CN1216066A - 真核生物中基因表达的调节 - Google Patents

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Abstract

调节真核活性基因的方法,它包括用转化盒转化细胞,该转化盒表达调节真核基因或其产物的调制基因产物和调节所述调制基因或其产物的另一基因产物,所述基因、调制基因和另外的基因之中的两种的启动子选自相同组织或补充组织的诱导型启动子和发育启动子。表达芽孢杆菌RNA酶(即解淀粉芽孢杆菌的RNA酶)的致死基因被置于组织特异性启动子的控制之下,该组织特异性启动子例如有得自辐射松的PrMADS1、2或3的那些或者得自巨桉的EGM1、2或3的那些。相同的组织特异性启动子被用于表达laclq基因,芽孢杆菌RNA酶的阻抑蛋白(芽孢杆菌RNA酶抑制剂)被包括lac操纵子的修饰了的35sRNACaMV启动子启动。该转化盒被用于转化植物细胞使之再生成为在靶组织内表达该芽孢杆菌RNA酶的植物,具有改进的特异性和减少的启动子渗漏。

Description

真核生物中基因表达的调节
本发明涉及真核生物中基因表达的调节方法。
本发明特别而不是唯独应用于靶器官中高度特异性表达的调节或者植物功能的调节，所以为了阐述起见将参考这类应用。然而，应懂得，本发明可用于其它用途，例如其它真核基因表达的调节如靶器官中特异性表达的调节以及酵母和动物的功能调节。
包括植物、动物和低级有机体如酵母的商业上有益的真核有机体经常转换生长源成为非商品化结构，或者表达经济有害的其它基因。引入增强商用价值的特性将有益于其它商品化种。
例如，林区树繁殖结构的发育代表树源的一个重要负担，该繁殖成果有损树林生长。成熟树木的种子产生下木苗，必须定期除去下木苗以免它们与树木竞争土壤资源并将森林火灾的危险性减到最小。
澳大利亚专利说明书No.86224/91公开了在林场增强营养生长的方法。该公开例举了一种方法，其中有关繁殖结构特异性基因的大致组织特异性启动子的选择基于开花调节剂赤霉素A4/7的诱导，该基因产物的早期出现、以及雄性和雌性再生芽中表达的特异性。分离并鉴定了该基因和启动子，通过将包括该基因的组织特异性启动子的一部分基因与RNA酶的结构基因融合而修饰该基因。
然而该转化体却缺乏繁殖结构，启动子渗漏倾向于引起非靶组织中致死RNA酶积累量较低，导致生长减少于是减小商品化可能性。
通常将基因表达启动子看作下列三大类之一：在所有组织中连续表达基因的组成型启动子；在特定组织或在特定阶段的组织中表达基因的发育启动子；响应代谢物、外源化合物或其它刺激因素如光、热或压力的存在而开启或关闭表达的诱导型启动子。
已知在大体上花组织特异性启动子控制下致死基因产物如芽孢杆菌RNA酶(Barnase)的表达可通过该基因产物的抑制剂(B*或“芽孢杆菌RNA酶抑制剂(Barstar)”)的组成型共表达而变得更为组织特异性。当抑制作用不足以抑制基因产物的作用时靶细胞中就会出现被抑制基因产物的作用，以及该启动子的非特异性的程度或者启动子渗漏引起的非靶细胞芽孢杆菌RNA酶活性基本上被抑制了。
然而，插入的启动子通常是易渗漏的，且较优的强启动子可能在不充分的抑制以防非靶细胞死亡的其它组织中有害地表达，这将不利地影响商业上重要的非靶组织。启动子渗漏不能预测，例如，若转化体如树首次开花前有一段长生长期，则非靶细胞中形成的基因产物活性将消除或减小开花抑制的优势。通常优选的强启动子限制启动子选择。
本发明旨在基本上减轻上述缺点的至少一个并提供应用中可靠且有效的、调节真核基因表达的方法。本发明的其它目的和优点将在下文中变得明了。
考虑前述和其它目的，本发明的一方面主要在于调节真核活性基因的方法，它包括用构建物转化细胞，该构建物表达调节真核基因或其产物的调制基因产物以及调节所述调制基因或其产物的另一基因产物，所述基因、调制基因和另外的基因之中的两个的启动子选自相同组织或补充组织的诱导型启动子和发育启动子。
该真核活性基因可以包括目的有机体的天然基因或者可以包括引入的基因。该基因可被它的天然启动子启动或者包括该基因的异源构建物。该真核活性基因可编码任意选择的细胞功能的表达产物。例如该基因可编码包括酶的活性多肽，其中的酶例如有对靶组织有致死效果的RNA酶或者赋予根组织以线虫抗性的过氧化物酶。该基因可编码能使下列物质的产生途径得以实现的产物：颜料和染料如花青苷，杀虫化合物如Bti毒素，或者香料。
在诱导型启动子控制下报道基因的表达可显示靶组织中靶细胞的准确位置而不会有任何至周围细胞的渗漏。这将对于研究病原体和昆虫与植物细胞之间相互作用的基本步骤很有用。GUS,Luc，花青苷基因和GFP可能包括报道基因的候选物。可在商品化之前对微量繁殖物质进行比色分析和荧光分析。
如本文应用的，“致死基因”这种表述表示编码肽或反义或核酶或其它非肽的一个或多个基因，该致死基因所编码的物质显著地破坏靶细胞于是导致靶细胞死亡。本发明将在下文参照包括真核有效致死基因的实施方案来描述。
该致死基因可以是编码肽或反义或核酶的任意基因或基因的组合，它们明显地破坏靶细胞于是导致靶细胞死亡。例如，该致死基因可选自编码下列酶的那些基因：RNA酶如得自解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)的芽孢杆菌RNA酶，得自A.aryzae的RNA酶T1，牛RNA酶A、得自大肠杆菌(E.coli)的RNA酶Ⅰ和RNA酶H以及植物RNA酶类(S蛋白系列)。备择地，该致死基因可选自核酸酶如限制酶系列，包括下列酶的酶：葡聚糖酶例如1-4-β-葡聚糖酶或1-3-葡聚糖酶，泛素，酸性焦磷酸酶以及植物细胞壁合成的抑制剂。
优选地，该致死基因是RNA酶。可构建嵌合致死基因，它包括在基因的上游(启动子)序列控制下编码解淀粉芽孢杆菌的芽孢杆菌RNA酶的区，其中所述基因是在发育早期植物繁殖器官的雄性和雌性部分中表达的。
在靶细胞中病原体-宿主植物最早的相互作用期间可实现靶细胞中致死基因表达的限制。例如，在受攻击细胞内芽孢杆菌RNA酶或者其它毒素如β-葡聚糖酶或壳多糖酶的表达将导致这些细胞的坏死，这就会防止感染向周围细胞扩散。该人工过敏性反应方案中的关键步骤是封阻周围细胞中可能的启动子渗漏。
细菌水杨酸盐-羟基化物基因的表达可减小水杨酸的量，在所有植物中该水杨酸负责在病原体诱导的启动子控制下盒的系统表达。例如，病原体诱导的启动子可从大麦分离，它在用粉状霉Eresifygraminis(Mouradov等，1993)接种后被强烈地表达。该基因的基因组克隆已被分离和鉴定(Mouradov等，1994)。该启动子区可融合至包括致死基因或其它功能基因的盒。
与其它植物MADS-盒基因同源的、被称为EGM1、3&2的三种桉树基因已被克隆并测序。进行了系统发育分析以检查该桉树基因与其它MADS-盒基因的相关性。结果表明，EGM2可能与花瓣和雄蕊发育中涉及的GLOBOSA MADS-盒基因组是同源的而EGM3和EGM1二者都落入MADS-盒基因的AGL2组。这些基因最常在花内三种轮生体(花瓣、雄蕊和心皮)中表达。
已鉴定了所有三种EGM基因的表达模式。在任何营养组织中都没有检测到这些基因的表达。EGM1基因是在桉树花的花瓣、雄蕊和心皮中表达的。EGM3是在花的分生组织和萼片中表达的。EGM2是在花瓣和雄蕊中表达的。已由Southern分析法证实EGM3基因和EGM2基因是单基因。EGM1也好象是单基因。
所有这三种基因的启动子区都可用于不育性基因构建物，它们可从桉树基因组文库中分离并被人工改造为致死基因构建物。
该真核活性基因、调制基因和另外的基因及其各自的启动子可包括转化盒，应用该转化盒可通过任意已知方法转化靶有机体。结合选择该真核活性基因、调制基因和另外的基因的启动子使得该真核活性基因的表达特异性被提高。例如，真核活性基因可通过诱导型或发育型启动子启动，而调制基因则可是组成型的。于是，甚至弱启动子的特异性和效用可通过运用与用于启动真核活性基因的启动子具有相同特异性的启动子来启动另外的基因而提高。
备择地，真核活性基因的组织特异性启动子可通过组成性启动的抑制基因产物来抑制，它反过来受诱导性启动的另外基因产物控制。
在又一备择方面，真核活性基因产物可在调制基因的调制作用下、在组织特异性启动子控制下被组成性表达，该调制基因或产物本身通过在不同组织或补充组织特异性的启动子控制下另一基因的表达而控制。例如通过该方法，赋予昆虫抗性的组成性启动的基因可通过在种子特异性启动子控制下表达基因抑制剂而集中它的效果排除种子，该基因抑制剂本身被在非种子组织特异性的启动子控制下表达的另一基因产物控制。
本发明的另一方面主要在于调节真核活性基因表达的方法，它包括用转化盒转化细胞，该转化盒包括所述真核活性基因，表达调节该真核基因或其产物的产物的调制基因，以及表达调节所述调制基因或其产物的产物的另一基因，所述基因、调制基因和另外的基因之中的两个的启动子选自相同组织或补充组织的诱导型启动子和发育启动子。
本发明的另一方面主要在于转化盒，该转化盒包括真核活性基因，表达调节该真核基因或其产物的产物的调制基因，以及表达调节所述调制基因或其产物的产物的另一基因，所述基因、调制基因和另外的基因之中的两个的启动子选自相同组织或补充组织的诱导型启动子和发育启动子。
本发明的又一方面主要在于用表达盒转化繁殖性真核细胞的方法，该表达盒包括：
于靶组织中在所述靶组织的大致特异性启动子的控制下表达细胞毒性肽的致死基因；
组成性表达所述细胞毒性肽的生产或作用的抑制剂的调制基因；以及
受所述大致特异性启动子控制并起封阻所述抑制剂或调制基因的作用的另外基因。
本发明的又一方面主要在于表达盒，它包括：
表达对靶组织呈细胞毒性的肽的基因，它受所述靶组织的大致特异性诱导型启动子的控制；
表达所述细胞毒性肽的生产或作用的抑制剂的抑制基因；以及
受所述诱导型启动子控制并起封阻所述抑制剂或抑制基因的作用的阻抑基因。
本发明的又一方面涉及用于从解淀粉芽孢杆菌的提取物PCR分离芽孢杆菌RNA酶基因和芽孢杆菌RNA酶抑制剂基因的引物，这些引物被称为P1和P2(芽孢杆菌RNA酶抑制剂的)以及P3和P4(芽孢杆菌RNA酶的)，包括：
P1         5′GCG AAT TCC GCA CAT GAA AAA AGC 3′
          EcoRⅠ
P2         5′GCA AGC TTA AGA AAG TAT GAT GGT G3′
          HindⅢ
P3         5′GCC CAT GGC ACA GGT TAT CAA CAC G3′
           NcoⅠ
P4         5′ CGG GTA CCT TAT CTG ATT TTT GTA A3′
               KpnⅠ
致死基因表达产物的细胞毒性效果可通过将定位信号序列与构建物偶联而增大。例如，优选的RNA酶的细胞毒性效果可通过定向入大多数前RNAs和成熟RNAs以未保护形式存在的核中而被增大。为此，例如芽孢杆菌RNA酶的编码区可通过将核定位信号(NLS)序列与RNA酶基因融合而修饰。
因此，本发明的进一步方面提供了用于将得自根瘤土壤杆菌(A.tumefaciens)VirD2基因的NLS序列与芽孢杆菌RNA酶抑制剂基因融合的一组PCR引物，它们包括：
P3    5′GCC CAT GGC ACA GGT TAT CAA CAC G3′
          NcoⅠ
BD1   5′CCT TAC AAA AAT CAG AGT CCT TTC AAA GCG TCC G3′
         芽孢杆菌RNA酶的3′端    VirD2的NLS的5′端
BD2   5′CGG ACG CTT TGA AAG GAC TCT GAT TTT TGT AAA G3′
         VirD2的NLS的5′端    芽孢杆菌RNA酶的3′端
D23   5′CGG GTA CCT ATC TCC TAT TTC CCC CAG G3′
         KpnⅠ
组织特异性启动子或发育启动子可选自在花的发育早期阶段中控制植物繁殖器官内基因的那些组织特异性启动子。这些基因在所有植物器官中在未开花期间被保持在阻抑状态，而在开花期间基本上在繁殖器官中被诱导。
该发育启动子可通过任何已知方法分离。例如，可鉴定和分离只在靶组织发育期间存在的mRNA，制备得自这些特定的mRNAs的cDNA并用于探测基因组文库，接着鉴定含有这些基因的启动子区的植物基因组部分。该组织特异性启动子可以是同源的(天然的)或异源(外源)的。对于植物繁殖器官组织来说，该启动子可选自雄性和雌性器官内不同花组织细胞中表达的那些，或者只在特定组织如萼片、花瓣、子房、花柱、柱头、胚珠、花冠和其它组织中表达的那些。至于不育植物的生产，在雄性和雌性器官发育早期阶段的组织中表达的启动子是优选的。
例如，编码那些在花的发育中起重要作用的同源异型MADS-盒基因的基因家族在花原基发育早期阶段表述。我们已从辐射松(P.radiata)分离了MADS基因，它们表现出与被称为AGAMOUS AGL-2和AGL-4基因的拟南芥属(Arabidopsis)同源异型MADS-盒基因强烈的同源性。这些基因在未成熟花原基中表达而不是在花序分生组织中表达。
编码致死基因产物的抑制剂的基因可包括阻抑该致死基因的表达的基因、转录反义RNA的基因，或者可包括表达能使致死蛋白质失活的蛋白质的基因。该抑制基因一般将受在非靶组织中表达该抑制剂的组成型启动子的表达控制，不过预计可应用包装的操纵基因-阻抑蛋白系统。
例如，可将芽孢杆菌RNA酶基因/瀪殖器官-组织特异性启动子系统与抗-芽孢杆菌RNA酶(B*或芽孢杆菌RNA酶抑制剂)基因/启动子系统联合。
备择地，大肠杆菌内噬菌体λN基因和SOS系统的表达中的负调节可被用于表达盒。该噬菌体λN基因的表达由PL启动子紧密调节并控制从该启动子表达的水平。可应用该系统来提供靶组织中抑制基因的表达所必需的负控制。
该SOS系统是由两种蛋白质的相互作用调节的。转录阻抑蛋白(LexA)通过与它的操纵基因靶的特异性结合而抑制转录的起始。RecA蛋白封阻LexA蛋白，因而防止在其特定位点上的抑制。这会是单组分致死基因系统，所以不需毒素封阻基因。
可选择处于诱导型启动子控制下的阻抑基因来阻抑抑制基因的转录、RNA转录物的翻译或其肽产物的作用。优选地，该阻抑基因编码直接阻抑该抑制基因的表达的肽产物。因此，优选地该阻抑基因和抑制基因应适合形成特定的阻抑蛋白/操纵基因偶联物。例如，受与该致死基因构建物相同的组织特异性启动子控制的大肠杆菌laclq基因可用于阻抑通过插入lac操纵基因序列而修饰的阻抑基因启动子的作用。
该阻抑基因启动子可以是修饰的35S-RNA-CaMV启动子，它至少具有一个位于该启动子和该阻抑基因的编码区之间的lac操纵基因。在下文例举的修饰了的35S-RNA-CaMV启动子的选择中，本发明人开发了用于扩增该修饰了的35S-RNA-CaMV序列的引物。
因此，本发明的进一步方面提供了用于PCR扩增修饰了的35S-RNA-CaMV序列、被称为35S1和35S2的引物，该引物包括：
35S1       5′ GCC TCG AGC ATG GTG GAG CAC GAC AC3′
                XhoⅠ
35S2       5′ GCG TCG ACT CTC CAA ATG AAA TGA AC3′
                 SalⅠ
至于将lac操纵基因引入修饰了的35S-RNA-CaMV启动子的3′区和5′区，该序列可由如下PCR引物扩增：
OP1        5′ GCC TCG AGC TTT GTG AGC GGA TAA C3′
                XhoⅠ
35S2       5′ GCG TCG ACT CTC CAA ATG AAA TGA AC3′
               SalⅠ
已很详细地了解乳糖操纵子的分子机制，DNA结合蛋白(阻抑蛋白，laclq)和靶启动子序列(操纵基因)之间的相互作用。该lac操纵子的表达处于laclq阻抑蛋白的强烈而紧密的负控制之下。纯化了的阻抑蛋白是由4个相同的亚单位形成的四聚体，各个亚单位具有360个氨基酸(MW38,350kDa)。该操纵基因序列由35个碱基对构成，它包括对称序列的28个碱基对。
对于最大程度地阻抑该抑制基因的表达，该阻抑蛋白优选被定向入靶细胞核中。这可通过将核定位信号序列与该阻抑蛋白的C端融合来实现。
本发明的又一方面涉及适合于分离该laclq基因的一组引物，它们具有供克隆入植物载体的适当的限制酶切割位点，这两种引物相应于该基因的5′端和3′端并且被称为AM1和AM2：
AM1        5′GCT CTA GAC CAT GGA ACC AGT AAC GTT ATA 3′
        XbaⅠ
AM2        5′GCG GTA CCT CAC TGC CCG CTT TC3′
        KpnⅠ
本发明的又一方面提供了用于将NLS序列与laclq基因的3′端融合的一组PCR引物，它们包括：
AM1    5′GCT CTA GAC CAT GGA ACC AGT AAC GTT ATA 3′
    XbaⅠ
LD1    5′CTG GAA AGC GGG CAG GTC CTT TCA AAG CGT CCG 3′
       laclq的3′端        VirD2基因中NLS的5′端
LD2    5′CGG ACG CTT TGA AAG GAC CTG CCC GCT TTC CAG 3′
       VirD2中NLS的5′端laclq的3′端
D23    5′CGG GTA CCT ATC TCC TAT TTC CCC CAG G3′
               KpnⅠ
如果需要的话，本发明的方法可以是可逆方法。例如，该基因级联系统可应用能将人工改造的不育性逆变为能育性的分子元件，于是允许产生种子。该逆转机制可包括将抗阻抑基因置于化学开关启动子的控制之下。例如当需要恢复能育性时，可向植物喷洒或者施用诱导抗阻抑RNA的表达的化学物质，其中该抗阻抑RNA将会封阻已修饰的抑制基因的表达的抑制作用。该抑制产物在花器官内的聚集将抑制致死基因的作用，于是允许形成正常的花。
例如，就所述lac/laclq系统而言，可在植物上喷洒可诱导抗-laclqRNA的表达的化学物质，其中该抗-laclq RNA将会封阻已修饰的芽孢杆菌RNA酶抑制剂基因的表达的抑制作用。该芽孢杆菌RNA酶抑制剂产物在花器官中的聚集将抑制致死基因的作用，于是允许形成正常的花。玉米谷胱甘肽-S-转移酶(GSTⅡ)基因的启动子区可被用于化学诱导的表达。该GSTⅡ启动子的表达可通过化学物质如二氯胺(dichloramin，N,N-二烯丙基-2,2-二氯乙酰胺)或解草胺(fluorazole，苄基-2-氯-4-三氟甲基-5-噻唑-羧酸酯)开启。
至于桉树属(Eucalyptus)，包括EGM3基因的上游序列的EGM3启动子可被用于特异性地在桉树花组织中表达致死基因。应用该启动子，可在发育的很早阶段于花的分生组织中特异性地表达细胞毒性芽孢杆菌RNA酶基因。抑制剂芽孢杆菌RNA酶抑制剂可在携带lac-操纵基因序列的35S-RNA-CaMV启动子控制下被表达。
受EGM3启动子控制的大肠杆菌laclq基因可被用作阻抑基因而防止开始开花时花分生组织中芽孢杆菌RNA酶抑制剂的表达。在开花期间，EGM3启动子将会在花分生组织中表达芽孢杆菌RNA酶和laclq，而修饰了的35S-RNA-CaMV启动子将会在除了花分生组织之外的所有组织中表达芽孢杆菌RNA酶抑制剂，给予保护以防启动子渗漏。在未开花期间，35S-RNA-CaMV启动子通常会表达芽孢杆菌RNA酶抑制剂，给予保护以防渗漏。
线虫每年给全世界农业带来的损失远远超过1000亿美元。迄今侵袭广范围植物的最重要病原体是线虫假根瘤线虫(Meloidogyne incognita)和爪哇根瘤线虫(Meloidogyne javanica)。控制措施包括应用有害的化学物质，栽培实践如轮作以及在有限的作物范围内应用抗性品种。人工改造对线虫的抗性的优点包括不需特别的栽培实践以及减小了环境危险性。
该致死基因/抑制剂/阻抑蛋白方法可被用于人工改造对线虫的抗性。激活植物防御线虫的理想位点是在植物根的维管区内摄食细胞(feedingcell)中。在数种植物-线虫相互作用中，正在用示差筛选鉴定基因启动子，该基因启动子可被用于在线虫摄食位点上特异性地表达芽孢杆菌RNA酶基因。最近已鉴定了两种基因(Lemmi9和Lemmi10)，它们是在感染了假根瘤线虫的番茄根内巨细胞摄食位点中被高水平表达的(Vander Eycken等，(1996)植物杂志(Plant Journal)9,45-54)。
致死基因在摄食细胞中的表达会迅速杀伤该细胞并破坏摄食过程，该摄食过程尤其对雌性植物的发育相当关键。需要抑制基因在非靶组织中的表达以防因启动子渗漏引起对根的其它部分的损害。这尤为重要，因为在巨摄食细胞内高水平表达的启动子也在非靶组织中低水平表达。在摄食位点启动子之下该阻抑基因的表达将会封阻该抑制基因在靶组织中的充分表达以允许致死基因破坏该细胞。
为了使本发明更容易被理解并付诸实施，现在可参照阐述本发明优选的实施方案的下述实施例和附图，其中：
图1表示芽孢杆菌RNA酶/NLS基因定域致死基因系统的构建；
图2表示包括lac操纵子修饰的35S-RNA-CaMV操纵基因/芽孢杆菌RNA酶抑制剂抑制基因系统的构建物；
图3表示laclq/NLS定域阻抑基因系统的构建；
图4表示本发明的芽孢杆菌RNA酶/芽孢杆菌RNA酶抑制剂：lac/laclq级联系统的作用方式，
图5表示本发明的备择级联芽孢杆菌RNA酶：op/LexA/RecA，
图6表示本发明的可逆芽孢杆菌RNA酶/芽孢杆菌RNA酶抑制剂：lac/laclq/反义laclq级联系统的作用方式；
图7用图解表示该控制盒以及图1的致死基因/NLS系统的作用方式；
图8是PrMADS1、PrMADS2、PrMADS3、PrFL1和PrCON1这些基因在辐射松的繁殖组织和营养组织中的表达；
图9是PrMADS3基因在雄性球花和雌性球花中的表达；
图10是PrMADS1、PrMADS2和PrMADS3的凝胶移位分析；
图11是EGM1启动子的核苷酸序列；
图12是EGM2启动子的核苷酸序列；
图13是桉树花特异性MADS基因EGM3的启动子的推定序列；
图14是从用EGM1 cDNA(曝光6小时)探测的桉树属组织提取的全部RNA的RNA印迹图解说明；
图15是从用EGM3 cDNA探测的桉树属组织提取的全部RNA的RNA印迹图解说明；
图16是从用EGM2 cDNA(曝光6小时)探测的桉树属组织提取的全部RNA的RNA印迹图解说明；
图17是数种植物MADS-盒基因的MADS-盒区的预测蛋白质序列的对比；
图18是表示数种植物MADS--盒基因的相关性的系统树；
图19是用EcoRⅠ和HindⅢ消化然后用EGM3基因和EGM2基因探测的巨桉(Eucalyptus grandis)DNA的DNA印迹；
图20是从用EGM3 cDNA(曝光6小时)探测的桉树组织提取的全部RNA的RNA印迹；
图21是质粒7prom芽孢杆菌RNA酶抑制剂的图解说明；
图22是含有V1-启动子的质粒pBR芽孢杆菌RNA酶prom芽孢杆菌RNA酶抑制剂的图解说明；
图23是含有V2-启动子的质粒的图解说明；
图24是EGM3双仓(double bin)的Pst1消化物的琼脂糖分离图解说明。假定EcoRⅠ克隆位点是在EGM3仓(bin)的碱基6772上，则从该图对此消化预测的片段大小是4.9,4.8,4.4,3.3,1.9,1.1和0.6kb。
图25是EGM3仓的Pst1消化物的两凝胶曝光的图解说明，显示该克隆化插入片段的其它可能取向。从该消化物预计的片段大小是7.4,4.9,4.4,1.1,0.7和0.6kb。
图26是EGM3双仓的质粒图。
图27是EGM3 V1有义的质粒图。
图28是质粒V1(芽孢杆菌RNA酶-芽孢杆菌RNA酶抑制剂)的质粒图。
图29是质粒V2(laclq NLS-35s启动子Op-芽孢杆菌RNA酶抑制剂)的质粒图。
图30说明了启动子探测方案；
图31是PrMADS2启动子的核苷酸序列；
图32是PrMADS3 cDNA的核苷酸序列；
图33是PrMADS3蛋白质的氨基酸序列；
图34是PrMADS启动子的核苷酸序列；
图35是PrFL1 cDNA克隆的核苷酸序列；
图36是PrFL1蛋白质的氨基酸序列；
图37是PrFL1启动子的核苷酸序列；
图38是PrCon1基因的核苷酸序列(部分的)；以及
图39是从用EGM2 cDNA(曝光3天)探测的桉树组织提取的全部RNA的RNA印迹。实施例1
构建包括繁殖器官特异性启动子和得自解淀粉芽孢杆菌的芽孢杆菌RNA酶基因的嵌合繁殖器官特异性表达盒，其中该启动子和该基因受编码得自解淀粉芽孢杆菌的芽孢杆菌RNA酶的抑制剂〔芽孢杆菌RNA酶抑制剂(B*)]的基因的正控制〔其中的基因受具有引入的lac-操纵基因序列、已修饰的组成型启动子(35S RNA CaMV)的控制〕，表达盒中的启动子和基因还受大肠杆菌laclq基因的负控制〔其中该laclq基因受与用于按图4表达该致死基因的相同的繁殖器官特异性启动子的控制〕。
该繁殖器官特异性启动子包括如下文所述在花发育早期状态的繁殖器官中表达的基因的上游序列。芽孢杆菌RNA酶的细胞毒性效果是通过将其定向入大多数前RNAs和成熟RNAs以未保护形式存在的核中而提高的。为此，如图1所示，通过将得自根瘤土壤杆菌菌株C58的VirD2基因的核定位信号(NLS)序列融合至该B基因的3′区而修饰该B基因的编码区。
按图2构建在35S-RNA-CaMV启动子区的5′区、3′区以及5′区加3′区携带lac-操纵基因序列的抑制剂芽孢杆菌RNA酶抑制剂(B*)基因部分载体。
受与用于表达致死基因的相同的繁殖器官特异性启动子控制的该大肠杆菌laclq基因，通过按图3将得自根瘤土壤杆菌VirD2基因的NLS融合至该laclq蛋白的C端而使其laclq蛋白定向入该核。实施例2
按图5构建备择的嵌合繁殖器官特异性表达盒，其中该繁殖器官特异性启动子和芽孢杆菌RNA酶基因受处于35S-RNA-CaMV启动子控制下的LexA产物的正转录控制，并且受RecA基因产物(该RecA基因产物受与用于按图5表达致死基因的相同的繁殖器官特异性启动子的控制)的负控制。实施例3
基本上按实施例1构建一个可逆系统。此外还包括得自调节反义laclqRNA基因的玉米谷胱甘肽-S-转移酶(GSTⅡ)基因的化学开关启动子。这就允许按图6生产种子。于是通过喷洒诱导物如二氯胺(N,N-二烯丙基-2,2-二氯乙酰胺)或解草胺(苄基-2-氯-4-三氟甲基-5-噻唑-羧酸酯)可实现能育性的恢复。该化学诱导的抗laclq RNA的表达封阻已修饰的35S-RNA-CaMV-B*基因的表达的抑制作用。B*在花器官中的聚集将抑制致死基因的作用，于是允许形成正常的花。实施例4
laclq阻抑基因的修饰以及插入植物表达载体。
用Xbal和Kpnl消化pRT99GUS载体以释放GUS基因的编码区并且变成供植物中表达的合适载体。
laclq阻抑蛋白几乎可从所有商品化大肠杆菌菌株获得。一些商品化质粒也含该阻抑基因。为了在植物中表达该基因，将原核翻译起始密码子(GTG)变成ATG。为了分离该laclq基因，设计了相应于该基因的5′端和3′端的两种引物(AM1和AM2)。这两种引物具有合适的限制酶切割位点供克隆入植物载体。
AM1       5′GCT CTA GAC CAT GGA ACC AGT AAC GTT ATA 3′
             Xba Ⅰ
AM2       5′GCG GTA CCT CAC TGC CCG CTT TC3′
             Kpn Ⅰ
扩增后，用XbaⅠ和KpnⅠ消化PCR片段并连接入pBR-35SGUS载体(该载体被同样的酶消化)以便置换该GUS基因(pBR-35Slaclq)。
为了将NLS序列融合至该laclq基因的3′端，进行了数个PCR。
引物：AM1 如前所述。
LD1   5＇CTG GAA AGC GGG CAG GTC CTT TCA AAG CGT CCG 3′
          laclq的3′端    VirD2基因中NLS的5′端
LD2   5′CGG ACG CTT TGA AAG GAC CTG CCC GCT TTC CAG 3′
      VirD2中NLS的5′端             laclq的3′端
D23   5′CGG GTA CCT ATC TCC TAT TTC CCC CAG G3′
         KpnⅠ
用XbaⅠ和KpnⅠ消化含有被融合至laclq基因的编码区的、得自根瘤土壤杆菌的VirD2基因的NLS的最终PCR片段并连接入用相同的酶消化的植物表达载体pBR322-35SGUS(pBR-35Slaclq-NLS)。将该载体从XL1 Blue转化入JC8697(recA-)大肠杆菌菌株以消除可能的同源重组。实施例5
芽孢杆菌RNA酶基因和芽孢杆菌RNA酶抑制剂基因。
应用P1和P2(对于芽孢杆菌RNA酶抑制剂)以及P3和P4(对于芽孢杆菌RNA酶)这些引物通过PCR从解淀粉芽孢杆菌的粗提取物分离这些基因。
P1    5′GCG AAT TCC GCA CAT GAA AAA AGC 3′
EcoRⅠ
P2    5′GCA AGC TTA AGA AAG TAT GAT GGT G3′
         HindⅢ
P3    5′GCC CAT GGC ACA GGT TAT CAA CAC G3′
            NcoⅠ
P4    5′CGG GTA CCT TAT CTG ATT TTT GTA A3′
             KpnⅠ
用EcoRⅠ和HindⅢ消化该P1-P2 PCR片段(芽孢杆菌RNA酶抑制剂)并连接入用相同的酶消化的Bluescript SK载体(BS-B*)。将BS-B*载体的BamHⅠ-HindⅢ片段引入蛋白质表达载体pQE32(pQE-B*)。
将P3-P4 PCR片段(芽孢杆菌RNA酶)连接入PCR克隆载体p/GEM-T(pGEM-T-B)。为了将NLS序列融合至该B基因的3′端，进行了数个PCR。
引物：
P3    5′GCC CAT GGC ACA GGT TAT CAA CAC G3′
          NcoⅠ
BD1   5′CCT TAC AAA AAT CAG A GT CCT TTC AAA GCG TCC G3′
      芽孢杆菌RNA酶的3′端    VirD2的NLS的5′端
BD2   5′CGG ACG CTT TGA AAG GAC TCT GAT TTT TGT AAA G3′
       VirD2的NLS的5′端    芽孢杆菌RNA酶的3′端
D23   5′CGG GTA CCT ATC TCC TAT TTC CCC CAG G3′
             KpnⅠ
将含有融合至芽孢杆菌RNA酶基因的编码区的、得自根瘤土壤杆菌的VirD2基因的NLS的最终PCR片段连接入PCR克隆载体pGEM-T(pGEM-T-B-NLS)。
实施例6
将lac-操纵基因序列引入35S-RNA-CaMV启动子。
商品化质粒pQE-32包含两种lac操纵基因(操纵基因Ⅰ和Ⅱ)的理想结合。第一步，将得自pRT99GUS载体的HindⅢ片段引入Bluescript SK载体(A1)。携带融合入35S-RNA-CaMV启动子的GUS基因以及终止区的该A1载体的EcoRⅠ-SaⅡ片段被引入用相同的酶消化的pQE32载体。
所得载体含在上游区(Op+35S-GUS)有两种lac操纵子的35S-RNA-CaMV启动子。
为了将该lac操纵基因引入35S-RNA-CaMV启动子和GUS基因的编码区之间，先将携带无启动子GUS基因的、该A1载体的BamHⅠ-SaⅡ片段连接入用相同的酶消化的pUC19载体(pUC19-启动子GUS)。下一步，用EcoRⅠ和SaⅡ酶消化pUC19-启动子GUS载体再将它连接入用相同的酶消化了的pQE32载体(pQE-启动子GUS)。应用相应于35S-RNA-CaMV启动子的5′区和3′区的35S1引物和35S2引物通过PCR扩增35S-RNA-CaMV启动子区。
35S1    5′GCC TCG AGC ATG GTG GAG CAC GAC AC3′
            XhoⅠ
35S2    5′GCG TCG ACT CTC CAA ATG AAA TGA AC3′
            SalⅠ
用XhoⅠ和SaⅡ消化该PCR片段再将它引入用XhoⅠ消化了的pQE-启动子GUS。选择含正确取向的启动子的克隆，并将所得质粒(35S-GUS)从XL1 Blue转化入JC8697(recA-)大肠杆菌菌株以消除可能的同源重组。
为了将lac操纵基因引入35S-RNA-CaMV启动子的5′区和3′区，应用相应于该-35S启动子的5′区和3′区的OP1引物和35S2引物通过PCR扩增该-35S-GUS载体的操纵基因-35S启动子区。
OP1    5′GCC TCG AGC TTT GTG AGC GGA TAA C3′
                XhoⅠ
用XohⅠ和SaⅡ消化该PCR片段再将它引入用XohⅠ消化了的pQE-启动子GUS。选择含正确取向的启动子的克隆，并将所得质粒(-35S-启动子GUS)从XL1 Blue转化入JC8697(recA-)大肠杆菌菌株以消除可能的同源重组。
在用EcoRⅠ+KpnⅠ消化二者后将芽孢杆菌RNA酶抑制剂基因克隆入pQE-启动子GUS载体。
组织摘除术的一个难点是启动子渗漏的影响或在其它组织中的表达。为克服该困难，我们开发了一个控制系统(基因级联系统)，凭该系统抵销致死基因在非靶组织中的表达(图7)。设计了携带芽孢杆菌RNA酶(V1)和芽孢杆菌RNA酶抑制剂加这些级联系统的阻抑蛋白(1aclq)(V2)部分的两种不同载体。
为了将启动子区克隆入载体V1和V2，应用几组引物扩增了它们，其中这些引物V1具有SalⅠ限制位点(SalⅠ引物)并在V2具有EcoRⅠ限制位点(EcoRⅠ引物)。为了检查该启动子在V1和V2载体中的取向，在正向SalⅠ引物中SalⅠ位点的下游设计了EcoRⅠ限制位点，并在EcoRⅠ引物中EcoRⅠ的下游设计了SalⅠ位点：SalⅠ引物：PrMADS2启动子：正向引物：5′CCGGTCGACGAATTCCGACAGTGGAGTCCACAAAGAAAGATGCG3′SalⅠ      EcoRⅠ反向引物：5′CCGGTCGACTTCTTTCCTTCTTTTCTTTCTGC3′SalⅠPrMADS3启动子：正向引物：5′ACGCGTCGACGAATTCAAGATTTCAAATCAGTCC3′SalⅠ      EcoRⅠ反向引物：5′ACGCGTCGACCAAGATCCCTCTGCTTCTTCACC3′SalⅠPrFL1启动子：正向引物：5′ACGCGTCGACGAATTCGAACTTCTGGAATAAGCTGC3′SalⅠ      EcoRⅠ反向引物：5′ACGCGTCGACTTCATCTTACGTCACGCGAGG 3′SalⅠEcoRⅠ引物：PrMADS2启动子：正向引物：5′ CCGGAATTCGTCGACCGACAGTGGAGTCCACAAAGAAAGATGCG3′
    EcoRⅠ   SalⅠ反向引物5′ CCGGAATTCTTCTTTCCTTCTTTTCTTTCTGC3′EcoRⅠPrMADS3启动子：正向引物    ：5′CGGAATTCGTCGACAAGATTTCAAATCAGTCC3′EcoRⅠ   SalⅠ反向引物    ：5′GCGAATTCCAAGATCCCTCTGCTTCTTCACC 3′EcoRⅠPrFL1启动子：正向引物：5′ CGGAATTCGTCGACGAACTTCTGGAATAAGCTGC 3′
      EcoRⅠ  SalⅠ反向引物：5′GCGAATTCTTCATCTTACGTCACGCGAGG 3′EcoRⅠ
用SalⅠ限制酶消化SalⅠ引物的PCR片段，再将该片段引入用SalⅠ消化了的V1载体。应用EcoRⅠ酶的消化检查启动子的取向。
用EcoRⅠ限制酶消化EcoRⅠ引物的PCR片段，再将该片段引入用EcoRⅠ消化了的V1载体。应用SalⅠ酶的消化检查启动子的取向。所得质粒的图示于图21和22。
用Hind Ⅲ酶将这些载体线性化后将它们引入用Hind Ⅲ消化了的Bin19二元载体(binary vector)。在有卡那霉素和氨苄西林抗生素的板上选择携带已修饰的Bin19载体的菌落。下一步将Bin19-V1-启动子载体和Bin19V2-启动子载体转化入几种土壤杆菌(agrobacterium)菌株。用土壤杆菌菌株共转化拟南芥、巨桉和辐射松的胚以及外植体。
质粒pRT99 gus(Topfer等，核酸研究(Nucleic acid Research)(1988)16(17):8725)的Hind Ⅲ片段被克隆入pBR322的Hind Ⅲ位点。该插入产生两种质粒，它们相当于在两个方向克隆的插入片段。该插入区包含花椰菜花叶病毒(CaMV)35S RNA启动子、β葡糖苷酸酶(GUS)基因以及CaMV 35S终止区。这些质粒被称为pBrGUS1和pBrGUS2，提供致死基因构建物的基础。用BamHⅠ消化物检查该插入过程的取向。pBRGUS2生成2.5kb和4.4kb的BamHⅠ片段，pBRGUS1生成6.1kb和0.8kb的片段。
应用5′引物LacⅠ(它具有EcoR1位点)和具有KpnⅠ位点的3′引物D23通过PCR从质粒pGEM laclqNLS扩增编码laclq核定位信号肽的DNA。用EcoRⅠ和KpnⅠ限制已扩增的DNA片段并将它克隆入用该相同的酶切割了的pBRGUS2。生成的质粒称为pBRLac。然后用SphⅠ切割pBRLac质粒后使它走琼脂糖凝胶以纯化该质粒片段，该质粒片段包含Laclq基因、氨苄西林抗性基因以及远离小SphⅠ片段的复制起点，它含我们希望除去的限制位点。生成的质粒称为pBRLac BH-。
质粒构建的第二个阶段是预备在已修饰的CaMV加lac操纵启动子调节下克隆芽孢杆菌RNA酶抑制剂基因。这是从包含该启动子/基因序列的质粒p35S-op-芽孢杆菌RNA酶抑制剂EcoRⅠ-扩增的，其中的启动子/基因序列已被修饰以除去启动子与编码序列之间的EcoRⅠ位点。是这样完成该修饰作用的，即用EcoRⅠ切割35S-op-芽孢杆菌RNA酶抑制剂质粒，用T4 DNA聚合酶进行钝化反应(blunting reaction)，然后重新连接该钝化质粒。是应用5′引物pQE-F和3′引物Bar-3′进行该PCR的。用XhoⅠ和KpnⅠ切割PCR片段。将它克隆入也用XhoⅠ和KpnⅠ切割了的35S-op-芽孢杆菌RNA酶抑制剂EcoRⅠ-质粒，并通过凝胶电泳对它纯化了不需要的基因。这使得能除去芽孢杆菌RNA酶抑制剂编码区的3′端上的限制位点。该质粒称为p35S-op-芽孢杆菌RNA酶抑制剂EcoRⅠ-2。
然后用XhoⅠ和SalⅠ将芽孢杆菌RNA酶抑制剂基因从p35S-op-芽孢杆菌RNA酶抑制剂EcoRⅠ-2质粒上切下，再将该基因克隆入用SalⅠ切割的pBrLacBH-。该芽孢杆菌RNA酶抑制剂基因可呈任一取向进入SalⅠ位点，但只发现一种取向。该插入片段的取向是由KpnⅠ消化物确定的。只见到一条1kb带，它指示在质粒pBRLac Op芽孢杆菌RNA酶抑制剂1中见到的该插入片段的取向。产生的质粒称为V2。
然后该质粒准备在该情况下将花特异性启动子克隆入单一EcoRⅠ克隆位点，即laclq基因的5′。得自桉树属MADS基因EGM3的EGM3启动子用于该用途。是用EcoRⅠ从质粒pEGM3切割它的。该启动子呈两种取向被克隆，生成的质粒称为V2 EGM3有义和V2 EGM3反义。将质粒V2 EGM3有义用作EGM3调节的laclq和CaMVop芽孢杆菌RNA酶抑制剂基因的来源，用于植物转化载体。EGM3启动子的取向是由Xbal PstⅠ消化物确定的。2.3和0.9kb带的存在指示正确取向。
含无启动子芽孢杆菌RNA酶基因的第二种构建物V1，是用pBrGUS2作起点构建的。应用引物芽孢杆菌RNA酶5′Sal，以及芽孢杆菌RNA酶3′Kpn从基因组解淀粉芽孢杆菌扩增芽孢杆菌RNA酶基因。用KpnⅠ和SalⅠ象限制pBrGus1那样限制生成的PCR产物并进行连接反应。将得自生成的菌落的质粒用作应用该扩增引物测序的模板。发现质粒SB4包含与解淀粉芽孢杆菌的芽孢杆菌RNA酶基因相同序列的芽孢杆菌RNA酶片段，该质粒被称为pBR芽孢杆菌RNA酶，将它用于进一步的构建。
应用芽孢杆菌RNA酶作为植物中致死基因的先前工作已证实，要求存在并从与芽胞杆菌RNA酶相同的质粒表达芽孢杆菌RNA酶抑制剂的抗毒素基因，这是在启动子区可被克隆该芽孢杆菌RNA酶基因的5′之前进行的(Paul等，1992，植物分子生物学(Plant MolecularBiology)19:611-622)。这是通过应用含芽孢杆菌RNA酶抑制剂基因和得自解淀粉芽孢杆菌的启动子的质粒而达到的，其中该启动子与芽孢杆菌RNA酶序列呈顺式。为此，应用引物5′芽孢杆菌RNA酶抑制剂启动子和Bar3′从解淀粉芽孢杆菌基因组DNA扩增该启动子加芽孢杆菌RNA酶抑制剂DNA区。用KpnⅠ象限制pGEM 3f那样限制PCR片段并进行连接反应。从产生的白色菌落筛选插入片段。将得自菌落7的DNA用于测序，发现该DNA含基因组解淀粉芽孢杆菌DNA中的那种芽孢杆菌RNA酶抑制剂启动子加芽孢杆菌RNA酶抑制剂序列。该质粒被称为7启动子芽孢杆菌RNA酶抑制剂，如图21所示。
用KpnⅠ象限制pBR芽孢杆菌RNA酶那样限制该7启动子芽孢杆菌RNA酶抑制剂质粒，再将启动子芽孢杆菌RNA酶抑制剂片段克隆入PBR芽孢杆菌RNA酶DNA的KpnⅠ位点。产生的质粒称为V1。用EcoRⅠ将该EGM3启动子从pEGM3切下，应用DNA聚合酶Ⅰ(克列诺片段)钝化，再克隆入也已被限制和钝化了的V1 DNA的单一SalⅠ克隆位点。产生的(插入的启动子呈正确取向)质粒被称为EGM3 V1有义(图27)。
用Hind Ⅲ将该EM3V1有义DNA线性化再克隆入也用Hind Ⅲ线性化了的植物转化载体Bin19。产生两种质粒，即EGM3 V1 Bin1和2，相应于插入的两种取向。在取向2中，存在于EGM3 V1 Bin中的两个EcoRⅠ位点大约相隔80bp。EGM3 V1 Bin2被EcoRⅠ切割后用DNA聚合酶Ⅰ(克列诺片段)钝化。应用AatⅡ和Hind Ⅲ将EGM3启动子laclq基因以及CaMV35S op芽孢杆菌RNA酶抑制剂基因从EGM3 V2有义上切下。该片段也被钝化后被连接入EcoRⅠ切割并钝化了的EGM3 V1Bin2而产生质粒EGM3 Double BinⅠ和Ⅱ(图26)，也相应于两种可能的取向。这些质粒被用于经由根瘤土壤杆菌转化植物。
然后进一步用桉树属MADS启动子重复该操作。这些是EGM2长形式和短形式，以及EGM3的更短形式。引物。芽孢杆菌RNA酶5′Sal5′CCGYCGACATGGCACAGGTTATCAA 3′
    SalⅠ芽孢杆菌RNA酶3′Kpn5′CGGGTACCTTATCTGATTTTTGTAAAGG 3′
  KpnⅠ5′芽孢杆菌RNA酶抑制剂启动子5′CGGGTACCGTCCAATCTGCAGCCGTCCGA 3′
KpnⅠ
Bar3′5′GCGGTACCTTAAGAAAGTATGATGGTG3′
   KpnⅠD235′CGGGTACCTATCTCCTATTCCCCCACG 3′
   KpnⅠpQE-F5′ GCGTATCACGAGGCCCTTTC 3′LacⅠ5′ GCGAATTCAACATGGAACCAGTAACGTTATA 3′
    EcoRⅠ
实施例7
繁殖器官特异性启动子的分离
从制备自未成熟雌球花和雄球花的辐射松cDNA文库分离表现为与拟南芥和Anthirrhinum majus花分生组织有强同源性的5种球花特异性基因以及器官同一性基因。其中的3种，即PrMADS1、2和3属于MADS--盒基因家族，显示分别与拟南芥属(Arabidopsis)AGL-2、AGL-4和AGL6基因以及得自另一种非被子植物即欧洲云杉(Picea abies)(挪威云杉)的dal1基因的同源性。PrFL1基因是得自Anthirrhinum的Arabidopsis Leafy(Lfy)和Floricaula(Flo)基因的松直向同源基因。PrCon1显示与拟南芥属CONSTANS(co)基因的强同源性。为了阐释这些基因的作用，我们采取了这种方法即在球花发育的不同阶段鉴定它们在雄球花和雌球花中的表达模式。
在营养组织、营养芽、针叶、茎和根中检测到很低水平的表达。原位杂交表明，这些基因的表达只能在繁殖组织细胞中检测到。
表达分析揭示所有这5种基因在雄球花和雌球花的不同发育阶段中表现为不同的表达模式(图8和9)。PrMADS1、2和3基因是球花特异性的：两种基因的表达受限于繁殖器官原基组织。在营养组织：营养芽、针叶、茎、根中未观测到这些基因可检测的表达。至于PrFL1和PrCon1，在营养芽中观测到低可检测量的表达。
在球花发育早期阶段(5mg球花)检测到繁殖器官中两种基因的低水平表达，表达水平在球花发育期间(50mg球花)增大了。在雄球花中，两种基因的表达受含初生造孢细胞的小孢子囊限制。在雌球花中，两种基因的表达受早熟胚珠的限制。
为了在体外鉴定MADS蛋白质为DNA结合蛋白，我们在大肠杆菌中表达了这两种蛋白质并鉴定了它们的DNA结合性能。PrMADS1、2、3蛋白质都是序列特异性DNA结合蛋白。它们的DNA结合共有序列与AGAMOUS蛋白的相似。所有这三种蛋白质都结合与CArG盒的共有序列配对的DNA序列，关于PrMADS1和PrMADS2的是TT(A/T)CC(A/T)(A/t)2(T/A)NN GG(-G)(A/T)2(oligo A)(图32)。这些共有序列的突变(oligo B)明显地减弱了它们与PrMADS1、2或3蛋白质的结合。与非放射性oligos的竞争未减弱任何这些蛋白质与CArG共有序列的结合。这表明我们正处理特异性DNA-蛋白质相互作用。
应用‘启动子探测’方案(图30)分离了上游序列。将特定的衔接子连接至DNA片段的末端，这些DNA片段是通过分别用EcoRV、ScaⅠ、DraⅠ、PvulⅠ和SspⅠ消化辐射松的基因组DNA而产生的。选择应用的酶，因为它们具有六个碱基的识别位点并产生平端。在衔接子连接后，将这些DNA片段用作PCR的模板，该PCR应用第一衔接子引物AP1、AP2以及基因特异性引物GSP-1,2。
衔接子序列(第一序列)、衔接子引物和聚合酶封阻引物如下所示。应注意，衔接子引物AP1相应于衔接子22的碱基1至22，衔接子引物AP2相应于碱基13至31，而该聚合酶封阻引物则相应于碱基41至48。衔接子：5′GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCCCGGG-CTGGT-3′聚合酶封阻引物：
AP1    3′-NH2-CCCGACCA-PO4-5′
AP2衔接子引物1(AP1):    5′-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3′衔接子引物2(AP2):5-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3′
下链3′端氨基的存在封阻聚合酶催化的未连接的单体衔接子分子增长，于是防止引物结合位点的产生，除非一确定的、基因特异性引物延长与衔接子上链相反的DNA链。
应用Advantage Tth Plymerase Mix(Clontech)以及有关PrMADS2,3基因和PrFL1基因的衔接子引物AP1和GSP-1进行首次PCR。GSP-1序列：PrMADS2: 5′ CGGCGCTTCCGAACTCATAGAGTTTTCCTC 3′PrMADS3: 5′ TTAGCGCCACTTCGGCATCGCACAGC 3′PrFL1:   5′ CAAGGGACTTCAAATCCTTTCTCCCATTCATGG 3′PCR两步循环参数：7次循环：    94℃    25秒
         72℃    4分32次循环：   94℃    25秒
         67℃    4分最后一次循环后又一次67℃达4分钟。
将1ml首次PCR用于第二次PCR，其中应用相同的循环参数以及第二组GSP引物与AP2衔接子-引物。GSP-2引物序列：PrMADS2:     5′ CGCCTTTTTCAGCAGACCATTCCGGC 3′PRMADS3:     5′ CAGCAGTCCGTTTCCGGCGCTTCG 3′PrFL1:       5′ CGTCCATGGTCCTTGTTAAAGACAGTTGTTGTTGG 3′
将1～2kb PCR片段克隆入TA型克隆载体并测序。cDNAs和蛋白质的序列以及PrMADS2、PrMADS3和PrFL1的启动子区示于图31、34&37。
实施例8
将嵌合DNA序列引入植物中
应用根瘤土壤杆菌系统将嵌合DNA序列共转移入植物组织。使转化体保持生长在选择性培养基上。应用标准分子生物学技术(Southern杂交、Northern杂交、PCR)证实两种质粒的存在。质粒A具有芽孢杆菌RNA酶基因，质粒B具有受植物启动子控制的芽孢杆菌RNA酶抑制剂基因。这就引起共转化的另外选择。
设计的载体系统包括基因的级联系统，该基因的表达受繁殖器官特异性启动子的正控制以及大肠杆菌乳糖(lac)阻抑蛋白-操纵基因系统的负控制。在未开花期间，缺乏阻抑蛋白时，操纵基因序列将允许在所有器官中组成性表达芽孢杆菌RNA酶抑制剂基因或反义RNA。由于繁殖器官特异性启动子的可能渗漏，在不同植物器官和细胞中致死基因产物将以低水平存在。
芽孢杆菌RNA酶抑制剂蛋白在这些细胞的细胞质中或反义RNA在细胞核中的积聚将封阻致死基因产物的细胞毒性效果。在开花的早期阶段，该B(或其它RNA酶)和laclq基因在繁殖器官合适的细胞中的表达将急剧增多。laclq蛋白在这些繁殖器官细胞核中的积聚将通过lac阻抑蛋白-操纵基因相互作用封阻芽孢杆菌RNA酶抑制剂基因(或反义RNA)的表达，这就会增大致死基因产物在靶繁殖器官细胞中的量。
实施例9
与其它植物MADS-盒基因具有同源性的三种桉树基因(EGM1、3&2)已被克隆并测序(图10～13和17)。进行了系统发育分析以检查这些桉树基因与其它MADS-盒基因的相关性(图18)。表明EGM2很可能与花瓣和雄蕊的发育中涉及的GLOBOSA MADS-盒基因组是同源的。EGM3和EGM1都属于MADS-盒基因的AGL2组。这些基因最常在花内部三种轮生体(花瓣、雄蕊和心皮)中表达，但尚未确定它们在花发育中的作用。
鉴定了所有三种EGM基因的表达模式(图14、15&16)。在任何营养组织中都未检测到这些基因的表达。EGM1基因是在桉树花的花瓣、雄蕊和心皮中表达的。EGM3是在花分生组织和萼片中表达的，EGM2是在花瓣和雄蕊中表达的。已由Southern分析(图19)证实EGM3和EGM2基因是单基因。EGM1也可能是单基因。
所有这三种基因的启动子区都可用于不育性基因构建物并且已从桉树基因组文库中分离出来。EGM3启动子已被人工改造入致死基因构建物中。
对一系列组织进行了RNA印迹分析以测定三种EGM MADS-盒基因表达的组织特异性。用于从根、苗、茎、枝、叶和成熟的花分离RNA的组织得自巨桉植物。用于从包括花托、花瓣、雄蕊、心皮和花柱的花组织分离RNA的组织是从蓝桉(E.globulus)花采集的。应用该物种是由于它生长很大的花，使得采集足量RNA容易得多。将10微克总的RNA用于包括不同花组织的印迹分析，而将20微克用于包括营养组织的巨桉RNA的印迹分析。是对三种EGM基因探测了印迹，其中该EGM基因已用合适的限制酶消化以除去MADS盒。
RNA印迹指示，所有三种EGM基因在桉树花中被高水平表达。当RNA印迹长期暴露于胶片时，在营养组织中检测到EGM2基因和EGM1基因的弱表达。EGM3三基因尤其是在营养组织中表达的。在花中，观测到EGM2基因在雄蕊和花瓣中表达。EGM3基因是在花托、花瓣、雄蕊、心皮和花柱中表达的。实施例10
该级联系统的第一部分(组分1)包含报道GUS基因，它受带有lac操纵基因(LEAFY-op)的花分生组织同一性基因启动子(即拟南芥的LEAFY)的控制。第二种构建物(组分2)包含受玉米GST-27基因启动子控制的阻抑laclq基因。通过用防护剂、二氯丙烯胺(dichlormid)和R-29148处理植物而上调该启动子。是用两种组分对拟南芥属植物共转化的。
一种备择方案是关于携带待分别杂交的组分1和2的转基因拟南芥属系。只从组分1表达在用X-gal染色后产生蓝花。在表达组分1的植物中，化学诱导性诱导从组分2的表达可消除见于花中的蓝色。
实施例11
该级联系统的第一个组分包含芽孢杆菌RNA酶基因，它受带有lac操纵基因的花分生组织同一性基因启动子(即拟南芥的LEAFY)的控制。第二种组分包含受玉米GST-27基因启动子控制的阻抑laclq基因。拟南芥属植物是用这两种组分共转化的。在未诱导的植物中，只有组分1的表达产生不育性拟南芥属植物。在表达组分1的植物中，诱导从组分2的表达阻止了从LEAFY-op启动子的表达并恢复了初始不育性拟南芥属植物的能育性。实施例12
在下文中应用了一些缩写。这些是常用于植物组织培养领域中的缩写。BA：苄基腺嘌呤，也称为6-苄基氨基嘌呤。IBA：吲哚-3-丁酸。NAA：1-萘乙酸TDZ：苯基噻二唑基脲，也称为1-苯基-3-[1,2,3-噻二唑-5-基]脲。
下面是从枝和苗外植体材料生产转基因桉树属的优选步骤详细描述。枝外植体1．每月在含0.2mM BA的固体KG培养基上传代培养枝。保持在低光度(16小时光照周期，100～350Lux或1～8mmolm-2s-1 PAR)和22.5℃。2．传代培养3～4周后应用全部枝条。3．除去下方叶子留下上部4～6片叶。4．用针(例如25G)刺伤叶片5～6次并将全部枝条置于含10～100mM乙酰丁香酮的土壤杆菌属悬浮液(大约1×108 cfu ml-1)中达10分钟至2小时。在600nm处光密度为1.0的土壤杆菌属悬浮液稀释1/20约为1×108 cfu mL-1。当创伤靠近叶基时得最佳结果。备择地，不将刺伤的枝条置于土壤杆菌属悬浮液中达1小时，可将枝条用土壤杆菌属悬浮液在40～100Kpa下真空浸润10～30分钟。供真空浸润处理的枝不需刺伤。然而，当用针刺伤而不是通过真空浸润时形成的胼胝体更大。5．在无菌滤纸之间吸干枝条，再将枝条垂直插入含0.2mM BA的KG培养基。在暗处共培养2天。6．转移枝条(仍直立)至包含0.2mM BA和200mgL-1头孢噻肟的KG培养基。在低光度中保持5天(16小时光照周期，100～350Lux或1～8mmolm-2s-1 PAR)。7．切下4～6片上方的叶子，将它们近轴面朝上放在固体胼胝体诱导培养基G22上，该培养基包含2mM BA、2.5mM NAA、200mgL-1头孢噻肟和5～10mgL-1遗传霉素(geneticin)。在暗处培养2周。8．将该外植体转至包含2mM BA、2.5mM NAA、1.0mM TDZ、200mgL-1头孢噻肟和15mgL-1遗传霉素的G22培养基。每2周在暗处传代培养。当在亮处培养时产生棕色酚类化合物。9．6周后将外植体转至含有200mgL-1头孢噻肟和15mgL-1遗传霉素的枝诱导培养基GBA(即含5mM BA和0.5mM NAA的G22)。在暗处放置5～6天后移到亮处(16小时光照周期，100～350Lux或1～8mmolm-2s-1PAR)。每2周传代培养。10．在含200mgL-1头孢噻肟和15mgL-1遗传霉素的GBA上培养8～10周后，将带芽的胼胝体和在原来的外植体上形成的胼胝体的切片转至含200mgL-1头孢噻肟和30mgL-1遗传霉素的GBA上。每2周传代培养。11．在该培养基上培养4～6周后，将再生枝置于含0.01mM BA、50mgL-1头孢噻肟和5mgL-1遗传霉素的液体KG培养基中达2周，然后转至含更高遗传霉素(10mgL-1)的培养基中达2～4周。在100～120rpm下振荡这些液体培养物，其中在70ml容器中盛有8ml液体。12．将存活的枝和胼胝体转至固体培养基(KG，包含200mgL-1头孢噻肟和10mgL-1遗传霉素但不含激素)以及更高的光强度(16小时光照周期，450Lux或10mmol m-2s-1PAR)。每2周传代培养。13．对推定已转化的枝分析标志基因活性。14．从确证为阳性的枝材料再生植物。通过将枝条转至含10mgL-1遗传霉素但不含激素的KG上而诱导生根。但是，如果三周后未生根就移到含IBA 0.2mgL-1(9.8mM)的相同培养基上。
如上详述的方案从转化到再生出枝将历时1～8个月。苗外植体1．将种子消毒后使之在含0.2mM BA的KG上发芽。2．应用10～12天龄的苗，除去根后将它们放入过夜生长的、含50mM乙酰丁香酮的土壤杆菌属悬浮液(大约1×108 cfu ml-1)。在600nm处光密度为1.0的土壤杆菌属悬浮液稀释1/20约为1×108cfu mL-1。在解剖显微镜下用30G注射针轻轻地刺入而损伤子叶和下胚轴。培养1小时后从悬浮液中取出苗，在无菌的滤纸之间吸干它们以除去多余的液体。不将刺伤的子叶置于土壤杆菌属悬浮液中达1小时，可将子叶用土壤杆菌属悬浮液在95KPa(28mmHg)下真空浸润20分钟。供真空浸润处理的子叶不需刺伤。然而，即使运用真空浸润，下胚轴也需刺伤。3．在暗处的KG培养基(包含0.2mM BA)上共培养2天，确保这些苗在培养基中直立。4．将苗(仍直立)转移到含200mgL-1头孢噻肟的KG培养基(含有0.2mMBA)上。在低光度(16小时光照周期，100～350Lux或1～8mmol m-2s-2PAR)中继续培养5天。5．切下这些下胚轴和子叶。将下胚轴转移到包含0.5mM BA、1.0mMNAA、1.0mM TDZ、200mgL-1头孢噻肟和10mgL-1遗传霉素的胼胝体诱导培养基G22。将子叶转移到包含1.0mM BA、1.0mM NAA、0.3mM TDZ、200mgL-1头孢噻肟和10mgL-1遗传霉素的G22培养基。在暗处继续培养2周。6．将外植体转移到含15mgL-1遗传霉素和200mgL-1头孢噻肟的相同培养基。继续暗处培养。每两周传代培养直至约6周为止。7．6周后，转移到含15mgL-1遗传霉素的枝诱导培养基GBA(即包含5mMBA和0.5mMNAA的G22)。将培养物在暗处放置5～7天再转到光亮处(16小时光照周期，100～350Lux或1～8mmol m-2s-1 PAR)。8．在含15mgL-1遗传霉素和200mgL-1头孢噻肟的GBA上培养约10周后，一些外植体将已长出了枝。切下这些枝并转移到含有30mgL-1遗传霉素和200mgL-1头孢噻肟的KG培养基(含0.2mM BA)上。同时，将也已在原来的外植体上形成的胼胝体返回到含有15mgL-1遗传霉素和200mgL-1头孢噻肟的GBA上传代培养且再放置一个月，那时可长出更多的枝，然后可将这些枝转移到含30mgL-1遗传霉素和200mgL-1头孢噻肟的KG培养基(含0.2mM BA)上。9．现将所有的枝和胼胝体转移到包含30mgL-1遗传霉素和200mgL-1头孢噻肟的新鲜KG培养基(含0.2mM BA)再培养一个月左右。10．在该培养基上4～6周后，将再生枝放入含0.01mM BA、50mgL- 1头孢噻肟和5mgL-1遗传霉素的液体KG培养基中达2周，然后转至含更高遗传霉素(10mgL-1)的培养基中达2～4周。11．将存活的枝和胼胝体转移到固体培养基(KG，包含200mgL-1头孢噻肟和10mgL-1遗传霉素但不含激素)上以及更高的光强度(16小时光照周期，450Lux或10mmol m-2s-1PAR)。每2周传代培养。12．对推定已转化的枝分析标志基因活性。13．从确证为阳性的枝材料再生植物。通过将枝条转至含10mgL-1遗传霉素但不含激素的KG上而诱导生根。但是，如果三周后未生根就移到含IBA 0.2mgL-1(9.8mM)的相同培养基上。
12天龄或更嫩的苗最适于转化，但高达20天龄的苗可用于再生。
就未选择的未转化子叶和下胚轴外植体来说，枝再生率约为80％。
经验证实，即使3个月后，从培养基除去头孢噻肟将导致土壤杆菌属迅速过分生长。头孢噻肟的浓度在液体培养基和固体培养基之间变化。
当与在固体培养基上生长的枝相比时，枝材料在液体培养基中生长更快且形成更多的枝。与固体生长培养物相比，液体选择步骤具有通过提高选择压力、减少残余的土壤杆菌属以及增大枝组织的量而减少假阳性枝的优点。
然后将再生的已长根的转基因植物移到土壤基培养基上，使它们长成适合栽插的大小和形式的树。可通过组织培养繁殖技术微小繁殖克隆并使它们生长成适合栽插的大小和形式的树。
用于该研究的培养基有如Laine和David(1994)描述的G22、GBA和KG。不过，测试了包括MS、B5和P24的各种基本培养基，发现它们可维持枝再生。该植物生长调节方法一般不同于Laine和David(1994)的那些，后者是结合1～3mMBA、0.05～2mM TDZ和0.5～2.5mMNAA用于从叶诱导胼胝体；1～3mM BA、0.05～1mM TDZ和0.5～2.5mM NAA用于子叶；以及1～3mM BA、0.05～2mM TDZ和0.5～2.5mM NAA用于下胚轴。分化培养基通常是GBA培养基，它是G22但补加了2.5～5mM BA和0.5mM NAA(Laine和David,1994)。包含0.2mM BA的KG培养基通常用作克隆物质的传代培养基。所有培养基都用0.25％Gelrite或Phytagel固化。在121C高压灭菌15分钟之前应用氢氧化钾将pH调节到5.7～5.8。
制备土壤杆菌属接种物的优选方法描述如下：1．将包含构建物的土壤杆菌属菌株划线到选择板上，例如YEP+利福平(50mg/L)+卡那霉素(100mg/L)用于含pBin GUSINT构建物的LBA4404、EHA105和AGL1。2．在280C下将板培养2天。3．将单一菌落选入YEP选择性液体培养基，在280C下的摇床上生长一夜。4．应用该过夜培养物接种(1％种子培养物)新鲜的选择性培养基，在280C下的摇床上生长一夜。该另加的步骤将产生供植物转化的更稠密的种子培养物。5．收获土壤杆菌属，洗涤并重悬浮于组织培养基中。稀释至适合转化的合适浓度。6．将重悬浮的土壤杆菌属划线到乳糖酵母培养基板上，在280C下将板培养2天。对菌落进行本尼迪特试验(Bernaerts和Deley,1963)以确定它们是土壤杆菌属。
在转化的那天本方法将给出良好的稠密土壤杆菌属培养物。从板或甘油贮存物接种的培养物生长一夜将给出不同的结果。
如上述那样生长并被稀释到0.98的光密度(600nm)的AGL1培养物存活数为2.37×109cfu/ml。
当然应认识到，虽然给出了上述阐释性的本发明的实施例，对本领域技术人员显而易见的所有这些以及其它的更改和变化形式都认为属于本发明的宽范围(正如附后的权利要求中所要求的那样)。

Claims (31)

1．调节真核活性基因的方法，它包括用构建物转化细胞，该构建物表达调节该真核基因或其产物的调制基因产物以及调节所述调制基因或其产物的另一基因产物，所述基因、调制基因和另外的基因之中的两种的启动子选自相同组织或补充组织的诱导型启动子和发育启动子。
2．权利要求1的调节真核活性基因的方法，其中所述真核活性基因选自目的有机体的天然基因或引入的基因。
3．权利要求2的调节真核活性基因的方法，其中所述真核活性基因编码选自活性多肽、酶或者能完成合成途径的基因产物的表达产物。
4．权利要求3的调节真核活性基因的方法，其中所述合成途径是为生产颜料和染料而选择的。
5．权利要求4的调节真核活性基因的方法，其中所述染料例如是花青苷。
6．权利要求4的调节真核活性基因的方法，其中所述合成途径是为生产杀虫化合物而选择的。
7．权利要求6的调节真核活性基因的方法，其中所述杀虫化合物是Bti毒素。
8．权利要求3的调节真核活性基因的方法，其中所述酶选自对靶组织具有致死效果的RNA酶以及赋予根组织以线虫抗性的过氧化物酶。
9．权利要求8的调节真核活性基因的方法，其中所述RNA酶基因是得自解淀粉芽孢杆菌的芽孢杆菌RNA酶的基因。
10．权利要求9的调节真核活性基因的方法，其中所述基因被构建，它包括得自解淀粉芽孢杆菌的芽孢杆菌RNA酶的编码区，受在发育早期阶段植物繁殖器官的雄性部分和雌性部分中表达的基因的启动子序列控制。
11．前述权利要求任一项的调节真核活性基因的方法，其中所述真核活性基因是应用启动子构建的，该启动子选自在巨桉中启动称为EGM1、3&2的桉树基因的那些启动子。
12．权利要求1～10中任一项的调节真核活性基因的方法，其中所述真核活性基因是用启动子构建的，该启动子选自在辐射松中启动称为PrMADS1、2和3的松基因的那些启动子。
13．前述权利要求任一项的调节真核活性基因的方法，其中所述真核活性基因、调制基因和另外的基因及其各自的启动子可包括转化盒，用该转化盒可转化靶有机体。
14．权利要求13的调节真核活性基因的方法，其中所述真核活性基因是由发育启动子启动的，且其中所述调制基因的启动子是组成型。
15．权利要求13的调节真核活性基因的方法，其中所述真核活性基因的启动子是组织特异性的并受组成性启动的抑制基因产物的抑制，它反过来受诱导性启动的其它基因产物的控制。
16．权利要求13的调节真核活性基因的方法，其中所述真核活性基因产物是在调制基因的调制作用下被组成性表达的，该调制基因的表达受组织特异性启动子的控制，该调制基因或产物本身通过在不同组织或补充组织特异性的启动子控制下另外基因的表达而被控制。
17．调节真核活性基因的表达的方法，它包括用转化盒转化细胞，该转化盒包括：所述真核活性基因、表达调节该真核基因或其产物的产物的调制基因、以及表达调节所述调制基因或其产物的产物的另一基因，所述基因、调制基因和另外的基因之中的两种的启动子选自相同组织或补充组织的诱导型启动子和发育启动子。
18．用表达盒转化繁殖性真核细胞的方法，该表达盒包括：
于靶组织中在所述靶组织的大致特异性启动子的控制下表达细胞毒性肽的致死基因；
组成性表达所述细胞毒性肽的生产或作用的抑制剂的调制基因；以及
受所述大致特异性启动子控制并起封阻所述抑制剂或调制基因的作用的另外基因。
19．前述权利要求1～16任一项的调节真核活性基因的方法，其中所述真核活性基因选自得自解淀粉芽孢杆菌提取物的芽孢杆菌RNA酶基因和芽孢杆菌RNA酶抑制剂基因，是由被称为P1和P2(对于芽孢杆菌RNA酶抑制剂)以及P3和P4(对于芽孢杆菌RNA酶)的引物通过PCR分离的，这些引物包括：
P1         5′GCG AAT TCC GCA CAT GAA AAA AGC 3′
           EcoRⅠ
P2         5′GCA AGC TTA AGA AAG TAT GAT GGT G3′
              HindⅢ
P3         6′GCC CAT GGC ACA GGT TAT CAA CAC G3′
              NcoⅠ
P4         5′CGG GTA CCT TAT CTG ATT TTT GTA A3′
              KpnⅠ
20．前述权利要求1～16任一项的调节真核活性基因的方法，其中所述真核活性基因是致死基因，其中该致死基因表达产物的细胞毒性效果是通过将定位信号序列与构建物偶联而提高的。
21．权利要求20的调节真核活性基因的方法，其中所述真核活性基因编码RNA酶，该RNA酶是通过将核定位信号(NLS)序列与RNA酶基因融合而被定向入核的。
22．权利要求21的调节真核活性基因的方法，其中该基因是芽孢杆菌RNA酶基因且所述融合是通过PCR进行的，其中应用一组PCR引物将得自根瘤土壤杆菌的VirD2基因的NLS序列与B基因融合，这组引物包括：
P3    5′GCC CAT GGC ACA GGT TAT CAA CAC G3′
         NcoⅠ
BD1    5′CCT TAC AAA AAT CAG AGT CCT TTC AAA GCG TCC G3′
          芽孢杆菌RNA酶的3′端    VirD2的NLS的5′端
BD2    5′CGG ACG CTT TGA AAG GAC TCT GAT TTT TGT AAA G3′
          VirD2的NLS的5′端    芽孢杆菌RNA酶的3′端
D23    5′CGG GTA CCT ATC TCC TAT TTC CCC CAG G3′
      KpnⅠ
23．前述权利要求1～22任一项的调节真核活性基因的方法，其中所述阻抑基因和抑制基因适于形成特定的阻抑蛋白/操纵基因偶联物。
24．权利要求23的调节真核活性基因的方法，其中所述阻抑蛋白/操纵基因偶联物包括大肠杆菌laclq基因，该laclq基因受与真核活性基因构建物相同的启动子控制而且用于阻抑通过插入lac操纵基因序列而修饰的阻抑基因启动子的作用。
25．权利要求24的调节真核活性基因的方法，其中所述阻抑基因启动子是已修饰的35S RNA CaMV启动子，它在该启动子和该阻抑蛋白的编码区之间具有至少一个lac操纵基因。
26．权利要求25的调节真核活性基因的方法，其中所述已修饰的35S-RNA-CaMV序列是应用被称为35S1和35S2的引物通过PCR扩增的，该引物包括：
35S1       5′ GCC TCG AGC ATG GTG GAG CAC GAC AC3′
                 XhoⅠ
35S2      5′ GCG TCG ACT CTC CAA ATG AAA TGA AC3′
                SalⅠ
27．权利要求25的调节真核活性基因的方法，其中所述已修饰的35S-RNA-CaMV序列是应用被称为OP1和35S2的引物通过PCR扩增的，该引物被用于将lac操纵基因引入已修饰的35S启动子的3′和5′区：
OP1        5′ GCC TCG AGC TTT GTG AGC GGA TAA C3′
                 XhoⅠ
35S2      5′ GCG TCG ACT CTC CAA ATG AAA TGA AC3′
                SalⅠ
28．权利要求24的调节真核活性基因的方法，其中所述laclq基因是用供克隆入植物载体的酶切割位点分离的，应用相应于该基因的5′和3′端、被称为AM1和AM2的两种引物：
AM1   5′GGT CTA GAC CAT GGA ACC AGT AAC GTT ATA 3′
         Xba Ⅰ
AM2   5′GCG GTA CCT CAC TGC CCG CTT TC3′
         KpnⅠ
29．权利要求28的调节真核活性基因的方法，其中该laclq基因的3′端通过一组PCR引物与NLS序列融合，该PCR引物为：
AM15′GCT CTA GAC CAT GGA ACC AGT AAC GTT ATA 3′
       XbaⅠ
LD1   5′CTG GAA AGC GGG CAG GTC CTT TCA AAG CGT CCG 3′
      laclq的3′端    VirD2基因中NLS的5′端
LD2   5′CGG ACG CTT TGA AAG GAC CTG CCC GCT TTC CAG 3′
             VirD2中NLS的5′端laclq的3′端
D23   5′CGG GTA CCT ATC TCC TAT TTC CCC CAG G3′
KpnⅠ
30．一种转化盒，它包括：真核活性基因、表达调节该真核基因或其产物的产物的调制基因、以及表达调节所述调制基因或其产物的产物的另一基因，所述基因、调制基因和另外的基因之中的两种的启动子选自相同组织或补充组织的诱导型启动子和发育启动子。
31．一种表达盒，它包括：
在靶组织的大致特异性诱导型启动子控制下表达所述靶组织的细胞毒性肽的基因；
表达所述细胞毒性肽的生产或作用的抑制剂的抑制基因；以及
受所述诱导型启动子控制并起封阻所述抑制剂或抑制基因的作用的阻抑基因。
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