CZ20004156A3 - Insekticidy na bázi rekombinantního bakuloviru - Google Patents

Abstract

Předkládané řešení poskytuje Izolovaný rekombinantní bakulovirus pro Plutella xylostella, použitelný jako insekticidní činidlo. Výhodně má rekombinantní bakulovirus do svého genomu vložený gen kódující insekticidní toxin. Řešení také poskytuje insekticidní přípravky a kompozice obsahující rekombinantní bakuloviry pro Plutella xylostella a způsoby pro hubení hmyzích škůdců a pro snížení zamoření plodin hmyzem.

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká vylepšených Plutella xylostella bakuloviru. použitelných jako biologické insekticidy. Vynález poskytuje rekombinantní bakuloviry, které byly geneticky upraveny tak, aby obsahovaly geny kódující insekticidní toxiny.

Dosavadní stav techniky

Bakuloviry jsou hmyzí viry, které jsou použitelné jako biologické insekticidy. Bylo popsáno více než 400 izolátů bakulovirů. Virus jaderné polyhedrosy Autographa californica (AcMNPV), typický představitel čeledi Baculoviridae, byl původně izolován z Autographa californica, nočního motýla běžně známé jako vojtěšková housenka. Tento virus infikuje 12 čeledí a více než 30 druhů hmyzu řádu Lepidopteran (Granados et al., The Biology of Baculoviruses, I, 99 (1986)). Není známo, že by AcMNPV produktivně infikoval jakýkoliv druh mimo tento řád.

Životní cyklus bakulovirů, jako je například AcMNPV, má dvě stadia. Každé stadium životního cyklu je representováno specifickou formou viru: vyvinuté viriony (BV), které jsou neuzavřené, a oklusní tělíska (OB).

V přirozené formě infikujíc! hmyz jsou četné viriony nacházeny ve formě zanořené do parakrystalické proteinové matrice známé jako oklusní tělísko (OB), které se také označuje jako polyhedrální inklusní tělísko (PIB). Proteinové virové obaly jsou označovány jako polyhedra. Polyhedrinový protein mající molekulovou hmotnost 29 kD je hlavním virem kódovaným strukturálním proteinem virové okluse (U.S. patent č. 4745051).

• ·· · · β · · · · · · ······ · · · • ···<»· * · ** * * • «··· · · · ···· · · ·· ··· ·· ···

Virové okluse jsou významnou části přirozeného životního cyklu bakuloviru, protože poskytují prostředek pro horizontální (ze hmyzu na hmyz) přenos mezi citlivými druhy hmyzu. V prostředí požije citlivý hmyz (obvykle v larválním stadiu) virové okluse v kontaminované potravě, jako je rostlina. Krystalické okluse disociují ve střevu citlivého hmyzu za uvolnění infekcích virových částic. Tyto viry vzniklé z okluse (ODV) se replikují v buňkách tkáně středního střeva.

Předpokládá se, že virové částice vstupují do buněk endocytosou nebo fúsí a že virová DNA je neobalená v místě jaderného póru nebo jádra. Replikace virové DNA je detekována během 6 hodin. 10-12 hodin po infekci (p,i.) se sekundární infekce šíří do jiných tkáni hmyzu prostřednictvím extracelulárního šíření víru (BV) z povrchu buněk. BV forma viru je odpovědná za šíření viru mezi buňkami u infikovaného hmyzu, stejně jako za přenos infekce v buněčné kultuře.

Později v infekčním cyklu (12 hodin p.i.) může být v infikovaných buňkách detekován polyhedrinový protein. Za 18-24 p.i. se polyhedrinový protein skládá v jádru infikované buňky a virové částice se zanořují do proteinových oklusí. Virové okluse se akumulují ve velkém počtu 4-5 dnů, do lýzy buňky. Tyto polyhedra nemají aktivní úlohu v šíření infekce v larvě. BV se v hemolymfě množí a šíří, což vede ke smrti larvy.

Po smrti infikované larvy zůstávají miliony polyheder v rozkládající se tkáni, zatímco BV jsou degradovány. Když jiná larva pozře polyhedra, například v kontaminovaném rostlinném materiálu nebo jiné potravě, cyklus se opakuje.

Závěrem, uzavřená forma viru je odpovědná za prvotní infekci hmyzu ve střevě, stejně jako za stabilitu viru v prostředí. ODV ···«·· · · · • ····· · · 99 · · • · · · · ··· ···· ·· ·· ··· ·· ·*· jsou v podstatě neinfekční pří podání injekcí, ale jsou vysoce infekční při orálním podání. Neuzavřená forma viru (t.j. BV) je odpovědná za sekundární infekci a infekci mezi buňkami. BV jsou vysoce infekční pro buňky v kultuře nebo pro vnitřní tkáně hmyzu při injekci, ale jsou v podstatě neinfekční při orálním podání.

Hlavní překážkou intenzivního použití insekticidních bakulovirů v zemědělství je prodleva mezi prvotní infekcí hmyzu a jeho smrtí. Tato prodleva může být v řádu dnů až týdnů. Během tohoto období hmyz pokračuje v příjmu potravy, což dále poškozuje rostliny. Pro zkrácení této prodlevy byly připraveny rekombinantní bakuloviry, které exprimují substance kontrolující nebo modifikující hmyz, jako jsou toxiny, neuropeptidy, hormony nebo enzymy (Tomalski,

M.D. et al., Nátuře 352: 82-85 (1991); Federici, In Vitro 28: 50A (1992); Martens et al., App. and Envir. Microbiology 56: 2764-2770 (1990); Menn et al., Agríc. Food Chem. 37: 271-278 (1989);

Eldridge et al., Insect Biochem 21: 341-351 (1992); Hammock et al., Nátuře 344: 458-461 (1990)).

Druhou hlavní překážkou použití insekticidních bakulovirů je omezený rozsah jejich hostitelů. Ačkoliv omezený rozsah hostitelů pro bakuloviry je činí bezpečnými pro jiné než cílové organismy, znemožňuje jim také kontrolu různých škůdců čeledi lepidopteran přítomných na poli. Toto zejména platí tehdy, když komplex hmyzu čeledi lepidopteran, který má být kontrolován, zahrnuje hmyz, který je bud nepermisivní, nebo semipermisivní pro infekci použitým insekticidním bakulovirem. Hmyz, který je nepermisivní pro infekci, je takový hmyz, který nemůže být produktivně infikován jakoukoliv dávkou; hmyz, který je semipermisivní pro . infekci, je takový hmyz, který může být produktivně infikován dávkou viru, která je alespoň o jeden, častěji však o dva nebo více, řádů vyšší než dávka nutná pro produktivní infekci citlivých hostitelů, t.j. permisivních hostitelů. Před předkládaným vynálezem nebyl identifikován žádný bakulovirus rodu

Nucleopolyhedrovirus, pro který je předivka polní, Plutella xylostella, permisivnim hostitelem. Tento hmyz je významným škůdcem na mnohé zelenině a vyvinula se u něj resistence jak na chemické, tak na biologické insekticidy.

Proto existuje potřeba biologických insekticidů, které mají (i) lepší účinnost a kratší prodlevu mezi infekcí a mortalitou, a (ii) větší rozsah hostitelů, který umožní kontrolu širokého rozsahu hmyzích škůdců čeledi Lepidopteran, včetně, například Plutella xylostella.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález poskytuje rekombinantní bakuloviry pro Plutella xylostella (PxNPV), které mají lepší insekticidní aktivitu proti Plutella xylostella než jiné přirozené a rekombinantní bakuloviry.

Rekombinantní PxNPV podle předkládaného vynálezu jsou PxNPV obsahující jednu nebo více genetických alterací vzhledem k přirozenému PxNPV. Mezi genetické alterace patří například vložení nebo delece jednoho nebo více restrikčních míst; modifikace, delece nebo duplikace jednoho nebo více genů kódovaných virem; a vložení jednoho nebo více genů kódujících heterologní proteiny, t.j. proteiny, které nejsou kódované virem nebo jsou kódované jiným virem.

Výhodně obsahují rekombinantní PxNPV ve svých genomech sekvenci nukleové kyseliny kódující substanci ovlivňující hmyz, jako je například insekticidní toxin, peptidový hormon, enzym nebo receptor, která je operativně navázaná na promotor schopný aktivovat transkripci v cílovém hmyzu. Nejlépe je substancí b

·· ·» ·· • · · · · · • · · · · • ··· · · · • · · ♦ ··· ·· ·· ovlivňující hmyz insekticidní toxin. Předpokládá se, že rekombinantní bakulovirus kódující insekticidní toxin v kontextu s

PxNPV genomem bude mít výrazně lepší insekticidní vlastnosti.

Příklady insektici dních toxinů jsou AalT, AaHITí, AaHIT2, LqhIT2, LqqlTl, LqqIT2, BjITl, BjIT2, LqhP35, LqhalT, SmpIT2, SmpCT2, SmpCT3, SmpMT, DK9.2, DK11, DK12, μ-agatoxin, King Kong toxin, Pt6, NPS-326, NPS-331, NPS-373, Tx4(6-l), TxP-1, omega-atratoxiny, α-konotoxiny, μ-konotoxiny, chlorotoxin a omega-konotoxiny. V některých provedeních je použit přirozený sekreční signální peptid, t.j. signální peptid asociovaný s toxinem; v jiných provedeních je použit heterologní signální peptid pro navození sekrece toxinu z infikovaných hmyzích buněk. Příklady použitelných heterologních signálních peptidů jsou peptidy odvozené od pBMHPC-12 signální sekvence z Bonibyx moři; signální sekvence ad ipokinetického hormonu z Mandura sexta; apolipoforinová signální sekvence z Manduca sexta; chorionová signální sekvence z Bombyx moři; kutikulová signální sekvence z Drosophila melanogaster; signální sekvence esterasy-6 z Drosophila melanogaster; a pohlavně specifická signální sekvence z Bombyx moři .

Vynález také zahrnuje přímé ligační vektory, které jsou navrženy pro usnadnění konstrukce rekombinantních PxNPV genomu pomocí ligace DNA fragmentů in vitro. Vložení DNA vzniklé při takové ligaci do vhodného hostitele vede k produkci rekombinantních PxNPV.

V jiném aspektu vynález poskytuje expresní kazety kódující insekticidní toxiny. Expresní kazety obsahují promotorovou sekvenci, výhodně odvozenou od Drosophila melanogaster hsp70 promotoru, která je operativně navázaná na sekvenci nukleové kyseliny kódující toxin. Expresní kazety podle předkládaného

vynálezu mohou být také obsaženy v plasmidových vektorech, které jsou navrženy jako modulární expresní vektory.

V ještě jiném provedení vynález poskytuje geny s optimalizovanými kodony kódující hmyzí toxiny, jako jsou například geny uvedené, na obr. 10 a 11, dále. Geny s optimalizovanými kodony jsou ty geny, ve kterých byly jednotlivé kodony přítomné v přirozené sekvenci kódující toxin substituovány alternativními kodony, které jsou účinněji využívány aparátem syntetizujícím proteiny v hmyzí buňce.

V ještě jiném aspektu vynález poskytuje insekticidní kompozice a přípravky obsahující alespoň jeden rekombinantní PxNPV podle předkládaného vynálezu a zemědělsky přijatelný nosič.

V ještě jiném aspektu vynález poskytuje způsob pro hubení hmyzích škůdců a pro redukci zamoření škůdci, který obsahuje aplikaci insekticidně účinného množství insekticidní kompozice nebo přípravku obsahujícího PxNPV do dané oblasti.

Popis obrázků na připojených výkresech

Obr. 1 je schematické znázornění postupů použitých pro přípravu pmd 205.1 , pmd 216.1 a pmd 220.2 vektorů pro produkci rekombinantních PxNPV s deletovaným genem pro virovou ecdysteroid glukosytransferasu (egt).

Obr. 2 je schematické znázornění postupů použitých pro přípravu vektoru LAB 50.2.

Obr. 3 je schematické znázornění struktury pMEV modulárních expresních vektorů.

•· ·· · ·· • · · ·· · ·

Obr. 4 je schematické znázornění pMEV vektorů obsahujících různé promotory.

Obr. 5 je schematické znázornění klonování sekvencí do modulárních expresních vektorů.

Obr. 6 ukazuje D. melanogaster hsp70 promotorový modul v pMEVS a amplifikační primery použité pro izolaci sekvence.

Obr. 7 ukazuje D. melanogaster hsp70 promotorový modul v pMEV6 a amplifikační primery použité pro izolaci sekvence.

Obr. 8 je ilustrací DNA sekvence s optimalizovanými kodony kódující AalT a ukazuje oligonukleotidy a amplifikační primery použité pro syntézu sekvence.

Obr. 9 je schematické znázornění struktury pMEV/ADK modulárních expresních vektorů.

Obr. 10 je ilustrací DNA sekvence s optimalizovanými kodony kódující LqhIT2 toxin a ukazuje oligonukleotidy a amplifikační primery použité pro syntézu sekvence.

Obr. 11 je ilustrací DNA sekvence s optimalizovanými kodony kódující omega-ACTX-HVl toxin a ukazuje oligonukleotidy a amplifikační primery použité pro syntézu sekvence.

Podrobný popis vynálezu

Při provádění předkládaného vynálezu může být použito mnoho technik molekulární biologie, mikrobiologie, rekombinantní DNA, proteinové biochemie a hmyzí virologie známých odborníkům v oboru, jak jsou plně vysvětleny v, například, Sambrook et al., 1989, ···· · · · · · · · · ·»«··· · · · • ··· *··· · • · · · · * · · ···· ·· ·· ··· ·· ···

Molecular Cloníng: A Laboratory Manual, druhé vydání, Cold Spring

Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York;

01igonucleotide Synthesis, 1984 (M.L. Gait ed.); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, 1997 (Jhn Wiley and Sons) serie Methods in Enzymology (Academie Press, lne.); Protein Purification: Prínciples and Practice, druhé vydání (Springer-Verlag, N.Y.); Summers et al., A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555, 1987; a 0'Eeilly et al . , Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, 1994 (Oxford Univ. Press, N.Y.).

Předkládaný vynález poskytuje izolované, přečištěné rekombinantní Plutella xylostella bakuloviry (PxNPV), které jsou použitelné jako biologické insekticidy. PxNPV, jak je zde použít, označuje izolát bakuloviru rodu Nucleopolyhedrovirud (NPV), jehož přirozená verze byla izolována z infikovaných larev Plutella xylostella a který je geneticky odlišný od jiných známých bakulovirů a který vykazuje vyšší infektivitu pro larvy Plutella xylostella než ostatní bakuloviry. Genomové sekvence rekombinantních PxNPV podle předkládaného vynálezu, s vyloučením heterologních sekvencí, vykazují alepoft 90% identitu sekvence, a lépe alespoň 95% identitu sekvence, s genomovou sekvencí PxNPV uloženou jako ATCC VR-2607. PxNPV spadající do rozsahu předkládaného vynálezu může být identifikován:

(i) Měřením infektivity pro larvy Plutella xylostella. PxNPV podl předkládaného vynálezu obvykle vykazuje infektivitu pro larvy Plutella xylostella, která je alepoň o dva řády vyšší, než je infektivita V8 kmene AcMNPV uloženého jako ATCC VE-2465.

(ii) Trávením virové genomové DNA HindlII, Xhol a/nebo Pstl a srovnáním vzniklých restrikčních fragmentů s fragmenty ······ · · z • 11119 9 · ·· · · • 1111 111

1111 11 11 ··· ·· ··· produkovanými trávením genomové DNA odvozené od PxNPV a non-PxNPV bakulovirů. PxNPV podle předkládaného vynálezu, s vyloučením fragmentů vzniklých v důsledku genetických změn, má restrikční fragmenty charakteristické pro PxNPV, t.j. fragmenty, které vznikají při trávení PxNPV a nevznikají při trávení DNA jiných bakulovirů.

Vynálezci zjistili, že rekombinantní PxNPV podle předkládaného vynálezu má lepší insekticidní aktivitu na larvy Plutella xylostella ve srovnání s přirozenými PxNPV a/nebo rekombinantními NPV odvozenými od jiných druhů bakulovirů. Rekombinantní PxNPV podle předkládaného vynálezu jsou PxNPV, které obsahují jednu nebo více genetických alterací vzhledem k přirozenému PxNPV. Termín genetická alterace označuje jakoukoliv změnu v sekvenci genomu PxNPV, včetně, například, vložení nebo delece jednoho nebo více restrikčních míst; modifikace, delece nebo duplikace jednoho nebo více genů kódovaných virem; a vložení jednoho nebo více genů kódujících heterologní proteiny, t.j. proteiny, které nejsou kódované virem nebo jsou kódované jiným virem. Například, modifikované PxNPV, jejíchž genomy obsahujíc restrikční místa nepřítomná v přirozených PxNPV, nebo naopak, které neobsahují jedno nebo více restrikčních míst přítomných v přirozeném PxNPV, spadají do rozsahu předkládaného vynálezu. Termín restrikční místo označuje sekvenci nukleové kyseliny, která je rozpoznávacím místem pro restrikční endonukleasu. Obvykle je provedena adice a/nebo delece jednoho nebo více restrikčních míst pro vytvoření klonovacího místa nepřítomného v přirozeném PxNPV, t.j. pro vytvoření sekvence obsahující alespoň jedno jedinečné restrikční místo pro vložení heterologního genu do genomu PxNPV. Výhodně obsahuje rekombinantní PxNPV ve svém genomu alespoň jeden heterologní gen, včetně například genů kódujících substance ovlivňující hmyz, jako jsou například insekticidní toxiny, hormony, enzymy nebo receptory.

Nejlépe obsahuje

···· · ·· * • ·· · · ··· · · · · ······ · · · • ··· · · · · · · * · • · · · · ··· ···· ·· ·· ··· ·· ··· rekombinantní PxNPV heterologní gen kódující

insekticidní toxin. Mezi vhodné insekticidní toxony patří, například, toxiny uvedené v následující tabulce.

Toxin Odkaz

AalT, AaH IT1, AaH IT2 Darbon et al., Int. J. Peptide

	Protein Res., 20: 320-330, 1982; Loret et al., Biochem. 29: 142-1501, 1990
LqhIT2	Zlotkin et al., Biochem. 30: 4814— 4821, 1991; Zlotkin et al., Evropská patentová, přihláška EP 0374753 A2, 1990
LqqlTl, LqqIT2	Zlotkin et al., Arch. of Biochem. and Biophys. 240: 877-887, 1985; Zlotkin et al., Evropská patentová přihláška EP 0374753 A2, 1990
BjITl, BjIT2	Loret et al., Biochem. Biophys. Acta 701: 370-387, 1982; Zlotkin et al., Evropská patentová přihláška EP 0374753 A2, 1990
LqhP35	Zlotkin et al., Evropská patentová přihláška EP 0374753 A2, 1990
LphalT	Eitan et al., Biochem. 29: 5941-5947, 1990
SmpIT2	Zlotkin et al., Evropská patentová přihláška EP 0374753 A2, 1990

• · • · · • · s »» * patentová ·· ·· • « · · • · · • ·»· • · ···· ·· • · » • » • · • · ·· ·

SmpCT2

Zlotkin et al.

Evropská

SmpCT3 přihláška EP 0374753 A2 , 1990

Zlotkin et al., Evropská patentová Přihláška EP 0374753 A2, 1990

SmpMT

DK9.2

DK11

Zlotkin et al., Evropská patentová Přihláška EP 0374753 A2, 1990

Krapcho et et., Mezinárodní patentová přihláška WO 92/15195, 1992

Krapcho et et.. Mezinárodní patentová přihláška WO 92/15195, 1992

DK12

Krapcho et et., Mezinárodní patentová přihláška WO 92/15195, 1992 μ-agatoxin

Kink Kong toxin

Skinner et al., J. Biol.	Chem.	264:
2150-2155, 1989; Adams et Biol. Chem. 265: 861-867,	al. , 1990	J.
Hillyard et al., Biochem.	28:	358-361

Pt.6

NPS-326

1989

Leisy et al., Evropská patentová přihláška EP 0556160 A2, 1993

Krapcho et et., Mezinárodní patentová přihláška WO 93/15192, 1993

NPS-331

Krapcho et et., Mezinárodní patentová přihláška WO 93/15192, 1.993

	44 44 44 4 ·· * • 44 4 4 444 « 4«· • 44··· 4·· 4 44444 4 4 *4 4 4 • 4444 »44 • 444 44 44 444 ·· ···
NPS-373	Krapcho et et., Mezinárodní patentová přihláška WO 93/15192, 1993
Tx4(6-1)	Figueriredo et al., Toxieon 33: 83-93, 1995
TxP-1	Tomalski et al., Toxieon 27: 1151-1167 1989
omega-atrakotoxiny	Atkinson et et., Mezinárodní patentová přihláška WO 93/15108, 1993
a~konotoxiny	Gray et al., J. Biol. chem. 256: 4734- 4740, 1981; Gray et al., Biochem. 23: 2796-2802, 1984
μ-konotoxiny	Cruz et al., J. Biol. Chem. 260: 92809288, 1989; Cruz et al., Biochem. 28; 3437-3442, 1989
chlorotoxin	Debin et al., Am. J. Physiol. 264: 361-369, 1993
omega-konotoxiny	Olivera et al., Biochem. 23: 5087- 5090, 1984; Rivier et al., J. Biol. Chem. 262: 1194-1198, 1987

Sekvence kódující toxin je operativně navázaná na promotor, t.j. promotorové sekvence je umístěna před sekvencí kódující toxin tak, že exprese toxinu je pod kontrolou promotoru. Promotor může být promotor odvozený od bakulovirů, jako je například DA26, 35K, 6.9K a polyhedrinový (polh) promotor (0'Reilly et al., J. Gen. Virol. 71: 1029 (1990); Friesen et al., J. Virol. 61: 2264, 1987;

• · · · r · · · • · ·

Wilson et al., J. Virol. 61: 661-666, 1987; Hooft van Iddekinger et al., Virol. 131: 561, 1983; a obecně viz Miller, ed., The Baculoviruses, Plenům Press, New York, 1997). Alternativně může byt použit promotor hostitelské buňky, jako je například hmyzí hsp70 promotor nebo aktinový promotor. Může být použit jakýkoliv přirozený nebo syntetický promotor aktivní v navození transkripce v cílových hmyzích buňkách.

Dále, DNA sekvence kódující toxin může obsahovat před sebou sekvenci kódující signální peptid, který - ve své původní buňce řídí sekreci toxinu. Alternativně může být sekvence kódující toxin fúzována v rámečku s předcházející DNA sekvencí kódující heterologní signální sekvenci, t.j. sekvenci odvozenou z jiného zdroje, včetně například sekvencí odvozených z pBMHPC-12 signální sekvence z Bombyx moři; signální sekvence adipokinetického hormonu z Mandura sexta; apolipoforinové signální sekvence z Manduca sexta; chorionové signální sekvence z Bombyx moři; kutikulové signální sekvence z Drosophila melanogaster; signální sekvence esterasy-6 z Drosophila melanogaster; a pohlavně specifické signální sekvence z Bombyx moři, které jsou všechny popsány v U.S. patentu č. 5547871.

V některých provedeních obsahují PxNPV podle předkládaného vynálezu ve svém genomu gen kódující přirozenou nebo mutantní esterasu juvenilního hormonu (JHE), jejíž exprese může způsobit ireversibilni ukončení příjmu potravy a zakuklení a tak může vést ke smrti cílového hmyzu. Viz například WO 94/03588.

Rekombinantní PxNPV mohou být také připraveny genetickým upravením přirozeného nebo preexistujícího rekombinantního PxNPV kmene tak, že výsledkem je modifikace jedné nebo více funkcí kódovaných virem. Například, jeden nebo více virových genů, jako jsou například geny kódující virový polyhedrinový protein,

4

• ·· · · ··· • ♦ » · · · • · · · · 4 0 • 0 0··

000 ·· 00 00· ecdysteroid glukosyltransferasu (EGT) nebo plO protein může být modifikován, deletován nebo duplikován. Kromě toho mohou být vloženy sekvence odvozené od jiných bakulovirů, jako je například region V8 kmene AcMNPV, který obsahuje determinantu vedoucí k fenotypu s rychlejším usmrcováním, jak je popsána v U.S. patentu č. 5662897.

Příklady rekombinantních PxNPV podle předkládaného vynálezu jsou ty, které mají ATCC přírůstková č. VP-2607, VR-2608 a

VR-2609.

Předkládaný vynález poskytuje způsoby a přípravky pro konstrukci rekombinantních PxNPV. Pro přípravu rekombinantních PxNPV může být použita jakákoliv metoda známá v oboru. Například, současná infekce vhodné hostitelské buňky dvěma kmeny PxNPV může vést k homologní rekombinaci mezi dvěma příbuznými sekvencemi in vivo, která může vést ke vzniku rekombinantního PxNPV. Obdobně může homologní rekombinace proběhnout in vivo v buňkách současně transfektováných přečištěnou genomovou DNA PxNPV viru a druhou nukleovou. kyselinou obsahující PxNPV sekvence. Alternativně může být rekombinantní PxNPV připraven vložením izolované virové genomové DNA, která byla předem modifikována in vitro, do buněk.

V jedné sérii provedení jsou rekombinantní PxNPV připraveny za použití vektorů pro přímou ligaci a modulárních expresních vektorů. Tyto složky a způsoby jejich použití pro přípravu rekombinantních PxNPV jsou popsány dále.

Vektory pro přímou ligaci odvozené od PxNPV

Vírové vektory pro přímou ligaci obsahují přečištěné genomové DNA PxNPV viru, které mohou být použity pro konstrukci rekombinantních PxNPV genomu pomocí DNA ligace in vitro. Vektory s

pro přímou ligaci řídí produkci rekombinantních PxNPV virionů po vnesení do vhodné hostitelské buňky. V některých provedeních obsahující PxNPV vektory pro přímou ligaci PxNPV genomovou DNA, která byla modifikována tak, aby obsahovala alespoň jedno klonovací místo, které není přítomné v přirozeném PxNPV. Klonovací místo obsahuje jedno nebo více restrikčních míst, které bud nejsou přítomné v genomu přirozeného PxNPV, nebo nejsou přítomné v nukleové kyselině kódující nebo regulující základní funkce PxNPV viru. Ve druhém případě jsou vektory pro přímou ligaci podle předkládaného vynálezu upraveny tak, aby měly deletována jakákoliv restrikční místa, která leží mimo klonovací místo, takže klonovací místo obsahuje jedno jedinečné restrikční místo. Trávení vektoru pro přímou ligaci jedním nebo více restrikčními enzymy specifickými pro klonovací místo potom vede k zisku DNA přípravku, do kterého může být vložen heterologní segment nukleové kyseliny, obvykle v jednom ligačním kroku, bez narušení základních virových funkcí. Po ligaci heterologní nukleové kyseliny do vektoru pro přímou ligaci může být vzniklý DNA přípravek vložen do vhodné hostitelské buňky pro propagaci rekombinantního PxNPV. Přímé ligační vektory zjednodušují produkci rekombinantních PxNPV tím, že eliminují závislost na rekombinacích in vivo tvořících rekombinantní. viry. Viz například Mezinárodní patentová přihláška WO 94/28114.

Klonovací místa pro použiti v PxNPV přímých ligačních vektorech jsou navržena nejprve pomocí výběru jednoho nebo více restrikčních enzymů, které bud (i) netráví PxNPV DNA vůbec, nebo (ii) rozpoznávají malý počet míst, která neleží v nukleové kyselině kódující nebo regulující základní funkce PxNPV viru. Selekce se provede (i) počítačovým prohledáváním PxNPV DNA sekvence nebo (ii) trávením PxNPV DNA enzymem a detekcí přítomnosti nebo nepřítomnosti produktů trávení. Pokud enzym rozpoznává malý počet míst, tak mohou být tato místa narušena, za použití běžných b

technik (jako je například trávení restrikčním enzymem následované zakončením lepivými konci a re-ligací) za zisku PxNPV DNA, která neobsahuje tato místa, ale zachovává si virovou replikaci a inf ekt ivi tu.

Po selekci jednoho nebo více restrikčních míst se klonovací místo vloží jakýmikoliv vhodnými prostředky, včetně homologní rekombinace in vivo nebo ligace in vitro, do PxNPV DNA (ať přirozené, nebo modifikované jak je popsáno výše pro inaktivací jednoho nebo více restrikčních míst). Výhodně obsahuje klonovací. místo alespoň nepřekrývající se restrikční místa pro umožnění (i) přímého klonování insertu nukleové kyseliny a/nebo (ii) nezávislé inserce mnoha insertů nukleové kyseliny.

Pro přípravu přímých ligačních vektorů z PxNPV mohou být vloženy další modifikace, včetně například modifikací, které vedou k inaktivací virového genu, jako je například gen kódující polyhedrin, ecdysteroid glukosy 1transferasu (EGT) nebo plO protein. V některých provedeních je klonovací místo vloženo v místě, ve kterém způsobí takovou inaktivací.

Modulární expresní vektory a expresní kazety

Modulární expresní vektory pro použití v předkládaném vynálezu jsou plasmidové vektory obsahující expresní kazetu, která může být excidována z modulárního expresního vektoru a ligována do PxNPV přímých ligačních vektorů popsaných výše. Obvykle expresní kazeta obsahuje ve směru 5'-3': promotorovou sekvenci operativně navázanou na 5' netranslaťovaný region (UTP), která obsahuje start místo pro trankripci; sekvenci obsahující jedno nebo více restrikčních míst pro usnadnění inserce heterologního genu (tato sekvence je označena inserční místo); a 3' UTR sekvenci obsahující alespoň místo pro zpracování 3' terminální mRNA a . · ··· ··· ···· ·· ·· ··· ·· ··· polyadenylaci. Expresní kazeta sousedí na jednom z konců s vhodnými restrikčními místy kompatibilními s PxNPV přímým ligačním vektorem.

Mezi vhodné promotory pro použití v modulárních expresních vektorem patří bakulovirové promotory a promotory hostitelských buněk. Mezi vhodné bakulovirové promotory patří, například, DA26, 35K, 6.9K a polyhedrinový (polh) promotor. Mezi vhodné promotory hostitelské buňky patří například hsp70 a aktinový promotor, výhodně odvozený od hmyzu. Sekvence odvozená od promotorové sekvence je sekvence obsahující modifikace, včetně delecí, insercí, substitucí a duplikací přirozené promotorové sekvence. Jediným požadavkem je účinnost konečného promotoru v cílových hmyzích buňkách ve smyslu řízení exprese heterologního genu., na který je operativně navázaná.

Expresní kazety mohou také obsahovat sekvence kódující signální sekvence, které řídí sekreci hetero1ogního proteinu. Signální sekvence mohou být sekvence asociované s heterologním proteinem nebo mohou být odvozeny od jiného proteinu. Mezi vhodné signální sekvence patří například sekvence odvozené od pBMHPC—12 signální sekvence z Bombyx moři; od signální sekvence adipokinetického hormonu z Mandura sexta; od apolipoforinové signální sekvence z Manduca sexta; od chorionové signální sekvence z Bombyx moři; od kutikulové signální sekvence z Drosophila melanogaster; od signální sekvence esterasy-6 z Drosophila melanogaster; a od pohlavně specifické signální sekvence, z Bombyx moři. Sekvence nukleové kyseliny kódující signální peptid je insertována mezi 5-UTR a začátek zralého heterologního proteinu. Spoj mezi 3'~koncem sekvence kódující signální peptid a začátkem zralého heterologního proteinu je navržena tak, aby inserce heterologní sekvence vedla ke vzniku fúsního proteinu mezi signálním peptidem a heterologní sekvenci ve čtecím rámci. Sekvence odvozená od

I 8 známé signální sekvence je sekvence obsahující modifikace, včetně delecí, insercí a substitucí aminokyseliných zbytků v signální sekvenci. Jediným požadavkem je účinnost vzniklé signální sekvence v cílových hmyzích buňkách ve smyslu řízení sekrece heterologní sekvence, na kterou je navázaná, z hmyzích buněk.

Heterologní sekvence pro použití v předkládaném vynálezu zahrnují, například, sekvence kódující substance ovlivňující hmyz, jako jsou například insekticidní toxiny, hormony, enzymy a receptory. Mezi vhodné insekticidní toxiny patří, například, AalT, AaHITl, AaHIT2, LqhIT2, LqqlTl, LqqIT2, BjITl, BjIT2, LqhP3S, LqhotlT, SmpIT2, SmpCT2, Sm_PCT3, SmpMT, DK9.2, DK11, DK12, μ-agatoxin, King Kong toxin, Pt6, NPS-326, NPS-331, NPS-373, Tx4(6-1), TxP-1, omega-atratoxiny, α-konotoxiny, μ-konotoxiny, chlorotoxin a omega-konotoxiny.

Sekvence nukleové kyseliny kódující substanci ovlivňující hmyz a/nebo signální peptidy mohou odpovídat přirozeným sekvencím nukleové kyseliny kódujícím tyto peptidy. Alternativně mohou být sekvence pozměněny tak, aby využívaly optimální kodony pro známé geny ve virovém vektoru (nebo v blízce příbuzných kmenech) a/nebo ve hmyzu, které jsou cílem insekticidních virů podle předkládaného vynálezu. Sekvence s optimalizovanými kodony, t.j. sekvence, ve kterých byla sekvence nukleové kyseliny kódující určitou aminokyselinu modifikována beze změny aminokyseliny kódované v této pozici, mohou být navrženy za použití metod dobře známých v oboru, jako je například srovnání využití kodonů ve známých genových sekvencích viru a/nebo cílového hmyzu a v sekvencích nukleové kyseliny kódujících signální peptidy a substance ovlivňující hmyz podle předkládaného vynálezu. Výhodně odráží použití kodonů v sekvencích kódujících signální peptidy a substance ovlivňující hmyz použití kodonů ve virovém vektoru nebo cílovém hmyzu. Příklady sekvencí toxinu s optimalizovanými kodony jsou uvedeny na obr. 10 a 11.

Produkce rekombinantních PxNPV

Rekombinantní PxNPV mohou být produkovány buď (i) současnou transfekci PxNPV DNA a heterologní sekvence do vhodné hostitelské buňky pro umožnění homologní rekombinace in vivo, nebo (ii) in vitro ligací heterologní sekvence do přímého ligačního vektoru, po které následuje vložení konstruktu do vhodné hostitelské buňky pro umožnění propagace viru. Vhodnou hostitelskou buňkou je jakákoliv buňka podporující replikaci bakuloviru, včetně například Sf9 buněk, Sf21 buněk a High Five™ buněk (Invitrogen, Carlsbad, CA). Izolovaný virus podle předkládaného vynálezu je virus, který byl, klonován, například, pomocí přečištění plaků ve tkáňové kultuře, nebo který byl jinak připraven z jediného virového genotypu.

Obvykle je modulární expresní vektorkonstruován tak, aby obsahoval expresní, kazetu, ve které je vhodná promotorova sekvence operativně navázaná na sekvenci kódující heterologní protein, t.j. exprese heterologního proteinu je pod kontrolou promotoru.

Expresní kazeta je excidována z modulárního expresního vektoru a je insertována do PxNPV přímého ligačního vektoru DNA ligací in vitro. Ligační směs se potom přenese do vhodné hostitelské buňky. Rekombinantní PxNPV jsou získány z kultivačního media a jakoukoliv vhodnou metodou jsou stanoveny LCso a LT50, včetně například testu postřiku potravy, testu inkorporace do potravy a testů namočení listů.

LC50 je koncentrace viru, při které hyne 50% infikovaných larev během trvání testu. LT50 je čas po infekci, kdy 50% infikovaných larev hyne po expozici určité dávce víru.

Výhodně má PxNPV podle předkládaného vynálezu LC50 přibližně 1

2U » * ·· ·· ·♦ • · · ♦ · · • 99 · « • 99989 « • · * <

···· · · · · χ 10⁵ OBs/16 cm² nebo méně pro larvy Plutella xylostella při měření standardním testem nanesení viru na potravu, který je popsán v příkladu 6. Jiné bakulovirové izoláty mají obvykle vyšší

LCso pro larvy Plutella xylostella, t.j. jsou méně účinné, vzhledem k jejich infektivitě pro jiné druhy hmyzu.

Insekticidní kompozice a přípravky

Předkládaný vynález poskytuje insekticidní kompozice a prostředky, které obsahují jeden nebo více rekombinantních PxNPV. Výhodně usmrcuje rekombinantní PxNPV podle předkládaného vynálezu larvy Plutella xylostella účiněji než přirozený PxNPV nebo rekombinantní verze jiných bakulovirů (viz například příklad 11, dále).

Insekticidní kompozice podle předkládaného vynálezu obsahuje alespoň jeden rekombinantní PxNPV. Insekticidní přípravek obsahuje alespoň jeden rekombinantní PxNPV v insekticidně účinném množství a zemědělsky přijatelný nosič. Insekticidně účinné množství je množství, které způsobuje detekovatelné snížení zamoření, jak se projeví množstvím nebo počtem hmyzích škůdců v dané oblasti nebo v daném množství plodin; poškozením způsobeným hmyzími škůdci; nebo jakýmkoliv jiným vhodným parametrem zamoření. Přípravek může být ve formě smáčivých prášků, dispergovatelných granulí, granulí, suspenzí, emulzí, roztoků pro aerosoly, návnad a jiných běžných formách insekticidních přípravků. Vhodnými, nosiči jsou, například, voda, alkohol, uhlovodíky nebo jiná organická rozpouštědla, nebo minerální, živočišné nebo rostlinné oleje, nebo prášky jako je talek, hlinka, silikát nebo křemelina. Také mohou být obsažena amáčivá činidla, potahovací činidla, činidla pro ochranu před UV zářením, disperzní činidla a pojivá. Živiny jako je cukr mohou být přidány pro zvýšení příjmu hmyzem a/nebo pro přilákání hmyzu. Činidla zvyšující tekutost, jako jsou například činidla zvyšující

1

•· · ·· · « · ·· ♦ · ·· • φ φ ·ίϊ φφφ φφφ * · φφφ φ· ··· tekutost, na bázi hlinky, mohou být přidána pro minimalizaci spékání smáčivých prášků nebo jiných suchých přípravků. Přípravek může být vyroben ve formě potažených částic nebo ve formě mikroenkapsulovaného materiálu. Prostředek musí být nefytotoxický a nesmí poškozovat integritu rekombinantního PxNPV obsaženého v přípravku, ani by neměly žádné složky přípravku zhoršovat příjem přípravku hmyzem nebo jakoukoliv funkci víru. Příklady přípravků jsou popsány v EP publikované přihlášce 0697 170 Al; PCT přihlášce WA 92/191025; a v U.S. patentu č. 4948586.

Insekticidní přípravky podle předkládaného vynálezu mohou obsahovat jeden nebo více chemických insekticidů a/nebo jedno nebo více biologických kontrolních činidel jiných než PxNPV. Mezi chemické insekticidy patří, například, pyrethroidy, pyrazoliny, organofosfaty, karbamaty, formadiny a pyrroly, které jsou všechny dobře známé v oboru. Příklady sloučenin jsou popsány v PCT přihláškách 96/03048, 96/01055 a 95/95741. Mezi biologická, kontrolní činidla patří, například, non-PxNPV bakuloviry (přirozené nebo rekombinantní); Bacillus thuringiensis; Nosema polyvora; M. grandis; Bracon mellitor; entomopatogenní houby a členovci.

Předkládaný vynález také poskytuje způsob pro hubení hmyzích škůdců. Způsob obsahuje kontaktování hmyzu s insekticidně účinným množstvím kompozice nebo přípravku podle předkládaného vynálezu. Vynález také poskytuje způsob pro snížení zamoření plodin hmyzem, který obsahuje aplikaci insekticidně účinného množství kompozice nebo přípravku podle předkládaného vynálezu do dané oblasti. Insekticidní přípravky jsou aplikovány za použití běžných technik, jako je například postřik nebo práškování plodin. Obvykle jsou přípravky aplikovány v dávce mezi přibližně 2,4 χ 10⁸ a přibližně 2,4 χ 10¹² OB/hektar (OB jsou oklusní tělíska), účinné dávky závisí, například, na cílovém hmyzu, použitém rekombinantním PxNPV

4 ·« a na plodině, která je ošetřována. Dávka obsahující insekticidně účinné množství může být určena odborníkem v oboru za použití běžných metod.

Příklady provedení vynálezu

Následující příklady dokreslují, ale neomezují předkládaný vynález.

Příklad 1: Konstrukce rekombinantního PxNPV obsahujícího β-galaktosidasu s deletovaným Egt

Následující pokusy byly provedeny pro přípravu rekombinantního PxNPV, ve kterém je gen pro virovou ecdysteroid glukosyl transferasu (egt) deletován a nahrazen markerovým genem E. coli pro β-galaktosidasu (β-gal).

Zásoba přirozeného PxNPV, který byl pasáž,ován na hmyzu, byla plakově přečištěna za použití běžných postupů popsaných v 0'Peilly et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual,

Oxford University Press, New York, NY, 1994) pro přípravu klonální zásoby viru pro genetické úpravy. Integrita této zásoby, označené PxNPV-3, byla potvrzena srovnáním charakteru restrukčních fragmentů s charkterem původní zásoby PxNPV. Biotesty proti panelu hmyzích druhů také potvrdily, že virulence odpovídá nekl onovanérnu původnímu viru.

Obr. 1 ilustruje postup použitý pro konstrukci přenosového vektoru pro narušení egt genu v PxNPV insercí genu pro β-galaktosidasu. Blízká podobnost charakteru retričkních fragmentů AcNPV a PxNPV ukazuje na homologii na úrovni DNA, která umožňuje použití přenosových vektorů na bázi V8 kmenu AcNPV, který je popsán v U.S. patentu č. 5662897. Vektor obsahující β-gal kazetu,

Z i

označený pmd 216.1, byl připraven následujícím způsobem.

BamHI-až-Xbal fragment obsahující β-gal gen pod kontrolou

Drosophila melanogaster hsp70 promotoru byl izolován z pAcDyl (Zuidema et al., J. Gen. Virol. 71: 2201 (1990)). Tento fragment byl potom subklonován do pBluescr ipt™SK ⁺ (STratagene, La Jolla, CA) mezi BamHI a Xbal místa polylinkeru. Pst G fragment AcNPV kmene VSvEGTDEL, který obsahuje egt gen a sousední region (viz U.S. patent č. 5662897) byl potom subklonován do polylinkeru pUC9 v Pstl místě. Vzniklý plasmid byl označen pmd 205.1.

Konečný přenosový vektor byl připraven provedením čtyř fragmentové ligace mezi (i) pBluescr ipť^rMSK⁺ tráveným BamHI a Pstl, který byl defosforylován telecí střevní fosfatasou; (ii) 0.975 kb BglII-ažPvuII fragmentem pmd 205.1; (iii) 3,86 kb Smal-až-Xbal β-gal fragmentem pmd216.1; a (iv) 1,6 kb Xbal-až-Pstl fragmentem pmd205.1. Výsledný přenosový vektor, označený pmd 220.2, obsahoval markerový β-gal gen řízený hsp70 klonovaný do místa egt delece.

β-gal označený PxNPV s deletovaným egt genem byl připraven homologní rekombinací mezi pmd 220.2 a PxNPV-3 DNA současně transfektovanými do kultivovaných Sf-9 buněk. 1 pg pmd 220.2 DNA a 250 ng PxNPV-3 DNA se smísily s 252 pg Lipofectinu (Gibco BEL, Gaithersburg, MD) v konečném objemu 200 pl TNM-FH (JRH Biosceinces, Lenexa, KS). Po inkubaci při teplotě okolí po dobu 15 minut se směs přenesla do konečného objemu 2,0 ml TNM-FH kompletního media (TNM-FH plus 10% fetální hovězí sérum a 1% plurinic F68 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD)). Směs se převrstvila přes 2,75 x 10⁵ Sf-9 buněk, které byly potom kultivovány v jamkách standardní 6-jamkové tkáňové kultivační plotny. Buňkám bylo obměňováno medium každých 24 hodin a vyvinutý virus byl odebírán po dalších 96 hodinách. Rekombinantní viry byly pozitivní na oklusní tělíska (occ+) a exprimovaly β-gal gen. Rekombinanty

D, Η·· ·· ·· ·

9 9 9 9 9 99

9 9 9 9 9

99999 9 9

9 9 9 9

9999 99 99 99

9

9 9 (occ+/modré plaky) se identifikovaly třemi koly plakového přečištění za přítomnosti 100 pg/ml 5-brom-4-chlor-3-indolyl-0-D-galaktopyranosidu (X-gal). Výsledný vir byl označen T96-19. 1.1.1

Příklad 2: Konstrukce přímého ligačního PxNPV virového vektoru s deletovaným egt genem

Následující pokusy byly provedeny pro přípravu přímého ligačního vektoru odvozeného od PxNPV (viz Mezinárodní patentová přihláška US 94/06079). Tento vektoi obsahuje po ly-spo j ovac í sekvenci (označenou Bsu-Sse spojovací sekvence) insertovanou do PxNPV genomu v egt místě.

Pro přípravu Bsu-Sse spojovací sekvence byly syntetizovány dva oligonukleotidy, které měly sekvence:

5'-CCTCAGGGCAGCTTAAGGCAGCGGACCGGCAGCCTGCAGG-3' (Oligo 32), a 5'-CCTGCAGGCTGCCGGTCCGCTGCCTTAAGCTGCCCTGAGG-3' (Oligo 33)

Po tepelném zpracování kódují tyto dva oligomery několik míst pro restrikční endonukleasy, včetně Bsu 361 a Sse 83871 míst, která jsou použitelná při konstrukci rekombinantních virů. Každý byl ředěn na koncentraci 30 pmol/μΙ do pufru pro tepelné zpracování obsahujícího 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM NaCI a 1 mM EDTA. Směs se zahřála na 95 °C na dobu 10 minut a potom se pomalu ochladila na teplotu okolí během několika hodin.

Tepelně zpracované oligonukleotidy se insertovaly do pmd 205.1 přenosového vektoru následujícím způsobem. Pmd 205.1 vektor se trávil Spěl, který ho tráví v jediném místě umístěném těsně před egt delecí (obr. 2). Konce tráveného plasmidu se doplnily Klenowovým fragmentem DNA polymerasy I za přítomnosti všech čtyř nukleotidů. 100 ng 1 inearizovaného plasmidu. se potom ligovalo do b

tf · tftf tftf » tftf · tftf · • ··· • · • tftftf tftf pmol dvojřetězcové spojovací sekvence pomocí T4 DNA ligasy v celkovém objemu 10 pl. Po dokončení ligační reakce se T4 ligasa inaktivovala teplem a směs se zpracovala polynukleotid kinasou.

8,8 kb DNA proužek se přečistil elektroforesou v 1% agarosovém gelu preparativní čistoty s nízkou teplotou tání (BioRad,

Richmond, VA). Proužek gelu obsahující 8,8 kb lineární DNA se nechal roztát při 65 °C a ligace v gelu za použití přibližně 1/10 gelového proužku se použila pro recirkularizaci DNA, která byla potom použita pro transformaci DH5a E. coli buněk.

Vzniklé plasmidy byly vyšetřovány polymerasovou řetězovou reakcí (PCR) pro určení orientace Bsu-Sse spojovací sekvence vzhledem k egt genu. Oligo 32 a 33 byly samostatně párovány s oligomerem EGT 1 (5'-GCGGCCAATATATTGGCCGTGTTT-3'), který je specifický pro region egt genu 5' k delecí. Orientace Bsu-Sse spojovací sekvence v LAB 50.2 je uvedena na obr. 2.

Přímý ligační vektor PxNPV s deletovaným egt genem se připravil homologní rekombinací mezi LAB 50.2 a T96-19.1.1.1 PxNPV virovou DNA, které byly současně transfektovány do kultivovaných Sf9 buněk způsobem popsaným v příkladu 1, za použití 1 pg LAB 50.2. a 250 rig T96-1.9.1 . 1. . 1. virové DNA. V tomto případě byly rekombinantní viry pozitivní na oklusní tělíska a neexprimovaly (3-gal gen. Rekombinantní (occ+/bílé) viry byly identifikovány třemi koly plakového přečištění za přítomnosti 100 pg/ml X-gal. Získaný virus byl označen T97-8.1.1.1 (ATCC přírůstkové č. VR-2608).

Příklad 3: Konstrukce modulárních expresních vektorů použitelných pro produkci rekombinantních PxNPV

A. pMEV 1-4

Návrh, konstrukce a použi tí vektorů pMEVl. , pMEV2, pMEV3 a pMEV4 ·· ·· ·· • · · · * · • · · · » • ··· · · · • · · · » ·· ·· ·· pro expresi cizorodých genů pod kontrolou bakulovirových promotorů jsou popsány v Mezinárodní patentové přihlášce US 94/06079. Tyto vektory mají obecnou strukturu uvedenou na obr. 3. Každý vektor byl odvozen od pBluescript SK+ plasmidu (Stratagene, La Jolla, CA) substitucí regionu mezi Sstl a Xhol místy v pBluescritp polyspojovací sekvenci expresní kazetou složenou z následujících prvků: (i) krátké syntetické spojovací DNA s rozpoznávacími místy pro restrikční enzymy Sstl, Sse 83871 a Stul; (ií) promotorového modulu, který se skládá z promotoru a kompletního 5' netranslatovaného regionu (UTR) vybraného AcMNPV virového genu; (iii) poly-spojovacího modulu, který usnadňuje inserci požadovaného regionu kódujícího protein; (iv) 3’ UTR modulu, který se skládá z kompletního 3'-netranslatovaného regionu AcMNPV 6.9K genu (základní protein); a (v) krátké syntetické spojovací DNA s rozpoznávacími místy pro restrikční enzymy Stul, Bsu36I a Xhol.

Jak je uvedeno na obr. 4, promotorové moduly ve vektorech pMEVl až pMEV4 jsou odovozeny z genů, které jsou exprimovány v různých stadiích životního cyklu viru. Promotorový modul DA26 genu v pMEVl. a promotorový modul 35K genu v pMEV4 jsou odvozeny z genů, které jsou exprimovány v životním cyklu viru časně; to znamená před zahájením syntézy DNA. Promotorový modul 6.9K genu v pMEV2 je odvozen od pozdního strukturálního genu, který je exprimován po zahájení syntézy DNA, a promotorový modul polyhedrinového (polh) genu v pMEV3 je odvozen z velmi pozdního genu, který kóduje hlavní strukturální složku virových oklusních tělísek.

Polylinkerový modul byl navržen tak, aby umožnil umístění regionu kódujícího protein do bezprostředního sousedství 5’ UTR promotorového modulu bez vložení dalších spojovacích sekvencí. Jak je uvedeno na obr. 5, polylinker obsahuje Esp3I místo, které je umístěno tak, že trávení vektoru Esp3I jej štěpí mezi pozicemi.-4 a -5 v horním řetězci promotorového modulu a ve spojení mezi • « · * • · 9 ··· · • ·

9 9 99 *

9 • »

9

9 promotorovým a polylinkerovám modulem v dolním řetězci. Zpracování DNA trávené Esp3I DNA polymerasou za přítomnosti čtyř standardních 2'-deoxynukleosid trifosfatů (dNTP) vytvoří 1inearizovaný vektor, který je zakončen lepivým koncem v přesném 3' konci promotorového modulu. Tento segment může být navázán na 5' fragment zakončený lepivými konci, jehož sekvence začíná ATG iniciačním kodonem požadovaného regionu kódujícího protein. Pro usnadnění přímého klonování fragmentu kódujícího protein je 3' konec fragmentu připraven tak, aby obsahoval rozpoznávací místo pro jeden z enzymů, které štěpí polylinkerový modul (jak je ilustrováno BamHI na obr.5) a jak fragment kódující protein, tak vektor jsou tráveny tímto enzymem před ligací.

Klíčovou vlastností těchto vektorů je přítomnost rozpoznávacích míst pro restrikční enzymy Sse8387I a Bsu36I na jednom z konců expresní kazety. Toto umožňuje excisi insertovaných sekvencí z modulárního expresního vektoru a jejich ligaci do přímých ligačních PxNPV vektorů podle předkládaného vynálezu (viz například příklad 2, výše).

B. pMEVS a pMEV6

Dva vektory, pMEVS a. pMEV6, byly připraveny tak. aby obsahovaly D. melanogaster promotor genu hsp70 (hlavní protein teplotního šoku). pMEVS obsahuje 724 bp segment D. melanogaster hsp70 promotoru/5' LITE (označený hsp70Bam na obr. 4) v .rozsahu od pozice -493 do pozice +231 vzhledem ke start místu pro transkripci hsp70 genu. pMEVč obsahuje 475 bp segment stejného promotoru/5' UTE (označený hsp70Xba na obr. PD2), v rozsahu od pozice -244 do pozice +23 1.

Promotorové moduly použité pro přípravu pMEVS a pMEV6 byly syntetizovány PCE amplifikací za použití plasmidu phcHSP70PL • β · · · · • · · · · · · * · · · ♦ • · · · « · v • 9 '.· 9

9 9 9 9 99 9

9

9 9

9 • 99

9 9 99 (Morris et al., J. Virol. 66: 7397 (1992)) jako templátu.

Ol igonukleotidové primery pro každou reakci a sekvence amplifikovaného produktu jsou uvedeny na obr. 6 a 7 (pro pMEVS a pMEV6, v příslušném pořadí). Každý z primerů má dvoudílnou strukturu. 5’ část nemá žádnou homologii sekvence s phcHSP70PL templátem a je použita pro inkorporaci specifických restrikčních míst do konců konečného PCR produktu. Mezi tato místa patří Sstl, Sse8387I a Stul místa na 5' konci PCP produktu a Esp3 a Xbal místa na 3' konci PCP produktu (viz obr. 6 a7). 3'-část každého primerů obsahuje sekvence homologické s phcHSP70PL templátem a definuje jednu hranici hps70-specifické sekvence v každém modulu.

Před PCR reakcemi byl primer (-) řetězce (HSP70Esp) fosforylován na svém 5' konci inkubací 200 pmol primerů po dobu 30 minut při 37 °C v 10 ml reakční směsi obsahující 70 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgClz, 5 mM DTT, 1 mM ATP a 10 jednotek T4 polynukleotid kinasy (New England Biolabs, Beverly, MA). PCR reakce byly potom provedeny v samostatných Micro Amp zkumavkách (Perkin Elmer, Norwalk, CT) za použití následujícího postupu. 50 pmol každého primerů se smísilo s 0,25-1,0 ng phcHSP70PL DNA v 50 μΐ reakční směsi obsahující 200 pM dNTP, IX klonovaný Pfu polymerasový pufr (STratagene, La Jolla, CA) a 5 jednotek klonované Pfu DNA polymerasy (Stratagene, La Jolla, CA). Vzorky byly umístěny do Perkin Elmer Model 9600 terroocyklovače (Perkin Elmer, Norwalk, CT) a byly zpracovány ve vdou cyklech o 1 minutě při. 94 °C (denaturační stupeň), 1,5 minutě při 50 °C (stupeň tepelného zpracování) a 3 minutách při 72 °C (stupeň rozšíření), po kterých následovalo 28 cyklů 1 minuta, při 94 °C, 1,5 minuty při

0C a 3 minuty při 72 °C.Při posledním cyklu byla rozšiřovací reakce prováděna po dobu dalších 7 minut a reakční směs byla ochlazena na 4 °C. Produkty amplifikace byly extrahovány jednou fenolem:chloroformem:isoamylalkoholem (25:24:1) upraveným na 0,3 M octanem sodným a vysrážely se ethanolem.

·· »· ♦ · · · • « ·

Po rozpuštění ve vhodném reakčním pufru se DNA trávila Pstl (která jí štěpí v Sse8387I místě) a fragmenty obsahující předpokládané hsp70 promotorové moduly se přečistily elektroforesou na 1,2% agarosovém gelu s nízkou teplotou tání s preparátivním stupněm čistoty (BioRad, Richmond, CA). Základní vektor pro konstrukci pMEVS a pMEV6 byl připraven štěpením pMEVl EcoRI a doplněním konců Klenowovým fragmentem DNA polymerasy I za přítomnosti všech čtyř nukleotidů. Po sekundárním štěpení vektoru Sse8387I a defosforylaci konců pomocí telecí střevní alkalické fosfatasy se velký (3,1 kb) fragment obsahující pBluescript skelet a 3' UTR a polylinkerové moduly přečistil na agarosovém gelu s nízkou teplotou tání a ligová! se individuálně s přečištěnými hsp70 promotorovými moduly za vznikli pMEVS a pMEV6.

C. pMEVS/ADK-AalT a pMEV6(ADK-AalT pMEVS a _PMEV6 vektory popsané výše byly dále zpracovány tak, aby obsahovaly gen kódující AalT, toxin specifický pro hmyz, který je přítomen v jedu východoafrického štíra Andoctuonus australis (Hector) (Zlotkin et al., Biochimie 53: 1073 (1971)). Když je AalT injikován do tělní dutiny hmyzí larvy, váže se selektivně na napěťově sensítivní sodíkové kanály a způsobuje přechodnou kontraktilní paralýzu. Chronické podávání toxinu, které může být dosaženo infekcí larev bakuloviry produkujícími AalT, je spojeno s prodloužením paralýzy a případně se smrtí (Stewart et al. , Nátuře, 352: 85 (1991); Maeda et al., Virol. 184: 777 (1991); McCutchen et al., Biotechnol. 9: 848 (1991)). U.S. patent 5547871 popisuje sekvenci ADK-AalT genu s optimalizovanými kodony, ve které je sekrece AalT toxinu řízena signálním peptídem z genu pro adipokinetický hormon (ADK) Manduca sexta. Inserce

ADK-AalT kódujícího regionu do vektorů. _PMEV1-_PMEV4 (pro získání plasmidů pMEVl/ADK-AalT - pMEV4/ADK-AalT) je popsána v Mezinárodní patentové přihlášce US 94/06079.

ÓU

0000 0* · «· >000 ··«· ·

Pro konstrukci pMEV5 a pMEV6 derivátů kódujících ADK-AalT byl syntetizován fragment obsahující sekvenci ADK-AalT genu pomocí PCR za použití pMEV3/ADK-AaIT jako templátu. Primer (+) řetězce, označený PD30, začínal v iniciátorovém ATG kodonu ADK signálního peptidu. Primer (-) řetězce, označený 69K3UT, byl vyhrán tak, aby navodil syntézu DNA za poly1inkerovým modulem; to znamená, v 3'

UTR pMEV3/ADK-AalT. Sekvence primerů a amplifikovaného DNA fragmentu jsou uvedeny na obr. 8.

Před amplifikací. byl 5' konec primeru ( + ) řetězce defosforylován způsobem uvedeným výše pro HSP70Esp. PCR reakce byla také provedena způsobem popsaným výše, s tou výjimkou, že amplifikace byla provedena při 25 cyklech 1 minuty při 94 °C, 1,5 minuty při 52 °C a 3 minut při 72 °C. Po syntéze byla DNA trávena BamHI, který ji štěpí v polylinkerovém modulu, a 274 bp 5'-1epivý/3'-BamHI fragment obsahující ADK-AalT kódující region byl insertován do pMEVS a pMEV6. Struktury vzniklých plasmidů, pMEV5/ADK-AaIT a pMEVó/ADK-AalT, byly potvrzeny analýzou restrikčními enzymy a částečným určením sekvence DNA.

D. MEVS vektory obsahující modul ADK signálního peptidu

Následující pokusy byly provedeny pro přípravu serie modulárních expresních vektorů, které obsahují DNA kódující ADK signální peptid (viz výše), které mohou být použity pro řízení sekrece jakékoliv insertované sekvence. Byla připravena serie vektorů (označených pMEVl/ADK až pMEV6/ADK), ve kterých byla 57 bp sekvence optimalizovaných kodonů pro ADK signální peptid /zbytky 1-57 na obr. 8) umístěna mezi promotorové a polylinkerové moduly. Expresní kazety v těchto vektorech mají obecnou strukturu uvedenou na obr. 9.

Pro přípravu serie pMEVx/ADK vektorů byl DNA fragment obsahující promotorovy modul a navázaný ADJ signální peptid získán z příslušných pMEVx/ADK-AalT vektorů pomocí PCR. Primér pro (+) řetězec pro každou reakci byl oligonukleotid specifický pro promotor, který navozuje syntézu DNA na 5' konci promotorového modulu a vkládá restrikční místa pro Sstl, Sse8387I a Stul do 5' konce amplifikovaného fragmentu. Templáty a primery pro (+) řetězec pro každou reakci jsou uvedeny v následující tabulce.

Templat	Primér	Sekvence
pMEVl/ADK- AalT	DA26FZ	5'- AGCAGCGAGCTCCTGCAGGCCTACGCGT AATTCGATATAGAC -3'
pMEV2/ADK- AalT	69KFZ	5' - AGCAGCGAGCTCCTGCAGGCCTATGCCG TGTCCAATTGCAAG -3’
pMEV3/ADK- AalT	PHF	5’- AGCAGCGAGCTCCTGCAGGCCTGACGCA CAAACTAATATCAC -3'
pMEV4/ADK- AalT	35KPRO1	5'- AGCAGCGAGCTCCTGCAGGCCTCITGAT GTCTCCGATTTC -3'
pMEV5/ADK- AalT	HSP70Bam	5’- AGCAGCGAGCTCCTGCAGGCCTGATCCT TÁÁATTGTATCCTA -3'
pMEV6/ADK- AalT	HSP70Xba	5'- AGCAGCGAGCTCCTGCAGGCCTAGAATC CCAAAACAAACTGG -3'

Primér pro (-) řetězec pro každou reakci, označený ADKRev (5'-CGGATCTAGACACGTCTCGGGCCTCAGCGATAATCACGAAGGC-3') , navozuj e syntézu od 3¹ konce ADK signálního peptidu a vkládá místa pro Esp3I a Xbal do 3’ konce amplifikovaného fragmentu. PCR reakce byla také provedena způsobem popsaným výše pro pMEV5-6, s tou výjimkou, že amplifikace byla provedena při 25 cyklech. 1 minuty při 94 °C, 1,5 minuty při 52 °C a 3 minut při 72 °C. DNA syntetizovaná ze všech templátů s výjimkou pMEV5/ADR-AalT byla trávena Pstl, který jí štěpí v Sse8387I místě před promotorem, a • · • · • · · ·*· * • »

Xbal, který jí štěpí za ADK signálním peptidem, a fragment obsahující promotorovy modul a signální peptid byl insertován mezi Pstl (Sse8387) a Xbal místa v jednom z existujících pMEVx vektorů, j ako j e pMEVl.

Protože hsp70Bam promotorovy modul v pMEVS obsahuje vnitřní Xbal místo, musí být hsp70Bam/ADK modul insertován do pMEVx pracovního rámce ve dvou částech. Proto byla jedna část DNA syntetizované z pMEV5/ADK-AaIT templátu trávena Pstl a Xhol a druhá část byla trávena Xhol a Xbal. Pstl/Xhol fragment představující 5' segment hsp70Bam/ADK modulu byl kombinován s Xhol/Xbal fragmentem představujícím 3' segment hsp70Bam/ADK modulu a byl ligován do Pstl/Xbal fragmentu vektoru připraveného z pMEVl.

Každý připravený pMEVx/ADK vektor měl identickou atrukturu s příslušným pMEVx vektorem s výjimkou inserce 57 bp ADK signálního peptidu mezi promotorým a polylinkerovým modulem.

Příklad 4: Konstrukce modulárních expresních vektorů kódujících insekticidní toxiny

Následující pokusy byly provedeny pro přípravu modulárních expresních vektorů kódujících insekticidní toxiny vhodných pro vložení do rekombinantních PxNPV podle předkládaného vynálezu.

A. Txp-I

Toxin zákožky svrabové TxP-I je paralytický neurotoxin izolovaný z jedu zákožky svrabové, Pyemotes tritici (Tomalski et al., Toxicon 27: 151 {1989)). Tox34 gen kóduje prekursorový protein o 291 aminokyselinách (Tomalski et al., Nátuře 352: 82 (1991)).

9 « ·

99 8

9

Pro testování účinnosti tox34 genu v rekombinantních PxNPV byly připraveny tři různé Txp-1 konstrukty, které se lišily v aminoterminální signální sekvenci řídící sekreci toxinu z buněk. Jeden konstrukt obsahoval přirozenou tox34 aminoterminální sekvenci; jeden obsahoval ADK signální peptid místo aminoterminálních 40 zbytků tox34 preproteinu; a jeden obsahoval ADK signální peptid místo aminoterminálních 26 zbytků tox34 preproteinu.

Tři různé segmenty tox34 genu odpovídající kodonům 1-291 (označený tox34), 27-291 (označený tox34L) a 40-291 (tox34S) byly syntetizovány PCR a byly upraveny pro klonování do jednoho nebo více modulárních expresních vektorů popsaných výše. Templátem pro amplifikační reakce byl plasmid pHSP70tox34 (Lu et al., Biological Control 7: 320 (1996)). Primery (+) řetězce pro každou amplifikaci jsou uvedeny v následující tabulce.

Fragment	Primer	Sekvence
tox34	TOX34ATG	5' - ATGAAAAirTGTACATTTTTTATrCC -3'
tox34L	TOX34NT1	5' - GTTAAACCTTTTAGGTCTITTAAT AAT ATTTCC -3'
tox34S	TOX34NT2	5' - GATAATGGCAATGTCGAATCTGTA - 3'

Primer (-) řetězce, označený T0X34CT2, 5¹-GTACCCCCGGGATCCAATTTAACACAGTCTTGAATCACTT-3', navozuje syntézu od 3’-konce tox34 kódujícího regionu a vkládá restrikční místa pro BamHl a Xmal (Smál) do 3' konce arnplifikovaného fragmentu. Před amplifikaci byl 5' konec každého primerů (+) řetězce fosforylován za použití postupu popsaného výše pro primer HSP70Esp v příkladu 3. PCR reakce byly provedeny způsobem popsaným v příkladu 3, s tou výjimkou, že cykly se skládaly ze 2 cyklů 1 minuta při 94 °C, 1,5 minuty při 45 °C a 3 minuty při 72 °C a potom 28 cyklů 1 minuta ♦ 0» • · · · • « ·«·9 99 při 94 °C, 1,5 minuty při 55 °C a 3 minuty při 72 °C.

Po syntéze byla DNA trávena Xmal a 5'-lepivý/3'-Xmal fragmenty tox34 kódujícího regionu (označené tox34, tox34L a tox34S) byly přečištěny a klonovány do MEV vektorů způsobem popsaným v příkladu 3, s tou výjimkou, že polylinker byl štěpen Xmal (který jej štěpí ve Smál místě) místo BamHI.

Následující tabulka shrnuje složky, ze kterých byl každý MEVS vektor exprimující TxP-I připraven.

Konstrukt	Vektor	Fragment kódující Txp-I
pMEVl/Tox34	pMEVI	tox34
pMEV5/Tox34	pMEV5	tox34
pMEV6/Tox34	pMEVÓ	tox34
pMEVl/ADK-Tox34L	pMEVl/ADK	tox34L
pMEVl/ADK-Tox34S	pMEVI/ADK	tox34S
pMEV2/ADK-Tox34L	pMEV2/ADK	tox34L
pMEV2/ADK-Tox34S	PMEV2/ADK	tox34S

B. LqHIT2

Kromě excitačních toxinů, jako je AalT, obsahuje mnoho jedů štírů Buthinae druhý typ toxinu specifického pro hmyz, který způsobuje polou, progresivní atonickou paralýzu (Zlotkin et al., Biochemistry 30: 4814 (1991)). Nejlépe prostudovaným členem této skupiny je toxin LqhIT2, který byl izolován od štíra Leiurus quinquestriatus hebreaeus. Klonovaná cDNA pro LghIT2 ukázala přítomnost 21 aminokyselinového signálního peptidu a tří C-terminálních aminokyselin (Gly-Lys-Lys, které jsou odstraněny z peptidu post-translačně (Zlotkin et al., Arch. Insect. Biochem.

• · • φ

I • ♦ • * · ♦ · » « · · β · • · · · · · · • · · · v··· · Φ · ·

Physiol. 22: 55 (1993)).

Pro výzkum schopnosti LqhIT2 toxinu zlepšovat insekticidní aktivitu PxNPV byla DNA sekvence kódující zralý LqhIT2 toxin sestavena a klonována do čtyř různých pMEVx/ADK expresních vektorů: pMEVl/ADK, _PMEV2/ADK, pMEVS/ADK a _PMEV6/ADK. Sekvence kódujícího regionu toxinu uvedená na obr. 10 se liší od přirozené cDNA sekvence ve 27 ze 61 kodonů; tyto změny byly vloženy tak, aby využití kodonů v syntetickém kódujícím regionu pro LqhIT2 odrážely celkové využití kodonů v AcMNPV genomu (Ayres et al., 1994).

Sestavení DNA fragmentu obsahujícího kódující region pro LqhIT2 bylo provedeno v několika krocích. Nejprve byly syntetizovány čtyři nukleotidy, které dohromady představují oba řetězce LqhIT2 kódujícího regionu a malou část 3' sousedící spojovací DNA sekvence (obr. 10). Před použitím byly 5' konce oligonukleotidů LqhIT2F2 (obsahující 3' část (+) řetězce) a LqhIT2R3 (obsahující 3' část (-) řetězce) fosforylovány za použití postupu popsaného v příkladu 3. 40 pmol každého oligonukleotidu bylo tepelně zpracováno v 10 μΐ 50 mM NaCI krátkým zahřátím na 95 °C a potom pomalým ochlazením směsi na 60 °C. Celkový objem směsi se upravil na 40 μΐ a dvě poloviny LqhIT2 kódujícího regionu (LqhIT2Fl:LqhIT2R3 a LqhIT2F2:LqhIT2R4) se ligovaly. Z důvodu přítomnosti produktů neúplné syntézy v každém oligonukleotidu vedla prvotní ligace k zisku heterogenní směsi fragmentů délky 200-1000 bp. Požadovaný produkt se izoloval z této směsi PCR, za použití 0,5 μΐ ligační reakční směsi jako zdroje templátu a oligonukleotidů LqhIT2 PCRF (fosfory! ováného na jeho 5' konci) a LqhIT2 PCRR jako primerů (obr. 10). Amplifikace byla provedena ve 25 cyklech 1 minuta při 94 °C, 1,5 minuty při 55 °C a 3 minuty při 72 °C, jak je popsáno v příkladu 3. Po syntéze byla DNA trávena BamHI, který štěpí spojovací segment sousedící s terminačním kodonem, a požadovaný 190 bp 5'-1epivý/3'-BamHI fragment se

JO • ·

• Λ · · přečistil gelovou elektroforesou a klonoval se do MEV vektorů pMEVí/ADK, pMEV2/ADK, pMEV5/ADK a pM.EV6/ADK, jak je uvedeno v příkladu 3 a na obr. 5. Sekvence LqhIT2 kódujícího regionu v každém vektoru byla potvrzena sekvenováním DNA.

B. omega-ACTX-HVl

Omega-atrakotoxiny jsou rodinou insekticidních peptidových toxinů izolovaných od australských pavouků. Nejlépe prostudovaným členem této rodiny je omega-atracotoxin-HVl (omega-ACTX-HVl), 37-zbytkový peptidový toxin izolovaný z jedu pavouka Hadronyche versuta (Mezinárodní patentová přihláška AU 93/00039).

Omega-ACTX-HVl inhibuje hmyzí vápníkové kanály závislé na napětí a je letální pro larvy Helicoverpa armigera, ale je neškodný pro novorozené myši.

Na základě aminokyselinové sekvence omega-ACTX-HVl byly navrženy dva o 1igonukleotidy, které představují dva řetězce omega-ACTX-HVl kódujícího regionu a malou část 3' sousedící spojovací DNA. Použití kodonů v omega-ACTX-HVl kódujícím regionu je navrženo tak, aby odpovídalo použití kodonů v AcMNPV genomu (Ayres et al., 1994). Sekvence těchto oligonukleotidů jsou uvedeny na obr. 11. Z důvodů délky oligonukleotidů ACTXHV1F a ACTXHV1R je značně pravděpodobné, že každý bude významně kontaminován produkty nekompletní syntézy. Proto byla PCR strategie podobná strategii použité pro LqhIT2 použita také pro syntézu fragmentu omega-ACTX-HVl kódujícího regionu vhodného pro klonování do MEVS vektorů, V tomto případě bylo smíseno 0,1 pmol každého oligonukleotidu a směs byla použita jako templát pro PCR amplifikaci omega-ACTX-HVl produktu požadované délky. Primery pro reakci byly ACTXPCRF (fosforylováný na svém 5' konci) a ACTXPCRR. PCR reakce byla provedena způsobem uvedeným výše, s tou výjimkou, že amplifikace byla provedena v 15 cyklech 1 minuta při 94 °C, ó f • ·

9

99

9 9 9 9 9 « • » · « t • ·«»<*· * • · # ·

9999 99 99 9

1,5 minuty při 55 °C a 3 minuty při 72 OC. Po amplifikaci byla DNA štěpena BamHI, který štěpí spojovací segment sousedící s terminačním kodonem, a požadovaný 118 bp 5'-1epivý/3'-BamHI fragment se přečistil gelovou elektroforesou a klonoval se do MEV vektorů pMEVl/ADK, pMEV2/ADK, pMEV5/ADK a pMEV6/ADK. Sekvence omega-ACTX-HVl kódujícího regionu v každém vektoru byla potvrzena sekvenováním DNA.

Příklad 5: Konstrukce rekombinantních PxNPV

Následující pokusy byly provedeny pro konstrukcí rekombinantních PxNPV kódujících insekticidní toxiny.

Virová DNA byla připravena z oklusních tělísek (O'Reilly et al., 1994). Přečištěná DNA byla trávena Bsu36I a Sse8387I za použití přibližně 5 jednotek enzymu/pg DNA. Chromatografie s vylučováním podle velikosti nebo přečištění gradientem sacharosy bylo použito pro separaci virové genomové DNA z excidovaného fragmentu. Získaná 1inearizovaná virová DNA se srážela ethanolem a resuspendovala se v 10 ml Tris-HCl pH 8,0/1 mM EDTA v koncentraci 0,2-1 pg/pl.

0,5 pg 1inearizované DNA se potom ligovalo s 15 ng přečištěného Bsu36I/Sse8387I tráveného fragmentu z vhodného MEV vektoru v reakčním objemu 5 pl přes noc při 15 °C. Směs se potom použila pro transfekci Sf-9 buněk, jak je popsáno v příkladu 1. Kultivační medium bylo obměněno 24 hodin po transfekci. Po dalších 72 hodinách se odebral supernatant kultury, ředil se a použil se pro reinfekci Sf-9 buněk pro izolaci plaků. Náhodné plaky byly seškrábnuty a použity pro infikování jamek 48-jamkové plotny obsahující 6 x 1.0⁴ Sf-9 buněk/jamku v 0,5 ml TNM-FH kompletního media. Rekombinanty byly identifikovány za použití promerů specifických pro insertovaný gen. Virus z plaků dávajících

* 9 · φ • ΦΦΦΦ • Φ

ΦΦΦΦ Φ φ pozitivní jamky byl přečištěn dvěma dalšími koly plakového přeci štění.

Následující tabulka uvádí informace pro různé rekombinantní PxNPV, které byly připraveny.

Virus Použitý MEV

PxEGTDEL/35 K ADK~AaIT

PxEGTDEL/hsp70Bam ADK-Aa

PxEGTDEL/DA26 tox34

PxEGTDEL/hsp70Bam tox34

PxEGTDEL/hsp70Xba tox34

PxEGTDEL/DA26 ADK-tox34S

PxEGTDEL/DA26 ADK-tox34L

PxEGTDEL/6.9K ADK-1ox3 4S

PxEGTDEL/6.9K ADK-tox34L

Ac(V8)EGTDEL/DA26 ADK-AalT

PxEGTDEL/Da26 ADK-LqhIT2

PxEGTDEL/6.9K ADK-LqhIT2

PxEGTDEL/hsp70Bam ADK-LqhIT2 PxEGTDEL/hs_P70Xba ADK-LqhIT2 PxEGTDEL/DA26 ADK-omega-ACTX-HVl PxEGTDEL/6.9K ADK-omega-ACTX-HVl PxEGTDEL/hsp70Bam ADK-omega-ACTX-HVl PxEGTDEL/hsp70Xba ADK-omega-ACTX-HVl pMEV4/ADK-AaIT pMEV5/ADK-AaIT pMEVl/tox34 pMEV5/tox34 pMEV6/tox34 pMEVl/ADK-tox34S pMEVl/ADK-tox34L pMEV2/ADK-tox34S _PMEV2/ADK-tox34L pMEV4/ADK-AaIT pMEVl/ADK-LqhIT2 pMEV2/ADK-LqhIT2 pMEV5/ADK-LqhIT2 pMEV6/ADK-LqhIT2 pMEV1/ADK-ome g a-ACTX-HV1 pMEV2/ADK-otnega-ACTX-HV 1 pMEV5/ADK-omega-ACTX-HVl pMEV5/ADK-omega-ACTX-HVl

Příklad 6: účinnost rekombinantních PxNPV exprimujících insekticidní proteiny

Následující pokusy byly provedeny pro testování insekticidní účinnosti rekombinantních PxNPV podle předkládaného vynálezu.

« · 4 • 4 4 4 4

4 4 4

444 44 4·· • 4 * 4 4

Standardní test nanesení viru na potravu byl proveden na druhém instarstadiu larev Plutella xylostella (stáří 2-3 dny, 0,15-0,3 mg) pro stanovení dávky nutné pro dosažení 50% mortality v testované hmyzí populaci (t.j. LC50). Zásoby viru byly sériově ředěny v 0,01% dodecylsíranu sodném a 50 μΐ podíly virových suspenzí byly použity pro povrchovou kontaminaci 15 mm okrouhlých oblastí obsahujících lněným olejem posílenou Stoneville potravu (Southland Products Incorporated, Lake Village, AK). Jednotlivé larvy byly umístěny do každé oblasti a krmily se kontaminovanou potravou po dobu trvání testu. Mrtvé larvy byly počítány dvakrát denně během prvních tří dnů testu a potom alespoň jednou denně do nástupu kuklení v šestém nebo sedmém dnu. Data z opakovaných pokusů byla shrnuta a analyzována probit analýzou (Finney, 1.952). Medián času pro létal i tu (LT50) byl stanoven z probit analýzy času do úhynu při jedné dávce.

Výsledky jsou uvedeny v následujících tabulkách. Pro srovnání jsou koncentrace oklusních tělísek (OB) uvedeny jako OB/16 cm² potravy.

rPxNPV	LC50	(OB/16 cm2)	LT50 (dny) konc. 4,5 x 104
PxEGTDEL/35K ADK-AalT	9,34	X 102	2,69
wt PxNPV	5,97	X 104	4,39

Probit hodnoty byly určeny ze čtyř provedeni s přibližně 32 larvami/dávku.

4U

99

9 9 · <

rPxNPV	LCso (OB/16 cm2)	LT5.0 konc.	(dny). 4,5x103	LT50 konc.	(dny) 4,5x104
PxEGTDEL/35K ADK-AalT	7xl02	3,7		3,0
PxEGTDEL/hsP70 ADK-AalT	6 x 10 2	3,7		2,7
Ac(V8)EGTDEL/DA26 ADK-AalT	6,3x105	ND*		4,0

* ND = není stanoveno

Probit hodnoty byly určeny ze čtyř provedení s přibližně 32 1arvami/dávku.

Tyto výsledky ukazují, že (i) adice genu pro toxin k PxNPV genomu nejen zvyšuje rychlost usmrcení virem, ale také výrazně snižuje účinnou LCso pro larvy Plutella xylostella; a (ii) rekombinantní PxNPV má výrazně nižší LCso s mnohem vyšší rychlostí zabíjení ve srovnání s blízce příbuzným rekombinantním AcNPV. Protože Plutella xylostella je významným škůdcem na rostlinách, má toto zjištění zásadní význam při volbě rekombinantního bakuloviru pro použití jako biopesticidu na zemědělském trhu.

Následující tabulky uvádějí data z testů rekombinantních PxNPV exprimujících druhý toxin selektivní pro hmyz, tox34.

i φ

φ «

φ φ

• φ φ φ φφ ·« φφ · φ φφφ φ φ φ φφφ * · φ • φφ· φφφφ φφ φφ

rPxNPV	LT50 (dny) konc. 4,5 x 103	LT50 (dny) konc 4,5 x 104
PxEGTDEL/DA6 tox34	4,5	3,4
PxEGTDEL/hsp70Bam tox34	2,6	1,9
PxEGTDEL/hsp70Xba tox34	2,0	1,8
PxEGTDEL/DA26 ADK-tox34S	3,7	2,7
PxEGTDEL/DA26 ADK-tox34L	3,1	2,4
PxEGTDEL/6.9K ADK-tox34S	2,9	1 , 6
PxEGTDEL/6.9K ADK-tox34L	3,2	1,8
PxEGTDEL/hsp70Bam ADK-AalT	3,0	2,2
Probit hodnoty byly určeny larvami/dávku.	ze čtyř provedení	s přibližně 32
rPxNPV	Průměrná LC50 (OB/16 cm2)	LT50 (dny) konc. 4,5 x 103
PxEGTDEL/hsp70 Xba tox34	0,8 x 102	2,4
PxEGTDEL/hsP70BamADK-AaIT	2,9 x 102	3,3
wt PxNPV	165 x 102	4,6 při konc. 4,5x104

Data. naznačují, že zvýšená účinnost rekombinantní ch PxNPV není omezena na konstrukty exprimující AalT. PxNPV exprimující tox34 mají stejně nízkou LTso a LC50 jako rekombinanty exprimující AalT V některých případech (t.j. PxEGTDEL/hsp70Xha tox34) vede exprese tox34 rekombinantním PxNPV k významně nižší LC50 než rekombinanty exprimující AalT.

Všechny patenty, patentové přihlášky, články, publikace a <4 Z ·· ·# *· * 9 9 9 9 · · * * * · · • 9 9 9 9 9 9

9 9 9

způsoby testů zde uvedené jsou uvedené jako odkazy ve své úplnosti.

Odborníkům v oboru budou po pročtení uvedeného popisu jasné mnohé variace předkládaného vynálezu. Takové jasné variace spadají do rozsahu předkládaného vynálezu.

•f -J ·· ·* * · · 4 4 4 • · 0 · 0 0 * · · 4 4 4 ♦•••00 4 4 4 • 444 4 4 4 4444 4 • 4 4 4 4 4 4 4 ···· ·♦ ·· ··· ·» 444 'W <<?joot5 —'ΐ·Έ(

Claims (57)

1. Patentové nároky

   1. Izolovaný rekombinantní bakulovirus pro Plutella xylostella (PxNPV) mající genetickou alteraci vzhledem k přirozenému PxNPV, kde uvedená alterace je vybrána ze skupiny zahrnující (a) vložení nebo delece restrikčního místa; (b) modifikace, delece nebo duplikace genu kódovaného virem; (c) vložení genu kódujícího heterologní protein; a (d) jakékoliv kombinace výše uvedených al. terací .
2. 2. Rekombinantní bakulovirus podle nároku 1, který má do svého genomu vloženou sekvenci nukleové kyseliny kódující substanci ovlivňující hmyz operativně navázanou na promotor schopný aktivace transkripce ve hmyzí buňce.
3. 3. Rekombinantní bakulovirus podle nároku 2, kde uvedenou substancí ovlivňující hmyz je insekticidní toxin.
4. 4. Rekombinantní bakulovirus podle nároku 3, kde uvedený toxin je vybrán ze skupiny zahrnující AalT, AaHITl, AaHIT2, LqhIT2,

   LqqlTl, LqqI.T2, BjITI. , BjIT2, LqhP35, Lqha.IT, SmpIT2, SmpCT2,

   SmpCT3, SmpMT, DK9.2, DK1Í, DK12, μ-agatoxin, King Kong toxin,

   Pt6, NPS-326, NPS-331, NPS-373, Tx4(6-1), TxP-1, omega-atratoxiny, α-konotoxiny, μ-konotoxiny, chlorotoxin a omega-konotoxiny.
5. 5. Rekombinantní bakulovirus podle nároku 4, kde uvedený toxin je vybrán ze skupiny zahrnující AalT, TxP-1, LqhIT2 a omega-atracotoxin.
6. 6. Rekombinantní bakulovirus podle nároku 4, který dále obsahuje sekvenci kódující heterologní signální peptid, kde uvedená sekvence kódující, signální peptid je fúzována v pracovním rámci se

   Η Η· ·· ·· · · • · · · · · · • · · · · » ··· · · 9

   9 9 9 9 sekvencí kódující uvedený toxin.
7. 7. Rekombinantní bakulovirus podle nároku 6, kde uvedený signální peptid je vybrán ze skupiny zahrnující pBMHPC-12 signální sekvencí z Bombyx moři; signální sekvenci adipokinetického hormonu z Mandura sexta; apolipoforinovou signální sekvenci z Manduca sexta; chorionovou signální sekvenci z Bombyx moři; kutikulovou signální sekvenci z Drosophila melanogaster; signální sekvenci esterasy-6 z Drosophila melanogaster; a pohlavně specifickou signální sekvenci z Bombyx moři.
8. 8. Rekombinantní bakulovirus podle nároku 2_S kde uvedený promotor je hsp70 promotor.
9. 9. Rekombinantní bakulovirus podle nároku 8, kde uvedený promotor je vyhráli ze skupiny zahrnující hsp70 Bam a hsp70 Xba.
10. 10. Rekombinantní bakulovirus podle nároku 3, kde uvedený promotor je vybrán ze skupiny zahrnující DA26, 35K, 6.9K, polyhedrinový, hsp70 a aktinové promotory.
11. 11. Rekombinantní bakulovirus podle nároku 3, kde uvedený genom byl dále modifikován pro inaktivaci virového egt genu.
12. 12. Rekombinantní bakulovirus podle nároku 3, který dále obsahuje sekvenci nukleové kyseliny kódující esterasu juvenilního hormonu (.THE) operativně navázanou na promotor schopný aktivace transkripce ve hmyzí buňce.
13. 13. Rekombinantní bakulovirus podle nároku 5, kde uvedený promotor je hsp70 promotor.
14. 14. Rekombinantní bakulovirus pro Plutella xylostella mající do ·♦ ·· »· • ♦ · · · · • · · · · • · · · · · 9 • 9 9 ·

    9 999 99 99

    9 9 9 svého genomu vloženou sekvenci kódující TsP-1 operativně navázanou na Drosophila hsp70 promotor.
15. 15. Rekombinantní bakulovirus pro Plutella xylostella mající do svého genomu vloženou sekvenci kódující AalT operativně navázanou na Drosophila hsp70 promotor.
16. 16. Rekombinantní bakulovirus podle nároku 1, kde uvedená genetická alterace tvoří klonovací místo nepřítomné v přirozeném PxNPV.
17. 17. Rekombinantní bakulovirus podle nároku 16, který má do uvedeného klonovacího místa vloženou sekvenci nukleové kyseliny kódující substanci ovlivňující hmyz operativně navázanou na promotor schopný aktivace transkripce ve hmyzí buňce.
18. 18. Rekombinantní bakulovirus podle nároku substancí ovlivňující hmyz je insekticidní

    17, kde uvedenou toxin.
19. 19. Rekombinantní bakulovirus podle nároku 1.8 je vybrán ze skupiny zahrnující AalT. AaHITl, kde uvedený toxin AaHIT2, LqhTT2,

    LqqlTl, LqqIT2, BjITl SmpCT3, SmpMT, DK9.2, Pt.6, NPS-326, NPS-331

    BjIT2, LqhP35, LqhalT, DKÍ1, DK12, μ-agatoxin,

    NPS-373, Tx4(6-1), TxP-1,

    SmpIT2, SmpCT2, King Kong toxin, omega-atratoxiny, α-konotoxiny, μ-konotoxiny, chlorotoxin a omega-konotoxiny.
20. 20. Rekombinantní bakulovirus podle nároku 19, kde uvedený promotor je vybrán ze skupiny zahrnující DA26, 35K, 6.9K, polyhedrinový, hsp70 a aktinové promotory.
21. 21. Rekombinantní bakulovirus podle nároku 20, kde uvedený genom byl dále modifikován pro inaktivaci virového egt genu.

    μ- υ ··· • ·
22. 22. Rekombinantní bakulovirus podle nároku 21, který dále obsahuje sekvenci nukleové kyseliny kódující esterasu juvenilního hormonu (JHE) operativně navázanou na promotor schopný aktivace transkripce ve hmyzí buňce.
23. 23. Rekombinantní bakulovirus pro Plutella xylostella vybraný ze skupiny zahrnující ATCC VR-2607, ATCC VR-2608 a ATCC VR-2609.
24. 24. Přímý ligační vektor obsahující genomovou DNA izolovanou z rekombinantního bakulovirů podle nároku 1.
25. 25. Přímý ligační vektor podle nároku 24, ve kterém uvedená DNA dále obsahuje DNA kódující substanci ovlivňující hmyz operativně navázanou na promotor schopný aktivace transkripce ve hmyzí buňce.
26. 26. Přímý ligační vektor podle nároku 25, kde uvedená substance ovlivňující hmyz obsahuje insekticidní toxin vybraný ze skupiny zahrnující AalT, AaHITl, AaHIT2, LqhIT2, LqqlTl, LqqIT2, BjITl, BjIT2, LqhP35, LqhalT, SmpIT2, SmpCT2, SmpCT3, SmpMT, DK9.2,

    DK11, DK12, μ-agatoxin, King Kong toxin, Pt6, NPS-326, NPS-331, NPS-373, Tx4(6-1), TxP-1, omega-atratoxiny, α-konotoxiny, μ-konotoxiny, chlorotoxin a omega-konotoxiny.
27. 27. Přímý ligační vektor podle nároku 26, který dále obsahuje sekvenci kódující heterologní signální peptid, kde uvedená sekvence kódující signální peptid je fúzována v pracovním rámci se sekvencí kódující uvedený toxin.
28. 28. Přímý ligační vektor podle nároku 27, kde uvedený signální peptid je vybrán ze skupiny zahrnující pBMHPC-12 signální sekvenci z Bombyx moři; signální sekvenci adipokinetického hormonu z Mandura sexta; apolipoforinovou signální sekvenci z Manduca sexta; chorionovou signální sekvenci z Bombyx moři; kutikulovou <+ /

    4 4

    4 4· 4 • · 4 · 4 ·

    4 · · 4 · • 44444 4

    4 4 4 4

    4444 44 44 signální sekvenci z Drosophila melanogaster; signální sekvenci esterasy-6 z Drosophila melanogaster; a pohlavně specifickou signální sekvenci z Bombyx moři.
29. 29. Přímý ligační vektor podle nároku 25, kde uvedený genom byl dále modifikován pro inaktivaci virového egt genu.
30. 30. Přímý ligační vektor podle nároku 25, který dále obsahuje sekvenci nukleové kyseliny kódující esterasu juvenilního hormonu (JHE) operativně navázanou na promotor schopný aktivace transkripce ve hmyzí buňce.
31. 31. Přímý ligační vektor obsahující genomovou DNA izolovanou z rekombinantního bakuloviru podle nároku 16.
32. 32. Přímý ligační vektor obsahující genomovou DNA izolovanou z rekombinantního bakuloviru podle nároku 19.
33. 33. Přímý ligační vektor obsahující genomovou DNA izolovanou z rekombinantního bakuloviru podle nároku 23.
34. 34. Insekticidní přípravek vyznačující se t í m, že obsahuje rekombinantní bakulovirus pro Plutella xylostella (PxNPV) mající genetickou alteraci vzhledem k přirozenému PxNPV a zemědělsky přijatelný nosič, kde uvedená alterace je vybrána ze skupiny zahrnující (a) vložení nebo delece restrikčního místa; (b) modifikace, delece nebo duplikace genu kódovaného virem; (c) vložení genu kódujícího heterologní protein; a (d) jakékoliv kombinace výše uvedených alterací.
35. 35. Insekticidní přípravek podle nároku 34 vyznačuj ící se t í m, že uvedený rekombinantní bakulovirus má do,svého genomu vloženou sekvenci nukleové kyseliny kódující substanci

    HO *· » · ι · • · · ovlivňující hmyz operativně navázanou na promotor schopný aktivace transkripce ve hmyzí buňce.
36. 36. Insekticidní přípravek podle nároku 35 v y z n a č u j ící se t í m, že uvedenou substancí ovlivňující hmyz je insekticidní toxin vybraný ze skupiny zahrnující AalT, AaHITl, AaHIT2, LqhIT2, LqqlTl, LqqIT2, BjITl , BjIT2, I,qhP35, LqhalT, SmpIT2, SmpCT2, SmpCT3, SmpMT, DK9.2, DK11, DK12, μ-agatoxin, King Kong toxin,

    Pt6, NPS-326, NPS-33Í, NPS-373, Tx4(6-1), TxP-1, omega-atratoxiny, α-konotoxiny, μ-konotoxiny, chlorotoxin a omega-konotoxiny.
37. 37. Insekticidní přípravek podle nároku 36 vyznačuj ící s e t í tn, že uvedený rekombinantní bakulovirus dále obsahuje sekvenci kódující heterologní signální peptid, kde uvedená sekvence kódující signální peptid je fúzována v pracovním rámci se sekvencí kódující uvedený toxin.
38. 38. Insekticidní přípravek podle nároku 37 vyznačuj ící se t í tn, že signální peptid je vybrán ze skupiny zahrnující pBMHPC-12 signální sekvenci z Bombyx moři; signální sekvenci ad ipokinet i ckého hormonu, z Mandura sexta; apolipoforinovou signální sekvenci z Manduca sexta; chorionovou signální sekvenci z Bombyx moři; kutikulovou signální sekvenci z Drosophila melanogaster; signální sekvenci esterasy-6 z Drosophila melanogaster; a pohlavně specifickou signální sekvenci z Bombyx moři.
39. 39. Insekticidní přípravek podle nároku 36 v y z n a č u j ící se t í tn, že uvedený genom byl dále modifikován pro inaktivaci virového egt genu.
40. 40. Insekticidní přípravek podle nároku 36 vyznačuj ící • ·

    9 9 9 tvoří klonovaci místo • «ι • 999 9 9

    9 9 9 9 9

    9 99999 9 • 9 9 9

    9999 99 9 9

    99 9 se t m, že uvedená genetická al terace nepřítomné v přirozeném PxNPV.
41. 41. Insekticidní přípravek podle nároku 40 vyznačuj ící se t í m, že uvedený bakulovirus má do uvedeného klonovacího místa vloženou sekvenci nukleové kyseliny kódující substanci ovlivňující hmyz operativně navázanou na promotor schopný aktivace transkripce ve hmyzí buňce.
42. 42. Insekticidní přípravek podle nároku 41 v y z n a č u j ící se t í m, že uvedenou substancí ovlivňující hmyz je insekticidní toxin.
43. 43. Insekticidní přípravek podle nároku 42 vyznačuj ící se t í m, že uvedený toxin je vybrán ze skupiny zahrnující AalT, AaHITl, AaHIT2, LqhIT2, LqqlTl, LqqIT2, BjITl, BjIT2, LqhP35, LqhalT, SmpIT2, Sm_PCT2, Sm_PCT3, SmpMT, DK9.2, DK11, DK12, μ-agatoxin, King Kong toxin, Pt6, NPS-326, NPS-331, NPS-373, Tx4(6-1), TxP-1, omega-atratoxiny, α-konotoxiny, μ-konotoxiny, chlorotoxin a omega-konotoxiny.
44. 44. Insekticidní přípravek vyznačující se tím, že obsahuje rekombinantní bakulovirus pro Plutella xylostella podle nároku 2 a zemědělsky přijatelný nosič.
45. 45. Insekticidní přípravek vyznačuj ící se tím, že obsahuje rekombinantní bakulovirus pro Plutella xylostella podle nároku 4 a zemědělsky přijatelný nosič.
46. 46. Insekticidní přípravek vyznačuj ícíse tím, že obsahuje rekombinantní bakulovirus pro Plutella xylostella podle nároku 7 a zemědělsky přijatelný nosič.

    xJ V

    9 91 1

    19 1 111

    9 9 19

    1111 9

    1 111

    191 11 111
47. 47. Insekticidní přípravek vyznačuj ícíse tím, že obsahuje rekombinantní bakulovirus pro Plutella xylostella podle nároku 14 a zemědělsky přijatelný nosič.

    »· *1 ·· » · · · · · • · * » · • 11111 1

    1 111 19 11 11 11
48. 48. Insekticidní přípravek vyznačuj ícíse t í m, že obsahuje rekombinantní bakulovirus pro Plutella xylostella podle nároku 15 a zemědělsky přijatelný nosič.
49. 49. Insekticidní přípravek vyznačuj ícíse t í m, že obsahuje rekombinantní bakulovirus pro Plutella xylostella podle nároku 20 a zemědělsky přijatelný nosič.
50. 50. Insekticidní přípravek vyznačuj ícíse tím, že obsahuje rekombinantní bakulovirus pro Plutella xylostella podle nároku 23 a zemědělsky přijatelný nosič.
51. 51. Způsob pro hubení hmyzu vyznačující se tím, že obsahuje konatktování uvedených škůdců s insekticidně účinným množstvím insekticidního přípravku podle nároku 44.
52. 52. Způsob pro hubení hmyzu vyznačující se tím, že obsahuje konatktování uvedených škůdců s insekticidně účinným množstvím insekticidního přípravku podle nároku 45.
53. 53. Způsob pro hubení hmyzu vyznač u j í c í se t í m, že obsahuje konatktování uvedených škůdců s insekticidně účinným množstvím insekticidního přípravku podle nároku 46.
54. 54. Způsob pro hubení hmyzu vyznačuj ícíse tím, že obsahuje konatktování uvedených škůdců s insekticidně účinným množstvím insekticidního přípravku podle nároku 47.
55. 55. Způsob pro hubení hmyzu vyznačující se tím »· ·· ·· • · · · · · • · · « « • ·*· · · · • * · · ·· · · ·· ·· ·· že obsahuje konatktování uvedených škůdců s insekticidně účinným množstvím insekticidního přípravku podle nároku 48.
56. 56. Způsob pro hubení hmyzu v y z n a č u j í c í s e tím, že obsahuje konatktování uvedených škůdců s insekticidně účinným množstvím insekticidního přípravku podle nároku 49.
57. 57. Způsob pro hubení hmyzu vyznačující se tím, že obsahuje konatktování uvedených škůdců s insekticidně účinným množstvím insekticidního přípravku podle nároku 50.