JPH09510871A

JPH09510871A - 生物学的昆虫制御剤

Info

Publication number: JPH09510871A
Application number: JP7525037A
Authority: JP
Inventors: ウィンダス，ジョン・デイヴィッド
Original assignee: ゼネカ・リミテッド
Priority date: 1994-03-25
Filing date: 1995-03-27
Publication date: 1997-11-04
Also published as: WO1995026410A2; GB9405951D0; US5885569A; MX9604199A; EP0752001A1; CA2185234A1; BR9507195A; CN1147275A; AU1957095A; WO1995026410A3; KR970702372A; NZ282463A; AU688011B2

Abstract

(57)【要約】ポリヘドリン遺伝子および殺虫性蛋白質を発現する非相同遺伝子を含むゲノムを持つ、昆虫制御剤として使用するための組換え体バキュロウイルスであって、ポリヘドリン遺伝子および非相同遺伝子は同一のプロモーターの制御下にはなく、生存可能である野生型バキュロウイルスとの組換えにより産生されるウイルスの子孫がポリヘドリン遺伝子および非相同遺伝子の両方の発現を保持しないようにゲノム上に位置されている上記の組換え体バキュロウイルス。

Description

【発明の詳細な説明】生物学的昆虫制御剤本発明は昆虫の生物学的制御剤として使用するためのバキュロウイルス、特に殺虫性蛋白質を発現することができる非相同遺伝子を含むバキュロウイルス、ある種のウイルスの子孫の産生を最少にするバキュロウイルスの使用、および害虫制御の方法に関する。昆虫生物学的制御剤とは昆虫に関して用いられる場合、昆虫に感染し、正常な生化学的および生理学的過程に干渉して最終的に昆虫を不能にするかまたは殺すことができる薬剤を意味している。バキュロウイルスは昆虫病原性ウイルスの最も大きくおよび最も多様な群の一つを構成し、非相同性蛋白質の強力な発現系として普通に使用される。現在、昆虫生物学的制御剤としてバキュロウイルスに大きな関心が寄せられている。特に、バキュロウイルスの病原性と、毒素、ホルモンまたは昆虫に対して活性である酵素の殺虫作用とを組み合わせることにより宿主昆虫を殺すために、ウイルスが使用する時間を改良する研究が行われている。能力を高められおよび市販品として販売可能なレベルの殺虫活性を生じる非相同性殺虫遺伝子産物を発現できる組換え体バキュロウイルスの使用に対する関心は、組換え体バキュロウイルスが野生型ウイルスと競合し、その結果環境内で確立され、野生型ウイルス集団の肩代わりすることである。野生型バキュロウイルスとは非組換え体バキュロウイルスを意味している。それ故、殺虫効果は与えるのに環境中に存続する必要がない組換え体バキュロウイルスを開発することが重要である。殺虫剤として使用される組換え体バキュロウイルスの生存能力を減少させることを目的として、種々の（多少の）複合体系が提案されている。これらの案は潜在的な欠点を持っている。例えば、Ｍｉｌｌｅｒｅｔａｌ（ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｆｏｒＣｒｏｐＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，１９８８，Ｅｄ，Ｈｅｄｉｎｅｔａｌ，ｐｐ４０５）は効果的で安全な組換え体バキュロウイルスが共吸蔵法により製造できることを提案している。この方法において、環境での安定性を確保するのに必要な吸蔵体の産生に必要とされるポリヘドリン遺伝子の発現能力が欠けた組換え体バキュロウイルスは、ポリヘドリン蛋白質を提供する野生型ウイルスと混合して感染させて繁殖させる。組換え体および野生型ウイルス粒子の両方を含んでいる多角体が産生される。この提案の背後にある考えは共吸蔵過程がポリヘドリンマイナス（ｐｏｌ^-）バキュロウイルス（即ち、機能的ポリヘドリン遺伝子を欠くもの）を地面に感染型で放出するための方法を提供するであろうということである。ウイルス集団中の共吸蔵されたｐｏｌ^-バキュロウイルスの永続性は、ウイルスが昆虫から昆虫へ受け渡されるので両方のウイルス型を持つ個々の幼虫および細胞の共感染の確率により決定される。共吸蔵されたウイルス集団の生存特性の限定された野外試験がＷｏｏｄらにより報告されている（一般的な総説としてＡｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９１），４５，ｐ６９−８７、特に８３ページを参照されたい）。バキュロウイルスの集団からのポリヘドリン欠損遺伝子の減退速度はむしろ驚くべきことに遅いことが観察された。製造の立場からは、共吸蔵ウイルス集団の製造は技術的に厳しいであろうし、非常に注意深く制御された二重の感染法を必要とし、そして生産物のかなりの部分が改良された殺虫効果を及ぼすことに関して有利ではないことから本質的に不経済である。多角体を作る能力が遺伝的に欠損したバキュロウイルス集団を提供するための遺伝子操作の使用に関する別の方法は、ポリヘドリンを発現しないように遺伝子工学的に操作された細胞株／宿主において機能的多角体遺伝子を欠くバキュロウイルスを複製させることである。使用において得られたウイルス粒子は経口で活性であるが、繁殖後、野生型ウイルスはポリヘドリンまたは吸蔵体を産生することができない。そのような感染物の子孫は非常に不安定でありおよび／または感染能力が低い。この方法の欠点は次の点である；（ｉ）天然のバキュロウイルス感染の間、吸蔵体産生の時点においてポリヘドリンレベルは非常に高く、細胞株でのそのような発現レベルの再現は非常に困難であろう、および（ｉｉ）細胞株／宿主は機能的ポリヘドリン遺伝子を運んでいなければならない。それ故、組換えにより殺虫性蛋白質を産生する能力を保持しおよびポリヘドリンを作る能力を獲得したウイルスゲノムを生み出せるかなりの見込みが存在する。そのようなバキュロウイルスが環境に放出されたら遺伝子工学によるポリヘドリンが加わった（ｐｏｌ⁺）ウイルス（すなわち、機能的ポリヘドリン遺伝子を含む）のように振る舞うであろう。Ｗｏｏｄら（国際特許公開第９３／２２４４２号）は、ポリヘドリンの供給および吸蔵されたウイルスを産生する能力は高いレベルの経口活性を持つバキュロウイルスの産生には必ずしも必要とされないことを示唆している。ポリヘドリン欠損ウイルスで感染した細胞の核において発生されるいわゆる”前吸蔵”ウイルスは経口で活性であり、非吸蔵ウイルスの限定された生存特性を持っていると期待されると報告している。しかしながら、この方法の実現は不活性化される前に野外で標的害虫がウイルスに出会って取り入れる高い確率が存在するのに十分な期間「前吸蔵」ビリオンを保護できる処方技術の開発に依存するであろう。天然の吸蔵体ポリヘドリンは少なくとも部分的にこの機能を満足している。バキュロウイルスのゲノムは二本鎖ＤＮＡの閉環超らせん分子である。ゲノム構造の変異が株内に観察されている。ＤＮＡ配列の相違はゲノムの一部の再複製の結果によるものであろう（配列の欠失および塩基置換）。再反復されたＤＮＡ配列もまたゲノム内に観察され、例えばＡｃＭＮＰＶのゲノムはＤＮＡ相同性を示す五つの領域を持っていることが報告されている。バキュロウイルス間の遺伝子内相同性についていくつかの報告がなされている。例えば、ポリヘドリン遺伝子およびｐ１０遺伝子を含む領域は核多角体病ウイルス（ＮＰＶ）感染鱗翅目間では高度に保存されている。ウイルスゲノム内へ宿主細胞ＤＮＡが挿入された場合も報告されている。特に、細胞性ＤＮＡが二つの近縁のウイルス、ＡｃＭＮＰＶおよびガレリアメロネラ（ＧａｌｌｅｒｉａｍｅｌｌｏｎｅｌｌａＮＢＶ、（ＧｍＭＮＰＶ））、のゲノム内へ取り込まれていることも報告されている。理論に拘束されることは望まないが、相同性領域がそのようなゲノム突然変異と関係しているであろうと考えられる。最近、ＳｅＭＮＰＶのゲノム内への細胞性ＤＮＡの挿入と関係しているであろう五つの領域が同定された。一般的総説としてはＡｒｉｆＢＭ「ウイルスゲノムの構造」、２６−２７ページ、「ＣｕｒｒｅｎｔＴｏｐｉｃｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−ＴｈｅＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ」、ＤｏｅｒｆｌｅｒおよびＢｏｈｍ編、を参照されたい。従って、野生型ウイルスとの競合と同様に、組換え体バキュロウイルスの放出に伴う問題とは、それらが相同的組換えにより野生型と相互作用して新規なバキュロウイルスを導くということであるということが、認識された。そのような相同的組換えでは、第二のウイルスのゲノム領域と相同的であるゲノムの二つの領域間に存在するＤＮＡ領域がウイルス間で転移または交換される。組換え体バキュロウイルスの放出に伴う危険性は放出前に評価されているであろうが、野生型とのそのような組換え体の子孫は変化した昆虫宿主範囲および／または標的害虫に対する変化した毒性を持っているであろう。本発明の一つの態様に従うと、非相同遺伝子（heterologous）および殺虫性蛋白質を発現するポリヘドリン遺伝子を含むゲノムを持つ生物学的昆虫制御剤として使用するための組換え体バキュロウイルスが提供され、ここで非相同遺伝子およびポリヘドリン遺伝子は同一のプロモーターの制御下にはなく、非相同遺伝子およびポリヘドリン遺伝子は、ポリヘドリンおよび非相同遺伝子両方の発現を保持する野生型バキュロウイルスとの組換えでの生存可能なウイルスの子孫の産生を最少にするように十分に空間的に離れている。本発明のもう一つ別の態様に従うと、ポリヘドリン遺伝子および非相同遺伝子（殺虫性蛋白質を発現する）を含むゲノムを持つ昆虫制御剤として使用するための組換え体バキュロウイルスが提供され、ここでポリヘドリン遺伝子および非相同遺伝子は同一のプロモーターの制御下にはなく、生存可能である野生型バキュロウイルスとの組換えにより生産されるウイルスの子孫がポリヘドリン遺伝子および非相同遺伝子の両方の発現を保持しないようにゲノム上に位置している。生存可能とは子孫が必須遺伝子を欠いていないことを意味している。本発明は以下に添付する図面を参照することにより最も良く説明できる：図１は従来技術による組換え体ウイルスを含む組換えを模式的に示したものであり、図中Ｆは従来技術による組換え体ウイルスであり、Ｂは組換えられる野生型ウイルスであり、十字形は相同の領域を示しており、従って同時転移される領域を定義しており、ｗｈ⁺は非相同遺伝子を示しており、およびｐｏｌ⁺は多角体遺伝子を示している。Ｆにおいて、ｗｈ⁺およびｐｏｌ⁺遺伝子はそれらの決まった位置に存在し、すなわち、遺伝子はお互いに非常に近くに存在する。遺伝子間に非常に小さな配列が存在し、それ故他のウイルスと相同であろう機会は非常に少なく、組換えの基質として働くことができる。相同配列が両方の遺伝子のどちらかの側に生じるという十分により大きな機会があり、それ故組換えの間に両方の遺伝子が一つの単位として一緒に動くであろうという対応したより大きな機会があることが理解されるであろう。図２および３は各々本発明の一つの態様に従った組換え体ウイルス（Ａにより示されている）を含む組換えを模式的に示したものであり、野生型ウイルスは各々ＣおよびＤである。相同的組換えによる他のウイルスへのｗｈ⁺およびｐｏｌ⁺遺伝子両方の同時転移の見込みは従来技術の組換え体より本発明の組換え体では十分により小さいことが理解されるであろう。本発明に従ったｗｈ⁺およびｐｏｌ⁺遺伝子の分離とは遺伝子間により多くの基質が存在し、それらに組換えが起こってもｗｈ⁺およびｐｏｌ⁺遺伝子両方が一緒に転移されない機会は対応して大きいことを意味している。図２に示されているようにＡのｗｈ⁺遺伝子により占められている位置で組換えが起こったら、生じるＡは二つのｐｏｌ⁺遺伝子を持っているであろうが、実用頭部を持っていず、生じるＣはｗｈ⁺を持っているであろうが、ｐｏｌ⁺遺伝子を欠くことか、それが無能力であろうことを意味している。図３に示されているようにＡのｐｏｌ⁺遺伝子により占められている位置で組換えが起こったら、生じるＡはｗｈ⁺を持っているであろうが、ｐｏｌ⁺遺伝子を欠くために無能力であり、生じる子孫ウイルスＤは実用頭部を持っていないであろう。本発明のさらなる特色は、たとえｗｈ⁺ｐｏｌ⁺が同時転移されても、それらが転移されたウイルスは過程中の少なくとも一つの必須遺伝子を失っているであろうので、少なくとも無能力であるかまたは生存可能ではない見込みが従来技術より大きいということである。この状況は遠縁のウイルス間での同時転移に対して特に確かである。この状況は模式的に図４に示されており、ここでＸは必須遺伝子の位置を表している。示されたような組換えが野生型ウイルスＥからＸが失われるように、ＡおよびＥのゲノム上の異なった位置にＸは位置している。本質的に本発明に従ったウイルスは： −より野生型の構築物に基づいた構築物より安全であり； −ありそうな組換えに関して安全であり；および −産生が依然真っすぐ（straightforward）である。好適には少なくともバキュロウイルスのゲノムの１０％が非相同遺伝子およびポリヘドリン遺伝子を分離しなければならない。さらに好適にはゲノムの約１２％が二つの遺伝子を分離している。このことは簡単に参照できるように図６に示されている。図６において、配列の位置は０−１００地図単位のスケールに関して報告されている。ＡｃＭＮＰＶは約１３０／１３１キロ塩基対の大きさのゲノムを持っている。従って、本発明に従うと非相同遺伝子およびポリヘドリン遺伝子は好適には少なくとも１３ｋｂ、より好適には約１５ｋｂから約１６ｋｂ離れている。一般的には、バキュロウイルスのゲノムは約９０から２００ｋｂの範囲内である。それ故、遺伝子間の適した分離距離は本発明に用いたバキュロウイルスに依存するであろうことが理解されるであろう。好適には、ポリヘドリン遺伝子はｐ１０プロモーターの制御の下にあり、非相同遺伝子は他のプロモーター、例えばポリヘドリンプロモーターの制御の下にある。これは好適な態様ではあるが、疑いを避けるために、ポリヘドリン遺伝子はその天然の部位から離れたゲノム中の任意の他の部位（必須な遺伝子を破壊しない）に存在できることについて記載するであろう。同じことは非相同遺伝子についても当てはまる。通常ｐ１０遺伝子により占められている位置にポリヘドリン遺伝子を持ち、ｐ１０遺伝子は無能力化されているかまたは欠損されており、通常ポリヘドリン遺伝子により占められているであろう位置に殺虫性蛋白質をコードしている遺伝子を適応させるように遺伝子学的に操作できる組換え体は安定性が減少したウイルスの発生についての簡単な解決法を提供することも提案されている。そのようなｐ１０欠損ウイルスはそれらを殺虫剤として有効にする一方、野生型ウイルスに関して遺伝子学的に無能力であるようにする多くの特色を持っている。従って、本発明のもう一つ別の好適な態様に従うと、ゲノムはｐ１０遺伝子を無能力化するかまたは欠損させるために改変されている。ｐ１０遺伝子を欠いた本発明に従うバキュロウイルスはまた以下の特色を持っていることが観察された： −そのようなウイルスで感染された昆虫は、同一の発育段階で野生型ウイルスで感染させた昆虫と比較して死亡時点で生存可能な子孫の産出量が少なく； −産生された多角体は野生型多角体と比較すると小さくおよび形が悪い。従って、それらは生存能力が減少しているようであり； −しかしながら多角体は野生型多角体と同様に感染性であり、産生は真っすぐあろうことを意味している。本発明のこの特色は図５に例示されている（ここでＭａｇⁿ＝倍率）。図５ａはｐ１０遺伝子が欠けているＡｃＵＷ１バキュロウイルスを示している。図５ｂのｐ１０⁺ＡｃＵＷ１バキュロウイルスと比較すると、ｐ１０^-バキュロウイルスの多角体は不完全であることが容易に観察されるであろう。無能力化されたｐ１０^-ＡｃＵＷ１バキュロウイルスのクラスターは図５ｃに示されている。この図５ｃは多角体が不完全であるだけではなく、これらのバキュロウイルスは遺失したバイロンを持っていることを示している。再び、図５ｃの無能力化されたバキュロウイルスと図５ｄに示したより健康な無能力化されていないバキュロウイルスとを比較することができる。これらの写真を作製するため、多角体を３０％のグルタルアルデヒドを含む０．０５Ｍリン酸緩衝液中、４℃で９０分固定し、１％の四酸化オスミウムを含む０．０５Ｍリン酸緩衝液で後固定した。脱水および浸透に続いて試料をＳｐｕｒｒ樹脂（Ｓｐｕｒｒ，１９６９）に埋め込み薄断片を作り、２％酢酸ウランのアルコール溶液で１５分、続いて０．２％のクエン酸鉛を含む０．１Ｎ水酸化ナトリウムで５分間染色した。本発明の好適な態様は図６ｂにより非常に詳細に例示されており、その構築は以下の実施例に説明されている。この図は図６ａに示した組換え体バキュロウイルスの特色と直感的に比較できる。図６ａは非相同遺伝子の通常の位置を示しており、即ちポリヘドリン遺伝子に非常に近接している。本発明の種々の好適な特色および態様がここで非常に詳細に説明されるであろう。本発明は参照を簡単にするため非相同遺伝子としてコノトキシン（conotoxin ）の使用に関して説明され、特に軟体動物および甲殻類に活性な「キングコング」コノトキシン（Ｈｉｌｌｙａｒｄｅｔａｌ．（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）に関し、これは後にＫＫ−０［配列番号１６］（Ｗｏｏｄｗａｒｄｅｔａｌ．（１９９０）ＥＭＢＯＪ．９１０１５−１０２０）と称され、二つの関連ペプチドＫＫ−１［配列番号１７］およびＫＫ−２［配列番号１８］が１９８８年１０月２４−２８日に開かれたＣｏｎｆｅｒｅｎｃｅｓＪａｃｑｕｅｓＭｏｎｏｄｏｎＴｏｘｉｎｅｓＡｎｉｍａｌｅｓ（Ａｕｓｓｏｉｓ，Ｆｒａｎｎｃｅ）で報告されている。下記実施例１で詳述するように、ＫＫ−０、ＫＫ−１およびＫＫ−２の報告されている配列に対応する合成ペプチド（図１２参照）が製造され、成虫のペリプラナタアメリカナ（Ｐｅｒｉｐｌａｎａｔａａｍｅｒｉｃａｎａ）（目：網翅目）および幼虫のヘリオチスビレセンス（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）およびトリコプルシアニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ）（目：鱗翅目）の試料内へ注射することにより評価された。ＫＫ−０およびＫＫ−１の調製物の両方が試験された試料の各々において顕著な殺虫性および／または麻痺誘導活性を示した。また、「キングコング」（ＫＫ−０）コノトキシン（７８アミノ酸の蛋白質であり、少なくともコヌステクスチレ（Ｃｏｎｕｓｔｅｘｔｉｌｅ）においては合成の間に分泌経路に入るらしく、最初は前毒素として産生され、それは続いて成熟ＫＫ−０を産生するために加工される、Ｗｏｏｄｗａｒｄｅｔａｌ．（１９９０）ＥＭＢＯＪ．９１０１５−１０２０）の仮定された天然前駆体をコードしているであろうｍＲＮＡ分子をコードするように設計された合成遺伝子［配列番号１］が使用されたことがわかるであろう。この研究で使用された合成遺伝子はコヌステクスチレ（Ｃｏｎｕｓｔｅｘｔｉｌｅ）ＫＫ−０遺伝子の天然のヌクレオチド配列を考慮せずに設計された。むしろ遺伝子は天然のＫＫ−０前駆体をコードしているけれども、昆虫細胞系で効果的に発現されるようにおよび操作が容易であることの両方を確実にするように設計された（詳しくは実施例２を参照されたい）。天然のＫＫ−０遺伝子またはコヌステクスチレ（Ｃｏｎｕｓｔｅｘｔｉｌｅ）からのｃＤＮＡは使用されなかったけれども、ＫＫ−０前駆体をコードできるそのような配列または他の合成遺伝子がバキュロウイルス宿主の作用の速度を促進することに等しく有効ではないということを予測するための基礎もない。使用された合成遺伝子（ｓＫＫ−０）は実際には天然のＫＫ−０ｍＲＮＡのコード配列とわずか７７％のヌクレオチド配列同一性を有していた。この毒素のさらなる詳細は我々の係属中の国際特許公開第ＷＯ９４／２３０４７号に記載されている。本発明が、入手可能なまたは開発されている、殺虫性蛋白質を発現する他の非相同遺伝子に応用可能であることは当業者には容易に理解されるであろう。そのような遺伝子の例としては、北アフリカサソリアンドロクトナスオーストラリス（Ａｎｄｒｏｃｔｏｎｕｓａｕｓｔｒａｌｉｓ）ヘクター（ＡａＩＴ）の毒素を発現する遺伝子およびわら皮癬虫ピエモテストリチシ（Ｐｙｅｍｏｔｅｓｔｒｉｔｉｃｉ）のＴｏｘ３４毒素（ＴｏｍａｌｓｋｉＭＤａｎｄＭｉｌｌｅｒＬＫ，Ｎａｔｕｒｅ（１９９１），３５２，８２−８５）を発現する遺伝子が挙げられる。バキュロウイルスはオートグラファカリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）多エンベロープ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）または遺伝子工学または操作技術に適した任意の他の入手可能なまたは開発されたウイルス種でもよい。さらなる例としては、カイコ（Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒｉ）ＮＰＶ、スポドプテラエキシグア（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｅｘｉｇｕａ）ＭＮＰＶ、ガレリアメロネラ（Ｇａｌｌｅｒｉａｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ）ＭＮＰＶ、トリコプルシアニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ）ＭＮＰＶ、コリストネウラフミフェラナ（Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａｆｕｍｉｆｅｒａｎａ）ＭＮＰＶ、オルギアシュードトスガータ（Ｏｒｇｙｉａｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａｔａ）ＭＮＰＶ、スポドプテラフルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）ＭＮＰＶ、マメストラブラッシカエ（Ｍａｍｅｓｔｒａｂｒａｓｓｉｃａｅ）ＭＮＰＶ、ＨＰＶ−８５−ＣＬＭＥＶと称されるいわゆるセレリールーパーウイルス（国際特許公開第ＷＯ９０／１０３８７に開示されている）、我々の係属中の国際特許出願第ＰＣＴ／ＧＢ９４／０２４３８号に開示されているいわゆるＮＣ−１ウイルスおよびヘリオチスゼア（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓｚｅａ）ＳＮＰＶ（単エンベローフ核多角体病ウイルス）が含まれる。バキュロウイルスゲノムの改変に関係しての使用に適した任意のｐｏｌ^-伝達ベクターが本発明の昆虫制御剤の製造に使用されるであろう。その例にはｐＶＬ１３９２およびｐＶＬ１３９３が挙げられる。他の適当なベクターも本分野では知られている。図７および図８のＤＮＡ配列を取り込んだｐＶＬ１３９２に基づいたプラスミドが大腸菌へ導入され、１９９３年３月１２日にＮａｔｉｏｎａｌＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌａｎｄＭａｒｉｎｅＢａｃｔｅｒｉａ（ＡｂｅｒｄｅｅｎＵＫ）へＮＣＩＭＢ４０５４０の番号の下で寄託された。本発明に従った組換え体バキュロウイルスは既知の技術により構築できる。一般的には、適当な運搬ベクターが上記のように構築される。この運搬ベクターは、野生型ウイルスゲノム中のＤＮＡ配列に対し適した相同配列を含んでいる。ウイルスＤＮＡおよびプラスミドベクターの構築により、組換え体子孫は相同的組換えにより生じるようである。次いで、組換え体ウイルスは常法を用いて親ウイルスから分離できる。本発明の種々の好適な態様は以下の実施例により例示されるであろう。実施例１「キングコング」（ＫＫ−０）、ＫＫ−１およびＫＫ−２ペプチドの合成標品の生物学的評価ＫＫ−０、ＫＫ−１およびＫＫ−２ペプチドの合成標品の生物活性の予備的評価は成虫のゴキブリ（ペリプラネタアメリカナ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａａｍｅｒｉｃａｎａ）：ゴキブリ科：網翅目）および第５虫齢タバコ芽虫幼虫（ヘリオチスビレセンス（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓｖｉｒｅｓｃｅｎｅ：ヤガ科：鱗翅目）を用いる一連の注入研究により行われた。蛋白質は蒸留水および注射に通常使用される標準水性緩衝液には不溶であった。ＫＫ−０およびＫＫ−１は１０ｍｇ／ｍｌの濃度で０．１Ｍ炭酸水素アンモニウムに懸濁された。懸濁液を１時間穏やかにかき混ぜた後、０．２μｍのフィルターを通して濾過した。視覚による評価ではＫＫ−０生成物の約５０％が可溶化されたが、一方ＫＫ−１生成物は実質的により少なくしか溶けないことを示した。このことは正確な定量および異なった蛋白質の直接的用量比の比較を困難にしている。しかしながら、送り込まれた最大用量の評価は可能であった。ＫＫ−２は非常に疎水性であり、ｍｌ当たり１０ｍｇの粗生成物の濃度でＤＭＳＯに溶解させた。タバコ芽虫幼虫（ＴＢＷ）には１５ｍｍ３３番ゲージ針を付けた１０μｌのハミルトンシリンジを用いて注射した。約３００ｍｇの平均体重を持つ初期第５虫齢幼虫には各々の処置において１−４μｌが注射された。典型的には各々の処置は少なくとも５匹で行われた。成虫オスゴキブリには１５ｍｍ２７番ゲージ針を付けた５０μｌのハミルトンシリンジを用いて注射した。各々の動物には１−１０μｌの試験溶液が注射された；平均体重は約８４０ｍｇであった。対照昆虫には等容量の適当な溶液が注射された。注射後、処置昆虫は個々に給餌装置がついた容器中、制御された状態下（２５ ℃、６５％ＲＨ）に７２時間まで保たれた。定期的に観察し、通常ではない総体的症状をチェックした。タバコ芽虫Ｈ．ビレセンス（Ｈ．ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）幼虫へのＫＫ−０およびＫＫ−１両方の注射により特徴的な「弛緩性麻痺」が生じた（表Ｉ）。典型的には症状は幼虫に注射したほぼ直後に観察され、「麻酔状態」になっていくようであった。影響を受けた幼虫は立つことおよび／または協調歩行ができなかった。さらに、背を下にして置くと再び転回することができず、刺激への応答においては口部分および把握器の弱い動きにのみ限られていた。「麻酔」のピークでは、影響を受けた幼虫は足を引きずり、柔軟であった。しかしながらこれらの効果は比較的短時間であり、注射後５−１０分で完全な回復が通常生じた。全ての幼虫は生存しており処置後２４時間では元気であった（２４ＨＡＴ）。より高い用量の注射では症状が重度であり、持続時間が長かった。総体的症状はＫＫ−０ではより明白であるようにみえた。Ｈ．ビレセンス（Ｈ．ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）幼虫へ、幼虫当たり約１０μｇ蛋白質の最大用量に等しい単一率（即ち３３μｇ蛋白質／ｍｇ幼虫）でＫＫ−２蛋白質を注射した後でも異常な効果は観察されなかった。ゴキブリ三つ全ての蛋白質はゴキブリに特有のおよび衰弱させる効果を生みだした（表 II）。各々の場合で、効果の強さは注射した蛋白質懸濁液の容量とともに増加した。ゴキブリへのＫＫ−０蛋白質懸濁液の注射により、最初は重度の震えを起こし、続いて協調の喪失、麻痺およびノックダウンが起こった。効果は最初は後ろ足で観察され、急速に中間および最終的には前足にひろがり、昆虫が衰弱した。他の症状としては背面の弓状化が挙げられる。影響を受けた昆虫は回復できず、２２ＨＡＴで死亡した。ＫＫ−１蛋白質を注射した昆虫は同様の総体的症状を示したが、１μｌの蛋白質懸濁液の最低用量では効果はわずかにより軽いように思われた。異常効果が２および５μｌのＫＫ−２ペプチドを注射した昆虫でも短時間観察された。症状には、背部の弓状化、羽の平板化および協調運動の喪失などが含まれ、注射後数分以内に起こった。効果は一次的なものにみえ、影響を受けた昆虫は注射後２０分で完全に回復しているようにみえた。しかしながら、この処置において、全ての動物は７２ＨＡＴで死亡した。最低率（１μｌ容量）で処置された昆虫では異常な症状は観察されず、全ての昆虫は生存しており、７２ＨＡＴで元気であった。これらの観察は続いての実験で確認され、コノトキシン蛋白質はゴキブリおよびＴＢＷ幼虫に対して殺虫活性を持っていることが示された。実施例２合成キングコング（ｓＫＫ−０）コノトキシン遺伝子設計天然のＫＫ−０遺伝子のコドン使用が昆虫細胞においての発現に特に利点があるということを信じる前もっての理由が全くなかったので、我々は新規合成（ｓＫＫ−０）遺伝子を設計することに決定した。これはＴＲＡＮＳＬ、ＲＥＳＴＲＩおよびＭＵＴＳＩＴＥのようなＰＣＧｅｎｅ^TM（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，７００ＥａｓｔＣａｍｉｎｏＲｅａｌ，ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）プログラムの助けをかりて行われた。ｓＫＫ−０遺伝子の特色は下記のようである：− ｃＤＮＡクローニング研究によりＷｏｏｄｗａｒｄら（（１９９０）ＥＭＢＯＪ．９１０１５−１０２０）により記載されているＫＫ−０プロペプチドのアミノ酸配列［配列番号２］を正確にコードしている。ＫＫ−０プロペプチドをコードするために使用したコドンが選択された、なぜなら、それらは発現研究は酵母で行われるであろうと予測されたので昆虫（ドロソフィラメラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ））および酵母（サッカロミセスセレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））で好まれるまたは少なくともしばしば遭遇するからである（Ａｓｈｂｕｒｎｅｒｅｔａｌ．（１９８４）Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ４２９５−３１２；Ｉｋｅｍｕｒａ（１９８５）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．２１３−３４；Ｓｈａｒｐ（１９８６）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１４５１２５−５１４３）。翻訳開始コドン（ＡＴＧ）のすぐ前のヌクレオチド配列はＫｏｚａｋにより決定された動物ｍＲＮＡに好適な配列と密接に一致している（Ｋｏｚａｋ（１９８１）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ９５２３３−５２５２；Ｋｏｚａｋ（１９８４）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１２８５７−８７３；Ｋｏｚａｋ（１９８６）Ｃｅｌｌ４４２８３−２９２；Ｋｏｚａｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６９４７ −９５０）。ＫＫ−０プロペプチドをコードするためにＣｏｎｕｓｔｅｘｔｉｌｅによって使用されたコドンの考慮は全くなされなかった（その結果、ｓＫＫ−０と天然ＫＫ−０遺伝子の全相同性は７７．２％のみである）。隣接する制限酵素認識部位（上流ＢｇｌIIおよび下流ＸｍａIIIおよびＢａｍＨＩ）が最初に選択されたバキュロウイルス転移ベクターｐＶＬ１３９２（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，３９８５ＳｏｒｒｅｎｔｏＶａｌｌｅｙＢｏｕｌｅｖａｒｄ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）内への直接的クローニングを容易にするために設計に組み込まれた。これらの酵素によるクローニングは、この転移ベクターにより運ばれたＡｃＭＮＰＶポリヘドリンプロモーターから直接遺伝子を転写する可能性を生じさせると期待された（図１０参照）。いくつかの追加の独特のヘキサヌクレオチド認識配列部位が、コードされているアミノ酸配列に影響を及ぼさないような遺伝子の位置でｓＫＫ−０配列内へ取り込まれた。これらの部位は組み換え体の特徴決定および続いて行う可能性のある遺伝子の操作を容易にするために導入された（実施例１４参照）。この部位の取り込みによっても特に好ましくないコドンの包含は生じなかった。得られたｓＫＫ−０配列［配列番号１］は図７（ＫＫ−０プロペプチドをコードしている配列は強調されている）、および図８（制限酵素認識部位の位置が強調されている）に示されている。実施例３ｓＫＫ−０遺伝子の合成ｓＫＫ−０遺伝子の組立に選択された方法は、図７および８に示されたＤＮＡ断片をコードしている重複相補的オリゴヌクレオチドを合成し、続いてＤＮＡポリメラーゼ仲介により一本鎖領域を完成させ、そしてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅して完全な遺伝子断片（図９）の十分な量を発生させることを含んでいた。従って、一緒になると完全ｓＫＫ−０ＤＮＡ断片をコードしている４つのオリゴヌクレオチド（ＣｏｎｏＡ、ＣｏｎｏＢ、ＣｏｎｏＣ、ＣｏｎｏＤ）［配列番号３、４、５、６］はＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ３８０ＢＤＮＡ合成機を用い、常法により合成された。二つの追加のより短いオリゴヌクレオチド、ＣｏｎｏＰＣＲ１およびＣｏｎｏＰＣＲ２［配列番号７、８］（ＣｏｎｏＡおよびＣｏｎｏＤの５’の３０および２８のヌクレオチドと同一である）もまたＰＣＲプライマーとして利用するために合成された。各々のオリゴヌクレオチドは５５℃で約８時間インキュベーションすることにより脱保護し、続いて真空下で乾燥した。それらは２００μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭＥＤＴＡ）に溶解し、濃度をＵＶ分光法により測定し（１ＯＤ₂₆₀単位／ｍｌは約２０μｇ／ｍｌと等価である）、ＴＥで希釈して約１０μＭ貯蔵液を得た。これらは使用するまで−２０℃で保存された。ｓＫＫ−０合成反応は以下の工程を含んでいる：− １）１０μＭのＣｏｎｏＡおよびＣｏｎｏＢの各々５μｌを５００μｌの無菌円錐形ポリプロピレン遠心分離チューブ中で５μｌの１０ｍＭｄＧＴＰ、１０ｍＭｄＡＴＰ、１０ｍＭｄＣＴＰ、１０ｍＭＴＴＰ、および５μｌの５００ｍＭＫＣｌ、１００ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１５ｍＭＭｇＣｌ₂、０．１％ゼラチンと一緒に混合して水で４９μｌとなし、１μｌ（５単位）のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ／ＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ）を加えた後に、２滴の軽パラフィン油（Ｓｉｇｍａ）を層積した。チューブに蓋をしてＴｅｃｈｎｅＰＨＣ−１プログラム可能Ｄｒｉ−Ｂｌｏｃｋ^Rに入れ、以下の温度サイクルにかける：− １．１’ ＠９４℃ １’ ＠５５℃ ４’ ＠７３℃ ５回、続いて７’＠７３℃の最終インキュベーション時間。２）１０μＭのＣｏｎｏＣおよびＣｏｎｏＤの各々５μｌを混合して上記（１）のように正確に処理する。３）０．５μｌの反応（１）の生成物をとって０．５μｌの反応（２）の生成物と混合し、および５μｌの反応（１）の生成物を反応（２）の生成物と混合する。各々の混合物に１０μｌの１０μＭＣｏｎｏＰＣＲ１；１０μｌの１０μ ＭＣｏｎｏＰＣＲ２；１０μｌの５００ｍＭＫＣｌ、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１５ｍＭＭｇＣｌ₂、０．１％ゼラチン；１０μｌの１０ｍＭｄＧＴＰ、１０ｍＭｄＡＴＰ、１０ｍＭｄＣＴＰ、１０ｍＭＴＴＰを加え水で９９μｌとなし、１μｌ（５単位）のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ／ＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ）を加えた後に、２滴の軽パラフィン油（Ｓｉｇｍａ）を層積した。平行してＰＣＲプライマー、反応１または反応２の生成物を欠く対照反応を準備する。反応液はＴｅｃｈｎｅプログラム可能Ｄｒｉ −Ｂｌｏｃｋ^R中で、以下の温度サイクルにかける：− １．１’ ＠９４℃ １’ ＠６８℃ ４’ ＠７３℃ ２５回、続いて７’＠７３℃の最終インキュベーション時間。反応３の生成物の１０μｌで分析用アガロースゲル電気泳動を行い、すべての必要なＤＮＡ断片およびオリゴヌクレオチドを含む反応中でのみ、約２７０ｂｐの断片が産生されたことを確認した。各々のＤＮＡ断片の残留物はエタノール沈澱により回収する前に、等容量の水飽和フェノールによるフェノール抽出（２回）次に等容量の水飽和ｎ−ブタノール（２回）により後処理を行った。実施例４ｐＶＬ１３９２／ｓＫＫ−０組換え体転移ベクターの組立回収後、上記ＰＣＲ生成物の各々を使用説明書に従ってＢｇｌIIおよびＥｃｌＸＩ（ＸｍａIIIのイソシゾマー）で消化した。平行して、市販品として入手可能なバキュロウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）転移ベクター（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）ｐＶＬ１３９２の５μｌを同様に処理した。制限消化物は次いで、０．５μｇ／ｍｌのエチジウムブロミドを含む分取０．８％アガロース／トリス−酢酸電気泳動ゲル上で泳動した。ＰＣＲ生成物および直線状化ベクターＤＮＡ断片はＵＶ照射下でゲルから切り出した。それらはシリコン化ガラスウールを通した遠心分離およびエタノール沈澱により回収した。単離された挿入物の一部およびベクターＤＮＡ断片を適当な緩衝液条件下（ＳａｍｂｒｏｏｋＪ．，ＦｒｉｔｓｃｈＥ．Ｆ．＆ＭａｎｉａｔｉｓＴ．（１９８９）「ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ」，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ）、Ｔ４リガーゼとともに混合した。次いで、ライゲーション混合物を使用してコンピテントＤＨ５α細胞を標準的方法によって形質転換した（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．上記文献）。子孫形質転換体は１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬ寒天プレート上で一夜増殖させることにより選別した。形質転換体は次に常法による（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．上記文献）ＨｙＢｏｎｄ−Ｎ（ＡｍｅｒｓｈａｍＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）フィルター上のコロニーハイブリダイゼーションによりｓＫＫ−０遺伝子と相補的な配列の存在についてスクリーニングした。使用したハイブリダイゼーションプローブはｇ³²Ｐ−ＡＴＰ（ＡｍｅｒｓｈａｍＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）およびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮｏｒｔｈｕｍｂｒｉａＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓＬｔｄ．）による処理により５’がホスホリル化されているオリゴヌクレオチドＣｏｎｏＢであった。プラスミドＤＮＡは六つの強くハイブリダイズするコロニーから製造された。これらのＤＮＡの制限分析は、三つがｓＫＫ−０に期待される大体の大きさおよび特性を持つ挿入物を含むｐＶＬ１３９２誘導体であることを示唆した。選択されたｐＶ１１３９２組換え体（＃２．２、＃５．２、＃６．１）中に存在する挿入物の配列がＳｅｑｕｅｎａｓｅ^TM（ＵＳＢ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ）キットおよびＢｇｌIIおよびＸｍａIII認識部位に隣接するｐＶＬ１３９２の領域にハイブリダイズするように、およびこれらの部位間（図１０参照）に導入された挿入物の配列決定を可能にするように設計された二つの合成オリゴヌクレオチドプライマー（ｐＶＬ１３９２ＦＯＲおよびｐＶＬ１３９２ＲＥＶ）［配列番号１３、１４］を用いてチェックされた。三つの組換え体の一つの（＃２．２）挿入物［配列番号１５］の配列がクローン化されたｓＫＫ−０に期待されるものと期待される様式（図１１参照）で厳密に一致した。他のプラスミドは小さな配列変異（突然変異）を持つ挿入物を含んでいた。組換え体＃２．２（ＡｃＭＮＰＶポリヘドリンプロモーターの転写制御下の遺伝子ｓＫＫ−０を含む転移ベクターｐＶＬ１３９２の誘導体）が従ってすべての以下の研究のために選択された。組換え体プラスミドｐＶＬ１３９２／ｓＫＫ− ０＃２．２を運ぶ大腸菌ＤＨ５α培養物はＮＣＩＭＢ４０５４０の寄託番号としてＮａｔｉｏｎａｌＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌａｎｄＭａｒｉｎｅＢａｃｔｅｒｉａ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，ＵＫに寄託されている。実施例５ｓＫＫ−０を運ぶ組換え体（ポリヘドリンマイナス）ＡｃＭＮＰＶの発生Ｋｉｎｇ＆Ｐｏｓｓｅｅ（１９９２）「ＴｈｅＢａｃｃｕｌｏｖｉｒｕｓＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＳｙｓｔｅｍ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＧｕｉｄｅ」（Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ）の実施例に記載されているような標準バキュロウイルス技術を用いて、ポリヘドリンプロモーターの転写制御下にｓＫＫ−０を運んでいるが機能的ポリヘドリン遺伝子が欠けている組換え体ＡｃＭＮＰＶウイルスが、Ｓｆ２１細胞と約２００ｎｇのＳａｕｌ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ）直線状化ＡｃＭＮＰＶ．ｌａｃＺ（Ｐｏｓｓｅｅ＆Ｈｏｗａｒｄ（１９８７）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１５１０２３３−１０２４８）および１μｇのｐＶＬ１３９２／ｓＫＫ−０＃２．２ＤＮＡとのコトランスフェクションにより発生させた。組換え体ウイルスの選択は最初に組換え体ｌａｃＺ−ウイルスがＳｆ−２１細胞単層培養で発生するプラーク中のＸ−ｇａｌ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ，ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ，ＮｅｗＹｏｒｋ）を代謝できないことに基づくものとした。６個のそのようなｌａｃＺ−ウイルス（「ＣＯＮＯ−Ａ」、「ＣＯＮＯ−Ｂ」、「ＣＯＮＯ−Ｃ」、「ＣＯＮＯ−Ｄ」および「ＣＯＮＯ−Ｅ」）を選び取り、それらを均一に精製するためおよびそれらがβガラクトシダーゼを合成する能力がないことを確認するためにＳｆ−２１細胞上に再び播種した。次に２５ｃｍ²の組織培養フラスコ（Ｂｉｂｂｙ，Ｓｔｏｎｅ，Ｓｔａｆｆｓ．）中、４ｍｌのＴＣ１００／７．５％ウシ胎児血清培地（両方ともＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから）に１．５ｘ１０⁶個のＳｆ２１細胞を播種し、２８℃で一夜インキュベートし、単一精製プラークをほじることにより回収されたウイルスの５０％を加え、さらに６日間２８℃でインキュベーションを続けることにより各々の精製されたウイルスの小規模の（約４ｍｌ）培養物が製造された。これらのウイルス貯蔵物の各々のアリコートでバイオアッセイ（実施例６参照）が行われた。相等しいアリコートは物理分析のために、ウイルスＤＮＡの少量の試料の調製に使用された（Ｋｉｎｇ＆Ｐｏｓｓｅｅ（１９９２）上記文献）。予期されたｓＫＫ−０／ＡｃＭＮＰＶ組換え体で行われた診断的物理分析は以下のものであった：− ａ）ｓＫＫ−０、そして平行してβガラクトシダーゼ遺伝子特異的プライマーを用いてのＰＣＲ研究。ｂ）ＣｌａＩおよびＢｇｌIIで処理されたウイルスＤＮＡに対するサザンブロット分析、１％アガロースゲル上での電気泳動により分画し、ＨｙＢｏｎｄ−Ｎフィルターに移し、そして単離されたランダムプライムドα³²Ｐ−ｄＣＴＰ標識されたｓＫＫ−０プローブでハイブリダイズした。これらの研究により、ウイルス「ＣＯＮＯ−Ｃ」がｓＫＫ−０遺伝子を含んでおり、すべての予期された物理特性を持ち、そしてβガラクトシダーゼ遺伝子が欠けていたことが確認された。他の予期された組換え体ウイルスはｓＫＫ−０遺伝子が欠けていた。実施例６予期されたＡｃＭＮＰＶ／ｐＶＬ１３９２／ｓＫＫ−０組換え体ウイルスのバイオアッセイ推定ＡｃＭＮＰＶ／ｐＶＬ１３９２／ｓＫＫ−０ウイルスの生物学的活性は後期段階のヘリオチスビレセンス（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）幼虫を用いた一連の注射実験において評価された。精製された非吸蔵ウイルスのアリコートは１５ｍｍ３３番ゲージ針をつけた１０μｌハミルトンシリンジを用いて第４または５虫齢のＨ．ビレセンス幼虫内へ注射された。典型的には、処置あたり少なくとも５匹の幼虫がウイルス懸濁液１μｌの標準容量で注射された。対照昆虫には等容量のＡｃＭＮＰＶ／ｐＶＬ１３９２／ｌａｃＺウイルス、ＡｃＭＮＰＶ野生型ウイルスまたは無菌水が注射された。注射後、幼虫は人工飼料で個々に保持され、２４時間間隔で以後さらに７日間試験された。各々の評価機会時に生きているおよび死んだ幼虫の数が記録された。生き残っている幼虫は異常な総体的症状および／または行動応答に関してが試験された。最初に、実施例５に記載したように発生された六つの推定ＡｃＭＮＰＶ／ｐＶＬ１３９２／ｓＫＫ−０クローンが試験された。ただ一つのＡｃＭＮＰＶ／ｐＶＬ１３９２／ｓＫＫ−０ＣＯＮＯ−Ｃが異常な効果を示した。生物学的観察で、ＣＯＮＯ−Ｃウイルスのみが予期された物理特性のすべてを持つｓＫＫ−０遺伝子を運んでいることを示した実施例５に記載の物理分析が確認された。ＡｃＭＮＰＶ／ｐＶＬ１３９２／ｓＫＫ−０ＣＯＮＯ−Ｃの生物学的特性を特徴付けるさらなる注射アッセイはウイルスの使い古しの貯蔵物を用いて実施された。初期第４虫齢Ｈ．ビレセンス幼虫に対するＡｃＭＮＰＶ／ｐＶＬ１３９２／ｓＫＫ−０ＣＯＮＯ−ＣおよびＡｃＭＮＰＶ／ｐＶＬ１３９２／ｌａｃＺウイルス間の生物学的効力を比較したデータが表IIIに示されている。処置後７２時間では（７２ＨＡＴ）、ＡｃＭＮＰＶ／ｐＶＬ１３９２／ｓＫＫ−０ＣＯＮＯ− Ｃで処置した４／１１の幼虫は全または部分的弛緩性麻痺を示した。「完全に麻痺した」と分類された幼虫は死にかけていた：立つこと、再転回または歩行ができず、刺激に応答して口部分および把握器の非常に弱い動きのみしかできない。「部分的に麻痺した」幼虫は体の中部および後部の局部的麻痺を示したが、頭部および口部分を含む前部領域は刺激に対して正常の応答ができた。これらの幼虫はその背部上に置いても再転回でき、動きは遅くて協調性は悪いが限られた運動は可能であった。９６ＨＡＴではＡｃＭＮＰＶ／ｐＶＬ１３９２／ｓＫＫ−０ＣＯＮＯ−Ｃウイルスで処置したすべての幼虫は死ぬかまたは異常な総体的症状を示した。対照的に、ＡｃＭＮＰＶ／ｐＶＬ１３９２／ｌａｃＺ対照ウイルスが注射されたすべての幼虫は９６ＨＡＴでは生存しており、正常に行動していた；これらの幼虫の１／１０は１２０ＨＡＴで死亡しており，６／１０の幼虫は１４４ＨＡＴで死亡した。ｌａｃＺ遺伝子を運んでいるＡｃＭＮＰＶ／ｐＶＬ１３９２誘導体は野生型ウイルスより死亡させる速度が遅かった。典型的には、野生型ＡｃＭＮＰＶは１２０ＨＡＴおよび越えた時点で著しく死亡率が高くなり始めた。従って、ＡｃＭＮＰＶ／ｐＶＬ１３９２／ｓＫＫ−０ＣＯＮＯ−Ｃ構築物はＡｃＭＮＰＶ野生型およびＡｃＭＮＰＶ／ｐＶＬ１３９２／ｌａｃＺ対照ウイルスの両方よりも早い作用速度を示し、殺虫効果が促進されている。実施例７ｐＡｃＵＷ２１／ｓＫＫ−０組換え体転移ベクターの組立経口で感染性であり、それ故用量応答効果が現実的に評価でき、および作物防護効果を評価するためのポリヘドリン⁺（吸蔵された）組換え体ＡｃＭＮＰＶ／ｓＫＫ−０誘導体を製造する目的で、ｐＡｃＵＷ２１転移ベクター（ＡＭＳＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＵＫ）Ｌｔｄ．）を使用することを最初に選択した。この転移ベクターは、強力な後期ｐ１０プロモーターの制御下での昆虫選択的毒素遺伝子の発現のため、加速された生物学的効果の引渡しができる組換え体ウイルスの製造に従来成功的に使用された転移ベクターｐＡｃＵＷ２ｂ（Ｓｔｅｗａｒｔｅｔａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ３５２８５−８８；ＭｃＣｕｔｃｈｅｎｅｔａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ９８４８−８５２）の単純な誘導体である（ＰｏｓｓｅｅＲ．Ｄ．私信）。ｐＡｃＵＷ２１内への導入に適したｓＫＫ−０挿入物を放出させるため、ｐＶＬ１３９２／ｓＫＫ−０＃２．２プラスミドＤＮＡの２０μｇのアリコートをＥｃｏＲＩおよびＢｇｌII制限酵素で消化した。平行して、ｐＡｃＵＷ２１転移ベクターＤＮＡの１０μｇのアリコートを同様に処理した。制限消化物は次に０．５μｇ／ｍｌのエチジウムブロミドを含む分取１％アガロース／トリス−酢酸電気泳動ゲルで泳動した。放出されたｓＫＫ−０挿入物（約２８２塩基対）および直線状化ベクターＤＮＡはＵＶ照射下でゲルから切り出した。それらはシリコン化ガラスウールを通した遠心分離およびエタノール沈澱により回収された。単離されたｓＫＫ−０挿入物のアリコートおよびｐＡｃＵＷ２１ベクターＤＮＡ断片を適当な緩衝液条件下（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．（１９８９）「ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ」，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ）、Ｔ４リガーゼとともに混合した。ライゲーション混合物は常法により（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．上記文献）コンピテントＤＨ５α細胞を形質転換するのに使用された。子孫形質転換体は１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬ寒天プレート上で一夜増殖させることにより選別した。プラスミドＤＮＡは六つの推定組換え体コロニーから製造された。これらのＤＮＡの制限分析は、６個すべてがｐＡｃＵＷ２１誘導体であり、ｓＫＫ−０に対して予期される大きさおよび特色を持つ挿入物を含んでいることを示唆した。上記六つの組換え体の二つ（＃Ａ１＆＃Ａ２）に存在する挿入物の配列はＳｅｑｕｅｎａｓｅ^TM（ＵＳＢ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ）キットおよびｓＫＫ−０挿入物にハイブリダイズするように設計された二つの合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いてチェックされた。両方のクローンの挿入物の配列はクローン化されたｓＫＫ−０に予期されるものと意図した様式で正確に一致した。ＡｃＭＮＰＶ．ｐ１０プロモーターの転写制御下の遺伝子ｓＫＫ−０を含む転移ベクターｐＡｃＵＷ２１の誘導体である組換え体＃Ａ１が続いての研究のために選択された。この組換え体転移ベクターはまた天然のポリヘドリンプロモーターの制御下にある無傷のＡｃＭＮＰＶポリヘドリン遺伝子も持っている。実施例８ｐ１０プロモーター／ｓＫＫ−０遺伝子発現ユニットを運ぶ組換え体（ポリヘドリンプラス）ＡｃＭＮＰＶの発生標準バキュロウイルス技術（Ｋｉｎｇ＆Ｐｏｓｓｅｅ（１９９２）「ＴｈｅＢａｃｃｕｌｏｖｉｒｕｓＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＳｙｓｔｅｍ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＧｕｉｄｅ」（Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ））をｐ１０プロモーターの転写制御下にｓＫＫ−０遺伝子を運んでいるポリヘドリン⁺（吸蔵された）ＡｃＭＮＰＶ誘導体を生成するために使用した。これはＳｆ２１細胞と約２００ｎｇのＳａｕＩ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ）直線状化ＡｃＭＮＰＶ．ｌａｃＺ（Ｐｏｓｓｅｅ＆Ｈｏｗａｒｄ（１９８７）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１５１０２３３−１０２４８）および１μｇのｐＡｃＵＷ２１／ｓＫＫ−０組換え体＃Ａ１ＤＮＡとのコトランスフェクションにより達成された。組換え体ＡｃＭＮＰＶ／ｓＫＫ−０ウイルスの候補はＳｆ２１細胞単層上のプラーク精製（Ｋｉｎｇ＆Ｐｏｓｓｅｅ（１９９２）上記文献）により選択され、最初にウイルスがＸ−ｇａｌ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ、ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ，ＮｅｗＹｏｒｋ）を代謝できないこと、そして顕微鏡により判断されるように多角体（ウイルス吸蔵体）を産生できることをスクリーニングした。６個のそのようなｌａｃＺ−ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ／ｐＡｃＵＷ２１／ｓＫＫ−０＃１、ＡｃＭＮＰＶ／ｐＡｃＵＷ２１／ｓＫＫ−０＃２、ＡｃＭＮＰＶ／ｐＡｃＵＷ２１／ｓＫＫ−０＃３、ＡｃＭＮＰＶ／ｐＡｃＵＷ２１／ｓＫＫ−０＃４、ＡｃＭＮＰＶ／ｐＡｃＵＷ２１／ｓＫＫ−０＃５およびＡｃＭＮＰＶ／ｐＡｃＵＷ２１／ｓＫＫ−０＃６）が拾い上げられた。それらを均一に精製するため、およびそれらがβガラクトシダーゼを合成できないこと、およびそれが多角体を生成することができることを確認するために、Ｓｆ２１細胞単層上で上記６個のクローンを用いて第二のプラークアッセイを実施した。実施例５に記載したように各々の精製されたウイルスの小規模な培養物が作られた。これらのウイルス貯蔵物の各々のアリコートでバイオアッセイが行われた（実施例９参照）。相等しいアリコートを用いて物理分析のためのウイルスＤＮＡの少量の試料を調製した。サザンブロット分析が予期されるＡｃＭＮＰＶ／ｐＡｃＵＷ２１／ｓＫＫ−０ウイルスＤＮＡに対して実施された。これらのＤＮＡは（ａ）ＨｉｎｄIIIおよび（ｂ）ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで処理され、１％アガロースゲルによる電気泳動により分画され、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎフィルターに移され、そして単離されたランダムプライムドα³²Ｐ−ｄＣＴＰ標識されたｓＫＫ−０プローブでハイブリダイズされた。これらの実験によりウイルスＡｃＭＮＰＶ／ｐＡｃＵＷ２１／ｓＫＫ−０＃１、ＡｃＭＮＰＶ／ｐＡｃＵＷ２１／ｓＫＫ−０＃４およびＡｃＭＮＰＶ／ｐＡｃＵＷ２１／ｓＫＫ−０＃５が各々すべての予期される物理特性を持つｓＫＫ−０遺伝子を含み、βガラクトシダーゼ遺伝子を欠いており、そしてポリヘドリン⁺ウイルス粒子を産生することが確認された。ウイルスＡｃＭＮＰＶ／ｐＡｃＵＷ２１／ｓＫＫ−０＃１がすべての以下の研究のために選択された。実施例９予期されたＡｃＭＮＰＶ／ｐＡｃＵＷ２１／ｓＫＫ−０組換え体ウイルスのバイオアッセイ推定ＡｃＭＮＰＶ／ｐＡｃＵＷ２１／ｓＫＫ−０ウイルスの生物学的特性はＨ．ビレセンス（Ｈ．ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）に対する一連の注射および経口投薬研究により評価された。精製された非吸蔵ウイルス貯蔵物を用いる注射アッセイは実施例６に概説した方法を用いて実施された。精製された多角体による経口投薬試験はＨｕｇｈｅｓおよびＷｏｏｄ（（１９８１）Ｊ．Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒ．Ｐａｔｈｏｌ．３７，５４）による新生幼虫のための小滴摂取法の改良版を用いて行われた。実施例８に記載したように生成させた６個の推定ＡｃＭＮＰＶ／ｐＡｃＵＷ２１／ｓＫＫ−０ウイルスでの予備的注射研究では三つのクローン（ＡｃＭＮＰＶ／ｐＡｃＵＷ２１／ｓＫＫ−０＃１、＃４および＃５）のみがｓＫＫ−０遺伝子を運んでいることが示された。これらのウイルスで処理された幼虫のいくつかはＡｃＭＮＰＶ／ｐＶＬ１３９２／ｓＫＫ−０ＣＯＮＯ−Ｃウイルスで処理された昆虫で観察されたものと最初は同じように思える異常な症候を示した。しかしながら、ＡｃＭＮＰＶ／ｐＣＵＷ２１／ｓＫＫ−０＃１についてのその後の研究により、これらの「異常」効果は一般的には明白ではなくて特別に衰弱させてはおらず、ＡｃＭＮＰＶ／ｐＡｃＵＷ２１／ｓＫＫ−０＃１は行動の速度または殺虫効果に関しては野生型ＡｃＭＮＰＶに優る顕著な利点を示さなかった。ＡｃＭＮＰＶ／ｐＡｃＵＷ２１／ｓＫＫ−０＃１および野生型ＡｃＭＮＰＶの生物学的効果を比較する経口投薬研究から前記の観察が確認された。実施例１０組換え体ＡｃＭＮＰＶの生成のためのＡｃＵＷ１−ＰＨＤＮＡの製造ｓＫＫ−０遺伝子がｐ１０プロモーターから発現されるポリヘドリンプラスＡｃＭＮＰＶ誘導体（実施例７、８＆９）と比較した場合のｓＫＫ−０遺伝子がポリヘドリンプロモーターから発現されるポリヘドリンマイナスＡｃＭＮＰＶ誘導体（実施例４、５＆６）の異なった振る舞いに鑑みて、改良された殺虫効果がｐ１０プロモーター／ｓＫＫ−０発現ユニットではなくポリヘドリンプロモーター／ｓＫＫ−０発現ユニットで達成できているかどうかを確立するためにｓＫＫ− ０遺伝子がポリヘドリンプロモーターから発現されるポリヘドリンプラス誘導体を構築することを決定した。ポリヘドリンプロモーター／ｓＫＫ−０発現ユニットの受容体として選択されたウイルスはＡｃＵＷ１−ＰＨ（Ｗｅｙｅｒｅｔａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７１１５２５−１５３４および図６参照）であった。このウイルスは野生型ＡｃＭＮＰＶにおいてｐ１０遺伝子で占められている座位にｐ１０プロモーター／ポリヘドリン遺伝子発現ユニットを、そして通常ポリヘドリン遺伝子で占められている位置にポリヘドリンプロモーター／ｌａｃＺインジケーター遺伝子発現ユニットを運んでいる。従って、それはＡｃＭＮＰＶ吸蔵体を運ぶ細胞を含み、（Ｘ−Ｇａｌ指示薬（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ、ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ，ＮｅｗＹｏｒｋ）の存在下で青に染色される）Ｓｆ２１細胞単層上でプラークを形成するであろう。ポリヘドリンプロモーター／ｌａｃＺ発現ユニットをｐＶＬ１３９２／ｓＫＫ−０＃２．２組換え体転移ベクターのポリヘドリンプロモーター／ｓＫＫ−０発現ユニットへの置き換えはポリヘドリンプロモーター／ｓＫＫ−０遺伝子発現ユニットを運ぶポリヘドリンプラスＡｃＭＮＰＶ誘導体を製造する都合の良い手段であろうことが予想される。未知の力価のＡｃＵＷ１−ＰＨウイルス貯蔵物はＲ．Ｄ．Ｐｏｓｓｅｅ博士（ＮＥＲＣＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙａｎｄＥｎｖｉｒｏｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ＭａｎｓｆｉｅｌｄＲｏａｄ，Ｏｘｆｏｒｄ）から親切にも提供された。２５ｃｍ²の組織培養フラスコ（Ｂｉｂｂｙ，Ｓｔｏｎｅ，Ｓｔａｆｆｓ．）中、４ｍｌのＴＣ１００／１０％ウシ胎児血清培地（両方ともＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから）に三つのロットの１．５ｘ１０⁶ Ｓｆ２１細胞を播種し、２８℃で一夜インキュベートし、次に貯蔵ウイルスの５０μｌ、５μｌおよび１／１０希釈液の５μｌを各々一つのフラスコに加え、さらに６日間２８℃でインキュベーションを続けることによりこのウイルスの小規模の増殖培養物が製造された。これらの小規模の増殖物は標準プラークアッセイ技術（Ｋｉｎｇ＆Ｐｏｓｓｅｅ（１９９２）「ＴｈｅＢａｃｃｕｌｏｖｉｒｕｓＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＳｙｓｔｅｍ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＧｕｉｄｅ」（Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ））を用いて滴定した。得られたすべてのプラークは封入体を含み、Ｘ−Ｇａｌの存在下で青に染色された。最初に５０μｌを加えた培養物から産生されたウイルス貯蔵物は２．３ｘ１０⁷ｐｆｕ／ｍｌの力価を持っており、より大きなＡｃＵＷ１−ＰＨの２００ｍｌスピナー貯蔵培養物の製造に使用され、それからウイルスの精製貯蔵物およびその後のウイルスＤＮＡが常法により製造された（Ｋｉｎｇ＆Ｐｏｓｓｅｅ（１９９２）上記文献＆Ｐｏｓｓｅｅ＆Ｈｏｗａｒｄ（１９８７）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１５１０２３３−１０２４８）。直線状化ＡｃＵＷ１−ＰＨＤＮＡの貯蔵物は３μｇのウイルスＤＮＡを使用説明書に従ってＳａｕｌ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）で消化することにより（この酵素はβガラクトシダーゼ遺伝子内のみを切断し、ＡｃＭＮＰＶ．ｌａｃＺのようにこのことは組換え体ＡｃＭＮＰＶ子孫の製造および検出を容易にするであろう方法であるものと予測された、Ｋｉｎｇ＆Ｐｏｓｓｅｅ（１９９２）上記文献）製造された。実施例１１ポリヘドリンプロモーター／ｓＫＫ−０遺伝子発現ユニットを運ぶ組換え体（ポリヘドリンプラス）ＡｃＭＮＰＶの生成標準バキュロウイルス技術（Ｋｉｎｇ＆Ｐｏｓｓｅｅ（１９９２）上記文献）を用いてポリヘドリンプロモーターの転写制御下のｓＫＫ−０を運び、活性ポリヘドリン遺伝子を持つ組換え体ＡｃＭＮＰＶウイルスが、ｐＶＬ１３９２／ｓＫＫ−０＃２．２からのポリヘドリンプロモーター／ｓＫＫ−０発現モジュールの受容体としてＳａｕＩ線状化ＡｃＵＷ１−ＰＨウイルスＤＮＡを使用して生成された。このことはＳｆ２１細胞と、実施例１０に記載したように製造した２００ｎｇのＳａｕＩ線状化ＡｃＵＷ１−ＰＨＤＮＡおよび１μｇのｐＶＬ１３９２／ｓＫＫ−０＃２．２ＤＮＡとをコトランスフェクションにより達成された。プラークアッセイ技術を用い（ウイルスはＳｆ２１細胞単層培養でプラークを発生する）、Ｘ−ｇａｌ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ、ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ，ＮｅｗＹｏｒｋ）を代謝できる能力を欠くが、吸蔵体（多角体）を産生する能力は保持しているウイルスを最初にスクリーニングすることにより組換え体ウイルスを選択した。六つのそのようなｌａｃＺ−ウイルス（ＡｃＵＷ１−ＰＨ／ＫＫＯ＃１、ＡｃＵＷ１−ＰＨ／ＫＫＯ＃２、ＡｃＵＷ１−ＰＨ／ＫＫＯ＃３、ＡｃＵＷ１−ＰＨ／ＫＫＯ＃４、ＡｃＵＷ１−ＰＨ／ＫＫＯ＃５、ＡｃＵＷ１−ＰＨ／ＫＫＯ＃６）を拾い上げた。均一に精製するため、およびそれらがβガラクトシダーゼを合成できないこと、およびそれらが多角体を生成できることを確認するために、Ｓｆ２１上で上記６個のクローンの各々に対して第二のプラークアッセイを実施した。実施例５に記載したように各々の精製されたウイルスの小規模な培養物が作られた。これらのウイルス貯蔵物の各々のアリコートでバイオアッセイが行われた（実施例１２参照）。平行して、小規模のウイルス貯蔵物のアリコートを使用して、物理分析のためのウイルスＤＮＡの少量の試料を調製した。サザンブロット分析が予期されるＡｃＵＷ１−ＰＨ／ｐＶＬ１３９２／ｓＫＫ −０ウイルスＤＮＡに対して実施された。これらのＤＮＡはＢｇｌIIおよびＢｓｃＩ（ＣｌａＩのイソシゾマー）で処理され、１．４％アガロースゲルによる電気泳動により分画され、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎフィルターに移され、そして単離されたランダムプライムドα³²Ｐ−ｄＣＴＰ標識されたｓＫＫ−０プローブでハイブリダイズされた。これらの研究により、ウイルスＡｃＵＷ１−ＰＨ／ｓＫＫ−０＃２、ＡｃＵＷ１−ＰＨ／ｓＫＫ−０＃４、ＡｃＵＷ１−ＰＨ／ｓＫＫ−０＃５およびＡｃＵＷ１−ＰＨ／ｓＫＫ−０＃６が各々すべての予期される物理特性を持つｓＫＫ−０遺伝子を含み、βガラクトシダーゼ遺伝子を欠いており、そしてポリヘドリン⁺ウイルス粒子を産生することが確認された。ＡｃＵＷ１−ＰＨ／ｓＫＫ−０＃２ウイルスが以後の研究のために選択された。実施例１２予期されたＡｃＵＷ１−ＰＨ／ｐＶＬ１３９２／ｓＫＫ−０組換え体ウイルスのバイオアッセイ推定ＡｃＵＷ１−ＰＨ／ｐＶＬ１３９２／ｓＫＫ−０組換え体ウイルスの生物学的特性はヘリオチスビレセンス（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）幼虫に対する一連の注射および経口投薬研究により評価された。精製された非吸蔵ウイルス貯蔵物を用いる注射アッセイは実施例６に記載した方法を用いて実施された。精製された多角体による経口投薬試験は実施例９に記載の小滴摂取法の改良版を用いて行われた。実施例１１に記載したように生成させた６個の推定ＡｃＵＷ１−ＰＨ／ｐＶＬ１３９２／ｓＫＫ−０ウイルスの生物学的活性を比較した予備的注射研究ではウイルスＡｃＵＷ１−ＰＨ／ｓＫＫ−０＃２、ＡｃＵＷ１−ＰＨ／ｓＫＫ−０＃４、ＡｃＵＷ１−ＰＨ／ｓＫＫ−０＃５およびＡｃＵＷ１−ＰＨ／ｓＫＫ− ０＃６のみが野生型ウイルスと比較して促進された殺虫効果を持っているようであることが示された。ＡｃＵＷ１−ＰＨ／ｐＶＬ１３９２／ｓＫＫ−０＃２がスケールアップおよびさらなる特性付けに選択された。注射アッセイのデータはＡｃＵＷ１−ＰＨ／ｐＶＬ１３９２／ｓＫＫ−０＃２ウイルスで処理された幼虫は７２ＨＡＴから先において異常な総体的症状が現れることを示している（表IV）。９６ＨＡＴで幼虫の大多数が死滅し、生き残ったものも麻痺している。１４４ＨＡＴまでにすべての幼虫が死滅した。対照的に、野生型ＡｃＭＮＰＶで処理した幼虫は５０％の幼虫が死ぬ１２０ＨＡＴまで異常な効果は観察されず；野生型ＡｃＭＮＰＶに対し１４４ＨＡＴで１００％の死亡率が記録された。ＡｃＵＷ１−ＰＨ／ｐＶＬ１３９２／ｓＫＫ−０および野生型ＡｃＭＮＰＶの生物学的効力を比較するため、精製された多角体を用いて一連の経口投薬研究が実施された。すべての場合において、ＡｃＵＷ１−ＰＨ／ｐＶＬ１３９２／ｓＫＫ−０＃２は野生型に比べて殺虫の速度が有意に速く、それ故殺虫効果は改良されていることが示された。ＡｃＵＷ１−ＰＨ／ｐＶＬ１３９２／ｓＫＫ−０ウイルスで処理した幼虫は麻痺症状および死亡を７２ＨＡＴから先で示し始めた（表Ｖ）。用量応答データのプロビット分析で、ＡｃＵＷ１−ＰＨ／ｐＶＬ１３９２／ｓＫＫ−０＃２の殺虫速度は野生型ＡｃＭＮＰＶの速度より７２および９６ＨＡＴで有意に速かったが、１２０ＨＡＴまでに野生型ウイルスが追いついていることが確認された。本発明のバキュロウイルスは本分野の既知のまたは開発された技術を用いて昆虫または昆虫の存在部位へ適用することができるであろう。好適には、バキュロウイルスは処方される。任意の既知のまたは開発された処方が適宜使用することができる。処方は殺虫の速度を至適から最大にするようにしなければならず、好適にはｕ．ｖ．放射からバキュロウイルスを保護する。バキュロウイルスは、空中に（特に森林害虫に対して）、農作物にはブーム型スプレイ器で、主として果実および野菜作物には高圧装置で適用することができる。一般的に粉末または顆粒処方よりもスプレーで適用され、湿潤可能な散剤は好適な適用手段である。補助剤（例えば、スプリーダーのような表面活性剤）、固着剤および乳化剤、日光防護剤、緩衝剤および味覚促進剤もまた添加してもよい。本発明に従って相同的組換えが起こった事実は、常法を用いて確かめることができる。特に、ウイルスゲノム中での正確な変化は例えばエンドヌクレアーゼ制限なたは配列決定を用いて調べることができる。宿主範囲の変化もまた既知のバイオアッセイ法を用いて評価できる。ゲノムマーカーを使用してのウイルス遺伝子組立の追跡もまた可能である。操作されたウイルスおよび他のウイルス間の遺伝子交換の最初の研究、または宿主細胞ＤＮＡの取得さえも実験室内で行わなければならず、その中で幼虫の群を野生型および組換え体ウイルスで感染させる。追加の幼虫は継続する世代の代わりとして加えることができる。その次の研究は抑制された野外試験により行うことができる。そのような試験において、幼虫は野外に放つ前に実験室内で感染させ、野外では四六時中ウイルス集団がモニターされた。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９６年２月１６日【補正内容】請求の範囲１．ポリヘドリン遺伝子および殺虫性蛋白質を発現する非相同遺伝子を含むゲノムを持つ、昆虫制御剤として使用するための組換え体バキュロウイルスであって、ポリヘドリン遺伝子および非相同遺伝子が同一のプロモーターの制御下にはなく、バキュロウイルスのゲノムの少なくとも１０％がポリヘドリン遺伝子および非相同遺伝子を分離して、生存可能である野生型バキュロウイルスとの組換えにより産生されるウイルスの子孫がポリヘドリン遺伝子および非相同遺伝子の両方の発現を保持していないような、上記の組換え体バキュロウイルス。２．野生型ウイルスのゲノムの領域と相同的である少なくとも一つのゲノムの領域がポリヘドリン遺伝子および非相同遺伝子間に存在する請求項１に記載の組換え体バキュロウイルス。３．ポリヘドリン遺伝子および非相同遺伝子がゲノムの二つの領域間に位置され、その領域は野生型ウイルスのゲノムの領域と相同的であり、およびこの位置は野生型ウイルス中の相同的領域間に存在する必須遺伝子を欠いている請求項１および２のいずれかに記載の組換え体バキュロウイルス。４．ポリヘドリン遺伝子がｐ１０プロモーターの制御下にある請求項１から３のいずれか１項に記載の組換え体バキュロウイルス。５．非相同遺伝子がポリヘドリンプロモーターの制御下にある前記任意の請求項に記載の組換え体バキュロウイルス。６．ゲノムがｐ１０遺伝子を無能力化または欠損するように改変されている前記任意の請求項に記載の組換え体バキュロウイルス。７．分離がゲノムの約１２％である前記任意の請求項に記載の組換え体バキュロウイルス。８．ポリヘドリン遺伝子および非相同遺伝子が少なくとも１３キロ塩基対によって分離されている前記任意の請求項に記載の組換え体バキュロウイルス。９．分離が約１５キロ塩基対である請求項８に記載の組換え体バキュロウイルス。１０．図６ｂに示された組換え体に匹敵し得るゲノム構成および特性を持つ前記任意の請求項に記載の組換え体バキュロウイルス。１１．前記の請求項のいずれか１項に従ったバキュロウイルス組換え体から誘導される子孫バキュロウイルス。１２．組換え体ウイルスおよび野生型ウイルスの間の組換えにより、ポリヘドリン遺伝子および非相同遺伝子の両方の発現を保持した生存可能なウイルス子孫の産生を防止または最少にするための前記任意の請求項に記載の組換え体バキュロウイルスの使用。１３．請求項１から１１のいずれか１項に記載の組換え体バキュロウイルスで害虫またはそのいる場所を処置することを含む有害昆虫を駆除するための方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．ポリヘドリン遺伝子および殺虫性蛋白質を発現する非相同遺伝子を含むゲノムを持つ、昆虫制御剤として使用するための組換え体バキュロウイルスであって、ポリヘドリン遺伝子および非相同遺伝子が同一のプロモーターの制御下にはなく、生存可能である野生型バキュロウイルスとの組換えにより産生されるウイルスの子孫がポリヘドリン遺伝子および非相同遺伝子の両方の発現を保持しないようにゲノム上に位置されている上記の組換え体バキュロウイルス。２．野生型ウイルスのゲノムの領域と相同的である少なくとも一つのゲノムの領域がポリヘドリン遺伝子および非相同遺伝子間に存在する請求項１に記載の組換え体バキュロウイルス。３．ポリヘドリン遺伝子および非相同遺伝子がゲノムの二つの領域間に位置され、その領域は野生型ウイルスのゲノムの領域と相同的であり、およびこの位置は野生型ウイルス中の相同的領域間に存在する必須遺伝子を欠いている請求項１および２のいずれかに記載の組換え体バキュロウイルス。４．ポリヘドリン遺伝子がｐ１０プロモーターの制御下にある請求項１から３のいずれか１項に記載の組換え体バキュロウイルス。５．非相同遺伝子がポリヘドリンプロモーターの制御下にある前記任意の請求項に記載の組換え体バキュロウイルス。６．ゲノムがｐ１０遺伝子を無能力化または欠損するように改変されている前記任意の請求項に記載の組換え体バキュロウイルス。７．少なくとも１０％のバキュロウイルスのゲノムがポリヘドリン遺伝子および非相同遺伝子を分離している前記任意の請求項に記載の組換え体バキュロウイルス。８．分離がゲノムの約１２％である請求項７に記載の組換え体バキュロウイルス。９．ポリヘドリン遺伝子および非相同遺伝子が少なくとも１３キロ塩基対によって分離されている前記任意の請求項に記載の組換え体バキュロウイルス。１０．分離が約１５キロ塩基対である請求項９に記載の組換え体バキュロウイルス。１１．図６ｂに示された組換え体に匹敵し得るゲノム構成および特性を持つ前記任意の請求項に記載の組換え体バキュロウイルス。１２．前記の請求項のいずれか１項に従ったバキュロウイルス組換え体から誘導される子孫バキュロウイルス。１３．組換え体ウイルスおよび野生型ウイルスの間の組換えにより、ポリヘドリン遺伝子および非相同遺伝子の両方の発現を保持した生存可能なウイルス子孫の産生を防止または最少にするための前記任意の請求項に記載の組換え体バキュロウイルスの使用。１４．請求項１から１２のいずれか１項に記載の組換え体バキュロウイルスで害虫またはそのいる場所を処置することを含む有害昆虫を駆除するための方法。