SK282444B6 - Hmyzí vírus so zníženou schopnosťou šíriť sa v životnom prostredí z hostiteľa na hostiteľa a spôsob jeho výroby - Google Patents

Abstract

Je opísaný hmyzí vírus so zníženou schopnosťou šíriť sa v životnom prostredí z hostiteľa na hostiteľa, ktorý je vytvorený proti hmyzu neinfekčným pozmenením miesta p74 génu kódujúceho 74kDa proteín tohto vírusu, ktorého infekčnosť je obnovená komplementáciou s funkčným génom p74 alebo kódovaným p74 proteínom príslušného vírusu divého typu, pričom hmyzia bunka nesúca tento pozmenený hmyzí vírus je prídavne transfekovaná fragmentom DNA poskytujúcim chýbajúci produkt alebo funkciu pozmeneného miesta p74 génu funkčného vírusu divého typu. Tiež je opísaný spôsob výroby tohto vírusu zahŕňajúci tieto kroky: a) zbavenie vírusu infekčnosti pre hmyz pozmenením miesta p74 génu vírusu a b) obnovenie infekčnosti vírusu komplementáciou takto pozmeneného vírusu s produktom alebo funkciou, ktoré v pozmenenom víruse chýbajú alebo sú defektné, transfekciou hmyzej bunky nesúcej tento pozmenený vírus fragmentom DNA poskytujúcim produkt alebo funkciu, ktoré chýbajú alebo sú defektné v mieste p74 génu divého typu.ŕ

Description

Oblasť techniky

Tento vynález sa týka neinfekčného hmyzieho vírusu so zmeneným genetickým základom, ktorého funkčnosť sa obnoví génovou komplementáciou, čím sa opäť pripraví forma vírusu infekčná pre hmyz. Tento vynález sa ďalej zaoberá inzerciou heterológneho génu do vírusového genómu, pričom touto inzerciou sa dosiahne to, že vírus produkuje látku s potláčajúcimi alebo modifikačnými účinkami na hmyz, a tým sa zlepší bioinsekticídny účinok a genetická stabilita žiadaných vlastností.

Doterajší stav techniky

V tomto opise sa používajú nasledujúce skratky: A. cal. - Autographa califomica,

A^CMNPV - jadrový polyedrický vírus Autographa californica, bp - páry báz,

ECV - extracelulámy vírus, GV - granulózny vírus, kD - kilodaltony,

MOI - multiplicita infekcie, NPV - jadrový polyedrický vírus, OB - oklúzne teleso, OV - okludovaný vírus,

PCR - reťazová polymerázová reakcia,

PDV - vírus odvodený od polyedrického vírusu, p. i. - po infekcii,

PIB - polyedrické inklúzne teleso /známe tiež ako OB -oklúzne teleso/,

5'UTR - sekvencia mRNA alebo génová sekvencia zodpovedajúcej oblasti, ktorá začína od štartového miesta transkripcie génu a pokračuje až k poslednej báze alebo poslednému páru báz, ktorá /ktorý/ predbieha iniciačný kodón pre syntézu proteínu,

3’UTR - sekvencia mRNA alebo génová sekvencia zodpovedajúcej oblasti, ktorá začína od prvej bázy alebo prvého páru báz za terminačným kodónom pre syntézu proteínu a pokračuje až k poslednej báze kódovanej génom na 3' konci mRNA, /+/-vlákno - vlákno DNA génu a jeho lemujúce sekvencie, ktoré má rovnaký zmysel čítania ako RNA, ktorá je od tohto génu odvodená, /-/-vlákno - vlákno DNA génu a jeho lemujúce sekvencie, ktoré je komplementárne k /+/-vláknu.

Vynález sa vzťahuje na všetky hmyzie vírusy, včítane DNA a RNA vírusov. Medzi DNA vírusy sa zahŕňajú entomopox vírusy /EPV/ a vírusy čeľade Baculoviridae, ako sú jadrové polyedrické vírusy /NPV/ a granulózne vírusy /GV/ a podobne. Medzi RNA vírusy sa zahŕňajú togavírusy, flavivírusy, picomavírusy, cytoplazmatické polyedrické vírusy /CPV/ a podobne. Podčeľade dvoj vláknových DNA vírusov Eubaculovirinae obsahuje dva rody, vírusy typu NPV a vírusy typu GV, ktoré sú obzvlášť užitočné pre biologickú kontrolu, pretože vo svojom životnom cykle vytvárajú oklúzne telesá /OB/.

V bezstavcových živočíchoch bola zistená prítomnosť viac než 400 druhov baculovírusov. Jadrový polyedrický vírus Autographa califomica /A^CMNPV/ je prototypom vírusu čeľade Baculoviridae, ktorý pôsobí na mnoho hostiteľov. A^CMNPV vírus bol pôvodne izolovaný z druhu nočného motýľa Autographa califomica /A. cal./, z larválneho štádia /vo svojom dospelom Štádiu je tento druh nočná mora/. Larvy druhu A. cal. sú všeobecne známe ako húsenice žijúce na lucerne. Vírus A'MNPV napadá 12 čeľadí a viac než 30 druhov radu hmyzu Lepidoptera /motýle/ /Granados, R. R., a Federici, B. A., The Biology ov Baculoviruses (Biológia baculovírusov) I, 99 /1986//. Nie je známe, že by tento vírus účinne infikoval akýkoľvek iný druh okrem tohto radu.

Použitie baculovírusov ako bioinsekticídov je veľmi sľubné. Jednou z hlavných prekážok, ktorá bráni ich širokému použitiu v poľnohospodárstve, je časové zdržanie medzi infikovaním hmyzu a jeho smrťou. Toto zdržanie môže trvať niekoľko dní až niekoľko týždňov. Počas tohto času sa hmyz stále živí, a tým spôsobuje na rastlinách ďalšiu škodu. Rad vedcov sa snažil tento nedostatok prekonať vložením heterológneho génu do vírusového genómu tak, aby sa v napadnutom hmyze exprimovala riadiaca alebo pozmeňujúca látka pre hmyz, ako je toxín [Tomalski, M. D., a Miller, L. K., Náture, 352, 82 - 85 /1991/, Federici, B. A. , In Vitro, 28, 50A /1992/, Martens, J. W. M., a ďalší, App. & Envir. Microbiology, 56,2764 - 2770 /1990/], neuropeptid a hormón [Menn, J. J., a Borkovec, A. B., J. Agric. Food Chem., 37,271 - 278 /1889/, Eldridge, B., a ďalší, Insect Biochem., 21, 341 - 351 /1892/] alebo enzým [Hammock, B. D., a ďalší, Náture, 344,458 - 461 /1990/].

Génové inžinierstvo poskytuje prostriedky na prekonanie technických prekážok komerčného využitia vírusov ako bioinsekticídov, ale zároveň rastie pocit, že tu môže byť ďalšia potenciálna prekážka brániaca ich širokému prijatiu. Ide najmä o predpoklad, že uvoľnenie týchto geneticky manipulovaných vírusov do životného prostredia môže mať nepredvídateľné následky pre ekosystém, v ktorom sa tieto vírusy replikujú a šíria [Williamson, M., Náture, 353, 394 /1991/, Hammock, B., Náture, 355, 119 /1992/]. Tento predpoklad by sa až doteraz mohol vzťahovať na všetky rekombinačné vírusy hmyzu, vytvorené pre biologické potláčanie hmyzu, pretože všetky tieto vírusy sú schopné prenosu z hmyzu na hmyz. Preto je potrebné vytvoriť rekombinantné vírusy špecifické pre hmyz, ktoré majú zníženú schopnosť pre prenos z hmyzu na hmyz /z hostiteľa na hostiteľa/ po svojom uvoľnení do životného prostredia.

Životný cyklus baculovírusov, ukázaný na príklade vírusu A^CMNPV, sa skladá z dvoch štádií. V každom štádiu životného cyklu má vírus špecifickú formu: extraceluláme vírusové partikuly /ECV/, ktoré nie sú okludované a okludované vírusové partikuly /OV/ [Luckow, V. A., a Summers, M. D., Bio/Technology, 6, 47 - 53 /1988/, Miller, L. K., Ann. Rev. Microbiol., 42, 177 - 199 /1988/]. Extraceluláme i okludované vírusové formy majú rovnaký genóm, ale majú odlišné biologické vlastnosti. Zrenie každej z obidvoch foriem vírusu je riadené separátnymi súpravami vírusových génov, pričom niektoré z týchto súprav sú jedinečné pre každú formu.

Vo svojej prirodzene sa vyskytujúcej podobe, infekčnej pre hmyz, sa pomnožené virióny nachádzajú zabalené v parakryštalickej proteínovej matrici a sú známe ako oklúzne teleso /OB/OB/ alebo tiež polyedrické inklúzne teleso /PIB/. Proteínové vírusové oklúzie sa nazývajú polyédre, mnohosteny /jednotné číslo je polyéder, mnohosten/. Hlavným štruktúrnym proteínom vírusových oklúzií, ktorý je kódovaný vírusom, je polyhedrín, s molekulovou hmotnosťou 29 kD [Luckow, V. A., a Summers, M. D., Bio/Technology, 6, 47 - 53 /1985/, Smith, G. E., a Summers, M. D., US patent č. 4 745 051]. [Podobne vírusy GV vytvárajú OB, ktoré sú zložené najmä z granulínu, skôr než z polyhedrínu].

Vírusové oklúzie sú dôležitou časťou prirodzeného životného cyklu baculovírusov, poskytujúcich prostriedok pre horizontálny prenos /z hmyzu na hmyz/ medzi susceptibilnými druhmi hmyzu. V životnom prostredí susceptibil2

SK 282444 Β6 ný hmyz /obvykle v larválnom štádiu/ požerie vírusové oklúzie z kontaminovaného zdroja potravy, ako napríklad z rastliny. Kryštalické oklúzie sa v tráviacom trakte susceptibilného hmyzu rozpadnú, a tým sa uvoľňujú infekčné vírusové častice. Tieto vírusy odvodené od polyedrických vírusov /PDV/ napádajú tkanivové bunky vnútorností a replikujú sa v nich [Luckow, V. A., a Summers, M. D., Bio/Technology, 6,47 - 53 /1988/].

Vírusové častice pravdepodobne vstupujú do bunky endocytózou alebo fúziou a vírusová DNA sa v bunke vyskytuje nezahalená v jadrovom póre alebo v jadre. Replikácia vírusovej DNA sa v bunke objaví do šiestich hodín po vstupe vírusu. V čase do 10 až 12 hodín po infekcii /p.i./ sa sekundárna infekcia rozšíri do iných hmyzích tkanív pučaním extracelulámeho vírusu /ECV/ z povrchu bunky. ECV forma vírusu je zodpovedná za šírenie vírusu z bunky do bunky v infikovanom jedincovi hmyzu, rovnako ako za prenos infekcie v bunkovej kultúre.

V neskoršej fáze infekčného cyklu /12 hodín p.i./ sa dá v infikovaných bunkách zistiť proteín polyhedrin. Až po uplynutí 18 až 24 hodín p.i. sa v jadre infikovanej bunky proteín polyhedrin zoskupuje a vírusové častice sa zabalia do proteínových oklúzií. Počas 4 až 5 dní s postupom lýzy buniek narastá počet vírusový oklúzií do veľkých hodnôt. Tieto polyédre nemajú aktívnu úlohu pri šírení infekcie v larve. Vírusy v ECV forme sa množia a šíria v hemolymfe, a tým spôsobujú smrť larvy [Luckow, V. A., a Summers, M. D. , Bio/Technology, 6, 47 - 53 /1988/, Miller, L. K., Ann. Rev. Microbiol., 42, 177 - 199 /1988/, Smith, G. E., a Summers, M. D., US patent č. 4 745 051],

Keď infikovaná larva zahynie, v rozkladajúcom sa tkanive zostanú milióny polyédrov, zatiaľ čo ECV formy vírusu sa rozložia. Cyklus sa opakuje, keď je iná larva vystavená vplyvu týchto polyédrov napríklad tým, že požerie kontaminované rastliny alebo inú kontaminovanú potravu [Luckow, V. A., a Summers, M. D., Bio/Technology, 6, 47 - 53 /1988/].

Súhrnom sa dá povedať, že okludované formy vírusu zodpovedajú za počiatočné infikovanie hmyzu prostredníctvom tráviacich ústrojov a tiež za stabilitu vírusu v životnom prostredí. PDV formy vírusu nie sú v zásade infekčné pri injekčnom podávaní, ale sú vysoko infekčné pri orálnom podávaní. Neokludované formy vírusu /t. j. ECV formy/ zodpovedajú za sekundárnu infekciu a prenos infekcie medzi bunkami. ECV formy vírusu sú vysoko infekčné pre bunky v kultúre alebo pre vnútorné hmyzie tkanivové bunky, ak sú do nich vpravené injekciou, ale nie sú v zásade infekčné pri orálnom podávaní.

Použitie rekombinantných baculovírusov, ktoré exprimujú cudzie proteíny, toxické pre hmyz, je uľahčené tým, že tieto vírusy nie sú patogénne pre stavovce alebo rastliny. Okrem toho môžu baculovírusy všeobecne napádať úzky okruh hostiteľov. Mnoho kmeňov parazituje iba na jednom druhu hmyzu alebo na niekoľkých hmyzích druhoch.

Najskúmanejším baculovírusom je A^CMNPV vírus. Je známe, že vírus A'MNPV infikuje 12 čeľadí a viac než 30 druhov hmyzieho radu Lepidoptera /motýle/ [Granados, R. R., a Federici, B. A., The Biology of Baculoviruses (Biológia baculovírusov) 11,99 /1986/]. Nie je známe, že by tento vírus mohol účinne infikovať akýkoľvek iný druh okrem tohto radu. Verejnosť i rôzne úrady diskutovali o možných následkoch, ktoré by malo uvoľnenie kmeňa A'MNPV, obsahujúceho cudziu sekvenciu DNA [Williamson, Náture, 353 394 /1991/, Rammock, B., Náture, 355, 119 /1992/]. Diskusia sa týka možnosti, že by sa manipulovaný vírus mohol rozšíriť i na iné druhy radu Lepidoptera, proti kto rým nebol určený. Ďalším uvažovaným faktorom je známa stabilita týchto vírusov v životnom prostredí.

Preto je potrebné vytvoriť rekombinantný vírus špecifický pre určitý hmyz, so zníženou schopnosťou šíriť sa z hmyzu na hmyz (z hostiteľa na hostiteľa). Tieto vírusy by mali byť schopné infikovať hmyz, ale mali by mať významne zníženú schopnosť prenosu z hmyzu na hmyz, a tým aj schopnosť udržať sa v životnom prostredí.

Podstata vynálezu

Predmetom vynálezu je hmyzí vírus so zníženou schopnosťou šíriť sa v životnom prostredí z hostiteľa na hostiteľa, ktorý je vytvorený proti hmyzu neinfekčným pozmenením miesta p74 génu kódujúceho 74kDa proteín tohto vírusu, ktorého infekčnosť je obnovená komplementáciou s funkčným génom p74 alebo kódovaným P74 proteínom príslušného vírusu divého typu, pričom hmyzia bunka nesúca tento pozmenený hmyzí vírus je prídavné transfekovaná fragmentom DNA poskytujúcim chýbajúci produkt alebo funkciu pozmeneného miesta p74 génu funkčného vírusu divého typu.

Okrem toho je predmetom vynálezu aj spôsob výroby tohto vírusu, ktorého podstata spočíva v tom, že zahŕňa tieto kroky

a) zbavenie vírusu infekčnosti pre hmyz pozmenením miesta p74 génu vírusu a

b) obnovenie infekčnosti vírusu komplementáciou takto pozmeneného vírusu s produktom alebo funkciou, ktoré v pozmenenom víruse chýbajú alebo sú defektné, transfekciou hmyzej bunky nesúcej tento pozmenený vírus fragmentom DNA poskytujúcim produkt alebo fiinkciu, ktoré chýbajú alebo sú defektné v mieste p74 génu divého typu.

Vynález sa teda týka konštrukcie a pestovania rekombinantných vírusových kmeňov proti hmyzu, ktoré majú zníženú schopnosť šíriť sa z hmyzu na hmyz, t.j. majú zníženú schopnosť prenosu medzi hostiteľmi v životnom prostredí. Vírusy čeľade Baculoviridae sú obzvlášť vhodné na konštrukciu takých kmeňov, vzhľadom na dve štádiá svojho životného cyklu, ako je to opísané v texte.

Tieto vírusové kmene sa získajú tak, že sa najprv zmení genetický základ takým spôsobom, že vírus sa stane pre hmyz neinfekčným. Termín genetický základ neznamená v kontexte tohto vynálezu iba gény, ktoré kódujú trans-pôsobiace látky, ako sú DNA alebo proteínové molekuly, ale zahŕňa i cis-pôsobiace elementy alebo regulačné sekvencie, ako sú transkripčné enhacery, promótory, iné transkripčné, translačné a replikáciu genómu riadiace elementy a baliace sekvencie vírusovej DNA /alebo RNA/.

Zmena genetického základu môže mať podobu delécie, posunu čítacieho rámca, inzercie, prešmyku, bodovej mutácie, alebo iného porušenia funkcie génu. Iné formy zmeny zahŕňajú spôsoby, ktoré zabraňujú fungovaniu vírusu, ako je potlačenie transkripcie alebo translácie, použitie antikodónovej RNA inzercia prídavného génového elementu a inzercia prídavného regulačného elementu, ako je napríklad kvasinková aktivačná sekvencia, nachádzajúca sa pred cieľovým génom, ktorá vyžaduje prítomnosť GAL 4 proteínu pre svoju aktivitu /UAS_gal/.

Cieľ obnoviť infekčnosť rekombinantného vírusu, pričom prenos z hostiteľa na hostiteľa je významne znížený, sa dosiahne komplementáciou génov produktom alebo funkcií, ktoré v zmenenom víruse chýbajú alebo sú defektné.

Tento vynález zahŕňa rôzne spôsoby produkcie infekčnej podoby rekombinantného hmyzieho vírusu komple3

SK 282444 Β6 mentáciou génov, a to: /1/ produkciu infekčného rekombinantného vírusu v kultúre tkanivových buniek hmyzu, transfekovaných fragmentom DNA, poskytujúcim produkt alebo funkciu, ktoré v zmenenom víruse chýbajú alebo sú defektné; /2/ produkciu infekčného rekombinantného vírusu v líniách buniek hmyzu, ktoré boli stabilne transformované fragmentom DNA, poskytujúcim produkt alebo funkciu, ktoré v zmenenom víruse chýbajú alebo sú defektné; /3/ produkciu infekčného rekombinantného vírusu v transgénnych jedincoch hmyzu, ktoré obsahujú fragment DNA, poskytujúci produkt alebo funkciu, ktoré v zmenenom víruse chýbajú alebo sú defektné.

V závislosti od poskytnutého produktu alebo íunkcie môže byť nutné alebo žiaduce použil heterológny vírusový alebo bunkový promótor na riadenie expresie daného DNA fragmentu. Použitie promótora môže byť vynútené ohľadmi na dávkovanie alebo času.

Bunky hmyzu používané na spôsob prípravy infekčného rekombinantného vírusu podľa spôsobu /1/ a /2/ a transgénne druhy hmyzu podľa spôsobu /3/ fungujú teda ako „pomocníci“ pri obnove infekčnosti virusu. Vírusové častice /virióny/ pripravené podľa týchto spôsobov spôsobujú infekciu, ak sú v prírode požité hmyzom. Virióny utvorené v infikovaných larvách sú defektné, pretože nie sú komplementované, a infekcia sa preto nešíri ľahko na iné jedince hmyzu. V neprítomnosti koinfikujúceho divého vírusu preto životný cyklus rekombinantného vírusu končí po tejto jedinej infekcii.

Pri prednostnej aplikácii tohto vynálezu sa do vírusového genómu vloží gén, kódujúci látku, ktorá má riadiace alebo modifikačné účinky na hmyz. Tento gén sa vloží na akékoľvek vhodné miesto do genómu zmeneného vírusu. Látkami, ktoré majú riadiace alebo modifikačné účinky na hmyz, môžu byť toxíny, neuropeptidy, hormóny a enzýmy. Expresia takej látky zvyšuje bioinsekticídny účinok.

Vhodné je najmä, keď sa tento gén vloží priamo do miesta zmeny genetického základu, ktoré zodpovedá za zníženú schopnosť prenosu z hostiteľa na hostiteľa alebo na pozíciu, ktorá s týmto miestom susedí. Vloženie heterológneho génu do miesta zmeny genetického základu alebo do jeho blízkosti zabraňuje alebo veľmi obmedzuje rekombináciu génov, ktorá by mohla dať vzniknúť forme daného vírusu, majúcej fenotyp divej podoby vírusu i gén s potláčajúcimi účinkami na hmyz alebo modifikačný gén pre prenos z hostiteľa na hostiteľa.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1 zobrazuje lineárnu mapu známych baculovírusových génov A'MNPV genómu [Blissard, G. W., a Rohrmann, G. F., Ann. Rev. Entomol., 35,127 - 155 /1990/].

Obr. 2 ukazuje detail konštrukcie plazmidu p74-l, ktorý obsahuje deléciu v p74 géne z vírusu A^CMNPV.

Obr. 3 ukazuje detail delécie v p74 géne /v plazmide p74/ z vírusu A^CMNPV, z kmeňa A4000.

Obr. 4 ukazuje reštrikčnú mapu časti expresného vektora zo sérií PMEV, na ktorej je zobrazený promótor, polylinker a oblasť 3'UTR.

Nasleduje podrobný opis vynálezu

Výsledkom genetickej manipulácie vírusu hmyzu so zníženou schopnosťou šíriť sa z jedného jedinca hmyzu na iného je zvýšená rýchlosti vymiznutia infekčného vírusu z prostredia, presahujúca rýchlosti prirodzených procesov abiotickej a biotickej degradácie. Preto sa manipulovaný vírus sám nepresadí v životnom prostredí.

Tento vynález sa týka všetkých vírusov hmyzu včítane DNA a RNA vírusov. DNA vírusy zahŕňajú vírusy obsahujúce zabalenú dvojvláknovú DNA, ako napríklad /najprv uvedená čeľaď, potom druh/ Entomopoxvirinae [poxvírus radu coleoptera /chrobáky/], Eubaculovirinae /Autographa californica MNPV; Heliocoverpa zea SNPV/, Nudibaculovirinae /Heliocoverpa zea NOB/, Ichnovírus /Campoletis sonorensis vírus/, a Bracovirus /Cotesi sia melanoscela vírus/ a tiež vírusy obsahujúce nezahalenú dvojvláknovú DNA, ako napríklad Iridoviridae /Chilo iridescent vírus/, a vírusy obsahujúce nezahalenú jednovláknovú DNA, ako napríklad Parvoviridae /Galleria densovirus/.

RNA vírusy zahŕňajú vírusy, obsahujúce zabalenú dvojvláknovú RNA, ako napríklad Togaviridae /Sindbis vírus/, Bunyaviridae /repný vírus krútenia listov/ a Flaviviridae /Wesselbron vírus/ a tiež vírusy obsahujúce nezahalenú dvojvláknovú RNA, ako napríklad Reoviridae /Corriparta vírus/, a Birnaviridae /Drosophila X vírus/, a tiež vírusy obsahujúce nezahalenú jednovláknovú RNA, ako napríklad Picornaviridae /Cricket paralysis vírus/, Tetraviridae /Nudaurelia beta vírus/ a Nodaviridae.

Podčeľaď vírusov obsahujúcich dvojvláknovú DNA, Eubaculovirinae, obsahuje dva rody, jadrové polyedrické vírusy /NPV/ a granulózne vírusy /GV/, ktoré sú obzvlášť užitočné na biologické potláčanie, pretože vo svojom životnom cykle tvoria oklúzne telesá. Príklady NPV vírusov sú Lymantria dispar NPV /NPV vírus červenej mory/, Autographa californica MNPV, Anagrapha falcifera NPV /NPV vírus piadivky zelerovej/, Spodoptera litturalis NPV, Spodoptera frugiperda NPV, Heliothis armigera NPV, Mamestra brassicae NPV, Choristoneura Jumiferana NPV, Trichoplusia ni NPV, Heliocoverpa zea NPV, Rachiplusia ou NPV atď. Príklady GV vírusov sú Cydia pomonella GV /GV vírus víjačky jablčnej/, Pieris brassicae GV, Trichoplusia ni GV, Artogeia rapae GV, Plodia interpunctella GV /vírus kukuričnej mory/ atď. Príklady entomopox vírusov sú Melolontha melolontha EPV, Amsacta moorei EPV, Locusta migratoria EPV, Melanoplus sanguinipes EPV, Schistocerca gregaria EPV, Aedes aegypti EPV, Chironomus luridtts EPV atď.

Použitím tohto vynálezu sa docieli ochrana poľnohospodárskych plodín, stromov, krov, sadov a okrasných rastlín pred útokom hmyzu, obzvlášť hmyzu z radu Lepidoptera, Orthoptera, Diptera, Isoptera, Hymenoptera, Homoptera, Hemiptera a Coleoptera.

Aj keď vynález je ilustrovaný na príklade vírusu NPV /A^CMNPV/ pre druh Autographa californica, je samozrejmé, že tu opísané námety sa dajú použiť pre všetky uvedené hmyzie vírusy. Ďalej sa predpokladá, že tento vynález bude veľmi užitočný pri zlepšovaní nových hmyzích vírusov, ktoré doteraz neboli identifikované a klasifikované v literatúre.

Výsledkom infekcie vírusom A^CMNPV je najprv tvorba pučiacej formy virusu, ktorá je známa ako ECV. ECV forma spôsobuje šírenie vírusu z bunky do bunky v napadnutom jedincovi hmyzu a tiež počas rastu v bunkovej kultúre. V prípade vírusov NPV začne infikovaná bunka v neskoršej fáze infekčného cyklu tvoril PDV formu vírusu. PDV forma je zabalená v kryštalickom oklúznom telese /OB/, ktoré sa tiež niekedy nazýva polyedrické inklúzne teleso /PIB/. /Podobne GV vírusy tvoria OB, ktoré sa skladajú hlavne z proteínu granulínu, skôr než z polyhedrinu./ Táto PDV forma vírusu spôsobuje počiatočnú infekciu hmyzu vnútornosťami a tiež stabilitu virusu v životnom prostredí.

Taká zmena funkcie, ktorá spôsobuje tvorbu intaktných infekčných OB, ktorá neovplyvňuje pučiacu formu vírusu /ECV/, je obzvlášť užitočná.

SK 282444 Β6

Vo víruse A°MNPV boli nájdené také mutácie, [Partington, S., a ďalší, Virology, 175, 91 - 102 /1990/]. Po uskutočnení mnohých mutačných pokusov boli identifikované génové lokusy, ktoré spôsobujú tvorbu pučiacej formy vírusu, ale nezodpovedajú za tvorbu intaktných infekčných polyédrov. Jedným z najzaujímavejších potenciálne užitočných lokusov, ktorý bol identifikovaný, je p74 gén, nachádzajúci sa v Hind ΙΠ fragmente „P“ genómu vírusu A^CMNPV [Kuzio, J., a ďalší, Virology, 173, 759 - 763 /1989/]. p74 je proteín produkovaný v neskoršej fáze infekcie baculovírusom a v relatívne malých množstvách [Kuzio, J., a ďalší, Virology, 173,759 - 763 /1689/].

Homológne sekvencie p74 génu boli identifikované v iných NPV vírusoch, včítane Choristoneura fumeiferana NPV [Hill, J. E., a ďalší, Biochimica et Biophysica Acta, 1172,1 - 2 /1993/ a Orgyia pseudotsugata NPV [Leisy, D.

J. , a ďalší, Virology, 153, 157 · 167 /1986/]. Homológna sekvencia génu p74 by sa mala vyskytovať vo všetkých druhoch rodu NPV. Vzhľadom na podobnosti medzi životnými cyklami NPV vírusov a životnými cyklami vírusov príbuzného rodu granulóznych vírusov /GV/ je veľmi pravdepodobné, že tieto GV vírusy obsahujú gén s vlastnosťami podobnými génu p74.

Výsledkom rozsiahlych delécií, ktorými sa odstráni tento p74 gén a susedný p 10 gén, je vírus tvoriaci polyédre, ktoré však, ak sú súčasťou potravy lariev, nepôsobia infekčne. Pretože výsledkom delécie iba v géne plO je tvorba orálne infekčných polyédrov, predpokladá sa, že uvedená zmena fenotypu je spôsobená deléciou génu p74 [Kuzio, J., a ďalší, Virology, 173,759 - 763 /1989/].

Ako je opísané ďalej v texte, v príklade 1, bol vytvorený transferový vektor /pomenovaný Ap74-1/, ktorý po rekombinácii s genómom vírusu divého typu spôsobí deléciu v samotnom géne p74 /Ap74/ /obr. 3/. Vzorky E. coli kmeňa HB101, nesúce tento transferový vektor Ap74-1, boli uložené 21. mája 1992 v Americkej zbierke typov kultúr, /Američan Type Culture Collection/ 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, a dostali ATCC prírastkové číslo 68 988. 21. mája 1992 boli v tejto zbierke uložené tiež vzorky A'MNPV kmeňa označeného A4000 /v tomto kmeni je gén p74 poškodený deléciou/, ktoiý dostal ATCC prírastkové číslo VR 2373.

Je potvrdené a opísané v príklade 2 ďalej v texte, že je to práve delécia DNA segmentu, kódujúceho p74 gén, ktorá spôsobuje tvorbu PIB telies neinfekčných pre larvy, ktoré ich požijú. Stále sa však tvorí pučiaca forma vírusu, a tá pôsobí infekčne, ak je injekciou vpravená do hemocoelu hmyzu.

Jednoduchá delécia DNA segmentu nie je jediným typom zmeny, používaným na porušenie funkcie cievového genetického základu vírusu. Na účely toho vynálezu termín genetický základ neznamená iba gény, ktoré kódujú trans-pôsobiace látky, ako sú RNA alebo proteínové molekuly, ale zahŕňa aj cis-pôsobiace elementy alebo regulačné sekvencie, ako sú transkripčné enhacery, promótory, iné transkripčné, translačné a replikáciu genómu riadiace elementy a baliace sekvencie vírusovej DNA /alebo RNA/.

Zmena môže mať tiež podobu posunu čítacieho rámca, inzercie, preskupenia génov, bodovej mutácie alebo iného porušenia funkcie génu. Do tohto súpisu spadá posun čítacieho rámca, ktorý spôsobí buď predčasné ukončenie tvorby proteínu, alebo tvorbu zmeneného nefunkčného proteínu. Ďalej tento vynález zahŕňa inzerciu terminačného kodónu do oblasti génu kódujúcej proteín a vsadenie génu pre vhodnú supresorovú tRNA do pomocnej „helper“ bunkovej línie.

Iné formy zmeny genetického základu zahŕňajú spôsoby, ktoré zabraňujú fungovaniu vírusu, ako je potlačenie transkripcie alebo translácie, použitie antikodónovej RNA, inzercie prídavného génového elementu do vírusového genómu a poskytnutie žiadaného regulačného elementu pre trans-pôsobiace látky. Príkladom tohto spôsobu je použitie kvasinkovej aktivačnej sekvencie, uloženej pred cieľovým génom, závislej od GAL 4 proteínu /UAS_GAL/·

Vloženie tejto kvasinkovej sekvencie, aktivovanej proteínom GAL 4 /UAS_gal/, pred cieľový vírusový gén spôsobí, že transkripcia vírusového génu je závislá od prítomnosti GAL 4 proteínu. Pomocná bunková línia /helper/ obsahuje kódujúcu oblasť pre GAL 4 gén pod kontrolou jedného z heterológnych promótorov, opísaných v texte. Tento vynález zahŕňa aj iné možné UAS elementy, ako sú napríklad UAS elementy vyskytujúce sa pri párovaní /mating/ kvasiniek. Ďalej tento vynález zahŕňa sekvencie regulačných elementov, ktoré vyžadujú naviazanie proteínu pre svoju aktiváciu, ako sú receptory pre steroidy a ich väzbové miesta v DNA.

Vynález sa tiež vzťahuje na použitie promótorov, ktoré fungujú iba v prítomnosti špecifických proteínov. Príkladom takého promótora je T7 promótor bakteriofágu T7, ktorý na začatie transkripcie vyžaduje T7 špecifickú RNA polymerázu. Vloženie T7 promótora pred p74 gén na miesto jeho prirodzeného promótora spôsobí, že transkripcia vírusového génu je závislá od prítomnosti T7 RNA polymerázy. Bunková línia helper pre tento vírus obsahuje gén pre T7 RNA polymerázu pod kontrolou heterológneho promótora, ako je IE-1 vírusový promótor.

Okrem génu p74 a jeho funkčných homológov sa môžu zmeniť funkcie prídavných génov, čo spôsobí zamedzenie šírenia rekombinantného vírusu /napríklad 14/. Z tohto hľadiska sú obzvlášť užitočné gény ovplyvňujúce funkcie, nevyhnutné pre tvorbu intaktných infekčných OB. Príklady týchto génov sú génový element, riadiaci reguláciu prepínania /switch/ z tvorby ECV na tvorbu OB, gén kódujúci funkciu žiadanú pre priame zoskupovanie alebo zrenie vírusovej častice a gén kódujúci štruktúrny proteín vírusovej častice.

Ďalšími príkladmi génov, ktoré sa môžu meniť podľa tohto vynálezu, sú gény, ktoré tvoria FP /few polyhedra, t. j. malé množstvo polyédrov/ mutanty, ako je 25K gén [Beames, B., a Summers, M. D., Virology, 168, 344 - 353 /1989/], a tiež gény, ktorých funkcia po ich porušení vedie k vzniku žiadaného fenotypu, ako sú vírusové transkripčné faktory špecifické pre fungovanie neskorých a veľmi neskorých génov, gény pre polyedrické obalové proteiny /s hmotnosťou 32 až 36,5 kĎ/, gén pre PDV proteín, ktorý interaguje s receptorom v tráviacich ústrojoch a je zodpovedný za počiatočné infikovanie buniek tráviacich ústrojov, gén alebo génový element zodpovedný za zoskupovanie PDV nukleokapsidu, gén zodpovedný za organizáciu polyédra a gén kódujúci NPV funkčný ekvivalent vírusového zosilňovacieho /enhancing/ faktora [Gallo, L. G., a ďalší, J. Invertabrate Path., 58, 203 - 210 /1991/], ktoiý bol nájdený v GV vírusoch.

Aj keď na zmenu genetického základu je tiež možné použiť gén pre polyhedrín, existujú pre toto použitie významné praktické obmedzenia. Výsledkom vysokej rýchlosti transkripcie/translácie génu pre polyhedrín, spojenej s veľkou amplifikáciou vírusového genómu, ktorá sa odohráva pri replikácii vírusu, je fakt, že množstvo proteínu polyhedrínu dosahuje 50 až 75 % celkového množstva farbiteľných proteínov v napadnutej bunke. Toto veľké množstvo proteínov môže spochybniť možnosť, aby obmedzené množstvo extravírusových kópií génu pre polyhedrín kompenzo5

SK 282444 Β6 valo deletovaný vírusový gén pre polyhedrín. Ale komplementácia polyhedrín-mínus vírusu /vírusu netvoriaceho polyhedrín/ by sa mala získať s použitím regulačných elementov alebo faktorov, ktoré by sa iba mali dodať v menšom množstve. Príkladom je manipulácia vírusového génu pre polyhedrín tak, aby obsahoval gén pre supresorovú tRNA alebo zmena regulačných elementov génu pre polyhedrín a pestovanie vírusu vo vhodnej bunkovej línii helper alebo kmeni hmyzu, ako je to opísané v texte.

Zdá sa, že na rozdiel od polyhedrínu je p74 proteín žiadaný v omnoho menšom množstve. Aj keď sa gén p74 prepisuje v neskoršej fáze infekcie vírusom, kedy vírusový genóm je už výrazne amplifikovaný, hladina p74-špecifickej mRNA je pomerne nízka. Malo by teda byť možné manipulovať p74 konštrukt tak, aby len obmedzené množstvo extravírusových kópií mohlo zaistiť dostatočné fungovanie génu p74 pre komplementáciu vírusu, aby sa docielila jeho orálna infekčnosť.

Vynález je demonštrovaný na príklade vírusu A^CMNPV. Gén majúcii homológnu funkciu s génom p74 by mal byť prítomný vo všetkých vírusoch patriacich do NPV a GV skupín baculovírusov. V druhoch baculovírusov, ktoré sú blízko príbuzné vírusu A^CMNPV, sa dajú identifikovať homológy p74 génu pomocou hybridizácie s p74 fragmentom vírusu A^CMNPV za podmienok zníženej stringencie. Tento prístup je najmä vhodný, pretože dostupné údaje ukazujú, že p74 gén je jedným z najviac zachovaných baculovírusových génov [Hill, J. E., a ďalší, Biochimica et Biophysica Acta, 1172, 1 - 2 /1993/]. Pre vzdialenejšie príbuzné vírusy, ako sú GV vírusy, sa tento prístup nemôže použiť. Alternatívny spôsob identifikácie génov, kódujúci homológnu funkciu k identifikovanému génu vírusu A^CMNPV, je opísaný v príklade 14. Pri tomto súbore pokusov sa A^CMNPV kmeň so známym genetickým defektom transfekuje spoločne s fragmentmi vírusového genómu, ktorý je predmetom záujmu. Komplementácia defektu identifikuje gén, ktorý je predmetom záujmu. Tento spôsob sa úspešne použil pri identifikácii génu v granulóznom víruse Cydia pomonella s funkciou homológnou k p35 apoptose, inhibujúcej gén vírusu A^CMNPV [Crook, N. E., a ďalší, J. Virology, 67,2168 - 2174 /1993/].

Môžu sa tiež použiť iné spôsoby identifikácie funkcií ďalších nevyhnutných neskorých génov. Passarelli a Miller [Passarelli, A. L., a Miller, L. K., J. Virology, 67, 2149 - 2158 /1993/] nedávno publikovali spôsob identifikácie transkripčných faktorov pre neskoré/veľmi neskoré gény. Pri tomto spôsobe sa fragmenty A^CMNPV vírusového genómu transfekujú spoločne s konštruktmi, ktoré na riadenie expresie CAT génu používajú neskoré alebo veľmi neskoré vírusové promótoiy. Fragmenty A’MNPV genómu, ktoré obsahujú gény zúčastňujúce sa pri normálnej transkripcii vírusových neskorých alebo veľmi neskorých génov, sa identifikujú podľa svojej stimulácie CAT aktivity nad obvyklú úroveň.

Pre hmyz sa infekčná forma vírusu vytvorí dodaním zmenenej génovej funkcie technikou génovej komplementácie. Táto pre hmyz infekčná forma zmeneného vírusu sa neprenáša ľahko z hostiteľa na hostiteľa. Génová komplementácia poskytne génu schopnosť konvertovať mutačný fenotyp na fenotyp divého typu v trans-podmienkach.

Tento vynález zahŕňa rôzne spôsoby produkcie infekčnej formy rekombinantného vírusu hmyzu, menovite: /1/ produkciu tohto vírusu v kultúre tkanivových buniek hmyzu transfekovaných fragmentom DNA, poskytujúcim produkt alebo funkciu, ktoré v zmenenom víruse chýbajú alebo sú defektné; /2/ produkciu tohto vírusu v líniách buniek hmyzu stabilne transfekovaných fragmentom DNA, pos kytujúcim produkt alebo funkciu, ktoré v zmenenom víruse chýbajú alebo sú defektné; /3/ produkciu tohto vírusu v transgénnych jedincoch hmyzu obsahujúcich fragment DNA, poskytujúci produkt alebo funkciu, ktoré v zmenenom víruse chýbajú alebo sú defektné. Bunková línia použitá pri spôsobe /1/ alebo /2/ poskytuje chýbajúcu funkciu, a tak slúži ako bunková línia helper.

Napríklad p74 gén vírusu A'MNPV sa deletuje, ako je opísané v texte. p74 gén divého typu komplementuje deficienciu zmeneného vírusu pri troch špecifických usporiadaniach, práve opísaných v texte, nasledujúcimi spôsobmi: /1/ Vírus sa pestuje v bunkách hmyzu, ktoré obsahujú extrachromozómové kópie funkčného p74 génu. Týmito extrachromozómovými kópiami môžu byť DNA fragmenty, plazmidy obsahujúce p74 gén alebo plazmidy schopné replikácie počas bunkového delenia alebo ako odpoveď na vírusovú infekciu. /2/ Vírus sa pestuje v línii buniek hmyzu obsahujúcej jednu alebo viac funkčných kópií p74 génu, pričom tieto kópie sú stabilne integrované do bunkového genómu. /3/ Vírus sa pestuje v transgénnych hmyzových jedincoch obsahujúcich jednu alebo viac funkčných kópií p74 génu v hmyzovom genóme.

Pri všetkých troch spôsoboch sa funkčný p74 gén môže dodať z vírusu A^CMNPV alebo z akéhokoľvek iného jedinca čeľade Eubaculoviridae, ak tento jedinec naviacia infekčnosť. Kľúčovú úlohu hrá fakt, že funkčný p74 gén je prítomný v trans-podmienkach a poskytuje látku schopnú difúzie, ktorá regeneruje fenotyp divého typu.

Pri jednom spôsobe produkcie komplementovanej formy vírusu sa vírus pestuje v bunkovej línii, ktorá mu poskytuje chýbajúcu fimkciu. Napríklad sa p74 vírus tvorí v bunkovej línii, ktorá exprimuje produkt p74 génu. Transfekciou plazmidu obsahujúceho Hind III fragment „P“ vírusu A'MNPV /hlavne ide o p74 gén s malým množstvom natívnych lemujúcich sekvencií A'MNPV genómu/, spoločne s Ap74 vírusom, sa dosiahne prechodne regenerácia infekčnej formy vírusu. Vzorky E. coli kmeňa HB101 nesúceho tento plazmid s označením ACOO28.3, obsahujúce p74 gén a lemujúce sekvencie, ako bolo práve opísané, boli uložené 21. mája 1992 v Americkej zbierke typov kultúr a bolo im udelené ATCC prírastkové číslo 68 987. Pretože len 0,1 až 5,0 % buniek použitých na túto spoločnú transfekciu obsahuje funkčný p74 gén aj Δρ74 vírusový genóm, je tento spôsob v podstate neúčinný.

Účinnejším spôsobom tvorby bunkovej línie helper je vloženie kópie p74 génu do bunky tak, že sa tento gén stabilne integruje do bunkového genómu /pozri príklad 6/. Tento postup bol použitý na vloženie nebaculovírusových génov do Sf9 línie buniek hmyzu [Jarvis, D. L., a ďalší, Biotechnology, 8, 950 - 955 /1990/]. Sf9 línia buniek hmyzu /ATCC prírastkové číslo CRL 1711/je odvodená od druhu Spodoptera frugiperda21 /Sf21/. Plazmid obsahujúci kópiu génu, ktorý je predmetom záujmu, sa transfekuje spoločne s plazmidom obsahujúcim selekčný marker.

Selekčný marker je gén, ktorého expresia umožňuje identifikáciu buniek, ktoré boli transformované vektorom obsahujúcim tento markerový gén a tiež gén, ktorý je predmetom záujmu. Medzi príklady všeobecne užívaných selekčných markerov patria gény pre tymidínkinázu /TK/ a pre hypoxantínguanínfosforibozyltransferázu /HGFRT/ a tiež gény, ktoré kódujú rezistenciu k antibiotikám, ako je neomycín a hygromycin.

Na komplementáciu sa používa dvojnásobný až dvadsaťnásobný mólový prebytok komplementárnej DNA k

DNA obsahujúcej selekčný marker. Tento prebytok maximalizuje pravdepodobnosť, že bunka, ktorá exprimuje selekčný marker, obsahuje tiež gén, o ktorý je záujem. Vy6

SK 282444 Β6 bratá bunková línia musí dovoliť vstup používaného vírusu. Pri prednostnom použití vírusu A'MNPV je takou bunkovou líniou S® alebo Sf21 línia. Po transfekcii sa bunky pestujú za podmienok selekčného tlaku, a tak sa pomnožia bunky exprimujúce selektívny marker. Tieto pomnožené bunkové línie sa podrobia výberu, ktorého kritériom je schopnosť týchto línií komplementovať p74 deléciu v Ap74 víruse.

Tento spôsob sa používa na izoláciu S® bunkových línií obsahujúcich kópie plazmidu ACOO28.3, čo je plazmid obsahujúci p74 gén, opísaný v texte. Vzorky bunkovej línie označené S® /28.3/ CL-2, obsahujúce kópie plazmidu ACOO28.3 stabilne integrované do bunkového genómu, boli uložené 7. apríla 1993 v Americkej zbierke typov kultúr a dostali ATCC prírastkové číslo CRL 11 322. Bolo potvrdené, ako je opísané v príklade 7 ďalej v texte, že pestovanie defektného orálne neinfekčného Δρ74 vírusu v uvedenej bunkovej línii vedie k produkcii orálne infekčného Δρ74 vírusu.

Komplementácia sa neobmedzuje na pestovanie vírusu v bunkovej kultúre. Rovnako ako sa môže vytvoriť bunková línia typu helper, môže sa tiež utvoriť kmeň hmyzu typu helper. Napríklad P element transformácie druhu Drosophila je teraz bežne používaný a podobný systém sa môže vytvoriť pre akýkoľvek druh hmyzu. Okrem toho sa vykonáva bezvektorová transformácia hmyzu podobným spôsobom ako bezvektorová transformácia cicavcov. Na vytvorenie jedincov hmyzu nesúcich nevyhnutný gén sa môže použiť priame injekčné vpravenie génu do preblastodermálnych vajíčok [Presnail, J. K., a Hoy, M. A., Prac. Natl. Acad. Sci., 89, 7732 - 7736 /1992/ alebo balistická transformácia týchto vajíčok kovovými vláknami [Baldarelli R. M., a Lengyel, J. A., Nucleic Acids Pes., 18, 5903-5904/1991/].

Na tvorbu produktu p74 génu stačí relatívne slabý endogénny p74 promótor. Ale môže byť žiaduce použiť silnejší alebo skôr pôsobiaci promótor na urýchlenie tvorby produktu p74 génu. Použitie heterológneho promótora by mohlo zlepšiť účinnosť komplementácie Δρ74 vírusu. Na toto použitie sa hodia vírusové promótory akejkoľvek veľkosti. Príklady týchto promótorov sú 6,9K promótor /pre základný proteín/, DA26 promótor, promótor pre polyhedrín, 35K promótor, 39K promótor, plO promótor a IE-1 promótor.

Použitie konštruktov s heterológnymi promótormi, ako sú konštrukty opísané v príkladoch 4 a 5, má ďalšiu výhodu. V týchto konštruktoch sú odstránené takmer všetky homológne sekvencie od 5'konca k delécii v p74 géne v A4000 Δρ74 vírusu opísanom v príklade 1. Toto by malo vysoko znížiť akúkoľvek možnosť homológnej rekombinácie, odohrávajúcej sa medzi p74 vírusom a p74 sekvenciami, ktoré sú integrované do bunkového genómu. Výsledkom tejto homológnej rekombinácie by inak mohlo byť obnovenie p74 funkcie a obnovenie divého fenotypu vírusu /pozri diskusie v príklade 7/. Ďalším krokom, ako znížiť možnosť homológnej rekombinácie, je zvýšiť veľkosť delécie v p74 géne Δρ74 vírusu tak, aby nezvyšovala žiadna kódujúca sekvencia. To sa ľahko uskutoční modifikovaním postupu, ktorý je opísaný v príklade 1.

Heterológnym promótorom nemusia byť vírusové promótory. Bunkové promótory sú tiež vhodné a existuje ich neobmedzený výber. Príklady takých promótorov sú Bombyx mori aktin promótor a Drosophila melanogaster hsp 70 promótor. Dobré promótory udržujú expresiu na strednej alebo vysokej úrovni vo vhodných hmyzových bunkách počas infekcie vírusom. Tieto charakteristiky neobmedzujú výber na hmyzové promótory. Týmto kritériám môžu vy hovovať rôzne promótory zo stavovcov, kvasiniek alebo z iných tried vírusov. Akýkoľvek z uvedených promótorov tiež riadi expresiu selekčného markera.

Podľa ďalšieho spôsobu prevedenia tohto vynálezu sa do vírusového genómu vloží heterológny gén pre látku, ktorá má potláčajúce alebo modifikačné účinky na hmyz. Touto látkou je napríklad toxín, neuropeptid alebo hormón, alebo enzým. Vhodné je najmä, keď sa heterológny gén vloží priamo na miesto zmeny genetického základu vírusu, čo znamená, že rekombináciou medzi geneticky zmeneným vírusom a superinfekčným divým typom vírusu vo väčšine prípadov nevznikne vírus s funkciou vírusu divého typu a s vloženým heterológnym génom. Do tohto vynálezu tiež spadá inzercia heterológneho génu na miesto susediace s miestom zmeny genetického základu vírusu, takže segregácia heterológneho génu a zmeneného genetického základu sa vyskytne pri menej ako 10 % z celkového množstva vírusových potomkov. Obmedzenie šírenia geneticky manipulovaného vírusu sa preto zachová v obidvoch prípadoch.

Takými toxínmi sú napríklad pre hmyz špecifický toxín AalT zo škorpióna Androctonus australis [Zlotkin, E., a ďalší, Toxicon, 9, 1 - 8 /1871/], toxín z roztoča druhu Pyemotes tritici [Tomalski, M. D., a Miller, L. K., Náture, 352, 82 - 851, /1991/], toxín z Bacillus thuringiensis subsp. aizawai /BTK/ [Martens, J. W. M., a ďalší, App. & Envir. Microbiology, 56, 2764 - 2770 /1990/], toxín izolovaný z pavúčieho jedu [Jackson, J. R. H., aParks, T. N., US patent č. 4 925 664] a toxín z Bacillus thuringiensis CrylVD /BTI/ [Federici, B. A., In Vitro, 28, 50A /1992/]. Medzi príklady takých neuropeptidov alebo hormónov, ktoré môžu byť vhodné pre tento postup sa radí hormón eklosion [Eldridge, R., a ďalší, Insect Biochem., 21,341 - 351 /1992/], protoracikotrópny hormón /ΡΠΉ/, adipokinetický hormón, diuretický hormón a proktolín [Menn, J. J., a Borkovec, A. B., J. Agric. Food Chem., 37, 271 - 278 /1989/]. Príkladom takých enzýmov je juvenilná hormonesteráza /JHE/ [Hammock, B. D., a ďalší, Náture, 344,458 - 461 /1990/].

Napríklad vytvorením rekombinantného baculovírusu, ktorý má defektný alebo deletovaný p74 gén a obsahuje tiež heterológny gén kódujúci toxín vložený na miesto zmeny p74 génu, vznikne vírus so zvýšenou účinnosťou proti cieľovému hmyzu, ale neschopný ľahko sa prenášať z jedného jedinca hmyzu na druhého v životnom prostredí.

Izoluje sa A^CMNPV vírus, ako je opísané v texte v príkladoch 11 a 12, pričom na miesto delécie v Δρ74 vírusu A-4000, pod kontrolou vírusového DA26 promótora, sa vloží gén pre toxín AalT zo škorpióna špecifický pre hmyz. Vzorky takto vytvoreného vírusu, označeného A4001, boli uložené 7. apríla 1993 v Americkej zbierke typov kultúr a dostali ATCC prírastkové číslo VR 2405. Výsledkom pestovania tohto vírusu v bunkách S® divého typu je produkcia orálne neinfekčných PIB /podľa očakávania/. Keď sa tento vírus pestuje v bunkovej línii typu helper S® /28.3/ CL-2 opísané v texte, výsledné PIB sú orálne infekčné a infikovaný hmyz má príznaky kontrakčnej paralýzy, ktorá je charakteristická pre Aal AalT toxín /pozri príklad 12 ďalej v texte/.

Pestovanie tohto vírusu v bunkovej línii alebo transgénnom hmyze, ktoré dodajú produkt funkčného p74 génu, umožní tomuto vírusu infikovať hmyz tráviacou sústavou. Pretože tu nenastane ďalšia komplementácia, prirodzené populácie hmyzu produkujú iba vírus defektný z hľadiska orálnej infekčnosti. Preto v neprítomnosti koinfikujúceho vírusu divého typu životný cyklus rekombinantného vírusu končí po tejto jedinej infekcii. To je rozdiel oproti publikovaným postupom použitia baculovírusu [Tomalski, M. D., a Miller, L. K., Náture, 352, 82 - 85 /1991/], kde po zániku

SK 282444 Β6 napadnutého hmyzu sa do prostredia uvoľnia OB; tieto OB sú strávené iným hmyzom a životný cyklus vírusu sa opakuje, čiže prenes z hostiteľa na hostiteľa sa tu vyskytuje.

Snáď najdôležitejšou vecou v tomto vynáleze je umiestnenie heterológneho génu pre toxín, neuropeptid alebo hormón, alebo enzým priamo na miesto zmeny vírusového genetického základu alebo do jeho blízkosti, čo znamená, že akákoľvek homologická rekombinácia medzi týmto geneticky manipulovaným vírusom divého typu iba obnoví pôvodné rodičovské genotypy.

Napríklad inzerciou génu pre toxín do deletovanej oblasti génu p74 sa vytvorí vírus s fenotypom toxín+/tvorba infekčných OB-. Rekombináciou s vírusom divého typu /s fenotypom toxín-/tvorba infekčných OB+/ sa získa iba potomstvo s fenotypmi toxín+ /tvorba infekčných OB- a toxín-/tvorba infekčných OB+. Rekombinantnému prípadu spôsobenému homológnou rekombináciou, ktorý by viedol k získaniu potomstva s fenotypom toxín+/tvorba infekčných OB+, sa zabráni tým, že delécia a inzercia génov sa odohráva na rovnakom mieste a nie ďaleko od seba na rôznych lokusoch vírusového genómu. Preto sa gén pre toxín nachádza len vo vírusoch, ktoré sú geneticky defektné pre produkciu infekčných OB. Toto zamedzenie šírenia heterológneho génu pre toxín sa zachová a infekčný vírus zmizne z ekosystému rýchlejšie ako vírus divého typu, vzhľadom na jeho zníženú schopnosť vytvárať potomstvo.

Pre lepšie pochopenie tohto vynálezu sú ďalej uvedené nasledujúce príklady. Tieto príklady sú uvedené iba na ilustráciu a nie preto, aby obmedzovali rozsah tohto vynálezu.

Príklady uskutočnenia vynálezu

V príkladoch sa používajú štandardné techniky molekulovej biológie podľa postupov, ktoré opísali Sambrook a ďalší [Sambrook, J., a ďalší, Molekulové klonovanie: laboratórna príručka /Molecular Cloning: A Laboratory Manuál/, 2. vydanie, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. /1989/]. Ďalej sa používajú štandardné techniky pre rast a produkciu baculovírusov podľa postupov, ktoré opísali Summers a Smith [Summers, M. D., a Smith, G. E., Príručka spôsobov prípravy baculovírusových vektorov a kultivácie hmyzových buniek /A Manual of Methods for Baculovirus and Insect Celí Culture Frocedures/, Dept. of Entomology, Texas Agricultural Experiment Station and Texas A & M University, College Station, Texas 77843 - 2475, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 /1987/]. Všetky odkazy na „pomenované“ reštrikčné fragmenty vírusu A^CMNPV vychádzajú z fyzických máp E2 kmeňa vírusu A°MNPV, ktoré publikovali Summers a Smith v uvedenej Príručke spôsobov prípravy baculovírusových vektorov a kultivácie buniek hmyzu.

Príklad 1

Konštrukcia prenosového vektora Δρ74-1 a rekombinantného vírusu A4000

Prenosový vektor Δρ74-1 sa skonštruuje na účely deletovania p74 génu z E2 kmeňa vírusu Autographa californica NPV, ktoré sa deje približne v mieste jednotky 90 na mape vírusového genómu /pozri obr. 1/. Bst EII fragment „E“, ktorý obsahuje DNA kódujúci gén p74, sa vyčistí z E2 kmeňa vírusovej DNA. Tento fragment sa klonuje na Bst EII miesto pSE280 plazmidového vektora /výrobca Invitrogen, San Diego, CA/. Tento kloň sa nazýva LB10.2. Fragment kódujúci 5'oblasi génu p74 a 5'lemujúce sekvencie sa izoluje z klonu LB10.2 štepením enzýmom Nco I. Ďalej sa na tomto Nco I mieste pripraví tupý koniec T4 DNA poly merázou, ten sa štiepi enzýmom Xho I a výsledný fragment sa čistí v géli. Tento fragment, v ktorom miesto Nco I s tupým koncom bolo štiepené Xho I enzýmom, sa klonuje medzi Κρη I miesto s tupým koncom a Xho I miesto plazmidu LB9.6. Plazmid LB9.6 je derivátom „Bluescript „SK“ plazmidu /výrobca Stratagene, La Jolla, CA/, do ktorého sa na Hinc II miesto vloží polylinker. Tento linker obsahuje ďalšie miesta pre jednotlivé reštrikčné enzýmy, ktoré sú užitočné pre inzerciu heterológnych génov do deletovanej oblasti génu p74 /pozri ďalej v texte/. Výsledný plazmid obsahujúci 5’lemujúce sekvencie a 5’sekvencie génu p74, opísané v texte, sa nazýva LB 11.12. Ďalej sa izoluje fragment génu p74 kódujúci 3'tretinu tohto génu a 3'lemujúce sekvencie, ktorý je ohraničený na jednej strane HPa I miestom a na druhej Bam Hl miestom. Tento fragment sa klonuje medzi Eco RV miesto plazmidu LB 11.12. Výsledný kloň je prenosovým vektorom Δρ74-1 /pozri obr. 2/. Tento prenosový vektor kóduje 4750 párov báz /bp/ 5'lemujúcich sekvencii, sekvencie génu p74 od bp 1 do bp 69, 64 bp plazmidového polylinkera, opísaného v texte, sekvencie génu p74 od bp 1237 k terminačnému kodónu na mieste 1937 a 1796 bp 3'lemujúcich sekvencii [Kuzio, J. a ďalší, Virology, 173, 759 - 763 /1989/]. Obr. 3 ukazuje v p74 kódujúcej oblasti podrobnejšie. Tento prenosový vektor sa ďalej použije na konštrukciu A4000 kmeňa uvedeného vírusu štandardnými postupmi kotransfekcie [Webb, N. R., a Summers, M. D., J. Methods Celí & Molec. Biol., 2, 173 - 188 /1990/]. Množstvo 2 x 10⁶ Sf9 buniek sa zaočkuje na misku pre tkanivové kultúry s priemerom 60 mm. Pri prihnutí buniek sa očkovacie médium odstráni z buniek a nahradí sa 0,75 ml média podľa Grace, ktoré obsahuje 10 % fetálneho teľacieho séra /FCS/ s antibiotikami. Do 0,75 ml transfekčného pufra /zloženie: 25 mM HEPES, pH 7,1, 140 mM roztok NaCl, 125 mM roztok CaCl₂/sa pridá 1 pg DNA z vírusu A^CMNPV a 2 pg DNA z vektora Δρ74-1. Tento pufer obsahujúci DNA sa po kvapkách pridá k bunkám a bunky sa 4 hodiny inkubujú pri teplote 27 °C. Po 4 hodinách sa médium odstráni a bunky sa opatrne premyjú čerstvým roztokom TNMFH, obsahujúcim 10 % FCS a antibiotiká. Po 4 až 5 dňoch sa odstránia ECV vírusy a jednotlivé plaky sa izolujú pomocou stanovenia plakov kov, ktoré opísali Summers a Smith [Summers, M. D., a Smith, G. E., Príručka spôsobov prípravy baculovírusových vektorov a kultivácia buniek hmyzu /A Manual of Methods for Baculovirus Vektors and Insect Celí Culture Procedures/, Dept. of Entomology, Texas Agricultural Experiment Station and Texas A & M University, College Station, Texas 77843 - 2475, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555/1987/].

Jednotlivé plaky sa potom použijú na infikovanie jednotlivých jamiek na platni pre tkanivové kultúry obsahujúcej 48 jamiek, pričom do každej jamky sa vopred zaočkuje množstvo 7,5 x 10⁴ Sf9 buniek v 0,5 ml čerstvého TNMFH média. Po 5 dňoch sa z každej jamky buť v rade alebo stĺpci odoberie do zásoby 10 pl supematantu obsahujúceho pučiaci vírus. Začne sa PCR reakcia, pričom sa použijú 4 pl zásobného supematantu a oligoméry A a C ukázané na obr. 3. Pretože oligomér C je špecifický pre deletovaný gén p74, ampliíikuje sa fragment iba v tých reakčných zmesiach, ktoré obsahujú rekombinantný vírus. PCR reakcia sa spustí nasledujúcim spôsobom: 4 pl zásobného supematantu sa najprv štiepia hodinu pri teplote 55 °C nešpecifickou proteázou /s koncentráciou 200 pg/ml/ zo Streptomyces griseus /výrobca Boehringer Mannheim, Indianopolis, IN/ v 25 pl reakčnej zmesi obsahujúcej IX pufer A [so zložením: 10 mM Tris /pH 0,3/, 50 mM roztok KC1, želatínu s koncentráciou 0,1 pg/ml, 0,45 %Nonidet P40 /výrobca Shell Oi

Oil Co./ a 0,45 % Tween 20 /výrobca ICI Americas, Inc./]. Nešpecifická proteáza sa potom inaktivuje zahrievaním počas 12 minút pri teplote 95 °C. PCR amplifikácia spočíva v zmiešaní vírusu ošetreného proteázou, s množstvom 50 pmol každého zo špecifických oligonukleotidových prímerov v 50 μΐ reakčnej zmesi, ktorá obsahuje 200 μΜ štyroch dNTP /dATP, dGTP, dCTP a dTTP/, 1,5 mM MgCl₂, IX pufer A a AmpliTaq DNA polymerázu s koncentráciou 1,25 jednotky [výrobca Perkin-Elmer/Cetus, Norwalk, CT]. Vzorka sa podrobí 230 amplifikačným cyklom, z ktorých sa každý skladá z troch krokov: 1 minúta pri teplote 94 °C /denaturačný krok/, 1,5 minúty pri teplote 55 °C /ochladzovací krok/ a 2,5 minúty pri teplote 72 °C /predlžovací krok/. Po 25 cykloch nasleduje predlžovací krok s dĺžkou 7 minút pri teplote 72 °C. 20 μΐ reakčnej zmesi sa podrobí elektroforéze v agarózovom géli s koncentráciou 1,2 %, aby sa potvrdila prítomnosť rekombinantného vírusu. Pretože vzorky sú organizované podľa radov a stĺpcov, rekombinantný vírus sa identifikuje podľa jamky, ktorá je spoločná pozitívnemu radu i pozitívnemu stĺpcu.

Príklad 2

Demonštrácia fenotypu vírusu A4000 pri skúške na terčíkoch listov s druhom Heliothis virescens

Štandardná skúška na terčíkoch listov sa vykonáva na larvách a Heliothis virescens v štádiu tretieho instaru, aby sa testovala infekčnosť vírusového kmeňa A4000. K lístku bavlníka tvaru terčíka s priemerom 5 mm, ktorý je umiestnený v jamke obsahujúcej vopred navlhčený terčík z filtračného papiera /terčík má asi 4 mm v priemere a je navlhčený 30 μΐ vody/, sa pridá kvapôčka s objemom 1 μΐ obsahujúca vírus /s definovanou dávkou PIB/ v TET pufri /zloženie: 50 mM Tris-HCl, pH 7,5/10 nmM EDTA/0,1 % Triton X-100 [výrobca Rohm and Haas, Philadelphia, PA]. Po vyschnutí kvapky sa do jamky umiestni jedna larva a jamka sa uzavrie. Larvy sa nechajú cez noc živiť. Ďalší deň ráno sa larvy, ktoré skonzumovali celý listový terčík, prenesú do jednotlivých jamiek obsahujúcich potravu pre hmyz. Úmrtnosť lariev sa sleduje pokiaľ sa larvy, ktoré prežili, nezakuklia. Tento postup sa opakuje s vírusovým kmeňom Α°ΜΝΡν divého typu E2 označeným A1000, ktorý sa použije ako kontrola. Ďalej sú uvedené výsledky dvoch oddelených testov:

Vírus	Dávka (PIB)	Počet uhynutých lariev
Test 1
A4000	2,5 x 105	1/31
(Δρ74)	5xl04	0/32
	5xlO3	0/31
	5 x 102	0/32
A1000	5xl02	16/18
(divý typ)	5x10'	14/31
Test 2
A4000	5 x 106	0/20
(Δρ74)	5 x 105	0/21
	5 x 104	0/24
	5xl03	0/20
A1000	5 x 102	22/32
(divý typ)	5x10’	5/32

Tieto výsledky ukazujú, že vírus obsahujúci deléciu v p74 géne nie je infekčný ani v dávkach 10 OOO-krát vyšších než infekčný vírus obsahujúci intaktný p74 gén. Nepredpokladá sa, že úhyn jednej larvy pri použití kmeňa A4000 bol spôsobený normálnym infikovaním.

Príklad 3

Príprava neinfekčnej formy vírusu komplementáciou kmeňa A4000 pri raste v bunkovej línii, obsahujúcej nestabilne integrovanú kópiu Hind III fragmentu „P“ vírusu A'MNPV

Sf9 bunky sa kotransfckujú podľa postupov opísaných v príklade L Pri transfekciách sa použije 1 pg genómovej vírusovej DNA vírusu A4000 a desaťnásobný mólový prebytok plazmidovej DNA z plazmidu ACOO28.3. Plazmid ACOO28.3 sa skladá z Hind III fragmentu „P“ vírusu A'MNPV, vloženého na Hind III miesto plazmidu Bluescript KS II /výrobca Stratagene, La Jolla, CA/. Hind III fragment „P“ je vyznačený v hornej časti obr. 2 ako časť Bst EII fragmentu „E“ vírusu A'MNPV. Tento fragment obsahuje kódujúcu sekvenciu celého génu p74 s množstvom 221 bp 5’lcmujúcich sekvencii a 56 bp 3'lemujúcich sekvencii. Po 48 hodinách sa polyédre získajú z infikovaných buniek odstreľovaním pri nízkej rýchlosti a následným resuspendovaním v TET pufri. K resuspendovanému vírusu sa pridá roztok SDS tak, aby jeho výsledná koncentrácia bola 1 %. Bunková DNA sa naruší strižnými silami pri intenzívnom miešaní a pipetovaní vzorky. Na odstránenie bunkovej DNA sa uskutočňuje rad následných premývaní P1B častíc v TET pufri bez SDS, po ktorých nasleduje odstreďovanie pri nízkej rýchlosti. Nakoniec sa PIB častice resuspendujú v TET pufri a na účel stanovenia sa spočítajú na hemocytometre. Biostanovenie sa uskutoční podľa postupu opísaného v príklade 2. Pri dávke 1 x 10⁵ PIB nespôsobia samotné polyédre zo Sf9 buniek transfekovaných DNA z vírusu A4000 úhyn lariev. Častice PIH zo Sf9 buniek kotransfekovaných DNA z vírusu A4000 a DNA z plazmidu ACOO28.3 spôsobia úhyn lariev vzhľadom na to, že sú infekčné. Rast vírusu v bunkách poskytujúcich funkčný p74 proteín /vzhľadom na prítomnosť ACOO28.3 plazmidu/ teda spôsobí tvorbu X4000 vírusu., ktorý je infekčný pre hmyz. Tento vírus je schopný spôsobiť produktívnu infekciu v larvách. Tento výsledok sa potvrdí zberom častíc PIB z mŕtvych lariev. Častice PIB sa získajú umiestnením mŕtvych lariev do pohárika s odstráneným dnom, ktoré je nahradené Nytexom /výrobná značka firmy Tetko, Briarcliff Manor, N. Y./. Mŕtve larvy sa potom prelejú TET pufrom množstvo 1 ml/ /larva/ a zhromaždia sa tie časti výtoku, ktoré obsahujú PIB častice. Tieto PIB častice sa nesuspendujú v TET pufri obsahujúcom 1 % roztok SDS. Suspenzia sa premieša a odstredí pri nízkej rýchlosti. PIB častice sa ďalej niekoľkokrát premyjú TET pufrom bez SDS. DNA z týchto PIB sa získa postupom opísaným v príklade 6, podľa Summersa a Smitha [Summers, M. D., a Smith, G. E., príručka spôsobov prípravy baculovírusových vektorov a kultivácia buniek hmyzu /A Manual of Methods for Baculovírus Vectors and Insect Celí Culture Procedures/, Dept. of Entomology, Texas Agricultural Experiment Station and Texas A & M University, College Station, Texas 77843 - 2475, Texas Agric cultural Experiment Station Bulletin No. 1555 /1987/]. Prítomnosť Ap74 vírusu v týchto mŕtvych larvách sa potvrdí PCR amplifikáciou, pri ktorej sa použijú oligoméry opísané v príklade L

Príklad 4

Konštrukcia expresných vektorov obsahujúcich heterológny promótor

Použitie heterológnych promótorov na riadenie expresie p74 génu môže zvýšiť účinnosť komplementácie p74 vírusu. Expresné vektory vhodné na toto použitie sa skladajú z nasledujúcich modulov: /1/ heterológny promótorový modul, ktorý sa požíva na reguláciu transkripcie; /2/ polylinkerový modul, ktorý uľahčuje inzerciu DNA sekvencii,

SK 282444 Β6 ktorých expresia sa požaduje, a /3/ modul, obsahujúci 3'UTR oblasť, ktorá poskytuje miesto spracovania primárneho transkriptu a polyadenyláciu /pozri obr. 4/. Taký expresný vektor, ktorý obsahuje DA26 génový promótor vírusu A’MNPV, polylinker a 3'UTR oblasť pre základný proteín 6,9 K z vírusu A’MNPV, sa nazýva pMEVl. Vzorky E. coli kmeňa DH5 nesúceho špecifický pMEVl izolát, označené ACOO64.1, boli uložené 7. apríla 1993 v Americkej zbierke typov kultúr a bolo im pridelené ATCC prírastkové číslo 69 275.

Ďalšie vektory sa môžu ľahko pripraviť náhradou promótora, obsahujúceho Pst I/Xba I fragment pMEVl, fragmentmi štiepenými Pst I/Xba I, ktoré obsahujú oblasť kódujúcu 6,9 K oblasť vírusového promótora vírusu A’MNPV /vektor pMEV2/. Miesto oblasti kódujúcej 6,9 K oblasť promótora vírusu A’MNPV môže byť vo fragmentoch, štiepených Pst I/Xba I, promótorová oblasť kódujúca polyhedrín /vektor pMEV3/ alebo 35 K oblasť vírusového promótora /vektor pMEV4/.

Promótorové fragmenty použité pri konštrukcii týchto vektorov sa vytvoria PCR amplifikáciou klonovanej vírusovej DNA s použitím promótor-špecifických párov oligonukleotidových primérov. Prímery sa vytvoria tak, že amplifikované promótorové segmenty majú nasledujúcu všeobecnú štruktúru obsahujúcu: /1/ heteropolymému syntetickú sekvenciu utvorenú z 22 5'koncových párov báz s rekongičnými miestami pre reštrikčné endonukleázy Sst I, Sse 83871 a Stu I /v tomto poradí/; /2/ segment vírusovej DNA, ktorý začína od pozície umiestnenej 100 - 350 bp proti smeru transkripcie od hlavného štartovacieho miesta transkripcie daného génu a pokračuje k 3'koncu 5'UTR oblasti /t. j. k pozícii -1, označenej vzhľadom na translačný iniciačný kodón/, a /3/ heteropolymému oblasť utvorenú z 23 3'koncových bp s rekogičnými miestami pre reštrikčné endonukleázy Esp 31 a Xba I /v tomto poradí/. Poloha a orientácia Esp I a rekogničného miesta lokalizuje miesta štepenia medzi pozície -5 a -4 v /+/vlákne a medzi pozície -1 a+1 v/-/vlákne.

Templátom použitým na prípravu 35 K promótorov je Hind III fragment „K“ vírusu A’MNPV. Sekvencia primeru /+/vlákna obsahuje heteropolymému sekvenciu s veľkosťou 22 bp s miestami pre reštrikčné enzýmy Sst I, Sse 83871 a Stu I a 35 K sekvenciu 5'konca siahajúcu od pozície -399 do pozície -382. Primér /-/vlákna obsahuje 35 K sekvenciu 5'konca od -21 do -1, nasledovanú heteropolymémou oblasťou s veľkosťou 23 bp s miestami pre reštrikčné enzýmy Esp 31 a Xba I. Pre každú amplifikačnú reakciu sa 50 pmol vhodného páru primérov zmieša s 250 pg templátu DNA v 50 μί reakčnej zmesi obsahujúcej 10 mM Tris-HCl /pH 8,3/, 50 mM KC1, 1,5 mN; MgClj, 200 μΜ báz dNTP, 100 μg/ml želatíny a 2,5 jednotky AmpliTag DNA polymerázy [výrobca Perkin-Elmer/Cetus, Norwalk, CT]. Vzorka sa amplifikuje pri 25 cykloch skladajúcich sa z 3 krokov: 1 min. pri teplote 94 °C /dcnaturačný krok/, 1,5 min. pri teplote 55 °C /ochladzovacl krok/ a 3 min. pri teplote 72 °C /predlžovací krok/. Ako pri iných reakciách k času posledného reakčného kroku sa pridá 7 minút.

Každá reakcia sa ukonči prídavkom EDTA na koncentráciu 10 mM v reakčnej zmesi a Sarkosylu /N-lauroylsarkosin sodný/ na koncentráciu 2 g/1. Produkty sa potom extrahujú raz chloroformom a raz zmesou fenol : : chloroform a vyzrážajú sa etanolom. Vzorky DNA sa znovu rozpustia vo vhodnom pufri a potom sa štepia Pst I /tento enzým rozpoznáva šesť centrálnych párov báz [CTGCA G] miesta pre Sse 83871/ a Xba I. Každý predpokladaný promótorový fragment sa ďalej čistí gélovou elektroforézou v 1,2 % agarózovom géli s nízkou teplotou to penia a liguje sa do Pst I/Xba I vektorového fragmentu s veľkosťou 3,2 kb, pripraveného z pMEVl. Tento fragment obsahuje polylinkerový modul, 3'UTR modul a SK+ základ plazmidu Bluescript z pMEVl. Žiadané rekombinanty sa identifikujú analýzou reštrikčnými enzýmami a určením sekvencie DNA. Odborníci v odbore môžu podľa tohto postupu pripraviť akúkoľvek promótorovú oblasť, ktorej sekvencia je dostupná, ako je napríklad 6,9 promótor vírusu A’MNPV, polyhedrínový promótor alebo bunkové promótory, napríklad hsp 70 promótor z Drosophila melanogaster.

Príklad 5

Príprava heterológnych konštruktov obsahujúcich promótor-p74 kódujúcu oblasť

Proteín kódujúci oblasť génu p74 sa izoluje PCR amplifikáciou vhodnej oblasti ACOO28.3, aby sa mohla vložiť do expresných vektorov obsahujúcich heterológne promótory /ako je opísané v príklade 4/. V PCR reakcii sa použije primér /+/ vlákna s veľkosťou 24 bp, ktorého 5'koniec je na ATG translačnom štartovacom mieste p74 génu. Primér /-/vlákna s veľkosťou 29 bp sa skladá z 20 bp 3'sekvencie génu p74 končiacej TAA translačným stop kodónom, za ktorou je umiestnená ďalšia sekvencia s veľkosťou 9 bp obsahujúcou Bam Hl miesto. Pri PCR reakcii sa 250 pmol ACOO28.3 zmieša s 50 pmol každého zo špecifikovaných oligonukleotidových primérov v 50 μί reakčnej zmesi, obsahujúcej 200 μΜ každého dNTP /dATP, dGTP, dCTP a dTTP/, 1,5 mM MgCl₂, 1 X pufer A a 1,25 jednotky AmpliTaq DNA polymerázy [výrobca Perkin-Elmer/Cetus, Norwalk, CT]. Vzorka sa podrobí 5 cyklom amplifikácie, pričom každý cyklus sa skladá z 1 min. pri teplote 94 °C /denaturačný krok/, 1,5 min. pri 45 /ochladzovací krok/ a 3 min. pri 72 °C /predlžovací krok/. Ďalej 25 amplifikačných cyklov, ktoré sa skladajú z 1 min. pri 94 °C /denaturačný krok/, 1,5 min. pri 55 °C /ochladzovací krok/ a 2,5 min. pri 72 ’C /predlžovací krok/. PCR reakcia sa ukonči zdržaním 7 min. pri 72 °C.

Po čistení sa reakčné produkty ošetria Klenowovým fragmentom DNA polymerázy I [Sambrook, J., a ďalší, Molekulové klonovanie: laboratórna príručka /Molecular Cloning: A Laboratory Manual/, 2. vydanie, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. /1989/] v prítomnosti všetkých štyroch dNTP, aby sa zaistilo, že PCR produkty budú mať tuhé konce. 3'koniec p74 kódujúcej oblasti sa potom štepí Bam Hl a výsledný fragment sa čistí elektroforézou v 1 % agarózovom géli s nízkou teplotou topenia. Tento fragment sa potom klonuje do akéhokoľvek vektora z niekoľkých expresných vektorov opísaných v príklade 4. Pri tvorbe expresných vektorov pre inzerciu p74 génu sa každý vektor štiepi Esp 31 a výsledné prečnievajúce 5'konce sa doplnia pôsobením DNA polymerázy I z E. coli /Klenowov fragment/ v prítomnosti všetkých štyroch dNTP. Každý vektor sa potom štiepi Bam HI. Vektor sa oddelí od uvoľneného polylinkerového fragmentu elektroforézou v 1 % agarózovom géli s nízkou teplotou topenia. Potom sa pri oddelených reakciách tento vektor liguje s fragmentom obsahujúcim p74 gén.

Príklad 6

Izolácia stabilných Sf9 bunkových línii obsahujúcich funkčnú kópiu p74 génu integrovanú do bunkového genómu

V tomto príklade sa izolujú deriváty Sf9 buniek, ktoré obsahujú konštrukty s génom p74, pričom tieto konštrukty sú integrované do bunkového genómu. Postup izolácie opísali Jarvis a ďalší [Jarvis, D. L., a ďalší, Biotechnology, 8,

950 - 955 /1990/]. V tomto príklade sa používa plazmid označený ACOO28.3 /ATCC 68.987/. Tento plazmid obsa10

SK 282444 Β6 huje Hind III fragment „P“ vírusu A^CMNPV, ktorý zahŕňa p74 gén a malé množstvo pôvodných lemujúcich sekvencií. Najprv sa SÍ9 bunky kotransfekujú zmesou 2 pg DNA ACOO28.3 plazmidu a 1 pg DNA plazmidu IE-1 Neo [Jarvis, D. L., a ďalší, Biotechnology, 8, 950 - 955 /1990/]. Po transfekcii sa bunky 2 hodiny inkubujú pri teplote 28 °C. Po premytí buniek kompletným TNMFH médiom [Sambrook, J., a ďalší, Molekulové klonovanie laboratórna príručka /Molecular Cloning: A Laboratory Manual/, 2. vydanie, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. /1989/] sa bunky opäť dajú do živného média a inkubujú sa 22 hodín pri teplote 28 °C. Bunky sa potom naočkujú v nízkej koncentrácii na misky tak, aby vzniknutá kultúra bola riedka a dodá sa kompletné TNMFH médium s 0,5 mg/ml analógu neomycínu G418 /výrobca GIBCO-BRL, Grand Island, N, Y./ /uvedená koncentrácia analógu G418 je uvedená pre aktívnu bázu tejto látky/. Bunky sa potom inkubujú týždeň pri teplote 28 °C. Na konci týždňa sa médium vymení a použije sa kompletné médium bez G418. Nasledujúci postup sa použije pre každú z troch oddelených misiek. Prežívajúce bunky sa pozberajú a pomnožia. Tri pomnožené súpravy buniek sú stabilnými bunkovými líniami, označenými SÍ9/28.3/CL-1, Sf9/28.3/CL-2 /ATCC CRL 11,322/ a SÍ9/28.3/CL-3. Tieto zmiešané populácie sa napestujú a potom sa kontrolujú na prítomnosť p74 génu s použitím PCR reakcie, ako je opísané v príklade L Pri tejto PCR reakcii sa použije oligomér špecifický pre /+/vlákno génu p74 /oligomér A/ a oligomér špecifický pre oblasť chýbajúcu v p74 géne vírusu A4000 /oligomér B/. Oligoméry sú znázornené na obr. 3.

Príklad 7

Produkcia A4000 vírusu infekčného pre hmyz pestovaním v uvedených bunkových líniách a demonštrácia jeho fenotypu

Každá z uvedených troch bunkových línií, izolovaných spôsobom opísaným v príklade 6, sa infikuje pri hodnote MOI väčšej než 1 vírusom A4000. Produkcia vírusu nastáva pri hodnotách MOI v rozmedzí asi od 0,01 do 20. Častice PIB sa získajú z infikovaných buniek spôsobom opísaným v príklade 3. Uskutoční sa štandardná skúška na terčíkoch listov /pozri príklad 2/. Ďalej sú uvedené výsledky troch oddelených testov. Vírus A1000 je E2 kmeň divého typu vírusu A'MNPV:

VÍrus/Bunková línia (Pasáž číslo)	Dávka	(PIB)	Počet uhynutých/ Počet testovaných	1 únrtnosti
Test 1
A4000/SÍ9	1 x	10»	0/16	0
A4000/CL-1(P3)	1 x	10S	7/Xfi	44
A4000/CL-2(P2)	1 x	IC5	9/15	60
M000/CL-3IF3)	1 x	10S	6/16	38
A1000/SÍ9	1 x	103	30/32	94
kontrola	0		O/3O	0

Test ž

A4000/SÍ9	1 X 105	0/15	0
A4OOO/CL-KP3)	3 x 105	1/15	6
A40Q0/CL—2(P2)	1 X 105	4/16	25
A4000/CL-3(P2)	1 X 105	4/16	38
A1000/8Í9	1 x 101	21/28	78
kontrola	0	0/32	0
Test 3
A4000/8f9	1 x 105	0/16	0
A4OOO/CL-1(P7)	1 x xo5	5/16	31
A4000/CL-2(P6)	1 x xo5	5/16	31
A4000/CL-3(P6)	x x xo5	0/16	Q
A40QO/CL-3(F3)	x x xo5	3/15	20
A1000/8Í9	X x xo3	17/31	55
kontrola	0	0/15	0

Z týchto údajov je zrejmé, že keď sa Sf? bunky stabilne transformované plazmidom ACOO28.3 infikujú vírusom A4000, tak výsledné PIB častice sú orálne infekčné. Naopak PIB častice z rodičovských netransformovaných Sí9 buniek infikovaných vírusom A4000 nespôsobujú úhyn lariev. To znamená, že pestovanie vírusu A4000 v bunkách poskytujúcich íúnkčný p74 proteín,/čo je spôsobené stabilnou integráciou konštruktu p74 génom, ako je opísané v príklade 6/ má za následok produkciu vírusu A4000, ktorý je infekčný pre hmyz. Príčina neuskutočnenia komplementácie v pasáži čislo 6 bunkovej línie SÍ9/28.3/CL-3 nie je známa.

DNA sa ďalej pripraví [ako je opísané v príkladoch 3 a 6 podľa Summersa a Smitha /Summers, M. D., a Smith, G. E., Príručka spôsobov prípravy baculovírusových vektorov a kultivácia buniek hmyzu /A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Celí Culture Procedures/, Dept. of Entomology, Texas Agricultural Experiment Station and Texas A & M University, College Station, Texas 77843 - 2475 Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 /1987/] z častíc PIB jednotlivo pozberaných z dvadsiatich lariev, ktoré boli usmrtené komplementovaným vírusom pre teste 1 vyššie v texte. Pre skúšanie prítomnosti Ap74 vírusu sa uskutoční PCR amplifikácia s použitím primérov A a C a pre skúšanie prítomnosti divého typu vírusu s použitím A a B /všetky priméry pozri obr. 3/. Postup pri PCR amplifikácii je opísaný v príklade 1. Výsledky ukazujú, že všetkých dvadsať lariev bolo infikovaných Δρ74 vírusom. Okrem pozitívneho signálu pre Δρ74 vírus má päť z dvadsiatich lariev silný PCR pás špecifický pre prítomnosť intaktného p74 génu. S PIB časticami izolovanými z 18 z dvadsiatich lariev z testu 1 sa vykoná skúška na terčíkoch listov /pozri príklad 2/. Pre každú vzorku sa použije dávka 1 x 10^s PIB/larva a 32 testovacích lariev. Úmrtnosť nad úroveň kontroly majú len častice PIB, izolované zo štyroch skúmaných lariev s pozitívnym signálom na prítomnosť intaktného p74 génu. Častice PIB zo žiadnej zo 14 skúmaných lariev, pri ktorých bol pozitívny test iba na prítomnosť deletovaného p74 génu, nespôsobili úmrtnosť lariev nad úroveň kontroly.

Tieto výsledky by mali byť pravdepodobne spôsobené jednou z dvoch nasledujúcich príčin. Príčinou by mohol byť fakt, že vzorky komplementovaného vírusu sú kontaminované vírusom divého typu a že niektoré larvy z pôvodného testu /testu 1/ nesú vírus divého typu. Keby sa tieto larvy ďalej infikovali Δρ74 vírusom, mohli by byť v PIB prípravkoch z týchto lariev prítomné PIB častice vírusu divého typu, aj PIB častice Δρ74 vírusu. Alternatívnym vysvetlením by mohlo byť, že sa počas pestovania Δρ74 vírusu v komplementujúcej bunkovej línii vyskytne homológna rekombinácia medzi týmto vírusom a p74 sekvenciami, integrovanými do bunkového genómu. Ak sa rekombinácia vyskytne v malej miere, potom len niektoré larvy, ktoré žali

SK 282444 Β6 hynú pôsobením komplementovaného vírusu, by tiež obsahovali vírus divého typu. Tento vírus divého typu by bol v druhom cykle stanovenia orálne infekčný. V prítomných konštruktoch existuje homológia s veľkosťou 284 bp medzi Δρ74 vírusom na 5'konci delécie a sekvenciami génu p74, integrovanými do bunkového génu a homológia s veľkosťou 713 bp na 3'konci delécie. Ak je toto alternatívne vysvetlenie správne, potom sa tomuto výsledku môže zabrániť znížením veľkosti alebo ak je to nutné, vylúčením tejto homológnej sekvencie vyskytujúcej sa medzi vírusom a bunkovou líniou.

Príklad 8

Konštrukcia transgénnyeh druhov hmyzu, ktoré obsahujú funkčnú kópiu p74 génu stabilne integrovanú do genómu hmyzu

V tomto príklade sa na konštrukciu transgénnyeh kmeňov hmyzu použije balistické zavedenie DNA pomocou volfrámových častíc, [Baldarelii, R. M., a Lengyel, J. A., Vucleic Acids Res., 18, 5903 - 5904 /1991/]. Pre jeden z p74 konštruktov, opísaných v príklade 5, sa vyzráža 20 až 100 pg DNA v injekčnom pufri pre embryá /0,1 M fosforečnan sodný, pH 6,8, 5 mM KC1/ na povrchu premytých volfrámových častíc s polomerom 1,2 mm /výrobca Bio-Rad, Richmond, CA/. Celkový objem zrážacej reakčnej zmesi je 65 pl. Po zrážaní sa odstráni 50 pl supematantu. Tesne pred vnesením 8 pl do makroprojektilu sa peleta a 12 až 15 pl supematantu intenzívne premieša. Na bombardovanie embryí Trichoplusia ni s odstránenou vonkajšou blanou, v štádiu vývoja pred vytvorením blastodermu, sa použije balistický systém pre dopravu biočastíc [A Biolistícs bioparticle delivery systém /výrobca DuPont, Wilmington, DE/]. Počas tohto postupu sú embryá zachytené na filtračnom papieri. Embryá sa potom umiestnia pod Šerieš 700 halocarbon oil /výrobca Halocarbon Products Corp., Hackensack, N. J./, dokiaľ sa nevyliahnu. Po vyliahnutí hmyzu, ktorý prežil, sa do schrániek dohromady umiestni vždy skupina 25 týchto jedincov hmyzu. Vajíčka z týchto schránok sa zhromaždia a z embryí sa pripraví DNA spôsobom, ktorý opísal Roberts [Roberts, D. B., ed., Drosophila: praktický prístup /Drosophila: A Practical Approach/, str. 276, IRL Press, Oxford, England /1986/]. Aby sa určila schránka, v ktorej vajíčka obsahujú p74 gén, uskutoční sa reakcia /pozri príklad 1/ s použitím oligomérov A a B, zobrazených na obr. 3. Keď sa identifikujú pozitívne skupiny hmyzu, vajíčka z týchto skupín sa vyživujú a nechajú sa vyvíjať až do dospelosti. Jednotlivé páry dospelých jedincov sa spária a DNA izolovaná z ich vajíčok sa opäť testuje PCR reakciou na prítomnosť p74 génu. Tento proces pokračuje, dokiaľ sa nevytvorí línia mór, ktoré sú pre p74 gén homozygótne.

Príklad 9

Produkcia A4000 vírusu infekčného pre hmyz pestovaním v uvedených transgénnyeh druhoch hmyzu a demonštrácia jeho fenotypu

Najprv sa malému počtu /10 až 20/ transgénnyeh lariev druhu Trichoplusia ni vo štvrtom instarštádiu podá injekčné do hemolymfy 5 pl tkanivového kultivačného média s množstvom 1 x 10⁵ častíc napúčaného vírusu A4000. Po 4 až 5 dňoch, kedy sa zaznamená úhyn väčšiny lariev spôsobený vírusom A4000, sa pozbierajú PIB častice spôsobom opísaným v príklade 3. Tieto PIB častice sa potom použijú na ďalšie pomnoženie. Transgénne larvy Trichoplusia ni v treťom instarštádiu, ktoré obsahujú jeden z p74 konštruktov opísaných v príklade 5, sa na obdĺžnikoch s rozmermi 2,54 x 3,81 cm kŕmia potravou povrchovo kontaminovanou 0,4 μΐ média s koncentráciou 1 x 10⁶ PIB častíc A4000 vírusu v 1 ml. Po 5 až 6 dňoch, kedy sa pri väčšine lariev zaznamená smrť spôsobená vírusom A4000, sa PB častice pozberajú spôsobom opísaným v texte. Vzorka týchto PIB častíc sa uchováva v TET pufri ako zásoba. Biologické účinky vírusu sa ďalej stanovia štandardnou skúškou na tcrčíkoch listov s larvami Trichoplusia ni divého typu v druhom instarštádiu. Výsledky ukazujú, že pestovanie vírusu A4000 v transgénnyeh druhoch hmyzu, obsahujúcich funkčný p74 gén, obnoví infekčnosť vírusu proti hmyzu na približne normálnu úroveň. Ale vírus pozberaný z týchto lariev divého typu, ktoré boli usmrtené týmto komplementovaným vírusom, má zníženú schopnosť infikovať hmyz orálne.

Príklad 10

Inzercia génu kódujúceho toxín do p74-l transferoého vektora a izolácia rekombinantného vírusu A4TxP-I

Fragment DNA, kódujúci toxín z roztoča Pyemotes tritici /TxP-I/ špecifický pre hmyz, sa izoluje z cDNA klonu Tox34 [Tomalski, M. D., a Milier, L. K., Náture, 352, 82 - 85, /1991/] Eco RI fragment, obsahujúci celú proteín-kódujúcu oblasť génu s nejakými nepreloženými oblasťami na 5' a 3'konci, sa klonuje do A^CMNPV pVL 1393 vektora /súprava Invitrogén, San Diego, CA/. Fragment s tupými koncami, siahajúci od Eco RV miesta k Hind III miestu, vytvorený z tohto konštruktu sa vloží do transferového vektora Ap74-1 na Afl II miesto, ktoré je vnútri danej delécie /pozri obr. 2/. Výsledkom spoločnej transfekcie tohto plazmidu označeného LB15.9, s genómovou DNA vírusu A4000 do Sf9 buniek, je rekombinantný vírus, ktorý kóduje TxP-I gén a ktoiý nemôže orálne infikovať larvy. Injekčné pravenie napúčanej formy tohto vírusu do hemolymfy lariev Heliothis virescens vo štvrtom instarštádiu však spôsobí charakteristickú paralýzu, vzniknutú expresiou génu TxP-I. Okrem toho sa pestovaním tohto vírusu spôsobmi opísanými v príkladoch 3, 7, a 9 docieli produkcia A4TxP-I vírusu infekčného pre hmyz. Tento infekčný A4TxP-I vírus môže orálne infikovať larvy a vyvolať paralýzu. Ale vírus vytvorený týmito infikovanými larvami si nezachová svoju infekčnosť pre hmyz.

Príkladll

Konštrukcia expresného vektora obsahujúceho kódonovo optimalizovaný AalT gén

Toxín AalT špecifický pre hmyz sa nachádza v jede severoafrického škorpióna Androctonus australis Hector. Skonštruuje sa transferový vektor pre inzerciu AalT génu do génovej oblasti vírusu A^CMNPV kódujúcej polyhedrín. Tento vektor označený ACOO55.1 obsahuje AalT gén vložený na BamHI miesto plazmidu pVL 985 [Roberts, D. B., ed., Drosophila: praktický prístup /Drosophila: A Practical Approach/, str. 276, IRL Press, Oxford, England /1986/] a pozostáva z kódonovo optimalizovanej nukletidovej sekvencie pre zrelý AalT toxín, spojenej so sekvenciou pre signálny peptid kutikulového génu z Drosophila melanogaster. Vzorky E. coli kmeňa HB101 nesúceho tento transferový vektor ACOO55.1 boli uložené 17. decembra 1982 v Americkej zbierke typov kultúr a dostali ATCC prírastkové číslo 69166.

Pre následné vloženie do expresných vektorov podľa príkladu 4 sa toxín-kódujúci segment tohto transferového vektora získa PCR reakciou. Prímerom /+/vlákna použitým v tejto reakcii je oligonukleotid s veľkosťou 27 báz, ktorého 5'koniec sa zhoduje s ATG iniciačným kodónom pre transláciu AalT génu, ktorý je kodónovo optimalizovaný a

SK 282444 Β6 ktorý sa má amplifikovať /AalT gén je obsiahnutý v AC005.1 vektore/.

Prímer /-/vlákna hybridizuje s miestom, ktoré leží vo vektore ACOO55.1 vzdialené asi 35 až 40 bp od 3'konca AalT génu v smere prepisu. Podmienky pre PCR reakciu sú v zásade opísané v príklade 1. Po purifikácii sa reakčné produkty čistia spôsobom opísaným v príklade 5, s výnimkou toho, že fragment sa čistí elektroforézou v 1,8 % agarózovom géli s nízkou teplotou topenia.

Na prípravu expresných vektorov pre inzerciu toxínového génu sa každý vektor štepí enzýmom Esp 31 a vzniknuté 5'prečnievajúce konce sa doplnia pôsobením DNA polymerázy I /Klenowovho fragmentu/ z E Coli za prítomnosti všetkých štyroch dNTP báz. Každý preparát sa ďalej štiepi BamHI. Vektor sa oddelí od uvoľneného polylinkerového fragmentu elektroforézou v 1 % agarózovom géli s nízkou teplotou topenia a potom sa liguje v oddelených reakciách s génovým fragmentom kódujúcim AalT toxín.

Príklad 12

Izolácia rekombinantného A4001 vírusu kódujúceho AalT toxín

Aby sa pripravila DNA vírusu A4000 pre inzerciu génu, linearizuje sa táto DNA postupným štepením enzýmami Sse 83871 a Bsu 361. V typickom usporiadaní sa 40 pg DNA vírusu A4000 štepí 2 hodiny pri teplote 37 °C enzýmom Sse 8371 v množstve 100 jednotiek [výrobca Takara Biochemical, Inc., Berkeley, CA] v 250 1 reakčnej zmesi, obsahujúcej 10 mM pufer Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 1 mM ditiotreitolu /DTT/, 50 mM NaCl a 0,01 % BSA. Reakčná zmes sa potom upraví 100 mM NaCl a 50 mM pufra Tris-HCl, pH 7,9 a DNA sa štepí 2 hodiny pri teplote 37 °C enzýmom Bsu 361 v množstve 100 jednotiek /výrobca New England Biolabs, Beverly, MA/. Potom sa reakcia ukončí pridaním SDS na výslednú koncentráciu 10 g/1, NaCl na výslednú koncentráciu 0,3 M a EDTA na koncentráciu 10 mM. Ďalej sa DNA chromatograficky čistí v „poly-prep“ kolóne /výrobca BioRad La Laboratories, Pichmond, CA/, obsahujúcej 2 ml Sephacryl-300 /výrobca Pharmacia, Piscataway, N. J./, uvedenej do rovnováhy 10 mM pufrom Tris-HCl /pH 8,0/, 1 mM roztokom EDTA, 0,1 % roztokom SDS a 0,3 M roztokom NaCl. Zachytí sa 12 frakcii s objemom 150 μΐ. 10 μΐ každej frakcie sa analyzuje gélovou elektroforézou, aby sa identifikovali frakcie obsahujúce vírusovú DNA. Tieto frakcie sa spoja, extrahujú sa jednou zmesou fenol : chloroform a vírusová DNA sa potom vyzráža etanolom. DNA sa nesuspenduje v TE pufri /zloženie 10 mM Tris-HCl s pH 8,0,1 mM EDTA/ tak, aby koncentrácia DNA bola 0,2 až 1 mg/ml a suspenzia sa skladuje pri teplote 4 °C. Na stanovenie, či bola vírusová DNA kompletne linearizovaná, sa alikvotná časť DNA štepí Eco RI a analyzuje sa gélovou elektroforézou. Vírusová DNA majúca Eco RI fragment s veľkosťou 7 kb nebola štepená Bsu 361 a Sse 83871 úplne a nepoužije sa.

Expresný vektor obsahujúci AalT gén, opísaný v príklade 11, sa štepí Ssu 361 a Sse 83871. 12 pg fragmentu kódujúceho toxín sa liguje s množstvom 0,5 pg Ssu 361/Sse 87831-linearizovanej a vyčistenej DNA vírusu A'MNPV A4000 v 5 μΐ reakčnej zmesi, obsahujúcej 25 mM Tris-HC1 /pH 7,6/, 5 mM MgCl₂, 1 mM ATP, 1 mM DTT, 50 g/1 polyetylénglykolu-8000 a 0,5 jednotky T4 DNA ligázy /výrobca Gibco-BRL, Gaithersburg, MD/. Po inkubácii prebiehajúcej cez noc pri teplote 16 °C sa celá ligačná zmes použije na transfekciu Sf9 buniek, ako je opísané v príklade

1.

Päť dní po transfekcii sa z transfekovaných SfP buniek odstráni médium. Pripravia sa desaťnásobné sériové zrie denia transfekčného supematantu. Dva alikvotné podiely s objemom 1 ml zo zriedení 10³, 10⁴ a 10‘⁵ sa použijú na infekciu buniek /množstvo 1,5 x 10⁶/ v kultivačnej miske s priemerom 6 cm. Za hodinu po pridaní vírusu sa vírusové inokulum odstráni a bunky sa prelejú médiom obsahujúcim agarózu, ako je opísané v predchádzajúcom príklade. Keď sa plaky úplne vyvinú, použijú sa na inokuláciu jednotlivých jamiek platne so 48 jamkami. Výsledná ďalšia generácia vírusu sa analyzuje PCR reakciou s použitím prímeru A /na obr. 3/ ako prímeru /+/vlákna a kutikulového-AalT prímeru /-/vlákna, opísaného v príklade 11.

Po jednom alebo dvoch ďalších kolách purifikácie plakov sa pripravia PI zásoby [Summers, M. Ď., a Smith, G. E., Príručka spôsobov prípravy baculovírusových vektorov a kultivácia buniek hmyzu /A Manual of Nethods for Baculovírus Vectors and Insect Celí Culture Frocedures/, Dept. of Entomology, Texas Agricultural Experiment Station and Texas A & M University, College Station, Texas 77843 - 2475, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 /1987/]. Rekombinantný vírus obsahujúci AaíT sa označí A4001. Biologická aktivita tohto vírusu sa testuje injekčnou skúškou na stanovenie ECV. ECV forma vírusu sa injekčné upraví do lariev Heliothis virescens, ktoré sú uprostred štvrtého instarštádia. Vírus sa titruje plakovou skúškou /pozri Summers, M. D., a Smith, G.E., Príručka spôsobov prípravy baculovírusových vektorov a kultivácia buniek hmyzu/ a potom sa zriedi na 2 x 10⁷, 2 x 10⁶ a 2 x 10⁵ PFU /plak tvoriacich jednotiek/ na ml v TNM-FH médiu obohatenom 0,5 % /obj./ červene číslo 5. Každá larva sa znecitlivie pôsobením oxidu uhličitého počas 2 až 5 minút a potom sa do nej injekciou vpraví 0,5 μΐ zriedeného vírusu, pričom sa použije Hamiltonova injekčná striekačka vybavená ciachovanou ihlou č. 26. Ihla sa vpichne pozdĺžne medzi posledné dve panôžky a potom sa posunie ventrálne o dva až tri telové články pred vpich. Po injekcii sa každá larva prezrie, či neuniká zafarbená hemolymfa. Ak je podozrenie na stratu vzorky alebo ak je jej strata zrejmá, larva sa odstráni. Larvy sa potom umiestnia do zakrytých stravovacích buniek s plochou 4 cm² /1 larva na bunku/ a nechajú sa pri teplote 27 °C. Raz denne sa larvy vizuálne kontrolujú, aby sa zistila ich morbidita alebo mortalita. Larva sa považuje za hynúcu /pozitívna odpoveď/, ak nie jc schopná sa vrátiť po obrátení na chrbát počas 0,5 až 2 minút do správnej polohy.

Keď sa do lariev H. virescens injekčné vpraví množstvo 6 x 10³ - 1 x 10⁴ PFU vírusu, larvy odpovedajúce na infekciu vírusom A4001 majú kontraktilnú paralýzu a čas potrebný na odpoveď sa zníži, ak sa porovná charakteristická doba na odpoveď po infikovaní vírusom A'MNPV divého typu s rekombinantným vírusom tvoriacim AalT toxín. Konktrétne priemerný čas odpovede na rekombinantný vírus /RT50/je 50 % /s odchýlkou 4 %/ tejto hodnoty pre vírus divého typu v jednej skúške biologickej aktivity. V druhej skúške je RT₅₀ rekombinantného vírusu 52 % /s odchýlkou 5 %/ tejto hodnoty pre vírus divého typu. Tento výsledok ukazuje, že inzercia AalT génu a kutikulovej signálnej sekvencie do vírusu A'MNPV ΖΑ4001/ urýchľuje rýchlosť usmrtenia pomocou expresie biologicky aktívneho toxínu.

Pri štandardnej skúške na terčíkoch listov, opísanej v príklade 2, majú kontraktilnú paralýzu charakteristickú pre

AalT toxín len larvy kŕmené A4001 vírusom, pestovaným v záchrannej bunkovej línii SÍ9/28.3/CL-2. Naopak larvy kŕmené A4001 vírusom v SF9 bunkách divého typu, nemazujú kontraktilnú paralýzu.

SK 282444 Β6

Príklad 13

Konštrukcia transferového vektora UASqal p74 a vírusu A4UAS

V tomto príklade sa na pozíciu -1 bp /proti smeru prepisu/ do p74 kódujúcej oblasti vírusu vloží špecifická kvasinková aktivačná DNA sekvencia UAS_gal, ktorá leží pred regulovaným génom, dohromady s hsp 70 promótorom z Drosophila melanogaster s minimálnou veľkosťou -43 až -1 bp. GAL4 štruktúrny gén sa izoluje z pLA plazmidu [Johnston, S. A., a ďalší, Proc. Natl. Acad. Sci., 83, 6553 - 6557 /1986/] v podobe fragmentu, ohraničeného BamHI a Hind III miestom, s veľkosťou 2,9 kb. Tento GAL4 fragment sa vloží do jedného z vektorov obsahujúcich heterológny promótor tak, ako je opísané v príklade 5. Stabilné Sf9 bunky, ktoré obsahujú funkčné kópie heterológnych promótor-GAL4 konštruktov sa izolujú spôsobom opísaným v príklade 6. Na vytvorenie UAS_GAL-p74 nekombinantného vírusu sa skonštruuje UASqaľp74 transferový vektor. Ako substrát pre PCR reakciu, pri ktorej vznikne fragment s veľkosťou 175 bp, sa použije 17-hsp 70/lacZ konštrukt [Fischer, J. A., a ďalší, Náture, 332, 853 - 856 /1988/]. Vytvorený fragment sa skladá zo štyroch kópií repetície s veľkosťou 29 pb a obsahuje 17mér GAL4 rekogničné miesto s vysokou afinitou spojené s hsp 70 promótorom z Drosophila melanogaster s minimálnou veľkosťou -43 až -1 bp. Po pridaní reštrikčného miesta Srna I na 5'koniec a reštrikčných miest Esp 31 a Nde I na 3'koniec tohto fragmentu sa použijú špecifické prímery. Uvedené reštrikčné miesta sú potrebné pre následné klonovacie kroky. Tento fragment sa vloží do Ap74-1 transferového vektora /pozri obr. 4/ medzi 5'koniec, na ktorom je väčšinou Hind III miesto tupo ukončené a kde I miesto p74 génu. Tento plazmidový kloň sa označí LB 17.8. Fragment s p74 kódujúcou oblasťou sa vytvorí PCR amplifikačnou reakciou, pri ktorej sa použije p74-špecifický prímer pre /+/vlákno, opísaný v príklade 5, a Bluescript, špecifický prímer T3 /výrobca Stratagene, La Jolla, CA/ pre /-/vlákno. Na tento p74 fragment sa pôsobí Klenowovým fragmentom DNA polymerázy I tak, ako už bolo skôr v texte opísané. Po čistení sa fragment štepí enzýmom Bcl I, ktorý pôsobí v blízkosti 3'konca p74 génu. Plazmid LB 17.8 sa pripraví podobne štepením enzýmom Esp 31 a následným vytvorením tupých koncov pôsobením Klenowovho fragmentu. Po čistení sa tento vektor tiež štepí Bcl I. Pripravený vektor a p74 génový fragment sa potom za štandardných podmienok ligujú dohromady. Tento kloň, označený pUAS_GAL-p74, obsahuje kompletný p74 gén riadený hsp promótorom, pričom tento promótor závisí od prítomnosti GAL4 proteínu. Rekombinantný vírus nazvaný A4UAS sa vytvorí spôsobom opísaným v príklade 1. Komplementovaný vírus sa pripraví pestovaním tohto rekombinantného vírusu v bunkových líniách, opísaných v príklade 6. Výsledky štandardného biostanovenia, opísaného v príklade 2, ukazujú, že vírus obsahujúci UAS_GAL-p74 je neinfekčný proti hmyzu, ak je podávaný orálne. Keď sa však tento vírus pestuje v GAL4 komplementačnej bunkovej línii, je pri orálnom podávaní infekčný.

Príklad 14 Izolácia funkčného analógu A^CMNPV p74 génu z genómu granulózneho vírusu

Izolácia génu zodpovedného za orálnu infekčnosť granulózneho vírusu sa vhodne uskutoční využitím techniky „marker rescue“ /Passarelli, A. L., a Miller, L. K., J. Virology, 67, 2149 - 2158 /1993/]. Najprv sa z vírusovej DNA Trichoplusia ni granulózneho vírusu /TnGV/ pripraví čiastočným štepením Sal I fragment Sal I TnGV DNA. Tento fragment sa liguje do kozmidového vektora pVK102 [Knauf, V. C., a Nester, E. W., Plasmid, 8 45 - 54 /1982/], a tým sa vytvorí genómová knižnica prekrývajúcich sa kozmidových klonov. Alikvotná časť jedného z CpGV kozmidových klonov /s hmotnosťou 1 pg/ sa dohromady s 1 pg A^CMNPV A4000 vírusovej DNA transfekuje do buniek spôsobom opísaným v príklade L Po 5 dňoch sa vykoná štandardná plaková skúška. Po úplnom vyvinutí sa jednotlivé plaky použijú na infikovanie jednotlivých jamiek tkanivovej kultivačnej platne so 48 jamkami, ako je opísané v príklade L Vypestovaný vírus z týchto jamiek sa zhromaždí do skupín po dvadsať. Tento vírus sa podáva s potravou larvám Trichoplusia ni v trefom instarštádiu pri stanovení na terčíkoch listov, opísanom v príklade 2. Ak kozmidový kloň obsahuje funkčný analóg génu p74, orálna infekčnosť vírusu A4000 zostane zachovaná. Špecifický gén zodpovedný za zachovanie infekčnosti sa identifikuje opakovaním kotransfekcie a testovacieho postupu s plazmidovými subklonmi pozitívneho kozmidu.

Claims (15)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Hmyzí vírus so zníženou schopnosťou šíriť sa v životnom prostredí z hostiteľa na hostiteľa, ktorý je vytvorený proti hmyzu neinfekčným pozmenením miesta p74 génu kódujúceho 74kDa proteín tohto vírusu, ktorého infekčnosť je obnovená komplementáciou s funkčným génom p74 alebo kódovaným p74 proteínom príslušného vírusu divého typu, pričom hmyzia bunka nesúca tento pozmenený hmyzí vírus je prídavné transfekovaná fragmentom DNA poskytujúcim chýbajúci produkt alebo funkciu pozmeneného miesta p74 génu funkčného vírusu divého typu.
2. 2. Vírus podľa nároku 1 zvolený zo skupiny skladajúcej sa z DNA a RNA vírusov.
3. 3. Vírus podľa nároku 2, zvolený zo súboru DNA vírusov pozostávajúceho z vírusov Eubaculovirinae, Nudibaculovirinae, Entomopoxvirinae, Ichnovirus, Bracovirus, Iridoviridae a Parvoviridae.
4. 4. Vírus podľa nároku 3, z čeľade Eubaculovirinae, vybraný zo skupiny pozostávajúcej z jadrových polyedrických vírusov a granulóznych vírusov.
5. 5. Vírus podľa nároku 1, v ktorom pozmenenie genetického prvku vírusu spočíva buď v odstránení funkcie génu, alebo v interferencii s vírusovou funkciou.
6. 6. Vírus podľa nároku 1, ktorého infekčnosť sa obnoví produkciou vírusu:

   a) v hmyzích bunkách transfekovaných fragmentom DNA, ktorý poskytuje produkt alebo funkciu, ktoré chýbajú alebo sú defektné v pozmenenom víruse;

   b) v bunkových líniách, ktoré obsahujú fragment DNA poskytujúci produkt alebo funkciu, ktoré chýbajú alebo sú defektné v pozmenenom víruse;

   c) v transgénnom hmyze, ktorý obsahuje fragment DNA poskytujúci produkt alebo funkciu, ktoré chýbajú alebo sú defektné v pozmenenom víruse.
7. 7. Vírus podľa nároku 6, v ktorom sa na riadenie expresie daného fragmentu DNA použije heterológny promótor.
8. 8. Vírus podľa nároku 1, ktorý ďalej obsahuje heterológny gén kódujúci látku s potláčajúcimi alebo modifikačnými účinkami na hmyz, pričom tento gén je vložený do vírusového genómu.
9. 9. Vírus podľa nároku 8, v ktorom je látka s potláčajúcimi alebo modifikačnými účinkami na hmyz zvolená zo skupiny pozostávajúcej z toxínov, neuropeptidov, hormónov a enzýmov.

   SK 282444 Β6
10. 10. Vírus podľa nároku 8, kde heterológny gén je vložený

    a) priamo do miesta p74 génu vírusu; alebo

    b) vedľa miesta p74 génu vírusu takým spôsobom, že segregácia heterológneho génu a pozmeneného p74 génu sa vyskytuje pri menej ako 10 % vírusového potomstva.
11. 11. Spôsob výroby hmyzieho vírusu so zníženou schopnosťou šíriť sa v životnom prostredí z hostiteľa na hostiteľa, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa tieto kroky

    a) zbavenie vírusu infekčnosti pre hmyz pozmenením miesta p74 génu vírusu a

    b) obnovenie infekčnosti vírusu komplementáciou takto pozmeneného vírusu s produktom alebo funkciou, ktoré v pozmenenom víruse chýbajú alebo sú defektné, transfekciou hmyzej bunky nesúcej tento pozmenený vírus fragmentom DNA poskytujúcim produkt alebo funkciu, ktoré chýbajú alebo sú defektné v mieste p74 génu divého typu.
12. 12. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa t ý m , že pozmenenie genetického prvku vírusu sa uskutoční odstránením funkcie génu alebo interferenciou s vírusovou funkciou.
13. 13. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa t ý m , že infekčnosť vírusu sa obnoví produkciou vírusu

    a) v hmyzích bunkách transfekovaných fragmentom DNA, ktorý poskytuje produkt alebo funkciu, ktoré chýbajú alebo sú defektné v pozmenenom víruse;

    b) v bunkových líniách, ktoré boli stabilne transformované fragmentom DNA, ktorý poskytuje produkt alebo funkciu, ktoré chýbajú alebo sú defektné v pozmenenom víruse;

    c) v transgénnom hmyze, ktorý obsahuje fragment DNA poskytujúci produkt alebo funkciu, ktoré chýbajú alebo sú defektné v pozmenenom víruse.
14. 14. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa t ý m , že ďalej zahŕňa použitie heterológneho promótora
15. 15. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa t ý m , že ďalej zahŕňa použitie heterológneho génu, ktorý kóduje látku s potláčajúcimi alebo modifikačnými účinkami na hmyz, vloženého do vírusového genómu.