelferi를 포함하는 ventricosus 그룹의 것들을 포함한다.

곤충-특이적 마비 신경독소는 민감한 곤충 유충 또는 성충의 마비를 일으키는 폴리펩티드이지만 다른 유기체에 대해 어떤 유의한 독성 효과도 갖지 않는다. 마비 효과는 초기에 섭취행동을 포함하는 운동성 또는 다른 행동에 대한 효과로서 관찰될 수 있다. 곤충-특이적 신경독소는 역으로 곤충에 영향을 미치는 것이고 고등동물, 특히 포유류에는 무시해도 좋은 효과를 갖는다. 본 발명의 곤충-특이적 마비 신경독소는 특히 Tox34와 Tox21a 및/또는 P. tritici에 의해 생성된 TxP-I와 TxP-Ⅱ단백질에 의해 예시된다. 2개의 대표적인 곤충-특이적 마비 단백질에 대해 유래된 아미노산 서열은 SEQ ID NO:2와 SEQ ID NO:4로 표시된다. 기능적으로 본 발명의 신경독소와 동일한 독소는 Tox34와 Tox21a에 의해 발생되는 바와같이 곤충에서 유사한 근육 수축성 마비를 가져온다. 어떤 아미노산 치환은 단백질 기능에 영향을 미치지 않고 단백질 서열로 만들어질 수 있다고 생물학적 선행기술에 잘 알려져 있다. 일반적으로, 보수적인 아미노산 치환 또는 유사한 아미노산의 치환은단백질 기능에 영향을 미치지 않고 허용된다. 유사한 아미노산은 크기 및/또는 전하 성질이 비슷한 것, 예를들면 아스파르테이트와 글루타메이트이고 이소레우신과 발린은 유사한 아미노산 쌍이다. 아미노산쌍 사이의 유사성은 많은 방법으로 선행기술에서 평가되어 왔다. 예를들면, 여기에 참고로 도입된 데이호프(Dayhoff)등 (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure, 5권, suppl. 3, 22장, pp345-352는 아미노산 유사성의 측정으로서 사용될 수 있는 아미노산 치환을 위한 주기표를 제공한다. 데이호프 등의 주기표는 진화론적으로 다양한 다른 원(source)으로부터 같은 기능을 갖는 단백질용 아미노산 서열의 비교에 기초를 둔다.

여기에 정의된 바와같이 곤충-특이적 마비 신경독소의 추가적인 기능등가는 Tox34 또는 Tox21a로 입증된 아미노산 서열의 단백질을 갖는 폴리펩티드를 포함하거나 폴리펩티드 그 자체는 전체길이 TxP-I단백질의 단백질이거나 Tox34 또는 Tox21a단백질의 아미노산 서열내로 삽입이 이루어지며 이들 실시예에서 생물학적 활성도, 수축성 근육 마비를 갖는다.

곤충-특이적 마비 신경독소 유전자는 표 1에 기재된 것으로 제한된 것은 아니지만 특히 ventricosus 군, 또는 다른 곤충 기생충 또는 육식동물의 것들을 포함하는 곤충-육식 진드기에서 발견될 수 있다. 본 발명의 tox34와 tox21a에 일치하는 유전자는 본 발명에 기술된 서열에 핵산 하이브리다이제이션 또는 본 발명의 독소에 특이적인 항체를 갖는 독소분자의 교차반응 또는 여기에 예시된 독소 유전자의 유지되거나 명백한 부위에 해당하는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 수행된 PCR기술의 사용을 포함하는 본 기술분야에 알려진 다른 방법에 의해 진드기 또는 다른 원으로 입증될 수 있다. 원리상, 곤충-특이적 마비 신경독소 유전자는 확인될 수 있고 그 유전자는 바쿠로바이러스 벡터로 발현된다. 발현된 단백질의 생물학적 활성도는 쉽게 측정되고 유사하게 이러한 유전학적으로 변성된 벡터의 효능은 기술분야에 잘 알려진 기술과 협력하여 본 발명의 기술을 사용하여 평가될 수 있다.

다른 알려진 곤충-특이적 독소는 전갈과 거미의 독소를 포함한다[예를들면 보기스(Bougis)등 (1988) Proc. World Congress on Animal Natural Toxins, pp.94-101; EP 417, 906;및 EP 507,207]. 공개된 코딩서열과 재조합 바쿠로바이러스의 기능적인 등가는 본 기술분야, 예를들면 진드기 독소용으로 상기에 기술된 것과 유사한 방법으로 잘 알려진 기술과 정보를 사용하여 당업자에 의해 생성될 수 있다.

여기에 사용된 바와같이 재조합 DNA분자는 원래 발생하지 않고 알려진 방법을 사용하여 자연과정에 의해 생성되거나 이종원(heterologous source)으로부터 파생된 부분으로부터 바람직한 결과 또는 인공적으로 생성하기 위해 사람들에 의해 행해지고, 이 부분은 자연적으로 발생하거나 화학적으로 합성된 분자이고 여기에서 이러한 부분은 결찰 또는 기술분야에 알려진 다른 방법에 의해 결합된다.

곤충-특이적 마비 신경독소 유전자와 같은 곤충-특이적 독소 유전자를 함유하고 발현하기 위해 유전학적으로 변성된 것은 단백질과 같은 것을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 의미하고 이의 합성 방향은 변성된 바쿠로바이러스가 신경독소 단백질을 생성할 수 있도록 바쿠로바이러스 게놈에 도입된다.

본 발명에서, 프로모터 및/또는 프로모터 관련된 서열은 유전자 발현을 나타내는데 즉, 감염된 표적곤충에서 곤충-특이적 독소를 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전사와 전이를 조절한다. 특히, 바람직한 프로모터는 hsp70, hsp83, hsp22 및 hsp23 유전자과, 특히 Drosophila melanogaster hsp70 프로모터 및 AcMNPV(또는 다른 바쿠로바이러스)6.9K 프로모터와 같은 열충격 프로모터이다. 또 다른 한편으로 바쿠로바이러스 DA26 프로모터가 사용될 수 있다.

당업자의 목표는 특정한 규정 서열 및/또는 프로모터의 선택을 결정하는 것으로 이해될 것이다. 예를들면, 바쿠로바이러스 프로모터에 있어서, 높은 수준의 발현이 요구된다면 감염후 매우 이른 시기에 발현되고 광범위한 곤충세포에 있는 특히 강한 프로모터가 적당하다. 이것은 가능한한 짧은 시간으로 곤충 유충의 섭취를 제한하는(또는 곤충 바이러스의 효과적인 숙주 범위를 확장시키는)목표와 일치한다.

Autographa californica(Lepidoptera:Noctuidae)로부터 분리된 NPV 바쿠로바이러스, 특히 AcMNPV는 본 발명의 발표에 예시된다. 용어 AcMNPV와 AcNPV는 같은 뜻이다. 대부분의 NPVs의 감염은 원래숙주의 속,과 또는 목의 일부로 제한되는 것으로 보고되었다. AcMNPV 바쿠로바이러스는 몇가지 Lepidoptera의 과로 복제하지만 그들의 감염성은 그 목으로 제한되는 것으로 보고되었다. 살충제로서 개선된 효능을 달성하기 위해 변성된 특이적으로 예시된 바쿠로바이러스는 면화씨벌레 Helicoverpa zea로부터 분리된 HzSNPV이다. HzSNPV는 Helicoverpa(Heliothis)의 대부분의 종을 감염시키고 죽인다. 1970년대 중반에, HzSNPV는 면화씨벌레의 만연을 방제하기 위해 Sandoz Corp.에 의해 살충제(Elcar^TM)로서 등록되고 상업적으로 생산되었다[Ignoffo, C.M.(1981) Living Microbial insecticides. In : Essays in Applied Microbiology(eds. J.R Norris and M.H Richmond) John Wiley & Sons, 뉴욕, pp.2-31]. 그러나 이 생성물은 새롭게 도입된 피레트로이드 살충제와 성공적으로 경쟁하지 않았다. Elcar^TM의 나쁜 시장성은 부분적으로 바이러스가 화학적 살충제를 접촉시키는 것과 비교하여 해충을 죽이는 속도가 느리기 때문이고; 바이러스 살포와 곤충 살멸 사이의 지연은 중요한 수확물 손상을 가져온다[밀러, 엘.케이(1995) J. Invertebr. Pathol. 65 : 211-216].

본 기술은 바이러스 복제 기능을 방해하지 않는 부위에 바이러스 게놈내에 발현가능한 유전자를 삽입하는 방법을 이해하고 있다. 유사하게, 당업자는 소정의 바쿠로바이러스 벡터에서 곤충-특이적 독소 유전자의 발현을 유도하기 위해 소정의 강도와 일시적인 발현을 갖는 프로모터를 선택할 수 있다. 표적 곤충은 선택된 바이러스를 규정하고 처리된 특정 바이러스는 적당한 프로모터의 선택에서 당업자를 안내할 것이다.

많은 프로모터는 재조합 바쿠로바이러스 시스템에서 이종 코딩 서열의 발현을 조절하기 위해 사용된다. AcMNPV와 같은 바이러스용 바이러스 프로모터의 3종류는 초기, 후기 및 매우 후기 프로모터이다[예를들면 Morris와 Miller(1992) J.Virol. 66 7397-7405를 참조]. 초기 프로모터는 미국특허 제 5,266,317호에 기술된 AcMNPV의 ETL프로모터 DA26프로모터 및 IE0,IE1과 IEN 프로모터를 포함한다[오레일리 등(1990) J. Gen. Virol. 71 : 1029-1037 ; 카르손(Carson)등(1991) J.Virol. 65 : 945-951 ; 코바크스(Kovacs)등(1991) J. Virol. 65 : 5281-5288]. 후기 AcMNPV프로모터는 6.9K, 캡시드 (vp39)프로모터를 포함한다[Hill-Perkins와 Possee(1990) J. Gen. Virol. 71 : 971-976 ; 티엠과 밀러(1989) J. Virol.63 : 2008-2018]. 매우 후기 프로모터는 폴리헤드린 합성 프로모터를 포함한다[미국특허 제 5,244,805, 1993년 엘. 밀러에게 허여됨]과 변성된 폴리헤드린 프로모터 LsXIV[오이등 (1989) J. Molec. Biol. 210 : 721-736; 미국특허 제 5,244,805(1993년 엘. 밀러에게 허여됨)]. AcMNPV에 예시된 바와같이 매우 후기 바쿠로바이러스 프로모터는 폴리헤드린과 p10프로모터[켈리(Kelly)와 레스코트(Lescott) (1981) Microbiologica 4 : 35-57 ; 밀러, 엘. 케이.(1988) Ann. Rev. Microbiol. 42 : 172-199; 보닝(Bonning) 등 (1994) J. Gen. Microbiol. 75:1551-1556]. 후기 및 매우 후기 유전자 발현의 설명을 위해 티엠과 밀러(1990) Gene를 또한 참조 바람. Baculoviruses, ed., 엘. 에이. 밀러, Plenum Press, 뉴욕, 1997을 참조.

하향으로 실시가능하게 결합된 코딩 서열의 구성적인 발현의 유의한 수준을 갖는 열 충격 프로모터는 hsp70 프로모터, 특히 D. melanogaster hsp70 프로모터에 의해 예시된다[예를들면 토에레크(Toerek)와 카르크(Karch) (1980). Nucl. Acids Res. 8 : 3105-3123]. 이 프로모터는 성공의 정도를 다양하게 하면서 재조합 바쿠로바이러스 벡터에서 이종 코딩 서열의 발현에 사용되어 왔다[모리스와 밀러(1992) supra].

열 충격 유전자의 일반적인 설명에서, 그들에 의해 유도된 프로모터와 이종 발현은 예를들면 노버 엘.(Nover. L.)(1987)Enzym. Microb. Technol. 9 : 130-144; 아민(Amin)등 (1988) Mol. Cell. Biol. 8 : 3761-3760 및 상기 참고문헌에 언급된 참고문헌을 참고하고 그들 중 모두는 전체적으로 여기에 참고로 도입된다. Drosophila와 하향 유전자 발현의 상대적으로 높은 구성 수준이 있는 것이 다른 유기체에서 hsp70의 일반적인 성질이다. 다양한 곤충, 동물, 식물 및 효모원으로부터 hsp 프로모터와 프로모터 관련된 서열은 본 기술분야에 잘 알려져 있다.

본 출원의 문맥에서 재조합 DNA분자는 인간 개입을 통해 생성되고 이것은 원래 공유적으로 결합되거나 연결되지 않은 뉴클레오티드 서열을 함유한다. 화학적 합성 또는 시험관내 효소 결찰은 결합에 효과적일 수 있거나 재조합은 투입서열이 실험실에서 단일 세포로 도입될 때 달성될수 있고 예상된 결과는 분석되고 정제된다.

여기에 사용된 바와같이, 곤충 방제제는 조성물 또는 해충에 역효과를 갖는 조성물의 활성 성분이다. 곤충에 의한 섭취는 발현된 독소의 결과로서 본 발명의 유전학으로 처리된 바쿠로바이러스에 대해 감소되고 곤충의 죽음이 이어진다. 본 발명의 곤충방제제는 바람직하게 곤충-특이적 독소를 엔코딩하는 이종 유전자를 발현하기 위해 유전학적으로 처리된 곤충 바이러스이다. 이러한 독소 단백질의 특이적인 예는 제한된 것은 아니지만 각각 SEQ ID NO:2와 SEQ ID NO:4에 기술된 아미노산 서열을 갖는 Tox34와 Tox21a뿐만 아니라 알려진 전갈과 거미독소에 포함한다.

HzSNPV가 egt유전자를 소유하고 발현하는지 측정하기 위해 감염되지 않거나 감염된 HzUNDK세포로부터 상청액에서 EGT활성도 존재는 [³H]에크디손과 기질로서 UDP-글루코스 또는 UDP-글루코스를 사용하여 효소 평가에 의해 측정되었다. 기질로서 UDP-글루코스를 사용하여 AcMNPV-와 HzSNPV-감염된 세포로부터 상청액은 에크디손을 에크디손-글루코스 결합체로 상기에 입증된 변경된 극성의 생성물로 전환시켰다(도 8). EGT활성도는 감염되지 않은 HzUNDK세포에서 관찰되지 않고 HzSNPV는 감염동안 EGT활성도를 야기시키고 egt유전자를 소유한다고 나타낸다. UDP-갈락토스가 기질로서 사용될 때 AcMNPV-감염된 세포 추출물에서 EGT활성도는 에크디손-갈락토스 결합체를 형성할 수 있지만 HzSNPV-감염된 세포는 기질로서 UDP-갈락토스를 사용할 수 없고(도 8) AcMNPV와 HzSNPV EGTs의 기질 특성에 차이를 나타낸다[오레일리(O'Reilly)등(1992) Insect Biochem. Molec. Biol 22 : 313-320].

HzSNPV의 Elcar분리물의 제한 소화는 크넬(Knell)과 서머스(Summers)(1984) J. Gen. Vinol. 65 : 445-450과 코완등(1994) J. Gen. Virol. 75 : 3211-3218에 의해 상기에 기술된 분리물과 동일했다. 전체 HzSNPV게놈을 대표하는 중첩하는 코스미드 세트는 분리되고 특징되었다. HzSNPV게놈의 기본적인 물리적 지도는 확인되고 개량되었다(도 9A). 폴리헤드린 유전자(polh)부위, 예를들면 IE1유전자에서 유전자는 통상적인 AcMNPV지도에 대해 역순으로 알려져 있다. [코완등 (1994) supra]. 써던 블롯(southern blot)에 대한 하이브리다이제이션 프로브로서 ACMNPV egt 유전자를 사용하는 것은 사용된 조건하에서 강한 하이브리다이제이션 신호를 제공하는데 실패했다. egt유전자를 지도화하기 위한 대안적인 접근으로서 polh유전자와 측면에 접하는 부위에 해당하는 코스미드 플라즈미드 클론은 egt유전자의 보존된 부분으로부터 일치 서열에 기초를 두고 만들어진 퇴보된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 스크린되었다. HindIII-J부터 -E입자까지 이루어진 HzSNPV코스미드와 주형으로서 HindIII-C입자를 함유하는 플라즈미드 클론을 사용하는 PCR증폭은 egt유전자에 대해 기대되는 크기의 PCR생성물을 생산했다. PCR생성물 중 하나는 클론되고 서열화되었으며 egt유전자를 함유하는 것으로 발견되었다. 생산된 서열은 전체 HzSNPV egt유전자의 서열화를 가능하게 하는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 제조하기 위해 사용되었다. egt유전자는 전체적으로 EcoRI Q입자내에 위치되고(도 9A) polh와 IE1 유전자와 같이 동일한 성분으로부터 전사된다. HzSNPV egt의 DNA 서열은 도 10A-10B에 제시되고; SEQ ID NOs : 23과 24를 참조하라. 다른 알려진 EGTs를 갖는 HzSNPV EGT의 퍼센트 서열 동질성과 유사성은 표 7에 제시되고 도 11은 몇가지 바쿠로바이러스 egt 유전자의 아미노산 서열 비교에 기초하여 계통발생학적 계보를 나타낸다.

HzSNPV 게놈은 HindIII-C 입자내에 위치된 Sse8387I 부위와 단일 Bus36I 부위를 갖고 있지 않은것으로 발견되었다(도 9A). 제한 부위를 둘러싸고 있는 서열은 측정되었다(도 9B). 그 영역은 50코돈 이상의 개방 판독 프레임(ORFS)을 함유하지 않고 컴퓨터 분석에 의한 다른 알려진 바이러스 유전자를 갖는 어떤 유사성도 나타내지 않았다. 이 부위는 제한 소화, 3bp 결합 말단에 충전 및 재결찰에 의해 바이러스 게놈으로부터 제거되었다. 결과로 생긴 바이러스가 부족한 Bus36I 부위, HzSNPV (Bus36I')의 감염성과 병독성은 H. zea 유충에서 각각 LC₅₀s와 ET₅₀s를 측정하므로서 결정되었다. Bsu36I 부위의 제거가 제시된 복제 LC₅₀분석(표 6과 7)은 바이러스의 감염에 거의효과를 갖지 않거나 어떤 효과도 갖지 않았으며 변성된 바이러스의 병독성을 나타내는 복제 ET₅₀평가(표 8과 9)는 또한 기본적으로 변경되지 않았다. Bus36I'바이러스는 직접적인 크로닝에 의해 바이러스 게놈내로 유전자를 삽입시키기 위한 능력이 구성 중인 바이러스 재조합체의 빠르고 유용한 방법을 제공하기 때문에 모든 연속적인 바이러스 구조의 구성에 사용되었고[어니스트(Ernst)등 (1994) Nucl. Acids Res. 22 : 2855-2856 ; 루(Lu)와 밀러(1996) Biotechniques 21 : 63-68] Bsu36I' 바이러스의 egt영역으로 Bus36I와 Sse8387I부위의 삽입은 이 영역내로 직접적인 클로닝을 단순화시킨다.

유전학적으로 HzSNPV를 처리하는 다음 단계는 마커 유전자, E.coli GUS유전자를 GUS지시자, X-Gluc(실시예 4를 참조)의 존재하에서 파란색을 생성하는 바이러스용 HzSNPV와 스크린의 egt유전자내로 삽입하는 것이다. 이 바이러스는 대립 유전자 치환에서 이중-교차 재조합체용 스크린으로서 흰색 플라그의 존재를 사용하여 추가적인 HzSNPV 재조합체를 구성하기 위해 모(parental) 바이러스로서 사용되었다.

egt 제거 바이러스, 3개의 tox34-발현 재조합 바이러스와 egt활동반경내에서 Bsu36I와 Sse8387I부위를 함유하는 egt 제거 바이러스는 적당한 전이 플라즈미드를 사용하여 대립 유전자 치환에 의해 구성되었다(도 7 참조). 각각의 tox34-발현 재조합체는 다른 프로모터: D. melanogaster hsp70 프로모터, 초기 AcMNPV DA26(ORF16) 바이러스 프로모터 또는 후기 AcMNPV p6.9유전자(ORF 100)프로모터를 함유했다. 이들 독소-발현 바이러스의 감염성과 병독성은 H. zea neonates에서 HzSNPV, HzSNPV(Bsu36I')와 egt 제거 돌연변이(HzEGTdel)바이러스에 비교되었다(표 8-11). LC₅₀s는 동일하지 않다면 시험된 모든 바이러스와 유사한 것으로 발견되었다. tox34를 함유하는 모든 바이러스는 유의적으로 낮은 ET₅₀s를 갖고 있는 바, 사용된 모든 3개의 프로모터는 H. zea 유충에 기능적이고 독소 유전자 발현은 사실상 ET₅₀s를 감소시킨다고 나타낸다. 바이러스 DA26 프로모터의 조절하에서 tox34를 발현하는 재조합체는 이 종(species)에서 Drosophila hsp70 프로모터의 조절하에서 tox34 유전자를 함유하는 재조합체보다 낮은 ET₅₀을 나타냈다. AcMNPV p6.9 프로모터 또한 연속적으로 hsp70보다 우수하게 수행하였으며, 비록 AcMNPV DA 26 프로모터 보다 다소 덜 효과적일지라도 유사했다. vEGTDA26tox34 바이러스는 40h이하, wt HzSNPV보다 40%이하로 ET₅₀을 감소시켰다. HzEGTdel용 ET₅₀s는 HzSNPV wt와 HzSNPV(Bsu36I')보다 낮지 않다.

HzSNPV egt 유전자는 HzSNPV지도의 93.1과 94.5 m.u.사이에 위치되고 다른 알려진 바쿠로바이러스 EGT_S로 50%이하의 서열 일치를 갖는 515 아미노산 폴리펩티드를 엔코드하기 위한 것으로 예상된다. 다른 바쿠로바이러스 egt 유전자 생성물과 같이[오레일리등(1992) Insect Biochem. Molec. Biol. 22 : 313-320], 이의 아미노 말단에서 분리가능한 신호 서열을 갖으며 C-말단 트랜스멤브레인 범위는 부족한 것으로 예상된다. HzSNPV EGT는 모든 EGTs와 UDP-글리코실 전이효소 가운데 절대적으로 유지되는 것으로 발견된 7개의 아미노산을 갖는다[오레일리, 디.알(1995) Insect. Biochem. Molec. Biol. 25 : 541-550]. 아미노산 잔기 254-267로부터 EGTs의 범위 Ⅱ[오레일리(1995)supra]는 HzSNPV EGT를 포함하는 모든 바쿠로바이러스 EGTs 중에서 가장 보존적인 범위이다. AcMNPV EGT와 비교하여[오레일리 등(1992)Insect. Biochem. Molec. Biol. 22 : 313-320], HzSNPV EGT는 기질로서 UDP-갈락토스를 사용할 수 없다. UDP-당(sugar) 결합을 위한 부위는 EGT 폴리펩티드의 범위 Ⅲ과 Ⅳ내에 위치하는 것으로 예상된다[오레일리 (1995) supra]. HzSNPV EGT는 MbNPV EGT에 대해 최고의 서열일치(70%)과 최고의 S1NPV로의 유사성을 갖는다(표 7; 계통발생론 계보용 도 11A를 참조 바람).

AcMNPV egt 유전자의 제거가 2개의 다른 종에서 이 바이러스의 LT₅₀을 감소시킬지라도 [오레일리와 밀러 (1991) BioTechnology 9 : 1086-1089], 치사율에서 비슷한 감소는 H. zea 유충에서 HzSNPV egt 제거 돌연변이에서 관찰되지 않았다. 야생형 HzSNPV가 이의 각각의 숙주에서 야생형 AcNPV보다 빠르게 작용하기 때문에 egt의 효과(예를들면 LT₅₀에서 15% 감소)는 너무나 예민하여 이종(species) 또는 이 유충 영(instar)에서 관찰되지 않는다. egt의 발현은 숙주 곤충의 탈피를 방지하는 것으로 알려져 있고 [오레일리와 밀러 (1991) supra] 또한 감염과정 동안 말피기관의 퇴화를 방지한다.

tox 34 발현 및 애벌레 마비에 대한 프로모터 의존 효과는 이미 AcMNPV [토말스키(Tomalski)와 밀러(Miller)(1992) BioTechnology 10 : 545-549 ; 루(Lu) 등(1996) BioTechniques 21 : 63-68]에서 보고되었다. Drosophila hsp70과 바이러스성 p6.9 프로모터 모두는 T. ni 및 S. frugiperda 에서 AcMNPV의 ET₅₀을 감소시키는데 polh 프로모터 보다 상당히 더 효과적으로서 p6.9 와 hsp70 프로모터의 상대적인 효능은 종-의존성이다. [루 등(1996) Biol. Control 7 :320-332]. 그러나, DA26 프로모터는 polh, p 6.9 또는 hsp70 프로모터보다 이들 두 종에 있어서, AcMNPV의 ET₅₀을 감소시키는데 덜 효과적이다. 본 발명자들은 H. zea 유충의 HzSNPV 게놈과 연계하여 Drosophila hsp70, AcMNPV DA26 또는 AcMNPV p6.9 프로모터의 방제하에서 tox34를 위치시킨 것의 효과를 비교하여 모든 독소-발현 재조합 바이러스가 wt HzSNPV와 관련하여 마비/사망으로의 효과적인 시간을 감소시켰다는 것을 발견했다. 가장 효과적인 바이러스성 프로모터는 AcMNPV DA26으로서 AcMNPV p6.9 프로모터보다 단지 약간 더 효과적이었다. D. melanogaster hsp70 프로모터는 이러한 조건하에서는 hsp70 또는 DA26 프로모터보다 약간 덜 효과적이었다. 초기 및 후기 AcMNPV 프로모터가 HzSNPV 게놈과 연계하에서 효과적이었다. 이론에 구속되지는 않지만 등가의 HzSNPV 프로모터도 AcMNPV 프로모터만큼 또 이보다 더 효과적인 것으로 예상된다.

본 발명자들은 유전공학기술을 통하여 살충제로서의 HzSNPV 특성을 성공적으로 개선시켜 제 1 재조합 HzSNPV를 제공했다. 40시간 이하의 ET₅₀에서 HzDA26tox34 재조합체가 현재까지 보고된 가장 빠른 바쿠로바이러스이다. 유전적으로 조작된 HzSNPV 유도체도 유전자 발현 벡터로서 유용하다.

tox 34를 발현하는 재조합 AcMNPV [토말스키와 밀러(1991) Nature 352 : 82-85]로 감염된 곤충세포로부터 분비된 Tox34 단백질의 성숙형태는 진드기에 의해 생성된 것과 같은 형태인 것으로 생각된다. TxP-I는 291 아미노산의 전구 단백질로서 합성된다 ; 처음 39아미노산은 성숙체 분비생성물에 없는 단일 서열이다. 성숙 Tox34는 감염된 곤충세포의 분비경로와 상호작용해야 하는 분비단백질이므로 본 발명자들은 Tox34의 발현 및 분비시에 다른 신호 펩타이드의 영향을 연구했다. 바쿠로바이러스 감염세포로 부터의 어떤 이종 단백질의 분비는 신호서열의 특성에 의해 영향을 받는 것으로 보인다. [테시어(Tessier)등 (1991) Gene 98 : 177-183 ; 오레일리(O'Reilly)등 (1995) Insect Biochem. Mol. Biol. 25 ; 475-485].

Sarcophaga peregrina(쉬파리)의 사르코톡신 IA 유전자, D. melanogaster의 상피유전자 및 tox34의 동족체(tox 21A)로부터 유도된 세개의 다른 신호서열이 천연 tox34 신호서열 대신에 치환되어(도 1A- 1E 참조) AcMNPV의 개질 폴리헤드린 프로모터 P_synXIV의 방제하에 위치되었다(도 2A-2C). 재조합 바이러스 감염 SF-21 세포에서 발현되어 48h pi에서 조직배양 배지로 분비되는 Tox34의 수준은 Tox34에 특이적인 폴리클로날 항체를 사용하여 웨스턴 블롯분석으로 비교했다(도 3). 48h. p.i.에서 생성된 독소의 세포내 수준은 다양했다(도 3, 1-6레인). vSp-Bsigtox 34로부터의 발현은 보다 적은 세포내 독소 단백질을 생성(도 3, 레인 2와 3을 비교)한 반면에 vSp-DCtox34와 VSP-tox34 감염세포는 비슷한 양의 세포내 독소를 생성 (도 3, 레인 2와 4를 비교)했다. 이에 비하여, vSp-tox21A/tox34 감염세포에서 독소의 세포내 수준은 vSp-tox34 감염 세포에서 보다 약 3배 더 높았다(도 3, 레인 2 와 5). 야생형 AcMNPV 감염세포에서는 Tox34가 검출되지 않았다(도 3, 레인 1). vSp-tox34와 관련하여 vSp-tox21A 감염 세포에서 세포내 독소의 15배 감소(도 3, 레인 6)는 Tox 34 항체에 의한 Tox21A의 비효율적인 인식을 반영한다. vSp-Bsigtox34 및 vSp-DCtox34로 감염된 세포에서 생성되어 분비된 독소는 Tox34보다 약 5kDa적은 것으로 보인다. 어떤 특정한 이론에 구속되지는 않지만 이것은 교호적인 신호서열에 의해 통제되는 결절의 효율성 또는 부위의 차이를 나타내는 것으로 믿어진다. TxP-I의 N-말단 서열은 알려져 있다 [토말스키, 등(1989) Toxicon 27 : 1151-1167] ; 성숙한 재조합 Tox34의 N-말단서열은 실험적으로 측정되지 않았다.

vSp-tox21A/tox34 감염 세포에서 세포내 Tox34의 크기에 있어서의 이종(heterogeneity)은 이미 관찰되었는데 [토말스키와 밀러(1991) Nature 352 : 82-85 ; 토말스키와 밀러(1992) Bio/Technology 10 :545-549] 아마도 성숙한 Tox34 단백질의 전구물질을 나타낼 것이다. Tox34의 성숙한 형태에 대한 전구물질의 비는 시간 p.i와 함께 증가하는데 [토말스키와 밀러(1992) supra], 이것은 세포의 분비경로가 감염의 후단계 동안 기능적으로 손상된다는 사실을 반영하는 것으로 보인다 [자비스(Jarvis) 등 (1993) J. Biol. Chem. 268 : 16754-16762]. vSp-tox21A/tox34로 감염된 세포에서 발현된 독소가 vSp-tox34로 감염된 세포에서 보다 3배 더 높은 수준이기 때문에 이러한 이종 생성물의 존재는 전자가 후자보다 더 높은 수준으로 발현되고 및/또는 tox21A 신호서열이 효과적으로 처리되지 않는다는 것을 암시한다. 두 시나리오 모두 vSp-tox21A/tox34 감염세포에서 Tox34의 미처리 형태의 축적을 야기할 수 있다.

tox34의 신호서열로의 변화 중 어떤 것도 독소의 분비량을 증가시키지 않았다. 48h p.i.에서 vSp-tox34, vSp-DCtox34 및 vSp-tox21/tox34 감염세포에 의해 분비된 Tox34의 양은 비슷했으며(도 3, 레인 8,10,11), 반면에 Tox34는 vSp-BSigtox34 및 vSp-tox21A 감염세포의 상청액 프랙션에서 검출되지 않았다(도 3, 레인 9와 12). 다시, 어떤 특정한 이론에 구속되지는 않지만 Tox21A의 명백한 부존재는 Tox34 항체와의 부족한 반응성때문인 것으로 믿어진다. vSp-BSigtox34 감염세포로부터 분비된 독소의 저수준은 독소 전사의 수준이 비슷한 것으로 보이기때문에 번역 또는 후-번역 문제때문인 것으로 믿어진다. 성숙한 독소의 N-말단 서열에 부가된 부가 글리신 잔기는 이러한 효과에 책임이 있을 수 있다.

새로 생긴 T. ni 유충을 각 재조합 바이러스의 LC₅₀(시험곤충의 50%를 치사시키는데 요구되는 폐색바이러스의 농도) 및 ET₅₀(시험곤충의 50%를 무력화시키거나 치사시키는데 요구되는 시간)에 대한 tox34의 신호서열 변화효과를 평가하기 위해 각 재조합 바이러스로부터 폐색된(occluded) 바이러스로 입을 통하여 감염시켰다(표 2).

이 바이러스들에 대하여는 LD₅₀에 있어서 큰 차이가 관찰되지 않았다 ; 따라서, tox34의 발현은 야생형에 대한 감염을 개시하는 능력을 손상시키지 않는다. 모든 경우에서, tox34 발현 바이러스를 T. ni 유충에 입으로 감염시키는 것은 무력화를 가져왔다. vSp-tox34와 vSp-DCtox34 감염된 유충은 야생형 AcMNPV보다 약 50% 더 빠르게 무력화되었으며, vSp-tox21A와 vSp-tox21A/tox34 감염유충은 야생형보다 약 35% 더 빠르게, 그리고 vSp-BSigtox34 감염유충은 약 25% 더 빠르게 무력화 되었다. vSp-tox34의 ET₅₀은 기공개된 결과와 근접하게 일치한다 [토말스키와 밀러 (1992) supra] ; 그러나, vSp-tox21A의 ET₅₀은 토말스키등의(1993) Toxicon 31 : 319-326에 의해 같은 구성에 대해 보고된 것 보다 약 15시간 더 길었다.

vSp-tox34 및 vSp-DCtox34에 대한 ET₅₀값은 감염 세포의 상청액에서 검출된 독소의 수준과 서로 관련 있다 ; 그러나, vSp-tox21A/tox34의 ET₅₀은 비슷한 수준의 독소가 분비되었음에도 불구하고 vSp-tox34 및 vSp-DCtox34 보다 더 길었다. 이것은 vSp-tox21A/tox34 감염세포로부터 분비된 독소 모두가 생리학적으로 활성적인 것이 아니라는 것을 암시한다. vSp-BSigtox34 감염세포로 부터의 상청액에서 독소가 발견되지는 않지만 VSP-BSigtox34로 입을 통하여 감염된 신생 T. ni 유충은 무력화를 나타는데 이것은 T. ni 유충의 무력화를 위해 요구되는 독소의 한계수준이 낮으며, 어떤 곤충조직이 이러한 구성에서 활성 독소를 생성하는데 보다 효율적이라는 것을 나타낸다. 2.0×10⁵pfu의 vSp-BSigtox34가 혈강을 통하여 주입된 제 4령의 T.ni은 48시간 후에 무력화를 나타냈다. 배약 상청액으로 분비된 독소 수준은 생체내에서의 바이러스 능력을 예측가능하게 했다.

vSp-BSigtox34 감염세포에 의해 생성된 저 수준의 독소가 전사 또는 번역의 수준인지를 측정하기 위해 S1 뉴클레아제 분석을 수행했다. S1 뉴클레아제 보호 평가에서, 독특하게 NdeI 부위에서 단부 라벨링된 648bp 또는 668bp HindIII-NdeI 프로브를 0,6,12,24 및 36h p.i에서 vSp-BSigtox34 또는 vSp-tox34로 감염된 세포로부터 분리된 총 RNA와 함께 사용했다. P_synXIV프로모터의 TAAG 모티프(motif)내에 전사개시에 상응하는 보호된 프로브가 12h p.i에서 일찍 관찰되어 vSp-BSigtox34 및 vSp-tox34 감염세포 모두로 부터 제조된 RNA와 함께 36h p.i까지 계속 증가했다. 각 시간점에서 보호된 프로브의 양은 두 바이러스들 사이에서 비슷했는데 이것은 vSp-BSigtox34 감염세포에서 생성된 저수준의 독소가 전사감소때문이 아니라는 것을 나타낸다.

흥미롭게도, 또 다른 전사 출발부위가 vSp-BSigtox34 감염세포로부터 분리된 RNA에 존재하지 않는 천연 tox34 신호서열내에 있는 상보적 스트랜드상의 TAAG 서열에 매핑되었다. 프라이머 연장 분석은 이러한 추가적인 출발 부위가 역 TAAG 모티프에 상응한다는 것을 확인시켰다. S1 뉴클레아제 및 프라이머 연장 분석에서 이중나선 RNA로 부터의 유사한 간선이 기술되어 왔다. [우이(Ooi)와 밀러(1991) J. Gen. Virol. 72 : 527-534 ; 루 및 카스텐(Carstens)(1992) Virology 190 : 201-209]. 이러한 결과는 tox34 mRNA의 5'말단에서 이중나선 RNA의 형성이 그 번역을 억제하여 tox34 수준을 감소시킬 수 있기 때문에 tox34 발현과 잠재적인 관련성을 가졌다.

신행 T. ni 유충의 vSp-tox34 감염(하이브리드 매우 후기 프로모터, P_synSIV의 전사조절하에서 발현된 tox34)는 야생형보다 약 45% 더 빠른 유충의 무력화를 가져왔다. 따라서, tox34 발현 재조합체, D. melanogaster HSP70 프로모터의 조절하에서 tox34를 발현하는 4개의 재조합 바이러스(vHSP 70tox34), 초기 AcMNPV DA26 유전자 프로모터(vDA26tox34), 후기 AcMNPV 6.9K DNA 결합 단백질 유전자 프로모터(vp6.9tox34) 및 매우 후기의 P_synXIV프로모터(vSp-tox34)의 ET₅₀을 더 감소시키기 위한 방법이 작게되었기때문에(도 2A 및 실시예 참조) 감염세포에서 tox34의 잠재적으로 더 빠른 발현에 대한 프로모터의 효과를 평가하는 것이 관심사였다. P. tritici Tox34 독소 코딩서열이 초기 ETL프로모터의 조절하에서 발현되는 vETL-tox34 [토말스키와 밀러(1992) Bio/Technology 10 : 545-549]는 곤충 조절제로서 vp6.9tox34 또는 vHSP70tox34만큼 바람직하지 않았다.

이들 4개의 바이러스와 야생형 AcMNPV로 감염된 TN-368세포에서 tox34발현의 시간 과정 분석은 이 세포들에서 tox34 발현의 상대적인 수준 및 타이밍을 설명하고 있다. Tox34에 대한 항체를 사용하는 웨스턴 블롯분석은 0,6,12,24 및 48h p.i.에서 바이러스 감염세포에 상청액 및 세포 용균액에서 Tox34를 검출했다(도 4A-4B). 세포 용균액 또는 상청액 프랙션 어느쪽에서도 감염시간의 과정 전체의 걸쳐 야생형 AcMNPV 감염세포에서는 Tox34가 검출되지 않았다(도 4A 및 도 4B, 레인 1-5). 놀랍게도, Tox34가 vHSP70tox34 감염세포로 부터의 용균액에서는 발견되지 않았으며 24h p.i에서 상청액에서 처음 관찰되었고 48h p.i에서 수준이 증가된 것으로 발견되었다(도 4B, 레인 9 와 10). 세포 프랙션에서 이러한 축적이 결핍은 Tox34가 감염세포로부터 효과적으로 분비되었다는 것을 나타낸다. vDA26tox34 감염세포에서 Tox34의 수준을 너무 낮아서 세포내 또는 세포의 프랙션 어느쪽에서도 검출할 수 없었다(도 4A 와 4B, 레인 11-15). vp6.9tox34 감염 세포는 시험된 모든 프로모터 중에서 최고의 Tox34 발현을 나타냈으며, 24와 48h p.i 모두에서 실질적 수준의 Tox34 두 프랙션에서 검출되었다(도 4A 와 4B, 레인 19 와 20). vp6.9tox34 감염세포에서 Tox34의 발현은 Tox34가 48h p.i까지 검출되지 않은, 매우 후기의 프로모터 조절하에서의 tox34 보다 최소한 24시간 더 빨랐다(도 1A 와 도 4B, 레인 19 와 24 및 레인 20 과 25를 비교). vp6.9tox34 및 vSp-tox34 감염세포 용균액에서 발견된 두개의 면역 반응성 종은 성숙한 Tox34와 이것은 미처리된 전구물질형태를 나타낸다.

여러 프로모터들의 조절하에서 tox34의 바이러스 발현의 의한 감염에 대한 신생 S. frugiperda(표 3) 또는 T. ni 유충(표 4)의 반응을 무력화시간이 프로모터에 의해 영향을 받는지 그리고 종-특이적인 차이점이 있는지 측정하기 위해 연구했다. 두 종에 있어서, 네개의 모든 재조합체의 LC₅₀은 야생형 AcMNPV와 유사했다. T. ni 유충에 비하여 S. frugiperda에서 야생형 AcMNPV에 대하여 보다 높은 LC₅₀값(약 200배)을 갖는 다는 것이 이미 보고되었다 [클렘(Clem) 등 (1994) J. Biol. 75 : 1551-1556]. T. ni 유충에서는 vp6.9tox34가 가장 잘 수행되어 야생형과 비교할때 무력화 시간은 약 60%까지 감소시켰으며, vp6.9tox34는 vSp-tox34를 20% 정도 능가했다. 유사한 ET₅₀이 S. frugiperda 유충에서의 vp6.9tox34에 대해서 발견되었지만, 이 경우에 더 우수하지는 않더라도 vHSP70tox34도 역시 잘 수행되었다. 또 다른 ET₅₀에서의 종 특이적인 차이점을 약 10시간 정도 T. ni 유충보다 S. frugiperda 유충에서 보다 효과적인 vDA26tox34에서 발견되었다. 이 결과는 두 곤충 종에서 이들 두 "초기" 프로모터가 상대강도에 있어서 차이가 있다는 것을 나타낸다.

프로모터-특이적 효과가 세포 배양물에서 검출가능한지를 측정하기 위해 vHSP70tox34 와 vDA26tox34 감염 SF-21 및 TN-368 세포에서 Tox34 발현의 시간 과정을 연구했다(도 5). vHSP70tox34 와 vDA26tox34로 부터 분비된 Tox34의 수준이 검출 불가능하게 너무 낮기 때문에 상청액 프랙션의 단백질을 SDS-PAGE로 단백질을 분리하여 면역 블롯 분석으로 Tox34로 검출하기 전에 20% 트리클로로아세트산(TCA)으로 침전시켰다. 각 세포주에 의해 분비된 Tox34의 상대적 수준 비교는 HSP70 프로모터가 두 세포주에서 DA26 유전자 프로모터보다 매우 더 강하다는 것을 나타냈다(도 5 레이 1-5와 레인 11-15 및 레인 6-10과 레인 16-20을 비교). 두 세포주에서 각 프로모터의 비교는 DA26과 HSP70 프로모터로 부터의 Txo34의 검출가능한 수준이 TN-368 세포에서 보다 SF-21에서 최소한 24h 더 빨리 보이는 것으로 나타났다. 이러한 블롯의 보다 긴 노출은 vHSP70-tox34 감염 SF-21 및 TN-368 세포의 상청액에서 6 및 12h p.i와 같이 일찍 Tox34를 검출했다. 단백질 수준으로 두 세포주에서 vHSP70tox34 및 vDA26tox34로 tox34 발현의 수준 및 타이밍에 대한 이러한 분석은 신생물 생검법에서 무력화하기 위한 상대적 시간과 잘 일치한다(표 4와 5).

S1 뉴클레아제 분석은 전사 출발 부위가 천연 tox34 신호 서열내의 상보적 스트랜드상에 위치된다는 것을 나타냈다. 이 부위로부터 개시하는 전사는 tox34의 번역을 간섭하도록 감염세포에서의 tox34 전사와 함께 이중 나선 RNA를 잠재적으로 형성한다.

올리고뉴클레오티드 부위 지향적 돌연변이 유발이 신호 펩타이드의 아미노산 서열을 변화시키지 않고 tox34 신호코딩서열내의 CTTAA모티프를 CTTGA 모티프로 변화시키기 위하여 pSp-tox34 및 pSp-p6.9tox34에 대하여 수행했다(도 1E 참조). 이러한 변화된 신호 펩타이드 코딩 서열의 효과가 6.9K(vp6.9tox34m) 또는 P_synXIV(vSp-tox34m) 프로모터 조절하에서 변성 tox34 유전자(tox34m)를 발현하는 재조합 바이러스를 사용하여 시험되었다. 18-48h p.i 까지의 Tox34 또는 Tox34m에 발현에 대하여 세포 용균액 및 상청액을 시험했다(도 6A 와 6B). vSp-tox34 및 vSp-tox34m 감염세포에 있어서, 두 프랙션에서 48h p.i에 Tox34를 검출했다. 6.9K 프로모터로부터 Tox34 또는 Tox34m의 발현은 18h p.i에서 관찰되었다. 세포내 Tox34의 상대적인 수준은 vp6.9tox34로 감염된 세포보다 vp6.9tox34m으로 감염된 세포에서 약 2-3배 더 높았는데, 이것은 역 TAAG 모티프의 제거가 Tox34 단백질의 세포내 수준을 증가시킨다는 것을 나타낸다. 이러한 차이가 vSp-tox34 및 vSp-tox34m 감염세포에서는 관찰되지 않았다. 이론에 구속되는 것은 아니지만 상보적인 TAAG 모티프는 감염시 매우 후기의 프로모터라기 보다는 후기의 프로모터로서 작용하고, 따라서 이 프로모터로부터 시작하는 RNA가 기본적으로 후기 6.9K 프로모터로부터 발현된 tox34로 부터의 번역을 이루는 것으로 믿어진다. vp6.9tox34 및 vp6.9tox34m 사이에서 Tox34의 세포내 수준 차이는 관찰되지 않았다(도 5B). vp6.9tox34 감염 세포에서 생성된 Tox34의 수준이 세포의 분비 경로를 압도하여 vp6.9tox34m 감염세포에서 생성된 전구물질 Tox34의 보다 높은 수준도 분비된 Tox34의 수준에 영향을 미치지 않도록 하는 것에 가능하다.

vp6.9tox34m 과 vSp-tox34m 재조합 바이러스의 LC₅₀및 ET₅₀에 어떤 차이가 있는지 측정하기 위하여 이들 재조합 바이러스들을 신생 S. frugiperda 및 T. ni 유충의 입을 통하여 감염시켜 사용했다. 야생형 AcMNPV에 비해 어느 중에서도 각 바이러스의 LC₅₀에서의 차이는 관찰되지 않았다(표 6). vp6.9tox34m의 ET₅₀은 S. frugiperda에서 4.5h 그리고 T. ni 유충에서 5.6h 정도 vp6.9tox34보다 적절히 더 길어서 표준오차의 한계 밖이 었다. 두 종 모두에서 vSp-tox34m이 vSp-tox34보다 잘 수행되었다. 그 효과는 S. frugiperda 유충에서 보다 더 큰 것으로 보는데 약 7h 정도 무력화 시간을 감소시켰다.

시험된 신호서열 중 어떤 것도 세포 배양물에서 분비된 Tox34의 수준을 증가시키지 않았으며 어떤 것도 이들 바이러스 재조합체로 감염된 T. ni의 무력화 시간을 개선시키지 않았다. 그러나, 프로모터의 선택은 세포 배양물에서 분비된 독소의 타이밍과 수준에 매우 영향을 미쳤으며, 놀랍게도 어떤 프로모터는 생 살충제로서의 바이러스 특성을 극적으로 개선시켰다.

신호서열을 변화시키는 것의 중요한 효과는 Tox34의 세포내 수준에 영향을 미치는 것이었다. vSp-tox21A/tox34 감염세포에서 독소의 수준은 48h p.i.에서 vSp-tox34 감염세포에서 보다 높은 수준으로 축적되었는데 이것은 tox21A 신호서열이 천연 tox34 신호서열보다 Tox34의 분비를 지시하는데 있어서 덜 효율적이라는 것을 암시한다. 유사한 수준의 독소 전사가 vSp-BSigtox34 감염세포에서 검출되었다. Tox34의 안정성을 신호서열 또는 성숙 폴리펩타이드의 N-말단 잔기 변화 결과에 따라 영향을 받을 수 있다. 이 신호서열은 바쿠로바이러스 발현 시스템을 사용하여 활성 프로토라시코트로픽(prothoracicotropic) 호르몬의 분비를 촉진하는데 성공적으로 사용되어 왔다 [오레일리(O'Reilly) 등(1995) Supra]. 성숙한 Tox34의 아미노 말단에 여분의 글리신 잔기의 부가는 Tox34를 안정화시키기 보다 불안정화시킬 수 있다.

상보적인 TAAG 모티프를 제거하기 위한 천연 tox34 신호서열의 변형은 세포 배양물에서 분비된 Tox34의 수준을 증가시키지 않았지만 세포내 Tox34 및 그 전구물질의 수준을 크게 증가시켰다. 이것은 TAAG 서열의 제거나 세포에서 Tox34의 발현을 증가시킨 반면에 분비경로를 통한 처리 및 운반은 증가된 세포의 독소수준을 얻는데 있어서 제한적인 단계였다는 것을 나타낸다. S. frugiperda 유충에서 vSp-tox34에 비하여 vSp-tox34m 의 경우에 ET₅₀감소가 관찰되었는데 이것은 이러한 역 TAAG 모티프를 변화시키는데 약간의 생체내 효과가 있었다는 것을 나타낸다. 이러한 결과는 감염의 보다 초기에 발현되어 후기까지 계속 발현되지만 무력화에 요구되는 한계 수준보다 낮은 독소를 생성하는 프로모터(예를들면, HSP 70)에 대하여 이러한 변성 신호를 사용하는 것이 바람직하다.

모든 독소발현 재조합 바이러스는(프로모터에 관계없이) 야생형에 AcMNPV에 비하여 효과적인 무력화/사망시간을 감소시켰다. 시험된 두종에 있어서 가장 효과적인 바이러스성 프로모터는 AcMNPV의 후기 6.9K 단백질 결합 단백질 유전자 프로모터였다. 6.9K 프로모터 조절하의 Tox34는 후기 및 매우 후기의 프로모터 요소로 구성된 하이브리드 프로모터 조절하의 tox34보다 초기(최소한 24h)에 그리고 큰 수준으로 발현되었다[토말스키와 밀러 (1992) Supra]. p10 또는 폴리헤드린 유전자 프로모터보다 6.9K 프로모터에 의해 매개된 보다 우수한 발현은 미숙 호르몬 에스테라제 및 β-갈락토시다제와 관련하여 이미 보고되었다 [보닝(Bonning) 등 (1994) J. Gen. Virol. 75 : 1551-1556] vp6.9tox34 감염 SF-21 세포에서 Tox34의 보다 빠른 합성 및 분비는 생체내에서 재조합 바이러스의 성능을 반영한다.

초기 DA26 프로모터 조절하의 Tox34는 두 종에 있어서 가장 덜 효과적인데 그 결과는 AcMNPV의 또 다른 초기 프로모터(ETL)와 함께 발견된다 [토말스키와 밀러 (1992) Supra]. 그 결과는 tox가 이들 세포에서 보다 초기에 발현되지만 유충을 무력화시키는데 필요한 한계수준으로 처음부터 발현되는 것이 아니라는 것을 나타낸다. hsp70 프로모터 초기 바이러스성 프로모터와 비교할때 상대적으로 강한 프로모터인 것으로 나타났으며 [모리스(Morris)와 밀러(1992) J. Virol. 66 : 7397-7405], 이 프로모터는 T.ni와 S.frugiperda 모두에게 DA 26 프로모터보다 높은 수준의 tox34 발현을 유도하는 것으로 발견되었다. 놀랍게도, hsp70 프로모터의 조절하에서 발현된 tox34는 hsp70 프로모터하에서 분비된 Tox34의 전체수준이 6.9K 프로모터 조절하에서 발현된 tox34보다 실질적으로 낮음에도 불구하고 S.frugiperda 유충에서 가장 짧은 ET₅₀을 가져왔다. 이것은 강한 구성성분 프로모터로부터의 tox34 발현이 최소한 어떤 경우에서는 강한 후기 바이러스 프로모터로 부터의 발현보다 덜 효과적이라는 것을 나타낸다. 두 종에서 vHSP70tox34와 vDA26tox34의 ET₅₀값에 대해 관찰된 차이는 특정 프로모터의 효능이 숙주 의존성이라는 것을 나타낸다.

상기한 바와같이, 본 기술분야에서는 표적 해충에 대해 특히 선택적인 생물학적 살충제에 대한 필요성이 있어 왔다. 바쿠로바이러스가 이러한 필요성을 충족하는 것으로 간주되고 있지만 대부분의 바쿠로바이러스는 그들의 곤충숙주를 치사시키는데 4-14일이 요구되고 이 기간동안 곤충은 계속 식생하여 작물 및 다른 식물에 심각한 손상을 야기한다. 바쿠로바이러스 게놈의 유전적 변형은 감염된 곤충의 치사시간을 감소시키므로서 곤충방제제로서의 바쿠로바이러스의 개선을 가져왔다. 재조합 바쿠로바이러스에 의해 곤충에 특이적인 곤충을 잡아먹는 진드기 독소는 감염된 곤충의 섭생시간을 단축시킨다 ; 본 발명은 그러한 바쿠로바이러스의 추가적인 개선을 제공한다. 곤충 특이적 독소의 신호서열에 대해 이루어진 변화는 분비된 진드기 독소의 수준을 개선시키지 않았으며, 실제로 시험된 신호서열에 대한 특이적인 변화는 감염된 곤충의 무력화 시간의 증가를 가져왔다. 그러나, 놀랍게도 프로모터의 선택은 발현시간을 개선하고, 독소 단백질의 수준을 증가시키며, 숙주의존적인 방법으로 무력화 시간을 단축시키는데 있어서 주 요인이었다. 어떤 이론에 구속되지는 않지만, 대부분의 곤충 숙주에서 독소 발현을 유도하기 위해 가장 효과적인 프로모터는 AcMNPV6.9K 프로모터이거나 열 충격 프로모터, 특히 Drosophila hsp 70 프로모터이다.

해충을 방제하기 위해 식물 살포용으로 적당한 살충 조성물은 농업적으로 적절한 캐리어와 곤충방제제를 포함한다. 본 발명 살충조성물의 살포는 감염되기 쉬운 곤충의 섭생을 감소시키고 치사시키므로서 해충으로부터 식물을 보호할 수 있다.

당업자는 특정 해충의 방제를 위해 적당한 곤충 방제제, 예를들면 곤충 바이러스를 어떻게 선택할 것인가를 안다. 해충이 곤충방제제의 섭취, 흡입 또는 직접적인 접촉을 포함하는 통상의 방법에 의해 본 발명의 곤충방제제에 노출될 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다.

본 발명의 유전적으로 처리된 바쿠로바이러스의 일차적인 용도는 해충의 생물학적 방제를 이루기 위해 식물, 식물환경에 살포하거나 미끼로 반포되는 농업적 조성물의 성분으로서이다. 또한, 곤충특이적인 마비성 신경독소를 발현하도록 유전적으로 변성된 특정유기체를 적절하게 선택하여 다른 해충의 방제에 있어서 본 발명의 곤충방제제를 사용하는 것도 가능하다. 예를들면, 일반적인 인시목 (Lepidopterans) 이외에 모기, 갑충 및 벼룩 각각을 특이적으로 감염시키는 것으로 알려진 바쿠로바이러스가 있다. 표적 곤충은 마비성 독소를 발현하는 곤충방제제의 선택에 있어서 당업자를 안내하고 특정의 제제는 적절한 프로모터 서열의 선택을 구속한다. 본 기술분야에서는 곤충방제를 위한 그러한 농업적으로 적절하고 및/또는 환경적으로 수용가능한 조성물을 제조하는 것의 많은 변형이 알려져 있다.

해충의 방제를 위한 살충효과가 있는 조성물을 제조하는데 요구되는, 유전공학적으로 처리된 바쿠로바이러스의 농도는 사용된 유기체와 신경독소의 형태 및 조성물의 제형에 좌우된다. 조성물내에서의 곤충방제제의 살충효과가 있는 농도는 당업자에게 이해되는 바와같이 실험에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 예를들면, 바이러스의 살충효과가 있는 농도는 본 기술분야에서 알려진 생검 기술을 사용하여 쉽게 결정될 수 있다.

식물의 해충방제를 위한 농업용 조성물은 농업적 용도 및 논밭에서의 분산에 적절해야만 한다. 마찬가지로, 다른 해충의 방제를 위한 조성물은 환경적으로 수용가능해야 한다. 일반적으로, 조성물의 성분은 비식물독성이어야 하고 폐색된 바이러스의 보전에 손상이 없어야 한다. 잎에 살포하는 것은 식물잎을 손상시키지 않아야 한다. 적절한 고체, 보다 바람직하게는 액체 캐리어 이외에 농업용 조성물은 점착 및 접착제 ; 유화제 및 습윤제를 포함할 수 있지만, 곤충 섭생 또는 어떤 바이러스 기능을 막는 성분이 없어야 한다. 또한, UV비활성화로 부터 곤충방제제를 보호하는 성분 또는 곤충병원체의 효력 및/또는 발병력을 증가시키기 위한 보조제로 제공되는 성분을 첨가하는 것이 바람직할 수 있다. 해충방제를 위한 농업용 조성물은 또한 곤충 섭생을 자극하는 제제를 포함할 수 있다.

생물학적 곤충 방제제의 살포방법 및 농업적 살포 방법 및 조성물을 기술한 참고자료들을 입수가능한데, 예를들면 코우치(Couch)와 이그노포(Ignoffo)(1981) Microbial Control of Pests and Plant Disease 1970-1980, 버게스(Burges)(ed.), Chapter 34, pp. 621-634 ; 코크(Corke)와 리쉬베스(Rishbeth), ibid, Chapter 39, pp. 717-732 ; 브록웰(Brokwell)(1980) Methods for Evaluating Nitrogen Fixation, 버거슨(Bergerson)(ed.) pp. 417-488 ; 버튼(Burton)(1982) Biological Nitrogen Fixation Technology for Tropical Agriculture, 그라함(Graham)과 해리스(Harris)(eds.) pp. 105-114 ; 및 러플리(Roughley)(1982) ibid, pp.115-127; The Biology of Baculoviruses, vol. Ⅱ, supra 및 상기에 인용된 자료들을 참고할 수 있다. 곤충방제에 사용하기 위한 바쿠로바이러스를 도입한 습윤가능 분말 조성물은 여기에 참고로 도입된 EP 697,170 (아메드(Ahmed), 1996년 2월 21일 공개)에 기술되어 있다.

본 발명 발명을 사용하여 확인된 특정의 코딩서열에 의해 엔코딩된 독소 단백질과 특이적으로 반응하는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체, 바람직하게는 모노클로날 항체는 본 기술분야에서 알려진 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를들면, 할로우(Harlow)와 레인(Lane) (1988) Antibodies : A Laboratory Mannual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY 및 고딩(Goding)(1986) Monoclonal Antibodies : Principles and Practice, 2d ed., Academic Press, New York 참조.

클로닝, DNA 분리, 증폭 및 정제를 위한 표준기술, DNA 리가아제, DNA 폴리머라제, 제한 엔도뉴클레아제등을 포함하는 효소 반응을 위한 표준기술 및 다양 분리기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 일반적으로 사용되는 것들이다. 다수의 표준 기술들이 오레일리 등(1992) Baculovirus Expression Vectors : A Laboratory Mannual, W.H.Freeman, New York ; 셀브룩 등(1989) Molecular Cloning, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York ; 매니아티스(Maniatis) 등 (1982) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York ; 우(Wu)(ed.)(1993) Meth. Enzymol. 218, Part Ⅰ ; 우(ed.)(1979) Meth Enzymol. 68 ; 우 등(eds.)(1983) Meth. Entymol. 100 및 101 ; 그로스맨(Grossman)과 몰데이브(Moldave)(eds.) Meth. Enzymol. 65 ; 밀러(ed.)(1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York ; 올드(old)와 프림로즈(Primrose) (1981) Principles of Gene Manipulation, University of California Press, Berkeley ; 쉴리프(Schleif)와 웬싱크(1982) Practical Methods in Molecular Biology ; 글로버(Glover)(ed.)(1985) DNA Cloning Vol. Ⅰ 과 Ⅱ, IRL Press, Oxford, UK ; 헤임즈(Hames)와 히긴스(eds.)(1985) Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, UK ; 및 세트로우(Setlow)와 홀라엔더(Hollaender)(1979) Genetic Engineering : Principles and Methods, Vols. 1-4, Pleunm Press, New York 에 기술되어 있다. 사용된 약어 및 명명자는 여기에 인용된 것들과 같은 전문지에 일반적으로 사용되고 본 분야에서 표준인 것으로 간주된다. 본 출원에 인용된 각 자료들은 그들 전체가 여기에 참고로 도입되었다.

본 발명은 하기 실시예에 의해 보다 상세히 설명되는데 이것은 본 명의 범위를 어떤 식으로든지 제한하는 것으로 간주되어서는 않된다. 당업자는 여기에 상세하게 기술된 과정의 물질 및 기술의 다른 실시, 변형, 대체 및 등가물을 이룰 수 있으며 이는 여기의 설명을 읽은 후 본 발명의 정신 및/또는 첨부된 청구범위를 벗어나지 않고 그러한 것들을 제시할 수 있는 것으로 이해되어야 한다.

실시예 1. 곤충세포 및 바이러스

모든 AcMNPV 바이러스들을 원래 AcMNPV L-1으로 부터 유도하여 [리 와 밀러(1978) J. Virol. 27 : 754] 플라크 정제하고 상기한 바와같이 [오레일리 등(1992) Baculovirus Expression Vectors : A Laboratory Manual, W.H. Freeman, New York, NY] 27℃에서 10% 태아 송아지 혈청과 0.26% 트립토즈 브로쓰가 보충된 TC-100 배지(GIBCO, Grand Island, New York)에서 Spodoptera frugiperda IPLB-SF-21 세포(Sf 세포, Spodoptera frugiperda)[본(Vaughn) 등, (1977) In Vitro 13 :213-217] 또는 TN-368 세포(Tn) Trichoplusia ni 세포 [힝크, 더블유. 에프(Hink, W.F.)(1970) Nature 226 : 466-467]에 만연시켰다. AcMNPV 바이러스를 IPLB-SF-21 세포와 오레일리 등의 (1992 Supra)에서 기술된 표준 플라크 검정법을 사용하여 적정했다. AcMNPV L1을 비교목적의 야생형 바이러스로 제공했다.

각각 합성 하이브리드 바이러스 프로모터 P_synXIV[왕(Wang)등(1991) Gene 100 : 131-137]와 Drosophila melanogaster hsp70 [토말스키와 밀러(1992) Bio/Technology 10 : 545-549 ; 맥니트(McNitt) 등 (1995) Bio. Control 5 : 267-278]의 관리 조절하에서 발현된 재조합 바이러스 vSptox34와 vHSP70tox34는 tox34 코팅 서열을 함유한다. EcoRI 와 BglII로 소화된 pEVptox34로 출발하여 tox34와 단편을 방출하고 [미국특허 제 5,266,317호 참조], EcoRI와 BglII로 소화된 플라즈미드 pHSP70PLV1+CAT [모리스와 밀러(1992) J. Virol. 66 :7397-7405]로 출발하여 벡터 단편과 버려지는 cat 단편을 생성하도록 vHSP70tox34를 구축했다. 벡터 단편은 약 -500-+231의 서열을 갖는 D. melanogaster hsp70 프로모터를 함유한다 [퇴로엑(Toeroek)과 카쉬(Karch)(1980) Nucl. Acids Res. 8 :3105-3123 참조]. 적절한 배향으로의 Tox34 코팅서열 삽입을 제한 엔도뉴클레아제 분석으로 확인했다(XbaI, NdeI로 소화 및 EcoRI 와 BglII로의 이중 소화). 이 전달 플라즈미드를 pohl 대신에 lac ZI를 함유하는 AcMNPV 유도체인 바이러스 vSynVl-gal의 DNA와 함께 SF21에 동시감염시켰다. Xgal 플레이트상의 백색의 폐색-양성 표현형으로 재조합 바이러스를 확인하고 제한 엔도뉴클레아제 분석으로 그들의 유전자형을 확인했다. 재조합 바이러스 vSp-tox21A는 P_synXIV의 관리조절하에서 Pyemotes tritici 곤충 포식 진드기로부터 cDNA 클로닝에 의해 분리된 tox34 코팅서열의 동족체인 tox21A 코딩서열을 발현한다.

IPLB-Hz107S 로부터 클로닝에 의해 분리된 Hz105/LIND-K 세포(HzUNDK) [코르사로(Corsaro)등 (1989) J. Virol Methods 5 : 283-292]를 말콤 레이(Malcolm Fraser) 박스(인디애나, 노틀담, 유니버시티 오브 노틀담)로 부터 제공받아 상기한 바와같이 [오레일리등(1992) Baculovirus Expression Vectors : A Laboratory Manual, W.H. Freeman, New York, NY] 10% 태아 송아지 혈청과 0.26% 트립토즈 육즙이 보충된 TCIOO 배지에서 27℃로 유지시켰다. 윌리엄 라이스(William Rice) 박사(USDA-ARS Rice Research Center, Crawley, LA)로 부터 제공받은 HzSNPV의 Elcar^TM균주의 플라크-정제된 분리물을 모 야생형(wt) 바이러스로 제공하여 HzUNDK 세포에 만연시켰다. HzSNPV 바이러스는 본 기술분야에서 쉽게 입수가능하다.

실시예 2 : EGT 평가

HzUNDK 세포 (60mm 접시당 2×10⁶)를 10번의 감염으로 다양하게 wt HzSNPV 또는 AcMNPV로 감염시켰다. 후감염 48시간 후 감염된 세포배양물 상청액을 수집하고 트랜스퍼라제 활성을 기질로서 제공되는 [³H] 에크디손(ecdysone)(Dupont, NEN Research Products)와 UDP-갈락토오즈 또는 UDP-글루코오즈를 갖는 상청액의 100㎕를 사용하여 평가했다 [오레일리 등 (1992) Insect Biochem. Molec, Biol. 22 : 313-320]. 박층 크로마토그래피 또는 실리카겔 프레이트로 에크디손-당 콘쥬게이트로부터 에크디손을 분리하고 방사라벨을 오토라디오그래피로 검출했다.

실시예 3 : HzSNPV egt 유전자의 확인 및 서열화

벡터로서 SuperCos (Stratagene, LaJolla, CA)를 사용하여 HzSNPV의 게놈의 코스미드 라이브러리를 구축했다. HzSNPV 게놈 단편을 함유하는, 선택된 코스미드 및 플라즈미드 클론을 공지된 UDP-글루코실트랜스퍼라제의 두개의 고도로 보존된 영역으로부터 설계된 두개의 변질된 프라이머를 사용하여 폴리머라제 쇄 반응(PCR)으로 스크리닝 했다. 프라이머들의 서열(Ⅰ가 이노신, Y가 C 또는 T, S가 G 또는 C, K가 G 또는 T, M은 A 또는 C, W는 A또는 T, H는 A 또는 C 또는 T, B는 G 또는 T 또는 C, V는 G 또는 C 또는 A 및 N은 네개 모두의 뉴클레오티드일 경우)들로는 각각 5'말단 BanHI 또는 EcoRI 부위를 포함한다 : 5'GC GGA TCC AIY GTG SWG TWY NTK GGM GG 3'(SEQ ID NO : 16)[AcMNPV EGT 서열의 SVQYLGG(SEQ ID NO :17)에 상응함]과 5' GC GAA TTC GGM ABV MHC ACC AKN GG 3'(SEQ ID NO :18) [원래 많은 EGT 서열의 PMVCLP (SEQ ID NO : 19)에 상응하는 것으로 생각됨].

HindIII J-E 단편에 걸쳐 있는 HzSNPV 코스미드와 템플레이트로서 HindIII-C 단편을 함유하는 플라즈미드 클론을 사용한 PCR 증폭은 egt 유전자에 대해 예상된 크기의 PCR 생성물을 생성시켰다. PCR 생성물의 서열은 HzSNPV egt 유전자로부터 유도된 것으로 확인되었다. 확실한 정렬과 명백한 서열정보를 위해 인접서열들 사이에 충분한 중첩이 제공된 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머의 보조하에서 전체 유전자를 양방향으로 서열화했다.

GenBank에서 입수가능한 공지 egts의 뉴클레오티드 서열을 Pileup과 Boxshade 프로그램을 사용하여 정렬시켰다(도 11B-11C 참조). Bestfit 분석 (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI)을 사용하여 아미노산 서열들을 비교했다. 서열비교에 기초한 계통발생적(phylogenetic)관계를 도 11A에 다이아그램으로 도시했다.

실시예 4 : HzSNPV 전달 벡터와 재조합 HzSNPV 바이러스의 구축

egt 유전자는 전체적으로 EcoRI Q 단편내에 위치되는 것으로 발견되었다. 이 단편은 HzSNPV로부터 Bluescript Ⅱ KS+(Stratagen)의 EcoRI 부위로 클론하고 600bp SalI/EcoRI 단편 하류를 제거하여 pHzEGT를 생성했다(도 7). egt의 내부 세그먼트를 제거한 SalI로 pHzEGT를 소화시키고 그 단부를 Klenow로 채웠다. D. melanogaster hsp70 promoter의 조절하에서 E. coli β-글루쿠로니다제 유전자(GUS)및 GUS의 어느 한쪽에 Bsu36Ⅰ와 Sse8387I 부위를 함유하는 블런트 단부(blunt-ended) 단편에 결합했다. 또한, DA26 촉진-, p6.9 촉진- 또는 D. melanogaster HSP 촉진- tox34 유전자에 결합했다. AcMNPV로 부터 DA26과 p6.9프로모터를 유도했다 [루 등(1995) Biol. Control 7 :320-332]. egt의 삭제를 갖는 플라즈미드를 벡터 단편의 결합에 의해 salI-소화 pHzEGT로 부터 제조했다. 이 플라즈미드 pEGTdel을 사용하여 플라즈미드 pEGTlinker를 생성했는데 이것은 플라즈미드 DNA를 salI로 소화시키고 이것을 SalI 결합단부 및 독특한 Bsu36I 및 Sse 8787Ⅰ 부위를 갖는 올리고뉴클레오다이드에 결합시키므로서 egt내에 독특한 Bsu36Ⅰ 및 Sse8387Ⅰ 부위를 갖는다(도 7) . 하기의 프라이머들을 함께 어닐링하여 올리고뉴클레오티드를 구축했다(5' T CGA CCT CAG GGC AGC TTA AGG CCT GCA GG 3'(SEQ ID NO :20) 및 5' TCG ACC TGC AGG CCT TAA GCT GCC CTG AGG 3'(SEQ ID NO : 21)).

HzSNPV는 HindIII-C 단편내에 위치된 독특한 Bsu26Ⅰ 부위를 갖는 것으로 발견되었다. HindIII-C로부터 Bsu36I 부위를 함유하는 2.1kb ClaI 단편을 클론하고 그 부위를 둘러싸고 있는 영역을 서열화 했다. 바이러스 DNA를 Bsu36Ⅰ로 소화시키고 Klenow 폴리머라제로 채운 후 DNA를 재결합하여 바이러스로부터 그 부위를 제거했다. 이 DNA를 Bsu36I로 다시 소화시키고 HzUNDK 세포에 감염시켰다. 이러한 감염으로부터 생긴 바이러스를 플라크 정제, 증폭하고 Bsu36I 부위의 손실을 시험했다. Bsu36Ⅰ부위가 없는 선택된 바이러스들에 대해서 H. zea 신생물에서의 그들의 감염도(LC₅₀) 및 발병력(LT₅₀)을 시험했다.

Bsu36Ⅰ^-바이러스 HzSNPV(Bsu36Ⅰ^-)를 pEGTHspGUS와 대립형질적으로 재조합시켜 X-gluc (5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 β-D-글루쿠로니드)의 존재하에서 HzUNDK 세포에서 청색 플라크를 생산하는 EGT 삭제 바이러스를 생성했다. 이 바이러스, HzSNPV(Bsu36Ⅰ^-) - EGTHspGUS 또는 보다 단순하게 HzEGThspGUS를 사용하여 하기 바이러스들을 전달 플라즈미드 HzEGTdel, HzEGTDA26 tox34, HzEGTp6.9tox34 및 HzEGTHSPtox34를 이용하는 대립형질적 치환 [오레일리 등(1992) Baculovirus Expression Vectors : A Laboratory Manual, W.H.Freeman, New York, NY]으로 생성시켰다(도 7). 재조합을 강화시키기 위하여 바이러스성 DNA를 바이러스 및 플라즈미드 감염전의 Bsu36Ⅰ로 선형화했다. 백색의 폐색양성 플라크 표현형을 위해 바이러스 재조합체를 스크리닝했다. 바이러스를 더 플라그 정제한 후 증폭시켰다. 제한 엔도뉴클레아제로 바이러스성 DNA를 분석하여 대립형질적 치환을 확인했다.

실시예 5 : HzSNPV와 그 유도체로의 곤충 생검

바이러스들의 LC₅₀과 ET₅₀(시험유충의 50%를 효과적으로 무력화 시키기 위한 평균시간)을 신생물인 H. zea를 사용하여 측정했다. 휴즈(Hughes) 등 (1986) J. Invertebr, Pathol. 48 : 189-192에 의해 개발된 프로토콜에 따라 소적공급 평가로서 생검을 수행했다. 60mm의 프랄스틱 페트리접시의 중앙에 신생물을 위치시키고 이들에게 접시의 모서리 근처 바닥에 피펫으로 옮긴 0.5㎕ 소적의 바이러스성 폐색체(PIB)를 제공하므로서 신생물에 5% 슈크로즈와 1mg/ml FD&C 블루 #1 색소(Hilton Davis, Cincinnat, OH)에 현탁된 공지농도의 PIBs를 공급했다. 청색으로 측정되는 바와같이 30분내에 PIBs를 소화시킨 유층을 새로운 영양식 [오레일리등 (1992) Baculovirus Expression Vectors : A Laboratory Manual, W.H.Freeman, New York, NY에서 S. frugiperda 영양식으로 기술된]으로 옮기고 약 매 6시간마다 모니터했다. 복용량당 30곤충에서 5 바이러스 농도를 각 바이러스에 대해 시험했다. Vistat 2.1 프로그램 [휴즈, 피.알(1990) Vistat : Statistical package for the analysis of baculovirus bioassay data, Boyce Thompson Institute, Cornell University, Ithaca, NY]으로 ET₅₀을 측정하고 Polo-PC[로버트슨(Robertson)과 프리엘러(Prieler)(1992) Polo-PC. In "Pesticide Bioassays with Arthropods." CRC Press, Boca Raton, FL]을 사용하여 LC₅₀을 측정했다.

실시예 6 : 교호적인 신호서열을 갖는 재조합 바이러스의 구축

상기한 방법 [오레일리 등.(1992) supra]을 사용하여 대립형질적 치환으로 모든 재조합 바이러스를 구축했다. 전달 플라즈미드를 vSynVI-gal [왕 등(1991) supra]와 함께 SF-21 세포에 동시감염시키고, 백색의 폐색 양성 플라그 표현형에 기초하여 재조합 바이러스들을 선택했다. 적절한 제한 엔도뉴크레아제 소화 분석을 사용하여 각 재조합 바이러스를 검증했다. 모든 재조합 바이러스들은 폴리헤드린 유전자의 상류에 그리고 대향 방향으로 삽입된 tox34를 함유한다.

쉬파리 Sarcophaga peregrina [오레일리 등(1995)supra]로 부터의 사르코톡신 IA 유전자 신호서열에 대하여 프레임에 융합된 tox34를 함유하는 바이러스, vSp-BSigtox34를 하기와 같이 구축했다 : 각각 Tox34의 뉴클레오티드 118-138에 상응하고 tox34의 뉴클레오티드 862-876에 상보적인 두개의 올리고뉴클레오티드 프라이머인 tox34up과 tox34down (SEQ ID NO : 3) [토말스키와 밀러(1991) Nature 352 : 82-85]를 폴리머라제 쇄 반응(PCR)에 사용하여 본래의 신호서열 없는 tox34를 함유하는 777 염기상 단편을 증폭시켰다. 프라이머 tox34up은 성숙된 tox34 유전자 생성물의 N-말단에 여분의 그리신 잔기를 부가하도록 설계했다(도 1A 와 1B) : N-말단 글리신 잔기는 재조합 유전자 생성물을 안정화시키는 것으로 알려져 있다 [배치마이어(Bachmair)등(1986) Science 34 : 179-186] PCR-증폭생성물을 HindIII 와 SmaI로 (프라이머에 도입된 인식부위)로 소화시키고 Mung Bean 뉴클레아제와 블런트 단부인 EcoRI 부위와 HindIII 부위 사이의 플라즈미드 pBSig[오레일리등(1995) supra]로 프레임에 삽입했다. 이 구축물 pBSigtox34는 사르코톡신 IA신호서열과 융합된 tox34를 함유한다. 신호서열과 tox34사이의 연결을 서열 분석으로 확인했다(도 2B). 또한, PCR 도중 돌연변이가 일어나지 않았다는 것을 보장하기 위해 전체 tox34 PCR생성물을 서열화 했다. BanHI로 pBSigtox34를 소화시키고 DNA 폴리머라제 I의 큰 단편(Klenow)를 단부에 채운 후 BglII로 소화시켜 전달 벡터 pSp-BSigtox34를 구축했다. BSigtox34 함유 단편을 겔 정제하고 P_synXIV프로모터의 조절하에서 블런트 단부 EcoRI 부위와 BSigtox가 위치하는 BglII 부위사이의 pSp-tox34에 삽입했다(도 2A, vSp-BSigtox34).

Drosophila 상피 유전자 신호서열과 융합된 tox34(도 1)를 함유하는 재조합 바이러스 vSp-DCtox34(도 2A) [스나이더 등(1982) Cell 29 : 1027-1040]를 BanHI 와 SnaI로 플라즈미드 pBSIGtox34SmI으로 소화시키고 Esp3I 와 BspMI 부위를 함유하는 24염기쌍 올리고뉴클레오티드를 삽입하여 구축했다. 플라즈미드 pBSigtox34SmaI는 사르코톡신 IA 신호서열과 tox34 사이의 연결부에 SmaI 부위를 함유하는 pBSigtox34의 유도체이다. 이 플라즈미드 pEBtox34는 사르코톡신 IA 신호서열대신에 성숙 tox34 서열의 상류에 두개의 독특한 제한부위(Esp3I와 BspMI)를 함유한다. Esp3I 와 BspMI로의 소화 및 이어지는 Klenow 폴리머라제를 단부에 채워 넣는 것은 어떤 신호서열이 최적의 바쿠로바이러스 후기/매우 후기 AUG에 tox34와 함께 프레임에 삽입될 수 있는 블런트 단부를 생성하도록 올리고뉴클레오티드가 설계된다 [오레일리등 (1992) supra]. Esp3I 부위를 갖는 Drosophila 상피 신호서열을 함유하는 두개의 상보적인 올리고뉴클레오티드를 어닐링하고 Eps3I로 소화시키며 Klenow로 블런드 단부를 갖게 한 다음 단부가 Klenow로 채워진 후 pEBtox34의 Esp3I와 BspMI 부위에 삽입했다. 이 구축물 pEBDCtox34는 Drosophila 상피 신호서열과 프레임에 융합된 tox34를 함유한다. Drosophila 상피 신호서열-tox34 유전자 융합(DCtox34)를 BamHI로 pEBDCtox34를 소화시키고 Klenow로 단부에 채운 후 BglII로 소화시키므로서 pSp-tox34로 전달했다. EcoRI로 소화시키고, 블런트 단부화하며, BglII로 소화시킨 pSp-tox34에 DCtox34 함유단편을 클로닝하므로서 P_synXIV프로모터의 존재하에서 DCtox34를 위치시켰다.

tox21A 신호서열과 융합된 성숙 tox34 유전자로 이루어진 하이브리드 독소 유전자를 함유하는 재조합 바이러스 vSp-tox21A/tox34 (도 2A) [토말스키 등 (1993) supra)를 중첩연장에 의한 유전자 접합 기술을 사용하여 구축했다. [호톤(Horton)등(1989) Gene 77 : 61-68]. 먼저, 템플레이트로서 pBS-tox21A [토말스키 등(1993) supra]를 사용하여 프라이머 "a" (SEQ ID NO : 5)와 "6" (SEQ ID NO : 6)로 tox21A 신호서열을 증폭시켰다. 이 프라이머들은 tox21A 신호서열의 처음 24 뉴클레오티드와 일치하고 각각 tox34의 뉴클레오티드 94-120에 상보적이다. 두개의 프라이머를 사용하여 성숙한 tox34 유전자를 PCR 증폭했는데 프라이머 중 하나는 프라이머 "b" (도 1A, 프라이머 "C", SEQ ID NO : 7)에 상보적이고, 두번째 것은 vSp-BSigtox34 (tox34 down, 상기 참조)의 tox34 를 증폭시키기 위하여 이미 사용된 tox34 의 3'말단에 있는 뉴클레오티드 862-876 [토말스키와 밀러(1991) supra]에 상보적이다. 이러한 두개의 개별적인 증폭으로부터의 PCR 생성물들을 조합하고 프라이머 "a" 와 tox34down을 사용하여 더 증폭하므로서 tox21A 신호서열을 갖는 tox34 (tox21A/tox34)를 함유하는 단일 단편을 얻었다. tox21A/tox34를 EcoRI 와 BglII (프라이머 "a"와 tox34up에 도입된 인식부위)로 소화시키고 pSp-tox34의 대응 부위로 클론했다(도 2A 참조).

실시예 7 : 다른 세포성 및 바이러스성 프로모터의 조절하에서 tox34로의

재조합 AcMNPV 바이러스의 구축

하기한 전달 플라즈미드를 사용하는 상기한 대립형질 치환 [오레일리 등(1992) supra]을 사용하여 vp6.9tox34와 vDA26tox34(도 2B)를 생성했다. T4 DNA 폴리머라제로 브런트 단부화된 KpnI과 BglII 부위 사이의 p6.9hc로 pSp-tox34로 부터의 tox34 를 함유하는 933bp EcoRI 단편을 클로닝하므로서 p6.9tox34를 구축했다. p6.9hc는 AcMNPV의 후기 6.9K 코어 DNA 결합 단백질 유전자 프로모터(토드 등(1996) J. Virol. 70 : 2307-2317)의 조절하에서 클로르암페니콜 아세틸트랜스퍼라제 유전자(cat)를 함유하는 리포터 플라즈미드이다. EcoRI와 EcoRV로 소화시킨 pSp-tox34로 6.9K 프로모터 [윌슨(Wilson)등 (1987) J. Virol. 61 : 661-666] 조절하에서 tox34 를 함유하는 p6.9tox34로 부터의 1.1Kb EcoRI/EcoRV 단편을 클로닝하므로서 전달벡터, pSp-p6.9tox34를 구축했다(도 2B 참조). AcMNPV의 초기 DA26 유전자 mRNA [오레일리 등(1990) J. Gen. Virol. 71 : 1029-1037] 중 AUG의 뉴클레오티드 -283 - -264 와 일치하고 -22 - -1에 상보적인 두개의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 vDA26tox34를 구축했다. 290bp PCR 생성물을 EcoRI와 BglII (프라이머에 도입된 인식부위들)로 소화시키고 AcMNPV의 후기 캐스피드(caspid) 단백질 유전자 프로모터[티엠(Thiem)과 밀러 (1989) J. Virol. 63 : 4489-4497]의 조절하에서 cat를 함유하는 pCAPCAT[티엠과 밀러(1990) supra]리포티드 플라즈미드의 EcoRV와 BglII 부위 사이로 클론했다. 이 구축물, pDA26CAT는 캐스피드 단밸질 유전자 프로모터 대신에 DA26 유전자 프로모터를 함유한다. tox34 함유 933bp 단편을 Klenow로 블런트 단부화한 EcoRI로 소화시켜 pSp-tox34로 부터 제거하고 BglII 와 KpnI로 소화시킨 pDA26CAT로 클론한 다음 T4 DNA 폴리머라제로 처리했다. 이 구축물은 EcoRI와 EcoRV로 소화시키고 DA26 프로모터 조절하에서 tox34 함유 1.2kb 단편을 pSp-p6.9tox34의 상응부위에 삽입하여 전달벡터 pSp-DA26tox34를 얻었다(도 2B 참조).

실시예 8 : 천연 tox34 신호서열에서 역 TAAG 서열이 없는 재조합

바이러스의 구축

제조자의 프로토콜에 따라 Transformer Kit (Clontech, Pal. Alto, California)를 사용하여 전달 플라즈미드 pSp-p6.9tox34와 pSp-tox34를 부위지향적 돌연변이유발시키므로서 천연 tox34 신호서열 (도 1E)에 돌연변이된 TAAG서열을 갖는 바이러스 vp6.9tox34m과 vSp-tox34m(도 2C)를 생성했다. 두개의 모 플라즈미드에서 BglII 부위를 제거한 선택 프라이머 5'-GGG TCG ACA CAG CTG CAG CTC-3'(SEQ ID NO : 8)과 역 TAAG 서열을 제거한, tox34 [토말스키와 밀러(1991) supra] 뉴클레오티드 104-126에 상보적인 돌연변이 유발 프라이머 5'-GCC ATT ATC AAT CAA GGA AAT AT-3' (염기변화에 밑줄을 쳤다 : SEQ ID NO : 9)의 두 프라이머를 킷트와 함께 사용했다. 전달 플라즈미드 pSp-p6.9tox34m 과 pSp-tox34m을 서열화하여 tox34 신호서열에 염기 변화가 존재한다는 것을 입증했다.

실시예 9 : 곤충세포에서 tox34 발현의 시간 경과

세포당 10플라크 형성 유니트(pfu)의 감염 다중도로 SF-21 또는 TN-368세포(35mm 플레이트 당 1.0×10⁶세포)를 바이러스 감염시켰다. 다양한 감염 후 (p.i) 시간에서 조직 배양 배지를 수집하고 세포를 2X 전기영동 샘플 완충액 [오레일리 등(1992) supra]에 용균화시켰다. 세포용균액과 세포외 유체로 부터의 단백질을 10% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 SDS-PAGE로 분석하고, 밀리포어 임모빌론(Millipore Immobilon) 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 멤브레인(Millipore, Bedford, MA) 상에 트랜스블롯한 후 TOX34 [맥니트 등(1995) supra ; 토말스키 등(1989) supra]에 특이적인 폴리클로날 항체로 탐침했다. ECL 웨스턴 블롯딩 검출 킷트(Amersham Corp., Arlington Heights, IL)를 사용하여 Tox34를 가시화하고 Molecular Dynamics 농도계(Sunnyvale, California)를 사용하여 정량화했다.

실시예 10 : RNA 분리 및 S1 뉴클레아제 분석

구아니디늄 이소티오시아네이트 법 [처윈(chirgwin) 등 (1979) Biochemistry 24 : 5294-5299]로 다양한 시간 p.i.에서 vSp-BSigtox34 와 vSp-tox34 감염 SF-21 세포로부터 총 RNA를 분리했다. 25㎍의 총 RNA와 NdeI 부위에서 독특하게 단부 라벨링된 648pb 또는 668pb NdeI-HindIII 단편을 사용하여 vSp-BSigtox34 또는 vSp-tox34 감염 세포에 있는 tox34 전사물의 S1 뉴클레아제 분석을 수행했다. 80% 포름아미드-40mM 피페라진-N, N'-비스(2-에탄설폰산)(PIPES)-0.4M NaCl-1mM EDTA로 30℃에서 밤새 DNA-RNA 교잡을 수행했다. S1 뉴클레아제 반응을 샘브룩등(1989) supra에 기술된 바와같이 수행했다.

실시예 11 : AcMNPV와 재조합체에 대한 유충 생검법

각각의 재조합 바이러스들로 부터의 미숙 AcMNPV 2.0×10⁵pfu로 제 5령의 Spodoptera frugiperda 유충을 감염시켜 폴리헤드랄 봉입체(PIBs)를 제조했다. PIBs를 상기한 바와같이 [엘드리지(Eldridge) 등(1992) Biol. Control 2 : 104-110] 분리했다. 상기한 바와같이 [토말스키와 밀러(1992) supra] 신생 Trichoplusia 와 S. frugiperda를 사용하여 LC₅₀(시험유충의 50%를 치사시키는데 요구되는 폐색 바이러스의 농도) 및 ET₅₀(시험된 유충의 50%를 효과적으로 무력화시키거나 치사시키는데 요구되는 평균시간)을 측정했다. 각 바이러스를 시험하기 위해 용량당 60 곤충을 갖는 6개의 바이러스 농도를 사용했다. LC₅₀및 ET₅₀데이타를 각각 프로빗(Probit) 분석[다움, 알.제이. (Daum, R.J.)(1970) Nature 226 : 466-467] 및 비스댓(Vistat) 2.1분석 [휴즈(1990) Vistat : Statistical package for the analysis of baculovirus bioassay data, Boyce Thompson Institute, Cornell University, Ithaca, NY] 으로 분석했다. 모든 생검을 최소한 두번 수행했는데 제시된 결과는 결과의 평균을 나타낸다.

실시예 12 : 재조합 AcMNPV 바이러스 구축

AcMNPV의 폴리헤드린 유전자 측면에 있는 강력한 LSXIV 프로모터와 서열을 공급한 EcoRI-절단 pEVmodXIV로 Tox34 코딩서열 함유 EcoRI 단편을 삽입하여 pEV-Tox34를 구축했다. 야생형 AcMNPV와 pEV-Tox34의 DNA를 밀러 등(1986) supra에 기술된 바와같이 곤충세포에 동시감염시키고 재조합 바이러스를 분리한 다음 폐색-음성 표현형을 기초로 한 선택 및 제한 엔도뉴클레아제 분석 및 서던 교잡에 의한 적절한 대립형질 치한을 위한 스크리닝 후 vEV-Tox34를 선정했다.

vEV-Tox34 감염 곤충세포에서 Tox34 유전자의 발현을 하기와 같이 시험했다. SF21세포들을 리 등(1978) supra에 기술된 바와같이 AcMNPV와 vEV-Tox34로 개별적으로 감염시키고, 대조군(감염되지 않은), AcMNPV와 vEV-Tox 감염세포로 부터 세포배당액을 감염 48시간시간 후에 수집했다. 왁스 나방 Galleria mellonella의 유충에 각각 5㎕ 분취량의 배양액을 주입했다. vEV-Tox34 감면세포로부터의 배양액이 주입된 곤충유충은 2분이내에 무력화된 반면에 야생형 AcMNPV 감염 세포로 부터의 배양액이 주입된 곤충유충은 장기간(몇일)이 지나도 무력화 반응화 반응이 나타나지 않았다. 무력화된 유충은 가시적으로 동작이 없어졌으며 그들은 정향반응(righting response ; 그들을 뒤집어 놓은 후 그들 스스로 똑바로 돌아올 수 있는 능력)이 없었고 그들의 피신처를 만들기 위해 실을 뽑아내는데(왁스나방 유충의 일반적인 습성) 실패했다. 대조유충은 이동, 정향반응 및 실을 뽑는 습성을 나타냈다. 이 결과는 Tox34 cDNA 코딩서열의 발현을 거쳐 야생형 AcMNPV로 감염된 세포에서가 아니라 vEV-Tox34 감염세포에서 신경무력화 독소가 생성되며 이러한 독소는 세포외 매질로 분비되었다는 것을 나타낸다. Tox34 유전자 생성물은 시험된 곤충유충에서 수축근육의 무력화를 이룬다.

감염 중 곤충유충의 섭취 습성을 조절하는, Tox34 유전자를 갖는 바쿠로바이러스의 능력을 실험하기 위하여 시험유충의 혈임파에 정제된 신생 바이러스를 주입하므로서 곤충을 vEV-Tox34에 감염시켰다. 초기 약 제 4령의 T. ni 유충에 TC-100배지(거짓 감염시킨) 또는 야생향 AcMNPV 또는 vEV-Tox34(유충당 4×10⁵플라그 형성 유니트의 바이러스)에 감염된 세포 배양물로부터의 신생 바이러스 입자를 함유하는 배지를 주입했다. 대조 유충은 배양배지 또는 야생형 AcMNPV가 주입된 유충들을 포함시켰다. VEV-Tox34가 주입된 곤충들은 주입후 36시간 정도에서 무력화(무동작 및 정향 반응 없음) 되었다.

상기한 바이러스 구축에 있어서, Tox34 코딩서열은 고감염 중복도(moi ; 즉 10바이러스/세포)로 감염된 세포에서 약 18hrs pi까지 또는 1의 moi로 감염된 세포에서 24-30hrs pi까지 발현되지 않은 매우 후기의 LSXIV 바쿠로바이러스 프로모터 [1993. 9. 19. 에 허여된 미국특허 제 5,244,805호 (밀러) 참조)의 엄격한 조절하에서 발현된다. 따라서, 바쿠로 바이러스 매개 Tox34 발현의 무력화 효과가 약 36hrs pi까지 관찰되지 않는다는 것이 예상되지 않았던 것은 아니다.

AcMNPV의 ETL 프로모터 (여기에 참고로 도입된 크로우포드(Crawford) 등(1988) J. Virol. 62 : 2773-2778 에 기술된)의 엄격한 조절하에서 발현된 Tox34 코딩서열로 트랜스플레이스먼터(transplacement) 플라즈미드 phc-ETL-Tox34를 구축했다. EcoRV 부위와 BglII 부위 사이의 폴리헤드린 프로모터를 ETL 코딩 서열의 상류-6 (+1, +2, +3에서 ETL 번역개시 ATG에 비하여)에서 약 300bp까지 연장하는 ETL 프로모터 서열과 치환하므로서 phcwt [랜킨(Rankin) 등(1988) supra] 로부터 유도된 phc-dET의 EcoRI 부위에 Tox34함유 EcoRI단편을 삽입했다. 트랜스플레이트먼트 플라즈미드와 아생형 AcMNPV를 동시감염시키고 적절한 비폐색 재조합체를 분리, 특성화시켰다.

속 Pyemotes 에서 진드기 종에 대한 숙주 성능의 독서오가 부분적인 목록
독 성
	곤 충	사 람	숙 주
ventricosus 군
anobii	심함	(?)	CurculionidaeScolytidaeBuprestidaeAnobiidae
beckeri	심함	(?)	LyctidaeScolytidae
emarginatus	약함	약함	Cecidomyiidae
schwerdtfegeri	심함	심함	AnobiidaeBuprestidae
tritici	심함	심함	CucujidaeCurculionidaeKalotermitidaeVespidae
tuberculatus	(?)	(?)	Anobiidae
ventricosus	심함	심함	ApoideaChalcidoidea
zwoelferi	심함	심함	Cecidomyiidae
scolyti 군
dimorphus	약함	없음	Scolytidae
dryas	약함	없음	Scolytidae
giganticus	약함	없음	Scolytidae
parviscolyti	약함	없음	Scolytidae
scolyti	약함	없음	Scolytidae

크로스(Cross)와 모저(Moser)(1975) Ann. Entomol. Soc. Am. 68: 723-732로부터 변성됨.

¹프로빗 분석에 의해 측정됨

²LC₉₅용량에서 ViStat 2.1 분석에 의해 측정됨.

¹프로빗 분석에 의해 측정됨.

²LC₉₅용량에서 ViStat 2.1분석에 의해 측정됨.

¹프로빗 분석에 의해 측정됨.

²LC₉₅용량에서 ViStat 분석에 의해 측정됨.

¹프로빗 분석에 의해 측정됨.

²LC₉₅용량에서 ViStat 2.1분석에 의해 측정됨.

¹프로빗 분석에 의해 측정됨.

²LC₉₅용량에서 ViStat 2.1분석에 의해 측정됨.

* 293 아미노산의 부분적인 서열.

야생형 HzSNPV와 다양한 재조합 바이러스로 입으로 감염된Heliocoverpa zea 유충의 시간-사망률 반응. 생물학적 정량 #2
	LC50	LC95
바이러스	ET50 ± SE	기울기 ± SE	ET50 ± SE	기울기 ± SE
HzSNPV Elkar	64.3 ± 2.8	8.9 ± 1.7	65.4 ± 2.2	12.0 ± 2.0
HzSNPV (BSU361-)	62.2 ± 2.3	11.6 ± 2.5	58.3 ± 1.9	10.0 ± 1.6
HzEGTdel	67.3 ± 3.8	9.6 ± 2.6	67.3 ± 2.3	9.5 ± 1.5
HzEGTp6.9tox34	41.6 ± 1.2	14.5 ± 3.0	38.0 ± 0.7	18.3 ± 3.1
HzEGThsptox34	44.0 ± 0.9	20.0 ± 3.9	44.1 ± 0.7	20.6 ± 3.6
HzEGTDA26tox34	39.1 ± 1.5	12.0 ± 2.8	35.4 ± 0.6	19.0 ± 3.9

Claims (20)

1. 바쿠로바이러스 6.9K 프로모터, 바쿠로바이러스 DA26 프로모터 및 열 충격 유전자 프로모터로 이루어진 그룹으로부터 선택된 프로모터와 이 프로모터에 결합되어 이 프로모터의 엄격한 조절하에서 발현되는, 곤충 특이적 독소에 대한 코딩서열을 포함하는 재조합 DNA 분자.
2. 제 1항에 있어서, 상기 코딩서열이 곤충 특이적 신경독소를 엔코딩하는 재조합 DNA분자.
3. 제 2항에 있어서, 상기 코딩서열이 Pyemotos 속의 진드기로부터의 곤충특이적 무력화 신경독소를 엔코딩하는 재조합 DNA 분자.
4. 제 3항에 있어서, 상기 코딩서열이 SEQ ID NO : 1으로 주어진 바와같이 뉴클레오티드 120-873 또는 거기에 최소한 약 70%의 뉴클레오티드 서열 동족체를 가지며, 곤충 특이적 신경독소 활성을 갖는 단백질을 엔코딩하는 서열인 재조합 DNA 분자.
5. 제 4항에 있어서, 엔코딩된 곤충 특이적 무력화 신경독소가 SEQ ID NO : 4 에 도시된 아미노산을 포함하는 재조합 DNA 분자.
6. 제 4항에 있어서, 엔코딩된 곤충특이적 무력화 신경독소가 약 뉴클레이티드 120에서 엔코딩된 아스파르데이트부터 SEQ ID NO : 1의 약 뉴클레오티드 873에서 엔코딩된 시스테인까지 SEQ ID NO : 2에 도시된 아미노산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자.
7. 바쿠로바이러스 6.9K, 바쿠로바이러스 DA26 프로모터 및 열 충격 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 프로모터와 이 프로모터의 엄격한 조절하에서 발현되는, 곤충특이적 독소에 대한 코딩서열을 함유하도록 유전공학적으로 처리된 바쿠로바이러스.
8. 제 7항에 있어서, 상기 코딩서열이 Pyemotos 속의 진드기로부터의 곤충특이적 무력화 신경독소를 엔코딩하는 바쿠로바이러스.
9. 제 8항에 있어서, 상기 코딩서열이 SEQ ID NO : 1으로 주어진 바와같이 뉴클레오티드 120-873 또는 거기에 최소한 약 70%의 뉴클레오티드 서열 동족체를 가지며, 곤충 특이적 신경독소 활성을 갖는 단백질을 엔코딩하는 서열인 바쿠로바이러스.
10. 제 9항에 있어서, 엔코딩된 곤충 특이적 무력화 신경독소가 SEQ ID NO : 2에 도시된 아미노산 서열을 포함하는 바쿠로바이러스.
11. 제 10항에 있어서, 엔코딩된 곤충 특이적 무력화 신경독소가 SEQ ID NO : 4 에 도시된 아미노산을 포함하는 바쿠로바이러스.
12. 제 7항에 있어서, 상기 바쿠로바이러스가 뉴클레오폴리헤드로바이러스인 바쿠로바이러스.
13. 제 7항 내지 제 12항에 있어서, 상기 뉴클레오폴리헤드로바이러스가 Autographa California 뉴클레어 폴리헤드로시스 바이러스(AcMNPV) 또는 Helicoverpa zea 뉴클레오폴리헤드로스드 바이러스(HzSNPV)인 바쿠로바이러스.
14. 제 7항 내지 제 12항에 있어서, 상기 열 충격 프로모터가 Drosophila melanogaster hsp70 프로모터인 바쿠로바이러스.
15. 제 14항에 있어서, vHSP70tox34인 바쿠로바이러스.
16. 제 13항에 있어서, v6.9-Tox34 또는 vDA26-Tox34인 바쿠로바이러스.
17. 제 13항에 있어서, vHzDA26tox34, vHSP70tox34, vHzEGTHSP70tox34, vHz6.9tox34, vHzEGT6.9tox34, vHzHSP70tox34 및 vHzEGTDA26tox34인 바쿠로바이러스.
18. 제 7항 내지 제 17항에 있어서, 엑다이스테로이드 UDP-글루코실 트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자가 불활성화되어 있는 바쿠로바이러스.
19. 표적곤충에 대한 독성효과를 이루는데 효과적인 양의, 제 7항 내지 제 18항 중 어느 한 항의 바쿠로바이러스 및 농업적으로 수용가능한 캐리어를 포함하는 곤충독성 조성물.
20. 해충의 해동반경에 제 19항의 곤충독성 조성물을 살포하는 단계를 포함하는 해충방제 방법.