KR100341542B1 - 환경에서숙주대숙주전염에관해능력이감소된재조합곤충비루스및그의생산방법 - Google Patents
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Abstract
기능이 유전자 보충에 의해 회복되어 곤충 감염 형태의 비루스를 다시 생산하는, 변경된 유전요소를 갖는 비감염성 곤충 비루스가 설명된다.
또한 비루스 게놈으로의 이종 유전자 삽입이 설명되어, 개선된 생물 살충 효과 및 원하는 형질의 유전자 안정성을 위해 곤충 조절 또는 수정 물질이 또한 비루스에 의해 생산되도록 한다.
Description
본 발명은, 기능이 유전자 보충(complementation)에 의해 회복되어 곤충 감염 형태의 비루스를 다시 생산하는, 변경된 유전요소(genetic element)를 갖는 비감염성 곤충 비루스에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이종 유전자를 비루스 게놈에삽입하여, 개선된 생물살충 효과 및 원하는 형질의 유전적 안정성을 위해 곤충 제어 또는 변형 물질이 또한 비루스에 의해 생산되게 함에 관한 것이다.
다음 약어는 이 출원 도처에서 사용된다:
A.cal. - 오토그라파 캘리포니카(Autographa californica)
AcMNPV - 오토그라파 캘리포니카 핵 다면성비루스증(polyhedrosis) 비루스
bp - 염기쌍
ECV - 세포외 비루스(extracellular virus)
CV - 과립증 비루스(granulosis virus)
kD - 킬로달톤
MOI - 감염 중복도(multiplicity of infection)
NPV - 핵 다면성비루스증 비루스
OB - 폐색체(occlusion body)
OV - 폐색된 비루스
PCR - 폴리머라제 연쇄 반응
PDV - 다면체 유래 비루스
p. i. - 감염후
PIB - 다면체 봉입체(inclusion body) (또한 OB로서 알려짐)
5' UTR - 유전자 전사 출발 부위로부터 단백질 합성에 관한 개시코돈 앞에 있는 마지막 염기 또는 염기쌍까지 뻗어있는 구역에 해당하는 mRNA 또는 유전자 서열
3' UTR - 단백질 합성에 관한 종결코돈 뒤의 첫 번째 염기 또는 염기쌍으로부터mRNA의 3' 말단에 있는 마지막 유전자를 코딩하는 염기까지 뻗어있는 구역에 해당하는 mRNA 또는 유전자 서열
(+) 가닥 - 그 유전자로부터 유래된 RNA와 동일한 의미를 갖는 유전자 및 이의 측면 서열의 DNA 가닥
(-) 가닥 - (+) 가닥에 상보적인 유전자 및 이의 측면서열의 DNA 가닥.
본 발명은 DNA 및 RNA 비루스를 포함하는 모든 곤충 비루스에 적용된다. DNA 비루스는 엔토모폭스 비루스(entomopox virus; EPV), 및 핵 다면성비루스증 비루스(NPV) 및 과립증 비루스(GV)와 같은 바쿨로비리대(Baculoviridae) 비루스 등을 포함한다. RNA 비루스는 토가비루스(togavirus), 플라비비루스(flavivirus), 피코르나비루스(picornavirus), 세포질 다면성비루스증 비루스(CPV) 등을 포함한다. 이중 가닥 DNA 비루스 유바쿨로비리내(Eubaculovirinae)의 아과(亞科)는 2개의 속, NPV 및 GV를 포함하는데, 이들은 생활사에서 폐색체(OB)를 생산하기 때문에 생물학적 조절에 특히 유용하다.
400개 이상의 바쿨로비루스가 무척추동물에 존재하는 것으로 확인되었다. 오토그라파 캘리포니카 핵 다면성 비루스증 비루스(AcMNPV)는 바쿨로비리대 과의 원형 비루스이고 넓은 숙주범위를 갖는다. AcMNPV 비루스는 흔히 자주개자리 자벌레(alfalfa looper)로 알려진, 인시목 밤나방과(lepidopteran noctuid) (성체 단계에서 밤나방이다), 오토그라파 캘리포니카(A. cal.)로부터 최초로 분리되었다. 이 비루스는 인시목 곤충의 목(目)내 12개의 과 및 30개 이상의 종을 감염시킨다(참고서 목록 기입 1). 이 목 외의 다른 종을 효과적으로 감염하는지 여부는 알려져있지 않다.
생물살충제로서 바쿨로비루스의 사용은 매우 유망하다. 농업에서의 광범위한 사용에 있어서 주요 장애중 하나는 곤충의 초기감염과 그의 죽음간의 시간지연이다. 이 지연은 수일 내지 수주 범위일 수 있다. 이 지연동안, 곤충은 계속하여 먹이를 먹어, 식물에 부가의 피해를 일으킨다. 많은 연구자들은 독소(2, 3, 4), 신경펩티드 및 호르몬(5, 6) 또는 효소(7) 같은 곤충 제어 또는 변형 물질을 발현하도록, 이종 유전자를 비루스 게놈에 삽입함으로써 이 결함을 극복하려고 시도해 왔다.
유전공학은 생물살충제로서 비루스들의 상업화에 대한 기술적 장애를 극복하는 수단을 제공하는 한편, 또한 이들의 광범위한 허용에 대한 잠재적인 이차적 장애가 존재할 수 있다는 인식을 일깨웠다. 구체적으로, 이들 유전자 조작된 비루스들의 환경으로의 방출은 이들 비루스들이 복제되어 유포될 때 생태계에 뜻하지 않은 결과를 초래할 수 있다는 추측이 있다(8, 9). 지금까지 곤충의 생물학적 제어를 위해 생산된 모든 재조합 곤충 비루스들은 전부 곤충 대 곤충으로 전염할 수 있기 때문에 이 추측을 하기 쉬웠을 것이다. 따라서, 환경으로의 방출 후 곤충 대 곤충 (숙주 대 숙주) 전염에 관해 감소된 능력을 갖는 재조합 곤충 특이적 비루스가 요구된다.
AcMNPV에 의해 예시되는 바와 같이, 바쿨로비루스의 생활사는 2단계를 포함한다. 생활사의 각 단계는 특정한 형태의 비루스로 나타난다: 폐색안된 세포외 비루스입자(ECV), 및 폐색된 비루스입자(OV)(10, 11). 세포외 및 폐색된 비루스 형태는 동일한 게놈을 가지나, 서로 다른 생물학적 성질을 보인다. 두 가지 형태의 비루스 각각의 성숙(maturation)은 별개의 비루스 유전자 셋트에 의해 지도되며, 그들중 상당수는 각각의 형태에 독특하다.
천연적으로 존재하는 곤충감염 형태에서, 다수의 비리온은 폐색체(OB)로서 알려진 불완전결정질(paracrystalline) 단백질 매트릭스에 파묻혀 발견되며, 이는 또한 다면체 폐색체(PIB)라고 한다. 단백질 비루스 폐색물들은 다면체들(다면체는 단수용어이다)이라 한다. 분자량 29 kD를 갖는 다면체 단백질은 비루스에 의해 코딩된 주요한 비루스 폐색물의 구조단백질이다(10, 12). (유사하게, GV는 다면체보다는 오히려 과립으로 주로 구성되는 OB를 생산한다).
비루스 폐색물은 천연 바쿨로비루스 생활사의 중요한 부분이며, 감수성 곤충종 간의 수평적 (곤충 대 곤충) 전염을 위한 수단을 제공한다. 환경에서, 감수성 곤충(보통 유충단계에서)은 식물같은 오염된 먹이원으로부터 비루스 폐색물을 섭취한다. 결정질 폐색물은 감수성 곤충의 장에서 분리되어 감염성 비루스 입자를 방출한다. 이들 다면체 유래 비루스(PDV)는 중장(midgut) 조직의 세포에 침입하여 복제된다(10).
비루스 입자는 세포이물흡수(endocytosis) 또는 융합에 의해 세포 내로 들어가며, 비루스 DNA는 핵공 또는 핵에서 외피물이 제거되는 것으로 보인다. 비루스 DNA 복제는 6시간 내에 탐지된다. 감염 후 10-12시간 내에, 이차 감염이 세포외 비루스(ECV)의 세포표면으로부터의 출아에 의해 다른 곤충조직으로 퍼진다. ECV 형태의 비루스는 개개의 감염된 곤충 내에서 비루스의 세포 대 세포 확산, 및 세포 배양에서의 감염 전달의 원인이 된다.
감염주기의 후반기(감염후 12시간)에, 다면체 단백질이 감염세포에서 탐지될 수 있다. 감염 후 18-24시간이 지나면, 다면체 단백질이 감염세포의 핵에서 회합(assembly)되고 비루스입자가 단백질 폐색물에 파묻히게 된다. 비루스 폐색물은 세포가 용해됨에 따라 많은 수로 4-5일 동안 축적한다. 이들 다면체는 유충에서 감염확산에 적극적인 역할을 하지 않는다. 헤모림프에서 ECV가 증식되고 확산되어 유충의 죽음을 초래한다(10, 11, 12).
감염된 유충이 죽을 때, ECV는 붕괴되는 한편, 수백만의 다면체가 부패조직에 잔류한다. 다른 유충이 예컨대, 오염된 식물 또는 다른 먹이재료의 섭취에 의해 다면체에 노출될 때, 주기는 반복된다(10).
요약하면, 폐색 형태의 비루스는 비루스의 환경안정성뿐 아니라 장을 통한 곤충의 초기 감염의 원인이 된다. PDV는 주사로 투여될 때 본질적으로 감염성이 없으나, 경구로는 매우 감염성이 있다. 비폐색형태의 비루스(즉, ECV)는 이차 및 세포 대 세포 감염의 원인이다. ECV는 주사에 의해서 배양 또는 내부의 곤충조직 세포에 관해 매수 감염성이 있으나, 본질적으로 경구투여에 의해서는 감염성이 없다.
곤충에 유독한 외래단백질을 발현하는 재조합 바쿨로비루스의 사용은 이들 비루스가 척추동물 또는 식물에 대해 병원이 아니라는 사실에 의해 촉진된다. 또한, 바쿨로비루스는 일반적으로 좁은 숙주범위를 갖는다. 많은 균주는 하나 또는 몇몇의 곤충종에 제한된다.
가장 널리 연구된 바쿨로비루스는 AcMNPV이다. AcMNPV는 곤충 인시목 내의12개의 과 및 30개 이상의 종을 감염시키는 것으로 알려져 있다(1). 이 목 외의 다른 종을 효과적으로 감염시키는지는 알려지지 않았다. 일반 공공기관 및 여러 관리기관 둘 모두는 외래 DNA 서열을 갖는 AcMNPV 균주 방출의 가능한 결과를 논의해왔다(8, 9). 이것은 조작된 비루스가 비-표적 인시목으로 확산될 수 있다는 가능성에 관한 것이다. 고려할 다른 요인은 이들 비루스의 알려진 환경 안정성이다.
따라서, 곤충으로부터 곤충으로 (숙주 대 숙주) 확산시키는 감소된 능력을 갖는 재조합 곤충 특이적 비루스가 요구된다. 이들 비루스는 곤충을 감염시킬 수 있어야 하나, 곤충으로부터 곤충으로 전염되는 능력을 유의하게 감소시켜 환경에서 비루스의 존속을 제한해야 한다.
본 발명은 곤충으로부터 곤충으로 확산시키는 능력이 감소된 즉, 환경에서 숙주 대 숙주 전염에 관해 능력이 감소된 재조합 곤충 비루스 균주의 구성 및 증식을 제공한다. 바쿨로비리대 과의 비루스는 특히 상기 설명한 2단계 생활사 때문에 상기 균주가 구성되기 쉽다.
이들 비루스 균주는 먼저 비루스가 곤충에 비감염성이 되도록 유전요소를 변경시켜 얻는다. 이 적용을 위하여, 유전요소는 RNA 또는 단백질 분자 같은 트랜스 작용물질을 코딩하는 유전자에 제한되지 않으며, 전사 강화제(enhancer), 프로모터, 다른 전사, 번역 및 게놈 복제 조절요소, 및 비루스 DNA (또는 RNA) 패키징 서열 같은 시스템 작용 요소 또는 조절 서열도 포함한다.
변경은 결실, 프레임 이동, 삽입, 재배열, 일점 돌연변이, 또는 다른 유형의 유전자 기능 붕괴 형태를 취한다. 다른 형태의 변경은 전사 또는 번역 억제, 안티센스 RNA의 사용, 부가의 유전요소 삽입, 및 활성을 위해 GAL 4 단백질의 존재를 필요로 하는 효모 상류 활성화 서열(UASGAL)같은 부가의 조절요소 삽입과 같이, 비루스 기능을 방해하는 방법을 포함한다.
숙주 대 숙주 전염을 유의하게 감소시키면서 재조합 비루스의 감염성을 회복하는 목표는 변경된 비루스에서 빠지거나 결여된 산물 또는 기능을 보충함으로써 얻는다.
유전자 보충에 의해 곤충 감염 형태의 재조합 곤충 비루스를 생산하는 여러가지 방법이 본 발명의 범위 내에 포함된다. 즉,
(1) 변경된 비루스에서 빠지거나 결여된 산물 또는 기능을 제공하는 DNA 단편으로 트랜스펙팅된 곤충 조직 배양 세포에서의 생산;
(2) 변경된 비루스에서 빠지거나 결여된 산물 또는 기능을 제공하는 DNA 단편으로 안정하게 형질전환된 곤충세포계에서의 생산; 및
(3) 변경된 비루스에서 빠지거나 결여된 산물 또는 기능을 제공하는 DNA 단편을 갖는 트랜스제닉(transgenic) 곤충에서의 생산.
제공되는 산물 또는 기능에 따라, DNA 단편의 발현을 조절하기 위해 이종 비루스 또는 세포외 프로모터를 사용하는 것이 필요하거나 바람직할 수 있다. 이것은 투약량 및 시간적 고려사항에 의해 요구될 수 있다.
따라서 방법 (1) 및 (2)의 곤충세포 및 방법(3)의 트랜스제닉 곤충은 비루스의 감염성을 회복하는 "헬퍼"로서 작용하여, 이렇게 생산된 비루스입자(비리온)가자연계에서 곤충에 의해 섭취될 때 감염을 일으키게 한다. 감염된 유충에서 생산된 비리온은 보충되지 않기 때문에 결여되어, 감염은 다른 곤충으로 쉽게 확산되지 않는다. 그러므로, 공-감염 야생형 비루스 부재 하에서, 재조합 비루스의 생활사는 이 일회감염으로 종료된다.
본 발명의 적절한 구체예에서, 곤충 제어 또는 변형물질을 코딩하는 유전자는 비루스 게놈에 삽입된다. 유전자는 비루스 게놈 내의 임의의 적합한 위치에서 변경된 비루스에 삽입된다. 이러한 물질은 독소, 신경펩티드 및 호르몬, 및 효소를 포함한다. 이렇게 발현된 물질은 생물살충 효과를 향상시킨다.
구체적으로, 상기 유전자는 숙주 대 숙주 감염에 관해 감소된 능력의 원인이 되는 유전 요소의 변경 부위 부근에 또는 바로 그 내에 삽입된다. 유전요소의 변경 부위 또는 부근에 이종유전자의 삽입은 야생형 표현형 및 숙주 대 숙주 전염에 관한 곤충 제어 또는 변형 유전자 둘 모두를 갖는 비루스 형태를 생성할 수 있는 유전자 재조합을 막거나 크게 최소화한다.
한 곤충으로부터 다른 곤충으로의 감소된 확산을 갖는 곤충 비루스의 조작은 자연 과정에 의해 얻는 미생물 및 생물 붕괴 속도 이상으로 환경으로부터 감염성 비루스의 증가된 손실 속도를 결과시킨다. 그러므로, 조작된 비루스는 그 자체로 환경에서 정착하지 못할 것이다.
본 발명은 DNA 및 RNA 비루스를 포함하여 모든 곤충 비루스에 적용된다. DNA 비루스는 (과, 다음에 종) 엔토모폭스비리내(Entomopoxvirinae) (초시류의 폭스 비루스), 유바쿨로비리내(Eubaculovirinae) (오토그라파 캘리포니카 MNPV; 헬리오코버어파 제아(Heliocoverpa zea) SNPV), 누디바쿨로비리내(Nudibaculovirinae) (헬리오코버어파 제아 NOB), 이치노비루스(Ichnovirus) (캄폴레티스 소노렌시스)(Campoletis Sonorensis)비루스), 및 브라코비루스(Bracovirus) (코테시아 멜라노셀라(Cotesia melanoscela)비루스) 같은 이중가닥의 외막있는 DNA 비루스, 및 이리도비리대(Iridoviridae) (칠로 이리데슨드 비루스; Chilo iridescent virus) 같은 이중가닥의 외막없는 DNA 비루스 및 파아보비리데(Parvoviridae) (갈레리아 덴소비루스; Galleria densovirus)같은 단일 가닥의 외막없는 DNA 비루스를 포함한다.
RNA 비루스는 토가비리대(Togaviridae) (신드비스비루스;Sindbis virus), 번야비리대(Bunyaviridae) (비트 리프컬 비루스; Beet leafcurl virus) 및 플라비비리대(Flavivirdae) (웨셀브론 비루스; Wesselbron virus) 같은 이중가닥의 외막있는 RNA 비루스, 및 레오비리대(Reoviridae) (코리파아타 비루스; Corriparta virus) 및 비이나비리대(Birnaviridae)(드로소필라 X 비루스; Drosophila X virus) 같은 이중 가닥의 외막없는 RNA 비루스, 및 피코오나비리대(Picornaviridae)(크리켓 마비 비루스), 테트라이리대(Tetraviridae) (누도렐리아 베타 비루스; Nudaurelia beta virus) 및 노다비리대(Nodaviridae) (블랙 비틀 비루스; black beetle virus) 같은 단일가닥의 외막없는 RNA 비루스를 포함한다.
이중 가닥 DNA 비루스 유바쿨로비리내의 아과는 2개의 속, 핵 다면성비루스중 비루스(NPV) 및 과립증 비루스(GV)를 포함하며, 이는 그들의 생활사에서 폐색체를 생산하기 때문에 생물학적 조절에 특히 유용하다. NPV의 예는 리만트리아 디스파아(Lymantria dispar) NPV(질사나방 NPV), 오토그라파 캘리포니카 MNPV, 아니그라파 필시페라(Anagrapha falcifera) NPV (셀러리 자벌레 NPV), 스포돕테라 리투랄리스(Spodoptera litturalis) NPV, 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera Frugiperda) NPV, 헬리오티스 아르미게라(Heliothis armigera) NPV, 마메스트라 브라시캐(Mamestra brassicae) NPV, 코리스토네우라 푸미페라나(Choristoneura fumiferana) NPV, 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni) NPV, 헬리오코버어파 제아(Heliocoverpa zea) NPV, 라치플루시아 오우(Rachiplusia ou) NPV 등을 포함한다. GV의 예는 시디아 포모넬라(Cydia pomonella) GV(코들링 나방 GV), 피에리스 브-라시캐(Pieris brassicae) GV, 트리코플루시아 니 GV, 아토게이아 라패(Artogeia rapae) GV, 플로디아 인터펑텔라(Plodia interpunctella) GV(인디안 밥 나방) 등을 포함한다. 엔토모폭스 비루스의 예는 멜롤론타 멜로노타(Melolontha melonotha) EPV, 암삭타 모오레이(Amsacta moorei) EPV, 로쿠스타 미그라토리아(Locusta migratoria) EPV, 멜라노플러스 산쉬니페스(Melanoplus sanguinipes) EPV, 쉬스토세르카 그레가리아(Schistocerca gregaria) EPV, 아에데스 아에집티(Aedes aegypti) EPV, 키로노무스 루리두스(Chironomus luridus) EPV 등을 포함한다.
곤충, 구체적으로 인시목, 직시류, 쌍시류, 흰개미목, 막시류, 동시류, 반시류 및 초시류목의 방제, 및 농작물, 수목, 관목, 과수 및 관상목의 이들 곤충에 의한 공격으로부터의 보호는 이 출원 발명의 사용에 의해 얻는다.
발명은 오토그라파 캘리포니카 NPV(AcMNPV)에 관해 예시될 것이지만, 여기에서 설명된 개념은 상기 기재된 모든 곤충 비루스에 적용될 수 있음은 물론이다.
본 발명은 문헌에서 아직 확인되지 않고 분류되지 않은 새로운 곤충비루스를 개량하는데 매우 유용할 것임이 부가적으로 숙고된다.
초기에 AcMNPV에 의한 감염은 ECV로 알려진 출아된 형태의 비루스 생산을 결과시킨다. ECV는 개개의 감염 곤충 내에서, 및 세포배양시 증식동안에 비루스의 세포 대 세포 확산의 원인이다. NPV의 경우, 감염주기의 후반기에 세포는 PDV 형태를 생산하기 시작하며, 이는 결정질 폐색체(OB)에 포장되며, 이는 또한 다면체 봉입체(PIB)라 불린다(유사하게, GV는 다면체보다는 오히려 주로 과립으로 구성되는 OB를 생산한다). 이 PDV 형태의 비루스는 장을 통한 곤충의 초기감염, 및 비루스의 환경안정성의 원인이 된다.
비루스(ECV)의 출아형태에 영향을 미치지 않는 본래의 감염성 OB의 생산과 관련된 기능의 변경이 특히 유용하다.
상기 돌연변이는 AcMNPV에서 발견되었다(14). 출아된 비루스가 생산되나 본래의 감염성 다면체는 생산되지 않는 유전자 좌(loci)가 많은 돌연변이유발 실험에 의해 확인되었다. 확인된 가장 흥미있고 가능하게 유용한 좌중 하나는 AcMNPV 게놈의 HindIII 단편 "P"에 포함된 p74 유전자이다(15). p74는 바쿨로비루스 감염의 후반기에 및 비교적 낮은 수준으로 생산되는 단백질이다(15).
p74 유전자에 관한 상동물이 코리스토네우라 푸메이페라나 (Choristoneura fumeiferana) NPV (16) 및 오르기이아 슈도추가타 (Orgyia pseudotsugata) NPV(17)를 포함하는 다른 NPV에서 확인된다. p74에 관한 상동물은 핵 다면성비루스증 비루스 속의 모든 일원에 존재해야 한다. NPV 및 관련된 과립증 비루스 속의 생활사간의 유사성으로 인해 이들 GV는 p74와 유사한 성질을 갖는 유전자를 코딩할 가능성이 높다.
이 p74 유전자 및 부근의 p1O 유전자를 제거하는 대규모의 결실은 유충에게 섭취될 때 감염성이 없는 다면체를 생산하는 비루스를 결과시킨다. p10 유전자만의 결실은 경구 감염성 다면체의 생산을 결과시키므로, p74 유전자의 결실이 이 표현형을 초래하는 것으로 보인다(15).
아래 실시예 1에서 설명되는 바와 같이, 출원인은 이제 야생형 게놈과 재조합될 때 p74 유전자만(△p74)에서의 결실을 야기시키는 운반 벡터(△p74-1 이라 칭함)를 생성했다(제 3 도). 이 운반 벡터 △p74-1 을 포함하는 이. 콜라이(E. Coli) 균주 HB101 시료는 미합중국 메릴랜드주 20852, 록빌시, 파크론 드라이브 12301, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉숀에 1992년 5월 21일자로 출원인에 의해 기탁되었고, ATCC 수탁번호 68,988로 지정되었다. 출원인은 또한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉숀에, A4000 (p74 유전자는 결실에 의해 붕괴되었음)으로 칭하는 AcMNPV 균주 시료를 1992년 5월 21일자로 기탁했고 ATCC 수탁번호 VR2373으로 지정되었다.
출원인은, 아래 실시예 2에서 설명되는 바와 같이, 그것이 유충에게 섭취될때 감염성이 없는 PIB 를 결과하는 p74 유전자를 코딩하는 DNA 단편의 결실임을 확인하였다. 출아된 비루스는 여전히 생산되고 곤충의 헤모코엘(hemocoel)에 주사될 때 감염성이 있다.
DNA 단편의 단순 결실은 비루스의 표적 유전요소의 기능을 파괴하는데 사용되는 유일한 유형의 변경이 아니다. 이 적용을 위하여, 유전요소는 RNA 또는 단백질분자 같은 트랜스 작용 물질을 코딩하는 유전자에 제한되지 않으며, 전사 강화제, 프로모터, 다른 전사, 번역 및 게놈 복제조절요소, 및 비루스 DNA (또는 RNA) 패키징 서열 같은 시스 작용요소 또는 조절서열도 포함한다.
변경은 또한 프레임 시프트, 삽입, 재배열, 일점 돌연변이, 또는 다른 유형의 유전자 기능 붕괴 형태를 취한다. 단백질을 불완전하게 종결시키거나 변경된 비-기능 단백질을 결과시키는 프레임시프트가 포함된다. 유전자의 단백질 코딩 구역으로 종결코돈의 삽입 및 "헬퍼" 세포계에서 적당한 억제 tRNA에 관한 유전자의 배치 또한 발명의 범위 내에 있다.
다른 형태의 변경은 전사 또는 번역의 억제, 안티센스 RNA의 사용, 부가의 유전요소의 비루스 게놈으로의 삽입, 및 필요한 조절요소의 트랜스로의 제공과 같이, 비루스 기능을 방해하는 방법을 포함한다. 이 방법의 일례는 GAL 4 단백질에 의존성인 효모 상류 활성화 서열(UASGAL)의 사용이다.
표적이 되는 비루스 유전자 상류에 GAL 4 반응성 효모 상류의 활성화 서열(UASGAL)의 배치는 비루스 유전자의 전사를 GAL 4 단백질의 존재에 의존하게 한다. "헬퍼" 세포계는 아래에서 설명되는 이종 프로모터중 하나의 조절 하에 있는 GAL 4 유전자에 관한 코딩구역을 포함한다. 효모 교배형 시스템에서의 UAS 요소와 같이 다른 가능한 UAS 요소도 본 발명의 범위 내에 있다. 또한 스테로이드 수용체 및 이의 DNA 결합부위같이, 활성화를 위해 단백질의 결합을 필요로 하는 조절 서열요소도 포함된다.
또한 특정한 단백질의 존재 하에서만 작용하는 프로모터의 사용이 포함된다. 일례는 박테리오파지 T7의 T7 프로모터이고, 이는 전사를 개시하기 위해서 T7 특이적 RNA 폴리머라제를 필요로 한다. p74 유전자 상류에 원래의 프로모터 대신에 T7 프로모터의 배치는 비루스 유전자의 전사가 T7 RNA 폴리머라제의 존재에 의존하게 한다. 이 비루스에 관한 "헬퍼" 세포계는 IE-1 비루스 프로모터 같은 이종 프로모터의 조절 하에 있는 T7 RNA 폴리머라제를 포함한다.
p74 및 이의 기능적 상동물에 부가하여, 변경될 때 재조합 비루스의 봉쇄를 결과시키는 부가의 유전자 기능이 존재한다(예, 14). 본래의 감염성 OB 생산에 필수적인 기능에 관련된 유전자가 특히 유용하다. 예는 ECV의 생산으로부터 OB로의 조절 스위치에 관련된 유전요소, 비루스입자의 직접 회합 또는 성숙에 필요한 기능을 코딩하는 유전자, 및 비루스 입자의 구조단백질을 코딩하는 유전자를 포함한다.
또한 본 발명에 따라 변경되는 유전자의 예는 25K 유전자같이 FP (소수의 다면체) 돌연변이체를 생산하는 유전자(18), 및 후반기 및 매우 후반기의 유전자 기능에 특이적인 비루스 전사인자같이, 붕괴될 때 기능이 원하는 표현형에 이르는 유전자, 다면체 피막 단백질(32-36.5 kD)에 관한 유전자, 중장 수용체를 방해하고 중장세포의 초기감염의 원인이 되는 PDV 단백질에 관한 유전자, PDV 누클레오캡시드의 회합에 원인이 되는 유전자 또는 유전요소, 다면체의 조직화에 원인이 되는 유전자, 및 GV에서 발견되는 비루스 강화인자(19)의 NPV 기능 등가물을 코딩하는 유전자를 포함한다.
다면체 유전자는 또한 변경되기 쉽지만, 그의 사용에 대한 상당한 실제적인 제한이 존재할 수 있다. 비루스 복제가 일어나는 비루스 게놈의 대규모 증대와 결합되어, 다면체 유전자의 전사/번역의 고도의 속도는 감염된 세포에서 염색가능한 총 단백질의 50-75%에 이르는 다면체 단백질 양을 결과한다. 이 대량의 단백질은 제한된 수의 다면체 유전자의 비루스의 복사물(extraviral copy)이 결실된 비루스 다면체 유전자를 보상하는 것이 가능하지 않게 할 수 있다. 그러나, 다면체가 제거된 비루스의 보충은 더 낮은 수준으로 제공되어질 필요가 있는 조절요소 또는 인자의 사용을 통해 성취가능해야 한다. 예는 억제 tRNA를 갖도록 비루스 다면체 유전자를 조작 또는 다면체 유전자의 조절요소의 변경 및 상기 설명한 바와 같은 적당한 "헬퍼" 세포계 또는 곤충주에서 비루스의 증식을 포함한다.
다면체 유전자와 반대로, p74 단백질은 훨씬 낮은 수준으로 요구되는 것으로 나타난다. 비루스 게놈이 크게 증대되었을 때 유전자가 비루스 감염에서 후반기에 전사되지만, p74 특이 mRNA의 수준은 비교적 낮다. 제한된 수의 비루스외 복사물이 경구 감염성에 대한 비루스의 보충에 충분한 p74 기능을 제공할 수 있도록 p74 구조물을 조작하는 것이 가능해야 한다.
발명은 AcMNPV로 예시된다. p74 유전자와의 상동 기능을 수행하는 유전자가 바쿨로비루스의 NPV 및 GV 군에 속하는 모든 비루스에 존재해야 한다. AcMNPV와 밀접하게 관련된 바쿨로비루스 종에서, 감소된 엄격성(stringency) 조건 하에 AcMNPV p74 단편과의 혼성체화에 의해 p74 유전자 상동물을 확인하는 것이 가능하다. 이 방법은 입수가능한 자료가 P74 유전자는 보다 고도로 보존된 바쿨로비루스 유전자중 하나임을 나타내기 때문에 특히 실행가능하다(16). GV 같이 더 멀리 관련된 비루스의 경우에도 이 방법은 사용될 수 있다. 확인된 AcMNPV 유전자와의 상동기능을 코딩하는 유전자를 확인하는 대안 방법은 실시예 14에서 설명된다. 이 실험 셋트에서, 알려진 유전자 결손을 갖는 AcMNPV 균주는 관심사가 되는 비루스 게놈 단편과 함께 공통 트랜스펙팅된다. 결손의 보충은 관심사가 되는 유전자를 확인한다. 이 방법은 AcMNPV 유전자를 억제하는 p35 아폽토시스(apoptosis)와 상동인 기능을 갖는 시디아 포모넬라(cydia pomonella) 과립증 비루스에서 유전자를 확인하는데 성공적으로 사용되었다(20).
부가의 필수적인 후반기 유전자기능을 확인하기 위해 다른 방법을 사용할 수 있다. Passarelli 및 Miller(21)는 최근에 후반기/매우 후반기 유전자에 관한 전사인자를 확인하는 방법을 발표했다. 이 방법에서, AcMNPV 비루스 게놈의 단편은 CAT 유전자의 발현을 작동시키는 후반기 또는 매우 후반기 비루스 프로모터를 사용하는 구조물과 함께 공동 트랜스펙팅된다. 비루스 후반기/매우 후반기 유전자의 정상 전사에 관련된 유전자를 갖는 AcMNPV 게놈 단편은 바탕수준 이상의 CAT 활성 자극에 의해 확인된다.
비루스의 곤충감염 형태는 유전자 보충기술을 통해 변경된 유전자 기능을 공급함으로써 생산된다. 이 변경된 비루스의 곤충감염 형태는 숙주로부터 숙주로 쉽게 전염될 수 있다. 유전자 보충은 트랜스로 존재할 때 돌연변이 표현형을 야생형 표현형으로 전환시키는 유전자의 능력을 말한다.
재조합 곤충비루스의 곤충 감염 형태를 생산하는 여러 가지 방법은 본 발명의 범위내에 포함된다. 즉:
(1) 변경된 비루스에서 빠지거나 결여된 산물 또는 기능을 제공하는 DNA 단편으로 트랜스펙팅된 곤충 조직 배양 세포에서의 생산; (2) 변경된 비루스에서 빠지거나 결여된 산물 또는 기능을 제공하는 DNA 단편으로 안정하게 형질전환된 곤충 세포계에서의 생산; 및 (3) 변경된 비루스에서 빠지거나 결여된 산물 또는 기능을 제공하는 DNA 단편을 갖는 트렌스제닉 곤충에서의 생산. 방법 (1) 또는 (2) 에서 사용되는 세포계는 빠진 기능을 제공하여 "헬퍼" 세포계로서 기여한다.
예컨대, AcMNPV 의 p74 유전자는 상기에서 설명한 바와 같이 결실된다. 야생형 p74 유전자는 다음과 같이 바로 앞에서 설명한 세 가지 방법의 특정한 구체예로 변경된 비루스의 결손을 보충한다: (1) 비루스는 기능성 p74 유전자의 염색체의 복사물을 갖는 곤충세포에서 증식된다. 이들 염색체의 복사물은 DNA 단편, p74 유전자를 갖는 플라스미드, 또는 세포분열동안 또는 비루스 감염에 반응하여 복제할 수 있는 플라스미드일 수 있다. (2) 비루스는 세포 게놈에 안정하게 통합된 하나 이상의 p74 유전자의 기능성 복사물을 갖는 곤충 세포계에서 증식된다. (3) 비루스는 곤충게놈내에 하나 이상의 p74 유전자의 기능성 복사물을 갖는 트랜스제닉 곤충에서 증식된다.
모든 세 방법에서, 기능성 p74 유전자는 그것이 감염성을 회복하는 한 AcMNPV로부터, 또는 유바쿨로비리대과의 임의의 다른 일원으로부터 공급될 수 있다. 주요 개념은 기능성 p74 유전자가 트랜스로 존재하고 야생형 표현형을 재생하는 확산성 물질을 제공한다는 것이다.
보충된 형태의 비루스를 생산하는 한 방법에서, 비루스는 빠진 기능을 제공하는 세포계에서 증식된다. 예컨대, △p74 비루스는 p74 유전자 산물을 발현하는 세포계에서 생산된다. △p74 비루스와 함께 AcMNPV의 Hind III 단편 "p" -- 주로 p74 유전자 + AcMNPV 게놈의 소량의 원래 측면서열 --를 갖는 플라스미드를 공동 트랜스펙팅하여, 감염형태의 비루스 재생을 일시적으로 얻는다. p74 유전자 및 방금 설명한 측면서열을 갖는, ACO028.3으로 칭하는 이 플라스미드를 갖는 이. 콜라이 균주 HB101 시료는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉숀에 1992년 5월 21일자로 출원인에 의해 기탁되었고 ATCC 수탁번호 68,987 이 주어졌다. 이 공동 트랜스펙션 방법에서 세포의 0.1-5.0% 만이 기능성 p74 유전자 및 △p74 비루스 게놈 둘 모두를 갖기 때문에, 이 방법은 본래 비효율적이다.
"헬퍼" 세포계를 생성하는 더 효율적인 방법은 p74 유전자 복사물을 세포에 삽입하여, 유전자가 세포 게놈으로 안정하게 통합되게 하는 것이다(실시예 6 참조). 이 방법을 사용하여 비-바쿨로비루스(non-baculoviral) 유전자를 Sf 9 곤충 세포계에 삽입하였다(22). Sf 9 곤충 세포계(ATCC 수탁번호 CRL 1711)는 스포돕테라 프루기페르다 21(Sf 21)의 유도체이다. 관심사가 되는 유전자 복사물을 갖는 플라스미드를 선택성 표식을 갖는 플라스미드와 함께 공동 트랜스펙팅한다.
선택성 표식은 유전자의 발현이 관심사가 되는 유전자 뿐 아니라 표식 유전자를 갖는 벡터로 형질전환된 세포의 확인을 가능케 하는 유전자이다. 흔히 사용되는 선택성 표시의 예는 티미딘 키나아제(TK) 및 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(HGPRT) 유전자, 및 네오마이신 및 하이그로마이신 같은 항생물질에대해 내성을 주는 유전자를 포함한다.
2 내지 20배 몰 과량의 보충 DNA 대 선택성 표식을 갖는 DNA가 사용된다. 이것은 선택성 표식을 발현하는 세포가 관심사가 되는 유전자를 갖는 가능성을 최대화한다. 선택되는 세포계는 사용되는 비루스를 허용해야 한다. AcMNPV를 갖는 적절한 구체예에서, 세포계는 Sf 9 또는 SF 21이다. 트랜스펙션 후, 세포는 선택하에 증식되고 선택성 표식을 발현하는 세포가 증대된다. 이들 세포계를 p74 비루스에서 p74 결실을 보충하는 능력에 관해 선별한다.
이 방법을 사용하여, 상기에서 설명한 p74를 갖는 플라스미드인 플라스미드 ACO028.3 의 복사물을 갖는 SF 9 세포계를 분리한다. 세포게놈으로 안정하게 통합된 플라스미드 ACO028.3 복사물을 갖는 Sf 9(28.3) CL-2 로 칭하는 세포계 시료는 출원인에 의해 1993년 4월 7일자로 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉숀에 기탁되었고 ATCC 수탁번호 CRL 11,322가 주어졌다. 아래 실시예 7에서 설명되는 바와 같이, 출원인은 상기 세포계에서 결손된 비경구 감염성 △p74 비루스의 증식은 경구 감염성 △p74 비루스의 생산을 결과시킴을 확인하였다.
보충은 세포 배양에서의 비루스 증식에 제한되지 않는다. "헬퍼" 세포계가 생산될 수 있는 바와 같이, "헬퍼" 곤충주 역시 생산될 수 있다. 예컨대, 드로소 필라의 p 요소 형질전환은 이제 일상적인 일이고 유사한 시스템이 임의의 곤충에 관해 고안될 수 있다. 더욱이, 곤충의 무벡터 형질전환이 포유동물에서 사용되는 것과 유사한 기술을 사용하여 달성된다. 금속 필라멘트에 의한 전-포배엽란의 직접 주사(23) 또는 탄도(ballistic) 형질전환(24)을 사용하여 필요한 유전자를 보유하는 곤충을 생성할 수 있다.
비교적 약한 내인성(endogeneous) p74 프로모터는 p74 유전자 산물의 생산에 충분하다. 그러나, p74 유전자의 생산을 작동시키기 위해 더 강하거나 용이한 프로모터를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 이종 프로모터의 사용은 △p74 비루스의 보충효율을 개선할 수 있다. 임의의 수의 비루스 프로모터가 사용에 적합하다. 예는 6.9 K (기본 단백질) 프로모터 DA 26 프로모터, 다면체 프로모터, 35 K 프로모터, 39 K 프로모터, p10 프로모터 및 IE-1 프로모터를 포함한다.
실시예 4 및 5에서 설명되는 것과 같은 이종 프로모터 구조물의 사용은 부가의 유익을 갖는다. 이들 구조물에서, 실시예 1에서 설명되는 A4000 △p74 비루스에서 p74 유전자의 결실을 위해 거의 모든 상동 서열 5'이 제거된다. 이것은 △p74 비루스와 세포 게놈에 통합되는 p74 서열 사이에서 일어나는 임의의 상동 재조합의 기회를 크게 감소시켜야 한다. 이 상동 재조합은 그렇지 않으면 비루스에 P74 기능 및 야생형 표현형의 회복을 결과시킨다(실시예 7의 논의 참조). 상동 재조합의 가능성을 감소시키는 부가의 단계는 △p74 비루스의 p74 유전자에서 결실물 크기를 증가시켜 코딩서열이 잔류하지 않도록 하는 것이다. 이것은 실시예 1의 프로토콜을 변형시킴으로써 쉽게 달성된다.
이종 프로모터는 비루스 프로모터에 제한되지 않는다. 세포 프로모터 또한 적합하다. 세포 프로모터의 무제한적 선택이 있다. 이는 봄빅스 모리(Bombyx mori) 액틴 프로모터 및 드로소필라 멜라노가스터 (Drosophila melanogaster) hsp 70 프로모터를 포함한다. 양호한 프로모터는 비루스 감염동안 적당한 곤충세포에서 중간내지 고도의 수준으로 발현한다. 이들 특성은 곤충 프로모터에 대한 것을 제한하지 않는다. 여러 가지 척추동물, 효모, 또는 다른 부류의 비루스로부터의 프로모터가 이들 기준에 맞을 수 있다. 임의의 상기 언급한 프로모터는 또한 선택성 표식의 발현을 작동시킨다.
본 발명의 부가의 구체예에서, 곤충 제어 또는 변형 물질에 관한 이종유전자는 비루스 게놈에 삽입된다. 물질은, 예컨대 독소, 신경펩티드 또는 호르몬, 또는 효소이다. 구체적으로, 이종 유전자는 비루스 유전요소의 변경 부위에 직접 삽입되고, 이것은 유전자 변경된 비루스와 과잉감염 야생형 비루스간의 재조합이 대부분의 경우에 야생형 기능 및 삽입된 이종 유전자를 갖는 비루스를 생성하지 않을 것을 의미한다. 또한 비루스 유전요소의 변경부위 부근에 이종유전자의 삽입은 본 발명의 범위 내에 있어, 이종유전자 및 변경된 유전 요소의 격리가 비루스 자손의 10% 이하로 일에나게 한다. 그러므로 유전자 조작된 비루스의 봉쇄가 두 경우에 유지된다.
상기 독소는 전갈 안드록토누스 아우스트랄리스 (Androctonus australis)로 부터의 곤충 특이성 독소 AaIT(25), 진드기종 피에모테스 트리티시 (Pyemotes tritici)로부터의 독소 (2), 바실루스 트링겐시스 (Bacillus thuringiensis) 아종. 아이자와이(aizawai) (BTK) 독소 (4), 거미독액으로부터 분리된 독소(26) 및 바실 루스 투링겐시스 Cry IVD (BTI) 독소 (3)를 포함한다. 이 방법에 따를 수 있는 상기 신경펩티드 또는 호르몬의 예는 부화호르몬(6), 향전흉 호르몬(PTTH), 지방운동 호르몬, 이뇨 호르몬 및 프록톨린(5)을 포함한다. 상기 효소의 예는 유충호르몬 에스테라제(JHE)이다(7).
예컨대, 결여 또는 결실된 p74 유전자를 가지며 또한 p74 유전자 변경 부위에 삽입된 독소를 코딩하는 이종유전자를 갖는 재조합 바클루비루스는 표적 곤충에 대해 증가된 효능을 갖는 비루스를 결과시키나, 이는 환경에서 한 곤충으로부터 다른 곤충으로 쉽게 전염될 수 없다.
아래 실시예 11-12에서 설명되는 바와 같이, AcMNPV 비루스가 분리되며, 이때 비루스 DA 26 프로모터의 조절하에 있는 곤충 특이성 전갈독소 AaIT 는 △p74 비루스 A4000 에서 결실부위로 삽입된다. A4001로 칭하는 이 비루스 시료는 출원인의 양수인에 의해 1993년 4월 7일자로 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉숀에 기탁되었고 ATCC 수탁번호 VR 2405가 주어졌다. 야생형 Sf 9 세포에서 이 비루스의 증식은 비경구 감염성 PIB의 생산을 결과한다(예상한 바와 같이). 이 비루스가 상기에서 설명한 헬퍼 세포계 Sf 9 (28.3) CL-2 에서 증식될 때, 결과의 PIB 는 경구 감염성이 있고 감염된 곤충은 AaIT 독소의 수축마비 특성을 나타낸다(아래 실시예 12 참조).
기능성 p74 유전자 산물을 공급하는 세포계 또는 트랜스제닉 곤충에서 이 비루스의 증식은 이 비루스가 장을 통해 곤충을 감염시키게 할 수 있다. 그러나, 부가의 보충이 없기 때문에, 곤충의 자연집단만이 경구 감염성이 결여된 비루스를 생산한다. 따라서, 공동감염 야생형 비루스 부재 하에서 재조합 비루스의 생활사는 이 일회 감염으로 종료된다. 이것은 바쿨로비루스 사용에 관해 발표된 방법(2)과 대조가 되며, 이때 감염된 곤충이 죽은 후, OB 는 환경으로 방출되며, 여기에서 그들은 다른 곤충에 의해 섭취되고 비루스의 생활사가 반복되어 숙주 대 숙주 전염이일어나도록 한다.
아마도 본 발명에서 가장 중요하게는, 비루스 유전요소의 변경부위로 직접 도는 그 부근으로 독소, 신경펩티드 또는 호르몬, 또는 효소에 관한 이종유전자를 대체하는 것은 유전자 조작된 비루스와 야생형 비루스간의 임의의 상동 재조합만이 원래의 양친 유전형을 재생함을 의미한다.
예컨대, p74의 결실구역에 독소유전자의 삽입은 독소 +/감염성 OB- 인 비루스를 생성한다. 야생형(독소-/감염성 OB+) 비루스와의 재조합은 단지 독소+/ 감염성 OB- 및 독소-/감염성 OB+ 자손을 산출할 것이다. 유전자 결실 및 삽입이 비루스 게놈 상의 서로 다른 좌에서 멀리 떨어져 있기보다는 오히려 동일한 위치에서 일어나기 때문에, 독소+/감염성 OB+ 자손을 산출할 동종 재조합으로 인한 재조합 사건은 방지된다. 그러므로, 독소유전자는 감염성 OB의 생산이 유전적으로 결여된 비루스에서만 발견될 것이다. 독소에 관한 이종유전자의 이 봉쇄는 유지될 것이고 감염성 비루스는 자손 비루스를 발생시키는 감소된 능력 때문에 야생형 비루스보다 빠르게 생태계로부터 사라질 것이다.
본 발명이 더 잘 이해될 수 있기 위해서, 다음 실시예가 상술된다. 이 실시예는 설명 목적만을 위한 것이고 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석해서는 안된다.
실시예
표준 분자생물학 기술은 Sambrook 일동에서 설명된 프로토콜(27)에 따라 이용된다. 바쿨로비루스 증식 및 생산에 관한 표준 기술은 Summers 및 Smith에서 설명된 프로토콜(28)에 따라 이용된다. 더욱이, 지정된 AcMNPV 제한단편에 대한 모든 언급은 Summers 및 Smith에서 발표된 AcMNPV의 E2 균주의 물리적 지도(28)를 근거로 한다.
실시예 1
운반벡터 △ p74-1 및 재조합 비루스 A4000의 구성
운반벡터 △ p74-1은 오토그라파 캘리포니카 NPV의 E2 균주로부터 바쿨로비 루스 게놈의 지도단위 약 90개의 p74 유전자를 결실시키기 위해 구성된다(제 1 도 참조). p74를 코딩하는 DNA를 갖는 Bst EII 단편 "E" 를 E2 균주 비루스 DNA로부터 정제한다. 이 단편을 pSE280 플라스미드 벡터(Invitrogen, San Diego, CA)의 Bst EII 부위에 서브클로닝한다. 이 클론은 LB 10.2라 칭한다. p74의 5' 구역 +5' 측면 서열을 코딩하는 단편은 Nco I 으로 절단하고, 이 Nco I 부위를 T4 DNA 폴리머라제로 평활하게 하고, Xho I 으로 절단하고 결과의 단편을 겔정제하여 LB 10.2 로부터 분리한다. 이 평활화된 Nco I 단편 내지 Xho I 단편은 평활화된 Kpn I 부위와 플라스미드 LB 9.6 의 Xho I 부위 사이에 서브클로닝된다. 플라스미드 LB 9.6은 Bluescript SK 플라스미드(Stratagene, La Jolla, CA)의 유도체이고, 여기로 폴리링커가 HincII 부위에서 삽입된다. 링커는 P74 결실구역으로의 이종유전자 삽입에 유용한 부가의 독특한 제한효소 부위를 갖는다(아래 참조). 상기에서 설명한 5' 측면 및 5' p74 서열을 갖는 결과의 플라스미드는 LB 11. 12라 칭한다. 유전자의 세 번째 3' 및 3' 측면서열을 코딩하는 P74의 Hpa I 내지 Bam HI 단편을 분리하고 LB 11. 12의 Eco RV 와 Bam HI 부위 사이에 클로닝한다. 결과의 클론은 운반벡터△p74-1 이다(제 2 도 참조). 이 운반 벡터는 5' 측면서열 4750 염기쌍(bp), bp 1-69 로부터의 p74 서열, 상기에서 설명한 플라스미드 폴리링커의 64bp, bp 1287 내지 1937 에서의 종결코돈의 p74 서열, 및 3'측면서열 1796 bp를 코딩한다 (15). 제 3 도는 p74 코딩구역에서의 결실을 보다 상세히 나타낸다. 그런다음 이 운반벡터를 사용하여 표준 공동트랜스펙션 방법(29)에 의해 비루스 A4000 균주를 구성한다. 2×106sf9 세포를 60 mm 조직배양접시 상에 파종한다. 세포가 부착된 후, 배지를 세포로부터 제거하고 10% 태내송아지혈청 (FCS) + 항생물질을 함유하는 그레이스 배지 0.75ml로 대체한다. AcMNPV DNA 1㎍ + △ p74-1 DNA 2㎍을 트랜스펙션 완충액(25 mM HEPES, pH 7.1, 140 mM NaCl, 125 mM Cacl2) 0.75 ml에 첨가한다. 그런다음 DNA를 세포에 적가하고 세포를 27℃에서 4시간동안 배양한다. 4시간 후, 배지를 제거하고 세포를 신선한 TNMFH + 10% FCS 및 항생물질로 조심스럽게 헹군다. 그런다음 세포에 다시 신선한 TNMFH + 10% FCS 및 항생물질을 다시 공급한다. 4-5일 후, ECV를 수확하고 Summers 및 Smith에 의해 설명된 바와 같은 플라크분석 (28)으로 개개의 플라크(plaque)를 분리한다.
그런다음 개개의 플라크를 사용하여 먼저 신선한 TNMFH 배지 0.5 ml 에서 7.5×104Sf9 세포가 파종된 48웰 조직배양판의 하나의 웰을 감염시킨다. 5일 후, 종 또는 열의 웰로부터 출아된 비루스를 함유하는 상층액 10 ㎕로부터 공동물을 제조한다. 합한 상층액 및 제 3 도에서 나타낸 바와같은 올리고머 A 및 C 4 ㎕를 사용하여 PCR 반응을 일으킨다. 올리고 C는 결실된 p74에 대해 특이성이 있으므로,단편은 재조합 비루스를 갖는 반응에서만 증대될 것이다. PCR 반응은 다음과같이 일어난다: 합한 상층액 4 ㎕를 먼저 1×완충액 A(10 mM Tris (pH 8.3), 50 mM KCl, 0.1 ㎍/ml 젤라틴, 0.45% NonidetTMP4O (Shell Oil Co.), 및 0.45% TweenTM20(ICI Americas, Inc.)를 함유하는 25 ㎕ 반응물에서 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus)로부터의 비특이성 프로테아제 200 ㎍/ml로 55℃에서 1시간동안 소화시킨다. 그런다음 비특이성 프로테아제를 95℃로 12분동안 가열함으로써 불활성화한다. PCR 증폭은 4가지 dNTP (dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP) 200μM, 1.5 mM MgC12, 1×완충액 A 및 1.25 단위 AmpliTagTMDNA 폴리머라제(Perkin-Elmer/Cetus, Norwalk, CT)를 함유하는 50 ㎕ 반응물에서 각각의 상술한 올리고누클레오티드 플라이머 50 pmol과 프로테아제 처리된 비루스를 혼합함으로 구성된다. 시료를 30 주기 증대시키고, 각각은 94℃에서 1분(변성단계), 55℃에서 1.5분 (재회합단계), 및 72℃에서 2.5분 (연장단계)으로 구성된다. 25주기 후에 72℃ 에서 7분 연장단계가 뒤따른다. 반응혼합물 20 ㎕를 1.2% 아가로스겔 상에서 전기이동시켜 재조합 비루스의 존재를 확인한다. 시료를 열 ×종으로 합하므로, 재조합 비루스는 양성 열 및 양성 종 둘다에 공통인 웰에서 확인된다.
실시예 2
헬리오티스 비레센스 상에서 잎 원판 분석으로 A4000 표현형의 입증
표준 잎 원판 분석을 3령의 헬리오티스 비레센스 유충에서 수행하여 A4000 비루스 균주의 감염성을 시험한다. TET 완충액(50 mM Tris-HCl pH 7.5/10 mMEDTA/0.1% TritonTMX-100 (Rohm and Haas, Philadelphia, PA)) 에 비루스 (한정된 투약량의 PIB를 함유)를 함유하는 1 ㎕ 소적을 미리 가습된 여과지 원판 (직경 약 4 mm - 30 ㎕ 물)을 갖는 개개 웰내의 5 mm 면잎 원판에 첨가한다. 소적이 건조된 후, 한 마리의 유충을 웰에 넣고 웰을 밀폐시킨다. 유충이 하룻밤동안 섭취하게 한다. 다음날 아침, 전체의 잎 원판을 소모하는 유충들을 곤충먹이를 가진 개개의 웰로 이동시킨다. 유충을 생존체가 번데기가 될 때까지 사망율에 관해 체크한다. 이 절차를 A 1000 으로 칭하는 야생형 E2 AcMNPV 비루스 균주에서 반복하고, 이는 대조로 사용한다. 두가지 별개의 시험결과는 다음과 같다.
이들 결과는 p74 유전자 결실을 갖는 비루스는 본래의 p74 유전자를 갖는 감염성 비루스보다 10,000 배 이상의 투약량에서도 감염성이 없음을 입증한다. A4000에서 나타난 한마리 유충의 사망은 정상적인 감염경로로 인한 것이 아니라고 생각된다.
실시예 3
AcMNPV 의 Hind III 단편 "P"가 불안정하게 통합된 복사물을 갖는 세포계에서 증식에 의해 비감염 형태의 비루스를 생산하기 위한 A4000 의 보충
Sf 9 세포는 실시예 1에서 설명된 표준 프로토콜에 의해 공동트랜스펙팅된다. 10배몰 초과량의 AC 0028.3 플라스미드 DNA 존재 및 부재 하에 A4000 게놈 비루스 DNA 1 ㎕을 트랜스펙션에서 사용한다. ACO0283은 Bluescript KS II(Stratagene, La Jolla, CA)의 Hind III 부위에 삽입된 AcMNPV 의 Hind III 단편 "P"로 구성된다. Hind III 단편 "P"는 AcMNPV의 Bst EII 단편 "E"의 일부로서 제 2 도의 정상에서 나타낸다. 이 단편은 5' 측면 서열 221 bp 및 3' 측면서열 56 bp을 갖는 전체의 p74 코딩서열을 갖는다. 48시간 후, 저속 원심분리에 의해 감염된 세포로부터 다면체를 수확한다음 TET 완충액에 재현탁한다. SDS 를 재현탁된 비루스에 최종농도 1%로 첨가한다. 세포 DNA를 시료의 격렬한 혼합 및 피펫팅으로 전단한다, SDS 없는 TET 완충액에서 PIB의 다수의 연속세척후 저속 원심분리를 사용하여 세포 DNA를 제거한다. 최종적으로, PIB를 TET 완충액에 재현탁하고 분석을 위해 혈구계측기 상에서 계수한다. 실시예 2에서 설명된 바와 같이 생물학적 정량을 수행한다. 1 ×105PIB의 투약량에서, A4000 DNA 만으로 트랜스펙팅된 Sf9 세포로부터의 다면체는 유충사망을 결과시키지 않는다. A4000 및 AC0028.3 DNA 로 공동 트랜스펙팅된 Sf9 세포로부터의 PIB 는 감염성 비루스로 인해 유충사망을 결과시킨다. 그러므로, 기능성 p74 단백질을 제공하는 (ACO028.3 플라스미드 존재로 인한) 세포에서 A4000 비루스의 증식은 곤충 감염성 A4000 비루스의 생산을 결과시킨다. 이 비루스는 유충에서 생산적 감염을 확립할 수 있다. 이 결과는 죽은 유충으로부터 PIB를 수확함으로써 확인된다. PIB 는 바닥이 제거되고 NytexTM(Tetko, Briarcliff Manor, N.Y. 의 상표명)으로 대체된 컵에 사체를 놓아 수확한다. 그런다음 TET 완충액을 사체위로 세척하고(1ml/유충) 흘러내려가게 하며 PIB를 함유하는 TET 완충액을 수집한다. 이들 PIB 를 TET 완충액 + 1% SDS 에 재현탁하고, 혼합하고 저속으로 회전시킨다. 그런다음 PIB 를 SDS 없는 TET 완충액으로 수회 세척한다. DNA는 Summers 및 Smith (28)의 35 페이지에서 설명된 바와같이 이들 PIB 로부터 제조한다. 실시예 1 에서 설명된 바와같은 올리고머를 사용하는 PCR 증대를 이용하여 이들 죽은 유충에서 △p74 비루스의 존재를 확인한다.
실시예 4
이종 프로모터를 갖는 발현벡터의 구성
p74 유전자의 발현을 작동시키기 위한 이종 프로모터의 사용은 △p74 비루스의 보충효능을 증가시킬 수 있다. 이 용도에 편리한 발현벡터는 다음 모듈로 구성된다. (1) 전사를 조절하는데 사용되는 이종 프로모터 모듈; (2) 발현을 원하는 DNA 서열의 삽입을 용이하게하는 폴리링커모듈; 및 (3) 일차 전사공정 및 폴리아데닐화를 위한 부위를 제공하는 3' UTR (제 4 도 참조). AcMNPV DA26 유전자 프로모터, 폴리링커 및 AcMNPV 6.9k 기본단백질 3' UTR로 구성되는 상기 발현벡터를 pMEV1 이라 칭한다. AC 0064.1 이라 칭하는 특정한 pMEV1 분리물을 갖는 이. 콜라이 DH5 α균주 시료가 출원인의 양수인에 의해 1993년 4월 7일자로 아메리칸 타입 컬쳐콜렉숀에 기탁되었고 ATCC 수학번호 69275가 주어졌다.
부가의 벡터는 AcMNPV 6.9 K (pMEV2), 다면체 (pMEV3) 및 35K (pMEV4) 비루스 유전자 프로모터를 갖는 Pst I/Xba I 소화 단편으로 pMEV1 의 프로모터를 갖는 Pst I/Xba I 단편을 치환하여 쉽게 조제할 수 있다.
이들 벡터를 구성하는데 사용되는 프로모터 단편은 올리고누클레오티드 프라이머의 프로모터 특이쌍을 사용하는 클로닝된 비루스 DNA의 PCR 증대에 의해 형성된다. 프라이머는 증대된 프로모터 부분이 다음의 일반적인 구조를 갖도록 고안된다: (1) 제한 엔도누클레아제 Set I, Sse 8387I 및 Stu I (그 순서로)에 관한 인식 부위를 갖는 5' 말단 22bp 이종 중합 합성서열: (2) 유전자의 우세한 전사 출발 부위 상류의 100-350 bp 지점으로부터 5' UTR의 3' 말단 (즉, 번역개시코돈에 관한 위치 -1) 까지 뻗어있는 비루스 DNA 부분; 및 (3) 제한 엔도누클레아제 Esp 3I 및 Xba I (그 순서로)에 관한 인식부위를 갖는 3' 말단의 23bp 이종 중합 구역. Esp 3I 인식부위의 위치 및 배향은 (+) 가닥에서 위치 -5와 -4 사이에 및 (-) 가닥에서 위치 -1과 +1 사이에 절개부위를 배치한다.
35K 프로모터를 제조하는데 사용되는 주형은 AcMNPV Hind III 단편 "K"이다. (+) 가닥 프라이머의 서열은 제한효소 Sst I, Sse 8387I 및 Stu I 에 관한 부위 및 35K 5' 서열 -399 내지 -382을 갖는 22bp 이종 중합 서열을 갖는다. (-) 가닥 프라이머는 35K 5' 서열 -21 내지 -1 뒤에, 제한효소 Esp 3I 및 Xba I에 관한 부위를 갖는 23bp 이종중합 구역을 갖는다. 각각의 증대반응의 경우, 50 pmol의 적당한 프라이머 쌍이 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 200 μM dNTP, 100 ㎍/ml 젤라틴 및 2.5 유니트 AmpliTagTMDNA 폴리머라제(Perkin-Elmer/Cetus, Norwalk, CT)를 함유하는 50 ㎕ 반응 혼합물에서 주형 DNA 250 pg과 혼합된다. 시료는 94℃ 에서 1분 (변성단계), 55℃ 에서 1.5분 (재회합 단계), 및 72℃ 에서 3.0분 (연장단계)의 25주기를 통해 증대된다. 다른 반응에서처럼, 마지막 연장단계에 7분이 추가된다.
각 반응은 edta 10 Mm 및 사르코실(Sarkosyl; 나트륨 N-라우로일 사르코신) 0.2% (w/v)로 첨가하여 종결시킨다. 그런다음 생산물을 클로로포름으로 1회, 페놀:클로로포름으로 1회 추출하고 에탄올로 침전시킨다. DNA 시료를 적당한 완충액에 재용해시킨 다음 Pst I (Sse 8387I 부위의 중앙의 6 염기쌍 [CTGCA↓G]을 인식한다) 및 Xba I으로 소화시킨다. 그런다음 각각의 추정되는 프로모터 단편을 1.2% 저융점 아가로스겔 상에서 겔 전기이동으로 정제하고 pMEV1 으로부터 제조된 3.2 kb Pst I/Xba I 벡터 단편에 연결한다. 이 단편은 폴리링커 모듈, 3' UTR 모듈 및 pMEV1 의 Bluescript SK+프레임워크를 갖는다. 원하는 재조합체는 제한효소 분석 및 DNA 서열결정으로 확인한다. 당 분야의 업자는 AcMNPV 6.9 K 프로모터, 다면체 프로모터, 또는 드로소필라 멜라노가스터 hsp 70 프로모터 같은 세포 프로모텅 같이, 서열이 입수가능한 임의의 프로머터 구역에 관해 이 절차를 중복할 수 있다.
실시예 5
이종 프로모터 -p74 코딩구역 구조물의 구성
p74의 단백질 코딩구역은 ACO028.3의 적당한 구역을 PCR 증대시킴으로써 이종 프로모터 (실시예 4 에서 설명된 바와같은)를 갖는 발현벡터로의 삽입을 위해 분리하였다. 이 반응에서 사용되는 24 bp (+) 가닥 프라이머는 p74 유전자의 ATG 번역 출발부위에 5' 말단을 갖는다. (-) 가닥 프라이머는 29 bp 길이이고 TAA 번역 정지코돈으로 종료되는 20 bp의 3' p74 서열 뒤에 Bam HI 부위를 포함하는 9 bp의부가서열로 구성된다. PCR에 관한 조건은 각각의 dNTP (dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP) 200 μM, 1.5 mM MgCl2, 1×완충액 A 및 1.25 단위 AmpliTagTMDNA 폴리머라제(Perkin-Elmer/Cetus, Norwalk, CT)를 함유하는 50 ㎕ 반응 혼합물에서 상술한 올리고누클레오티드 각각 50 pmol과 250 pmol의 AC 0028.3을 혼합함으로 구성된다. 시료를 5회 증대시키며, 각각은 94℃ 에서 1분(변성 단계), 45℃ 에성 1.5분 (재회합 단계), 및 72℃ 에서 3분 (연장 단계)으로 구성되고, 이후에 25회 증대시키되, 각각은 94℃ 에서 1분 (변성단계), 55℃에서 1.5분(재회합 단계), 및 72℃에서 2.5분 (연장단계)으로 구성된다. 주기 뒤에 72℃에서 7분 연장이 뒤따른다.
정제 후, 반응생성물을 모든 4가지 dNTP 존재 하에서 DNA 폴리머라제 I의 클레나우 단편(27)으로 처리하여 PCR 생성물이 평활말단을 갖도록 보장한다. 그런다음 p74 코딩 구역의 3' 말단을 Bam HI 으로 소화시키고 결과의 단편을 1% 저융점 아가로스겔 상에서 전기이동으로 정제한다. 그런다음 이 단편을 실시예 4 에서 설명된 임의의 몇몇 발현벡터에 클로닝한다. p74 유전자 삽입을 위한 발현벡터를 조제하기 위해서, 각 벡터를 Esp 3I로 소화시키고, 결과의 5' 돌출말단을 4가지 dNTP 전부의 존재하에서 이. 콜라이 DNA 폴리머라제 I (클레나우 단편)의 작용으로 채운다. 그런다음 각각의 조제물을 Bam HI 으로 소화시킨다. 벡터는 1% 저융점 아가로스겔 상에서의 전기이동에 의해 유리된 폴리링커 단편으로부터 분리시킨 다음 p74 코딩 유자 단편에 개별반응으로 연결한다.
실시예 6
세포 게놈에 통합된 p74 유전자의 기능성 복사물을 갖는 안정한 Sf9 세포계의 분리
이 실시예에서, 세포 게놈에 안정하게 삽입된 p74 유전자를 갖는 구조물을 갖는 Sf9 세포 유도체를 Jarvis 일동(22)에서 설명된 바와 같이 분리한다. 특정하게는, ACO028.3 이라 칭하는 플라스미드 (ATCC 68,987)를 사용한다. 이 플라스미드는 AcMNPV Hind III 단편 "p"를 가지며, 이는 p74 유전자 + 소량의 본래 측면서열을 포함한다. 먼저, Sf9 세포를 2 ㎍의 ACO028.3 플라스미드 DNA와 1 ㎍의 플라스미드 IE-1 Neo DNA(22)의 혼합물로 공동 트랜스펙팅한다. 트랜스펙션 후, 세포를 28℃에서 2시간동안 배양한다. 세포를 완전 TNMFH 배지(27)로 세척한 후, 세포를 다시 공급하고 28℃ 에서 22시간동안 배양한다. 그런다음 세포를 저밀도로 평판배양하여 희박하게 파종된 배양물을 생성하고 완전 TNMFH + 0.5 mg/ml (활성성분 기준으로)의 네오마이신 유사체 G418 (GIBCO-BRL, Grand Island, N. Y.)를 공급한다. 그런다음 세포를 28℃ 에서 1주일 동안 배양한다. 1주일의 끝부분에서, 배지를 G418 없는 완전 TNMFH로 바꾼다. 세개의 별개의 평판 각각에 관해 다음 절차를 사용한다. 살아남은 세포를 수확하고 증대시킨다. 3개의 증대된 세포셋트는 Sf9(28.3) CL-1, SF9(28.3) CL-2, (ATCC CRL 11,322) 및 Sf9(28.3) CL-3 이라 칭하는 안정한 세포계이다. 이 혼합된 집단을 증식시킨 다음, 실시예 1 에서 설명된 바와같이, 제 3 도에서 나타낸 바의 p74의 (+) 가닥에 특이성인 올리고머 (올리고머 A) 및 A4000 비루스에서 p74 유전자가 빠진 구역에 특이성인 올리고머 (올리고머 B)와 함께 PCR을 이용하여 p74 유전자의 존재에 관해 조사한다.
실시예 7
상기 세포계에서의 증식에 의해 곤충 감염성 A4000 비루스의 생산 및 표현형의 입증
실시예 6에서 설명된 바와같이 분리된 세가지 세포계 각각을 A4000 비루스로 1 이상의 MOI로 감염시킨다. 생산은 약 0.01 내지 20 범위의 MOI 로 수행될 수 있다. PIB 을 실시예 3 에서 설명된 바와같이 감염된 세포로부터 수확한다. 표준 잎원판 분석(실시예 2 참조)을 수행한다. 세가지 별개의 시험결과를 아래에서 설명하고, 이때 A1000 비루스는 AcMNPV 의 야생형 E2 균주이다.
이 자료로부터 볼 수 있는 바와 같이, 플라스미드 ACO028.3 으로 안정하게 형질전환된 Sf9 세포를 A4000 비루스로 감염시킬 때, 결과의 PIB는 이제 경구 감염성이 된다. 반대로, A4000 감염된 양친의 형질전환안된 Sf9 세포로부터의 PIB 는 유충사망을 결과시키지 못한다. 이것은 기능성 p74 단백질을 제공하는 (실시예 6에서 설명된 바와 같이 기능성 p74 유전자 구조물의 안정한 통합 때문에) 세포에서 A4000 비루스의 증식은 곤충 감염성 A4000 비루스의 생산을 결과함을 의미한다. Sf9 (28.3) CL-3 세포계의 통과 6 에서 보충의 손실이유는 알려지지 않는다.
다음에 DNA를 상기 시험 1 에서의 보충 비루스로 죽은 20 마리 유충으로부터 개별적으로 수확한 PIB 로부터 조제한다 (실시예 3 및 summers 및 Smith (28)의 35페이지에서 설명된 바와같이). △p74 비루스 존재에 관한 분석을 위해 프라이머 A 및 C, 및 야생형 비루스 존재에 관한 분석을 위해 프라이머 A 및 B (프라이머에 관한 제 3 도 참조)을 사용하는 PCR 증대를 실시예 1 에서 설명된 바와같이 수행한다. 결과는 20 마리 유충 전부가 △p74 비루스로 감염됨을 입증한다. △p74 비루스에 관한 양성신호 뿐 아니라, 20마리중 5 마리 유충은 본래의 p74 유전자 존재에 관해 특이성인 강한 PCR 띠를 나타낸다. 잎원판 분석(실시예 2 참조)은 시험 1로 부터의 20 마리 유충중 18 마리로부터 분리된 PIB를 사용하여 수행한다. 1 ×105PIB/유충의 투약량 및 32마리 시험유충을 각 시료에 관해 사용한다. 본래의 p74 유전자 존재에 관해 양성신호를 갖는 것으로 조사된 4마리 유충만이 바탕값 수준 이상의 사망률을 일으킨다. 결실된 p74 유전자 존재에 관해서 양성으로만 시험된 조사한 14 마리중 어떤 것도 바탕값 수준 이상의 유충 사망률을 일으키지 않는다.
다음에 의해 얽매임이 없이, 이들 결과는 두 가지 원인 중 하나 때문이어야 한다. 더 직접적인 이유는 보충된 비루스시료가 야생형 비루스로 오염되거나 초기의 시험 (시험 1)으로부터의 유충중 몇몇이 야생형 비루스를 가진다는 것일 수 있으며, △p74 비루스로 과잉감염될 때, 야생형 및 △p74 비루스는 이들 유충으로부터의 PIB 조제물에 존재할 수 있다. 대안적인 설명은 보충 세포계에서 △p74 비루스의 증식동안에, 상동 재조합이 비루스와 세포 게놈에 통합된 p74 서열사이에 일어난다는 것일 수 있다. 이것이 낮은 수준으로 일어나면, 보충된 비루스로 인해 죽은 유충중 몇몇만이 야생형 비루스를 가질 것이다. 이 야생형 비루스는 2회의 분석에 경구 감염성일 것이다. 본 구조물에서, △p74 비루스와 결실부의 세포 게놈 5'에 통합된 p74의 서열간에 284 bp의 상동성이 존재하고 713 bp의 상동성이 3'으로의 결실부위에 존재한다. 대안 설명이 옳다면, 이 결과는 비루스와 세포계 사이에 존재하는 상동서열의 양을 감소시키거나, 필요하면, 제거함으로써 피할 수 있다.
실시예 8
곤충게놈에 안정하게 통합된 p74 유전자의 기능성 복사물을 갖는 트랜스제닉 곤충의 구성
이 실시예에서, 텅스텐 입자에 의한 DNA의 탄소 도입을 사용하여 트랜스제닉 곤충 주(24)를 구성한다. 배주사 완충액(0.1 mM 인산나트륨, pH 6.8, 5 mM KCl)내의, 실시예 5에서 설명된 p74 구조물중 하나에 관한 DNA 20-100 ㎍을 1.2 mm 직경의 세척된 텅스텐 입자(Bio-Rad, Richmond, CA) 상에 침전시킨다. 침전 반응물의 총 부피는 6 5㎕ 이다. 침전후, 상충액 50 ㎕를 제거한다. 펠렛 및 상층액 12-15 ㎕ 를 대규모발사물에 8 ㎕를 적용하기 직전에 격렬하게 혼합한다. 탄도 생입자 전달시스템 (DuPont, Wilmington, DE)을 사용하여 포배엽, 형성 전에 탈염소화 트리코플루시아 니 배를 포격한다. 이 절차동안, 배를 여과지 상에 지지시킨다. 그런다음 배는 부화될 때까지 시리즈 700 할로카본 오일(Halocarbon Products Corp., Hackensack, N.J.)하에 배치한다. 살아남은 곤충이 부화될 때, 25 마리 곤충군을 함께 우리에 넣는다. 이들 우리로부터 알을 모으고 Roberts (30)에서 설명된 바와 같이 배로부터 DNA를 조제한다. 제 3 도에서 나타낸 바와같이 올리고머 A 및 B를 사용하여 PCR 반응 (실시예 1 참조)을 수행하여 어떤 우리가 p74 유전자를 갖는 알을 생산하고 있는지를 결정한다. 일단 양성군이 확인되면, 그 군으로부터의 알을 먹이위에 두고 성체로 발육시킨다. 개개 쌍의 성체를 교배하고 그들이 생산하는 알로부터 분리된 DNA를 다시 p74 존재에 관해 PCR로 분석한다. 이 방법을 p74 유전자에 관해 동형접합인 나방계가 확립될 때까지 계속한다.
실시예 9
상기 트랜스제닉 곤충주에서 증식에 의한 곤충 감염성 A4000 비루스의 생산 및 표현형의 입증
처음에, 조직배양 배지내의 1 ×105A4000 출아된 비루스의 5 ㎕ 헤모림프 주사물을 소수(10-20)의 4령 트랜스제닉 트리코플루시아 니 유충에게 제공한다. A4000 비루스로 인한 사망이 대부분의 유충에서 나타난 후 (4-5일), 실시예 3 에서 설명된 바와 같이 PIB를 수확한다. 그런다음 이들 PIB를 추후의 증대를 위해 사용한다. 실시예 5 에서 설명된 p74 구조물중 하나를 갖는 3령 트랜스제닉트리코플루시아 니유충을 0.4 ㎕ 의 1 ×106PIB/ml A4000 비루스로 2.54 ×3.81 cm(1 ×1.5인치) 직사각형의 표면 오염된 먹이를 먹인다. A4000 비루스로 인한 사망이 대부분의 유충에서 나타날 때 (5-6일), 상기에서 설명한 바와같이 PIB를 수확한다. 이들 PIB 시료를 TET 완충액에서 원료로서 보관한 다음 비루스를 야생형 2령 트리코플루시아 니 유충에 관한 표준 잎원판 분석으로 생물학적 정량한다. 결과는 기능성 p74 유전자를 갖는 트랜스제닉 곤충에서 A4000의 증식이 비루스의 곤충 감염성을 약 보통 수준으로 회복함을 입증한다. 그러나, 이 보충된 비루스에 의해 죽은 야생형 유충으로부터 수확된 비루스는 감소된 곤충 경구감염 능력을 갖는다.
실시예 10
△p74-1 운반벡터에 독소 코딩 유전자의 삽입 및 재조합 비루스 A4TxP-I의 분리
피에모테스 트리티시 (Pyemotes tritici; TxP-1)로부터의 곤충 특이성 진드기 독소를 코딩하는 DNA 단편을 cDNA 클론 Tox 34 (2)로부터 분리한다. 유전자의 전체 단백질 코딩구역 + 약간의 5' 및 3' 번역안된 구역을 갖는 Eco RI 단편을 AcMNPV pVL 1393 벡터 (Invitrogen, San Diego, CA)에 클로닝한다. 이 구조물로부터의 Eco RV 내지 Hind III (평활됨) 단편을 AF1 II 부위에서 운반벡터 △p 74-1에 삽입하고, 이는 결실물 내부이다(제 2 도 참조). LB 15.9라 칭하는 이 플라스미드를, 실시예 1에서 설명한 바와같이 Sf9 세포 상에 A4000 비루스 게놈 DNA와 공동 트랜스펙션하여, TxP-I 유전자를 코딩하나, 유충을 경구 감염시킬 수 없는 재조합 비루스를 결과시킨다. 그러나, 출아된 형태의 이 비루스를 4령의 헬리오티스 비레 센스 유충의 헤모림프에 주입하여, TxP-I 발현으로 기인되는 특징적인 마비를 결과시킨다. 또한, 실시예 3, 7 및 9에서 설명된 방법에 의한 이 비루스의 증식은 곤충 감염성 A4TxP-I 비루스의 생산을 결과시킨다. 그러나, 출아된 형태의 이 비루스를4령의 헬리오티스 비레센스 유충의 헤모림프에 주입하여, TxP-I 발현으로 기인되는 특징적인 마비를 결과시킨다. 또한, 실시예 3, 7 및 9에서 설명된 방법에 의한 이 비루스의 증식은 곤충 감염성 A4TxP-I 비루스의 생산을 결과시킨다. 이 감염성 A4TxP-I 비루스는 유충을 경구 감염시키고 마비를 유발할 수 있다. 그러나, 이 감염된 유충에 의해 생산된 비루스는 곤충 감염성을 보유하지 않는다.
실시예 11
AaIT 유전자를 최고로 활용하는 코돈을 갖는 발현벡터의 구성
곤충 특이성 독소, AaIT는 북아프리카 전갈 안드록토누스 오스트랄리스(Androctonus australis) 헥터의 독액에서 발견된다. AcMNPV의 다면체 유전자 구역에 AaIT 유전자의 삽입을 위한 운반벡터가 구성된다. AC 0055.1 이라 칭하는 이 벡터는 pVL 985 (30)의 BamHI 부위에 삽입된 AaIT 유전자를 가지며, 드로소필라 멜라노가스터 표피 유전자의 신호 펩티드에 연결될, 성숙한 AaIT 독소에 관한 누클레오티드 서열을 최고로 활용하는 코돈으로 구성된다. 이 운반 벡터 ACO055.1 을 갖는 이. 콜라이 균주 HB 101 시료는 출원인의 양수인에 의해 1992년 12월 17일자로 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉숀에 기탁되었고 ATCC 수탁 번호 69,166이 주어졌다.
이 운반 벡터의 독소코딩 부분은 PCR에 의해 실시예 4의 발현 벡터로의 이후의 삽입을 위해 회수된다. 반응을 위해 사용된 (+) 가닥 프라이머는 27 염기의 올리고누클레오티드이고, 그의 5' 말단은 증대될 AaIT 유전자 최고활용 코돈(ACO055.1)의 ATG 번역 개시코돈과 일치한다.
(-) 가닥 프라이머는 AaIT 유전자의 3' 말단의 약 35-40 bp 하류에 위치한 ACO055.1의 부위와 혼성체화된다. PCR 반응을 위한 조건은 본질적으로 실시예 1에서 설명된 바와같다. 단편이 1.8% 저융점 아가로스 겔 상에서 전기이동에 의해 정제되는 것을 제외하고는, 정제 후, 반응 생성물을 실시예 5 에서 설명된 바와같이 처리한다.
독소 유전자 삽입을 위한 발현 벡터를 조제하기 위해, 각 벡터를 Esp 3I로 소화시키고, 결과의 5' 돌출 말단은 4가지 dNTP 전부의 존재 하에서 이. 콜라이 DNA 폴리머라제 I (클레나우 단편)의 작용에 의해 채운다. 그런다음 각 조제물을 BamHI 으로 소화시킨다. 벡터를 1% 저융점 아가로스겔 상에서의 전기이동에 의해 유래된 폴리링커 단편으로부터 분리한 다음 AaIT 코딩 유전자 단편에 별개의 반응으로 연결시킨다.
실시예 12
AaIT 독소 코딩 재조합 A4001 비루소의 분리
유전자 삽입을 위한 A 4000 비루스 DNA를 조제하기 위해, Sse 8387I 및 Bsu 36I 에 의한 연속 소화에 의해 DNA를 선형화한다. 대표적인 조제에서 A4000 비루스 DNA 40 ㎍을 37℃ 에서 2시간 동안 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10mM MgCl2, 1mM 디티오트레이톨(DTT), 50 mM NaCl, 및 0.01% BSA를 함유하는 250 ㎕ 반응물에서 Sse 8387I(Takara Biochemical, Inc., Berkeley, CA) 100 유니트로 소화시킨다. 그런 다음 반응 혼합물을 100 mM NaCl 및 50 mM Tris HCl, pH 7.9로 조정하고 DNA를 Bsu36I (New England Biolabs, Beverly, MA) 100 유니트로 37℃ 에서 2시간동안 소화시킨다. 그런다음 반응은 SDS를 최종농도 1%(w/v)로, NaCl을 최종농도 0.3 M 로 및 EDTA 를 10 mM 농도로 첨가하여 종결시킨다. 이후에, DNA를 10 mM Tris-HCl(pH 8.0), 1mM EDTA, 0.1% SDS 및 0.3M NaCl로 평형화된, 2 ml 배드 부피의 Sephacryl-300 (Pharmacia, Piscataway, NJ)을 갖는 "폴리-프레프" 컬럼(BioRad Laboratories, Richmond, CA) 상에서 크로마토그래피한다. 12개의 150 ㎕ 분획을 수집한다, 10 ㎕의 각 분획을 겔 전기 이동으로 분석하여 비루스 DNA를 함유하는 분획을 확인한다. 이들 분획을 모으고, 페놀:클로로포름으로 1회 추출한 다음, 비루스 DNA를 에탄올로 침전시킨다. DNA를 TE (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1mM EDTA)에 0.2-1 mg/㎕ 농도로 재현탁하고 4에서 보관한다. 비루스 DNA가 완전히 선형화 되었는지를 결정하기 위해서 부분표본을 Eco RI 으로 소화시키고 겔 전기이동으로 분석한다. 7kb Eco RI 단편을 나타내는 비루스 DNA는 Bsu 36I 및 Sse 8387I로 완전히 소화되지 않아서 사용되지 않는다.
실시예 11 에서 설명된 AaIT 를 갖는 발현 벡터를 Bsu 36I 및 Sse 8387I 로 소화시킨다. 12 ng 의 독소 코딩 단편을 25 mM Tris-HCl (pH 7.6), 5 mM MgCl2, 1mM ATP, 1mM DTT, 5% (w/v) 폴리에틸렌 글리콜-8000, 및 0.5 유니트의 T4 DNA 연결효소 (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD)를 함유하는 5 ㎕ 반응혼합물에서 0.5 ㎍의 Bsu 36I/Sse 8783I-선형화 및 정제된 AcMNPV A4000 DNA 와 연결시킨다. 16℃ 에서 하룻밤동안 항온처리한 후, 전체의 연결반응은 사용하여, 실시예 1 에서 설명된 바와같이 Sf9 세포를 트랜스펙팅한다.
트랜스펙션 5일 후, 배지를 트랜스펙팅된 Sf9 세포로부터 제거한다. 트랜스펙션 상층액의 10배 계단희석물을 조제하고 10-3, 10-4및 10-5희석물의 2개의 1 ml 부분표본을 사용하여 6 cm 배양접시내의 1.5 ×106세포를 감염시킨다. 비루스 첨가 1시간 후, 비루스 접종물을 제거하고 세포를 상기 실시예에서 설명한 바와같이, 아가로스 함유 배지로 위에 덮는다. 플라크가 충분히 발달되었을 때, 그들을 사용하여 48 웰 평판의 개개 웰에 접종하고 결과의 자손 비루스를 실시예 11 에서 설명된 (+) 가닥 프라이머 및 (-) 가닥 표피-AaIT 프라이머로서 제 3 도의 프라이머 A를 사용하여 PCR 에 의해 분석한다.
1 또는 부가의 2회 플라크 정제 후, P1 원료를 조제한다(28). AaIT를 갖는 재조합 비루스는 A4001 이라 칭한다. 이 비루스의 생물학적 활성은 ECV 에 관해 주사 분석을 수행하여 분석한다. ECV 는 중기 4령 헬리오티스 비레센스 (담배싹벌레) 유충에 주사한다. 비루스를 플라크 분석방법(28)으로 적정한 다음, 0.5% (v/v)적색 염료 번호 5로 보충한 TNM-FH 배지에서 2×107, 2×106및 2×105PFU/ml로 희석한다. 각각의 유충을 이산화탄소로 2-5분 동안 마취시킨 다음 26 게이지의 바늘이 장치된 Hamilton 주사기를 사용하여 0.5 ㎕ 의 희석된 비루스를 주사한다. 바늘을 마지막 두개의 전각 사이에 세로로 삽입한 다음 주사 전에 2 내지 3개의 몸체 부분을 앞으로 이동시킨다. 주사 후, 각각의 유충을 염료로 염색된 헤모림프 방출에 관해 점검하고 시료 손실이 명백하거나 의심되면 폐기한다. 그런다음 유충을 뚜껑덮인 4㎠ 먹이 세포 (세포당 1마리 유충)에서 27℃로 보관하고 병적상태 또는 사망율의 증거에 관해 매일 한번씩 시각적으로 점검한다. 개체가 뒤집힌 후 0.5-2 분 내에 자세를 바로할 수 없으면 다 죽어가는 것(양성 반응)으로 계수한다.
에취. 비레센스 유충에 6 ×103- 1 ×104PFU 의 비루스를 주사할 때, A4001 비루스 감염에 반응하는 유충은 AaIT 생산 재조합 비루스의 야생형 AcMNPV 특성에 비교되는 수축성 마비 및 감소된 반응시간을 보인다. 특정하게, 재조합 비루스는 첫번째 생물학적 정량에서 야생형 비루스에 관한 값의 50% (+/- 4%)의 평균 반응시간(RT50) 및 두번째 생물학적 정량에서 야생형 비루스에 관한 값의 52% (+/- 5%)의 RT50을 갖는다. 이 결과는 AaIT 유전자 및 표피 신호서열의 AcMNPV(A4001)로의 삽입이 생물학적으로 활성이 있는 독소의 발현을 통해 치사 속도를 가속화함을 나타낸다.
실시예 2에서 설명한 바와 같은 표준 잎원판 분석에서, 구출 세포계 Sf9 (28.3) CL-2 에서 증식한 A4001 비루스가 공급된 유충만이 AaIT 독소의 수축성 마비특성을 보인다. 반대로, 야생형 Sf9 세포에서 증식한 A4001 비루스가 공급된 유충은 수축성 마비를 보이지 않는다.
실시예 13
운반벡터 UAS
GAL
- p74 및 비루스 A4UAS 의 구성
이 실시예에서, 특정한 효모 상류의 활성화 DNA 서열, UASGAL, 더하기 최소의드로소필라 멜라노가스터 hsp 70 프로모터 (-43 내지 -1 bp)를 비루스에서 p74 코딩구역 상류의 -1 bp 에서 삽입한다. GAL4 구조유전자를 2.9kb Bam HI 내지 Hind III 단편으로서 pLA 플라스미드(32)로부터 분리한다. 이 GAL4 단편을 실시예 5 에서 설명된 바와 같이 이종 프로모터를 갖는 벡터 중 하나에 삽입한다. 이종 프로모터-GAL4 구조물의 기능성 복사물을 갖는 안정한 Sf9 세포를 실시예 6 에서 설명된 바와 같이 분리한다. UASGAL- p74 재조합 비루스를 생성하기 위해, UASGAL- p74 운반 벡터를 구성한다. 17 hsp 70/lac Z 구조물(33)을 PCR을 위한 기질로서 사용하여 175 bp 단편을 생성한다. 이 단편은 최소의 드로소필라 멜라노가스터 hsp 70 프로모터(-43 내지 -1 bp)에 융합된 높은 친화성의 17 량체 GAL4 인식 부위를 갖는 29bp 반응물의 4개 복사물로 구성된다. 이 단편의 5' (Sma I) 및 3' (Esp 3I 및 Nde I) 말단으로의 후속 클로닝 단계에 필요한 제한 부위를 첨가한 특정한 프라이머가 사용된다. 이 단편을 평활화된 5' 최고의 Hind III 와 p74 유전자의 Nde I 부위 사이의 △p74-1 운반 벡터(제 4 도 참조)에 삽입한다. 이 플라스미드 클론은 LB17.8 이라 칭한다. p74 코딩구역 단편은 실시예 5 에서 설명된 바와 같이 (+) 가닥 p 74 특이성 프라이머 및 (-) 가닥을 프라이밍하는 Bluescript 특이성 프라이머 T3 (Stratagene, La Jolla, CA)을 사용하여 PCR 증대에 의해 생성한다. 이 p74 단편을 전술한 바와 같이 DNA 플리머라제 I 의 클레나우 단편으로 처리한다. 단편을 정제한 후, p74 유전자의 3' 말단 부근을 절단하는 Bcl I 으로 소화시킨다. LB 17.8 을 Esp 3I으로 소화시킨 다음 이 말단을 클레나우로 평활화하여 유사하게 조제한다. 벡터를 정제한 후, Bcl I으로 또한 소화시킨다. 그런다음 조제된 벡터 및 p74 유전자 단편을 표준조건 하에서 서로 연결시킨다. 이 클론을 pUASGAL-p74라 칭하고 hsp 프로모터 조절 하에 있는, 그러나 Gal 4 단백질 존재에 의존성인 완전 p74 유전자를 갖는다. A4UAS 라 칭하는 재조합 AcMNPV 비루스는 실시예 1 에서 설명된 방법으로 생성한다. 보충된 비루스는 이 재조합 비루스를 실시예 6 에서 설명한 세포계에서 증식시켜 생산한다. 실시예 2 에서 설명된 바와 같은 표준 생물학적 정량을 수행하며 결과는 UASGAL-p74 가 경구 공급될 때 곤충에 대해 비감염성이나, 이 비루스가 GAL4 보통 세포계에서 증식될 때, 그것은 경구 섭취에 의해 곤충에 대해 감염성임을 입증한다.
실시예 14
과립증 비루스 게놈으로부터 AcMNPV p74 유전자에 대한 기능성 유사체의 분리
과립증 비루스의 경구 감염성의 원인이 되는 유전자의 분리는 표식 구출 기술(21)을 사용하여 실행할 수 있다. 중복 코스미드 클론의 게놈 라이브러리는 먼저 TnGV DNA 의 부분적 Sal I 소화물을 코스미드 벡터 pVK102(34)로 연결시켜 트리코플루시아 니 차립증 비루스(TnGV)의 비루스 DNA 로부터 조제한다. CpGV 코스미드 클론중 하나의 1 ㎍ 부분표본을 실시예 1 에서 설명된 절차에 으해 AcMNPV A4000 비루스 DNA 1 ㎍ 과 함께 공동 트랜스펙팅한다. 5일 후, 표준 플라크 분석을 수행한다(28). 플라크가 충분히 발달되었을 때, 개개의 플라크를 사용하여 실시예 1 에서 설명된 바와 같이 48 웰 조직 배양 평판의 하나의 웰에 감염시킨다. 이들 웰로부터의 자손 비루스를 20개의 군으로 모으고 실시예 2 에서 설명된 바와 같이 잎원판 분석에서 3령 트리코플루시아 니 유충에 먹인다. 코스미드 클론이 p74의 기능성 유사체를 가지면, 그것은 경구 감염성에 대해 A4000 비루스를 구출한다. 구출의 원인이 되는 특정한 유전자는 양성 코스미드의 플라스미드 서브클론과의 공동 트랜스펙션 및 분석 프로토콜을 반복하여 확인한다.
참고서 목록
제 1 도는 알려진 AcMNPV 게놈의 바쿨로비루스 유전자의 선형지도를 나타낸다(13).
제 2 도는 플라스미드 △P74-1의 구성 상세도를 나타내며, 이는 AcMNPV의 P74 유전자의 결실물을 갖는다.
제 3 도는 AcMNPV A4000 균주의 P74 유전자(△P74)의 결실 상세도를 나타낸다.
제 4 도는 프로모터, 폴리링커 및 3' UTR 을 나타내는 pMEV 시리즈 발현벡터 일부의 개열지도를 나타낸다.
Claims (3)
- 핵 다면성비루스중 비루스(NPV)의 p74 유전자의 변경에 의해 곤충에 대해 비감염성이 되는 환경에서 숙주 대 숙주 전염에 관해 능력이 감소된 재조합 핵 다면성비루스증 비루스로서, 이의 감염성은 i) 상기 p74 유전자로 트랜스펙팅된 곤충조직배양세포에서의 생산 또는 ii) 상기 p74 유전자로 안정하게 형질전환된 곤충세포계에서의 생산에 의해, 야생형 p74 유전자의 산물을 보충함으로써 회복되는 재조합 핵 다면성비루스증 비루스.
- 제1항에 있어서, 이종 프로모터를 사용하여 DNA 단편의 발현을 조절하는 비루스.
- (1) 핵 다면성비루스증 비루스의 p74 유전자의 변경에 의하여 비루스를 곤충에 대해 비감염성이 되게 하고; (2) i) 상기 p74 유전자로 트랜스펙팅된 곤충조직배양세포에서의 생산 또는 ii) 상기 p74 유전자로 안정하게 형질전환된 곤충세포계에서의 생산에 의해, 야생형 p74 유전자의 산물을 보충함으로써 비루스의 감염성을 회복하는 단계로 구성되는, 환경에서 숙주 대 숙주 전염에 관해 능력이 감소된 재조합 핵 다면성비루스증 비루스의 생산 방법.
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